CN101578365A - 血管内皮细胞结合性肽 - Google Patents
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Abstract
本发明的由序列编号1～76中任一序列编号所示的氨基酸序列组成的肽、由在这些氨基酸序列中1个或数个氨基酸被替换、缺失、插入或添加的氨基酸序列组成、且具有结合或被摄入活化的血管内皮细胞的能力的肽、或者含有以上述肽作为部分序列、且具有结合或被摄入活化的血管内皮细胞的能力的肽是特异结合新生血管内皮细胞的新颖的肽配体，这样的配体可以有效地用于实体肿瘤等伴随着血管新生的疾病的治疗、诊断的目的。
Description
技术领域
本发明涉及对血管内皮细胞具有亲和性的肽。具体地，本发明涉及对活化的血管内皮细胞具有特异结合性的肽。
背景技术
如公知的那样，血管在向全身组织运送以氧为代表的各种养分、细胞中具有重要的作用。血管新生是形成新的血管的基础过程，该过程对个体发生、组织成长、创伤治愈等诸多正常生理现象是不可缺少的。另外，血管新生在若干病态表现中也是重要的，特别是在实体肿瘤的增殖和转移中的作用受到高度关注。除了肿瘤以外，还已知血管新生与关节炎、牛皮癣和糖尿病性网膜症、增龄性黄斑变性症等多种疾病之间的关系。
广泛已知的是，在实体肿瘤中，癌细胞为了获得对自身的增殖而言必要的氧、营养成分等的供给，在肿瘤组织内形成新的血管的现象；已经清楚了对该血管新生所必要的各种血管新生促进因子是由肿瘤细胞产生的。这样的诱导血管新生的因子之一是血管内皮细胞生长因子(VEGF)，使用针对血管内皮细胞生长因子的中和抗体来抑制肿瘤组织中的血管新生的尝试已经作为抗体药被实际应用，近年开始了在临床上的使用，据报道显示出所期待的抗肿瘤效果(非专利文献1)。
作为以肿瘤组织中的新生血管为靶的肿瘤治疗，除了上述抑制血管内皮生长因子的方法外，还考虑了特异地将药物递送至新生血管内皮细胞，引起该内皮细胞的损伤或增殖抑制的方法。另外，也能够期待通过提高新生内皮细胞周围的抗癌剂浓度而提高作用于癌细胞的药物浓度，获得抗癌作用。在这样的方法中，重要的点是获得特异结合新生血管内皮细胞的配体。作为该新生血管内皮细胞特异的配体，虽然若干报导报告了与所报告的在新生血管内皮细胞中表达提高的VEGF受体或αv整联蛋白等结合的肽(非专利文献2)，但在体内确认到足够有效性的肽少，现状是处于研究的初期阶段。认为在新生血管内皮细胞中，除了上述分子之外，还存在表达提高的多种未知分子，期待通过探索针对这样的未知分子的配体，能获得具有更高有效性的配体。
非专利文献1：Herbert Hurwitz和其它14人，“针对转移性大肠癌的贝伐单抗+伊立替康、氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸(Bevacizumab plusIrinotecan，Fluorouracil，and Leucovorin for Metastatic ColorectalCancer)”，New Engl J Med，2004年，第350卷，第2335-2342页，
非专利文献2：Arap Wadih和其它2人，“在小鼠模型中通过向肿瘤血管选择性递送药物的癌治疗(Cancer Treatment of Targeted DrugDelivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model)”，Science，1998年，第279卷，第377-380页。
发明内容
发明欲解决的课题
本发明的目的是提供特异结合新生血管内皮细胞的新的肽配体。
解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明人进行了自随机文库筛选这样的肽序列的研究，所述肽序列结合添加了肿瘤细胞株的培养上清的经培养的活化人血管内皮细胞，即，肿瘤新生血管内皮的模型细胞，但不结合未添加肿瘤细胞株的培养上清的经培养的人血管内皮细胞，即，正常血管内皮的模型细胞，从而获得了具有目的特性的肽。
即，本发明具有以下构成。
(1)(A)、(B)或(C)中任一项所述的肽。
(A)由序列编号1～76中任一序列编号所示的氨基酸序列组成的肽。
(B)在序列编号1～76中任一序列编号所示的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸被替换、缺失、插入或添加的序列，且具有结合或被摄入活化的血管内皮细胞的能力的肽。
(C)含有以所述(A)或(B)的肽作为部分序列，且具有结合或被摄入活化的血管内皮细胞的能力的肽。
(2)编码(1)中所述的肽的核酸。
(3)肽结合体，其特征在于(1)中所述的肽与亲水性高分子结合。
(4)医药组合物，其特征在于含有(1)中所述的肽。
(5)使用(1)中所述的肽，使药物积聚在新生血管的方法。
发明的效果
能够期待本发明的肽特异地积聚在实体肿瘤等病变组织中存在的新生血管，利用该性质，本发明的肽能够用于伴随着血管新生的各种疾病的治疗、诊断。
附图简述
[图1]是显示通过ELISA法测定的各噬菌体克隆向活化HUVEC和非活化HUVEC的结合性的结果图。
[图2]是显示克隆6的共焦荧光显微镜观察结果的照片代用图。
[图3]是通过共焦激光显微镜观察的荧光标记肽-BSA复合体被摄入HUVEC细胞和HeLa细胞的照片代用图。
[图4]是将荧光标记的多臂(multiarm)PEG-肽复合体投与荷瘤小鼠24小时后，对肿瘤组织切片免疫染色，然后通过荧光显微镜观察的照片代用图。
[图5]是使内封有阿霉素的肽修饰脂质体作用于HUVEC，显示用阿霉素定量此时细胞内摄入量的结果的图。
用于实施发明的最佳方案
本发明的肽是由序列编号1～76所示的氨基酸序列组成的肽，或者是在序列编号1～76中任一序列编号所示的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸被替换、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有结合或被摄入活化的血管内皮细胞的能力的肽。
本文中，替换、插入或添加的氨基酸与是否在自然界存在无关，只要是具有羧基和氨基的分子即可，也可以是经生物体内常见的羟化、磷酸化、或糖基化等翻译后修饰的氨基酸。优选地，是包含哺乳类细胞内通常存在的天然氨基酸和其旋光异构体的氨基酸序列，例如包含精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)等的氨基酸序列。
替换、缺失、插入或添加的氨基酸的数优选为1～7个，更优选为1～5个，更优选为1～3个。在通过替换、缺失或插入而变异的序列中，优选序列编号1～76中任一序列编号所示的原始氨基酸序列的4个以上氨基酸的连续排列被保留，更优选6个以上氨基酸的连续排列被保留。
另外，本发明包含这样的肽，所述肽含有以上述肽，即，由序列编号1～76所示的氨基酸序列组成的肽、或者在序列编号1～76中任一序列编号所示的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸被替换、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有结合或被摄入活化的血管内皮细胞的能力的肽，作为部分氨基酸序列，且具有结合或被摄入活化的血管内皮细胞的能力。
另外，本发明所述的肽广义地指2个以上的氨基酸通过酰胺键键接的物质，包含数十至数百或数千的氨基酸键接的通常称为蛋白质的物质。
本发明中所述的血管内皮细胞是构成血管内表面的细胞，优选使用人内皮细胞或其它的哺乳动物内皮细胞。包含人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)、人皮肤微小血管内皮细胞或人肺微小血管内皮细胞(HMVEC)等，但不限于此。
本发明中所述的活化的血管内皮细胞是指在已知促进血管新生的各种因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管生成素(angiopoietin)等，或者这些因子的混合物的存在下培养的内皮细胞。或者，是指在肿瘤细胞产生的任意因子的存在下培养的内皮细胞。能够预期在肿瘤细胞产生的因子的存在下进行培养的内皮细胞，如将肿瘤细胞的培养上清添加至培养基后培养的内皮细胞，能够高度模仿构成实体肿瘤组织中所诱导的新生血管的内皮细胞的性质，因此特别优选使用。作为文中所使用的肿瘤细胞，可以广泛使用人或其它的哺乳动物来源的各种脏器肿瘤细胞。例如，可以例举肝癌来源的HuH-7细胞、乳癌来源的MCF-7细胞、卵巢癌来源的OVCAR-3细胞、卡波西肉瘤来源的KSIMM细胞、大肠癌来源的LOVO细胞、胃癌来源的MKN-45细胞、前列腺癌来源的DU145细胞、肺癌来源的A549细胞、脑肿瘤来源的U-87MG细胞、皮肤癌来源的SK-MEL-5细胞、膀胱癌来源的T24细胞、胰腺癌来源的PANC-1细胞、肾癌来源的GRC-1细胞等。
对在这些血管新生促进因子或肿瘤细胞产生的因子的存在下培养内皮细胞的时间没有特别的限定，作为受到充分的作用且细胞不过度增殖的条件，优选2小时以上至72小时以内，更优选8小时以上至48小时以内。
作为在肿瘤细胞产生的任意因子的存在下进行培养的方法，有单独进行肿瘤细胞的培养，回收培养上清，然后将培养上清添加至内皮细胞的培养基的方法，或者使用不透过细胞但能透过各种蛋白、低分子等的滤器，向滤器的一边加入血管内皮细胞而向另一边加入肿瘤细胞进行培养的方法等。为了获得再现性良好的具有恒定性质的活化内皮细胞，优选单独进行肿瘤细胞的培养，回收培养上清，然后将培养上清添加至内皮细胞的培养基的方法。
本发明中所述的具有结合血管内皮细胞的能力的肽是指与血管内皮细胞表面存在的分子(细胞表面分子)通过化学的或物理的相互作用，能够停留在该细胞表面上的肽，也称为血管内皮细胞结合性肽。作为本文中所述的细胞表面分子，可以例举如脂质、蛋白质、多糖类等，但不限于此。另外，该相互作用可以是单一的细胞表面分子或多个细胞表面分子。
本发明中所述的具有被摄入血管内皮细胞的能力的肽是指具有这样性质的肽，所述性质为肽与该细胞接触后，能够通过细胞膜并侵入细胞内部。作为通过细胞膜的手段，可以例举如胞吞，但不限于此。在本发明中，具有被摄入血管内皮细胞的能力的肽也包含在血管内皮细胞结合性肽中。
本发明的肽结合或被摄入血管内皮细胞的能力例如能够使用共焦激光显微镜观察、流式细胞术、荧光强度计等评价。例如，关于使用共焦激光显微镜的评价方法，下文记载了一个例子，但不限于此。首先，将96孔微量培养板(玻璃底板，Nunc公司编号164588)预先用100μl 1％酸性胶原溶液处理10分钟，用120μl PBS洗1次后，播种1x 105个/ml的HUVEC细胞100μl，在37℃5％CO2条件下培养2天。使用时，将细胞用150μl的培养基(含2％胎牛血清的EBM-2培养基(Cambrex Bio Science公司，含有生长因子)洗1次，添加50μl同样的培养基和50μl用培养基稀释荧光标记的肽或荧光标记的肽-高分子复合体所得的肽浓度20μM的溶液，在37℃5％CO2条件下培养8小时(与细胞反应时的肽浓度为10μM)。通过使用共焦激光显微镜(Olympus公司FV1000)观察反应后的细胞，研究肽来源的荧光是存在于细胞表面或细胞内部，能够评价结合或被摄入血管内皮细胞的能力。
能够通过常规的化学合成法制造本发明的肽。制造方法包含通常的通过液相法和固相法的肽合成法。这样的肽合成法中，包含基于氨基酸序列的信息，使各氨基酸一个一个逐次结合而延长链的逐步延伸法；和预先合成由数个氨基酸组成的片段，接下来使各片段偶联反应的片段缩合法。本发明的肽的合成可以使用任一所述方法。
上述肽合成中所采用的缩合法也可以根据公知的各种方法进行。作为其具体例，可以例示例如叠氮法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、氧化还原法、DPPA(叠氮磷酸二苯酯)法、向DCC添加1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧基酰亚胺等的方法、伍德瓦德法等。能够用于每一这些方法中的溶剂也能自熟知在这种肽的缩合反应中使用的常规的溶剂中合适地选择。作为其例子，可以例举例如二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、六甲基磷酰三胺、二噁烷、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯等溶剂、或者这些溶剂的混合溶剂等。
在进行上述肽合成反应时，将不参与反应的氨基酸或肽中的羧基通常能够通过酯化以例如甲酯、乙酯、叔丁酯等低级烷基酯，以例如苄酯、对甲氧基苄酯、对硝基苄酯等芳烷基酯等保护。另外，对于侧链具有官能基的氨基酸如Tyr的羟基，根据需要，也可以使用乙酰基、苄基、苄氧羰基、叔丁基等保护。进一步地，例如Arg的胍基可以通过硝基、甲苯磺酰基、2-甲氧基苯磺酰基、亚甲基-2-磺酰基、苄氧羰基、异冰片基氧基羰基、金刚烷基氧基羰基等适当的保护基保护。具有上述保护基的氨基酸、肽和最终得到的本发明的肽中这些保护基的脱保护反应也可以按照惯用的方法实施，其中所述惯用的方法例如接触还原法、或使用液体氨/钠、氟化氢、溴化氢、氯化氢、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸等的方法等。
另外，本发明的肽可以通过使用基因工程学手法的常规方法调制。由此获得的本发明的肽可以按照常规方法，例如按照离子交换树脂、分配色谱、凝胶色谱、亲和层析、高效液相色谱(HPLC)、逆流分配法等在肽化学领域广泛应用的方法，合适地进行纯化，
另外，还可以将本发明的肽以与其它物质结合的状态使用。结合可以是化学的、物理的，也可以是在本发明的肽和其它物质之间插有接头。作为被结合的其它物质，具体地可以例举高分子、脂质、糖、低分子化合物，其中，从提高血中滞留性、和通过高密度修饰能够期待簇效果的点等出发，优选亲水性高分子。本文中所述的亲水性高分子可以例举化学合成的合成高分子和多糖类、核酸、蛋白质等生物体(天然)高分子，其中优选使用合成高分子，更优选使用其中的聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)等，其中从血中滞留性良好的点出发，特别适宜地使用PEG。
作为使肽与亲水性高分子结合的方法，可以例举利用导入至亲水性高分子的反应基的方法。作为导入的反应基，优选与肽中存在的SH基、OH基、COOH基、NH2基中的任一基团反应的反应基，可以例举例如马来酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基、二硫代吡啶基、NH2基、COOH基、OH基、SH基，但不限于此。一般而言，为了使PEG与肽中存在的-NH2基、-COOH基、-OH基、-SH基这样的官能基反应，已知可以使PEG功能化，从而含有适当的反应基，例如使用末端导入了马来酰亚胺基的PEG(例如，日本油脂生产的多臂PEG、SUNBRIGHT PTE-200MA)，通过使其与肽中存在的-SH基反应，能够获得肽-PEG修饰体。
另外，本发明的肽可以作为含有生物学活性的药物和本发明的肽这两者的医药组合物使用。医药组合物内的本发明的肽和药物优选形成缀合物。本文中所述的缀合物表示2个以上的物质能同时运动的状态，包含这些物质间通过共价键键合的缀合物、通过离子键静电结合的缀合物、也包含即使在不存在结合的情形下，通过立体构造，另一个已限制另一个的运动而处于能够同时运动状态的缀合物。包含例如表面修饰有本发明的肽的胶束、脂质体、高分子等微粒子中封入有生物学活性的药物所产生的物质等也形成缀合物。
作为药物的种类，考虑使用具有抑制或促进细胞增殖的活性的各种药物。在以肿瘤新生血管作为靶的治疗中，能够使用作为抗癌剂使用的阿霉素、紫杉醇、顺式铂氨、奥沙利铂、5-FU、CPT-11、丝裂霉素C等各种药物。
另外，也优选使用抗体等蛋白药、siRNA、适体等核酸药等所谓生物医药品。在作为药物使用蛋白质的情形时，作为本发明的肽和蛋白质的缀合物，也可以使用制备的融合蛋白质。在这种情况下，对使本发明的肽结合的位置没有特别的限定，优选肽呈现在蛋白质的外侧且对融合的蛋白质的活性、功能的影响小，期望位置为氨基末端或羧基末端。
在制备与本发明的肽融合的融合蛋白质时，可以根据常规的化学合成法进行。作为例示的是，混合本发明的肽和蛋白药物然后添加缩合剂使结合的方法、和使用肽合成装置(例如Applied Biosystems Medel 433)的方法。另外，可以基于碱基序列信息，使用基因工程学的手法，根据常规方法制造。作为例子的是，在具有蛋白表达启动子的基因表达载体中整合入编码本发明的肽和所融合的蛋白质的碱基序列而制造的方法。
作为本发明的医药组合物，可以例举由本发明的肽和药物、以及药学上容许的添加剂组成的粉末形态、或由本发明的肽和药物、以及水等介质和与该介质以外的药学上容许的基剂的混合物等组成的液状形态、进一步地通过与药学上容许的基剂的组合而固形化或半固形化的形态等。作为所述基剂，可以例举作为制剂原材料而惯用的各种有机或无机物质，可以例举例如赋形剂、润滑剂、结合剂、崩解剂、溶剂、溶解辅助剂、悬浮剂、等张化剂、缓冲剂、无痛化剂、吸收促进剂等。
可以期待本发明所获得的肽特异地积聚至实体肿瘤等病变组织中存在的新生血管，利用所述性质，可以用于各种疾病的治疗、诊断。例如，作为应抑制新生血管的癌种类，可以例举乳癌、皮肤癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肝癌、脑肿瘤、食道癌、膀胱癌、子宫颈癌、脂肪肉瘤、上皮癌、肾细胞癌、胆囊腺癌、耳下腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、子宫内膜瘤、多药耐性癌等。另外，作为癌以外的疾病，可以例举慢性关节性风湿病、牛皮癣、变形性关节症等慢性炎症、和增龄性黄斑变性症、糖尿病性网膜症、新生血管青光眼等网膜症等的疾病，但不限于这些疾病。
通过将含有生物学活性的药物和本发明的肽这两者的医药组合物投与活体，则使药物积聚在病变组织的新生血管成为可能。不特别限制医药组合物的投与方法，可以例举例如通过注射的方法、经口投与、经肺投与、经鼻投与、点眼投与等。优选通过注射投与，特别是静脉或动脉等向血管内的投与由于能够使药物有效送达新生血管病变部位，因此是优选的方法。
本发明的医药组合物投与活体时的投与量和投与次数可以根据与所述肽组合的药物、投与形态、患者的年龄、体重、症状的严重程度而适宜地选择，通常成年男性每日投与0.1μg～10g、优选地1μg～1000mg的范围。
实施例
以下，为了详细地说明本发明例举了实施例，但本发明不限于实施例。
实施例1活化血管内皮细胞结合噬菌体的筛选
<方法>
1.肿瘤细胞培养上清的调制
在7ml含5％胎牛血清的DMEM培养基中稀释人肝癌细胞株HuH-7，置于25cm2培养瓶中，于37℃5％CO2存在下进行24小时培养。培养至细胞密度为约70％汇合的状态。回收培养液，1000转/分钟离心5分钟回收上清。回收的培养上清保存在-30℃，直至使用时。
2.活化的正常人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)的调制
在噬菌体文库筛选中使用的正常人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)(Cambrex Bio Science公司)预先在含2％胎牛血清的EBM-2培养基(Cambrex Bio Science公司，含有生长因子)中以1x 104个/ml、1ml/孔的密度播种至12孔板，进行48小时的培养。用PBS洗3次，向一部分孔添加上述调制的0.5ml HuH-7肝癌细胞培养上清和0.5ml EBM-2培养基(不含生长因子)，向另一部分孔添加0.5ml含5％FCS的DMEM培养基和0.5mlEBM-2培养基(不含生长因子)，进行24小时的培养。将添加了HuH-7肝癌细胞培养上清所培养的细胞作为“HuH-7上清培养的HUVEC”，将添加了DMEM培养基所培养的细胞作为“DMEM培养的HUVEC”用于以下的筛选。
3.自噬菌体文库的筛选
作为噬菌体肽文库，使用15mer或12mer的随机氨基酸序列作为噬菌体pIII蛋白的融合蛋白而展现的M13噬菌体文库。用PBS洗上述2调制的DMEM培养的HUVEC 3次，添加1ml含有1.2x 1010TU(转化单位)噬菌体的0.1％牛血清白蛋白(BSA)/磷酸生理缓冲液(PBS)，室温反应30分钟。回收反应液(没有结合的噬菌体)，此时添加上述2调制的HuH-7上清培养的HUVEC(预先用PBS洗3次)，室温反应30分钟。反应后的细胞用PBS洗3次后，添加0.5ml酸性溶离液(含有0.1％BSA的0.1M甘氨酸盐酸pH2.4)，反应1分钟，使结合的噬菌体解离。回收溶离液，1200转/分钟离心5分钟回收上清，添加125μl 1M Tris盐酸(pH8.0)中和。添加该溶液至DMEM培养的HUVEC(预先用PBS洗3次)，室温反应30分钟后回收上清，从而获得了选择性结合HuH-7上清培养的HUVEC的噬菌体。
将获得的噬菌体溶液感染对数增殖期的大肠杆菌，通过培养进行噬菌体的扩增。培养液中产生的噬菌体通过添加PEG/NaCl溶液(含有2.5M氯化钠的20％PEG8000)而沉淀，通过离心回收进行噬菌体的纯化。
通过上述一系列的操作进行的HuH-7上清培养的HUVEC结合性噬菌体的分离和通过大肠杆菌感染的扩增为1个循环，共计进行3个循环的筛选。3个循环后的噬菌体回收液铺在LB-琼脂板上，自37℃过夜培养后得到的集落(单一克隆)随机选择数十个，分别培养，通过上述的PEG/NaCl沉淀法纯化上清的噬菌体，获得了纯化的噬菌体克隆。
4.通过细胞ELISA法分析噬菌体克隆的细胞结合性
在含2％胎牛血清的EBM-2培养基中的HUVEC以3x 104个/ml的密度播种0.1ml至96孔塑料板，37℃培养24小时，150μl PBS洗净后，向活化HUVEC调制孔中添加0.05ml HuH-7肝癌细胞培养上清和0.05mlEBM-2培养基(不含生长因子)，向非活化HUVEC调制孔中添加0.05ml含5％FCS的DMEM培养基和0.05ml EBM-2培养基(不含生长因子)，37℃培养24小时。细胞用PBS洗净后，添加用含0.1％BSA的PBS 50倍稀释的噬菌体克隆，室温反应30分钟。将反应后的细胞用150μl PBS洗3次，添加50μl含0.5％多聚甲醛的PBS，室温进行30分钟的固定化反应。用含0.05％吐温20的PBS洗3次后，添加50μl用含0.1％BSA的PBS 5000倍稀释的HRP标记的抗M13噬菌体抗体(Amersham公司)，室温反应60分钟。用含0.05％吐温20的PBS洗3次后，添加100μl HRP酶底物(含0.2μl/ml过氧化氢水和0.08mg/ml四甲基联苯胺的乙酸柠檬酸缓冲液pH4.5)，室温反应3至5分钟后，添加50μl 1N硫酸，使反应停止。使用微孔板读数仪测定450nm(对象波长595nm)的吸光度。
<结果>
各噬菌体克隆的吸光度测定结果示于图1。吸光度越大，显示对HUVEC的结合性越高。观察到50个克隆中半数以上的克隆与针对非活化HUVEC(图中为添加DMEM培养基)的结合相比较，对活化HUVEC(图中为添加HuH-7培养上清)的结合性高。
5.噬菌体克隆的序列分析
数次重复实施实施例1-1～4的筛选，选择观察到对活化HUVEC具有高结合性的共计68种克隆，感染大肠杆菌扩增后，通过分析噬菌体pIII蛋白的含有随机肽序列的区域的碱基序列，确定所展现的肽序列。
<结果>
获得了序列编号1～14和22～75所示的共计68种肽序列(表1)。
实施例2通过共焦荧光显微镜确认对HUVEC的噬菌体结合
<方法>
将HUVEC在含2％胎牛血清的EBM-2培养基中以3x 104个/ml的密度播种0.1ml至96孔玻璃底板(预先添加胶原溶液、洗净并进行了包被的板)，37℃培养24小时，用150μl PBS洗净后，向活化HUVEC调制孔中添加0.05ml HuH-7肝癌细胞培养上清和0.05ml EBM-2培养基(不含生长因子)，向非活化HUVEC调制孔添加0.05ml含5％FCS的DMEM培养基和0.05ml EBM-2培养基(不含生长因子)，37℃培养24小时。使用的细胞用PBS洗净后，添加用含0.1％BSA的PBS稀释的噬菌体克隆(噬菌体数约2x 109TU/ml)，室温反应30分钟。反应后的细胞用150μl PBS洗3次后，添加100μl含4％多聚甲醛的PBS，37℃进行10分钟的固定化反应。用PBS洗3次后，添加100μl含有0.2％TritonX-100的PBS，室温反应30分钟，再用PBS洗3次后，添加100μl含0.1％BSA的PBS，进行10分钟封闭反应。用PBS洗3次后，依次加入100μl用0.1％BSA/PBS 1000倍稀释的抗M13噬菌体抗体(Amersham公司，小鼠单克隆抗体)、100μl用0.1％BSA/PBS 2000倍稀释的荧光素标记的抗小鼠IgG抗体(ザイメツド社)、50μl用0.1％BSA/PBS 1000倍稀释的Alexa488标记的抗荧光素抗体(モレキユラ一プロ一ブ社)，分别在室温反应30分钟、30分钟、15分钟。每一反应后，将细胞用150μl PBS洗3次。用共焦激光荧光显微镜(Olympus FV1000)观察最终反应后的细胞，通过比较来自分别结合活化HUVEC、非活化HUVEC的噬菌体的发光点的数来评价细胞结合性。
<结果>
用荧光标记抗体染色结合了活化HUVEC、非活化HUVEC的噬菌体，通过共焦荧光显微镜观察，评分各噬菌体克隆分别对细胞的结合性的结果示于表2。另外，作为代表性的结果，将克隆6的共焦荧光显微镜照片示于图2。在许多克隆中观察了对活化HUVEC的特异结合。
实施例3肽的合成和高分子复合体的调制
通过Fmoc固相合成法化学合成具有实施例1所确定的碱基序列的肽。为了以被细胞的结合摄入评价为指标，在各肽的氨基末端结合荧光色素荧光素。另外，为了导入用于制备下述高分子复合体的作为官能基的巯基，在各肽的羧基末端添加半胱氨酸残基，合成序列。
为了评价各肽作为药物载体结合摄入进细胞的功能，通过下述(1)、(2)的方法，制备了荧光标记肽-高分子复合体。
(1)肽-多臂PEG复合体的制备
以2mM浓度将每1分子具有4个马来酰亚胺基的PEG(日本油脂制多臂PEG，SUNBRIGHT PTE-200MA)溶解于DMSO，将20μl该溶液与等量(20μl)的10mM荧光素标记肽DMSO溶液混合，室温反应2小时。添加60μl PBS，将总量稀释至100μl后，使用预先用500μl PBS洗3次的经平衡的旋转柱(Bio-Rad公司，Micro Bio-Spin Column 30)脱盐处理，分离除去未结合的肽，获得肽-多臂PEG复合体。
(2)肽-牛血清白蛋白(BSA)复合体的制备
将20mg BSA溶解于1ml 50mM碳酸氢钠溶液中，制备0.3mM溶液。向全量该溶液(1ml)添加20μl具有PEG链间隔子的2价交联剂NHS-PEO12-马来酰亚胺(Pierce公司生产，目录号22112)的250mM溶液(最终浓度5mM)，室温反应1小时。将100μl反应后的溶液使用预先用500μl0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗3次的经平衡的旋转柱(Bio-Rad公司，MicroBio-Spin Column 30)脱盐处理，分离除去未反应的交联剂。将50μl脱盐后的溶液与等量的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)混合、稀释，向得到的100μl溶液添加10μl荧光素标记肽DMSO溶液，室温反应1小时。将反应后的全部溶液使用预先用500μl PBS洗3次的经平衡的旋转柱(Bio-Rad公司，Micro Bio-Spin Column 30)脱盐处理，分离除去未结合的肽，获得肽-BSA复合体溶液。
实施例4荧光标记肽-PEG复合体被内皮细胞的摄入(定量分析)
<方法>
将96孔微量培养板(玻璃底板，Nunc公司编号164588)预先用100μl1％酸性胶原溶液处理10分钟，用120μl PBS洗1次后，播种1x 105个/mlHUVEC细胞100μl，37℃5％CO2条件下培养2天。使用时，将细胞用150μl培养基(含2％胎牛血清的EBM-2培养基(Cambrex Bio Science公司，含有生长因子)洗1次，依次添加50μl同样的培养基、和50μl将实施例3(1)调制的肽-多臂PEG复合体(序列编号12、13、16(序列编号14的部分序列)、77)用培养基稀释的肽浓度20μM的溶液，37℃5％CO2条件下培养8小时。(与细胞反应时的肽浓度为10μM。)培养后的细胞用150μlHBSS(+)缓冲液洗3次，除去未结合的肽-多臂PEG复合体后，添加100μl含有1％SDS的HBSS(+)，提取细胞所结合或摄入的肽。将提取液转移至另一96孔微量培养板(黑色板)，使用荧光光度计测定激发波长490nm、检测波长530nm的荧光。以添加的各肽-多臂PEG复合体的荧光强度为100％，由自细胞回收的荧光量计算细胞的肽摄入量(％)。
<结果>
各肽-多臂PEG复合体的回收率示于表3。与作为阴性对照的随机序列肽(序列编号77)比较，任一本发明的3种肽(序列编号12、13、16)均显示出高的回收率。
实施例5荧光标记的肽-BSA复合体被内皮细胞的摄入(定量分析)
<方法>
向96孔微量培养板(Corning公司编号3595)播种1x 105个/ml的HUVEC细胞100μl，在37℃5％CO2条件下培养2天。使用时，将细胞用150μl培养基(含2％胎牛血清的EBM-2培养基(Cambrex Bio Science公司，含有生长因子)洗1次，依次添加50μl同样的培养基、和50μl将实施例3(2)调制的肽-BSA复合体(序列编号12、13、16、77)用培养基稀释的肽浓度20μM的溶液，37℃5％CO2条件下培养8小时(与细胞反应时的肽浓度为10μM)。反应后的细胞所结合或摄入的肽-BSA复合体的回收和荧光定量采用与实施例3同样的方法进行。
<结果>
各肽-BSA复合体的回收率示于表4。与作为阴性对照的随机序列肽(序列编号77)比较，任一本发明的3种肽(序列编号12、13、16)均显示出高的回收率。
实施例6荧光标记的肽-BSA复合体被内皮细胞(HUVEC)和HeLa细胞的摄入(图像分析)
<方法>
将96孔微量培养板(玻璃底板，Nunc公司编号164588)预先用100μl 1％酸性胶原溶液处理10分钟，用120μl PBS洗1次后，播种1x 105个/mlHUVEC细胞100μl，37℃5％CO2条件下培养2天。使用时，将细胞用150μl培养基(含2％胎牛血清的EBM-2培养基(Cambrex Bio Science公司，含有生长因子)洗1次，依次添加50μl同样的培养基、和50μl将实施例3(2)调制的肽-BSA复合体(序列编号12、13、16、77)用培养基稀释的肽浓度20μM的溶液，37℃5％CO2条件下培养8小时(与细胞反应时的肽浓度为10μM)。使用共焦激光显微镜(Olympus公司FV1000)观察反应后的细胞。
<结果>
与各肽-BSA复合体反应的细胞的共焦激光显微镜图像示于图3。关于HUVEC细胞，任一本发明的3种肽(序列编号12、13、16)均观察到细胞内多个明亮的光点，显示了肽被摄入细胞内。作为阴性对照的随机序列肽(序列编号77)完全观察不到细胞内的肽。
另一方面，在使用作为内皮细胞以外的比较细胞HeLa的情形下，将序列编号12、13、16所示的本发明的肽进行被HUVEC摄入的比较，在HeLa细胞内仅观察到极少量的肽，表明摄入是内皮细胞特异的。
实施例7荧光标记的肽-多臂PEG复合体被内皮细胞的摄入(图像分析评分)
<方法>
将96孔微量培养板(玻璃底板，Nunc公司编号164588)预先用100μl 1％酸性胶原溶液处理10分钟，用120μl PBS洗1次后，播种1x 105个/mlHUVEC细胞100μl，37℃5％CO2条件下培养2天。使用时，将细胞用150μl培养基(含2％胎牛血清的EBM-2培养基(Cambrex Bio Science公司，含有生长因子)洗1次，依次添加50μl同样的培养基、和50μl将实施例3(1)调制的多臂PEG-肽复合体(序列编号12的肽和其部分肽(序列编号17、18、19)、序列编号13的肽和其部分肽(序列编号15、20、21)、随机序列肽(序列编号77))用培养基稀释的肽浓度32μM的溶液，37℃5％CO2条件下培养8小时(与细胞反应时的肽浓度为16μM)。使用共焦激光显微镜(Olympus公司FV1000)观察反应后的细胞。对细胞内观察到的肽来源的荧光发光点的量如下评分。
评分0：没有观察到细胞内的荧光发光点
评分1：观察到细胞内微弱的荧光发光点
评分2：观察到细胞内较评分1明确的荧光发光点
评分3：观察到细胞内许多较评分2更明亮的荧光发光点
<结果>
评分的结果示于表5。序列编号12的肽来源的部分肽(序列编号17、18、19)较原始的序列编号12的肽弱，但任一部分肽均观察到了细胞内的荧光，确认了摄入至细胞内。任一序列编号13的肽来源的部分肽(序列编号15、20、21)也观察到了细胞内的荧光，确认了摄入至细胞内。特别地，与序列编号13的肽的12mer肽的5-12个氨基酸残基相当的肽(序列编号15)观察到与序列编号13的肽同等的荧光。
另一方面，完全没有观察到作为阴性对照的随机序列肽(序列编号77)在细胞内的荧光。
实施例8荧光标记的肽-多臂PEG复合体朝向肿瘤的积聚评价
<方法>
向8周龄BALB/c小鼠(雄性)(自日本SLC购入)以1.5X106个/匹皮下移植PBS中悬浮的小鼠大肠癌细胞(colon26细胞)。1个月后，在肿瘤直径达约1.5cm的状态时，尾静脉投与200uL实施例3(1)调制的多臂PEG-肽(序列编号12和13)复合体的PBS悬浮液。投与24小时后，对小鼠实施安乐死，取出肿瘤块。将取出的肿瘤块使用OCT化合物(サクラフアインテツク社)包埋，制备冷冻块。使用恒冷切片机(ブライト社制)由该冷冻块制备肿瘤组织的冷冻切片。将得到的组织切片用冷风风干1小时。该组织切片用PBS洗净，除去OCT化合物后，通过浸在丙酮中5分钟进行固定处理。固定处理后，使用含10％胎牛血清的PBS室温作用30分钟，进行封闭处理。此时，将针对肽中修饰的荧光色素荧光素的抗体(anti-fluorescein/Oregon Green rabbit IgG fraction Alexa Fluor 488conjugate，Molecular Probes公司)和针对已知在血管内皮细胞表达的表面抗原CD31的抗体(Biotinanti-mouse CD31，BD Pharmingen公司)以100倍的稀释率作用，室温孵育2小时，进行1级抗体反应。反应结束后，用PBS洗净，然后通过使用分别针对1级抗体的荧光标记抗体(Alexa Fluor488conjugate goat anti-rabbit IgG，Molecular Probes公司和StreptavidinAlexa Fluor 594conjugate，Invitrogen公司)作用，进行2级抗体反应。2级抗体反应结束后，用PBS充分洗净，盖上盖玻片，使用荧光显微镜(IX-70，Olympus公司制)进行观察，评价肽向肿瘤组织的积聚。
<结果>
通过荧光显微镜的观察图像示于图4。观察结果是观察到肿瘤组织内来自肽的荧光，显示了静脉内投与的荧光标记肽-PEG复合体在肿瘤部位积聚。另外，肽来源的荧光的位置与通过CD31染色的位置一致，由此表明荧光标记的肽-多臂PEG复合体定位在肿瘤组织内的血管部位。
实施例9内封有阿霉素的肽修饰脂质体的调制
<方法>
将氢化大豆磷脂酰胆碱(10mg)、胆固醇(3.4mg)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(3.5mg)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-马来酰亚胺(3.1mg)溶解在氯仿中，使用蒸发器除去瓶内的溶剂，形成薄膜。向所述薄膜添加1.7mL 250mM硫酸铵水溶液，65℃加热。将得到的小泡用挤出器依次使用孔径大小1.0μm、0.4μm、0.2μm的多孔膜整粒。向调制的粒径约200nm的脂质体中通过主动载药法(remote loading method)封入阿霉素。用柱除去未封入的阿霉素后，分别添加相对马来酰亚胺1/5量的肽(序列编号12、13、76(序列编号7的部分序列)、78)，调制导入了各种肽的脂质体。添加3倍量的2-巯基乙醇失活未反应的马来酰亚胺。
实施例10内封有阿霉素的肽修饰脂质体被HUVEC的摄入(定量分析)
<方法>
对于24孔板培养的50-60％汇合的正常人脐带静脉内皮细胞，更换培养基后，添加半量培养基的内封有阿霉素的肽修饰脂质体分散液。6小时后用磷酸缓冲液洗净后，胰蛋白酶处理，通过离心操作回收细胞。向细胞沉淀添加50μl 10％Triton X-100，使细胞和内封有阿霉素的肽脂质体溶解后，添加350μL加有10％0.75M HCl的异丙醇，-20℃静置一晚。离心操作后，对上清通过ODS柱分析，定量细胞内摄入的阿霉素。
<结果>
结果示于图5。导入了序列编号12、13、76的脂质体，与导入了随机序列(序列编号78)的肽的脂质体和未导入肽的脂质体比较，阿霉素的摄入量显著提高。特别地，用导入了序列编号13的脂质体时，阿霉素摄入量较导入了序列编号12、76的情形高，是未导入肽的脂质体的约3倍。
产业上的可利用性
能够期待本发明的肽特异地积聚在实体肿瘤等病变组织中存在的新生血管，利用该性质，本发明的肽能够用于伴随着血管新生的各种疾病的治疗、诊断。
序列表
<110>东丽株式会社
<120>血管内皮细胞结合性肽
<130>660M03001
<160>78
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>1
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Leu Gln Phe Pro Leu Val Ile Pro Ile Leu Ser Ile Tyr Thr Ala
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Lys Lys Asp Leu Ile Asn Leu Ala Val Gly Phe Ile Asp Ser Phe
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GKy Met Arg Pro Arg Leu Ala Ser Asn Ser Gly Met Ser Asn Leu
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Thr Leu Pro Ser Pro Leu Ala Leu Leu Thr Val His
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Pro Phe Leu Pro Leu Tyr Val Pro
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Ala Thr Trp Ser His His Leu Ser Ser Ala Gly Leu
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His Leu Ser Ser Arg Asp Leu Ser Leu Thr Ser Leu
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<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>48
Asp Val Asn Lys Leu Leu Leu Arg Leu Pro Val Thr
1 5 10
<210>49
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>49
Ala Ile Pro Ile Gly Thr Leu Pro Lys Ile His Leu
1 5 10
<210>50
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>50
Tyr Pro Gln Ala Ser Leu Ser Thr Phe Lys Pro Leu
1 5 10
<210>51
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>51
Asn Val Phe Arg His Ala Ile Glu Gln Arg Thr Pro
1 5 10
<210>52
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>52
Ser Phe Tyr Asn Ala Asp Ser Ser Val Ser Arg Leu
1 5 10
<210>53
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>53
Trp Ser Pro Ser Gln Phe Lys Leu Asp Met Pro His
1 5 10
<210>54
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>54
Asn Ile Ala Lys Thr Ser Asn Ser Ser His Leu Pro
1 5 10
<210>55
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>55
Gly Pro Met Leu Asp Met Ala Leu Gly Pro Ala Pro
1 5 10
<210>56
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>56
Lys Ser Phe Leu Tyr Thr Pro Ala Thr Val Thr His
1 5 10
<210>57
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>57
Tyr Ala Thr Val His Thr Pro Leu Ala Trp Leu Pro
1 5 10
<210>58
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>58
Trp Met Pro Thr Lys Pro His Leu His Asn Leu Gly
1 5 10
<210>59
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>59
Glu Asn Pro Ser Pro Tyr Ile Pro Ile Pro Leu Thr
1 5 10
<210>60
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>60
Glu Val Pro Leu Thr Gln Phe Leu Trp His Gln Leu
1 5 10
<210>61
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>61
Met Ser Lys Asp Gln Pro Ser Phe Phe Arg Thr Ser
1 5 10
<210>62
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>62
His Ala Ala Tyr Leu Val Glu Trp Pro Gly Ala Gly
1 5 10
<210>63
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>63
Leu Pro Val Gln Leu Pro Val Asn Ile Ser Pro Arg
1 5 10
<210>64
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>64
Gln Leu Leu Asn Ala Leu Pro Phe Arg Leu Ala Tyr
1 5 10
<210>65
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>65
Ala Met Gly His Gly Leu Ala Lys Val Thr Thr Arg
1 5 10
<210>66
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>66
Thr Asn Ser His Ala Val Pro Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10
<210>67
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>67
Asp Ser Thr Met Met Pro Thr Val Leu Ser Thr Leu
1 5 10
<210>68
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>68
Val Ser Gly Ser Glu Thr His Thr Met Pro Leu Ala
1 5 10
<210>69
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>69
His Lys Leu Ala Thr Ser Pro Trp Trp Pro Pro Ile
1 5 10
<210>70
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>70
Ser Thr His His Arg His Tyr His Asp Thr Leu Ala
1 5 10
<210>71
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>71
Phe Ala Ser Ser His Lys Gln Ile Pro Leu Gln Leu
1 5 10
<210>72
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>72
Asp Ser Leu Tyr Thr Leu Phe Pro Arg Ser Ala Phe
1 5 10
<210>73
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>73
His Asn Pro Ile Pro Tyr Thr Ala Pro Leu Leu Phe
1 5 10
<210>74
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>74
Met Ile Asn Thr Lys Ile Pro Pro Phe Thr Arg Trp
1 5 10
<210>75
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>75
His Ala Lys Ser Gln Pro Ile Asn Ser Phe Ser Met
1 5 10
<210>76
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>设计的肽，作为血管内皮细胞结合性肽
<400>76
Val Ile Pro Ile Leu Ser Ile Tyr Thr Ala
1 5 10
<210>77
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>对照序列
<400>77
Glu Tyr Asp Leu Ser Thr Ala Gly Gly Ala Ala Ala
1 5 10
<210>78
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>对照序列
<400>78
Gly Leu Asp Lys Ser Ser Tyr Arg Ile Asp Thr Phe Ala Ala His Glu
1 5 10 15
Val Ala Gly
Claims (5)
1.以下的(A)、(B)或(C)中任一项所述的肽：
(A)由序列编号1～76中任一序列编号所示的氨基酸序列组成的肽，
(B)在序列编号1～76中任一序列编号所示的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸被替换、缺失、插入或添加的序列，且具有结合或被摄入活化的血管内皮细胞的能力的肽，
(C)含有以所述(A)或(B)的肽作为部分序列，且具有结合或被摄入活化的血管内皮细胞的能力的肽。
2.编码权利要求1中所述的肽的核酸。
3.肽结合体，其特征在于权利要求1中所述的肽与亲水性高分子结合。
4.医药组合物，其特征在于含有权利要求1中所述的肽。
5.使用权利要求1中所述的肽，使药物积聚在新生血管的方法。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112111564A (zh) * | 2020-07-31 | 2020-12-22 | 南方科技大学 | 探针及其制备方法和应用 |
| CN113366013A (zh) * | 2018-12-03 | 2021-09-07 | 株式会社海培普研究所 | 新型化合物和包含其的血管生成剂 |
-
2007
- 2007-12-21 CN CNA200780049496XA patent/CN101578365A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN112111564A (zh) * | 2020-07-31 | 2020-12-22 | 南方科技大学 | 探针及其制备方法和应用 |
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