JP2020048567A - イメージングのための新規ｐｄ−ｌ１結合ポリペプチド - Google Patents

イメージングのための新規ｐｄ−ｌ１結合ポリペプチド Download PDF

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Abstract

【課題】ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する新規１０Ｆｎ３ドメイン、ならびにそのドメインを基にした診断のためのイメージング剤を提供する。【解決手段】フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドであって、ここで、（ａ）該１０Ｆｎ３ドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含んでおり、（ｂ）該ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、特定のアミノ酸配列を含んでおり、（ｃ）該ポリペプチドは、１０ｎＭ以下のＫＤにてＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するポリペプチド。【選択図】なし

Description

関連出願
(関連出願の相互参照)
本出願は、２０１４年１１月２５日に提出した表題「イメージングのための新規ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド」なる米国仮特許出願番号第６２／０８４,２９８号に対する優先権を主張するものであり、その内容は、参照により本明細書に援用される。
プログラム死リガンド−１(ＰＤ−Ｌ１)は、ＰＤ−１に対する表面の糖タンパク質リガンドであり、これは活性化ＴおよびＢ細胞により発現され、かつ免疫抑制を媒介する重要な免疫チェックポイント受容であって、抗原提示細胞およびヒトの癌の双方に存在しており、ＰＤ−１への結合によりＴ細胞の活性化およびサイトカインの分泌を下方調節する(Freeman et al., 2000; Latchman et al, 2001)。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を阻害することにより、臨床前モデルにおいて強力な抗腫瘍活性が認められ、この相互作用を破壊する抗体は、癌治療のための臨床試験に導入されている(米国特許第8,008,449号および第7,943,743号；Brahmer et al., 2010；Topalian et al., 2012b；Brahmer et al., 2012；Flies et al., 2011；Pardoll, 2012；HamidおよびCarvajal, 2013)。
ＰＥＴまたはポジトロン断層法は、非侵略的な核医学的技術であって、体内の様々な分子プロセスまたは疾患の病理に関連するタンパク質の場所に関する三次元画像を提供する。この方法は、生理活性分子にて、体内に導入されるポジトロン放出放射性核種(トレーサー)により間接的に放出される一組のγ線を検出する。ＰＥＴイメージングツールは、薬剤開発のための広範囲かつ様々な用途を有しており、かつ独特なトランスレーショナルな医薬的利点を有しており、つまり同一ツールが前臨床および臨床の両方で使用され得る。例示には、標的のインビボ浸潤の直接的な視覚化；毒性または患者間変動を予測するための正常組織への取り込みのモニタリング；罹患組織の定量化；腫瘍転移；経時的な薬効または耐性のモニタリングが含まれる。
本明細書において記述されるものは、診断用／イメージング剤として使用するために、例えば、ポジトロン断層法において使用するために適切な新規の抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンである。
(発明の要旨)
本発明は、少なくとも部分的には、診断用／イメージング剤として、例えばポジトロン断層法において使用するために有用である新規の抗ヒトＰＤ−Ｌ１アドネクチンの発見に基づくものである。これらの剤は、例えば、ＰＤ−Ｌ１発現細胞と非ＰＤ-Ｌ１発現細胞、例えば腫瘍細胞とを区別するのに、ならびにＰＤ−Ｌ１発現組織と非ＰＤ-Ｌ１発現組織、例えば癌組織とを区別するのに有用である。
一局面において、本明細書において提供されるものは、フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン(１０Ｆｎ３)を含むポリペプチドである：ここで(ａ)前記１０Ｆｎ３ドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含んでいる、(ｂ)前記１０Ｆｎ３は、ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有しており、ヒト１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号：１)の対応しているループの配列に対して改変されたアミノ酸配列を含んでいる、ならびに(ｃ)前記ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、５００ｍＭ以下のＫＤ値、例えば、１００ｍＭ以下のＫＤ値にてＰＤ−Ｌ１に結合する。
ある実施態様において、１０Ｆｎ３ドメインは、後記のアミノ酸配列を含んでいるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む:
(１)配列番号：６、７および８の各々；
(２)配列番号：２１、２２および２３の各々；
(３)配列番号：３６、３７および３８の各々；
(４)配列番号：５１、５２および５３の各々；
(５)配列番号：６６、６７および６８の各々；
(６)配列番号：８１、８２および８３の各々；
(７)配列番号：９７、９８および９９の各々；
(８)配列番号：１１３、１１４および１１５の各々；
(９)配列番号：１２４、１２５および１２６の各々；
(１０)配列番号：１３５、１３６および１３７の各々；
(１１)配列番号：１４６、１４７および１４８の各々；
(１２)配列番号：１５７、１５８および１５９の各々；
(１３)配列番号：１６８、１６９および１７０の各々；
(１４)配列番号：１７９、１８０および１８１の各々；
(１５)配列番号：１９０、１９１および１９２の各々；
(１６)配列番号：２０１、２０２および２０３の各々；
(１７)配列番号：２１２、２１３および２１４の各々；
(１８)配列番号：２２３、２２４および２２５の各々；
(１９)配列番号：２３４、２３５および２３６の各々；
(２０)配列番号：２４５、２４６および２４７の各々；
(２１)配列番号：２５６、２５７および２５８の各々；
(２２)配列番号：２６７、２６８および２６９の各々；
(２３)配列番号：２７８、２７９および２８０の各々；
(２４)配列番号：２８９、２９０および２９１の各々；
(２５)配列番号：３００、３０１および３０２の各々；
(２６)配列番号：３１１、３１２および３１３の各々；
(２７)配列番号：３２２、３２３および３２４の各々；
(２８)配列番号：３３３、３３４および３３５の各々；
(２９)配列番号：３４４、３４５および３４６の各々；
(３０)配列番号：３５５、３５６および３５７の各々；
(３１)配列番号：３６６、３６７および３６８の各々；
(３２)配列番号：３７７、３７８および３７９の各々；
(３３)配列番号：３８８、３８９および３９０の各々；
(３４)配列番号：３９９、４００および４０１の各々；
(３５)配列番号：４１０、４１１および４１２の各々；
(３６)配列番号：４２１、４２２および４２３の各々；
(３７)配列番号：４３２、４３３および４３４の各々；
(３８)配列番号：４４３、４４４および４４５の各々；
(３９)配列番号：４５４、４５５および４５６の各々；
(４０)配列番号：４６５、４６６および４６７の各々；
(４１)配列番号：４７６、４７７および４７８の各々；
(４２)配列番号：４８７、４８８および４８９の各々；
(４３)配列番号：４９８、４９９および５００の各々；
(４４)配列番号：５０９、５１０および５１１の各々；
(４５)配列番号：５２０、５２１および５２２の各々；
(４６)配列番号：５３１、５３０および５３１の各々；
(４７)配列番号：５４２、５４３および５４４の各々；
(４８)配列番号：５５３、５５４および５５５の各々；または
(４９)配列番号：５６４、５６５および５６６の各々。
ある実施態様において、前記ポリペプチドは、表３に示した配列、例えば、配列番号：５、２０、３５、５０、６５、８０，９６、１１２、１２３、１３４、１４５、１５６、１６７、１７８、１８９、２００、２１１、２２２、２３３、２４４、２５５、２６６、２７７、２８８、２９９、３１０、３２１、３３２、３４３、３５４、３６５、３７６、３８７、３９８、４０９、４２０、４３１、４４２、４５３、４６４、４７５、４８６、４９７、５０８、５１９、５３０、５４１、５５２および５６３のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号：５、２０、３５、５０、６５、８０、９６、１１２、１２３、１３４、１４５、１５６、１６７、１７８、１８９、２００、２１１、２２２、２３３、２４４、２５５、２６６、２７７、２８８、２９９、３１０、３２１、３３２、３４３、３５４、３６５、３７６、３８７、３９８、４０９、４２０、４３１、４４２、４５３、４６４、４７５、４８６、４９７、５０８、５１９、５３０、５４１、５５２または５６３である非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、後記からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む：配列番号：９−１５、２４−３０、３９−４５、５４−６０、６９−７５、８４−９１、１００−１０７、１１６−１２２、１２７−１３３、１３８−１４４、１５０−１５５、１６０−１６６、１７１−１７７、１８２−１８８、１９３−１９９、２０４−２１０、２１５−２２１、２２７−２３２、２３７−２４３、２４８−２５４、２５９−２６５、２７１−２７６、２９１−２８７、２９２−２９８、３０３−３０９、３１４−３２０、３２５−３３１、３３７−３４２、３４７−３５３、３５８−３６４、３６９−３７５、３８０−３８６、３９１−３９７、４０２−４０８、４１３−４１９、４２４−４３０、４３５−４４１、４４６−４５２、４５７−４６３、４６８−４７４、４７９−４８５、４９０−４９６、５０１−５０７、５１２−５１８、５２３−５２９、５３４−５４０、５４５−５５１および５５６−５６２。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、後記からなる群から選択されるアミノ酸配列の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む：配列番号：９−１５、２４−３０、３９−４５、５４−６０、６９−７５、８４−９１、１００−１０７、１１６−１２２、１２７−１３３、１３８−１４４、１５０−１５５、１６０−１６６、１７１−１７７、１８２−１８８、１９３−１９９、２０４−２１０、２１５−２２１、２２７−２３２、２３７−２４３、２４８−２５４、２５９−２６５、２７１−２７６、２９１−２８７、２９２−２９８、３０３−３０９、３１４−３２０、３２５−３３１、３３７−３４２、３４７−３５３、３５８−３６４、３６９−３７５、３８０−３８６、３９１−３９７、４０２−４０８、４１３−４１９、４２４−４３０、４３５−４４１、４４６−４５２、４５７−４６３、４６８−４７４、４７９−４８５、４９０−４９６、５０１−５０７、５１２−５１８、５２３−５２９、５３４−５４０、５４５−５５１および５５６−５６２。
ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号：５７４−５８３からなる群から選択されるＮ-末端リーダーおよび／あるいは配列番号：５８４−６１８からなる群から選択されるＣ-末端テイルまたはＰｍＣｎ(ここで、Ｐはプロリンであり、ｍは少なくとも０の整数であり(例えば、０、１または２)、かつｎは少なくとも１の整数である(例えば、１または２)。
ある実施態様において、前記ポリペプチドは、ポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清イムノグロブリン結合タンパク質からなる群から選択される１以上の薬物動態(ＰＫ)部分を含む。ある実施態様において、前記ＰＫ部位および前記ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、ポリマー糖またはポリエチレングリコール基を介して結合される。ある実施態様において、前記ＰＫ部位および前記ポリペプチドは、配列番号：６２９−６７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して結合される。
本明細書において提供されるものは、本明細書に記述されたポリペプチドをコードしている核酸、ならびに前記核酸を含むベクターおよび細胞である。ある実施態様において、前記核酸は、配列番号：１６−１９、３１−３４、４６−４９、６１−６４、７６−７９、９２−９５および１０８−１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本明細書において提供されるものは、本明細書に記述した前記ポリペプチドおよび担体を含んでいる組成物である。例えば、本明細書に記述した組成物は、配列番号：５、９−１５、２０、２４−３０、３５、３９−４５、５０、５４−６０、６５、６９−７５、８０、８４−９１、９６、１００−１０７、１１２、１１６−１２２、１２３、１２７−１３３、１３４、１３８−１４４、１４５、１５０−１５５、１５６、１６０−１６６、１６７、１７１−１７７、１７８、１８２−１８８、１８９、１９３−１９９、２００、２０４−２１０、２１１、２１５−２２１、２２２、２２７−２３２、２３３、２３７−２４３、２４４、２４８−２５４、２５５、２５９−２６５、２６６、２７１−２７６、２７７、２９１−２８７、２８８、２９２−２９８、２９９、３０３−３０９、３１０、３１４−３２０、３２１、３２５−３３１、３３２、３３７−３４２、３４３、３４７−３５３、３５４、３５８−３６４、３６５、３６９−３７５、３７６、３８０−３８６、３８７、３９１−３９７、３９８、４０２−４０８、４０９、４１３−４１９、４２０、４２４−４３０、４３１、４３５−４４１、４４２、４４６−４５２、４５３、４５７−４６３、４６４、４６８−４７４、４７５、４７９−４８５、４８６、４９０−４９６、４９７、５０１−５０７、５０８、５１２−５１８、５１９、５２３−５２９、５３０、５３４−５４０、５４１、５４５−５５１、５５２および５５６−５６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドおよび担体を含む。
本明細書において提供されるものは、本明細書に記述した前記ポリペプチドを含んでいるイメージング剤である。ある実施態様において、前記イメージング剤は、配列番号：５、９−１５、２０、２４−３０、３５、３９−４５、５０、５４−６０、６５、６９−７５、８０、８４−９１、９６、１００−１０７、１１２、１１６−１２２、１２３、１２７−１３３、１３４、１３８−１４４、１４５、１５０−１５５、１５６、１６０−１６６、１６７、１７１−１７７、１７８、１８２−１８８、１８９、１９３−１９９、２００、２０４−２１０、２１１、２１５−２２１、２２２、２２７−２３２、２３３、２３７−２４３、２４４、２４８−２５４、２５５、２５９−２６５、２６６、２７１−２７６、２７７、２９１−２８７、２８８、２９２−２９８、２９９、３０３−３０９、３１０、３１４−３２０、３２１、３２５−３３１、３３２、３３７−３４２、３４３、３４７−３５３、３５４、３５８−３６４、３６５、３６９−３７５、３７６、３８０−３８６、３８７、３９１−３９７、３９８、４０２−４０８、４０９、４１３−４１９、４２０、４２４−４３０、４３１、４３５−４４１、４４２、４４６−４５２、４５３、４５７−４６３、４６４、４６８−４７４、４７５、４７９−４８５、４８６、４９０−４９６、４９７、５０１−５０７、５０８、５１２−５１８、５１９、５２３−５２９、５３０、５３４−５４０、５４１、５４５−５５１、５５２および５５６−５６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドを含む。
ある実施態様において、前記イメージング剤は、検出可能な標識を含む。ある実施態様において、前記イメージング剤は、本明細書に記述したポリペプチド、キレート剤および検出可能な標識を含む。ある実施態様において、前記イメージング剤は、本明細書に記述したポリペプチド、二官能性キレーターまたは結合(ＢＦＣ)基および検出可能な標識を含む。ある実施態様において、検出可能な標識は、放射性核種を含有する補欠分子族である。ある実施態様において、検出可能な標識は、ポジトロン断層法により検出することができる。
ある実施態様において、キレート剤および／または二官能性キレーターまたは結合(ＢＦＣ)基は、ＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＣＢ−ＤＯ２Ａ、３ｐ−Ｃ−ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、ＤＢＣＯ、ＤＩＢＯ、ＢＡＲＡＣ、ＤＩＭＡＣ、オキソ−ＤＯ３Ａ、ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ−ＴＥ２Ｐ、ＭＭ−ＴＥ２Ａ、ＤＭ−ＴＥ２Ａ、ｄｉａｍｓａｒ、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ−ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ−ＤＴＰＡ、ＣＨＸ−Ａ''−ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡ、ＤＡＴＡ、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡからなる群から選択される。
ある実施態様において、検出可能な標識は、放射性核種、例えば、６４Ｃｕ、１２４Ｉ、７６／７７Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１１Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、３２Ｃｌ、３３Ｃｌ、３４Ｃｌ、６８Ｇａ、７４Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７８Ｂｒ、８９Ｚｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃまたは１５３Ｓｍである。
ある実施態様において、キレート剤はＮＯＤＡＧＡであり、放射性核種は６４Ｃｕである。ある実施態様において、前記イメージング剤は、抗ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド(例えば、本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン、例えば、配列番号：８０または９６に示されるアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン)、キレート剤のＮＯＤＡＧＡおよび放射性核種６４Ｃｕを含む。
ある実施態様において、前記イメージング剤は、抗ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド(例えば、本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン、例えば、配列番号：８０または９６に示されるアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン)、二官能性キレーターまたは結合(ＢＦＣ)基および放射性核種１８Ｆを含んでいる補欠分子族を含む。ある実施態様において、前記イメージング剤は以下の構造：
Figure 2020048567
を有するもの、またはその医薬的に許容される塩を有する。
ある実施態様において、前記イメージング剤は、以下の構造:
Figure 2020048567
を有する。
ある実施態様において、前記ＢＦＣは、タンパク質上にアミン、カルボキシル、カルボニルまたはチオール官能基と共有結合を形成する反応基を含んでいるシクロオクチンである。ある実施態様において、前記シクロオクチンは、ジベンゾシクロオクチン(ＤＩＢＯ)、ビアリールアザシクロオクチノン(ＢＡＲＡＣ)、ジメトキシアザシクロオクチン(ＤＩＭＡＣ)およびジベンゾシクロオクチン(ＤＢＣＯ)からなる群から選択される。ある実施態様において、前記シクロオクチンは、ＤＢＣＯである。
ある実施態様において、前記ＢＦＣは、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ−エステル、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ−エステル、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−酸、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミンまたはＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドである。ある実施態様において、前記ＢＦＣは、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドである。
ある実施態様において、前記イメージング剤は、下記構造を有する：
Figure 2020048567
(式中、Ｘは、配列番号：１３、２８、４３、５８、７３、８８、１０４、１２０、１３１、１４２、１５３、１６４、１７５、１８６、１９７、２０８、２１９、２３０、２４１、２５２、２６３、２７４、２８５、２９６、３０７、３１８、３２９、３４０、３５１、３６２、３７３、３８４、３９５、４０６、４１７、４２８、４３９、４５０、４６１、４７２、４８３、４９４、５０５、５１６、５２７、５３８、５４９、５６０および５７１のいずれか1つのアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドである)。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号：８８に示したアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号：１０４に示したアミノ酸配列を含む。
本明細書において提供するものは、本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン組成物および／またはイメージング剤、ならびに使用説明書を含むキットである。
本発明により提供するものは、試料中のＰＤ−Ｌ１を検出する方法であって、前記方法は、試料を、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンと接触させること、およびＰＤ−Ｌ１を検出することを特徴とする。
本発明により提供するものは、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを含んでいるイメージング剤を対象に投与すること、および前記イメージング剤を検出すること、そしてこの検出されたイメージング剤が、対象におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞の位置を規定することを特徴とする、対象におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞を検出する方法である。
本発明により提供するものは、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを含んでいるイメージング剤を対象に投与すること、およびイメージング剤を検出すること、そしてこの検出されたイメージング剤が、対象における腫瘍の位置を規定することを特徴とする、対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍を検出する方法である。ある実施態様において、前記イメージング剤は、ポジトロン断層法により検出される。
本発明により提供するものは、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを含んでいるイメージング剤の画像を得る方法であって、前記方法は、
ａ)前記イメージング剤を対象に投与する工程；および
ｂ)前記イメージング剤のインビボ分布を、ポジトロン断層法により画像化する工程、
を特徴とする。
本発明により提供するものは、ＰＤ−Ｌ１を発現する組織または細胞の定量的な画像を得る方法であって、前記方法は、細胞または組織を、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを含んでいるイメージング剤と接触させること、およびポジトロン断層法を用いてＰＤ−Ｌ１を発現している組織を検出または定量化することを特徴とする。
本発明により提供するものは、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍を検出する方法であって、該方法は、画像化に有効な量の抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを含んでいるイメージング剤を、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍を有する対象に投与すること、および腫瘍中のイメージング剤の放射線放射を、ポジトロン断層法を用いて検出すること、前記放射線放射は腫瘍において検出されることを特徴とする。
本発明により提供するものは、対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍の存在を診断する方法であり、前記方法は、
(ａ)診断を必要とする対象に、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを含んでいるイメージング剤を投与する工程；および
(ｂ)対象の少なくとも一部分の放射線画像を得て、イメージング剤の存在または非存在を検出する工程；
ここでバックグランドを超える前記イメージング剤の存在および位置が、疾患の存在および位置の指標であること、
を特徴とする。
本発明により提供するものは、対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療剤の経過をモニタリングする方法であって、前記方法は、
(ａ)最初の時点で、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを含んでいるイメージング剤を、その必要のある対象に投与し、対象の少なくとも一部分の画像を得て、腫瘍のサイズを決定する工程；
(ｂ)対象に抗腫瘍治療剤を投与する工程；および
(ｃ)前記イメージング剤を、１以上の後続する時点で対象に投与して、各時点で対象の少なくとも一部分の画像を得る工程；ここで、各時点での腫瘍の体積および位置が疾患の進行の指標であること、
を特徴とする。
図１は、典型的な本明細書に記述された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンのコアアミノ酸配列の概略である。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループには下線が引かれている。野生型(ＷＴ)(配列番号：２)、ＡＴＩ−９６８(配列番号：５)、ＡＴＩ−９６４(配列番号：２０)、ＡＴＩ−９６７(配列番号：６５)、Ａ０２(配列番号：８０)、Ｅ０１(配列番号：９６)、ＡＴＩ−９６５(配列番号：３５)およびＡＴＩ−９６６(配列番号：５０)。 図２は、[１８Ｆ]−Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯ−ＦＰＰＥＧＡの化学合成についての概略である。分子のＥ０１部分は、配列番号：１０４に示した配列のセットを有する。 図３は、６４Ｃｕ−Ｅ０１抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン(ＮＯＤＡＧＡキレート剤を有する)を用いた、ｈＰＤ−Ｌ１−陽性Ｌ２９８７細胞とｈＰＤ−Ｌ１−陰性ＨＴ−２９細胞との相違を示すグラフである。比活性は、過剰なコールド(非標識)Ｅ０１アドネクチンと共インキュベーションした場合に、細胞に会合した６４Ｃｕ−Ｅ０１の低下により確認された。 図４Ａは、ＮＯＤＡＧＡ−６４Ｃｕ−標識Ａ０２抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを用いる、両側性の異種移植マウスにおけるｈＰＤ−Ｌ１(＋)とｈＰＤ−Ｌ１(−)腫瘍の相違を図示するＰＥＴ画像である。プローブの存在領域を示す０〜２時間の画像をまとめたものを示す。明るい領域は、暴露期間中に最大の占有組織である。 図４Ｂは、ｈＰＤ−Ｌ１(＋)[Ｌ２９８７]腫瘍における腫瘍標識の時間経過を図示するグラフである。ｈＰＤ−Ｌ１(＋)系[Ｌ２９８７ブロック]におけるｈＰＤ−Ｌ１(−)[ＨＴ２９]腫瘍およびパルス追跡実験は標識の比活性を示す。 図５は、γカウンターによりエクスビボで測定した場合の、両側性のｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７およびｈＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９異種移植を担持するマウスにおける１８Ｆ−標識Ａ０２抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン放射性トレーサーの組織分布を図示するグラフである。 図６は、カニクイザルにおける１８Ｆ−標識Ｅ０１抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン分布の合成画像である。 図７は、コールドＡ０２アドネクチンの表示された濃度と共インキュベーションした０.２５ｎＭ １８Ｆ−ＤＢＣＯ−Ａ０２抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンで標識された異種移植およびヒト肺組織のインビトロでのオートラジオグラフィーを図示する画像である。 図８は、ｈＰＤ−Ｌ１の腫瘍発現を示すために、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンで標識された異種移植およびヒト肺腫瘍試料片の免疫組織化学画像を図示する。 図９は、[１８Ｆ]−Ａ０２−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯ−ＦＰＰＥＧＡを合成するための反応スキームを示す。同じ反応スキームを使用して、Ｅ０１アドネクチンを標識した。 図１０は、[１８Ｆ]−ＦＰＰＥＧＡの自動合成のためのＧＥ ＴＲＡＣＥＲｌａｂ ＦＸ２ Ｎ 合成モデルのスキームである。 図１１は、[１８Ｆ]−ＦＰＰＥＧＡの自動合成のためのＳｙｎｔｈｅｒａ合成モジュール(ＩＢＡ)のスキームである。 図１２は、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンの典型的な競合曲線である。
(定義)
別段の記載が無ければ、本明細書に使用される全ての技術および科学用語は、当業者が一般的に理解される意味と同じ意味を示す。いずれの方法および組成物も、本明細書に述べた類似または同一方法および組成物を、本発明の実施または試験に使用され得、また好ましい方法および組成物は、本明細書に記述される。
「プログラム死リガンド−１(ＰＤ−Ｌ１)」は、ＰＤ−１への結合に対してＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方調節するＰＤ−１に対する２つの細胞表面糖タンパク質リガンドの内の１つである(もう一方が、ＰＤ−Ｌ２である)。本明細書において使用される用語「ＰＤ−Ｌ１」は、ヒトＰＤ−Ｌ１(ｈＰＤ−Ｌ１)、ｈＰＤ−Ｌ１のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにｈＰＤ−Ｌ１と少なくとも１つの共通するエピトープを有するアナログを包含する。完全なｈＰＤ−Ｌ１配列は、GenBank Accession No. Q9NZQ７として存在し得る。ＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ２７４、Ｂ７−Ｈ、Ｂ７Ｈ１、ＰＤＣＤ１Ｌ１およびＰＤＣＤ１ＬＧ１として参照される。
本明細書中において使用される「ポリペプチド」は、長さ、翻訳後修飾、または機能を問わない２つ以上のアミノ酸のいずれかの配列をいう。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で互換的に使用される。ポリペプチドは、天然アミノ酸、および引用により本明細書に援用される米国特許第６,５５９,１２６号に記述されるもののような、非天然アミノ酸を含みうる。ポリペプチドはまた、様々な一般的な化学的手法のいずれかによって修飾されうる(例えば、アミノ酸は保護基によって修飾されうる；アミノ酸のカルボキシ末端は、末端のアミド基を形成しうる；末端のアミノ基は、例えば親油性を上昇させるような基によって修飾されうる；またはポリペプチドは化学的にグリコシル化されうるか、そうでなければ安定性もしくはインビボでの半減期を上昇させるような修飾を受け得る)。ポリペプチドの修飾は、環状化合物または他の分子などの別の構造をポリペプチドに結合させることを含んでもよく、立体配置が変化した(すなわち、ＲもしくはＳ；またはＬもしくはＤ)１つ以上のアミノ酸を含むポリペプチドもまた含み得る。本明細書において記述されるペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するように修飾されているフィブロネクチンの第１０番目のＩＩＩ型ドメイン(the tenth type III ドメイン)から得られるタンパク質であり、かつ「抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン」または「ＰＤ−Ｌ１アドネクチン」として示されるタンパク質である。
本明細書中において使用されるような「ポリペプチド鎖」とは、ポリペプチドをいい、ここでそのドメインの各々は、非共有相互作用またはジスルフィド結合とは対照的に、ペプチド結合により別のドメインと連結されている。
「単離された」ポリペプチドとは、自然環境の一成分から同定、分離および／または回収されたものである。自然環境からの混入成分は、ポリペプチドの診断または治療的使用に干渉する可能性がある物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含みうる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)ローリー法によって決定されるポリペプチドが、９５重量％より大きく、最も好ましくは９９重量％より大きく、(２)少なくともＮ-末端の残基または内部のアミノ酸配列を、スピニング・カップ・シークエネーターを用いて得るのに十分な程度であり、または(３)クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて、還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一化されるまで精製される。単離されたポリペプチドは、当該ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組み換え細胞内の原位置のポリペプチドを含む。しかし、通常単離されたポリペプチドは少なくとも１回の精製工程によって得られる。
本明細書において使用されるような１０Ｆｎ３ドメインの「領域」とは、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの、ループ(ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧ)、β−ストランド(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ)、Ｎ−末端(配列番号：１のアミノ酸残基１〜７に対応する)またはＣ−末端(配列番号：１のアミノ酸残基９３〜９４に対応する)のいずれかをいう。
「スキャッホルド領域」とは、ヒト１０Ｆｎ３ドメインのいずれかの非ループ領域をいう。スキャッホルド領域は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧのβ−ストランド、ならびにそのＮ-末端領域(配列番号：１の残基１−７に対応するアミノ酸)およびＣ-末端領域(配列番号：１の残基９３−９４に対応するアミノ酸、および所望によりヒトフィブロネクチン内のＦｎ３ドメインの１０thと１１thリピートの間に天然のリンカーを構成する７つのアミノ酸を含んでいてもよい)を包含する。
本明細書において「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列同一性の一部分として保存的置換は考慮せずに、最大の％配列同一性を達成するために、配列を並べて、必要に応じてギャップを導入した後の、選択配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の％として定義される。％アミノ酸配列同一性を決定する目的上、アライメントは、当分野の技術範囲内にある様々な方法で、例えば、公的に利用できるコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ(登録商標))ソフトウェアを用いて達成され得る。当業者は、比較される全長配列全体で、最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めたアライメントを測定するための適切なパラメータを容易に決定できる。例えば、所定のアミノ酸配列Ｂに対する所定のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性は(所定のアミノ酸配列Ｂに対して、ある特定の％アミノ酸配列同一性を有するかまたは含む、所定のアミノ酸配列Ａと言い換えることもできる)、下記のように計算される：１００×割合Ｘ／Ｙ、ここでＸは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、つまりＡおよびＢのプログラムのアライメントにより、同一性一致としてスコアされたアミノ酸残基の数、ここでＹはＢ中のアミノ酸残基の全数。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等価でない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等価でないことは理解されるであろう。
本明細書において使用されるような、用語「アドネクチン結合部位」は、特定のアドネクチンに相互作用または結合するタンパク質(例えば、ＰＤ−Ｌ１)の部位または部分を意味する。アドネクチン結合部位は、タンパク質の三次構造により並列された連続するアミノ酸または不連続なアミノ酸から形成され得る。連続したアミノ酸により形成されたアドネクチン結合部位は、典型的には、溶媒変性への暴露時に保持されているが、三次構造により形成されたアドネクチン結合部位は、典型的には、溶媒変性の処置によって失う。
本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンについてのアドネクチン結合部位は、抗体のエピトープマッピングに対して通常使用される標準技術、例えば、これに限定するものではないがプロテアーゼマッピングおよび突然変異体分析を用いて決定され得る。あるいは、アドネクチン結合部位は、同一ポリペプチド、例えばＰＤ−Ｌ１に結合する参照アドネクチンまたは抗体を用いる競合アッセイにより決定され得る(同一のアドネクチン結合部位に結合する「交差競合アドネクチンおよび／またはアドネクチン」というセクションで、下記に更に記述される)。試験用アドネクチンおよび参照分子(例えば、別のアドネクチンまたは抗体)が競合するならば、それらは、同一アドネクチン結合部位または１つの分子の結合が別の分子に干渉するような十分に近接しているアドネクチン結合部位に結合する。
本明細書中で互換的に使用されるように、ＰＤ−Ｌ１へのアドネクチン結合なる文脈において、用語「特異的に結合する」、「特異的結合」、「選択的結合」および「選択的に結合する」は、当分野において利用できる技術、例えば、これに限定しないが、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ(例えば、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡコアアッセイ)により測定された場合、ＰＤ−Ｌ１に対する親和性を発揮するが、別のポリペプチドとは有意に結合しない(例えば、約１０％結合以下)アドネクチンをいう。この用語は、例えば、本明細書に記述されたアドネクチンの結合ドメインがＰＤ−Ｌ１に対して特異的である場合に利用できる。
本明細書中で使用されるように、用語「選択的に結合する」は、ＰＤ−Ｌ１へのアドネクチン結合の文脈において、当分野に利用できる技術、例えば、これに限定しないが、スキャッチャード分析および／または拮抗結合アッセイ(例えば、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡコアアッセイ)により測定された場合に、本明細書に記述されたアドネクチンが、異なるポリペプチドに結合する場合よりも、少なくとも約２０％を超えてＰＤ−Ｌ１に結合する状態をいう。
本明細書中で使用されるように、用語「交差反応性」は、アドネクチンの文脈において、同一または非常に類似性の高いアドネクチン結合部位を有する１以上の固有のタンパク質に結合するアドネクチンをいう。
本明細書中で使用されるように、用語「ＫＤ」は、ＰＤ−Ｌ１に結合しているアドネクチンという内容において、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを用いて測定される場合の、特定のアドネクチン−タンパク質(例えば、ＰＤ−Ｌ１)相互作用の解離平衡定数またはタンパク質(例えば、ＰＤ−Ｌ１)に対するアドネクチンの親和性を指すことが意図される。本明細書に使用されるような「望ましいＫＤ」とは、意図された目的にとって十分であるアドネクチンのＫＤを意味する。例えば、望ましいＫＤは、インビトロアッセイにおいて、例えば細胞を基にしたルシフェラーゼアッセイにおいて、機能的効果を誘起させるために必要なアドネクチンのＫＤを示し得る。
本明細書において使用されるように、用語「ｋａ」は、タンパク質に結合しているアドネクチンという内容において、アドネクチン／タンパク質複合体への、アドネクチンの会合についての会合速度定数を意味することが意図される。
本明細書において使用されるように、用語「ｋｄ」は、タンパク質に結合しているアドネクチンという内容において、アドネクチン／タンパク質複合体からのアドネクチンの解離についての解離速度定数を意味することが意図される。
本明細書で用いられる用語「ＩＣ５０」は、アドネクチンという内容において、インビトロまたはインビボアッセイのいずれかにおいて、最大の阻害応答の５０％、すなわち最大の阻害応答と未処理応答との中間水準まで反応を阻害する、アドネクチンの濃度をいう。
用語「ＰＫ」は「薬物動態」の頭文語であり、例えば患者による吸収、分布、代謝および排出などの化合物の性質を含む。本明細書で用いられる「ＰＫ調節タンパク質」または「ＰＫ部位」は、生物学的に活性な分子と融合しているか、またはそれと併用投与される場合に、生物学的に活性な分子の薬物動態特性に影響するいずれかのタンパク質、ペプチドまたは部位をいう。ＰＫ調節タンパク質またはＰＫ部位の例としては、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)結合剤(米国特許出願公開第２００５／０２８７１５３号および２００７／０００３５４９号、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ２００９／０８３８０４号およびＷＯ２００９／１３３２０８号に開示される)、ヒト血清アルブミンおよびそのバリアント、トランスフェリンおよびそのバリアント、ＦｃまたはＦｃフラグメントおよびそれらのバリアントならびに糖(例えば、シアル酸)が挙げられる。
タンパク質または化合物の「血中半減期」は、例えば、自然機構による、配列もしくは化合物の分解、および／または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離などによって、インビボでのポリペプチドの血清濃度が５０％まで減少するのに必要な時間と一般に定義されうる。当該半減期は薬物動態解析などのそれ自体が周知のいずれかの方法によって決定されうる。適切な技術は、当業者にとって明らかであり、例えば、本明細書のアミノ酸配列または化合物の適切な用量を患者に適切に投与する工程；患者から定期的に血液サンプルまたは他のサンプルを回収する工程；前記の血液サンプルにおいて、本明細書のアミノ酸配列または化合物の量または濃度を決定する工程；および前記で得られたデータ(の一部)から、本明細書のアミノ酸配列または化合物の量または濃度が、投与時の初期量と比較して５０％まで減少するまでの時間を計算する工程を一般的に含みうる。例えば、Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals： A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach(1996)などの標準的な便覧を参照されたい。Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker(1982)もまた参照されたい。
半減期はｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータ、ＨＬ＿ラムダ＿ｚ、および血中濃度時間曲線下面積(ＡＵＣ)などを用いて表されうる。本明細書において、「半減期の増加」とは、これらのパラメーターのいずれか１つ、これらのパラメーターのいずれか２つ、これらのパラメーターのいずれか３つ、またはこれらのパラメーターの４つ全てにおける増加をいう。「半減期の増加」は、特に、ｔ１／２−ベータ、および／またはＨＬ＿ラムダ＿ｚの増加をいい、ｔ１／２−アルファおよび／またはＡＵＣまたはその両方の増加を伴っても伴わなくてもよい。
用語「検出可能な」は、バックグラウンドのシグナルを超えるシグナルを検出することができることをいう。用語「検出可能なシグナル」は、これに限定はされないが、ポジトロン断層法(ＰＥＴ)などの非侵襲性のイメージング技術によって得られるシグナルである。検出可能なシグナルは、検出可能であり、かつ患者から生じうる他のバックグラウンドシグナルと区別できる。言い換えれば、検出可能シグナルとバックグラウンドの間に、測定可能および統計的に有意な違いが存在する(例えば、統計的に有意な差異は、検出可能なシグナルおよびバックグラウンドを区別するのに十分な違いであり、例えば検出可能なシグナルおよびバックグラウンドの違いが、約０.１％、１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または４０％またはそれ以上である)。検量線および／または較正曲線が、検出可能なシグナルおよび／またはバックグラウンドの相対強度を決定するために用いられうる。
本明細書に記述したイメージング剤を含んでいる組成物の「検出可能な有効量」は、臨床的使用が可能な装置を用いて、許容可能な画像を得るのに十分な分量と定義される。本明細書で提供されるイメージング剤の検出可能な有効量は、１回以上の注射によって投与されうる。検出可能な有効量は、個体の感受性の程度、個体の年齢、性別および体重、個体の特異体質反応などの因子によって変化しうる。イメージング組成物の検出可能な有効量は、用いられる機器および方法に依っても変化しうる。このような因子の最適化は、十分に当分野の技術の範囲内である。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１イメージング剤、例えば、本明細書に記述したものは、２つ以上の、例えば、３、４、５またはそれ以上の相違する因子(即ち、バックグラウンドシグナルに対して特異的なシグナル)を提供する。
用語「生体直交型化学」は、本来の生物化学プロセスと干渉しない生体システム内部において起こり得るあらゆる化学反応を指す。この用語は、生理学的ｐＨまたは水の存在下においてインビトロで起こる化学反応を含む。生体直交型であると考えるべきは、この反応は、選択的であり、かつ開始化合物中に存在する他の官能基との副反応を回避する。さらに、反応パートナー間で得られる共有結合は、強固でなくてはならず、生物学的反応に対して化学的に不活性であり、かつ目的とする分子の生物学的活性に影響を及ぼすべきでない。
用語「クリックケミストリー」とは、新規化合物の迅速な合成およびコンビナトリアルライブラリーのための一連の確実かつ選択的な生体直交型反応を意味する。クリック反応の特性は、生理学的条件下において安定である化合物を生成するためのモジュール性、高収量、立体特異性および単一生成物の単離(非クロマトグラフィー方法による不活性副生成物との分離)の特性を包含する。放射性化学および放射性医薬において、クリックケミストリーとは、選択的およびモジュラー型のビルディングブロックの使用を可能とし、かつ触媒の非存在において放射線標識生体関連化合物への化学選択的結合を可能とする、一連の標識化反応に対する一般的用語である。“クリック反応”は、銅と共に用いても、または銅不含のクリック反応であっても可能である。
用語「補欠分子族」または「二官能性標識化剤」は、ペプチドまたはタンパク質に結合することができる放射性核種(例えば、１８Ｆ)を含有する有機性低分子をいう。
放射性医薬品化学に関して本明細書中で使用されるように、用語「キレーターリガンド」とは、二官能性キレーターまたは結合(ＢＦＣ)基を意味するものであり、本明細書において互換的に使用され、放射性標識補欠分子族と生物学的に活性な標的分子(例えば、ペプチドまたはタンパク質)と共有結合する。ＢＦＣは、例えば、アミドカップリングのためにカルボン酸または活性化エステル、チオ尿素カップリングのためにイソチオシアネートおよびチオールカップリングのためにマレイミドなどの官能基を利用する。
本明細書において互換的に使用される用語「個体」、「対象」および「患者」は、動物、好ましくは哺乳類(例えば、非霊長類および霊長類)、例えばヒトを言う。ある実施態様において、対象は、ＰＤ−Ｌ１レベル低下またはＰＤ−Ｌ１の生物活性低下により恩恵を受ける疾患または障害または症状を有する。ある実施態様において、対象は、ＰＤ−Ｌ１のレベル低下またはＰＤ−Ｌ１の生物活性低下により恩恵を受ける疾患、障害または症状を発症するリスクがある。
「癌」は、体内において制御されていない異常細胞の増殖を特徴とする広範囲の種々の疾患を指す。制御されていない細胞分裂および増殖、分裂および成長は、近傍の組織へ浸潤し、またリンパ系または血流にのって体内の遠位部分へと転移もし得る悪性腫瘍の形成をもたらす。
「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌様または他の異常な細胞、あるいは、自己免疫性または病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞または組織に対して、選択的な標的化、結合、阻害、破壊および／または脊椎動物の身体からの排除をもたらす免疫系細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞および好中球)およびこれらの細胞または肝臓(例えば、Ａｂｓ、サイトカイン類および補体)のいずれかにより産生された可溶性高分子の挙動を意味する。
「免疫調節剤」は、免疫応答を制御する物質、薬剤、シグナル伝達経路またはその成分である。「制御する」、「修飾する」または「調節する」免疫応答は、免疫系の細胞またはかかる細胞の活性における任意の変化をいう。かかる制御は、様々な細胞タイプの数の増加または低下、これらの細胞の活性の増加または低下、あるいは免疫系において起こり得るその他の変化により起こり得る免疫系の刺激または抑制を包含する。阻害性および刺激性双方の免疫調節剤が同定されており、これらの幾つかのものは、癌の微環境において機能を増強させ得る。
用語「免疫治療」は、免疫応答を、誘導、増強、抑制または改変することを含む方法により、疾患に罹患している対象、あるいは疾患の再発に苦しんでいるか、または疾患の再発に罹っている対象の治療をいう。
対象の「処置」または「治療」は、疾患に関連のある、発症、進行、症状の重症度または再発性、合併症、症状または生化学的兆候を、回復、軽減、緩和、阻害、抑制または保護することを目的とした、対象に対して行う介入またはプロセスまたは活性剤の投与についてのあらゆるタイプを意味する。
本明細書中において使用される「投与」または「投与する」とは、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンに関するこの文脈において、本明細書に記述したＰＤ−Ｌ１アドネクチン、あるいはＰＤ−Ｌ１アドネクチンを基にしたプローブまたは標識プローブ(これは「イメージング剤」としても呼ばれる)を、対象に導入することを意味する。あらゆる投与経路が、適切であり、例えば、静脈内、経口、局所、皮下、腹膜、動脈内、吸入、経腟、直腸、経鼻、脳脊髄液への導入または身体区分への点滴が使用され得る。
用語「治療上の有効量」は、治療効果を対象に提供するために必要な薬剤の少なくとも最小用量、但し毒性用量未満をいう。
本明細書中において使用される、用語「有効量」は、目的とする結果を達成するために必要な投薬量および期間にて、少なくとも効果のある量をいう。
本明細書中において使用される、「十分な量」は、目的とする結果を達成するために十分な量をいう。
本明細書中において使用される、「ポジトロン断層法」または「ＰＥＴ」は、体内でのトレーサーの位置の三次元画像を提供する非侵略的な核医薬技術をいう。この方法は、身体に導入される、生理活性分子上のポジトロン放出放射性核種(トレーサー)により間接的に放出されたγ線の対を検出するものである。ＰＥＴイメージングツールは、広範囲の用途を有しており、前臨床および臨床的な薬剤開発の助けとなる。適用例としては、標的のインビボ飽和に関する直接的な可視化；正常組織への取り込みをモニタリングして、毒性または患者間偏差の予測；疾患組織の定量化；腫瘍転移；および薬物効力の経時的モニタリングまたは経時的耐性が挙げられる。
(要旨)
本明細書において提供されるものは、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、かつ異種分子、例えば放射性標識に結合され得るポリペプチドである。かかるポリペプチドは、診断用アッセイとして、試料または組織(例えば、選択的にＰＤ−Ｌ１を発現する癌組織などの組織)中のＰＤ−Ｌ１を検出するために有用である。
本発明は、患者ＰＤ−Ｌ１発現の全身の可視化を可能とする非侵略的臨床イメージング剤の開発に基づく。ある実施態様において、患者全身の１日の「バーチャル生体検査」が、ＰＤ−Ｌ１発現レベルをモニターして、その位置を特定するために行われる。本明細書に記述されたＰＤ−Ｌ１イメージング剤を使用して、１日における高いコントラストの全身のバーチャル生体検査を提供できる。
Ｉ.フィブロネクチンベースのスキャッホルド
Ｆｎ３は、フィブロネクチン由来のＩＩＩ型ドメインをいう。Ｆｎ３ドメインは、小さく、単量体の、可溶性および安定である。ジスルフィド結合を持たず、そのため還元条件下で安定である。Ｆｎ３の全体構造は、イムノグロブリンの折り畳み(fold)構造に類似している。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ-末端からＣ-末端の順に、βまたはβ様ストランド、Ａ；ループ、ＡＢ；βまたはβ様ストランド、Ｂ；ループ、ＢＣ；βまたはβ様ストランド、Ｃ；ループ、ＣＤ；βまたはβ様ストランド、Ｄ；ループ、ＤＥ；βまたはβ様ストランド、Ｅ；ループ、ＥＦ；βまたはβ様ストランド、Ｆ；ループ、ＦＧ；およびβまたはβ様ストランド、Ｇを含む。７つの逆平行β−ストランドは、安定なコアを形成する２つのβシートに配置され、同時に、βまたはβ様ストランドに連結するループから成る２つの「面」が生じる。ループＡＢ、ＣＤおよびＥＦは１つの面(「南極」)に位置し、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧは反対の面(「北極」)に位置する。ヒトフィブロネクチンには少なくとも１５個の異なるＦｎ３モジュールが存在しており、モジュール間の配列相同性は低いが、それらは全て三次構造において高い類似性を共有している。
本明細書において記述されるものは、１以上の溶媒露出ループが無作為化または変異されているＦｎ３ドメインを含んでいる抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンである。ある実施態様において、Ｆｎ３ドメインは、野生型ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン(１０Ｆｎ３)の第１０モジュール：
Figure 2020048567
(９４個のアミノ酸；ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループには下線が引かれる；コア１０Ｆｎ３ドメインは、アミノ酸９(“Ｅ”)で始まり、アミノ酸９４(“Ｔ”)で終結し、８６個のアミノ酸のポリペプチドに対応している)から得られるＦｎ３ドメインである。
コア野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：２に示されている。
ある実施態様において、１０Ｆｎ３の非リガンド結合配列、即ち“１０Ｆｎ３スキャッホルド”は、変更されてもよいが、但し１０Ｆｎ３がリガンド結合機能および／または構造安定性を保持している場合である。様々な突然変異株１０Ｆｎ３スキャッホルドが報告されている。一局面において、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９およびＡｓｐ２３のうち１以上は、別のアミノ酸、例えば、非陰性電荷のアミノ酸残基(例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど)により置換されている。有益であるか、または中立的である１０Ｆｎ３スキャッホルド内の様々な追加の変更が開示されている。例えば、Batori et al., Protein Eng., 15(12)：1015-1020(December 2002)；Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326 - 10333(Aug. 28, 2001)を参照されたい。
変異型および野生型１０Ｆｎ３タンパク質の双方は、同一構造、即ちＡ〜Ｇと表示された７つのβ-ストランドドメイン配列および７つのβ-ストランドドメイン配列を繋ぐ６つのループ領域(ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループおよびＦＧループ)を特徴とする。Ｎ−およびＣ−末端に最も近い位置にあるβ-ストランドは、溶液中でβ様立体構造をとり得る。配列番号：１において、ＡＢループは、残基１４〜１７に対応しており、ＢＣループは残基２３〜３１に対応しており、ＣＤループは、残基３７〜４７に対応しており、ＤＥループは残基５１〜５６に対応しており、ＥＦループは、残基６３〜６７に対応しており、ＦＧループは残基７６〜８７に対応している。
従って、ある実施態様において、本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：１に示されるヒト１０Ｆｎ３ドメインまたは配列番号：２に示されるそのコア配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一である１０Ｆｎ３ポリペプチドである。変異性の多くは、一般的には、１以上のループまたは１以上のβ-ストランドまたはＮ−またはＣ-末端領域においておこる。１０Ｆｎ３ポリペプチドのβまたはβ様ストランドの各々は、主に、配列番号：１または２の対応するβまたはβ様ストランドの配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列から構成され得るが、但し前記変異性は、生理条件において前記ポリペプチドの安定性を妨害しない)。
ある実施態様において、本発明は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型(１０Ｆｎ３)ドメインを含む抗ヒトＰＤ−Ｌ１アドネクチンを提供するものであり、前記１０Ｆｎ３ドメインは、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含んでおり；ならびに、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループ配列に対して改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有する。ある実施態様において、本明細書に記述された抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、配列番号：１または２の非ループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでいる１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここでＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループが変更される。ある実施態様において、ＢＣおよびＦＧループが変更され、ある実施態様において、ＢＣおよびＤＥループが変更され、ある実施態様において、ＤＥおよびＦＧループが変更され、ある実施態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが変更される、即ち１０Ｆｎ３ドメインは非天然ループを含む。ある実施態様において、ＡＢ、ＣＤおよび／またはＥＦループは変更される。「変更される」とは、テンプレート配列(ヒトフィブロネクチンドメインに対応している)に対する１以上のアミノ酸配列の変更を意味しており、アミノ酸の付加、削除、置換またはその組合せを包含する。アミノ酸配列の変更は、一般的には、核酸のコード配列の計画的、盲目的または自然発生的な配列の変動を介して達成され、また任意の技術、例えば、ＰＣＲ、変異性ＰＣＲまたは化学ＤＮＡ合成により起こり得る。
ある実施態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される１以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループ長に対して長くても、または短くてもよい。ある実施態様において、ループ長は、２〜２５個のアミノ酸にて伸長されてもよい。ある実施態様において、ループ長は、１〜１１個のアミノ酸にて短くされてもよい。抗原結合を至適化するために、１０Ｆｎ３のループ長を、長さならびに配列を変更して、抗原結合において最も高い適応性および親和性を得てもよい。
ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号：１または２の非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一である非ループ領域のアミノ酸配列を含むＦｎ３ドメインを含んでおり、ここでＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択された少なくとも１つのループが変更される。ある実施態様において、変更されたＢＣループは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個までのアミノ酸置換、１、２、３または４個までのアミノ酸削除、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個までのアミノ酸挿入、またはその組合せを有する。
ある実施態様において、インテグリン−結合モチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」(ＲＧＤ)(配列番号：１のアミノ酸７８−８０)の１以上の残基は、インテグリンの結合を妨害できるように置換されていてもよい。ある実施態様において、本明細書において提供される前記ポリペプチドのＦＧループは、ＲＧＤインテグリン結合部位を含まない。一実施形態において、ＲＧＤ配列は、極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列(Ｎ-末端からＣ-末端方向にて)により置換される。ある実施態様において、ＲＧＤ配列は、ＳＧＥにより置換される。一実施形態において、ＲＧＤ配列は、ＲＧＥにより置換される。
ある実施態様において、フィブロネクチンベースのスキャッホルドタンパク質は、一般的に以下の配列に従って規定される１０Ｆｎ３ドメインを含む：
Figure 2020048567
ここでＡＢループは(Ｚ)ａにより示され、ＣＤループは(Ｚ)ｂにより示され、ＥＦループは(Ｚ)ｃにより示され、ＢＣループは(Ｚ)ｘにより示され、ＤＥループは(Ｚ)ｙにより示され、ＦＧループは(Ｚ)ｚにより示される。Ｚは任意のアミノ酸を示し、Ｚに後続する下付きの文字は、アミノ酸の数(整数)を示す。特に、ａは、１−１５、２−１５、１−１０、２−１０、１−８、２−８、１−５、２−５、１−４、２−４、１−３、２−３または１−２のアミノ酸の範囲であってもよい；およびｂ、ｃ、ｘ、ｙおよびｚは、各々独立して、２−２０、２−１５、２−１０、２−８、５−２０、５−１５、５−１０、５−８、６−２０、６−１５、６−１０、６−８、２−７、５−７または６−７のアミノ酸のいずれの範囲であってもよい。βストランドの配列は、配列番号：１または２に示される対応するアミノ酸に対して、全ての７つのスキャッホルド領域にわたって、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲で置換、削除または付加を有していてもよい。ある実施態様において、βストランドの配列は、全ての７つのスキャッホルド領域にわたって、配列番号：１または２に示される対応するアミノ酸に対して０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲で保存的置換を有していてもよい。ある実施態様において、コアアミノ酸残基は決まっており、いずれの置換、保存的置換、削除または付加も、コアアミノ酸残基以外の残基でおこる。
ある実施態様において、本明細書において記述される抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、１０Ｆｎ３スキャッホルドを基にしており、かつ後記配列により一般的に規定される：
Figure 2020048567
ここで、ＢＣループは(Ｚ)ｘにより示され、ＤＥループは(Ｚ)ｙにより示され、ＦＧループは(Ｚ)ｚにより示される。Ｚは任意のアミノ酸を示し、Ｚに後続する下付き文字は、アミノ酸の数(整数)を示す。特に、ｘ、ｙおよびｚは、各々独立して、２−２０、２−１５、２−１０、２−８、５−２０、５−１５、５−１０、５−８、６−２０、６−１５、６−１０、６−８、２−７、５−７または６−７のアミノ酸の範囲であってもよい。好ましい実施態様において、ｘは１１個のアミノ酸であり、ｙは６個のアミノ酸であり、ｚは１２個のアミノ酸である。βストランドの配列は、配列番号：１または２に示される対応するアミノ酸に対して、全ての７つのスキャッホルド領域にわたって、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲で置換、削除または付加を有してもよい。ある実施態様において、βストランドの配列は、配列番号：１または２に示される対応するアミノ酸に対して、全ての７つのスキャッホルド領域にわたって、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲で保存的置換を有してもよい。ある実施態様において、コアアミノ酸残基、例えば外側の１以上のループは決まっており、いずれの置換、保存的置換、削除または付加も、コアアミノ酸残基以外の残基でおこる。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含み得る、ここで各々(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚにより示される少なくとも１つのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは変更される。上記したとおり、配列番号：１の残基２３−３１、５１−５６および７６−８７に対応するアミノ酸残基は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの各々を規定している。しかし、ループ領域の中の全ての残基というわけではないが、目的とする標的(例えば、ＰＤ−Ｌ１)に対して強力な親和性を有する１０Ｆｎ３結合剤を得るために該残基を改変することを要することは理解されるであろう。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：２１、２２および２３の各々に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：２１、２２および２３の各々のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含んでいる。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：３６、３７および３８の各々に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：３６、３７および３８の各々のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：５１、５２および５３の各々に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：５１、５２および５３の各々のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：６６、６７および６８の示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：６６、６７および６８の各々のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：６、７および８の各々に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：６、７および８の各々のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含んでいる。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：８１、８２および８３の各々に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：８１、８２および８３の各々のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含んでいる。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：９７、９８および９９の各々に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：９７、９８および９９の各々のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含んでいる。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３または４に示される配列を含んでおり、ここで(Ｚ)ｘ、(Ｚ)ｙおよび(Ｚ)ｚの各々により示されるようなＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、配列番号：１１３、１１４および１１５の各々；配列番号：１２４、１２５および１２６の各々；配列番号：１３５、１３６および１３７の各々；配列番号：１４６、１４７および１４８の各々；配列番号：１５７、１５８および１５９の各々；配列番号：１６８、１６９および１７０の各々；配列番号：１７９、１８０および１８１の各々；配列番号：１９０、１９１および１９２の各々；配列番号：２０１、２０２および２０３の各々；配列番号：２１２、２１３および２１４の各々；配列番号：２２３、２２４および２２５の各々；配列番号：２３４、２３５および２３６の各々；配列番号：２４５、２４６および２４７の各々； 配列番号：２５６、２５７および２５８の各々；配列番号：２６７、２６８および２６９の各々；配列番号：２７８、２７９および２８０の各々；配列番号：２８９、２９０および２９１の各々；配列番号：３００、３０１および３０２の各々；配列番号：３１１、３１２および ３１３の各々；配列番号：３２２、３２３および３２４の各々；配列番号：３３３、３３４および３３５の各々；配列番号：３４４、３４５および３４６の各々；配列番号：３５５、３５６および３５７の各々；配列番号：３６６、３６７および３６８の各々；配列番号：３７７、３７８および３７９の各々；配列番号：３８８、３８９および３９０ の各々；配列番号：３９９、４００および４０１の各々；配列番号：４１０、４１１および４１２の各々；配列番号：４２１、４２２および４２３の各々；配列番号：４３２、４３３および４３４の各々；配列番号：４４３、４４４および４４５の各々；配列番号：４５４、４５５および４５６の各々；配列番号：４６５、４６６および４６７の各々；配列番号：４７６、４７７および４７８の各々；配列番号：４８７、４８８および４８９の各々；配列番号：４９８、４９９および５００の各々；配列番号：５０９、５１０および５１１の各々；配列番号：５２０、５２１および５２２の各々；配列番号：５３１、５３０および５３１の各々；配列番号：５４２、５４３および５４４の各々；配列番号：５５３、５５４および５５５の各々；または配列番号：５６４、５６５および５６６の各々のアミノ酸配列を有するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含んでいる。かかる抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンのスキャッホルド領域は、配列番号：４のスキャッホルドアミノ酸残基に対して、０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲で置換、保存的置換、削除または付加も含み得る。このスキャッホルドの改変は、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンが、目的とするＫＤにてＰＤ−Ｌ１を結合できる限り行い得る。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンのＢＣループは、６、２１、３６、５１、６６、８１および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンのＤＥループは、７、２２、３７、５２、６７、８２および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンのＦＧループは、８、２３、３８、５３、６８、８３および９９アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：６、２１、３６、５１、６６、８１および９７；７、２２、３７、５２、６７、８２および９８；ならびに８、２３、３８、５３、６８、８３および９９の各々のいずれか一つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：５、２０、３５、５０、６５、８０、９６、１１２、１２３、１３４、１４５、１５６、１６７、１７８、１８９、２００、２１１、２２２、２３３、２４４、２５５、２６６、２７７、２８８、２９９、３１０、３２１、３３２、３４３、３５４、３６５、３７６、３８７、３９８、４０９、４２０、４３１、４４２、４５３、４６４、４７５、４８６、４９７、５０８、５１９、５３０、５４１、５５２および５６３のいずれか一つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一性のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本明細書に記述された抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、配列番号：５、２０、３５、５０、６５、８０または９６の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：９−１５、２４−３０、３９−４５、５４−６０、６９７５、８４−９１、１００−１０７、１１６−１２２、１２７−１３３、１３８−１４４、１５０−１５５、１６０−１６６、１７１−１７７、１８２−１８８、１９３−１９９、２０４−２１０、２１５−２２１、２２７−２３２、２３７−２４３、２４８−２５４、２５９−２６５、２７１−２７６、２９１−２８７、２９２−２９８、３０３−３０９、３１４−３２０、３２５−３３１、３３７−３４２、３４７−３５３、３５８−３６４、３６９−３７５、３８０−３８６、３９１−３９７、４０２−４０８、４１３−４１９、４２４−４３０、４３５−４４１、４４６−４５２、４５７−４６３、４６８−４７４、４７９−４８５、４９０−４９６、５０１−５０７、５１２−５１８、５２３−５２９、５３４−５４０、５４５−５５１および５５６−５６２のいずれか一つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記述された抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、配列番号：９−１５、２４−３０、３９−４５、５４−６０、６９７５、８４−９１および１００−１０７のいずれか１つの非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：６、７および８の各々に示されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：２１、２２および２３の各々に示されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：３６、３７および３８の各々に示されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：５１、５２および５３の各々に示されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：６６、６７および６８の各々に示されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：８１、８２および８３の各々に示されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、配列番号：９７、９８および９９の各々に示されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。
ある実施態様において、本明細書に記述されたＢＣ、ＤＥおよび／またはＦＧループアミノ酸配列(例えば、配列番号：６、２１、３６、５１、６６、８１および９７；７、２２、３７、５２、６７、８２および９８；ならびに８、２３、３８、５３、６８、８３および９９の各々)は、非１０Ｆｎ３ドメインタンパク質スキャッホルド中に移入される。例えば、１以上のループアミノ酸配列が、抗体の重鎖または軽鎖の１以上のＣＤＲループまたはそのフラグメントに交換または挿入される。ある実施態様において、１以上のアミノ酸ループ配列が交換または挿入されるタンパク質ドメインには、コンセンサスＦｎ３ドメイン(Centocor，US)、アンキリンリピートタンパク質(Molecular Partners AG, Zurich Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd, Cambridge, MA)、１つのドメインカメリドナノボディ(Ablynx, Belgium)、リポカリン(例えば、アンチカリン；Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、アビマー(Amgen, CA)、アフィボディ(Affibody AG, Sweden)、ユビキチン(例えば、アフィリン；Scil Protein GmbH, Halle, Germany)、タンパク質エピトープ擬体(Polyphor Ltd, Allschwil, Switzerland)、ヘリカルバンドルスキャッホルド(例えば、αボディー, Complix, Belgium)、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメイン(Covagen AG, Switzerland)またはアトリマー(Anaphor, Inc., CA)などが挙げられるが、これに限定するものではない。
ある実施態様において、本明細書において提供されるポリペプチドのＮ−末端および／またはＣ−末端領域のアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号：１または２)の対応する領域のアミノ酸配列に対して削除、置換または挿入により改変され得る。１０Ｆｎ３ドメインは、一般的には、配列番号：１のアミノ酸の数１から開始する。しかしながら、アミノ酸の削除を含むドメインもまた本発明に含まれる。追加の配列を、配列番号：１または２のアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ドメインのＮ−またはＣ−末端に加えてもよい。例えば、幾つかの実施態様において、Ｎ−末端伸長は、Ｍ、ＭＧおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸配列で構成される。ある実施態様において、ＭＧ配列は、配列番号：１により規定された１０Ｆｎ３のＮ−末端に位置し得る。Ｍは、通常切断されて、Ｎ−末端でＧが残る。さらに、Ｍ、ＧまたはＭＧは、表３に示されるＮ-末端からＮ-末端伸長部のいずれかに位置づけられてもよい。
例示的な実施態様において、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２または１つのアミノ酸長を有する別のＮ-末端領域を、配列番号：１または２あるいは表３に示されるアドネクチンのＮ-末端領域に加えてもよい。別のＮ-末端領域の例には、(一文字のアミノ酸コードにより示された)Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ(配列番号：５７４)およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ(配列番号：５７５)が挙げられる。その他の連結され得る、例えばアドネクチンのコア配列のＮ−末端に連結され得る適切な別のＮ-末端領域は、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ(配列番号：５７６)、ＸｎＤＶＰＲＤＬ(配列番号：５７７)、ＸｎＶＰＲＤＬ(配列番号：５７８)、ＸｎＰＲＤＬ(配列番号：５７９)ＸｎＲＤＬ(配列番号：５８０)、ＸｎＤＬ(配列番号：５８１)またはＸｎＬを包含し、ここで、ｎ＝０、１または２つのアミノ酸であって、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである。Ｍｅｔ−Ｇｌｙ配列が１０Ｆｎ３ドメインのＮ−末端に付加される場合、Ｍは、通常切断されて、Ｎ−末端にＧが残る。ある実施態様において、別のＮ-末端領域は、アミノ酸配列ＭＡＳＴＳＧ(配列番号：５８２)を含む。
例示的な実施態様において、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２または１つのアミノ酸長を有する別のＣ-末端領域を、配列番号：１または２あるいは表３に示されるいずれかのアドネクチンのＣ-末端領域に加えてもよい。別のＣ-末端領域配列の特定の例には、例えば、ＥＩＥＫ(配列番号：５８４)、ＥＧＳＧＣ(配列番号：５８５)、ＥＩＥＫＰＣＱ(配列番号：５８６)、ＥＩＥＫＰＳＱ(配列番号：５８７)、ＥＩＥＫＰ(配列番号：５８８)、ＥＩＥＫＰＳ(配列番号：５８９)またはＥＩＥＫＰＣ(配列番号：５９０)を、含むか、主にからなるか、またはからなるポリペプチドが挙げられる。ある実施態様において、別のＣ-末端領域は、ＥＩＤＫ(配列番号：５９１)を含み、特定の実施態様において、別のＣ-末端領域は、ＥＩＤＫＰＣＱ(配列番号：５９２)またはＥＩＤＫＰＳＱ(配列番号：５９３)のいずれかである。更なる適切なＣ-末端領域は、配列番号：５９４−６１８に示される。
ある実施態様において、アドネクチンは、Ｃ-末端伸長配列に結合され、これはＥおよびＤ残基を含んでおり、かつ８〜５０、１０〜３０、１０〜２０、５〜１０および２〜４つのアミノ酸長であり得る。ある実施態様において、テイル配列には、ＥＤベースのリンカーが含まれ、この配列の中には、ＥＤのタンデムリピートを含む。例示的な実施態様において、テイル配列は、２−１０、２−７、２−５、３−１０、３−７、３−５、３、４または５のＥＤリピートを含んでいる。ある実施態様において、ＥＤベースのテイル配列は、追加のアミノ酸残基、例えば：ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳおよびＥＧＣを含んでもよい。かかる配列は、ある部分において、既知のアドネクチンテイル配列、例えばＥＩＤＫＰＳＱ(配列番号：５９３)を基にしており、ここで残基ＤおよびＫは除かれる。例示的な実施態様において、ＥＤベースのテイルは、ＥＤリピートの前にＥ、ＩまたはＥ１残基を含んでいる。
ある実施態様において、Ｎ−またはＣ-末端伸長配列は、既知のリンカー配列(例えば、表３の配列番号：６２９−６７８)を有する抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン配列と結合される。ある実施態様において、配列は、薬物動態的部分の結合を促進するよう１０Ｆｎ３ドメインのＣ-末端に位置づけられてもよい。例えば、ＧＳＧＣ(配列番号：６３８)などのシステイン含有リンカーを、Ｃ-末端に付加して、システイン残基上に部位指向性ＰＥＧ化を強めてもよい。
ある実施態様において、Ｃ-末端アミノ酸ＲＴ(すなわち、アミノ酸９４)に結合され得る別のＣ-末端部分は、アミノ酸ＰｍＸｎを含んでおり、ここでＰはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１の整数であり、ｎは０または少なくとも１の整数である。ある実施態様において、別のＣ-末端部分は、アミノ酸ＰＣを含む。ある実施態様において、別のＣ-末端部分は、アミノ酸ＰＩ、ＰＣ、ＰＩＤ、ＰＩＥ、ＰＩＤＫ(配列番号：６０５)、ＰＩＥＫ(配列番号：６０６)、ＰＩＤＫＰ(配列番号：６０７)、ＰＩＥＫＰ(配列番号：６０８)、ＰＩＤＫＰＳ(配列番号：６０９)、ＰＩＥＫＰＳ(配列番号：６１０)、ＰＩＤＫＰＣ(配列番号：６１１)、ＰＩＥＫＰＣ(配列番号：６１２)、ＰＩＤＫＰＳＱ(配列番号：６１３)、ＰＩＥＫＰＳＱ(配列番号：６１４)、ＰＩＤＫＰＣＱ(配列番号：６１５)、ＰＩＥＫＰＣＱ(配列番号：６１６)、ＰＨＨＨＨＨＨ(配列番号：６１７)およびＰＣＨＨＨＨＨＨ(配列番号：６１８)を含む。そのＣ-末端にてＰＣを有する抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンの例示は、実施例および表３に提供される。
ある実施態様において、本明細書に記述されたアドネクチンは、６Ｘのｈｉｓテイル(配列番号：６１９)を有する。
ある実施態様において、フィブロネクチンベースのスキャッホルドタンパク質は、別のＮ-末端領域配列および別のＣ-末端領域配列の双方、ならびに所望により６Ｘｈｉｓテイルを有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。
ＩＩ.抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンの生物学的特性
本明細書において提供されるものは、例えば、ＳＰＲ(Biacore)により決定される場合、１０ｎＭ、１ｎＭ、０.５ｎＭ、０.１ｎＭ以下のＫＤにて、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合するアドネクチンであり、１以上の以下の特性を示す：
１．例えば、ヒトＰＤ−１Ｆｃタンパク質およびヒトＰＤ−Ｌ１陽性細胞、例えばＬ２９８７細胞を用いて、例えばフローサイトメトリーにより決定される場合に、ヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＰＤ−１の相互作用を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
２．例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＣＤ８０(Ｂ７−１)の結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
３．例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定される場合、抗ＰＤ−Ｌ１抗体１２Ａ４(例えば、米国特許第７,９４３,７４３号に記述される)とヒトＰＤ−Ｌ１の結合を、少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；ならびに
４．混合リンパ球反応(ＭＬＲ)において細胞増殖を阻害すること。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、１ｎＭ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、かつ特性１から４の各々１つを示す。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、０.１ｎＭ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、かつ特性１から４の各々１つを示す。
本明細書において提供されるものは、本明細書に記述された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンまたはその部分(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでおり、例えばＳＰＲ(Biacore)により決定された場合に、１０ｎＭ、１ｎＭ、０.５ｎＭ、０.１ｎＭ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、かつ１以上の以下の特性を示すアドネクチンである：
１．例えば、ヒトＰＤ−１Ｆｃタンパク質およびヒトＰＤ−Ｌ１陽性細胞、例えば、Ｌ２９８７細胞を用いて、例えばフローサイトメトリーにより決定される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＰＤ−１との相互作用を、少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
２．例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定される場合、ヒトＣＤ８０(Ｂ７−１)とヒトＰＤ−Ｌ１との結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
３．例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定される場に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体１２Ａ４とヒトＰＤ−Ｌ１の結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；ならびに
４．混合リンパ球反応(ＭＬＲ)において細胞増殖を阻害すること。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、１ｎＭ未満のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合する本明細書に記述された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンまたはその部分(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでおり、かつ特性１から４の各々１つを示す。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、０.１ｎＭ未満のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合する本明細書に記述された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンまたはその部分(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでおり、かつ特性１から４の各々１つを示す。
ある実施態様において、抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、ＰＤ−Ｌ１への結合に対して、本明細書に記述された特定の抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンと競合(例えば、交差競合)する。この競合性アドネクチンは、標準的なＰＤ−Ｌ１結合アッセイにおいて本明細書に記述されたアドネクチンのＰＤ−Ｌ１への結合を拮抗阻害するそれらの能力に基づいて同定され得る。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用することができ、このアッセイにおいて、組み換えＰＤ−Ｌ１タンパク質が、プレート上で固定され、アドネクチンの１つが蛍光標識されて、標識アドネクチンの結合と競合する非標識アドネクチンの能力が評価される。
ある実施態様において、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを行い、２つの抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンが、ＰＤ−Ｌ１上のオーバーラップしているアドネクチン結合部位に結合するかどうかを決定することができる。１つのフォーマットにおいて、アドネクチン＃１を、プレート上に被覆して、その後ブロッキングして洗った。このプレートに、ＰＤ−Ｌ１単独または飽和濃度のアドネクチン＃２とプレインキュベーションしたＰＤ−Ｌ１のいずれかを加えた。適切なインキュベーション期間の後に、プレートを洗い、ポリクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えばビオチン化抗ＰＤ−Ｌ１ポリクローナル抗体でプローブして、その後ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを用いて、標準テトラメチルベンジジン発色法により検出した。このＯＤシグナルが、アドネクチン＃２とのプレインキュベーションをしたものと、あるいはしなかったものと同一であれば、その場合、２つのアドネクチンは、互いに独立して結合しており、そのアドネクチン結合部位はオーバーラップしていない。しかし、ＰＤ−Ｌ１／アドネクチン＃２の混合物を施与したウェルについてのＯＤシグナルがＰＤ−Ｌ１単独を施与したウェルについてのシグナルよりも低いならば、その場合、アドネクチン＃２の結合は、アドネクチン＃１のＰＤ−Ｌ１への結合を阻害すると認められる。
あるいは、類似の実験が、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ、例えばBiocore)により行われる。アドネクチン＃１は、ＳＰＲチップ表面上に固定され、その後ＰＤ−Ｌ１単独または飽和濃度のアドネクチン＃２とプレインキュベーションされたＰＤ−Ｌ１いずれかのインジェクションを行う。ＰＤ−Ｌ１／アドネクチン＃２混合物についての結合シグナルが、ＰＤ−Ｌ１単独のシグナルと同一か、それよりも高いならば、その場合は、２つのアドネクチンが互いに独立して結合しており、それらのアドネクチン結合部位はオーバーラップしていない。しかし、ＰＤ−Ｌ１／アドネクチン＃２混合物についての結合シグナルがＰＤ−Ｌ１単独についての結合シグナルよりも低いならば、その場合は、アドネクチン＃２の結合は、ＰＤ−Ｌ１へのアドネクチン♯１の結合を阻害すると認められる。これらの実験の特徴は、飽和濃度のアドネクチン＃２の使用である。ＰＤ−Ｌ１がアドネクチン＃２で飽和しないならば、その場合、上記の結論は適用されない。類似の実験を使用して、任意の２つのＰＤ−Ｌ１結合タンパク質がオーバーラップするアドネクチン結合部位に結合するかどうかを決定することができる。
上記に例示した両方のアッセイは、順序を逆にして行ってもよい：その場合、アドネクチン＃２が固定されて、ＰＤ−Ｌ１−アドネクチン＃１がそのプレートに添加される。あるいは、アドネクチン＃１および／または＃２は、モノクローナル抗体および／または可溶性受容体−Ｆｃ融合タンパク質で置き換えられ得る。
ある実施態様において、競合は、ＨＴＲＦサンドイッチアッセイを用いて決定され得る。
ある実施態様において、競合するアドネクチンは、本明細書に記述した特定の抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンと、同一のＰＤ−Ｌ１上のアドネクチン結合部位に結合するアドネクチンである。標準マッピング技術、例えば、プロテアーゼマッピング、突然変異分析、ＨＤＸ−ＭＳ、Ｘ線結晶回折および２次元核磁気共鳴を使用して、アドネクチンが、参照アドネクチンと同一のアドネクチン結合部位またはエピトープに結合するかどうかを決定できる(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66、G. E. Morris, Ed.(1996)を参照されたい)。エピトープは、それを探すために使用した前記方法により規定される。例えば、ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１アドネクチンまたは抗体は、ＨＤＸ−ＭＳにより決定されるか、またはＸ線結晶回折により決定された通り、本明細書に記述されたＰＤ−Ｌ１アドネクチンの１つのエピトープと同じエピトープに結合する。
抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンを競合する候補は、本明細書に記述した抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンのＰＤ−Ｌ１への結合を、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％阻害でき、および／またはそれらの結合が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％まで、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンにより阻害される。競合％は、上記した方法を用いて決定され得る。
本明細書において提供されるものは、例えば、ＳＰＲ(Biacore)により決定された場合、１０ｎＭ、１ｎＭ、０.５ｎＭ、０.１ｎＭ以下のＫＤ値にて、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合するアドネクチンであり、１以上の以下の特性を示す：
１．例えば、フローサイトメトリーにより、例えば、ヒトＰＤ−１Ｆｃタンパク質およびヒトＰＤ−Ｌ１陽性細胞、例えばＬ２９８７細胞を用いて決定される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＰＤ−１の相互作用を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
２．例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定された場合、ヒトＣＤ８０(Ｂ７−１)とヒトＰＤ−Ｌ１との結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
３．例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定された場合、抗ＰＤ−Ｌ１抗体１２Ａ４とヒトＰＤ−Ｌ１との結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
４．混合型リンパ球反応(ＭＬＲ)における細胞増殖を阻害すること；ならびに
５．ヒトＰＤ−Ｌ１への結合に対して、本明細書において記述された抗ＰＤ−Ｌ１抗体と競合すること。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、１ｎＭ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、特性１から５の各々を示す。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、０.１ｎＭまたは０.１ｎＭ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、特性１から５の各々を示す。
本明細書において提供されるものは、例えば、ＳＰＲ(Biacore)により決定された場合、１０ｎＭ、１ｎＭ、０.５ｎＭ、０.１ｎＭ以下のＫＤ値にてヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、本明細書に記述された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンまたはその部分(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでおり、１以上の以下の特性を示すアドネクチンである：
１．例えば、フローサイトメトリーにより、例えば、ヒトＰＤ−１Ｆｃタンパク質およびヒトＰＤ−Ｌ１陽性細胞、例えばＬ２９８７細胞を用いて決定される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＰＤ−１の相互作用を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
２．例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定される場合、ヒトＣＤ８０(Ｂ７−１)とヒトＰＤ−Ｌ１との結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
３．例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＳＰＲ(Biacore)により決定される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１への抗ＰＤ−Ｌ１抗体１２Ａ４の結合を少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％以上阻害すること；
４．混合型リンパ球反応(ＭＬＲ)において細胞増殖を阻害すること；ならびに
５．ヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合に対して、本明細書において記述された抗ＰＤ−Ｌ１抗体と競合すること。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、本明細書に記述された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンまたはその部分(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでおり、１ｎＭ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、かつ特性１から５の各々を示す。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、０.１ｎＭ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合する本明細書に記述された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンまたはその部分(例えば、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ)と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでおり、かつ特性１から５の各１つを示す。
ＩＩＩ.薬物動態部位を含んでいる融合物
ある実施態様において、抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、例えば、診断用イメージングに使用される場合に、短い半減期を有するのが望ましい。
あるいは、例えば、治療目的のために、本明細書に記述された抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、さらに薬物動態(ＰＫ)部位を含む。改良された薬物動態は、認知される治療の必要性に従って評価され得る。タンパク質を投薬後の血清中にて利用できる状態に維持される時間を延ばすことにより、バイオアベイラビリティーを増加させること、および／または投薬間の時間間隔を延長することが望ましい。幾つかの例において、経時的なタンパク質の血清濃度の連続性を改善することが望まれる(例えば、投与直後および次の投与の直前のタンパク質の血清濃度の相違を少なくする)。抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、哺乳類(例えば、マウス、ラットまたはヒト)における前記ポリペプチドのクリアランス速度を、改変されていない抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンと比べて、２倍以上、３倍以上、４倍以上または５倍以上低下させる部分に結合され得る。改善された薬物動態の別の指標は、血中半減期に関するものであり、これは、α期とβ期とに分けられることが多い。いずれかの、または双方の期が、適切な基を加えることにより、有意に改善され得る。例えば、ＰＫ部位は、前記ポリペプチドの血清半減期を、Ｆｎ３ドメインのみと比べて、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、４００、６００、８００、１０００％以上増加し得る。
タンパク質の血液からのクリアランスを減速させる部位、本明細書においては「ＰＫ部位」と称されるが、この部位としては、ポリオキシアルキレン部位(例えば、ポリエチレングリコール)、糖(例えば、シアル酸)、および耐容性良好なタンパク質部位(例えば、Ｆｃおよびフラグメントおよびそれらのバリアント、トランスフェリンまたは血清アルブミン)が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、米国出願第２００７／００４８２８２号に記載のように、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント(一部)もしくはバリアントに融合されていてもよく、または本明細書に記述したように、アドネクチンに結合する１つ以上の血清アルブミンと融合されていてもよい。
本発明に用いることのできる他のＰＫ部位は、Kontermann et al.，(Current Opinion in Biotechnology 2011；22:868-76)に記述されるものを含み、引用により本明細書に援用される。かかるＰＫ部位としては、これらに限定はされないが、ヒト血清アルブミン融合体、ヒト血清アルブミンコンジュゲート、ヒト血清アルブミン結合体(例えば、アドネクチンＰＫＥ、ＡｌｂｕｄＡｂ、ＡＢＤ)、ＸＴＥＮ融合体、ＰＡＳ融合体(すなわち、プロリン、アラニン、およびセリンの３つのアミノ酸に基づく組み換えＰＥＧ模倣体)、炭水化物コンジュゲート(例えば、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ))、糖鎖付加体、ポリシアル酸コンジュゲートおよび脂肪酸コンジュゲートが挙げられる。
従って、ある実施態様において、本発明は、ポリマー性の糖であるＰＫ部位と融合した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを提供する。ある実施態様において、ＰＫ部位は、ポリエチレングリコール部分またはＦｃ領域である。ある実施態様において、ＰＫ部位は、血清アルブミン結合タンパク質、例えば、米国番号第２００７／０１７８０８２号および第２００７／０２６９４２２号に記載されたものであり得る。ある実施態様において、ＰＫ部位は、ヒト血清アルブミンである。ある実施態様において、ＰＫ部位はトランスフェリンである。
ある実施態様において、ＰＫ部位は、ポリペプチドリンカーを介して抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンに結合される。ポリペプチドリンカーの例示には、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３または１−２のアミノ酸を有するポリペプチドを含み得る。Ｆｎ３ドメインを連結するための適切なリンカーは、別々のドメインを標的分子への高親和性結合を許容する三次元構造の形成を互いに独立して保持できるものである。適切なリンカーの特定の例には、グリシン−セリンをベースとしたリンカー、グリシン−プロリンをベースとしたリンカー、プロリン−アラニンをベースとしたリンカー、ならびに本明細書に記述したその他のリンカーが挙げられる。ある実施態様において、リンカーは、グリシン−プロリンをベースとしたリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびプロリン残基を含んでおり、３〜３０、１０〜３０および３〜２０個のアミノ酸長であってもよい。前記リンカーの例は、ＧＰＧ、ＧＰＧＰＧＰＧ(配列番号：６７２)およびＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧ(配列番号：６７３)である。ある実施態様において、リンカーは、プロリン−アラニンをベースとしたリンカーである。これらのリンカーは、プロリンおよびアラニン残基を含んでおり、３〜３０、１０〜３０、３〜２０および６〜１８個のアミノ酸長であってもよい。かかるリンカーの例には、ＰＡＰＡＰＡ(配列番号：６７４)、ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ(配列番号：６７５)およびＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ(配列番号：６７６)が挙げられる。ある実施態様において、前記リンカーは、グリシン−セリンをベースとしたリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびセリン残基を含んでおり、８〜５０、１０〜３０および１０〜２０個のアミノ酸長であってもよい。前記リンカーの例には、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ((ＧＳ)５；配列番号：６６２)、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ((ＧＳ)６；配列番号：６６３)、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ((ＧＳ)１０；配列番号：６７７)、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ((Ｇ４Ｓ)４；配列番号：６７８)、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ((Ｇ４Ｓ)５；配列番号：６７０)およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ(配列番号：６７１)が挙げられる。例示的な実施態様において、前記リンカーは任意のＡｓｐ−Ｌｙｓ(ＤＫ)対を含有しない。適切なリンカーのリストは、表３に示される。
至適リンカー長およびアミノ酸組成物は、本明細書において提供される技術を考慮して、通常の実験により決定され得る。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、例えば、血中または標的組織中でプロテアーゼにより開裂できるプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介して抗−ＨＳＡアドネクチンに連結される。前記実施態様を、良好な送達または治療特性または高い製造効率のために抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを放出するために使用できる。
追加のリンカーまたはスペーサーは、Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーとの間のＦｎ３ドメインのＮ-末端またはＣ-末端にて導入されてもよい。
ポリエチレングリコール
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。ＰＥＧは、周知の水溶性ポリマーであり、市販されているか、または当技術分野において周知の方法(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York,Vol.3, pages 138-161)に従ってエチレングリコールの開環重合によって製造されうる。用語「ＰＥＧ」は、大きさ、またはＰＥＧの末端修飾に関わらず、あらゆるポリエチレングリコール分子を広く含むように用いられ、式：Ｘ−Ｏ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨによって示され得、ここでｎは２０から２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えばＣ１−４アルキルである。ＰＥＧは、当該分子の化学合成により生じるか；または当該分子の一部を最適な距離に保つためのスペーサーとして働く、結合反応に必要なさらなる化学基を含みうる。さらに、このようなＰＥＧは、互いに結合された１つ以上のＰＥＧ側鎖から成りうる。１つ以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多分岐または分岐型ＰＥＧと称されうる。分岐型ＰＥＧは、例えば、欧州公開出願第４７３０８４A号、および米国特許第５,９３２,４６２号に記述される。
１つ以上のＰＥＧ分子は、タンパク質の異なる部位に結合されていてもよく、このような結合はアミン、チオールまたは他の適切な反応基との反応によって達成されうる。アミン部位は、例えば、ポリペプチドのＮ-末端に存在する第１級アミン、またはリシンまたなアルギニンなどのアミノ酸に存在するアミン基でありうる。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ部位は、以下から成る群から選択されるポリペプチド上の部位に結合される：ａ)Ｎ-末端；ｂ)Ｎ-末端と、最もＮ-末端側のβストランドまたはβ様ストランドの間；ｃ)標的結合部位の反対側のポリペプチド面に位置するループ；ｄ)Ｃ-末端と、最もＣ-末端側にあるβストランドまたはβ様ストランドの間；およびｅ)Ｃ-末端。
ＰＥＧ化は、部位特異的なＰＥＧ化によって達成され得、ここでＰＥＧ化が選択的に生じる部位を創出するために、適切な反応基が当該タンパク質に導入される。いくつかの実施態様において、当該タンパク質は目的の部位にシステイン残基を導入するように改変され、これによってシステイン上での部位特異的なＰＥＧ化が可能になる。変異は、システイン残基を生じるようにタンパク質コード配列に導入されうる。これは、例えば、１つ以上のアミノ酸残基をシステインに変異させることによって達成されうる。システイン残基に変異されるのに好ましいアミノ酸としては、セリン、スレオニン、アラニンおよび他の親水性残基が挙げられる。好ましくは、システインに変異される残基は、表面に露出された残基である。一次配列またはタンパク質に基づき、残基の表面への到達性を予測するためのアルゴリズムは当技術分野において周知である。あるいは、結合性ポリペプチドの設計および進化の基盤となる骨格の結晶構造が解明され(Himanen et al., Nature 2001；414：933-8を参照されたい)、そのため表面に露出している残基が特定されたことから考えれば、表面の残基は結合性ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって予測されうる。システイン残基のＰＥＧ化は、例えばＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド、またはＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドを用いて実行されうる。ある実施態様において、ＰＥＧは、Ｃ-末端のシステイン、例えば抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンに付加されたシステインに、本明細書においてさらに説明されるような「ＰＣ」伸長の形態にて結合される。
ＰＥＧは一般に、ポリペプチドの目的の部位に結合させるのに適切な、適当な活性基によって活性化される。ＰＥＧ化方法は当技術分野において周知であり、さらに以下において記述される：Zalipsky,S., et al., 「Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides」 in Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York(1992) およびZalipsky(1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182。
ＰＥＧは分子量におけるばらつきが大きくてもよく、分岐または直鎖状であってもよい。一般に、ＰＥＧの重量平均分子量は約１００ダルトンから約１５０,０００ダルトンである。ＰＥＧの重量平均分子量の例としては、約５,０００ダルトン、約１０,０００ダルトン、約２０,０００ダルトン、約４０,０００ダルトン、約６０,０００ダルトンおよび約８０,０００ダルトンが挙げられる。ある実施態様において、ＰＥＧの分子量は約４０,０００ダルトンである。前記のいずれかの総分子量を有する分岐型ＰＥＧもまた用いられうる。ある実施態様において、ＰＥＧは２つの分岐を有する。ある実施態様において、ＰＥＧは４つの分岐を有する。ある実施態様において、ＰＥＧは、２つのアドネクチンがコンジュゲートされているビス−ＰＥＧ(NOF Corporation, DE-200MA)である(例えば、実施例１および表５のＡＴＩ−１３４１を参照)。
当技術分野において周知の通常の分離および精製技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)およびイオン交換クロマトグラフィーなどを使用して、ＰＥＧ化抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを精製することができる。生成物はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いても分離されうる。分離し得る生成物としては、モノ−、ジ−、トリ−、ポリ−および非-ペグ化アドネクチン、並びに遊離のＰＥＧが挙げられる。組成物中のモノ−ＰＥＧの割合を増加させるために、モノ−ＰＥＧ化コンジュゲートの割合は、溶出ピーク周辺の広範な画分を回収することによって制御されうる。約９０％のモノ−ＰＥＧ化コンジュゲートは、収率および活性の良好なバランスを示す。
ある実施態様において、ＰＥＧ化抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、好ましくは、非改変抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンと関連のある生物学的活性を少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％保持する。ある実施態様において、生物学的活性とは、ＫＤ、ｋｏｎまたはｋｏｆｆにより評価される場合のＰＤ−Ｌ１に結合するその能力をいう。ある実施態様において、ＰＥＧ化抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、非ＰＥＧ化抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンに比して、ＰＤ−Ｌ１への結合の増加を示す。
イムノグロブリンＦｃドメイン(およびフラグメント)
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、イムノグロブリン Ｆｃドメインまたはそのフラグメントまたはバリアントと融合される。本明細書中において使用される、「機能的Ｆｃ領域」とは、ＦｃＲｎに結合する能力を保持するＦｃドメインまたはそのフラグメントである。ある実施態様において、機能的Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎに結合するが、エフェクター機能を持たない。Ｆｃ領域またはそのフラグメントがＦｃＲｎに結合する能力は、当業者には既知の標準的な結合アッセイにより決定され得る。ある実施態様において、Ｆｃ領域またはそのフラグメントは、ＦｃＲｎに結合し、ネイティブなＦｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を有する。代表的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面受容体の下方調節(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)などが挙げられる。前記エフェクター機能は、一般的には、Ｆｃ領域と、結合ドメイン(例えば、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン)と組み合わせられることが必要であり、そのような抗体のエフェクター機能を評価するためには当業者には既知の様々なアッセイを用いて評価され得る。
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に存在するＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変のためにネイティブ配列Ｆｃ領域の配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親のポリペプチドのＦｃ領域内において少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５つのアミノ酸置換を有する。本明細書中のバリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と、好ましくは少なくとも約８０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する。
実施形態の例示において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１サブクラスから得られるが、他のサブクラス(例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４)を使用することもできる。下記に示した配列は、ヒトＩｇＧ１イムノグロブリンＦｃドメインの配列である：
Figure 2020048567
コアヒンジ配列は下線が引かれており、ＣＨ２およびＣＨ３領域は通常の文字である。Ｃ-末端リジンは適宜選択的であることは理解されよう。この配列のアロタイプおよび突然変異体を使用してもよい。当分野において知られているように、突然変異体は、Ｆｃの多様な特性、例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期を調節するために設計され得る。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン融合体に使用されるＦｃ領域は、ＣＨ１領域を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン融合体に使用されるＦｃ領域は、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン融合体に使用されるＦｃ領域は、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域(例えば、配列番号：６２０に示される)を含む。
ある実施態様において、「ヒンジ」領域は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域の配列番号：６２０(ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ；配列番号：６２１)のコアヒンジ残基スパン位置１−１６を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン−Ｆｃ融合体は、一部にヒンジ領域内の配列番号：６２０の位置６および９にてシステイン残基のために多重結合構造(例えば、ダイマー)を採っている。他の適切な代表的なヒンジ領域は、配列番号：６２２〜６２６に示される。
アドネクチン
ある実施態様において、ＰＫ部位とは、例えば、ＵＳ２０１２/００９４９０９に記述されるような血清タンパク質(例えば、人血清アルブミン)に対して特異的な別のアドネクチンであり、この全ての内容を出典明示により本明細書に全て組み込まれる。本明細書において記述されるアドネクチンと共に使用され得る他のＰＫ部位は、上掲したKontermann et al.(Current Opinion in Biotechmical 2011；22:868-76)に記述されている。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、例えば抗-ＨＳＡアドネクチンに、ポリマー性リンカーを介して直接的または間接的に連結されてもよい。ポリマー性リンカーを使用して、融合体の各成分間の距離を至適に変更して、１以上の以下の特性を有するタンパク質融合体を作成できる：
１)目的とするタンパク質と結合する場合に、１以上のタンパク質ドメインの結合に関する立体障害の低下または増加、２)タンパク質の安定性または可溶性の増加、３)タンパク質凝集の低下、および４)タンパク質の全体的な結合力または親和性の増加。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、ポリマー性糖などの生体適合性ポリマーを介して、例えば、抗-ＨＳＡアドネクチンに結合される。ポリマー性糖は、血液または標的組織中で酵素により開裂され得る酵素開裂部位を包含する。かかる実施態様は、良好な送達または治療特性または高効率の製造のために、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを放出するために使用され得る。
ＩＶ．核酸−タンパク質融合技術
一局面において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１を結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むアドネクチンを提供する。特異的な結合特性を有するＦｎ３ドメインを迅速に製造かつ試験するための方法の一つは、Adnexus(Bristol−Myers Squibb R&D Company)による核酸−タンパク質融合技術である。本開示は、「プロフュージョン（PROfusion)」と呼ばれる核酸−タンパク質融合体(ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合体)を用いるインビトロ発現およびターゲティング技術を利用して、タンパク質との結合に重要な新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定する。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質を、そのコードしている遺伝子情報を共有結合させる技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベースのスキャッホルドタンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な記述については、Szostak et al., 米国特許番号第6,258,558号、第6,261,804号、第6,214,553号、第6,281,344号、第6,207,446号、第6,518,018号および第6,818,418号;Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997;94:12297-12302;およびKurz et al., Molecules, 2000;5:1259-64を参照されたい。これらの全ての文献は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
Ｖ．ベクターおよびポリヌクレオチド
本開示に含まれるものは、本明細書に記述したタンパク質のいずれかをコードしている核酸配列である。当業者には認識されるように、第３番目の位置の縮重のため、殆どの個々のアミノ酸は、コードしているヌクレオチド配列において１以上のトリプレットコドンにより表される。さらに、マイナーな塩基対の変更は、コードされたアミノ酸配列中の保存的置換に至り得るが、その遺伝子生成物の生物学的活性を実質的に変えるとは考えられない。それ故に、本明細書に記述したタンパク質をコードしている核酸配列は、配列中でわずかに改変されてもよいが、その個々の遺伝子生成物を依然としてコードしているものである。本明細書に記述された抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンをコードしている特定の核酸およびその融合物の例には、配列番号：１６−１９、３１−３４、４６−４９、６１−６４、７６−７９、９２−９５および１０８−１１１に示される配列を有する核酸が挙げられる。
意図されるものは、配列番号：１６−１９、３１−３４、４６−４９、６１−６４、７６−７９、９２−９５および１０８−１１１と、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、かつＰＤ−Ｌ１に結合するタンパク質をコードしている核酸配列である。ある実施態様において、ヌクレオチド置換は、得られる翻訳後のアミノ酸配列が変化しないように導入される。
本明細書に記述された様々なタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成されてもよい。コドンの使用は、細胞内での発現を改善できるように選択され得る。そのようなコドンの使用は、選択される細胞のタイプに依存する。特殊なコドンの使用パターンは、Ｅ.ｃoliおよび他の細菌、ならびに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞について開発されてきた。例えば：Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442(Jan. 21, 2003);Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105(October 2002);Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449(October 2001);Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538(September 1996)；およびSharp et al., Yeast, 7(7):657-678(October 1991)を参照されたい。
核酸操作のための一般的な技術は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)またはAusubel, F. et al., Current Protocol in Molecular biology, Green Publishing and Wiley−Interscience, New York(1987)および定期改定版に記述されており、これらは出典明示により本明細書に組み込まれる。一般的には、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳類、ウイルスまたは昆虫遺伝子から得られる適切な転写または翻訳調節エレメントに操作可能なように結合される。かかる調節エレメントには、転写プロモーター、転写を制御するための選択的なオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードしている配列および転写および翻訳の停止を制御する配列が含まれる。通常、複製起点により付与される宿主における複製能および形質転換体の認識を促進する選択遺伝子を更に組み込んでもよい。
本明細書に記述されたタンパク質は、直接のみならず、異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドとして組み換え的に産生されてもよく、該異種ポリペプチドは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ-末端に特異的な開裂部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであるのが好ましい。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により、認識かつプロセシング(即ち、シグナルペプチダーゼにより開裂される)されるものである。哺乳類において、ポリペプチド産生のためのＮ-末端リーダー配列の例示は下記の通り：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ(配列番号：５８３)であり、これは、発現後に宿主細胞により除去される。
ネイティブシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞に対しては、該シグナル配列は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペニシラーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列により置換される。
酵母分泌のために、ネイティブシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、ファクターリーダー(例えば、SaccharomycesおよびKluyveromyces α−ファクターリーダー)または酸ホスファターゼリーダー、Ｃ. アルビカンスの糖アミラーゼリーダーまたは米国特許第5,631,144号に記述されたシグナル配列により置換されてもよい。哺乳類の細胞発現においては、哺乳類シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えばヘルペスシンプレックスｇＤシグナルを利用できる。該前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレーム内でタンパク質をコードするＤＮＡと結合され得る。
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方は、該ベクターが１種以上の選択した宿主細胞で複製することができる核酸配列を含有する。一般的には、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主クロモソーマルＤＮＡをベクターが独立して複製ことを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を包含する。かかる配列は、種々の細菌、酵母およびウイルス類についても良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点は、殆どのグラム陰性細菌に対して適切であり、２ミクロンのプラスミド起源は、酵母に適切であり、様々なウイルス起源(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ)は哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的には、複製起点の成分は、哺乳類発現ベクター(ＳＶ４０起源が通常使用されるが、単に早期プロモーターを含有することだけが理由ではない)には必要ではない。
発現およびクローニングベクターは、選択遺伝子を含有し得る、これは選択マーカーとも呼ばれる。典型的な選択遺伝子は、(ａ)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、(ｂ)栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または(ｃ)複合培地から利用できない必須栄養素を供給するタンパク質、例えば、ＢａｃｉｌｌｉにとってＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識されるプロモーターを含み、かつ明細書に記述したタンパク質、例えば、フィブロネクチンベースのスキャッホルドタンパク質をコードしている核酸と作動可能に連結している。原核生物宿主と使用するために適切なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよび乳糖プロモーター系、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｎプロモーターが挙げられる。しかし、その他の既知の細菌プロモーターが適切である。細菌系において使用するためのプロモーターは、明細書に記述されたタンパク質をコードしているＤＮＡに作動可能に結合されたシャイン-デカルノ(Ｓ.Ｄ.)配列を含有する。真核生物についてのプロモーター配列はよく知られている。事実上、全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から上流のおおよそ２５〜３０塩基に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始点から７０〜８０塩基上流に存在する別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、このＮは任意のヌクレオチドであってもよい。殆どの真核生物遺伝子の３'末端には、ポリＡテイルをコード配列の３'末端に付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列が存在する。これらの配列は全て、真核細胞の発現ベクターへの挿入に適当である。
酵母宿主と共に使用するための適切なプロモーター配列の例示には、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルベート脱カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸塩イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸塩イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。
哺乳類宿主細胞中のベクターからの転写は、例えば、ウイルス類のゲノム、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス２)、子ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはシミアンウイルス４０(ＳＶ４０)から得たプロモーター、ヘテロガス哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたはイムノグロブリンプロモーターから得たプロモーター、ヒートショックプロモーターから得たプロモーターにより制御され得るが、但し前記プロモーターが宿主細胞系と適合し得る場合である。
明細書に記述されたタンパク質をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、しばしばエンハンサー配列をベクターに挿入することにより上昇する。多くのエンハンサー配列は、哺乳類の遺伝子由来のものが知られている(グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン)。しかし、通常は、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例示には、複製起点(ｂｐ１００−２７０)の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマーエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについてはYaniv., Nature, 297:17-18(1982)もまた参照されたい。エンハンサーは、ベクター中にペプチドをコードしている配列に対して５'または３'位置でスプライスされていてもよいが、プロモーターの部位５'に位置するのが好ましい。
真核宿主細胞(例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞)において使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。該配列は、一般的に、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５'非翻訳領域、場合によっては３'非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、本明細書に記述されたタンパク質をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分に、ポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号およびその中に開示された発現ベクターを参照されたい。
組み換えＤＮＡは、タンパク質精製に有用であり得るいずれのタイプのタンパク質のｔａｇ配列を含んでいてもよい。タンパク質のｔａｇの例示には、ヒスチジンｔａｇ、ＦＬＡＧｔａｇ、ｍｙｃ ｔａｇ、ＨＡ ｔａｇまたはＧＳＴ ｔａｇが挙げられるが、これらに限定するものではない。細菌、真菌、酵母および哺乳類の細胞宿主に使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、クローニングベクター：A Laboratory Manual(Elsevier, New York(1985))に記載されており、この関連する開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
発現構築体は、宿主細胞に適切な方法を用いて宿主細胞中に導入されるが、当業者には明らかなことであろう。核酸を宿主細胞に導入するための様々な方法が、当分野で知られており、これにはエレクトロポーレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染(この場合、ベクターが感染性物質である)が挙げられるが、これらに限定するものではない。
適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳類細胞または細菌細胞が挙げられる。適切な細菌には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ.coliまたはBacillus spp.が含まれる。酵母類、好ましくはSaccharomyces species、例えばＳ. cerevisiaeも、ポリペプチド産生のために使用され得る。種々の哺乳類または昆虫細胞培養系を、組み換えタンパク質を発現するために用いることもできる。昆虫細胞における異種タンパク質産生のためのバキュロウイルス系は、Luckowら(Bio／Technology, 6:47(1988))により概説される。適切な哺乳類宿主細胞系の例示には、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)、ヒト胎児由来腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞系が挙げられる。精製ポリペプチドは、適切な宿主／ベクター系を培養して、その組み換えタンパク質を発現させることにより調製される。様々な用途のために、小規模の本明細書に記述された様々な前記ポリペプチドを、発現のための好ましい方法としてＥ.coliにおいて発現させる。その後、タンパク質は、培養培地または培養細胞抽出物から精製される。
ＶＩ.タンパク質産生
また、本明細書において記述されるものは、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンまたはその融合ポリペプチドを発現する細胞系である。抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを産生する細胞系の創出および単離は、当業者には既知の標準技術、例えば、本明細書に述べた技術を用いて達成され得る。
宿主細胞は、タンパク質産生のために本明細書に記述された発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために好適に改変された慣用の栄養培地中で培養される。
本発明のアドネクチンは、アドネクチンを、例えば原核細胞(例えば、Ｅ.coli)で産生することにより、脱グリコシル化形態で得ることができる。特に、本明細書に記述されたアドネクチンの脱グリコシル化形態は、インビトロで試験した場合、グリコシル化アドネクチンと同じ親和性、効力および作用機構を示す。
本発明のタンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。市販培地、例えば、ハムＦ１０(Sigma)、最小栄養培地((MEM)(Sigma)、ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)およびダルベッコ変法イーグル培地((DMEM), Sigma))は、宿主細胞を培養するのに適切である。さらに、Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44(1979)、Barites et al., Anal. Biochem., 102:255(1980)、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、第5,122,469号、第6,048,728号、第5,672,502号または米国特許第RE 30,985に記述された様々な培地は、宿主細胞のための培養培地として使用されてもよい。これらのいずれの培地も、必要な場合には、ホルモン類および／または他の成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩)、緩衝剤(例えば、ＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド類(例えば、アデノシンおよびチミジン)、抗生剤(例えば、ゲンタマイシン薬剤)、トレースエレメント(無機化合物質として規定されるマイクロモル範囲内の終濃度で通常示される)およびグルコースや同等のエネルギー源を用いて補充される。その他の必要な補足物質は、当業者には既知の適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞と共にすでに使用したものであり、当業者には明らかであろう。
本明細書に記述されたタンパク質は、無細胞翻訳系を用いても製造され得る。かかる目的のために、ポリペプチドをコードしている核酸を、ｍＲＮＡを製造するためのインビトロ転写、ならびに用いる特定の無細胞系(真核系、例えば、哺乳類または酵母無細胞翻訳系または原核生物の例えば、細菌の無細胞翻訳系細胞−不含翻訳系)におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするために、改変する必要がある。
また、本明細書に記述したタンパク質は、化学合成(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.(1984))により製造され得る。タンパク質に対する改変は、化学合成によっても提供され得る。
本発明のタンパク質は、タンパク質化学分野において一般的に既知のタンパク質についての単離／精製法により精製され得る。非制限的な例示には、抽出、再結晶、析出(例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いて)、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル透過性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後に、ポリペプチドを、当業者には既知の様々な方法により(例えば濾過および透析によるが、これに限定しない)、異なる緩衝液への交換および／また濃縮を行ってもよい。
精製ポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％の純度または好ましくは少なくとも９５％の純度、および最も好ましくは少なくとも９８％の純度である。厳密な純度の数値に関わらず、当該ポリペプチドは、医薬生成物として使用するために十分な純度である。
ハイスループットタンパク質産生(ＨＴＰＰ)
選択したバインダーが、ＨＩＳ６ ｔａｇのＰＥＴ９ｄベクター上流にクローニングされ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐｌｙｓＳ細胞中で形質転換され、２４ウェル形態の５０μg／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ培地(５ｍｌ)に植菌されて、３７℃で終夜培養された。新しく５ｍｌのＬＢ培養培地(５０μg／ｍＬ カナマイシン)を、終夜培養物から２００μｌを吸引採取して、適切なウェルにそれを分配することにより、誘導性発現用として調製した。培養物を、３７℃にてＡ６０００.６−０.９となるまで増殖させた。１ｍＭ イソプロピル−β−チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)を用いて誘導した後に、この培養物を、３０℃で６時間発現させて、４℃で１０分間、２７５０ｇ遠心分離により収集した。
細胞ペレット(２４ウェル形態中の)を、４５０μlの分解緩衝液[５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、１ｘ Complete(登録商標)プロテアーゼ阻害剤カクテル−EDTA不含(Roche)、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ イミダゾール、１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、３０μg／ｍｌ ＤＮＡｓｅ、２μg／ｍｌアプロトニン、ｐＨ８.０]に再懸濁することにより溶解して、室温で１〜３時間振盪した。溶解物を取り出して、１.２ ｍｌのキャッチプレートを取り付けた９６-ウェル(Whatman GF／D Unifilter)に再度移し入れて(re-racked)、陽圧により濾過した。取り出した溶解物を、平衡化緩衝液(５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８.０)を用いて平衡化した９６ウェルニッケルまたはコバルトキレート化プレートに移して、５分間インキュベートした。未結合物質を陽圧により除去した。樹脂を、洗浄緩衝液＃１(５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８.０)の０.３ ml／ウェルを用いて２回洗った。各洗液を、陽圧により除去した。溶出する前に、各ウェルを、５０μl 溶出緩衝液(ＰＢＳ＋２０ｍＭ ＥＤＴＡ)で洗い、５分間インキュベートして、この洗液を陽圧により除去した。更なる溶出緩衝液(１００μl)を各ウェルに加えることによりタンパク質を溶出した。室温で３０分インキュベーションした後に、プレートを、５分間２００ｇで遠心分離して、溶出の前に溶出キャッチプレートの底に加えた０.５Ｍ ＭｇＣｌ２(５μｌ)を含有する９６ウェルのキャッチプレートに集めたタンパク質を溶出した。溶出したタンパク質を、タンパク質標準として野生型１０Ｆｎ３ドメインを用いた全タンパク質アッセイにより定量した。
不溶性フィブロネクチンベースのスキャッホルドタンパク質バインダーのミッドスケール発現および精製
不溶性クローンの発現のために、このクローン後続してＨＩＳ６ｔａｇを、ｐＥＴ９ｄ(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクター中にクローニングし、Ｅ.ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４細胞内で発現させた。植菌培養物(１つの播種したコロニーから作成)(２０ｍｌ)を使用して、５０μg／ｍｌカルベニシリンおよび３４μg／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地(１リットル)に植菌した。培養物を、Ａ６０００.６−１.０となるまで３７℃で増殖させた。１ｍＭ イソプロピル−β−チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)を用いた誘導後に、培養物を、４時間３０℃で増殖させて、４℃で３０分間＞１０,０００ｇにて遠心分離により収集した。細胞ペレットを、−８０℃で凍結させた。細胞ペレットを、氷上でULTRA−TURRAX(登録商標)ホモジナイザー(IKA works)を用いて、２５ｍｌの溶解緩衝液(２０ｍＭ ａＨ２Ｐ０４, ０.５Ｍ ＮａＣｌ, １ｘ完全プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡ不含(Roche)、ＩｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７.４)に再懸濁させた。細胞の溶解を、Model M−l 10S MICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を用いて、高圧ホモジナイゼーション(＞１８,０００psi)により達成した。不溶性画分を、４℃で３０分間、２３,３００にて遠心分離により分離した。溶解物の遠心分離から回収した不溶性ペレットを、２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ７.４)を用いて洗った。ペレットを、６.０Ｍ グアニジン塩酸塩/２０ｍＭリン酸ナトリウム塩／５００Ｍ ＮａＣｌ(ｐＨ７.４)中に再溶解して、ソニケーションの後に３７℃で１〜２時間インキュベーションした。再溶解したペレットを、０.４５μｍに濾過して、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／６.０Ｍ グアニジン(ｐＨ７.４緩衝液)を用いて平衡化したHistrapカラムに重層した。重層後に、カラムを、更なる２５ＣＶのために、同じ緩衝液で洗った。結合したタンパク質を、５０ｍＭ イミダゾール/２０ｍＭリン酸ナトリウム塩／５００ｍＭ ＮａＣｌ／６.０Ｍのグアニジン−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)で溶出した。精製タンパク質を、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ４.５)の透析により、再度フォールディングさせた。
可溶性フィブロネクチンベースのスキャッホルドタンパク質バインダーのミッドスケール発現と精製
可溶性クローンの発現のために、このクロ−ンに後続してＨＩＳ６ｔａｇを、ｐＥＴ９ｄ(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクターにクローニングして、Ｅ.ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４細胞内で発現させた。植菌培養物(１つの播種したコロニーから作成)(２０ｍｌ)を用いて、５０μg／ｍｌカルベニシリンおよび３４μg／ｍｌクロラムフェニコールを含有する１リットルのＬＢ培地に植菌した。培養物を、Ａ６０００.６−１.０となるまで３７℃で増殖させた。１ｍＭ イソプロピル−β−チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)を用いた誘導後に、培養物を、４時間３０℃で増殖させて、４℃で３０分間、＞１０，０００ｇにて遠心分離により収集した。細胞ペレットを、−８０℃で凍結させた。細胞ペレットを、氷上でULTRA−TURRAX(登録商標)ホモジナイザー(IKA works)を用いて、２５ｍｌの溶解緩衝液(２０ｍＭ ＮａＨ２Ｐ０４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、ｌｘ 完全プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡ不含(Roche)、ＩｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７.４)に再懸濁させた。細胞の溶解を、Model M−l 10S MICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を用いて、高圧ホモジナイゼーション(＞１８,０００psi)により達成した。可溶性画分を、４℃で３０分間２３,３００ｇにて遠心分離により分離した。上清を、０.４５ μmフィルターを通して清澄にした。清澄化された溶解物を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ(ｐＨ７.４)で予め平衡化したHistrapカラム(GE)に重層した。次いで、カラムを、同じ緩衝液で２５のカラム体積、その後２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／２５ｍＭ イミダゾール(ｐＨ７.４)で２０カラム体積、その後２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／４０ｍＭ イミダゾール(ｐＨ７.４)で３５カラム体積にて洗った。タンパク質を、１５カラム体積の２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／５００ｍＭ イミダゾール(ｐＨ７.４)を用いて溶出して、画分を、吸光度Ａ２ＳＯに基づいて収集して、ｌＸＰＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８.５または５０ｍＭ ＮａＯＡｃ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ４.５で透析した。全ての沈殿物を、０.２２μｍで濾過することにより除去した。
ＶＩＩ．組成物
本発明はさらに、本明細書中に記述された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンまたはその融合タンパク質を含んでいる組成物、例えば、医薬組成物および放射性医薬品組成物を提供するものであり、該組成物は、主に、エンドトキシンを含まないか、または少なくとも、妥当な規制当局(例えば、ＦＤＡ)により決定されたようなエンドトキシンの許容レベル未満で含む。
本発明の組成物は、経口投与のための、ピル、錠剤、カプセル、液体または除放性錠剤；静脈内、皮下または非経口投与のための液体；または局所投与のための、ゲル、ローション、軟膏剤、クリームまたはポリマーあるいは他の徐放性放出ビヒクルの形態で存在し得る。
組成物を製造するための当分野において十分に既られた方法は、例えば、"Remington: The ScienceおよびPractice of Pharmacy"(20th ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)である。非経口投与のための組成物は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリアルキレングリコール類、例えば、ポリエチレングリコール、植物油または水素化ナフタレン類を含有し得る。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を使用して、化合物の放出を制御してもよい。ナノ粒子組成物(例えば、生分解可能なナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム)を使用して、化合物の生体分布を制御してもよい。その他の可能かつ有用な非経口送達システムには、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋込み式点滴システムおよびリポソームが包含される。組成物中の化合物の濃度は、多くのファクター、例えば、投与すべき薬剤の投薬量、投与経路および組成物の目的(例えば、予防用、治療用、診断用)に依って変化する。
許容できる担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投薬量および濃度にて受容者に非毒性であって、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム(methonium)；ベンザルコニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール)；低分子量(以下約１０残基)ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストラン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成の対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体(例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体)；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ(登録商標)またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。
本発明の前記ポリペプチドは、医薬分野で一般的に使用される医薬上許容される塩、例えば、非毒性酸付加塩または金属錯体として、所望により投与されてもよい。酸付加塩の例示には、有機酸、例えば、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アルコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸など；ポリマー酸、例えば、タンニン酸、カルボキシメチル セルロースなど；および無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などが挙げられる。金属錯体は、亜鉛、鉄などを含む。一実施例において、ポリペプチドは、熱安定性を増加させるように、酢酸ナトリウムの存在下で製剤される。
活性成分を、製造されるマイクロカプセル中に封入されてもよく、例えば液滴形成技術によるか、またはコロイド状薬剤送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル剤)またはミクロエマルジョン中で、界面ポリマー化、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタアシレート)マイクロカプセルの各々により封入されてもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)に開示されている。
徐放性製剤は調製され得る。徐放性製剤についての適切な例には、本明細書に記述されたタンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、これらのマトリクスは成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態で存在する。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド類(米国特許第3,773,919号)、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、分解不可能なエチレン−酢酸ビニル、分解可能な乳酸−グリコール酸共重合体、例えば、LUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア)およびポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー、例えばエチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸は、１００日間にわたって分子を放出できるのに対し、特定のヒドロゲルは、より短期間の間にタンパク質を放出する。本明細書に記述される封入タンパク質は、長時間体内で残る場合、それらのタンパク質が３７℃の湿度に暴露される結果として、変性または凝集して、生物学的活性を失い、免疫原性の変化を起こす可能性がある。関与するメカニズムに依り、安定化のための合理的な戦略を考えることができる。例えば、凝集メカニズムが、チオ−ジスルフィド交換による分子間のＳ−Ｓ結合形成であることが明らかである場合、安定化は、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分量の調節、適切な添加物の使用および特異的なポリマーマトリックス組成物の展開により達成し得る。
経口使用のための本発明の組成物には、非毒性の医薬的に許容し得る賦形剤と共に混合物中に活性成分(複数も含む)を含有する錠剤も含まれる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または増量剤(例えば、ショ糖およびソルビトール)、滑沢剤、流動促進剤および抗接着剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油またはタルク)であってもよい。経口使用のための組成物を、チュアブル錠剤として、硬ゼラチンカプセル剤として(ここで該活性成分は、不活性の固体希釈剤と混合される)あるいは軟ゼラチンカプセル剤として(ここで該活性成分は、水または油状媒質と共に混合される)提供されてもよい。
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、通常、無菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を通して濾過により達成され得る。この方法を用いる殺菌は、組成物が凍結乾燥される場合には、凍結乾燥および再調整の前または後のいずれかで行い得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液中で保存されてもよい。さらに、非経口組成物は、一般的には、滅菌アクセスポートを有する容器内、例えば、皮下注射針により刺すことができるストッパーを備えた点滴用バッグまたはバイアルに入れられる。
一旦医薬組成物が製剤されれば、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体または脱水または凍結乾燥粉末として滅菌バイアル内で保存され得る。かかる製剤は、即時使用形態または投与前に再調整が必要な形態(例えば、凍結乾燥物)のいずれかで貯蔵され得る。
本明細書中の組成物は、治療される特定の適応のために必要に応じて１以上の活性化合物を、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する化合物を含有してもよい。かかる分子は、意図する目的のために有効な量の組み合わせで適切に存在する。
ＶＩＩＩ．生物物理学および生物化学の特性
本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンとＰＤ−Ｌ１との結合は、平衡定数(例えば、解離ＫＤ)および速度定数(例えば、結合速度定数、ｋｏｎおよび解離速度定数、ｋｏｆｆ)により評価されうる。ｋｏｆｆが十分に小さいか、またはｋｏｎが十分に大きい場合には、大きなＫＤ値は許容されうるが、アドネクチンは、一般にＫＤが５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭまたは１００ｐＭにて、標的分子に結合する。
結合親和性についてのインビトロアッセイ
ＰＤ−Ｌ１に結合かつ競合する抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、様々なインビトロアッセイを用いて同定され得る。ある実施態様において、このアッセイは、複数の候補であるアドネクチンを同時にスクリーニングできるハイスループットアッセイである。
抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンの結合親和性を決定するためのアッセイの例示としては、溶液相方法、例えば、結合平衡除外法(KinExA)(Blake et al., JBC 1996；271:27677-85；Drake et al., Anal Biochem 2004；328:35-43)、Biacoreシステム(Uppsala, Sweden)(Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991；23:1；Morton and Myszka, Methods in Enzymology 1998；295:268)を用いた表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)および均一時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)アッセイ(Newton et al., J Biomol Screen 2008；13：674-82；Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008；6：55-68)が挙げられるが、これらに限定するものではない。
ある実施態様において、生体分子の相互作用は、表面の屈折率を最大３００ｎｍ変化させるための補助ガラス上の金薄膜上の表面における光の共鳴角の変化を検出するＳＰＲを用いたＢｉａｃｏｒｅシステムによって、リアルタイムでモニターされうる。Ｂｉａｃｏｒｅ解析によって、結合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数および結合定数が得られる。結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴システム(Biacore,Inc.)を用いて、結合および解離速度定数を評価することによって得られる。バイオセンサーチップが、標的の共有結合に対して活性化される。次いで、標的を希釈し、チップ上に注入することで、固定化された物質の応答ユニットにおいてシグナルが得られる。応答ユニット(ＲＵ)におけるシグナルは、固定化された物質の質量に比例するため、これはマトリックスにおける固定化された標的の密度の範囲を表す。結合および解離データは、１：１の二分子相互作用のための正味の発現率を解明するための網羅的解析に同時に適応され、ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＲｍａｘ(飽和時の最大応答)の最適値が得られる。結合の平衡解離定数、ＫＤはＳＰＲ測定からｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。
ある実施態様において、本明細書に記述した抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、実施例２に記述されたＳＰＲ親和性アッセイにおいて、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＫＤを示す。
当然のことながら、本明細書において上述のアッセイは例示的なものであり、タンパク質間の結合親和性を決定するための当技術分野において周知のあらゆる方法(例えば、蛍光エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、酵素結合免疫吸着アッセイ、および競合結合測定(例えば、放射免疫アッセイ))が、本明細書に記載のタンパク質標的分子の結合親和性を評価するために用いられうる。
ＩＸ．抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを用いるインビボイメージング
イメージング剤
本明細書に記述した抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、多様な診断的適用およびイメージング的適用に有用でもある。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、インビボで検出できる部位を用いて標識され、標識されたアドネクチンは、インビボイメージング剤として、例えば、全身のイメージングのために使用され得る。例えば、一実施形態において、対象におけるＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍を検出す方法は、対象に、検出可能な標識と結合された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを投与して、その後適切な時間、対象中の標識を検出することを特徴とする。
抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンのイメージング剤は、ＰＤ−Ｌ１レベルの増加に関連した疾患または疾病、例えば癌(癌のなかで腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１を選択的に過剰発現している)を診断するために使用され得る。同様に、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを使用して、対象、例えば、ＰＤ−Ｌ１レベルおよび／またはＰＤ−Ｌ１陽性細胞(例えば、腫瘍細胞)を低下させるために治療されている対象におけるＰＤ−Ｌ１レベルをモニターすることができる。抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、改変を伴うか、または伴わずに使用でき、また検出可能な部位を共有結合または非共有結合により標識されてもよい。
使用され得る検出可能な部位は放射活性物質、例えば、放射性重金属、例えば放射活性重金属、例えば、鉄キレート、ガドリニウムまたはマンガンの放射活性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムのポジトロン放射体、１８Ｆ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１２４Ｉ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、１１Ｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１１４Ｉｎ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、３２Ｃｌ、３３Ｃｌ、３４Ｃｌ、７４Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７８Ｂｒ、８９Ｚｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃまたは１５３Ｓｍを包含する。
ある実施態様において、放射活性物質は、１以上のアミノ酸残基でアドネクチンと結合されている。ある実施態様において、１以上の、例えば、２以上、３以上、４以上またはより多くの放射性核種は、標識プローブ中に存在し得る。ある実施態様において、放射性核種は、キレート剤によりアドネクチンに直接結合される(例えば、米国特許第8,808,665号を参照されたい)。ある実施態様において、放射性核種は、二官能性キレーターまたは結合(ＢＦＣ)基により、アドネクチンと結合した補欠分子族中に存在している。ある実施態様において、放射性核種キレーターおよび／またはコンジュゲート部分は、ＤＦＯ、ＤＯＴＡおよびその誘導体(ＣＢ−ＤＯ２Ａ、３ｐ−Ｃ−ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、オキソ−ＤＯ３Ａ)、ＤＢＣＯ、ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ−ＴＥ２Ｐ、ＭＭ−ＴＥ２Ａ、ＤＭ−ＴＥ２Ａ、ｄｉａｍｓａｒおよびその誘導体、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ−ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ−ＤＴＰＡ、ＣＨＸ−Ａ''−ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ(ＰＲＰ９)、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡおよび誘導体(ＤＡＴＡ)、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡベースのキレート剤ならびにその近縁アナログおよび誘導体。
ある実施態様において、放射性核種キレート化または結合(ＢＦＣ)基は、マレアミド−ＮＯＤＡＧＡまたはマレアミド−ＤＢＣＯであり、これはポリペプチドのＣ-末端付近のシステイン残基を介してポリペプチドに共有結合され得る。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、システインの付加によりそのＣ-末端で改変される。例えば、ＰｘＣｙは、アミノ酸残基ＮＹＲＴに対してＣ-末端に結合されてもよく、ここでＰはプロリンであり、Ｃはシステインであり、ｘおよびｙは整数であり、少なくとも１である整数である。そのＣ-末端にアミノ酸残基ＰＣを有する抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンの例示は、実施例に示される。マレイミド−ＮＯＤＡＧＡまたはマレイミド−ＤＢＣＯを、システインと反応させて、アドネクチン−ＮＯＤＡＧＡまたはアドネクチン−ＤＢＣＯの各々を得ることができる。
ある実施態様において、放射性核種のキレート剤はＤＦＯであり、これは例えば、無作為に表面リジンに結合され得る。
ある実施態様において、６４Ｃｕについてのキレート剤は、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＥＤＴＡ、Ｄｆ、ＤＴＰＡまたはＴＥＴＡである。キレート剤および放射性核種の適切な組合せは、Price et al., Chem Soc Rev 2014；43:260-90に広く概説されている。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、ＰＥＴトレーサー１８Ｆで標識される。１８Ｆは、１.８時間の放射性半減期を有する魅力的なＰＥＴ放射性核種であり、これは、ＰＥＴ放射性核種がアドネクチンの生物学的半減期と良好に合致する同日のイメージングツールを提供し、患者への暴露が少なくて、卓越した画像を得ることができる。ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、実施例において更に述べられるように、補欠分子族、例えば、[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン([１８Ｆ]−ＦＦＰＥＧＡ)を用いて標識されてもよい。実施例において更に示されるように、１８Ｆ−標識抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、マウスにおいてはヒトＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍およびカニクイザルにおいてはＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍を特異的および効率的に標識される。この標識方法に対する具体的な説明は、後記および実施例において提供される。
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１イメージング剤は、例えば、実施例に記述されたような６４Ｃｕで標識される抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンである。６４Ｃｕは、キレート剤、例えばＮＯＤＡＧＡと共にアドネクチンに結合され得る。実施例において更に示されるように、６４Ｃｕ−標識された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、マウスにおけるヒトＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍およびカニクイザルにおけるＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍を特異的および効果的に標識した。
本明細書に記述された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンベースのイメージング剤を合成するために、ポリペプチドを放射性核種（例えば、６４Ｃｕおよび１８Ｆ）で標識するための認識される他の技術方法を使用してもよい。例えば、US2014／0271467；Gill et al., Nature Protocols 2011；6:1718-25；Berndt et al. Nuclear Medicine and Biology 2007；34:5-15, Inkster et al., Bio有機& Medicinal Chemistry Letters 2013；23:3920-6を参照されたく、この内容は、その全体を引用することにより、本明細書に組み込まれる。
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１イメージング剤は、少量の漸増によりイメージング剤の血中ＰＫを増加させるため、イメージングのコントラストを増強させるため、あるいは抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンベースのイメージング剤の結合力を増加させるために、ＰＥＧ分子(例えば、５ＫＤａのＰＥＧ、６ＫＤａのＰＥＧ、７ＫＤａのＰＥＧ、８ＫＤａのＰＥＧ、９ＫＤａのＰＥＧまたは１０ＫＤａのＰＥＧ)を含んでいる。
投与およびイメージング
ある実施態様において、標識された抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンを使用して、ＰＤ−Ｌ１−陽性細胞または組織、例えば、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍を画像化する。例えば、標識された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、標識されたアドネクチンを目的とする組織(例えば、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍)に取り込むために十分な量で対象に投与される。その後対象は、イメージングシステム、例えばＰＥＴを使用して、使用される特定の放射性核種にとって好適な時間、画像化される。次いで、標識された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンと結合したＰＤ−Ｌ１発現細胞または組織、例えばＰＤ−Ｌ１発現腫瘍は、イメージングシステムにより検出される。
ＰＤ−Ｌ１イメージング剤を用いるＰＥＴイメージングを使用して、ＰＤ−Ｌ１を質的または定量的に検出する。ＰＤ−Ｌ１イメージング剤は、バイオマーカーとして使用されてもよく、対象中のＰＤ−Ｌ１陽性シグナルの存在または非存在が、例えば、対象が、所定の治療、例えば癌治療に応答性があるか、または対象が治療に応答しているか、または応答していないかという指標となり得る。
ある実施態様において、疾患(例えば、腫瘍)の進行または退縮は、時間または治療の関数として画像化され得る。例えば、腫瘍のサイズを、癌治療(例えば、化学治療、放射線治療)を受けている対象においてモニターされ得て、腫瘍の退縮の程度を、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンの検出に基づいてリアルタイムでモニターされ得る。
イメージング剤(例えば、１８Ｆ−アドネクチンイメージング剤、６４Ｃｕ−アドネクチンイメージング剤)の目的とする細胞または組織(例えば、腫瘍)に取り込まれる有効な量は、様々なファクター、例えば、年齢、体重、一般的な健康、性別および宿主の食事；投与時間；投与経路；用いた特定プローブの排泄速度；治療の持続時間；用いた特定組成物と組合せて、または同時に使用される他の薬剤の存在；および別のファクター、に依存し得る。
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１を発現する組織のイメージングは、標識された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを投与する前、間および後に実施される。
ある実施態様において、対象は、哺乳類、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、類人猿、サル、ラットまたはマウスである。
ある実施態様において、本明細書において記述される抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、肺、心臓、腎臓、肝臓および皮膚ならびに他の臓器の、またはＰＤ−Ｌ１を発現するこれらの臓器に関連がある腫瘍のＰＥＴイメージングに有用である。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤は、少なくとも５０％、７５％、２、３、４、５以上のコントラストを提供する。実施例は、使用された全ての抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンが、２以上のＰＥＴコントラストを提供すること、およびアドネクチンの親和性は重要ではないことを示す。
短い半減期の放射性核種(例えば、１８Ｆ)を用いるイメージング(例えば、ＰＥＴ)を使用した場合、放射性標識された抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、静脈投与されるのが好ましい。他の投与経路もまた適切であって、使用した放射性核種の半減期に依存する。
ある実施態様において、本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤は、本明細書に開示された抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤を対象に投与すること、および前記イメージング剤を検出することにより、対象におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞を検出するために使用され、この検出されたイメージング剤により、対象におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞の位置が規定される。ある実施態様において、前記イメージング剤は、ポジトロン断層法により検出される。
ある実施態様において、本明細書において記述される抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤は、本明細書に開示された抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤を対象に投与すること、およびイメージング剤を検出することにより、対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍を検出するために使用され、この検出されたイメージング剤は対象における腫瘍の位置を規定する。ある実施態様において、前記イメージング剤は、ポジトロン断層法により検出される。
ある実施態様において、本明細書において記述される抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤の画像は、前記イメージング剤を対象に投与する工程、およびポジトロン断層法による前記イメージング剤の分布を、インビボでイメージングする工程により得られる。
本明細書において開示されているものは、本明細書において記述されるＰＤ−Ｌ１を発現している組織または細胞の定量的な画像を得る方法であって、この方法は、細胞または組織と本明細書において記述される抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤とを接触させること、およびポジトロン断層法を用いて、組織発現ＰＤ−Ｌ１を検出または定量化することを特徴とする。
本明細書において開示されているものは、本明細書において記述されたＰＤ−Ｌ１発現腫瘍を検出する方法であり、画像化するのに有効な量の本明細書において記述された抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤を、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍を有する対象に投与すること、ポジトロン断層法を用いることにより、腫瘍中の放射線放射を検出すること(ここで、放射線放射は腫瘍中で検出される)を特徴とする。
本明細書において開示されているものは、対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍の存在を診断する方法であって、この方法は、下記工程を含む：
(ａ)本明細書において記述された抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤を、それを必要とする対象に投与する工程；および
(ｂ)対象の少なくとも一部分の放射線画像を得て、イメージング剤の存在または非存在を検出する工程；
ここで、バックグラウンドを超える前記イメージング剤の存在および位置は、疾患の存在および位置の指標である。
本明細書において開示されているものは、対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療剤の経過(progress)をモニターする方法であって、この方法は、下記を含む：
(ａ)最初の時点での本明細書において記述された抗ＰＤ−Ｌ１イメージング剤を、それを必要とする対象に投与して、対象の少なくとも一部分の画像を得て、腫瘍のサイズを決定する工程；
(ｂ)対象に抗腫瘍治療剤を投与する工程；
(ｃ)その後の１以上の時点で対象に、前記イメージング剤を投与して、各時点で対象の少なくとも一部分の画像を得る工程；
ここで、各時点で腫瘍の体積および位置は、疾患の経過の指標である。
ＰＥＴイメージング
一般に、ＰＥＴイメージングのために、単一の静脈内注入として約１ｍｇから２００ｍｇの範囲のアドネクチンの用量を患者に投与することが望ましいが、低容量または高容量もまた状況に応じて投与されうる。一般に、典型的な大人に対して、体表面積の平方メートルあたり約１ｍｇから１０ｍｇのタンパク質またはペプチドの範囲の用量を患者に投与することが望ましいが、低容量または高容量もまた状況に応じて投与されうる。イメージングの目的のためにヒトの患者に投与されうるタンパク質またはペプチドの用量の例としては、約１から２００ｍｇ、約１から７０ｍｇ、約１から２０ｍｇ、約１から１０ｍｇが挙げられるが、高容量または低容量もまた用いられうる。
いくつかの実施態様において、１８Ｆ−放射性標識−アドネクチンの分量は、１日に約０.００５μｇ／体重ｋｇから約５０μｇ／体重ｋｇの間、通常は０.０２μｇ／体重ｋｇから約３μｇ／体重ｋｇの間で投与される。ＰＥＴトレーサーに関連する質量は、自然同位体の形態、すなわち１８Ｆ ＰＥＴトレーサーにおいて１９Ｆのものである。当該組成物(the instant composition)の特定の分析用量としては、約０.５μｇから約１００μｇの１８Ｆ−放射性標識タンパク質が挙げられる。用量は通常は約１μｇから約５０μｇの放射性標識タンパク質である。
用量レジメンは、放射性標識されたアドネクチンを取り込む組織または細胞の鮮明なイメージを得るために最適化された検出可能な分量を提供するように調整される。特に有利であるのは、簡便な投与および用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形として製剤化することである。本明細書で用いられる単位剤形は、アドネクチンが投与される対象に対して均一な用量として適合された、物理的に個別の単位をいう。本明細書に記載の単位剤形のための仕様（Specification）は、以下によって決定および直接影響される：（ａ）放射性標識されたアドネクチンの標的部位固有の特性；（ｂ）標的とされる組織または細胞；（ｃ）用いられるイメージング技術固有の制約。
放射性標識されたアドネクチンの投与のために、用いられる用量は、疾患の種類、用いられる標的化合物、患者の年齢、健康状態および性別、疾患の程度、診察される部位などによって変化する。特に、患者の照射線量についての十分な配慮を行わなければならない。好ましくは、放射性標識(例えば、１８Ｆまたは１４Ｃ)の飽和用量が患者に投与される。例えば、放射性標識されたアドネクチンの放射線量は通常、３.７メガベクレルから３.７ギガベクレル、好ましくは、１８メガベクレルから７４０メガベクレルに及ぶ。あるいは、用量は、例えばミリキュリーによって測定されうる。いくつかの実施態様において、イメージング実験のために投与される１８Ｆイメージング剤の分量は、５から１０ｍＣｉである。別の実施態様において、有効量は約１−５ｍＣｉの範囲の放射線を生じるのに十分な化合物の分量である。
本明細書に記載の医薬組成物における活性成分の実際の用量段階は、特定の患者の細胞または組織、組成物、および投与方法において、患者に毒性がなく、放射性標識されたアドネクチンの望ましい取り込みが生じるのに有効な活性成分の分量を得るために変化しうる。当然のことながら、しかしながら、本開示の放射性標識されたアドネクチンの１日の総用量は、健全な医学的判断の範囲で、主治医または他の担当の専門家によって決定される。いずれかの特定の患者固有の有効な用量段階は、例えば、用いられる特定の組成物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活；投与時間；投与経路；用いられる特定の化合物の排出率；治療の継続時間；用いられる特定の組成物との組み合わせにおいて使用される、他の薬剤、化合物および／または物質、治療患者の年齢、性別、体重、病状、全体的な健康状態、および以前の病歴、並びに医療分野において周知の因子などの、様々な因子によって変化する。いくつかの実施態様において、ヒト患者に投与される、イメージングに必要な放射性標識されたアドネクチンの分量は、処方医によって決定され、一般に当該用量は放射性核種からの放射線量に従って変化する。
本明細書に記載の組成物は、当技術分野において周知の様々な方法の１つ以上を用いて、１つ以上の投与経路によって投与されうる。当業者によって理解されるように、投与経路および／または方法は、求められる結果に従って変化する。本明細書に記載の放射性標識されたアドネクチンの好ましい投与経路としては、例えば注射もしくは点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与が挙げられる。本明細書で用いられる用語「非経口投与」は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、例として、これらに限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および点滴が挙げられる。
あるいは、放射性標識されたアドネクチンは、局所、上皮または粘膜、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所などの投与経路によって経口(non parenteral)投与されうる。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の放射性標識されたアドネクチンは、インビボで適切に分布されるように製剤化されうる。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は多くの高親水性化合物を排除する。薬剤は、例えばリポソーム内に製剤化されることによってＢＢＢを通過しうる。リポソームを製剤化する方法としては、例えば、米国特許第４,５２２,８１１号；５,３７４,５４８号；および５,３９９,３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１つ以上の部位を含み得、そのため薬物の標的送達を向上させうる(例えば、V.V. Ranade(1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい)。標的成分の例示には、葉酸またはビオチン(例えば、U.S. Patent 5,416,016 to Low et al.を参照されたい)；マンノシド(Umezawa et al.，(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P.G. Bloeman et al.(1995) FEBS Lett. ３５７:１４０；M. Owais et al.(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤タンパク質Ａ受容体(Briscoe et al.(1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；p120(Schreier et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:9090)；K. Keinanen；M.L. Laukkanen(1994) FEBS Lett. 346:123；J.J. Killion；I.J. Fidler(1994)を参照されたい)が挙げられる。
ＰＥＴ法の例示
以下の例示的方法は、医院内で患者にＰＥＴイメージング試験を行う場合に利用されてもよい。２０Ｇ２−インチ静脈カテーテルが対側尺骨静脈に挿入される。ＰＥＴトレーサーの投与は、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン血中濃度の最大値(Ｔmax)または最小値(Ｔmin)の時点と同時に測定される。
患者をＰＥＴカメラに配置し、［１８Ｆ］−ＡＤＸ＿５４１７＿Ｅ０１(＜２０ｍＣｉ)などの、放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンのＰＥＴトレーサーのトレーサー量が、静脈カテーテルを通して投与される。未代謝のＰＥＴトレーサーである、血漿中の[１８Ｆ］−ＡＤＸ＿５４１７＿Ｅ０１の画分を解析および定量するために、動脈または静脈血液サンプルのいずれかが、ＰＥＴスキャン中に１５の適切な時間間隔において採血される。画像は最大で１２０分にわたって得られる。放射性トレーサーの注射の１０分以内およびイメージング時間の終わりに、ＰＥＴトレーサーの前に投与され得た非標識抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンの血漿濃度を決定するため、１ｍＬの血液サンプルが採血される。
画像再構成から断層画像が得られる。放射性トレーサーの分布を決定するため、関心領域(ＲＯＩ)が、肺、肝臓、心臓、腎臓、皮膚または他の臓器または組織などの再構成画像上に描かれるが、これらに限定はされない。これらの領域における放射性トレーサーの経時的な取り込みは、試験される様々な投与パラダイムにおいて、あらゆる治療介入が存在しない、または非標識抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンが存在する、時間放射能曲線(ＴＡＣ)を得るために用いられる。データは、単位容量あたりの単位時間あたりの放射能(μＣｉ／ｃｃ／注入用量のｍＣｉ)として表される。
Ｘ.抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを用いるＰＤ−Ｌ１の検出
ＰＤ−Ｌ１をインビボで検出することに加えて、抗ＰＤＬ1アドネクチン、例えば本明細書に記述されたものは、試料中の標的分子を検出するために使用され得る。この方法は、試料を本明細書に記述された抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンと接触させることを特徴とし得る、ここで前記の接触とは、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン標的コンジュゲートを形成できる条件下で実施される；および前記コンジュゲートを検出して、これにより前記試料中の前記標的を検出する。検出は、任意の当分野で認識される技術、例えば、ラジオグラフィー、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析または表面プラズモン共鳴を用いて実施され得る。この試料は、ヒトまたは他の哺乳類にから得られ得る。診断を目的として、適切な剤は、全身画像のために放射性同位体および試験サンプルのための放射性同位体、酵素、蛍光性標識および他の適切な抗体ｔａｇを包含する検出可能な標識である。
検出可能な標識は、インビトロ診断の分野において現在使用される様々なタイプのいずれかであり得る。微粒子標識は、例えば金属ゾル、例えば、コロイド状金、同位体、例えばＩ１２５またはＴｃ９９が挙げられる包含する、提示したＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳまたはＮ４型のペプチド様キレーター、発色団、例えば蛍光性マーカー、ビオチン、発光マーカー、リン光性マーカーなど、ならびに特定の基質を検出可能なマーカーに変換する酵素標識および、例えばポリメラーゼ連鎖反応による増幅後に明らかになる、ポリヌクレオチドタグが挙げられる。次いで、ビオチン化抗体は、アビジンまたはストレプトアビジン結合により検出できる。適切な酵素標識は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファタ−ゼなどを包含する。例えば、この標識は、存在または形成を測定することより検出され得るアルカリフォスファターゼであってもよい。１，２-ジオキセタン基質の変換後の化学発光、例えば、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム ３−(４−(メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２'−(５'−クロロ)トリシクロ｛３.３.１.１３，７｝デカン｝−４−イル)フェニルリン酸塩(Ｃなランタノイド類のキレート、例えば、テルビウム(ＩＩＩ)およびユーロピニウム(ＩＩＩ)は、当分野において周知であり、例えば、他の標識は、このイメージングセクション中で上記したものも包含する。この検出手段は、選択した標識により決定される。標識またはその反応生成物の出現は、裸眼により達成され得る。標識が粒子状であり、適切なベルで蓄積する場合においては、分光光度計、蛍光光度計などの機器は全て、標準的手法に従う。
ある実施態様において、コンジュゲート方法は、実質的に(または、殆ど)非免疫原性での結合に至る、そのような例は、ペプチド−(アミド、アミド−)、スルフィド(立体障害)、ジスルフィド−、ヒドラゾン−およびエーテル結合である。これらの連結は、殆ど非免疫原性であり、血清中で妥当な安定性を示す(例えば、Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13(2009) 235−244；WO2009／059278；WO95／17886)。
この成分およびアドネクチンの生物化学的特性に依って、様々な結合ストラテジーを用いることができる。この部分が５０〜５００個の間のアミノ酸の天然または組み換えポリペプチドである場合には、タンパク質コンジュゲートの合成化学を説明する参考書の中の標準的手法があり、これは当業者であれば、容易に実施され得る(例えば、Hackenberger、C. P. R.およびSchwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ４７(2008) 10030−10074を参照されたい)。一つの実施形態において、アドネクチンまたはその部分の範囲内にシステイン残基を含むマレイミド部分の反応が使用される。あるいは、アドネクチンのＣ-末端終結部へのカップリングが行われる。タンパク質のＣ-末端修飾は、記述した通り実施され得る、例えば、Sunbul, M.およびYin, J., Org. Biomol. Chem. 7(2009) 3361−3371)。この部分がペプチドまたはポリペプチドである場合に、アクチンおよびその部分は、標準的な遺伝子融合により、所望により本明細書に開示されたリンカーを用いて融合される。
一般的には、部位特異的反応および共有結合は、存在する別の官能基の反応性に対して直交型である反応性を有するアミノ酸への変換に基づく。例えば、ｒａｒｅ配列構築体中の特定のシステインは、アルデヒドへと酵素的に変換することができる(Frese. M. A.およびDierks, T., ChemBioChem. 10(2009) 425-427を参照されたい)。所定の配列構築体の中の天然アミノ酸とある酵素の特異的な酵素反応性を利用することにより、目的とするアミノ酸修飾を得ることも可能である[例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17(2004) 119-126；Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15(2008) 128-136.を参照されたい。プロテアーゼによる触媒によるＣ−Ｎ結合の形成は、Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry(2004) 389−403に記載されいる]。
部位特異的反応および共有結合は、末端アミノ酸と適切な修飾試薬との選択的反応により達成され得る。このＮ-末端システインとベンゾニトリルとの反応性を用いて(Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48(2009) 9658−9662を参照されたい)、部位特異的共有結合を達成させる。元々の化学結合は、Ｃ-末端システイン残基にも依存し得る(Taylor, E. Vogel；Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology(2009), 22(Protein Engineering), 65-96)。EP1 074 563は、正に荷電したアミノ酸の配列の並びの内に位置するシステインよりも、負に荷電したアミノ酸の配列の並びの内のシステインがより迅速に反応することに基いたコンジュゲーション法を説明する。
この部分は、合成ペプチドまたはペプチド擬体であってもよい。ポリペプチドが化学合成される場合には、直交型の化学反応基を有するアミノ酸が、かかる合成中に組み込まれる(例えば、de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. ｆ.を参照されたい)。多くの直交性官能基は、賭け(stake)であり、合成ペプチドに導入され得るので、リンカーに対するそのようなペプチドは標準的化学である。
１つの標識ポリペプチドを得るために、１:１の化学量論にてコンジュゲートは、クロマトグラフィーにより、別のコンジュゲーションの副生成物と分離される。この方法は、染色標識された結合対のメンバーおよび荷電リンカーを用いて促進され得る。この種の標識され、かつ高度に負に荷電した結合対のメンバーを用いることにより、モノコンジュゲートポリペプチドは、電荷および分子量における相違を用いて分離されるので、１以上のリンカーを担持する非標識のポリペプチドおよびポリペプチドと分離され易い。蛍光染料は、非結合成分から標識された一価のバインダーのようなこの複合体を精製するのに有用であり得る。
ＸＩ.１８Ｆ−標識抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンの合成
１８Ｆ−標識抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、最初に１８Ｆ放射性標識された補欠分子族を調製して、アドネクチンを二官能性キレーターに結合させ、次いでこれらの２つの試薬(参照、例えば図９)を組み合わせて合成される。
１８Ｆ放射性標識された補欠分子族
一局面において、本明細書において提供されるものは、水許容条件下において、選択的に進行するアジドおよびシクロオクチンの間の１,３−双極子環付加に関与する生体直交性反応において使用するための補欠分子族を含有する１８Ｆ−放射性標識された化合物である。本明細書に開示された１８Ｆ−放射性標識された補欠分子族は、１００％水に可溶性であり、前記補欠分子族を抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンに結合させるために有機相は必要でない。前記補欠分子族を抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンに結合させるために有機相を必要としないという特徴は、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンが少量の有機溶媒であっても許容できずに、変性および凝集の問題を与えるため、特に有利である。
さらに、脂肪族の補欠分子族とは異なり、１８Ｆフッ素化反応は、ＵＶを用いてモニターすることができ、本明細書において記述される１８Ｆ−放射性標識された補欠分子族は揮発性ではない。さらに、１８Ｆ−放射性標識された補欠分子族は、例えば実施例に記述したように、銅不含のクリックケミストリーを用いて、抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンに組み込んで、それにより、銅介在性のクリックケミストリーを使用した場合に、幾つかの生体製剤において観察される安定性に関する問題を回避することができる。
一局面において、本明細書において提供するものは、以下の構造：
Figure 2020048567
(式中、ｘは１〜８の整数である)
を有するアジドに共有結合されるＰＥＧ化１８Ｆ−ピリジンである。ある実施態様において、ｘは、２〜６の整数である。ある実施態様において、ｘは、３〜５の整数である。ある実施態様において、ｘは４である。ある実施態様において、１８Ｆは、Ｎ原に対してオルト位にてピリジンと結合される。ある実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分は、ピリジン環上の窒素に対して、１〜３位に存在する。ある実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分は、ピリジン環上の窒素に対して、１〜２位に存在する。ある実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ部分は、ピリジン環上の窒素に対して、１〜４位に存在する。
ある実施態様において、１８Ｆ−放射性標識された化合物は、下記構造を有する：
Figure 2020048567
(式中、ｘは１〜８の整数である)。
ある実施態様において、ｘは２〜６の整数である。ある実施態様において、ｘは３〜５の整数である。ある実施態様において、ｘは４である。
ある実施態様において、１８Ｆ−放射性標識された化合物は、下記構造を有する：
Figure 2020048567
(式中、ｘは１〜８の整数である)。
ある実施態様において、ｘは２〜６の整数である。ある実施態様において、ｘは３〜５の整数である。ある実施態様において、ｘは４である。
ある実施態様において、１８Ｆ−放射性標識された化合物は、[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(１８Ｆ−ＦＰＰＥＧＡ)であり、かつ下記構造を有する：
Figure 2020048567
ある実施態様において、１８Ｆ−放射性標識された補欠分子族は、ピリジン環上にフッ素化反応に干渉しない更なる基を含有してもよい。ある実施態様において、ピリジン環への付加物は、Ｃ１−６アルキル基、例えば、メチル、エチルおよびプロピルを包含する。
ある実施態様において、１８Ｆ−放射性標識された補欠分子族は、以下の構造を有する縮合環系である：
Figure 2020048567
(式中、“ＯＰＥＧ”は、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘであり、およびｘは１〜８の整数である)。
ある実施態様において、ｘは２〜６の整数である。ある実施態様において、ｘは３〜５の整数である。ある実施態様において、ｘは４である。
本明細書中に記述された１８Ｆ−放射性標識された補欠分子族は、本明細書の実施例において化学反応を用いて提供され得る。
本明細書において提供されるものは、以下の構造：
Figure 2020048567
(式中、ｘは１〜８の整数である)
を有するアジドに共有結合的に付加されたＰＥＧ化１８Ｆ−ピリジンを製造するための方法であって、下記工程：

(ａ)以下の構造:
Figure 2020048567
(式中、
ｘは、１〜８の整数であり、
Ｒは、ＮＯ、Ｂｒ、Ｆまたは
Figure 2020048567
であり、かつピリジン環のＮ原子に対してオルト位である)
を有する化合物ａの溶液を提供する工程；
（ｂ)１８Ｆ／１８Ｏ水、４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサンおよび弱塩基の混合物を提供する工程；
（ｃ）工程ｂ）の混合物を乾燥させて、固体を形成させる工程；ならびに
（ｄ）工程ａ）の溶液を、工程ｃ）から得た固体と反応させて、１８Ｆ−標識化合物を形成する工程、
を含む。
ある実施態様において、当該方法は、以下の構造ｂ：
Figure 2020048567
(式中、１８Ｆは、Ｎ原子に対してオルト位である)
を有する１８Ｆ−ピリジン補欠分子族を提供するものであって、かつ下記工程：

ａ)下記構造の化合物の溶液を提供する工程：
Figure 2020048567
(ここで、Ｘは、Ｎ原子に対してオルト位であり、かつＸは、ＮＯ２、Ｂｒまたは
Figure 2020048567
である)；
ｂ)１８Ｆ／１８Ｏ水、４,７,１３,１６,２１,２４−ヘキサオキサ−１,１０−ジアザビシクロ［８.８.８］ヘキサコサンおよび弱塩基、例えば、Ｋ２ＣＯ３の混合物を提供する工程；
ｃ)工程ｂ)の混合物を乾燥させて、固体を形成させる；ならびに
ｄ)工程ａ)から得た溶液を、工程ｃ)から得た固体と反応させて、１８Ｆ−標識化合物を形成する工程、
を含む。
ある実施態様において、前記方法は、下記に示したスキームＩ：
Figure 2020048567
 に従って、
以下の構造ａ：
Figure 2020048567
を有する化合物を製造する工程をさらに含む。
ある実施態様において、前記方法は、
以下の反応条件に従って：
Figure 2020048567
ｄから得たｅである
１８Ｆ−ピリジン補欠分子族［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(１８Ｆ−ＦＰＰＥＧＡ)を製造する工程を含む。
１８Ｆ−放射性標識されたＰＤ−Ｌ１アドネクチン
幾つかの局面において、本明細書において提供されるものは、以下の構造：
Figure 2020048567
を有する１８Ｆ−放射性標識されたプローブまたは薬剤である。
(式中、前記タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１アドネクチンであり、ｘは１〜８の整数である)。
ある実施態様において、ｘは、２〜６の整数である。ある実施態様において、ｘは、３〜５の整数である。ある実施態様において、ｘは４である。
ＢＦＣ
本明細書に開示された１８Ｆ−放射性標識組成物に使用される二官能性キレーターまたは結合(ＢＦＣ)基は、市販購入し得る(例えば、Sigma Aldrich；Click Chemistry Tools)か、または十分既知の化学反応に従って合成され得る。
いくつかの実施態様において、当該ＢＦＣはシクロオクチンに基づく化合物(例えば、ＤＢＣＯ、ＤＩＢＯ)、ＤＦＯ、ＤＯＴＡおよびその誘導体(ＣＢ−ＤＯ２Ａ、３ｐ−Ｃ−ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、Ｏｘｏ−ＤＯ３Ａ)、ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ−ＴＥ２Ｐ、ＭＭ−ＴＥ２Ａ、ＤＭ−ＴＥ２Ａ、ジアムサル(diamsar)およびその誘導体、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ−ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ−ＤＴＰＡ、ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ(ＰＲＰ９)、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡおよびその誘導体(ＤＡＴＡ)、Ｈ２デドパ(Ｈ２ｄｅｄｐａ)、Ｈ４オクタパ(Ｈ４ｏｃｔａｐａ)、Ｈ２アザパ(Ｈ２ａｚａｐａ)、Ｈ５デカパ(Ｈ５ｄｅｃａｐａ)、Ｈ６ホスパ(Ｈ６ｐｈｏｓｐａ)、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡ、並びにＴＲＩＴＡに基づくキレート剤、並びにそれらの近縁の類似体および誘導体から選択される。キレート剤および放射性核種の適切な組み合わせは、Price et al.,Chem Soc Rev 2014;43:260-90において広範囲にわたって記述される。
ある実施態様において、ＢＦＣは、標的タンパク質またはペプチド上のアミン、カルボキシル、カルボニルまたはチオール官能基と共有結合を形成する反応基を含むシクロオクチンである。シクロオクチン上の反応基としては、エステル、酸、ヒドロキシル基、アミノオキシ基、マレイミド、α−ハロゲンケトンおよびα−ハロゲンアセトアミドが挙げられる。
ある実施態様において、当該ＢＦＣは、ジベンゾシクロオクチン(ＤＩＢＯ)、ビアリールアザシクロオクチノン(ＢＡＲＡＣ)、ジメトキシアザシクロオクチン(ＤＩＭＡＣ)およびジベンゾシクロオクチン(ＤＢＣＯ)などのシクロオクチンである。ある実施態様において、当該シクロオクチンはＤＢＣＯである。
いくつかの実施態様において、前記シクロオクチンは、親水性のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)ｙスペーサーアームを含み、ここで、ｙは１〜８の整数である。いくつかの実施態様において、ｙは２〜６の整数である。ある実施態様において、ｙは４または５である。
ある実施態様において、当該ＢＦＣは第一級アミン(例えば、リシン残基の側鎖またはアミノシラン被覆表面)と選択的および効率的に反応する、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ−エステルまたはＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ−エステルである。ある実施態様において、前記ＢＦＣは、安定なアミド結合を形成する活性剤(例えばＥＤＣ)の存在下で、１級または２級アミンと反応しうる末端カルボン酸(−ＣＯＯＨ)を有するＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−酸である。ある実施態様において、前記ＢＦＣは活性剤(例えばＥＤＣまたはＤＤＣ)の存在下でカルボキシル基と、または安定なアミド結合を形成する活性化エステル(例えばＮＨＳエステル)と反応するＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミンである。
ある実施態様において、前記ＢＦＣは、システイン残基上の、例えばポリペプチドのＣ-末端付近のシステイン残基上の、スルフヒドリル基と反応するＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドである。
ある実施態様において、前記ポリペプチドは、システインを付加することによりポリペプチドのＣ-末端にて改変される。例えば、ＰｍＣｎが前記ポリペプチドのＣ-末端アミノ酸に結合され得て、ここで、Ｐはプロリン、Ｃはシステイン、ｍは少なくとも０である整数、およびｎは少なくとも１である整数である。かかる改変する方法は当技術分野において周知である。
ある実施態様において、１８Ｆ−放射性標識プローブまたは薬剤は以下の構造ａ：
Figure 2020048567
を有し、ここで、ＢＦＣはシステイン残基にてタンパク質(例えば、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン)に結合する。
本明細書において記述される１８Ｆ−放射性標識標的薬剤は、インビボで直接使用するのに適切な溶媒(例えば生理食塩水)において、本明細書に記載の手順に従い、生体直交性で金属フリーのクリックケミストリーを用いて製造されうる。
ＸＩＩ．治療方法
抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを用いる癌患者の免疫治療
ＰＤ−Ｌ１は、固形腫瘍のなかで主にＰＤ−１リガンド上方調節しており、それは阻害するＰＤ−１−陽性、腫瘍−浸潤性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ−細胞の各々のサイトカイン産生および細胞溶解活性を阻害することができる(Dong et al, 2002；Hino et al, 2010；Taube et al, 2012)。これらの特性により、ＰＤ−Ｌ１は、癌免疫治療についての有望な標的となる。例えば、WO2013／173223に記載したような抗ＰＤ−Ｌ１免疫治療による臨床試験では、免疫阻害剤リガンド、ＰＤ−Ｌ１のｍＡｂ遮断により、転移性ＮＳＣＬＣ、ＭＥＬ、ＲＣＣおよびＯＶに罹患している患者における耐性腫瘍の退縮および長期化した(＞２４週間)疾病安定化の双方を提供できる(広範囲の事前治療を受けた患者も含まれる)ことが示されており、この公報の全てを、出典明示により本明細書に組み込む。従って、ＰＤ−Ｌ１を標的化すること、例えば、ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを使用することは、抗腫瘍応答を誘起するのに適切である。
ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示された臨床データに基づいて、本明細書において記述されるものは、癌に罹患している対象の免疫治療のための方法であって、この方法は、本明細書において記述された治療上の有効量のＰＤ−Ｌ１アドネクチン含む組成物を、対象に投与することを特徴とする。本開示は、本明細書に記述されたＰＤ−Ｌ１アドネクチンを対象に投与することにより、対象における腫瘍細胞の成長を阻害する方法も提供する。ある実施態様において、対象はヒトである。
ＰＤ−Ｌ１を標的化することにより、癌に罹患している対象を治療するための詳細な方法が、ＷＯ２０１３／１７３２２３に記述されている。
ある実施態様において、本明細書に記述されたＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、本明細書に記述された方法に使用するために適切であり、以下の特徴の内の１以上の特徴を有する：
ヒトＰＤ−Ｌ１に対する高い親和性、つまり、Ｔ−細胞増殖を増強する、ＩＬ−２分泌(例えばＴ細胞由来のＩＬ−２分泌)を増強する、インターフェロン−γ産生の増加(例えば、Ｔ細胞由来のインターフェロン−γ産生の増加)、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との結合を阻害する、およびＴ調節細胞の抑制効果をＴ細胞のエフェクター細胞および／または樹状細胞に対して反転させる。
アドネクチン薬剤コンジュゲート(アドネクチン−ＤＣ)
本明細書に記述したアドネクチンは、システイン、例えばＣ-末端システインを介して、治療薬にコンジュゲートされて、イムノコンジュゲート、例えばアドネクチン−薬剤コンジュゲート(「アドネクチン−ＤＣ」)を形成できる。
アドネクチン−ＤＣにおいては、アドネクチンが、薬剤にコンジュゲートされ、該アドネクチン−ＤＣが、その抗原を発現する標的細胞、例えば癌細胞へと向かうための標的化剤として機能する。好ましくは、前記抗原とは、癌関連抗原、即ち癌細胞により固有に発現または過剰に発現しているものである。一旦そこから、前記薬剤は、内部の標的細胞またはその付近において放出され、治療薬として作用する。例えば癌治療において、抗体と共に使用されるような薬剤コンジュゲートの作用機構および用途に対する概説として、Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147を参照されたい。
薬剤コンジュゲートに使用するために適切な治療薬は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡ小溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡクロスリンカー、ヒストン脱アセチラーゼ阻害剤、核搬出阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および抗有糸分裂剤を包含する。アドネクチン−ＤＣにおいて、アドネクチンおよび治療薬は、好ましくは、開裂可能なリンカー、例えばペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーによりコンジュゲートされる。より好ましくは、前記リンカーは、ペプチジルリンカー、例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号：１６９)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕである。アドネクチン−ＤＣは、米国特許番号第７,０８７,６００；６,９８９,４５２；および７,１２９,２６１；ＰＣＴ公開公報ＷＯ ０２／０９６９１０；WO ０７／０３８６５８；ＷＯ０７／０５１０８１；ＷＯ０７／０５９４０４；WO ０８／０８３３１２；およびＷＯ０８／１０３６９３；米国特許公開公報２００６００２４３１７；２００６０００４０８１；および２００６０２４７２９５に記述された方法に従って製造され得る；これらの開示内容は、出典明示により本明細書に組み込まれる。リンカーそれ自体を、例えば共有結合により、例えば、前記ポリペプチドのシステイン、例えば前記ポリペプチドのＣ−末端または付近のシステイン、例えば、前記ポリペプチドのＣ-末端アミノ酸残基に結合したＰｍＣｎ部分のシステインと、マレイミドの化学的性質を用いて結合してもよい(ここで、ｍは整数、即ち少なくとも０(例えば、０、１または２)であり、ｎは整数、即ち少なくとも１(例えば、１または２)である。例えば、リンカーは、システイン、例えばアドネクチンのＣ-末端領域のシステイン、例えばアドネクチン−ＤＣ−ＰｍＣｎのＰＣ中のＣ-末端システインに共有結合され得る、ここでｍおよびｎは、少なくとも１つの独立した整数であり。例えば、リンカーは、アドネクチン−ＤＣ−ＰｍＣｎ(ここで、Ｐはプロリンであり、Ｃはシステインであり、ｍおよびｎは、少なくとも１、例えば１〜３の整数である)に連結され得る。ある実施態様において、ｍはゼロであり、その場合前記システインはプロリンの前には存在しない。システインとの連結は、マレイミドの化学的性質(例えば、Taylor, E. Vogel；Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology(2009), 22(Protein Engineering), 65−96)を用いて当分野において知られる通りに実施される。リンカーをアドネクチン上のシステインに結合するために、このリンカーは、例えば、マレイミド部分を含んでもよく、この部分は、システインと反応して、共有結合を形成する。ある実施態様において、システイン周辺のアミノ酸を至適化して、化学反応を促進させる。例えば、システインは、陽性に電荷を帯びたアミノ酸の配列の並びにより取り囲まれたシステインよりも、より迅速な反応のために、負に帯電したアミノ酸により取り囲まれてもよい(EP1 074 563)。
癌の治療のためには、薬剤は、治療される癌細胞を死に至らしめる細胞毒性薬剤が好ましい。アドネクチン−ＤＣに使用され得る細胞毒性薬剤とは、以下のタイプの化合物およびそのアナログおよび誘導体を包含する：
(ａ)エネジン類、例えば、カリケアマイシン(例えば、Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464および3466を参照されたい)およびウンシアラマイシン(例えば、Davies et al., WO 2007／038868 A2(2007)およびChowdari et al., US 8,709,431 B2(2012))；
(ｂ)ツブリシン類(例えば、Domling et al., US 7,778,814 B2(2010)；Cheng et al., US 8,394,922 B2(2013)；およびCong et al., US 2014/0227295 A1を参照されたい；
(ｃ)ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン(例えば、Boger, US 6,5458,530 B1(2003)；Sufi et al., US 8,461,117 B2(2013)；およびZhang et al., US 2012／0301490 A１(2012))を参照されたい；
(ｄ)エポシロン類(例えば、Vite et al., US 2007／0275904 A1(2007)およびUS RE42930 E(2011)を参照されたい)；
(ｅ)オーリスタチン類(例えば、Senter et al., US 6,844,869 B2(2005)およびDoronina et al., US 7,498,298 B2(2009)を参照されたい)；
(ｆ)ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)ダイマー(例えば、Howard et al., US 2013／0059800 A1(2013)；US 2013／0028919 A1(2013)；およびWO 2013／041606 A1(2013)を参照されたい)；ならびに
(ｇ)メイタンシノイド類、例えば、ＤＭ１およびＤＭ４(例えば、Chari et al., US 5,208,020(1993)およびAmphlett et al., US 7,374,762 B2(2008)を参照されたい)。
ＰＤ−Ｌ１アドネクチンにより処置される例示的な癌
本明細書に記述されたＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、一般的には免疫応答性であると考えられない難治性転移型ＮＳＣＬＣを含めた広範囲の癌の治療に使用するために適切である。本明細書に記述されたＰＤ−Ｌ１アドネクチンを使用して治療され得る癌の例には、ＭＥＬ(例えば、転移性悪性黒色腫)、ＲＣＣ、扁平上皮ＮＳＣＬＣ、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、ＣＲＣ、卵巣癌(ＯＶ)、胃癌(ＧＣ)、乳癌(ＢＣ)、膵臓癌(ＰＣ)および食道の癌腫が挙げられる。さらに、本明細書に記述されたＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、難治性または再発性悪性腫瘍を治療する際に使用するのに適切である。
ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示された抗ＰＤ−Ｌ１の免疫治療の広範囲の適用性についての適応に基づく、ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを用いて処理され得る癌種の非限定的な例示には、骨癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、腎臓癌、子宮癌、去勢抵抗性前立腺癌、大腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、卵巣の癌腫、胃腸管および乳房、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、急性骨髄性白血病を含む慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍の血管形成、脊髄の軸の腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、アスベストにより誘発される癌を含む環境誘発の癌、転移性癌、および上記癌の任意の組合せを含む。ＰＤ−Ｌ１アドネクチンはまた、転移性癌の治療に適用できる。
ＰＤ−Ｌ１アドネクチンとの組合せ治療
ある実施態様において、本明細書に記述されたＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、免疫原性剤、例えば癌性細胞の調製物、精製された腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む)、抗原提示細胞、例えば腫瘍関連抗原有する樹状細胞、および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞(He et ah, 2004)と組み合わせられ得る。非使用することができる腫瘍ワクチンの非限定的な例は、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼ、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞を含む。ＰＤ−Ｌ１遮断はまた、化学療法レジメン、放射線療法、外科処置、ホルモン喪失および血管形成阻害剤を含む標準癌処置、ならびに別の免疫治療抗体(例えば、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＬＡＧ−３ Ａｂ)と有効に組み合わせられ得る。
抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンの医薬品および使用
本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、癌に罹患している対象における内因性免疫応答を高めることができるように、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路からのシグナル伝達を阻害するための医薬品製造のために使用され得る。この開示内容は、癌に罹患している対象の免疫治療のための医薬製造のための、本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンの使用である。本開示は、本明細書に記述されたＰＤ−Ｌ１アドネクチンを用いる治療方法の実施態様の全てに対応しているあらゆる本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンの医薬用途を提供する。
また、癌に罹患している対象の治療において使用するために、本明細書において記述される抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路からのシグナル伝達を阻害することにより、癌に罹患している対象における内因性免疫応答を増強することを特徴とする。本開示内容は、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断することを特徴とする、癌に罹患している対象の免疫治療において使用するための、抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンをさらに提供するものである。これらの抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、内因性免疫応答を増強する際に、あるいは本明細書に記述した癌の全範囲の免疫治療の際に使用され得る。ある実施態様において、前記癌は、ＭＥＬ(例えば、転移性悪性ＭＥＬ)、ＲＣＣ、扁平上皮ＮＳＣＬＣ、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、ＣＲＣ、卵巣癌(ＯＶ)、胃癌(ＧＣ)、乳房癌(ＢＣ)、膵臓癌(ＰＣ)および食道の癌を包含する。
感染症
本明細書において記述されるものは、特定毒素または病原体に暴露さている患者を治療する方法でもある。例えば、ある局面において、この開示内容は、対象における感染症の治療方法を提供するものであって、本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを、対象(この対象は感染症について治療される)に投与することを特徴とする、対象における感染症の治療方法を提供するものである。
上記のとおり腫瘍へのその適用と同様に、アドネクチン介在性ＰＤ−Ｌ１の遮断は、病原体、毒素、および／または自己抗原に対する免疫応答を増強するために、単独、またはアジュバントとしてワクチンと組み合わせて、使用することができる。この治療アプローチが特に有用であり得る病原体の例は、現在、有効なワクチンが存在しない病原体、または慣用のワクチンが完全には有効でない病原体を含む。これらは、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、Ｂ、およびＣ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。ＰＤ−Ｌ１の遮断は、感染の間に変化した抗原を示す薬剤により確立された感染、例えばＨＩＶに対して特に有用である。これらの抗原上の新規エピトープは、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン投与時に外来物として認識され、こうして、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を介する負のシグナルにより抑えられない強いＴ細胞応答を誘導する。
上記方法において、ＰＤ−Ｌ１遮断は、当分野においては既知の免疫療法の他の形態、例えば、サイトカイン処置(例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＬ−２の投与)と組み合わせることができる。
ＸＩＩＩ.キットおよび製品
本明細書に記述された抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンは、本明細書に記述された治療または診断方法において使用するために、指示書と共に、予め決定された量の個装された試薬の組み合せられ得る。
例えば、ある実施態様において、本明細書に記述された障害または症状の治療または予防のために、あるいは本明細書において記述された検出方法のために有用な物品を含有する。製品は、容器およびラベルを含む。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成され得る。容器は、インビボのイメージングのために本明細書に記述された組成物を保持し得て、および滅菌アクセスポート(例えば、この容器は、静脈注射用溶液バックまたは滅菌済み注射針により刺せるストッパーを有する点滴用バッグまたはバイアルであってもよい)を有し得る。組成物中の活性化剤は、本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンである。製品は、医薬的に許容し得る緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液の生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二の容器を更に含んでもよい。それは、また更に、販売および消費者の観点から望まれる別の材料(別の緩衝剤、希釈剤、増量剤、針、シリンジおよび使用のための添付指示文書が含まれる)を包含してもよい。
ある実施態様において、キットは、本明細書に記述したような１８Ｆ標識抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンのインビボイメージング剤、例えばＰＤ−Ｌ１アドネクチン−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ−１８Ｆを形成するために必要な、１以上の試薬を含む。例えば、キットは、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン−ＰＥＧ−４−ＤＢＣＯを含む第一のバイアルおよび[１８F]ＦＰＰＥＧＡを含む第二のバイアルを含んでいてもよい。キットは、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン−ＰＥＧ−４−ＤＢＣＯを含む第一バイアル、４−ＰＥＧ−トシル−アジドを含む第二バイアル、および１８Ｆ／Ｏ１８水を含む第三バイアルを含んでいてもよい。このキットは、さらに、バイアル、溶液および所望により、ＰＤ−Ｌ１アドネクチン−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ−１８Ｆの製造のために必要な追加の試薬を含んでもよい。同様に、そのキットは、６４Ｃｕ標識された抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン、例えば本明細書に記述された試薬を形成するために必要な試薬を含んでもよい。
文献の参照
本明細書において記述された特許文献およびウェブサイトを含めた全ての文書および文献は、参照により、あたかも本明細書に記載されたものと同じ程度に全てまたは一部分を各々組み込まれる。
本発明は、以下の実施例を参照して説明されるが、これらは単る例示にすぎず、本発明を制限するものではない。本発明は、その具体的な実施態様において詳述されるが、様々な変更および修飾がその精神および範囲を逸脱せずに為され得ることは、当業者には明らかであろう。
実施例１：ＰＤ−Ｌ１結合アドネクチンの同定
抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質を用いてスクリーニングしたアドネクチンライブラリーから単離して、ライブラリー中で同定されたクローンから、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎによりアフィニティーマチュレーションを行った。これらのアドネクチンの全長配列、コア配列、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列、ならびに「ＰＣ」改変されたＣ-末端を有するバリアントは、図１および表３に示される。
例えば、高アフィニティーで、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンであるＡＤＸ＿５３２２＿Ａ０２(“A０２”)を、ＡＴＩ−９６４アドネクチンのアフィニティー成熟により得た。ＡＴＩ−９６４をコードしている遺伝子を、ループＢＣ、ＤＥまたはＦＧ中の残基がコードされ各ヌクレオチド位置で少量の非野生型ヌクレオチドを導入することにより再度多様化した。ＡＴＩ-９６４に関連のあるアドネクチン配列の得られるライブラリーを、次いでインビトロ選択に供して、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ(ｍＲＮＡディスプレイ)により、高緊縮条件下において、ヒトＰＤ−Ｌ１への結合について選択を行った。選抜が完了した後に、多く含むクローンを配列決定し、ＨＴＰＰフォーマットにて発現させて、およびＰＤ−Ｌ１へのその結合能力およびそのモノメリシティーの画分についてスクリーニングした。ＰＤ−Ｌ１に対する親和性およびロバストな生体物理特性の最良の組み合わせを有するクローンを、Ｃ-末端システインを用いて、最初にＣ-末端配列ＮＹＲＴＰＣＨ６(ＡＤＸ＿５３２２＿Ａ０２として同定された形態)および最後にＣ-末端配列ＮＹＲＴＰＣを含めるように変異させた。
同じ工程を、アフィニティーマチュレーションＡＴＩ−９６７に行い、アドネクチン ＡＤＸ＿５４１７＿Ｅ０１を得る。同様に、アフィニティーマチュレーションＡＴＩ＿１７６０＿Ｃ０２、ＡＴＩ＿１７６０＿Ｅ０１(“Ｅ０１”)およびＡＴＩ＿１７６０＿Ｆ０１を、ＡＴＩ＿１４２２＿Ｇ０５のアフィニティーマチュレーションにより得た。
別の抗ヒトＰＤ−Ｌ１アドネクチンを単離した。その配列は表３に示される。
ｈｉｓ−タグ化抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンの発現および精製
全てのＤＮＡ構築体は、Ｎ-末端のｈｉｓ ｔａｇに後続してＴＶＭＶ認識配列を含有している。上掲した抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンの発現プラスミド(ｐＥＴ−２８ＮＭベクター)を、ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞にトランスフォームした(New England Biolabs)。細胞を、１Ｌ 振盪フラスコの発現自己誘導性培地(Novagen)中で、３７℃で６時間終夜増殖させて、２０℃で、１６時間２２０ＲＰＭにて行った。細胞を、遠心分離により回収して、ＰＢＳ(ｐＨ７.２)中に再懸濁させた。細胞を機械的に溶解させて、次いで遠心分離により清澄させた。可溶性分画を、Ni−NTA Agarose resin(Qiagen)に自重重層して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋１０ｍＭ イミダゾール(ｐＨ８.０)、次いで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋４０ｍＭ イミダゾール(ｐＨ８.０)で洗い、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋４００ｍＭ イミダゾール(ｐＨ８.０)で溶出した。ニッケル溶出物を、１:２３倍モル過剰のアドネクチンにてＴＶＭＶプロテアーゼを用いてスパイクした。ＴＶＭＶ−アドネクチン溶出混合物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０, ４℃で１６時間)で透析した。ＴＶＭＶプロテアーゼと開裂したｈｉｓ ｔａｇフラグメントを分離するために、試料を、１０ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラム(GE Healthcare)に重層して、流出画分を集めた。
実施例２:ＰＤ−Ｌ１アドネクチンの生物物理学的評価
ＡＴＩ−１４２０Ｄ０５、ＡＴＩ−１４２０Ｄ０５、ＡＴ１−１４２１Ｅ０４およびＡＴＩ−１４２２Ｇ０５、ＡＴＩ＿１７６０＿Ｃ０２、ＡＴＩ＿１７６０＿Ｅ０１およびＡＴＩ＿１７６０＿Ｅ０１の結合特性を、評価した。
Figure 2020048567
ＢｉａＣｏｒｅにより決定した精製ＡＴＩ−９６４、ＡＴＩ−９６７、ＡＴＩ−９６８、ＡＤＸ_５３２２＿Ａ０２およびＡＤＸ＿５４１７＿Ｅ０１アドネクチンの、ヒトまたはカニクイサルＰＤ−Ｌ１への結合特性を、表２に示した。細胞結合を、ヒトＰＤ−Ｌ１陽性細胞Ｌ２９８７への結合を測定することにより評価した。

Figure 2020048567
結合データは、親和性成熟抗ヒトＰＤ−Ｌ１アドネクチンが、１ｎＭ以下または０.１ｎＭ以下である親和性にてヒトＰＤ−Ｌ１に結合することを示す。例示的な阻害曲線は、図１２に示される。
抗体ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、以下の更なる特性を有する：
−フローサイトメトリーにより、ヒトＰＤ−１Ｆｃの、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞Ｌ２９８７への結合の阻害を測定することにより決定されたような、かつ例えば、アドネクチンＡＴＩ−９６４、ＡＴＩ−９６５、ＡＴＩ−９６６、ＡＴＩ−９６７、ＡＴＩ−９６８、Ａ０２およびＥ０１について示されたような、ヒトＰＤ−１のヒトＰＤ−Ｌ１への結合の阻害；
−ＥＬＩＳＡにより決定されたような、ヒトＣＤ８０(Ｂ７−１)のヒトＰＤ−Ｌ１への結合の阻害。例えば、ＡＴＩ−９６４は４１ｐＭのＥＣ５０にて結合を阻害する；ＡＴＩ−９６５は２１０ｐＭのＥＣ５０にて結合を阻害する；ＡＴＩ−９６６は、２８ｐＭのＥＣ５０にて結合を阻害する；およびＡＴＩ−９６８は５６ｐＭのＥＣ５０にて結合を阻害する)；
−ＥＬＩＳＡにより決定されたような、抗ＰＤ−Ｌ１抗体１２Ａ４の、ヒトＰＤ−Ｌ１への結合の阻害。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)においても試験された：ＡＴＩ−９６４、ＡＴＩ−９６５およびＡＴＩ−９６８は、ＭＬＲにおいて活性であったが、ＡＴＩ−９６６およびＡＴＩ−９６７はＭＬＲにおいて活性ではなかった。
以下の実施例は、１８Ｆおよび６４Ｃｕを有する抗ＰＤ-Ｌ１アドネクチンの標識化に関する。
実施例３:２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホネートの製造
Figure 2020048567
((オキシビス(エタン−２，１−ジイル))ビス(オキシ))ビス(エタン−２，１−ジイル)ビス(４−メチルベンゼンスルホネート)(５ｇ、９.９５ｍｍｏｌ)およびアジ化ナトリウム(０.６４７ｇ、９.９５ｍｍｏｌ)の混合物を、エタノール(５０ｍＬ)中に溶解し、反応液を９０℃で１７時間にわたり環流した。溶媒を部分真空によって除去し、次いで４０グラムのシリカカートリッジに加え、フラッシュクロマトグラフィー(ＩｓｃｏＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ−ヘキサン中の１０％酢酸エチルからヘキサン中の９０％酢酸エチルまでの、４５分間の直線状勾配によって溶出)を用いて精製した。回収した画分をＴＬＣによって確認し、合わせて、２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホン酸を無色の油状物として得た。２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホネート生成物の反応特性によって、当該物質はさらなる特性評価をすることなく、そのままで用いられた。
実施例４:３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの製造
Figure 2020048567
０℃の水素化ナトリウム(０.１２９ｇ、３.２１ｍｍｏｌ)のＤＭＦ(１０ｍＬ)中の懸濁液に、２−フルオロピリジン−３−オール(０.３６３ｇ、３.２１ｍｍｏｌ)のＤＭＦ(５ｍＬ)中の攪拌溶液を滴下によって加え、次いで２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホン酸(１.００ｇ、２.６８ｍｍｏｌ)のＤＭＦ(５ｍＬ)溶液を滴下によって加えた。懸濁液を０℃で１０分間保ち、次いで１時間常温まで昇温させ、次いで６０℃で４時間加熱した。溶媒を真空で除去した。１００ｍＬの酢酸エチルを加え、次いで濃ブラインによって３回の洗浄抽出を行った。有機層を硫酸ナトリウムによって乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィー(ＩｓｃｏＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ−ヘキサン中の１０−５０％ＥｔＯＡｃによって溶出)によって精製し、無色のオイルを得た。３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(７０２ｍｇ、２.２３３ｍｍｏｌ、収率８３％)を透明な油として単離した。１Ｈ ＮＭＲ (４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ)δ ７.７５(ｄｔ，Ｊ＝４.９，１.６Ｈｚ，１Ｈ)、７.３３(ｄｄｄ，Ｊ＝１０.０，８.１，１.５Ｈｚ，１Ｈ)、７.１０(ｄｄｄ，Ｊ＝７.９，４.９，０.７Ｈｚ，１Ｈ)、４.３０−４.１６(ｍ，２Ｈ)、３.９５−３.８３(ｍ，２Ｈ)、３.８０−３.６１(ｍ，１０Ｈ)、３.３８(ｔ，Ｊ＝５.１Ｈｚ，２Ｈ)１３Ｃ ＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ)ｄ １４２.３，１３７.７，１３７.５，１２３.４，１２３.４，１２１.７，１２１.６，７７.３，７６.７，７０.９，７０.７，７０.６，７０.０，６９.４，６９.０，５０.６ １９Ｆ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ)δ −８３.５５.ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)理論値：Ｃ１３Ｈ２０ＦＮ４Ｏ４＋ ｍ／ｚ ３１５.４６４；実測値 ３１５.１４６３
実施例５:３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ニトロピリジンの製造
Figure 2020048567
水素化ナトリウム(０.１２１ｇ、３.０１ｍｍｏｌ)(油中の６０％懸濁液)をＤＭＦ(７.０ｍＬ)に溶解し、得られた懸濁液を０℃に冷却した。２−ニトロピリジン−３−オール(０.３８４ｇ、２.７４ｍｍｏｌ)のＤＭＦ(１.５ｍＬ)溶液をゆっくりと加え、次いでＤＭＦ(１.５ｍＬ)中の２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホネート(１.０２３ｇ、２.７４ｍｍｏｌ)を滴下によって加えた。懸濁液を０℃で１０分間保ち、次いで常温まで２時間昇温させ、次いで６０℃で７２時間加熱した。反応を１０ｍＬのＤＩ水でクエンチし、次いで酢酸エチル抽出を行った(３×１０ｍＬ)。回収したＥｔＯＡｃ抽出物を、濃ブライン(１０ｍＬ)によって洗浄し、硫酸ナトリウムによって乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、淡黄色の油状物を得た。粗製物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。２４ｇのシリカカートリッジを、２５ｍＬ／分で、ヘキサン中の１０％酢酸エチルから始め、ヘキサン中の５０％酢酸エチルにまで２５分間で直線的に変化させた。その後、勾配を当該溶媒組成において１０分間保ち、次いで１０分間で１００％酢酸エチルに変化させた。３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ニトロピリジンは、クロマトグラムの３０−４０分の間に溶出し、回収した画分を減圧、次いで真空で２時間留去し、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ニトロピリジン(６８７ｍｇ、１.９７３ｍｍｏｌ、収率７２.０％)を淡黄色の油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ)δ ８.１１(ｄｔ，Ｊ＝４.９，１.６Ｈｚ，１Ｈ)、７.６０(ｄｄｄ，Ｊ＝１０.０，８.１，１.５Ｈｚ，１Ｈ)、７.５２(ｄｄｄ，Ｊ＝７.９，４.９，０.７Ｈｚ，１Ｈ)、４.３０−４.１６(ｍ，２Ｈ)、３.９５−３.８３(ｍ，２Ｈ)、３.８０−３.６１(ｍ，１０Ｈ)、３.３８(ｔ，Ｊ＝５.１Ｈｚ，２Ｈ)１３Ｃ ＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ)ｄ １４７.３，１３９.５，１２８.４，１２４.４.７１.１，７０.７，７０.６，７０.０，６９.９，６９.３，５０.７.ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)理論値：Ｃ１３Ｈ２０Ｎ５Ｏ６＋ ｍ／ｚ ３４２.１４０８；実測値３４２.１４０９
実施例６：３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ブロモピリジンの合成
Figure 2020048567
０℃の水素化ナトリウム(ＮａＨ、２５.７ｍｇ、０.６４３ｍｍｏｌ)のジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、５ｍＬ)中の懸濁液に、２−ブロモピリジン−３−オール(１１２ｍｇ、０.６４３ｍｍｏｌ)のＤＭＦ(１ｍＬ)溶液を滴下によって加え、次いで２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホン酸(２００ｍｇ、０.５３６ｍｍｏｌ)のＤＭＦ(１ｍＬ)溶液を滴下によって加えた。懸濁液を０℃で１０分間保ち、次いで１時間室温に昇温させ、次いで６０℃で４時間加熱した。加熱が完了すると、粗製反応混合液の溶媒を真空で留去した。粗製反応物を、５０ｍＬの酢酸エチルに再溶解し、２×５０ｍＬのブラインで洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗製反応物を、逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ブロモピリジン、ＴＦＡ(１１２ｍｇ、０.２２９ｍｍｏｌ、収率４２.７％)を淡黄色の油状物として得た。ＨＲＭＳ ＥＳＩ ｍ／ｚ(Ｍ＋Ｈ)、理論値 Ｃ１３Ｈ２０ＢｒＮ４Ｏ４ ３７５.０６６４ 実測値 ３７５.０６６２；１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６)δ ７.９７(ｄｄ，Ｊ＝４.６，１.５Ｈｚ，１Ｈ)、７.５４(ｄｄ，Ｊ＝８.２，１.６Ｈｚ，１Ｈ)、７.４０(ｄｄ，Ｊ＝８.１，４.６Ｈｚ，１Ｈ)、４.２４(ｄｄ，Ｊ＝５.３，３.９Ｈｚ，２Ｈ)、３.８５−３.７８(ｍ，２Ｈ)、３.６８−３.６２(ｍ，２Ｈ)、３.６２−３.５２(ｍ，８Ｈ)、３.４２−３.３４(ｍ，２Ｈ)。
実施例７：トリメチルアニリウム化合物の合成のためのスキーム
Figure 2020048567
実施例８: ３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ−ジメチルピリジン−２−アミンの合成
Figure 2020048567
Figure 2020048567
３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(１６０ｍｇ、０.５０９ｍｍｏｌ)、炭酸カリウム(Ｋ２ＣＯ３、８４ｍｇ、０.６１１ｍｍｏｌ)、およびジメチルアミン(水中４０％、０.０９７ｍＬ、０.７６４ｍｍｏｌ)のジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ、２.５ｍＬ)中の混合物を、密閉された耐圧容器において１１０℃で１４時間加熱した。加熱が完了すると、粗製反応混合物の溶媒を真空で除去した。粗製反応物を５０ｍＬの酢酸エチルに再溶解し２×５０ｍＬのブラインで洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。粗製反応物を、順相クロマトグラフィーを用いて精製し、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン−２−アミン(１４０ｍｇ、０.４１３ｍｍｏｌ、収率８１％)を無色の油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ)δ ７.８６(ｄｄ，Ｊ＝４.９，１.５Ｈｚ，１Ｈ)、７.０２(ｄｄ，Ｊ＝７.８，１.５Ｈｚ，１Ｈ)、６.７３(ｄｄ，Ｊ＝７.８，４.９Ｈｚ，１Ｈ)、４.２０−４.０７(ｍ，２Ｈ)、３.９８−３.８６(ｍ，２Ｈ)、３.８１−３.６１(ｍ，９Ｈ)、３.３８(ｔ，Ｊ＝５.１Ｈｚ，２Ｈ)、３.１３−２.９４(ｍ，６Ｈ)、１.６９(ｓ，２Ｈ)。ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)理論値：Ｃ１５Ｈ２６Ｎ５Ｏ４＋ ｍ／ｚ ３４０.１９８０；実測値 ３４０.１９７９。
実施例９: ３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルピリジン−２−アミニウムの合成
Figure 2020048567
トリフルオロメタンスルホン酸メチル(０.０６５ｍＬ、０.５８９ｍｍｏｌ)を、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン−２−アミン(４０ｍｇ、０.１１８ｍｍｏｌ)のトルエン(１.５ｍＬ)溶液に、窒素の安定気流の下で密閉された容器において加えた。反応混合物を室温で１４時間にわたり攪拌した。溶媒を除去し、生じた残留物を２×１０ｍＬのエーテルで洗浄し、２×１ｍＬのジクロロメタンによって共沸によって乾燥させ、高圧真空下で一晩乾燥させ、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルピリジン−２−アミニウム、トリフルオロメタンスルホン酸塩を、無色の高粘度の油状物として定量的収率で得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ ３５４.３３；１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６)δ ８.２４−８.１７(ｍ，１Ｈ)、７.９８(ｄ，Ｊ＝８.３Ｈｚ，１Ｈ)、７.７５(ｄｄｄ，Ｊ＝８.２，４.６，３.２Ｈｚ，１Ｈ)、４.４４(ｂｒ.ｓ.，２Ｈ)、３.８８(ｄ，Ｊ＝３.９Ｈｚ，２Ｈ)、３.６９−３.４５(ｍ，２１Ｈ)。
実施例１０：３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルピリジン−２−アミニウム、トリフルオロメタンスルホネート塩を用いた、[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの合成
Figure 2020048567
［１８Ｆ］−フルオライドの水溶液(２.０ｍｌ，３３.３ＧＢｑ／９００ｍＣｉ)を、ペンシルベニア州ウエスト・ポイント、Ｐ.Ｅ.Ｔ.Ｎｅｔ(登録商標)Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから購入し、直接Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡに移した［Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡカートリッジは、使用前に、５ｍｌの０.５Ｍの炭酸水素カリウム、５ｍｌの脱イオン水、および５ｍｌのＭｅＣＮの順で前処理を行った］。移行が終了すると、炭酸カリウム(１５ｍｇ／ｍｌ；０.１ｍｌ)、次いで、炭酸カリウム(３０ｍｇ／ｍｌ、０.１ｍｌ)、４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８.８.８］ヘキサコサン(１５ｍｇ、０.０４ｍｍｏｌ)および１.２ｍｌのＭｅＣＮの混合物を逐次添加することによって、［１８Ｆ］フルオライド水溶液がＱＭＡ Ｓｅｐ−Ｐａｋから溶出した。溶媒を９０℃の窒素の緩やかな気流の下でおよび真空で蒸発させた。共沸乾燥を、１ｍｌのアセトニトリルによって２回繰り返し、無水Ｋ.２.２.２／Ｋ［１８Ｆ］Ｆ複合体を得た。３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルピリジン−２−アミニウム、トリフルオロメタンスルホン酸塩(２ｍｇ、５.６μｍｏｌ)を、５００マイクロリットルのＤＭＳＯに溶解し、乾燥クリプタンドに加えた。この溶液を１２０℃で１０分間加熱した。その後、粗製反応混合物を３ｍｌのＤＩ水で希釈した。次いで、粗製反応混合物の全量を、逆相ＨＰＬＣに移し、ロードし、以下の条件で精製した：ＨＰＬＣカラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０×１０ 溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡを含むＤＩ水；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡを含むアセトニトリル、流量４.６ｍｌ／分、３２％のＢの定組成メソッドを用い、ＵＶは２８０ｎｍにおいてモニターされた。［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンを、クロマトグラムの２４分のピークにおいて単離し、２分間回収した。この生成物を１０ｍｌのＤＩ水を含む１００ｍｌのフラスコに回収し、全ての内容物をＷａｔｅｒｓのＳｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ ｔＣ１８ ６ｃｃ １ｇ ｓｅｐ ｐａｃｋに移した。６.１ＧＢｑ／１６４ｍＣｉの［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンをこの反応液から単離した。これは３ｍｌのエタノールによってｓｅｐ−ｐａｋから回収され、この溶液を９８Ｃ熱源、窒素の安定な気流、および真空によって１５分間、当該バイアルにフィルムのみが残るまで蒸発させた。最終生成物を１００％の１×ＰＢＳ緩衝液に再溶解し、３７℃で１時間以上は当溶媒に安定である。
アルキンを含む適切な生物製剤との「クリック」アジド−アルキン反応を利用することにより、［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンを使用して、１８Ｆ標識生物学的製剤を製造してもよい。
実施例１１:「クリックケミストリー」を用いた１８Ｆ−放射性標識タンパク質の製造
４−ＰＥＧ−トシル−アジド前駆体のフッ素化による、［ １８ Ｆ］−ＦＰＰＥＧＡの生成
９００ｍＣｉの１８Ｆの１８Ｏ水(３ｍｌ)の放射能(ＩＢＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒから購入)を、４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８.８.８］ヘキサコサン(２.８ｍｇ、７.４４μｍｏｌ)および炭酸カリウム(１.７ｍｇ、０.０１２ｍｍｏｌ)を含むマイクロバイアル(ｎｏ ＱＭＡ)に直接移した。追加の２.０ｍｌのアセトニトリルをこの粗製反応混合物に加え、全ての混合物を共沸によって乾燥させた。９８℃の油浴を用いて溶液を蒸発させることによって、並びにＮ２の穏やかな気流を加えることおよび部分真空によって、乾燥を完了させた。溶液の体積は約２ｍｌに減少した。追加の２ｍｌのアセトニトリルを加え、このプロセスを４０分にわたり３回繰り返した。液体の体積が０.３ｍｌ未満まで減少した時、０.７ｍｌの分取量のアセトニトリルを加え、溶液をさらに共沸蒸留することで体積を〜０.１ｍｌにまで減少させた。追加の０.９ｍｌのアセトニトリルを加え、このプロセスを白色の固形物が生成するまで行った。このプロセスには〜５５分要した。最後の手順の間は、溶液が乾燥する前にバイアルを油浴から外し、バイアル中の残留物を２０分間室温で、完全真空(窒素気流なし)下に設置した。［１８Ｆ］−ＦＰＰＥＧＡクリプタンド混合物の移行および乾燥に要した合計時間は６５分であった。
乾燥［１８Ｆ］−ＦＰＰＥＧＡクリプタンド混合物に、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ニトロピリジン(２ｍｇ、５.８６μｍｏｌ)の、５００マイクロリットルのＤＭＳＯ溶液を加え、この混合物を１２０℃で１０分間加熱した。その後、粗製反応混合物を３ｍｌのＤＩ水で希釈し、次いで全ての溶液を、以下のＨＰＬＣカラムおよび条件において、移行およびロードした：ＨＰＬＣカラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０×１０ｍｍ；溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡを含むＤＩ水；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡを含むアセトニトリル；流量４.６ｍｌ／分；圧力１８２０ＰＳＩ；定組成メソッド ３２％Ｂ；ＵＶ−２８０ｎｍ。［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(［１８Ｆ］−ＦＰＰＥＧＡ)生成物を、クロマトグラムの２４分のピークにおいて単離し、２分間回収した。この生成物を、１５ｍＬのＤＩ水を含む１００ｍｌフラスコに回収し、全ての内容物をＳｅｐ ＰａｋＶａｃ ｔＣ１８ ６ｃｃ １ｇ ｓｅｐ ｐａｃｋに移した。ＰＮ ＷＡＴ０３６７９５。２.５ｍｌのエタノールを用いて［１８Ｆ］−ＦＰＰＥＧＡをＳｅｐ Ｐａｋから回収し、この溶液を乾燥するまで、９８℃のＮ２および真空によって１５分間蒸発させた。この化合物を０.１ｍｌの１×ＰＢＳ(リン酸緩衝化ブライン)に溶解させた。この生成物をＶａｒｉａｎ ＨＰＬＣを用いて解析した：ＨＰＬＣカラム Ｌｕｎａ Ｃ１８(２)４.６×１５０ｍｍ 溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡを含むＤＩ水；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡを含むアセトニトリル；流量１.０ｍｌ／分；勾配メソッド ０分 ９０％Ａ １０％Ｂ；１５分 ３０％Ａ ７０％Ｂ；１７分 ３０％Ａ ７０％Ｂ；１８分 ９０％Ａ １０％Ｂ；２０分 ９０％Ａ １０％Ｂ；ＵＶ−２８０ｎｍ。２２０ｍＣｉの［１８Ｆ］−ＦＰＰＥＧＡが単離された。
Ｂ.Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯの合成
この実施例では、Ｅ０１抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンのＰＥＧ４−ＤＢＣＯへの結合を記述する。
アドネクチンをＰＥＧ４−ＤＢＣＯに結合させるために、マレイミドケミストリーが用いられたため、Ｅ０１アドネクチンは、最初にプロリンを追加することで改変され、次いで所定の組み換え技術を用いてＣ末端のシステインを生成した。この改変Ｅ０１アドネクチンのアミノ酸配列は、配列番号：１０４において提供される。このシステインを使用して、アドネクチンをＰＥＧ４−ＤＢＣＯに結合させる。
４倍モル過剰量のマレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ(Click Chemistry Tools)をＤＭＳＯに溶解し、精製された改変Ｅ０１アドネクチンを、１ｍＭ ＴＣＥＰの存在下で加えた。ＤＭＳＯの最終濃度は、結合混合物中の５％を超えていなかった。質量スペクトル解析の前に、結合混合物を室温で１時間放置した。結合をＭＳで確認した後、ＰＢＳ ｐＨ７.２で平衡化されたＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ カラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用いて、サンプルをサイズ−排除クロマトグラフィーによって精製した。
Ｃ.［１８Ｆ］−ＦＰＰＥＧＡのアドネクチンへの結合
［１８Ｆ］−Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯ−ＦＰＰＥＧＡの合成スキームは、図２および９に示される。
０.２ｍｌの５.４ｍｇ／ｍｌのＥ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯアドネクチン溶液(セクションＢで記述されるように生成された)を、１×ＰＢＳ緩衝液中の２００ｍＣｉの０.１ｍｌの［１８Ｆ］−ＦＰＰＥＧＡ(実施例１)と共にインキュベートした。粗製反応液を上下に数回ピペッティングすることによって溶液を穏やかに混合させ、４５℃または室温で４５分間共にインキュベートした。この粗製反応混合液の内容物を、ＳＥＣカラムを用いて精製した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ０.５ｍｌ／分 １×ＰＢＳ緩衝液および［１８Ｆ］−Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯ−ＦＰＰＥＧＡ生成物を、クロマトグラムの３７分のピークにおいて２分間単離した。
［１８Ｆ］−Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯ−ＦＰＰＥＧＡは、非放射性スタンダードの同時注入を伴うＳＥＣ、ＰＬＲＰＳカラムを用いたＲＰ ＨＰＬＣ、およびゲル電気泳動によって解析された。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ カラム；溶媒 １００％１×ＰＢＳ緩衝液；０.５ｍｌ／分 ２８０ ＵＶ；
逆相ＨＰＬＣ
カラム：ＰＬＲＰＳ ８ ｍｉｃｒｏｎ １０００ Ａ ４.６×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：ＤＩ水中の０.１％ギ酸
溶媒Ｂ：アセトニトリル
流量：１ｍｌ／分
圧力：１３５１ ＰＳＩ
勾配：
０分 ９０％Ａ １０％Ｂ
３０分 ４５％Ａ ５５％Ｂ
３２分 ２５％Ａ ７５％Ｂ
３６分 ２５％Ａ ７５％Ｂ
５０分 ９０％Ａ １０％Ｂ
１５ｍＣｉの［１８Ｆ］−Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯ−ＦＰＰＥＧＡが単離され、反応が４５℃で行われた場合に、ＳＥＣおよびＲＰ ＨＰＬＣの計算によって＞９９％の放射化学的純度(ＲＣＰ)、および０.６ｍＣｉ／ｎｍｏｌの特異的活性を有した。反応が室温で行われた場合、５.７２ｍＣｉが得られた。反応が４５℃または室温で行われた場合はそれぞれ、合成の３時間において、［１８Ｆ］−ＦＰＰＥＧＡの特異的活性は０.５１２ｍＣｉ／ｎｍｏｌおよび８５.７％のＲＣＰであった。特異的活性はＮａｎｏｄｒｏｐ(http://www.nanodrop.comを参照されたい)によって測定した。生成物はＳＥＣおよびＰＬＲＰＳの両方において、非放射性スタンダードと共に溶出した。ゲル電気泳動によって、１８Ｆ生成物が１１ｋＤａの分子量標準と一致することを確認した。
１８Ｆ−放射性標識Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯは、診断イメージング、基礎研究および放射性治療応用などの様々なインビトロおよび／またはインビボイメージング応用において用いられうる。診断イメージングおよび放射性治療応用の可能な特定の例としては、哺乳動物、またはそれらの臓器もしくは組織サンプルにおける、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍の位置、相対的な活性および／または定量化の決定、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍の放射免疫アッセイ、並びにＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍の分布を決定するためのオートラジオグラフィーが挙げられる。
特に、１８Ｆ−放射性標識Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯは、ヒトおよび実験動物の肺、心臓、腎臓、肝臓および皮膚および他の臓器における、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍のポジトロン断層法(ＰＥＴ)イメージングに有用である。１８Ｆ−放射性標識Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯを用いたＰＥＴイメージングは、以下の情報を得るために用いられうる：ＰＤ−Ｌ１腫瘍−候補治療剤の組織占有度および患者の臨床効果の関係；長期間の臨床試験の開始前に、ＰＤ−Ｌ１腫瘍−治療剤の臨床試験のための用量選択；構造的に新しいＰＤ−Ｌ１腫瘍−治療剤の相対的な有効性；ＰＤ−Ｌ１腫瘍−治療剤を用いた臨床的標的の治療の間の、ＰＤ−Ｌ１腫瘍−治療剤のインビボでの輸送体親和性および密度への影響の調査；有効および非有効治療の間の、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍の密度および分布の変化。
実施例１２：ＮＯＤＡＧＡ−ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを作成するためのＰＤ−Ｌ１アドネクチンとＮＯＤＡＧＡとの結合
この実施例は、Ｅ０１およびＡ０２抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンとＮＯＤＡＧＡとの結合を記述する。マレイミド化学はアドネクチンとＮＯＤＡＧＡとの結合に使用されるので、双方のアドネクチンは、そのＣ-末端(上記Ｅ０１について述べたとおり)上にプロリンに続いてシステインを使用した。改変されたＥ０１およびＡ０２アドネクチンのアミノ酸配列を、配列番号：１０４および８８各々に示した。システインは、アドネクチンとＮＯＤＡＧＡとの結合のために使用される。アドネクチンの６４Ｃｕ標識のために、５０倍モル過剰のマレイミド−ＮＯＤＡＧＡ(CheMatech)を、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)に溶解して、精製したアドネクチンに１ｍＭ ＴＣＥＰ存在下で加えた。最終ＤＭＳＯ濃度は、コンジュゲーション混合物において５％を超えなかった。コンジュゲーション混合物を、室温にて１時間放置して、質量分光分析を行った。コンジュゲーションのＭＳによる確認の後に、試料を、ＰＢＳ(ｐＨ７.２)により平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 75 column(GE Healthcare)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
実施例１３：６４Ｃｕを基にした抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンプローブの合成
６４Ｃｕ−Ａ０２−ＮＯＤＡＧＡの合成
[６４Ｃｕ]−塩化銅(６４ＣｕＣｌ２)/０.１Ｎ 塩酸溶液を、０.１Ｎ 酢酸ナトリウム(ＮａＯＡｃ)水溶液(０.８ｍＬ)を用いて４分間周囲温度で中和した。６４Ｃｕ／ＮａＯＡｃ溶液(１ｍＬ)を、Ａ０２−ＮＯＤＡＧＡ(３０μＬ, １.６ ｍｇ／ｍＬ)に加えて、粗製反応を、穏やかにピペッティングを行い、混合して、周囲温度で３０分間静置した。粗製反応混合物の内容物を、試料を重層する前に１ｘリン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ, ｐＨ７.４)緩衝液(２０ｍＬ)を用いて予め活性化したＰＤ−１０脱塩カラムに移した。更に１xＰＢＳ(１.５ｍＬ)、次いで更に１ＸＰＢＳ溶液(０.８ｍｌ)をカラムに加えて、これらの画分を廃棄した。次いで［６４Ｃｕ］−Ａ０２−ＮＯＤＡＧＡを集めた。ＰＤ−１０カラムの１.２ｍＬ溶出後に集めて、１０.７９ｍＣｉを目的とする生成物として得た。クオリティーコントロールを、Agilent PLRP−S HPLCカラムサイズ：250 x 4.60 mm, 8 μm, 280 nmおよび移動相、０.１％ギ酸/蒸留水およびアセトニトリルを用いる逆相ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。グラジエント方法を使用したが、この場合アセトニトリルの％は、３０分の時間をかけて１０％〜４５％まで直線的に増加させた。[６４Ｃｕ］−Ａ０２−ＮＯＤＡＧＡは、ＨＰＬＣクロマトグラムで２２分にて参照標準の出現と共に同時に溶出した。放射性化学的な純度は、この方法を用いて９６％であると測定された。［６４Ｃｕ］−Ａ０２−ＮＯＤＡＧＡはまた、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)カラム：GE Superdex 200 GL Size：10 x 300 ｍｍ, 280 nmを用いて、２０分時に参照物質と共に共溶出された。Ｎａｎｏｄｒｏｐタンパク質濃度と単離された精製試料の放射活性に基づいて、計算された比活性は９５６.８ｍＣｉ／μｍｏｌであった。
６４Ｃｕ−Ｅ０１−ＮＯＤＡＧＡの合成方法
［６４Ｃｕ］−塩化銅（［６４Ｃｕ］ＣｕＣｌ２)/０.１Ｎ 塩酸溶液(２０ｍＣｉ/０.２５ ｍＬ)を、０.１Ｎ 酢酸アンモニウム緩衝液(１.１０ ｍＬ)を用いてｐＨ調整して、次いで混合し、１ＸＰＢＳ水溶液(４０μＬ, １.２ｍｇ／ｍＬ, ４.６２ｎｍｏｌ)中で３０分間周囲温度にてＥ０１−ＮＯＤＡＧＡアドネクチンとインキュベートした。インキュベーション３０分後に、この反応混合物(〜１２５０μＬ)を、ＰＤ−１０脱塩カラム(GE Healthcare Life Science, Sephadex G25 Medium, 14.5 x 50 mm - １X PBS(40 mL)を用いて平衡化)および試料を、カラムに全て入れて、１ＸＰＢＳ(１.１ ｍＬ)と共に付した。液体をカラムに完全に通過させた後に、この生成物を、試料バイアルあたり１Ｘ ＰＢＳの１ｍＬで漸増溶出により集めた。６４Ｃｕ-Ｅ０１-ＮＯＤＡＧＡを、二番目の１ｍｌ画分中に単離し、９.２６ ｍＣｉ/１ｍｌの１ＸＰＢＳであると測定した。この試料を、ＵＶ/ｖｉｓ検出機器(λ=２８０ｎｍ)、posi−ram検出機器およびSuperdex 200 10/300 GLサイズ排除カラム(GE Healthecare Life Science, グラジエント13 μｍ)を備えたAgilent HPLCシステムを用いる分析用サイズ排除HPLC方法を用いて分析した。流量は０.５ｍＬ／分であり、水性移動相は、６０分間の１Ｘ ＰＢＳ(０.０２％ ＮａＮ３を用いたイソクラティックである。放射性化学純度は、この系を用いて９９％であり、生成物は、非放射性の参照標準と共溶出した。比活性は、３点校正曲線（ｙ＝６５６９７８ｘ)方程式に基づいて計算された。バイアル３からの約１００μＬの生成物溶液を、Superdex−200 サイズ排除カラムに入れた。生成物のピークを集めて、測定すると０.７４ｍＣｉであり、生成物ピークのＵＶカウントは１５６３６７ユニットであり、比活性は３.１ｍＣｉ／nmolであった。
実施例１４：抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンイメージング剤を用いた、ＰＤ−Ｌ１−陽性細胞とＰＤ−Ｌ１−陰性細胞とのインビトロでの区別
この実験において、６４Ｃｕ−Ｅ０１ 抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン(ＮＯＤＡＧＡをキレート剤として使用した)が、インビトロでのｈＰＤ−Ｌ１−陽性細胞およびｈＰＤ−Ｌ１−陰性細胞を識別するその能力について試験した。ｈＰＤ−Ｌ１−陰性ＨＴ−２９細胞（ｈＰＤ−Ｌ１−陽性Ｌ２９８７細胞と比較して、細胞に関連する比活性が４４.６×高い)と比較して、６４Ｃｕ−Ｅ０１とｈＰＤ−Ｌ１−陽性Ｌ２９８７細胞との示差的会合により明らかであるが、細胞標識化は特異的であった。過剰量の４５０ｎＭのコールド(非標識)Ｅ０１アドネクチン(９９.６％の低下)と共に共インキュベーションした場合、細胞に会合した64Ｃｕ−Ｅ０１の顕著な低下により、比活性を更に確認した。細胞を４５０ｎＭのコールド(非標識)非-ＰＤ-Ｌ１結合アドネクチン(図３)と共インキュベーションした場合、細胞に会合した１８Ｆ−Ｅ０１が最小の減少を示した(９.９％低下、有意ではない)。
１×１０６のｈＰＤ−Ｌ１−陽性Ｌ２９８７ヒト肺癌細胞またはＰＤ−Ｌ１−陰性ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞を５ｍＬ培養チューブに入れた(条件ごとにｎ＝３チューブ)。１８Ｆ−放射性標識Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯ溶液を、ＰＢＳ＋０.５％ＢＳＡ中に、３００ｎＣｉ／２００μＬの濃度で調整した。この溶液の一部を、冷却(非標識)Ｅ０１アドネクチンまたは冷却(非標識)アドネクチン(コントロール)のいずれかに加え、最終濃度を４５０ｎＭにした。細胞サンプルを５分間２００×ｇで遠心分離し、次いで２００μＬの適切な１８Ｆ−放射性標識Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯ溶液に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞サンプルを２００×ｇで遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットを１ｍＬのＰＢＳ＋０.５％のＢＳＡに再懸濁し、洗浄の手順を合計３回繰り返した。最終の洗浄の後に、細胞を再び２００×ｇで遠心分離し、上清を捨てた。残存する細胞ペレットの放射能を、次いで、ガンマ計測器によって観測した。
まとめると、これらの結果は１８Ｆ−放射性標識Ｅ０１−４ＰＥＧ−ＤＢＣＯがインビトロにおいてＰＤ−Ｌ１(＋)とＰＤ−Ｌ１(−)細胞を識別することのできる能力を示す。比活性は、４５０ｎＭ 非標識抗ＰＤ−Ｌ１ Ｅ０１アドネクチンと共インキュベーションした試料中の細胞関連放射性トレーサーの有意な低下により更に実証された(４５０ｎＭの非-ＰＤ-Ｌ１結合アドネクチンと共インキュベーションした場合には、統計的には有意でない低下にずぎない)。様々なアドネクチンバリアントならびに放射性核種として１８Ｆを用いた類似の実験を行い、同様の結果を得た。
実施例１５：抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンイメージング剤を用いる、ＰＤ−Ｌ１−陽性腫瘍とＰＤ−Ｌ１−陰性腫瘍の区別
ＰＥＴイメージングのためには、迅速な血液クリアランス速度は、“バックグラウンド”のプローブシグナルにとっての必要な時間を最小にし、無関係の組織から枯渇させることにより、タンパク質(例えば、抗体)を遅くクリアランスするよりも利点を提供する。病院内においては、長期の血中半減期抗体に基づくＰＥＴトレーサーは、画像を収集する前に、注射後、数日間を要し得る。迅速にクリアランスするプローブは、プローブが注射された日と同日に、高いコントラストの画像を収集できる機会への扉を開くものであり、非常に重要なことは、それらは、試験動物または治験患者への放射性暴露全体量を低下させるように役立ち得る。
この実験において、６４Ｃｕ−Ａ０１ 抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチン（ＮＯＤＡＧＡをキレート剤として使用した)を、上記の実施例において記述されたとおりに得て、マウスにおけるｈＰＤ−Ｌ１−陽性腫瘍およびhＰＤ−Ｌ１−陰性腫瘍とを識別するその能力について試験した。
両側性の異種移植腫瘍を有するマウスは、マウスの両側に１×１０６のＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７ヒト肺癌細胞および１.５×１０６のＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞を皮下注射することによって作られた。腫瘍がおよそ３００ｍｍ３に達すると(細胞移植後、およそ２−３週間)、イメージングのために動物が選択された。イメージングのために、動物は２％イソフルランを用いた麻酔下に置かれ、尾静脈カテーテルが導入された。マウスは次いで、４匹の動物を収容できるカスタム動物ホルダーに入れられ、そこで研究の継続時間の間、麻酔下に保たれた。動物ホルダーをｍｉｃｒｏＰＥＴ(登録商標)Ｆ１２０ＴＭスキャナー(Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｉｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ)に移した。この機器の軸方向視野は７.６ｃｍである。この制限によって、動物は、スキャン領域が目の直前からおよそ尾の付け根までであるように配置された。
最終的なＰＥＴ画像を減衰補正するために、５７Ｃｏの点光源を用いて１０分の透過像を最初に得た。透過スキャンに続いて、あらかじめ導入された尾静脈カテーテルを介して放射性トレーサー溶液を投与し、２時間のエミッション画像を得た。注入された放射性トレーサー溶液は、約２００μＣｉの６４Ｃｕ−Ａ０２（ＮＯＤＡＧＡキレーターを含む）または、最終濃度が３ｍｇ／ｋｇのコールドの非標識Ａ０２アドネクチン(個々の動物の体重に基づく)を含む２００μＣｉの６４Ｃｕ−Ａ０２のいずれかから構成された。全ての注射剤は、注射の前に２００μＬのブライン中に製剤化された。正確な注入量は、製剤化された用量を直接計測し、シリンジおよび尾静脈カテーテルに残った放射能を差し引くことによって計算した。
画像は、得られた透過像を用いた減衰補正をした最大事後（ＭＡＰ）アルゴリズムによって再構築し、放射性同位体の崩壊について補正した。最終的な画像において、ＡＳＩＰｒｏソフトウェア（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて、腫瘍の境界付近に関心領域（ＲＯＩ）を引いた。それぞれのＲＯＩについて時間放射曲線を算出し、２時間のエミッション画像の経過における腫瘍体積中の放射性トレーサーの定量画像を得た。最終的な比較のために、個々の時間放射能曲線は、それぞれの特定の動物に対して注入された放射性トレーサーの用量に基づいて標準化した。放射性トレーサーの取り込みを、それぞれの時間放射能曲線の最後の１０分（放射性トレーサーの注入後１時間５０分から２時間）を用いて、腫瘍全域にわたって比較した。この手法を用いて、ｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植片における放射性トレーサーの取り込みは、６４Ｃｕ−Ａ０１放射性トレーサーのみを受けた動物のｈＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９異種移植片に見られるものに対して３.０５×であった。６４Ｃｕ−放射性標識Ａ０２放射性トレーサーおよび３ｍｇ／ｋｇの非標識Ａ０２アドネクチンを共に注入された動物において、ｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植片における取り込みは、ｈＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９異種移植片において見られるものに対してわずか１.０４×であった(図４Ａおよび４Ｂ)。
いくつかの実験において、動物は頸椎脱臼によって屠殺し、その直後にイメージングが行われた。当該動物において、次いで解剖が行われ、個々の組織(血液、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、筋肉、胃、骨、Ｌ２９８７腫瘍、およびＨＴ−２９腫瘍)を、あらかじめ秤量したチューブに回収した。全ての組織を、次いで再度秤量し、それぞれの組織の重量を決定した。次いで、それぞれの組織における放射能を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｗｉｚａｒｄ３ ガンマ計測器を用いてエクスビボで直接計測した。全ての組織について、カウント毎分(ＣＰＭ)における計測値を、個々の動物に注入された放射性量および補正された放射性崩壊に対して標準化した。次いで、これらの結果を、プロットして、放射性トレーサーの生体内分布を示した。１８Ｆ−Ａ０２アドネクチン放射性トレーサーについてのこの分析の例は、図５に示される。これらの結果は、hＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９異種移植片と比較してＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植片において、放射性トレーサーの取り込みが明らかに異なることを示す。さらに、ＰＤ−Ｌ１の高い取り込みが見られる唯一の組織は腎臓であったが、これは１８Ｆ−Ａ０２アドネクチンが分子の分子量に基づいて腎臓濾過を通過すると予測されるクリアランスのためだと考えられる。
まとめると、これらの結果は、インビボにおいてｈＰＤ−Ｌ１(＋)とｈＰＤ−Ｌ１(−)の異種移植腫瘍を識別する直接的な可視化を示す。特異性は、さらに、３ｍｇ／ｋｇの非標識、抗ＰＤ−Ｌ１Ａ０２アドネクチンを共に注入することによって検証され、ｈＰＤ−Ｌ１(＋)腫瘍における放射性トレーサーの取り込みは、ｈＰＤ−Ｌ１(−)異種移植片における程度にまで減少した。最大の放射性トレーサー取り込み比、ｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植片対ｈＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９異種移植片において３.５３：１が、１８Ｆ−Ａ０２アドネクチン放射性トレーサーを用いて得られた。このことはさらに、ＰＥＴイメージングを用いてＰＤ−Ｌ１の組織発現を可視化するために、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを使用することの正当性を立証する。放射性核種として１８Ｆを用いる同様の実験がマウスにおいて行われ、同様の結果が得られ、１８Ｆ−Ａ０２アドネクチン放射性トレーサーを用いる、最大の放射性トレーサーの取り込み比が、３.５３：１のｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植とｈＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９異種移植となった。
カニクイサルにおいて行われた場合、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンベースのイメージング剤は、また同様の結果を示した。これらの実験において、上記実施例に記載されるように合成された１８Ｆ−Ｅ０１抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、カニクイサルにおいて高コントラスト画像が得られるかを試験された。本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、カニクイサルＰＤ−Ｌ１に対して高い親和性を維持する(しかし、齧歯類ＰＤ−Ｌ１に対しては低い親和性を持つ)。さらに、カニクイサルは、マウスモデルにおいて見られるようなＰＤ−Ｌ１(＋)腫瘍を有していないため、イメージング性能は、内因性ＰＤ−Ｌ１発現(バックグラウンドが低いため、ＰＤ−Ｌ１(＋)組織の高感度検出が可能になる)に関連する画像において測定される、バックグラウンド量に基づいて最初に評価される。これらの実験において、得られたＰＥＴ画像におけるバックグラウンド量は極めて低く、顕著な放射性トレーサーの蓄積は主に腎臓、脾臓および膀胱に見られた。
あらかじめ血管アクセスポート(ＶＡＰ)を導入したオスのカニクイサルを、０.０２ｍｇ／ｋｇのアトロピン、５ｍｇ／ｋｇのテラゾールおよび０.０１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンＩ.Ｍ.によって麻酔した(全てを単一のシリンジから注入した)。次いで、イメージング手順の間水和を維持する点滴投与のために、静脈カテーテルを頭部血管に設置した。動物を気管内チューブ−通常は３.０ｍｍと共にインキュベートし、ｍｉｃｒｏＰＥＴ(登録商標)Ｆ２２０ＴＭ ＰＥＴ機器(Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN)の撮影台に移した。イメージング処置の間、麻酔をイソフルランおよび酸素によって維持し、静脈内輸液(ＬＲＳ)を６ｍｌ／ｋｇ／時間の速度で投与した。ｍｉｃｒｏＰＥＴ(登録商標)Ｆ２２０(登録商標)機器の軸方向視野はわずか７.６ｃｍであるため、心臓の直上からおよそ骨盤までの動物の合成画像を作成するために、５つの異なる台の位置における画像が得られた。
それぞれの視野において、最終的なＰＥＴ画像を減衰補正するために、５７Ｃｏの点光源を用いて１０分の透過像を最初に得た。全ての台の位置において透過像が得られた後、およそ１.５ｍＣｉ(およそ０.０１５ｍｇ／ｋｇ)の１８Ｆ−Ｅ０１アドネクチン放射性トレーサーを、導入されたＶＡＰを介して投与した。次いで、動物の心臓の中心付近のポジション１から始まり、骨盤に向かって動く、５分の継続したエミッションスキャンを、それぞれの台の位置で順に行った。それぞれの位置(１から５)において画像を得た後、撮影台をポジション１の台に戻し、手順を繰り返した。この手順を用いて、イメージング実験の継続時間にわたって、それぞれの台の位置について合計５つの異なる画像を得た。
個々の画像は、得られた透過像および補正された放射性同位体崩壊を用いる減衰補正と共に、フィルター逆投影(ＦＢＰ)アルゴリズムを利用して再構築された。最終的な合成画像は、次いで、イメージング実験の継続時間の間、１回の通過によって得られた全ての５つの台の位置の画像を整列させることによって得られた。最終的な画像は、放射性トレーサーの取り込みが可視の領域(すなわち、脾臓、腎臓、膀胱)およびバックグランド組織(筋肉)を指摘するために、視覚的に調査された（図６）。１８Ｆ−Ｅ０１アドネクチンのバックグラウンドの蓄積は極めて低く、筋肉などのバックグラウンド組織において、わずかなシグナルしか可視化されなかった。さらに、ＰＤ−Ｌ１(＋)がｍＲＮＡ発現に基づくと考えられる脾臓において、取り込みが検証された。このように、カニクイサルにおける実験によって、内因性ＰＤ−Ｌ１に関連する、高−感度のＰＤ−Ｌ１イメージングの可能性が示される。
概して、齧歯類およびカニクイサルにおけるＰＥＴ実験において、６４Ｃｕおよび１８Ｆ標識抗ヒトＰＤ−Ｌ１アドネクチンは、ＰＤ−Ｌ１の発現量が低い組織における高感度の検出を可能にする、インビボでのＰＤ−Ｌ１陽性組織を標識するための強力かつ特異的な検出プローブを提供することが示される。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いたインビボのイメージング実験および検出されるこのイメージング剤が、ＰＤ−Ｌ１イメージング剤を用いて検出された領域と同一であったので、故に抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンイメージング剤が、インビボでＰＤ−Ｌ１陽性細胞を検出することに成功したことが実証された。
実施例１６：［１８Ｆ］−Ｅ０１抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを用いたヒトおよび異種移植組織のインビトロオートラジオグラフィー
ヒトの肺腫瘍組織をＯＣＴに設置し、２−メチルブタン中で２−５分間、冷凍するまで冷却した。使用までサンプルを−８０℃の冷凍庫に保存した。ヒトの異種移植片組織もまた、当該アッセイにおいてインキュベートした。両側性の異種移植片を有するマウスは、４×１０６のｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７細胞および１.５×１０６のｈＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９ｔ細胞を、ｎｕ／ｎｕマウスの両側に皮下投与することで生成した。異種移植腫瘍が適切な大きさ(およそ２００−３００ｍｍ３)に到達した後に、マウスを２％イソフルランによって麻酔し、頸椎脱臼によって犠牲にした。新たな腫瘍組織を切除し、ＯＣＴに浸し、２−メチルブタン中で２−５分間、冷凍するまで冷却した。次いで組織をｆｏｉｌ／ＺＩＰＬＯＣ(登録商標)袋に包み、使用まで−８０℃で保存した。全ての組織(ヒトの肺腫瘍および異種移植片)について、５μｍの厚さの切片(２切片／スライドを回収した)を低温保持装置を用いて切り取り、顕微鏡のガラススライド上で解凍し、およそ３０分間空気乾燥させた。
０.０２５ｎＭ、０.２５ｎＭ、２.５ｎＭおよび２５ｎＭのそれぞれの冷却(非標識)Ａ０２アドネクチン、並びに２５ｎＭの非ＰＤ−Ｌ１結合性アドネクチンを用いたブロッキング実験が、以下の条件を用いて行われた。濃度につき１つの個々のスライドをプラスチック性スライドカセットに設置し、Ｄａｋｏの血清−フリータンパク質ブロック溶液中で３０分間、前−培養した。スライドを次いで、ガラススライド培養室に移し、さらにインキュベートした。これとは別に、０.２５ｎＭの１８Ｆ−Ａ０２アドネクチンのストック溶液を、１０.６μＬの元の放射性リガンドのストック溶液(実験時に７０６４ｎＭ)を３００ｍｌのＰＢＳ＋０.５％ＢＳＡで希釈することで生成した。このストック溶液から、４０ｍＬをそれぞれの培養室に加えた。これらの培養室のうちの１つは、放射性リガンド緩衝溶液のみを含み、これは総結合切片と称される。他の培養室は４０ｍＬの当該ストック溶液を、関連濃度(０.０２５ｎＭ、０.２５ｎＭ、２.５ｎＭ、もしくは２５ｎＭの非標識Ａ０２アドネクチン、または２５ｎＭのＰＤ-Ｌ１結合アドネクチン)のブロッキング化合物と共に加えた。スライドを、最大の結合に達するまで、室温で１時間、個々の緩衝溶液中でインキュベートした。インキュベートの後、それぞれの処理群のスライドを培養溶液から取り出し、氷冷された洗浄緩衝液(ＰＢＳ＋０.５％ＢＳＡ)中に、３分間設置し、４回に分けて浸した。スライドを次いで、冷気流下で、およそ３０分間乾燥させた。空気乾燥したスライドを、イメージングプレート(BAS-SR 3545S)上に設置し、室温で一晩露光した。イメージングプレートを、バイオイメージングアナライザー(Fujifilm Fluorescent Image Analyzer, FLA-9000)を用いてスキャンした。オートラジオグラム画像の画素サイズは１００μｍであった。マルチ−ゲージソフトウェアを用いて、画像解析を行った。全ての試験群において、腫瘍組織全体を包囲するように、関心領域(ＲＯＩ)を引いた。組織に関連する放射能によるオートラジオグラフィーシグナルを、これらのＲＯＩから定量した。
ヒトの肺腫瘍切片並びにヒトの異種移植片切片の両方において、非標識Ａ０２アドネクチンの４つの異なる濃度(０.０２５ｎＭ、０.２５ｎＭ、２.５ｎＭおよび２５ｎＭ)について、総結合切片と比較した場合の１８Ｆ−Ａ０２アドネクチン放射性リガンドの明らかな転移が測定された。非標識Ａ０２アドネクチンの添加に伴う、用量に依存した１８Ｆ−Ａ０２の転移が、全ての組織切片において観測された。全ての組織において、２５ｎＭの非ＰＤ−Ｌ１結合性アドネクチンは、総結合切片と比較して最小の阻害を示した(図７)。
当該サンプルにおけるＰＤ−Ｌ１抗原の発現量を確認するために、それぞれの組織からの一連の５μｍの組織切片を、抗ヒト−ＰＤ−Ｌ１免疫組織化学的方法に用いた(図８)。
まとめると、これらの結果は、ヒトの肺腫瘍サンプル並びにヒトの異種移植片組織の両方において、ＰＤ−Ｌ１の直接的な可視化を示す。個々の組織に結合する放射性リガンドの量は、ＩＨＣによって冷凍切片を染色されたＰＤ−Ｌ１の量と一致する。さらに、非標識抗ＰＤ−Ｌ１ Ａ０２アドネクチンを用いた、用量に依存した受容体の阻害(および、非標識非ＰＤ−Ｌ１結合性アドネクチンを用いた阻害の欠如)は、ＰＥＴイメージングを用いたＰＤ−Ｌ１組織発現の可視化のための１８Ｆ−Ａ０２の使用の正当性をさらに立証する。
実施例１７：市販のＧＥ ＴＲＡＣＥＲｌａｂ ＦＸ２ Ｎ合成ユニットを用いた、放射性合成のための一般的な方法による［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの自動合成
Figure 2020048567
手順：
非カセット型のＧＥ ＴＲＡＣＥＲｌａｂ ＦＸ２ Ｎ合成モジュールを用いて、［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの自動合成を行った。合成ユニットの配置は表４にまとめられる。[１８Ｆ]−フルオライド水溶液(２．０ｍｌ、２９．６ＧＢｑ／８００ｍＣｉ)が、Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡに移された［Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡカートリッジは使用前に、５ｍｌの０．５Ｍの炭酸水素カリウム、５ｍｌの脱イオン水、および５ｍｌのアセトニトリルの順で前処理を行った］。この移動が完了すると、反応容器に溶出混合液を加えることによって(「Ｖ１」から)、［１８Ｆ］フルオライド水溶液をＱＭＡ Ｓｅｐ−Ｐａkから溶出させた。溶媒を窒素の穏やかな気流および真空下で蒸発させた。前駆体の溶液を(「Ｖ３」から)乾燥クリプタンド残留物に加え、この反応混合物を１２０℃で１０分間加熱した。次いで、４ｍｌの蒸留水を(「Ｖ４」から)反応容器中の粗製反応混合物に加え、混合物を、ローディングの終わりを制御する液体センサーを介して、セミ−分取ＨＰＬＣの５ｍｌサンプル注入ループに移した。混合物をセミ−分取ＨＰＬＣカラム(Ｌｕｎａ Ｃ１８(２)．２５０ｘ１０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ)にロードした。０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中の３５％アセトニトリルの混合液を、毎分４．６ｍｌの速度でカラムに通した。生成物をこのＨＰＬＣカラムから、１５ｍｌの蒸留水を含む希釈フラスコに回収し、全ての内容物を、ｔＣ１８ １グラムの固相抽出カートリッジに移した。３ｍｌのエタノールによって、このカートリッジから３５２ｍＣｉ(１３ＧＢｑ)の［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンが溶出され(「Ｖ１４」から)、アルキンを含む適切な生体分子との「クリック」アジド−アルキン反応を利用した１８Ｆ標識生物学的製剤の生成に用いられうる。
Figure 2020048567
実施例１８：市販のＩＢＡ Ｓｙｎｔｈｅｒａ合成ユニットを用いた、放射性物質合成のための一般的な方法による、［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの自動合成
Figure 2020048567
手順：
カセット型のＩＢＡ Ｓｙｎｔｈｅｒａ合成モジュールおよび適切に組み立てた流体プロセッサー積算キットを用いて、［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの自動合成を行った。この合成のために、流体プロセッサー積算(ＩＦＰ)キットは適切な前駆体とともにロードされ、表２にまとめられる。精製は、ＶａｒｉａｎのＨＰＬＣユニットにおいて行われた。ＨＰＬＣの注入ループの充填は、ＨＰＬＣユニットの安定窒素気流によってコントロールされた。両方の自動装置の組み立ては、表２にまとめられる。［１８Ｆ］−フルオライド水溶液(２．０ｍｌ、２９．６ＧＢｑ／８００ｍＣｉ)が、Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡに移された［Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡカートリッジは使用前に、５ｍｌの０．５Ｍの炭酸水素カリウム、５ｍｌの脱イオン水、および５ｍｌのアセトニトリルの順で前処理を行った］。この移動が完了すると、反応容器に溶出混合液を加えることによって(「Ｖ１」から)、［１８Ｆ］フルオライド水溶液をＱＭＡ Ｓｅｐ−Ｐａkから溶出させた。溶媒を窒素の穏やかな気流および真空下で蒸発させた。前駆体の溶液を(「Ｖ２」から)乾燥クリプタンド残留物に加え、この反応混合物を１２０℃で１０分間加熱した。次いで、３ｍｌの蒸留水を(「Ｖ４」から)反応容器中の粗製反応混合物に加え、混合物を、ローディングの終わりを制御する液体センサーを介して、セミ−分取ＨＰＬＣの５ｍｌサンプル注入ループに移した。混合物をセミ−分取ＨＰＬＣカラム(Ｌｕｎａ Ｃ１８(２)．２５０ｘ１０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ)にロードした。０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中の３５％アセトニトリルの混合液を、毎分４．６ｍｌの速度でカラムに通した。生成物をこのＨＰＬＣカラムから、１５ｍｌの蒸留水を含む希釈フラスコに回収し、全ての内容物を、ｔＣ１８ １グラムの固相抽出カートリッジに移した。３ｍｌのエタノールによって、このカートリッジから３５２ｍＣｉ(１２ＧＢｑ)の［１８Ｆ］−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンが溶出され、アルキンを含む適切な生体分子との「クリック」アジド−アルキン反応を利用した１８Ｆ標識生物学的製剤の生成に用いられうる。
Figure 2020048567
実施例１９：６８Ｇａを基にした抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンプローブの合成
６８Ｇａ−Ｅ０１−ＮＯＤＡＧＡの合成
［６８Ｇａ］−ガリウムクロリド／０.１Ｎ 塩酸溶液を、４分間周囲温度で、酢酸ナトリウム(ＮａＯＡｃ)(３２ｍｇ)を用いて中和して、得られる溶液を撹拌して、確実に全容量を適切に混和した。次いで、この溶液を、Ｅ０１-ＮＯＤＡＧＡ(１５μＬ, １.３ｍｇ／ｍＬ)溶液に加えて、粗製反応を、穏やかにピペッティングして、混合し、周囲温度で１５分間静置した。粗製反応混合物を、試料を重層する前に１xリン酸塩緩衝生理食塩緩衝液(ＰＢＳ, ｐＨ７.４)(２０ｍＬ)を用いて予め活性化されたＰＤ−１０脱塩カラムに移した。追加の１ＸＰＢＳ(１.５ｍＬ)を、カラムに加えて、その後更なる０.８ｍｌ １ＸＰＢＳ溶液を加えて、これらの画分を廃棄した。次いで、ＰＤ−１０カラムの１.４ｍＬ溶出後の［６８Ｇａ］−Ｅ０１−ＮＯＤＡＧＡを集めて、５.７８ｍＣｉ（２１４ＭＢｑ)を目的とする生成物として得た。クオリティーコントロールを、Agilent PLRP−S HPLC column サイズ:250 x 4.60 mm、8μm、280 nmおよび０.１％ギ酸/蒸留水およびアセトニトリルの移動相を用いる逆相ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。グラジエント方法を用いたが、この場合アセトニトリルのパーセントを、３０分間かけて１０％から４５％に直線的に増加させた。［６８Ｇａ］−Ｅ０１−ＮＯＤＡＧＡは、２２分にて、ＨＰＬＣクロマトグラム参照標準と共に共溶出した。放射性化学純度を、この方法を用いて測定すると９８％であった。［６８Ｇａ］−Ｅ０１−ＮＯＤＡＧＡは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム：GE Superdex 200 GL サイズ：10 x 300 mm, 280 nmを用いて、２０分間で参照物質と共に共溶出した。
Figure 2020048567
表３：配列表
Figure 2020048567
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等価物
当業者は、明細書に記述した特定の実施態様に関する多くの等価物を認識するか、または通常の実験を用いて達成することができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内に含まれ得ることを意図する。
本発明により提供するものは、対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療剤の経過をモニタリングする方法であって、前記方法は、
(ａ)最初の時点で、抗ＰＤ−Ｌ１アドネクチンを含んでいるイメージング剤を、その必要のある対象に投与し、対象の少なくとも一部分の画像を得て、腫瘍のサイズを決定する工程；
(ｂ)対象に抗腫瘍治療剤を投与する工程；および
(ｃ)前記イメージング剤を、１以上の後続する時点で対象に投与して、各時点で対象の少なくとも一部分の画像を得る工程；ここで、各時点での腫瘍の体積および位置が疾患の進行の指標であること、
を特徴とする。
本発明はさらに以下の具体的態様を含む：
［項１］
フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン(１０Ｆｎ３)を含むポリペプチドであって、ここで、
(a)該１０Ｆｎ３ドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含んでおり、
(b)該該ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、下記のアミノ酸配列:
(a) 配列番号：６、７および８の各々；
(b) 配列番号：２１、２２および２３の各々；
(c) 配列番号：３６、３７および３８の各々；
(d) 配列番号：５１、５２および５３の各々；
(e) 配列番号：６６、６７および６８の各々；
(f) 配列番号：８１、８２および８３の各々；または
(g) 配列番号：９７、９８および９９の各々、
を含んでおり、
(c)該ポリペプチドは、１０ｎＭ以下のＫＤにてＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、
ポリペプチド。
［項２］
該１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号：５、２０、３５、５０、６５、８０および９６からなる群から選択されるアミノ酸配列の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、項１に記載のポリペプチド。
［項３］
該１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号：９−１５、２４−３０、３９−４５、５４−６０、６９−７５、８４−９１および１００−１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、項２に記載のポリペプチド。
［項４］
該ポリペプチドが、ポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清イムノグロブリン結合タンパク質からなる群から選択される１以上の薬物動態的(ＰＫ)部分を含む、項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［項５］
項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする、核酸。
［項６］
該核酸が、配列番号：１６−１９、３１−３４、４６−４９、６１−６４、７６−７９、９２−９５および１０８−１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項５記載の核酸。
［項７］
項５または６記載の核酸を含む、ベクター。
［項８］
項５または６記載の核酸を含む、細胞。
［項９］
項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチドおよび検出可能な標識を含む、イメージング剤。
［項１０］
検出可能な標識が６４Ｃｕ、１２４Ｉ、７６／７７Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１１Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、３２Ｃｌ、３３Ｃｌ、３４Ｃｌ、６８Ｇａ、７４Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７８Ｂｒ、８９Ｚｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃまたは１５３Ｓｍからなる群から選択される放射性核種である、項９記載のイメージング剤。
［項１１］
検出可能な標識がＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＣＢ−ＤＯ２Ａ、３ｐ−Ｃ−ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、ＤＢＣＯ、ＤＩＢＯ、ＢＡＲＡＣ、ＤＩＭＡＣ、Ｏｘｏ−ＤＯ３Ａ、ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ−ＴＥ２Ｐ、ＭＭ−ＴＥ２Ａ、ＤＭ−ＴＥ２Ａ、ｄｉａｍｓａｒ、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ−ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ−ＤＴＰＡ、ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡ、ＤＡＴＡ、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡからなる群から選択されるコンジュゲート部分により前記ポリペプチドとコンジュゲートされる、項９または１０記載のイメージング剤。
［項１２］
該コンジュゲート部分が、ＮＯＤＡＧＡであり、該放射性核種が６４Ｃｕである、項１１記載のイメージング剤。
［項１３］
ポリペプチド、１８Ｆ−放射性標識された補欠分子族基および二官能性結合(ＢＦＣ)基を含む、項１０記載のイメージング剤であって、該イメージング剤が、以下の構造：
Figure 2020048567
(ここで、(a) １８Ｆは、Ｎ原子に対してオルト位であり、ｘは１〜８、２〜６、３〜５の整数または４であり；
(b) ＢＦＣ基は、(i)タンパク質上のアミン、カルボキシル、カルボニルまたはチオール官能基と共有結合を形成している反応基および(ii)ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)ｙスペーサーアーム(ここで、ｙは１〜８、２〜６、または４もしくは５の整数である)を含んでいるシクロオクチンであり；
(c) タンパク質は、項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチドである)
またはその医薬上許容される塩を有する、イメージング剤。
［項１４］
該シクロオクチンが、ジベンゾシクロオクチン(ＤＩＢＯ)、ビアリールアザシクロオクチノン(ＢＡＲＡＣ)、ジメトキシアザシクロオクチン(ＤＩＭＡＣ)およびジベンゾシクロオクチン(ＤＢＣＯ)からなる群から選択される、項１３記載のイメージング剤。
［項１５］
該ＢＦＣが、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ−エステル、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ−エステル、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−酸、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミンまたはＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドである、項１３記載のイメージング剤。
［項１６］
該イメージング剤が、下記構造：
Figure 2020048567
(ここで、Ｘが、配列番号：１３、２８、４３、５８、７３、８８および１０４のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドであり、ＢＦＣのマレイミド基がポリペプチドのシステイン残基上のチオール基に共有結合している)
を有する、項１３記載のイメージング剤。
［項１７］
該ポリペプチドが、配列番号：８８または配列番号：１０４に記載のアミノ酸配列を含む、項９〜１６いずれか１項に記載のイメージング剤。
［項１８］
項１〜４いずれか１項に記載のポリペプチドまたは項９〜１７いずれか１項に記載のイメージング剤、および許容できる担体、賦形剤または安定剤を含む医薬組成物。
［項１９］
対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍の存在の検出に用いるための項９〜１７いずれか１項に記載のイメージング剤であって、検出が対象の少なくとも一部分の放射性画像における該イメージング剤の存在または非存在を検出する工程を含み、
ここで、バックグラウンドを超えるイメージング剤の存在および位置がＰＤ−Ｌ１発現腫瘍の存在および位置の指標となる、イメージング剤。
［項２０］
対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療の経過のモニタリングに用いるための項９〜１７いずれか１項に記載のイメージング剤であって、モニタリングが
(ａ)対象の少なくとも一部分の画像から腫瘍のサイズを検出する工程；
(ｂ)その後、１以上の後続する時点における各時点の対象の少なくとも一部分の画像を得る工程を含み、
ここで、各時点での腫瘍の大きさおよび位置がＰＤ−Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療の経過の指標となる、イメージング剤。

Claims (20)

  1. フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン(１０Ｆｎ３)を含むポリペプチドであって、ここで、
    (a)該１０Ｆｎ３ドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含んでおり、
    (b)該該ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、下記のアミノ酸配列:
    (a) 配列番号：６、７および８の各々；
    (b) 配列番号：２１、２２および２３の各々；
    (c) 配列番号：３６、３７および３８の各々；
    (d) 配列番号：５１、５２および５３の各々；
    (e) 配列番号：６６、６７および６８の各々；
    (f) 配列番号：８１、８２および８３の各々；または
    (g) 配列番号：９７、９８および９９の各々、
    を含んでおり、
    (c)該ポリペプチドは、１０ｎＭ以下のＫＤにてＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、
    ポリペプチド。
  2. 該１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号：５、２０、３５、５０、６５、８０および９６からなる群から選択されるアミノ酸配列の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 該１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号：９−１５、２４−３０、３９−４５、５４−６０、６９−７５、８４−９１および１００−１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列の非ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域と、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. 該ポリペプチドが、ポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清イムノグロブリン結合タンパク質からなる群から選択される１以上の薬物動態的(ＰＫ)部分を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  5. 請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする、核酸。
  6. 該核酸が、配列番号：１６−１９、３１−３４、４６−４９、６１−６４、７６−７９、９２−９５および１０８−１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５記載の核酸。
  7. 請求項５または６記載の核酸を含む、ベクター。
  8. 請求項５または６記載の核酸を含む、細胞。
  9. 請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチドおよび検出可能な標識を含む、イメージング剤。
  10. 検出可能な標識が６４Ｃｕ、１２４Ｉ、７６／７７Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１１Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、３２Ｃｌ、３３Ｃｌ、３４Ｃｌ、６８Ｇａ、７４Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７８Ｂｒ、８９Ｚｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃまたは１５３Ｓｍからなる群から選択される放射性核種である、請求項９記載のイメージング剤。
  11. 検出可能な標識がＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＣＢ−ＤＯ２Ａ、３ｐ−Ｃ−ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、ＤＢＣＯ、ＤＩＢＯ、ＢＡＲＡＣ、ＤＩＭＡＣ、Ｏｘｏ−ＤＯ３Ａ、ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ２Ａ、ＣＢ−ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ−ＴＥ２Ｐ、ＭＭ−ＴＥ２Ａ、ＤＭ−ＴＥ２Ａ、ｄｉａｍｓａｒ、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ−ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ−ＤＴＰＡ、ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡ、ＤＡＴＡ、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡからなる群から選択されるコンジュゲート部分により前記ポリペプチドとコンジュゲートされる、請求項９または１０記載のイメージング剤。
  12. 該コンジュゲート部分が、ＮＯＤＡＧＡであり、該放射性核種が６４Ｃｕである、請求項１１記載のイメージング剤。
  13. ポリペプチド、１８Ｆ−放射性標識された補欠分子族基および二官能性結合(ＢＦＣ)基を含む、請求項１０記載のイメージング剤であって、該イメージング剤が、以下の構造：
    Figure 2020048567
    (ここで、(a) １８Ｆは、Ｎ原子に対してオルト位であり、ｘは１〜８、２〜６、３〜５の整数または４であり；
    (b) ＢＦＣ基は、(i)タンパク質上のアミン、カルボキシル、カルボニルまたはチオール官能基と共有結合を形成している反応基および(ii)ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)ｙスペーサーアーム(ここで、ｙは１〜８、２〜６、または４もしくは５の整数である)を含んでいるシクロオクチンであり；
    (c) タンパク質は、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチドである)
    またはその医薬上許容される塩を有する、イメージング剤。
  14. 該シクロオクチンが、ジベンゾシクロオクチン(ＤＩＢＯ)、ビアリールアザシクロオクチノン(ＢＡＲＡＣ)、ジメトキシアザシクロオクチン(ＤＩＭＡＣ)およびジベンゾシクロオクチン(ＤＢＣＯ)からなる群から選択される、請求項１３記載のイメージング剤。
  15. 該ＢＦＣが、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ−エステル、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ−エステル、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−酸、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミンまたはＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドである、請求項１３記載のイメージング剤。
  16. 該イメージング剤が、下記構造：
    Figure 2020048567
    (ここで、Ｘが、配列番号：１３、２８、４３、５８、７３、８８および１０４のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドであり、ＢＦＣのマレイミド基がポリペプチドのシステイン残基上のチオール基に共有結合している)
    を有する、請求項１３記載のイメージング剤。
  17. 該ポリペプチドが、配列番号：８８または配列番号：１０４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９〜１６いずれか１項に記載のイメージング剤。
  18. 請求項１〜４いずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項９〜１７いずれか１項に記載のイメージング剤、および許容できる担体、賦形剤または安定剤を含む医薬組成物。
  19. 対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍の存在の検出に用いるための請求項９〜１７いずれか１項に記載のイメージング剤であって、検出が対象の少なくとも一部分の放射性画像における該イメージング剤の存在または非存在を検出する工程を含み、
    ここで、バックグラウンドを超えるイメージング剤の存在および位置がＰＤ−Ｌ１発現腫瘍の存在および位置の指標となる、イメージング剤。
  20. 対象におけるＰＤ−Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療の経過のモニタリングに用いるための請求項９〜１７いずれか１項に記載のイメージング剤であって、モニタリングが
    (ａ)対象の少なくとも一部分の画像から腫瘍のサイズを検出する工程；
    (ｂ)その後、１以上の後続する時点における各時点の対象の少なくとも一部分の画像を得る工程を含み、
    ここで、各時点での腫瘍の大きさおよび位置がＰＤ−Ｌ１発現腫瘍に対する抗腫瘍治療の経過の指標となる、イメージング剤。
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