CN115068625A - Pd-l1和tlr7双靶向纳米抗体偶联药物及其在抗肿瘤中的应用 - Google Patents

Pd-l1和tlr7双靶向纳米抗体偶联药物及其在抗肿瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗PD‑L1纳米抗体和TLR7小分子激动剂的联合治疗抗肿瘤用途，以及PD‑L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物及其制备方法和应用。具体地，本发明公开了联合抗PD‑L1的纳米抗体及其衍生蛋白和TLR7小分子激动剂及其衍生化合物用于抗肿瘤治疗的用途和方案，同时本发明公开了新型PD‑L1和TLR7双靶向纳米抗体药物偶联物及其衍生分子的设计、制备和鉴定方案及其在抗肿瘤治疗中的作用。本发明的PD‑L1和TLR7双靶向纳米抗体药物偶联物可在多种移植瘤模型中发挥显著的抗肿瘤药效。

Description

PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物及其在抗肿瘤中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及一种PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物及其在抗肿瘤中的应用。
背景技术
肿瘤通过上调表达PD-L1等免疫检查点分子来实现免疫逃逸。针对PD-L1等免疫检查点分子靶点已有多种抗体药物被开发用于治疗肿瘤，然而PD-L1抗体等免疫检查点阻断疗法仍面临患者响应率低等问题。联合治疗方案是提高免疫检查点阻断疗法抗肿瘤治疗效果和患者响应率的有效途径。然而，科学合理且安全有效的联合治疗方法仍需深入研究。
Toll样受体(TLR)是固有免疫的重要模式识别受体。TLR受体激动剂可以激活固有免疫反应从而辅助适应性免疫的激活，其中TLR7激动剂被广泛研究并应用于抗肿瘤治疗。TLR激动剂是免疫检查点阻断疗法的潜在联合对象之一。
单克隆抗体在肿瘤免疫治疗中取得了突破性进展。然而，传统单克隆抗体具有分子量大、组织穿透力差和免疫原性高等缺点。而纳米抗体是目前最小的抗体分子，除了具有单克隆抗体的特异性外，具有组织穿透能力强、免疫原性低、稳定性好、人源化简单、易于制备等优势。基于纳米抗体开发的纳米抗体偶联药物是一种新型的药物分子形式，在药物递送、体内成像和抗肿瘤治疗等领域具有广泛应用前景。
综上，本领域急需开发一种新型、有效的PD-L1纳米抗体偶联药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型、有效的PD-L1纳米抗体偶联药物。
本发明的目的在于提供一种PD-L1纳米抗体和TLR7激动剂联合抗肿瘤治疗用途以及提供一种PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物。
本发明的另一目的在于提供PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物在肿瘤预防和治疗中的应用，特别是PD-L1抗体低响应率的肿瘤中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，所述的抗体-药物偶联物结构如式Ⅰ所示：
Ab-(J-U)n (Ⅰ)
式中，
Ab为PD-L1抗体；
U各自独立地为TLR激动剂；
J为化学键或连接子；
n为0或正整数；
“-”为化学键或接头或连接子。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体包括单特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体(如三特异性抗体)。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体包括：单克隆抗体、单链抗体(scFv)、纳米抗体。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体包括单价、二价或多价抗体。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体包括多聚体形式的抗体。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体特异性结合PD-L1。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体包括PD-L1单价纳米抗体、二价纳米抗体和/或多价纳米抗体。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体包括阻断型(可阻断PD-L1和PD-1的结合)、非阻断型(不阻断PD-L1和PD-1的结合)、或其组合。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体为阻断型抗体。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体阻断PD-1与PD-L1的结合。
在另一优选例中，所述的PD-L1为人PD-L1或非人哺乳动物的PD-L1(如小鼠PD-L1)。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体为人或非人哺乳动物抗体。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物选自下组：骆驼、羊驼、小鼠、食蟹猴。
在另一优选例中，所述的PD-L1抗体为PD-L1纳米抗体或其衍生抗体。
在另一优选例中，所述的衍生抗体为针对PD-L1纳米抗体的修饰改造，包括但不限于将PD-L1纳米抗体连接Fc片段、人血清白蛋白、聚乙二醇PEG、形成二价抗体和/或多价抗体。
在另一优选例中，所述的纳米抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。
在另一优选例中，所述的PD-L1纳米抗体特异性结合PD-L1，且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR选自下组中的一种或多种：
(1)SEQ ID NO：2所示的CDR1、SEQ ID NO：3所示的CDR2、SEQ ID NO：4所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO：6所示的CDR1、SEQ ID NO：7所示的CDR2、SEQ ID NO：8所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO：10所示的CDR1、SEQ ID NO：11所示的CDR2，SEQ ID NO：12所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO：14所示的CDR1、SEQ ID NO：15所示的CDR2，SEQ ID NO：16所示的CDR3；和
(5)SEQ ID NO：18所示的CDR1、SEQ ID NO：19所示的CDR2，SEQ ID NO：20所示的CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与PD-L1结合能力的衍生序列。
在另一优选例中，所述抗PD-L1纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列；
(b)对(a)中的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生抗体或活性片段，所述衍生抗体或活性片段保留与PD-L1特异性结合能力。
在另一优选例中，所述的纳米抗体序列包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:17具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相似性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链的互补决定区CDR由SEQ ID NO：2所示的CDR1、SEQ ID NO：3所示的CDR2、SEQ ID NO：4所示的CDR3组成。
在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链序列如SEQ ID NO.:1所示。在另一优选例中，所述TLR激动剂为大分子(蛋白质或核酸)或小分子激动剂。
在另一优选例中，所述TLR激动剂包括但不限于TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂。
在另一优选例中，n为所述抗体-药物偶联物中的药物平均偶联数量，较佳地n为1～9，优选为2.5～6.5，更优选为3.5～5.5。
在另一优选例中，所述的TLR激动剂为TLR7激动剂。
在另一优选例中，所述的TLR激动剂不具有TLR8激动活性。
在另一优选例中，所述的TLR7激动剂为宿主内源性激动剂或外源性激动剂。
在另一优选例中，所述的TLR7激动剂为小分子激动剂。
在另一优选例中，所述的TLR7激动剂包括：SZU-101：
Figure BDA0002979318800000031
在另一优选例中，所述TLR7激动剂为SZU-101的衍生化合物，包括但不限于在SZU-101基础进行的一个或多个基团的替换、修饰或删除。
在另一优选例中，所述TLR7激动剂为SZU-101的多价化合物。
在另一优选例中，所述TLR7激动剂(如SZU-101)连接于PD-L1抗体的重链恒定区或重链可变结构域(VHH)的末端氨基或侧链氨基。
在另一优选例中，所述TLR7激动剂(如SZU-101)连接于PD-L1抗体的巯基。
在另一优选例中，所述SZU-101连接于PD-L1抗体的氨基，并形成S1所示结构：
Figure BDA0002979318800000041
或者
所述的SZU-101连接于PD-L1抗体的巯基，并形成S2所示结构：
Figure BDA0002979318800000042
在另一优选例中，所述的TLR7激动剂定点和/或随机地连接于所述的PD-L1抗体(即式I中，所述的U定点和/或随机地连接于Z)。
在另一优选例中，所述的U定点连接于Z。
在另一优选例中，所述的U定点连接于PD-L1抗体Z的选自下组的氨基酸位点：G、K、L、A、C或其组合。
在另一优选例中，所述化学键为聚乙二醇PEG。
在另一优选例中，所述化学键为PEG的衍生化合物，包括但不限于在SZU-101的基础上进行的一个或多个基团的替换、修饰或删除。
在另一优选例中，所述PEG化学键的聚合度为大于等于1的正整数。
在另一优选例中，所述抗体-药物偶联物提高肿瘤内细胞的PD-L1水平。
在另一优选例中，所述抗体-药物偶联物激活免疫细胞。
在另一优选例中，所述的激活为体外激活。
在另一优选例中，所述的体外激活包括：在所述的抗体-药物偶联物存在下，培养所述的免疫细胞一段时间(如6-48小时)，从而获得经免疫激活的免疫细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自但不限于：CD8+T细胞、自然杀伤细胞NK、树突状细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐用于制备一种组合物或制剂，所述组合物或制剂用于：
(a)促进树突状细胞的成熟；
(b)增加肿瘤浸润细胞毒性细胞(CD8+T细胞和NK细胞)的功能；
(c)促进肿瘤浸润细胞毒性细胞颗粒酶B和IFN-γ的表达；
(d)促使肿瘤相关巨噬细胞重极化；
(e)减少TGF-β+巨噬细胞的浸润；
(f)促进IFN-γ+CD4+T细胞的浸润；
(g)促进瘤内巨噬细胞表达PD-L1；
(h)靶向并重塑肿瘤免疫微环境；
(i)提高肿瘤细胞的PD-L1水平；和/或
(j)用于治疗中表达或低表达PD-L1的肿瘤。
在另一优选例中，所述的重塑肿瘤免疫微环境为协调肿瘤内先天免疫和适应性免疫抗肿瘤免疫应答。
在另一优选例中，所述的重塑肿瘤免疫微环境为提高抗肿瘤免疫细胞的浸润，和降低免疫抑制细胞的比例。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤免疫细胞包括但不限于分泌颗粒酶及IFN-γ的CD8+T细胞和NK细胞、活化的树突状细胞、分泌IFN-γ的CD4+T细胞、M1巨噬细胞。
在另一优选例中，所述的免疫抑制细胞包括但不限于M2巨噬细胞、Treg细胞、分泌TGF-β的白细胞。
在另一优选例中，所述的PD-L1水平包括细胞表面PD-L1水平和细胞内PD-L1水平。
在另一优选例中，所述的低表达PD-L1的肿瘤为实体瘤或血液瘤。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)如本发明第一方面所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐；
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包含：
(c)其他生物活性的药物，如治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述其他生物活性的药物促进CD8+T细胞和NK细胞的抗肿瘤功能。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方式选自下组：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。
在另一优选例中，所述药物组合物的施用方式为，将所述药物组合物和免疫细胞(如树突状细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞等)共培养后，分离免疫细胞进行体内回输。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型选自下组：液态、固体、或凝胶态。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于抗肿瘤治疗。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗PD-L1低表达的肿瘤。
在另一优选例中，“低表达PD-L1”指，所述肿瘤表达的PD-L1的量E1低于正常肿瘤表达PD-L1的量E0，较佳地E1/E0≤1/2，更佳地≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括但不限于：乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、白血病、肺癌、肾脏肿瘤、小肠癌、前列腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、骨癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
在本发明的第三方面，提供了一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的抗体-药物偶联物；和
(b)其他偶联部分。
在另一优选例中，所述其他的偶联部分选自下组：小分子化合物、PEG、荧光素、放射性同位素、造影剂、脂肪酸链、蛋白片段、或其组合。
在另一优选例中，所述的组分(a)和(b)可操作性连接。
在另一优选例中，所述的偶联部分包括化学标记和生物标记。
在另一优选例中，所述化学标记选自同位素、免疫毒素和/或化学药物。
在另一优选例中，所述生物标记选自生物素、亲和素或酶标记。
在另一优选例中，所述小分子化合物选自治疗肿瘤或自身免疫性疾病药物或毒素。
在另一优选例中，所述的放射性同位素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188，或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177，或其组合。
在另一优选例中，所述的放射性同位素包括但不限于碘131、铟111和镥177。
在另一优选例中，所述的造影剂用于MRI或CT。
在另一优选例中，所述的蛋白片段包括但不限于抗体Fc、生物素、亲和素、HRP、抗体、酶、细胞因子及其他生物活性蛋白或多肽。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。
在本发明的第四方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含：
(a)如本发明第一方面所述的抗体-药物偶联物；和
(b)任选的具有治疗功能的多肽分子和蛋白片段。
在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括但不限于：靶向PD-1、IL-4R、IL-4Rα、TNF-α、VEGF、4-1BB、CD47、TIM3、CTLA4、IL-17A、CD19、CD22、CD28、CD38、CD40、CD47、B7-H3、TSLP、BCMA、GLP-1、Trop2、TIGIT、LAG-3、FGL1、HER2的多肽分子或片段。
在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子。
在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括单链抗体(scFv)、双链抗体、单克隆抗体、或嵌合抗体。
在另一优选例中，所述融合蛋白还包含协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在另一优选例中，所述的融合蛋白包括双特异性抗体、嵌合抗体。
在本发明的第五方面，提供了一种多特异性抗体，所述的多特异性抗体包含：
(a)如本发明第一方面所述的抗体-药物偶联物；和
(b)任选的靶向第二抗原的抗体分子。
在另一优选例中，多特异性抗体还包括靶向选自下组的靶点的第二抗原结合区：PD-1、IL-4R、IL-4Rα、TNF-α、VEGF、4-1BB、CD47、TIM3、CTLA4、IL-17A、CD19、CD22、CD28、CD38、CD40、CD47、B7-H3、TSLP、BCMA、GLP-1、Trop2、TIGIT、LAG-3、FGL1、HER2或其组合。
在另一优选例中，所述的第二抗原结合区为纳米抗体。
在另一优选例中，所述多特异性抗体包括一个或多个第二抗原结合区。
在另一优选例中，所述多特异性抗体还包含抗体的Fc段。
在本发明的第六方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的抗体-药物偶联物的方法，所述方法包括步骤：
配置反应体系，所述反应体系中包括抗体和游离的药物分子，然后进行偶联反应，从而制得所述抗体-药物偶联物，其中，所述药物分子包括TLR激动剂、接头。
在另一优选例中，反应时间为3h-10h。
在另一优选例中，所述抗体与药物分子的摩尔比为1-2：3-20；优选为1：6-10。
在另一优选例中，将SZU-101、EDCI和NHS溶于DMSO中室温搅拌三小时反应制备SZU-101-NHS活性酯，PD-L1纳米抗体和SZU-101-NHS活性酯按照1:10的摩尔比剂量4℃搅拌反应4小时，制备获得纳米抗体偶联药物。
在本发明的第七方面，提供了一种预防或治疗肿瘤的方法，向有需要的受试者施用如本发明第一方面所述的纳米抗体偶联药物。
在另一优选例中，所述的肿瘤为表达PD-L1的肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：高表达PD-L1的肿瘤、中表达PD-L1的肿瘤、低表达PD-L1的肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤为中表达PD-L1的肿瘤或低表达PD-L1的肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤为低表达PD-L1的肿瘤。
在另一优选例中，“高表达PD-L1”指，所述肿瘤表达的PD-L1的量E1与正常肿瘤表达PD-L1的量E0之比(E1/E0)＞1，更佳地≥1.5，更佳地≥2.0。
在另一优选例中，“中表达PD-L1”指，所述肿瘤表达的PD-L1的量E1与正常肿瘤表达PD-L1的量E0之比(E1/E0)为0.5-1.1，更佳地为0.7-1.0，更佳地为0.8-0.9。
在另一优选例中，“低表达PD-L1”指，所述肿瘤表达的PD-L1的量E1与正常肿瘤表达PD-L1的量E0之比(E1/E0)≤1/2，更佳地≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括但不限于：乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、白血病、肺癌、肾脏肿瘤、小肠癌、前列腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、骨癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
在本发明的第八方面，提供了一种PD-L1纳米抗体，所述PD-L1纳米抗体特异性结合PD-L1，且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR选自下组中的一种或多种：
(1)SEQ ID NO：2所示的CDR1、SEQ ID NO：3所示的CDR2、SEQ ID NO：4所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO：6所示的CDR1、SEQ ID NO：7所示的CDR2、SEQ ID NO：8所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO：10所示的CDR1、SEQ ID NO：11所示的CDR2，SEQ ID NO：12所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO：14所示的CDR1、SEQ ID NO：15所示的CDR2，SEQ ID NO：16所示的CDR3；和
(5)SEQ ID NO：18所示的CDR1、SEQ ID NO：19所示的CDR2，SEQ ID NO：20所示的CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与PD-L1结合能力的衍生序列。
在另一优选例中，所述抗PD-L1纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列；
(b)对(a)中的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生抗体或活性片段，所述衍生抗体或活性片段保留与PD-L1特异性结合能力。
在另一优选例中，所述的纳米抗体序列包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:17具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相似性的氨基酸序列。
在本发明的第九方面，提供了一种药盒，所述的药盒包括：
(1)第一容器，以及位于所述第一容器内的如本发明的第八方面所述的PD-L1纳米抗体，以及药学上可用的载体；
(2)第二容器，以及位于所述第二容器内的TLR7激动剂，以及药学上可用的载体；
以及(3)任选的使用说明书。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了ELISA测定纳米抗体Nb16与PD-L1结合的EC50曲线。
图2显示了ELISA测定纳米抗体Nb16阻断PD-1与PD-L1结合的IC50曲线。
图3显示了PD-L1纳米抗体和TLR7激动剂联合治疗的体内抗肿瘤作用，其中，3A为实验荷瘤、给药天数示意图；3B为小鼠肿瘤生长曲线；3C为终点瘤重；3D为终点肿瘤解剖照片。
图4显示了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物的结构示意(4A)和偶联度前后的质谱鉴定(4B和4C)。
图5显示了流式细胞术测定PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101与PD-L1结合的EC50曲线，其中纳米抗体Nb16为对照。
图6显示了流式细胞术测定PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101阻断PD-1与PD-L1结合的IC50曲线，其中纳米抗体Nb16为对照。
图7显示了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101在诱导的CT26肿瘤模型中的抗肿瘤作用，其中7A为小鼠肿瘤生长曲线；7B为终点瘤重；7C为终点肿瘤解剖照片。
图8显示了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101在未诱导的CT26肿瘤模型中的抗肿瘤作用，其中8A为IFN-γ诱导(PD-L1高表达)和未用IFN-γ诱导(PD-L1低表达)的CT26细胞表面PD-L1表达量的比对图；8B为小鼠肿瘤生长曲线；8C为终点瘤重；8D为终点肿瘤解剖照片。
图9显示了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101在B16肿瘤模型中的抗肿瘤作用，其中9A为未诱导低表达PD-L1的B16-F10细胞的PD-L1表达示意图，blank为空白对照组，isotype control为同种型对照组；9B为小鼠肿瘤生长曲线；9C为终点瘤重；9D为终点肿瘤解剖照片。
图10显示了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101给药重塑肿瘤免疫微环境，其中，total为总细胞量，mFc为同型对照组(mFc)，Nb16-SZU-101为纳米抗体偶联药物组。
图11显示了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101给药时通过CD8+T细胞和NK细胞发挥抗肿瘤作用。其中，11A为肿瘤生长曲线；11B为终点瘤重；11C为终点肿瘤照片。
具体实施方式
发明人通过广泛而深入的研究，首次筛选并鉴定了一种PD-L1纳米抗体，并开发了一种PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物。具体地，在多种小鼠移植瘤模型中发现，本发明的双靶向纳米抗体偶联药物具有优异的抗肿瘤活性。此外，本发明还出乎意料地发现，本发明的双靶向纳米抗体偶联药物促进瘤内巨噬细胞表达PD-L1，并主要通过CD8+T细胞和NK细胞发挥体内抗肿瘤活性，有利于治疗低表达PD-L1分子的“冷”肿瘤。本发明开发的PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物表现出突出的抗肿瘤效果和新颖的作用机制，具备临床开发和应用价值。在此基础上完成了本发明。
TLR受体及TLR受体激动剂
如本文所用，术语“TLR受体”是指Toll样受体，是生物体免疫系统中一类重要的固有免疫模式识别受体，可特异性的识别病原微生物进化过程中相对保守的抗原分子(或称为病原相关分子模式)，实现病原微生物入侵的有效检测和固有免疫应答诱导。在人体中已发现十种TLR受体，即TLR1-TLR10,其中TLR3、TLR7、TLR8、TLR9定位于细胞的内体、溶酶体膜上，其余定位于细胞质膜上。在本发明实施方式中，优选TLR7作为药物分子靶标之一。TLR7分子的天然配体为单链线性RNA。
如本文所用，术语“TLR受体激动剂”是指可以特异性结合并激活TLR受体的大分子(蛋白质或核酸)或小分子激动剂，促进TLR受体的下游信号的转导，实现固有免疫细胞的活化。在本发明实施方式中，优选TLR7激动剂构建纳米抗体偶联药物。除本发明实施方式中应用的SZU-101外，可用的TLR7激动剂还包括咪喹莫特和R848等。
如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的靶向PD-L1的纳米抗体”、“本发明的抗PD-L1纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于PD-L1(包括人或鼠PD-L1)的纳米抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的纳米抗体(Nb16)。
如本文所用，术语“本发明纳米抗体偶联药物”、“本发明的双靶向纳米抗体偶联药物”、“本发明的PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物”，可互换使用，均指特异性识别和结合于PD-L1(包括人或鼠PD-L1)的纳米抗体及其衍生蛋白偶联TLR7激动剂形成的新型药物分子。纳米抗体偶联药物中的纳米抗体特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的纳米抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“单域抗体(single domain antibody，sdAb，或VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。
纳米抗体/单域抗体(Nanobody)作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。Nanobody(Nb)具有优良的生物学特性，分子量12-15kDa，是完整抗体的十分之一，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代抗体治疗中的新兴力量，在免疫诊断和治疗中显示出广阔的应用前景。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。
如本文所用，术语“纳米抗体偶联药物”与“纳米抗体药物偶联物”可互换使用。如本领域技术人员所知，纳米抗体偶联物是一种特殊的抗体药物偶联药物形式，其是将纳米抗体或者衍生蛋白偶联药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子形成的药物分子形式，可用于肿瘤治疗、药物递送和体内成像等，具有广阔的临床应用价值。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PD-L1的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有PD-L1结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
Figure BDA0002979318800000131
Figure BDA0002979318800000141
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物或具有促进免疫功能的药物。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
应理解，药物通常可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在本发明中，药物为激活或促进免疫反应的药物，例如激活固有免疫反应从而辅助适应性免疫的激活。在具体的实施方式中，药物为TLR受体激动剂。
在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂，例如SZU-101、咪喹莫特、R848、CpG等。在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Ab-(J-U)n (Ⅰ)
式中，
Ab为PD-L1抗体；
U各自独立地为TLR激动剂；
J为化学键或连接子；
n为0或正整数；
“-”为化学键或接头或连接子。
应用
本发明提供了本发明抗体的用途，例如用于制备诊断制剂、或制备用于预防和/或治疗PD-L1相关疾病的药物。所述PD-L1相关疾病包括炎症疾病、自身免疫疾病等，包括但不限于乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、白血病、肺癌、肾脏肿瘤、小肠癌、前列腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、骨癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
应理解，对一种或多种检查点抑制剂(例如结合PD-L1、CTLA-4或CD47等的抗体)的治疗无反应的癌症，例如胰腺癌或前列腺癌，这种肿瘤被称为冷肿瘤。对用一种或多种检查点抑制剂，例如结合PD-L1、CTLA-4或CD47等的抗体的治疗有反应的癌症，此类肿瘤也称为温或热肿瘤。与不响应检查点抑制剂治疗的肿瘤相比，此类肿瘤被认为具有更高的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)水平和/或更高的肿瘤突变负荷。
本发明提供的一种优选的抗体-药物偶联物，在冷肿瘤和低表达PD-L1的肿瘤模型中同样表现出极其显著的抗肿瘤活性和响应率，在多种移植瘤模型中发挥显著的抗肿瘤药效。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其他生物活性物质。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次提供了PD-L1纳米抗体和TLR7激动剂的联合治疗方案，表现出了显著的体内抗肿瘤活性，表明PD-L1抗体疗法和TLR7免疫激动剂具有联合合理性，可协同抗肿瘤。
(b)本发明首次开发了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物，其可以促进肿瘤中细胞上调表达PD-L1，并协调瘤内先天免疫和适应性抗肿瘤免疫应答，使得其在“冷”肿瘤和低PD-L1表达的肿瘤等PD-L1抗体治疗效果较差的多种肿瘤中表现出极佳的抑制肿瘤生长作用。
(c)本发明首次提供的PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物可靶向肿瘤免疫微环境，并重塑肿瘤免疫微环境，提高抗肿瘤免疫细胞的浸润，减少免疫抑制细胞的浸润。
(d)本发明首次提供的PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物发挥抗肿瘤药效机制明确，主要依赖于CD8+T细胞和NK细胞发挥肿瘤杀伤和抑制作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：抗PD-L1的纳米抗体筛选
1.1 PD-L1蛋白表达
构建mouse PD-L1(ECD)-pFUSE-hIgG1-Fc载体，转化进DH5α化学感受态细胞里，利用含有博来霉素抗性的LB固体培养基平板筛选获得单克隆菌株，接菌提取质粒。利用HEK293F细胞哺乳动物表达鼠和人的PD-L1蛋白，使用无血清培养基对HEK293F细胞进行培养，基于PEI的质粒络合，完成转染，表达蛋白5天后收集蛋白上清，通过Protein A亲和柱纯化蛋白。
1.2免疫动物和文库构建
(1)选取成年新疆骆驼，共需7次免疫鼠的PD-L1蛋白，首次免疫采用弗式完全佐剂，后续加强免疫采用弗式不完全佐剂；(2)免疫结束后3-5天内，从骆驼身上抽取外周血，分离外周血淋巴细胞，Trizol法提取RNA，反转录得到cDNA；(3)通过两步巢式PCR扩增获得VHH基因片段；(4)通过限制性酶PstI和NotI酶切将VHH基因片段连接到pMECS载体上；(5)将连接产物电转化至大肠杆菌电转感受态TG1中，构建鼠PD-L1蛋白的单域抗体文库；(6)对文库进行检定，通过稀释涂板，计算得到文库的库容大小为5.2×109CFU；利用菌落PCR随机选择24个菌落检测文库插入率，得到插入率为100％。以上结果表明一个高质量的靶向鼠PD-L1的特异性纳米抗体文库构建成功。
1.3文库淘选
向10倍库容的纳米抗体库中加入辅助噬菌体扩增得到纳米抗体展示噬菌体。96孔酶标板用5μg/mL NeutrAvidin溶液(每孔100μL)包被，4℃,包被过夜。第二天，用2％脱脂奶粉室温封闭2h，用20mM HEPES(pH7.5),150mM NaCl溶液洗5次。设置对照组和实验组，加入100μL 200nM PD-L1-biotin蛋白稀释液，室温振荡(700rpm)并孵育15min，用20mM HEPES(pH7.5),150mM NaCl溶液洗5次。之后加入100μL噬菌体稀释液(1×1013cfu/mL)，室温振荡(700rpm)并孵育2h，用20mM HEPES(pH7.5),150mM NaCl溶液洗涤5次除去不结合的噬菌体。后加入100μL0.25 mg/mL的胰酶室温振荡(700rpm)消化30min将特异性结合的噬菌体解离下，加入抑制剂终止消化。将洗脱的噬菌体感染TG1细胞，以便第二轮panning使用。重复上述操作2-3轮，直至阳性克隆被富集。
1.5 ELISA鉴定阳性克隆
几轮淘选过后，将洗脱下来的噬菌体感染处于生长对数期的TG1感受态，梯度稀释并涂布在平板上培养过夜。分别挑取96个克隆接种到每孔100μL培养基的96孔圆底板中静置过夜作为母板，之后吸取10μL过夜培养的菌液到每孔1mL培养基的96孔深底板中，诱导纳米抗体表达并粗纯。96孔酶标板用5μg/mL NeutrAvidin溶液包被，4℃,700rpm,过夜。第二天，加入2％脱脂奶粉室温封闭板子，用含牛血清白蛋白BSA的溶液洗3次。加入100μL 3μg/mL PD-L1蛋白室温孵育30分钟后洗涤，加入粗提的纳米抗体室温孵育1h后洗涤，加入小鼠抗HA一抗室温孵育1小时后洗涤，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记二抗室温孵育1h后洗涤，加入碱性磷酸酶显色液反应10min，在酶标仪405nm处检测吸收值，初步判定吸收值是对照组吸收值的3倍以上的即为阳性孔，将阳性克隆转移到摇菌管中培养以便提取质粒并进行测序。
实施例2：抗PD-L1纳米抗体的表达和鉴定
制备线性化pFUSE-mIgG2b-Fc和pFUSE-hIgG1-Fc载体后，PCR扩增纳米抗体片段，利用同源重组连接纳米抗体和载体pFUSE-hIgG1-Fc或pFUSE-mIgG2b-Fc，随后利用利用HEK293F细胞哺乳动物表达候选纳米抗体，并通过Protein A亲和柱纯化获得纳米抗体。
本发明中获得一优选的纳米抗体Nb16，VHH序列如SEQ ID NO.:1所示：
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTDRNYWMGWFRQAPGKEREGVAALYTRTGSTYYADSVKGRFTISHDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAADSNAYGLAPLHHYWGQGTQVTVSS
其中，下划线标示的为CDR部分。
此外，本发明中获得其它几株纳米抗体，分别为：Nb9、Nb10、Nb11、Nb17。
其中，Nb9、Nb10、Nb11、Nb17的VHH序列分别如SEQ ID NO.:5、9、13、17所示，CDR部分见表1。
表1.抗体的VHH及CDR序列
Figure BDA0002979318800000201
Figure BDA0002979318800000211
实施例3：抗PD-L1纳米抗体的体外活性评价
3.1候选纳米抗体Nb16的PD-L1结合活性测定
用mPD-L1-Fc融合蛋白包被平板4℃过夜，之后用BSA于37℃封闭2小时，每孔加入不同浓度的Nb16纳米抗体，室温下反应1小时，洗涤后加入山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记抗体，室温反应1小时。洗涤后加入显色液，450nm波长读取吸收值。
实验结果表明，该反应中，纳米抗体Nb16的EC50曲线见图1，为0.045μg/mL。
3.2候选纳米抗体Nb16的PD-1/PD-L1阻断活性测定
用mPD-L1-Fc融合蛋白包被平板4℃过夜，之后用BSA在37℃封闭2小时，每孔加入不同浓度的Nb16纳米抗体以及10μg/mL小鼠PD-1-Fc-Biotin融合蛋白，室温下反应1小时，洗涤后加入抗体SA-HRP，室温反应1小时。洗涤后加入显色液，450nm波长读取吸收值。
实验结果表明，该反应中，纳米抗体Nb16的IC50曲线见图2，为1.017μg/mL。可以有效阻断PD-1/PD-L1的结合。
3.3候选纳米抗体Nb9、Nb10、Nb11、Nb17的体外活性
测定结果表明，本发明中候选纳米抗体中，部分纳米抗体(如Nb9、Nb10等)为具有阻断型的候选抗体，部分纳米抗体(如Nb11、Nb17等)为非阻断型纳米抗体。
实施例4：TLR7激动剂SZU-101的制备
TLR7小分子激动剂用于偶联抗体的分子结构如下：
Figure BDA0002979318800000221
SZU-101及上述用于偶联的SZU-101衍生物的合成可采用以下方法或类似方法。
Figure BDA0002979318800000231
将化合物20-1溶解于无水DMSO中，于10℃冷却加入等当量的丁二酸酐，混合物自然室温搅拌24小时。混合反应物倒与20倍体积水中，析出大量白色固体化合物SZU-101。
将SZU-101(1eq),NHS(1.2eq)和EDC(1.3eq)溶于无水DMF，室温下搅拌4h，结束反应，将反应液倒入二氯甲烷中，抽滤干燥，得化合物23，即SZU-101-NHS，为白色固体。
SZU-101-Mal可用类似方法制备。
实施例5：纳米抗体Nb16和TLR7激动剂SZU-101的联合抗肿瘤作用
复苏小鼠CT26肿瘤细胞并传代，保证荷瘤时肿瘤细胞至少已经传了3代，荷瘤前用终浓度为100ng/mL的小鼠IFN-γ诱导肿瘤细胞24h，使其细胞表面高表达PD-L1；将诱导后高表达PD-L1的CT26肿瘤细胞皮下接种至雌性BALB/c小鼠中，接种量为1×106细胞/只；并将小鼠随机分组为4组(每组9只)，即：同型对照组(mFc)、纳米抗体Nb16组(Nb16)、TLR7激动剂SZU-101组(SZU-101)和联合治疗组(Nb16/SZU-101)；其中，mFc和Nb16给药量为10mg/kg，腹腔给药；SZU-101给药量为3mg/kg，瘤周给药。给药周期为Nb16于D1、D5、D9、D12、D14给药，SZU-101于D9-D14给药(3A)。给药周期中观察并记录小鼠体重和肿瘤长径(L)与短径(W)，直至解剖终点，计算瘤体积V＝(L×W×W)/2，绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤抑制率；第十五天结束实验，执行安乐死后，解剖动物，取出皮下肿瘤。
小鼠肿瘤生长曲线(3B)、终点瘤重(3C)和终点肿瘤解剖照片(3D)如图3所示。结果表明，Nb16和SZU-101均可以显著抑制肿瘤生长，而二者联用意外地发挥比单药治疗更显著的抗肿瘤作用，其中：单独给药组Nb16和SZU-101的抑瘤率分别为35％、49％，联合治疗的抑瘤率可达62％，终点肿瘤重量见表2。
以上结果提示PD-L1纳米抗体和TLR7激动剂联合治疗具有显著的协同抗肿瘤作用。
表2：终点肿瘤重量
Figure BDA0002979318800000241
实施例6：PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物的制备
将SZU-101、EDCI和NHS溶于DMSO中，室温下搅拌3h，LC-MS监测反应进程，反应完全后，加入十倍量的双蒸水，抽滤，真空干燥即可得到SZU-101-NHS活性酯。
Figure BDA0002979318800000242
之后将活化酯用DMSO溶解，抗体和小分子按照1：10的摩尔比剂量反应，投入一定量的小分子活化酯至Nb16中，4℃搅拌反应4小时。反应结束后，在混合物中加入PBS混合，用10 kD的生物滤膜过滤除去小分子，得新型偶联化合物Nb16-SZU-101。反应制得的偶联化合物，先将抗体变性打开二硫键，之后用XevoG2XSQTOF质谱仪鉴定样品，主要根据新型偶联化合物比未偶联抗体增加的分子量计算偶联度。
如图4所示，质谱鉴定纳米获得的纳米抗体偶联物的偶联度为4.5。
通过上述方法，制备了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物，命名为Nb16-SZU-101(图4A)。
实施例7：PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物的体外活性测定
7.1 PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物的PD-L1结合活性测定
消化处理稳转细胞株HEK293T/mPD-L1，离心去上清；用PBS清洗1遍并调节细胞密度为2.5×106细胞/mL；每个细胞样品加入100μL细胞悬液，即包含2.5×105细胞/样品；样品中分别加入不同的浓度的偶联化合物Nb16-SZU-101和裸抗Nb16，浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01、0.006、0.003、0.0008μg/mL，共17个浓度梯度；4℃冰箱孵育20 min；离心，去上清，用PBS洗一遍；用稀释后抗体anti-mouse IgG Fc(PE)作为二抗，重悬上述细胞；4℃冰箱孵育20min；离心，去上清，用PBS洗两遍，转移至流式管中；用流式细胞仪上机检测，得到Nb16-SZU-101的EC50值曲线，如图5所示。
实验结果提示，SZU-101的偶联并未改变原PD-L1纳米抗体的结合活性。
7.2 PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物的PD-1/PD-L1阻断活性测定
消化处理稳转细胞株HEK293T/mPD-L1，离心去上清；用PBS清洗1遍并调节细胞密度为2.5×106细胞/mL；每个细胞样品加入100μL细胞悬液，即包含2.5×105细胞/样品；样品中分别加入mouse PD-1-biotin蛋白(浓度为20μg/mL)和不同的浓度的偶联化合物Nb16-SZU-101和裸抗Nb16，浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01、0.006、0.003、0.0008μg/mL，共17个浓度梯度；4℃冰箱孵育20min；离心，去上清，用PBS洗一遍；用稀释后抗体SA-PE作为二抗，重悬上述细胞；4℃冰箱孵育20min；离心，去上清，用PBS洗两遍，转移至流式管中；用流式细胞仪上机检测，得到Nb16-SZU-101的IC50曲线，如图6所示。
实验结果提示，SZU-101的偶联并未改变原PD-L1纳米抗体的阻断活性。
实施例8：PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物的体内抗肿瘤活性评价
8.1双靶向纳米抗体偶联化合物和联合给药组的体内抗肿瘤作用
在IFN-γ诱导高表达PD-L1的CT26皮下荷瘤BALB/c小鼠模型中，将小鼠随机分为4组，分别为mFc组、Nb16组、Nb16/SZU-101联合给药组以及Nb16-SZU-101纳米抗体偶联药物组，其中mFc或Nb16或Nb16-SZU-101的给药剂量为10mg/kg、给药方式为腹腔给药，SZU-101的给药剂量为0.5mg/kg、给药方式为腹腔给药；分别于Day 2、Day 6、Day 10、Day 13给药，共给药4次。每周2-3次测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线；并在Day 14对小鼠进行解剖称重以及拍照。肿瘤生长曲线、终点瘤重和终点肿瘤照片如图7所示。
实验结果表明，本发明中纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101处理组具有显著提高的抗肿瘤效应，该模型中，单独给药组Nb16的抑瘤率为30％，联合给药组Nb16/SZU-101的抑瘤率为39％，纳米抗体偶联药物组的抑瘤率可达81％，终点肿瘤重量见表3。无论相对于单独给药组还是相对于联合给药组，纳米抗体偶联药物组均可显著抑制肿瘤生长。
需要说明的是，同单独给药组Nb16相比，联合给药组并没有显著抑制肿瘤生长，可能是由于联合给药组中SZU-101的剂量降低，且为了和偶联组相一致，给药方式换为腹腔给药，而腹腔给药相对瘤周给药利用度更低等原因导致。
表3：终点肿瘤重量
Figure BDA0002979318800000251
Figure BDA0002979318800000261
8.2未诱导(低表达)PD-L1及诱导(高表达)PD-L1的CT26皮下荷瘤BALB/c小鼠模型
在图8A中，已表明未诱导的CT26细胞表面PD-L1表达量很低约为17.3％，只有用IFN-γ诱导后PD-L1表达量才会提高至98.1％，因此，我们研究并比较了偶联化合物分别在未诱导以及诱导的CT26小鼠肿瘤模型中的作用。
两个模型中分别将诱导前后的CT26肿瘤细胞皮下接种至雌性BALB/c小鼠中构建荷瘤小鼠模型，接种量为1×106细胞/只；两个模型均将小鼠随机分为2组，每组6只，即：空白对照组mFc(浓度为10mg/kg)、以及偶联化合物Nb16-SZU-101组(浓度为10mg/kg)；给药剂量为200μL，给药方式均为腹腔给药；分别在Day 2、Day 5、Day 8、Day 11给药，共给药4次；每周2-3次测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线；并在Day 12对小鼠进行解剖称重以及拍照。
从肿瘤生长曲线的结果显示：同阴性对照相比，在CT26诱导前后的两个肿瘤模型中，偶联化合物均可显著抑制肿瘤生长(图8B)，其中未诱导的CT26模型中抑制率为78.9％，而诱导后的CT26模型中抑制率为83.6％，两个模型中偶联化合物的肿瘤抑制效果并没有明显差异。此外，终点肿瘤重量(图8C)和终点肿瘤照片(图8D)的结果，也均同终点肿瘤体积结果基本一致。证实了偶联化合物Nb16-SZU-101对PD-L1低表达和高表达的肿瘤均发挥显著抑制效果。
这提示本发明提供的PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物不仅对高表达PD-L1的“热”肿瘤有显著抗肿瘤作用，也可以用于PD-L1低表达的“冷”肿瘤的抗肿瘤治疗。
8.3未诱导低表达PD-L1的B16-F10皮下荷瘤C57BL/6模型
基于以上PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物对低表达PD-L1的CT26肿瘤的抑制作用，本发明进一步评价了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物在低表达PD-L1的C57BL/6小鼠B16F10皮下荷瘤模型中的作用。
将6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为2组，分别为mFc组和纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101组。在小鼠腋下皮下种植1×106个未诱导低表达PD-L1的B16-F10细胞(图9A)。分别用mFc、纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101给药；对照药和Nb16-SZU-101的给药剂量为10mg/kg、体积200μL；各组给药方式为腹腔注射。在种植肿瘤后的第2、5、8、11天各组分别给药，共给药4次。Day12将小鼠安乐死。肿瘤生长曲线、终点瘤重和终点肿瘤照片如图9B-D所示。
实验结果表明，意外地，在该低表达PD-L1的肿瘤模型中，本发明中纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101处理组具有显著提高的抗肿瘤效应，该模型中，肿瘤抑制率约68.2％，这提示本发明提供的PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物可以用于PD-L1低表达的肿瘤的抗肿瘤治疗。
采用的靶向PD-L1的治疗药物或方案通常仅能针对PD-L1高表达的肿瘤，而无法有效用于PD-L1低表达或中表达的肿瘤。因此，本发明的双靶点纳米抗体偶联药物居然可用于治疗PD-L1低表达或中表达的肿瘤，这是很出乎意料的。
实施例9：PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物给药的肿瘤免疫分型分析
在实施例8.1的小鼠解剖终点时，取皮下肿瘤，取150mg肿瘤组织剪碎成肉泥状，于透明质酸酶和胶原酶Ⅳ中37℃下180rpm震荡消化1.5h，处理成单细胞悬液。预处理后的细胞悬液分为两份，一份用于巨噬细胞和树突状细胞的免疫分型分析，一份用于T细胞和NK细胞的免疫分型分析。
巨噬细胞和树突状细胞样品悬液处理：细胞用2-4mL无菌红细胞裂解液处理8min并用PBS缓冲液终止，去除样品悬液中的红细胞及碎片；细胞样品清洗待用。
T细胞和NK细胞样品悬液处理：细胞用淋巴细胞分离液离心处理，获取淋巴细胞分离层，即为肿瘤淋巴细胞悬液，清洗待用。
将巨噬细胞和树突状细胞样品和T细胞和NK细胞样品用Fc受体封闭液4℃封闭1小时，去除Fc受体带来的非特异性染色；进行细胞表面蛋白染色，具体的：M1巨噬细胞(FITCRat Anti-Mouse CD45、PE-Cyanine7 Rat Anti-Mouse F4/80和APC Rat anti-MouseCD86)，M2巨噬细胞(FITC Rat Anti-Mouse CD45和PE-Cyanine7 Rat Anti-Mouse F4/80)，树突状细胞(PE-Cy7 Anti-Mouse CD11c、BB515 Rat Anti-Mouse I-A/I-E、PE HamsterAnti-Mouse CD80和APC Rat anti-Mouse CD86)，CD4+T细胞和CD8+T细胞(FITC HamsterAnti-Mouse CD3e、PerCP-CyTM5.5Rat Anti-Mouse CD4和APC Rat Anti-Mouse CD8a)，Treg细胞(FITC Hamster Anti-Mouse CD3e、PerCP-CyTM5.5Rat Anti-Mouse CD4和PE RatAnti-Mouse CD25)，NK细胞(CD3-FITC、CD49b-APC、CD69-PE)，随后于冰上染色20min；接着进行胞内蛋白染色，在细胞经受固定破膜处理后，对细胞进行破膜染色，具体的：M2巨噬细胞(Ms CD206 Alexa 647和ANTI-MOUSE LAP PE)染色，含有颗粒酶的功能性T细胞(ANTI-MOUSE GRANZYME B(NGZB)PE)，含有IFN-γ的功能性T细胞(PE Rat Anti-Mouse IFN-γ)，Treg细胞(ANTI-MOUSE/RAT FOXP3 APC)，随后冰上染色20min；清洗后重悬样品细胞液，流式细胞仪上机检测。
流式免疫分型结果如图10所示。
结果表明，与同型对照mFc组相比，PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物Nb16-SZU-101给药促进了树突状细胞的成熟。同时，PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物显著增加了肿瘤浸润细胞毒性细胞(CD8+T细胞和NK细胞)的功能，促进了它们的颗粒酶B和IFN-γ的表达。另外，PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联给药可促使肿瘤相关巨噬细胞重极化，减少TGF-β+巨噬细胞的浸润。在Nb16-SZU-101治疗组中，IFN-γ+CD4+T细胞的浸润也显著增加。
意外的是，PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物给药促进了瘤内微环境中巨噬细胞表达PD-L1(图10)，这可以使得PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物响应低表达PD-L1分子的“冷”肿瘤，达到更广泛的响应，且具有更佳的抗肿瘤药效。此外，在肿瘤微环境中，这些受本发明偶联物激活的免疫细胞(包括CD4+T细胞以及CD8+T细胞等)，其分泌IFN-γ的免疫细胞亚型增多，而IFN-γ是诱导PD-L1表达最常见的细胞因子之一，因此又可进一步促进肿瘤细胞表达PD-L1，从而使得“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。
综上所述，PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物靶向肿瘤免疫微环境，可重塑肿瘤免疫微环境，协调先天免疫和适应性免疫来发挥抗肿瘤活性。
实施例10：免疫细胞删除分析确定PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物药效发挥的免疫基础
将6-8周龄的BALB/c小鼠随机分为6组，每组6只动物。对应分组分别为：mFC组、Nb16-SZU-101组、Nb16-SZU-101+anti-CD4组、Nb16-SZU-101+anti-CD8组、Nb16-SZU-101+anti-NK1.1组、Nb16-SZU-101+氯磷酸脂质体组。mFc和Nb16-SZU-101的给药程序和实施例8.1一致。
免疫细胞删除方法为：分别于Day 3(200ug/只)/Day 4(100ug/只)/Day 5(100ug/只)腹腔注射抗体药(anti-CD4、anti-CD8、anti-NK1.1)删除对应的免疫细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞)，或者腹腔注射氯磷酸-脂质体去除巨噬细胞。
Day14将小鼠安乐死。肿瘤生长曲线和终点肿瘤照片如图11所示。
结果表明，有趣的是，CD8+T细胞和NK细胞的删除极大地影响了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物的药效发挥，而CD4+T细胞和巨噬细胞的删除对PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物的药效发挥影响不大，这说明本发明提供的PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物的体内抗肿瘤活性主要是通过CD8+T细胞和NK细胞发挥作用，杀伤性细胞在药效发挥中无可替代。
讨论
现有的PD-L1抗体对高免疫原性的“热”肿瘤和PD-L1表达水平高的肿瘤的靶向和抑制作用较好，对于低免疫原性和低表达PD-L1的肿瘤抑制效果较差。因此，联合治疗方案可以立足于提高肿瘤的免疫原性和PD-L1的表达水平，以提高治疗的效果和响应率。
科学合理且安全有效的联合治疗方案同样可以指导新型药物分子的设计，基于PD-L1纳米抗体和TLR7激动剂联合治疗可以显著抑制肿瘤生长，开发了PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物，达到了优于联合治疗的药效，可以协调统筹先天免疫和适应性免疫应答，靶向并重塑肿瘤免疫微环境，提高肿瘤组织的PD-L1表达水平，使得在“冷”肿瘤和低表达PD-L1的肿瘤模型中同样表现出极其显著的抗肿瘤活性和响应率，显示了其临床应用价值。
本发明首次提供了一种PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物，可后续进行肿瘤免疫治疗药物开发，尤其适用于低免疫原性和/或低表达PD-L1的肿瘤。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
<120> PD-L1和TLR7双靶向纳米抗体偶联药物及其在抗肿瘤中的应用
<130> P2021-0431
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 18
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
20 25 30
Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
35 40 45
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
50 55 60
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 80
Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
100 105 110
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 125
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
195 200 205
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Ser Leu Ser Cys Arg
225 230 235 240
Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser
245 250 255
Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys
260 265 270
Glu Asn Lys Leu Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
275 280 285
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
290 295 300
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
305 310 315 320
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
325 330 335
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
340 345 350
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
355 360 365
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
370 375 380
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
385 390 395 400
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
405 410 415
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
435 440 445
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
450 455 460
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
465 470 475 480
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
485 490 495
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
500 505
<210> 19
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
20 25 30
Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
35 40 45
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
50 55 60
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 80
Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
100 105 110
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 125
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
195 200 205
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Gly Gln Cys Ser Gln
225 230 235 240
Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu
245 250 255
Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn
260 265 270
Ala Ser Val Thr Asn Ser Val Lys Gly Thr Asn Ala Glu Pro Lys Ser
275 280 285
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
290 295 300
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
305 310 315 320
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
325 330 335
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
340 345 350
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
355 360 365
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
370 375 380
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
385 390 395 400
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
405 410 415
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
420 425 430
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
435 440 445
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
450 455 460
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
465 470 475 480
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
485 490 495
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
500 505 510
Ser Pro Gly
515
<210> 20
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
20 25 30
Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
35 40 45
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
50 55 60
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 80
Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
100 105 110
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 125
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
195 200 205
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ala Pro Ala Pro
225 230 235 240
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
245 250 255
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Glu Pro
260 265 270
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
340 345 350
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
355 360 365
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
370 375 380
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
405 410 415
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
420 425 430
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
450 455 460
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
465 470 475 480
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Ser Pro Gly
500

Claims (10)

1.一种抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的抗体-药物偶联物结构如式Ⅰ所示：
Ab-(J-U)n (Ⅰ)
式中，
Ab为PD-L1抗体；
U各自独立地为TLR激动剂；
J为化学键或连接子；
n为0或正整数；
“-”为化学键或接头或连接子。
2.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的PD-L1抗体为PD-L1纳米抗体或其衍生抗体。
3.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的TLR激动剂为TLR7激动剂。
4.如权利要求3所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的TLR7激动剂包括：SZU-101：
Figure FDA0002979318790000011
5.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐用于制备一种组合物或制剂，所述组合物或制剂用于：
(a)促进树突状细胞的成熟；
(b)增加肿瘤浸润细胞毒性细胞(CD8+T细胞和NK细胞)的功能；
(c)促进肿瘤浸润细胞毒性细胞颗粒酶B和IFN-γ的表达；
(d)促使肿瘤相关巨噬细胞重极化；
(e)减少TGF-β+巨噬细胞的浸润；
(f)促进IFN-γ+CD4+T细胞的浸润；
(g)促进瘤内巨噬细胞表达PD-L1；
(h)靶向并重塑肿瘤免疫微环境；
(i)提高肿瘤细胞的PD-L1水平；和/或
(j)用于治疗中表达或低表达PD-L1的肿瘤。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：
(a)如权利要求1所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐；
(b)药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于治疗PD-L1低表达的肿瘤。
8.一种预防或治疗肿瘤的方法，其特征在于，向有需要的受试者施用如权利要求1所述的纳米抗体偶联药物。
9.一种PD-L1纳米抗体，其特征在于，所述PD-L1纳米抗体特异性结合PD-L1，且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR选自下组中的一种或多种：
(1)SEQ ID NO：2所示的CDR1、SEQ ID NO：3所示的CDR2、SEQ ID NO：4所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO：6所示的CDR1、SEQ ID NO：7所示的CDR2、SEQ ID NO：8所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO：10所示的CDR1、SEQ ID NO：11所示的CDR2，SEQ ID NO：12所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO：14所示的CDR1、SEQ ID NO：15所示的CDR2，SEQ ID NO：16所示的CDR3；和
(5)SEQ ID NO：18所示的CDR1、SEQ ID NO：19所示的CDR2，SEQ ID NO：20所示的CDR3。
10.一种药盒，其特征在于，所述的药盒包括：
(1)第一容器，以及位于所述第一容器内的如权利要求9所述的PD-L1纳米抗体，以及药学上可用的载体；
(2)第二容器，以及位于所述第二容器内的TLR7激动剂，以及药学上可用的载体；
以及(3)任选的使用说明书。
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