CN109195611A - 用于car t细胞疗法的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗具有癌症的患者的方法，所述方法包括给所述患者施用包含CAR T细胞的组合物和通过接头与寻靶部分连接的小分子。本发明也涉及用于用在这样的方法中的组合物。

Description

用于CAR T细胞疗法的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请在美国法典第35篇第119(e)条下要求2016年4月8日提交的美国临时申请系列号62/320,183和2016年4月18日提交的美国临时申请系列号62/323,971的优先权，它们二者通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及治疗具有癌症的患者的方法，其通过给所述患者施用包含CAR T细胞的组合物和给所述患者施用通过接头与寻靶部分连接的小分子。本发明也涉及用于用在这样的方法中的组合物。
发明背景
基于淋巴细胞（例如，T细胞）向患者中的过继转移的免疫疗法在癌症和其它疾病的治疗中是一种有价值的疗法。在基于淋巴细胞的过继转移的免疫疗法的开发中已经做出了许多重要进展。在许多不同类型的免疫治疗剂中，正在开发中的最有前途的免疫治疗剂之一是表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)。所述嵌合抗原受体(CAR)是一种遗传工程改造的受体，其被设计成靶向特定抗原，例如，肿瘤抗原。该靶向可以产生对肿瘤的细胞毒性，例如，使得表达CAR的CAR T细胞可以经由特异性肿瘤抗原靶向和杀死肿瘤。
第一代CAR由识别区域（例如，从抗体衍生出的单链片段可变(scFv)区域，其用于识别和结合由肿瘤表达的抗原）和活化信号结构域组成，例如，T细胞的CD3ζ链可以充当CAR中的T细胞活化信号。尽管CAR T细胞已经在体外表现出积极结果，但是它们在临床试验中在消除疾病(例如，癌症)中已经获得有限的成功。一个问题是不能延长活化和在体内繁殖CAR T细胞群体。
为了解决该问题，已经在第二代CAR中包括共刺激结构域(例如CD137、CD28或CD134)来实现体内T细胞的延长活化。共刺激结构域的添加会增强含有CAR的T细胞的体内增殖和存活，且初步临床数据已经证实，这样的构建体在疾病（诸如癌症）的治疗中是有前途的治疗剂。
尽管已经在CAR T细胞疗法中做出了改善，仍然有几个问题。首先，由于表达被CART细胞靶向的抗原(例如，肿瘤相关抗原)的正常细胞，‘脱靶’毒性可能发生。其次，在CAR T细胞对患病细胞（例如，癌细胞）的快速和失控消除诱导大群代谢紊乱（在治疗肿瘤的情况下，称作肿瘤溶解综合征；或细胞因子释放综合征(CRS)，它们可能是对患者致命的）的情况下，可以发现失调的CAR T细胞活化。肿瘤溶解综合征和CRS可以由于施用的CAR T细胞（其不可容易地调节且失控地活化）而产生。因此，尽管CAR T细胞在疾病（诸如癌症）的治疗中表现出作为工具的巨大希望，但是需要另外的CAR T细胞疗法，其提供减小的脱靶毒性和CAR T细胞活化的更精确控制。
发明概述
本发明的发明人已经发现了降低脱靶毒性和更精确地控制CAR T细胞活化的方法，从而提供了CAR T细胞疗法中的重要进展。在本文描述的各个实施方案中，将通过接头与寻靶部分连接的小分子配体用作癌症和CAR T细胞之间的桥，其将CAR T细胞引导至癌症以改善所述癌症。在一个实施方案中，所述“小分子配体”可以是，例如，叶酸、DUPA、NK-1R配体、CAIX配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体或CCK2R配体，其中的每一种是特异性地结合癌细胞的小分子配体(即，这些配体的受体在癌症上相对于正常组织而言过表达)。
在一个实施方案中，所述“小分子配体”连接至“寻靶部分”，所述“寻靶部分”结合由CAR T细胞表达的CAR。在不同的实施方案中，所述“寻靶部分”可以选自，例如，2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛配基、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、五氟苯基酯(PFP)、四氟苯基酯(TFP)、knottin、centyrin和DARPin。
所述“寻靶部分”会结合由CAR T细胞表达的遗传工程改造的CAR的识别区域。因此，所述CAR的识别区域(例如，抗体的单链片段可变区(scFv))是指“被靶向的部分”。因而，通过接头与寻靶部分连接的小分子配体充当癌症和CAR T细胞之间的‘桥’，其将CAR T细胞引导至癌症以改善所述癌症。
在一个示例性实施方案中，发明人已经发现，改变通过接头（即，桥）与寻靶部分连接的小分子配体的剂量，可以产生控制体内CRS的能力。在另一个实施方案中，发明人已经发现，改变与寻靶部分连接的小分子配体中的接头(桥)可以在CAR T细胞活化后控制体内CRS。在另一个实施方案中，这些方法的组合可以用于精确地控制CAR T细胞活化和体内细胞因子释放。在另一个实施方案中，可以改变所述小分子配体对它在癌症上的受体的亲和力以控制CAR T细胞活化，或实现对所述癌症的特异性，从而避免对正常组织的毒性。
在一个实施方案中，提供了一种治疗癌症的方法。所述方法包括：i)给患者施用第一剂量化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包含通过接头与寻靶部分连接的小分子配体，ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR，ii)给所述患者施用第二剂量所述化合物或其药学上可接受的盐，其中所述第二剂量不同于所述第一剂量，和治疗所述患者以改善所述癌症。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗癌症的方法。所述方法包括：i)给所述患者施用第一种缀合物或其药学上可接受的盐，ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR，iii)给所述患者施用第二种缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述第一种和所述第二种缀合物各自包含通过接头与寻靶部分连接的小分子配体，且其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物是不同的，和iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗癌症的方法。所述方法包括：i)给患者施用第一剂量第一种缀合物或其药学上可接受的盐，ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR，ii)给所述患者施用第二剂量第二种缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物各自包含与寻靶部分连接的小分子配体，其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物是不同的，且其中所述第一剂量和所述第二剂量是不同的，和iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
在另一个示例性实施方案中，提供了一种CAR T细胞，其包含含有SEQ ID NO:1的核酸。在另一个方面，提供了一种CAR T细胞，其包含含有SEQ ID NO:2的多肽。在另一个实施方案中，提供了一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO:1且编码嵌合抗原受体。在另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:2的嵌合抗原受体多肽。在另一个方面，提供了包含SEQID NO:1的载体。在另一个示例性实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:1的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
下述列举的条款也描述了几个实施方案：
1. 一种治疗癌症的方法，所述方法包括
i)给患者施用第一剂量化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包含通过接头与寻靶部分连接的小分子配体；
ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR；
ii)给所述患者施用第二剂量所述化合物或其药学上可接受的盐，其中所述第二剂量不同于所述第一剂量；和
iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
2. 一种治疗癌症的方法，所述方法包括
i)给所述患者施用第一种缀合物或其药学上可接受的盐；
ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR；
iii)给所述患者施用第二种缀合物或其药学上可接受的盐，
其中所述第一种和所述第二种缀合物各自包含通过接头与寻靶部分连接的小分子配体，且其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物是不同的；和
iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
3. 一种治疗癌症的方法，所述方法包括
i)给患者施用第一剂量第一种缀合物或其药学上可接受的盐；
ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR；
ii)给所述患者施用第二剂量第二种缀合物或其药学上可接受的盐，
其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物各自包含与寻靶部分连接的小分子配体，其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物是不同的，且其中所述第一剂量和所述第二剂量是不同的；和
iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
4. 条款2或3的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头是不同的。
5. 条款2或3的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头是相同的。
6. 条款2-5中的任一项的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体是不同的。
7. 条款2-5中的任一项的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体是相同的。
8. 条款2-7中的任一项的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分是不同的。
9. 条款2-7中的任一项的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分是相同的。
10. 条款1-9中的任一项的方法，其中所述配体选自叶酸、DUPA、NK-1R配体、CAIX配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体和CCK2R配体。
11. 条款10的方法，其中所述配体是叶酸。
12. 条款10的方法，其中所述配体是NK-1R配体。
13. 条款10的方法，其中所述配体是DUPA。
14. 条款10的方法，其中所述配体是CCK2R配体。
15. 条款10的方法，其中所述配体是γ谷氨酰基转肽酶的配体。
16. 条款1-15中的任一项的方法，其中所述寻靶部分选自2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛配基、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、五氟苯基酯(PFP)、四氟苯基酯(TFP)、knottin、centyrin和DARPin。
17. 条款16的方法，其中所述寻靶部分是FITC。
18. 条款16的方法，其中所述寻靶部分是DNP。
19. 条款16的方法，其中所述寻靶部分是TNP。
20. 条款1-19中的任一项的方法，其中所述接头包含聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、亲水氨基酸、糖、非天然的肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和/或pluronic F-127。
21. 条款20的方法，其中所述接头包含PEG。
22. 条款1-21中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐具有下式
其中B代表小分子配体，L代表接头，且T代表寻靶部分，且其中L包含具有下式的结构
其中n是0-200的整数。
23. 条款22的方法，其中n是0-150的整数。
24. 条款22的方法，其中n是0-110的整数。
25. 条款22的方法，其中n是0-20的整数。
26. 条款22的方法，其中n是15-20的整数。
27. 条款22的方法，其中n是15-110的整数。
28. 条款1-27中的任一项的方法，其中所述接头包含PEG，且所述寻靶部分是FITC或其药学上可接受的盐。
29. 条款1-28中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约10 nmol/kg至约3000 nmol/kg患者体重。
30. 条款1-29中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约50 nmol/kg至约2000 nmol/kg患者体重。
31. 条款1-30中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约100 nmol/kg至约1000 nmol/kg患者体重。
32. 条款1-31中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约100 nmol/kg至约600 nmol/kg患者体重。
33. 条款1-32中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约200 nmol/kg至约500 nmol/kg患者体重。
34. 条款1-33中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约250 nmol/kg至约500 nmol/kg患者体重。
35. 条款1-34中的任一项的方法，其中所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑素瘤、眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三重阴性的乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊椎肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤和胃食管连接部的腺癌。
36. 条款1-11或16-35中的任一项的方法，其中所述癌症是表达叶酸受体的癌症。
37. 条款35的方法，其中所述癌症是子宫内膜癌。
38. 条款35的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
39. 条款35的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
40. 条款35的方法，其中所述癌症是三重阴性的乳腺癌。
41. 条款1-40中的任一项的方法，其中所述CAR具有识别区域且所述识别区域是抗体的单链片段可变(scFv)区域。
42. 条款1-11、16-17或20-41中的任一项的方法，其中所述CAR具有识别区域且所述CAR的识别区域是抗-FITC抗体的单链片段可变(scFv)区域。
43. 条款1-42中的任一项的方法，其中所述CAR具有共刺激结构域且所述共刺激结构域选自CD28、CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)和CD278 (ICOS)。
44. 条款1-43中的任一项的方法，其中所述CAR具有活化信号结构域且所述活化信号结构域是T细胞CD3ζ链或Fc受体γ。
45. 条款1-11、16-17或20-41中的任一项的方法，其中所述CAR具有识别区域且所述识别区域是抗-FITC抗体的单链片段可变(scFv)区域，其中所述CAR具有共刺激结构域且所述共刺激结构域是CD137 (4-1BB)，且其中所述CAR具有活化信号结构域且所述活化信号结构域是T细胞CD3ζ链。
46. 条款1-45中的任一项的方法，其中施用多剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐和所述CAR T细胞组合物。
47. 条款1-46中的任一项的方法，其中在施用所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐之前，或在施用所述CAR T细胞组合物之前，将所述患者成像。
48. 条款1-47中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐不是抗体，且不包含抗体的片段。
49. 条款1-48中的任一项的方法，其中所述寻靶部分不是肽表位。
50. 条款1-49中的任一项的方法，其中在所述患者中产生‘脱靶’毒性的细胞因子释放不会发生，且其中对所述癌症的CAR T细胞毒性发生。
51. 条款1-50中的任一项的方法，其中‘脱靶’组织毒性不会在所述患者中发生，且其中对所述癌症的CAR T细胞毒性发生。
52. 条款1-51中的任一项的方法，其中所述癌症包含肿瘤，其中肿瘤大小在所述患者中减小，且其中‘脱靶’毒性不会发生。
53. 一种CAR T细胞，其包含含有SEQ ID NO:1的核酸。
54. 一种CAR T细胞，其包含含有SEQ ID NO:2的多肽。
55. 一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO:1且编码嵌合抗原受体。
56. 包含SEQ ID NO:2的嵌合抗原受体多肽。
57. 包含SEQ ID NO:1的载体。
58. 条款57的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
59. 条款1-56中的任一项的方法、CAR T细胞、分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸或嵌合抗原受体多肽，其中所述CAR包含人氨基酸序列。
60. 条款1-56中的任一项的方法、CAR T细胞、分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸或嵌合抗原受体多肽，其中所述CAR由人氨基酸序列组成。
61. 一种试剂盒，其包含至少两种不同类型的桥，其中所述桥包含与寻靶部分连接的小分子配体，其中所述至少两种不同类型的桥中的配体是不同的，且其中所述配体选自叶酸、DUPA、CAIX配体、NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体和CCK2R配体。
62. 条款61的试剂盒，其中所述桥中的至少一种的配体是NK-1R配体。
63. 条款61的试剂盒，其中所述桥中的至少一种的配体是γ谷氨酰基转肽酶的配体。
64. 条款61的试剂盒，其中所述桥中的至少一种的配体是叶酸。
65. 条款61-64中的任一项的试剂盒，其中所述桥具有下式
其中B代表小分子配体，L代表接头，且T代表寻靶部分，且其中L包含具有下式的结构
其中n是0-200的整数。
66. 条款65的试剂盒，其中n是0-150的整数。
67. 条款65的试剂盒，其中n是0-110的整数。
68. 条款65的试剂盒，其中n是0-20的整数。
69. 条款65的试剂盒，其中n是15-20的整数。
70. 条款65的试剂盒，其中n是15-110的整数。
71. 条款1-10、16-52或59-60中的任一项的方法、或条款61-70中的任一项的试剂盒，其中所述配体是CAIX配体。
72. 下式的缀合物
。
附图简述
图1A-B显示了以5:1的(CAR T细胞):靶细胞(癌细胞)比率在不同细胞类型中使用FITC-小分子缀合物的CAR T细胞增殖。图1A显示了KB (FR+)细胞中的CAR T细胞增殖。图1B显示了HEK293 (NK1R+)细胞中的CAR T细胞增殖。
图2A-F显示了在不同细胞类型中具有FITC-小分子缀合物的CAR T细胞的炎症性细胞因子IFN-γ产生。图2A显示了在KB (FR+)细胞中的炎症性细胞因子IFN-γ产生。图2B显示了在LNCaP (PSMA+)细胞中的炎症性细胞因子IFN-γ产生。图2C显示了在HEK293(NK1R+)细胞中的炎症性细胞因子IFN-γ产生。图2D显示了在具有不同FITC-叶酸浓度的KB(FR+)细胞中的炎症性细胞因子IFN-γ产生。图2E显示了在具有不同缀合物的KB (FR+)细胞中的炎症性细胞因子IFN-γ产生。图2F显示了在具有不同缀合物的KB (FR+)细胞中的炎症性细胞因子IFN-γ产生。
图3A-F显示了在不同细胞类型中用FITC-小分子缀合物处理的肿瘤细胞的体外毒性。图3A显示了在KB (FR+)细胞中的体外毒性。图3B显示了在LNCaP (PSMA+)细胞中的体外毒性。图3C显示了在HEK293 (NK1R+)细胞中的体外毒性。图3D显示了随着不同的E:T (效应细胞:靶细胞)比率而变化的在KB (FR+)细胞中的体外毒性。图3E显示了随着FITC-叶酸浓度而变化的在KB (FR+)细胞中的体外毒性。图3F显示了在具有不同缀合物的KB (FR+)细胞中的体外毒性。
图4A-B表明CAR T细胞的活化与癌细胞上的肿瘤抗原的表达水平相关联。图4A显示了肿瘤抗原FRα水平。最高峰是关于KB (FR+)细胞。图4B显示了使用FITC-小分子缀合物的CAR T细胞活化，如在MDA-MB-231和KB细胞中通过IFN-γ产生所测得的。
图5A-C显示了HEK293 (NK1R+)肿瘤异种移植物和CAR T细胞疗法，所述疗法包括用FITC-PEG11-NK1缀合物或无缀合物处理CAR T细胞。图5A显示了在24天中测得的肿瘤体积。图5B显示了在22天疗法中测得的体重。图5C显示了与FITC-PEG11-NK1一起的CAR T细胞注射后在CD3+ 人T细胞中的CAR T细胞的百分比。
图6A-B显示了从在图5A-C中使用的示例性模型小鼠收获的器官。图6A显示了从非治疗组收获的器官。图6B显示了在2周的CAR T细胞疗法以后收获的器官。
图7A-C显示了在CAR T细胞疗法下的MDA-MB-231 (FR+)异种移植物，所述CAR T细胞疗法包括用具有FITC-PEG12-叶酸缀合物、FITC-叶酸缀合物或无缀合物的CAR T细胞处理所述细胞。图7A显示了在23天中测得的肿瘤体积。图7B显示了在21天疗法中测得的体重。图7C显示了在CAR T细胞注射后在CD3+ 人T细胞中的CAR T细胞的百分比。
图8A-B显示了从示例性小鼠收获的器官，所述示例性小鼠来自在图7A-C中所示的模型。图8A显示了从非治疗组收获的器官。图8B显示了在3周的CAR T细胞疗法以后收获的器官，所述CAR T细胞疗法包括CAR T细胞和500 n摩尔/kg体重的FITC-PEG12-叶酸缀合物。
图9显示了来自图5-6的HEK293 (NK1R+)异种移植物模型的血液指数和来自图7-8的MDA-MB-231 (FR+)异种移植物模型。
图10显示了对用CAR T细胞处理过的KB (FR+)肿瘤细胞的细胞毒性的差异，取决于使用的FITC-小分子缀合物。
图11显示了使用具有不同浓度的FITC-PEG-12-叶酸缀合物的CAR T细胞在KB肿瘤异种移植物模型中的体重变化百分比。
图12A-C显示了从图11所示的KB异种移植物模型的示例性小鼠收获的器官。图12A显示了从非治疗组收获的器官。图12B显示了从用250 nmol/kg FITC-PEG-12-叶酸处理过的CAR T细胞治疗组收获的器官。图12C显示了从用CAR T细胞和500 nmol/kg FITC-PEG-12-叶酸处理过的CAR T细胞治疗组收获的器官。
图13显示了来自图11-12的KB异种移植物模型的小鼠的血液指数。
图14A-B显示了用于CAR T转导的构建体。图14A显示了CAR4-1BBZ构建体。图14B显示了慢病毒载体。
图15A-B显示了转导的T细胞的流式细胞计量术分析。图15A显示了未转导的细胞。图15B显示了转导的细胞。
图16A-B显示了转导的CAR T细胞的荧光显微术。图16A显示了指示转导的GFP成像。图16B显示了定位至阳性转导的细胞的FITC叶酸。
图17显示了CAR T细胞的活化，如通过CD69的相对表达（随着使用的缀合物而变化）所测得的。
图18显示了KB、LNCaP和CAR T细胞的肿瘤异质性（随着使用的缀合物而变化）。
图19A-C显示了当将相同的抗-FITC CAR T细胞(107个细胞)引入小鼠时的抗肿瘤效力，所述小鼠在各侧携带从两种不同细胞系(即MDA-MB-231(FR+)和HEK (NK1R+))产生的两种不同肿瘤，此后每隔一天注射单独的PBS (图19A)、FITC-PEG11-NK1R (500nmol/kg)(图19B)、或FITC-PEG11-NK1R (500nmol/kg) + FITC-PEG12-叶酸(500nmol/kg) (图19C)。图19A：(●) FR+ (MDA-MB-231)：CAR T细胞+ PBS，(■) NK1R+(HEK)：CAR T细胞+ PBS；图19B：(●) FR+ (MDA-MB-231)：CAR T细胞+ PBS，(■) NK1R+(HEK)：CAR T细胞+ FITC-PEG11-NK1R (500 nmol/kg)；图19C：(●) FR+ (MDA-MB-231)：CAR T细胞+ FITC-PEG12-FA(500 nmol/kg)，(■) NK1R+(HEK)：CAR T细胞+ PBS。
定义
本文中使用的“一个”或“一种”可以是指一个/种或多个/种。如本文中使用的，关于数字值（包括、例如，整数、分数和百分比）的“约”通常表示本领域普通技术人员认为等同于列举的值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，列举的值±5%至10%)。
本文中使用的术语“治疗”或“处理”表示治疗性治疗/处理和预防性或防止性治疗/处理。
如本文中使用的，关于癌症的术语“改善”可以是指减轻癌症的征状，减小肿瘤的大小，完全地或部分地除去肿瘤(例如，完全或部分应答)，造成稳定的疾病，阻止癌症的进展(例如，无进展存活)，或被医师认为是癌症的治疗性或防止性处理的对癌症的任意其它效应。
本文中使用的术语“施用”或“给药”是指将本文描述的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或CART细胞组合物引入患者的所有方式，包括、但不限于，口服(po)、静脉内(iv)、肌肉内(im)、皮下(sc)和透皮。
本文中使用的术语“脱靶毒性”是指对于治疗患者的医师而言不可接受的器官损伤或患者的重量的减小，或对于治疗患者的医师而言不可接受的任意其它效应，诸如B细胞发育不全。
本文中使用的术语“转导”和“转染”等同地使用，且所述术语是指通过任何人工方法（包括病毒和非病毒方法）将核酸引入细胞中。
发明详述
在本文描述的不同实施方案中，将通过接头与寻靶部分连接的小分子配体用作癌症和CAR T细胞(即，表达嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞)之间的桥。所述桥将所述CAR T细胞引导至所述癌症以改善所述癌症。在一个实施方案中，所述“小分子配体”可以是叶酸、CAIX配体、DUPA、NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体或CCK2R配体，其中的每一种是特异性地结合癌细胞类型的小分子配体(即，这些配体中的每一种的受体相对于正常组织在癌症上过表达)。
与小分子配体连接的“寻靶部分”会结合由CAR T细胞表达的遗传工程改造的CAR的识别区域。因此，所述CAR的识别区域(例如，抗体的单链片段可变区(scFv))是指“被靶向的部分”。因而，通过接头与寻靶部分连接的小分子配体充当癌症和CAR T细胞之间的桥，其将CAR T细胞引导至癌症以改善所述癌症。在不同的实施方案中，所述癌症和所述CAR T细胞之间的桥可以是在实施例5-12中所示的缀合物中的任一种。
所述桥是小有机分子，所以可以快速地(例如，约20分钟或更少)实现从血流的清除。在一个方面，可以使CAR T细胞应答仅靶向表达所述“桥”的小分子配体部分的受体的那些癌细胞，由此降低对正常组织的脱靶毒性。在另一个方面，由于所述桥从血流中的快速清除以及改变所述桥的剂量和结构以调节CAR T细胞活化的能力，可以控制CAR T细胞活化。另外，因为一种类型的CAR T细胞构建体可以用于靶向多种癌症，所以该系统可以是“通用的”。示例性地，由CAR T细胞识别的寻靶部分可以保持恒定，使得可以使用一种类型的CART细胞构建体，而改变结合癌症的小分子配体以允许靶向多种癌症。
在一个实施方案中，发明人已经发现，改变通过接头与寻靶部分连接的小分子配体(即，桥)的剂量可以产生在CAR T细胞活化后控制体内CRS的能力。在另一个实施方案中，发明人已经发现，改变与寻靶部分连接的小分子配体中的接头(桥)可以在CAR T细胞活化后控制体内CRS。在另一个实施方案中，这些方法的组合可以用于精确地控制CAR T细胞活化和体内细胞因子释放。
在下面的条款列表和权利要求所述的不同实施方案中，通过接头与寻靶部分连接的小分子配体被称作“化合物”、“第一种缀合物”或“第二种缀合物”。在其中改变通过接头与寻靶部分连接的小分子配体的剂量以控制体内细胞因子释放的实施方案中，使用术语“化合物”。在其中将两种不同缀合物施用给患者的实施方案中，使用术语“第一种缀合物”和“第二种缀合物”。例如，可以改变与寻靶部分连接的小分子配体中的接头以控制体内细胞因子释放，或可以将所述缀合物修饰成含有不同的小分子配体或不同的寻靶部分。
下述列举的条款描述了几个实施方案:
1. 一种治疗癌症的方法，所述方法包括
i)给患者施用第一剂量化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包含通过接头与寻靶部分连接的小分子配体；
ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR；
ii)给所述患者施用第二剂量所述化合物或其药学上可接受的盐，其中所述第二剂量不同于所述第一剂量；和
iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
2. 一种治疗癌症的方法，所述方法包括
i)给所述患者施用第一种缀合物或其药学上可接受的盐；
ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR；
iii)给所述患者施用第二种缀合物或其药学上可接受的盐，
其中所述第一种和所述第二种缀合物各自包含通过接头与寻靶部分连接的小分子配体，且其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物是不同的；和
iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
3. 一种治疗癌症的方法，所述方法包括
i)给患者施用第一剂量第一种缀合物或其药学上可接受的盐；
ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR；
ii)给所述患者施用第二剂量第二种缀合物或其药学上可接受的盐，
其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物各自包含与寻靶部分连接的小分子配体，其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物是不同的，且其中所述第一剂量和所述第二剂量是不同的；和
iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
4. 条款2或3的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头是不同的。
5. 条款2或3的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头是相同的。
6. 条款2-5中的任一项的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体是不同的。
7. 条款2-5中的任一项的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体是相同的。
8. 条款2-7中的任一项的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分是不同的。
9. 条款2-7中的任一项的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分是相同的。
10. 条款1-9中的任一项的方法，其中所述配体选自叶酸、DUPA、CAIX配体、NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体和CCK2R配体。
11. 条款10的方法，其中所述配体是叶酸。
12. 条款10的方法，其中所述配体是NK-1R配体。
13. 条款10的方法，其中所述配体是DUPA。
14. 条款10的方法，其中所述配体是CCK2R配体。
15. 条款10的方法，其中所述配体是γ谷氨酰基转肽酶的配体。
16. 条款1-15中的任一项的方法，其中所述寻靶部分选自2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛配基、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、五氟苯基酯(PFP)、四氟苯基酯(TFP)、knottin、centyrin和DARPin。
17. 条款16的方法，其中所述寻靶部分是FITC。
18. 条款16的方法，其中所述寻靶部分是DNP。
19. 条款16的方法，其中所述寻靶部分是TNP。
20. 条款1-19中的任一项的方法，其中所述接头包含聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、亲水氨基酸、糖、非天然的肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和/或pluronic F-127。
21. 条款20的方法，其中所述接头包含PEG。
22. 条款1-21中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐具有下式
其中B代表小分子配体，L代表接头，且T代表寻靶部分，且其中L包含具有下式的结构
其中n是0-200的整数。
23. 条款22的方法，其中n是0-150的整数。
24. 条款22的方法，其中n是0-110的整数。
25. 条款22的方法，其中n是0-20的整数。
26. 条款22的方法，其中n是15-20的整数。
27. 条款22的方法，其中n是15-110的整数。
28. 条款1-27中的任一项的方法，其中所述接头包含PEG，且所述寻靶部分是FITC或其药学上可接受的盐。
29. 条款1-28中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约10 nmol/kg至约3000 nmol/kg患者体重。
30. 条款1-29中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约50 nmol/kg至约2000 nmol/kg患者体重。
31. 条款1-30中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约100 nmol/kg至约1000 nmol/kg患者体重。
32. 条款1-31中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约100 nmol/kg至约600 nmol/kg患者体重。
33. 条款1-32中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约200 nmol/kg至约500 nmol/kg患者体重。
34. 条款1-33中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约250 nmol/kg至约500 nmol/kg患者体重。
35. 条款1-34中的任一项的方法，其中所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑素瘤、眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三重阴性的乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊椎肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤和胃食管连接部的腺癌。
36. 条款1-11或16-35中的任一项的方法，其中所述癌症是表达叶酸受体的癌症。
37. 条款35的方法，其中所述癌症是子宫内膜癌。
38. 条款35的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
39. 条款35的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
40. 条款35的方法，其中所述癌症是三重阴性的乳腺癌。
41. 条款1-40中的任一项的方法，其中所述CAR具有识别区域且所述识别区域是抗体的单链片段可变(scFv)区域。
42. 条款1-11、16-17或20-41中的任一项的方法，其中所述CAR具有识别区域且所述CAR的识别区域是抗-FITC抗体的单链片段可变(scFv)区域。
43. 条款1-42中的任一项的方法，其中所述CAR具有共刺激结构域且所述共刺激结构域选自CD28、CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)和CD278 (ICOS)。
44. 条款1-43中的任一项的方法，其中所述CAR具有活化信号结构域且所述活化信号结构域是T细胞CD3ζ链或Fc受体γ。
45. 条款1-11、16-17或20-41中的任一项的方法，其中所述CAR具有识别区域且所述识别区域是抗-FITC抗体的单链片段可变(scFv)区域，其中所述CAR具有共刺激结构域且所述共刺激结构域是CD137 (4-1BB)，且其中所述CAR具有活化信号结构域且所述活化信号结构域是T细胞CD3ζ链。
46. 条款1-45中的任一项的方法，其中施用多剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐和所述CAR T细胞组合物。
47. 条款1-46中的任一项的方法，其中在施用所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐之前，或在施用所述CAR T细胞组合物之前，将所述患者成像。
48. 条款1-47中的任一项的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐不是抗体，且不包含抗体的片段。
49. 条款1-48中的任一项的方法，其中所述寻靶部分不是肽表位。
50. 条款1-49中的任一项的方法，其中在所述患者中产生‘脱靶’毒性的细胞因子释放不会发生，且其中对所述癌症的CAR T细胞毒性发生。
51. 条款1-50中的任一项的方法，其中‘脱靶’组织毒性不会在所述患者中发生，且其中对所述癌症的CAR T细胞毒性发生。
52. 条款1-51中的任一项的方法，其中所述癌症包含肿瘤，其中肿瘤大小在所述患者中减小，且其中‘脱靶’毒性不会发生。
53. 一种CAR T细胞，其包含含有SEQ ID NO:1的核酸。
54. 一种CAR T细胞，其包含含有SEQ ID NO:2的多肽。
55. 一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO:1且编码嵌合抗原受体。
56. 包含SEQ ID NO:2的嵌合抗原受体多肽。
57. 包含SEQ ID NO:1的载体。
58. 条款57的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
59. 条款1-56中的任一项的方法、CAR T细胞、分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸或嵌合抗原受体多肽，其中所述CAR包含人氨基酸序列。
60. 条款1-56中的任一项的方法、CAR T细胞、分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸或嵌合抗原受体多肽，其中所述CAR由人氨基酸序列组成。
61. 一种试剂盒，其包含至少两种不同类型的桥，其中所述桥包含与寻靶部分连接的小分子配体，其中所述至少两种不同类型的桥中的配体是不同的，且其中所述配体选自叶酸、DUPA、CAIX配体、NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体和CCK2R配体。
62. 条款61的试剂盒，其中所述桥中的至少一种的配体是NK-1R配体。
63. 条款61的试剂盒，其中所述桥中的至少一种的配体是γ谷氨酰基转肽酶的配体。
64. 条款61的试剂盒，其中所述桥中的至少一种的配体是叶酸。
65. 条款61-64中的任一项的试剂盒，其中所述桥具有下式
其中B代表小分子配体，L代表接头，且T代表寻靶部分，且其中L包含具有下式的结构
其中n是0-200的整数。
66. 条款65的试剂盒，其中n是0-150的整数。
67. 条款65的试剂盒，其中n是0-110的整数。
68. 条款65的试剂盒，其中n是0-20的整数。
69. 条款65的试剂盒，其中n是15-20的整数。
70. 条款65的试剂盒，其中n是15-110的整数。
71. 条款1-10、16-52或59-60中的任一项的方法，或条款61-70中的任一项的试剂盒，其中所述配体是CAIX配体。
72. 下式的缀合物
。
如本文中所述的，“患者”可以是人，或者，在兽医学应用的情况下，所述患者可以是实验动物、农业动物、家养动物或野生动物。在一个方面，所述患者可以是实验动物诸如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔、猴、黑猩猩，家养动物诸如狗、猫或兔，农业动物诸如牛、马、猪、绵羊、山羊，或被人工驯养的野生动物诸如熊、熊猫、狮子、老虎、豹、象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚或鲸鱼。在本文所述的方法中，“治疗所述患者以改善所述癌症”的步骤可以包括所述方法中的施用步骤或由其组成。
在一个示例性实施方案中，通过接头与寻靶部分连接的小分子配体(桥)包含与所述小分子配体连接的异硫氰酸荧光素(FITC)。所述癌症过表达所述小分子配体的受体。作为第二种组分，例如，将细胞毒性T细胞转化成表达包含抗-FITC scFv的CAR。在该方面，由于小分子配体与癌症的结合，所述CAR靶向用FITC分子装饰癌症的FITC。因而，可以避免对正常的非靶细胞的毒性。当表达抗-FITC CAR的T细胞结合FITC时，所述CAR T细胞被活化且所述癌症被改善(例如，通过杀死癌细胞)。
在一个实施方案中，所述“小分子配体”可以是叶酸、DUPA (被PSMA-阳性的人前列腺癌细胞和其它癌细胞类型结合的配体)、NK-1R配体(例如在结肠癌和胰腺癌上发现的NK-1R配体的受体)、CAIX配体(例如在肾癌、卵巢癌、外阴癌和乳腺癌上发现的CAIX配体的受体)、γ谷氨酰基转肽酶的配体(例如在卵巢癌、结肠癌、肝癌、星形细胞神经胶质瘤、黑素瘤和白血病中过表达的转肽酶)或CCK2R配体(在甲状腺、肺、胰腺、卵巢、脑、胃、胃肠间质和结肠以及其它的癌上发现的CCK2R配体的受体)，其中的每一种是特异性地结合癌细胞类型的小分子配体(即，这些配体中的每一种的受体可以相对于正常组织在癌症上过表达)。在一个实施方案中，DUPA衍生物可以是与寻靶部分连接的小分子配体的配体，且DUPA衍生物描述在WO 2015/057852（通过引用并入本文）中。
在一个实施方案中，所述小分子配体是叶酸。所述叶酸可以是叶酸、叶酸类似物或另一种结合叶酸受体的分子。在不同的实施方案中，可以使用的叶酸的类似物包括亚叶酸、pteropolyglutamic acid和结合叶酸受体的喋啶类诸如四氢蝶呤类、二氢叶酸类、四氢叶酸类和它们的脱氮和二脱氮类似物。术语“脱氮”和“二脱氮”类似物表示本领域公知的类似物，其用一个碳原子来置换天然存在的叶酸结构中的一个或两个氮原子。例如，脱氮类似物包括1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮和10-脱氮类似物。二脱氮类似物包括，例如，1,5-二脱氮、5,10-二脱氮、8,10-二脱氮和5,8-二脱氮类似物。前述叶酸类似物常规地被称作“叶酸”，这反映了它们的结合叶酸受体的能力。其它结合叶酸受体的类似物包括氨基蝶呤、甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、N10-甲基叶酸、2-去氨基-羟基叶酸、脱氮类似物诸如1-脱氮甲氨蝶呤或3-脱氮甲氨蝶呤和3',5'-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰基谷氨酸(二氯甲氨蝶呤)。
在一个实施方案中，所述小分子配体可以具有小于约10,000道尔顿、小于约9000道尔顿、小于约8,000道尔顿、小于约7000道尔顿、小于约6000道尔顿、小于约5000道尔顿、小于约4500道尔顿、小于约4000道尔顿、小于约3500道尔顿、小于约3000道尔顿、小于约2500道尔顿、小于约2000道尔顿、小于约1500道尔顿、小于约1000道尔顿或小于约500道尔顿的质量。在另一个实施方案中，所述小分子配体可以具有约1至约10,000道尔顿、约1至约9000道尔顿、约1至约8,000道尔顿、约1至约7000道尔顿、约1至约6000道尔顿、约1至约5000道尔顿、约1至约4500道尔顿、约1至约4000道尔顿、约1至约3500道尔顿、约1至约3000道尔顿、约1至约2500道尔顿、约1至约2000道尔顿、约1至约1500道尔顿、约1至约1000道尔顿或约1至约500道尔顿的质量。
在一个方面，结合由CAR T细胞表达的CAR的“寻靶部分”可以选自，例如，2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛配基、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、五氟苯基酯(PFP)、四氟苯基酯(TFP)、knottin、centyrin和DARPin。寻靶部分的鉴定仅受限于它应当被CAR识别和结合，优选地具有特异性，并且它具有相对低的分子量。在不同的方面，示例性的寻靶部分是包括小分子量有机分子的半抗原。
在一个示例性实施方案中，所述寻靶部分可以具有下述示例性的结构：
其中X是氧、氮或硫，且其中X连接至接头L；Y是ORa、NRa 2或NRa 3 +；且Y'是O、NRa或NRa 2 +；其中每个R在每种情况下独立地选自H、氟、磺酸、磺酸盐、及其盐等；且Ra是氢或烷基。
在一个示例性的方面，本文描述的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头可以是直接连接(例如，FITC的异硫氰酸酯基团和小分子配体的游离胺基团之间的反应)，或所述连接可以是通过中间接头。在一个实施方案中，如果存在的话，中间接头可以是本领域已知的任何生物相容的接头，诸如二价接头。在一个示例性实施方案中，所述二价接头可以包含约1至约30个碳原子。在另一个示例性实施方案中，所述二价接头可以包含约2至约20个碳原子。在其它实施方案中，采用较低分子量二价接头(即，具有约30至约300的近似分子量的那些)。在另一个实施方案中，合适的接头长度包括、但不限于具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个或更多个原子的接头。
在不同的实施方案中，与寻靶部分连接的小分子配体可以具有下式
其中B代表小分子配体，L代表接头，且T代表寻靶部分，且其中L包含具有下式的结构
其中n是0-200的整数。在另一个实施方案中，n可以是0-150、0-110、0-100、0-90、0-80、0-70、0-60、0-50、0-40、0-30、0-20、0-15、0-14、0-13、0-12、0-11、0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3、0-2、0-1、15-16、15-17、15-18、15-19、15-20、15-21、15-22、15-23、15-24、15-25、15-26、15-27、15-28、15-29、15-30、15-31、15-32、15-33、15-34、15-35、15-36、15-37、15-38、15-39、15-40、15-50、15-60、15-70、15-80、15-90、15-100、15-110、15-120、15-130、15-140、15-150的整数，或n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、108、110、120、130、140或150。
在另一个实施方案中，所述接头可以是可包括一个或多个间隔物的二价接头。示例性的间隔物显示在下表中。描述了下述非限制性的、示例性的间隔物，其中* 指示与小分子配体或寻靶部分的连接点。
在其它实施方案中，与寻靶部分连接的小分子配体(桥)可以具有下述结构中的任一种。
在其它实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐不是抗体，且不包含抗体的片段。在另一个实施方案中，所述寻靶部分不是肽表位。
在一个示例性的方面，可以将不同类型的缀合物(例如，第一种缀合物和第二种缀合物)施用给所述患者。例如，在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头可以是相同的或不同的。在另一个方面，在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体可以是相同的或不同的。在另一个示例性实施方案中，在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分可以是相同的或不同的。这些实施方案的任意组合也与下述的剂量的任意组合一起被涵盖。
在另一个实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含至少两种不同类型的桥，其中所述桥包含与寻靶部分连接的小分子配体，其中所述至少两种不同类型的桥中的配体是不同的，且其中所述配体选自叶酸、DUPA、CAIX配体、NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体和CCK2R配体。在该实施方案中，所述桥的至少一个中的配体可以是NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体、叶酸、CAIX配体、CCK2R配体或DUPA。
在另一个方面，所述试剂盒中的桥可以具有下式
其中B代表小分子配体，L代表接头，且T代表寻靶部分，且其中L包含具有下式的结构
其中n是0-200的整数。在其它实施方案中，n可以是0-150的整数、0-110的整数、0-20的整数、15-20的整数、15-110的整数或本文关于n描述的整数的任意其它值或范围。
涵盖通过接头与寻靶部分连接的小分子配体的“药学上可接受的盐”。本文中使用的术语“药学上可接受的盐”表示其抗衡离子可以用在药物中的盐。这样的盐包括：1)酸加成盐，其可以通过母体化合物的游离碱与无机酸（诸如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸等）或与有机酸（诸如乙酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲烷磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等）的反应得到；或2)当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子（例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子）替换或与有机碱（诸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基还原葡糖胺等）配位时形成的盐。药学上可接受的盐是本领域技术人员众所周知的，且任何这样的药学上可接受的盐可以与本文描述的实施方案关联地被涵盖。
在不同的实施方案中，从形成无毒盐的酸形成合适的酸加成盐。示例性的例子包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、羟苯酰苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
在不同的实施方案中，从形成无毒盐的碱形成合适的碱盐。示例性的例子包括精氨酸、苄星青霉素、钙、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、乙醇胺（olamine）、钾、钠、氨丁三醇和锌盐。也可以形成酸和碱的半盐，例如，半硫酸盐和半钙盐。
在一个示例性的方面，本文描述的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或第二种缀合物或其药学上可接受的盐可以含有一个或多个手性中心，或可以另外能够作为多种立体异构体存在。因此，不同的实施方案可以包括纯的立体异构体以及立体异构体的混合物，诸如对映异构体、非对映异构体和对映异构地或非对映异构地富集的混合物。在一个方面，本文描述的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐可以能够作为几何异构体存在。因此，不同的实施方案可以包括纯的几何异构体或几何异构体的混合物。
在某些方面，本文描述的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐可以以未溶剂化形式以及溶剂化形式（包括水合形式）存在。一般而言，所述溶剂化形式与未溶剂化形式等效且被包括在本发明范围内。
本文所述的方法也利用被工程改造成表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞毒性T淋巴细胞，所述嵌合抗原受体识别和结合所述桥的寻靶部分(例如，FITC、DNP或TNP)。在一个实施方案中，本文描述的CAR包含三个结构域，其包括：1)特异性地识别和结合寻靶部分的识别区域(例如，抗体的单链片段可变(scFv)区域)，2)增强T淋巴细胞的增殖和存活的共刺激结构域，和3)产生细胞毒性T淋巴细胞活化信号的活化信号结构域。
在不同的方面，作为非限制性例子，可以使用结合叶酸、DUPA、CAIX配体、NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体或CCK2R配体的抗体的scFv区域。在示例性实施方案中，可以从以下物质制备scFv区域：(i)本领域已知的结合寻靶部分的抗体，(ii)使用选择的寻靶部分新制备的抗体，诸如半抗原，和(iii)从这样的抗体的scFv区域衍生出的序列变体，例如，与它们的来源scFv区域的氨基酸序列具有至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%序列同一性的scFv区域。
在本文描述的任何实施方案中，CAR的结合部分可以是，例如，抗体的单链片段可变区(scFv)、Fab、Fv、Fc或(Fab’)2片段等。
在一个方面，所述共刺激结构域用于在CAR与寻靶部分结合后增强细胞毒性T淋巴细胞的增殖和存活。合适的共刺激结构域包括：1) CD28，2) CD137 (4-1BB)，肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的一个成员，3) CD134 (OX40)，TNFR-超家族受体的一个成员，和4) CD278(ICOS)，在活化的T细胞上表达的CD28-超家族共刺激性分子，或它们的组合。合适的共刺激结构域也包括、但不限于CD27、CD30、CD150、DAP10和NKG2D、或它们的组合。熟练的技术人员会理解，在不会不利地影响本发明的情况下可以使用这些共刺激结构域的序列变体，其中所述变体具有与它们的建模结构域相同或类似的活性。在不同的实施方案中，这样的变体与它们的来源结构域的氨基酸序列具有至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%序列同一性。
在一个示例性实施方案中，所述活化信号结构域用于在CAR与寻靶部分结合后活化细胞毒性T淋巴细胞。合适的活化信号结构域包括T细胞CD3ζ链和Fc受体γ。熟练的技术人员会理解，可以使用这些指出的活化信号结构域的序列变体，其中所述变体具有与它们的建模结构域相同或类似的活性。在不同的实施方案中，所述变体与它们的来源结构域的氨基酸序列具有至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%序列同一性。
在一个方面，使用基因工程技术制备编码CAR的构建体。这样的技术详细地描述在Sambrook等人, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第3版, Cold SpringHarbor Laboratory Press, (2001)，通过引用并入本文。作为一个例子，可以制备编码融合蛋白的质粒或病毒表达载体(例如，慢病毒载体、逆转录病毒载体、睡美人（sleepingbeauty）和寄生（piggyback）(包括非病毒介导的CAR基因递送系统的转座子/转座酶系统))，所述融合蛋白包含在框架内且在5’至3’方向连接的一个识别区域、一个或多个共刺激结构域和一个活化信号结构域。在其它实施方案中，其它排列是可接受的，且包括一个识别区域、一个活化信号结构域和一个或多个共刺激结构域。所述识别区域在融合蛋白中的布置通常将使得实现所述区域在细胞外部的展示。在一个实施方案中，所述CAR可以包括额外的元件，诸如确保融合蛋白向细胞表面的适当输出的信号肽，确保将融合蛋白维持为嵌膜蛋白的跨膜结构域，和给识别区域赋予柔性并允许与寻靶部分的强烈结合的铰链结构域。
一种示例性CAR的简图显示在图14A和B中，其中将融合蛋白序列掺入在慢病毒表达载体中，且其中“SP”是信号肽，所述CAR是抗-FITC CAR，CD8α铰链和跨膜(TM)区域存在，所述共刺激结构域是4-1BB，且所述活化信号结构域是CD3ζ。在一个方面，所述CAR插入物的核酸序列作为SEQ ID NO:1提供，且所述插入物的氨基酸序列作为SEQ ID NO:2提供。
在一个实施方案中，所述CAR具有识别区域且所述识别区域是抗-FITC抗体的单链片段可变(scFv)区域，具有共刺激结构域且所述共刺激结构域是CD137 (4-1BB)，具有活化信号结构域且所述活化信号结构域是T细胞CD3ζ链。熟练的技术人员众所周知，抗-FITCscFv和抗-荧光素scFv是等同的术语。
在一个实施方案中，通过用编码CAR构建体的表达载体转染细胞毒性T淋巴细胞群体，可以将细胞毒性T淋巴细胞遗传工程改造成表达CAR构建体。用于制备转导的T淋巴细胞（其表达选择的CAR构建体）的群体的合适方法是熟练的技术人员众所周知的，且描述在Sambrook等人, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第3版, Cold SpringHarbor Laboratory Press, (2001)中，通过引用并入本文。
在不同的实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:1或3的核酸的CAR T细胞。在另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:2的多肽的CAR T细胞。在另一个示例性的方面，提供了一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO:1或3且编码嵌合抗原受体。在另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:2的嵌合抗原受体多肽。在另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:1或3的载体。在另一个方面，提供了包含SEQ ID NO:1或3的慢病毒载体。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:2可以包含人的或人源化的氨基酸序列或由其组成。
在这些实施方案中的每一个中，涵盖与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%序列同一性的变体核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸序列可以是与SEQ ID NO:1或3具有至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%序列同一性的变体核酸序列，只要所述变体序列编码SEQ ID NO:2的多肽。在另一个实施方案中，所述核酸或氨基酸序列可以是沿着SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的200个核酸或200个氨基酸的段与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%序列同一性的变体核酸或氨基酸序列。例如，通过使用GAP程序(Genetics ComputerGroup, 软件；现在可经由Accelrys在http://www.accelrys.com上得到)，可以完成序列之间的同一性或相似性百分比的确定；并且使用例如ClustalW算法(VNTI软件, InforMaxInc.)可以完成比对。使用目标核酸或氨基酸序列可以检索序列数据库。数据库检索算法通常是基于BLAST软件(Altschul等人, 1990)。在某些实施方案中，可以沿着核酸或氨基酸序列的全长确定同一性百分比。
也在本发明范围内的是，与由SEQ ID NO:1或3表示的核酸互补的核酸，和与由SEQID NO:1或3表示的核酸杂交的那些，或在高严谨条件下与它的补体杂交的那些。根据本发明，“高严谨条件”是指在5X SSPE和50%甲酰胺中在65℃杂交，和在0.5X SSPE中在65℃洗涤。用于高严谨性、低严谨性和中严谨杂交的条件描述在Sambrook等人, “MolecularCloning: A Laboratory Manual”, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)，通过引用并入本文。在某些示例性方面，杂交沿着核酸的全长发生。
在一个实施方案中，用于制备在本文所述的方法中使用的CAR T细胞的细胞毒性T淋巴细胞可以是自体细胞，尽管还可以使用异源细胞，诸如当正在治疗的患者已经接受高剂量化学疗法或辐射处理以破坏患者的免疫系统时。在一个实施方案中，可以使用同种异体细胞。
在一个方面，所述细胞毒性T淋巴细胞可以通过本领域众所周知的方式得自患者。例如，可以如下得到细胞毒性T细胞：从患者收集外周血，对所述血液进行Ficoll密度梯度离心，然后使用阴性T细胞分离试剂盒(诸如EasySep™T Cell Isolation Kit)来从外周血分离细胞毒性T细胞群体。在一个示例性实施方案中，细胞毒性T淋巴细胞的群体不需要是纯的，且可能含有其它细胞诸如其它T细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞和B细胞。在一个方面，正在收集的群体可以包含至少约90%的选择的细胞类型，至少约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的选择的细胞类型。
在一个实施方案中，在得到细胞毒性T淋巴细胞以后，在促进所述细胞的活化的条件下培养所述细胞。在该实施方案中，所述培养条件可以使得，可以将所述细胞施用给患者，无需担心对培养基的组分的反应性。例如，培养条件可以不包括牛血清产品，诸如牛血清白蛋白。在一个示例性的方面，通过将已知的活化剂（诸如在细胞毒性T细胞的情况下，抗-CD3抗体）引入培养基中，可以实现活化。其它合适的活化剂包括抗-CD28抗体。在一个方面，可以将淋巴细胞群体在促进活化的条件下培养约1至约4天。在一个实施方案中，通过细胞大小、增殖速率或活化标志物（通过流式细胞计量术确定）可以确定适当的活化水平。
在一个示例性实施方案中，已经在促进活化的条件下培养细胞毒性T淋巴细胞群体以后，可以用编码CAR的表达载体转染所述细胞。上面描述了合适的载体和转染方法。在一个方面，在转染以后，可以立即将细胞施用给患者，或可以将细胞培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18天或更多天，或约5至约12天之间，约6至约13天之间，约7至约14天之间，或约8至约15天之间，例如，以允许所述细胞从转染恢复的时间。合适的培养条件可以类似于用于培养所述细胞进行活化的条件，有或没有用于促进活化的试剂。
因而，如上所述，在一个示例性的方面，本文描述的治疗方法可以进一步包括：1)得到自体或异源细胞毒性T淋巴细胞群体，2)在促进所述细胞的活化的条件下培养所述T淋巴细胞，和3)用编码CAR的表达载体转染所述淋巴细胞以形成CAR T细胞。
在一个示例性实施方案中，当已经将所述细胞转染和活化时，可以制备包含CAR T细胞的组合物并施用给患者。在一个实施方案中，可以使用缺少任何动物产品（诸如牛血清）的培养基。在另一个实施方案中，可以使用这样的组织培养条件：其通常被熟练的技术人员使用以避免细菌、真菌和支原体的污染。在一个示例性实施方案中，在施用给患者之前，将所述细胞沉淀、洗涤和重新悬浮在药学上可接受的载体或稀释剂中。包含表达CAR的细胞毒性T淋巴细胞的示例性组合物包括包含在无菌的290 mOsm盐水中、在可输注的冷冻介质（cryomedia）(含有Plasma-Lyte A、右旋糖、氯化钠注射、人血清白蛋白和DMSO)中、在含有2%人血清白蛋白的0.9%NaCl中或在任意其它无菌290 mOsm可输注物质中的细胞的组合物。可替换地，取决于培养基的特性，所述CAR T细胞可以在培养基中作为组合物施用，或经过浓缩并在施用之前重新悬浮在培养基中。经由任意合适的方式，诸如胃肠外施用，例如，真皮内地、皮下地、肌肉内地、腹膜内地、静脉内地或鞘内地，可以将CAR T细胞组合物施用给患者。
在一个方面，在施用给患者的组合物中的CAR T细胞的总数和所述细胞的浓度将随许多因素而变化，所述因素包括正在使用的细胞毒性T淋巴细胞的类型、CAR的结合特异性、寻靶部分和小分子配体的特性、癌症的特性、癌症在患者中的位置、用于将组合物施用给患者的方式和正在治疗的患者的健康、年龄和重量。但是，包含转导的CAR T细胞的合适组合物包括具有约5 ml至约200 ml之间的体积的那些，其含有约1 X 105至约1 X 1015个转导的CAR T细胞。典型的组合物包含约10 ml至约125 ml之间的体积，其含有约1 X 107至约1 X 1010个CAR T细胞。一种示例性的组合物包含在约100 ml体积中的约1 X 109个CAR T细胞。在一个方面，可以将单剂量或多剂量的CAR T细胞施用给患者。
在不同的实施方案中，要治疗的癌症是癌、肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、鼻咽癌、白血病、腺癌或骨髓瘤。在其它实施方案中，所述癌症可以是肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑素瘤、眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三重阴性的乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊椎肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤或胃食管连接部的腺癌。
在这些实施方案的某些方面，所述癌症是表达叶酸受体的癌症。在这些实施方案的某些方面，所述癌症是子宫内膜癌、非小细胞肺癌、卵巢癌或三重阴性的乳腺癌。在另一个实施方案中，正在成像的癌症是肿瘤。在另一个实施方案中，所述癌症是恶性的。
使用本领域已知的任意合适方法，可以将本文描述的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐或CAR T细胞组合物施用给患者。如本文中所述的，术语“施用”或“给药”包括将所述化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐或CAR T细胞组合物引入患者中的所有方式，包括、但不限于，口服(po)、静脉内(iv)、肌肉内(im)、皮下(sc)、透皮等。可以在含有常规的无毒的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的单位剂型和/或制剂中施用本文描述的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐。
在一个方面，可以将如本文中所述的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐或CAR T细胞组合物直接施用进血流中、肌肉中或内部器官中。用于这样的胃肠外施用的合适途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、硬膜外、脑室内、尿道内、胸骨内、颅内、肿瘤内、肌肉内和皮下递送。在一个实施方案中，用于胃肠外施用的方式包括针头(包括显微操作针)注射器、无针注射器和输注技术。
在一个示例性的方面，胃肠外制剂通常是水溶液，其可以含有载体或赋形剂诸如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地在3-9的pH)，但是它们可以更适当地配制为无菌的非水性溶液或要与合适的媒介物（诸如无菌的、无热原的水或无菌的盐水）结合使用的干燥形式。在其它实施方案中，本文描述的任何液体制剂可以适合用于如本文中所述的胃肠外施用。使用本领域技术人员众所周知的标准制药技术，可以容易地完成在无菌条件下的制备，对于胃肠外制剂通过冻干法来生产无菌的冻干的粉末。在一个实施方案中，通过使用适当的制剂技术，诸如增溶剂的掺入，可以增加在胃肠外制剂的制备中使用的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐的溶解度。
在某些实施方案中，通过调整第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的浓度，可以调节肿瘤裂解速率。因此，通过改变第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的浓度，可以调节CAR T细胞组合物的细胞毒性。在某些实施方案中，通过调整第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的浓度，可以相对于如本文中所述的肿瘤溶解综合征或细胞因子释放综合征(CRS)的风险平衡CAR T细胞组合物的细胞毒性。应当理解，第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的浓度可以随施用给患者的第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的量或剂量而变化。
要施用给患者的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐的量可以显著地随正在治疗的癌症、化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐的施用途径和组织分布而变化。要施用给患者的量可以基于体表面积、质量和医师评估。在不同的实施方案中, 要施用的量可以在以下范围内：例如，约0.05 mg至约30mg、0.05 mg至约25.0 mg、约0.05 mg至约20.0 mg、约0.05 mg至约15.0 mg、约0.05 mg至约10.0 mg、约0.05 mg至约9.0 mg、约0.05 mg至约8.0 mg、约0.05 mg至约7.0 mg、约0.05 mg至约6.0 mg、约0.05 mg至约5.0 mg、约0.05 mg至约4.0 mg、约0.05 mg至约3.0 mg、约0.05mg至约2.0 mg、约0.05 mg至约1.0 mg、约0.05 mg至约0.5 mg、约0.05 mg至约0.4 mg、约0.05 mg至约0.3 mg、约0.05 mg至约0.2 mg、约0.05 mg至约0.1 mg、约.01 mg至约2 mg、约0.3 mg至约10 mg、约0.1 mg至约20 mg、或约0.8至约3 mg。本领域技术人员会容易地认识到，所述剂量可以基于上面指出的因素在上面提供的各种范围内变化，且可以根据医师的判断。
在其它实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量可以在以下范围内：例如，约50nmol/kg至约3000 nmol/kg患者体重、约50 nmol/kg至约2000 nmol/kg、约50 nmol/kg至约1000 nmol/kg、约50 nmol/kg至约900 nmol/kg、约50 nmol/kg至约800 nmol/kg、约50nmol/kg至约700 nmol/kg、约50 nmol/kg至约600 nmol/kg、约50 nmol/kg至约500 nmol/kg、约50 nmol/kg至约400 nmol/kg、约50 nmol/kg至约300 nmol/kg、约50 nmol/kg至约200 nmol/kg、约50 nmol/kg至约100 nmol/kg、约100 nmol/kg至约300 nmol/kg、约100nmol/kg至约500 nmol/kg、约100 nmol/kg至约1000 nmol/kg、约100 nmol/kg至约2000nmol/kg患者体重。在其它实施方案中，所述剂量可以是约100 nmol/kg、约150 nmol/kg、约200 nmol/kg、约250 nmol/kg、约300 nmol/kg、约350 nmol/kg、约400 nmol/kg、约450nmol/kg、约500 nmol/kg、约600 nmol/kg、约700 nmol/kg、约800 nmol/kg、约900 nmol/kg、约1000 nmol/kg、约2000 nmol/kg或约3000 nmol/kg患者体重。在这些实施方案中，“kg”是千克患者体重。在一个方面，可以将单剂量或多剂量的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐施用给患者。
在另一个实施方案中，将约20 ug/kg患者体重至约3 mg/kg患者体重的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐施用给患者。在另一个方面，量可以是在约0.2 mg/kg患者体重至约0.4 mg/kg患者体重之间，或可以是约50 ug/kg患者体重。在一个方面，可以将单剂量或多剂量的化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐施用给患者。
在一个实施方案中，可以将与寻靶部分连接的小分子配体在CAR T细胞组合物之前施用给患者。在另一个实施方案中，可以将与寻靶部分连接的小分子配体与CAR T细胞组合物同时、但是在不同的制剂中施用给患者。在另一个实施方案中，可以将与寻靶部分连接的小分子配体在CAR T细胞组合物之后施用给患者。
在一个示例性的方面，CAR T细胞和与寻靶部分连接的小分子的施用之间的时间可以随多种因素宽泛地变化，所述因素包括正在使用的CAR T细胞的类型、CAR的结合特异性、寻靶部分和配体的特性、癌症的特性、癌症在患者中的位置、用于将CAR T细胞和与寻靶部分连接的小分子配体施用给患者的方式、以及患者的健康、年龄和重量。在一个方面，可以在CAR T细胞之前或之后施用与寻靶部分连接的小分子配体，诸如在约3、6、9、12、15、18、21或24小时内，或在约0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 5、6、7、8、9、10或更多天内。
在某些实施方案中，通过调整第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的施用速率，可以调节肿瘤裂解速率。因此，通过改变第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的施用速率，可以调节CAR T细胞组合物的细胞毒性。在某些实施方案中，通过调整第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的施用速率，可以相对于如本文中所述的肿瘤溶解综合征或细胞因子释放综合征(CRS)的风险平衡CAR T细胞组合物的细胞毒性。应当理解，第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的施用速率可以随本领域已知的任何适用给药计划而变化。例如，施用速率可以随给药计划而变化，所述给药计划基于连续给药、每天1次给药(又名qd)、每天2次给药(又名bid)、每天3次给药(又名tid)、每周2次(又名BIW)、每周3次(又名TIW)、每周1次等。应当理解，为第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐选择的给药计划可以与浓度关联地应用以调节CAR T细胞组合物的细胞毒性。在某些实施方案中，通过与第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐、或第一种和第二种缀合物或其药学上可接受的盐的浓度关联地调整给药计划，可以相对于如本文中所述的肿瘤溶解综合征或细胞因子释放综合征(CRS)的风险平衡CAR T细胞组合物的细胞毒性。
在本文所述的方法的一个实施方案中，在将所述化合物或其药学上可接受的盐、第一种缀合物或其药学上可接受的盐、第二种缀合物或其药学上可接受的盐施用给患者之前，或在将所述CAR T细胞组合物施用给患者之前，将癌症成像。在一个示例性实施方案中，通过PET成像进行成像。在其它示例性实施方案中，通过MRI成像或SPECT/CT成像进行成像。本领域技术人员会明白，所述成像方法可以是本领域已知的任意合适的成像方法。
在本文描述的任一个实施方案中，即使对癌症的CAR T细胞毒性发生，在患者中产生‘脱靶’毒性的细胞因子释放也不可能发生。在本文描述的任何实施方案中，即使对癌症的CAR T细胞毒性发生，‘脱靶’组织毒性也不可能在患者中发生。在本文描述的任何实施方案中，所述癌症可以包含肿瘤，且患者中的肿瘤大小可以减小，即使‘脱靶’毒性不会发生。
实施例
实施例1
编码CAR基因的慢病毒载体的制备
使用重叠PCR方法来制备包含针对荧光素的scFv的CAR构建体。合成了针对荧光素的scFv，即从抗-荧光素(4-4-20)抗体衍生出的4M5.3 (Kd = 270 fM, 762碱基对)。通过重叠PCR将如在图14A中所示编码人CD8α信号肽(SP，63碱基对)、铰链和跨膜区域(249碱基对)、4-1BB的细胞质结构域(CD137，141碱基对)和CD3ζ链(336碱基对)的序列与抗-荧光素scFV融合。将得到的CAR构建体(1551碱基对)插入EcoRI/NotI切割过的慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-(PGK-GFP) (图14B, System Biosciences)中。通过DNA测序来证实慢病毒载体中的CAR构建体的序列。
一种示例性的CAR核酸编码序列可以包含：
。
在上面显示的示例性核酸序列中，第一个ATG是起始密码子。一种示例性的CAR氨基酸序列可以包含：
一种示例性的插入物可以包含：
在上面所示的示例性插入物中，第一个GCCACC序列可以是限制性酶切割位点，继之以ATG起始密码子。一种示例性的插入物氨基酸序列可以包含：
实施例2
用于人T细胞转导的含有CAR基因的慢病毒的制备
为了制备含有抗-荧光素单链片段可变(scFv) CAR的慢病毒，用编码抗-荧光素scFvCAR的慢病毒载体和第2代包装质粒的混合物(Cellecta)共转染293TN包装细胞系。在24和48小时的转染以后，将含有具有CAR基因的慢病毒的上清液收获，并将病毒颗粒通过标准聚乙二醇病毒浓缩方法(Clontech)浓缩用于将来的人T细胞转导。
实施例3
从人PBMC分离人T细胞
通过Ficoll密度梯度离心(GE Healthcare Lifesciences)从人外周血单核细胞(PBMC)分离T细胞。洗掉残留的Ficoll溶液以后，使用EasySep™Human T Cell IsolationKit (STEM CELL technologies)分离T细胞。将纯化的T细胞在有人IL-2 (100 IU/mL,Miltenyi Biotech Inc)存在下在含有1%青霉素和硫酸链霉素的TexMACSTM培养基(Miltenyi Biotech Inc)中培养。在多孔平板中在1x106个细胞/mL的密度培养T细胞。将T细胞拆分并每2-3天重新补料。
实施例4
人T细胞的转导
将分离的T细胞在有人IL-2 (100 IU/mL)存在下用与抗-CD3/CD28抗体(LifeTechnologies)偶联的Dynabeads活化12-24小时，然后用编码抗-荧光素CAR基因的慢病毒转导。在72小时以后收获细胞，并通过使用流式细胞计量术测量GFP荧光细胞来鉴别转导的T细胞上的CAR的表达。如在图15A中所示，未转导的T细胞没有显示GFP表达。如在图15B中所示，转导的T-细胞表达GFP。
实施例5
FITC-叶酸的合成
在有四甲基胍和二异丙胺存在下在无水二甲基亚砜(DMF)中将叶酸-γ-乙二胺与异硫氰酸荧光素(FITC)异构体I (Sigma-Aldrich)偶联。将粗产物加载到Xterra RP18制备型HPLC柱(Waters)上并用梯度条件洗脱，所述梯度条件开始于99%5 mM磷酸钠(流动相A, pH7.4)和1%乙腈(流动相B)并在10 min中达到90%A和10%B，流速为20 mL/min。在这些条件下，FITC-叶酸主峰通常在27-50 min洗脱。通过具有紫外检测器的分析型反相HPLC监测FITC-叶酸级分的特性。将具有大于98.0%纯度(LCMS)的级分冻干以得到最终的FITC-叶酸产物。
实施例6
FITC-PEG12-叶酸的合成
将通用的聚乙二醇(PEG) Nova TagTM树脂(0.2 g)加载进肽合成容器中，并用异丙醇(i-PrOH) (3 x 10 mL)和二甲基甲酰胺(DMF, 3 x 10mL)洗涤。使用20%的哌啶在DMF中的溶液(3 x 10 mL)进行9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)去保护。执行Kaiser试验以评估反应进程。然后向所述容器引入Fmoc-L-谷氨酸5-叔丁酯(Fmoc-Glu-(O-t-Bu)-OH) (23.5 mg)在DMF、N,N-二异丙基乙胺(i-Pr2NEt) (4当量)和苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP) (2当量)中的溶液。使用20%的哌啶在DMF中的溶液(3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。然后向所述容器引入N10-TFA-Pte-OH (22.5 mg)、DMF、i-Pr2NEt (4当量)和PyBOP (2当量)的溶液。用氩气鼓泡2 h，并将所述树脂用DMF (3 x 3 mL)和i-PrOH (3 x 3 mL)洗涤。使树脂在二氯甲烷(DCM)中膨胀以后，加入1M羟基苯并三唑(HOBT)在DCM/三氟乙烷(TFE)(1:1)中的溶液(2 x 3 mL)。用氩气鼓泡1 h，将溶剂除去，并将树脂用DMF (3 x 3 mL)和i-PrOH (3 x 3 mL)洗涤。使树脂在DMF中膨胀以后，加入Fmoc-NH-(PEG)12-COOH (46.3 mg)在DMF、i-Pr2NEt (4当量)和PyBOP (2当量)中的溶液。用氩气鼓泡2 h，并将树脂用DMF (3 x3 mL)和i-PrOH (3 x 3 mL)洗涤。使用20%的哌啶在DMF中的溶液(3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。执行Kaiser试验以评估反应进程。然后向所述容器引入FITC (Life Technologies21.4 mg)在DMF和i-Pr2NEt (4当量)中的溶液，然后用氩气鼓泡2 h，并将树脂用DMF (3 x3 mL)和i-PrOH (3 x 3 mL)洗涤。然后向所述容器加入2%的NH2NH2在DMF中的溶液(2 x2mL)。将最终的化合物使用TFA:H2O: 三异丙基硅烷(TIS) (95:2.5:2.5) (切割溶液)从所述树脂切割并在真空下浓缩。将浓缩的产物在Et2O中沉淀并在真空下干燥。将粗产物使用制备型RP-HPLC (流动相: A = 10 mM乙酸铵pH = 7, B = ACN；方法: 在30 min中0%B至30%B，在13 mL/min)纯化。将纯的级分合并和冷冻干燥，从而得到FITC-PEG12-叶酸。
实施例7
FITC-PEG20-叶酸的合成
将乙二胺、聚合物结合的(200-400目)-树脂(50 mg)加载进肽合成容器中并用DCM (3mL)膨胀，随后用DMF (3 mL)膨胀。然后向所述容器引入Fmoc-PEG20-COOH (131 mg, 1.0当量)在DMF、i-Pr2NEt (6.0当量)和PyBOP (4.0当量)中的溶液。用氩气鼓泡6 h，将偶联溶液排空，并将树脂用DMF (3 x 10 mL)和i-PrOH (3 x 10 mL)洗涤。执行Kaiser试验以评估反应进程。在每次氨基酸偶联之前，使用20%的哌啶在DMF中的溶液(3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。重复以上顺序以Fmoc-Glu-OtBu (72 mg, 2.0当量)和Tfa.Pteroic-acid (41 mg, 1.2当量)偶联步骤结束反应。将树脂用2%的肼在DMF中的溶液3 x 10 mL (5 min)洗涤以切割蝶酸上的三氟-乙酰基保护基，并用i-PrOH (3 x 10 mL)洗涤，随后用DMF (3 x 10mL)洗涤。将树脂在氩气下干燥30 min。使用切割溶液从树脂切割叶酸-肽。引入10 mL切割混合物，并用氩气鼓泡1.5 h。将切割混合物排入干净烧瓶中。将树脂用更多的切割混合物洗涤3次。将合并的混合物在减压下浓缩至更小的体积(~ 5 mL)并在乙醚中沉淀。
将沉淀物通过离心进行收集，用乙醚洗涤(3次)，并在高真空下干燥。将干燥的叶酸-PEG20-EDA (1.0当量)在室温用在DMSO和DIPEA中的FITC (50 mg, 1.5当量)处理。通过LCMS监测反应进程。8 h以后，耗尽起始原料，得到产物。通过制备型HPLC (流动相A = 10mM乙酸铵, pH = 7；有机相B = 乙腈；方法: 在35分钟中0%B至30%B，在13 mL/min)纯化粗制的反应混合物，并以60%收率得到FITC-PEG20-叶酸。
实施例8
FITC-PEG108-叶酸的合成
将乙二胺、聚合物结合的(200-400目)-树脂(50 mg)加载进肽合成容器中并用DCM (3mL)膨胀，随后用DMF (3 mL)膨胀。然后向所述容器引入Fmoc-PEG36-COOH (161 mg、1.0当量)在DMF、i-Pr2NEt (6.0当量)和PyBOP (4.0当量)中的溶液。用氩气鼓泡6 h，将偶联溶液排空，并将树脂用DMF (3 x 10 mL)和i-PrOH (3 x 10 mL)洗涤。执行Kaiser试验以评估反应进程。在每次氨基酸偶联之前，使用20%的哌啶在DMF中的溶液(3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。重复以上顺序以2X Fmoc-PEG36-COOH (161 mg、1.0当量)、Fmoc-Glu-OtBu (72 mg、2.0equiv)和Tfa.Pteroic-acid (41.0 mg、1.2当量)偶联步骤结束反应。最后，将树脂用2%的肼在DMF中的溶液3 x 10mL (5 min)洗涤以切割蝶酸上的三氟-乙酰基保护基，并用i-PrOH(3 x 10mL)洗涤，随后用DMF (3 x 10mL)洗涤。将树脂在氩气下干燥30 min。使用切割溶液从树脂切割叶酸-肽。引入10 mL切割混合物，并用氩气鼓泡1.5 h。将切割混合物排入干净烧瓶中。将树脂用更多的切割溶液洗涤3次。将合并的混合物在减压下浓缩至更小的体积(~5 mL)并在乙醚中沉淀。
将沉淀物通过离心进行收集，用乙醚洗涤(3次)，并在高真空下干燥。将干燥的叶酸-PEG108-EDA (1.0当量)在室温用在DMSO和DIPEA中的FITC (50 mg, 1.5当量)处理。通过LCMS监测反应进程。10 h以后，耗尽起始原料，得到产物。通过制备型HPLC (流动相A =10mM乙酸铵, pH = 7；有机相B = 乙腈；方法:在35分钟中0%B至30%B，在13 mL/min)纯化粗制的反应混合物，并以64%收率得到FITC-PEG108-叶酸。
实施例9
FITC-DUPA的合成
如下通过固相方法合成DUPA−FITC。将通用的Nova TagTM树脂(50 mg, 0.53 mM)用DCM(3 mL)膨胀，随后用DMF(3 mL)膨胀。将20%的哌啶在DMF中的溶液(3×3 mL)加给树脂，并用氩气鼓泡5 min。将树脂用DMF (3×3 mL)和异丙醇(i-PrOH，3×3 mL)洗涤。使树脂在DMF中膨胀以后，加入DUPA-(OtBu)-OH (1.5当量)、HATU (2.5当量)和i-Pr2NEt (4.0当量)在DMF中的溶液。用氩气鼓泡2 h，并将树脂用DMF (3×3 mL)和i-PrOH (3×3 mL)洗涤。在DCM中膨胀树脂以后，加入1 M HOBt在DCM/TFE (1:1)中的溶液(2×3 mL)。用氩气鼓泡1 h，将溶剂除去并将树脂用DMF (3×3 mL)和i-PrOH (3×3 mL)洗涤。使树脂在DMF中膨胀以后，加入Fmoc-Phe-OH (2.5当量)、HATU (2.5当量)和DIPEA (4.0当量)在DMF中的溶液。用氩气鼓泡2 h，并将树脂用DMF (3×3 mL)和i-PrOH (3×3 mL)洗涤。重复以上顺序另外2个偶联步骤，用于添加8-氨基辛酸和异硫氰酸荧光素或异硫氰酸罗丹明B。将最终的化合物使用切割溶液从所述树脂切割并在真空下浓缩。将浓缩的产物在乙醚中沉淀并在真空下干燥。将粗产物使用制备型RP-HPLC [λ= 488 nm；溶剂梯度：在25 min中1%B至80%B，80%B洗涤30 min；A = 10 mM NH4OAc, pH = 7; B = 乙腈(ACN)]纯化。在真空下除去ACN，并将纯化的级分冷冻干燥以产生FITC-DUPA作为淡棕色-橙色固体。RP-HPLC: tR = 8.0 min (A = 10 mMNH4OAc, pH = 7.0; B = ACN, 溶剂梯度: 在10 min中1%B至50%B, 80%B洗涤15 min)。1HNMR (DMSO-d6/D2O): δ 0.98−1.27 (ms, 9H)；1.45 (b, 3H)；1.68−1.85 (ms, 11H)；2.03(m, 8H)；2.6−3.44 (ms, 12H)；3.82 (b, 2H)；4.35 (m, 1H)；6.53 (d, J = 8.1 Hz,2H), 6.61 (dd, J = 5.3, 3.5 Hz, 2H)；6.64 (s, 2H)；7.05 (d, J = 8.2 Hz, 2H),7.19 (m, 5H)；7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H)；8.38 (s, 1H)。HRMS (ESI) (m/z):C51H59N7O15S的(M + H)+ 计算值，1040.3712，实测，1040.3702。紫外可见光: λmax = 491nm。
实施例10
FITC-PEG12-DUPA的合成
将1,2-二氨基乙烷三苯甲基-树脂(0.025 g)加载进肽合成容器中，并用i-PrOH (3 x10 mL)洗涤，随后用DMF (3 x 10mL)洗涤。然后向所述容器引入Fmoc-NH-(PEG)12-COOH(42.8 mg)在DMF、i-Pr2NEt (2.5当量)和PyBOP (2.5当量)中的溶液。将得到的溶液用氩气鼓泡1 h，将偶联溶液排空，并将树脂用DMF (3 x 10 mL)和i-PrOH (3 x 10 mL)洗涤。执行Kaiser试验以评估反应进程。使用20%的哌啶在DMF中的溶液(3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。重复该操作以完成所有偶联步骤(在它们的各个偶联步骤的每一个上使用2 x 1.5当量的Fmoc-Phe-OH和1.5当量的8-氨基辛酸和1.2当量的DUPA)。DUPA偶联以后，将树脂用DMF (3x 10 mL)和i-PrOH (3 x 10 mL)洗涤并在减压下干燥。在肽合成容器中使用切割溶液从所述树脂切割肽。将15 mL切割溶液加入肽合成容器，并将反应物在氩气下鼓泡15 min。将树脂用另外两份10 mL量的切割溶液各处理5 min。将切割混合物浓缩至约5 mL并用乙醚沉淀。将沉淀物通过离心进行收集，用乙醚洗涤(3次)，并在高真空下干燥，导致粗制物质的回收。在室温向粗制的DUPA-(PEG)12-EDA (10 mg)和FITC (5.6 mg)在二甲基亚砜(DMSO, 1mL)中的搅拌溶液中加入i-Pr2NEt (5当量)并在氩气下搅拌6 h。通过LCMS监测反应并通过制备型HPLC (流动相: A = 10 mM乙酸铵pH = 7, B = ACN；方法: 在30 min中0%B至50%B，在13 mL/min)纯化。将纯化的级分合并和冷冻干燥，得到FITC-PEG12-DUPA。
实施例11
FITC-PEG11-NK1的合成
在氩气下在室温向NK-1 (0.02 g, 0.0433 mmol, 1.0当量)、O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(Boc-氨基)乙基]十乙二醇(BocNH-PEG11-NH2) (Sigma, 0.0336 g, 0.0521 mmol, 1.2当量)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP) (0.027 g, 0.0521 mmol,1.2当量)在无水CH2Cl2中的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA) (0.076 mL,0.4338 mmol, 10当量)。通过LCMS监测反应进程并通过制备型RP-HPLC (Waters,XBridgeTM Prep C18, 5 μm; 19×100 mm柱, 流动相A = 20 mM乙酸铵缓冲液, pH 7, B =乙腈, 梯度在30 min中10−100%B, 13 mL/min, λ= 220 nm, 254 nm)纯化。收集纯的级分，蒸发所有有机溶剂，并将样品冻干48 h以得到NK1-PEG11-NHBoc。收率：40.13 mg (97%)。向在无水DCM中的NK1-PEG11-NHBoc (0.0165 g, 0.015 mmol)中加入三氟乙酸(TFA, 20当量)，并将反应混合物在室温搅拌4 h。将多余的TFA除去，并将剩余的溶液用水稀释和使用CH2Cl2 (3 x 5 mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将得到的残余物在真空下干燥并不经进一步纯化用于下一步。在室温在氩气下将NK1-PEG11-NH2(0.008g, 0.0081 mmol, 1.0当量)、异硫氰酸荧光素(FITC) (Sigma, 0.0037 g, 0.0097 mmol,1.2当量)在无水二甲基亚砜(DMSO, 0.3 mL)中的搅拌溶液加入二异丙基乙基胺(0.0028mL, 0.0162 mmol, 2.0当量)中。通过LCMS监测反应进程并将产物通过制备型RP-HPLC(Waters, XBridgeTM Prep C18, 5 μm; 19×100 mm柱, 流动相A = 20 mM乙酸铵缓冲液,pH 7, B = 乙腈, 梯度在30 min中10−100%B , 13 mL/min, λ= 280 nm)纯化。收集纯的级分，蒸发所有有机溶剂，并将样品冻干48 h以8.54 mg (77%)的收率得到FITC-PEG11-NK1。
*注：从碱性配体开始通过两步操作合成NK-1化合物，所述碱性配体使用文献中的操作来制备(参考文献：DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDINGAGENT DELIVERY CONJUGATES, 申请号: PCT/US2015/44229；通过引用并入本文)。
实施例12
FITC-PEG2-CA9的合成
在50mL圆底烧瓶中使用Teflon磁力搅拌棒将CA9配体(53.6mg)溶解在DMF (2-3mL)中。将环境空气使用真空除去并用氮气替换，这在三个循环中完成。将圆底烧瓶保持在恒定氮气下。向烧瓶中加入28.9 mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，随后加入21.6mg 1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)和18.9 μL Boc-PEG2-NH2 (Sigma Aldrich)。加入5.4 μL三乙胺(TEA)，并将反应物搅拌过夜。将反应混合物使用HPLC纯化并用UHPLC-MS(831的靶m/z)证实。使用高真空旋转蒸发除去乙腈并将产物冻干。将化合物与1:1 TFA:DCM混合30分钟。使用高真空旋转蒸发除去TFA/DCM，随后在高真空下30分钟。然后将化合物溶解在DMF中并与5摩尔当量的i-Pr2NEt、16 mg异硫氰酸荧光素(Life Technologies)组合和搅拌1 h。将反应混合物通过HPLC纯化并用UHPLC-MS (1120的靶m/z)证实目标化合物。将样品冻干和在-20℃储存。
实施例13
转导的CAR-T细胞上的抗-FITC scFv表达的评价
为了证实功能性的抗-FITC scFv是否在转导的CAR T细胞的细胞表面上表达，将CAR T细胞与FITC-叶酸缀合物一起在冰上温育30 min。洗涤细胞以后，加入抗-叶酸抗体(SantaCruz)并在冰上温育30 min。最后，使用Alexa Fluor 647-标记的第二抗体(JacksonImmunoResearch)使表达功能性抗-FITC scFv的CAR T细胞显影。如在图16A中所示，转导的CAR T细胞显示GFP表达。如在图16B中所示，那些转导的CAR-T细胞可以结合FITC-叶酸缀合物，其通过免疫荧光标记而显影。
实施例14
体外CAR T细胞的细胞毒性测定
为了用期望的FITC-配体试验CAR T细胞的细胞毒性，使用来自ThermoFisherScientific的PierceTM LDH细胞毒性测定试剂盒执行标准的乳酸脱氢酶(LDH)释放测定。为了制备用于LDH测定的样品，将癌细胞以104个细胞/100µL培养基的密度接种在96孔板的每个孔中并培养过夜。次日以不同的数目制备CAR T细胞，以具有不同的效应细胞(CAR T细胞):靶细胞(癌细胞)比率(例如E:T=20:1、10:1、5:1和1:1)。将不同浓度的FITC-配体引入每个孔并共培养6-24小时。共温育以后，将含有CAR T细胞和癌细胞的平板在350 x g在室温离心10 min以除去细胞碎片或残余细胞。然后将每个样品的50µL上清液转移进新的96孔板。将50µL制备的LDH反应混合物加入每个转移的50µL样品并在室温温育30 min。加入50µL停止溶液，并在490nm和680nm测量每个样品的吸光度。使用以下方程式为每个样品计算细胞毒性百分比：
%细胞毒性=(实验值-效应细胞自发-靶细胞自发)/(靶细胞最大对照- 靶细胞自发对照) x 100。
如在图3A-C中所示，CAR T细胞仅在与匹配缀合物一起偶联至肿瘤抗原时被活化。图3A显示了使用100 nM每种缀合物对于10:1的E:T在KB (FR+)模型中的CAR T细胞的细胞毒性。FITC-叶酸、FITC-PEG20-叶酸和FITC-PEG108-叶酸活化大于FITC-DUPA或在没有缀合物存在下的活化。图3B显示了使用100 nM FITC-DUPA或FITC-PEG12-DUPA对于10:1的E:T在LNCaP (PSMA+)模型中的CAR T细胞的细胞毒性。FITC-DUPA缀合物显示与使用FITC-叶酸或在没有缀合物存在下相比更大的活化。图3C显示了使用100 nM FITC-PEG11-NK1对于10:1的E:T在HEK293 (NK1R+)模型中的CAR T细胞的细胞毒性。FITC-PEG11-NK1显示大于使用FITC-叶酸或在没有缀合物存在下的活化。
如在图3D中所示，在KB (FR+)模型中CAR T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性随在使用100nM FITC-叶酸和FITC-DUPA的测定中使用的E:T比率而变化。如在图3E中所示，在KB (FR+)模型中CAR T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性随在共温育中使用的FITC-叶酸的浓度(10:1的E:T比率)而变化。
如在图10中所示，通过调整缀合物桥的浓度，或使用具有不同PEG长度的接头（以10:1的E:T），可以控制在KB (FR+)模型中的CAR T细胞毒性。
实施例15
CAR T细胞增殖和CAR T细胞活化的鉴别
主要通过流式细胞计量术测量CAR T细胞增殖。首先，将癌细胞(KB (FR+)或HEK (NK1R+))以104个细胞/100µL培养基的密度接种在96孔板的每个孔中并培养过夜。次日，在有或没有期望的FITC-配体存在下将CAR T细胞引入每个孔，并将所述细胞共培养5天(120小时)。共温育以后，将CAR T细胞通过标准免疫染色操作(在冰上20 min)用抗-人CD3 APC抗体(Biolegend)染色。关于CAR T细胞增殖来计数抗-人CD3染色和GFP阳性的细胞。
如在图1A-B中所示，作为使用KB (FR+)细胞和HEK293 (NK1R+)细胞用FITC-小分子缀合物(100 nM)寻靶肿瘤细胞(E:T = 5:1)的结果，增殖CAR T细胞。图1A显示了在有具有不同缀合物的KB (FR+)细胞存在下的CAR T细胞增殖。图1B显示了在有具有不同缀合物的HEK (NK1R+)细胞存在下的CAR T细胞增殖。如在图1中可以进一步看到的，具有不同PEG长度的接头的存在会影响CAR-T细胞增殖的水平。
为了测量CAR T细胞活化，通过上述的相同操作制备癌细胞。在有或没有100 nMFITC-配体存在下共培养癌细胞和CAR T细胞（具有10:1的E:T比率）24小时并收获。洗涤以后，将来自每个样品的细胞用抗-人CD69 Alexa Fluor 647 (Biolegend)染色。在GFP阳性的T细胞的门控下分析数据，以便量化CAR T细胞活化。如在图17中所示，CD69表达与共培养的缀合物有关。
实施例16
IFN- γ产生测定
为了试验CAR T细胞对IFN- γ的产生，使用来自Biolegend的人IFN- γ检测ELISA试剂盒执行标准ELISA测定。简而言之，将癌细胞以104个细胞/100µL培养基的密度接种在96孔板的每个孔中并培养过夜。将CAR T细胞引入每个具有期望的FITC-配体的癌症样品并共培养24小时。共温育以后，将每个样品的上清液收获并在1000 x g和4℃离心10 min以除去细胞碎片。然后将来自每个样品的澄清上清液用于通过ELISA检测IFN- γ或在-80℃储存用于将来使用。完成每个样品的制备以后，基于生产商的说明书执行标准ELISA。
如在图2A-C中所示，对于在KB细胞(FR+) (图2A)、LNCaP (PSMA+) (图2B)或HEK(NK1R+) (图2C)中的5:1的E:T比率，CAR T细胞在有100 nM FITC-小分子缀合物存在下产生显著量的炎症性细胞因子。如可以进一步看到的，细胞因子的量依赖于使用的缀合物。如在图2D中所示，炎症性细胞因子的量与KB (FR+)细胞所用的FITC-叶酸的浓度有关。如在图2E和2F中所示，不同缀合物(100 nM)产生KB (FR+)细胞的不同IFN- γ应答。
如在图4A-B中所示，CAR T细胞的活化与KB (FR+)细胞和MDA-MB-231细胞中的肿瘤抗原水平相关。测量将所述细胞与相同缀合物剂量一起温育的IFN- γ产生表明，抗-FITC CAR T细胞的活化与癌细胞上的肿瘤抗原表达水平相关。
实施例17
肿瘤抗原水平和CAR-T活化之间的关联的评价
将KB (FR+)细胞和MDA-MB-231细胞与100 nM FITC-叶酸一起在冰上温育30 min。洗涤以后，通过流式细胞计量术测量与细胞上的FRα肿瘤抗原结合的FITC-叶酸。如在图4A中所示，KB (FR+)细胞具有与MDA-MB-231细胞相比更高的FR表达水平和对应的FITC结合。
在有100 nM FITC-叶酸、FITC-PEG20-叶酸和FITC-PEG108-叶酸存在下以10:1的E:T比率将这两种细胞系与CAR T细胞一起共培养24小时。通过测量它的INF- γ产生来检测CAR T细胞活化。收获培养的细胞的上清液，并使用ELISA试剂盒测量IFN- γ产生。如在图4B中所示，对于较高的FRα水平，KB细胞(FR+)细胞比MDA-MB-231细胞好得多地活化CAR T细胞。
实施例18
体内CAR T细胞的抗肿瘤效力
使用免疫缺陷的NSG小鼠(Jackson Laboratory)鉴别体内CAR T细胞抗肿瘤活性的效力。将每种表达肿瘤特异性抗原的癌细胞系皮下地注射进NSG小鼠的肩膀以建立实体瘤异种移植物。当达到约50-100 mm3的肿瘤体积时，将CAR T细胞引入携带肿瘤的小鼠中，并还每隔一天引入(静脉内)期望的FITC-配体。给对照小鼠施用PBS而不是FITC-配体。测量肿瘤体积和血液中的细胞因子水平(IL2、IL6、IL10、IFNγ和TNFα)。通过测量重量减轻来监测疗法的一般毒性。在每次治疗结束时，收集小鼠血液来试验贫血、白血细胞的数目和CAR T细胞增殖。还评价了小鼠器官。
使用HEK293 (NK1R+)细胞的异种移植物模型显示在图5A-C和6A-B中。如在图5A中所示，肿瘤大小在用FITC-PEG11-NK1 (500 nmol/kg)治疗的小鼠中减小，但是在对照小鼠中继续生长。如在图5B中所示，用FITC-PEG11-NK1治疗的小鼠的体重相对于对照小鼠没有变化。如在图5C中所示，人T细胞中的CAR T细胞的百分比在CAR T细胞注射以后增加。如在图6A-B中所示，在治疗2周以后，与从对照组(6A)收获的小鼠器官相比，从治疗组(6B)收获的器官表现出正常大小，没有细胞因子释放综合征的迹象。
使用MDA-MB-231 (FR+)细胞的异种移植物模型显示在图7A-C和8A-B中。如在图7A中所示，肿瘤大小在用FITC-PEG12-叶酸(500 nmol/kg)或FITC-叶酸(500 n摩尔/kg)治疗的小鼠中减小，但是肿瘤在对照小鼠中继续生长。如在图7B中所示，用FITC-PEG11-NK1治疗的小鼠的体重在治疗过程中没有变化。如在图7C中所示，人T细胞中的CAR T细胞的百分比在CAR T细胞和缀合物疗法以后增加。如在图8A-B中所示，在治疗3周以后，与从对照组(8A)收获的小鼠器官相比，从用FITC-PEG12-叶酸(8B)治疗的小鼠收获的器官表现出正常大小，没有观察到细胞因子释放综合征的迹象。如在该专利申请的任何实施方案中使用的，“nmol/kg”和“n摩尔/kg”是等同的。
如在图9中所示，使用FITC-PEG11-NK1 (500 n摩尔/kg)的HEK-NK1R模型和使用FITC-PEG12-叶酸(500 n摩尔/kg)的MDA-MB-231模型的血液指数也指示，在治疗过程中没有发生细胞因子风暴。
如在图11、12A-C和13中所示，用两种不同浓度的FITC-PEG12-叶酸处理KB (FR+)肿瘤异种移植物。如在图11中所示，与用较高剂量(500 n摩尔/kg)治疗的小鼠相比，用较低剂量(250 n摩尔/kg)治疗的小鼠具有更轻的体重损失。如在图12A-C中所示，与较高剂量(图12C)相比，从未治疗的小鼠(图12A)和接受较低剂量的小鼠(图12B)收获的器官显示更轻的细胞因子释放综合征。如在图13中所示，接受较低剂量的KB异种移植物小鼠显示更好的血液指数，从而指示更温和的细胞因子释放。
实施例19
体内CAR T细胞的抗肿瘤效力
为了研究相同的抗-FITC CAR T细胞是否可以根除具有FITC-配体的混合液的异质癌细胞的混合物，将免疫缺陷的NSG小鼠(Jackson Laboratory)用于体内研究。将两种不同的癌细胞系(例如MDA-MB-231(FR+)和HEK(NK1R+))植入同一小鼠的单独胁腹。然后，当肿瘤体积达到约50-100mm3时，通过静脉内注射引入抗-FITC CAR T细胞(107个细胞)。另外，每隔一天通过静脉内注射引入FITC-配体的混合物(即FITC-PEG12-叶酸(500nmol/kg)和FITC-PEG11-NK1R (500nmol/kg))、单独的FITC-PEG11-NK-1R (500nmol/kg)或PBS。通过每隔一天测量肿瘤体积，分析具有FITC-配体的CAR T细胞的抗肿瘤效力。
如在图19A-C中所示，当引入FITC-PEG11-NK1R和FITC-PEG12-叶酸时，相同的抗-FITC CAR T细胞消除了两种肿瘤(即MDA-MB-231 (MDA)和HEK (NK1R))。在仅用FITC-PEG11-NK1R治疗的小鼠中，仅HEK (NK1R)肿瘤被根除。不受理论的约束，据信，在仅施用FITC-PEG11-NK1R的情况下，因为没有施用FITC-PEG12-叶酸，MDA-MB-231继续在同一小鼠中生长。如预期的，当引入PBS时，两种肿瘤没有显示任何应答。这些数据提示，相同的抗-FITC CAR T细胞可以根除抗原性上异质的肿瘤混合物（尽管具有FITC-配体的混合液）。

Claims (72)

1.一种治疗癌症的方法，所述方法包括
i)给患者施用第一剂量化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包含通过接头与寻靶部分连接的小分子配体；
ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR；
ii)给所述患者施用第二剂量所述化合物或其药学上可接受的盐，其中所述第二剂量不同于所述第一剂量；和
iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
2.一种治疗癌症的方法，所述方法包括
i)给所述患者施用第一种缀合物或其药学上可接受的盐；
ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR；
iii)给所述患者施用第二种缀合物或其药学上可接受的盐，
其中所述第一种和所述第二种缀合物各自包含通过接头与寻靶部分连接的小分子配体，且其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物是不同的；和
iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
3.一种治疗癌症的方法，所述方法包括
i)给患者施用第一剂量第一种缀合物或其药学上可接受的盐；
ii)给所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含针对所述寻靶部分的CAR；
ii)给所述患者施用第二剂量第二种缀合物或其药学上可接受的盐，
其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物各自包含与寻靶部分连接的小分子配体，其中所述第一种缀合物和所述第二种缀合物是不同的，且其中所述第一剂量和所述第二剂量是不同的；和
iv)治疗所述患者以改善所述癌症。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头是不同的。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的接头是相同的。
6.根据权利要求2-5中的任一项所述的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体是不同的。
7.根据权利要求2-5中的任一项所述的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的配体是相同的。
8.根据权利要求2-7中的任一项所述的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分是不同的。
9.根据权利要求2-7中的任一项所述的方法，其中在所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分和在所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐中的寻靶部分是相同的。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中所述配体选自叶酸、DUPA、CAIX配体、NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体和CCK2R配体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述配体是叶酸。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述配体是NK-1R配体。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述配体是DUPA。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述配体是CCK2R配体。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述配体是γ谷氨酰基转肽酶的配体。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的方法，其中所述寻靶部分选自2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛配基、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、五氟苯基酯(PFP)、四氟苯基酯(TFP)、knottin、centyrin和DARPin。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述寻靶部分是FITC。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述寻靶部分是DNP。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述寻靶部分是TNP。
20.根据权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中所述接头包含聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、亲水氨基酸、糖、非天然的肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和/或pluronic F-127。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述接头包含PEG。
22.根据权利要求1-21中的任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐具有下式
其中B代表小分子配体，L代表接头，且T代表寻靶部分，且其中L包含具有下式的结构
其中n是0-200的整数。
23.根据权利要求22所述的方法，其中n是0-150的整数。
24.根据权利要求22所述的方法，其中n是0-110的整数。
25.根据权利要求22所述的方法，其中n是0-20的整数。
26.根据权利要求22所述的方法，其中n是15-20的整数。
27.根据权利要求22所述的方法，其中n是15-110的整数。
28.根据权利要求1-27中的任一项所述的方法，其中所述接头包含PEG，且所述寻靶部分是FITC或其药学上可接受的盐。
29.根据权利要求1-28中的任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约10 nmol/kg至约3000 nmol/kg患者体重。
30.根据权利要求1-29中的任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约50 nmol/kg至约2000 nmol/kg患者体重。
31.根据权利要求1-30中的任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约100 nmol/kg至约1000 nmol/kg患者体重。
32.根据权利要求1-31中的任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约100 nmol/kg至约600 nmol/kg患者体重。
33.根据权利要求1-32中的任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约200 nmol/kg至约500 nmol/kg患者体重。
34.根据权利要求1-33中的任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐的剂量是约250 nmol/kg至约500 nmol/kg患者体重。
35.根据权利要求1-34中的任一项所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑素瘤、眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三重阴性的乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊椎肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤和胃食管连接部的腺癌。
36.根据权利要求1-11或16-35中的任一项所述的方法，其中所述癌症是表达叶酸受体的癌症。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症是子宫内膜癌。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
39.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症是三重阴性的乳腺癌。
41.根据权利要求1-40中的任一项所述的方法，其中所述CAR具有识别区域且所述识别区域是抗体的单链片段可变(scFv)区域。
42.根据权利要求1-11、16-17或20-41中的任一项所述的方法，其中所述CAR具有识别区域且所述CAR的识别区域是抗-FITC抗体的单链片段可变(scFv)区域。
43.根据权利要求1-42中的任一项所述的方法，其中所述CAR具有共刺激结构域且所述共刺激结构域选自CD28、CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)和CD278 (ICOS)。
44.根据权利要求1-43中的任一项所述的方法，其中所述CAR具有活化信号结构域且所述活化信号结构域是T细胞CD3ζ链或Fc受体γ。
45.根据权利要求1-11、16-17或20-41中的任一项所述的方法，其中所述CAR具有识别区域且所述识别区域是抗-FITC抗体的单链片段可变(scFv)区域，其中所述CAR具有共刺激结构域且所述共刺激结构域是CD137 (4-1BB)，且其中所述CAR具有活化信号结构域且所述活化信号结构域是T细胞CD3ζ链。
46.根据权利要求1-45中的任一项所述的方法，其中施用多剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐和所述CAR T细胞组合物。
47.根据权利要求1-46中的任一项所述的方法，其中在施用所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐之前，或在施用所述CAR T细胞组合物之前，将所述患者成像。
48.根据权利要求1-47中的任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐、所述第一种缀合物或其药学上可接受的盐、或所述第二种缀合物或其药学上可接受的盐不是抗体，且不包含抗体的片段。
49.根据权利要求1-48中的任一项所述的方法，其中所述寻靶部分不是肽表位。
50.根据权利要求1-49中的任一项所述的方法，其中在所述患者中产生‘脱靶’毒性的细胞因子释放不会发生，且其中对所述癌症的CAR T细胞毒性发生。
51.根据权利要求1-50中的任一项所述的方法，其中‘脱靶’组织毒性不会在所述患者中发生，且其中对所述癌症的CAR T细胞毒性发生。
52.根据权利要求1-51中的任一项所述的方法，其中所述癌症包含肿瘤，其中肿瘤大小在所述患者中减小，且其中‘脱靶’毒性不会发生。
53.一种CAR T细胞，其包含含有SEQ ID NO:1的核酸。
54.一种CAR T细胞，其包含含有SEQ ID NO:2的多肽。
55.一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO:1且编码嵌合抗原受体。
56.一种嵌合抗原受体多肽，其包含SEQ ID NO:2。
57.一种载体，其包含SEQ ID NO:1。
58.根据权利要求57所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
59.根据权利要求1-56中的任一项所述的方法、CAR T细胞、分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸或嵌合抗原受体多肽，其中所述CAR包含人氨基酸序列。
60.根据权利要求1-56中的任一项所述的方法、CAR T细胞、分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸或嵌合抗原受体多肽，其中所述CAR由人氨基酸序列组成。
61.一种试剂盒，其包含至少两种不同类型的桥，其中所述桥包含与寻靶部分连接的小分子配体，其中所述至少两种不同类型的桥中的配体是不同的，且其中所述配体选自叶酸、DUPA、CAIX配体、NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体和CCK2R配体。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述桥中的至少一种的配体是NK-1R配体。
63.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述桥中的至少一种的配体是γ谷氨酰基转肽酶的配体。
64.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述桥中的至少一种的配体是叶酸。
65.根据权利要求61-64中的任一项所述的试剂盒，其中所述桥具有下式
其中B代表小分子配体，L代表接头，且T代表寻靶部分，且其中L包含具有下式的结构
其中n是0-200的整数。
66.根据权利要求65所述的试剂盒，其中n是0-150的整数。
67.根据权利要求65所述的试剂盒，其中n是0-110的整数。
68.根据权利要求65所述的试剂盒，其中n是0-20的整数。
69.根据权利要求65所述的试剂盒，其中n是15-20的整数。
70.根据权利要求65所述的试剂盒，其中n是15-110的整数。
71.根据权利要求1-10、16-52或59-60中的任一项所述的方法，或根据权利要求61-70中的任一项所述的试剂盒，其中所述配体是CAIX配体。
72.下式的缀合物
。
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