TW202124442A - 人源化抗ｃｌｄｎ１８．２抗體、編碼其的核酸分子、其產生方法、包含其的組合物、試劑盒及其用途 - Google Patents

人源化抗ｃｌｄｎ１８．２抗體、編碼其的核酸分子、其產生方法、包含其的組合物、試劑盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供了抗密連蛋白18.2(CLDN18.2)抗體及其抗原結合片段。還提供了編碼抗CLDN18.2抗體的分離的核酸分子、包含所述核酸的載體和包含所述載體或核酸的宿主細胞。提供了製備抗CLDN18.2的方法。還提供了相關的藥物組合物和使用該藥物組合物治療與異常CLDN18.2表達相關的疾病(例如，癌症)的方法。

Description

人源化抗密連蛋白18.2(CLDN18.2)抗體
[相關申請的交叉引用]
本發明要求於2019年9月13日提交的美國臨時申請No.62/900,381的優先權，其內容通過引用整體併入本申請案。
本發明關於人源化抗CLDN18.2抗體，包含此類抗體的治療方法，包含此類抗體的藥物，以及相關試劑盒。
密連蛋白(Claudins)是在上皮和內皮中表達並形成確定緊密連接通透性的細胞旁屏障和孔的緊密連接膜蛋白家族。Claudin 18同種型2(CLDN18.2)是Claudin 18蛋白的剪接變體，它是在短期分化的胃上皮細胞上表達的胃系抗原。CLDN18.2的表達通常在其它健康的人組織中檢測不到。然而，CLDN18.2在多種人類癌症(包括胃食管交界癌和胰腺癌)中以顯著水平異位表達(Sahinet al. (2008)Clin Cancer Res , 14(23): 7624-34)。在胃癌轉移中也頻繁檢測到CLDN18.2。
胃癌是世界上最常見的癌症之一，在發達國家，是癌症相關死亡的第四(男性)和第五(女性)最常見原因。據估計，2012年發生新的胃癌病例951,600例，死亡723,100例(Torreet al. (2015)CA Cancer J. Clin. 65(2): 87-108)。大多數胃癌患者總是被診斷為處於疾病晚期，並且治療通常需要姑息性化療，使得中位存活時間為8-10個月。因此，需要針對人類患者中表達CLDN18.2的癌細胞的抗體療法。
在一些實施方案中，提供了抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含CDR-H2，所述CDR-H2包含IIIGGIYT(SEQ ID NO：6)。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體或抗原結合片段進一步包含：(a)CDR-L1，其包含QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO：1)；(b)CDR-L2，其包含WAS(SEQ ID NO：2)；(c)CDR-L3，其包含QNNYIYPFT(SEQ ID NO：3)；(d)CDR-H1，其包含GFTFSNYA(SEQ ID NO：4)；和(e)CDR-H3，其包含ARQVYGNSFAY(SEQ ID NO：7)。
在一些實施方案中，本發明提供了抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，包含：VL結構域，所述VL結構域包含如SEQ ID NO：55-58中所示的任一氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含如SEQ ID NO：59-65中所示的任一氨基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：59；(ii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：60；(iii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：61；(iv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：62；(v)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：63；(vi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：59；(vii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：60；(viii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：61；(ix)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：62；(x)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：63；(xi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：59；(xii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：60；(xiii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：61；(xiv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：62；(xv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：63；(xvi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：59；(xvii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：60；(xviii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：61；(xix)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：62；(xx)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：63；(xxi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：64；(xxii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：64；(xxiii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：64；(xxiv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：64；(xxv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：65；(xxvi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：65；(xxvii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：65；或(xxviii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：65。
在一些實施方案中，本發明提供抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變結構域(VL)和重鏈可變結構域(VH)，其中VL結構域包含：(i)框架區1(FW1)，其包含SEQ ID NO：34、37、39或20)；(ii)框架區2(FW2)，其包含SEQ ID NO：35、38或40；(iii)框架區3(FW3)，其包含SEQ ID NO：36或22；以及(iv)框架區4(FW4)，其包含SEQ ID NO：19；和/或其中VH包含：(i)框架區1(FW1)，其包含SEQ ID NO：41、44、46或49；(ii)框架區2(FW2)，其包含SEQ ID NO：42、47、50或52；(iii)框架區3(FW3)，其包含SEQ ID NO：43、45、48或51；以及(iv)框架區4(FW4)，其包含SEQ ID NO：26或30。在一些實施方案中，VL包含：(i)FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含SEQ ID NO：19；(ii)FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含SEQ ID NO：19；(iii)FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含SEQ ID NO：19；或(iv)FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含SEQ ID NO：19；和/或VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：43；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(ii)FW1，其包含SEQ ID NO：44；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：45；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(iii)FW1，其包含SEQ ID NO：46；FW2，其包含SEQ ID NO：47；FW3，其包含SEQ ID NO：48；和FW4，其包含SEQ ID 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ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(p)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：43；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(q)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：44；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：45；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(r)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：46；FW2，其包含SEQ ID NO：47；FW3，其包含SEQ ID NO：48；和FW4，其包含SEQ ID NO：30；(s)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(t)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(u)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(v)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(w)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(x)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(y)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(z)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(aa)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；或(bb)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段還包含例如描述於PCT/CN2019/078150中的抗CDLN抗體的6個互補性決定區(CDR)，所述文獻的內容通過引用整體併入本發明。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含人IgG的Fc序列。在一些實施方案中，人IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含Fc結構域，所述Fc結構域包含SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：111的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體是人源化抗體。在一些實施方案中，本文提供的抗CLDN18.2抗體的抗原結合片段選自由以下組成的組：Fab、Fab’、F(ab)’2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段、雙抗和線性抗體。在一些實施方案中，抗體是多特異性抗體。在一些實施方案中，通過本發明提供的抗體或其抗原結合片段結合的CLDN18.2是人CLDN18.2。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體或抗原結合片段與治療劑綴合。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體或抗原結合片段與標記物綴合。在一些實施方案中，標記物選自由以下組成的組：放射性同位素、螢光染料和酶。
在一些實施方案中，提供了編碼本發明提供的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段的分離的核酸分子。在一些實施方案中，提供了編碼核酸分子的表達載體。在一些實施方案中，提供了包含核酸分子或表達載體的宿主細胞。在一些實施方案中，提供了產生抗CLDN18.2抗體的方法，包含培養宿主細胞和從細胞培養物中回收抗體。
在一些實施方案中，提供了包含本發明所述的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載體的組合物。
在一些實施方案中，提供了檢測來自患者的樣品中的CLDN18.2蛋白的方法，其通過使本發明所述的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段與樣品接觸並檢測與CLDN18.2蛋白結合的抗CLDN18.2抗體(或片段)來進行。在一些實施方案中，用於該方法的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段與標記(例如，放射性同位素、螢光染料和酶)綴合。在一些實施方案中，所述方法包含免疫組織化學測定(IHC)或ELISA測定。
在一些實施方案中，提供了治療受試者的癌症的方法，包含施用有效量的包含本發明所述的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載體的組合物。在一些實施方案中，癌症選自實體瘤、胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌。在一些實施方案中，向受試者進一步施用選自由以下組成的組的治療劑：抗腫瘤劑、化療劑、生長抑制劑和細胞毒性劑。
以下描述闡述了示例性方法，參數等。然而，應當認識到，這樣的描述並非旨在作為對本發明的保護範圍的限制，而是作為對示例性實施方案的描述來提供。 [定義]
在詳細描述所公開的實施方案之前，應當理解，本發明不限於特定的組合物或生物系統，其當然可以變化。還應當理解，本發明使用的術語僅出於描述特定實施方案的目的，而並不意圖進行限制。
如本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式“一”、“一個”和“該”包括複數個物件，除非上下文另外明確指出。因此，例如，提及“一種分子”任選地包括兩種或更多種這樣的分子的組合，等等。
本發明所使用的術語“約”是指本技術領域的技術人員容易知道的各個值的通常誤差範圍。本文中提及“約”一個值或參數包括(並描述)涉及該值或參數本身的實施方案。
應當理解，本發明的各方面和各實施方案包括“包含(comprising)”、“由…組成(consisting)”以及“基本上由…組成(consisting essentially of)”方面和實施方案。
術語“claudin 18”或“CLDN18”較佳是指人CLDN18並且包括CLDN 18的任何剪接變體，諸如CLDN18.1和CLDN18.2。CLDN18.1和CLDN18.2的不同在於包含第一跨膜(TM)區和環1的N-末端部分，而C-末端的一級蛋白序列是相同的。
術語“CLDN18.1”較佳涉及人CLDN18.1，且特別涉及一種蛋白質，所述蛋白質包含氨基酸序列 MSTTTCQVVA FLLSILGLAG CIAATGMDMW STQDLYDNPV TSVFQYEGLW RSCVRQSSGF TECRPYFTIL GLPAMLQAVR ALMIVGIVLG AIGLLVSIFA LKCIRIGSME DSAKANMTLT SGIMFIVSGL CAIAGVSVFA NMLVTNFWMS TANMYTGMGG MVQTVQTRYT FGAALFVGWV AGGLTLIGGV MMCIACRGLA PEETNYKAVS YHASGHSVAY KPGGFKASTG FGSNTKNKKI YDGGARTEDE VQSYPSKHDY V(SEQ ID NO：106) 或所述氨基酸序列的變體。
術語“CLDN18.2”較佳涉及人CLDN18.2，且特別是涉及一種蛋白質，所述蛋白質包含氨基酸序列 MAVTACQGLG FVVSLIGIAG IIAATCMDQW STQDLYNNPV TAVFNYQGLW RSCVRESSGF TECRGYFTLL GLPAMLQAVR ALMIVGIVLG AIGLLVSIFA LKCIRIGSME DSAKANMTLT SGIMFIVSGL CAIAGVSVFA NMLVTNFWMS TANMYTGMGG MVQTVQTRYT FGAALFVGWV AGGLTLIGGV MMCIACRGLA PEETNYKAVS YHASGHSVAY KPGGFKASTG FGSNTKNKKI YDGGARTEDE VQSYPSKHDY V(SEQ ID NO ： 107) 或所述氨基酸序列的變體。
術語“CLDN”、“CLDN18”、“CLDN18.1”和“CLDN18.2”是指任何翻譯後修飾的變體和構象變體。
如本發明所用，術語“抗體”可以指完整的(全長)抗體；抗體片段(包括但不限於Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、雙抗、scFv、scFv-Fc、單結構域抗體、單重鏈抗體和單輕鏈抗體)，只要它們表現出所需的生物學活性(例如表位元結合)；單株抗體；多株抗體；單特異性抗體；多特異性抗體(例如雙特異性抗體)；抗體樣蛋白，包括但不限於例如融合蛋白、半胱氨酸工程抗體，共價修飾的抗體和抗體綴合物(諸如抗體-藥物綴合物或與可檢測標記物綴合的抗體)。
“分離的”抗體可以指已從其天然環境的組分(例如，宿主細胞或生物體)分離和/或回收的抗體。在一些實施方案中，將抗體純化至期望的重量純度(例如，至少95%)；和/或通過SDS-PAGE使用例如銀染色、考馬斯(Coomassie)染色等進行均質化。在一些實施方案中，在一個或多個純化步驟後獲得分離的抗體。
如本領域已知的，“天然”抗體通常指包括兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈的異源四聚體複合物。可變數目的二硫鍵連接兩條重鏈，除了鏈內二硫鍵外，一個二硫鍵還將每條輕鏈連接至重鏈。重鏈包括：可變結構域(VH)，其後(N端至C端)是三個或四個恆定域。輕鏈包括可變結構域(VL)，其後是恆定結構域(CL)。通常，基於氨基酸序列，哺乳動物輕鏈分為兩類之一：κ和λ。
“恆定結構域”可以指抗體或片段的更保守部分，例如在可變結構域的外部。該術語可以包括CL結構域以及重鏈恆定結構域CH1、CH2、CH3和任選的CH4。
重鏈的恆定結構域可指定為5種主要類型之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些主要類型中的許多存在若干亞型。不同類別免疫球蛋白的亞型結構和三維構型是熟知的，並且通常描述於例如Abbaset al. Cellular and Mol.Immunology, 4th ed. (W.B.Saunders, Co., 2000)。
如本發明所用，術語“抗體可變結構域”是指抗體的輕鏈和重鏈的部分，包括互補決定區(CDRs，例如CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2和CDR H3)和框架區(FRs)。
術語“可變”是指抗體之間的可變結構域的子序列在序列上實質上不同並且對於特定抗體針對其抗原的結合特異性起到關鍵作用的事實。可變性集中在VH和VL結構域中的三個“高變區”(HVRs)或“互補性決定區”(CDRs)(術語“HVR”和“CDR”在本文中可互換使用)。可變區的更保守的部分稱為框架區(“FR”或“FW”)，CDRs散佈在其中。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含由形成環的三個CDRs連接的四個FR區(參見Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991))。
術語“高變區(HVR)”或“互補性決定區(CDR)”可以指VH和VL結構域的以增強的序列可變性和/或限定環的形成為特徵的子區。這些包括在VH結構域中的三個CDR(H1、H2和H3)和在VL結構域中的三個CDR(L1、L2和L3)。認為H3在賦予良好的結合特異性中是關鍵的，其中L3和H3顯示最高水平的多樣性。參見Johnson和Wu,在分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)248:1-25中所述(Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)。
許多CDR/HVR描繪是已知的。Kabat互補性決定區(CDR)是基於序列可變性的，並且是最常用的(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991))。而Chothia是指結構環的位置(Chothia and Lesk J. Mol.Biol.196:901-917 (1987))。“Martin”(增強型Chothia)方案還考慮了框架區中indel(插入缺失)的結構正確位置。因此，Martin編號方案在大多數方面與Chothia相同，但框架indel的位置已被細化(參見，例如，bioinf(dot)org(dot)uk/abs/index(dot)html#martinnum)。AbM HVR代表Kabat HVRs和Chothia結構環之間的折衷，並且被牛津分子(Oxford Molecular)的AbM抗體建模軟體使用。“接觸”HVRs基於可用的複雜晶體結構的分析。這些HVRs/CDRs的每一個的殘基如下所示。“框架”殘基(在本發明中也稱為“FR”殘基或“FW”殘基)是那些不同於HVR/CDR殘基的可變結構域殘基。關於這些和其他CDR編號方案(例如IMGT和Aho)的附加資訊可以在例如www(dot)bioc(dot)uzh(dot)ch/plueckthun/antibody/Numbering/NumFrame.html.中找到。 環 Kabat AbM Chothia 接觸 L1          L24-L34      L24-L34       L26-L32        L30-L36 L2          L50-L56      L50-L56       L50-L52        L46-L55 L3          L89-L97      L89-L97       L91-L96        L89-L96 H1          H31-H35B          H26-H35B   H26-H32            H30-H35B   (Kabat編號) H1          H31-H35      H26-H35    H26-H32     H30-H35        (Chothia編號) H2          H50-H65      H50-H58    H53-H55     H47-H58 H3          H95-H102       H95-H102      H96-H101     H93-H101
“延伸的”HVRs已知為：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)(Kabat編號)。
“根據Kabat編號”可指用於Kabat等(同上)中抗體的彙編的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統。實際的線性氨基酸序列可以含有更少或附加的對應於可變結構域的FR或HVR的縮短或插入的氨基酸。通過在抗體序列的同源性區域與“標準”Kabat編號序列比對，可以確定給定抗體的殘基的Kabat編號。通常，當涉及可變結構域中的殘基時，使用Kabat編號(大約輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113)；然而當涉及重鏈恆定區中的殘基時，通常使用EU編號系統或索引(例如，如Kabat中的EU索引，根據EU IgG1編號)。
例如與抗體片段相反，“全長”或“完整”抗體通常包括具有Fc區的重鏈。具有單一抗原結合位點的抗原結合“Fab”片段可以通過木瓜蛋白酶消化從殘餘Fc片段中釋放。F(ab’)2片段包括由胃蛋白酶處理抗體產生的兩個抗原結合位點。然而，抗體片段將包括一個或多個抗體可變區。
“Fv”片段含有完整的抗原結合位點。單鏈Fv(scFv)可以包括通過肽接頭連接的VH和VL結構域，使得VH和VL結構域例如在抗體或Fab片段中締合，使得HVRs形成抗原結合位點。參見Pluckthün，在單株抗體的藥理學(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore編輯，(Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315。在一些實施方案中，scFv融合至抗體Fc結構域(例如，scFv-Fc)。雖然六個HVRs通常包含抗原結合位點，但是具有三個HVRs的單個可變結構域仍然能夠結合抗原，儘管親和力較低。參見Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)。單個結構域抗體(例如，駱駝抗體)通常包括用於抗原結合的單個單體可變結構域。單重鏈(VHH)和單輕鏈抗體也是已知的。Fab'片段通常在C-末端包括比Fab片段多幾個殘基。Fab’-SH包括具有游離巰基的半胱氨酸殘基。抗體片段的各種化學偶聯是本領域已知的。
“雙抗體”包括具有兩個抗原結合位點的抗體片段。這些包括通過接頭連接的VH和VL結構域，其通常太短而不能促進相同鏈中的結構域的配對。雙抗可以是二價的或雙特異性的。三抗和四抗，或其它數目的VH/VL結構域是已知的。參見Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003)。
如本發明所用，“單株”抗體是指從基本上均一的抗體群獲得的抗體，抗體群例如是基本上相同但允許較低水平的背景突變和/或修飾的抗體群。“單株”表示抗體的基本上均一的特性，並且不需要通過任何特定的方法產生抗體。在一些實施方案中，單株抗體通過其HVR、VH和/或VL序列和/或結合特性來選擇，例如選自克隆(例如，重組體、雜交瘤或噬菌體衍生物)的集合。可以將單株抗體工程化以包括一個或多個突變，例如以影響抗體的結合親和力或其它性質，產生人源化或嵌合抗體，改善抗體產生和/或均一性，設計多特異性抗體，其產生的抗體仍然被認為是天然單株的。單株抗體群可以與多株抗體區分開，因為群的單個單株抗體識別相同的抗原位點。生產單株抗體的各種技術是已知的；參見，例如，雜交瘤方法(例如，Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)；Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling等，在單株抗體和T-細胞雜交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)563-681(Elsevier, N.Y., 1981))，重組DNA方法(參見，例如美國專利No. 4,816,567)，噬菌體展示技術(參見，例如 Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol.Biol.222: 581-597 (1992)；Sidhu et al., J. Mol.Biol.338(2):299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34): 12467-12472 (2004)；以及Lee et al., J. Immunol.Methods 284(1-2): 119-132 (2004)，以及用於在具有編碼人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的動物中產生人或類人抗體的技術(參見，例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol.7:33 (1993)；美國專利No. 5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnol.14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol.14: 826 (1996)；和Lonberg and Huszar, Intern.Rev. Immunol.13: 65-93 (1995)。
“嵌合”抗體可以指具有來自特定同種型、類別或有機體的重鏈和/或輕鏈的一部分和來自另一同種型、類別或有機體的另一部分的抗體。在一些實施方案中，可變區來自一個來源或有機體，且恆定區來自另一個來源或有機體。
“人源化抗體”可以指具有主要為人的序列和最少量的非人(例如，小鼠或雞)序列的抗體。在一些實施方案中，人源化抗體具有來自移植到人受體抗體框架“FR”或“FW”上的非人(例如，鼠或雞)生物體的抗體的一個或多個HVR序列(具有感興趣的結合特異性)。在一些實施方案中，將非人殘基進一步移植到人框架(不論是源抗體還是受體抗體都不存在)上，例如，以改善抗體性質。通常，人源化抗體將包含至少一個，且通常兩個，可變區的基本上全部，其中高變環的全部或基本上全部對應於非人免疫球蛋白的那些序列，並且FRs的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些序列。人源化抗體任選地還包含(通常是人免疫球蛋白的)免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分。參見Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；和Presta, Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。
“人”抗體可以指具有與人產生的抗體的氨基酸序列相對應的氨基酸序列的抗體和/或使用本發明公開的用於製備人抗體的任何技術製備的抗體。人抗體可以使用本領域已知的各種技術產生，包括噬菌體展示文庫。Hoogenboom and Winter, J. Mol.Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol.Biol., 222:581 (1991)；如以下中描述的人單株抗體的製備：Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)；和通過將抗原向已被修飾以回應抗原攻擊而產生此類抗體但其內源性基因座已被禁用的轉基因動物施用，例如免疫的異種移植小鼠(xenomice)(參見例如關於XENOMOUSETM技術的美國專利 No.6,075,181和6,150,584)或具有人免疫球蛋白序列的雞(參見例如WO2012162422、WO2011019844和WO2013059159)。
本發明所用的術語“細胞毒性劑”可以指抑制細胞增殖或誘導細胞死亡的任何試劑。細胞毒性劑包括但不限於化療劑；放射性同位素；生長抑制劑；和毒素，如小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。示例性細胞毒性劑包括但不限於代謝抑制劑、抗微管劑、含鉑化合物、烷化劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶II抑制劑、抗代謝物、拓撲異構酶I抑制劑、信號轉導通路抑制劑、非受體酪氨酸激酶血管生成抑制劑、激素和激素類似物、促凋亡劑、LDH-A的抑制劑、細胞週期抑制劑、HDAC抑制劑和抗生素劑。
如本發明所使用，“標記”可包括例如充當本發明的經標記抗體與大分子或細胞之間的結合的檢測劑的任何部分。示例性標記包括但不限於螢光(例如，化合物或蛋白質)、放射性或酶部分，以及親和純化標籤。
術語“檢測”旨在包括確定物質的存在或不存在，或定量物質(諸如CLDN18.2)的量。因此，該術語是指本發明的材料、組合物和方法用於定性和定量測定的用途。通常，用於檢測的特定技術對於本發明的實施不是關鍵的。
例如，根據本發明的“檢測”可包括：觀察CLDN18.2多肽的CLDN18.2基因產物的存在或缺失；結合至靶標的CLDN18.2多肽的水平或量的變化；CLDN18.2多肽的生物學功能/活性的改變。在一些實施方案中，“檢測”可包括檢測野生型CLDN18.2水平(例如，多肽水平)。檢測可以包括當與對照相比時定量10%至90%之間的任何值、或30%至60%之間的任何值、或超過100%的變化(增加或減少)。檢測可以包括量化在2倍至10倍或更多(例如100倍)之間的任何值的變化。
如本發明所用，抗體可以說以足以使抗體用於體外和/或體內操縱抗原的親和力“結合”抗原。
如本發明所用，術語“親和力”或“結合親和力”是指兩個分子之間的結合相互作用的強度。通常，結合親和力是指分子與其結合配偶體(如高親和力SIRP-α D1變體和CD47)之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另外指明，否則結合親和力是指固有結合親和力，其反映結合對的成員之間的1:1相互作用。兩種分子間的結合親和力通常用解離常數(Kd )或締合常數(Ka )來描述。彼此具有低結合親和力的兩個分子通常結合緩慢，易於解離，並且表現出大的Kd 。彼此具有高親和力的兩個分子通常容易結合，趨於更長久地保持結合，並且表現出小的Kd 。在一些實施方案中，使用已知的方法和技術測定兩種相互作用分子的Kd ，例如，表面等離子體共振(SPR)。Kd 可以作為koff/kon的比率計算。
如本發明所用，術語“小於...的Kd ”是指數值上較小的Kd 值和相對於所列舉的Kd 值增加的結合親和力。如本發明所用，術語“大於...的Kd ”是指數值上較大的Kd 值和相對於所列舉的Kd 值降低的結合親和力。
如本發明所用，“治療”可指分子、化合物、製劑、組合物等的治療性施用，以獲得有益的或期望的治療結果，包括臨床結果。出於本發明的目的，有益的或期望的臨床結果包括但不限於以下中的一種或多種：減輕由疾病引起的一種或多種症狀，減少疾病的程度，穩定疾病(例如，防止或延遲疾病的惡化)，防止或延遲疾病的傳播(例如，轉移)，預防或延遲疾病的復發，延遲或減緩疾病的進展，改善疾病狀態，提供疾病的緩解(部分或全部)，減少治療疾病所需的一種或多種其它藥物的劑量，減輕病理症狀或疾病狀態，增加或改善生存品質，防止過度體重減輕，改善預後，實現疾病緩解和/或延長存活。“治療”還包括減少癌症的病理結果(諸如，舉例而言腫瘤體積增加)。本發明提供的方法考慮了治療的這些方面中的任何一個或多個。
如本發明所用，疾病的“延遲進展”可以指減緩、延遲、延緩、推遲疾病的發展，穩定或以其他方式阻礙疾病的病理過程。在一些實施方案中，該術語可以指有效地涵蓋預防(例如足以在預防個體疾病發展中)的延遲。在一些實施方案中，例如，對於晚期癌症來說，延遲進展可以包括延遲轉移。本領域技術人員將理解，延遲的精確長度可取決於例如具體疾病、個體狀況等。
術語“再發(recurrence)”或“復發(relapse/relapsed)”是指以經臨床評價疾病消失後以異常的CLDN18.2表達或異常的CLDN18.2活性為特徵的疾病或病症的復發(例如，癌症，諸如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)。
術語“難治的(refractory)”或“抗性的(resistant)”是指尚未對使用特定藥劑或藥劑組合的治療作出反應、以異常的CLDN18.2表達或異常的CLDN18.2活性為特徵的疾病或病症(例如，癌症，諸如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)。
如本發明所用，術語“有效量”可以指本發明的抗體或含有本發明的抗體的藥物組合物足以且有效地實現治療或延遲患有疾病的患者的進展的期望治療效果的量，疾病諸如為表達CLDN18.2的腫瘤或以異常CLDN18.2表達或活性為特徵的癌症，例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等。在一些實施方案中，治療有效量將避免不良副作用，和/或這種副作用將被有益效果抵消。有效量可取決於所治療的個體(例如，年齡、體重、性別、疾病狀態)以及藥劑產生所需反應的能力。 可以一次或多次施用來施用有效量。如在臨床環境中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以或可以不與另一種藥物、化合物或藥物組合物(例如另一種治療劑)聯合實現。因此，“有效量”也可以在施用一種或多種另外的治療劑的環境中考慮，並且如果單一藥劑與一種或多種其它藥劑聯合可以得到或實現期望的結果，則可以認為以有效量施用。
術語“治療有效量”是指如本發明所公開的人源化抗CLDN18.2抗體(或其片段)或組合物有效“治療”哺乳動物(例如患者或受試者)中的疾病或病症的量。在癌症的情況下，治療有效量的本發明公開的人源化抗CLDN18.2抗體(或其片段)或組合物可以減少癌細胞的數量；減小腫瘤大小或重量；抑制(即，在一定程度上減慢並且較佳地停止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即，在一定程度上減慢並且較佳地停止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕與癌症相關的一種或多種症狀。就如本發明所公開的人源化抗CLDN18.2抗體(或其片段)或組合物可以防止現存癌細胞生長和/或殺死現存癌細胞而言，其可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。在一個實施方案中，治療有效量是生長抑制量。在另一個實施方案中，治療有效量是延長患者存活的量。在另一個實施方案中，治療有效量是改善患者的無進展存活的量。
如本發明所用，術語“藥物組合物”可以指包括活性成分以及賦形劑或稀釋劑(或賦形劑和稀釋劑兩者)並且使得活性成分能夠通過合適的施用方法施用的藥用或藥物製劑。在一些實施方案中，本發明公開的藥物組合物包括與本發明的一種或多種抗體相容的藥學上可接受的組分。在一些實施方案中，藥物組合物是用於口服施用的片劑或膠囊形式或用於靜脈內或皮下施用(例如通過注射)的水性形式。
如本發明所用，“藥學上可接受的”或“藥理學上相容的”是指不是生物學上或其它方面不期望的材料，例如，所述材料可併入向患者施用的藥物組合物中，而不引起任何顯著不期望的生物效應或以有害方式與含有所述材料的組合物的任何其它組分的相互作用。藥學上可接受的載體或賦形劑較佳滿足毒理學和製造測試的所需標準和/或包括在美國食品和藥物管理局編寫的《非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)》中。
如本發明所用，術語“受試者”、“個體”和“患者”可互換使用，是指脊椎動物，例如哺乳動物。哺乳動物包括但不限於鼠、猿、人、農場動物、運動動物和寵物。
關於本發明鑒定的多肽和抗體序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”或“同源性”定義為在將考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分的序列比對後，候選序列中與被比較多肽中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。用於確定氨基酸序列同一性百分比的比對可通過本領域技術人員已知的各種方法實現，例如，使用公眾可獲得的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於測量比對的適當參數，包括在所比較的全長序列上實現最大比對所需的任何演算法。然而，出於本發明的目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生%氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech公司編寫，其原始程式碼已在20559華盛頓特區的美國版權局中與用戶文檔一起提交，以美國版權註冊號No.TXU510087登記。ALIGN-2程式可通過加利福尼亞州南三藩市Genentech公司公開獲得。應編譯ALIGN-2程式以在UNIX作業系統上使用，較佳在數位UNIX V4.0D上使用。 所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不更改。
本文引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物，均通過引用整體併入本文。 [人源化抗Claudin 18.2(CLDN18.2)抗體]
本發明基於結合claudin 18.2(CLDN18.2)的人源化抗體的鑒定。本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體可用於多種治療和診斷方法。例如，人源化抗CLDN18.2抗體可單獨使用或與其它藥劑組合使用以治療以異常CLDN18.2表達或異常CLDN18.2活性為特徵的疾病或病症，包括但不限於實體瘤或癌症，例如，胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等。本發明所提供的人源化抗體可以用來檢測患者(如人類患者)或患者樣品中的CLDN18.2，例如通過向患者施用人源化抗CLDN18.2抗體並檢測與CLDN18.2結合的人源化抗CLDN18.2抗體(例如，體內或離體)，或者，例如通過使來自患者的樣品與人源化抗CLDN18.2抗體接觸，並定性或定量地檢測與CLDN18.2蛋白結合的人源化抗CLDN18.2抗體。
人源化抗CLDN18.2抗體是以足夠的親和力和特異性結合CLDN18.2的抗體。例如，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其生物活性片段)可用作靶向和干擾與畸變/異常CLDN18.2表達和/或活性相關的疾病或病症的治療劑。在一些實施方案中，人源化抗CLDN18.2抗體是單株抗體。在一些實施方案中，所述人源化抗CLDN18.2抗體包含本發明公開的抗體的至少一個CDR、重鏈可變結構域(VH)和/或輕鏈可變結構域(VL)。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)(或其抗原結合片段)包含CDR-H2，所述CDR-H2包含IIIGGIYT(SEQ ID NO：6)。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段進一步包含：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：1和85-93中的任一個；(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：2或94；(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：3和95-105中的任一個；(d)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：4和66-74的任一個；和(e)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：7、75-84和108中的任一個。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含(a)CDR-L1，其包含QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO：1)；(b)CDR-L2，其包含WAS(SEQ ID NO：2)；(c)CDR-L3，其包含QNNYIYPFT(SEQ ID NO：3)；(d)CDR-H1，其包含GFTFSNYA(SEQ ID NO：4)；(e)CDR-H2，其包含IIIGGTYT(SEQ ID NO：5)或IIIGGIYT(SEQ ID NO：6)；和(e)CDR-H3，其包含ARQVYGNSFAY(SEQ ID NO：7)。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含(a)CDR-L1，其包含QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO：1)；(b)CDR-L2，其包含WAS(SEQ ID NO：2)；(c)CDR-L3，其包含QNNYIYPFT(SEQ ID NO：3)；(d)CDR-H1，其包含GFTFSNYA(SEQ ID NO：4)；(e)CDR-H2，其包含IIIGGTYT(SEQ ID NO：5)；和(e)CDR-H3，其包含ARQVYGNSFAY(SEQ ID NO：7)。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含(a)CDR-L1，其包含QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO：1)；(b)CDR-L2，其包含WAS(SEQ ID NO：2)；(c)CDR-L3，其包含QNNYIYPFT(SEQ ID NO：3)；(d)CDR-H1，其包含GFTFSNYA(SEQ ID NO：4)；(e)CDR-H2，其IIIGGIYT(SEQ ID NO：6)；和(e)CDR-H3，其包含ARQVYGNSFAY(SEQ ID NO：7)。在一些實施方案中，CDRs根據IMGT CDR編號方案定義，如在www(dot)imgt(dot)org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition(dot)html中所描述。SEQ ID NO：1-7的氨基酸序列提供於下表1中。 [表1]
QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO ： 1) WAS(SEQ ID NO ： 2) QNNYIYPFT(SEQ ID NO ： 3) GFTFSNYA(SEQ ID NO ： 4)
IIIGGTYT(SEQ ID NO ： 5) IIIGGIYT(SEQ ID NO ： 6) ARQVYGNSFAY(SEQ ID NO ： 7) GFTFSDYG(SEQ ID NO ： 66)
GFTFSDYG(SEQ ID NO ： 67) GYSFTGYN(SEQ ID NO ： 68) GYTFTVWS (SEQ ID NO：69) GFTFSNNA(SEQ ID NO ： 70)
GFTFSDYG(SEQ ID NO ： 71) GFSFSDYG(SEQ ID NO ： 72) GYTFTSWS(SEQ ID NO ： 73) GYSFTGYN(SEQ ID NO ： 74)
IARGNAMDY(SEQ ID NO ： 75) FARGNVLDY(SEQ ID NO ： 76) PYYGNSFDY(SEQ ID NO ： 77) AYYGNSFAY(SEQ ID NO ： 78)
FVRGNSMDY(SEQ ID NO ： 79) FARGNTMDY(SEQ ID NO ： 80) FTRGNALDY(SEQ ID NO ： 81) FVRGNALDY(SEQ ID NO ： 82)
FARGNTLDY(SEQ ID NO ： 83) FARGNAMDY(SEQ ID NO ： 84) QSLLNSGNQRNY(SEQ ID NO ： 85) QSLLNSGNLRNY(SEQ ID NO ： 86)
QSLLNSGNQRNY(SEQ ID NO ： 87) QSLLNSGNQRNY(SEQ ID NO ： 88) QSLFNTGNQKNY(SEQ ID NO ： 89) QSLFNSGNQRNY(SEQ ID NO ： 90)
QILLNSGNQKNY(SEQ ID NO ： 91) QSLFNSENQKNY(SEQ ID NO ： 92) QSLLNSGNLKNY(SEQ ID NO ： 93) WTS(SEQ ID NO ： 94)
QNDYFYPLT(SEQ ID NO ： 95) QNGYSYPLT(SEQ ID NO ： 96) QDGYFYPFP(SEQ ID NO ： 97) QNDFIYPFT(SEQ ID NO ： 98)
QNNYFYPFT(SEQ ID NO ： 99) QNDYSYPLT(SEQ ID NO ： 100) QNAYSYPLT(SEQ ID NO ： 101) QNAYSFPLT(SEQ ID NO ： 102)
QNDYIYPLT(SEQ ID NO ： 103) QNNYYYPLT(SEQ ID NO ： 104) QNDYYYPFT(SEQ ID NO ： 105) HVRGNSFDY(SEQ ID NO ： 108)
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：輕鏈可變結構域(VL)，所述輕鏈可變結構域(VL)包含(諸如由其組成)：在SEQ ID NO：55-58中的任一個的氨基酸序列；和/或重鏈可變結構域(VH),所述重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：59-65中的任一個的氨基酸序列。SEQ ID NO：55-65的氨基酸序列提供於下表2中： [表2]
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLLNSGNQKNYMTWYQQKPGKAPKLLIYWASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNNYIYPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：55)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSLLNSGNQKNYMNWYQQKPGKAPKLLIYWASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNNYIYPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：56)
DIVMTQSPDSLTVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFSLTISSLQAEDVAVYYCQNNYIYPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：57)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNNYIYPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：58)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAWNWIRQAPGKGLEWVASIIIGGTYTNYNPSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：59)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSNYAWNWIRQAPGKGLEWVASIIIGGTYTNYNPSVKGRITISRDDSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：60)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMHWIRQAPGKGLEWVAVIIIGGTYTYYADSVKGRFAISRDNPKNTLFLQMNSLRPDDTAVYYCARQVYGNSFAYWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO：61)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWIRQAPGKGLEWVSTIIIGGIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：62)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWIRQAPGKGLEWVATIIIGGIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：63)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWIRQAPGKGLEWVSTIIIGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：64)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWIRQAPGKGLEWVATIIIGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：65)
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：輕鏈可變結構域(VL)的一個、兩個或三個CDR，所述輕鏈可變結構域(VL)包含(諸如由其組成)：在SEQ ID NO：55-58中的任一個的氨基酸序列；或重鏈可變結構域(VH)的一個、兩個或三個CDR，所述重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：59-65中的任一個的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：輕鏈可變結構域(VL)的一個、兩個或三個CDR，所述輕鏈可變結構域(VL)包含(諸如由其組成)：在SEQ ID NO：55-58中的任一個的氨基酸序列；和重鏈可變結構域(VH)的一個、兩個或三個CDR，所述重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：59-65中的任一個的氨基酸序列。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：59。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：60。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：61。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：62。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：63。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：63。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：59。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL(結構域)，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：60。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：61。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：62。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：63。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：63。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：59。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：60。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：61。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：62。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：63。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：63。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL(結構域)，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：59。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：60。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：61。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：62。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：63。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：63。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55的氨基酸序列；和/或VH(結構域)，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：59。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：64。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：60。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：64。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：61。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：64。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：62。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：64。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：59。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：55；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：65。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：60的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：60。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：56；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：65。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：61。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：57；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：65。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和/或VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL結構域的3個CDR，所述VL結構域包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域的3個CDR，所述VH結構域包含SEQ ID NO：62。在一些實施方案中，CDR根據IMGT編號方案、Chothia編號方案、Kabat編號方案、Martin(增強型Chothia)編號方案、AbM編號方案或Aho編號方案定義。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)包含：VL結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：58；和VH結構域，其包含(諸如由以下組成)SEQ ID NO：65。
在一些實施方案中，本發明提供抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變結構域(VL)和重鏈可變結構域(VH)，其中VL結構域包含(i)框架區1(FW1)，其包含SEQ ID NO：34、37、39或20；(ii)框架區2(FW2)，其包含SEQ ID NO：35、38或40；(iii)框架區3(FW3)，其包含SEQ ID NO：36或22；以及(iv)框架區4(FW4)，其包含SEQ ID NO：19；並且其中VH包含：(i)框架區1(FW1)，其包含SEQ ID NO：41、44、46或49；(ii)框架區2(FW2)，其包含SEQ ID NO：42、47、50或52；(iii)框架區3(FW3)，其包含SEQ ID NO：43、45、48或51；以及(iv)框架區4(FW4)，其包含SEQ ID NO：26或30。
SEQ ID NO：19、20、22、26、30和34-52的氨基酸序列提供於實施例1的表A-C中，其再現如下： [表A.全鼠和全人可變區的非CDR序列]
Figure 02_image001
Figure 02_image003
[表B.人源化回復突變輕鏈(LC)可變區的非CDR序列]
Figure 02_image005
Figure 02_image007
[粗體和底線氨基酸表示鼠序列的回復突變] [表C.人源化回復突變重鏈（HC）可變區的非CDR序列]
Figure 02_image009
Figure 02_image011
[粗體和底線氨基酸表示鼠序列的回復突變]
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含VL，所述VL包含：(i)FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含SEQ ID NO：19；(ii)FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含SEQ ID NO：19；(iii)FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含SEQ ID NO：19；或(iv)FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含SEQ ID NO：19。另外或可選地，在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含VH，所述VH包含：(i)FW1，其包含SEQ ID NO：41；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：43；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(ii)FW1，其包含SEQ ID NO：44；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：45；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(iii)FW1，其包含SEQ ID NO：46；FW2，其包含SEQ ID NO：47；FW3，其包含SEQ ID NO：48；和FW4，其包含SEQ ID NO：30；(iv)FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(v)FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；(vi)FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；或(vii)FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34，FW2，其包含SEQ ID NO：35，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41，FW2，其包含SEQ ID NO：42，FW3，其包含SEQ ID NO：43，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34，FW2，其包含SEQ ID NO：35，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：44，FW2，其包含SEQ ID NO：42，FW3，其包含SEQ ID NO：45，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34，FW2，其包含SEQ ID NO：35，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：46，FW2，其包含SEQ ID NO：47，FW3，其包含SEQ ID NO：48，和FW4，其包含SEQ ID NO：30。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34，FW2，其包含SEQ ID NO：35，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：50，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34，FW2，其包含SEQ ID NO：35，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：52，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37，FW2，其包含SEQ ID NO：38，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41，FW2，其包含SEQ ID NO：42，FW3，其包含SEQ ID NO：43，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37，FW2，其包含SEQ ID NO：38，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：44，FW2，其包含SEQ ID NO：42，FW3，其包含SEQ ID NO：45，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。(在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37，FW2，其包含SEQ ID NO：38，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：46，FW2，其包含SEQ ID NO：47，FW3，其包含SEQ ID NO：48，和FW4，其包含SEQ ID NO：30。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37，FW2，其包含SEQ ID NO：38，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：50，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37，FW2，其包含SEQ ID NO：38，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：52，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；且VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41，FW2，其包含SEQ ID NO：42，FW3，其包含SEQ ID NO：43，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：44，FW2，其包含SEQ ID NO：42，FW3，其包含SEQ ID NO：45，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：46，FW2，其包含SEQ ID NO：47，FW3，其包含SEQ ID NO：48，和FW4，其包含SEQ ID NO：30。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：50，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：52，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41，FW2，其包含SEQ ID NO：42，FW3，其包含SEQ ID NO：43，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：44，FW2，其包含SEQ ID NO：42，FW3，其包含SEQ ID NO：45，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：46，FW2，其包含SEQ ID NO：47，FW3，其包含SEQ ID NO：48，和FW4，其包含SEQ ID NO：30。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：50，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：52，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34，FW2，其包含SEQ ID NO：35，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：50，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37，FW2，其包含SEQ ID NO：38，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：50，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：50，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：50，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34，FW2，其包含SEQ ID NO：35，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：52，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(例如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37，FW2，其包含SEQ ID NO：38，FW3，其包含SEQ ID NO：36，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：52，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：52，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20，FW2，其包含SEQ ID NO：40，FW3，其包含SEQ ID NO：22，和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；和VH，所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49，FW2，其包含SEQ ID NO：52，FW3，其包含SEQ ID NO：51，和FW4，其包含SEQ ID NO：26。
在一些實施方案中，抗CLDN抗體(諸如人源化抗體)或其抗原結合片段包含：VL，其包含本發明所述的FW1、FW2、FW3和FW4序列；和VH，其包含本發明所述的FW1、FW2、FW3，和FW4序列；還包含例如在PCT/CN2019/078150中描述的抗CDLN抗體的6個互補性決定區(CDR)，所述文獻的內容通過引用整體併入本發明。
在一些實施方案中，提供了本發明所述的抗CLDN18.2抗體(諸如人源化抗體)或其片段的氨基酸序列變體(“抗CLDN18.2抗體變體”)。例如，可能需要改善抗CLDN18.2抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。抗CLDN18.2抗體的氨基酸序列變體可通過在編碼抗體試劑的核苷酸序列中引入適當的修飾或通過肽合成來製備。這樣的修飾包括例如抗體試劑的氨基酸序列內的殘基的刪除和/或插入和/或取代。可以進行刪除、插入和取代的任何組合以獲得最終構建體，條件是最終構建體具有所需的特徵，例如抗原結合。
在一些實施方案中，提供了具有一個或多個氨基酸取代的抗CLDN18.2抗體變體。用於取代誘變的目標位元點包括HVR和FR。可以將氨基酸取代引入到感興趣的抗體試劑中，並篩選具有期望活性的產物，例如保留的/改善的抗原結合，降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
示例性的取代變體是親和力成熟的抗體試劑，其可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術來方便地產生。簡單地說，使一個或多個CDR殘基突變，並且在噬菌體上展示變體抗體部分，並且針對特定的生物活性(例如，結合親和力)進行篩選。可以在HVR中進行改變(例如取代)以改善抗體親和力。這樣的改變可以在HVR“熱點”中進行，即，在由在體細胞成熟過程中以高頻率經歷突變的密碼子編碼的殘基中進行(參見，例如，see ,e.g., Chowdhury,Methods Mol.Biol. 207:179-196 (2008))，和/或在特異性確定殘基(SDR)中進行，測試所得變體VH 或VL 的結合親和力。例如，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brienet al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))中已經描述了通過從二級文庫構建和重新選擇的親和力成熟。
在親和力成熟的一些實施方案中，通過多種方法(例如易錯PCR、鏈重排或寡核苷酸定向誘變)中的任一種將多樣性引入用於成熟選擇的可變基因中。然後創建二級文庫。然後篩選文庫以鑒定具有期望親和力的任何抗體試劑變體。引入多樣性的另一種方法涉及HVR-定向途徑，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。涉及抗原結合的HVR殘基，可以例如使用丙氨酸掃描誘變或建模，被特異性地鑒定。通常特定地靶向CDR-H3和CDR-L3。
在一些實施方案中，取代、插入或刪除可以發生在一個或多個HVR內，只要這樣的改變基本上不降低抗體試劑與抗原結合的能力。例如，可以在HVR中進行基本上不降低結合親和力的保守改變(例如，本發明提供的保守取代)。這些改變可以在HVR“熱點”或SDR之外。在以上提供的變體VH和VL序列的一些實施方案中，每個HVR或者是未改變的，或者含有不超過一個、兩個或三個氨基酸取代。
如Cunningham and Wells (1989)Science , 244:1081-1085所述，鑒定可靶向突變的抗體試劑的殘基或區域的有用方法稱為“丙氨酸掃描突變”。在該方法中，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys和glu)，並用中性或帶負電荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以確定抗體試劑與抗原的相互作用是否受影響。可以在氨基酸位置引入進一步的取代，表明對初始取代的功能敏感性。可選地或另外，可測定抗原-抗體試劑複合物的晶體結構以鑒定抗體試劑和抗原之間的接觸點。這樣的接觸殘基和相鄰殘基可以作為用於取代的候選物被靶向或消除。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括在長度上從一個殘基到含有一百個或更多個殘基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有N-末端甲硫氨醯基殘基的抗體試劑。抗體試劑分子的其它插入變體包括抗體試劑的N-或C-末端與酶(例如用於ADEPT)或增加抗體試劑的血清半衰期的多肽的融合。
在某些實施方案中，抗CLDN抗體變體中的氨基酸取代是保守氨基酸取代。在某些實施方案中，抗CLDN抗體變體中的氨基酸取代是非保守氨基酸取代。在某些實施方案中，氨基酸取代基本上不降低抗體與抗原結合的能力。例如，可以進行基本上不降低CLDN18.2結合親和力的保守改變(例如，本發明提供的保守取代)。抗CLDN18.2抗體對CLDN18.2的結合親和力可使用以下實施例中所述的方法評估。
保守取代示於表3中“保守取代”的標題下。在表3的“示例性取代”標題下提供了更實質性的改變，以及如以下關於氨基酸側鏈類別的進一步描述。可以將氨基酸取代引入興趣抗體中，並篩選具有期望活性的產物，例如保留的/改善的CLDN18.2結合。 [表3：氨基酸取代]
原始殘基 示例性的取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu (L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
非保守取代需要將這些類別之一的成員替換為另一類別。示例性替代變體是親和力成熟的抗體，其可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術(例如本發明所述的那些技術)方便地產生。簡單地說，使一個或多個CDR殘基突變，並且在噬菌體上展示變體抗體，並且針對特定的生物活性(例如，結合親和力)進行篩選。可以在HVR中進行改變(例如取代)以改善抗體親和力。這樣的改變可以在HVR“熱點”中進行，即，在由在體細胞成熟過程中以高頻率經歷突變的密碼子編碼的殘基中進行(參見，例如，see,e.g., Chowdhury,Methods Mol.Biol. 207:179-196 (2008))，和/或在SDR中進行，測試所得變體VH或VL的結合親和力。例如，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brienet al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)中已經描述了通過從二級文庫構建和重新選擇的親和力成熟)。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體與CLDN18.2蛋白(或其片段)的至少一種等位基因變體交叉反應。在一些實施方案中，當與天然存在的CLDN18.2(或其片段)相比時，等位基因變體具有至多約30個(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個)氨基酸取代(諸如保守取代)。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體不與CLDN18.2蛋白(或其片段)的任何等位基因變體交叉反應。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(或抗體變體)與來自至少兩個不同物種的CLDN18.2蛋白結合(例如，與之交叉反應)。在一些實施方案中，例如，抗CLDN18.2抗體(或抗體變體)與來自小鼠、大鼠或非人靈長類動物(諸如食蟹猴或恆河猴)的人CLDN18.2蛋白(或其片段)和CLDN18.2蛋白(或其片段)結合。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體可以完全對人CLDN18.2有特異性並且可以不顯示物種或其它類型的非人交叉反應性。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體試劑特異性識別在癌細胞(諸如實體瘤細胞)的細胞表面上表達的CLDN18.2。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體試劑特異性識別在表面腫瘤細胞或癌性組織(例如，胃癌細胞、食管癌細胞、胃食管交界癌細胞、膽管癌細胞、胰腺癌細胞、卵巢癌細胞、肝癌細胞、頭頸癌細胞、膽囊癌細胞、結腸癌細胞和肺癌細胞)上表達的CLDN18.2。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體試劑特異性識別在一種或多種癌細胞系的細胞表面上表達的CLDN18.2，所述癌細胞系包括但不限於例如，KATO III(ATCC HTB-103)和NUGC-4(JCRB0834)。
在某些實施方案中，抗CLDN18.2抗體與CLDN18.2結合，但不是CLDN 18.1。在某些實施方案中，抗CLDN18.2抗體與CLDN18.2和CLDN18.1兩者結合。在某些實施方案中，抗體對CLDN18.2的結合親和力比其對CLDN18.1的結合親和力更強。在一些實施方案中，所述抗體對CLDN18.2和CLDN18.1具有相當的親和力，例如，與CLDN18.2結合的抗體和與CLDN18.1結合的抗體的EC50 和/或Kd 值在小於約10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍或1.5倍中的任一個的範圍內，如通過本領域熟知的方法(如本發明別處所述)所測定。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體(任何形式)以約10-7 M至約10-13 M(諸如約10-7 M至約10-13 M，約10-9 M至約10-13 M，或約10-10 M至約10-12 M)的Kd 特異性地與CLDN18.2結合。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體與非靶蛋白之間的結合的Kd 大於抗CLDN18.2抗體與CLDN18.2之間的結合的Kd 。在一些實施方案中，所述非靶蛋白不是CLDN18.2。在一些實施方案中，所述非靶蛋白是CLDN18.1。在一些實施方案中，所述非靶蛋白不是CLDN18.1。在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體與非靶蛋白結合的Kd 可以比抗CLDN18.2抗體與靶CLDN18.2之間的結合的Kd 大至少約10倍，諸如約10-100倍、約100-1000倍、約103 -104 倍、約104 -105 倍、約105 -106 倍、約106 -107 倍、約107 -108 倍、約108 -109 倍、約109 -1010 倍、約1010 -1011 倍或約1011 -1012 倍。
在一些實施方案中，本發明提供的與CLDN18.2特異性地結合的抗CLDN18.2抗體與不同於由IMAB362結合的CLDN18.2的表位的CLDN18.2上的表位(例如，人CLDN18.2)結合。在一些實施方案中，本發明提供的與CLDN18.2特異性結合的抗CLDN18.2抗體與不與由IMAB362結合的CLDN18.2的表位重疊的CLDN18.2上的表位(例如人CLDN18.2)結合。IMAB362(也稱為zolbetuximab或claudiximab)是與CLDN18.2結合的嵌合單株抗體。
在某些實施方案中，抗體包含人IgG的Fc序列，人IgG例如人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。在某些實施方案中，Fc序列已被更改或以其它方式改變，使得其缺乏抗體依賴性細胞毒性(ADCC)效應子功能，通常與它們與Fc受體(FcR)的結合相關。存在可以更改效應子功能的Fc序列的改變或突變的許多實例，包括但不限於本發明別處描述的那些。例如，WO 00/42072和Shieldset al.J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)描述了與FcR的結合改善或減弱的抗體變體。這些出版物的內容在本發明特別引入作為參考。抗體可以是Fab、Fab’、F(ab)’2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段；雙抗和線性抗體。此外，抗體可以是與CLDN18.2結合但也與一種或多種其它靶標結合並抑制其功能的多特異性抗體。所述抗體可以與治療劑(例如，細胞毒性劑、放射性同位素和化療劑)或用於通過成像(例如，放射性同位素、螢光染料和酶)在患者樣品或體內檢測CLDN18.2的標記綴合。其它修飾包括毒素與本發明提供的抗CLDN18.2抗體的綴合。 [編碼人源化抗Claudin 18.2抗體的核酸]
還考慮了編碼本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體的核酸分子。在一些實施方案中，提供了編碼人源化抗CLDN18.2抗體(包括本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體的任一個)的核酸(或一組核酸)。在一些實施方案中，本發明描述的編碼人源化抗CLDN18.2抗體的核酸(或一組核酸)可進一步包含編碼肽標籤(諸如蛋白質純化標籤，例如His標籤、HA標籤)。
這裡還考慮了分離的宿主細胞，其包含：人源化的抗CLDN18.2抗體；分離的核酸，其編碼人源化的抗CLDN18.2抗體的多肽組分；以及載體，其包含編碼本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體的多肽組分的核酸。
本發明還包括這些核酸序列的變體。例如，變體包括在至少中等嚴格的雜交條件下與編碼本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體的核酸序列雜交的核苷酸序列。
本發明還提供了其中插入了本發明的核酸的載體。
簡而言之，編碼人源化抗CLDN18.2抗體的天然或合成核酸對人源化抗CLDN18.2抗體的表達可以通過將核酸插入合適的表達載體來實現，使得核酸可操作地連接至與5'和3'調節元件，包括例如啟動子(例如，淋巴細胞特異性啟動子)和3'非翻譯區(UTR)。該載體可適用於真核宿主細胞的複製和整合。典型的克隆(cloning)和表達載體含有轉錄和翻譯終止子、起始序列和用於調節期望核酸序列表達的啟動子。
使用標準基因遞送方案，本發明的核酸也可用於核酸免疫和基因治療。基因轉運的方法是本領域熟知的。參見，例如，美國專利No.5,399,346、5,580,859、5,589,466，通過引用將其整體併入本文。在一些實施方案中，本發明提供了一種基因治療載體。
可將核酸克隆到多種類型的載體中。例如，可以將核酸克隆到載體中，所述載體包括但不限於質粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和粘粒。特別感興趣的載體包括表達載體、複製載體、探針產生載體和測序載體。
此外，所述表達載體可以病毒載體的形式提供給細胞。病毒載體技術在本領域中是眾所周知的，並且已被描述於例如Sambrooket al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)，以及其他病毒學和分子生物學手冊。可用作載體的病毒包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包含在至少一個生物體中有功能的複製起點、啟動子序列、方便的限制性內切核酸酶位點和一個或多個可選擇標記(參見，例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美國專利No. 6,326,193)。
已經開發了許多基於病毒的系統用於將基因轉移到哺乳動物細胞中。例如，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供了方便的平臺。可以使用本領域已知的技術將選擇的基因插入載體並包裝在逆轉錄病毒顆粒中。然後可以分離重組病毒並在體內或離體遞送至受試者的細胞。許多逆轉錄病毒系統是本領域已知的。在一些實施方案中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體是本領域已知的。在一些實施方案中，使用慢病毒載體。衍生自諸如慢病毒的逆轉錄病毒的載體是實現長期基因轉移的合適工具，因為它們允許轉基因的長期、穩定的整合及其在子細胞中的增殖。慢病毒載體相對於衍生自諸如鼠白血病病毒的瘤逆轉錄病毒的載體具有額外的優點，因為它們可以轉導非增殖細胞，諸如肝細胞。它們還具有低免疫原性的附加優點。
另外的啟動子元件，例如增強子，調節轉錄起始的頻率。通常，它們位於起始位點上游30-110 bp的區域，儘管最近已經顯示許多啟動子也含有起始位點下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔經常是柔性的，使得當元件相對於彼此倒置或移動時保持啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可以增加至相距50 bp，之後活性開始下降。
合適的啟動子的一個實例是立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列是能夠驅動與其可操作連接的任何多核苷酸序列的高水平表達的強組成型啟動子序列。合適的促進劑的另一個實例是延長生長因數-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、莫洛尼(MoMuLV)啟動子、鳥白血病病毒啟動子，埃巴(EB)病毒立即早期啟動子、勞斯(Rous)肉瘤病毒啟動子以及人基因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子和肌酸激酶啟動子。此外，本發明不應限於使用組成型啟動子。誘導型啟動子也被考慮作為本發明的一部分。使用誘導型啟動子提供了分子開關，當期望這種表達時，該分子開關能夠接通與其可操作連接的多核苷酸序列的表達，或者當不期望表達時關閉該表達。誘導型啟動子的實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子和四環素啟動子。
在一些實施方案中，所述人源化抗CLDN18.2抗體試劑的表達是誘導型的。在一些實施方案中，編碼抗CLDN18.2抗體試劑的核酸序列可操作地連接至誘導型啟動子，包括本文所述的任何誘導型啟動子。 [抗體生產方法]
本發明的抗體可以通過本領域已知的任何方法產生。下面描述用於抗體生產的示例性技術；然而，這些示例性技術僅僅是為了說明的目的而提供的，並不旨在是限制性的。此外，進一步描述了預期與本發明所述抗體一起使用的示例性抗體特性。
為了製備抗原，可以純化抗原或者從天然來源獲得抗原，或者可以使用重組技術表達抗原。在一些實施方案中，抗原可用作可溶性蛋白質。在一些實施方案中，抗原可以綴合至另一多肽或其它部分，例如，以增加其免疫原性。例如，本文所述的抗原可以與Fc區偶聯。在一些實施方案中，在其細胞表面上表達抗原的細胞可用作抗原。
可以通過多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射抗原和佐劑在動物中產生多株抗體。例如，本發明描述了雞免疫的描述。在一些實施方案中，使用雙功能或衍生化試劑使抗原與免疫原性蛋白質綴合，所述免疫原性蛋白質例如是鑰孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。本發明提供了用於雞免疫的示例性方法。適用於諸如哺乳動物的各種其它生物體的相關方法是本領域熟知的。
如上所述，單株抗體可通過多種方法產生。在一些實施方案中，本發明的單株抗體使用雜交瘤方法製備,該方法首次描述於Kohleret al. ,Nature , 256:495 (1975)，並且在Hongoet al. ,Hybridoma , 14 (3): 253-260 (1995)；Harlowet al. ,Antibodies: A Laboratory Manual , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；以及Hammerling等人，在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)中進一步描述。人雜交瘤技術(Trioma technology)描述於Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005)和Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)。 可以例如通過體外結合測定、免疫沉澱、ELISA、RIA等在其中生長有雜交瘤細胞的培養基中篩選興趣抗體的存在，且結合親和力可以通過例如Scatchard分析來確定。產生具有期望結合特性的抗體的雜交瘤可以使用已知的培養技術進行亞克隆和生長，在動物中作為腹水腫瘤進行體內生長等。
在一些實施方案中，使用諸如噬菌體展示文庫的文庫方法來製備單株抗體。參見，例如，Hoogenboom等人，在Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)中所描述。在一些實施方案中，通過聚合酶鏈反應(PCR)克隆VH和VL基因的所有組成成分，並在噬菌體文庫中隨機重組，然後篩選抗原結合的噬菌體，例如，如Winter等人，在JWinter et al.,Ann. Rev. Immunol. , 12: 433-455 (1994)中所描述。噬菌體通常展示抗體片段，作為單鏈Fv(scFv)片段或作為Fab片段。或者，可克隆(例如，來自人)所有幼稚組成成分，以提供針對廣泛的非自身以及自身抗原的單一抗體來源，而無需如Griffiths等人，在EMBO J, 12: 725-734 (1993)中所述的任何免疫。最後，如Hoogenboom and Winter,J. Mol. Biol. , 227: 381-388 (1992)所述，通過從幹細胞克隆未重排的V-基因片段，並使用含有隨機序列的PCR引物來編碼高度可變的CDR3區並在體外完成重排，也可以合成地製備天然文庫。
在一些實施方案中，本發明的抗體是雞抗體。可以使用本領域已知的各種技術生產雞抗體；參見，例如，美國專利No. 6,143,559；8,592,644；和9,380,769。
在一些實施方案中，本發明的抗體是嵌合抗體。參見，例如，美國專利No. 4,816,567和Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984)。在一些實施方案中，嵌合抗體包含非人可變區(例如，來自雞、小鼠、大鼠、倉鼠、兔或諸如猴的非人靈長類動物的可變區)和人恆定區。在一些實施方案中，嵌合抗體是“類別轉換的”抗體，其中類別或亞類已經從親本抗體的類別或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在一些實施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。可以將非人抗體人源化以降低對人的免疫原性，同時保持親代非人抗體的特異性和親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個可變結構域，其中，HVR，例如CDR(或其部分)，衍生自非-人抗體(例如雞抗體)，並且FR(或其部分)衍生自人抗體序列。人源化抗體任選地還包含人恆定區的至少一部分。在一些實施方案中，人源化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體(例如，衍生自所述抗體的HVR或CDR殘基)的相應殘基取代，例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。在Almagro和Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中綜述了人源化抗體及其製備方法。例如，在WO2005014653中還描述了將雞抗體人源化的方法。
對於人源化有用的人框架區包括但不限於：使用“最佳匹配”方法選擇的框架區域；來自輕或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列的框架區；人體細胞突變框架區或人種系框架區；和衍生自篩選FR庫的框架區。參見，例如，Simset al.J. Immunol. 151:2296 (1993)；Carteret al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285 (1992)；Prestaet al. J. Immunol. , 151:2623 (1993)；Almagro and Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)；和Baca et al.,J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)。
在一些實施方案中，本發明的抗體是人抗體。人抗體可以使用本領域已知的各種技術產生。在一些實施方案中，人抗體由非人動物產生，諸如基因工程雞(參見例如美國專利No8,592,644和9,380,769)和/或本發明所述的小鼠產生。人抗體一般描述於Lonberg,Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)。
在一些實施方案中，本發明的抗體是抗體片段，包括但不限於Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv或scFv片段、或單結構域、單重鏈或單輕鏈抗體。抗體片段可以例如通過酶消化或重組技術產生。在一些實施方案中，使用完整抗體的蛋白水解消化來產生抗體片段，例如，如在Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)和Brennan et al.,Science , 229:81 (1985)中所述。在一些實施方案中，通過重組宿主細胞產生抗體片段。 例如，Fab、Fv和ScFv抗體片段由大腸桿菌表達並從大腸桿菌分泌。或者可從抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。
可以從大腸桿菌中直接回收Fab'-SH片段並化學偶聯以形成F(ab')2 片段。參見Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167 (1992)。F(ab')2 片段也可以直接從重組宿主細胞培養物中分離。具有增加的體內半衰期、包含挽救受體結合表位殘基的Fab和F(ab')2 片段描述於美國專利No.5,869,046。
在一些實施方案中，抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185和美國專利No.5,571,894和5,587,458。可以構建scFv融合蛋白以在scFv的氨基或羧基末端產生效應蛋白的融合體。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如，如美國專利No.5,641,870。這樣的線性抗體可以是單特異性的或雙特異性的。
在一些實施方案中，本發明的抗體是多特異性抗體。多特異性抗體具有針對多於一種抗原的結合特異性(例如，具有兩種、三種或更多種結合特異性的抗體)。在一些實施方案中，抗體是雙特異性抗體。在一些實施方案中，雙特異性抗體包含針對同一抗原的兩種不同的結合特異性(例如，針對同一抗原具有不同的結合親和力和/或特異性表位)。在一些實施方案中，雙特異性抗體包含對兩種不同抗原的結合特異性。在一些實施方案中，雙特異性抗體是全長或完整抗體。在一些實施方案中，雙特異性抗體是本發明的抗體片段。
用於產生和純化雙特異性抗體的各種方法是本領域已知的。已經描述了許多方法。一種途徑是“杵臼”或“突起-進入-空腔”途徑(參見，例如，美國專利No.5,731,168)。在一些實施方案中，Fc結構域單體的異二聚化通過在兩個Fc結構域單體中引入不同的但相容的取代來促進，諸如“杵臼”殘基對和電荷殘基對。杵和臼相互作用有利於異二聚體的形成，而杵-杵和臼-臼相互作用由於有利相互作用的空間碰撞和缺失而阻礙同二聚體的形成。臼是指當蛋白質中的原始氨基酸被具有較小側鏈體積的不同氨基酸替代時產生的空隙。杵是指當蛋白質中的原始氨基酸被具有較大側鏈體積的不同氨基酸替代時產生的凸起。例如，在一些實施方案中，被置換的氨基酸在Fc結構域單體的CH3抗體恆定結構域中並且參與兩個Fc結構域單體的二聚化。在一些實施方案中，在一個CH3抗體恆定結構域中產生臼以容納另一個CH3抗體恆定結構域中的杵，使得杵和臼氨基酸起到促進或有利於兩個Fc結構域單體的異源二聚化的作用。在一些實施方案中，在一個CH3抗體恆定結構域中產生臼以更好地容納另一個CH3抗體恆定結構域中的原始氨基酸。在一些實施方案中，一個CH3抗體恆定結構域中產生杵以與另一個CH3抗體恆定結構域中的原始氨基酸形成額外的相互作用。
在一些實施方案中，通過用具有較小側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸或蘇氨酸)置換具有較大側鏈的氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)來構建臼，例如在CH3抗體恆定結構域中的Y407V突變。類似地，在一些實施方案中，通過用具有較大側鏈的氨基酸置換具有較小側鏈的氨基酸來構建杵，例如在CH3抗體恆定結構域中的T366W突變。在一些實施方案中，一個Fc結構域單體包含杵突變T366W，並且另一個Fc結構域單體包含臼突變T366S、L358A和Y407V。杵-臼氨基酸對的實例包括但不限於表4中所示的那些。 [表4.杵-臼氨基酸突變]
Fc結構域單體1 Y407T Y407A F405A T394S T366S L358A Y407V T394W Y407T T394S Y407A T366W T394S
Fc結構域單體2 T366Y T366W T394W F405W T366W T366Y F405A T366W F405W F405W Y407A
另一種途徑使用具有期望結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區，其與免疫球蛋白恆定結構域序列融合，例如與包含鉸鏈區CH2區和CH3區的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恆定結構域融合。在一些實施方案中，雙特異性抗體具有在一個臂中具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和在另一個臂中具有雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)。參見WO 94/04690。另一種方法使用交聯(參見，例如，美國專利No.4,676,980)以產生異源綴合抗體。在一些實施方案中，雙特異性抗體可以使用化學連接(參見，例如，Brennan et al.,Science , 229: 81 (1985))來製備，以蛋白水解地將完整抗體裂解成F(ab')2 片段，所述片段在二硫醇絡合劑的存在下被還原並轉化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物，其中一種通過還原重新轉化為Fab’-硫醇並與另一種Fab’-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。在一些實施方案中，Fab’-SH片段被化學偶聯。在一些實施方案中，使用亮氨酸拉鍊在細胞培養物中產生雙特異性抗體片段，如Kostelny et al.,J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992)所述。對於其它雙特異性抗體形式，參見，例如，Spiess, C.et al. (2015)Mol. Immunol. 67:95-106。
在一些實施方案中，本發明的抗體是雙抗,參見,例如Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993)；在雙抗中，一個片段的VH 和VL 結構域與另一片段的互補VL 和VH 結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。還已經報導了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體製備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber et al,J. Immunol , 152:5368 (1994)。
在一些實施方案中，本發明的抗體是單結構域抗體。單結構域抗體是指包含抗體的全部或部分重鏈可變結構域或全部或部分輕鏈可變結構域的單個多肽鏈。在某些實施方案中，單結構域抗體是人單結構域抗體(參見，例如，美國專利No.6,248,516 B1)。在一個實施方案中，單結構域抗體包括抗體的重鏈可變結構域的全部或一部分。駱駝科動物抗體也是已知的。
可以使用重組方法產生抗體。為了重組產生抗抗原抗體，將編碼抗體的核酸分離並插入可複製載體中用於進一步克隆(DNA擴增)或用於表達。使用常規步驟(例如，通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)，可以容易地分離和測序編碼抗體的DNA。許多載體是可用的。載體元件通常包括但不限於以下的一種或多種：信號傳導序列、複製起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。
本發明的抗體可以作為融合多肽與異源多肽(例如，信號傳導序列或在成熟蛋白質或多肽的N末端具有特異性切割位點的其他多肽)重組產生。所選擇的異源信號傳導序列可以是被宿主細胞識別和加工(例如，通過信號肽酶切割)的信號傳導序列。對於不識別和處理天然抗體信號傳導序列的原核宿主細胞而言，所述信號傳導序列被選自例如鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定腸毒素II前導序列的原核信號傳導序列取代。對於酵母分泌，天然信號傳導序列可被例如以下取代：酵母轉化酶前導序列、因數前導序列(包括酵母屬(Saccharomyces )和克魯維酵母屬(Kluyveromyces )α-因數前導序列)或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌(C. albicans )葡糖澱粉酶前導序列等。在哺乳動物細胞表達中，可獲得哺乳動物信號傳導序列以及病毒分泌前導序列，例如單純皰疹gD信號。
表達和克隆載體都含有使載體能夠在一個或多個選定的宿主細胞中複製的核酸序列，以例如允許載體獨立於宿主染色體DNA進行複製。該序列可以包括複製起點或自主複製序列。這些序列對於各種細菌、酵母和病毒是熟知的。通常，哺乳動物表達載體不需要複製起點元件(可以使用SV40起點，因為它含有早期啟動子。
表達和克隆載體可以含有選擇基因或可選擇標誌物。典型的選擇基因編碼蛋白質，該蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如，氨苄青黴素、新黴素、氨甲喋呤或四環素，(b)補充營養缺陷型缺陷，或(c)提供不能從複合培養基獲得的關鍵營養物。較佳實例使用新黴素、黴酚酸和潮黴素。用於哺乳動物細胞的合適的可選擇標誌物的另一個實例是能夠鑒定有能力吸收抗體編碼的核酸的細胞的那些標誌物，諸如DHFR、穀氨醯胺合成酶(GS)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II，較佳靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，通過在含有DHFR的競爭性拮抗劑甲氨蝶呤(Mtx)的培養基中培養轉化體，鑒定了用DHFR基因轉化的缺乏內源DHFR活性的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
或者，用編碼興趣抗體的DNA序列、野生型DHFR基因和諸如氨基糖苷3-磷酸轉移酶(APH)的另一可選擇標誌物轉化或共轉化的宿主細胞(特別是含有內源性DHFR的野生型宿主)可以通過細胞在含有用於可選擇標誌物(諸如氨基糖苷抗生素，例如卡那黴素、新黴素或G418)的選擇試劑的培養基中生長來選擇。
表達和克隆載體通常含有被宿主生物體識別並與編碼抗體的核酸可操作連接的啟動子。適用於原核宿主的啟動子包括pho A啟動子、β-內醯胺酶和乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶啟動子、色氨酸(trp)啟動子系統和雜合啟動子，如tac啟動子。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。已知用於真核的啟動子序列。酵母啟動子是本領域熟知的，並且可以包括由生長條件調節的誘導型啟動子/增強子。幾乎所有真核基因都具有富AT的區域，該區域位於轉錄起始位元點上游約25-30個鹼基處。實例包括但不限於3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶。來自哺乳動物宿主細胞中的載體的抗體轉錄可以例如通過從病毒基因組獲得的啟動子來控制。SV40病毒的早期和晚期啟動子方便地作為也含有SV40病毒複製起點的SV40限制性片段獲得。人巨細胞病毒的立即早期啟動子方便地作為HindIII E限制性片段獲得。或者，Rous肉瘤病毒長末端重複可用作啟動子。
編碼本發明抗體的DNA在高等真核生物中的轉錄通常通過將增強子序列插入到載體中來增加。現在已知許多來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白和胰島素等)的增強子序列。然而，通常使用真核細胞病毒的增強子。
用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體也將含有轉錄終止和穩定mRNA所需的序列。
用於在本發明的載體中克隆或表達DNA的合適的宿主細胞是上述原核生物、酵母或高等真核生物細胞。為此目的合適的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏桿菌屬(Escherichia )，例如大腸桿菌(E. coli )，腸桿菌(Enterobacter )，歐文氏菌(Erwinia )，克雷伯菌(Klebsiella )，變形桿菌(Proteus )，沙門氏菌(Salmonella )，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium )，沙雷氏菌(Serratia )，例如粘質沙雷氏菌(Serratia marcescans )和志賀氏菌(Shigella )等，除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母菌的真核微生物也是編碼抗體的載體的合適克隆或表達宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )或普通麵包酵母在低等真核宿主微生物中是最常用的。可以選擇某些真菌和酵母菌株，其中糖基化通路已經被“人源化”從而導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。參見，例如，Li et al.,Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、浮萍(Leninaceae )、苜蓿(M. truncatula )和煙草的植物細胞培養物可以用作宿主。
用於表達糖基化抗體的合適的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒株和變體，以及來自諸如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )、埃及伊蚊(Aedes aegypti )、白紋伊蚊(Aedes albopictus )、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )、和家蠶(Bombyxmori)的宿主的相應受納昆蟲宿主細胞。
脊椎動物細胞可用作宿主、脊椎動物細胞在培養(組織培養)中的增殖已成為常規步驟。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例是：通過SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎系(293或用於在懸浮培養中生長的亞克隆293細胞，Grahamet al. ,J. Gen Virol. 36:59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞爾托利氏(sertoli)細胞(TM4，Mather,Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Matheret al. ,Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞系(Hep G2)。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaubet al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；和骨髓瘤細胞系，諸如NS0和Sp2/0。對於某些適於產生抗體的哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見，例如，Yazaki和Wu，《分子生物學方法》(Methods in Molecular Biology)，第248卷(B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003)，第255-268頁。
本發明的宿主細胞可以在多種培養基中培養。市售培養基，諸如Ham's F10(Sigma)、最小必需培養基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜氏改良伊戈爾培養基((DMEM)，Sigma)適於培養宿主細胞。另外，在Hamet al. ,Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barneset al. ,Anal. Biochem. 102:255 (1980)、美國專利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195或U.S. Pat. Re. 30,985中描述的培養基的任一個均可用作宿主細胞的培養基。這些培養基中的任一種可根據需要補充激素和/或其它生長因數(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因數)，鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂、和磷酸鹽)，緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)，抗生素(諸如GENTAMYCINTM 藥物)，微量元素(定義為通常以微摩爾範圍內的終濃度存在的無機化合物)和葡萄糖或等同的能量源。還可以包括本領域技術人員已知的適當濃度的任何其它必要補充劑。培養條件，諸如溫度、pH等，是先前選擇用於表達的宿主細胞使用的那些，並且對於本領域技術人員是顯而易見的。
當使用重組技術時，抗體可以在胞內、周質空間中產生，或直接分泌到培養基中。如果抗體在胞內產生，則作為第一步驟，通過例如離心或超濾除去宿主細胞或裂解片段的顆粒碎片。Carteret al. ,Bio/Technology 10:163-167 (1992)描述了對分泌到大腸桿菌周質空間的抗體進行分離的步驟。
可以使用例如羥基磷灰石層析、疏水作用層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化從細胞製備的抗體組合物，其中親和層析是通常較佳的純化步驟之一。 [糖基化變體]
在一些實施方案中，改變本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體以增加或降低抗CLDN18.2抗體糖基化的程度。通過改變人源化抗CLDN18.2抗體或其多肽部分的氨基酸序列，使得產生或除去一個或多個糖基化位點，可以方便地完成向人源化抗CLDN18.2抗體添加或刪除糖基化位點。
當人源化抗CLDN18.2抗體包含Fc區時，與其連接的碳水化合物可以更改。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含通常通過N-連接與Fc區CH2結構域的Asn297連接的分支，雙觸角寡糖。參見，例如Wrightet al. ,TIBTECH 15:26-32 (1997)。所述低聚糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在雙觸角低聚糖結構的“莖”中與GlcNAc連接的岩藻糖。在一些實施方案中，可以對本發明的人源化抗CLDN18.2抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善性質的人源化抗CLDN18.2抗體變體。
與Fc的CH2結構域連接的N-聚糖是異質的。在CHO細胞中產生的抗體或Fc融合蛋白通過岩藻糖基轉移酶活性被岩藻糖基化。參見Shoji-Hosakaet al. , J. Biochem. 2006, 140:777- 83。通常，可以在人血清中檢測到小百分比的天然存在的無岩藻糖基化IgGs。Fc的N-糖基化對於結合FcγR是重要的；並且N-聚糖的岩藻糖基化增加Fc’對FcγRIIIa的結合能力。增加的FcγRIIIa結合可以增強ADCC，這在期望細胞毒性的某些抗體試劑治療應用中是有利的。
在一些實施方案中，當Fc介導的細胞毒性是不期望的時，增強的效應子功能可能是有害的。在一些實施方案中，Fc片段或CH2結構域未被糖基化。在一些實施方案中，使CH2結構域中的N-糖基化位點突變以防止糖基化。
在一些實施方案中，提供了包含Fc區的人源化抗CLDN18.2抗體變體，其中附著於Fc區的碳水化合物結構具有減少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，這可以改善ADCC功能。具體地，本發明考慮了人源化抗CLDN18.2抗體，其相對於在野生型CHO細胞中產生的相同人源化抗CLDN18.2抗體上的岩藻糖的量具有降低的岩藻糖。就是說，它們的特徵在於其岩藻糖的量比天然CHO細胞(例如，產生天然糖基化模式的CHO細胞，諸如含有天然FUT8基因的CHO細胞)產生的岩藻糖的含量低。在一些實施方案中，所述人源化抗CLDN18.2抗體是其上少於約50%、40%、30%、20%、10%或5%的N-聯聚糖包含岩藻糖的抗體。例如，在這種人源化抗CLDN18.2抗體中岩藻糖的量可以為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。在一些實施方案中，所述人源化抗CLDN18.2抗體是其上沒有N-聯聚糖包含岩藻糖的抗體，即，其中人源化抗CLDN18.2抗體完全不帶有岩藻糖或沒有岩藻糖或無岩藻糖基化。岩藻糖的量是通過相對於通過MALDI-TOF質譜法測得的與Asn 297附著的所有糖結構(例如，複雜、雜合和高甘露糖結構)的總和計算Asn297糖鏈中岩藻糖的平均量來確定的，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位於Fc區中約297位的天冬醯胺殘基(Fc區殘基的EU編號)；然而，由於抗體中的微小序列變化，Asn297也可位於位置297上游或下游約±3個氨基酸，即在位置294和300之間。這樣的岩藻糖基化變體可以具有改善的ADCC功能。參見，例如，美國專利公開No.US 2003/0157108(Presta, L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo株式會社)。涉及“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏型”抗體試劑變體的出版物的實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140;Okazakiet al.J. Mol. Biol . 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnukiet al.Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004)。能夠產生脫岩藻糖基化抗體的細胞系的實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化的Lec13 CHO細胞(Ripkaet al.Arch. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986)；美國專利申請No US 2003/0157108 A1, Presta, L；和WO 2004/056312 A1, Adams等，特別是實施例 11)，和敲除細胞系，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、敲除CHO細胞(參見例如，Yamane-Ohnukiet al.Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004)；Kanda, Y.et al. ,Biotechnol. Bioeng ., 94(4):680-688 (2006); and WO2003/085107)。
進一步為人源化抗CLDN18.2抗體變體提供等分寡糖，例如其中連接於人源化抗CLDN18.2抗體Fc區的雙觸角寡糖被GlcNAc等分。這種人源化抗CLDN18.2抗體變體可以具有減少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此類抗體試劑變體的實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利No.6,602,684(Umana等人)；US 2005/0123546(Umana等)，和Ferraraet al. ,Biotechnology and Bioengineering , 93(5): 851-861 (2006)。還提供了在附著於Fc區的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的人源化抗CLDN18.2抗體變體。這種人源化抗CLDN18.2抗體變體可以具有改善的CDC功能。這樣的抗體試劑變體例如描述於WO 1997/30087 (Patelet al. )；WO 1998/58964 (Raju, S.)；和WO 1999/22764 (Raju, S.)。
在一些實施方案中，包含Fc區的人源化抗CLDN18.2抗體變體能夠結合FcγRIII。在一些實施方案中，與包含人野生型IgG1 Fc區的其它相同的人源化抗CLDN18.2抗體相比，包含Fc區的人源化抗CLDN18.2抗體變體在人效應細胞(例如，T細胞)存在下具有ADCC活性或在人效應細胞存在下具有增加的ADCC活性。在一些實施方案中，本發明提供的抗CLDN18.2抗體包含SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：111的氨基酸序列。 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PD VFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPL PE EKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG(SEQ ID NO：109) ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLL PPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPP EEQYN STL RVVSI LT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPL V LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG(SEQ ID NO：110) ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYNA TYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIAA TIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG (SEQ ID NO：111) [半胱氨酸工程變體]
在一些實施方案中，可能需要產生半胱氨酸工程化人源化抗CLDN18.2抗體，其中一個或多個氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代。在一些實施方案中，取代的殘基出現在人源化抗CLDN18.2抗體的可接近位點。通過用半胱氨酸取代那些殘基，反應性巰基由此位於人源化抗CLDN18.2抗體的可接近位點，並可用於將人源化抗CLDN18.2抗體與諸如藥物部分或接頭-藥物部分的其它部分綴合，以產生如本發明進一步描述的人源化抗CLDN18.2免疫綴合物。半胱氨酸改造的人源化抗CLDN18.2抗體可以如例如描述於美國專利No.7,521,541來完成。 [效應子功能工程]
可能需要在效應子功能方面修飾本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體，以增強(例如)抗體在治療癌症中的有效性。例如，可將半胱氨酸殘基引入Fc區中，從而允許在該區中形成鏈間二硫鍵。如此產生的同二聚體抗體可具有提高的內化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caronet al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shapes,J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可以使用異雙功能交聯劑製備，如Wolffet al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)中所述。或者，可將抗體工程化以包含通常的Fc區，並由此可具有增強的補體裂解和ADCC能力。參見，Stevensonet al., Anti-Cancer Drug Design3: 219-230 (1989)。
可在Fc區序列中進行突變或改變以改善FcR結合(例如，與FcγR、FcRn的結合)。在一些實施方案中，與天然IgG或親本抗體相比，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體包含至少一種改變的效應子功能，例如，改變的ADCC、CDC和/或FcRn結合。在一些實施方案中，包含突變或改變的抗體的效應子功能相對於親本抗體增加。在一些實施方案中，包含突變或改變的抗體的效應子功能相對於親本抗體降低。幾種有用的特異性突變的實例描述於，例如，Shields, RLet al. (2001)JBC 276(6)6591-6604；Presta, L.G., (2002)Biochemical Society Transactions 30(4):487-490；和WO 00/42072。
在一些實施方案中，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體包含野生型Fc結構域，例如，野生型IgGA、IgD、IgE、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM Fc結構域。在一些實施方案中，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體包含Fc結構域變體，所述Fc結構域變體包含突變，例如Fc結構域的至少一個位置上的取代突變。可以對Fc結構域中的氨基酸位置進行這樣的取代突變，所述氨基酸位置包括但不限於，例如，238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc區中殘基的編號是根據EU編號系統。在一些實施方案中，Fc受體突變是D265A取代。在一些實施方案中，Fc受體突變是N297A取代。其他合適的突變是本領域眾所周知的。示例性突變在例如美國專利No.7,332,581中所述。 [免疫偶聯物和共價修飾]
本發明還涉及包含與第二部分綴合的抗體的免疫綴合物。在一些實施方案中，第二部分是細胞毒性劑，諸如化療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性綴合物)。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈，白喉毒素的非結合活性片段，外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、modeccin A鏈、α-sarcin、油桐(Aleurites fordii )蛋白、香石竹蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana )蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Phytolaca americana )抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲裂黴素(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素、依諾黴素和單端孢菌素(tricothecenes)。各種放射性核素可用於製備放射性綴合的抗體。實例包括212 Bi、131 I、131 In、90 Y和186 Re。用於產生此類免疫綴合物的示例性化療劑在本發明別處描述。
在某些實施方案中，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)與美登素(maytansine)、美登木素生物鹼(maytansinoid)或加利車黴素(calicheamicin)綴合。在某些實施方案中，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)與美登木素生物鹼DM1綴合。
抗體和細胞毒性劑的綴合物使用多種雙功能蛋白質-偶聯劑製備，所述雙功能蛋白質-偶聯劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫雜環戊烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如己二醯亞氨酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮基苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitettaet al., Science, 238: 1098 (1987)中所述製備。碳-14-標記的1-異硫氰醯苄基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與抗體綴合的示例性螯合劑。參見WO 94/11026。
在另一個實施方案中，抗體可以與“受體”(諸如鏈黴素親和素)綴合，用於腫瘤預靶向，其中向患者施用抗體-受體綴合物，然後使用清除劑從循環中除去未結合的綴合物，然後施用與細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)綴合的“配體”(例如親和素)。
還提供了包含與至少一種其它抗體共價連接的本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體的異源綴合物抗體。例如，已經提出異源綴合物抗體將免疫系統細胞靶向不需要的細胞(美國專利No.4,676,980)，並用於治療HIV感染。包含本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體的異源綴合物抗體可以使用合成蛋白質化學中已知的方法體外製備，包括涉及交聯劑的那些方法。例如，可以使用二硫化物交換反應或通過形成硫醚鍵構建免疫毒素。用於此目的的合適試劑的實例包括亞氨基硫醇鹽和4-巰基丁醯亞胺酸甲酯以及例如在美國專利No.4,676,980中公開的那些。
還提供了包含至少一種共價修飾的人源化抗CLDN18.2抗體。一種類型的共價修飾包括將人源化抗CLDN18.2的靶向氨基酸殘基與能夠與抗體的選定側鏈或N-或C-末端殘基反應的有機衍生劑反應。常用的交聯劑包括但不限於，例如，1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯基乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀醯亞胺酯，例如，與4-疊氮基水楊酸的酯；高雙官能亞氨酸酯，包括二琥珀醯亞胺酯，諸如3,3’-二硫代雙(琥珀醯亞胺基-丙酸酯)；雙官能馬來醯亞胺，諸如雙-N-馬來醯亞胺-1,8-辛烷；和試劑，諸如3-[(對-疊氮基苯基)-二硫]丙亞氨酸甲酯。
其它修飾包括穀氨醯胺醯基和天冬醯胺醯基殘基分別脫醯胺為相應的穀氨醯和天冬氨醯殘基，脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨醯基或蘇氨醯基殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的α-氨基的甲基化[T.E. Creighton, Proteins:Structure and Molecular Properties , W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]，N-末端胺的乙醯化和任何C-末端羧基的醯胺化。
共價修飾的另一種類型包括,以美國專利No.4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中闡述的方式，將本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)連接至多種非蛋白質聚合物中的一種，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。 [嵌合分子]
本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)也可以由嵌合分子修飾，所述嵌合分子包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的抗體。
在一個實施方案中，這樣的嵌合分子包含本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)與蛋白轉導結構域的融合物，所述蛋白轉導結構域使用例如人免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白轉導結構域靶向多肽以遞送至各種組織，更特別地穿過腦血屏障(Schwarzeet al., 1999, Science 285: 1569-72)。
在另一個實施方案中，這樣的嵌合分子包含本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)與標籤多肽的融合物，所述標籤多肽提供抗標籤抗體可以選擇性結合的表位。表位標籤通常位於多肽的氨基或羧基末端。可使用抗標記多肽的抗體來檢測本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)的此類表位元標記形式的存在。各種標記多肽和它們各自的抗體是本領域已知的。實例包括聚組氨酸(poly-His)或聚組氨酸-甘氨酸(poly-His-gly)標籤；flu HA標籤多肽及其抗體12CA5[Fieldet al .,Mol. Cell. Biol ., 8:2159-2165 (1988)]；c-myc標籤和其上的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體[Evanet al .,Molecular and Cellular Biology , 5:3610-3616 (1985)]；和單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標籤及其抗體[Paborskyet al .,Protein Engineering , 3(6):547-553 (1990)]。其它標籤多肽包括Flag-肽[Hoppet al .,BioTechnology , 6:1204-1210 (1988)]；KT3表位肽[Martinet al .,Science , 255:192-194 (1992)]；α-微管蛋白表位肽生物[Skinneret al .,J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；和T7基因10蛋白肽標籤[Lutz-Freyermuthet al .,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 87:6393-6397 (1990)]。 [嵌合抗原受體(CAR)和CAR效應細胞]
在一些實施方案中，人源化抗CLDN18.2抗體或其片段(稱為“抗CLDN18.2部分”)是抗CLDN18.2構建體的一部分。一些實施方案中的抗CLDN18.2構建體是包含抗CLDN18.2抗體部分(在本發明中也稱為“抗CLDN18.2 CAR”)的嵌合抗原受體(CAR)。還提供了包含CAR的CAR效應細胞(例如，T細胞、NK細胞或巨噬細胞)，所述CAR包含抗CLDN18.2抗體部分。此類細胞在本發明中也稱為“抗CLDN18.2 CAR效應細胞”，例如，“抗CLDN18.2 CAR T細胞”、“抗CLDN18.2 CAR NK細胞”或“抗CLDN18.2 CAR 巨噬細胞”。
一些實施方案中的抗CLDN18.2 CAR)包含a)包含與CLDN18.2特異性結合的人源化抗CLDN18.2抗體部分的細胞外結構域，和b)胞內信號傳導結構域。跨膜結構域可以存在於胞外結構域和胞內結構域之間。
在抗CLDN18.2 CAR的胞外結構域和跨膜結構域之間，或者在抗CLDN18.2 CAR的胞內結構域和跨膜結構域之間，可以存在間隔區結構域。間隔區結構域可以是任何寡肽或多肽，其功能是將跨膜結構域連接到多肽鏈中的細胞外結構域或胞內結構域。間隔區結構域可包含至多約300個氨基酸，包括例如約10個至約100個、或約25個至約50個氨基酸。
跨膜結構域可以衍生自天然或合成來源。當來源是天然的時，結構域可以衍生自任何膜結合或跨膜蛋白。在本發明中特別使用的跨膜區可以衍生自(即至少包含下述的跨膜區)T細胞受體CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的α、β、δ或γ鏈。在一些實施方案中，跨膜結構域可以是合成的，在這種情況下它可以主要包含疏水殘基，諸如亮氨酸和纈氨酸。在一些實施方案中，苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的三聯體可以在合成的跨膜結構域的每一端找到。在一些實施方案中，短的寡聚(?)或長度例如在約2至約10個氨基酸之間(例如約2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任何一個)的多肽接頭可形成抗CLDN18.2 CAR的跨膜結構域和胞內信號傳導結構域之間的連接。在一些實施方案中，接頭是甘氨酸-絲氨酸雙聯體。
在一些實施例中，使用與抗CLDN18.2 CAR的胞內結構域中的序列中的一個天然相關聯的跨膜結構域(例如，如果抗CLDN18.2 CAR的胞內結構域包含4-1BB共刺激序列，那麼使用抗CLDN18.2 CAR的跨膜結構域衍生自4-1BB跨膜結構域)。
抗CLDN18.2 CAR的胞內信號傳導結構域負責啟動已放置抗CLDN18.2 CAR的免疫細胞的正常效應子功能的至少一種。例如，T細胞、NK細胞或巨噬細胞的效應子功能可以是溶細胞活性或輔助活性，包括細胞因數的分泌。因此，術語“胞內信號傳導結構域”是指轉導效應子功能信號並指導細胞執行特定功能的蛋白質的部分。雖然通常可以使用整個胞內信號傳導結構域，但在許多情況下不必使用整條鏈。就使用胞內信號傳導結構域的截短部分而言，可使用此類截短部分代替完整鏈，只要其轉導效應子功能信號即可。術語“胞內信號傳導序列”因此意指包括足以轉導效應子功能信號的胞內信號傳導結構域的任何截短部分。
用於本發明的抗CLDN18.2 CAR的胞內信號傳導結構域的實例包括：T細胞受體(TCR)和共同受體的細胞質序列，其在抗原受體接合後共同作用以啟動信號轉導；以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同功能能力的任何合成序列。
T細胞啟動可由兩類不同的胞內信號傳導序列介導：通過TCR啟動抗原依賴性初級啟動的那些(初級信號傳導序列)和以抗原非依賴性方式起作用以提供次級或共刺激信號的那些(共刺激信號傳導序列)。本發明所述的抗CLDN18.2 CAR可包含一個或兩個信號傳導序列。
初級信號傳導序列以刺激方式或以抑制方式調節TCR複合物的初級啟動。以刺激方式起作用的初級信號傳導序列可以含有信號傳導基序，其被稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序或ITAM。在一些實施方案中，所述抗CLDN18.2 CAR構建體包含一種或多種ITAM。在本發明中特別使用的含有初級信號傳導序列的ITAM的實例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2 CAR包含衍生自CD3ζ的初級信號傳導序列。例如，CAR的胞內信號傳導結構域可以包含CD3ζ胞內信號傳導序列本身或與在本發明的抗CLDN18.2 CAR的上下文中有用的任何其它期望的胞內信號傳導序列組合。
本發明描述的共刺激信號傳導序列可以是共刺激分子的胞內結構域的一部分，所述共刺激分子包括，例如，CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合的配體等。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2 CAR的胞內信號傳導結構域包含CD3ζ的胞內信號傳導序列和CD28的胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2 CAR的胞內信號傳導結構域包含CD3ζ的胞內信號傳導序列和4-1BB的胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，抗CLDN18.2 CAR的胞內信號傳導結構域包含CD3ζ的胞內信號傳導序列和CD28和4-1BB或其它共刺激分子的胞內信號傳導序列。
因此，例如，在一些實施方案中，提供了抗CLDN18.2 CAR，其包含a)包含與CLDN18.2特異性結合的抗CLDN18.2抗體部分的細胞外結構域(諸如人源化抗CLDN18.2抗體或其片段(例如，scFv、scFv)中的任一個)，b)跨膜結構域，和c)胞內信號傳導結構域。在一些實施方案中，所述胞內信號傳導結構域能夠啟動免疫細胞。在一些實施方案中，所述胞內信號傳導結構域包含初級信號傳導序列和共刺激信號傳導序列。在一些實施方案中，所述初級信號傳導序列包含CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，共刺激信號傳導序列包含CD28和/或4-1BB胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，所述胞內結構域包含CD3ζ胞內信號傳導序列和CD28和/或-1BB胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，所述胞內結構域包含CD3ζ胞內信號傳導序列和CD28和/或-1BB胞內信號傳導序列以及單獨的細胞因數轉基因，如CAR-誘導型白介素-12(iIL-12)盒。
本發明還提供了表達抗CLDN18.2 CAR的效應細胞(諸如，T細胞、NK細胞和/或巨噬細胞)。
還提供了產生表達抗CLDN18.2 CAR的效應細胞的方法，所述方法包含將編碼抗CLDN18.2 CAR的核酸引入效應細胞。在一些實施方案中，所述方法包含例如通過轉導、轉染或電穿孔將包含編碼抗CLDN18.2 CAR的核酸的載體引入效應細胞中。在一些實施方案中，所述方法包含通過病毒轉導引入包含編碼抗CLDN18.2 CAR的核酸序列的載體。在一些實施方案中，所述方法包含通過轉座子引入包含編碼抗CLDN18.2 CAR的核酸的載體。在一些實施方案中，所述方法包含通過CRISPR/Cas9引入包含編碼抗CLDN18.2 CAR的核酸序列的載體。在一些實施方案中，所述方法包含，通過非病毒轉移，例如質粒DNA的電穿孔或體外轉錄的mRNA(IVT-mRNA)的電穿孔，引入包含編碼抗CLDN18.2 CAR的核酸序列的載體。可以使用本領域已知的任何方法將載體或mRNA轉導、轉染或電穿孔到效應細胞中。 [治療方法]
可將本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)施用於受試者(例如哺乳動物，諸如人)以治療或延緩涉及異常CLDN18.2活性或表達的疾病或病症的進展，所述疾病或病症包括例如實體瘤或癌症(諸如胃癌，食管癌，胃食管交界癌，胰腺癌、膽管癌，肺癌，卵巢癌，結腸癌，肝癌，頭頸癌，膽囊癌等)。在某些實施方案中，提供了本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)在製備藥物的用途，所述藥物用於在受試者(諸如哺乳動物，例如人)中治療實體瘤或癌症(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)。在某些實施方案中，提供了本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)用於在受試者(諸如哺乳動物，例如人)中治療實體瘤或癌症(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)的用途。在某些實施方案中，提供了包含本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)的藥物組合物用於在受試者(諸如哺乳動物，例如人)中治療實體瘤或癌症(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)的用途。在一些實施方案中，治療表達CDLN 18.2的腫瘤。
在某些實施方案中，待治療的受試者是哺乳動物(例如人、非人靈長類動物、大鼠、小鼠、母牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓等)。在某些實施方式中，受試者是人。在某些實施方案中，受試者是臨床患者、臨床試驗志願者、實驗動物等。在某些實施例中，受試者被懷疑患有或有風險患有表達CDLN 18.2的腫瘤(諸如實體瘤)或癌(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)。在某些實施例中，受試者已被診斷為患有表達CDLN 18.2的腫瘤(例如實體瘤)或癌(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)，和/或與異常CLDN18.2表達或活性相關的疾病。在某些實施方案中，施用本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)的受試者對克勞地單抗(claudiximab)(IMAB362)或其生物相似藥具有抗性。在某些實施方案中，施用本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)的受試者針對claudiximab(IMAB362)或其生物類似物已經是進展性的。在某些實施方案中，施用本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)的受試者對claudiximab(IMAB362)或其生物相似藥具有耐性。
對於表達CDLN 18.2的腫瘤(例如實體瘤)或癌(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)或與異常CLDN18.2活性相關的其它疾病和那些疾病的臨床描述是本領域已知的。這些方法包括，但不限於例如免疫組織化學、PCR、螢光原位雜交(FISH)。關於這種用於評估異常CLDN18.2活性或表達的診斷方法的其它細節描述於，例如，Guptaet al. (2009)Mod Pathol. 22(1): 128-133；Lopez-Rioset al. (2013)J Clin Pathol. 66(5): 381-385；Ellisonet al. (2013) J Clin Pathol 66(2): 79-89；和Guhaet al. (2013)PLoS ONE 8(6): e67782。
本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)可以使用任何合適的途徑施用，包括例如靜脈內、肌內或皮下。在一些實施方案中，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)與第二、第三或第四試劑(包括例如抗腫瘤劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化療劑)組合施用以治療與異常CLDN18.2活性相關的疾病或病症。這類藥劑包括但不限於例如多西他賽、吉非替尼、FOLFIRI(伊立替康、5-氟尿嘧啶和亞葉酸)、伊立替康、順鉑、卡鉑、紫杉醇、貝伐單抗(bevacizumab)(抗VEGF抗體)、FOLFOX-4(輸注氟尿嘧啶、亞葉酸和奧沙利鉑、阿法替尼、吉西他濱、卡培他濱、培美曲塞、伐替尼、依維莫司、CpG-ODN、雷帕黴素、來那度胺、維羅非尼、內皮抑素、拉帕替尼、PX-866、Imprime PGG和伊洛替尼(irlotinibm))。在一些實施方案中，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)與抗腫瘤劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化療劑綴合。
在某些實施方案中，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)與一種或多種另外的療法例(諸如放射療法、手術、化學療法和/或靶向療法)組合施用。在某些實施方案中，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)與化學療法聯合施用。在某些實施例中，該化學療法包含EOX(即，表柔比星、奧沙利鉑和卡培他濱)。 在某些實施方案中，化療包含唑來膦酸和白介素-2。
取決於待治療的適應症和與本領域技術人員熟悉的劑量相關的因素，本發明提供的抗體將以有效治療該適應症同時使毒副作用最小化的劑量施用。對於表達CDLN 18.2的腫瘤(例如實體瘤)或癌(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)的治療，典型的劑量可以是例如：0.001-1000 μg的範圍；然而，低於或高於該示例性範圍的劑量在本發明所述的治療方法的範圍內。該劑量可以是約0.1 μg/kg至約100 mg/kg總體重(例如，約5 μg/kg、約10 μg/kg、約100 μg/kg、約500 μg/kg、約1 mg/kg、約50 mg/kg或由前述值中的任何兩個限定的範圍，包括前述值之間的任何範圍)。在一些實施方案中，典型劑量可以是，例如，在10 mg/m2 和1500 mg/m2 之間；然而，低於或高於該示例性範圍的劑量在本發明所述的治療方法的範圍內。劑量可以是約25 mg/m2 至約1000 mg/m2 (例如，約25 mg/m2 、約100 mg/m2 、約250 mg/m2 、約500 mg/m2 、約750 mg/m2 或由前述值中的任何兩個限定的範圍，包括前述值之間的任何範圍)。在一些實施方案中，劑量為約300 mg/m2 、600 mg/m2 、800 mg/m2 或1000 mg/m2 中的任一個。
本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)可以以單次日劑量施用，或總日劑量可以以每日兩、三或四次的分劑量施用。或者，人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)可以低於每天的頻率施用，例如每週六次、每週五次、每週四次、每週三次、每週兩次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四周一次、每月一次、每兩月一次、每三月一次、或每六月一次。
在一些實施方案中，在第一週期期間以800 mg/m2 的劑量施用一次本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)，之後每三周或之後21天以600 mg/m2 的劑量施用一次。在一些實施方案中，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)以1000 mg/m2 的劑量每三周或21天施用一次。在一些實施方案中，在週期1的第1天以800 mg/m2 的劑量施用本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)，之後在每隔一個後續週期的第1天以600 mg/m2 的劑量施用。
治療或預防功效可以通過對接受治療的受試者進行定期評估來監測。對於幾天或更長時間的重複給藥，根據情況，重複治療直至出現期望的疾病症狀抑制。然而，其他劑量方案可能是有用的並且在本發明的範圍內。期望劑量可通過單次推注施用本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)、通過多次推注施用本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)、或通過連續輸注施用本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其抗原結合片段)來遞送。
可通過例如但不限於以下評價癌症治療：腫瘤消退、腫瘤重量或尺寸縮小、進展時間、緩解率、生存期、無進展存活、總反應率、總存活、反應持續時間、疾病控制率、臨床受益率、生活品質、CLDN18.2表達的量或水平、和/或CLDN18.2活性的水平。可以使用確定療效的途徑，包括例如通過例如RECIST(實體瘤療效評價評估)標準的反應測量(參見例如，Eisenhaueret al. (2009) “New response evaluation in solid tumors: Revised RECIST guideline (version 1.1).”Eur J. Cancer. 45: 228-247)。 [抗CLDN18.2 CAR效應細胞療法]
本發明還提供了在個體中刺激對包含CLDN18.2呈遞細胞的靶細胞群或組織的效應細胞介導的反應(諸如T細胞、NK細胞或巨噬細胞介導的免疫反應)的方法，包含向個體施用表達抗CLDN18.2 CAR的效應細胞(諸如T細胞)的步驟。在一些實施方案中，所述個體是人類個體。
可將表達抗CLDN18.2 CAR的抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞、NK細胞和/或巨噬細胞)輸注至有需要的接受者。在一些實施方案中，抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞、NK細胞和/或巨噬細胞)能夠在體內複製，導致可導致持續腫瘤控制的長期持久性。在一些實施方案中，抗CLDN18.2 CAR效應細胞可經歷穩健的體內T細胞擴增並持續延長的時間量。在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2 CAR T細胞發育成特異性記憶T細胞，其可被再啟動以抑制任何另外的腫瘤形成或生長。
體外步驟是本領域熟知的。簡單地說，細胞分離自個體(例如人)並用表達本發明公開的抗CLDN18.2 CAR的載體或mRNA修飾。可向哺乳動物受體施用抗CLDN18.2 CAR細胞以提供治療益處。哺乳動物受體可以是人並且抗CLDN18.2 CAR細胞相對於受體可以是自體的。或者，細胞相對於受體可以是同種異體的、同基因的或異種的。
造血幹細胞和祖細胞的離體擴增方法描述於通過引用併入本發明美國專利No. 5,199,942，可以應用於本發明的細胞。其它合適的方法是本領域已知的；因此，本發明不限於細胞離體擴增的任何特定方法。簡單地說，T細胞的離體培養和擴增包括：(1)從外周血收穫物或骨髓外植體收集來自哺乳動物的CD34+造血幹細胞和祖細胞；和(2)離體擴增這些細胞。除了美國專利No. 5,199,942中描述的細胞生長因數外,諸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配體的其它因數可用於細胞培養和細胞擴增。
本發明的抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)可單獨施用，或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與諸如IL-2的其它組分或其它細胞因數或細胞群組合施用。簡單地說，本發明的藥物組合物可以包含抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)與一種或多種藥學上或生理學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的組合。這類組合物可包含：緩衝液，例如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或氨基酸，諸如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。在一些實施方案中，配製抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物用於靜脈內施用。
待施用的本發明的抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物的精確量可由醫師考慮患者(受試者)的年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移的程度和狀況的個別差異來確定。在一些實施方案中，包含抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)的藥物組合物以約104 至約109 細胞/kg體重的劑量施用，諸如約104 至約105 、約105 至約106 、約106 至約107 、約107 至約108 或約108 至約109 細胞/kg體重中的任一個，包括那些範圍內的所有整數值。抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物也可以以這些劑量多次施用。這些細胞可以通過使用免疫治療中通常已知的輸注技術來施用(參見，例如，Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988)。特定患者的最佳劑量和治療方案是本領域技術人員通過監測患者的病情和相應調整治療而容易確定的。
抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)的施用可以以任何方便的方式進行，包括通過氣霧劑吸入、注射、攝入、輸注、植入或移植。本發明所述的組合物可以通過皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌內、通過靜脈內(i.v.)注射或腹膜內施用於患者。在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物通過皮內或皮下注射施用於患者。在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)組合物通過i.v.注射施用。抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)的組合物可直接注射到腫瘤、淋巴結或感染部位。
因此，例如，在一些實施方案中，提供了治療個體的疾病(諸如癌症)的方法，其包含向所述個體施用有效量的包含效應細胞(諸如T細胞)的組合物，所述效應細胞表達抗CLDN18.2 CAR，所述抗CLDN18.2 CAR包含a)包含與CLDN18.2特異性結合的人源化抗CLDN18.2抗體部分的細胞外結構域，b)跨膜結構域，和c)包含CD3ζ胞內信號傳導序列和4-1BB胞內信號傳導序列的胞內信號傳導結構域。在一些實施方案中，所述個體對CLDN18.2呈陽性。在一些實施方案中，與患者群體中的中等水平相比，所述個體表達高水平的CLND18.2。在一些實施方案中，所述施用經由靜脈內、腹膜內或腫瘤內途徑。在一些實施方案中，所述施用經由靜脈內途徑。在一些實施方案中，所述施用經由瘤內途徑。在一些實施方案中，所述個體是人。
在一些實施方案中，提供了在個體中引發T細胞的方法，包含向所述個體施用有效量的組合物，所述組合物包含表達根據上述任一種抗CLDN18.2 CAR的抗-CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞)。在一些實施方案中，個體患有癌症。在一些實施方案中，所述施用經由靜脈內、腹膜內或腫瘤內途徑。在一些實施方案中，所述施用經由靜脈內途徑。在一些實施方案中，所述施用經由瘤內途徑。在一些實施方案中，所述個體是人。 [藥物製劑]
本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其片段)可以與藥學上可接受的載體或賦形劑一起配製，使得它們適於向有需要的受試者(例如，哺乳動物，諸如人)施用。通過將具有期望純度的抗體(或其片段)與任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))混合來獲得合適的抗體製劑，以凍乾製劑或水溶液的形式。藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度下對接受者是無毒的，並且包括：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲氧銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚，丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸，穀氨醯胺，天冬醯胺，組氨酸，精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬配合物(例如鋅-蛋白複合物；和/或非離子表面活性劑，例如，或TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
本發明公開的抗體也可以配製成免疫脂質體。含有所述抗體的脂質體通過本領域已知的方法製備，諸如描述於Epsteinet al., PNAS USA, 82: 3688 (1985)；Hwanget al., PNAS USA, 77: 4030 (1980)；和美國專利No.4,485,045或4,544,545。美國專利No.5,013,556公開了循環時間延長的脂質體。
特別有用的脂質體可以通過反相蒸發方法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生的磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。脂質體通過限定孔徑的濾器擠出以產生具有期望直徑的脂質體。如Martinetal., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)中所述，本發明抗體的Fab'片段可以經由二硫化物交換反應與脂質體綴合。脂質體內任選還包含抗腫瘤劑、生長抑制劑或化療劑(諸如多柔比星)。參見Gabizonet al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)。
包含本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體的藥物製劑還可以含有一種以上的活性化合物，這對於所治療的特定適應症是必需的，較佳那些具有互補活性但不會彼此不利影響的活性化合物。例如，可能需要提供除本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體之外的抗腫瘤劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化療劑。這類分子合適地以對預期目的有效的量而組合存在。此類其它試劑的有效量取決於製劑中存在的抗體的量、疾病或病症或治療的類型和上文討論的其它因素。此類其它試劑的有效量取決於製劑中存在的抗體的量、疾病或病症或治療的類型和上文討論的其它因素。這些通常以與本發明所述相同的劑量和施用途徑使用，或為迄今使用的劑量的約1至99%。
在一些實施方案中，本發明的抗體是凍乾的。 這樣的凍乾製劑可以用合適的稀釋劑重構為高蛋白濃度，並且重構的製劑可以施用於哺乳動物(諸如人)。
在某些實施方案中，用於體內施用的藥物製劑是無菌的。這可通過(例如)通過無菌過濾膜過濾包含本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體的溶液而容易地實現。 [使用抗Claudin 18.2抗體的診斷和成像方法]
與CLDN18.2多肽特異性結合的經標記的人源化抗CLDN18.2抗體、其片段及其衍生物和類似物可用於診斷目的以檢測、診斷或監測與CLDN18.2的表達、異常表達和/或活性相關的疾病和/或病症。例如，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其片段)可用於原位、體內、離體和體外診斷測定或成像測定。用於檢測CLDN18.2多肽的表達的方法，其包含(a)使用一種或多種本發明的抗體測定所述多肽在個體的細胞(例如組織)或體液中的表達，和(b)將基因表達水平與標準基因表達水平進行比較，其中與標準表達水平相比，所測定的基因表達水平的增加或降低指示異常表達。這樣的測定可以在體內或離體(例如使用從患者獲得的樣品)進行。
本發明還提供了診斷與動物(例如，哺乳動物，諸如人類)中的CLDN18.2的表達或異常表達相關的疾病或病症的方法。在一些實施方案中，所述方法包含檢測哺乳動物中的CLDN18.2多肽。在某些實施方案中，診斷包含：(a)向哺乳動物施用有效量的標記的人源化抗CLDN18.2抗體(或其片段)；(b)等待施用步驟後的時間間隔，以允許標記的人源化抗CLDN18.2抗體(或其片段)優先在受試者中表達CLDN18.2的位點濃縮(和/或對於未結合的標記分子，以清除至背景水平)；(c)檢測受試者中標記的人源化抗CLDN18.2抗體的量或水平；和(d)將受試者中標記的人源化抗CLDN18.2抗體的量或水平與健康對照受試者中的人源化抗CLDN18.2抗體的水平或量進行比較。如果受試者中標記的人源化抗CLDN18.2抗體的量或水平超過健康對照受試者中人源化抗CLDN18.2抗體的量或水平，則這可以指示受試者具有與CLDN18.2的表達或異常表達相關的疾病或病症。
使用本領域技術人員已知的經典免疫組織學方法，本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體(或其片段)可用於分析生物樣品中CLDN18.2的量或水平(例如參見Jalkanen,et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen,et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987))。用於檢測CLDN18.2表達的其它基於抗體的方法包括免疫測定，諸如酶聯免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。合適的抗體測定標記是本領域已知的，並且包括酶標記，諸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(131 I、125 I、123 I、121 I),碳(14 C),硫(35 S)，氚(3 H)，銦(115m In、113m In、112 In、111 In)和鍀(99 Tc、99m Tc)，鉈(201 Ti)，鎵(68 Ga、67 Ga)，鈀(103 Pd)，鉬(99 Mo)，氙(133 Xe)，氟(18 F)，153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru；魯米諾(luminol)；螢光標記，諸如螢光素、羅丹明和生物素。
本領域已知的技術可應用於本發明提供的標記抗體(或其片段)。這類技術包括但不限於使用雙官能綴合劑(參見例如，美國專利No.5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003)。
在一些實施方案中，通過確定諸如血清的生物體液中脫落的抗原的量來測量CLDN18.2過表達，例如通過使用基於抗體的測定法(還參見例如1990年6月12日公佈的美國專利No.4,933,294；1991年4月18日公開的W091/05264；1995年3月28日公佈的美國專利5,401,638；和Siaset al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990))。除了上述測定法之外，本領域技術人員可以獲得各種體內和離體測定法。例如，可以將哺乳動物體內的細胞暴露於抗體，所述抗體任選地用可檢測標記物(例如放射性同位素)標記，並且可以例如通過體外掃描放射性或通過分析取自先前暴露於抗體的哺乳動物的樣品(例如活組織檢查或其他生物樣品)來評估抗體的結合。 [CAR效應細胞製備]
在一個方面，本發明提供表達抗CLDN18.2 CAR的效應細胞(諸如T細胞、NK細胞和/或巨噬細胞)。本發明提供了製備表達抗CLDN18.2 CAR的效應細胞(諸如T細胞、NK細胞和/或巨噬細胞)(抗CLDN18.2 CAR效應細胞，諸如抗CLDN18.2 CAR T細胞、抗CLDN18.2 CAR NK細胞和/或抗CLDN18.2 CAR 巨噬細胞)的示例性方法。
在一些實施方案中，抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞、NK細胞或巨噬細胞)可通過將包含抗CLDN18.2 CAR(例如下述一種CAR,其包含抗CLDN18.2抗體部分、4-1BB共刺激序列和CD3ζ初級信號傳導序列或其它序列，諸如能夠延長CAR細胞存活的IL-2、IL15或能夠消除CAR細胞的序列)的載體(包括例如慢病毒載體)引入效應細胞(諸如T細胞、NK細胞或巨噬細胞)來產生。在一些實施例中，本發明的抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞、NK細胞和/或巨噬細胞)能夠在體內複製。在一些實施方案中，抗CLDN18.2 CAR效應細胞(諸如T細胞，NK細胞或巨噬細胞)可通過將編碼抗CLDN18.2 CAR(諸如包含抗CLDN18.2抗體部分、4-1BB共刺激序列和CD3ζ初級信號傳導序列的CAR)的mRNA引入效應細胞(諸如T細胞、NK細胞和/或巨噬細胞活動。
本發明的抗CLDN18.2 CAR T細胞可以經歷穩健的體內T細胞擴增並且可以建立在血液和骨髓中以高水平持續延長的時間量的CLDN18.2特異性記憶細胞。在一些實施方案中，注入患者的本發明的抗CLDN18.2 CAR T細胞可以在患有疾病(例如以高CLDN18.2表達為特徵的疾病)的患者體內消除CLDN18.2-呈遞細胞，諸如CLDN18.2-呈遞癌細胞。
在T細胞、NK細胞或巨噬細胞的擴增和遺傳修飾之前，從受試者獲得T細胞、NK細胞或巨噬細胞的來源。例如，T細胞可以從許多來源獲得，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在本發明的一些實施方案中，可以使用本領域可獲得的任何數量的T細胞、NK細胞和/或巨噬細胞系。在本發明的一些實施方案中，可以使用本領域技術人員已知的任何數量的技術，例如Ficoll™分離，從收集自受試者的血液單位獲得T細胞。在一些實施方案中，通過單採血液成分術獲得來自個體的循環血液的細胞。單採血液成分術產物通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞，其它有核白細胞、紅細胞和血小板。在一些實施方案中，可以洗滌通過單採血液成分術收集的細胞以除去血漿部分並將細胞置於合適的緩衝液或培養基中以用於隨後的處理步驟。在一些實施方案中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一些實施方案中，洗滌溶液缺乏鈣並且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(如果不是全部的話)二價陽離子。如本領域普通技術人員將容易理解的，洗滌步驟可以通過本領域技術人員已知的方法完成，例如根據製造商的說明書通過使用半自動“流通式”離心機(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter細胞器或Haemonetics Cell Saver 5)進行。洗滌後，可以將細胞重懸於各種生物相容性緩衝液中，諸如不含Ca2+ 、不含Mg2+ 的PBS、PlasmaLyte A或其它含或不含緩衝液的鹽水溶液。或者，可除去單採血液成分術樣品中不需要的成分，並將細胞直接重懸於培養基中。
在一些實施方案中，通過裂解紅細胞並耗竭單核細胞，例如，通過PERCOLL™密度梯度離心或通過逆流離心淘析，從外周血淋巴細胞分離T細胞。可以通過陽性或陰性選擇技術進一步分離T細胞的特定亞群，諸如CD3+ 、CD28+ 、CD4+、CD8+ 、CD45RA+ 和CD45RO+ T細胞。可以使用多輪選擇。
通過負選擇富集T細胞群可以用針對負選擇細胞所特有的表面標誌物的抗體的組合來實現。一種方法是通過負磁性免疫粘附或流式細胞術進行細胞分選和/或選擇，所述負磁性免疫粘附或流式細胞術使用針對負選擇的細胞上存在的細胞表面標誌物的單株抗體的混合物。 [製品和試劑盒]
提供了包含用於治療表達CDLN 18.2的腫瘤(諸如實體瘤)或癌(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)的材料的製品。
在某些實施方案中，所述製品或試劑盒包含含有一種或多種本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體或組合物的容器。在某些實施方案中，製品或試劑盒包括含有編碼一種(或多種)本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體或組合物的核酸的容器。在一些實施方案中，試劑盒包括產生如本發明所述的抗CLDN18.2抗體的細胞系的細胞。在一些實施方案中，試劑盒包括一種或多種陽性對照，例如CLDN18.2(或其片段)或CLDN18.2+ 細胞。在一些實施方案中，試劑盒包括陰性對照，例如基本上不含CLDN18.2的表面或溶液。
在某些實施方案中，製品或試劑盒包括容器和在容器上或與容器相關的標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。這些容器可以由多種材料形成，諸如玻璃或塑膠。該容器容納一種組合物，該組合物單獨的或與有效治療、預防和/或診斷表達CDLN 18.2的腫瘤(諸如實體瘤)或癌(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)的另一種組合物組合，並且可以具有無菌進入埠(例如容器可以是靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的至少一種試劑是本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體。標籤或包裝插頁表明該組合物用於治療表達CDLN 18.2的腫瘤(諸如實體瘤)或癌(例如胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌等)。
此外，所述製品或試劑盒可包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發明所述的人源化抗CLDN18.2抗體；和(b)其中含有組合物的第二容器，其中所述組合物包含另外的細胞毒性劑或其它治療劑。在一些實施方案中，所述治療劑是免疫治療劑，如本發明所述。另外，所述製品還可包含另外的容器，所述容器包含藥學上可接受的緩衝液，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可以進一步包括從商業和使用者的觀點所期望的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、篩檢程式、針和注射器。
應理解，任何上述製品或試劑盒可包括本發明所述的免疫綴合物代替人源化抗CLDN18.2抗體(或除人源化抗CLDN18.2抗體外，還包括本發明所述的免疫綴合物)。
還提供了可用於各種目的的試劑盒，例如任選地與製品組合用於分離或檢測患者中的CLDN18.2。對於CLDN18.2的分離和純化，試劑盒可以含有本發明提供的與珠粒(例如瓊脂糖珠粒)偶聯的人源化抗CLDN18.2抗體(或其片段)。可以提供試劑盒，其包含用於在體外例如在ELISA或蛋白質印跡中檢測和定量CLDN18.2的抗體(或其片段)。就像該製品一樣，試劑盒包含容器和在容器上或與容器相關的標籤或包裝插頁。例如，所述容器容納包含至少一種本發明提供的人源化抗CLDN18.2抗體的組合物。可以包括另外的容器，其例如包含稀釋劑和緩衝液、對照抗體。標籤或包裝插頁可提供組合物的描述以及用於預期體外或診斷用途的說明書。 [實施例]
通過參考以下實施例將更全面地理解本發明。然而，這些實施例不應被解釋為限制本發明的範圍。應理解，本發明所述的實施例和實施方案僅用於說明目的，並且根據其的各種修改或變化將被建議給本領域技術人員，並且將包括在本發明的精神和範圍以及所附請求項的範圍內。 [實施例1：鼠抗人CLDN18.2抗體的人源化] [CDR移植抗體可變區序列的設計]
使用兩種不同的途徑，即基於結構的途徑和基於序列同源性的途徑，來使鼠抗人CLDN18.2抗體人源化。
在基於結構的途徑中，使用BIOLUMINATE® Suite (Schrödinger)生成鼠抗人CLDN18.2抗體的CDR環結構模型，並且然後使用所建模的鼠CDR環搜索人抗體的晶體結構資料庫(可從Schrödinger獲得)。然後選擇來自最接近匹配的人抗體結構的框架作為鼠CDR移植的受體框架。
在基於序列同源性的途徑中，針對IMGT人抗體種系基因資料庫(IMGT®，即國際免疫遺傳學資訊系統®，在www(dot)imgt(dot)org上可獲得)，使用IMGT的DomainGapAlign程式(在www(dot)imgt(dot)org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign(dot)cgi上可獲得)，分別對鼠重鏈和輕鏈序列的可變區進行序列同源性檢索。選擇最接近匹配的人抗體種系基因作為鼠CDR移植的受體框架。 [人源化回復突變重鏈和輕鏈變體的設計]
在將鼠CDR移植到所選擇的人種系基因框架上之後(如上文所述)，將人源化框架的氨基酸序列與鼠框架序列進行比較。如Padlan EA (1994)Mol Immunol . 31(3) 169-217 and Foote and Winter (1992)J.Mol.Biol. 224:487-499中所述，將以前顯示在CDR-框架相互作用和重鏈-輕鏈相互作用中起作用的人源化框架中的關鍵殘基被靶向回復為鼠殘基突變以保持人源化抗體對hCLDN18.2的親和力。通過改變回復突變的數目和被鑒定為對於恢復原始鼠抗體的抗原結合親和力可能關鍵的回復突變殘基的位置，設計了一系列重鏈和輕鏈變體。參見下表A、B、C和D。 [表A.全鼠和全人可變區的非CDR序列]
Figure 02_image013
Figure 02_image015
Figure 02_image017
[表B.人源化回復突變輕鏈(LC)可變區的非CDR序列]
Figure 02_image019
Figure 02_image021
[粗體和底線氨基酸表示鼠序列的回復突變] [表C.人源化回復突變重鏈(HC)可變區的非CDR序列]
Figure 02_image023
Figure 02_image025
[粗體和底線氨基酸表示向鼠序列的回復突變] [表D.人源化回復突變CLDN18.2抗體輕鏈變體和重鏈變體的可變區的氨基酸序列*]
SEQ ID NO ： 變體 氨基酸序列
53 鼠L DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSS QSLLNSGNQKN YLTWYQQKPGQPPKLLIY WAS TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNNYIYPFT FGSGTKLEIK
54 鼠H EVQLVESGGALVKPGGSLKLSCAAS GFTFSNYA MSWIRQTPEKRLEWVAT IIIGGTYT YYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYC ARQVYGNSFAY WGQGTLVTVSA
55 VK1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSS QSLLNSGNQKN YMTWYQQKPGKAPKLLIY WAS YLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QNNYIYPFT FGQGTKVEIK
56 VK2 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QSLLNSGNQKN YMNWYQQKPGKAPKLLIY WAS YLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QNNYIYPFT FGQGTKVEIK
57 VK3 DIVMTQSPDSLTVSLGERATISCKSS QSLLNSGNQKN YLTWYQQKPGQPPKLLIY WAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFSLTISSLQAEDVAVYYC QNNYIYPFT FGQGTKVEIK
58 VK4 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS QSLLNSGNQKN YLTWYQQKPGQPPKLLIY WAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNNYIYPFT FGQGTKVEIK
59 VH1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSNYA WNWIRQAPGKGLEWVAS IIIGGTYT NYNPSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARQVYGNSFAY WGQGTLVTVSS
60 VH2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVS GFTFSNYA WNWIRQAPGKGLEWVAS IIIGGTYT NYNPSVKGRITISRDDSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYC ARQVYGNSFAY WGQGTLVTVSS
61 VH3 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSNYA MHWIRQAPGKGLEWVAV IIIGGTYT YYADSVKGRFAISRDNPKNTLFLQMNSLRPDDTAVYYC ARQVYGNSFAY WGKGTTVTVSS
62 VH4 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSNYA MSWIRQAPGKGLEWVST IIIGGIYT YYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARQVYGNSFAY WGQGTLVTVSS
63 VH5 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSNYA MSWIRQAPGKGLEWVAT IIIGGIYT YYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARQVYGNSFAY WGQGTLVTVSS
64 VH6 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSNYA MSWIRQAPGKGLEWVST IIIGGTYT YYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARQVYGNSFAY WGQGTLVTVSS
65 VH7 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSNYA MSWIRQAPGKGLEWVAT IIIGGTYT YYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARQVYGNSFAY WGQGTLVTVSS
[*CDR序列為粗體並帶有底線] [CDR移植和回復突變變體的構建]
如以上表D所示，設計了總共4個輕鏈變體和7個重鏈變體。它們的DNA序列合成、克隆並表達為人IgG1，用於結合親和力表徵。這4個輕鏈和7個重鏈變體的完整交叉配對產生了28個重鏈/輕鏈組合，即HuCLDN18.2-v.1至v.28。參見表 E ： [表E.重/輕鏈組合和變體版本ID]
變體ID 表達組合 SEQ ID No的組合
HuCLDN18.2-v.1 VK1/VH1 SEQ ID NO：55和59
HuCLDN18.2-v.2 VK1/VH2 SEQ ID NO：55和60
HuCLDN18.2-v.3 VK1/VH3 SEQ ID NO：55和61
HuCLDN18.2-v.4 VK1/VH4 SEQ ID NO：55和62
HuCLDN18.2-v.5 VK1/VH5 SEQ ID NO：55和63
HuCLDN18.2-v.6 VK2/VH1 SEQ ID NO：56和59
HuCLDN18.2-v.7 VK2/VH2 SEQ ID NO：56和60
HuCLDN18.2-v.8 VK2/VH3 SEQ ID NO：56和61
HuCLDN18.2-v.9 VK2/VH4 SEQ ID NO：56和62
HuCLDN18.2-v.10 VK2/VH5 SEQ ID NO：56和63
HuCLDN18.2-v.11 VK3/VH1 SEQ ID NO：57和59
HuCLDN18.2-v.12 VK3/VH2 SEQ ID NO：57和60
HuCLDN18.2-v.13 VK3/VH3 SEQ ID NO：57和61
HuCLDN18.2-v.14 VK3/VH4 SEQ ID NO：57和62
HuCLDN18.2-v.15 VK3/VH5 SEQ ID NO：57和63
HuCLDN18.2-v.16 VK4/VH1 SEQ ID NO：58和59
HuCLDN18.2-v.17 VK4/VH2 SEQ ID NO：58和60
HuCLDN18.2-v.18 VK4/VH3 SEQ ID NO：58和61
HuCLDN18.2-v.19 VK4/VH4 SEQ ID NO：58和62
HuCLDN18.2-v.20 VK4/VH5 SEQ ID NO：58和63
HuCLDN18.2-v.21 VK1/VH6 SEQ ID NO：55和64
HuCLDN18.2-v.22 VK2/VH6 SEQ ID NO：56和64
HuCLDN18.2-v.23 VK3/VH6 SEQ ID NO：57和64
HuCLDN18.2-v.24 VK4/VH6 SEQ ID NO：58和64
HuCLDN18.2-v.25 VK1/VH7 SEQ ID NO：55和65
HuCLDN18.2-v.26 VK2/VH7 SEQ ID NO：56和65
HuCLDN18.2-v.27 VK3/VH7 SEQ ID NO：57和65
HuCLDN18.2-v.28 VK4/VH7 SEQ ID NO：58和65
[實施例2：HuCLDN18.2抗體的質粒構建，表達和純化]
合成編碼表D所示VH和VK變體的DNA片段。編碼VH結構域的DNA片段分別與人IgG1恆定區符合讀框地克隆到pcDNA3.4中，編碼VK結構域的DNA片段分別與人Ig Kappa恆定區符合讀框地克隆到pcDNA3.4中。將編碼重鏈和輕鏈DNA的質粒使用EXPIFECTAMINE™ 293(Thermo Fisher Scientific)轉染試劑轉染(轉染的HC:LC質粒=1:1)至6孔板中的2 mL Expi293F中。轉染20小時後將EXPIFECTAMINE™ 293轉染增強子1和2加入孔中。於37℃、在提供有5% CO2 的75%濕度的潮濕培養箱中培養培養物。轉染後6天，通過在4℃、13,200 rpm離心20分鐘來收穫轉染的培養物。使用蛋白質A HP SPINTRAP™柱(GE Healthcare)通過將上清液和樹脂在室溫下培養4分鐘來純化HuCLDN18.2抗體。該柱用pH 7.2的磷酸鈉緩衝液洗滌，然後用pH 2.9的100 mM甘氨酸-HCl洗脫。洗脫液用pH 9.0的1.0 M Tris-HCl中和。純化的抗體在pH 7.2的PBS緩衝液中透析，並通過0.2μm膜無菌過濾。表F中總結了來自2 mL培養物的HuCLDN18.2-v.1 - HuCLDN18.2-v.20的每一個的純化收率。表G總結了來自2 mL培養物的HuCLDN18.2-v.21 - HuCLDN18.2-v.28的每一個的純化收率。HuCLDN18.2-v.3、HuCLDN18.2-v.4、HuCLDN18.2-v.5、HuCLDN18.2-v.21和HuCLDN18.2-v.25不表達。抗體的SDS-PAGE分析，如圖1A-1F所示，證明所有HuCLDN18.2抗體(除了HuCLDN18.2-v.3、HuCLDN18.2-v.4、HuCLDN18.2-v.5、HuCLDN18.2-v.21和HuCLDN18.2-v.25)都純化至接近90%的純度。 [表F. 2 mL Expi293F培養物中HuCLDN18.2-v.1 - HuCLDN18.2-v.20的純化收率]
抗體 純化收率
嵌合CLDN18.2抗體 201 μg
HuCLDN18.2-v.1 45 μg
HuCLDN18.2-v.2 46 μg
HuCLDN18.2-v.3 無表達
HuCLDN18.2-v.4 無表達
HuCLDN18.2-v.5 無表達
HuCLDN18.2-v.6 198 μg
HuCLDN18.2-v.7 0 μg*
HuCLDN18.2-v.8 103 μg
HuCLDN18.2-v.9 105 μg
HuCLDN18.2-v.10 106 μg
HuCLDN18.2-v.11 192 μg
HuCLDN18.2-v.12 102 μg
HuCLDN18.2-v.13 143 μg
HuCLDN18.2-v.14 72 μg
HuCLDN18.2-v.15 196 μg
HuCLDN18.2-v.16 193 μg
HuCLDN18.2-v.17 98 μg
HuCLDN18.2-v.18 192 μg
HuCLDN18.2-v.19 99 μg
HuCLDN18.2-v.20 175 μg
[* HuCLDN18.2-v.7在用pH 2.9的100 mM甘氨酸-HCl洗脫以及透析過程後在用pH 9.0的1M Tris-HCl中和的步驟中沉澱。因此，未回收HuCLDN18.2-v.7抗體。] [表G. 2 mL Expi293F培養物中HuCLDN18.2-v.21 - HuCLDN18.2-v.28的純化收率]
抗體 純化收率
HuCLDN18.2-v.21 無表達
HuCLDN18.2-v.22 193 μg
HuCLDN18.2-v.23 190 μg
HuCLDN18.2-v.24 256 μg
HuCLDN18.2-v.25 無表達
HuCLDN18.2-v.26 189 μg
HuCLDN18.2-v.27 188 μg
HuCLDN18.2-v.28 181 μg
[實施例3A.流式細胞術分析HuCLDN18.2抗體與表達CLDN18.2的細胞的結合]
使用HEK293-CLDN18.2細胞(即，表達人CLDN18.2的穩定的HEK293細胞系)和KATO-III(ATCC® HTB-103™) (即CLDN18.2+ 人胃癌細胞系)經由FACS評估圖1A-1D所示的純化的HuCLDN18.2抗體與細胞表面表達的人CLDN18.2的相互作用。FACS試驗按如下進行：製備每種抗體的系列稀釋液，在冰上用HEK293-CLDN18.2或KATO-III細胞染色一小時，抗體終濃度為20 μg/ml、10 μg/ml、5 μg/ml、2.5 μg/ml、1.25 μg/ml、0.63 μg/ml、0.31 μg/ml、0.16 μg/ml、0.08 μg/ml、0.04 μg/ml、0.02 μg/ml和0.01 μg/ml。用染色緩衝液(PBS+2%胎牛血清)洗滌細胞以除去游離抗體，並進一步用ALEXA FLUOR 488®(螢光染料綴合的抗人IgG抗體)在冰上染色30分鐘。洗滌細胞並通過FACS分析。人源化抗體的結合曲線和EC50 值總結在圖2A-2B和圖3中。
如圖2A和2B所示，在使用HEK293-CLDN18.2細胞、HuCLDN18.2-v.1、v.2、v.11、v.14、v.15、v.16、v.19和v.20的試驗中，證明了與自製嵌合抗CLDN18.2抗體和參照抗CLDN18.2抗體IMAB362相當的EC50 值。還測試了人源化抗體與KATO III細胞的結合。如圖3中所示，發現HuCLDN18.2-v.14、v.15、v.19和v.20的EC50 值和最大結合值與自製嵌合抗CLDN18.2抗體相當。此外，發現HuCLDN18.2-v.1、v.2、v.11和v.16的EC50 值和最大結合值與參照抗CLDN18.2抗體IMAB362的那些相當。 [實施例3B.流式細胞術分析HuCLDN18.2抗體與表達CLDN18.2的細胞的結合]
使用HEK293-CLDN18.2細胞(即，表達人CLDN18.2的穩定的HEK293細胞系)和KATO-III(ATCC® HTB-103™) (即CLDN18.2+ 人胃癌細胞系)經由FACS評估圖1E-1F所示的純化的HuCLDN18.2抗體與細胞表面表達的人CLDN18.2的相互作用。FACS試驗按如下進行：製備每種抗體的系列稀釋液，在冰上用HEK293-CLDN18.2或KATO-III細胞染色一小時，抗體終濃度為20 μg/ml、10 μg/ml、5 μg/ml、2.5 μg/ml、1.25 μg/ml、0.63 μg/ml、0.31 μg/ml、0.16 μg/ml、0.08 μg/ml、0.04 μg/ml、0.02 μg/ml和0.01 μg/ml。用染色緩衝液(PBS+2%胎牛血清)洗滌細胞以除去游離抗體，並進一步用ALEXA FLUOR 488®(螢光染料綴合的抗人IgG抗體)在冰上染色30分鐘。洗滌細胞並通過FACS分析。人源化抗體的結合曲線和EC50 值總結在圖4和圖5中。
如圖4中所示，在使用HEK293-CLDN18.2細胞、HuCLDN18.2-v.23、v.24、v.27和v.28的試驗中，顯示了與自製嵌合抗CLDN18.2抗體和參照抗CLDN18.2抗體IMAB362相當的EC50 值。還測試了人源化抗體與KATO III細胞的結合。如圖5中所示，發現HuCLDN18.2-v.23、v.24、v.27和v.28的EC50 值和最大結合值與自製嵌合抗CLDN18.2抗體相當。 [實施例4：HuCLDN18.2抗體的結合特異性]
使用HEK293-CLDN18.1細胞(即表達人CLDN18.1的穩定的HEK293細胞系)經由FACS評估圖1A-1F中所示的純化的HuCLDN18.2抗體與細胞表面表達的人CLDN18.1的結合。還使用HEK293-CLDN18.2細胞(即表達人CLDN18.2的穩定的HEK293細胞系)作為對照，經由FACS評估圖1A-1F中所示的純化的HuCLDN18.2抗體與細胞表面表達的人CLDN18.2的結合。FACS試驗按如下進行：製備20 μg/ml的每一種HuCLDN18.2抗體並在冰上用HEK293-CLDN18.2或HEK293-CLDN18.1細胞染色一小時。用染色緩衝液(PBS+2%胎牛血清)洗滌細胞以除去游離抗體，並進一步用ALEXA FLUOR 488®(螢光染料綴合的抗人IgG抗體)在冰上染色30分鐘。洗滌細胞並通過FACS分析。人源化抗體的結合總結在圖6中。
如圖6中所示，未檢測到HuCLDN18.2抗體與HEK293-CLDN18.1細胞結合。因此，所有HuCLDN18.2抗體均顯示對HEK293-CLDN18.2的特異性結合。 [實施例5：評估抗CLDN18.2抗體與IMAB362特異性肽的結合]
IMAB362(也稱為zolbetuximab或claudiximab)是對CLDN18.2有特異性的嵌合IgG1抗體。預先通過噬菌體展示開發了兩種小環化肽(即，肽2C和肽3C)，然後經由肽微陣列技術優化以結合IMAB362，用於通過ELISA在臨床組織樣品中檢測血清IMAB362(參見Daneschdar et al.(2014) JPT Peptide Technologies, Volmerstrasse 5, 12489)。 Daneschdar和同事們通過ELISA顯示IMAB362以亞納摩爾親和力與肽2C和肽3C結合。通過ELISA評估圖1A-1F中所示的抗體和參考抗體IMAB362結合肽2C和肽3C的能力。
如圖7A和圖7B所示，僅發現參考抗體IMAB362結合肽2C和3C。相反，沒有發現測試的HuCLDN18.2抗體可檢測地結合任一肽。這些結果表明，所有HuCLDN18.2抗體與CLDN18.2的表位結合、與IMAB362結合的表位不同。 [實施例6：評價Fc突變對HuCLDN18.2-v.19的ADCC活性的影響]
HuCLDN18.2-v.19的Fc結構域是野生型人IgG1。對包含HuCLDN18.2-v.19可變結構域和以下所列的變體Fc結構域之一的氨基酸序列的抗體進行構建、表達和純化。每個Fc變體結構域中的突變用粗體和底線表示。 Fc結構域變體1： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PD VFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPL PE EKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG(SEQ ID NO：109) Fc結構域變體2： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFL L PPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKP P EEQYN ST L RVVS I LT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTP L V LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG(SEQ ID NO：110) Fc結構域變體3： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN A TYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPI AA TIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG(SEQ ID NO ： 111)
如下製備用於ADCC測定的試劑：將純化的抗體在ADCC測定培養基(99.5% RPMI 1640 + 0.5%FBS)中稀釋至20 μg/ml的濃度。進行5倍連續稀釋以產生10種另外的工作液(即，4 μg/ml、0.8 μg/ml、160 ng/ml、32 ng/ml、6.4 ng/ml、1.28 ng/ml、256 pg/ml、51.2 pg/ml、10.24 pg/ml和2.048 pg/ml用於ADCC測定。分別培養ADCC效應細胞(ADCC FcγRIIIa(158V)Jurkat效應細胞系克隆，Genomeditech，Cat#GM-C01620)和靶細胞(Kato-III-hClaudin18.2細胞系，由BEIJING XUANYI PHARMATECH公司開發)，直到ADCC效應細胞和靶細胞的細胞密度達到1.2×106 /ml。兩種培養物的細胞活力均大於90%。將效應細胞培養物和靶細胞培養物以1000 rpm離心5分鐘。棄去上清液，然後將效應細胞和靶細胞各自重懸於ADCC測定培養基中至終密度為6.0×106 /ml(效應細胞)和4.0×105 /ml(靶細胞)。
為了準備測定，將25 μl每種HuCLDN18.2-v.19抗體變體的每種工作溶液加入到微量滴定盤的單獨孔中。接著，向各孔中依次加入25 μl靶細胞和25 μl效應細胞。效應細胞與靶細胞的比例為15:1。在單獨的孔中平行製備以下對照：(1)75 μl的ADCC測定培養基(背景對照)；和(2)25μl的ADCC測定培養基，25 μl效應細胞和25 μl靶細胞(陰性對照)。在向含有HuCLDN18.2-v.19抗體變體的各孔中添加效應細胞和靶細胞後，將微量滴定板於37℃和5%CO2 下培養6小時。培養後，將微量滴定板冷卻至室溫15分鐘。接著，向各孔中加入75 μl BIO-GLO™螢光素酶試劑(Promega Catalog #G7940)，並將微量滴定板在室溫下培養5分鐘。每個孔中產生的信號由SPECTRA MAX i3x®微板讀數器讀取。發光值由SPECTRA MAX i3x®微板讀數器以全長波讀取模型獲得。對於相對發光單位(RLU)分析，將發光值直接輸出至GraphPad Prism以計算EC50 並進行曲線擬合分析。對於誘導倍數(FI)分析，通過下式計算FI值：FI= (Exp_RLU - B_RLU) / (CK_RLU-B_RLU)，其中Exp_RLU是實驗樣品的RLU，B_RLU是背景的RLU，且CK_RLU是RLU的陰性對照。將計算的FI值輸出至GraphPad Prism以計算EC50 並進行曲線擬合分析。
如圖8中所示，HuCLDN18.2-v.19_變體1抗體的EC50 和HuCLDN18.2-v.19_變體2抗體的EC50 均比包含WT人IgG1 Fc的HuCLDN18.2的EC50 高約100倍。HuCLDN18.2-v.19_變體3的EC50 比包含WT人IgG1 Fc的HuCLDN18.2高大約~30倍。 [實施例7：小鼠模型中所選HuCLDN18.2抗體的體內功效研究]
在同系Mc38-HuCLDN18.2異種移植小鼠模型中評價了HuCLDN18.2-v.2-mIgG2a、HuCLDN18.2-v.19-mIgG2a和HuCLDN18.2-v.24-mIgG2a的抗腫瘤活性。Mc38-HuCLDN18.2細胞系是已被工程化以表達人claudin 18.2的鼠claudin18.2-/- 小鼠結腸癌細胞系。用Mc38-hCLDN18.2腫瘤細胞在右前肋區皮下接種六組C57BL/6N小鼠(7隻小鼠/組)。一旦平均腫瘤體積約為87 mm3 ，則如表H所示進行處理。小鼠通過i.v.給藥每週處理兩次。 [表H:不同處理組的攜帶Mc38-HuCLDN18.2結腸癌細胞小鼠的平均腫瘤生長抑制(TGI)]
組別 治療 小鼠數量/組 劑量 (mg/kg)a 施用途徑 TGI%
G1 緩衝液 7 5 i.v.   
G2 IMAB362-mIgG2a 7 5 i.v. 25.8
G3 嵌合CLDN18.2-mIgG2a 7 5 i.v. 18.6
G4 HuCLDN18.2-v.2-mIgG2a 7 5 i.v. 10.8
G5 HuCLDN18.2-v.19-mIgG2a 7 5 i.v. 39.7
G6 HuCLDN18.2-v.24-mIgG2a 7 5 i.v. 39.3
如圖9和表H所示，施用後第18天，用HuCLDN18.2-v.19-mIgG2a(1433±363 mm3 )或HuCLDN18.2-v.24-mIgG2a(1442±2318 mm3 )處理的小鼠的平均腫瘤體積小於用緩衝液對照(2318±750 mm3 )處理的小鼠的平均腫瘤體積(HuCLDN18.2-v.19-mIgG2a 與緩衝液：P＜0.05；HuCLDN18.2-v.24-mIgG2a 與緩衝液：P＜0.05)。HuCLDN18.2-v.19-mIgG2a或HuCLDN18.2-v.24-mIgG2a(1442±2318 mm3 )處理的小鼠的平均腫瘤體積小於IMAB362-mIgG2a處理的小鼠的平均腫瘤體積。
無。
圖1A顯示了自製嵌合抗hCLDN18.2抗體和下列純化的HuCLDN18.2抗體：v.13、v.1、v.2、v.6、v.7、v.8、v.9、v.10、v.17和v.19的非還原性SDS PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)分析。
圖1B顯示了自製嵌合抗hCLDN18.2抗體和下列純化的HuCLDN18.2抗體：v.13、v.1、v.2、v.6、v.7、v.8、v.9、v.10、v.17和v.19的還原性SDS PAGE分析。
圖1C顯示了自製嵌合抗hCLDN18.2抗體和下列純化的HuCLDN18.2抗體：v.11、v.12、v.13、v.14、v.15、v.16、v.18和v.20的非還原性SDS PAGE分析。
圖1D顯示了自製嵌合抗hCLDN18.2抗體和下列純化的HuCLDN18.2抗體：v.11、v.12、v.13、v.14、v.15、v.16、v.18和v.20的還原性SDS PAGE分析。
圖1E顯示了下列純化的HuCLDN18.2抗體：v.22、v.23、v.24、v.26和v.27的還原性SDS PAGE分析，和下列純化的HuCLDN18.2抗體：v.22、v.23、v.24、v.26、v.27和v.28的非還原性SDS-PAGE分析。
圖1F顯示了下列純化的HuCLDN18.2抗體：v.19和v.28的還原性SDS-PAGE分析和非還原SDS-PAGE分析。
圖2A提供了實驗結果，進行該實驗用於評價與自製嵌合抗CLDN18.2抗體和參照抗CLDN18.2抗體IMAB362相比，人源化抗CLDN18.2抗體v.1、v.2、v.6、v.8、v.9、v.10、v.17和v.19與在HEK293-CLDN18.2細胞表面表達的CLDN18.2的結合。
圖2B提供了實驗結果，進行該實驗用於評價與自製嵌合抗CLDN18.2抗體和參照抗CLDN18.2抗體IMAB362相比，人源化抗CLDN18.2抗體v.11、v.12、v.13、v.14、v.15、v.16、v.18和v.20與在HEK293-CLDN18.2細胞表面表達的CLDN18.2的結合。
圖3提供了實驗結果，進行該實驗用於評價與自製嵌合抗CLDN18.2抗體和參照抗CLDN18.2抗體IMAB362相比，人源化抗CLDN18.2抗體v.1、v.2、v.11、v.14、v.15、v.16、v.19和v.20與在KATO III人胃癌細胞表面表達的CLDN18.2的結合。
圖4提供了實驗結果，進行該實驗用於評價與自製嵌合抗CLDN18.2抗體和參照抗CLDN18.2抗體IMAB362相比，人源化抗CLDN18.2抗體v.22、v.23、v.24、v.26、v.27和v.28與在HEK293-CLDN18.2細胞表面表達的CLDN18.2的結合。
圖5提供了實驗結果，進行該實驗用於評價與自製嵌合抗CLDN18.2抗體和參照抗CLDN18.2抗體IMAB362相比，人源化抗CLDN18.2抗體v.23、v.24、v.27和v.28與在KATO III人胃癌細胞表面表達的CLDN18.2的結合。
圖6提供了實驗結果，進行該實驗用於評價人源化抗CLDN18.2抗體v.1、v.2、v.6、v.8、v.9、v.10、v.11、v.12、v.13、v.14、v.15、v.16、v.17、v.18、v.19、v.20、v.22、v.23、v.24、v.26、v.27和v.28與CLDN18.1的結合。
圖7A提供了實驗結果，進行該實驗用於評價人源化抗CLDN18.2抗體v.1、v.2、v.6、v.8、v.9、v.10、v.11、v.12、v.13、v.14、v.15、v.16、v.17、v.18、v.19、v.20、v.22、v.23、v.24、v.26、v.27和v.28與肽2C的結合。
圖7B提供了實驗結果，進行該實驗用於評價人源化抗CLDN18.2抗體v.1、v.2、v.6、v.8、v.9、v.10、v.11、v.12、v.13、v.14、v.15、v.16、v.17、v.18、v.19、v.20、v.22、v.23、v.24、v.26、v.27和v.28與肽3C的結合。
圖8提供了實驗結果，進行該實驗用於評價與包含野生型人IgG1 Fc結構域的人源化抗CLDN18.2 v.19抗體相比人源化抗CLDN18.2抗體v.19_Fc變體1、v.19_Fc變體2和v.19_Fc變體3的ADCC活性。
圖9提供了在小鼠中同基因Mc38-HuCLDN18.2腫瘤異種移植實驗的結果，進行這些實驗以評價抗體HuCLDN18.2-v2、HuCLDN18.2-v19、HuCLDN18.2-v24、自製嵌合抗CLDN18.2抗體和參考抗體IMAB362在抑制腫瘤生長中的體內功效。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (27)

  1. 一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含CDR-H2，所述CDR-H2包含IIIGGIYT(SEQ ID NO：6)。
  2. 如請求項1所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其進一步包含： (a)CDR-L1，其包含QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO：1)； (b)CDR-L2，其包含WAS(SEQ ID NO：2)； (c)CDR-L3，其包含QNNYIYPFT(SEQ ID NO：3)； (d)CDR-H1，其包含GFTFSNYA(SEQ ID NO：4)；以及 (e)CDR-H3，其包含ARQVYGNSFAY(SEQ ID NO：7)。
  3. 一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含： VL結構域，其包含如SEQ ID NO：55-58中所示的任一氨基酸序列；和/或 VH結構域，其包含如SEQ ID NO：59-65中所示的任一氨基酸序列。
  4. 一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含： (i)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：59； (ii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：60； (iii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：61； (iv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：62； (v)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：63； (vi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：59； (vii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：60； (viii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：61； (ix)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：62； (x)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：63； (xi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：59； (xii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：60； (xiii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：61； (xiv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：62； (xv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：63； (xvi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：59； (xvii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：60； (xviii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：61； (xix)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：62； (xx)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：63； (xxi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：64； (xxii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：64； (xxiii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：64； (xxiv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：64； (xxv)VL結構域，其包含SEQ ID NO：55；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：65； (xxvi)VL結構域，其包含SEQ ID NO：56；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：65； (xxvii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：57；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：65； 或 (xxviii)VL結構域，其包含SEQ ID NO：58；和/或VH結構域，其包含SEQ ID NO：65。
  5. 一種包含輕鏈可變結構域(VL)和重鏈可變結構域(VH)的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段， 其中所述VL結構域包含： (i)框架區1(FW1)，其包含SEQ ID NO：34、37、39或20； (ii)框架區2(FW2)，其包含SEQ ID NO：35、38或40； (iii)框架區3(FW3)，其包含SEQ ID NO：36或22；以及 (iv)框架區4(FW4)，其包含SEQ ID NO：19；且 其中所述VH包含： (i)框架區1(FW1)，其包含SEQ ID NO：41、44、46或49； (ii)框架區2(FW2)，其包含SEQ ID NO：42、47、50或52； (iii)框架區3(FW3)，其包含SEQ ID NO：43、45、48或51；以及 (iv)框架區4(FW4)，其包含SEQ ID NO：26或30。
  6. 如請求項5所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段， 其中所述VL包含： (i)FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含SEQ ID NO：19； (ii)FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含SEQ ID NO：19； (iii)FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含SEQ ID NO：19；或者 (iv)FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含SEQ ID NO：19；且 其中所述VH包含： (i)FW1，其包含SEQ ID NO：41；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：43；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (ii)FW1，其包含SEQ ID NO：44；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：45；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (iii)FW1，其包含SEQ ID NO：46；FW2，其包含SEQ ID NO：47；FW3，其包含SEQ ID NO：48；和FW4，其包含SEQ ID NO：30； (iv)FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (v)FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (vi)FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；或者 (vii)FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26。
  7. 如請求項5或6所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中： (a)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：43；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (b)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：44；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：45；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (c)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：46；FW2，其包含SEQ ID NO：47；FW3，其包含SEQ ID NO：48；和FW4，其包含SEQ ID NO：30； (d)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (e)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (f)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：43；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (g)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：44；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：45；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (h)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：46；FW2，其包含SEQ ID NO：47；FW3，其包含SEQ ID NO：48；和FW4，其包含SEQ ID NO：30； (i)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (j)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (k)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：43；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (l)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：44；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：45；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (m)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：46；FW2，其包含SEQ ID NO：47；FW3，其包含SEQ ID NO：48；和FW4，其包含SEQ ID NO：30； (n)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (o)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (p)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：41；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：43；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (q)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：44；FW2，其包含SEQ ID NO：42；FW3，其包含SEQ ID NO：45；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (r)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：46；FW2，其包含SEQ ID NO：47；FW3，其包含SEQ ID NO：48；和FW4，其包含SEQ ID NO：30； (s)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (t)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (u)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (v)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (w)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (x)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：50；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (y)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：34；FW2，其包含SEQ ID NO：35；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (z)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：37；FW2，其包含SEQ ID NO：38；FW3，其包含SEQ ID NO：36；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26； (aa)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：39；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26；或者 (bb)所述VL包含：FW1，其包含SEQ ID NO：20；FW2，其包含SEQ ID NO：40；FW3，其包含SEQ ID NO：22；和FW4，其包含：SEQ ID NO：19；並且所述VH包含：FW1，其包含SEQ ID NO：49；FW2，其包含SEQ ID NO：52；FW3，其包含SEQ ID NO：51；和FW4，其包含SEQ ID NO：26。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含人IgG的Fc結構域序列。
  9. 如請求項8所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述人IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  10. 如請求項1至7中任一項所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含Fc結構域，所述Fc結構域包含SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：111的氨基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體為人源化抗體。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之抗CLDN18.2抗體的抗原結合片段，其中所述抗原結合片段選自由以下組成的組：Fab、Fab’、F(ab)’2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段、雙抗和線性抗體。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之抗CLDN18.2抗體，其中所述抗體是多特異性抗體。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之抗CLDN18.2抗體，其中所述CLDN18.2是人CLDN18.2。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其與治療劑綴合。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其與標記物綴合。
  17. 如請求項16所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述標記物選自由以下組成的組：放射性同位素、螢光染料和酶。
  18. 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至14中任一項所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段。
  19. 一種編碼如請求項18所述之核酸分子的表達載體。
  20. 一種包含如請求項18所述之核酸分子或如請求項19所述之表達載體的宿主細胞。
  21. 一種產生抗CLDN18.2抗體的方法，其包含培養如請求項20所述之宿主細胞；和從細胞培養物中回收抗體。
  22. 一種組合物，其包含如請求項1至15中任一項所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段；以及藥學上可接受的載體。
  23. 一種檢測來自患者的樣品中的CLDN18.2蛋白的方法，所述方法通過使如請求項1至14和16至17中任一項所述之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段與所述樣品接觸並檢測與所述CLDN18.2蛋白結合的抗CLDN18.2抗體來進行。
  24. 如請求項23所述之方法，其中所述抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段用於免疫組織化學測定(IHC)或ELISA測定中。
  25. 一種治療受試者的癌症的方法，包含向所述受試者施用有效量的如請求項22所述之組合物。
  26. 如請求項25所述之方法，其中所述癌症選自實體瘤、胃癌、食管癌、胃食管交界癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌。
  27. 如請求項25或26所述之方法，其中向所述受試者進一步施用選自由以下組成的組的治療劑：抗腫瘤劑、化療劑、生長抑制劑和細胞毒性劑。
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