KR20150120994A - 암의 치료에 클라우딘 18.2에 대한 항체를 이용하는 조합 요법 - Google Patents

암의 치료에 클라우딘 18.2에 대한 항체를 이용하는 조합 요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌장암 및 그의 전이암과 같은 암 질환을 포함하여 CLDN18.2를 발현하는 세포와 관련된 질환을 효과적으로 치료 및/또는 예방하기 위한 복합 치료법을 제공한다.

Description

암의 치료에 클라우딘 18.2에 대한 항체를 이용하는 조합 요법{COMBINATION THERAPY INVOLVING ANTIBODIES AGAINST CLAUDIN 18.2 FOR TREATMENT OF CANCER}
췌장암은 가장 치명적인 암 중 하나이다. 췌장암은 조기에 전이 확산되는 경향과, 방사선 치료 및 화학요법에 대한 내성이 높기 때문에 치사율이 100%에 근접한다. 북아메리카에서만 매년 27,000 건의 췌장암이 발명하고 유럽에서는 68,000 건이 발병하므로, 췌장암 환자들의 사망율을 저감시키기 위한 새로운 치료전략이 시급한 실정이다.
밀착연접(tight junction) 분자인 클라우딘 18 스플라이스 변이체 2 (클라우딘 18.2 (CLDN18.2))는 밀착연접 단백질들의 클라우딘 패밀리의 일원이다. CLDN18.2는 2개의 작은 세포외 루프와 함께, 4개의 막 스패닝 도메인으로 이루어져 있다. 정상 조직에서는 위장을 제외하고 RT-PCR에 의해 CLDN18.2의 발현이 검출되지 않는다. CLDN18.2 특이 항체를 이용한 면역조직화학에 의하면 위장은 유일한 양성 조직이다. CLDN18.2는 단명한(short-lived) 분화된 위상피세포 상에서만 발현되는 고도로 선택적인 위 직계 항원이다. CLDN18.2는 악성 세포전환의 경과 중에 유지되며 그에 따라 인간 위암 세포 표면에 종종 나타난다. 뿐만 아니라, 이 범종양 항원은 식도, 췌장 및 폐 선암종에서 유의적인 수준으로 이소적으로(ectopically) 활성화된다.
CLDN18.2에 지향된 키메라 IgG1 항체 IMAB362가 가니메드 파마슈티칼스 아게(Ganymed Pharmaceuticals AG)에 의해 개발되었다. IMAB362는 CLDN18.2의 첫번째 세포외 도메인(ECD1)을 고도의 친화성과 특이성으로 인식한다. IMAB362는 클라우딘 18의 밀접하게 관련된 스플라이스 변이체 1(CLDN18.1)을 비롯한 다른 어떠한 클라우딘 패밀리 멤버와도 결합하지 않는다. IMAB362는 정확한 종양 세포 특이성과 4개의 독립적이고 고도로 강력한 작용 메카니즘을 나타낸다. IMAB362는 표적과 결합하면 ADCC, CDC 및 종양 세포 표면에서의 표적의 가교에 의해 유도된 세포자멸사의 유발 그리고 직접적인 증식 저해에 의해 세포 사멸을 매개한다. 따라서, IMAB362는 시험관내 및 생체내에서 인간 위암 세포주를 비롯한 CLDN18.2-양성 세포를 효과적으로 용해시킨다.
시노몰구스 원숭이에 있어서 투여량 범위 탐색 연구, 28일 반복형 투여량 독성 연구와 마우스에 있어서 3개월 반복형 투여량 독성 연구를 비롯하여 IMAB362의 독성 및 PK/TK 프로파일이 마우스와 시노몰구스 원숭이에 대해 철저히 수행되었다. 마우스(최장 치료기간 3개월간 매주 투여, 최고 투여량 수준 400 mg/kg) 및 시노몰구스 원숭이(최대 5주일간 최대 100 mg/kg 투여) 양자 모두에서 IMAB362 i.v.의 반복 투여가 잘 관용되었다. 전신 독성 또는 국소 독성의 징후는 관찰되지 않았다. 특히, 어떠한 독성 연구에서도 위장 독성은 관찰된 바 없다. IMAB362는 면역 활성화 및 시토카인 방출을 유도하지 않는다. 남성이나 여성의 생식기관에 대한 어떠한 약영향도 기록되지 않았다. IMAB362는 표적이 없는 조직에는 결합하지 않는다. 마우스에서의 바이오분포 연구 결과 위장 독성이 없는 이유는 아마도 건강한 위장 상피의 내강 위치(luminal site)에서의 밀착연접의 구획화(compartimentalization)에 기인하는 것으로 여겨지며, 이것이 IMAB362 에피토프의 접근성을 심하게 방해하는 것으로 보인다.
IMAB362는 초기 임상단계 시험중이다. I상 임상 연구가 사람을 대상으로 수행되었다. 3명의 각 환자들의 5 투여량 코호트 (33　mg/m2, 100 mg/m2, 300 mg/m2, 600 mg/m2, 1000 mg/m2)에게 IMAB362를 일회 정맥투여하고 28일간 관찰하였다. IMAB362는 환자들에서 유관성 있는 안전성 관찰 없이 매우 잘 관용되었다. 한 명의 환자에 있어서 측정된 모든 종양 마커들이 치료 4주 이내에 유의적으로 감소되었다. 진행 중인 IIa상 임상 시험에서는 IMAB362가 반복 투여된다.
본 발명에서 본 발명자들은 화학요법 약물이 췌장암 세포 표면에서 CLDN18.2를 안정화시키거나 그의 발현을 증가시킴으로 해서, IMAB362와 같은 항CLDN18.2 항체에 의한 CLDN18.2의 약물가능성(drugability)을 개선시킴을 입증하는 데이터를 제시한다. IMAB362와 같은 항CLDN18.2 항체와 특정 화학요법, 특히 췌장암 치료에 사용되는 화학요법과의 상승 효과가 관찰되었다. 화학요법에 의해 전처리된 인간 암세포들은 항체-유도된 표적-특이적 사멸에 대해 보다 감수성이 높았다. 마우스 종양 모델에서, 항CLDN18.2 항체 플러스 화학요법을 이용한 종양 제어는 단일 약물로서 항CLDN18.2 항체를 이용한 경우보다 더 우수하다.
발명의 개요
본 발명은 일반적으로 위암, 식도암, 췌장암, 폐암 예컨대 비소세포 폐암 (NSCLC), 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 및 담낭암 및 이들의 전이암, 특히 크루켄버그 종양과 같은 위암 전이 종양, 복강 전이 및 림프절 전이와 같은 암 질환을 비롯하여, CLDN18.2를 발현하는 세포와 연관된 질병을 효과적으로 치료 및/또는 예방하기 위한 조합 치료법을 제공한다. 특히 바람직한 암 질환은 췌장암 및 그의 전이암이다.
일 측면에서, 본 발명은 환자에게 (i) CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) CLDN18.2의 발현, 즉 발현 수준을 안정화 또는 증가시키는 물질을 투여하는 것을 포함하는, 환자에 있어서 췌장암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. CLDN18.2의 발현은 좋기로는 암세포의 세포 표면에서 일어난다. CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 또는 그의 조합의 투여 전, 투여와 동시 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
The CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 세포독성 및/또는 세포증식억제 물질일 수 있다. 일 구체예에서, CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 유도하거나 또는 1개 이상의 세포 주기 페이즈, 좋기로는, S-페이즈, G2-페이즈와 같이 G1-페이즈 이외의 세포 주기 또는 그의 조합 또는 S-페이즈 또는 G2-페이즈와 G1-페이즈와의 조합 주기에 세포를 축적시키는 것을 유도하는 물질을 포함한다. CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질에는 뉴클레오사이드 유사체, 백금 화합물, 캄토테신 유사체 및 탁산, 그의 전구약물, 그의 염 및 그의 조합이 포함된다. 뉴클레오사이드 유사체는 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 그의 전구약물 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 백금 화합물은 옥살리플라틴, 시스플라틴, 그의 전구약물 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 캄토테신 유사체는 이리노테칸, 토포테칸, 그의 전구약물 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 탁산은 파클리탁셀, 도세탁셀, 그의 전구약물 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 파클리탁셀, 그의 전구약물, 그의 염 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 포함할 수 있다. CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 옥살리플라틴과 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물과의 조합, 시스플라틴과 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물과의 조합, 적어도 1종의 탁산과 옥살리플라틴과의 조합, 적어도 1종의 탁산화 시스플라틴과의 조합, 적어도 1종의 탁산과 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물과의 조합, 또는 적어도 1종의 캄토테신 유사체와 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물과의 조합을 포함할 수 있다. CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 겜시타빈과 옥살리플라틴과의 조합, 겜시타빈과 시스플라틴과의 조합, 겜시타빈과 카르보플라틴과의 조합 또는 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물과 이리노테칸과의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 겜시타빈 및 옥살리플라틴의 조합, 겜시타빈 및 시스플라틴의 조합, 겜시타빈 및 카르보플라틴의 조합 또는 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물 및 이리노테칸의 조합을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 폴린산, 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물, 이리노테칸 및 옥살리플라틴을 투여하는 것을 포함한다. CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 면역원성 세포의 사멸을 유도하는 물질을 포함할 수 있다. 면역원성 세포의 사멸을 유도하는 물질은 옥살리플라틴을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에게 (i) CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) 겜시타빈을 투여하는 것을 포함하는, 환자에 있어서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 암은 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 방광암 및 그의 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 암 질환은 크루켄버그 종양, 복강 전이암 및/또는 림프절 전이암일 수 있다. 일 구체예에서, 암은 선암종, 특히 진행된 선암종일 수 있다. 일 구체예에서, 암은 췌장암이다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 γδ T 세포를 자극하는 물질를 자극하는 물질을 투여하는 것을 더 포함한다. 일 구체예에서, γδ T 세포는 Vγ9Vδ2 T 세포이다. 일 구체예에서, γδ T 세포를 자극하는 물질은 비스포스포네이트 예컨대 질소-함유 비스포스포네이트(아미노비스포스포네이트)이다. 일 구체예에서, γδ T 세포를 자극하는 물질은 졸레드론산, 클로드론산, 이반드론산, 파미드론산, 리제드론산, 미노드론산, 올레판드론산, 알렌드론산, 인카드론산 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, γδ T 세포를 자극하는 물질은 인터류킨-2와 조합하여 투여된다.
본 발명의 방법은 세포독성 물질일 수 있는 적어도 1종의 추가 화학요법 약제를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 살아있는 세포 표면에 존재하는 CLDN18.2의 천연 에피토프에 결합할 수 있다. 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN18.2의 제1 세포외 루프에 결합한다. 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 하나 이상의 보체의존성 세포독성(CDC) 매개된 용해, 항체 의존성 세포독성(ADCC) 매개된 용해, 세포자멸사의 유도 및 증식 억제에 의해 세포 사멸을 매개한다. 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 모노클로날, 키메라 또는 인간화 항체, 또는 항체 단편이다. 일 구체예에서, 상기 항체는 세포의 CLDN18.2에 결합되었을 때, 특히 그의 세포 표면에서 세포에 의해 발현된 CLDN18.2에 결합되었을 때 (여기서 세포는 암 세포, 예컨대 본 발명에 설명된 바와 같은 암 세포임) 세포 사멸을 유도한다. 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 (i) 수탁번호 DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, 또는 DSM ACC2810으로 기탁된 클론으로부터 생산 및/또는 수득가능한 항체, (ii) 상기 (i)의 항체의 키메라 형태 또는 인간화 형태인 항체, (iii) 상기 (i)의 항체의 특이성을 갖는 항체 및 (iv) 좋기로는 상기 (i)의 항체의 특이성을 갖고 (i)의 항체의 항원 결합부 또는 항원 결합자리 특히 가변부를 포함하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체이다. 일 구체예에서, 이 항체는 독소, 방사능동위원소, 약물 또는 세포독성 물질과 같은 치료제에 커플링된다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체를 최대 1000 mg/m2의 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체를 300 내지 600 mg/m2의 투여량으로 반복 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 따라, CLDN18.2는 좋기로는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구체예에서, 본 발명에 설명된 암은 CLDN18.2 양성이다. 일 구체예에서, 본 발명에 설명된 암의 암 세포들은 CLDN18.2 양성이다. 일 구체예에서, 본 발명에 설명된 암의 암 세포들은 그의 세포 표면에서 CLDN18.2를 발현한다.
일 구체예에서, 본 발명에 설명된 췌장암은 원발암, 진행암, 또는 전이암, 또는 그의 조합, 예컨대 원발성 췌장암과 그의 전이암과의 조합을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 원발암과 전이암의 동시 치료, 예컨대 원발성 췌장암과 전이성 췌장암의 동시 치료를 위한 것이다. 일 구체예에서, 전이암에는 림프절, 난소, 간 또는 폐로의 전이 또는 이의 조합이 포함된다. 일 구체예에서, 췌장암은 췌관의 암을 포함한다. 일 구체예에서, 췌장암은 선암종 또는 암종 또는 그의 조합을 포함한다. 일 구체예에서, 췌장암은 췌관 선암종, 점액 선암종, 신경내분비암종 암종 또는 세엽세포암종, 또는 이의 조합을 포함한다. 일 구체예에서, 췌장암은 겜시타빈 단독요법과 같은 겜시타빈 치료에 대해 부분적으로 또는 전적으로 무반응성(refractory)이다. 일 구체예에서, 췌장암의 예방에는 췌장암의 재발을 예방하는 것이 포함된다.
일 구체예에서, 본 발명에 따라 치료될 환자는 췌장암 수술을 받은 환자이다. 일 구체예에서, 상기 환자는 전암성 췌장 병변, 특히 췌관에서 악성 조직학적 변화의 개시를 포함하는 전암성 췌장 병변을 갖는 환자이다. 이러한 구체예에서, 본 발명의 방법은 악성 췌장암의 발달을 예방하는 것을 목표로 하는 것이 바람직하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질을 포함하는, 췌장암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조제물(medical preparation)을 제공한다. 본 발명의 의약 조제물은 γδ T 세포를 자극하는 물질를 자극하는 물질을 더 포함할 수 있다. CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및 CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질, 그리고 임의로 γδ T 세포를 자극하는 물질은 의약 조제물 내에 혼합물로서 또는 서로 이격되어 존재할 수 있다. 의약 조제물은 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체를 포함하는 제1 용기 및 CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질을 포함하는 제2 용기, 및 임의로 γδ T 세포를 자극하는 물질을 포함하는 용기를 포함하는 키트 형태로 존재할 수 있다. 의약 조제물은 또한 췌장암의 치료 또는 예방을 위한 조제물의 사용, 특히 본 발명의 방법에서 상기 조제물의 사용에 관한 지침이 적힌 인쇄물을 추가로 포함할 수 있다. 의약 조제물, 및 특히 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체, CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질 및 γδ T 세포를 자극하는 물질에 관한 여러가지 상이한 구체예들은 본 발명의 방법과 관련하여 전술된 바와 같다.
바람직한 측면에서, 본 발명은 (i) CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체, 및 (ii) 겜시타빈을 포함하는 의약 조제물을 제공한다. 본 발명의 의약 조제물은 추가로 γδ T 세포를 자극하는 물질을 더 포함할 수 있다. CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및 겜시타빈, 그리고 임의로 γδ T 세포를 자극하는 물질은 의약 조제물 내에 혼합된 상태로 또는 서로 이격되어 존재할 수 있다. 의약 조제물은 췌장암과 같은 암의 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있다. 의약 조제물은 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체를 포함하는 제1 용기 및 겜시타빈을 포함하는 제2 용기, 그리고 임의로 γδ T 세포를 자극하는 물질을 포함하는 용기를 포함하는 키트의 형태로 존재할 수 있다. 의약 조제물은 추가로 췌장암과 같은 암의 치료 또는 예방을 위한 조제물의 사용, 특히 본 발명의 방법에서 조제물의 사용에 관한 지침이 적힌 인쇄물 더 포함할 수 있다. 의약 조제물, 및 특히 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체, CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질 및 γδ T 세포를 자극하는 물질에 관한 여러가지 상이한 구체예들은 상기 본 발명의 방법에 대해 전술된 바와 같다.
본 발명은 또한 본 발명에서 설명된 물질, 예컨대 본 발명에 설명된 방법에 사용하기 위한 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및/또는 CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질 역시도 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 겜시타빈과 같이 CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질, 및 임의로 γδ T 세포를 자극하는 물질과 연계하여 투여되는, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 역시도 제공한다.
도 1. 췌장암 세포주의 형질도입에 사용된 렌티바이러스 벡터 인간 CLDN18.2을 EF1α 프로모터의 하류에 클로닝하였다. 상기 바이러스의 mRNA의 패키징 및 역전사를 가능케 하는 긴 말단 반복물들 (5' 및 3'-LTR) 사이에 상기 발현 카세트를 삽입한다. RSV: 라우스 육종 바이러스는 바이러스의 mRNA의 Tat 독립적 생산을 허용한다. Amp: 암피실린 내성 유전자. PGKp: 블라스티시딘의 프로모터. WPRE: 마멋의(woodchuck) 후전사 조절 요소; 이식유전자(transgene) 유전자 발현을 증강시킨다. LTR: 장 말단반복(long terminal repeat)은 바이러스 패키징을 가능케 한다. SV40A는 mRNA의 전사 종결 및 폴리아데닐화를 허용한다. pUC: 세균의 벡터 백본. Bla: 암피실린의 프로모터.
도 2. 마우스 폐 내의 췌장 세포의 전이 분석. 마우스에게 췌장암 세포를 정맥 주사한 후 마우스 폐의 절제 계획도.
도 3. 정상 및 암성 췌장 조직에서의 CLDN18.2 발현. 포르말린 고정 및 파라핀 포매된(FFPE) 정상적인 췌장 조직 (A) 및 췌장 선암종 조직 (B)을 쥐의 모노클로날 35-22A 항체 (0.2 μg/ml)로 염색. 헤마톡실린 대조염색 (2:00 min). 배율 200x.
도 4. 정상 및 전암성 췌장 조직에서의 CLDN18.2 발현. 다양한 췌장 구조 (A) 정상 및 PanIN1; (B) PanIN2; (C) PanIN3의 43-14A 염색. 배율 200x.
도 5. 파일럿 연구 - CLDN18.2 시그널 강도와 분석된 췌장 원발 종양에 있어서 양성 종양 세포의 양 사이의 상관관계. 각각의 점은 쥐의 모노클로날 35-22A 항체 (0.2μg/ml)를 이용하여 FFPE 염색 섹션에 의해 분석된 췌장의 원발 종양 케이스를 나타낸다. 점선은 10% 값을 표시한다.
도 6. 파일럿 연구 - 원발 및 전이 췌장 종양 조직에서의 CLDN18.2의 발현. (A) 선암종 원발 종양 및 (B) 림프절 전이암의 쥐의 모노클로날 35-22A 항체를 이용한 FFPE 조직 섹션 (3 μm)의 염색. 헤마톡실린 (Mayers)으로 대조염색함.
도 7. 본 연구: CLDN18.2 시그널 강도와 분석된 췌장 원발 종양에 있어서 양성 종양 세포의 양 사이의 상관관계. 각각의 점은 쥐의 모노클로날 43-14A 항체 (0.2μg/ml)를 이용하여 FFPE 염색 섹션에 의해 분석된 췌장의 췌관 선암종 원발 종양 (검은색 원) 또는 신경내분비암종 원발 종양 (흰색 원) 케이스를 나타낸다.
도 8. CLDN18.2 시그널 강도와 분석된 췌장 전이암에 대한 양성 종양 세포의 양 사이의 상관관계. 각각의 점은 쥐의 모노클로날 43-14A 항체 (0.2μg/ml)를 이용하여 FFPE 염색 섹션에 의해 분석된 췌장 림프절(검은색 원) 또는 간 (흰색 원) 전이암의 케이스를 나타낸다. 점선은 10% 값을 표시한다.
도 9. 원발 및 전이 췌장 종양 조직에서의 CLDN18.2의 발현. 쥐의 모노클로날 43-14A 항체를 이용한 (A, C, E) 선암종 원발 종양 및 (B, D, F) 전이암에 대한 FFPE 조직 섹션(3 μm)의 염색. 상기 섹션들을 Mayers 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
도 10. 그래프 분석 - 맷칭된 췌장 원발 종양 및 림프절 전이 조직에서CLDN18.2의 발현.
도 11. 맷칭된 췌장 원발 종양 및 림프절 전이 조직에서CLDN18.2의 발현. 쥐의 모노클로날 43-14A 항체를 이용한, (A) 원발 선암종, (B) 간 전이 및 (C) 림프절 전이의 FFPE 조직 섹션의 염색. 상기 섹션들을 Mayers 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 200x 배율.
도 12. 췌장 암종 세포주 내의 CLDN18.2 mRNA 수준. (A) 여러가지 췌장 CA 세포주, 즉 렌티바이러스에 의해 형질도입된(LVT) 세포주 (회색 막대), 위암 세포주 KATO-III (양성 대조군) 및 유방암 세포주 SKBR-3 (음성 대조군)의 Q-PCR 발현 분석. 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 CLDN18.2 전사체를 증폭시켰다. 상대적인 발현 수준이 1x105를 초과하는 내인성 세포주를 CLDN18.2 양성(빗금친 막대)으로 점수 매겼다. NTC: H2O 대조군 샘플. 오차 막대: 평균 + SD. (B-D) Patu8988S (B), Panc05.04 (C) 및 표시된 LVT 세포주 (D)에서의 계대-의존적(Passage-dependent) CLDN18.2 발현 분석. 계대 횟수를 각 막대 아래에 표시하였다.
도 13. 췌장 암종 세포주의 세포 용해물 중 CLDN18.2 단백질 수준. 단백질을 12.5% SDS-PAGE 상에서 분리하였다. CLDN18.1 및 CLDN18.2 (Zymed-MID)의 C-말단을 검출하는 CLDN18 항체 및 β-액틴을 검출하는 로딩 대조군 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 각각 노출 시간을 140 초(Pierce SuperSignal West Dura) 및 20 초 (Pierce SuperSignal West Pico)로 하였다. (A) 췌장 세포주 용해물, 양성 대조군 (HEK293-p740) 및 음성 대조군 세포 용해물 (SKBR-3) 중 CLDN18의 검출. (B) 형질도입되지 않은 모세포 용해물과 렌티바이러스에 의해 형질도입된(LVT) 세포주 용해물 간의 CLDN18.2 발현 비교. Patu8988S 및 SKBR-3를 각각 양성 대조군과 음성 대조군으로서 첨가하였다.
도 14. 췌장암 세포주 중 CLDN18 발현의 검출 및 세포 국소화. 커버 슬립 상에 성장한 췌장암 세포주의 염색. 항체: 35-22A (20x 배율, 노출 시간을 각 도면 아래에 표시하였다) DAPI를 이용하여 핵(청색)을 염색하였다. (A: AsPC1; B: BxPC3; C: CFPAC; D: DANG; E: HPAF-II; F: HUP-T3; G: HUP-T4; H: KCI-MOH; I: Panc1; J: Panc05.04; K: Panc02.04; L: Panc04.03; M: Patu8902; N: Patu8988S; O: Su86.86: P: Suit-2; Q: SW-1990; R: YAPC; S: 위암 대조군 세포주 KATO-III).
도 15. CLDN18.2 형질도입된 췌장암 세포주에서의 CLDN18 발현의 검출 및 세포 국소화. 고정 및 침투화(fixation 및 permeabilization) 후 35-22A 항체를 이용하여 렌티바이러스에 의해 형질도입된 (LVT) 췌장암 세포주에서의 CLDN18 검출. Alexa488 또는 Alexa555 표지된 이차 항체(secondary antibodies)를 검출에 이용하였다. A: BxPC3-LVT; B: CAPAN1-LVT; C: DANG-LVT; D: HPAC-LVT; E: MiaPaCa2-LVT; F: Patu8902-LVT; G: Suit-2-LVT; H: YAPC-LVT.
도 16. CLDN18.2 양성 췌장 CA 세포주 (pharmacodynamics)의 세포 표면에 대한 IMAB362의 결합. CLDN18.2를 발현하는 KATO-III 위암 대조군 세포 (C, F), 췌장암 세포주 (A,B,D,E) 및 렌티바이러스에 의해 형질도입된 췌장 세포주 (G-L)의 IF 분석. 세포들을 자연 조건 하에 IMAB362를 이용하여(D-E) 그리고 대조를 위해 세포의 고정 및 침투화 후 35-22A로 염색하였다(A-C). 핵 염색에는 DAPI를 이용하였다. 각 패널에 노출 시간을 표시하였다. G: BxPC3-LVT; H: CAPAN1-LVT; I: DANG-LVT; J: MiaPaCa2-LVT; K: Patu8902-LVT; L: Suit2-LVT.
도 17. 상이한 세포주의 이종이식 종양에서의 CLDN18.2 발현. CAPAN1-LVT (A,B), BxPC3-LVT (C,D), PATU8988S-LVT (E,F), MiaPaCa2-LVT (G,H), YAPC-LVT (J,K) 및 DANG-LVT (L,M) 이종이식 종양에서의 CLDN18.2의 발현. Zymed-MID 항체를 이용하여 조직 염색을 실시하였다. 렌즈 배율 10x (A,C,E,G,J,L) 및 20x (B,D,F,H,K,M).
도 18. Suit-2 및 MiaPaCa2 췌장암 세포주의 생착 검사. 세포들을 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. Suit-2 (A-C) 적용으로부터 45 (A), 52 (B), 59 (C)일 후에, 또는 MiaPaCa2(D-F)의 주사로부터 59 (D), 66 (E), 73 (F)일 후에 동물들을 희생시켰다. 폐를 준비하고 MHC 클래스 I 항체(항-인간 MHC I, 클론 EPR1394Y)으로 염색하여 마우스 조직 중 인간 세포를 검출하였다.
도 19. Patu8988S의 전이 생착 분석. Patu8988S 세포를 Nu/Nu 마우스에 1x106 또는 2x106 세포로 정맥 주사하고 마우스의 폐(A)와 간(B)를 x-축에 표시된 다양한 시점에서 분리하였다. 각 조직 조제물에 존재하는 인간 DNA의 %를 계산하기 위해, 인간과 마우스의 DNA를 혼합함으로서 표준 곡선을 작성하고 7x 5배 희석물을 준비하여 100% (1)- 0.0064% (7) 인간 DNA를 결과시켰다.
도 20. 마우스 폐 조직 중 Patu8988S 전이의 IHC 분석. 꼬리 정맥에 Patu8988S 세포가 주사된 마우스들을 상이한 시점(A-D = 70일, E-H = 86일)에서 희생시키고, 폐 조직을 분리한 다음 1:1000으로 희석된 MHC-I (EPR1394Y) 항체 (A, B, E, F) 또는 0.2 μg/ml의 항-클라우딘18 (Zymed-Mid) (C, D, G, H)으로 염색하였다. 배율: A, C, E, G = 10x 및 B, D, F, H = 20x.
도 21. 겜시타빈 처리된 췌장 종양 세포의 IMAB362 매개된 세포자멸사(apoptosis). 48 시간 후 BxPC3~CLDN18에서 CLDN18.2의 가교에 의해 세포자멸사 유도됨. BxPC3~CLDN18을 배지 또는 배지 + 100 ng/ml 겜시타빈에서 배양하였다. 단핵구 세포들의 세포자멸사 세포 분획을 쉬프트시켰다. 종양 세포들을 캄토테신과 인큐베이션하자 유사한 쉬프트들이 얻어졌다.
도 22. 췌장암 세포에 대한 IMAB362-유도된 ADCC 활성의 효능. (A) 다양한 도너들의 PBMCs를 이용하여 CLDN18.2 양성 췌장암 세포주를 이용하여 실시된 ADCC. (B-F) 이소적으로 CLDN18.2을 발현하는 LVT 췌장 세포주 및 대응하는 모세포를 이용하여 수행된 ADCC. (G) 도트 플롯
도 23. 췌장암 세포에 대한 IMAB362-유도된 CDC 활성의 효능. (A) 보체 공급원으로서 건강한 인간 혈청 풀, IMAB362 및 4 가지 독립적인 실험으로서 CLDN18.2 양성 췌장 CDOK1-p740 대조군 세포를 이용하여 수행된 CDC (B) CLDN18.2 양성 (Patu8988S, DANG, Panc05.04) 및 CLDN18.2 음성 (CAPAN1, Suit2, BxPC3, YAPC) 췌장 세포주를 이용하여 수행된 CDC (C) 이소적으로 발현하는 LVT 세포주를 이용한 CDC (D) 췌장암 세포주에 대해 절반 최대 용해율(EC50: half maximum lysis rates)을 일으키는 IMAB362 농도를 나타내는 도트 플롯. (E) 췌장암 세포주에 대해 IMAB362를 이용하여 얻어진 최대 사멸률.
도 24. 피하 MiaPaCa2-LVT 이종이식편에 미치는 IMAB362 처리 효과. 각각의 처리 그룹 당 15 마리의 암컷 Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu 마우스들의 옆구리에 1e7 MiaPaCa2-LVT 세포를 피하 주사함으로써 MiaPaCa2-LVT 이종이식편 종양을 접종하였다. 종양 세포 주사로부터 3일째, 200 μg IMAB362 또는 대조군을 이용하여 각각 처리를 개시하였다. 동물을 희생시키기 전까지 주 2회(semi-weekly) 복강 주사와 정맥 주사를 번갈아가면서 처치를 계속하였다. (A) 종양 성장에 미치는 IMAB362 처리의 효과. 피하 종양의 크기를 주 2회 측정하였다 (평균 + SEM). (B) 카플란-마이어 생존 플롯. 종양의 크기가 1400 mm3에 도달하거나 종양이 궤양성이 되었을 때 마우스들을 희생시켰다.
도 25. 피하 BxPC3-LVT 이종이식편의 IMAB362 처리. 각각의 처리 그룹 당 15 마리의 암컷 Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu 마우스들의 옆구리에 1e7 BxPC3-LVT 세포를 피하 주사하여 BxPC3-LVT 이종이식편 종양을 접종하였다. 종양 세포 주사로부터 3일째, 200 μg IMAB362 또는 대조군을 이용하여 각각 처리를 개시하였다. 동물을 희생시키기 전까지 주 2회 복강 주사와 정맥 주사를 번갈아가면서 처치를 계속하였다. (A) 종양 성장에 미치는 IMAB362 처리의 효과. 피하 종양의 크기를 주 2회 측정하였다 (평균 + SEM, * p<0.05). (B) 카플란-마이어 생존 플롯. 종양의 크기가 1400 mm3에 도달하거나 종양이 궤양성이 되었을 때 마우스들을 희생시켰다.
도 26. Suit2-LVT 췌장 전이암의 성장에 미치는 IMAB362 처리 효과. 각각의 처리 그룹 당 12 마리의 암컷 Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu 마우스들의 꼬리 정맥에 2x106 Suit2-LVT 종양 세포들을 정맥 주사하였다. 종양 세포 주사로부터 3일째, 200 μg IMAB362, 200 μg 이소타입 대조군 또는 동량의 PBS를 이용하여 처리를 새시하였다. 이식한지 42일 후에 동물들을 희생시켰다. (A) 마우스 폐 샘플에 존재하는 인간 DNA의 백분율을 결정하는 qPCR 분석 (샘플 당 2-4회 반응의 평균). (B) 마우스 폐 표면을 커버하는 인간 세포의 백분율을 구적법에 의해 구하였다. 항-인간 MHC-클래스 I 항체를 이용하여 조직 섹션에서 인간 세포들을 면역조직화학적으로 염색하였다. * p<0.05 (Kruskal-Wallis 검정법). 오차 막대: 평균 ± SD.
도 27. Patu8988S 폐 전이암의 Q-PCR 및 IHC 분석. 마우스 한 마리 당 2x106 Patu8988S 세포를 주사하였다. 동물들을 65일 후에 희생시켰다. 흰색 원: 63일 후에 희생된 마우스. (A) 마우스들을 200 μg IMAB362로 주 2회 또는 염수 대조군으로 처리하였다. Q-PCR에 의해 탐지된 인간 DNA의 양 (ng), Ct 값으로부터 산출됨. (B) A에서 설명된 바와 같이 Q-PCR 실험 반복. 여기서는 마우스 DNA 내에 존재하는 인간 DNA의 백분율을 Ct 값으로부터 산출하였다. (C) 마우스들을 IMAB362 및 이소타입 대조군 항체 (리툭시맙)로 처리하였다. 마우스 폐 내에 존재하는 인간 DNA의 백분율을 Ct 값으로부터 계산하였다. IMAB362 그룹의 경우, 하나의 이상치(outlier)가 탐지되었다 (흰색 삼각형). 이상치 값을 포함 또는 제외함으로써 유의성을 나타내었다. (D/E) C와 동일한 실험. 여기서는 전이암의 표면적을 Image J 프로그램을 이용하여 구하였다. 도트 플롯은 이상치 값을 포함하거나(D) 또는 포함하지 않은 (E) IMAB362 억제의 유의성을 나타낸다. P-값: 쌍을 이루지 않은 t-검정법 (unpaired t-test). 오차 막대±SD
도 28. 겜시타빈에 대한 투여량 반응 곡선. 췌장암 세포주는 겜시타빈에 대해 매우 상이한 감수성을 나타낸다. 세포주들을 다양한 농도의 겜시타빈에 4일간 노출시키고 생존 분석을 통해 증식 억제 정도를 분석하였다.
도 29. 옥살리플라틴에 대한 투여량 반응 곡선. 췌장암 세포주는 옥살리플라틴에 대해 매우 상이한 감수성을 나타낸다. 세포주들을 다양한 농도의 옥살리플라틴에 4일간 노출시키고 생존 분석을 통해 증식 억제 정도를 분석하였다.
도 30. CLDN18.2 발현(RNA)에 미치는 화학치료제 처리의 효과. 미처리, Gem (1 ng/ml) 또는 GemOx (Gem 1 ng/ml + Ox 10 ng/ml) 예비처리된 DANG (2일)의 RNA (A) 또는 Gem (10 ng/ml 또는 GemOx (Gem 10 ng/ml + Ox 100 ng/ml)으로 3일 전처리된 Patu8988S (B) 세포. RNA를 cDNA로 전환하고 CLDN18.2 전사체 수준을 정량적 실시간 PCR로 분석하였다. 하우스 키핑 유전자 HPRT의 전사 수준과 비교한 상대 유닛으로 결과를 나타내었다.
도 31. 췌장 암종 세포에서 CLDN18.2 단백질 수준에 미치는 화학요법의 효과. 미처리되거나(med), Gem (1 ng/ml) 또는 GemOx (Gem 1 ng/ml + Ox 10 ng/ml) 전처리된 DANG (A) 또는 Patu8988S (B) 세포들의 총 세포 용해물로부터 얻은 단백질을 Zymed C-말단 폴리클로날 항혈청을 이용하여 CLDN18.2 발현에 대해 분석하였다. 액틴을 이용하여 동 부하량의 단백질을 나타내었다.
도 32. CLDN18.2 세포 표면 발현의 FACS 분석. 배지 배양(좌측) 및 Gem 처리된 (우측) Patu8988S의 CLDN18 발현 (검은색 히스토그램)을 Isotyp Co와 비교하여 오버레이로 나타내었다. Patu8988S를 3일간 겜시타빈 (10 ng/ml))으로 처리하였다.
도 33. 겜시타빈 (Gem; 2ng/ml) 또는 겜시타빈+옥살리플라틴 (GemOx; 1ng/ml+10ng/ml)으로 2일간 처리되거나 처리되지 않은 DANG 세포의 세포 주기 분석. (A) 겜시타빈 처리로 인해 세포의 세포 주기가 S-페이즈에서 정지되게 되었다. 각 막대의 면적을 나누어 G0/G1, S 및 G2 페이즈의 세포 백분율을 표시하였다. (B) 웨스턴 블롯 분석 결과 Gem 처리 후 CLDN18이 상향조절된 것으로 나타났다.
도 34. Patu8988S 세포에 있어서 세포 주기 (A) 및 CLDN18.2 발현 (B, C)에 미치는 겜시타빈의 영향. Patu8988S 세포들을 겜시타빈 (10 ng/ml)으로 2일간 처리하거나 처리하지 않았다. (A) 각 막대의 면적을 나누어 G0/G1, S 및 G2 페이즈의 세포 백분율을 표시하였다. CLDN18.2의 밀도 (x-축)를 세포 수 (y-축)에 대해 플로팅하였다.(B) 미처리 (점선) 대 Gem 처리 (직선)된 경우의 CLDN18.2 발현을 플로팅하였다. (C) G0/G1 페이즈의 gem 처리된 Patu8988S 세포(점선) 대 S 페이즈의 세포(직선)의 CLDN18.2 발현을 나타내었다.
도 35. 위암 세포에 대한 화학요법의 효과. Kato III 세포를 96 시간 배양하자 세포 주기가 G0/G1-페이즈에서 정지하였고 (a) CLDN18.2가 하향조절되었다 (c). 여러가지 상이한 페이즈의 세포 주기로 세포 사이클의 정지를 초래한 세포증식억제 화합물들은 CLDN18.2-발현을 안정화시킨다 (c).
도 36. 위암 세포에 미치는 화학요법의 효과. 상이한 세포 주기 페이즈로 세포 주기의 정지를 초래하는 세포증식억제 화합물들(S/G2-페이즈 (이리노테칸) 또는 G2-페이즈 (도세탁셀)). 각 막대의 면적을 나누어 G0/G1, S 및 G2 페이즈의 세포 백분율을 나타내었다.
도 37. DANG의 화학요법 처리 후 IMAB362 매개된 ADCC의 투여량 반응 곡선. (A) Gem 또는 GemOx로 DANG 췌장암 세포를 40 시간 전처리한 후 대표적인 하나의 도너에 있어서의 투여량 반응 곡선. (B) IMAB362 매개된 ADCC의 EC50 값 (평균). P-값: 쌍을 이루어지 않은 t-검정법.
도 38. 위암 세포에 미치는 화학요법의 효과. a: 이리노테칸, 도세탁셀 또는 시스플라틴으로 처리된 세포들은 배지 배양된 표적 세포들에 비해 살아있는(viable) 세포들의 수준이 더 낮은 것으로 나타난다. b: 이리노테칸, 도세탁셀 또는 시스플라틴으로 처리된 세포들에 있어서 CLDN18.2 발현은 배지 배양된 세포들에 비해 증가된다. c/d: 이리노테칸, 도세탁셀 또는 시스플라틴에 의한 세포 처리는 ADCC를 유도하는 IMAB362의 효능을 증강시킨다.
도 39. MiaPaCa2-LVT 세포의 IMAB362 매개된 CDC에 미치는 화학요법제의 영향. 2 가지 독립적인 분석의 투여량 반응 곡선. MiaPaCa2-LVT를 배지, Gem (10ng/ml) 또는 GemOx (10 ng/ml Gem + 100 ng/ml Ox)에서 70 시간 동안 배양하였다.
도 40. IMAB362-유도된 CDC에 미치는 화학요법의 효과
도 41. BxPC3-LVT 이종이식편에 대한 Gem 또는 GemOx와 조합된 IMAB362 처리 효과. 각 처리 그룹 당 10마리 암컷 Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu 마우스들의 옆구리에 8.5e6 BxPC3-LVT 세포를 주사함으로써 BxPC3-LVT 이종이식편 종양을 접종하였다. 종양 세포를 주사한 지 3일 째에, 화학요법 처리를 개시하고(50 mg/kg 겜시타빈 i.p., 각각 50 mg/kg 겜시타빈 플러스 5 mg/kg 옥살리플라틴 i.p.) 6주일간 매주 계속 처리하였다. 화학요법제 주사로부터 24시간 후, 800 μg IMAB362 또는 대조군을 꼬리 정맥 내로 주사하였다. IMAB362 처리를 마우스를 희생시키기 ㅈ전까지 매주 실시하였다. (A) 피하 BxPC3-LVT 이종이식편의 성장 곡선. 피하 종양의 크기를 주2회 측정하였다 (평균 + SEM). (B) 카플란-마이어 생존 곡선. 1400 mm3 에 달하거나 또는 종양이 궤양성이 되었을 때 종양의 크기가 마우스들을 희생시켰다.
도 42. IMAB362와 조합된 겜시타빈 치료에 의한 항종양 효능의 향상. 처리 그룹 당 10마리 암컷 Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu 마우스들의 옆구리에 8.5e6 BxPC3-LVT 세포를 피하 주사함으로써 BxPC3-LVT 이종이식편 종양을 접종하였다. 종양 세포 주사로부터 3일 째, 화학요법(100 mg/kg 겜시타빈 i.p., 또는 100 mg/kg 겜시타빈 플러스 5 mg/kg 옥살리플라틴 i.p.)을 개시하고 6주일간 매주 1회 이 치료를 계속하였다. 화학요법 약물 주사로부터 24시간 후, 200 μg (1/2 투여량) 또는 400 μg (완전 투여량) IMAB362를 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다. 마우스를 희생시키기 전까지 주2회 복강 및 정맥 주사로 IMAB362 처리를 교대로 하였다. (A) 피하 BxPC3-LVT 이종이식편의 성장 곡선. 피하 종양의 크기를 주2회 측정하였다(평균 + SEM). (B) 카플란-마이어 생존 곡선. 종양 크기가 1400 mm3에 도달하거나 또는 종양이 궤양성이 되었을 때 마우스들을 희생시켰다.
도 43. MiaPaCa2-LVT 이종이식편에 대한 겜시타빈과 조합된 IMAB362 치료 효과. 처리 그룹 당 10마리 암컷 Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu 마우스들의 옆구리에 5e6 MiaPaCa2-LVT 세포를 피하 주사함으로써 MiaPaCa2-LVT 이종이식편 종양을 접종하였다. 종양 세포를 주사한지 4일 후, 화학요법(50 mg/kg 겜시타빈 i.p) 치료를 개시하고 6주일간 매주 이 치료를 계속하였다. 화학요법 약물 주사 24시간 후, 200 μg IMAB362 또는 대조군을 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다. 마우스를 희생시키기 전까지 주2회 복강 및 정맥 주사로 IMAB362 처리를 교대로 하였다. (A) 피하 이종이식편의 성장. 종양 크기를 주2회 측정하였다 (평균 + SEM). (B) 카플란-마이어 생존 곡선. 종양 크기가 1400 mm3에 도달하거나 또는 종양이 궤양성이 되었을 때 마우스들을 희생시켰다.
도 44. 수립된 MiaPaCa2-LVT 이종이식편 종양에 대한 겜시타빈과 조합된 IMAB362 치료 효과. 암컷 Hsd:Athymic Nude-Foxn1 nu 마우스들의 옆구리에 1e7 MiaPaCa2-LVT 세포를 피하주사 함으로써 MiaPaCa2-LVT 이종이식편 종양을 접종하였다. 종양을 피하접종한 지 9일 후, 종양 산생 마우스들을 그룹 당 8 마리의 균일 처리군으로 재편하고 처리를 개시하였다. 마우스들을 150 mg/kg 겜시타빈으로 4주일간 주2회 복강주사하였다. 겜시타빈 주사 24시간 후, 200 μg IMAB362 또는 대조군을 꼬리 정맥 내로 정맥 주사하였다. 마우스를 희생시키기 전까지 주2회 복강 및 정맥 주사로 200 μg IMAB362 처리를 교대로 하였다. (A) 피하 종양의 크기를 주2회 측정하였다 (평균 + SEM; **=p<0.01). (B) 카플란-마이어 생존 곡선. 종양 크기가 1400 mm3에 도달하거나 또는 종양이 궤양성이 되었을 때 마우스들을 희생시켰다. (Log-rank (Mantel-Cox) 검정법; **=p<0.01).
도 45. Patu8988S 이종이식편 모델에서 폐 전이에 대한 겜시타빈과 조합된 IMAB362의 효과. 처리 그룹 당 12마리의 암컷 Hsd:Athymic Nude-Foxn1 nu 마우스들의 꼬리 정맥에 2x106 Patu8988S 종양 세포를 정맥 주사하였다. 종양 세포를 정맥 주사한 지 2주일 후 4주일 동안 주2회 100 mg/kg 겜시타빈 i.p. 투여와 조합하여 주2회 200 μg IMAB362 (i.v./i,.p.) 유지 처리를 개시하였다. 대조군은 주2회 100 mg/kg 겜시타빈과 조합된 200 μg 이소타입 대조군 항체로 처리하였다. 이식한지 70일 후에 동물들을 희생시켰다. (A) IMAB362 및 이소타입 항체로 처리된 마우스의 폐 샘플 중 인간 DNA의 정량적 PCR 분석(샘플 당 3회 반응의 평균). 유의차 (P = 0.0035, 만 휘트니 검정법) 대 이소타입 대조군 (B) 컴퓨터 기반 분석에 의해 마우스의 폐 표면을 뒤덮은 염색된 인간 세포의 백분율을 구하였다. 파라핀 포매된 폐 조직 상의 항 인간 MHC-I 항체 (클론 EPR1394Y)에 대해 면역조직학적 염색을 실시하였다 (평균 ± SEM; P = 0.0003, 만 휘트니 검정법). C 및 D: IMAB362 + 겜시타빈 처리된 마우스 (C) 또는 이소타입 항체 + 겜시타빈 처리된 마우스 (D)에 있어서 Patu8988s 폐 전이암에 대한 항 MHC-I 항체를 이용한 면역조직학적 염색 사례.
이하에 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약들로 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 용어들은 어디까지나 특정 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 아니되며 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하에서, 본 발명의 요소들을 설명한다. 이 구성 요소들은 특정 구체예와 함께 리스트되지만, 이들은 여하한 방식 및 여하한 횟수로든 조합되어 부가적인 구체예를 생성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양한 실시예와 바람직한 구체예들은 다양하게 설명된 실시예와 바람직한 구체예들은 본 발명을 단지 명시적으로 설명된 구체예들만으로 한정짓는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이 설명은 명시적으로 설명된 구체예들과 여하한 수의 개시된 및/또는 바람직한 구성 요소들을 조합하는 구체에들을 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 뿐만 아니라, 이 출원의 모든 설명된 구성요소들의 여하한 순열 및 조합들 역시 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
좋기로는, 본 명세서에 사용된 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. Koebl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 설명된 바와 같이 정의된다.
본 발명을 실시하는데 있어서는 달리 설명되지 않는 한, 이 기술분야의 문헌 (cf., 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook 외 eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)에서 설명되는 화학, 생화학, 세포생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 상법이 이용될 것이다.
이하의 상세한 설명과 청구범위에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한 "포함하다(comprise)" 및 그의 변형어들 예컨대 "comprises" 및 "comprising"은 명시된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹을 포괄하되, 비록 몇몇 구체예에서는 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹이 배제될 수도 있지만, 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹이 배제되는 것은 아니다, 즉, 본 발명의 청구대상은 명시된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹들을 포함한다. 본 발명을 설명함에 있어 문맥상 사용된 관사 "a" 및 "an" 및 "the" 그리고 이와 유사한 참조 용어들(특히 청구범위 문맥상)은 달리 언급되거나, 반대 의미를 갖는 것이 명백하지 않은 한, 단복수를 아우르는 것이다.
본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 분리된 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 인용된 것으로 간주된다. 본 발명에 설명된 모든 방법들은 달리 언급하거나 문맥상 모순되지 않는 한, 적절한 순서로 실시될 수 있다. 본 명세서에 제공된 여하한 그리고 모든 예시 또는 예시적 언어 (예컨대 "와 같은")는 본 발명을 좀 더 잘 설명하기 위해 의도된 것으로, 본 발명의 범위를 달리 한정지으려는 것이 아니다. 명세서 내의 어떠한 언어도 청구되지 않은 구성요소를 본 발명을 실시하는데 필수적인 것으로 가리키는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명의 명세서 전반에 걸쳐 몇가지 문헌들이 인용된다. 인용된 이들 각각의 상기 또는 하기 문헌들 (모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 모두 그 내용 전체가 본 발명에 참조 병합된다. 이들 언급된 문헌들 중 어느 것도 선행발명임을 이유로, 본 발명이 그러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
용어 "CLDN18"은 클라우딘 18에 관한 것으로, 클라우딘 18 스플라이스 변이체 1 (클라우딘 18.1 (CLDN18.1)) 및 클라우딘 18 스플라이스 변이체 2 (클라우딘 18.2 (CLDN18.2))를 비롯한 여하한 변이체들을 포괄한다.
용어 "CLDN18.2"는 좋기로는 인간 CLDN18.2에 관한 것으로, 좋기로는, 서열목록의 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는, 좋기로는 이러한 서열로 구성된 단백질에 관한다.
용어 "CLDN18.1"은 좋기로는 인간 CLDN18.1에 관한 것으로, 특히 서열목록의 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는, 좋기로는 이러한 서열로 구성된 단백질에 관한다.
본 발명에 있어서 용어 "변이체(variant)"는 특히 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 컨포메이션(conformations), 이소형(isoforms), 대립형 변이체(allelic variants), 종 변이체(species variants) 및 종 동족체(species homologs), 특히 자연적으로 존재하는 것들을 칭한다. 대립형 변이체는 어떤 유전자의 정상적 서열에 있어서의 변경과 관련된 것으로, 그 유의성은 종종 불확실하다. 주어진 유전자에 대한 완전한 유전자 시퀀싱에 의해 종종 수많은 대립형 변이체들이 동정된다. 종 동족체는 주어진 핵산이나 아미노산 서열의 그것과 기원을 달리하는 다른 종의 핵산 또는 아미노산 서열이다. "변이체"라는 용어는 후번역적으로 변형된 변이체 및 컨포메이션 변이체들을 모두 포괄한다.
본 발명에 따라, 용어 "CLDN18.2 양성 암"은 CLDN18.2를 발현하는 암세포, 좋기로는 상기 암세포 표면에 CLDN18.2를 발현하는 암세포를 포함하는 암을 의미한다.
"세포 표면"이라 함은 기술분야에서 흔히 갖는 그대로의 의미로 사용되며, 따라서 단백질 및 기타 분자들이 결합할 수 있도록 접근가능한 세포의 외부를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 세포외 부분을 갖는 막투과 단백질은 세포 표면 상에서 발현되는 것으로 간주된다.
CLDN18.2는 만일 그것이 상기 세포의 표면에 위치하면 세포 표면 상에서 발현되며 그 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합에 대해 접근을 허용한다.
본 발명에 있어서, CLDN18.2는 만일 발현 수준이 위장 세포 또는 위장 조직에서의 발현 수준보다 낮을 경우 세포에서 실제로 발현되지 않는다. 좋기로는, 발현 수준은 위장 세포 또는 위장 조직에서의 발현 수준의 10% 미만, 좋기로는 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.05% 미만 또는 심지어 이보다 더 낮은 것이 바람직하다. 좋기로는, CLDN18.2는 만일 발현 수준이 위장이 아닌 다른 비암(non-cancerous) 조직에서의 발현 수준을 2배 이하, 좋기로는 1.5배 이하로 초과할 경우 실제로 세포에서 발현되지 않으며, 바람직하게는, 상기 비암 조직에서의 발현 수준을 초과하지 않는 것이 좋다. 좋기로는, CLDN18.2는 만일 발현 수준이 검출한계 미만이고/미만이거나 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 발현 수준이 너무 낮을 경우 세포에서 실제로 발현되지 않는다.
본 발명에 따라, CLDN18.2는 발현 수준이 위장이 아닌 비암 조직에서의 발현 수준을 좋기로는 2배 초과, 좋기로는 10배 초과, 100배 초과, 1000배 초과, 또는 10000배 초과할 경우 세포에서 발현된다. 좋기로는, CLDN18.2는 발현 수준이 검출한계를 상회하고/상회하거나 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 충분할 정도로 발현 수준이 높을 경우 세포에서 발현된다. 좋기로는, 세포에서 발현된 CLDN18.2는 상기 세포의 표면에서 발현되거나 노출된다.
본 발명에 따라, "질병/질환"이라는 용어는 암, 특히 본 명세서에 설명된 유형의 암을 비롯하여 모든 병리적 상태를 일컫는다. 암 또는 암의 특정 형태에 대한 모든 칭호는 그의 암 전이도 포괄한다. 바람직한 구체예에서, 본 출원발명에 따라 치료될 질병은 CLDN18.2를 발현하는 세포와 연관되어 있다.
"CLDN18.2를 발현하는 세포와 연관된 질병" 또는 이와 비슷한 표현은 본 발명에 따라, CLDN18.2가 병에 걸린 조직 또는 장기의 세포에서 발현됨을 의미한다. 일 구체예에서, 병에 걸린 조직이나 장기의 세포에서 CLDN18.2의 발현은 건강한 조직 또는 장기에서의 상태에 비해 증가된다. 증가라 함은 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상의 증가를 의미한다. 일 구체예에서, 발현은 오직 병에 걸린 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서는 발현이 억제된다. 본 발명에 따라, CLDN18.2를 발현하는 세포와 연관된 질환에는 암 질환이 포함된다. 또한, 본 발명에 따라, 암 질환은 좋기로는 암세포가 CLDN18.2를 발현하는 질환이다.
본 발명에서, "암 질환" 또는 "암"은 세포 성장, 증식, 분화, 유착 및/또는 이동이 비정상적으로 조절됨을 특징으로 하는 질환을 포괄한다. "암 세포"라 함은 급속하게 제어되지 않는 세포 증식에 의해 성장하고 그 새로운 성장을 개시시킨 자극이 멈춘 후에도 지속적으로 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 좋기로는, "암 질환"은 CLDN18.2를 발현하는 세포에 의해 특징지어지며 암 세포는 CLDN18.2를 발현한다. CLDN18.2를 발현하는 세포는 좋기로는 암 세포이며, 본 발명에서 설명된 암의 암 세포인 것이 바람직하다.
본 발명에서 "암종(carcinoma)"은 상피세포로부터 유래된 악성 종양이다.
"선암종(Adenocarcinoma)"은 샘조직에 기원을 둔 암이다. 이 조직은 또한 상피 조직이라 알려진 보다 큰 조직 카테고리의 일부이기도 하다. 상피 조직에는 피부, 샘 및 신체의 캐비티와 장기들을 라이닝하는 다양한 기타 조직이 포함된다. 상피는 발생학적으로 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 유래한다. 해당 세포가 분비 특성을 갖는 한, 선암종으로 분류되기 위해, 이들이 반드시 샘의 일부일 필요는 없다. 암종의 이러한 형태는 인간을 비롯한 어느 정도 고등 포유동물에서 일어날 수 있다. 잘 분화된 선암종은 이들이 유래한 샘 조직과 유사한 경향이 있는 반면, 덜 분화된 선암종은 그렇지 않을 수 있다. 생검에 의해 세포를 염색함으로써, 병리학자는 종양이 선암종인지 또는 다른 유형의 암인지 결정할 수 있다. 선암종은 샘들이 체내 도처에 존재하는 특성 상 신체의 많은 조직에서 일어날 수 있다. 각각의 샘이 동일한 물질을 분비하는 것이 아닐 수 있으나, 세포에 대해 외분비 기능이 있는 한, 샘이라 간주되며 그의 악성 형태는 따라서 선암종이라 명명된다. 악성 선암종은 다른 조직을 침습하며 시간이 충분할 경우 종종 전이되기도 한다.
내배엽으로부터 유도된 장기인 췌장은 글루코스 항상성과 단백질 및 탄수화물의 소화에 있어서 핵심적인 조절자이다. 외분비 췌장(이 장기의 조직 질량의 80%)은 소화 효소를 생산하여 위장관 내로 전달하는 샘꽈리 세포와 관세포의 분지상 네트워크로 이루어져 있다. 관형 네트워크를 따라 기능성 단위로 조직되어 있는 샘꽈리 세포들은 위장과 십이지장으로부터의 신호에 따라 효소를 합성하여 관강 내로 분비한다. 관 부근의 샘꽈리 단위들에는 샘꽈리중심 세포들이 존재한다. 혈류 내로 호르몬 분비를 통해 대사 및 글루코스 항상성을 제어하는 내분비 췌장은 4가지 특화된 내분비 세포 유형으로 구성되는데 이들은 함께 랑게르한스 섬이라 칭해지는 클러스터를 형성한다.
췌장암은 췌장을 형성하는 조직에서 발생하는 변형된 세포에 기인하는 악성 신생물이다. 췌장암은 미국에서 암 질환 사망 사유 중 4위를 차지하고 전 세계적으로는 8위를 차지한다. 조기 췌장암은 종종 증상이 없으며 후기 증상은 대개 비특이적이며 다양하다. 따라서, 췌장암은 상당히 진행될 때까지 종종 진단되지 않는다. 췌장암은 예후가 좋지 않다: 모든 단계를 통털어, 1년 및 5년 상대 생존율은 각각 25% 및 6%에 지나지 않는다. 국소 질환에 있어서, 5년 생존은 약 20%인 반면 국소 진행된 질환과 집합적으로 개체의 80% 이상을 차지하는 전이 질환의 중위수 생존율은 각각 약 10 개월과 6 개월에 불과하다.
췌장암은 섬세포들로부터 일어나는 신경내분비암종과 췌장의 외분비 성분에서 일어나는 선암종(선 구조물을 나타내는 종양)을 포함한다.
췌장암의 가장 흔한 형태인 관형 선암종은 일반적으로 현미경 검사에서 보통 내지 잘 분화되지 않은 선형 구조(glandular structures)를 갖는 것으로 특징지어진다. 췌장의 췌관 선암종(PDAC: pancreatic ductal adenocarcinoma)는 흔히 췌장의 머리 부분에서 발생하며 림프관, 비장 및 복강을 비롯한 주변 조직으로 침윤되고, 간과 폐로도 전이된다. PDAC는 주로 관과 유사한 구조를 갖는 관형 패턴을 나타내며 다양한 정도의 세포 비정형성과 분화도를 나타낸다. PDAC의 보다 덜 흔한 서브타입들에는 콜로이드, 선편평상피, 또는 육종유사형(sarcomatoid) 조직학이 포함된다. 개별적인 종양에서도, 종종, 조직학, 종양 등급 및 분화도는 지역적으로 차이가 있다. 심지어 가장 작은 원발 병변조차도 흔히 신경주위 및 림프-혈관 침윤을 나타내는데, 이는 조기에 먼 거리까지 확산하는 성향이 있음을 시사하는 것이다.
외분비 췌장암의 두 번째로 가장 흔한 유형은 점액성이다. 점액성 선암종은 뮤신을 대량으로 생산하는데 이로 인해 영상 연구에서 낭성 외형이 나타나게 된다.
췌장의 신경내분비암종 종양들은 췌장의 호르몬-생산 세포들(섬 세포들)에서 형성된다. 샘꽈리 세포 신생물은 췌장의 샘꽈리 세포로부터 발생한다.
본 발명에 따라, "암"이라는 용어에는 원발 췌장암과 같은 원발성 종양의 전이 암도 포함된다. 따라서, 본 발명에서 예컨대 췌장암이라 하면, 췌장암의 전이암, 예를 들면, 폐, 간 및/또는 림프절의 전이암도 포함하는 것이다.
"전이(metastasis)"라 함은 암 세포가 그의 원래 자리로부터 체내의 다른 부분으로 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정으로서 종양으로부터 악성 세포의 탈착, 세포외 매트릭스의 침습, 상피기저막의 침입에 의한 체강 및 혈관으로의 유입 및 이어서 혈액에 의한 운반 후 표적 장기내로의 침윤에 의존한다. 마지막으로, 표적 부위에서의 새로운 종양의 성장은 혈관신생에 의존한다. 종양 전이는 원발성 종양의 제거 후에도 종양 세포 또는 성분들이 남아있을 수 있거나 전이 잠재능을 발달시키기 때문에 종종 발생한다. 일 구체예에서, 본 발명에 따라 "전이"라는 용어는 원발성 종양 및 지역 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어진 전이에 관한 것인 "원격전이(distant metastasis)"에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 "전이"라는 용어는 림프절 전이에 관한 것이다. 본 발명의 치료법으로 치료가능한 전이의 한 가지 특별한 형태는 원발 부위로서 췌장암으로부터 기원하는 전이이다. 바람직한 구체예에서 이러한 췌장암 전이는 림프절로의 전이, 폐로의 전이 및/또는 간으로의 전이이다.
크루켄버그 종양은 모든 난소 종양의 1% 내지 2%를 차지하는, 난소의 흔치 않은 전이 종양이다. 크루켄버그 종양은 난소의 전이성 반지세포 선암종이다. 위장은 대부분의 크루켄버그 종양 케이스의 원발 부위이다(70%). 결장, 충수 및 유방의 암종(주로 침윤성 소엽 암종)이 두 번째로 흔한 원발 부위이다. 담낭, 담도관, 췌장, 소장, 바터 팽대부, 자궁경부 및 방광/요막관의 암종으로부터 기원하는 흔치 않은 경우의 크루켄버그 종양 역시 보고된 바 있다.
난치암은 특정한 치료가 효과가 없는 악성 암으로서 초기 치료에 무반응성이거나, 시간이 지나도 무반응성인 악성 암이다.
"치료하다(treat)"라 함은 대상자에서 종양의 크기 또는 종양의 수를 감소시키는 것; 대상자의 질환 진행을 멈추거나 둔화시키는 것; 대상자에서 새로운 질병의 발달을 억제하거나 둔화시키는 것; 현재 질병에 걸려 있거나 이전에 질병에 걸렸었던 대상자에서 증상 및/또는 재발의 빈도나 위중도를 감소시키는 것; 및/또는 대상자의 수명을 연장, 즉 증가시키는 것을 비롯하여, 질병을 예방 또는 제거하기 위해, 대상자에게 화합물이나 조성물 또는 화합물이나 조성물의 조합을 투여하는 것을 의미한다.
특히, "질병의 치료"라는 용어에는, 질병이나 그의 증상을 치유, 기간 단축, 완화, 예방, 둔화시키거나 진행이나 악화를 억제하거나 또는 개시를 예방 또는 둔화시키는 것이 포함된다.
본 발명에서 "환자"라는 용어는 치료의 대상자, 특히 질병에 걸린 대상자를 의미하며 여기에는 인간, 비인간 영장류 또는 기타 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이와 같은 포유동물 또는 마우스나 래트와 같은 설치류가 포함된다. 특히 바람직한 구체예에서, 환자는 인간이다.
"CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질"이라는 용어는 상기 물질이 세포에 제공될 경우, 제공되지 않을 경우에 비해, 상기 세포에서 CLDN18.2의 RNA 및/또는 단백질 수준 증가, 좋기로는, 상기 세포 표면에서 CLDN18.2 단백질의 수준 증가를 야기하는 물질 또는 물질들의 조합을 가리킨다. 좋기로는, 세포는 암세포, 특히 CLDN18.2를 발현하는 세포인 것이 바람직하며 따라서 본 명세서에 설명된 암 유형, 특히 췌장암의 세포와 같이, CLDN18.2 결합 항체에 대한 표적이 되는 암 세포인 것이 바람직하다. "CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질"은 특히, 상기 물질이 세포에 제공될 경우, 제공되지 않을 경우에 비해, 상기 세포 표면에서의 CLDN18.2의 밀도 증가를 야기하는 물질 또는 물질들의 조합을 가리킨다. "CLDN18.2의 안정화 발현"에는 특히 상기 물질 또는 물질들의 조합이 CLDN18.2의 발현 저하를 예방 또는 감소하는 상황, 예컨대, CLDN18.2의 발현이 상기 물질 또는 물질들의 조합의 제공 없이 저하하고 상기 물질 또는 물질들의 조합의 제공이 상기 CLDN18.2의 발현 저하를 예방하거나 상기 저하를 감소시키는 상황이 포함된다. "CLDN18.2의 발현 증가"에는 특히, 상기 물질 또는 물질들의 조합이 CLDN18.2의 발현을 증가시키는 상황, 예컨대 CLDN18.2의 발현이 상기 물질 또는 물질들의 조합의 제공 없이 감소, 실제로 일정하게 유지 또는 증가하는 상황 또는 상기 물질 또는 물질들의 조합의 제공이 상기 물질 또는 물질들이 제공되지 않을 경우에 비해 CLDN18.2의 발현을 증가시켜 그 결과 발현이, 상기 물질 또는 물질들의 조합이 제공되지 않은 경우 CLDN18.2의 발현이 감소, 실제로 일정하게 유지 또는 증가되는 상황에 비해 더 높은 상황이 포함된다.
본 발명에 따라, "CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질"이라는 용어에는 세포증식억제제와 같은 화학치료제 또는 화학치료제들의 조합이 포함된다. 화학치료제는 다음 중 한 가지 방식으로 세포에 영향을 미칠 수 있다: (1) 더 이상 DNA가 재생할 수 없도록 세포의 DNA를 손상시킴, (2) 새로운 DNA 스트랜드의 합성을 저해하여 세포 복제을 불가능하게 만듬, (3) 세포의 유사분열과정(mitotic processes)을 중단시켜 세포가 2개의 세포로 분할되지 못하도록 함.
본 발명에 따라, "CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질"이라는 용어는 좋기로는 세포, 특히 암세포에 제공될 경우, 세포 주기의 하나 이상의 페이즈, 좋기로는 G1- 및 G0-페이즈 이외의 하나 이상의 세포 주기, 좋기로는, G1-페이즈가 아닌 세포 주기, 좋기로는 세포 주기의 G1/G2-, S/G2-, G2- 또는 S-페이즈와 같이 세포 주기의 G2- 또는 S-페이즈 중 하나 이상의 세포 주기에 세포를 중단(arrest) 또는 축적시키는 결과를 초래하는 세포증식 억제 화합물 또는 세포증식 억제 화합물들의 조합과 같은 물질 또는 물질들의 조합에 관한 것이 바람직하다. "세포 주기의 하나 이상의 페이즈에 세포가 멈추거나 축적된다"는 용어는 세포 주기의 상기 하나 이상의 페이즈에 있는 세포의 백분율이 증가한다는 의미이다. 각각의 세포는 그 자신의 복제를 위해 4가지 페이즈를 포함하는 세포 주기를 거친다. G1이라 칭해지는 최초의 페이즈는 세포가 그의 염색체를 복제하기 위해 준비하는 단계이다. 두 번째 단계는 S 페이즈라 칭해지며, 이 페이즈에서는 DNA 합성이 일어나서 DNA가 복제된다. 그 다음 페이즈는 G2 페이즈로서, RNA와 단백질에 복제되는 단계이다. 마지막 단계는 M 단계로서, 실제로 세포 분할이 일어나는 단계이다. 이 마지막 단계에서, 복제된 DNA와 RNA는 갈라져서 세포의 양 말단으로 이동하며 세포가 실제로 2개의 동일한, 기능적 세포로 분할된다. DNA를 손상시키는 물질인 화학요법제들은 대개 G1 및/또는 G2 페이즈에서 세포의 축적을 초래한다. 항대사물질과 같이 DNA 합성을 간섭함으로써 세포 성장을 차단하는 화학요법제들은 대체로 세포를 S-페이즈에 축적시키는 결과를 야기한다. 이러한 약물의 예로는 겜시타빈, 6-머캅토퓨린 및 5-플루오로우라실을 들 수 있다.
본 발명에 따라, "CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질"이라는 용어는 겜시타빈, 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물과 같은 뉴클레오사이드 유사체, 옥살리플라틴 및 시스플라틴과 같은 백금 화합물, 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 탁산, 및 이리노테칸 및 토포테칸과 같은 캄토테신 유도체, 및 약물들의 조합 예컨대 겜시타빈, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실 중 하나 이상을 포함하는 조합물, 예컨대 겜시타빈 및 옥살리플라틴, 겜시타빈 및 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실과 같은 약물들의 조합 또는 본 명세서에 기재된 다른 조합들을 포함한다. 본 발명에 따라 CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질, 뉴클레오사이드 유사체, 백금 화합물, 캄토테신 유사체, 탁산, 예컨대, 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴, 이리노테칸 또는 파클리탁셀을 칭할 경우 여기에는 상기 물질의 전구약물 예컨대 에스테르, 염, 유도체 예컨대 컨쥬게이트 역시도 포함되는 것이다. 예를 들면 담체 물질과 상기 물질과의 컨쥬게이트, 예를 들면 단백질-결합된 파클리탁셀 예컨대 알부민-결합된 파클리탁셀을 들 수 있다. 좋기로는, 상기 물질의 염은 약학적으로 허용가능한 것이 바람직하다.
바람직한 일 구체예에서, "CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질"은 "면역원성 세포 사멸을 유도하는 물질"이거나 또는 "면역원성 세포 사멸을 유도하는 물질"을 포함하는 것이다.
특정한 상황에서, 암 세포는 면역계에 의해 암호해독되는 시공간적으로 규정되는 시그널들의 조합의 방출과 연결된 치명적인 스트레스 경로에 들어가, 종양-특이적인 면역 반응을 활성화시킬 수 있다(Zitvogel L. 외 (2010) 세포 140: 798-804). 이러한 시나리오 하에서는 암 세포들이 수지상 세포와 같은 선천적인 면역 이펙터에 의해 감지되는 시그널을 방출하도록 촉발되어 CD8+ T 세포 및 IFN-γ시그널링이 관여된 동종(cognate) 면역반응을 촉발함으로 해서, 종양 세포 사멸이 생산적인 항암 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 이러한 시나리오 하에서는 암 세포들이 수지상 세포와 같은 선천적인 면역 이펙터들에 의해 감지되는 시그널을 방출하도록 촉발되어 CD8+ T 세포 및 IFN-γ시그널링이 관여하는 동종(cognate) 면역 반응을 촉발함으로 해서 종양 세포 사멸이 생산적인 항암 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 이 시그널들은 세포 표면에의 세포질세망(ER) 샤프론 칼레티쿨린 (CRT)의 예비-세포자멸사 노출, ATP의 예비-세포자멸사 분비 및 핵 단백질 HMGB1의 후-세포자멸사 방출을 포함한다. 이와 함께, 이들 프로세스들은 면역원성 세포사멸(ICD)의 분자 결정인자를 구성한다. 안트라사이클린, 옥살리플라틴, 및 γ 자극은 ICD를 정의하는 모든 시그널을 유도할 수 있는 반면, 죽어가는 세포 표면에 ER로부터의 CRT 전좌(translocation)의 유도 - ER 스트레스를 필요로 하는 프로세스 -를 결여하는 시스플라틴과 같은 물질은 ER 스트레스 인듀서인 탑시가르긴(thapsigargin)에 의한 상보성을 필요로 한다.
본 발명에 따라, "면역원성 세포 사멸을 유도하는 물질"은 세포, 특히 암세포에 제공될 경우 세포가 치명적인 스트레스 경로에 들어가도록 유도하여 종국적으로 종양-특이적 면역 반응을 야기할 수 있는 물질 또는 물질들의 조합을 가리킨다. 특히, 세포에 제공될 경우 면역원성 세포 사멸을 유도하는 물질은 그 세포로 하여금 시그널, 특히, 세포 표면에서의 세포질세망(ER) 샤프론 칼레티쿨린 (CRT)의 예비-세포자멸사 노출, ATP의 예비-세포자멸사 분비 및 핵 단백질 HMGB1의 후-세포자멸사 방출을 포함하하는 시그널들의 시공간적으로 규정된 조합을 방출하도록 유도한다.
본 발명에 따라, "면역원성 세포 사멸을 유도하는 물질"에는 안트라사이클린 및 옥살리플라틴이 포함된다.
"뉴클레오사이드 유사체"라는 용어는 퓨린 유사체 및 피리미딘 유사체 양자를 모두 포함하는 카테고리인 뉴클레오사아이드의 구조적 유사체를 가리킨다.
"겜시타빈"이라는 용어는 다음 화학식의 뉴클레오사이드 유사체인 화합물이다:
Figure pct00001
특히, 이 용어는 화합물 4-아미노-1-(2-데옥시-2,2-디플루오로-β-D-에리쓰로-펜토퓨라노실)피리미딘-2(1H)-온 또는 4-아미노-1-[(2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-4-히드록시-5-(히드록시메틸)옥솔란-2-일]-1,2-디히드로피리미딘-2-온을 가리킨다.
본 발명에 따라, 겜시타빈은 정맥 경로로 투여되는 것이 바람직하다. 좋기로는, 겜시타빈은 0.5 내지 2 g/m2 체표면적, 좋기로는 0.8 내지 1.5 g/m2 체표면적, 더욱 좋기로는 1 내지 1.2 g/m2 체표면적의 범위로 투여되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 겜시타빈은 제곱 미터 당 1000 mg의 투여량으로 8의 7주 동안 매주 그리고 이어서 4의 3주 동안 매주 투여될 수 있다.
"뉴클레오사이드 유사체"라는 용어에는 플루오로우라실 및 그의 전구약물과 같은 플루오로피리미딘 유사체가 포함된다. "플루오로우라실" 또는 "5-플루오로우라실" (5-FU 또는 f5U) (Adrucil, Carac, Efudix, Efudex 및 Fluoroplex라는 상품명으로 판매됨)이라는 용어는 다음 화학식의 피리미딘 유사체인 화합물이다:
Figure pct00002
특히, 이 용어는 화합물 5-플루오로-1H-피리미딘-2,4-디온을 가리킨다.
"카페시타빈" (Xeloda, Roche)이라는 용어는 조직 내에서 5-FU로 전환되는 전구약물인 화학요법 약물을 가리킨다. 경구 투여될 수 있는 카페시타빈은 다음 화학식을 갖는다:
Figure pct00003
특히, 이 용어는 화합물 펜틸 [1-(3,4-디히드록시-5-메틸테트라히드로퓨란-2-일)-5-플루오로-2-옥소-1H-피리미딘-4-일]카르바메이트를 가리킨다.
본 발명에 따라, 용어 "백금 화합물"은 예컨대 백금 착화합물과 같이 그 구조 내에 백근을 함유하는 화합물을 가리키며 여기에는 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴 등의 화합물이 포함된다.
용어 "시스플라틴" 또는 "시스플라티늄"은 다음 화학식을 갖는 화합물 시스-디암민디클로로백금 (II) (CDDP)을 가리킨다:
Figure pct00004
용어 "카르보플라틴"은 다음 화학식을 갖는 화합물 시스-디암민(1,1-시클로부탄디카르복실라토)백금(II)을 가리키는 것이다:
Figure pct00005
용어 "옥살리플라틴"은 다음 화학식의 디아미노시클로헥산 담체 리간드와 착화된 백금 화합물인 화합물을 가리킨다:
Figure pct00006
특히, 용어 "옥살리플라틴"은 화합물 [(1R,2R)-시클로헥산-1,2-디아민](에탄디오에이토-O,O')백금(II)을 가리킨다. 주사용 옥살리플라틴 역시도 상표명 Eloxatine으로 판매되고 있다.
탁산은 탁서스(Taxus) 속의 식물과 같은 천연 공급원으로부터 최초로 유도된 바 있는 디테르펜 화합물 부류이지만, 이들 중 몇몇은 인공적으로 합성되어 왔다. 탁산 클래스 약물의 주된 작용 메카니즘은 미세관(microtubule) 기능의 파괴이므로, 세포 분할 과정을 억제하는 것이다. 탁산에는 도세탁셀 (Taxotere) 및 파클리탁셀 (Taxol)이 포함된다.
본 발명에 따라, 용어 "도세탁셀"은 다음 화학식을 갖는 화합물을 가리킨다:
Figure pct00007
특히, 용어 "도세탁셀"은 화합물 1,7β,10β-트리히드록시-9-옥소-5β,20-에폭시탁-11-센-2α,4,13α-트리일 4-아세테이트 2-벤조에이트 13-{(2R,3S)-3-[(3차-부톡시카르보닐)-아미노]-2-히드록시-3-페닐프로파노에이트"를 가리킨다.
본 발명에 따라, 용어 "파클리탁셀"은 다음 화학식을 갖는 화합물을 가리킨다:
Figure pct00008
특히, 용어 "파클리탁셀"은 화합물 (2α,4α,5β,7β,10β,13α)-4,10-비스-(아세틸옥시)-13-{[(2R,3S)- 3-(벤조일아미노)-2-히드록시-3-페닐프로파노일]옥시}- 1,7-디히드록시-9-옥소-5,20-에폭시탁-11-센-2-일 벤조에이트를 가리킨다.
본 발명에 따라, 용어 "캄토테신 유사체"는 화합물 캄토테신(CPT; (S)-4-에틸--히드록시-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14-(4H,12H)-디온)의 유사체를 가리킨다. 좋기로는 용어 "캄토테신 유사체"는 다음 화학식의 구조를 포함하는 화합물을 가리킨다:
Figure pct00009
본 발명에 따라, 바람직한 캄토테신 유사체는 DNA 효소 토포이소머라제I (topo I)의 저해제이다. 본 발명에 따른 바람직한 캄토테신 유사체는 이리노테칸 및 토포테칸이다.
이리노테칸은 DNA가 토포이소머라제 I의 저해에 의해 풀리는 것을 예방하는 약물이다. 화학적 용어로, 이것은 다음 화학식을 갖는 천연 알칼로이드 캄토테신의 반합성 유사체이다:
Figure pct00010
특히, 용어 "이리노테칸"은 화합물 (S)-4,11-디에틸-3,4,12,14-테트라히드로-4-히드록시-3,14-디옥소1H-피라노[3',4':6,7]-인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-9-일-[1,4'-비피페리딘]-1'-카르복실레이트를 가리킨다.
토포테칸은 다음 화학식을 갖는 토포이소머라제 저해제이다:
Figure pct00011
특히 용어 "토포테칸"은 화합물 (S)-10-[(디메틸아미노)메틸]4-에틸-4,9-디히드록시-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14(4H,12H)-디온 일염산염을 가리킨다.
안트라사이클린은 역시 항생제인 암 화학요법에서 흔히 사용되는 약물 부류이다. 구조적으로, 모든 안트라사이클린은 공통되는 4환식 7,8,9,10-테트라히드로테트라센-5,12-퀴논 구조를 가지며 대체로 특정 위치에서 글리코실화를 요구한다.
안트라사이클린은 좋기로는 다음 중 하나 이상의 메카니즘을 야기하는 것이 바람직하다: 1. DNA/RNA 스트랜드의 염기쌍 사이에 삽입됨으로써 DNA 및 RNA 합성을 저해하여 급속히 성장하는 암세포의 복제를 방지함. 2. 토포이소머라제 II 효소을 억제하여, 수퍼코일된 DNA의 풀림을 방지하고 그에 따라 DNA 전사 및 복제를 차단함. 3. DNA 및 세포막을 손상시키는 철-매개된 자유 산소 래디칼을 발생시킴.
본 발명에 따라, 용어 "안트라사이클린"은 좋기로는 세포자멸사를 유도하는 항암제, 좋기로는 토포이소머라제 II에서 DNA의 풀림을 억제함으로써 세포자멸사를 유도하는 항암제를 가리킨다.
좋기로는, 본 발명에 따라, 용어 "안트라사이클린"은 일반적으로 다음의 고리 구조를 갖는 화합물 부류를 가리키며
Figure pct00012
여기에는 상기 화합물의 유사체 및 유도체, 약학적 염, 수화물, 에스테르, 컨쥬게이트 및 그의 전구약물이 포함된다.
안트라사이클린 및 안트라사이클린 유사체의 비제한적인 예로는 다우노루비신(다우노마이신), 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 이다루비신, 로도마이신, 피라루비신, 발루비신, N-트리플루오로-아세틸 독소루비신-14-발레레이트, 아클라시노마이신, 모르폴리노독소루비신(모르폴리노-DOX), 시아노모르폴리노-독소루비신(시아노-모르폴리노-DOX), 2-피롤리노-독소루비신(2-PDOX), 5-이미노다우노마이신, 미토잔트론 및 아클라시오마이신 A(아클라루비신)을 들 수 있다. 미토잔트론은 안트라센디온 부류 화합물의 일원인데, 이들은 안트라사이클린의 당 부분은 결여하지만 DNA로의 삽입을 허용하는 평면 폴리시클릭 방향족 고리 구조는 유지하는 화합물이다.
본 발명에서 특히 바람직한 안트라사이클린은 다음 화학식을 갖는 화합물이다:
Figure pct00013
식 중
R1은 H 및 OH로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2는 H 및 OMe로 이루어진 군으로부터 선택되며, R3는 H 및 OH로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4는 H 및 OH로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, R1은 H이고, R2는 OMe이며, R3는 H이고 R4는 OH이다. 또 다른 구체예에서, R1은 OH, R2는 OMe, R3는 H이고, R4는 OH이다. 또 다른 구체예에서, R1 은 OH, R2는 OMe, R3는 OH이고, R4는 H이다. 또 다른 구체예에서, R1은 H, R2는 H, R3 는 H이고, R4는 OH이다.
본 발명의 문맥 상 안트라사이클린으로서 특히 고려되는 것은 에피루비신이다. 에피루비신은 다음 구조식을 갖는 안트라사이클린으로서:
Figure pct00014
미국에서는 상표명 Ellence로, 그리고 다른 지역에서는 Pharmorubicin 또는 Epirubicin Ebewe로서 판매되고 있다. 특히, 용어 "에피루비신"은 화합물 (8R,10S)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-아미노-5-히드록시-6-메틸-옥산-2-일]옥시-6,11-디히드록시-8-(2-히드록시아세틸)-1-메톡시-8-메틸-9,10-디히드로-7H-테트라센-5,12-디온을 가리킨다. 에피루비신은 가장 흔한 안트라사이클린인 독소루비신보다 더 선호되는데, 이는 몇몇 화학치료법에서 에피루비신이 부작용을 덜 일으키는 것으로 나타났기 때문이다.
본 발명에 따라, CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 화학요법제, 특히 암치료에서 확립된 화학요법제일 수 있으며 암 치료에 사용되는 것으로 확립된 약물의 조합과 같은 약물의 조합의 일부일 수도 있다. 이러한 약물 조합은 화학요법제에서 사용되는 약물 조합일 수 있으며, FOLFIRINOX 화학치료법에 사용되는 약물 조합일 수도 있다.
FOLFIRINOX 화학치료법에 사용되는 약물 조합은 류코보린, 플루오로우라실, 이리노테칸 (예컨대 이리노테칸 염산염) 및 옥살리플라틴으로 구성될 수 있다. 옥살리플라틴은 체표면적 1 제곱 미터 당 85 mg: 이리노테칸은 1 제곱 미터 당 180 mg; 류코보린은 1 제곱 미터 당 400 mg; 및 플루오로우라실은 1 제곱 미터 당 400 mg양으로 투여되며 이어서 5-플루오로우라실을 좋기로는 2주 마다, 좋기로는 46 시간 동안 1 제곱 미터 당 2400 mg으로 연속 주입한다.
용어 "폴린산" 또는 "류코보린"은 화학요법제 5-플루오로우라실과 상승 조합되는 유용한 화합물을 가리킨다. 따라서, 만일 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물을 투여한다고 하면, 일 구체예의 이러한 투여는 폴리산과 연계하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 폴린산은 다음 화학식을 갖는다:
Figure pct00015
γδ T 세포 (γ δ T 세포)는 그 표면에 독특한 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor)를 지니는 T 세포의 작은 서브세트이다. 대다수의 T 세포들은 α- 및 β-TCR 사슬로 칭해지는 2개의 당단백질 사슬로 구성된 TCR을 갖는다. 이와 대조적으로, γδ T 세포에서는, TCR이 하나의 γ-사슬과 하나의 δ-사슬로 이루어져 있다. 이 T 세포 그룹은 대개 αβT 세포에 비해 매우 드물다. 인간의 γδ T 세포는 감염성 질환 및 자가면역과 같은 스트레스-감시(stress-surveillance) 반응에 있어서 중요한 역할을 한다. 종양에 있어서 형질전환-유도된 변화 역시 γδ T 세포에 의해 매개되는 스트레스-감시 반응을 일으켜 항종양 면역성을 증강시키는 것으로 유추된다. 항원 인게이지먼트 후, 병변에서 활성화된 γδ T 세포가 다른 이펙터 세포의 소환을 매개하는 케모카인 및/또는 시토카인(예컨대 INFγ, TNFα)을 제공하고 세포독성(죽은 수용체와 세포용해성 과립구 경로를 통해) 및 ADCC와 같은 즉각적인 이펙터 기능을 나타낸다는 것은 매우 중요하다.
말초혈액에서 대부분의 γδ T 세포들은 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체 (TCRγδ)를 발현한다. Vγ9Vδ2 T 세포는 인간과 영장류만 가지며 이들은 많은 급성 염증에서 급속히 확장함에 따라 침입 병원균에 의한 "위험"을 감지하는데 있어서 초기에 중요한 역할을 하는 것으로 추정되며 예컨대 결핵, 살모넬라증, 에를리히증, 브루셀라증, 야토증, 리스테리아증, 톡소플라즈마증 및 말라리아 있어서 수일 내에 다른 모든 림프구들을 능가할 수 있다.
γδ T 세포들은 메발로네이트 경로를 통해 포유동물 세포에서 생산된 이소펜테닐 파이로포스페이트(IPP) 및 세균에서 합성된 파이로포스페이트와 같은 작은 비펩타이드성 포스포릴화 항원(포스포항원)에 대해 반응한다. 정상 세포에서의 IPP 생산이 γδ T 세포의 활성화에 충분치 않은 반면, 종양 세포에서의 메발로네이트 경로의 조절곤란은 IPP의 축적과 γδ T 세포의 활성화를 유도한다. IPPs는 메발로네이트 경로 효소인 파네실 파이로포스페이트 합성효소 (FPPS)를 억제하는 아미노비스포스포네이트에 의해 치료적으로 증가될 수도 있다. 그 중에서도, 졸레드론산(ZA, 졸레드로네이트, ZometaTM, Novartis)는 이러한 아미노비스포스포네이트를 대표하는 것으로, 이것은 이미 골다공증 및 전이성 골질환의 치료를 위해 환자에게 임상적으로 투여되고 있다. 시험관내에서 PBMCs 치료시, ZA는 특히 단핵구에 의해 흡수된다. IPP는 단핵구에 축적되어 γδ T 세포의 발달을 자극하는 항원-제시 세포로 분화된다. 이 세팅에서는, 활성화된 γδ T 세포에 대한 성장 및 생존 인자로서 인터류킨-2 (IL-2)의 첨가가 바람직하다. 마지막으로, 어떤 알킬화 아민이 시험관내에서 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화시키는 것으로, 그러나 단지 밀리몰 농도의 수준으로 활성화시키는 것으로 설명된 바 있다.
본 발명에 따라, "γδ T 세포를 자극하는 물질"이라는 용어는 시험관내 및/또는 생체내에서, 특히 γδ T 세포의 활성화 및 확장을 유도함으로써, γδ T 세포, 특히 Vγ9Vδ2 T 세포의 발달을 자극하는 화합물에 관한다. 이 용어는 좋기로는 메발로네이트 경로 효소인 파네실 파이로포스페이트 합성효소 (FPPS)를 억제함으로써, 포유동물 세포에서 생산된 이소펜테닐 파이로포스페이트 (IPP)를 및/또는 생체내에서 증가시키는 화합물에 관한다.
γδ T 세포를 자극하는 특정한 일군의 화합물들은 비스포스포네이트, 특히 질소-함유 비스포스포네이트 (N-비스포스포네이트; 아미노비스포스포네이트)이다.
예컨대, 본 발명에 사용되기에 적절한 비스포스포네이트에는 다음 화합물들 중 하나 이상, 그의 유사체 및 유도체, 약학적 염, 수화물, 에스테르, 컨쥬게이트 및 전구약물들이 포함될 수 있다:
[1-히드록시-2-(1H-이미다졸-1-일)에탄-1,1-디일]비스(포스폰산), 졸레드론산, 예컨대 졸레드로네이트;
(디클로로-포스포노-메틸)포스폰산, 예컨대 클로드로네이트
{1-히드록시-3-[메틸(펜틸)아미노]프로판-1,1-디일}비스(포스폰산), 이반드론산, 예컨대 이반드로네이트
(3-아미노-1-히드록시프로판-1,1-디일)비스 (포스폰산), 파미드론산, 예컨대파미드로네이트
(1-히드록시-1-포스포노-2-피리딘-3-일-에틸)포스폰산, 리세드론산, 예컨대 리세드로네이트;
(1-히드록시-2-이미다조[1,2-a]피리딘-3-일-1-포스포노에틸)포스폰산, 미노드론산;
[3-(디메틸아미노)-1-히드록시프로판-1,1-디일]비스(포스폰산), 올파드론산.
[4-아미노-1-히드록시-1-(히드록시-옥시도-포스포릴)-부틸]포스폰산, 알레드론산, 예컨대 알레드로네이트;
[(시클로헵틸아미노)메틸렌]비스(포스폰산), 인카드론산;
(1-히드록시에탄-1,1-디일)비스(포스폰산), 에티드론산, 예컨대 에티드로네이트; 및
{[(4-클로로페닐)티오]메틸렌}비스(포스폰산), 틸루드론산.
본 발명에 따라, 졸레드론산 (INN) 또는 졸레드로네이트 (Novartis가 상표명Zometa, Zomera, Aclasta 및 Reclast로 시판중임)는 특히 바람직한 비스포스포네이트이다. Zometa는 다발골수종 및 전립선암과 같은 암 환자의 골격 골절의 예방과 골다공증을 치료하는데 이용된다. 이것은 또한 악성 고칼슘혈증의 치료에도 이용될 수 있고 골전이로 인한 통증을 치료하는데도 도움이 될 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 γδ T 세포를 자극하는 물질은 IL-2와 조합 투여된다. 이러한 조합은 γ9δ2 T 세포의 확장을 매개하고 활성화시키는데 특히 효과적인 것으로 나타났다.
인터류킨-2(IL-2)는 면역계에서 시토카인 시그널링 분자의 한 종류인 인터류킨이다. 이것은 림프구를 유인하며 미생물 감염에 대한 우리 몸의 자연적인 반응의 일부를 구성하여, 우리 몸(self)과 외래 물질(non-self)을 구별한다. IL-2는 림프구에 의해 발현되는 IL-2 수용체에 대한 결합에 의해 그의 효력을 매개한다.
본 발명에 사용되는 IL-2는 γδ T 세포의 자극을 지지하거나 자극을 가능케하는 IL-2이면 어느 것이든 무방하고, 모든 종, 좋기로는 인간으로부터 유래될 수 있다. Il-2는 분리되거나 재조합적으로 생산되거나 합성적인 IL-2일 수 있고, 자연발생적이거나 변형된 IL-2일 수 있다.
용어 "항원"은 면역 반응이 지향되거나 지향될 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 같은 물질에 관한다. 바람직한 구체예에서, 항원은 예컨대 CLDN18.2와 같은 종양-관련 항원, 즉 세포질, 세포 표면 및 세포핵으로부터 유래할 수 있는 암 세포의 구성원이며, 특히, 암 세포 상에서 표면 항원으로서 또는 세포내에서 대량 생산되는 항원인 것들이 바람직하다.
본 발명의 문맥 상, "종양-관련 항원"은 좋기로는 정상 조건 하에서 제한된 수의 조직 및/또는 장기에서 특이적으로 또는 특이적 발달 단계에서 발현되고 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 또는 비정상적으로 발현되는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 문맥 상, 종양-관련 항원은 암 세포의 세포 표면과 연관이 있고, 정상 조직에서는 발현되지 않거나 발현되더라도 드물게만 발현되는 것이 바람직하다.
"에피토프"라는 용어는 분자 내의 항원 결정인자를 가리키는데, 즉, 면역계에 의해 인식되는, 예컨대, 항체에 의해 인식되는 분자의 일부를 가리킨다. 예컨대, 에피토프는 항원 상의 불연속적인, 3차원적 부분이며, 면역계에 의해 인식된다. 에피토프는 대개 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학 활성적인 표면 그루핑을 구성하며, 대체로 특이적인 3차원 구조 특징과 특이적인 전하 특징을 갖는다.
입체형태적(Conformational) 에피토프와 비입체형태적(non-conformational) 에피토프는 변성 용매의 존재 하에서는 전자에 대한 결합이 소실되는 반면 후자에대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. CLDN18.2와 같은 단백질의 에피토프는 좋기로는 상기 단백질의 연속적 또는 불연속적 부분을 포함하며 좋기로는 길이가 예컨대 5 내지 100, 좋기로는 5 내지 50, 더욱 좋기로는 8 내지 30, 가장 좋기로는 10 내지 25 아미노산인 것이 바람직하고, 예컨대, 에피토프의 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산인 것이 좋다.
"항체"라 함은 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 칭하는 것으로, 그의 항원 결합부를 포함하는 분자이면 어느 것이든 이에 포함된다. "항체"라는 용어에는 모노클로날 항체 및 항체 단편 또는 항체 유도체가 포함되고 여기에는, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 예컨대 scFv's 및 항원-결합 항체 단편 예컨대 Fab 및 Fab' 단편이 포함되나 이에 한정되지 않으며, 항체의 모든 재조합 형태, 예컨대, 원핵생물에서 발현되는 항체, 비글리코실화 항체 및 본 명세서에 설명된 모든 항원-결합 항체 단편 및 유도체도 이에 포함된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부(VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부(VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 이루어진다. VH 및 VL 부분은 상보성 결정부(CDR)라 명명되는 하이퍼변이성 부분들로 더 세분화될 수 있고, 프레임워크부(FR)로 명명되는, 보다 보존적인 부분들이 사이사이에 배치될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDRs과 4개의 FRs로 구성되며, 이들은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지 다음 순서로 배치된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄와 경쇄의 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변부는 면역계의 다양한 세포들(예컨대 이펙터 세포) 및 클래시컬 보체계의 제1 성분(Clq)을 비롯하여, 숙주의 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명에 설명된 항체들은 인간 항체일 수 있다. 본 발명에서 "인간 항체"라는 용어는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변부와 불변부를 갖는 항체를 포괄하는 것으로 의도된다. 본 발명에 설명된 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다(예컨대, 무작위적인 또는 위치-특이적 돌연변이 유발에 의해 시험관내 유도된 돌연변이 또는 생체내 체세포 돌연변이).
"인간화 항체"라 함은 분자의 항원 결합부는 실질적으로 비인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래한 반면, 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초하는 것인 분자를 가리킨다. 항원-결합 부분는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인을 포함할 수도 있고 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 부분에 그래프트된 상보성 결정부(CDR) 만을 포함할 수도 있다. 항원-결합 부분는 야생형이거나 또는 1 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있는데, 예컨대, 인간 면역글로불린에 보다 더 밀접히 닮도록 변형될 수 있다. 인간화 항체들 중 몇몇 유형은 모든 CDR 서열을 보존한다 (예컨대 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDRx를 함유하는 인간화된 마우스 항체). 다른 유형들은 하나 이상의 CDR이 오리지널 항체와 다를 수 있다.
"키메라 항체"라는 용어는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 일 부분이 특별한 클래스에 속하거나 특별한 종들로부터 유래된 항체들에서 상응하는 서열들과 상동성이고, 반면 사슬의 남아있는 세그먼트(segment)는 상응하는 서열들에 달리 상동성이다. 전형적으로 경쇄 및 중쇄들의 가변부는 포유류의 한 종들로부터 유래된 항체들의 가변부들과 닮은 반면, 불변 부분들은 달리 유래된 항체들의 서열들과 상동성이다. 그러한 키메라 형태들의 한가지 분명한 잇점은 가변부가 예컨대, 인간 세포 제조로부터 유래된 불변부들과 조합하여 비인간 숙주 유기체로부터 쉽게 이용가능한B-세포들 또는 하이브리도마를 이용하여 현재 알려진 소스로부터 편리하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변부는 각각의 제조물의 잇점을 가지고, 특이성은 소스에 영향을 받지 않는 반면, 인간인 불변부는 항체들이 비인간 소스로부터의 불변부인 것 보다 항체들이 주입될 때 인간 대상으로부터의 면역 반응을 잘 이끌어내지 않는다. 그러나 정의는 이러한 특별한 예시에 제한되지 않는다.
항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 (또는 간단히, "결합 부분") 또는 항체의 "항원-결합 단편(또는 간단히 "결합 단편")은 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장(full-length) 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있다는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함된 결합 단편들의 예들은 (i) Fab 단편들, VL, VH, CL 및 CH 도메인들로 구성된 1가의 단편들; (ii) F(ab')2 단편들, 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가의 단편들; (iii) VH 및 CH 도메인들로 구성된 Fd 단편들; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인들로 구성된 Fv 단편들, (v) dAb 단편들 (Ward 외, (1989) Nature 341: 544-546), VH 도메인으로 구성됨; (vi) 분리된 상보성 결정 영역들 (CDR), 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의적으로 결합될 수 있는 두개 이상의 CDR들의 조합들을 포함한다. 또한, VL 및 VH의 2개의 도메인들이 분리된 유전자들에 의해 코딩됨에도 불구하고, VL과 VH영역들이 1가의 분자들을 형성하기 위해 짝을 이루는 단일 단백질 사슬로써 그것들이 만들어지도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법들을 이용하여 결합될 수 있다 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려진; Bird 외 (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston 외 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 참고). 그러한 단일 사슬 항체들은 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어 내에서 포함될 수 있는 것으로 생각된다. 추가적인 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합되는 결합 도메인 폴리펩타이드, (ii) 힌지 영역에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH2 불변부, (iii) CH2 불변부에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH3 불변부를 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질들이다. 결합 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변부 또는 경쇄 가변부일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질들은 추가적으로 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 개시된다. 이러한 항체 단편들은 기술분야에 당업자에게 알려져있는 통상의 기술을 이용하여 얻고, 그 단편들은 인택트(intact) 항체들처럼 동일한 방식으로 사용을 위해 스크리닝된다.
"이중특이성 분자"는 예컨대, 단백질, 펩타이드 또는 단백질 또는 펩타이드 복합체와 같은 어떠한 물질을 포함하는 것으로 생각되고, 이것은 두개의 서로다른 결합 특이성을 가진다. 예컨대, 분자는 (a) 세포 표면 항원, 및 (b) 이펙터 세포의 표면 상에 Fc 수용체와 결합하거나 상호작용할 수 있다. "다중특이성 분자" 또는 "이종특이성 분자"라는 용어는 예컨대, 단백질, 펩타이드 또는 단백질 또는 펩타이드 복합체와 같은 어떠한 물질을 포함하는 것으로 생각되고, 이것은 두개 이상의 서로다른 결합 특이성을 가진다. 예컨대, 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포의 표면상에 Fc 수용체, 및 (c) 적어도 하나의 다른 성분과 결합하거나 상호작용 할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 이것에 제한되는 것은 아니지만, CLD18.2 및 이펙터 세포들 상에 Fc 수용체를 비롯한 다른 표적들에 지시된 이중특이성, 삼중특이성, 사중특이성, 및 다른 다중특이성 분자들을 포함한다. "이중특이성 항체들"이라는 용어는 이체(diabodies)들을 또한 포함한다. 이체들은 2가이고, VH 및 VL 도메인들이 단일 폴리펩타이드 사슬에 발현되지만, 같은 사슬상에 두개의 도메인들 사이에 짝을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용하고 그것에 의해 도메인들이 다른 사슬들의 상보적 도메인들과 짝을 이루고, 두개의 항원 결합 사이트들을 생성할 수 있는 이중특이성 항체들이다 (Holliger, P., 외 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., 외 (1994) Structure 2: 1121-1123 참고).
항체는 세포독소, 약물(예를 들어 면역 억제약), 또는 방사성 동위원소와 같은 치료적 모이어티나 물질에 컨쥬게이트될 수도 있다. 세포독소 또는 세포독성 물질은 세포에 해롭거나 특히 세포를 살해시키는 모든 물질을 포함한다. 그 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미디신 D, 이티디움 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-디히드록테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 그리고 퓨로마이신과 이것들의 유사체 또는 동족체 물질을 포함한다. 항체 컨쥬게이트를 형성하기 위한 적절한 치료적 물질은, 이것에 제한되는 것은 아니지만, 항대사산물 (예컨대, 메토트렉세이트(methodtrexate), 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬레이팅 물질(예컨대, 메크로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜파란, 카르무스틴 (BSNU), 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 플라티넘 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예컨대, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신)) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC), 및 항-미토틱 물질 (예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다. 일 선호된 구체예에서, 치료제는 세포 독성 물질나 방사성 독성 물질이다. 다른 구체예예서, 치료제는 면역억제제이다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 GM-CSF이다. 선호된 구체예에서, 치료제는 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 황산염, 카르무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드 또는 리신 A이다.
항체는 또한 요오드-131, 이트륨-90, 인듐-111과 같은 방사성 동위원소에 결합해 세포 독성 방사성 의약품을 생산할 수 있다.
본 발명의 항체 컨쥬게이트는 해당 생물학적 반응을 변형시키는 데 사용될 수 있으며, 이 약물 모이어티는 전통적 화학 치료 물질에 국한되는 뜻으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 이 약물 모이어티는 단백질이나 바람직한 생물학적 작용을 억제하는 폴리펩타이드일 수 있다. 그러한 단백질에는 예를 들어 효소적 활성 독성, 또는 그것의 활성 단편인 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독성; 괴사 인자나 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 예를 들어 림포킨, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립성 대식세포 군집 자극 인자(GM-CSF), 과립성 군집 자극 인자(G-CSF) 또는 다른 성장 인자들을 비롯한 생물학적 반응 변형자들을 포함할 수 있다.
이러한 치료적 모이어티를 항체에 컨쥬게이트시키는 기술은 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌들(Arnon 외, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies 및 Cancer Therapy, Reisfeld 외(eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom 외, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson 외 (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological 및 Clinical Applications, Pinchera외 (eds. ), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, 및 Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection 및 Therapy, Baldwin 외 (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe 외, "The Preparation 및 Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982))을 참조할 것.
본 발명에서, 동물을 면역시키거나 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크르닝함으로써 계로부터 항체가 얻어지는 경우 그 항체는 특정 생식세포 서열로부터 "유래된(derived from)" 것이며, 선택된 항체는 그 생식세포 면역글로불린 유전자가 코딩하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 더욱 좋기로는 적어도 95%, 더더욱 좋기로는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 것이다. 일반적으로, 특정 생식세포 서열로부터 유래된 항체는 그 생식세포 면역글로불린이 코딩하는 아미노산 서열과 아미노산 차이가 10개 이하, 더욱 좋기로는, 5개 이하, 더더욱 좋기로는 4개, 3개, 2개, 또는 1개 이하인 것이 바람직하다.
본 발명에서, "헤테로항체(heteroantibody)"라는 용어는 함께 결합된 둘 이상의 항체들, 그 유도체들, 또는 항원 결합부 중 적어도 2개가 상이한 특이성을 가짐을 의미한다. 이러한 상이한 특이성들은 이펙터 세포 상에 Fc 수용체를 위한 결합 특이성, 및 표적 세포, 예컨대 종양 세포 상에 항원 또는 에피토프를 위한 결합 특이성을 포함한다.
본 발명에 기재된 항체들은 모노클로날 항체들일 수 있다. 본 발명에서 "모노클로날 항체"라는 용어는 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제조물을 말한다. 모노클로날 항체는 단일 결합 특이성과 친화도를 나타낸다. 일 구체예에서, 모노클로날 항체들은 불사화된 세포에 융합되는 비인간 동물, 예컨대, 마우스로부터 얻어지는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 발명에 설명된 항체들은 재조합 항체들일 수 있다. 본 발명에서 "재조합 항체"라는 용어는 (a) 면역글로불린 유전자들 또는 그들로부터 제조되는 하이브리도마에 관하여 유전자 이식 또는 트랜스염색체적인 동물 (예컨대, 마우스)로부터 분리된 항체들 , (b) 항체를 발현하기 위해 형질전환된 숙주 세포, 예컨대, 트랜스팩토마로부터 분리된 항체들, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체들, 및 (d) 다른 DNA 서열들에 면역글로불린 유전자 서열들의 스플라이싱과 관련된 다른 수단들에 의해 분리되거나, 생성되거나, 발현되거나 제조된 항체들을 비롯한, 재조합적 수단에 의해 분리되거나, 생성되거나, 발현되거나, 제조된 모든 항체들을 포함한다.
본 발명에 설명된 항체들은 비제한적인 예로서 마우스, 래트, 토끼, 기니픽 및 인간을 비롯한 서로 다른 종으로부터 유래할 수 있다.
본 발명에 설명된 항체들에는 폴리클로날 및 모노클로날 항체들이 포함되며 IgA 예컨대 IgA1 또는 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, 및 IgD 항체가 포함된다. 다양한 구체예에서, 항체는 IgG1 항체, 더욱 특히는 IgG1, κ 또는 IgG1, λ 이소형 (즉 IgG1, κ,λ), IgG2a 항체 (예컨대 IgG2a, κ,λ), IgG2b 항체 (예컨대 IgG2b, κ,λ), IgG3 항체 (예컨대 IgG3, κ,λ) 또는 IgG4 항체 (예컨대 IgG4, κ,λ)이다.
본 발명에서, "트랜스펙토마(transfectoma)"라는 용어는 CHO 세포들, NS/0 세포들, HEK293 세포들, HEK293T 세포들, 식물 세포들, 또는 효모를 포함하는 곰팡이를 비롯한, 항체를 발현하는 재조합 진핵 숙주세포들을 포함한다.
본 발명에서, "이종 항체(heterologous antibody)"는 그러한 항체를 생산하는 형질전환 유기체와 관련하여 규정된다. 이러한 용어는 아미노산 서열을 가지거나, 형질전환 유기체를 구성하지 않는 유기체에서 나타나는 것에 상응하는 핵산 서열을 코딩하고, 형질전환 유기체 외에 종들로부터 일반적으로 유래되는 항체를 지시한다.
여기에서 사용된, "헤테로하이브리드 항체"는 상이한 유기체들 기원의 경쇄 및 중쇄를 가지는 항체를 말한다. 예컨대, 쥐의 경쇄와 연관된 인간 중쇄를 가지는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 모든 항체 및 항체의 유도체를 포함하는데, 본 발명의 목적은 용어 "항체"에 의하여 포괄된다. 용어 "항체 유도체"란 항체의 임의의 변형된 형태, 예컨대 항체와 다른 약제 또는 항체, 또는 항체 단편과의 컨쥬게이트를 의미한다.
본 발명에 기재된 항체들은 좋기로는 분리된 것이다. 본 발명에서 사용된 "분리된 항체"라는 용어는 상이한 항원성 특이성을 가지는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 가리키는 것으로 의도된 것이다 (예컨대, CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 항체에는 실질적으로 CLDN18.2가 아닌 항원들과 특이적으로 결합하는 항체들이 없다). 인간 CLDN18.2의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 그러나, 다른 관련된 항원들, 예컨대, 다른 종들로부터 유래된 다른 관련된 항원들과 교차반응성을 갖는다 (예컨대, CLDN18.2 종 동족체).또한, 분리된 항체에는 실질적으로 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 없을 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, "분리된" 모노클로날 항체들의 조합은 상이한 특이성들을 가지며 잘 규정된 조성물 또는 혼합물로서 조합된 항체들에 관한 것이다.
본 발명에서 "결합(binding)"이라는 용어는 좋기로는 특이적 결합에 관한 것이다.
본 발명에서, 만일 항체가 표준 분석법에 의할 때 소정의 표적에 대해 유의적인 친화도를 가지고 상기 소정의 표적과 결합한다면 상기 항체는 상기 소정의 표적에 결합할 능력이 있는 것이다. "친화도" 또는 "결합 친화도"는 평형 해리 상수(KD)에 의하여 종종 측정된다. 바람직하게는, 용어 "유의적인 친화도"란 10-5 M 또는 그 미만, 10-6 M 또는 그 미만, 10-7 M 또는 그 미만, 10-8 M 또는 그 미만, 10-9 M 또는 그 미만, 10-10 M 또는 그 미만, 10-11 M 또는 그 미만, 또는 10-12 M 또는 그 미만의 해리 상수(KD) 값으로 소정의 표적에 결합하는 것을 의미한다.
만일 항체가 상기 표적에 대해 유의적인 친화도를 가지지 않고, 표준 분석에서 상기 표적에 유의적으로 결합하지 않는다면, 그 항체는 상기 표적에 결합할 능력이 (실질적으로) 없는 것이다. 좋기로는, 항체가 최대 2, 좋기로는 최대 10, 더욱 좋기로는 최대 20, 특히 최대 50 또는 100 ㎍/ml 또는 그 이상의 농도로 존재하면, 그 항체는 상기 표적과 검출가능할 정도로 결합하는 것이 아니다. 좋기로는, 만일 항체가 결합할 능력이 있는 소정의 표적에 대한 결합 KD에 비해 KD값이 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 또는 106배 더 높게 상기 표적과 결합한다면 그 항체는 상기 표적에 대해 유의적인 친화도를 갖는 것이 아니다. 예컨대, 만일 항체가 결합 가능한 표적에 대한 항체의 결합 KD값이 10-7 M이면, 그 항체가 유의적인 친화도를 갖지 않는 표적에 대한 결합 KD는 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M이 될 것이다.
어느 항체가 다른 표적에는 결합할 수 없는 것, 즉 다른 표적에는 유의적인 친화도를 가지지 않고, 표준 분석에서 다른 표적에는 유의적으로 결합하지 않는 것인 반면에, 소정의 표적에는 결합할 수 있는 것이라면, 그 항체는 상기 소정의 표적에 특이적인 것이다. 본 발명에 따를 때, 어느 항체가 CLDN18.2에 대해서는 결합할 수 있지만, 다른 표적, 특히 CLDN9, CLDN4, CLDN3 및 CLDN1와 같이 CLDN18.2가 아닌 다른 클라우딘 단백질에는 결합할 수 없는 것이라면, 그 항체는 CLDN18.2에 특이적인 것이다. 좋기로는, CLDN9, CLDN4, CLDN3 및 CLDN1와 같은 CLDN18.2가 아닌 클라우딘 단백질에 대한 친화도 및 결합이, 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 클라우딘과 관계없는 단백질에 대한 친화도 또는 결합, 또는 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체와 같은 비클라우딘 막투과 단백질, 또는 다른 특정 폴리펩타이드에 대한 친화도 또는 결합을 유의적으로 능가하는 것이 아니라면, 상기 항체는 CLDN18.2에 대하여 특이적인 것이다. 좋기로는 어느 항체가 특이적이지 않은 표적에의 결합을 위한 KD 값보다 적어도 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 또는 106-배 더 낮은 KD 값을 가지고 소정의 표적에 결합한다면, 그 항체는 상기 표적에 대하여 특이적인 것이다. 예를 들어 어느 항체가 그것이 특이적인 표적에 결합하기 위한 KD 값이 10-7 M인 경우, 그것이 특이적이지 않은 표적에 결합하기 위한 KD 값은 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M일 것이다.
어느 항체가 다른 표적에는 결합할 수 없는 것, 즉 다른 표적에는 유의적인 친화도를 가지지 않고, 표준 분석에서 다른 표적에는 유의적으로 결합하지 않는 것인 반면에, 소정의 표적에는 결합할 수 있는 것이라면, 그 항체는 상기 소정의 표적에 특이적인 것이다. 본 발명에서, 어느 항체가 CLDN18.2에 대해서는 결합할 수 있지만, 다른 표적에는 (실질적으로) 결합할 수 없는 것이라면, 그 항체는 CLDN18.2에 특이적인 것이다. 좋기로는, CLDN18.2가 아닌 클라우딘 단백질에 대한 친화도 및 결합이, 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 클라우딘과 관계없는 단백질에 대한 친화도 또는 결합, 또는 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체와 같은 비클라우딘 막투과 단백질, 또는 다른 특정 폴리펩타이드에 대한 친화도 또는 결합을 유의적으로 능가하는 것이 아니라면, 상기 항체는 CLDN18.2에 대하여 특이적인 것이다. 좋기로는 어느 항체가 특이적이지 않은 표적에의 결합을 위한 KD 값보다 적어도 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 또는 106-배 더 낮은 KD 값을 가지고 소정의 표적에 결합한다면, 그 항체는 상기 표적에 대하여 특이적인 것이다. 예를 들어 어느 항체가 그것이 특이적인 표적에 결합하기 위한 KD 값이 10-7 M인 경우, 그것이 특이적이지 않은 표적에 결합하기 위한 KD 값은 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M일 것이다.
항체의 표적에 대한 결합은 임의의 적절한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있는데, 예를 들어 논문(Berzofsky 외, "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman 및 Company New York, N Y (1992)) 및 본 명세서에 기술된 방법을 참조할 것. 평형투석의 사용; 제조사에 의해 개괄된 일반적 절차를 사용하는 BIAcore 2000 기구의 사용; 방사능 표지된 표적 항원을 사용하는 방사능 면역 분석법에 의하여; 또는 숙련된 기술자에게 알려진 또 다른 방법에 의하는 것과 같은 통상적인 기법을 사용하여 친화도를 손쉽게 결정할 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어 논문(Scatchard 외, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949))의 방법에 의하여 분석될 수 있다. 만일 다른 조건(예컨대 염 농도, pH)에서 측정된다면, 특정 항체-항원 결합의 측정된 친화도는 변할 수 있다. 따라서, 친화도 및 KD, IC50와 같은 다른 항원-결합 파라미터의 측정은 표준화된 항체 및 항원 용액 및 표준화된 완충액을 사용하여 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에서, "이소형(isotype)"이라 함은 중쇄 불변부 유전자들에 의해 코딩되는 항체 클래스(예컨대, IgM 또는 IgG1)를 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "이소형 스위칭(switching)"은 항체들의 클래스 또는 이소형이 하나의 Ig 클래스로부터 다른 Ig 클래스들 중 하나까지로 변화하는 것에 의한 현상을 나타낸다.
목적에서 적용된 바와 같이, 본 발명에서 사용된 바와 같은, "자연적으로 일어나는"이라는 용어는 목적을 자연에서 찾을 수 있는 사실을 나타낸다. 예컨대, 자연에서 소스로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스들을 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연적으로 일어난다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "재배열된(rearranged)"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 로커스(locus)의 배열을 나타내는 것으로, V 세그먼트는 필수적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 구조에서 D-J 또는 J 세그먼트에 즉시 인접하여 위치된다. 재배열된 면역글로불린 (항체) 유전자 로커스는 생식세포(germline) DNA와 비교에 의해 확인될 수 있다; 재배열된 로커스는 적어도 하나의 재조합된 헵타머/나노머 상동성 요소를 가질 것이다.
V 세그먼트와 관련하여 본 명세서에서 사용된 "비재배열된(unrearranged)" 또는 "생식세포(germline) 배열"이라는 용어는 V 세그먼트가 재조합되지 않아 D 또는 J 세그먼트에 직접적으로 인접되어 있는 배열을 가리킨다.
본 발명에서 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN18.2에 존재하는 에피토프, 좋기로는 CLDN18.2의 세포외 도메인들, 특히 제1 세포외 도메인 내에 위치하는 에피토프, 특히, CLDN18.2의 아미노산 위치 29 내지 78 내에 존재하는 에피토프에 결합할 수 있는 항체이다. 특정 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 (i) CLDN18.1 상에 존재하는 것이 아닌, CLDN18.2, 좋기로는 SEQ ID NO: 3, 4, 및 5 상의 에피토프, (ii) CLDN18.2-루프1, 좋기로는 SEQ ID NO: 8 상에 위치하는 에피토프, (iii) CLDN18.2-루프2, 좋기로는 SEQ ID NO: 10 상에 위치하는 에피토프, (iv) CLDN18.2-루프D3, 좋기로는 SEQ ID NO: 11 상에 위치하는 에피토프, (v) CLDN18.2-루프1 및 CLDN18.2-루프D3을 포괄하는 에피토프, 또는 (vi) CLDN18.2-루프D3, 좋기로는 SEQ ID NO: 9 상에 위치하는 비글리코실화 에피토프에 결합할 수 있는 항체이다.
본 발명에 따라 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN18.1에는 결합하지 않지만 CLDN18.2에는 결합하는 능력이 있는 항체이다. 좋기로는, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN18.2에 대해 특이적이다. 좋기로는, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 좋기로를 그 세포 표면에서 발현되는 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체이다. 특히 바람직한 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 살아있는 세포 표면에 존재하는 CLDN18.2의 천연 에피토프에 결합한다. 좋기로는, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NOs: 1, 3-11, 44, 46, 및 48-50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 펩타이드에 결합한다. 좋기로는, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 전술한 단백질, 펩타이드 또는 면역원성 단편 또는 그의 유도체에 특이적이다. CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NOs: 1, 3-11, 44, 46, 및 48-50로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이나 펩타이드 또는 상기 단백질이나 펩타이드를 발현하는 핵산 또는 숙주 세포로 동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하다. 좋기로는, 상기 항체는 암 세포, 특히 전술한 유형의 암 세포에 결합하고, 비암(non-cancerous) 세포에는 실질적으로 결합하지 않는 것이 좋다.
바람직하게도, CLDN18.2를 발현하는 세포에 대한 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체의 결합은 CLDN18.2를 발현하는 세포의 사멸을 유도하거나 매개한다. CLDN18.2를 발현하는 세포는 좋기로는 암 세포이며 특히 종양원성(tumorigenic)인 위, 식도, 췌장, 폐, 난소, 결장, 간, 두경부 및 담낭의 암 세포인 것이 바람직하다. 좋기로는 이 항체는 보체의존성 세포독성(CDC) 매개형 용해, 항체의존성 세포독성(ADCC) 매개형 용해, 세포자멸사 및 CLDN18.2를 발현하는 세포의 증식 억제 중 한 가지 이상의 유도에 의해 세포의 사멸을 유도하거나 매개한다. 좋기로는, 세포의 ADCC 매개형 용해는, 특정 구체예에서 단핵구, 단핵구 세포, NK 세포 및 PMNs로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이펙터 세포의 존재 하에 일어나는 것이 바람직하다. 세포의 증식 억제는 브로모데옥시우리딘(5-브로모-2-데옥시우리딘, BrdU)을 이용하는 분석에서 세포의 증식을 탐지함으로써 시험관내 측정가능하다. BrdU는 티미딘의 유사체인 합성 뉴클레오사이드로서 복제중인 세포(세포 주기의 S 페이즈 동안)의 새롭게 합성된 DNA내로 병합어, DNA 복제가 일어나는 동안 티미딘을 대체할 수 있다. 예컨대 BrdU에 특이적인 항체들을 이용하여, 병합된 화학물질을 탐지함으로써, 그들의 DNA를 활발하게 복제하는 세포들을 찾아낼 수 있다.
바람직한 구체에에서, 본 발명에 설명된 항체들은 다음 특성들 중 한 가지 이상에 의해 특징지어질 수 있다:
a) CLDN18.2에 대한 특이성;
b) CLDN18.2 of 약 100 nM 이하, 좋기로는, 약 5-10 nM 이하 및, 더욱 좋기로는, 약 1-3 nM 이하의 CLDN18.2에 대한 결합 특이성,
c) CLDN18.2 양성 세포에 대한 CDC를 유도하거나 매개하는 능력;
d) CLDN18.2 양성 세포에 대한 ADCC를 유도하거나 매개하는 능력;
e) CLDN18.2 양성 세포의 성장을 억제하는 능력;
f) CLDN18.2 양성 세포의 세포자멸사를 유도하는 능력.
특히 바람직한 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 DSMZ(Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Germany; 신주소: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Germany)에 기탁되어 다음의 명칭과 수탁번호를 부여받은 하이브리도마에 의해 생산된다:
a. 182-D1106-055, 수탁번호 DSM ACC2737, 2005년 10월 19일에 기탁됨
b. 182-D1106-056, 수탁번호 DSM ACC2738, 2005년 10월 19일에 기탁됨
c. 182-D1106-057, 수탁번호 DSM ACC2739, 2005년 10월 19일에 기탁됨
d. 182-D1106-058, 수탁번호 DSM ACC2740, 2005년 10월 19일에 기탁됨
e. 182-D1106-059, 수탁번호 DSM ACC2741, 2005년 10월 19일에 기탁됨
f. 182-D1106-062, 수탁번호 DSM ACC2742, 2005년 10월 19일에 기탁됨,
g. 182-D1106-067, 수탁번호 DSM ACC2743, 2005년 10월 19일에 기탁됨
h. 182-D758-035, 수탁번호 DSM ACC2745, 2005년 11월 17일에 기탁됨
i. 182-D758-036, 수탁번호 DSM ACC2746, 2005년 11월 17일에 기탁됨
j. 182-D758-040, 수탁번호 DSM ACC2747, 2005년 11월 17일에 기탁됨
k. 182-D1106-061, 수탁번호 DSM ACC2748, 2005년 11월 17일에 기탁됨
l. 182-D1106-279, 수탁번호 DSM ACC2808, 2006년 10월 26일에 기탁됨
m. 182-D1106-294, 수탁번호 DSM ACC2809, 2006년 10월 26일에 기탁됨,
n. 182-D1106-362, 수탁번호 DSM ACC2810, 2006년 10월 26일에 기탁됨.
본 발명에 따른 바람직한 항체들은 전술한 하이브리도마가 생산하거나 이로부터 수득가능한 것들이다; 즉, 37G11 182-D1106-055의 경우 37G11, 182-D1106-056의 경우 37H8, 38G5 182-D1106-057의 경우, 182-D1106-058의 경우 38H3, 182-D1106-059의 경우 39F11, 182-D1106-062의 경우 43A11, 182-D1106-067의 경우 61C2, 182-D758-035의 경우 26B5, 182-D758-036의 경우 26D12, 182-D758-040의 경우 28D10, 182-D1106-061의 경우 42E12, 182-D1106-279의 경우 125E1, 182-D1106-294의 경우 163E12, 및 182-D1106-362의 경우 175D10; 및 이들의 키메라 형태 및 인간화 형태.
바람직한 키메라 항체 및 이들의 서열은 다음 표에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00016
바람직한 구체예에서, 항체, 특히 본 발명에 따른 항체의 키메라 형태는 SEQ ID NO: 13 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열과 같은 인간 중쇄 불변부로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변부(CH)를 포함하는 항체를 포함하는 것이 좋다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 항체, 특히 본 발명에 따른 항체의 키메라 형태는 SEQ ID NO: 12 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열과 같은 인간 경쇄 불변부로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변부(CL)를 포함하는 항체를 포함하는 것이 좋다. 특히 바람직한 구체예에서, 항체, 특히 본 발명에 따른 항체의 키메라 형태는 SEQ ID NO: 13 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열과 같은 인간 CH로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 CH 또는 SEQ ID NO: 12 또는 그의 단편으로 나타내지는 아미노산 서열과 같은 인간 CL로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 CL을 포함한다.
일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 κ, 쥐의 경쇄 가변부, 인간 κ 경쇄 불변부 동종이형(allotype) Km(3), 쥐의 중쇄 가변부, 인간 IgG1 불변부, 동종이형 G1m(3)을 포함하는 키메라 마우스/인간 IgG1 모노클로날 항체이다.
바람직한 특정 구체예에서, 항체들의 키메라 형태에는 SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/포함하거나 SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체들이 포함된다.
바람직한 특정 구체예에서, 항체들의 키메라 형태에는 다음의 (i) 내지 (ix)의 가능성으로부터 선택되는 중쇄와 경쇄와의 조합을 포함하는 항체들이 포함된다:
(i) 중쇄는 SEQ ID NO: 14로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 경쇄는 SEQ ID NO: 21로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ii) 중쇄는 SEQ ID NO: 15로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 경쇄는 SEQ ID NO: 20으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iii) 중쇄는 SEQ ID NO: 16으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 경쇄는 SEQ ID NO: 22로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iv) 중쇄는 SEQ ID NO: 18로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 경쇄는 SEQ ID NO: 25로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(v) 중쇄는 SEQ ID NO: 17로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 경쇄는 SEQ ID NO: 24로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vi) 중쇄는 SEQ ID NO: 19로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 경쇄는 SEQ ID NO: 23으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vii) 중쇄는 SEQ ID NO: 19로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 경쇄는 SEQ ID NO: 26으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(viii) 중쇄는 SEQ ID NO: 19로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 경쇄는 SEQ ID NO: 27로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함, 및
(ix) 중쇄는 SEQ ID NO: 19로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 경쇄는 SEQ ID NO: 28로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
전술한 바와 같이 본 발명에서 "단편" 또는 "아미노산 서열의 단편"이라 함은 항체 서열의 일부를 가리키는 것으로서, 즉, N- 및/또는 C-말단에서 단축된 항체 서열을 나타내며, 이것이 항체에서 상기 항체 서열을 대체할 경우, CLDN18.2에 대한 상기 항체의 결합을 유지하고, 좋기로는 전술한 바와 같은 상기 항체의 기능예컨대, CDC 매개형 용해 또는 ADCC 매개형 용해능을 유지하는 서열을 의미한다. 좋기로는, 아미노산의 단편은 상기 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 적어도 80%, 좋기로는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함하는 것이 바람직하다. SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 단편은 좋기로는 N-말단에서 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 아미노산이 제거된 상기 서열에 관한 것이다.
바람직한 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 (VH)를 포함한다.
바람직한 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 (VL)를 포함한다.
바람직한 특정 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 다음의 가능한 경우 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 중쇄 가변부 (VH)와 경쇄 가변부 (VL)와의 조합을 포함한다:
(i) VH는 SEQ ID NO: 29로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 36로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ii) VH는 SEQ ID NO: 30으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 35로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iii) VH는 SEQ ID NO: 31로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 37로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iv) VH는 SEQ ID NO: 33으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 40으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(v) VH는 SEQ ID NO: 32로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 39로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vi) VH는 SEQ ID NO: 34로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 38로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vii) VH는 SEQ ID NO: 34로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 41로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(viii) VH는 SEQ ID NO: 34로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 42로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ix) VH는 SEQ ID NO: 34로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 43으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
바람직한 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 다음 구체예 (i) 내지 (vi)로부터 선택되는 상보성-결정부 CDR1, CDR2 및 CDR3 세트를 포함하는 VH를 포함한다:
(i) CDR1: SEQ ID NO: 14의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 14의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 14의 위치 116-125,
(ii) CDR1: SEQ ID NO: 15의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 15의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 15의 위치 116-126,
(iii) CDR1: SEQ ID NO: 16의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 16의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 16의 위치 116-124,
(iv) CDR1: SEQ ID NO: 17의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 17의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 17의 위치 116-126,
(v) CDR1: SEQ ID NO: 18의 위치 44-51, CDR2: SEQ ID NO: 18의 위치 69-76, CDR3: SEQ ID NO: 18의 위치 115-125, 및
(vi) CDR1: SEQ ID NO: 19의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 19의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 19의 위치 117-128.
바람직한 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 다음 구체예 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 상보성-결정부 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 포함하는 VL을 포함한다:
(i) CDR1: SEQ ID NO: 20의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 20의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 20의 위치 115-123,
(ii) CDR1: SEQ ID NO: 21의 위치 49-53, CDR2: SEQ ID NO: 21의 위치 71-73, CDR3: SEQ ID NO: 21의 위치 110-118,
(iii) CDR1: SEQ ID NO: 22의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 22의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 22의 위치 109-117,
(iv) CDR1: SEQ ID NO: 23의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 23의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 23의 위치 115-123,
(v) CDR1: SEQ ID NO: 24의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 24의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 24의 위치 115-123,
(vi) CDR1: SEQ ID NO: 25의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 25의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 25의 위치 115-122,
(vii) CDR1: SEQ ID NO: 26의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 26의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 26의 위치 115-123,
(viii) CDR1: SEQ ID NO: 27의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 27의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 27의 위치 115-123, 및
(ix) CDR1: SEQ ID NO: 28의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 28의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 28의 위치 109-117.
바람직한 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 다음 구체예 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 상보성-결정부 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 각각 포함하는 VH와 VL의 조합을 포함한다:
(i) VH: CDR1: SEQ ID NO: 14의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 14의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 14의 위치 116-125, VL: CDR1: SEQ ID NO: 21의 위치 49-53, CDR2: SEQ ID NO: 21의 위치 71-73, CDR3: SEQ ID NO: 21의 위치 110-118,
(ii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 15의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 15의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 15의 위치 116-126, VL: CDR1: SEQ ID NO: 20의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 20의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 20의 위치 115-123,
(iii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 16의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 16의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 16의 위치 116-124, VL: CDR1: SEQ ID NO: 22의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 22의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 22의 위치 109-117,
(iv) VH: CDR1: SEQ ID NO: 18의 위치 44-51, CDR2: SEQ ID NO: 18의 위치 69-76, CDR3: SEQ ID NO: 18의 위치 115-125, VL: CDR1: SEQ ID NO: 25의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 25의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 25의 위치 115-122,
(v) VH: CDR1: SEQ ID NO: 17의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 17의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 17의 위치 116-126, VL: CDR1: SEQ ID NO: 24의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 24의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 24의 위치 115-123,
(vi) VH: CDR1: SEQ ID NO: 19의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 19의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 19의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 23의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 23의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 23의 위치 115-123,
(vii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 19의 위치 45-53 , CDR2: SEQ ID NO: 19의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 19의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 26의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 26의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 26의 위치 115-123,
(viii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 19의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 19의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 19의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 27의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 27의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 27의 위치 115-123, 및
(ix) VH: CDR1: SEQ ID NO: 19의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 19의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 19의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 28의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 28의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 28의 위치 109-117.
또 다른 바람직한 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 좋기로는 하나 이상의 상보성 결정부 (CDRs), 적어도 좋기로는, CLDN18.2에 대한 모노클로날 항체, 좋기로는 본 발명에 설명된 CLDN18.2에 대한 모노클로날 항체의 중쇄 가변부 (VH) 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 CDR3 가변부를 포함하는 것이 바람직하고, 좋기로는 하나 이상의 상보성 결정부 (CDRs), 적어도 좋기로는, CLDN18.2에 대한 모노클로날 항체, 좋기로는 본 발명에 설명된 CLDN18.2에 대한 모노클로날 항체의 중쇄 가변부 (VH) 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 CDR3 가변부를 포함하는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 하나 이상의 상보성 결정부 (CDRs)는 본 발명에 설명된 상보성 결정부 CDR1, CDR2 및 CDR3 세트로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 좋기로는 CLDN18.2에 대한 모노클로날 항체, 좋기로는 본 발명에 설명된 CLDN18.2에 대한 모노클로날 항체의 중쇄 가변부 (VH) 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 상보성 결정부 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 것이 바람직하며, 좋기로는 본 발명에 설명된 중쇄 가변부들 (VH) 및/또는 경쇄 가변부들 (VL)의 상보성 결정부 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 것이 바람직하다.
일 구체예에서 본 발명에 설명된 바와 같은 하나 이상의 CDRs, CDRs 세트 또는 CDRs 세트의 조합을 포함하는 항체는 상기 CDRs 및 그들의 개재(intervening) 프레임워크 부분을 함께 포함한다. 좋기로는 상기 부분은 또한 제1 및 제4 프레임워크 부분 중 어느 일방 또는 양방을 적어도 약 50% 포함하며, 이 50%는 제1 프레임워크 부분의 C-말단 50%와 제4 프레임워크 부분의 N-말단 50%이다. 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 항체의 구조는, 면역글로불린 중쇄, 기타 가변부(예컨대 다이아바디 제조시) 또는 단백질 표지를 비롯한 추가 단백질 서열에 본 발명의 가변부를 결합시키기 위해 링커를 도입하는 것을 비롯하여, 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 수행하도록 도입되는 링커에 의해 코딩된 가변부의 N-말단 또는 C-말단 잔기가 도입되도록 할 수 있다.
일 구체예에서 본 발명에 설명된 하나 이상의 CDRs, CDRs 세트 또는 CDR 세트들의 조합은 인간 항체 프레임워크 내의 상기 CDRs을 포함한다.
본 발명에서 항체가 중쇄와 관련하여 특정 사슬 또는 특정 부분 또는 서열을 포함하는 경우 좋기로는 상기 항체의 모든 중쇄들이 상기 사슬, 부분 또는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이것은 항체의 경쇄에도 마찬가지로 적용된다.
본 발명에서 "핵산"이라는 용어는 DNA 및 RNA를 포괄하도록 의도된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 좋기로는 이중-가닥 DNA가 바람직하다.
본 발명에서, "발현"이라는 용어는 대부분 그의 일반적인 의미로 사용되며 RNA 또는 RNA와 단백질/펩타이드의 생산을 포함한다.
이것은 핵산의 부분적 발현도 포함한다. 또한, 발현은 일시적으로 또는 안정적으로 수행될 수도 있다.
특이적인 아미노산 서열, 예컨대 서열목록에 나타나 있는 서열들에 대한 본원발명의 교시 내용은 상기 특이적인 서열과 기능적으로 동등한 서열, 예컨대 특이적인 아미노산 서열과 동등한 특성을 나타내는 아미노산 서열을 결과시키는 상기 특이적인 서열의 변이체에 대해서도 적용되는 것으로 이해된다. 한 가지 중요한 특성은 표적에 대한 항체의 결합을 유지하거나 항체의 이펙터 기능을 유지하는 것이다. 좋기로는, 어떤 특이적인 서열과 관련한 변이체인 서열은 항체에서 그 특이적인 서열을 대체할 경우, CLDN18.2에 대한 상기 항체의 결합을 지속하는 것이 바람직하고, 본 발명에 설명된 상기 항체의 기능, 예컨대 CDC 매개형 용해 또는 ADCC 매개형 용해와 같은 기능을 유지하는 것이 바람직하다.
통상의 기술자는 특히 CDR, 하이퍼가변부 및 가변부의 서열들이 CLDN18.2에 대한 결합능을 잃지 않고도 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 예컨대, CDR 부분은 본 발명에 명시된 항체의 부분들과 동일하거나 고도로 상동적일 것이다. "고도로 상동적인(highly homologous)"이라는 의미는 CDRs 내에 1 내지 5, 좋기로는 1 내지 4, 예컨대 1 내지 3 또는 1 또는 2개의 치환이 있을 수 있는 것으로 의도된다. 또한, 하이퍼가변부 및 가변부는 이들이 본 발명에 특별히 설명된 항체들의 부분과 실제로 상동성을 갖도록 변형될 수도 있다.
본 발명의 목적상, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결여 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단의 결여를 포함하는 아미노산 결여 변이체는 또한 N-말단 및/또는 C-말단 절단 변이체로도 불리운다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열 중에 1 또는 2 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 가지는 아미노산 서열 변이체의 경우, 생성물의 적절한 스크리닝을 구비한 랜덤한 삽입 또한 가능하지만, 1 이상 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 특정 부위 속으로 삽입된다.
아미노산 첨가 변이체는 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산과 같은 1 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합을 포함한다.
아미노산 결여 변이체는 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산을 제거하는 것에 의하는 것과 같이 서열로부터 1 이상의 아미노산을 제거하는 것을 특징으로 한다. 결여는 단백질의 임의의 부위에 있을 수 있다.
아미노산 치환 변이체는 서열 내 적어도 하나의 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입하는 것을 그 특징으로 한다. 상동체 단백질 또는 펩타이드 사이에 보존되지 않은 아미노산 서열 부위에서의 변형 및/또는 아미노산을 유사한 성질을 가지는 다른 것으로 치환하는 것이 선호된다. 바람직하게는 단백질 변이체에서의 아미노산의 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 전하성 또는 비전하성 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 그것의 측쇄와 관련된 아미노산 족의 하나의 치환과 관련된다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 다음의 4개 족으로 나뉜다: 산성 아미노산(아스파르트, 글루타메이트), 염기성 아미노산(라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 아미노산(알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비전하성 극성 아미노산(글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다.
좋게는, 유사성 정도, 좋기로는 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 간의 동일성이 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 것이 바람직하다. 유사성 또는 동일성의 정도는 좋기로는 참조 아미노산 서열의 전장의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대하여 주어진다. 예를 들어 참조 아미노산 서열이 200개 아미노산으로 구성된 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 좋기로는 적어도 약 20, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 80, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개 아미노산에 대하여, 좋기로는 연속되는 아미노산에 대하여 주어진다. 바람직한 구체예에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 서열 목록에 나타난 아미노산 서열과 같은 참조 아미노산 서열의 전체 길이에 대하여 주어진다. 서열 유사성 결정을 위한 배열, 좋기로는 서열 동정은 당업계에 알려진 도구를 이용하여, 좋기로는 최상의 서열 배열을 사용하여, 예를 들어 얼라인(Align)을 사용하여, 표준 세팅, 좋기로는 EMBOSS::니들, 매트릭스(Matrix): Blosum62, 갭 오픈(Gap Open) 10.0, 갭 익스텐드(Gap Extend) 0.5를 사용하여 수행될 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산들의 백분율을 나타낸 것이다. 두 개의 아미노산 서열들 간의 "서열 동일성"은 서열 간 동일한 아미노산들의 백분율을 가리킨다.
용어 "퍼센트 동일성(percentage identity)"은 가장 적합한 정렬 후 얻어지는 비교될 두 개의 서열들 간에 동일한 아미노산 잔기들의 퍼센트를 나타내고자 하는 것으로, 이러한 퍼센트는 오로지 통계적인 퍼센트이고 임의적으로 분포된 두 개의 서열 간의 차이 및 전장 서열에 걸친 두 개의 서열 간의 차이이다. 두 개의 아미노산 서열들 간의 서열 비교는 통상적으로 상술한 서열들을 최적으로 정렬시킨 후 비교함으로써 실시되고, 상기 비교는 섹션 또는 "비교 윈도우(window of comparison)"에 의해 실시되어 서열 유사성의 국소적 부위들을 동정하고 비교하는 것이다. 비교를 위한 서열들 간의 최적 정렬은 수작업을 제외한 Smith 및 Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국소 상동성 알고리즘, Neddleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국소 상동성 알고리즘, Pearson 및 Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 탐구 방법, 또는 상술한 알고리즘들을 이용하는 컴퓨터 프로그램들(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)에 의해 얻어질 수 있다.
퍼센트 동일성은 비교되는 두 개의 서열들 간의 동일한 위치들의 수를 결정하는 단계, 비교된 위치들의 수로 상기 동일한 위치들의 수를 나누는 단계 및 얻어진 결과들에 100을 곱하는 단계에 의해 계산되어 상술한 두 개의 서열들 간의 퍼센트 동일성을 얻는다.
용어 "트랜스제닉 동물(transgenic animal)"은 하나 이상의 트랜스유전자들, 바람직하게는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스유전자들, 또는 트랜스염색체들(동물의 천연 게놈 DNA 내로 동합되거나 또는 통합되지 않음)을 포함하는 게놈을 가지는 동물을 의미하고 좋게는 상기 트랜스유전자들을 발현할 수 있는 동물이다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는 인간 경쇄 트랜스유전자 및 인간 중쇄 트랜스유전자 또는 인간 중쇄 트랜스염색체 중 어느 하나를 가질 수 있으며, 그로 인해 상기 마우스가 CLDN18.2 항원 및/또는 CLDN18.2를 발현하는 세포들로 면역화되는 경우 상기 마우스는 인간 항-CLDN18.2 항체들을 생산한다. 인간 중쇄 트랜스유전자는 트랜스제닉 마우스, 예컨대 HCo7 또는 HCol2 마우스 같은 HuMAb 마우스 또는 인간 중쇄 트랜스유전자의 경우에서처럼 마우스의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있거나, 또는 상기 인간 중쇄 트랜스유전자는 WO 02/43478에 기재된 대로 트랜스염색체성 마우스(예컨대, KM)의 경우 같이 염색체 외적으로 유지될 수 있다. 그러한 트랜스제닉 및 트랜스염색체성 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소형 스위칭을 통해 CLDN18.2에 대한 인간 단일클론 항체들의 복수 이소형들(예컨대, IgG, IgA 및/또는 IgE)을 생산할 수 있을 것이다.
본 발명에서 "감소시키다", "저감시키다", "억제하다"의 의미는 어떤 수준, 예컨대 세포의 증식 수준 또는 발현 수준을, 좋게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 보다 좋게는 50% 이상, 및 가장 좋게는 75% 이상 전반적으로 감소시키거나 전반적인 감소를 유발하는 능력을 의미한다.
"증가시키다" 또는 "증대시키다"라는 용어는 좋기로는 약 적어도 10%, 좋기로는 적어도 20%, 좋기로는 적어도 30%, 더욱 좋기로는 적어도 40%, 더욱 좋기로는 적어도 50%, 더더욱 좋기로는 적어도 80%, 및 가장 좋기로는 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상 증가 또는 증대시키는 것에 관한다.
mAb작용의 메카니즘
후술하는 것이 본 발명의 항체의 치료적 효능에 근거한 메카니즘에 관한 고려를 제공하더라도, 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하는 것으로 고려되지 않는다.
본 발명에 개시된 항체는 바람직하게는 면역 시스템, 좋게는 ADCC 또는 CDC를 통한 면역 시스템의 인자와 상호반응한다. 본 발명의 항체는 직접 종양 세포를 살해하는 표적 페이로드(payload)에 또한 이용될 수 있거나, T 임파구에서 화학치료적 세포독성 부작용 때문에 타협될 수 있는 항종양 면역 반응을 함유할 수 있는 작용의 상보적인 기전을 통해 종양을 공격하는 전통적인 화학치료제를 상승적으로 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 항체는 세포 표면 상의 CLDN18.2에 단순히 결합하는 것에 의하여, 그리하여 세포의 증식을 차단하는 것에 의하여 효능을 또한 행사할 수도 있다.
항체 의존성 세포-매개된 세포독성
ADCC는 본 발명에 개시된 것처럼 이펙터 세포들, 특히 임파구들의 세포 살해 능력을 설명하고, 이것은 좋게는 항체에 의해 마킹(mark)되는 표적 세포를 필요로한다.
ADCC는 좋게는 항체들이 종양 세포상에 항원과 결합하고, 항체 Fc 도메인들이 면역 이펙터 세포들의 표면에 Fc 수용체와 관여할 때 일어난다. Fc 수용체들의 몇몇 패밀리는 확인되어왔고, 특이적 세포 집단은 특징적으로 규명된 Fc 수용체들을 발현한다. ADCC는 항원 표시 및 종양 관련된 T 세포 반응의 유도를 가져오는 즉각적인 종양 파괴의 다양한 정도를 직접 유도하기 위한 메카니즘으로서 간주될 수 있다. 좋게는, ADCC의 생체 내 유도는 종양 관련 T 세포 반응들 및 숙주 유래 항체 반응을 가져온다.
보체 의존성 세포독성
CDC는 항체에 의해 지시될 수 있는 다른 세포 살해 방법이다. IgM은 보체 활성을 위한 가장 효과적인 이소형이다. IgG1 및 IgG3는 전형적인 보체활성 경로를 통해 CDC를 지시하는 것에서 매우 효과적이다. 좋게는, 이러한 캐스캐이드(cascade)에서, 항원-항체 복합체들의 형성은 IgG 분자 (C1q는 보체 C1의 3개의 하위인자 중 하나이다)를 비롯한 항체 분자를 참여하는 CH2 도메인상에 가깝게 근접하여 다중 C1q 결합 사이트의 노출을 일으킨다. 좋게는, 이러한 노출된 C1q 결합 사이트는 이전의 낮은 친화도의 C1q-IgG 상호반응을 높은 애비더티(avidity)로 전환하고, 이것은 다른 일련의 보체 단백질이 관련된 하나의 캐스캐이드 작용을 일으키고, 이펙터 세포 화학주성의/활성제 C3a 및 C5a의 단백질 분해적 방출을 가져온다. 좋게는, 막의 형성에서 보체 캐스캐이드 말단은 복합체를 공격하고, 이것은 세포 내외의 용질 및 물의 자유(free) 통로를 촉진하는 세포 막에서 구멍을 형성한다.
항체의 생산 및 시험
본 발명의 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예컨대, Kohler 및 Milstein, Nature 256: 495 (1975)의 표준 체세포 하이브리다이제이션 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산가능하다. 체세포 혼성화 절차가 선호될 지라도, 주로, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술들이 전개될 수 있다, 예컨대, B-임파구 또는 파지의 바이러스 또는 종양 형질변환은 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 기술을 나타낸다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위한 선호되는 동물 시스템은 쥐과(murine) 계열이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘 구축된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장림프구의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 기술분야에서 잘 알려져있다. 융합 파트너 (예컨대, 쥐의 골수종 세포)와 융합 절차는 또한 알려져있다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 다른 선호되는 동물 시스템은 래트 및 래빗 시스템이다 (예컨대, Spieker-Polet 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), Rossi 외, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)에 개시됨).
또 다른 바람직한 구체예에서, 인간 모노클로날 항체들은 마우스 시스템 보다 인간 면역 시스템의 부분들을 수행하는 유전자이식(transgenic) 또는 트랜스염색체적(transchromosomal) 마우스를 이용하여 생성가능하다. 이러한 유전자이식 및 트랜스염색체적 마우스는 각각 HuMab 마우스 및 KM 마우스로 알려져 있고, "유전자 이식 마우스"로 본 발명에 집합적으로 언급된다. 그러한 유전자 이식 쥐 내에 인간 항체의 생산은 WO2004 035607에서 CD20을 위한 자세히 기재된 내용으로써 수행될 수 있다.
모노클로날 항체들을 생성하기 위한 또 다른 전략은 예컨대, Babcock 외, 1996; 규정된 특이성의 항체를 생산하는 단일의 분리된 임파구들로부터 모노클로날 항체를 생산하기 위한 신규한 전략을 참고한, 규정된 특이성의 항체를 생산하는 임파구로부터 항체를 코딩하는 유전자를 직접 분리하는 것이다. 재조합 항체 공학의 자세한 내용은 또한 문헌(Welschof 및 Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 및 Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1)을 참고할 것.
항체를 생성하기 위해, 항원 서열, 즉 그 항체을 지향시키고자 하는 서열로부터 유래된 담체-컨쥬게이트된 펩타이드, 기재된 CLDN18.2을 재조합적으로 발현된 풍부한 제조물 또는 그 단편 및/또는 CLDN18.2 또는 그의 단편을 발현하는 세포들로 마우스를 면역화시킬 수 있다. 별법으로, 마우스는 항원 또는 그 단편을 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 항원의 정제된 또는 풍부한 제조물을 이용한 면역화가 항체를 생성하지 않는 경우에, 마우스는 면역 반응을 촉진하기 위해, 항원을 발현하는 세포들, 예컨대 세포주로 또한 면역화될 수 있다.
면역 반응은 꼬리 정맥 또는 안와후(retroorbital) 블리즈(bleeds)에 의해 수득되는 혈장 및 혈청 시료로 면역화 프로토콜의 코스로 모니터될 수 있다. 충분한 역가의 면역글로불린을 가진 마우스는 융합에 이용될 수 있다. 마우스는 희생되어, 하이브리도마를 분비하는 특이적 항체의 비율을 증가시키기 위한 비장(spleen) 제거전에 3일 동안 항원 발현 세포들로 복강내 또는 정맥내로 부스트(boost)될 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스들로부터의 림프절 세포들 및 비장림프구를 분리하여, 마우스 골수종 세포주를 비롯한 적절한 불사화된 세포주에 융합시킬 수 있다. 이어서, 결과적으로 나오는 하이브리도마들을 항원 특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 그리고나서, 각각의 웰들은 하이브리도마를 분비하는 항체를 위한 ELISA에 의해 스크린될 수 있다. 항원 발현 세포들을 이용한 면역형광 및 FACS에 의해, 항원에 특이적인 항체들이 확인될 수 있다. 하이브리도마를 분비하는 항체는 리플레이트(replate)될 수 있고, 다시 스크린될 수 있으며, 만약 모노클로날 항체들을 위해 여전히 양성이라면 제한하는 희석에 의해 서브클론될 수 있다. 안정적인 서브클론은 그리고나서 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생성하기 위해 시험관내(in vitro)에서 배양될 수 있다.
항체들은 또한 예컨대, 기술분야에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법들의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
예컨대, 일 구체예에서, 흥미로운 유전자(들), 예컨대, 항체 유전자들은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 기술분야에 잘 알려진 다른 발현 시스템에 의해 사용된 것을 비롯한 진핵 발현 플라스미드를 비롯한 발현 벡터내로 라이게이션 될 수 있다. 클론된 항체 유전자들을 가진 정제된 플라스미드는 CHO 세포들, NS/0 세포들, HEK293T 세포들 또는HEK293 세포들 또는 대안적으로 식물 유래 세포들, 곰팡이 또는 효모 세포들과 같은 다른 진핵 세포들내로 도입될 수 있다. 이러한 유전자들을 도입하기 위해 사용되는 방법은 일렉트로포레이션, 리포펙틴, 리포펙타민 또는 다른 것들을 비롯한 기술분야에 기재된 방법들일 수 있다. 숙주 세포 내에서 이러한 항체 유전자들의 도입 후에, 항체를 발현하는 세포들은 확인되고 선택된다. 이러한 세포들은 그리고나서 그 발현 수준을 위해 증폭되고, 항체를 생산하기 위해 업스케일(upscale)될 수 있는 트랜스펙토마를 나타낸다. 재조합 항체들은 이러한 배양 상청액 및/또는 세포들로부터 분리되고 정제될 수 있다.
다르게, 클론된 항체 유전자들은 E.coli를 비롯한 미생물을 비롯한 원핵 세포들을 함유하는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, 항체들은 쉽(sheep) 또는 래빗으로부터의 우유에서 또는 암탉의 달걀에서와 같은 형질전환 비인간 동물들 또는 형질전환 식물들에서 생산될 수 있다(Verma, R., 외 (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, 외 (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; 및 Fischer, R., 외 (1999) Biol. Chem. 380: 825-839 참고).
키메라화(Chimerization)
뮤린(murine) 모노클로날 항체들은 독소 또는 방사성 동위원소로 표지될 때 인간 내에서 치료적 항체로써 사용될 수 있다. 비표지된 뮤린 항체들은 반복적으로 치료적 효과의 감소를 가져올 때 인간 내에서 높은 면역성이다. 뮤린 항체의 면역원성은 중쇄 불변부에 의해 매개된다. 인간에서 뮤린 항체들의 면역원성은 만약 각각의 항체들이 키메라화되거나 인간화되면 감소되거나 완전히 막을 수 있다. 키메라 항체들은 항체들이고, 뮤린 항체로부터 유래된 가변부 및 인간 면역글로불린 불변부를 가지는 것을 비롯한 상이한 동물 종들로부터 유래된 상이한 부분들이다. 항체들의 키메라화는 인간 중쇄 및 경쇄의 불변영역과 뮤린 항체 중쇄 및 경쇄의 불변부를 결합함에 의해 성취된다 (예컨대, Kraus 외, in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8에 의해 개시된). 선호되는 방식으로는, 키메라화된 항체는 인간 κ 경쇄의 불변부를 뮤린 경쇄의 가변부에 결합시킴으로써 생성할 수 있다. 또 다른 선호되는 항체의 키메라화 방식으로는 인간 λ(lambda) 경쇄의 불변부를 뮤린 경쇄의 가변부에 결합시키는 방법이 있다. 키메라화된 항체 생성을 위한 선호되는 중쇄 불변부는 IgG1, IgG3 및 IgG4가 있다. 그 밖에 키메라 항체의 생성을 위해 선호되는 중쇄 불변부으로는 IgG2, IgA, IgD 및 IgM이 있다.
인간화(Humanization)
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR안에 존재하는 아미노산 잔여물을 통해 우세하게 표적 항원과 반응한다. 이 때문에 CDR 내부의 아미노산 서열들은 CDR 외부의 서열보다 각각의 항체들 사이에서 다양하게 나타난다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원간 반응에 있어 결정적 역할을 하기 때문에, 서로 다른 성질들을 가진 서로 다른 항체로부터의 프래임워크(framework) 서열들 상에 이식되는 특이적으로 일어나는 항체로부터 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써, 특이적 자연적으로 발생하는 항체들의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(e.g., Riechmann, L. 외 (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. 외 (1986) Nature 321: 522-525; 및 Queen, C. 외 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). 그러한 프래임워크 서열은 생식세포(germline) 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 이러한 생식세포 서열은 성숙한 항체 유전자 서열과 다를 것인데, 이들은 B 세포의 성숙 분열기 동안 V (D) J가 결합됨으로써 생성되는 완전히 결합된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문이다. 생식세포 유전자 서열은 또한 가변부 전체에 고르게 분포된 각각의 고친화도 이차적 레퍼토리 항체와도 다를 것이다.
항원에 결합하는 항체의 능력은 표준 결합분석법(예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광법 및 유세포분석법)을 이용하여 탐지될 수 있다
항체들을 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마들은 모노클로날 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 자랄 수 있다. 별법으로, 항체들은 투석 기반 생물반응기에서 생산될 수 있다. 상청액은 필터될 수 있고, 만약 필요하다면, 단백질 G-세파로스 또는 단백질 A-세파로스로 친화도 크로마토그래피 전에 농축될 수 있다. 녹여서 분리된(eluted) IgG는 젤 전기영동 및 순도를 보장하기 위해 고 수행 액체 크로마토그래피에 의해 체크될 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교체될 수 있고, 농도는 1.43 소강 계수(extinction coefficient)를 이용하여 OD280에 의해 측정된다. 모노클로날 항체들은 나누어떨어지고(aliquote), -80℃에서 보관될 수 있다.
만약 선택된 모노클로날 항체들이 유일한 에피토프와 결합하는지를 알아보기 위해, 사이트-지시된(site-directed) 또는 멀티사이트 지시된(multi-site directed) 돌연변이유발(mutagenesis)이 이용될 수 있다.
항체들의 이소형을 알아보기 위해, 다양한 키트의 이소형 ELISA(예컨대, Zymed, Roche Diagnostics)가 수행되었다. μ 타이터의 웰들은 항-마우스 Ig로 코팅될 수 있다. 블록킹 후에, 플레이트는 2시간동안 주변 온도에서 모노클로날 항체들 또는 정제된 이소형 대조군들로 반응시켰다. 그리고나서 웰들은 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3, IgA 또는 마우스 IgM-특이적 페록시다제-컨쥬게이트된 프로브들과 반응시킬 수 있다. 세척 후, 플레이트들은 ABTS 기질 (1mg/ml)로 현상시키고, 405-650 OD로 분석할 수 있다. 또 다르게는, 아이소스트립 마우스 모노클로날 항체 아이소타이핑 키트 (Roche, Cat. No. 1493027)가 제조자에 의해 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
항원을 발현하는 살아있는 세포들에 대한 모노클로날 항체들의 결합 또는 면역화된 마우스들의 혈청에서 항체들의 존재를 증명하기 위해, 유세포 분석법이 사용되었다. 천연 또는 형질감염후 CLDN18.2 발현하는 세포주들 및 항원 발현을 결여한 음성 대조군들 (표준 성장 조건에서 자란)은 하이브리도마 상청액들 또는 1% FBS 함유 PBS 내 모노클로날 항체들의 다양한 농도로 혼합될수 있고, 40분동안 4℃에서 인큐베이션 할 수 있다. 세척 후, APC- 또는 Alexa647-표지된 항 IgG 항체는 초기 항체 염색과 같은 조건하에 항원-결합된 모노클로날 항체와 결합할 수 있다. 시료들은 단일, 살아있는 세포들을 게이트(gate)하기 위한 빛 및 사이드 산란 특징(light 및 side scatter properties)들을 이용한 FACS 기구로 유세포 분석법에 의해 분석될 수 있다. 단일 측정에서 비특정 바인더(binder)들로부터 항원-특이적 모노클로날 항체들을 구별하기 위해, 공동-형질감염 방법이 구현될 수 있다. 항원 및 형광 마커를 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 세포들은 상기에 기재된 바와 같이 염색될 수 있다. 형질감염된 세포들은 항체-염색된 세포들보다 서로 다른 형광 채널에서 검출될 수 있다. 형질감염된 세포들의 다수가 이식유전자(transgene) 모두를 발현하는 것처럼, 항원-특이적 모노클로날 항체들은 형광 마커 발현 세포들에 선호되게 결합하는 반면, 비특이적 항체들은 비형질감염된 세포들에 비교할만한 비율로 결합한다. 형광 현미경을 이용하는 대안적인 어세이는 유세포 분석법 어세이에 더하여 또는 대신으로 사용될 수 있다. 세포들은 상기한 바와 같이 정확히 염색되고, 형광 현미경에 의해 조사될 수 있다.
면역화된 마우스의 혈청에 항체의 존재 또는 항원을 발현하는 살아있는 세포와 모노클로날 항체와의 결합을 증명하기 위해 면역 형광 현미경이 사용될 수 있다. 예를 들어 자발적으로, 혹은 형질감염 후에 항원을 발현하는 세포주나 항원 발현을 결여하는 음성대조군은 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지에서 표준 성장 조건하의 챔버 슬라이드에서 배양된다. 세포들은 그 후 메탄올이나 파라포름알데히드로 고정되거나 미처리된다. 그리고나서 30분간 25℃에서 항원에 대해 모노클로날 항체와 반응하게 된다. 세척 후, 이 세포들은 동일 조건에서 Alexa555 표지된 항-마우스 IgG 2차 항체(Molecular Probes)와 반응하게 된다. 그리고 나서 형광 현미경으로 조사할 수 있다.
항원을 발현하는 세포나 적절한 음성대조군으로부터의 세포추출물을 준비해 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동시킬 수 있다. 전기이동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로오스 막으로 이동되어 차단되고, 실험할 모노클로날 항체와 함께 조사된다. IgG 결합은 항-마우스 IgG 페록시다아제를 사용해 검출되고 ECL 기질로 현상(develop)된다.
항체는 당업자에게는 잘 알려진 방식으로 면역조직화학에 의해, 예컨대, 수술 과정에서 환자로부터, 혹은 자발적으로 또는 형질 감염후, 항원을 발현하는 세포주가 접종된 이종 이식된 종양을 갖고 있는 마우스로부터 얻은 암 없는 조직이나 암 조직 시료들로부터 파라포름알데히드나 아세톤 고정된 크라이오섹션, 또는 파라핀을 함유하고 파라포름알데히드로 고정된 조직 섹션을 사용하는 방식에 의해, 항원에 대한 반응성을 추가적으로 측정할 수 있다. 면역염색을 위해, 항원에 대해 반응성이 있는 항체들을 인큐베이션한 다음 배포업체 지시에 따라 고트 항-마우스 또는 고트(goat) 항-래빗 항체들(DAKO)과 호스래디쉬-퍼옥시다제 컨쥬게이트시킨다.
항체를 대식작용을 매개하는 능력 및 CLDN18.2르르 발현하는 세포를 사멸하는 능력에 대해 테스트할 수 있다. 시험관내에서의 모노클로날 항체 활성의 테스트 의해 생체내 모델에서의 테스트에 앞서, 초기 스크리닝이 이루어질 수 있다.
항체 의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC):
간단히 설명하면, 건강한 도너로부터 나온 PMNs(polymorphonuclear cells), NK 세포, 모노사이트, 단핵 세포, 또는 다른 이펙터 세포를 오염된 적혈구의 용해 후에 피콜 하이파크 밀도 원심분리에 의해 정제할 수 있다. 세척된 이펙터 세포를 10% 열-비활성화된 FCS가 보강되거나 또는 별법으로, 5% 열-비활성화된 인간 혈청이 보강된 RPMI에 현탁하고, CLDN18.2를 발현하는, 51Cr로 표지된 표적 세포와 다양한 이펙터 세포 대 표적 세포의 비율로 혼합한다. 별법으로, 표적 세포를 리간드를 향상시키는 형광(BATDA)으로 표지할 수도 있다. 죽은 세포에서 나오는 강화 리간드와의 유로피움의 고형광 킬레이트를 형광계로 측정할 수 있다. 또 다른 대안 기술은 루시페라제에 의한 표적 세포의 형질감염을 이용하는 것일 수 있다. 이렇게 첨가된 루시퍼 옐로우는 살아있는 세포에 의해서만 산화될 수 있다. 이어서 정제된 항-CLDN18.2 IgGs를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 무관한 인간 IgG를 음성대조군으로 사용할 수 있다. 사용된 이펙터 세포 유형에 따라 적게는 4시간에서 많게는 20시간동안 37℃에서 분석을 실시할 수 있다. 시료들을 배양 상청액의51Cr 배출 또는 EuTDA 킬레이트 화합물의 존재를 측정함으로써 세포용해를 위해 분석한된다. 별법으로, 루시퍼옐로우의 산화에 의한 발광이 살아있는 세포들의 척도가 될 수 있다.
또한 세포용해가 다수의 모노클로날 항체와 함께 증가하는지를 알아보기 위해, 항-CLDN18.2 모노클로날 항체를 다양한 조합으로 테스트할 수 있다.
보체 의존성 세포독성(CDC)
모노클로날 항-CLDN18.2 항체의 CDC 매개 능력을 다양한 알려진 테크닉을 통해 테스트할 수 있다. 예를 들어, 보체를 위한 혈청은 당업자에게 알려진 방식에 따라 혈액으로부터 얻을 수 있다. mAbs의 CDC 작용을 측정하기 위해서는 다른 방법이 사용된다. 예를 들어 51Cr 배출을 측정할 수도 있고 상승한 세포막 삼투성을 PI 제외 어세이를 사용해 측정할 수도 있다. 간단하게, 표적 세포를 세척해 5 x 105/ml를 다양한 농도의 mAb로 10-30분간 37℃정도의 실온에서 인큐베이팅할 수 있다. 그리고나서 혈청이나 혈장을 최종 농도가 20%(v/v)가 될 때까지 첨가하여 세포를 37℃에서 20-30분간 둔다. 각각의 시료에서 나온 모든 세포를 FACS 튜브의 PI 용액에 더한다. 이 혼합물은 FACS 어레이를 사용하여 플로우 사이토미트릭 분석을 통해 즉시 분석할 수 있다.
또 다른 분석법에서, CDC 유도는 부착 세포(adherent cell)에 따라 결정된다. 이러한 분석법의 일 구체예에서, 세포들을 조직배양 편평한 바닥 μ티터 플레이트에서 3 x 104/웰의 밀도로 분석 24시간 전에 접종한다. 그 다음날 생장 배지를 제거하고 이 세포들을 항체들과 함께 세벌(triplicate)로 인큐베이션시킨다. 대조군 세포들을 각각 배경(background) 용해나 최대 용해의 측정을 위해 생장 배지나 0.2%의 사포닌을 함유하는 생장 배지와 함께 인큐베이션한다. 20분간 상온에서 인큐베이션한 후에 상청액을 제거하고 DMEM(37℃에서 예열됨) 안의 20%(v/v) 인간 혈장이나 혈청을 세포에 더해 37℃에서 다시 20분간 인큐베이션한다. 각 시료에서 나온 모든 세포들을 프로피디윰 요오드화물 용액(10㎍/ml)에 더한다. 그리고나서, 상청액을 2.5㎍/ml 에티디움 브로마이드를 포함하는 PBS로 대체하고 520 nm에서 여기(excitation)에 의한 형광 방출을 Tecan Safire를 사용해 600nm에서 측정한다. 특이적 용해 백분율은 다음과 같이 계산된다.: % 특이적 용해 = (형광 시료-형광 배경)/ (형광 최대 용해-형광 배경) x 100
모노클로날 항체에 의한 세포자멸사의 유도 및 세포 증식의 억제:
세포자멸사(apoptosis) 개시 능력을 시험하기 위해, 예를 들어 모노클로날 항 CLDN18.2를 CLDN18.2 양성 종양 세포, 예컨대, SNU-16, DAN-G, KATO-III 또는 CLDN18.2로 형질감염된 종양 세포와 37℃에서 약 20시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 이 세포들을 채취된 후 Annexin-V 결합되는 버퍼(BD 생명과학)에서 세척하여 FITC나 APC(BD 생명과학)와 접합된 Annexin V와 15분간 암실에서 인큐베이션한다. 각 시료에서 나온 모든 세포들을 FACS 튜브 안의 PI 용액(10 ㎍/ml in PBS)에 첨가하고 즉시 유세포분석법(상기한 바와 같음)으로 평가한다. 별법으로 상용 키트에 의해 모노클로날 항체에 의한 세포 증식의 일반적 억제를 검출할 수도 있다. DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200)는 μ플레이트 안의 증식하는 세포의 DNA 합성 동안의 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) 혼합 측정에 기초한 비동위원소 면역분석법이다. 혼합된 BrdU는 유로피움 표지된 모노클로날 항체를 사용해 검출된다. 항체가 검출될 수 있도록, 세포들을 고정하고 Fix 용액을 사용해 DNA를 변성시킨다. 결합되어 있지 않은 항체를 씻어내고, 표지된 항체로부터 유로피움 이온을 분리시키기 위해 DELFIA 유도인자를 용액에 첨가하면, 여기서. 이들은 DELFIA 유도인자의 구성성분을 가진 고 형광 킬레이트 화합물을 형성한다. 측정된 형광 -검출에서 시간-분해된(time-resolved) 유세포분석법을 이용함-은 각 웰의 세포에서 DNA 합성에 비례한다.
전임상 연구
CLDN18.2를 발현하는 종양 세포의 성장을 제어하는데 있어서의 효능을 알아보기 위해, CLDN18.2에 결합하는 모노클로날 항체들을 생체내 모델(예컨대 SNU-16, DAN-G, KATO-III, 또는 형질감염 후 예컨대 HEK293와 같은 CLDN18.2을 발현하는 세포주가 접종된, 이종이식된 종양을 지니는 면역결핍 마우스에서)에서 실험할 수 있다.
CLDN18.2 발현 양성 세포를 면역손상 마우스나 다른 동물에 주입한 후의 체내 연구를 본 발명의 항체를 사용해 수행할 수 있다. 종양의 형성이나 종양 관련 증상을 예방하기 위한 항체의 효과를 측정하기 위해, 종양 없는 마우스에게 항체들을 투여하고 종양 세포의 투여할 수 있다. 항체들을 종양이 있는 마우스에 투여하여 종양의 성장, 전이 또는 종양 관련 증상을 줄이기 위한 각각의 항체의 치료 효능을 측정할 수 있다. 항체 적용(application)은 세포 증식 억제제(cystostatic drugs), 성장 인자 억제제, 세포주기 차단제, 혈관신생 억제제 같은 다른 물질과 다른 항체들의 적용을 조합들의 시너지 효과나 잠재적 독성을 측정할 수 있다. 항체에 의한 독성 부작용을 분석하기 위해 동물에 항체나 대조 시약을 주입하고 CLDN18.2 항체 치료와 연관이 있을 수 있는 증상에 대해 면밀히 조사할 수 있다. CLDN18.2 항체의 생체 내 적용의 가능한 부작용으로는 위장을 비롯한 CLDN18.2 발현 조직에서의 독성이 있다. 인간이나 그 밖에 쥐와 같은 다른 종에서의 CLDN18.2을 인식하는 항체는 특히 인간에서의 모노클로날 CLDN18.2 항체의 적용에 의해 나타나는 잠재적 부작용을 예방하는 데 유용하다.
항체에 의해 인지되는 에피토프 맵핑을 "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 및 in 'Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay 에 자세히 설명된 대로 수행할 수 있다.
본 발명에 설명된 화합물들과 약제는 적절한 의약 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
의약 조성물은 단위 투여제형으로 대개 제공되며 공지 방식으로 제조될 수 있다. 의약 조성물은 예컨대 용액 또는 현탁액 형태일 수 있다.
의약 조성물은 염, 완충물질, 보존제, 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 약학적으로 허용가능한 것이 좋다. "약학적으로 허용가능한"이라 함은 그 의약 조성물의 활성 성분의 작용과 상호반응하지 않는, 물질의 비독성을 가리킨다.
약학적으로 허용가능하지 않은 염들을 이용하여 약학적으로 허용가능한 염을 만들 수 있으며 이들 역시 본 발명에 속한다. 이러한 종류의 약학적으로 허용가능한 염에는 다음의 산으로부터 제조되는 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다: 염산, 히드로브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등. 약학적으로 허용가능한 염은 또한 알칼리금속 염이나 알칼리토금속염, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염으로서 제조될 수도 있다.
의약 조성물에 사용되기에 적합한 완충물질에는 아세트산염, 시트르산염, 붕산염 및 인산염이 포함된다.
의약 조성물에 사용되기에 적합한 보존제로는 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 들 수 있다.
주사가능한 포뮬레이션은 Ringer Lactate와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
"담체"라는 용어는 활성성분의 적용을 용이화, 증강 또는 가능하게 하기 위해, 활성성분과 조합되는, 천연 또는 합성된 유기 또는 무기 성분을 가리키다. 본 발명에 따라, "담체"는 또한 환자에게 투여하는데 적합한 1 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함하기도 한다.
비경구 투여를 위한 가능한 담체 물질은 예컨대 멸균수, Ringer, Ringer 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 폴리알킬렌 글리콜, 수소첨가된 나프탈렌 미치 특히, 생물적합성 락타이드 폴리머, 락타이드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 코폴리머이다.
본 발명에서 "부형제"라는 용어는 의약 조성물 내에 존재할 수 있으나, 예컨대 담체, 바인더, 윤활제, 농후제, 표면활성제, 보존제, 유화제, 완충제, 풍미제 또는 착색제와 같이, 활성성분은 아닌 모든 물질을 가리키는 것으로 의도된다.
본 발명에 설명된 물질과 조성물은 주사 또는 주입을 비롯한 비경구 투여와 같은 여하한 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는 좋기로는 예컨대 정맥내, 동맥내, 피하(subcutaneously), 피내(intradermally), 또는 근육내를 비롯한 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 대체로 활성 화합물의 멸균된 수성 또는 비수성 제제를 포함하며, 이것은 수용자의 혈액과 등장성인 것이 좋다. 적합한 담체 및 용매는 Ringer 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 이에 더해, 대개 멸균된 고정 오일(fixed oils)이 용액 또는 현탁액 매질로서 이용된다.
본 발명에 설명된 물질 및 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"이라 함은 그 단독으로 또는 추가 투여량(doses)과 함께 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 내래 수 있는 양이다. 특정 질환 또는 특정 상태를 치료하는 경우, 소망되는 반응은 좋기로는 그 질환의 경과를 억제하는 것에 관한다. 이것은 질병의 진행을 둔화시키는 것, 특히, 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 상태의 치료시 소망되는 반응은 또한 상기 질병이나 상기 상태의 개시를 둔화시키거나 개시를 방지하는 것일 수도 있다.
본 발ㄹ명에 설명된 물질 또는 조성물의 유효량은 치료하고자 하는 상태, 질병의 위중도, 환자의 개별적인 변수, 예컨대 연령, 생리적 상태, 크기 및 체중, 치료 기간, 부수되는 치료법의 종류(있을 경우), 특정 투여 경로 및 유사 인자들에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명에 설명된 물질의 투여량은 이러한 다양한 변수에 따라 달라진다. 만일 환자의 반응이 초기 투여량으로 불충분할 경우, 더 많은 투여량(또는 보다 국소적인, 다른 투여 령로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 투여량)이 사용될 수 있다.
본 발명에 설명된 물질과 조성물은 본 발명에 설명된 것과 같은 다양한 질환을 치료 또는 예방하기 위해 환자에게 예컨대, 생체내로 투여될 수 있다. 바람직한 환자로는 본 발명에 설명된 물질과 조성물의 투여에 의해 교정 또는 완화될 수 있는 질병에 걸린 인간 환자가 포함된다. 여기에는 CLDN18.2의 변경된 발현 패턴에 의해 특징지어지는 세포가 관련된 질병이 포함된다.
예컨대, 일 구체예에서, 본 발명에 설명된 항체들을 이용하여 암 질환, 예컨대, CLDN18.2를 발현하는 세포의 존재에 의해 특징지어지는 본 발명에 설명된 것과 같은 암질환에 걸리니 환자를 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 의약 조성물과 치료 방법은 또한 본 발명에 설명된 질병의 예방을 위한 면역화 또는 백신접종을 위해 사용될 수도 있다.
다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
1. 항체
Figure pct00017
2. 면역조직화학(IHC)
조직 섹션들(4 μm 두께)을 사용 전까지 2-8℃에서 보관하였다. 탈파라핀(deparaffinization) 공정에 앞서서, 섹션들을 1시간 동안 58-60℃의 건조 오븐에서 넣어 파라핀을 녹이고 물을 정량적으로 제거함으로써, 유리 슬라이드에 대한 조직의 부착력을 개선시켰다 ("베이킹").
탈파라핀
용융 및 건조 후, 슬라이드를 2 단계의 자일리톨 처리 (5분)에 의해 탈파라핀시키고 알코올 농도를 감소시키는 어레이(주변 온도 20-27℃)를 이용하여 재수화시켰다:
● 자일렌 배쓰에서 5(±1)분;
● 신선한 배쓰에서 이 단계를 한 번 더 반복;
● 과량의 액체;
● 무수 에탄올에서 5(±1)분;
● 신선한 배쓰에서 이 단계를 한 번 더 반복;
● 과량의 액체를 제거;
● 96% 에탄올에서 5(±1)분;
● 신선한 배쓰에서 이 단계를 한 번 더 반복;
● 과량의 액체를 제거;
● 80% 에탄올에서 5(±1)분;
● 과량의 액체를 제거;
● 70% 에탄올에서 5(±1)분;
● 과량의 액체를 제거;
● 증류수 또는 탈이온수에서 5분;
에피토프 회수 및 켄칭 (quenching)
파라핀 제거 후 표적 에피토프들을 열 유도된 에피토프 회수 공정을 이용하여 회수하였다. 따라서, 200 ml의 회수 완충액(10 mM 구연산 완충; 0.05 % Tween-20; pH 6)으로 채워진 염색 단지에 슬라이드들을 넣고 압력 쿠커(PASCAL, Dako)에서 120℃에서 10분간 인큐베이션시켰다. 이어서 단지들을 쿠커로부터 꺼내어 실온에서 에피토프 회수 용액에서 10(±1)분 간 식혔다. 슬라이드들을 세척 완충액(1x PBS)으로 헹구었다.
조직 섹션들을 냉각한 후 200 ml 켄칭 용액(1x PBS 중 0.3 % 퍼옥시다제)이 채워진 염색 단지에 옳긴 다음 실온에서 15분간 인큐베이션한 후, 신선한 세척 완충액에서 2 x 5 분간 세척 단계를 실시하였다.
블로킹 및 항체 인큐베이션
과량의 세척 완충액을 제거하고, 슬라이드를 200 μl 블로킹 완충액 (1x PBS 중 10% 염소 혈청)으로 덮은 후 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 블로킹 완충액을 제거하고 이를 200 μl 희석 항체 용액(블로킹 완충액에 희석)으로 대체하였다. 슬라이드들을 2-8℃에서 밤새 일차 항체(primary antibody)와 함께 인큐베이션시켰다:
Figure pct00018
다음 날 일차 항체 용액을 제거하고 섹션들을 세척 완충액으로 3 x 5분간 세척하였다. 이어서 과량의 세척 완충액을 제거하고 200 μl의 즉석사용 이차 항체 용액을 첨가하였다(Power Vision HRP 염소-α-마우스; Immunologic; NL). 슬라이드들을 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 과량의 액체를 제거하고 슬라이드를 신선한 세척 완충액으로 3 x 5분간 세척하였다.
기질 반응 및 대조염색
과량의 세척 완충액을 제거한 후 섹션들을 약 50-150 μL의 갓 준비한 기질-크로모겐 용액(VectorRed; Vector Labs)으로 2분간 덮었다. 과량의 기질을 제거하고 슬라이드를 탈이온수와 함께 1-5분간 단지에서 인큐베이션시켰다.
이어서, 200 ml의 마이어즈 헤마톡실린을 함유하는 단지에서 2분간 섹션들을 침지시킴으로써 조직의 대조염색을 실시하였다. 그 후, 핵을 파랗게 물들이기 위해(blueing) 수돗물에 5-10분간 담가두었다.
탈수 및 마운팅
대조염색 수행 후, 알코올 농도를 증가시키는 어레이를 이용하여 섹션들을 탈수시켰다:
● 70% 에탄올에 침지 (대략 5-10초)
● 80% 에탄올에 침지 (대략 5-10초)
● 96% 에탄올에 침지 (대략 5-10초)
● 96% 에탄올에 침지 (대략 5-10초)
● 무수 에탄올에 침지 (대략 5-10초)
● 자일렌에 5분간 침지
● 자일렌에 5분간 침지
샘플의 마운팅을 위해 비수성 마운팅 배지(X-TRA-Kit, Medite)를 이용하였다. 자일렌을 마지막으로 충전한 단지로부터 슬라이드를 직접 마운트하고 실온에서 공기 건조시켰다.
Figure pct00019
3. 세포 배양
본 실시예에 제시된 실험에 사용된 모든 췌장암 세포주와 부가적인 대조군 세포주들을 기원물(origin)의 데이터 시트와 다음의 표준 조직배양 공정에 따라 배지에서 배양한다. 배양 조건을 다음 표 4에 요약하였다. 새로 수득된 모든 세포주의 경우, 세포들을 미코플라즈마 오염에 대해 검사하고 마스터 세포 은행을 준비하였다.
Figure pct00020
Figure pct00021
4. 췌장 세포주의 루시페라제 트랜스펙션
ADCC 분석을 위해 췌장암 세포주를 루시페라제 RNA로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 이 루시페라제 RNA (pST1-luc2mut-2hBgUTR-A121-EciI 벡터 (pST1-109))를 ARCA 캡으로 제조하고 H2O에 용해시켰다. RNA를 -80℃에서 22 μl 분주액에 보관하였다. 모든 췌장 세포주에 있어서 최고의 트랜스펙션율과 세포의 생존능을 결과시키는 최적의 전기영동 조건을 탐지하였다. 각각의 분석에서 세포들을 PBS/ 5 mM EDTA로 탈착시키고 250 μl X-Vivo에 용해된 2.5x106 세포를 얼음-냉동된 큐벳에서 10 μg RNA와 혼합하였다. 세포들을 즉시 전기영동하고(GenePulser Xcell, Biorad) 예열시킨 분석-배지에 재현탁시켜 세포 밀도를 5x105 세포/ml로 조정하였다. 검사된 전기영동 조건은 모든 세포주에 대해 공통이었다:
EP1: 250 V, 475 μF
EP2: 200 V, 300 μF
EP3: 150 V, 300 μF
EP4: 200 V, 400 μF
EP5: 250 V, 950 μF
대조군: 0 V, 0 μF
세포의 생존능을 CASY를 이용한 전기영동 직후 또는 트리판 블루를 이용한 세포 염색에 의해 구하고 노이바우어(Neubauer) 챔버 내의 죽은 세포의 백분율을 구하였다. 세포들을 백색 96-웰 플레이트(2.5x104 세포/웰)에 사중 접종하고 24 시간 인큐베이션시켰다. 이어서, 루시페린 믹스를 90분간 첨가한 후 루시페라제 활성을 광도계(Tecan Infinite200)로 측정하였다. 만일 RLU 값이 > 1.000이면, 트랜스펙션은 성공적이고 그 결과 ADCC는 측정가능한 것이었다.
5. 정량적 실시간 PCR (Q- PCR )
췌장암 세포주로부터 RNA 분리를 위해, 세포들을 10 cm 디쉬에 접종하고 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 2-3일간 성장시켰다. RNeasy
Figure pct00022
미니 키트 (Qiagen)에 제공된 지침에 따라 RNA를 분리하였다. SuperScript
Figure pct00023
III First Strand kit (Invitrogen)에 제공된 제조업체의 지침에 따라 cDNA 제조를 실시하였다. RNA 및 cDNA 샘플을 -80℃에서 보관하였다.
CLDN18.1 및 CLDN18.2 이소형들 간의 PCR 프라이머 #5054s (5'-AGAGAGCTCTGGCTTCACCGAGTG-3') 및 #5060as (5'-CCAGAAGTTAGTCACCAGCATGTTGG-3') 차이를 이용하여 40 사이클 PCR 반응으로 올리고(dT)-프라임된 cDNA를 증폭시킴으로써 CLDN18.2 전사체의 정량적 분석을 실시하였다. 이중나선 DNA에 인터컬레이팅하는, SYBR 그린 (QuantiTect SYBR Green PCR Kit, Qiagen)을 이용하여 이 반응을 준비하였다. ABI-PRISM7900 Sequence Detection System 기기 및 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 반응 및 측정을 실시하였다.
CLDN17 전사체의 상대적인 발현 수준을 하우스 키핑 유전자 HPRP에 대한 ΔΔCT 계산법을 이용하여 컴퓨팅하였다.
6. 웨스턴 블롯 분석
췌장암 세포주의 단백질 분리를 위해, 세포들을 10 cm 디쉬에 접종하고 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 2-3일간 성장시켰다. 800 μl 4 x SDS 샘플 완충액(34% 글리신, 250 mM Tris pH6.8, 5% β-머캅토에탄올, 8.2% SDS)을 첨가함으로써 세포를 용해시켰다. 게놈 DNA를 붕괴시키기 위해, 단백질 샘플을 다음 조건 하에서 초음파 처리하였다: 아웃풋 대조군: 레벨1, 듀티 사이클: 20-25초간 70%. 단백질 농도를 분광광도계 (280 nm에서 흡수도)로 측정하고 샘플을 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다. 웨스턴 블롯으로 CLDN18.2 발현을 검출하기 위해, 2개의 고정된 유리 플레이트 사이에 분리용 12.5% 폴리아크릴아미드 겔(2개의 소형 겔에 있어서 4.1 ml 29:1 아크릴아미드/비스-아크릴아미드, 100 μl 10% SDS, 2.5 ml Tris pH8.8, 3.2 ml H2O, 100 μl APS, 10 μl TEMED)을 준비하였다. 중합 후에 이 겔에 스태킹 겔(1.5 ml 29:1 아크릴아미드/비스-아크릴아미드, 100 μl 10% SDS, 2.5 ml Tris pH6.8, 5.8 ml H2O, 100 μl APS, 10 μl TEMED)를 오버레이하고 유리 플레이트 사이에 겔 콤(gel comb)을 설치하였다. 중합 후 4x SDS-샘플 완충액(250 mM Tris-HCL, 34% 글리세린, 8.2% SDS, pH 6.8) 및 7.5 μl의 크기 마커-믹스(6 μl SeaBlue Plus2 Prestained Standard와 혼합된 1.5 μl Magic Mark XP Western Standard) 첨가 (1:20)에 의해 얻어진 각 단백질 샘플 75 μg을 겔에 로딩하였다. 겔을 80 V에서 30분간 그리고 180 V에서 60분간 1x SDS 러닝 완충액 (25 mM Tris, 0.192 M 글리신, 0.1% SDS)에서 흘려보냈다. 니트로셀룰로스 막 상의 겔의 반건조 블로팅을 1 x 트랜스퍼 완충액(25 mM Tris, 0.192 mM 글리신, 20% MeOH) 중, 160 mA에서 90분간 실시하였다. 5% 분유/PBS에서 블롯들을 처음 블로킹하고 일차 항체(0.25 μg/ml 항-클라우딘18 (C-term) 또는 0.1 μg/ml 항-β-액틴)를 1% 분유/PBS 용액에 첨가하였다. 블롯들을 밤새 4℃에서 인큐베이션하고 1x PBS/0.05% Tween20에서 10분간 3회 세척한 다음, 실온, 1% 분유/PBS (염소-항-토끼 IgG(FC) 1:1000 희석됨)에 표지된 이차 항체와 함께 1 시간 인큐베이션시켰다. 블롯들을 1x PBS/0.05% Tween20에서 10분간 다시 3회 세척한 다음 1-3 ml 검출 용액 (Pico 및 Dura Detection System (Pierce)을 1분간 첨가하고 GA_056_Chemolumineszenzentwickler LAS3000에 따라 LAS-3000 검출 박스(증분: 10sec, 시간 간격:10초, 민감성: 높음)에서 블롯들을 스캐닝함으로서 검출을 수행하였다.
7. 유세포분석( FACS )
70-85% 컨플루언시로 대수 성장하는 배양체로부터 PBS/5 mM EDTA 또는 트립신/EDTA를 이용하여 세포들을 수확하였다. 세포들을 계수하고 5분간 원심분리(468 g) 한 다음 펠렛을 FACS 완충액 (2% FCS, PBS 중 0.1% 소듐 아자이드)에 재현탁시켜 농도를 2x106/ml로 조정하였다. 100 μl 세포들을 둥근바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅한 다음 다시 원심분리(5분, 468 g)하였다. IMAB362 (또는 이소타입 대조군 리툭시맙)을 50 μl FACS-완충액에 0.1-200 μg/ml (11 희석 단계 + 항체 대조군 없음) 계대희석하고 4℃에서 30분간 세포에 첨가하였다. 이어서, 200 μl FACS 완충액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 원심분리하였다(5 분, 468 g). 상등액을 제거하고 반복 세척하였다. 이차 염소 항-인간 항체 (FC 특이적, APC (Dianova)와 컨쥬게이트된 F(ab')2)를 FACS 완충액에 희석하고(1:100) 각 웰에 30 μl 씩 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 플레이트들을 200 μl FACS 완충액으로 다시 2회 세척하고, GA_018_BD FACS 어레이 바이오애널라이저에 따라 FACS Array Bioanalyzer (BD) 측정을 위해 100 μl FACS 완충액에 최종적으로 재현탁시켰다.
8. 렌티바이러스 형질도입
렌티바이러스 벡터 구축: 렌티바이러스는 RNA 바이러스에 속하며, 분열중인 베포와 비분열중인 세포 두 가지 모두의 인간 게놈 DNA내로 안정적으로 통합된다. 벡터 pLenti6.4 (Invitrogen)을 백본으로서 사용하였다. 이것은 양성 형질도입된(positively transduced) 세포의 선발을 위한 블라스티시딘 유전자를 함유한다. pL64B42E (EF1α-h클라우딘18.2)-블라스티시딘 (도 1)을 생성하는 벡터의 재조합 영역 내로 EF1α 프로모터에 융합된 CLDN18.2를 클로닝시켰다.
세포주의 선발: 문헌상 데이터에 따라 또는 앞서 생체내 시험된 세포주들을 선발하였다. 선발 기준에는 누드 마우스에서 균질하게 피하 성장할 것과 20-100일의 치료창(therapeutic window)를 가질 것이 포함되었다. 이전에 CLDN18.2 mRNA를 약하게 발현하는 것으로 나타난 바 있는 3가지 세포주(DANG, YAPC 및 BxPC3) 및 문헌에 따라 전이가능한 것으로 나타난 3 가지 세포주(MiaPaCa-2, Patu8902 및 Suit-2)를 통합시켰다. 다른 2종의 세포주(생체내에서 균질한 피하 종양으로서 성장한다고 알려진 것들)를 무작위적으로 선발하였다(HPAC, CAPAN1).
블라스티시딘 선발 조건 결정: 모든 세포주에 있어서 형질도입을 수행하기 전에 렌티바이러스 형질도입 후 세포의 선발에 필요한 블라스티시딘 농도를 구하였다. 췌장암 세포들을 고밀도로 6웰 플레이트에 접종하여 24시간 후 80-90%의 컨플루언스를 결과시켰다. 0.5-12 μg/ml (5 희석 단계 + 블라스티시딘 대조군 없음) 범위로 농도를 증가시키면서 웰에 블라스티시딘 (원액(Stock): 10 mg/ml, Invitrogen)을 첨가하였다. 3-4일마다 배지를 갈아주었고 세포들을 배지로부터 제거하기 전에 현미경으로 분석하였다. 죽은 세포들의 양과 살아있는 세포들의 상태를 기록하였다. 세포들을 14일간 배양하였다. 14일 후 100% 세포자멸사하는 세포들을 일으키는 블라스티시딘 최저 농도가 렌티바이러스 형질도입된 세포를 선발하는데 바람직하다. 수립된 LVT 세포주들 각각에 대하여 요구되는 블라스티시딘 농도를 표 4에 나타내었다.
엔벨롭 선발: 렌티바이러스 형질도입을 위해, GFP-렌티바이러스 대조군 벡터 pL64B42E-(EF1a-GFP)-블라스트를 상이한 엔벨롭 입자들(VSV-G, GALV, RD114, Mokola-G 및 Rabies-G) 내로 패키징하였다. 엔벨롭 내에 존재하는 단백질과 세포막의 조성에 따라, 표적 암세포에 대한 부착성이 더 또는 덜 효과적이다. 모든 췌장암 세포주에 있어서 VSV-G 엔벨롭이 최고의 형질도입 효능 (68.5-91.2%)을 나타내었다 (표 5). 결론적으로, CLDN18.2 발현 벡터 pL64B42E (EF1α-hCLaudin18.2)-블라스티시딘을 VSV-G 엔벨롭에 패키징하였다. 프로쥬서 세포들을 감염시키고 바이러스들을 최고 역가(3.86x107 입자/ml)에서 배지로부터 분리하였다. 바이러스 상등액을 -80℃에서 보관하였다.
Figure pct00024
췌장암 세포주의 렌티바이러스 형질도입: 췌장암 표적 세포주의 감염을 위해, 24-웰 플레이트를 200 μl 1x 레트로넥틴
Figure pct00025
(20 μg/ml, Takara Inc.)으로 코팅하고 플레이트를 파라필름
Figure pct00026
으로 밀봉한 다음 4℃에서 3-16 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트들을 200 ml PBS로 세척하고 실온에서 30분간 PBS/2%BSA로 블로킹처리하였다. 플레이트들을 다시 세척하고 15℃, 2500 rpm으로 25분간 원심분리함으로써 300 μl 바이러스 상등액을 로딩하였다. 상등액을 제거하고 로딩을 3회 반복하였다. 플레이트들을 PBS를 이용하여 마지막으로 한번 세척하고 각 웰에 저계대의 표적 세포들을 접종하였다. 모든 췌장암 세포주에 대해, 24웰 당 5x105-1x107 세포들을 접종하였다. 플레이트들을 37℃에서 2일간 인큐베이션하였다. 이어서, 세포들을 탈착하고 FITC-표지된 IMAB362 항체를 이용하여 FACS에 의해 형질도입 효능을 구하였다. 세포들을 증식시키고 각 세포주에 대해 마스터 세포 은행을 준비하였다.
9. ADCC 분석
췌장암 표적 세포들을 플라스크에 2일 먼저 접종하여 ADCC 개시 당일에 80-90% 컨플루언시 배양에 이르게 하였다. 췌장암 세포들을 루시페라제 RNA로 트랜스펙션시키고 50 μl 분석 배지(표 4에 설명된 배양 배지에 20 mM HEPES이 추가됨) 중 웰 당 1x104 세포의 밀도로 화이트 96 웰 플레이트에 접종하였다. 모든 분석에서 양성 대조군으로서 NUGC-4 sub 10cH11 subE10 Luci#2 세포들 (8000 세포/웰)을 추가 접종하였다. 항체 및 정제된 PBMC를 첨가하기 전에 세포들을 4-6 시간 동안 배양하였다. PBMC는 건강한 도너들로부터 수득된 신선한 인간 버피 코트로부터 준비하였다. 약 3x 20-25 ml 혈액을 PBS로 희석하고(1:2) 50 ml 팔콘 시험관에서 4x 15 ml Ficol-Paque Plus(GE Healthcare) 상에서 주의깊게 레이어링하였다. 구배물들을 원심분리하였다(25분, 700 g). 원심분리 후, 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)를 인터페이즈로부터 수집하여, PBS/2 mM EDTA로 세척, 원심분리(5분 , 468 g)하고, PBS/2 mM EDTA에 재현탁한 다음 원심분리(10분, 208 g)하여 혈소판을 제거하였다. 펠렛들을 50 ml PBS/2 mM EDTA에 재현탁하고 세포들을 계수하였다. PBMCs를 원심분리하고(5분, 468 g) 췌장 세포에 첨가하기 위해 1.6x107 세포/ml의 농도로, 그리고 NUGC-4 sub 10cH11 subE10 Luci#2 세포에 첨가하기 위해 1.28x107 세포/ml의 농도로 X-Vivo-15 배양 배지에 재현탁시켰다.
항체들 (IMAB362 및 이소타입 대조군 항체 ch78H11 1H6)을 10회 연속희석(4.5배)하여 200 μg/ml-0.26 ng/ml의 농도 범위로 만들었다. 각 희석물 25 μl를 표적 세포들에 사중 첨가하였다. 무항체 PBS를 배지 및 용해 대조군 웰에 첨가하였다. 이어서, 25 μl PBMCs를 각 웰에 첨가하고(E:T 비율 = 40:1) 플레이트들을 37℃, 5% CO2에서 24 h ± 1 h 동안 인큐베이션하였다.
다음 날, 용해 대조군 웰에 10 μl 8% Triton X100/PBS 용액을 첨가하고 그 밖의 모든 웰에는 10 μl PBS를 첨가하였다. 마지막으로, 50 μl의 갓 제조한 루시페린 원액(160 mM HEPES, 1x PBS, 3.84 mg/ml D-루시페린 (BD Biosciences))을 각 웰에 첨가하고 플레이트들을 실온의 암실에서 80분간 인큐베이션하였다. 살아있는 세포들의 루시페라제에 의한 루시퍼 옐로우의 산화에 기인하는 발광을 마이크로플레이트 판독기(Infinite200, Tecan, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 세포의 세포독성 백분율을 다음 방정식을 이용하여 계산하였다:
특이적 사멸 (%) = 100 - [(RLU샘플 - RLUtriton) / (RLU배지 대조군 - RLUtriton) x 100]
10. CDC
다음과 같이 CDC를 수행하였다. 96-웰 화이트 분석 플레이트(10,000 세포/웰) 중 50 μl 분석 배지에 표적 세포들 (CHO-K1 p740 MACS/FACS (24H5) p3151 Luci#2A5)을 접종하고 샘플 첨가 전까지 37℃, 7.5% CO2 및 95% rH에서 24h+20 min 동안 성장시켰다. 각각의 96-웰 분석 플레이트는 총 3종의 상이한 음성 대조군 (열에 불활성화된 혈청, IMAB362가 있거나 없는 혈청 및 이소타입 대조군 항체 (리툭시맙)가 있는 혈청) 및 500 ng/ml IMAB362가 있는 건강한 인간 혈청 풀(lot #31032011)의 양성 대조군으로 구성되었다. 제2 배지 대조군에 0.8% Triton X100을 첨가함으로써 반응 말기에 부가적인 양성 대조군을 생성하여 총 용해를 일으켰다. 96-웰 분석 플레이트들 중 하나는 IMAB362 (10 000 - 31.8 ng/ml)의 7 연속 3.16배 희석에 의해 생성된 기능적 양성 대조군으로 구성되었다. 이 대조군은 표적 세포들의 S자형(sigmoid) 투여량-의존 용해를 야기하였다. 모든 샘플들을 96 웰 딥웰 희석 플레이트에서 동시에 준비하였다(각각 200 μl). 샘플들을 역 피페팅에 의해 각 웰로부터 3회 채취하여 분석 플레이트에서 삼중으로 만들었다. 각 시험 아이템과 대조군 아이템 50 μl 씩을 분석 플레이트에 첨가한 후, 플레이트들을 37℃, 7.5% CO2 및 95% rH에서 80+5 분간 인큐베이션하였다.
Triton-용해 대조군 웰을 제외한 각 웰에 10 μl PBS를 첨가하였다. 각각의Triton-용해 대조군 웰에는, 10 μl 0.8% Triton/PBS 용액을 첨가하였다. 루시페린 기질 용액을 제조하였다(6114 μl Aqua bidest, 2496 μl HEPES (1M), 1998 μl 1xDPBS, 4992 μl D-루시페린 원액 용액(12 mg/ml)). 각 웰에 50 μl 루시페린 기질 용액을 첨가하였다. 플레이트들을 37℃, 7.5% CO2 및 95% rH에서 45분간 인큐베이션하였다. 플레이트들을 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다.
● 보체-의존성 용해를 다음 방정식을 이용하여 계산하였다:
특이적 용해(%) = 100 - [(RLU샘플 - RLUtriton) / (RLUHSCM - RLUtriton) x 100 )]
췌장암 세포주의 검사를 위한 변형:
● 췌장암 세포들을 최적 조건을 이용하여 루시페라제 RNA로 트랜스펙션시켰다. 검사된 각 세포주에 대해, 웰 당 1.5x104 세포들을 접종하였다.
● 대부분의 췌장암 세포주는 탈착 및 단수화(singularize)하기 어려우므로, 트립신을 제1일에 사용하였다.
● 분석 플레이트 중 췌장암 세포를 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
● 화학치료제로 전처리된 세포들에 대한 CDC 분석을 다음 IMAB362에 대해 또는 이소타입 대조군 항체로서 ch78H11 1H6 항체 농도: 640000, 160000, 40000, 10000, 2500, 625, 156 및 39 ng/ml를 이용하여 실시하였다.
11. 증식의 억제
각 화학치료제의 투여량-반응 곡선을 분석하기 위해, 증식 분석을 실시하였다.
Figure pct00027
세포들을 96 웰 플레이트에 접종하고 4-6시간 후 겜시타빈 또는 옥살리플라틴을 다음 농도로 첨가하였다: 1000, 500, 250, 100 및 20 ng/ml. 증식 분석물을 37℃ 및 5% CO2에서 4일 간 인큐베이션하였다. 50 μl XTT 완전 시약(50부 XTT + 1부 coupl. 시약 혼합됨)을 첨가하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 흡수도 측정 (세포 플러스 상등액)을 3시간 및 4시간 후에 Tecan Safire로 실시하였다. 100%로 설정된 배지 값과 비교하여 증식 억제를 계산하였다. 겜시타빈과 옥살리플라틴의 EC50 값들을 GraphPad Prism 프로그램으로 계산하였다.
12. ADCC 또는 CDC 를 위한 췌장암 세포주의 화학치료약물과의 배양
DANG의 경우 4 내지 6E+06 세포들을 접종하고 배지 또는 배지 + 1 ng/ml 겜시타빈 또는 1 ng/ml 겜시타빈 + 10 ng/ml 옥살리플라틴에서 2일간 배양하였다. 1-1.4E+07 Patu8988S를 접종하고 10 ng/ml 겜시타빈 또는 옥살리플라틴 100 ng/ml과 조합된 10 ng/ml 겜시타빈의 존재 또는 부재 하에 배양하였다.
ADCC 개시일에, 전술한 프로토콜을 수행하고 CLDN18의 세포 표면 발현을 전술한 바와 같이 FACS 분석에 의해 알아보았다.
13. 세포 주기 분석
세포들을 6-웰 플레이트에 플레이팅하고 5-6 시간 후 화학치료제들을 24 h 48 h 또는 3일 동안 첨가하였다. 배지에 부유하는 세포들을 트립신화된 부착 세포층과 조합시켰다. 세포들을 세척하였다. 전술한 바와 같이 어느 쪽이든 세포 주기 분석을 직접 개시하거나 또는 세포 표면 염색을 수행하였다. 세포들을 1 ml PBS에 현탁하고 3 ml 4% PFA에 첨가하였다. 실온에서 세포를 15분간 고정한 후 세포들을 펠렛화 및 세척한다. RNAse 처리를 위해 세포들을 200 μl RNAse (10000 U/ml) 플러스 0.05% Triton X-100에 재현탁하고 37℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 1 ml PBS를 첨가하여 샘플을 원심분리 하고 200 μl PBS/PJ 50 μg/ml에 재현탁하였다. 적어도 30분 후 샘플은 유세포분석 준비가 되어 있었다. 세포 주기 페이즈 분포를 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 알아내어 DNA 함량 히스토그램을 분석하였다.
14. 세포자멸사 분석( Apoptose assay)
지시된 처리에 이어서, 제조업체(PharMingen, San Diego, CA)의 권장사항에 따라 DNA 단편화 분석(Apo-Direct) 또는 어넥신 V 결합 (검출 키트 I)에 의해 세포자멸사를 측정하였다. 간단히 설명하면, 상등액 중에 부유하는 세포들을 부착 분획과 조합하고 이를 트립신화한 다음 세척하였다. 5E+05 세포의 분주액을 어넥신 V-APC 및 PI와 함께 실온의 암실에서 15분간 인큐베이션시켰다. 세포들을 유세포분석에 의해 즉시 분석하였다. 살아있는 세포들은 어넥신 V-APC와 PI를 모두 배제한다. 초기 세포자멸사한 세포들은 어넥신 V-APC-양성 및 PI-음성인 반면, 세포자멸사 또는 세포괴사로 인해 더 이상 살아있지 않은 세포들은 어넥신 V와 PI 양자 모두에 의해 양성적으로 염색된다. 각각의 사분역(quadrant)에서 염색된 세포의 백분율을 FlowJo 소프트웨어(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 정량화하였다.
DNA 단편화에 기초한 세포자멸사 분석을 다음과 같이 수행하였다. 처리된 세포들(부착 및 부유)을 70% 빙냉시킨 EtOH에서 밤새 고정시켰다. 세척 후, 106개의 고정된 세포들을 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 효소(TdT) 및 FITC-dUTP와 함께 37℃에서 990분간 인큐베이션시켜 DNA 절단(DNA breaks) 부분들을 표지하였다. 세포들을 헹구고, 실온의 암실에서 30분간 RNase A/프로피디움 요오다이드 중에서 인큐베이션시켜 총 DNA를 염색한 다음, 유세포분석법으로 분석하였다. 세포 더블릿(cell doublets)과 응괴물들은 게이팅에 의해 분석으로부터 배제하였다.
15. 생체내 연구
모든 생체내 실험들은 실험동물 연구에 관한 국가 법령과 윤리적 지침에 따라 실시하였다.
15.1 이종이식편의 처리
암컷 Hsd:Athymic Nude-Foxn1 nu 마우스들의 옆구리에 200 μl PBS 중의 종양 세포를 피하 주사함으로써 이종이식편 종양을 접종하였다. 종양 산생 마우스들을 0 μg, 200 μg, 400 μg 또는 800 μg 항체를 주1회 정맥 주사하거나 또는 주2회 교대로 i.v./i.p. 주사함으로써 처리하였다. 화학치료제를 주1회 또는 주2회 복강 투여하였다. 종양 크기와 동물의 건강 상태를 주2회 모니터링하였다. 화학치료제 처리 말기에, 종양 크기가 >1400 mm3에 달하거나 또는 종양이 궤양성으로 될 때까지 항체 적용을 계속하였다. 후속 분석을 위해 종양 샘플을 냉동 보존하거나 또는 4 % 포르말린에 고정하였다.
15.2 전이 분석
상이한 췌장암 세포주들을, 우선 누드 마우스들에서 이들 세포들이 정맥 적용된 후 전이암을 형성하는 이들의 능력에 대해 분석하였다. 이들 생착 분석(engraftment analyses)을 위해 5-10마리의 그룹에게 1x106 및/또는 2x106 세포들을 주사하고 단일 마우스들을 여러 시점에서 희생시켜 전이암 생착 및 성장 여부를 알아보았다.
전이암 처리는 처리 그룹 당 10-12 Hsd:Athymic Nude-Foxn1 nu 마우스들에 대해 수행하였다. 이들에게 2x106 세포 (Patu8988S 또는 Suit2-LVT)를 정맥주사하였다. 전이 질환의 최초 증상 (체중 감소, 쇠약, 숨가쁨)이 나타나자마자 또는 마우스의 최초 사망 직후에 모든 마우스들을 동일한 시점에서 희생시켰다.
조직 준비: 생착 연구를 위해, 마우스들을 서로 다른 시점에서 또는 마우스들이 전이 질환의 신체적 징후(체중 감소, 쇠약, 숨가쁨)를 명백하게 나타내자마자 희생시켰다. 이들의 모든 장기들에 대해 전이 질환을 거시적으로 분석하였다. Patu8988S 세포와 Suit-2 세포의 경우에서만, 폐 및 폐/간이 각각 거시적으로 관찰가능한 전이 질환을 나타내었다. 이들 장기들을 4개의 균등한 섹션들로 절제하고, 2개 (폐: 우상엽 및 좌하엽)는 게놈 DNA 분리를 위해 보관하였다. 다른 2개의 섹션은 IHC 분석을 위해 포르말린 고정시켜 보관하였다(도 2).
게놈 DNA 준비 및 Q- PCR 전략: 게놈 DNA를 폐 또는 간 조직으로부터 추출하였다. 대조군으로는, 인간 췌장암 세포 Patu8988S 뿐 아니라 주사되지 않은 음성 대조군 마우스로부터 게놈 DNA 역시도 분리하였다.
Q-PCR 전략은 전이 조직 중에 존재하는 인간 DNA의 증폭에 기초한다. 마우스의 폐 샘플 내의 인간 DNA의 상대적인 검출 수준은 전이의 양 및/또는 크기와 직접 상관이 있다. 이 방법은 전이 질환이 폐 내에서 균일하게 확산되지 않고 때때로 하나의 폐엽이 다른 폐엽보다 더 많이 영향을 받을 수 있어 편향될 수 있기 때문에, 폐의 2개의 상이한 부분을 하나의 DNA 준비를 위해 혼합하였다 (도 2).
인간의 17변 염색체에는 존재하지만 마우스 DNA에는 존재하지 않는 α-위성 DNA를 특이적으로 증폭시키는 프라이머 쌍 #5861 5'-GGGATAATTTCAGCTGACTAAACAG-3' 및 #5862 5'-TTCCGTTTAGTTAGGTGCAGTTATC-3'을 이용하여 Q-PCR 반응을 수행하였다. 표준 곡선을 작성하기 위해 그리고 양성 대조군으로서, Patu8988S DNA를 마우스 DNA와 혼합하고 5배 희석물을 준비하여, 마우스 DNA 중 100%, 20%, 4%, 0.8%, 0.16%, 0.032% 및 0.0064% 인간 DNA를 결과시켰다. 얻어진 곡선을 이용하여 마우스의 폐 조직 내에 존재하는 인간 전이 DNA의 양을 구하였다 (선형회귀법). 20 μl (200 ng) 마우스 폐 DNA, 25 μl Sybr Green (Qiagen), 1.6 μl 센스 프라이머 (10 μM) 및 1.6 μl 항-센스 프라이머 및 1.8 μl H2O7로 이루어진 50 μl의 최종 부피에서 Q-PCR 반응을 수행하였다.
실시예 2: 정상 및 종양 인간 췌장 조직에서의 CLDN18 .2 발현
정상 및 췌장암 조직에서의 CLDN18.2의 발현 수준 및 패턴을 분석하기 위해 2 가지 쥐의 모노클로날 항체 시약을 이용하여 FFPE 섹션의 조직 염색을 실시하였다(도 3).
조직 마이크로어레이(TMAs) 상에서 프로토타입 항체 35-22A를 이용하여 탐험적 파일럿 실험을 실시하였다. TMAs의 가장 큰 단점은 스팟된 조직의 품질이 가변적이고 크기가 작음으로 해서, 샘플의 대표적인 특징이 아닐 수도 있다는 것이다. 이러한 단점과 함께 완전히 최적화되지 않은 염색 프로토콜이 한데 어우러져 양성 케이스들을 과소평가하는 결과가 나올 수도 있다.
항체 43-14A를 이용하여 주요 실험을 수행하였다. 조직 섹션에서 이들 염색을 수행하였는데 이것은 (TMA에 비해) 더 컸고 종양 세포의 존재 여부에 대해 예비 평가하였다.
췌관으로부터 유래하는 전암성 병변은 국제 췌장 상피내 종양(PanIN) 시스템(PanIN-1A, -1B, -2, -3 서브타입)에 따라 랭킹을 매길 수 있다.
PanIN-1 병변(도 4A)은 평평하고, 기저에 위치한 핵과 풍부한 핵상(supranuclear) 뮤신을 갖는 키큰 컬럼형 세포들로 이루어져 있다. 핵은 소형이며 모양은 원형 내지 타원형이고 베이스먼트 막에 대해 수직 배향되어 있다. 비종양성의 평평한 증식성(hyperplastic) 병변과 이형성(atypia)이 없는 평평한 종양 병변 사이에는 조직학적으로 겹치는 부분이 있다.
서브타입 PanIN-1B의 병변은 유두상, 마이크로유두상 또는 기저에 거짓중층(pseudostratification) 구조를 가지며 그렇지 않으면 PanIN-1A와 동일하다. (Hruban 외 Am J Surg Pathol. 2001 May;25(5):579-86.)
PanIN-2 병변(도 4B)은 평평하거나 유두상이며, 다소간의 극성 손상, 핵 그라우딩(crowding), 핵 확장, 거짓중층 구조 및 과다염색성을 비롯한 핵 이상성을 일반적으로 갖는다. 유사분열은 드물지만, 존재할 경우 비관강성(non-luminal)(첨단성이 아님: not apical)이며 이형성도 아니다. (Hruban 외 Am J Surg Pathol. 2001 May;25(5):579-86.)
PanIN-3 병변(도 4C)은 대체로 유두상 또는 마이크로유두상이지만, 이들은 거의 평평하지 않다. 진성 체모양(True cribriforming), 상피세포들의 소형 클러스터들의 관강 내로의 발아 및 관강 괴사는 PanIN-3의 진단을 시사한다. 병변들은 핵 극성의 손상, 비정상적 술잔세포(관강을 향해 배향된 핵 및 기저막을 향해 배양된 점액성 세포질을 갖는 술잔세포), 종종 비정상적일 수 있는 유사분열, 핵 불규칙성 및 명백한(마크로) 핵소체를 갖는다는 특징이 있다(Hruban 외 Am J Surg Pathol. 2001 May;25(5):579-86.).
췌장 조직에서의 CLDN18.2의 발현을 다양한 소스의 조직 샘플을 이용하여 43-14A 항체를 이용하여 분석하였다.
CLDN18.2는 PanIN-1, -2 및 -3 서브타입의 PanIN 구조체에서 종종 검출되는데 이는 전암성 병변에서 CLDN18.2의 조기 발현을 입증하는 것으로 (도 4), 이것은 후기 단계에서 보존된다. 이와 대조적으로, 췌장의 췌관 구조를 비롯한 정상적인 췌장 조직 샘플에서는 발현이 관찰되지 않았다.
결론적으로, CLDN18.2는 췌관에서의 악성 조직학적 변화의 개시를 알리는 조기 마커이다.
원발 췌장암에서의 CLDN18.2의 발현을 평가하기 위해 2 가지 연구를 수행하였다.
파일럿 연구를 위해 총 141 원발 췌장암 케이스의 몇몇 TMA를 모노클로날 CLDNA18.2 특이 항체 35-22A로 염색하였다. 분석된 TMA의 전체적인 품질은 불만족스러웠다. 많은 스팟들이 회수가 진행되는 동안 부분적으로 소실되었고 불균질한 헤마톡실린 대조염색은 곧 FFPE 조직의 최적에 미치지 못하는(suboptimal) 조직 프로세싱을 시사하였다.
염색된 케이스들 중 전체적으로 >48.9%가 CLDN18.2에 대해 양성적이었는데 여기에는 49.2% (65/132) 췌관 선암종, 50% (1/2) 세엽세포암종 및 7개 중 3개의 신경내분비암종 (표 7)이 포함되었다. 종양 세포 막을 다른 세포 유형에 대한 백그라운드 없이 염색하였다(도 6).
또한, 본 발명자들은 CLDN18.2 발현 강도와 종양내 염색된 종양 세포 분획 간의 관계를 관찰하였다(표 8, 도 5).
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
두 번째 연구는 품질 제어된 조직 섹션을 이용하여 고도로 민감한 항체 43-14A를 이용하는 최적화된 염색 프로토콜에 따라 수행하였다.
Figure pct00031
총 42개의 원발 췌관 췌장암 샘플을 분석하였다. 이의 약 90% (42 케이스 중 38 케이스)는 CLDN18.2에 대해 양성이었고 (표 10), 이들 대부분 (>60%)은 강한 시그널 강도 +++를 나타내었다 (도 7, 표 11). 또한, CLDN18.2 발현 수준과 양성 종양 세포의 분획 사이에서도 어떤 상관관계가 관찰되었다. 분석된 케이스의 대부분(62%)은 3등급 종양이었다(표 12).
Figure pct00032
Figure pct00033
췌장암은 대부분의 환자에서 진행된 후에야 진단된다. 이들 환자에 있어서 종양은 이미 림프절과 다른 장기, 특히 간으로 전이된 경우가 많았다. 메인 연구에서 림프절의 79 조직 샘플과 췌장암의 간 전이에 대해 CLDN18.2 특이적 43-14A 항체를 이용하여 면역조직화학분석을 실시 분석하였다.
림프절 전이의 70.5%(31/44 케이스) 및 68.6%의 원격 간 전이(24/35 케이스)는 CLDN18.2에 대한 종양세포의 명백한 염색을 입증한다(표 13). 양성 종양 세포의 염색 패턴은 막성(membranous)이었고 몇몇 경우 부가적으로 보다 약한 세포질 시그널을 나타내었다(도 9). 원발 종양 분석 결과에 따라, 전이 샘플에서 CLDN18.2 발현 수준과 CLDN18.2 양성 종양 세포의 분획 사이에서 어떤 상관관계가 발견되었다(도 8).
분석된 종양의 등급과 CLDN18.2의 발현 수준 또는 양성 종양 세포의 분획 사이에는 아무런 상관관계도 발견되지 않았다.
Figure pct00034
양성 원발 종양 케이스들의 CLDN18.2 발현이 동일한 환자의 전이암에서 보존되는지를 시험하기 위해, 맷칭된 원발 암/림프절 전이 더블릿(doublets)을 항체 43-14A를 이용하여 스크리닝하였다.
Figure pct00035
분석된 27쌍의 케이스들 중 25쌍(92.5%)에서 원발 종양과 림프절 쌍이 CLDN18.2에 대해 양성적이었다. 어떤 단일 케이스에서는 두 가지 조직 모두 음성적이었고 또 다른 케이스에서는 원발 종양은 CLDN18.2에 대해 양성적인 반면 전이암은 음성적이었다.
시험된 26 더블릿 중 21 더블릿(80.7%)에서 원발 종양 및 전이 종양 세포의 시그널 강도는 동일하였다. 5 케이스에서 시그널 강도는 +++에서 ++로 저감되었다. 25 쌍의 조직 중 11 쌍(44%)에서 양성 종양 세포의 갯수는 원발 종양에 비해 전이 종양에서 더 낮았다(표 14).
요약하면, CLDN18.2 발현은 원발 종양 세포들이 전이 단계로 진행하는 경우에도 보존되는 것으로 나타났다. 림프절 전이 중 양성 종양 세포의 전체적인 강도 및 분획은 원발 종양에 비해 아주 약간만 낮을 뿐이었다(도 10).
원발 종양으로부터 유래하는 환자의 조직 샘플들 중 소수의 경우 림프절 전이와 간 전이가 일어났다. 이들 맷칭된 트리플렛을 염색하여 원격 전이에서의 CLDN18.2 발현의 보존성을 검사하였다. 6종의 맷칭된 트리플렛을 항체 43-14A를 이용하여 분석하였다.
Figure pct00036
6종의 트리플렛 중 3종에서, 3종의 조직 모두의 표본을 CLDN18.2에 대한 이들의 양성 점수에 대해 비교하였다(도 11). 3가지 경우에서 종양 세포의 분획은 원발 병변에서 CLDN18.2 양성이었던 반면, 전이 병변에서는 CLDN18.2 염색이 나타나지 않았다(표 15).
실시예 3: 시험관내 및 생체내 모델 그리고 췌장암 모델에서 사용된 인간 췌
장암 세포주에서의 표적 발현
세포주의 공급원
이 전임상 평가 연구의 주목적은 적절한 모델 시스템에서 IMAB362 처리의 저해 효과를 분석하는 것이었다. IMAB362 효과의 시험관내 및 생체내 특징화에 사용가능한 CLDN18.2-양성 세포주를 동정하기 위해, 상업적으로 구득가능한 26종의 췌장암 세포주 세트를 CLDN18.2 발현에 대해 스크리닝하고 자세히 특징지었다. 실험적 사용을 위한 세포 은행을 각 세포주가 도착할 때 마다 즉시 만들었다. 이들은 원발 췌장 선암종(10종, 이들 중 6종은 점액성 선암종), 원발 암종(4), 간(5) 또는 비장 (1)으로의 췌장 선암종, 또는 복수로부터 분리된 것 (5)이었다 (표 16 참조). 이들 세포주들 중 몇가지 (8)은 렌티바이러스에 의해 형질도입되어 CLDN18.2을 발현하였다.
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
인간 췌장암 세포주에서 CLDN18.2 전사체 발현
CLDN18.2-발현 췌장 세포주를 동정하기 위해, CLDN18.2의 엑손 1에 결합하는 정방향 프라이머와 CLDN18.2의 엑손 3에 결합하는 역방향 프라이머를 이용하여 정량적 실시간 PCR (RT-PCR)에 의해 전사체 수준을 구하였다. 내재적으로 CLDN18.2을 발현한 인간 위암종 세포주 KATO-III 및 CLDN18.2 음성 유방암 세포주 SKBR-3를 각각 양성 대조군과 음성 대조군으로서 포함시켰다. RT-PCR 수행 결과 췌장암 세포주 DANG, Panc03.27, Panc05.04, Patu8988S 및 YAPC에서 1x105를 초과하는 상대 강도로 명백히 내재적인 CLDN18.2 발현이 관찰되었다. 흥미로운 것은, Patu8988S 세포가 위장의 CA KATO-III 세포에 필적하는 CLDN18.2 발현 수준(~1x108)을 나타냈다는 것이다.
내인성 세포주에 더해, CLDN18.2을 이소적으로 발현하는 LVT 세포주들을 전사 수준에 대해 분석하였다 (도 12A). 8 종의 LVT 세포주들 중 6종에서, 1x108 을 초과하는 상대적인 CLDN18.2 발현 수준이 탐지되었다. HAPC-LVT 및 Suit2-LVT 세포들에서만, 발현 수준이 1x105를 초과하였다.
본 발명자들은 CLDN18.2 발현이 시험관내 배양 중에 안정한지 여부를 조사하였다. Patu8988S, Panc05.04 세포 및 렌티바이러스에 의해 형질도입된 세포주 Suit2-LVT, MiaPaCa2-LVT 및 Patu8902-LVT를 최대 15회까지 계대시키고 CLDN18.2 전사체를 분석하였다 (도 12B-D). 본 발명자들은 높은 계대 횟수의 형질도입된 세포와 내인성 세포 양자 모두에서 CLDN18.2 발현의 손실을 관찰하였다. 발현 손실은 형질도입된 세포에서 가장 높았다. 따라서, 시험관내 실험에서 가능한 경우라면 조기 계대(early passages)가 이용되었으며 후술하는 생착 실험에서 종양 이종이식편 중의 CLDN18.2의 발현이 입증되었다.
인간 췌장암 세포주에서의 CLDN18 .2 단백질 발현
전체 세포 용해물 중 CLDN18 .2의 검출
전사체 분석에 더해, 웨스턴 블롯 및 IF에 의해 CLDN18.2의 발현을 단백질 수준으로 분석하였다. 웨스턴 블롯 분석의 경우 26 췌장암 세포주의 세포 용해물(lysates)을 CLDN18 특이적인 항체 항-클라우딘18(C-말단)을 이용하여 웨스턴 블로팅함으로써 조사하였다. SKBR-3 세포의 용해물을 다시 음성 대조군으로 이용하는 한편, CLDN18.2에 의해 안정하게 트랜스펙션된 HEK293 세포의 용해물(HEK293-p740)은 양성 대조군으로서 사용하였다. 여기서, 본 발명자들은 Patu8988S, DANG 및 Panc05.04 세포에서 높은 단백질 발현을 검출하였는데, 이는 RNA 데이터를 확인해주는 것이다. Panc03.27 및 BxPC3 세포 용해물에서 희미한 밴드들을 찾아볼 수 있었다. RNA 수준에 대해 양성적으로 동정된 YAPC 세포들은 웨스턴 블랏에서 보다 작은 크기의 희미한 밴드를 나타내었다. 그 밖의 다른 모든 세포주들은 음성적이었다(도 13).
췌장암 세포 중 CLDN18 의 세포 발현
보충적인 단백질 발현 데이터를 얻기 위해, 세포들을 고정 및 영구화시킨 후 검출을 위해 항체 35-22A를 이용하여 면역형광법(IF)에 의해 췌장 암종 세포주들을 조사하였다. IF 분석 결과는 대부분의 췌장암 세포주가 CLDN18.2 염색에 대해 음성적이라는 앞선 RNA 및 단백질 데이터를 확인해주었다(도 14). 몇몇 세포주 (예컨대 AsPC1, DANG, HUP-T3, HUP-T4, Panc01)에서는, 핵의 도트(nuclear dots)가 관찰되었는데 이들은 대부분 염색 아티팩트를 나타내었다. RNA 및/또는 단백질 수준에 대해 낮은 CLDN18.2를 갖는 것으로 동정된 DANG, Panc03.27 및 BxPC3 세포들은 검출 감도가 더 낮은 IF 분석에서 음성적이었다. 이와 대조적으로, Panc05.04, Patu8988S 및 KATO-III 위장의 암종 대조군 세포들의 막 및 세포질은 CLDN18.2에 대해 강하게 양성으로 염색되었다. 염색 강도는 각 세포마다 달랐으며 집단 내에서 음성 세포도 탐지되었다(도 14J 및 N). LVT 세포주에서 본 발명자들은 모든 세포의 80% 이상에서 강한 막 염색을 발견하였다.
췌장암 세포 중 CLDN18 .2 발현의 확인
CLDN18.2의 발현을 확인하고 세포 표면 상의 이 표적의 양을 평가하기 위해 자연적인 염색 프로토콜을 이용하여 LVT 세포주와 내인성 세포주 Panc05.04 및 Patu8988S 세포주들을 IMAB362로 염색하였다. 비록 IMAB362에 의한 Patu8988S, Panc05.04 및 KATO-III 위암 대조군 세포의 염색 강도가 덜하고 양성 세포들의 백분율은 35-22A를 이용한 세포 염색에 비해 저감되긴 하였으나 (도 16A-F), IF 분석 결과 CLDN18.2가 췌장암 세포의 표면에서 발현된 것으로 확인되었다. 이소적으로 CLDN18.2를 발현하는 8 LVT 췌장암 세포주의 경우, 거의 모든 세포에서 명백한 막 염색이 관찰되었다 (도 16G-L의 6 LVT 세포주를 참조).
결론적으로, CLDN18.2 발현 분석 결과 내재적으로 발현하는 췌장암 세포주 Panc05.04 및 Patu8988S 그리고 8종의 모든 렌티바이러스 형질도입된 세포주들인 BxPC3-LVT, CAPAN1-LVT, DANG-LVT, MiaPaCa-2-LVT, Suit-2-LVT, Patu8902-LVT 및 YAPC-LVT가 적절한 CLDN18.2 양성 세포 모델 시스템인 것으로 동정되었다.
췌장암 이종이식편의 발달 및 전이 모델
적절한 피하 췌장암 종양 모델의 동정을 위한 생착 연구
IMAB362의 생체내 효능을 시험하기 위해 상이한 췌장암 세포주들에 대한 총 37가지 생착 연구를 수행하여 적절한 피하 이종이식편 모델을 동정하였다. 시험된 모든 세포주들 중, CLDN18.2를 이소적으로 발현하는 BxPC3-LVT, CAPAN1-LVT, MiaPaCa-2-LVT, HPAC-LVT, DANG-LVT 및YAPC-LVT 세포주들을 피하 이종이식편 모델에 대해 선발하자 높은 생착률과 균일한 종양 성장을 나타내었다. 이에 더해, 생체내 IMAB362 효능을 검사하기 위해 내재적으로 CLDN18.2를 발현하는 Patu8988S 및 DANG 세포주들을 이용하여 피하 이종이식편 모델을 선발하였다. Panc05.04 세포의 피하 주사는 피하 종양 형성을 초래하지 않았다.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
적절한 전이 모델들의 동정을 위한 생착 연구
전이암 형성에 대한 IMAB362의 효과를 연구하기 위해, 누드 마우스들에서 전이암 모델을 수립하였다. 췌장암 세포주들의 정맥 적용 후 이들의 전이 능력을 분석하였다. CAPAN1-LVT, MiaPaCa-2, Patu8988S, Patu8902 및 Suit-2 세포들을 문헌 Mohanty 및 Xu 2010에 설명된 바와 같이 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 전이 생착 시점과 성장률을 알아보기 위해, 마우스들을 여러가지 상이한 시점에서 희생시켰다 (표 18).
Figure pct00045
Patu8902 세포 및 CAPAN1-LVT의 생착 분석은 간단하지 않았는데, 이는 대부분의 마우스들이 거의 즉시 죽어버렸기 때문이다. CAPAN-LVT 세포로 챌린지된 마우스들 중 생존한 5 마리의 폐와 간에서는 72일 후 거시적으로 관찰가능한 전이는 탐지되지 않았다. 이와 대조적으로, Suit-2 및 MiaPaCa2 세포 주사의 경우에는 잘 관용되었다. 이들 마우스들의 폐 조직을 주사 후 여러 상이한 시점에서 IHC 분석하였다. MiaPaCa-2 세포로 챌린지된 마우스들에서는 73일까지는 폐에서 전이가 전혀 탐지되지 않았으므로 이 세포주는 IMAB362 처리 모델로서 선발하지 않았다. Suit-2 암 세포들이 마우스의 폐 내로 전이되었다. 이 조직을 통해 다초점 검출을 시행하였다. 그에 따라, 렌티바이러스에 의해 CLDN18.2 형질도입된 Suit-2-LVT 세포주들을 전이암 형성에 미치는 IMAB362의 효과를 분석하기 위한 모델 시스템으로서 선발하였다.
Suit-2에 더해 내재적으로 CLDN18.2을 발현하는 Patu8988S 세포의 전이암을 형성하는 능력도 분석하였다. 마우스 당 2 가지 상이한 세포수(1x106, 2x106)가 정맥 주사된 경우의 생착률 검사를 실시하였다. 표 18에 나타난 바와 같이 여러 가지 상이한 시점에서 폐와 간을 분리하였다. 먼저, 수득된 여러 가지 상이한 조직들을 Q-PCR을 이용하여 분석하였다. 17번 염색체의 인간α-위성(satellite) DNA를 증폭시킴으로써 제70일까지 수득된 폐와 간을 분석하였다. 폐의 결과 경시적으로 마우스 중의 인간 DNA의 백분율이 명백히 증가하는 것으로 나타났는데 이는 주사된 세포 수에 의존하는 것은 아니었다. 1x106 또는 2x106 세포를 정맥 적용함으로써, 각각 70일 후 5.8% 및 3.7% 인간 DNA가 검출되었다(도 19). 간에서는 인간 DNA가 거의 증폭되지 않았다. 70일 후 백분율이 약간 증가하긴 했지만 여전히 0.005%를 밑돌았다.
Patu8988S 전이암에서의 CLDN18.2 발현을 입증하기 위해, 항-클라우딘18 (Mid) 항체 뿐 아니라 마우스 조직 중의 인간 세포의 검출을 위해 항-인간 MHC 클래스 I을 이용하여 폐 조직을 면역조직화학적으로 염색시켰다. MHC-I 염색 결과 마우스의 폐 조직 섹션에서는 명백한 전이 초점(metastasis foci)이 탐지되었으나 간 섹션에서는 그렇지 않았다(도 20). 뿐만 아니라, 이들 초점들 내의 세포막은 항-클라우딘18 (Mid) 항체로 염색되었는데 이는 이들 세포에서의 IMAB362 표적 단백질의 명백한 발현을 나타내는 것이다. 따라서, Suit2-LVT 모델에 더해, 이 내인성 전이모델을 IMAB362 처리 연구에 사용하도록 선발하였다.
실시예 4: IMAB362 - 매개된 세포 사멸 효과
IMAB362 교차결합은 효과적인 세포자멸사를 유도한다
세포 표면 표적에 대한 항체 결합은 세포 사멸을 직접적으로 야기하는 비정상적인 시그널링을 개시할 수 있다. 이러한 시그널링 이벤트는 표적 에피토프, 결합가 및 결합이 표적의 교차결합과 연관되어 있는지 등에 의존할 수 있다. 몇몇 CD20 양성 림프종 세포주의 경우, 예를 들어 리툭시맙에 의한 세포자멸사의 유도는 교차결합 조건 하에서만 관찰된다. 이러한 교차결합은 고친화성 Fc-수용체-양성 면역 세포들이 항체-코팅된 종양 세포와 상호반응할 경우 생체내에서 일어날 수도 있다.
IMAB362의 교차 결합은 TUNEL 분석에 의해 측정시 18-42 시간 이내에 인간 위암 세포 NUGC-4 및 KATO-III에서 직접적인 세포자멸사를 유도한다. 세포자멸사의 규모는 항체 투여량 및 암세포 상에서의 표적 발현 수준과 연관이 있다. 겜시타빈 처리는 종양 세포의 세포 주기 중단을 야기하고 이어서 세포사멸사를 유도한다. 겜시타빈으로 처리된 췌장 종양 세포의 세포자멸사를 도 21에 도시하였다.
췌장암 세포에 대한 IMAB362 - 매개된 ADCC 활성
IMAB362는 내츄럴 킬러 세포와 같은 Fcγ-수용체-양성 면역 이펙터 세포를 매우 강력하게 동원(recruiting) 및 활성화시킨다. 표적 세포들에 대한 IMAB362의 결합은 항체에 대한 이들의 Fcγ 수용체 결합시 이펙터 세포에 의해 분비되는 그랜자임(granzymes)과 퍼포린에 의한 항체-의존세포매개 세포독성(ADCC)을 유도한다. 이 작용 메카니즘의 효과는 인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)의 존재 하에 IMAB362와 함께 24 시간 인큐베이션된 루시페라제- 및 CLDN18.2-양성 위장 CA 세포 (예컨대 NUGC-4 및 KATO-III)의 경우 앞서 입증된 바 있다 (이펙터 대 표적 비율 = 40:1). 최고 200 μg/ml의 IMAB362를 적용하자 최대 용해율(maximum lysis rates) 80-100%가 얻어졌다.
여기서 본 발명자들은 췌장암 세포주에 대한 IMAB362의 ADCC 활성을 알아보았다. IMAB362의 농도를 증가시키면서 여러가지 상이한 세포주와 함께 E:T 비율을 40:1로 하여 인큐베이션시켰다. 각 실험에 상이한 도너들의 PBMC를 첨가하였다. 모든 세포주에 대한 결과를 표 19에 요약하였다. 초기에 동정된 5종의 CLDN18.2-양성 췌장 세포주들 중, 오직 Patu8988S, Panc05.04 및 DANG만이 IMAB362와 PBMCs의 첨가에 의해 효과적으로 사멸되었다(도 22A). 비록 CLDN18.2 표면 발현은 Panc05.04와 DANG에 대한 FACS에서 탐지할 수 없었지만, 발현 수준은 이펙터 세포-의존성 사멸을 일으키기에 충분히 유의적이다(EC50: Patu8988S: 0.01- 1.4μg/ml, DANG/Pan05.04: 0.1-38 μg/ml). 이러한 데이터로부터 RNA를 상대적인 수준 > 5.5x105으로 발현시키는 세포들만이 효과적으로 용해된다는 결론을 내릴 수 있다.
LVT 췌장암 세포주 및 이들에 대응하는 모 세포주에 대해서도 ADCC 분석을 실시하였다(도 22B-F). ADCC는 표적에 대한 IMAB362의 특이적 결합에 엄격하게 의존하는데, 이는 오로지 CLDN18.2 양성 표적 세포들만이 IMAB362와 PBMCs에 의해 사멸되기 때문이다. IMAB362에 의해 인간 췌장암 세포에서 유도되는 절반 최대 사멸률(half maximum killig rate)와 최대 사멸률(maximum killing rate)은 PBMC 도너들에 따라 차이가 났으며 CLDN18.2 발현 수준에 영향을 미치는 세포의 계대 수에도 의존하였다.
표적 세포들의 절반 최대 사멸률과 최대 사멸률을 일으키는 IMAB362의 농도를 도 22G-H에 나타내었다. LVT 췌장 CA 세포주는 소량의 항체를 고비율로 첨가시 사멸된 반면, DANG 및 Panc05의 경우에는 ~50% 최대 사멸률에 도달하는데 최고의 항체 농도가 요구된다. 서브클론 15D3 (Panc05.04 및 FACS의 제한 희석에 의해 선발된 CLDN18.2 양성 클론)을 이용하여 얻어진 Panc05.04 결과를 도면에 포함시켰는데 LVT 세포주의 경우에 필적하는 ADCC 용해율을 나타내고 있다. 불행하게도, 이 클론에서의 CLDN18.2 발현은 세포의 계대배양 후에는 시험관내에서 급속히 침묵하므로 이 클론은 추가 실험에서는 사용되지 않았다.
췌장암 세포에 대한 IMAB362 - 매개된 CDC 활성
ADCC 분석에서 IMAB362에 의해 사멸된 췌장암 세포들을 IMAB362 \의 보체-의존성 용해 활성에 대한 민감성에 대해 분석하였다. 이에 더해, LVT 세포주와 모 균주들도 CDC에 대해 시험하였다.
CDC 활성은 항원과 IgM 또는 IgG 항체의 복합체에 의해(클래식한 경로) 또는 미생물 표면에 의해(대체 경로) 활성화된다. 클래식한 경로에서 보체 C5는 C5b로 전환된다. 아나필로아톡신(anaphyloatoxins) C3a, C4a 및 C5b가 방출되어 막공격 복합체(membrane attack complex: MAC)가 C5b, C7, C8 및 C9에 대한 순차 결합에 의해 형성된다. 이 경로는 가용성이지만 막에 결합하는 단백질 (예컨대 CR1, DAF, MCP, CD59, CD55, CD46) 보호 자가 조직에 의해 저해된다.
CLDN18.2에 의해 안정하게 트랜스펙션된 CHO-K1 세포들 (p740) 및 루시페라제를 각 분석에서 분석 양성 대조군으로서 사용하였다(도 23A). 세포주 DANG, BxPC3, YAPC, Patu8988S, Panc05.04, CAPAN1 및 Suit2는 IMAB362 및 건강한 인간 혈청 풀의 첨가에 의해 용해되지 않았다(도 23B). 비록 DANG, Patu8988S 및 Panc05.04 세포들은 앞선 모든 실험에서 CLDN18.2 양성적이었지만, 이들 세포들은 보체-의존적 방식으로 용해되지는 않았다. 이것은 아마도 종양 세포들이 하나 이상의 막 결합 보체 억제 단백질(예컨대 CD46, CD55 및 CD59)을 과도하게 발현하기 때문일 가능성이 크다(Geis 외, Curr Cancer Drug Targets, 2010 10:922-931). 그러나, 종양 세포상에서의 이들 억제 단백질의 발현이 항체 치료법의 임상결과에 어떤 영향을 미치는지는 여전히 논란거리이다 (Dzietczenia 외 Med. Oncol. 2010, 27:743-6; Weng 및 Levy 외, Blood 2001 98:1352-7).
내인성 세포주에 더해, 모든 LVT 세포주들을 CDC 분석으로 시험하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, MiaPaCa-2-LVT, Suit2-LVT 및 CAPAN1-LVT에 대한 IMAB362 및 혈청 첨가는 0.3 내지 2.6 μg/ml의 EC50값으로 투여량-의존적인 용해를 일으켰다.
인간 췌장암 세포주 내 CLDN18 .2 발현의 개관
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
실시예 5: 췌장암 이종이식편 모델에 대한 IMAB362 의 효능
생체내 IMAB362의 효능을 조사하기 위해 시험된 41종의 췌장암 이종이식편 모델 중 10종을 선택하였다. CLDN18.2의 발현이 높은 췌장 이종이식편 모델에서, IMAB362 처리는 높은 항종양 효과를 나타내었다. 이것은 좌측 옆구리에 BxPC3-LVT 또는 MiaPaCa-2-LVT 이종이식편이 피하 주입된 마우스들을 처리함으로써 조사되었다. 처리는 종양 접종 3일 후부터 주2회 200 μg IMAB362를 주사함으로써 개시되었다. IMAB362 처리된 마우스들은 식염수 대조군으로 처리된 마우스들에 비해 종양 성장이 유의적으로 억제된 것으로 나타났다. 이에 더해 IMAB362 처리된 바우스의 종양 성장 억제는 중위수 생존율도 연장시켰다(도 24 및 도 25). IMAB362 효능은 치료 기간과 연관이 있다. 조기 시점에서 IMAB362 처리를 개시한 경우 수립된 종양에 대한 효과를 시험하기 위해 나중에 처리를 개시한 경우에 비해 종양 성장 억제에 대해 더 증가된 효과를 나타내었다. 뿐만 아니라, IMAB362의 항종양 효과는 CLDN18.2 표적 발현량에도 의존하였다. DANG 및 Patu8988S 이종이식편과 같이 CLDN18.2를 낮게 발현하는 종양의 IMAB362 매개된 성장 억제는 CLDN18.2를 고도로 발현하는 이종이식편 종양을 이용한 종양 성장의 억제에 비해 감소하였다.
실시예 6: 췌장 전이 마우스 모델의 처리
Figure pct00049
Suit2 - LVT 전이 모델:
마우스들에게 2x106 Suit2-LVT 세포를 정맥 주사하고 표 20에 표시된 바와 같이, 200 μg IMAB362, 이소타입 대조군 항체 (IMAB027), 또는 PBS로 처리하였다. 35일 후 첫 번째 마우스 (이소타입 대조군)은 죽었다. 결국, 제42일에 모든 마우스들을 희생시켜 IHC 및 Q-PCR 분석을 위해 폐와 간을 적출하였다.
마우스의 폐 내의 인간 DNA의 Q-PCR 분석을 세벌씩 적어도 2회 반복하였다. 얻어진 Cv 값을 이용하여 인간 DNA의 백분율을 계산하자 PBS 및 이소타입 대조군 처리 양자에 비해 마우스가 IMAB362로 처리된 경우(도 26A), 폐에서 검출된 Suit2-LVT 전이가 유의적으로(P<0.05) 감소한 것으로 밝혀졌다. 이 결과를 확인하기 위해, 폐 샘플의 조직 섹션을 준비하고 MHC-I 항체를 이용하여 염색하였다. 폐 섹션 내의 양성 염색된 세포들의 표면적을 ImageJ 프로그램을 이용하여 계산하였다. IMAB362 처리의 경우 PBS 처리에 비해 유의적인 억제(P<0.05)가 관찰되었는데 이는 Q-PCR로 얻은 결과를 뒷받침하는 것이다. 그러나 이소타입 대조군 항체의 경우에는, 차이가 유의적이지 않았다(도 26B). 이러한 차이는 가장 크게는 조직 프로세싱의 차이에 기인한다: 조직 섹션의 IHC 프로세싱은 조직의 절반으로부터 게놈 DNA가 추출되는 Q-PCR 분석에 비해 폐의 매우 적은 섹션으로의 통찰만을 가능케 한다.
조직 프로세싱에 더해, 상기 결과는 CLDN6을 표적으로 하는 이소타입 대조군 항체의 예기치 않은 억제 효과를 나타내는 것일 수 있다. 이 옵션을 연구 조사하기 위해, Suit2-LVT 세포를 FACS에서 CLDN6 발현 및 IMAB027 결합에 대해 분석하였다.
Suit2-LVT 세포에 대한 200 μg/ml IMAB362의 첨가 결과 세포에 강한 결합이 확인된 반면, 200 μg/ml IMAB027 첨가는 이들 표적 세포들에 대한 약한 항체 결합을 야기하였는데, 이는 CLDN6이 실제로 이들 세포에서 약하게 발현됨을 가리키는 것이다. 이러한 결과는 적어도 2개의 팩터(조직 프로세싱 및 약한 IMAB027 억제)가 이소타입 대조군 항체의 관찰된 차이점을 야기함을 시사하는 것이다.
Patu8988S 전이 모델
생체내에서 Patu8988S 전이의 발달 및 성장에 미치는 IMAB362의 치료 효과를 분석하기 위해, 그룹 당 10 마리의 마우스에게 2x106 Patu8988S 세포를 주사하였다. 최초 실험은 PBS 처리된 마우스와 IMAB362 처리된 마우스를 비교함으로써 수행하였다. 각 그룹에서 1 마리의 마우스가 상기 세포를 주사한 직후에 죽었다. 다른 18 마리의 마우스에서는, 생착 실험에 비해 전이가 매우 급속히 일어났다. 63일 후, 건강 상태 악화로 인해 PBS 그룹의 최초 2 마리를 희생시켰다. 다른 모든 마우스들은 65일 후에 희생시켰다. 폐를 광학 분석한 결과 폐 조직 전반에 걸쳐 대규모 전이가 일어난 것으로 나타났다. 전이의 양은 Q-PCR 실험으로 분석하였다. (도 27). 그 결과 IMAB362가 폐 조직에서 전이암의 성장을 저해한 것으로 나타났다.
그룹 당 11 마리의 마우스를 이용한 두 번째 실험은 이소타입 대조군(리툭시맙) 대조군 처리와 IMAB362 처리를 비교함으로써 실시하였다. 이 실험에서 전이는 생착에서 관찰된 것 만큼 느리게 일어났다. 그럼에도 불구하고, 비교를 위해 이 두 번째 실험도 제65일에 종결지었다. 이 실험에서도 폐 조직을 Q-PCR로 분석하자 이 경우에도 IMAB362가 전이암의 성장을 저해시킨 것으로 나타났다. IMAB362 그룹의 마우스 한 마리는 이상치(outlier)인 것으로 동정되었고 이 이상치 마우스를 배제하면 거의 유의적인(P=0.0588) 저해를 일으킨 것으로 결론지어졌다. 이 데이터를 Suit2-LVT 전이 실험에서 설명된 것과 같이 IHC 표면 분석에 의해 검증하였다. 여기서도 동일한 이상치가 동정되었으며, t-검정법에서 이 이상치 값을 제외하자, IMAB362의 저해 역시 동일한 마우스의 값인, 유의값(P=0.0691)의 경계에 해당하는 것으로 나타났다.
실시예 7: 화학요법과 조합된 IMAB362 의 약력학
겜시타빈 및 옥살리플라틴에 대한 췌장암종 세포의 감수성
본질적으로 CLDN18.2를 발현하는 췌장암 세포주들(DANG, Patu8988S) 및 CLDN18.2에 의해 안정적으로 형질도입된 세포들(MiaPaCa-2-LVT, BxPC3-LVT)을 이용하여 화학치료제 옥살리플라틴 또는 겜시타빈와 조합된 IMAB362의 작용 모드를 조사하였다.
화학적으로, 겜시타빈(Gemzar, Eli Lilly & Co사가 판매)은 뉴클레오사이드 유사체이다. 5-플루오로우라실(5-FU) 및 다른 피리미딘계 유사체와 같이, 겜시타빈의 트리포스페이트 유사체는 DNA 복제가 일어나는 동안 핵산의 빌딩 블록들 중 하나를 대체한다. 이 프로세스는 종양 성장을 중지시키는데, 이는 오직 하나의 부가적인 뉴클레오사이드만으로 "거짓(faulty)" 뉴클레오사이드에 부착하여, 세포자멸사를 일으킬 수 있기 때문이다.
옥살리플라틴은 DNA에서 DNA 스트랜드간(inter-strand) 및 스트랜드내(intra-strand)의 양자 모두의 교차결합을 형성함으로써 기능한다. DNA 내의 교차 결합은 DNA 복제와 전사를 방지하여, 세포 사멸에 이르게 한다(Graham, Joanne; Mushin, Mohamed; Kirkpatrick, Peter (January 2004). "Oxaliplatin". Nature Reviews Drug Discovery 3 (1): 11-2.).
겜시타빈과 옥살리플라틴의 투여량 반응 곡선은 시험된 췌장 종양 세포주에 대해 상이한 감수성을 나타내었다(도 28 및 도 29).
Figure pct00050
Patu8988S의 세포 증식을 억제하기 위해서는 고농도의 겜시타빈 (IC50 > 100 ng/ml) 또는 옥살리플라틴 (IC50 > 500 ng/ml)이 요구된다. DANG 및 BxPC3-LVT는 겜시타빈에 대해서는 매우 민감하게 반응하지만 옥살리플라틴에 대해서는 그렇지 못하다. MiaPaCa-2-LVT 세포는 옥살리플라틴에 대해서는 가장 민감하게 반응하지만 겜시타빈 처리에 대하여는 덜 민감하다 (도 28, 도 29 및 표 21).
췌장 암종 세포주에서 CLDN18 .2 발현에 미치는 화학요법제의 효과
IMAB362 결합에 의해 촉발되는 작용 모드는 그의 표적인 CLDN18.2의 존재 여부와 세포 표면 밀도에 정확하게 의존한다. DANG 및 Patu8988S 세포를 겜시타빈(Gem) 및 겜시타빈과 옥살리플라틴과의 조합(GemOx)에 의해 전처리하고, 미처리 세포 및 화학요법 전처리 세포의 RT-PCR (도 30) 및 웨스턴 블롯(도 31) 분석 하자, CLDN18.2의 mRNA 및 단백질 수준이 증가하는 결과가 초래되었다. 결론적으로, 유세포분석에 의할 때, Gem 또는 GemOx 전처리된 췌장암 세포주의 표면에서 IMAB362에 의해 표적될 수 있는 CLDN18.2 단백질의 양이 증가하였다(도 32).
DANG 및 Patu8988S를 겜시타빈으로 처리하면 CLDN18.2이 상향조절된다. Patu8988S는 Gem 처리에 의해서는 CLDN18.2의 강력한 상향조절을, GemOx 처리에 의해서는 그 보다는 낮은 상향조절을 나타낸다.
세포 주기 및 CLDN18 .2 발현에 미치는 화학요법제 화합물들의 효과
세포 주기 진행(cell cycle progression)이라 함은 하나의 세포 내에서 하나의 유사 분열과 또 다른 유사 분열 간의 일련의 이벤트들을 일컫는다. 휴지기(resting phase (G0/G1))에 이어 DNA 합성 페이즈(S)가 찾아오고, 이어서, 세포 증대 페이즈(G2) 및 DNA 복제 페이즈(M)가 나타나며 이어서 세포가 2개의 딸 세포들로 분열된다. 세포 주기의 어떠한 페이즈에서건 세포 부속물에 어떠한 간섭이 일어나도 전체 세포 주기의 진행이 저해될 수 있다. 예를 들어, 특정한 화학요법 약물은 G2 또는 M 페이즈의 진행을 차단하거나 또는 G2 및 M (G2/M) 페이즈 양자 모두의 진행을 차단할 수 있다.
DANG 또는 Patu8988S을 겜시타빈으로 처리하면 S-페이즈에서 세포 주기가 중단된다(도 33, 도 34). Gem과 함께 배양된 Patu8988S를 분석하였다. 겜시타빈 처리는 세포 주기의 중단 뿐만 아니라 CLDN18.2의 발현도 변화시킨다(도 34B). 겜시타빈 처리 후 CLDN18.2의 밀도 변화는 S 페이즈의 증식 세포와 G0/G1 페이즈 S의 휴지 세포를 비교하면 훨씬 더 심하다(도 34C). Patu8988S 세포에서, CLDN18.2는 세포 주기의 모든 페이즈에서 발현된다. 겜시타빈으로 처리하면, 그의 발현은 더욱 증가하여, S 페이즈의 세포 집단에서 세포 당 CLDN18.2의 수준이 최고조에 이른다.
종양 세포 표현형의 이와 같은 작은 변화(pertubation)는 치료 항체의 생물학적 효능에 유의적인 영향을 미친다. ADCC 및 CDC는 투여량-의존적이므로 표적 구조 CLDN18.2가 증가하면 표준 화학치료법에 상승적으로 도움이 된다.
세포증식억제 화합물 존재 또는 부재하에 인간 위종양 세포주인 KatoIII 세포를 37℃ 및 5% CO2에서, 20% FCS (Perbio) 및 2 mM Glutamax (Invitrogen)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Invitrogen)에서 배양하였다. 5-FU (NeoCorp AG사의 Neofluor)를 10 또는 100 ng/ml의 농도로, 그리고 옥살리플라틴 (Hospira)을 50 또는 500 ng/ml의 농도로 시험하였다. 37℃ 및 5% CO2 6-웰 조직배양 플레이트에서 8x105 KatoIII 세포를 배지 변경없이 96 시간 동안 배양하거나 또는 72 시간 배양한 후 표준 배지에서 24 시간 배양하여 세포 주기 중단으로부터 세포를 방출시켰다. 세포들을 EDTA/트립신을 이용하여 수확, 세척 및 분석하였다.
CLDN18.2의 세포외 검출을 위해 세포들을 모노클로날 항CLDN18.2 항체 IMAB362(Ganymed) 또는 이소형-맷치된 대조군 항체(Ganymed)로 염색하였다. 제2 시약으로서 Dianova사의 염소-항huIgG-APC를 이용하였다.
세포성 DNA 함량의 측정에 기초하여 세포 주기 단계들을 알아보았다. 이 과정에 의해 세포 주기의 G1-, S- 또는 G2-페이즈의 세포들을 서로 구별할 수 있다. S-페이즈에서는 DNA 복제가 일어나는 반면 G2-페이즈에서는 세포가 성장하고 유사분열을 준비한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 BD Biosciences사의 CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit을 이용하여 세포 주기 분석을 실시하였다. BD FACS CantoII (BD Biosciences) 및 FlowJo (Tree Star) 소프트웨어를 이용하여 유세포분석 자료수집 및 분석을 수행하였다.
도 35a 및 35b의 컬럼은 세포 주기의 G1-, S- 또는 G2-페이즈의 세포 백분율을 나타낸다. 배지로 배양된 KatoIII 세포는 주로 G1-페이즈로 세포 주기가 중단된 것으로 나타났다. 5-FU로 처리된 세포들은 주로 S-페이즈에 머물렀다. 옥살리플라틴으로 처리된 KatoIII 세포들은 주로 G1- 및 G2-페이즈에 많이 나타났다. 도 35c에 나타난 바와 같이, S-페이즈 또는 G2-페이즈에서의 세포 주기 중단은 CLDN18.2의 안정화 또는 상향조절(upregulation)을 야기한다. 세포 주기의 여하한 페이즈에서건 일단 세포가 벗어나면 (도 35b) KatoIII 세포의 세포 표면 상에서의 CLDN18.2 발현이 상향조절된다(도 35d).
KatoIII 세포를 4일간 이리노테칸 또는 도세탁셀로 전처리한 다음 CLDN18.2 발현 및 세포 주기 중단에 대해 분석하였다. 이리노테칸에 의한 세포 처리는 세포 성장의 억제 및 S/G2-페이즈로의 세포 주기 중단을 투여량 의존적으로 결과시켰다(도 36). 도세탁셀에 의한 세포 처리는 세포 성장의 억제 및 G2-페이즈로의 세포 주기 중단을 투여량 의존적으로 결과시켰다(도 36).
IMAB362 유도된 항체 의존성 세포 독성( ADCC )에 미치는 화학요법의 효과
IMAB362-매개된 ADCC에 미치는(Gem) 또는 겜시타빈 + 옥살리플라틴(GemOx)의 효과를 조사하기 위해, 본질적으로 CLDN18.2를 발현하는 췌장암 세포주 Patu8988S 및 DANG에 대해 일련의 실험을 수행하였다. 전처리된 세포들의 IMAB362 매개된 세포 용해의 투여량-반응 곡선들을 배지 배양된 경우와 비교하였다.
Gem (1 ng/ml) 또는 GemOx (Gem 1 ng/ml + Ox 10 ng/ml)으로 전처리된 DANG (2일)의 투여량 반응 곡선은 미처리 표적 세포들에 비해 상방 및 좌측으로 쉬프트된다(도 37A). 종양 세포를 Gem 또는 GemOx로 처리하자 CLDN18.2의 상향조절 및 IMAB362 매개된 ADCC에 대해 더 높은 감수성이 야기되었다. 본 발명자들은 화학요법 약물로 처리한 후 DANG 세포에서 IMAB362-매개된 ADCC에 대한 EC50 값의 감소 및 더 높은 최대 세포 용해를 관찰할 수 있었다(도 37B).
건강한 인간 도너로부터 얻은 NK 세포, 단핵구, 단핵 세포 또는 기타 이펙터 세포를 비롯한 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 Ficoll Hypaque 밀도 원심분리에 의해 정제하였다. 세척된 이펙터 세포를 X-Vivo 배지에 접종하였다. CLDN18.2를 내재적으로 발현하고 위에 기원하는 KatoIII 세포들을 이 세팅에서 표적 세포로 사용하였다. 표적 세포는 살아있는 세포에 의해서만 산화되는 루시퍼 옐로우, 루시페라제를 안정적으로 발현하였다. 정제된 항CLDN18.2 항체 IMAB362를 다양한 농도로 첨가하고 이소형 대조군 항체로는 무관한(irrelevant) 키메라(chim) huIgG1 항체를 이용하였다. IMAB362 유도된 세포독성 후 남아있는 살아있는 세포의 수를 나타내는 값인 루시퍼 옐로우의 산화로부터 결과되는 발광량을 측정함으로써 샘플을 세포용해에 대해 분석하였다. 이리노테칸 (1000 ng/ml), 도세탁셀 (5 ng/ml) 또는 시스플라틴 (2000 ng/ml)에 의해 3일간 전처리된 KatoIII를 미처리된 배지 배양 표적 세포와 비교하고 IMAB362 유도된 ADCC를 정량하였다.
이리노테칸, 도세탁셀 또는 시스플라틴으로 3일간 전처리된 KatoIII 세포는 배지 배양된 표적 세포에 비해 살아있는 세포 수준이 더 낮게 나타났고(도 38a), 이리노테칸, 도세탁셀 또는 시스플라틴으로 전처리된 세포에서의 클라우딘18.2 발현은 배지 배양된 세포에 비해 증가하였다(도 38b).
또한, 이리노테칸, 도세탁셀 또는 시스플라틴에 의한 KatoIII 세포의 전처리는 ADCC를 유도하는 IMAB362의 능력을 증강시켰다 (도 38c, d).
IMAB362 유도된 CDC 에 미치는 화학요법의 효과
IMAB362의 CDC 효능을 보체 공급원으로서 인간 혈청 존재 하에 표적 세포들과 함께 인큐베이션시킴으로서 특징화하였다.
배지 배양된 MiaPaCa-2-LVT는 IMAB362 특이적 용해에 대해 7665 ng/ml의 EC50 값을 나타내었다. Gem 처리에 의해 EC50 은 최대 용해 증가에 비해 4677 ng/ml로 감소되었다(도 39).
KATO III 위암 세포를 10 ng/ml 5-FU 및 500 ng/ml 옥살리플라틴 (5-FU + OX)으로 48 시간 전처리함으로써 IMAB362-유도된 CDC에 미치는 화학요법제의 효과를 분석하였다. 화학요법제로 전처리된 KATO III 세포를 이용한 IMAB362-유도된 CDC의 대표적인 투여량 반응 곡선을 도 40에 나타내었다. 48 시간 동안의 종양 세포 전처리에 의해 CDC를 유도하는 IMAB362의 강도가 증가되었고, 미처리 세포에 비해 전처리된 종양세포의 최대 세포 용해가 더 높아지는 결과가 초래되었다.
실시예 8: Efficacy of IMAB362 in combination with chemotherapy in 마우스 종양 모델
앞서 단일 약제로서 IMAB362의 효과를 검사하는데 사용되었던 피하 췌장 암종 이종이식편 모델에서 Gem 또는 GemOx와 조합된 IMAB362의 항종양 활성을 시험하였다.
IMAB362로 처리된 BxPC3-LVT 또는 MiaPaCa-2-LVT 종양 산생 누드 마우스들은 염수 대조군으로 처리된 대조군 마우스에 비해 유의적인 종양 성장 지연을 나타내었다.
부가적인 IMAB362 처리 없이 최대 100 mg/kg의 겜시타빈을 이용한 화학요법 치료 결과 BxPC3-LVT 또는 MiaPaCa-2-LVT 이종이식편에 아무런 유의적인 치료 효과가 나타나지 않았다. 이와 대조적으로, 50-100 mg/kg 겜시타빈 플러스 IMAB362를 이용한 조합 치료는, 화학요법 약물 단독으로 마우스를 처리한 경우와 비교할 때 유의적인 종양 성장 억제 및 종양 산생 마우스의 생존 기간을 유의적으로 연장시키는 결과를 야기하였다 (도 41, 도 42, 도 43). 이러한 관찰 결과는 겜시타빈과 IMAB362 면역요법의 조합에 의한 상승적인 치료 효과를 가리키는 것이다.
1주일에 2 x 150 mg/kg의 고투여량으로 겜시타빈을 사용할 경우, 수립된 MiaPaCa-2-LVT 이종이식편 종양이 IMAB362 처리와 독립적으로, 종양 성장에 있어서 강력하게 저해된다(도 44A). 그러나, IMAB362와 겜시타빈과의 조합 치료로 처리된 마우스들은 단일 약제로서 겜시타빈으로 처리된 마우스들에 비해 생존기간이 유의적으로 더 연장되었다 (도 44B).
실시예 9: ZA /IL-2 치료는 Vγ9Vδ2 T-세포의 대량 증식을 야기한다
300 U/ml IL-2이 보강된 RPMI 배지에서 그리고 1 μM 졸레드론산(ZA) 존재 또는 부재 하에 PBMC를 14일간 배양하였다. CD3+ 림프구 집단 내의 Vγ9+Vδ2+ T 세포 백분율 및 CD3+Vγ9+Vδ2+ T 세포 집단 내의 CD16+ 세포 백분율 제0일과 제14일에 다색 FACS를 이용하여 구하였다.
림프구의 생존과 성장을 위해 PBMC 배양체 중의 IL-2 첨가가 요구된다. 이들은 300 U/ml IL-2가 보강된 배양체에서 효과적으로 증식한다. Vγ9 및 Vδ2 특이적인 항체를 이용하여 FACS 분석한 결과 ZA/IL-2는 Vγ9Vδ2 T 세포의 축적을 특이적으로 유도하는 것으로 나타났다. 14일 후, CD3+ 림프구 집단은 최대 80%의 Vγ9Vδ2 T 세포를 포함하였다. Vγ9Vδ2 T 세포의 일부는 CD16을 발현하는 반면, CD3+ 림프구 집단 중의 이들 세포의 농축 정도는 도너에 따라 다르지만 10-700배 였다. 배양체 중의CD16+Vγ9+Vδ2+ T 세포는 ZArk 없이 성장한 배야체에 비해 10-600배 더 높다. 본 발명자들은 시험관내 PBMCs의 ZA/IL-2 처리가 γδ T 세포의 유의적인 비율로 ADCC-매개 FcγIII 수용체 CD16의 상향 조절을 결과시키는 것으로 결론지었다.
NK 세포와 마찬가지로, ZA/IL-2 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포는 FcγRIII 수용체인 CD16에 대해 양성이며, 세포-결합된 항체는 이를 경유하여 ADCC를 촉발한다. Vγ9Vδ2 T 세포가 IMAB362와 연계하여 강력한 ADCC를 유도할 수 있는지 평가하기 위하여 일련의 실험을 실시하였다.
2명의 서로 다른 도너(#1 및 #2)로부터 유래된 PBMCs를 1 μM ZA의 존재 또는 부재 하에, 300 U/ml IL-2이 보강된 배지에서 배양하였다. 14일 후 세포들을 수확하고 CLDN18.2를 발현하는 NUGC-4 세포에 IMAB362의 농도를 증가시키면서(0.26 ng/ml - 200 ㎍/ml) 첨가하였다. 루시페라제 분석에서 특이적인 사멸을 탐지하였다. ZA의 존재 또는 부재 하, 300 U/ml IL-2에서 성장한 27명의 도너에 대해 ADCC 분석을 실시하였으며 여기서 NUGC-4가 표적 세포 역할을 한다. 각각의 도너에 대해, 투여량-반응 곡선으로부터 계산되 EC50 값 및 200 ㎍/ml IMAB362에서의 최대 특이적 사멸률을 스캐터 플롯으로 점수화하였다.
ZA/IL-2와 함께 14일간 배양된 PBMCs를 이용한 CLDN18.2-양성 NUGC-4 세포에 대해 강력한 IMAB362-의존성 ADCC 활성이 관찰되었다. ZA/IL-2-처리된 PBMC 배양체를 이용하면, ADCC는 Vγ9Vδ2 T 세포의 존재에 의존한다. ZA 부재하에 세포들이 배양된 경우, ADCC 활성은 대부분의 도너에서 감소한다. 이들 배양체에서, 잔여 ADCC 활성은 NK-세포 의존적이다. 20명이 넘는 도너들을 테스트한 결과, ADCC 분석에 의해 PBMCs의 ZA/IL-2 처리는 IL-2 단독의 존재 하에 배양된 PBMCs의 경우에 비해 EC50 및 최대 특이적 사멸률을 향상시킨 것으로 나타났다.
실시예 10: 마우스 전이 모델에 있어서 겜시타빈과 조합된 IMAB362 의 효능:
Patu8988S 폐 전이암에 대하여 겜시타빈과 조합된 IMAB362의 생체내 효과를 분석하기 위하여, 그룹 당 12 Hsd:Athymic Nude-Foxn1 nu 마우스들의 꼬리 정맥 내로 2x106 Patu8988S 세포를 정맥 주사하여 처리하였다. 종양 세포를 주사한지 14일 후 주2회 마우스들을 200 μg IMAB362 또는 대조군으로서 PBS (i.v./i.p.) 플러스 주1회 100 mg/kg 겜시타빈을 복강투여하되 이 처리는 4주일간 실시하였다. IMAB362 또는 PBS 처리는 종양 세포 주사 후 제70일에 마우스들을 희생시킬 때까지 유지하였다. 폐 내에 로딩된 이종이식편 종양 분석을 준비된 폐 내의 인간 DNA의 QPCR 및 항-인간 MHC-I 항체(클론 EPR1394Y)에 의한 면역조직학적 염색의 광학 분석에 의해 실시하였다. 그 결과 IMAB362 플러스 겜시타빈으로 처리된 마우스들은 그들의 폐 내의 인간 DNA의 양이 유의적으로 감소된 것으로 나타났고(도 45A) 및 무관한 항체 플러스 겜시타빈으로 처리된 마우스들의 폐에서보다 인간 MHC-1 복합체에 대하여 염색된 폐의 슬라이스 표면적이 유의적으로 더 적은 것으로 나타났다(도 45B). 두 가지 방법들 모두 IMAB362 플러스 겜시타빈으로 처리된 마우스들의 폐에서 Patu8988s 이종이식편의 종양 로드량이 감소되었음을 나타내며, 이는 IMAB362과의 조합이 겜시타빈을 이용한 단독요법에 비해 유의적으로 더 우수함을 가리키는 것이다.
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
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Claims (39)

  1. (i) CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에 있어서 췌장암을 치료 또는 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, CLDN18.2의 발현은 암 세포의 세포 표면에서 일어나는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 세포 주기를 중단시키거나 또는 세포 주기의 하나 이상의 페이즈, 좋기로는 G1-페이즈가 아닌 세포 주기의 하나 이상의 페이즈, 더욱 좋기로는 G2-페이즈 및/또는 S-페이즈에 세포를 축적시키는 것을 유도하는 물질을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 뉴클레오사이드 유사체, 백금 화합물, 캄토테신 유사체, 탁산, 이의 전구약물, 이의 염 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 파클리탁셀, 이의 전구약물, 이의 염 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있엇, CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질은 면역원성 세포 사멸을 유도하는 물질을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 면역원성 세포 사멸을 유도하는 물질은 옥살리플라틴을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 겜시타빈과 옥살리플라틴과의 조합, 겜시타빈과 시스플라틴과의 조합, 겜시타빈과 카르보플라틴과의 조합 또는 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물과 이리노테칸과의 조합을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 폴린산, 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실 또는 그의 전구약물 및 이리노테칸을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  10. (i) CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) 겜시타빈을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에 있어서 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 암은 췌장암인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 γδ T 세포를 자극하는 물질을 투여하는 것을 더 포함하되, 여기서 γδ T 세포는 좋기로는 Vγ9Vδ2 T 세포인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, γδ T 세포를 자극하는 물질은 비스포스포네이트인 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, γδ T 세포를 자극하는 물질은 질소-함유 비스포스포네이트 (아미노비스포스포네이트)인 것인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, γδ T 세포를 자극하는 물질은 졸레드론산,클로드론산, 이반드론산, 파미드론산, 리세드론산, 미노드론산, 올파드론산, 알렌드론산, 인카드론산 및 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, γδ T 세포를 자극하는 물질은 인터류킨-2와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 CLDN18.2의 제1 세포외 루프에 결합하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 보체 의존성 세포독성(CDC)에 의해 매개된 용해, 항체 의존성 세포독성(ADCC)에 의해 매개된 용해, 세포자멸사의 유도 및 증식 억제 중 한 가지 이상에 의해 세포 사멸을 매개하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체는 (i) 수탁번호 DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, 또는 DSM ACC2810으로 기탁된 클론에 의해 생산되거나 및/또는 상기 클론에 의해 수득가능한 항체, (ii) 상기 (i)의 항체의 키메라 항체 또는 인간화 항체, (iii) 상기 (i)의 항체의 특이성을 갖는 항체 및 (iv) 상기 (i)의 항체의 항원 결합부 또는 항원 결합 자리, 특히 가변부를 포함하고 좋기로는 상기 (i)의 항체의 특이성을 갖는 것인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체인 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체를 최대 1000 mg/m2의 투여량으로 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체를 300 내지 600 mg/m2의 투여량으로 반복적으로 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 CLDN18.2 양성인 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN18.2는 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 췌장암은 원발암, 진행암 또는 전이암 또는 이의 전이암, 예컨대 췌장의 원발암과 전이암과의 조합을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 전이암은 림프절, 난소, 간, 또는 폐로의 전이암, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 췌장암은 췌관의 암을 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 췌장암은 선암종 또는 암종 또는 이의 조합을 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 췌장암은 관형 선암종, 점액성 선암종, 신경내분비암종 또는 세엽세포암종, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 췌장암은 겜시타빈 단독요법과 같은 겜시타빈 치료에 대해 부분적으로 또는 완전히 무반응성인 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 췌장암의 예방은 췌장암의 재발을 예방하는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 환자는 췌장암 수술을 받은 적이 있는 환자인 방법.
  32. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 환자는 전암성 췌장암 병변, 특히 췌관 내 악성 조직학적 변화가 일어나기 시작한 것을 포함하는 전암성 췌장 병변을 갖는 환자인 방법.
  33. (i) CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질을 포함하는 췌장암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조제물.
  34. 제33항에 있어서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체를 포함하는 제1 용기 및 CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 물질을 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트 형태로 존재하는 것인 의약 조제물.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 췌장암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조제물의 사용 지침 인쇄물을 더 포함하는 것인 의약 조제물.
  36. (i) CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체 및 (ii) 겜시타빈을 포함하는 의약 조제물.
  37. 제36항에 있어서, 암, 특히 췌장암을 치료 또는 예방하기 위한 것인 의약 조제물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 항체를 포함하는 제1 용기 및 겜시타빈을 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트 형태로 존재하는 것인 의약 조제물.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암, 특히 췌장암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조제물의 사용 지침 인쇄물을 더 포함하는 것인 의약 조제물.
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