CN110225770B - 结合cd8a的纤连蛋白iii型结构域 - Google Patents

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Abstract

与CD8A特异性结合的纤连蛋白III型结构域(FN3)、能够编码CD8A特异性FN3结构域的相关多核苷酸、表达FN3结构域的细胞、和相关载体、以及可检测标记的FN3结构域可用于治疗和诊断应用。

Description

结合CD8A的纤连蛋白III型结构域
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且特此通过引用整体并入。于2017年12月5日创建的所述ASCII副本命名为JBI5112WOPCT_SL.txt且大小为266,978字节。
技术领域
本发明涉及与分化簇8a(CD8a)特异性结合的纤连蛋白III型(FN3)结构域。此类FN3结构域可用于例如医学成像、诊断和药物疗法。还提供了产生此类分子的方法和包含此类分子的诊断剂。
背景技术
快速发展的癌症免疫疗法领域最近有几种新的免疫疗法获FDA批准，目前有更多的疗法处于各种癌症的临床试验中。此外，细胞、小分子、基于抗体的免疫疗法及其组合正在进行临床前严格测试以用于临床翻译。动态肿瘤微环境和肿瘤异质性已成为临床前和临床研究中的重要课题(Hanahan D,Weinberg RA.Cell 2011；144:646–74；M antovani A,Allavena P,Sica A,Balkwill F.Nature 2008；454:436–44；Schreiber RD,Old LJ,SmythMJ.Science 2011；331:1565–70.)，但监测原发病灶和转移癌的免疫状态变化的能力有限。监测来自全血的淋巴细胞或来自异质性肿瘤的活组织检查的当前方法无法反映监测对治疗干预的免疫反应可能需要的动态和空间信息，其中许多信息引起了免疫细胞数量和定位的全身变化。因此，在实验性治疗期间可以非侵入性地监测全身和肿瘤内免疫细胞数量或定位的变化的分子成像方法具有增加对免疫治疗机制动力学的理解的能力，具有提供用于预测和/或评估临床免疫治疗反应的可翻译方法的潜力。
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的分析已经证明了肿瘤免疫微环境的重要性，并且细胞毒性CD8+ T细胞的存在可以预测乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和结直肠癌的总体存活率(综述见参考文献Pages F等人，Oncogene 2010；29:1093–102.和Gooden MJ等人，Br JCancer 2011；105:93–103)。随着改变肿瘤免疫微环境的免疫疗法最近在临床上的成功，所述免疫疗法包括T细胞受体(TCR)-或嵌合抗原受体转导的细胞毒性T细胞的过继细胞转移(ACT)(Johnson LA等人，Blood 2009；114:535–46；Rosenberg SA.Sci Transl Med 2012；4:127ps8.)，靶向CD137(4-1BB)和CD40的激动性抗体(Melero I等人，Clin Cancer Res2013；19:997–1008；Melero I等人，Nat Rev Cancer 2007；7:95–106；Vinay DS和KwonBS.Mol Cancer Ther 2012；11:1062–70.)，和检查点抑制剂CTLA-4、PD-1和PD-L1的抗体阻断(Callahan MK和Wolchok JD.J Leukoc Biol 2013；94:41–53；Shin DS和Ribas A.CurrOpin Immunol 2015；33C:23–35；Topalian SL,et al.Cancer Cell 2015；27:450–61.)，能够非侵入性地监测肿瘤对治疗的免疫反应已经变得至关重要。
发明内容
本发明包括结合CD8A的纤连蛋白III型(FN3)结构域。还描述了能够编码所提供的FN3结构域的相关多核苷酸，表达所提供的FN3结构域的细胞，以及相关载体。另外，描述了使用所提供的FN3结构域的方法。例如，本发明的FN3结构域可用于非侵入性地且定量地监测CD8+ T细胞的存在和丰度。
在一些实施方案中，本发明包括分离的FN3结构域，其中所述FN3结构域与包含SEQID NO:35的人CD8A结合。在其他实施方案中，CD8A特异性FN3结构域与人CD8A和食蟹猴CD8A结合。在其他实施方案中，CD8A特异性FN3结构域基于SEQ ID NO:1的Tencon序列。在另外的实施方案中，CD8A特异性FN3结构域基于SEQ ID NO:4的Tencon27序列。在一些实施方案中，白蛋白特异性FN3结构域分离自包含SEQ ID NO:2、3、5、6、7或8的序列的文库。在一些实施方案中，正如通过酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法所测量的，CD8A特异性FN3结构域不激活体外CD8+ T细胞。在一些实施方案中，正如通过表面等离振子体共振所测量的，CD8A特异性FN3结构域与人CD8A结合，亲和力(KD)介于约0.02至约6.6nM之间。在其他实施方案中，CD8A特异性FN3结构域在SEQ ID NO 79、81、83、89、122和68的残基位置54处具有半胱氨酸取代。在其他实施方案中，CD8A特异性FN3结构域包含SEQ ID NO:40-269的氨基酸序列。在其他实施方案中，CD8A特异性FN3结构域与可检测标记缀合。
除所描述的CD8A特异性FN3结构域之外，还提供了能够编码所描述的FN3结构域的多核苷酸序列。还提供了包含所描述的多核苷酸的载体，以及表达本文的CD8A特异性FN3结构域的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞(如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(如Sf7细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))。还提供了产生所描述的FN3结构域的方法。
本发明还包括使所描述的CD8A特异性FN3结构域与各种分子缀合或以其他方式缔合以用于诊断目的的方法。例如，Zr-89或I-124是用于产生能够检测CD8+ T细胞的存在的诊断剂的理想融合伴侣。因而，CD8A特异性FN3结构域在使用CD8A作为生物标志物的癌症诊断中具有实用性。
本发明的另一个实施方案是检测生物样品中表达CD8A的细胞的方法，其包括用包含所描述的CD8A特异性FN3结构域的诊断剂处理生物样品。在实施例中提供了这些方法。
包括所公开的CD8A特异性FN3结构域的试剂盒在本发明的范围内。所述试剂盒可用于实施使用本文提供的CD8A特异性FN3结构域的方法，或本领域技术人员已知的其他方法。在一些实施方案中，所描述的试剂盒可包括本文所描述的FN3结构域和用于检测生物样品中人CD8A的存在的试剂。所描述的试剂盒可包括一种或多种本文所描述的FN3结构域和用于在不使用时容纳FN3结构域的容器，固定在固体支持物上的使用FN3结构域的说明书，和/或可检测标记形式的FN3结构域，如本文所述。
附图说明
图1A-1D。在24小时INFγEliSpot测定中CD8S365-DFO缀合物不会重新激活T细胞并且不会调节T细胞的抗原依赖性活化。在CMV肽不存在(A)或存在(B)的情况下，用365-DFO处理CMV反应性T细胞。还在M1肽不存在(C)或存在(D)的情况下测试了第二M1反应性供体。
图2A和2B。在6天INFγMSD测定中CD8S365-DFO缀合物不会重新激活T细胞并且不会调节T细胞的抗原依赖性活化。在CMV肽不存在(A)或存在(B)的情况下，用365-DFO处理CMV反应性T细胞。
图3。[124I]-IPEM的粗制备型HPLC迹线。使用Waters 1525二元HPLC泵、Waters2489双波长UV/可见光检测器(λ＝214和254nm)、Bioscan Flow Count无线电探测器(B-FC-2000)和Atlantis T3、
Figure BDA0002117739950000041
5μm、150×4.6mm HPLC柱进行制备型HPLC。使用的洗脱曲线如下：溶剂A＝H2O(0.1％AcOH(v/v))，溶剂B＝MeCN(0.1％AcOH(v/v))，流速＝1.5mLmin-1；初始＝80％A，20分钟＝0％A(线性梯度)。在UV-vis迹线上254nm(上图)和214nm(中间图)的多个小分子吸光度表明在粗反应混合物中存在杂质和副产物。放射性迹线(下图)也显示出由放射性标记的杂质所引起的预期基线峰值。
图4。[124I]-IPEM的分析型HPLC迹线。使用Waters 1525二元HPLC泵、Waters 2707自动取样器、Waters 2489双波长UV/可见光检测器(λ＝214和280nm)、Bioscan Flow Count无线电探测器(B-FC-2000)和Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18
Figure BDA0002117739950000051
150×4.6mm HPLC柱进行分析型HPLC。使用的洗脱曲线如下：溶剂A＝H2O(0.1％TFA(v/v))，溶剂B＝MeCN(0.1％TFA(v/v))，流速＝1mLmin-1；初始＝90％A，15分钟＝0％A(线性梯度)。分析纯的[I-124]IPEM显示单个放射性峰值(下图)，其具有平滑的基线，证实成功纯化。请注意，[I-124]IPEM是一种有机小分子；因此，在280nm(上图)和214nm(中间图)处没有吸收。
图5。纯化[124I]-IPEM CD8S365的放射性TLC。在Bioscan AR-2000放射性TLC成像扫描仪上对iTLC-SG板(Agilent，目录号#SGI0001)进行读数。将放射性TLC板(图3)用1μL的NaI(0.1M)共同点样，并用柠檬酸(0.5mM，pH＝5)作为洗脱剂显影。原点＝20mm，溶剂前沿＝100mm。通过将96mg柠檬酸(Spectrum目录号#CI131)溶解在25mL的Trace Select H2O中制备放射性TLC洗脱剂，然后添加Na2CO3(245μL，2M)；用试纸条检查pH(pH＝5)。
图6。纯化[124I]-IPEM CD8S 365的分析型HPLC迹线。使用Waters1525二元HPLC泵、Waters 2707自动取样器、Waters 2489双波长UV/可见光检测器(λ＝214和280nm)、BioscanFlow Count无线电探测器(B-FC-2000)和Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18
Figure BDA0002117739950000052
150×4.6mm HPLC柱进行分析型HPLC。使用的洗脱曲线如下：溶剂A＝H2O(0.1％TFA(v/v))，溶剂B＝MeCN(0.1％TFA(v/v))，流速＝1mLmin-1；初始＝90％A，15分钟＝0％A(线性梯度)。280nm处的生物分子(CD8S)吸光度(上图)和214nm处的小分子(I124-IPEM)吸光度(中间图)证实缀合反应成功。UV和放射性迹线(下图)指示分析纯的样品。
图7。IPEM CD8S365的MALDI-MS(理论分子量＝10786.12)。在BiointerfacesInstitute使用UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF以正离子模式(线性检测器)进行MALDI-MS分析。在TA30溶剂(30:70(v/v)MeCN:0.1％TFA水溶液)中制备饱和芥子酸(sinapinicacid)溶液。将样品(c＝0.397mgmL-1)与基质溶液以1:1的比率混合，并将1μL点样在板上。使用蛋白质溶液作为外标。
图8。[124I]-IPEM CD8S365与冷标准品的共注射。使用Waters1525二元HPLC泵、Waters 2707自动取样器、Waters 2489双波长UV/可见光检测器(λ＝214和280nm)、BioscanFlow Count无线电探测器(B-FC-2000)和Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18
Figure BDA0002117739950000061
150×4.6mm HPLC柱进行分析型HPLC。使用的洗脱曲线如下：溶剂A＝H2O(0.1％TFA(v/v))，溶剂B＝MeCN(0.1％TFA(v/v))，流速＝1mLmin-1；初始＝90％A，15分钟＝0％A(线性梯度)。与冷样品共注射导致UV峰完全重叠(上图和中间图)，证实了产物的分子特性(即除了碘-124置换碘以外,冷的和放射性标记的缀合物是相同的)
图9。在注射后2小时拍摄的显示经I-124放射性标记的CD8S365-IPEM5的代表性PET图像。该图像是最大密度投影(前-后)，脾脏以十字线为中心。脾脏下方的器官是肾脏并且该图像定向为在顶部显示头部。甲状腺中的摄取是蛋白质有些脱碘的证据。
图10。非人灵长类动物中对于经Zr-89或I-124标记的每个抗CD8A FN3结构域的血液放射性的时间-活性曲线。
图11A和11B。NHP中对于经Zr-89或I-124标记的每个centyrin的器官放射性的时间-活性曲线。图11A包括肾脏、肝脏和脾脏，而图11B集中在脾脏上。由于技术问题，[124I]-IPEM CD8S365的24小时时间点缺失。在I-124数据中几乎不存在肾脏中由于同位素残留所引起的Zr-89的高摄取量。
图12A-12C。确认到第3天取自非人灵长类动物的血液中CD8 T细胞消耗(12A)。还显示了CD4(12B)和CD3T细胞(12C)的变化。
图13。在CD8消耗型动物中注射后2小时拍摄的显示经I-124放射性标记的365抗CD8A FN3结构域的代表性PET图像。该图像是最大密度投影(前-后)。这将与图9中的非消耗型动物进行比较，其中脾脏在肾脏上方清晰可见。
图14。施用[124I]-IPEM CD8S365后，对于消耗型和非消耗型动物而言，食蟹猴的血液放射性的时间-活性曲线。
图15A和15B。对于消耗型和非消耗型动物而言食蟹猴中器官放射性的时间-活性曲线。15A包括肾脏、肝脏和脾脏，而15B集中在脾脏上。
图16。在注射后3小时拍摄的两只相同处理的小鼠的代表性PET图像，其显示经I-124放射性标记的CD8S365-IPEM。该图像是覆盖在CT扫描上的3D最大密度投影。用箭头指示肿瘤(由HEK-293-luc转染以过-表达huCD8+而形成)和其他器官。甲状腺中的摄取是蛋白质有些脱碘的证据。
图17。携带HEK-293-luc CD8+或HEK-293亲代肿瘤的小鼠的血液放射性的时间-活性曲线。
图18。携带HEK-293-luc CD8+或HEK-293亲代肿瘤的小鼠的肿瘤放射性的时间-活性曲线。
图19。在过表达HEK293CD8的细胞中随植入细胞数量而变化的I-124标记的CD8S365的摄取量。
具体实施方式
定义
在整个说明书和权利要求书中使用与说明书的各方面有关的各种术语。除非另有说明，否则将为此类术语给予本领域中的普通含义。其他具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式解释。
如说明书和所附权利要求书中所用，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。
如本文所用，当提及诸如量、时距等可测量值时，术语“约”意在涵盖与指定值相差达±10％的变化，因为此类变化适于执行所公开的方法。除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、性质(如分子量)、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均受术语“约”修饰。因此，除非指出相反，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的所需性质而变化。至少，并不是试图将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数位的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实例中列出的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值固有地含有由其各自的试验测量中存在的标准偏差所必然引起的某些误差。
“分离的”意指生物组分(如核酸、肽或蛋白质)已基本上与该组分天然存在的生物体的其他生物组分，即其他染色体和染色体外的DNA和RNA以及蛋白质分开、远离其产生或从中纯化。因此，已经“分离”的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可以是组合物的一部分，并且如果此类组合物不是核酸、肽或蛋白质的天然环境的一部分，则仍然可以分离。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。如本文所用，“分离的”FN3结构域意图是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他FN3结构域的FN3结构域(例如，与人血清白蛋白特异性结合的分离的FN3结构域基本上不含特异性结合除人血清白蛋白以外的抗原的FN3结构域)。然而，与人血清白蛋白的表位、同种型或变体特异性结合的分离的FN3结构域可以与例如来自其他物种的其他相关抗原(如血清白蛋白物种同源物)具有交叉反应性。
如本文所用的术语“纤连蛋白III型(FN3)结构域”(FN3结构域)是指蛋白质中经常出现的结构域，所述蛋白质包括纤连蛋白、肌腱蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(Bork和Doolittle,Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994,1992；Meinke等人，JBacteriol 175:1910-1918,1993；Watanabe等人，J Biol Chem 265:15659-15665,1990)。示例性的FN3结构域是存在于人肌腱蛋白C中的15个不同的FN3结构域，存在于人纤连蛋白(FN)中的15个不同的FN3结构域，和如例如美国专利第8,278,419号中所述的非天然合成FN3结构域。各个FN3结构域用结构域编号和蛋白质名称表示，例如，肌腱蛋白的第3个FN3结构域(TN3)，或纤连蛋白的第10个FN3结构域(FN10)。
如本文所用，“Centyrin”是指基于人肌腱蛋白C中存在的15个不同的FN3结构域的共有序列的FN3结构域。
术语“捕获剂”是指与特定类型的细胞结合并且能够将该细胞与其他细胞分离的物质。捕获剂的实例包括但不限于磁珠、铁磁流体、包封试剂等。
术语“生物样品”是指血液、组织、骨髓、痰等。
术语“诊断试剂”是指可用于分析生物样品的任何物质，无论该物质是作为单一物质配销还是与诊断试剂盒中的其他物质组合配销。
如本文所用的术语“取代”或“取代的”或“突变”或“突变的”是指改变、缺失或插入多肽或多核苷酸序列中的一个或多个氨基酸或核苷酸以产生该序列的变体。
如本文所用的术语“随机化”或“随机化的”或“多样化的”或“多样化”是指在多核苷酸或多肽序列中产生至少一个取代、插入或缺失。
如本文所用的“变体”是指通过一种或多种修饰(例如取代、插入或缺失)与参考多肽或参考多核苷酸不同的多肽或多核苷酸。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性的结合”是指本发明的FN3结构域以约1x10-6M或更小，例如约1x10-7M或更小，约1x10-8M或更小，约1x10-9M或更小，约1x10-10M或更小，约1x10-11M或更小，约1x10-12M或更小，或约1x10-13M或更小的解离常数(KD)与预定抗原结合的能力。通常，本发明的FN3结构域与预定抗原(即人CD8A)结合，正如使用例如Proteon仪器(BioRad)通过表面等离子体共振所测量的，其KD比其对非特异性抗原(例如BSA或酪蛋白)的KD小至少10倍。然而，与人CD8A特异性结合的本发明的分离的FN3结构域可以与其他相关抗原，例如与来自其他物种(直系同源物)，如食蟹猴(Macaca Fascicularis)或黑猩猩(Pan troglodytes)的相同预定抗原具有交叉反应性。
术语“文库”是指变体的集合。文库可以由多肽或多核苷酸变体组成。
如本文所用，术语“CD8A”或“CD8”具体包括人CD8α蛋白，例如，如NCBI参考序列：NP_001139345.1、NP_0011759.3和NP_741969.1中所述。CD8A在科学文献中也称为CD8a分子、MAL、p32、Leu2、T细胞表面糖蛋白CD8α链、CD8抗原、α多肽(p32)、Leu2 T淋巴细胞抗原、OKT8 T细胞抗原、T细胞抗原Leu2、T淋巴细胞分化抗原T8/Leu-2和T8 T细胞抗原。
如本文所用的“Tencon”是指合成的纤连蛋白III型(FN3)结构域，其具有SEQ IDNO:1所示的序列并且在美国专利公开号US2010/0216708中有描述。
术语“载体”意指能够在生物系统内复制或者可以在此类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有元件，如复制起点、多腺苷酸化信号或选择标志物，其起到促进这些多核苷酸在生物系统中复制或保持的功能。此类生物系统的实例可包括细胞、病毒、动物、植物和利用能够复制载体的生物组分的重构生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA或RNA分子或这些的杂合体。
术语“表达载体”意指可用于生物系统或重构生物系统中以指导由该表达载体中存在的多核苷酸序列编码的多肽的翻译的载体。
术语“多核苷酸”意指包含通过糖-磷酸骨架或其他等效共价化学方式共价连接的核苷酸链的分子。双链和单链DNA和RNA是多核苷酸的典型实例。
术语“多肽”或“蛋白质”意指包含通过肽键连接形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。小于约50个氨基酸的小多肽可称为“肽”。
如本文所用的术语“与......组合”意指两种或多种治疗剂可以混合物形式一起施用给受试者，作为单一药剂同时施用给受试者或作为单一药剂按任何顺序依次施用给受试者。
物质组成
本发明提供结合人CD8A的FN3结构域和与可检测标记缀合的结合CD8A的FN3结构域。本发明提供编码本发明的FN3结构域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞，以及制备和使用它们的方法。
CD8A结合分子
本发明提供与CD8A特异性结合的纤连蛋白III型(FN3)结构域，其任选与可检测标记缀合。这些分子可广泛用于临床前应用和使用CD8A作为生物标志物的癌症诊断中。本发明提供编码本发明的FN3结构域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞，以及制备和使用它们的方法。
本发明的FN3结构域以高亲和力结合CD8A并且可以定位表达CD8的细胞，从而提供将诊断试剂递送到肿瘤微环境中的有效方式。
本发明的一个实施方案是分离的FN3结构域，其与包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的人CD8A特异性结合。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，本发明的FN3结构域与具有SEQ ID NO:271的氨基酸序列的食蟹猴CD8A交叉反应。
本发明的FN3结构域可结合人、食蟹猴和/或黑猩猩CD8A，正如本领域技术人员所实践的那样，通过表面等离子体共振测定，其解离常数(KD)小于约1x10-7M，例如小于约1x10-8M，小于约1x10-9M，小于约1x10-10M，小于约1x10-11M，小于约1x10-12M，或小于约1x10- 13M。如果在不同条件(例如，渗透压、pH)下测量，则测得的特定FN3结构域-抗原相互作用的亲和力可以不同。因此，用蛋白质支架和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液(如本文描述的缓冲液)进行亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量。
在一些实施方案中，结合CD8A的FN3结构域包含与分子的N-端连接的起始子甲硫氨酸(Met)。
在一些实施方案中，结合CD8A的FN3结构域包含与FN3结构域连接的半胱氨酸(Cys)。
添加N-端Met和/或Cys可促进第二分子的表达和/或缀合。
本发明的另一个实施方案是特异性结合人CD8A的分离的FN3结构域，并且其中CD8A特异性FN3结构域不激活体外CD8+ T细胞。可以使用标准方法测量CD8+ T细胞活化。例如，可以使用酶联免疫斑点(ELISPOT)测定。ELISPOT测定采用夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)技术。将干扰素-γ抗体预先涂覆到PVDF(聚偏二氟乙烯)背衬微孔板上。将适当刺激的细胞(细胞+肽、FN3结构域等)移液到孔中，并将微孔板置于加湿的37℃CO2培养箱中保持指定时间段。在该孵育期间，紧邻分泌细胞的固定化干扰素-γ抗体结合分泌的干扰素γ。洗去任何细胞和未结合的物质后，向孔中添加第二生物素化干扰素-γ抗体。洗涤去除任何未结合的生物素化抗体后，添加与链霉抗生物素蛋白偶联的碱性磷酸酶。随后通过洗涤去除未结合的酶，并添加底物溶液(BCIP/NBT)。形成蓝黑色沉淀并在干扰素-γ定位位点处显示为斑点，每个单独的斑点代表单独的干扰素γ-分泌细胞。斑点可以用自动化ELISpot读数器系统计数或使用立体显微镜手动计数。如实施例中所述，当以1μM浓度测试时，本发明的结合CD8A的分离FN3结构域不激活体外CD8+ T细胞。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，分离的FN3结构域包含SEQ ID NO:40-269的氨基酸序列。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，CD8A特异性FN3结构域在SEQ ID NO 79、81、83、89、122和68的残基位置54处具有半胱氨酸取代。
导致将半胱氨酸引入蛋白质序列中的取代可用于使用标准化学方式将小分子如细胞毒性剂、可检测标记、半衰期延长分子、螯合剂、聚乙二醇和/或核酸化学缀合至FN3结构域。
在一些实施方案中，特异性结合人CD8A的FN3结构域与SEQ ID NO:229-234的FN3结构域竞争结合人CD8A。可以使用熟知的体外方法来评价FN3结构域与参考分子结合人CD8A的竞争。在示例性方法中，可以将重组表达人CD8A的HEK细胞与未标记的参考分子在4℃下孵育15分钟，然后与过量的荧光标记的试验FN3结构域在4℃下孵育45分钟。在PBS/BSA中洗涤后，可以使用标准方法通过流式细胞术测量荧光。在另一种示例性方法中，可以将人CD8A的细胞外部分涂覆在ELISA板的表面上。可以添加过量未标记的参考分子，保持约15分钟，随后可以添加生物素化试验FN3结构域。在PBS/Tween中洗涤后，可以使用辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的链霉抗生物素蛋白检测试验生物素化FN3结构域的结合，并使用标准方法检测信号。显而易见的是，在竞争测定中，参考分子可以标记而试验FN3结构域未标记。当参考分子抑制试验FN3结构域的结合时，或试验FN3结构域抑制参考分子的结合20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％时，试验FN3结构域可与参考分子竞争。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD8A的分离的FN3结构域与螯合剂缀合,螯合剂可与放射性金属结合并且可用作成像剂以评价肿瘤分布，对肿瘤内CD8-T细胞的存在的诊断和/或癌症治疗的功效。
在一些实施方案中，CD8A特异性FN3结构域通过肾和/或肝清除从血液中去除。
从基于Tencon序列的文库中分离结合CD8A的FN3结构域
Tencon(SEQ ID NO:1)是非天然存在的纤连蛋白III型(FN3)结构域，其由来自人肌腱蛋白-C的15个FN3结构域的共有序列设计而成(Jacobs等人，Protein Engineering,Design,and Selection,25:107-117,2012；美国专利公开号2010/0216708)。Tencon的晶体结构显示六个表面暴露的环，其连接七条β-链，这是FN3结构域的特征，所述β-链称为A、B、C、D、E、F和G，并且所述环称为AB、BC、CD、DE、EF和FG环(Bork和Doolittle,Proc Natl AcadSci USA 89:8990-8992,1992；美国专利第6,673,901号)。这些环或每个环内的选定残基可以随机化，以便构建可以用于选择结合CD8A的新型分子的纤连蛋白III型(FN3)结构域的文库。表1示出了Tencon中每个环和β-链的位置和序列(SEQ ID NO:1)。
因此基于Tencon序列设计的文库可以具有随机化的FG环，或随机化的BC和FG环，例如如下所述的文库TCL1或TCL2。Tencon BC环长度为7个氨基酸，因此在BC环处多样化并基于Tencon序列设计的文库中,1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可以随机化。Tencon FG环长度为7个氨基酸，因此在FG环处多样化并基于Tencon序列设计的文库中,1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可以随机化。Tencon文库中环的进一步多样性可以通过环上残基的插入和/或缺失来实现。例如，FG和/或BC环可延长1-22个氨基酸，或减少1-3个氨基酸。Tencon中的FG环长度为7个氨基酸，而抗体重链中的相应环范围为4-28个残基。为了提供最大的多样性，FG环可以在序列以及长度上多样化以与4-28个残基的抗体CDR3长度范围相对应。例如，FG环可以通过使该环延长额外的1、2、3、4或5个氨基酸而在长度上进一步多样化。
基于Tencon序列设计的文库也可以具有随机化的替代表面，其在FN3结构域的一侧形成并且包含两条或更多条β链，以及至少一个环。一种此类替代表面由C和Fβ-链中的氨基酸以及CD和FG环形成(C-CD-F-FG表面)。基于Tencon替代C-CD-F-FG表面的文库设计在美国专利公开号US2013/0226834中有描述。基于Tencon序列设计的文库还包括基于Tencon变体设计的文库，所述Tencon变体例如在残基位置11、14、17、37、46、73或86处具有取代的Tencon变体(残基编号对应于SEQ ID NO:1)，以及显示出热稳定性提高的变体。示例性Tencon变体在美国专利公开号2011/0274623中有描述并且包括与SEQ ID NO:1的Tencon相比，具有取代E11R、L17A、N46V和E86I的Tencon27(SEQ ID NO:4)。
表1.Tencon拓扑
Figure BDA0002117739950000151
Figure BDA0002117739950000161
基于Tencon和其他FN3序列的文库可以使用随机或限定的一组氨基酸在所选残基位置随机化。例如，文库中具有随机取代的变体可以使用编码全部20种天然存在的氨基酸的NNK密码子产生。在其他多样化方案中，DVK密码子可用于编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。或者，NNS密码子可用于产生全部20种氨基酸残基并同时降低终止密码子的频率。在有待多样化的位置具有偏态氨基酸分布的FN3结构域文库可以例如使用
Figure BDA0002117739950000162
技术(http:_//www_sloning_com)合成。该技术使用预先制备的双链三联体文库，其作为足以用于数千个基因合成过程的通用构造块。三联体文库代表构造任何所需DNA分子所必需的所有可能的序列组合。密码子名称是根据熟知的IUB代码。
本发明的特异性结合人CD8A的FN3结构域可以通过以下方式分离：使用顺式展示以将编码支架蛋白的DNA片段连接到编码RepA的DNA片段以产生在体外翻译后形成的蛋白质-DNA复合物库而产生FN3文库如Tencon文库，其中每种蛋白质与编码它的DNA稳定缔合(美国专利第7,842,476号；Odegrip等人，Proc Natl Acad Sci U S A 101,2806-2810,2004)，并通过本领域已知的和实施例中描述的任何方法测定文库与CD8A的特异性结合。可以使用的示例性熟知方法是ELISA、夹心免疫测定，以及竞争性和非竞争性测定(参见，例如，Ausubel等人编辑，1994,Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，JohnWiley&Sons,Inc.,New York)。进一步表征鉴定的特异性结合CD8A的FN3结构域对CD8A活性、内化、稳定性和其他所需特征的抑制。
本发明的特异性结合人CD8A的FN3结构域可以通过以下方式产生：使用任何FN3结构域作为模板产生文库并使用其中提供的方法筛选该文库中特异性结合人CD8A的分子。可以使用的示例性FN3结构域是肌腱蛋白C的第3个FN3结构域(TN3)(SEQ ID NO:145)、Fibcon(SEQ ID NO:146)和纤连蛋白的第10个FN3结构域(FN10)(SEQ ID NO:147)。使用标准的克隆和表达技术将文库克隆到载体中或合成文库的双链cDNA盒，以使文库在体外表达或翻译。例如，可以使用核糖体展示(Hanes和Pluckthun，Proc Natl Acad Sci USA,94,4937-4942,1997)、mRNA展示(Roberts和Szostak，Proc Natl Acad Sci USA,94,12297-12302,1997)或其他无细胞系统(美国专利第5,643,768号)。FN3结构域变体的文库可以表达为在表面(例如任何合适噬菌体的表面)上展示的融合蛋白。用于在噬菌体表面上展示融合多肽的方法是熟知的(美国专利公开号2011/0118144；国际专利公开号WO2009/085462；美国专利第6,969,108号；美国专利第6,172,197号；美国专利第5,223,409号；美国专利第6,582,915号；美国专利第6,472,147号)。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，特异性结合人CD8A的FN3结构域基于SEQID NO:1的Tencon序列或SEQ ID NO:4的Tencon27序列，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4任选地在残基位置11、14、17、37、46、73和/或86处具有取代。
可以修饰本发明的特异性结合人CD8A的FN3结构域以改善其性质，如改善热稳定性及热折叠和解折叠的可逆性。已经应用了几种方法来增加蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于和高度相似的热稳定序列的比较的合理设计，稳定二硫键的设计，增加α-螺旋倾向的突变，盐桥的工程改造，蛋白质表面电荷的改变，定向进化和共有序列的组成(Lehmann和Wyss,Curr Opin Biotechnol,12,371-375,2001)。高的热稳定性可以增加所表达的蛋白质的产率，改善溶解度或活性，降低免疫原性，并最小化制造中对冷链的需要。可以取代以改善Tencon(SEQ ID NO:1)的热稳定性的残基是残基位置11、14、17、37、46、73或86，并且在美国专利公开号2011/0274623中有描述。对应于这些残基的取代可以并入到本发明的含有FN3结构域的分子中。
蛋白质稳定性和蛋白质不稳定性的测量可以视为蛋白质完整性的相同或不同方面。蛋白质对由热、紫外线或电离辐射，环境渗透压和pH的变化(如果在液体溶液中)，小孔径过滤所施加的机械剪切力，紫外线辐射、电离辐射(例如γ辐射)，化学或热脱水，或任何其他可导致蛋白质结构破坏的作用或力所引起的变性敏感或“不稳定”。可以使用标准方法测定分子的稳定性。例如，分子的稳定性可以通过使用标准方法测量热解链(“Tm”)温度来测定，热解链温度是按摄氏度(℃)计的一半分子解折叠时的温度。通常，Tm越高，分子越稳定。除了热量之外，化学环境也会改变蛋白质保持特定三维结构的能力。
在一个实施方案中，通过Tm的增加测量，本发明的特异性结合人CD8A的FN3结构域可以表现出与工程改造之前的相同结构域相比稳定性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。
化学变性同样可以通过各种方法测量。化学变性剂包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素、丙酮、有机溶剂(DMF、苯、乙腈)、盐(硫酸铵、溴化锂、氯化锂、溴化钠、氯化钙、氯化钠)；还原剂(例如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、二硝基硫代苯和氢化物，如硼氢化钠)、非离子型和离子型洗涤剂、酸(例如盐酸(HCl)、乙酸(CH3COOH)、卤代乙酸)、疏水性分子(例如磷脂)和靶向变性剂。变性程度的定量可以依赖于功能特性(如结合靶分子的能力)的丧失，或者依赖于生理化学特性，如聚集倾向，暴露先前溶剂难以接近的残基，或破坏或形成二硫键。
本发明的FN3结构域可以作为单体、二聚体或多聚体产生，例如，作为增加效价并因此增加靶分子结合的亲合力的手段，或产生同时结合两种或更多种不同靶分子的双特异性或多特异性支架的手段。二聚体和多聚体可以通过连接单特异性、双特异性或多特异性蛋白质支架而产生，例如通过包含氨基酸接头，例如含有聚甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸，或丙氨酸和脯氨酸的接头。示例性接头包括(GS)2(SEQ ID NO:148)、(GGGS)2(SEQ ID NO:149)、(GGGGS)5(SEQ ID NO:150)、(AP)2(SEQ ID NO:151)、(AP)5(SEQ ID NO:152)、(AP)10(SEQ IDNO:153)、(AP)20(SEQ ID NO:154)和A(EAAAK)5AAA(SEQ ID NO:142)。二聚体和多聚体可以在N至C方向上彼此连接。使用天然存在的肽接头以及人工肽接头将多肽连接成新型连接融合多肽在文献中是熟知的(Hallewell等人，J Biol Chem 264,5260-5268,1989；Alfthan等人，Protein Eng.8,725-731,1995；Robinson和Sauer,Biochemistry 35,109-116,1996；美国专利第5,856,456号)。
诊断剂
根据本发明，本发明的CD8A特异性FN3结构域可包含可检测标记。在一个实施方案中，可检测标记可以与缀合至FN3结构域的螯合剂复合。在另一个实施方案中，可检测标记可以与螯合剂复合，所述螯合剂与缀合至FN3结构域的接头缀合。在另一个实施方案中，可检测标记可以与缀合至FN3结构域的接头偶联。在另一个实施方案中，可检测标记可通过该标记与第二分子特异性结合的能力而间接连接到本发明的肽上。这类间接连接的标记的一个实例是可以被第二分子即链霉抗生物素蛋白特异性结合的生物素标记。单标记、双标记或多标记可以是有利的。如本文所用，“可检测标记”是在与本发明的FN3结构域连接时使FN3结构域可检测的任何类型的标记。可检测标记也可以是对细胞有毒的或具有细胞毒性。通常，可检测标记可包括发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光团、荧光淬灭剂、有色分子、放射性同位素、放射性核素、cintillant、质量标记如金属原子(用于通过质量变化进行检测)、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、蛋白质A、蛋白质G、抗体或其片段、Grb2、聚组氨酸、Ni2+、Flag标签、myc标签、重金属、酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶、电子供体/受体、吖啶酯和比色底物。在一个具体实施方案中，可检测标记是放射性核素。本领域技术人员将容易认识到以上未提及的可用于本发明的操作中的其他有用标记。
可检测标记发出可通过信号转换机器检测的信号。在一些情况下，可检测标记可以自发地发出信号，例如当可检测标记是放射性核素时。在其他情况下，可检测标记由于受外场刺激而发出信号，例如当可检测标记是弛豫金属时。信号的实例包括但不限于γ射线、X射线、可见光、红外能和无线电波。信号转换机器的实例包括但不限于伽马相机，包括SPECT/CT设备、PET扫描仪、荧光计和磁共振成像(MRI)机器。因而，可检测标记包括可以使用磁共振成像、闪烁成像、超声或荧光检测的标记。
合适的荧光团包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素氨基硫脲、若丹明、德克萨斯红(Texas Red)、CyDyes(例如Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluor(例如Alexa488、Alexa555、Alexa594；Alexa647)、近红外(NIR)(700-900nm)荧光染料，以及羰花青和氨基苯乙烯染料。可以通过使用本领域熟知的技术用荧光团标记药剂来标记本发明的FN3结构域用于荧光检测(参见，例如，Lohse等人，Bioconj Chem 8:503-509(1997))。例如，许多已知的染料能够与NH2-端氨基酸残基偶联。或者，荧光染料如荧光素可以与肽接头的赖氨酸残基结合。
放射性核素可以是发射γ的放射性核素、发射俄歇的放射性核素、发射β的放射性核素、发射α的放射性核素或发射正电子的放射性核素。放射性核素可以是可检测标记和/或细胞毒性剂。合适的放射性核素的非限制性实例可包括碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、氟脱氧葡萄糖-18、磷-32、钪-47、铜-64、65和67、镓-67和68、溴-75、77和80m、铷-82、锶-89、锆-89、钇-86和90、钌-95、97、103和105、铼-99m、101、105、186和188、锝-99m、铑-105、汞-107、钯-109、铟-111、银-111、铟-113m、镧系元素-114m、锡-117m、碲-121m、122m和125m、碘-122、123、124、125、126、131和133、镨-142、钷-149、钐-153、钆-159、铥-165、167和168、镝-165、钬-166、镥-177、铼-186和188、铱-192、铂-193和195m、金-199、铊-201、钛-201、砹-21 1、铋-212和213、铅-212、镭-223、锕-225及由其衍生的氮化物或氧化物形式。在一个具体实施方案中，放射性核素选自铜-64、锆-89、钇-90、铟-111和镥-177。在另一具体实施方案中，放射性核素选自钇-90、铟-111和镥-177。在一个示例性实施方案中，放射性核素是锆-89。
多种金属原子可用作可检测标记。金属原子通常可选自由原子序数为20或更大的金属组成的金属原子族。例如，金属原子可以是钙原子、钪原子、钛原子、钒原子、铬原子、锰原子、铁原子、钴原子、镍原子、铜原子、锌原子、镓原子、锗原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、铷原子、锶原子、钇原子、锆原子、铌原子、钼原子、锝原子、钌原子、铑原子、钯原子、银原子、镉原子、铟原子、锡原子、锑原子、碲原子、碘原子、氙原子、铯原子、钡原子、镧原子、铪原子、钽原子、钨原子、铼原子、锇原子、铱原子、铂原子、金原子、汞原子、铊原子、铅原子、铋原子、钫原子、镭原子、锕原子、铈原子、镨原子、钕原子、钷原子、钐原子、铕原子、钆原子、铽原子、镝原子、钬原子、铒原子、铥原子、镱原子、镥原子、钍原子、镤原子、铀原子、镎原子、钚原子、镅原子、锔原子、锫原子、锎原子、锿原子、镄原子、钔原子、锘原子或铹原子。在一些实施方案中，金属原子可选自包含原子序数大于20的碱金属的族。在其他实施方案中，金属原子可选自包含原子序数大于20的碱土金属的族。在一个实施方案中，金属原子可以选自包含镧系元素的金属的族。在另一个实施方案中，金属原子可以选自包含锕系元素的金属的族。在另一个实施方案中，金属原子可以选自包含过渡金属的金属的族。在另一个实施方案中，金属原子可以选自包含贫金属的金属的族。在其他实施方案中，金属原子可以选自包含金原子、铋原子、钽原子和钆原子的族。在优选实施方案中，金属原子可以选自包含原子序数为53(即碘)至83(即铋)的金属的族。在替代实施方案中，金属原子可以是适于磁共振成像的原子。在另一个替代实施方案中，金属原子可以选自由CT的x射线能带中具有K-边缘的金属组成的族。优选的金属原子包括但不限于锰、铁、钆、金和碘。
金属原子可以是+1、+2或+3氧化态形式的金属离子。例如，非限制性实例包括Ba2+、Bi3+、Cs+、Ca2+、Cr2+、Cr3+、Cr6+、Co2+、Co3+、Cu+、Cu2+、Cu3+、Ga3+、Gd3+、Au+、Au3+、Fe2+、Fe3+、F3+、Pb2+、Mn2+、Mn3+、Mn4+、Mn7+、Hg2+、Ni2+、Ni3+、Ag+、Sr2+、Sn2+、Sn4+和Zn2+。金属原子可包含金属氧化物。例如，金属氧化物的非限制性实例可包括氧化铁、氧化锰或氧化钆。另外的实例可包括磁铁矿、磁赤铁矿或其组合。
根据本发明，包含螯合剂的FN3结构域可以并入放射性核素或金属原子。可以通过配位化学领域中常见的各种方法实现放射性核素或金属原子与FN3结构域-螯合剂复合物的合并。
延长半衰期的部分
本发明的特异性结合人CD8A的FN3结构域可以例如通过共价相互作用并入其他亚基。在本发明的一个方面，本发明的FN3结构域还包含延长半衰期的部分。示例性的延长半衰期的部分是白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白及其片段和类似物，以及Fc区。
为了所需性质，可以将附加部分并入本发明的FN3结构域中，如聚乙二醇(PEG)分子(如PEG5000或PEG20,000)、不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯(例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、山嵛酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等)、聚赖氨酸、辛烷、碳水化合物(葡聚糖、纤维素、寡聚糖或多糖)。这些部分可以是与蛋白质支架编码序列的直接融合物，并且可以通过标准的克隆和表达技术产生。或者，可以使用熟知的化学偶联方法将所述部分连接到本发明重组产生的分子上。
例如，通过将半胱氨酸残基并入到分子的C-端，或将半胱氨酸工程改造到背离分子的人CD8A结合面的残基位置中，并使用熟知的方法将聚乙二醇基团(pegyl group)连接到半胱氨酸上，可以将聚乙二醇部分添加到本发明的FN3结构域上。可通过几种熟知的测定法来比较并入附加部分的本发明FN3结构域的功能性。例如，可以在Fc受体结合测定中使用可溶形式的受体(如FcγRI、FcγRII、FcγRIII或FcRn受体)，或使用熟知的测量例如ADCC或CDC的基于细胞的测定，或评价体外模型中本发明的分子的药代动力学性质来测定由于并入Fc结构域和/或Fc结构域变体而改变的性质。
多核苷酸、载体、宿主细胞
本发明提供编码本发明的特异性结合人CD8A的FN3结构域的核酸，其作为分离的多核苷酸或作为表达载体的一部分或作为线性DNA序列的一部分，包括用于体外转录/翻译的线性DNA序列，与组合物或其定向诱变剂的原核、真核或丝状噬菌体表达、分泌和/或展示相容的载体。本文公开了某些示例性多核苷酸，然而，考虑到给定表达系统中遗传密码的简并性或密码子偏好，编码本发明的FN3结构域的其他多核苷酸也在本发明的范围内。
本发明的一个实施方案是编码FN3结构域的分离的多核苷酸，所述FN3结构域特异性结合人CD8A，包含SEQ ID NO:40-269的氨基酸序列的。
本发明的多核苷酸可以通过化学合成，例如在自动化多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合成产生，并组装成完整的单链或双链分子。或者，本发明的多核苷酸可以通过其他技术如PCR，然后进行常规克隆来产生。用于产生或获得给定已知序列的多核苷酸的技术是本领域熟知的。
本发明的多核苷酸可包含至少一个非编码序列，如启动子或增强子序列、内含子、多聚腺苷酸化信号、促进RepA结合的顺式序列等。多核苷酸序列还可以包含编码附加氨基酸的附加序列，其编码例如标志物或标签序列如组氨酸标签或HA标签，以促进纯化或检测蛋白质、信号序列、融合蛋白伴侣(如RepA)、Fc或噬菌体外壳蛋白(如pIX或pIII)。
本发明的另一个实施方案是包含本发明的至少一种多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体，用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或适于通过任何方式将本发明的多核苷酸引入指定生物或遗传背景的任何其他载体。此类载体可以是包含核酸序列元件的表达载体，所述核酸序列元件可以控制、调节、引起或容许由此类载体编码的多肽的表达。此类元件可包含转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点和促进指定表达系统中所编码的多肽表达的其他位点。此类表达系统可以是本领域熟知的基于细胞的系统或无细胞系统。
本发明的另一个实施方案是包含本发明的载体的宿主细胞。如本领域所熟知的，本发明的特异性结合人CD8A的FN3结构域可任选地由细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体产生。参见，例如，Ausubel等人编辑，Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor,NY(1989)；Harlow和Lane，Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Colligan等人编辑，Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,NY,(1997-2001)。
选择用于表达的宿主细胞可以是哺乳动物来源的或者可以选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、He G2、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或其衍生、永生化或转化细胞。或者，宿主细胞可以选自不能使多肽糖基化的物种或生物，例如原核细胞或生物体，如BL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XL1-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)，以及任何天然或工程化的大肠杆菌属、克雷白杆菌属(Klebsiella)或假单胞菌属(Pseudomonas)菌株。
本发明的另一个实施方案是产生本发明的特异性结合人CD8A的分离的FN3结构域的方法，其包括在使得表达特异性结合人CD8A的分离的FN3结构域的条件下培养本发明的分离的宿主细胞，并纯化FN3结构域。
可以通过熟知的方法，例如通过蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法或高效液相色谱法(HPLC)，从重组细胞培养物中纯化特异性结合人CD8A的FN3结构域。
用于检测人CD8A的试剂盒
本文提供了用于检测生物样品中的CD8A的试剂盒。这些试剂盒包括本文所述的一种或多种CD8A特异性FN3结构域和该试剂盒的使用说明书。
所提供的CD8A特异性FN3结构域可以呈溶液；是冻干的；固定在基板、载体或板上；或经可检测标记的。
所描述的试剂盒还可包括可用于实施本文所述的方法的附加组分。举例来说，试剂盒可包括用于获得来自受试者的样品、对照或参考样品(例如，来自患有缓慢进展的癌症的受试者和/或未患癌症的受试者的样品)的装置，一个或多个样品隔室和/或描述本发明的方法和组织特异性对照或标准的性能的说明材料。
用于测定CD8A水平的装置还可包括，例如，用于测定CD8A水平的测定法中的缓冲液或其他试剂。说明书可以是例如用于进行测定的印刷说明书和/或用于评价CD8A水平的说明书。
所描述的试剂盒还可包括用于从受试者中分离样品的装置。这些装置可包括一件或多件可用于从受试者获得流体或组织的设备或试剂。用于获得来自受试者的样品的装置还可以包括用于从血液样品中分离血液组分(如血清)的装置。优选地，该试剂盒设计用于人类受试者。
本发明的结合人CD8A的FN3结构域的用途
本发明的特异性结合人CD8A的FN3结构域可用于使用CD8A作为生物标志物诊断人类疾病或细胞、组织、器官、液体或通常，宿主中的特定病理。本发明的方法可用于属于任何分类的动物患者。此类动物的实例包括哺乳动物，如人、啮齿动物、狗、猫和家畜。
实施方案
本发明还提供了以下非限制性实施方案。
1)一种分离的FN3结构域，其特异性结合包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的人CD8A蛋白。
2)如实施方案1所述的分离的FN3结构域，其中所述FN3结构域与包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列的食蟹猴CD8A蛋白交叉反应。
3)如实施方案2所述的分离的FN3结构域，其中
a)所述FN3结构域基于SEQ ID NO:1的Tencon序列；
b)所述FN3结构域基于SEQ ID NO:4的Tencon27序列；和/或
c)所述FN3结构域分离自包含SEQ ID NO:2、3、5、6、7或8的序列的文库。
4)如实施方案3所述的分离的FN3结构域，其中所述FN3结构域与第二分子缀合。
5)如实施方案4所述的分离的FN3结构域，其中所述第二分子是可检测标记。
6)如实施方案5所述的分离的FN3结构域，其中所述可检测标记是放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原。
7)如实施方案3所述的分离的FN3结构域，其中所述FN3结构域在SEQ ID NO 79、81、83、89、122和68的残基位置54处具有半胱氨酸取代。
8)如实施方案3所述的分离的FN3结构域，其中正如通过酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法所测量的，所述FN3结构域不激活体外CD8+ T细胞。
9)如实施方案3所述的分离的FN3结构域，其中所述FN3结构域与包含SEQ ID NO:229-234之一的氨基酸序列的FN3结构域竞争结合人CD8A蛋白。
10)如实施方案3所述的分离的FN3结构域，其中正如通过根据实施例3中所述的条件进行的表面等离子体共振所测量的，所述FN3结构域结合人CD8A蛋白，亲和力(KD)介于约0.02至约6.6nM之间。
11)如实施方案3所述的分离的FN3结构域，其中所述FN3结构域包含SEQ ID NO:40-269的任一氨基酸序列。
12)如实施方案11所述的分离的FN3结构域，其还包含在所述FN3结构域的N末端的甲硫氨酸。
13)如实施方案3所述的分离的FN3结构域，其中所述FN3结构域与延长半衰期的部分偶联。
14)如实施方案13所述的分离的FN3结构域，其中所述延长半衰期的部分是CD8结合分子、聚乙二醇(PEG)、CD8、CD8变体或免疫球蛋白Fc区的至少一部分。
15)一种分离的多核苷酸，其编码实施方案3所述的FN3结构域。
16)一种载体，其包含实施方案15所述的多核苷酸。
17)一种分离的宿主细胞，其包含实施方案16所述的载体。
18)一种产生特异性结合人CD8A蛋白的FN3结构域的方法，其包括在使得表达所述FN3结构域的条件下培养实施方案17所述的分离的宿主细胞，并纯化所述FN3结构域。
19)一种诊断试剂盒，其包含实施方案3所述的FN3结构域。
20)一种诊断剂或捕获剂，其包含实施方案3所述的FN3结构域。
21)如实施方案20所述的诊断剂或捕获剂，其中所述FN3结构域在SEQ ID NO 79、81、83、89、122和/或68的残基位置54处具有半胱氨酸取代。
22)如实施方案21所述的诊断剂，其中所述经取代的半胱氨酸与Zr-89或I-124缀合。
23)一种检测生物样品中表达CD8的细胞的方法，其包括用实施方案20所述的诊断试剂处理所述生物样品，并评价所述生物样品与此类诊断剂的所述FN3结构域的结合。
24)如实施方案23所述的方法，其中所述诊断剂在SEQ ID NO79、81、83、89、122和/或68的残基位置54处具有半胱氨酸取代，并且所述经取代的半胱氨酸与Zr-89或I-124缀合。
实施例
提供以下实施例以补充先前的公开内容并提供对本文描述的主题的更好理解。不应将这些实施例视为限制所描述的主题。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据其进行的各种修改或改变对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且包括在本发明的真实范围内，并且可以在不脱离本发明的真实范围的情况下进行。
实施例1.构建具有随机化环的TENCON文库
Tencon(SEQ ID NO:1)是免疫球蛋白样支架、纤连蛋白III型(FN3)结构域，其由来自人肌腱蛋白-C的15个FN3结构域的共有序列设计而成(Jacobs等人，ProteinEngineering,Design,and Selection,25:107-117,2012；美国专利第8,278,419号)。Tencon的晶体结构显示六个表面暴露的环，其连接七条β-链。这些环或每个环内的选定残基可以随机化，以便构建可以用于选择与特定靶标结合的新型分子的纤连蛋白III型(FN3)结构域的文库。
Tencon：
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQ ID NO 1)：
使用tencon支架和各种设计策略生成各种文库。一般而言，文库TCL1和TCL2产生良好的结合物。在国际专利公开号WO2014081944A2中详细描述了TCL1和TCL2文库的产生。
TCL1文库的构建
设计用于仅随机化Tencon(SEQ ID NO:1)的FG环的文库TCL1被构建用于顺式展示系统(Jacobs等人,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107-117,2012)。在该系统中，产生并入Tac启动子序列、Tencon文库编码序列、RepA编码序列、顺式元件和ori元件的双链DNA。在体外转录/翻译系统中表达后，由Tencon-RepA融合蛋白与编码该融合蛋白的DNA顺式结合产生复合物。然后如下所述，通过聚合酶链反应(PCR)分离并扩增与靶分子结合的复合物。
通过连续几轮PCR实现用于顺式展示的TCL1文库的构建，产生分为两半的最终线性双链DNA分子；5’片段含有启动子和Tencon序列，而3’片段含有repA基因及顺式元件和ori元件。这两半通过限制性消化组合产生完整构建体。设计TCL1文库仅在Tencon的FG环，KGGHRSN(SEQ ID NO:32)中并入随机氨基酸。使用NNS密码子构建该文库，导致可能将所有20种氨基酸和一个终止密码子并入FG环中。TCL1文库含六个单独的子文库，每个子文库具有不同的随机化FG环长度，从7到12个残基，以进一步增加多样性。
TCL1文库(SEQ ID NO:2)
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX7-12PLSAEFTT；
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7是任何氨基酸；并且
X8、X9、X10、X11和X12是任何氨基酸或缺失
TCL2文库的构建
构建TCL2文库，其中Tencon的BC和FG环随机化，并且严格控制每个位置的氨基酸分布。表2示出了TCL2文库中所需环位置的氨基酸分布。设计的氨基酸分布有两个目的。首先，使该文库偏向于根据对Tencon晶体结构的分析和/或由同源建模预测对Tencon折叠和稳定性具有结构重要性的残基。例如，将位置29固定为仅是疏水性氨基酸的亚组，因为该残基埋在Tencon折叠的疏水性核中。第二层设计包括使氨基酸分布偏向于优先在抗体重链HCDR3中发现的残基的氨基酸分布，以有效地产生高亲和力结合物(Birtalan等人，J MolBiol 377:1518-28,2008；Olson等人，Protein Sci 16:476-84,2007)。为实现这一目标，表1中的“设计分布”是指如下分布：6％丙氨酸、6％精氨酸、3.9％天冬酰胺、7.5％天冬氨酸、2.5％谷氨酸、1.5％谷氨酰胺、15％甘氨酸、2.3％组氨酸、2.5％异亮氨酸、5％亮氨酸、1.5％赖氨酸、2.5％苯丙氨酸、4％脯氨酸、10％丝氨酸、4.5％苏氨酸、4％色氨酸、17.3％酪氨酸和4％缬氨酸。该分布无甲硫氨酸、半胱氨酸和终止密码子。
TCL2文库(SEQ ID NO:3)
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT；其中
X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X2是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X3是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X4是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X5是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X6是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X7是Phe、Ile、Leu、Val或Tyr；
X8是Asp、Glu或Thr；
X9是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X10是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X11是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X12是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X13是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X14是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；并且
X15是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。
表1.
Figure BDA0002117739950000321
Figure BDA0002117739950000331
*残基编号基于SEQ ID NO:1的Tencon序列
随后，将这些文库通过各种方式改进，包括在与野生型tencon相比时并入了取代E11R/L17A/N46V/E86I(Tencon27；SEQ ID NO:4)的稳定化Tencon框架上构造文库(美国专利第8,569,227号)，以及改变BC和FG环中随机化的位置时。国际专利申请号WO2013049275中描述了Tencon27。由此，产生了设计为仅随机化Tencon的FG环(文库TCL9)或BC和FG环的组合(文库TCL7)的新文库。构建这些文库用于顺式展示系统(Odegrip等人，Proc NatlAcad Sci U S A 101:2806-2810,2004)。该设计的细节如下所示：
稳定化的Tencon(Tencon27)(SEQ ID NO:4)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
TCL7(随机化FG和BC环)(SEQ ID NO:5)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT；
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、X13、X14、X15和X16是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；并且
X7、X8、X9、X17、X18和X19是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或缺失。
TCL9(随机化FG环)(SEQ ID NO:6)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12SNPLSAIFTT；
X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；并且
X8、X9、X10、X11和X12是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或缺失。
对于文库构建，使用Slonomics技术(Sloning Biotechnology GmbH)以控制文库的氨基酸分布并消除终止密码子，合成编码随机化BC环(长度6-9个位置)或FG环(长度7-12个位置)的DNA片段。独立地合成两组不同的随机化BC环或FG环的DNA分子，随后使用PCR进行组合以产生完全的文库产物。
FG环文库(TCL9)的构建
产生一组合成DNA分子，除了FG环中的随机化密码子外，其由5’Tac启动子组成，接着是Tencon的完整基因序列(SEQ ID NO:26-31)。对于FG环随机化，以相等百分比编码除半胱氨酸和甲硫氨酸外的所有氨基酸。多样化部分的长度使其在FG环中编码7、8、9、10、11或12个氨基酸。每个长度变异的子文库单独以2ug的规模合成，然后使用寡核苷酸Sloning-FOR(SEQ ID NO:9)和Sloning-Rev(SEQ ID NO:10)通过PCR扩增。
该文库的3’片段是含有用于展示的元件的恒定DNA序列，所述元件包括PspOMI限制性位点、repA基因的编码区及顺式元件和ori元件。使用质粒(pCR4Blunt)(Invitrogen)作为模板，用M13正向引物和M13反向引物进行PCR反应以扩增该片段。将所得PCR产物用PspOMI消化过夜并进行凝胶纯化。为了将文库DNA的5’部分连接到含有repA基因的3’DNA，在37℃下在NotI和PspOMI酶和T4连接酶的存在下使2pmol(～540ng至560ng)的5’DNA连接到等摩尔(～1.25μg)的3’repA DNA上过夜。通过用寡核苷酸POP2250(SEQ ID NO:11)和DigLigRev(SEQ ID NO:12)，使用12个PCR循环来扩增连接的文库产物。对于每个子文库，将来自12个PCR反应的所得DNA组合并通过Qiagen离心柱纯化。每个TCL9子文库的产量范围为32-34μg。
FG/BC环文库(TCL7)的构建
TCL7文库提供具有随机化Tencon BC和FG环的文库。在该文库中，将长度为6-9个氨基酸的BC环与长度为7-12个氨基酸的随机化FG环组合性混合。产生合成Tencon片段BC6、BC7、BC8和BC9(SEQ ID No.13-16)以包括编码蛋白质的N-端部分直至并且包括残基VX的Tencon基因，使得BC环被6、7、8或9个随机化氨基酸置换。这些片段是在发现L17A、N46V和E83I突变(CEN5243)之前合成的，但是这些突变是在下面描述的分子生物学步骤中引入的。为了将该片段与编码随机化FG环的片段组合，采取以下步骤。
首先，使用寡核苷酸POP2222ext(SEQ ID No.18)和LS1114(SEQ ID No.19)通过PCR产生编码Tac启动子和Tencon的5’序列直至编码氨基酸A17的核苷酸的DNA片段(130mer-L17A，SEQ ID No.17)。这样做将L17A突变(CEN5243)包括在文库中。接下来，使用作为模板的BC6、BC7、BC8或BC9及寡核苷酸LS1115(SEQ ID No.20)和LS1117(SEQ IDNo.21)，通过PCR扩增编码包括随机化BC环的Tencon残基R18-V75的DNA片段。该PCR步骤在3’末端引入了BsaI位点。随后使用寡核苷酸POP2222ext和LS1117作为引物通过重叠PCR连接这些DNA片段。汇合所得240bp的PCR产物，并用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化。用BsaI-HF消化纯化的DNA并进行凝胶纯化。
使用作为模板的FG7(SEQ ID No.31)、FG8(SEQ ID No.30)、FG9(SEQ ID No.29)、FG10(SEQ ID No.28)、FG11(SEQ ID No.27)和FG12(SEQ ID No.26)及寡核苷酸SDG10(SEQID No.22)和SDG24(SEQ ID No.23)通过PCR扩增编码FG环的片段以并入BsaI限制性位点及N46V和E86I变异(CEN5243)。
使用3向连接将消化的BC片段和FG片段一步连接在一起。建立16种可能组合的四个连接反应，每个连接反应组合了两个BC环长度和2个FG环长度。每次连接含有～300ng的总BC片段和300ng的FG片段。然后使用寡核苷酸POP2222(SEQ ID No.24)和SDG28(SEQ IDNo.25)通过PCR扩增这4个连接库。然后用Not1消化7.5μg的每种反应产物，并用Qiagen PCR纯化柱净化。将5.2μg该DNA连接到等摩尔量的用PspOMI消化的RepA DNA片段(～14μg)上，并使用寡核苷酸POP2222通过PCR扩增产物。
实施例2：具有替代结合表面的TENCON文库的产生
在特定库设计中待随机化的残基的选择决定了所产生的相互作用表面的整体形状。从其中BC、DE和FG环随机化的文库中选择的结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的含FN3结构域的支架蛋白的X射线晶体学分析显示具有适合MBP活性位点的很大程度弯曲的界面(Koide等人，Proc Natl Acad Sci U S A 104:6632-6637,2007)。相比之下，发现选择与MBP结合的锚蛋白重复支架蛋白具有更加平坦的相互作用表面，并与远离活性位点的MBP外表面结合(Binz et al.,Nat Biotechnol 22:575-582,2004)。这些结果表明支架分子的结合表面的形状(弯曲对比扁平)可以决定哪些靶蛋白或那些靶蛋白上的特定表位能够被支架有效结合。围绕工程改造用于蛋白质结合的含FN3结构域的蛋白质支架的公开成果依赖于工程改造用于靶标结合的相邻环，从而产生弯曲的结合表面。该方法可以限制此类支架可接近的靶标和表位的数量。
Tencon和其他FN3结构域含有两组位于分子相对面的CDR样环，第一组由BC、DE和FG环形成，第二组由AB、CD和EF环形成。这两组环被形成FN3结构中心的β-链分开。如果将Tencon的图像旋转90度，则可以看到替代表面。这个略微凹陷的表面由CD和FG环和两条反向平行β-链(C和Fβ-链)形成，并且在本文中称为C-CD-F-FG表面。通过随机化形成该表面的残基亚组，C-CD-F-FG表面可作为模板用于设计蛋白质支架相互作用表面的文库。β-链具有重复结构，其中每个其他残基的侧链暴露于蛋白质的表面。因此，可以通过随机化β链中的一些或所有表面暴露的残基来制备文库。通过选择β-链中的适当残基，应该在提供独特支架表面以与其他蛋白质相互作用的同时，使Tencon支架的固有稳定性受到最小程度的损害。
将文库TCL14(SEQ ID NO:7)设计成Tencon27支架(SEQ ID NO:4)。
美国专利公开号2013/0226834中描述了用于构建该文库的方法的完整描述。
TCL14文库(SEQ ID NO:7)：
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT；
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12和X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或M。
在Tencon27中形成C-CD-F-FG表面的两条β链总共具有9个可以随机化的表面暴露残基；C链：S30、L32、Q34、Q36；F链：E66、T68、S70、Y72和V74，而CD环有6个潜在残基：S38、E39、K40、V41、G42和E43，并且FG环有7个潜在残基：K75、G76、G77、H78、R79、S80和N81。选择残基以包括在TCL14设计中，因为如果所有22个残基均随机化，则文库的理论大小更大。
选择Tencon中的13个位置进行随机化：C链中的L32、Q34和Q36，CD环中的S38、E39、K40和V41，F链中的T68、S70和Y72，FG环中的H78、R79和N81。在C和F链中，S30和E66未随机化，因为它们恰好位于CD和FG环之外，并且看起来似乎不是C-CD-F-FG表面的一部分。对于CD环，G42和E43未随机化为甘氨酸，提供了灵活性，在环区域中可能是有价值的，并且E43位于表面的交界处。FG环排除了K75、G76、G77和S80。由于上述原因排除了甘氨酸，同时仔细检查晶体结构显示S80与核形成关键接触以帮助形成稳定的FG环。K75背离C-CD-F-FG表面，是不那么吸引人的随机化候选物。尽管上述残基在原始TCL14设计中未随机化，但它们可以包括在后续文库设计中以为重新选择或例如为选择的TCL14靶特异性命中物的亲和力成熟文库提供额外的多样性。
在产生TCL14之后，产生了另外3个类似设计的Tencon文库。这两个文库TCL19、TCL21和TCL23在与TCL14相同的位置随机化(见上文)，然而在这些位置出现的氨基酸的分布改变(表2)。将TCL19和TCL21设计为在每个位置包括平均分布的18种天然氨基酸(各5.55％)，仅排除了半胱氨酸和甲硫氨酸。将TCL23设计为使得每个随机化位置近似于在功能性抗体的HCDR3环中发现的氨基酸分布(Birtalan et al.,J Mol Biol 377:1518-1528,2008)，如表2所述。与TCL21文库一样，排除了半胱氨酸和甲硫氨酸。
构造第三附加文库以扩展其他文库的潜在靶标结合表面。在该文库TCL24中，与文库TCL14、TCL19、TCL21和TCL23相比，随机化了4个附加Tencon位置。这些位置包括来自D链的N46和T48以及来自G链的S84和I86。尤其选择位置46、48、84和86，因为这些残基的侧链从β-链D和G表面暴露，并且在结构上与C和F链的随机化部分相邻，从而增加了可接近以与靶蛋白结合的表面积。在TCL24的每个位置使用的氨基酸分布与表2中对TCL19和TCL21描述的氨基酸分布相同。
TCL24文库(SEQ ID NO:8)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT；
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12和X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V或W。
表2.TCL21、TCL23和TCL24的每个随机化位置的氨基酸频率(％)。
<u>氨基酸</u> <u>TCL19</u> <u>TCL21</u> <u>TCL23</u> <u>TCL24</u>
Ala 5.6 5.6 6.0 5.6
Arg 5.6 5.6 6.0 5.6
Asn 5.6 5.6 3.9 5.6
Asp 5.6 5.6 7.5 5.6
Cys 0.0 0.0 0.0 0.0
Gln 5.6 5.6 1.5 5.6
Glu 5.6 5.6 2.5 5.6
Gly 5.6 5.6 15.0 5.6
His 5.6 5.6 2.3 5.6
Ile 5.6 5.6 2.5 5.6
Leu 5.6 5.6 5.0 5.6
Lys 5.6 5.6 1.5 5.6
Met 0.0 0.0 0.0 0.0
Phe 5.6 5.6 2.5 5.6
Pro 5.6 5.6 4.0 5.6
Ser 5.6 5.6 10.0 5.6
Thr 5.6 5.6 4.5 5.6
Trp 5.6 5.6 4.0 5.6
Tyr 5.6 5.6 17.3 5.6
Val 5.6 5.6 4.0 5.6
TCL21、TCL23和TCL24文库的产生
使用Colibra文库技术(Isogenica)控制氨基酸分布产生TCL21文库。使用Slonomics技术(Morphosys)控制氨基酸分布产生TCL19、TCL23和TCL24基因片段。在初始合成后使用PCR扩增每个文库，然后连接到RepA基因，以便用于使用CIS-展示系统进行选择(Odegrip et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 101:2806-2810,2004)，如以上对于环文库所述。
实施例3：结合CD8A的纤连蛋白III型(FN3)结构域的选择
人CD8α抗原的设计和产生：
使两种人CD8α(Swiss Prot P01732)构建体表达并从HEK细胞中纯化，以产生用于CIS-展示淘选的重组蛋白(表3)。
表3：产生的用作抗原的CD8A构建体
构建体 SEQID No. 描述
CD8W7 35 与人IgG1的Fc片段融合的人CD8α残基22-167
CD8W13 36 与人IgG1的Fc片段融合的人CD8α残基22-182
将每种构建体设计为包括鼠IgGκ分泌信号(SEQ ID No 3)并与人IgG1的Fc片段(SEQ ID No.4)融合。CD8α和Fc片段序列通过含有标记(flag)和多组氨酸标签序列(SEQ IDNo.5)的接头连接。
通过瞬时转染将编码这些蛋白质的质粒转染到HEK 293-Expi细胞中，并通过以6000x g离心收获培养物上清液，并用0.2微米过滤器使其澄清。将上清液装载到HiTrapMabsure Select柱(GE Healthcare)上，并在pH 3.5的0.1M乙酸钠中洗脱CD8A蛋白，并通过添加pH 7的2M Tris进行中和。然后将每个样品透析到pH 7.4的PBS中，用No Weigh EZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒(Thermo Scientific)进行生物素化。
文库筛选
使用顺式展示从TCL18、TCL19、TCL21、TCL23和TCL24文库中选择人CD8α结合结构域。将生物素化的CD8W7和CD8W13用于淘选。对于体外转录和翻译(ITT)，将3μg文库DNA与0.1mM完整氨基酸、1X S30预混物组分和15μL的S30提取物(Promega)一起孵育，总体积为50μL，并且在30℃下孵育。1小时后，添加375μL封闭溶液((0.1％酪蛋白(Thermo Fisher,Rockford,IL)、100mg/ml鲱鱼精子DNA(Promega,Madison,WI)、1mg/mL肝素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))并将反应物在冰上孵育15分钟。为了选择，以400nM(第1轮)、200nM(第2轮和第3轮)和100nM(第4轮和第5轮)的浓度添加生物素化抗原。使用中性抗生物素蛋白磁珠(Thermo Fisher,Rockford,IL)(第1、3和5轮)或链霉抗生物素蛋白磁珠(Promega,Madison,WI)(第2轮和第4轮)回收结合的文库成员，并通过用500μL PBST洗涤珠粒5-14次，然后用500μL PBS洗涤2次去除未结合的文库成员。进行附加选择轮次以便鉴定亲和力改善的支架分子。简言之，如上所述制备来自第5轮的输出物并进行附加迭代轮次的选择，具有以下变化：生物素化靶标浓度降至25nM(第6和第7轮)或2.5nM(第8和第9轮)，和在过量非生物素化靶蛋白的存在下再进行1小时洗涤。这些变化的目的是同时选择具有可能更快的结合速率和更慢的解离速率，产生显著更低的KD的结合物。
淘选后，使用寡核苷酸Tcon6(SEQID NO:33)和Tcon5shortE86I(SEQID NO:34)通过PCR扩增选择的FN3结构域，通过退火亚克隆到pET15-LIC中并转化到BL21-GOLD(DE3)细胞(Agilent,Santa Clara,CA)中，以使用标准的分子生物学技术在大肠杆菌中进行可溶性表达。挑取单个克隆物并使其在37℃下在96深孔板中的1mL含氨苄青霉素的LB中生长至饱和。第二天，将25uL转移到96深孔板中的1mL新鲜LB-Amp培养基中，并使其在37℃下生长2小时。按1mM最终浓度添加IPTG，并在30℃下诱导蛋白质表达16小时。通过离心收获细胞，随后用补充有0.2mg/mL最终鸡卵清蛋白溶菌酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的Bugbuster HT(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)裂解细胞。大约16小时后通过离心收获细胞并在-20℃下冷冻。通过在室温下将每个团块在0.6mL的
Figure BDA0002117739950000421
HT裂解缓冲液(Novagen EMDBiosciences)中振荡孵育45分钟来实现细胞裂解。
结合CD8A的FN3结构域的选择
将中性抗生物素蛋白包被的板在Starting Block T20(Pierce)中封闭1小时，然后用生物素化CD8W7或CD8W13(与淘选中相同的抗原)或阴性对照(人Fc)包被1小时。将板用TBST冲洗，并将稀释的裂解物施加到板上1小时。在另外的冲洗之后，将孔用HRP缀合的抗FN3结构域抗体(PAB25)处理1小时，然后用POD(Roche)测定。选择信号比背景高至少10倍的FN3结构域分子做进一步分析。
鉴定的结合CD8A的FN3结构域的小规模表达和纯化
将通过生物化学结合ELISA鉴定的分离自独特命中物的克隆物组合成单个命中物板，用于在96孔块板中生长；克隆物在1mL培养物(补充有卡那霉素(kanamycin)用于选择的LB培养基)中在37℃下振荡生长过夜。对于96块板中的蛋白质表达，用50uL过夜培养物接种1mL补充有卡那霉素的TB培养基，并以300rpm连续振荡使其在37℃下生长直至OD600＝0.6-1。一旦达到目标OD，就添加IPTG至1mM诱导蛋白质表达；将板转移至30℃(300rpm)过夜生长。将过夜培养物离心以收获细胞；将细菌团块储存在-80℃直至备用。用
Figure BDA0002117739950000422
HT裂解缓冲液(Novagen EMD Biosciences)裂解团块并用His MultiTrapTMHP板(GEHealthcare)从澄清的裂解物中纯化His标记的Centyrin，并在pH 7.4的含有20mM磷酸钠、500mM氯化钠和250mM咪唑的缓冲液中洗脱。将纯化样品交换到pH 7.4的PBS中，使用PDMultiTrapTMG-25板(GE Healthcare)进行分析。
尺寸排阻色谱分析
使用尺寸排阻色谱法确定抗CD8αFN3结构域分子的聚集状态。将各纯化FN3结构域的等分试样(10μL)在pH 7.4的PBS流动相中以0.3mL/分钟的流速注射到Superdex 75 5/150柱(GE Healthcare)上。通过280nm处的吸光度监测从柱上的洗脱。每次运行中包括野生型Tencon作为对照。使用Agilent ChemStation软件分析洗脱曲线。仅考虑那些在相同运行中具有与肌腱蛋白共有蛋白相似的洗脱曲线的蛋白质用于进一步表征。在淘选、ELISA筛选和尺寸排阻色谱分析后，通过SEC总共分离出190个独特的抗人CD8αFN3结构域，这些结构域与重组人CD8α结合比背景高10倍并且不含聚集物(见表4，SEQID no.40-228和70)。
表4.从ELISA筛选鉴定的结合CD8A的FN3结构域的汇总
Figure BDA0002117739950000431
Figure BDA0002117739950000441
Figure BDA0002117739950000451
Figure BDA0002117739950000461
Figure BDA0002117739950000471
Figure BDA0002117739950000481
筛选与来自人和食蟹猴供体的T细胞结合
通过流式细胞术评估190种ELISA命中物与人和食蟹猴原代CD8 T细胞的结合。将FN3结构域分子在PBS中稀释为2μM和0.2μM，并与人或食蟹猴CD8+ T细胞一起以96孔形式孵育。在4℃下1小时后，用PBS洗涤细胞一次，然后用抗FN3结构域抗体(PAB25)溶液使其重新悬浮。孵育后，用PBS洗涤细胞两次并添加PE缀合的二抗和活力染料。最后，洗涤细胞并使其重新悬浮在PBS中，使用BD Canto仪器进行流式细胞术分析。细胞在活细胞上进行门控，并使用Cytobank软件计算结合的Centyrin(PE通道)的中值荧光强度。结果汇总在表4中。
抗人CD8αCentyrin的解离速率分析
使用Proteon表面等离子体共振仪器对纯化的抗CD8A FN3结构域进行解离速率分析，以便挑取解离速率最慢的克隆物用于进一步表征。如表4所示，测量的解离速率范围为2.64E-5至1.07E-2sec-1。
通过在PBST(PBS、0.005％Tween)中以30μl/分钟的流速，在芯片上以垂直方向在所有6个配体通道上进行胺偶联(pH 5.0)，在10μg/ml，pH5.0下将山羊抗人Fc IgG(Jacksonimmunoresearch，目录号#109-005-098)直接固定在GLC传感器芯片上。固定的GAH-Fc IgG密度平均为约6000个反应单位(Ru)，不同通道之间的变异小于1％。在垂直方向上以3种不同的配体密度(10、5、2.5μg/ml)以30ul/分钟的流速捕获内部的人CD8A-Fc 5分钟。将所有FN3结构域标准化为3μM浓度，并测试水平方向的结合。所有6个分析物通道均用于FN3结构域以使筛选通量最大化。使用PBST作为运行缓冲液，以100μl/分钟的流速监测解离阶段15分钟。通过0.85％磷酸的短脉冲(以100uL/分钟接触18s)实现表面的再生。使用Bio-RadProteOn Manager软件(版本3.1.0.6)进行数据分析。通过减去点间(interspot)(空芯片表面，没有固定或捕获蛋白质)信号对原始数据进行双重参考以校正FN3结构域与预包被的GAH-Fc IgG表面的非特异性结合，然后使用其中未捕获hCD8A-Fc的空通道L6进行双重校正。将经过处理的结合数据局部拟合至1:1简单Langmuir结合模型，以提取与捕获的hCD8A-Fc结合的每个FN3结构域的koff。
实施例4：抗CD8A FN3结构域的工程改造
将许多突变设计到顶级抗CD8A候选物中以消除氧化(甲硫氨酸或色氨酸)、脱酰胺(NS)、异构化(DG)和剪切(DP)的翻译后修饰风险。在β链中发现的脯氨酸残基也突变，因为脯氨酸具有使β链不稳定的潜力(Chiba T.等人，J Biol Chem.2003；278:47016-24)。仅考虑源自FN3结构域文库设计位置的残基进行突变。选择变体序列以模拟母体分子的相似化学性质(例如色氨酸突变为酪氨酸)或用在其他CD8A FN3结构域中在该位置处发现的氨基酸置换PTM风险氨基酸。表5中列出了工程化序列的完整列表。通过表面等离子共振测量每种突变体和重组CD8α之间的解离速率以估计相对结合强度。
表5.CD8A Centyrin突变体的解离速率。根据母体分子对突变体进行分组。
Figure BDA0002117739950000491
Figure BDA0002117739950000501
Figure BDA0002117739950000511
从表5中呈现的数据，显而易见许多降低可展性风险的突变保持了与母体分子相似的解离速率。突变体CD8S402(DP位点消除)、CD8S390(Trp残基消除)和CD8S403(从β链去除Pro)导致比母体适当分子更慢的解离速率，表明结合更紧密。许多其他突变保持与母体分子类似的结合，因此可能优于母体，因为这些分子在发育过程中造成较低的CMC相关风险。
实施例5：结合CD8A的FN3结构域的亲和力测量。
选择19种抗CD8A候选物用于与重组人CD8α结合的全面动力学分析。使用以下标准从上述阳性命中物(表4)中选择这些候选物：1)与人T细胞的强相对结合，2)与食蟹猴T细胞的强相对结合，3)与2uM相比，在0.2uM下细胞结合的减少最小，4)通过SEC测定不含聚集物，5)解离速率低于2.07E-3sec-1，6)相对于序列家族的序列多样性，和7)具有潜在可展性挑战(氧化、脱酰胺、剪切和疏水性)的序列的相对倾向。
在类似于koff筛选的条件下，使用GLC传感器芯片在ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad)上测量前19种候选物与hCD8A-Fc结合的亲和力，稍后重复测量前6种候选物。通过在PBST(PBS、0.005％Tween)中以30μl/分钟的流速，在芯片上以垂直方向在所有6个配体通道上进行胺偶联，在10μg/ml，pH5.0下将山羊抗人Fc抗体直接固定在芯片上，在每个配体通道上达到平均6200Rus。然后以五个200至1200反应单位的表面密度捕获人CD8A-Fc，留下第6个通道作为GAH-Fc IgG表面的空通道对照。通过使五种不同浓度的抗CD8A FN3结构域(以3倍稀释系列稀释1μM)作为分析物在捕获的hCD8A-Fc表面上的水平方向同时流动来测量结合，其中第六分析物通道仅含运行缓冲液PBST。所有相互作用均以100uL/分钟流速测量，缔合和解离时间分别为4分钟、30分钟。通过0.85％磷酸的1次短脉冲(以100μL/分钟接触18s)实现配体表面再生。使用Bio-Rad ProteOn Manager软件(版本3.1.0.6)进行数据分析。通过减去点间(空芯片表面，没有固定或捕获蛋白质)信号对原始数据进行双重参考以校正FN3结构域与预包被的GAH-Fc IgG表面的非特异性结合，然后使用缓冲液空白反应进行双重参考(以校正随时间推移因配体解离而产生的任何基线漂移)。在多个分析中始终如一地观察到抗CD8A FN3结构域结合数据与1:1简单Langmuir结合模型未很好地吻合，这暗示了无法使用简单的1:1结合模型来说明的试剂问题和/或本质上复杂的结合机制。鉴于hCD8A-Fc形式的GAH-Fc捕获相对于其他形式在引入潜在实验假象(例如由于胺偶联引起的配体活性丧失和/或人工表位/异源配体群)方面破坏性最小，因此认为尽管在许多情况下观察到不吻合的1:1Langmuir拟合，但此处报告的GAH-Fc捕获实验的结果代表最可靠的ProteOnSPR数据。选择异源配体模型来拟合假定两种不同配体种类的数据，这是由于配体蛋白质群体的异源性或由于每个FN3结构域与Fc融合蛋白中的2种hCD8A单体结合的潜在不同机制。在这种情况下，因为每个抗CD8A FN3结构域将具有单独的亲和力，所以所得到的传感图反映了具有对于每个FN3结构域结合报告的两组速率常数的两个独立反应的总和。
表6：前六种抗CD8A FN3结构域候选物的动力学亲和力的汇总。注意：亲和力，KD＝kd/ka。
Figure BDA0002117739950000521
Figure BDA0002117739950000531
实施例6：用DFO和89ZR标记抗CD8A FN3结构域
将抗CD8A FN3结构域修饰为包括单个半胱氨酸残基，用于缀合含马来酰亚胺的螯合剂或PET标记。在DNA2.0合成编码有残基E54突变为半胱氨酸的克隆物P282DR9P1359_F5、P282DR9P1359_F7、P282DR9P1359_G7、P282ER9P1360_C8、P283AR9P1362_D6和P282DR9P1359_C5的合成质粒DNA(表7)。基于早期研究选择E54作为突变位置，早期研究证明在该残基处突变的其他FN3结构域的结合亲和力、稳定性和表达水平的维持(GoldbergS.等人Protein Engineering Design and Selection 2016Epub提前出版)。
表7：经修饰的抗CD8A FN3结构域分子
原始克隆物 SEQID NO 具有E54C的克隆物 SEQID No
P282DR9P1359_F5 79 CD8S368 229
P282DR9P1359_F7 81 CD8S367 230
P282DR9P1359_G7 83 CD8S370 231
P282ER9P1360_C8 89 CD8S365 232
P283AR9P1362_D6 122 CD8S369 233
P282DR9P1359_C5 68 CD8S366 234
经游离半胱氨酸修饰的抗CD8A FN3结构域与去铁胺(DFO)缀合以便螯合放射性金属。将0.5mL的100-500μM抗CD8A FN3结构域溶液与10μL的500mM TCEP(Sigma，目录号#646547)组合，用氮气轻轻吹洗，并在室温下孵育1小时。向每支管中添加1.0mL饱和硫酸铵(4.02M)以达到3.2M的最终浓度，之后在冰上孵育10分钟并以16,000x g或更高速度离心以使蛋白质团块化。使所得团块重新悬浮并在1.0mL补充有100mM磷酸钠(pH 7.2)和1mM EDTA的3.2M硫酸铵中洗涤，然后再次离心。在第二离心步骤后，将所得团块溶解在100mM磷酸钠7中。将0,1mM EDTA与10uL的50mM DFO溶液混合，使DFO与抗CD8A的最终摩尔比为5:1。使该反应在室温下进行30分钟，之后用5.0微升β-巯基乙醇淬灭。最后通过各种方法去除过量DFO，包括如上所述的第二轮硫酸铵沉淀，通过脱盐柱如Zeba 7k柱(Pierce目录号#89889)，或通过用镍-NTA树脂(Qiagen#30450)纯化。在1X PBS中配制抗CD8A FN3结构域-DFO缀合物用于进一步分析。
缀合至DFO后，如前所述通过表面等离振子共振评估每个抗CD8A FN3结构域与重组人CD8α的结合。在E54突变为Cys并与DFO缀合后，所有样品保持与人CD8A的紧密结合(表8)。
表8.DFO缀合后的结合亲和力
Figure BDA0002117739950000541
实施例7：抗CD8A FN3结构域与人和CYNO T细胞的结合。
为19个选定的抗CD8A FN3结构域产生完整的剂量反应结合曲线。将每种候选物在PBS中稀释至20μM，然后进行1:3连续稀释，以产生11点或18点剂量反应曲线。将人或食蟹猴CD8+ T细胞与稀释的FN3结构域在4℃下孵育1小时。用PBS洗涤细胞一次，并与抗-centyrin抗体(PAB25)在4℃下孵育1小时。用PBS洗涤细胞两次，然后与PE-二抗、抗-CD3-PacB、抗-CD4-APC和活力染料一起孵育。最后，洗涤细胞并使其重新悬浮在PBS中，使用BD Canto仪器进行流式细胞术分析。将CD8 T细胞定义为活的CD3+ CD4-细胞。使用Cytobank软件计算结合的Centyrins(PE通道)的中值荧光强度和显示阳性染色的细胞％。使用Prism对结果进行绘图，并使用4参数剂量反应可变斜率方程计算EC50值。
进行基于MesoScale Discovery-细胞亲和力技术(MSD-CAT)的平衡细胞结合测定以确定结合原代人细胞毒性T细胞表面CD8A受体的前六种抗CD8A候选物的亲和力。将50pM恒定浓度的每种抗CD8A FN3结构域与10种不同浓度的原代细胞毒性CD8 T细胞预孵育(一行中的第2-11列)。在结合测量之前检查细胞活力，并且对于有效分析而言需要>85％的活力。由于这些细胞来自不同的供体，在供体-供体变异的情况下，仅将相同供体的细胞组合在一起。使用来自相同供体的细胞重复测量每个单独的抗CD8A FN3结构域结合。将细胞和FN3结构域在4℃下在旋转器上孵育过夜以达到平衡。孵育后，将细胞与细胞结合的抗CD8AFN3结构域一起离心，并使用MSD测定法定量上清液中未结合的(游离)抗CD8A FN3结构域，其中在4℃下生物素化重组hCD8A-Fc蛋白在测定缓冲液中以0.6ug/mL捕获至链霉抗生物素蛋白MSD板过夜～16小时。将板封闭后，将含有游离抗CD8A FN3结构域的上清液添加到板中并孵育1小时，然后以1.6ug/ml进行SulfoTag pAb139(内部)检测。包括第1列中不含任何FN3结构域和hCD8A的缓冲液对照(板背景结合对照)和第12列中不含hCD8A (100％游离/未结合)的FN3结构域对照。包括小鼠抗hCD8A mAb(mIgG1k，BD Biosciences，目录号#555364，克隆物RPA-T8)作为阳性对照。Tencon27作为阴性对照包括在初始测定验证中，并且未观察到显著的结合，因此，由于细胞可用性，未包括在后面的细胞结合中。通过将原液1:4稀释到H2O中添加MSD读数缓冲液后，立即在MSD Sector Imager 6000TM读数器上读取板的发光水平。
使用具有可变斜率函数的非线性拟合在Prism中输出和分析原始MSD数据，以得出Bmax和Hillslope值。将仅考虑那些具有收敛Bmax值和hillslope在-1.5～-0.5范围内(理想为-1.0)的那些用于进一步分析。然后使用Bmax值标准化结合数据以计算标准化游离FN3结构域％。每个细胞50,000个受体的表面CD8密度用于受体浓度计算。对于1:1结合模型，需要在最高CD8细胞浓度下<20％游离Centyrin的饱和标准，以使用“标准化数据的溶液亲和力方程”确定亲和力。
抗CD8A FN3结构域与原代细胞结合，亲和力范围为0.167至2.81nM(表9)。
表9：前六种抗CD8A FN3结构域候选物的EC50值汇总
Figure BDA0002117739950000561
实施例8：人T细胞的活化
重新活化
为了确定抗CD8A FN3结构域是否激活T细胞，进行流式细胞术测定以监测T细胞活化标志物的变化。评价六个抗CD8A FN3结构域的T细胞活化。通过将1μM或10nM的FN3结构域一式两份与人泛-T细胞(pan-T cell)在培养基中孵育4天来评估重新活化。测试了两个独立供体。将板结合的抗CD3以2个剂量，即0.1ug/mL和0.01ug/mL用作阳性对照。将PBS用作阴性对照。然后用活力染料和下组的抗体对细胞染色：CD4-FITC、CD3-PerCP-Cy5.5、CD69-PacB、CD45RA-BV605、CD25-BV650、CD127-PE和CD137-PE-Cy7。将CD8+细胞定义为活的CD3+CD4-细胞，并对每种T细胞活化标志物进行分析。使用FlowJo软件计算中值荧光强度值，并将重复值取平均值。结果汇总在表10A (供体022)和表10B(供体146)中。对于365、366、367、368和370，在1μM的最高剂量水平下测试的2个供体中的仅1个中观察到T细胞活化标志物的微小变化。在10nM剂量下两个供体中均不存在这些变化，表明分子在相关浓度下不会重新激活T细胞。在最高剂量水平下，369分子确实显著激活两个供体中的CD137表达。
表10：供体022(A)和供体146(B)的CD8+ T细胞上各种T细胞活化标志物的中值荧光强度(MFI)值
A
Figure BDA0002117739950000571
B
Figure BDA0002117739950000581
泛T细胞活化
为了确定抗CD8A FN3结构域是否可以影响泛-活化T细胞中T细胞活化的标志物，还与低剂量的板结合的CD3的组合评价了抗CD8A FN3结构域。在该测定中，使用次最佳浓度(0.01μg/mL)的板结合的抗CD3在1μM或10nM抗CD8A的存在下激活T细胞。4天后，使用与上述相同的组和门控策略评估细胞。测试了两个独立供体。使用FlowJo软件计算中值荧光强度值，并将重复值取平均值。结果汇总在表11A(供体022)和表11B(供体146)中。
表11A和B：在板结合的CD3存在下供体022(A)和供体146(B)的CD8+ T细胞上各种T细胞活化标记物的中值荧光强度(MFI)值。
A
Figure BDA0002117739950000591
B
Figure BDA0002117739950000592
Figure BDA0002117739950000601
细胞因子反应
为了确定在活化标志物中观察到的任何变化是否导致细胞因子产生方面的变化，还使用两个抗CD8A FN3结构域进行抗原依赖性T细胞活化测定。对于一组测定，将CMV反应性或M1反应性人PBMC解冻并在37℃下在6孔板中静置过夜。第二天，通过移液收集PBMC，计数并在存在或不存在10μg/mL肽的情况下接种到IFNg Mabtech ELISpot板上。向孔中添加1μM抗CD8A FN3-DFO缀合物并且使板在37℃下不受干扰地孵育大约24小时。取出细胞并将板用PBS洗涤5次。添加所提供的检测抗体并将板孵育2小时。将板再次洗涤并将试剂盒底物添加到每个孔中。通过使板在水下运行来终止反应之前使板显影大约5分钟。将板在黑暗中倒置干燥过夜。在AID EliSpot读数器上对板进行读数，并使用AID EliSpot软件生成斑点计数。在Prism中对结果进行绘图。结果汇总在图1中。在该测定中，在不存在肽的情况下与单独的培养基或非CD8A结合性TenCon对照相比，365-DFO未增加IFNg斑点的数量(图1A、图1C)。包括肽和CD3作为阳性对照。在肽的存在下，与单独的肽或具有非CD8A结合性tencon的肽相比，365-DFO不改变IFNg斑点的数量(图1B、图1D)。包括培养基作为阴性对照，并且包括CD3作为阳性对照。这些结果表明，centyrin不影响T细胞活化。
为了在长期测定中证实这些结果，还在6天活化测定中测量了IFN-γ水平。对于该研究，在存在或不存在0.25μg/mL pp65肽的情况下将CMV反应性PBMC与抗CD8A FN3结构域以1uM一式三份孵育。将细胞在37℃下孵育6天。在每个时间点离心细胞并收获上清液。将样品储存在-80℃下直至分析。使用基于单重Meso Scale Discovery(MSD)的ELISA分析解冻的样品的IFN-γ。对于该测定，根据制造商的说明书制备标准曲线。将样品和标准品添加到预包被的96孔MSD板中。孵育2小时后，添加试剂盒检测抗体。再孵育2小时后，将板洗涤三次，然后添加提供的读数缓冲液。在MSD Sector Imager 6000酶标仪上对板进行读数。根据使用MSD Discovery Workbench软件生成的标准曲线分析原始MSD数据文件。使用TibcoSpotfire程序对分析的数据绘图。结果汇总在图2中。在该测定中，在不存在肽的情况下与单独的培养基相比，365-DFO未增加IFNg向培养基中的分泌(图2A)。包括CMV肽作为阳性对照。在肽的存在下，与单独的肽相比，365-DFO也不改变IFNg分泌的量(图2B)。包括培养基作为阴性对照。这些结果表明，centyrin不影响T细胞活化。
实施例9：用I124/I125标记抗CD8A FN3结构域
用碘-124放射性标记CD8S365以产生[124I]-IPEM CD8S 365的当前方法(方案1)改编自文献程序(Bioconjugate Chem.1991,2,435-440；ChemistryOpen 2015,4,174-182)。
Figure BDA0002117739950000611
方案1：[124I]-IPEM CD8S 365的合成
向1.5mL Eppendorf小瓶中，依次添加Na124I溶液(≤13μL，≤2.5mCi)、AcOH(5μL以酸化溶液)、1-(4-(三丁基甲锡烷基)苯乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(75μL，1.00mg/mL于MeCN中)和非水溶性碘化试剂(iodogen)(5μL，1.00mg/mL于MeCN中)溶液。使反应在室温下保持5分钟。
将粗反应混合物用0.5mL的20％EtOH/H2O稀释，并用制备型HPLC直接纯化，保留时间＝14.4分钟(图3)。将[124I]-IPEM收集在已经用Sigma-CoteTM预处理(然后用3mL的70％EtOH冲洗，接着用3mL的H2O冲洗)的1打兰小瓶中；从制备型HPLC收集的总体积<750μL。
然后将纯化级分的等分试样(～5-25μCi)注射到分析型HPLC上(图4，保留时间＝11.7分钟)。
然后将纯化的[124I]-IPEM在环境温度下真空浓缩至体积<100μL。
添加磷酸钠缓冲液(1.0M磷酸钠、1mM EDTA，pH＝6.86)(≥25μL)，使pH达到～6.5-7(用试纸条检查)。最后添加适量的新还原的CD8S 365(浓度～4.57mg/mL，在100mM磷酸钠缓冲液、1mM EDTA中，pH＝6.86)，以达到靶向比活性(即，如果收集25mCi/mg和2.0mCi靶向比活性的[124I]-IPEM，则添加17.5μL浓度为～4.57mg/mL的centyrin)。使缀合反应在环境温度下保持60分钟并检查反应进程以通过iTLC验证转化率超过90％。
纯化由以下步骤组成：用PBS/10％EtOH(1mL，pH＝7)稀释反应溶液，将反应溶液从1打兰小瓶转移到Vivaspin 6 5kDa MWCO离心过滤器中(参见附录中的预调节)。转移后，用PBS/10％EtOH(2×1mL，pH＝7)冲洗反应Eppendorf，并将洗涤液添加到过滤器中。将粗制反应混合物在20℃下以4000rpm离心30分钟。离心后，剩余<500μL溶液并且通过放射性TLC发现具有>95％的放射化学纯度(RCP)(图5)。如果体积<500μL，则用PBS/10％EtOH将纯化的[124I]-IPEM CD8S 365稀释为500μL体积，然后通过Millex-GV 0.22μm亲水性Durapore(PVDF)膜过滤。
该方案的放射化学产率为～50％，通过放射性TLC测量，放射化学纯度≥95％RCP。使用分析型反相HPLC测定最终产物的蛋白质浓度和比活性。使用UV中λ＝280nm处，保留时间＝7.3分钟的峰值的平均积分从校准曲线推断蛋白质浓度(代表性实例，参见图6)。还进行了与非放射性冷标准品IPEM CD8S 365(图7所示的MALDI分析)的共注射(参见图8)。使用
Figure BDA0002117739950000631
便携式测试系统，使用含LAL试剂水的10倍稀释液测量细菌内毒素浓度。
实施例10：食蟹猴中CD8表达的检测
选择两种抗CD8A FN3分子(CD8S365和CD8S368)用于非人灵长类动物(NHP)中的PET成像。用Zr-89(Zevacor,Somerset,NJ)或I-124(CPDC,Hamilton,Canada和Zevacor,Somerset,NJ)放射性标记抗CD8A分子。将大约1-2mCi放射性标记的抗CD8A分子注射到雌性NHP(食蟹猴)的隐静脉中，同时用氧气中的异氟烷麻醉。在大口径microPET Focus 220PET扫描仪(Siemens,Knoxville,TN)中，移动床以容纳动物整个身体(头部到下腹部)，扫描每只动物。每次扫描持续大约1小时，并在注射后15分钟、2小时和24小时获取扫描。使用2D最大似然期望最大化(ML-EM)算法将PET图像重构为体素大小1.898x 1.898x 0.796mm，尺寸128x 128x 475的3D图像。在多个时间点从注射的对侧腿的隐静脉到获得血液样品，并且在井式计数器中对血液放射性计数。
使用PMOD v3.7软件(PMOD,Zurich,Switzerland)分析PET图像。在诸如脾脏、肾脏和肝脏的器官周围手动绘制目标区域。将计数转换为每克组织的注射剂量百分比单位(％ID/g)，而血液放射性表示为％ID。代表性PET图像示于图9中。
每种NHP和每种抗CD8A FN3结构域分子(用Zr-89或I-124标记)的血液动力学示于表11中，并汇总在图10中。对于相同动物和抗CD8A分子，器官生物分布示于表12中(单位为％ID/g)，并汇总在图11中。在排泄器官中Zr-89标记的分子表现出放射性同位素的残留，这在肾脏中产生大背景信号，可能遮蔽其他附近组织。这在I-124标记的分子中几乎不存在。对于所有时间点，两种不同分子和两种不同放射性同位素之间的脾脏摄取量非常相似。
表11.用Zr-89或I-124放射性标记的每个centyrin的血液动力学(条目为％ID)。
Figure BDA0002117739950000641
对于相同动物和抗CD8A分子，器官生物分布示于表12中(单位为％ID/g)，并汇总在图11中。
表12.用Zr-89或I-124标记的不同centyrin的器官吸收量(条目为％ID/g)。
Figure BDA0002117739950000642
Figure BDA0002117739950000643
Figure BDA0002117739950000651
Figure BDA0002117739950000652
Figure BDA0002117739950000653
实施例11：食蟹猴中抗CD8A FN3结构域的特异性
为了测试抗CD8A分子的特异性，在成像前用嵌合CD8消耗抗体(CM-T807小鼠V/人Fc抗CD8抗体)处理相同的猴子以减少CD8+ T细胞。在成像前3天动物皮下施用10mg/kg CD8消耗抗体。通过在消耗之前和之后测量取自每只动物的血液样品中CD8 T细胞的百分比来确认CD8消耗(图12)。
将大约1-2mCi放射性标记的[I-124]CD8S365抗CD8FN3结构域分子注射到雌性NHP(食蟹猴)的隐静脉中，同时用氧气中的异氟烷麻醉。在大口径microPET Focus 220PET扫描仪(Siemens,Knoxville,TN)中，移动床以容纳动物整个身体(头部到下腹部)，扫描每只动物。每次扫描持续大约1小时，并在注射后15分钟、2小时和24小时获取扫描。使用2D最大似然期望最大化(ML-EM)算法将PET图像重构为体素大小1.898x 1.898x 0.796mm，尺寸128x128x 475的3D图像。在多个时间点从注射的对侧腿的隐静脉到获得血液样品，并且在井式计数器中对血液放射性计数。
使用PMOD v3.7软件(PMOD,Zurich,Switzerland)分析PET图像。在诸如脾脏、肾脏和肝脏的器官周围手动绘制目标区域。将计数转换为每克组织的注射剂量百分比单位(％ID/g)，而血液放射性表示为％ID。对于消耗型动物，图13中示出了代表性PET图像，显示图9中在非消耗型动物中看到的脾脏信号完全不存在。
图14中示出了每个消耗型和非消耗型NHP的血液动力学，而器官摄取量示于图15中。消耗型和非消型耗动物之间的血液动力学几乎没有差异。最早时间点的脾脏摄取量在消耗型和非消耗型之间相似，因为这是由血流控制的。然而，在稍后的时间点(2小时)，消耗型动物中的脾脏摄取量小于非消耗型动物中看到的脾脏摄取量的一半，并且基本上处于背景水平，证明了放射性标记的centyrin的CD8A特异性。
实施例12：在CD8过表达肿瘤中PET成像的灵敏度和特异性
为了测定可用抗CD8A FN3结构域分子和PET检测到的最低细胞数量，在小鼠中使用不同数量的CD8过表达细胞进行研究。使用40只4-5周龄雌性NOD-scid IL2rγnull(NSG)小鼠(JAX实验室)，并使其适应7-10天。将小鼠分组饲养在IVC笼中，处于12小时光照:黑暗循环(在06:30h照亮)，温度为19至22℃。为小鼠随意喂食标准高压灭菌的实验室食物和水。在研究开始前5-7天对小鼠进行耳标，并对尾部进行刺标以标识每只动物。
将HEK-293亲本和HEK-293-luc CD8+过表达细胞系保持为2D培养物。小鼠皮下植入在1:1培养基中的总共106个肿瘤细胞以培养含有不同比率的HEK-293-Luc CD8+表达细胞和HEK-293亲本细胞的混合物。一旦肿瘤可触诊，大约10-14天且大小为200-300mm3，就使用[I-124]CD8-S365使人CD8+细胞可视化。
在IVIS光谱光学成像仪(Perkin Elmer)中使用生物发光成像体内定量HEK-293-Luc CD8+细胞的荧光素酶表达。在注射150mg/kg D-荧光素后立即进行动态光学成像以鉴定峰值光发射。
将大约0.2-0.5mCi放射性标记的抗CD8A FN3结构域分子注射到尾静脉中，同时用氧气中的异氟烷麻醉。在Inveon microPET-CT扫描仪(Siemens,Knoxville,TN)中对每只动物进行扫描，静态扫描20分钟。示踪剂注射后2-3小时获取扫描。使用2D最大似然期望最大化(ML-EM)算法将PET图像重构为体素大小0.776x 0.776x 0.796mm，尺寸128x 128x 159的3D图像。
使用PMOD v3.7软件(PMOD,Zurich,Switzerland)分析PET图像。在肿瘤和其他器官如脾脏、肾脏和肝脏周围手动绘制目标区域。将计数转换为每克组织的注射剂量百分比单位(％ID/g)。代表性PET图像示于图16中。通过在Living Image v4.4软件(PerkinElmer)中绘制目标区域来量化荧光素酶表达。以光子数/秒/cm2/球面度单位测量光发射。
图17和图18中示出了对于CD8+HEK293细胞和亲本细胞而言，血液和肿瘤中放射性标记的抗CD8A FN3结构域分子的时间-活性曲线。与亲本相比，CD8表达细胞中抗CD8A FN3结合显著增加，而两者的血液活性相同。图19中根据植入细胞数量的变化，示出了CD8+HEK293细胞对抗CD8A FN3的摄取量。基于这些数据，估计最低检测水平为大约7.5x106个细胞。
序列表
SEQ ID No.1＝原始Tencon序列
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT
SEQ ID No.2＝TCL1文库
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV(X)7-12PLSAEFTT；
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7是任何氨基酸；并且
X8、X9、X10、X11和X12是任何氨基酸或缺失
SEQ ID No.3＝TCL2文库
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT；
其中
X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X2是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X3是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X4是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X5是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X6是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X7是Phe、Ile、Leu、Val或Tyr；
X8是Asp、Glu或Thr；
X9是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X10是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X11是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X12是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X13是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；
X14是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；并且
X15是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。
SEQ ID No.4＝稳定化的Tencon(Tencon 27)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
SEQ ID No.5＝TCL7(FG和BC环)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT；
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、X13、X14、X15和X16是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；并且
X7、X8、X9、X17、X18和X19是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或缺失
SEQ ID No.6＝TCL9(FG环)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12SNPLSAIFTT；
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；并且
X8、X9、X10、X11和X12是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或缺失。
SEQ ID No.7＝TCL14文库
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT；
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12和X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或M。
SEQ ID No.8＝TCL24文库
TCL24文库(SEQ ID NO:8)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT；
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12和X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V或W。
SEQ ID No.9＝Sloning-FOR
GTGACACGGCGGTTAGAAC
SEQ ID No.10＝Sloning-REV
GCCTTTGGGAAGCTTCTAAG
SEQ ID No.11＝POP2250
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC
SEQ ID No.12＝DigLigRev
CATGATTACGCCAAGCTCAGAA
SEQ ID No.13＝BC9
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
SEQ ID No.14＝BC8
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
SEQ ID No.15＝BC7
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
SEQ ID No.16＝BC6
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
SEQ ID No.17＝130mer-L17A
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTG
SEQ ID No.18＝POP222ext
CGG CGG TTA GAA CGC GGC TAC AAT TAA TAC
SEQ ID No.19＝LS1114
CCA AGA CAG ACG GGC AGA GTC TTC GGT AAC GCG AGA AAC AAC CAG GTT TTTCGG CGC CGG CAG CAT GGT AGA TCC TGT TTC
SEQ ID No.20＝LS1115
CCG AAG ACT CTG CCC GTC TGT CTT GG
SEQ ID No.21＝LS1117
CAG TGG TCT CAC GGA TTC CTG GTA CTG GAT CAG GAA AGA GTC GAA
SEQ ID No.22＝SDG10
CATGCGGTCTCTTCCGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTCCTGACCGTTCCGGGT
SEQ ID No.23＝SDG24
GGTGGTGAAGATCGCAGACAGCGGGTTAG
SEQ ID No.24＝POP2222
CGGCGGTTAGAACGCGGCTAC
SEQ ID No.25＝SDG28
AAGATCAGTTGCGGCCGCTAGACTAGAACCGCTGCCACCGCCGGTGGTGAAGATCGCAGAC
SEQ ID No.26＝FG12
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID No.27＝FG11
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID No.28＝FG10
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID No.29＝FG9
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID No.30＝FG8
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID No.31＝FG7
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID NO:32Tencon的FG环
KGGHRSN
SEQ ID No.33＝Tcon 6
AAGAAGGAGAACCGGTATGCTGCCGGCGCCGAAAAAC
SEQ ID No.34＝Tcon5E86Ishort
GAG CCG CCG CCA CCG GTT TAA TGG TGA TGG TGA
TGG TGA CCA CCG GTG GTG AAG ATC GCA GAC AG
>SEQID No 35:CD8W7
SQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAGSGSGSDYKDDDDKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>SEQID No 36:CD8W13
SQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDGGGGSDYKDDDDKGGGGSHHHHHHDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>SEQID No.37：mIgGK信号肽
Metdtlllwvlllwvpgstg
>SEQID No.38：人Fc
Dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
>SEQID No.39：接头序列
Ggggsdykddddkggggshhhhhh
Figure BDA0002117739950000781
Figure BDA0002117739950000791
Figure BDA0002117739950000801
Figure BDA0002117739950000811
Figure BDA0002117739950000821
Figure BDA0002117739950000831
Figure BDA0002117739950000841
Figure BDA0002117739950000851
Figure BDA0002117739950000861
Figure BDA0002117739950000871
Figure BDA0002117739950000881
Figure BDA0002117739950000891
Figure BDA0002117739950000901
SEQ ID.No.270 Tencon25
Figure BDA0002117739950000902
SEQ ID.NO：271食蟹猴CD8α
Figure BDA0002117739950000903
序列表
<110> 杨森生物科技公司(JANSSEN BIOTECH, INC.)
丽贝卡·霍金斯(HAWKINS, REBECCA)
史蒂文·雅各布斯(JACOBS, STEVEN)
曼纽尔·塞普尔韦达(SEPULVEDA, MANUEL)
<120> 结合CD8A的纤连蛋白III型结构域
<130> JBI5112WOPCT
<140> 待分配
<141> 2017-12-13
<150> 62/434,017
<151> 2016-12-14
<160> 281
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 1
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 2
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (75)..(81)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (82)..(86)
<223> 任何氨基酸或不存在
<400> 2
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85 90
<210> 3
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> Phe、Ile、Leu、Val或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> Asp、Glu或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (75)..(75)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (76)..(76)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (77)..(77)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(78)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (79)..(79)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (81)..(81)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (82)..(82)
<223> Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val
<400> 3
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser
65 70 75 80
Xaa Xaa Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 4
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 4
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 5
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(27)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(30)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(84)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (85)..(87)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或不存在
<400> 5
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp
20 25 30
Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile
35 40 45
Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr
85 90 95
Thr
<210> 6
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (75)..(81)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (82)..(86)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或不存在
<400> 6
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90 95
<210> 7
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu,
Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(41)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (68)..(68)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu,
Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (70)..(70)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (72)..(72)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(79)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (81)..(81)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr或Met
<400> 7
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa
20 25 30
Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser
65 70 75 80
Xaa Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 8
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(41)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (68)..(68)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (70)..(70)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (72)..(72)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(79)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (81)..(81)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (84)..(84)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (86)..(86)
<223> Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp
<400> 8
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa
20 25 30
Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Xaa Leu Xaa
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser
65 70 75 80
Xaa Pro Leu Xaa Ala Xaa Phe Thr Thr
85
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 9
gtgacacggc ggttagaac 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 10
gcctttggga agcttctaag 20
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 11
cggcggttag aacgcggcta caattaatac 30
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 12
catgattacg ccaagctcag aa 22
<210> 13
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (198)..(224)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 13
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180
ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttygac tctttcctga 240
tccagtacca ggaatctgaa aaagttggtg aagcgatcaa cctgaccgtt ccgggttctg 300
aacgttctta cgacctgacc ggtctgaaac cgggtaccga atacaccgtt tctatctacg 360
gtgttcttag aagcttccca aaggc 385
<210> 14
<211> 382
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (198)..(221)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 14
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180
ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nttygactct ttcctgatcc 240
agtaccagga atctgaaaaa gttggtgaag cgatcaacct gaccgttccg ggttctgaac 300
gttcttacga cctgaccggt ctgaaaccgg gtaccgaata caccgtttct atctacggtg 360
ttcttagaag cttcccaaag gc 382
<210> 15
<211> 379
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (198)..(218)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 15
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180
ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt ygactctttc ctgatccagt 240
accaggaatc tgaaaaagtt ggtgaagcga tcaacctgac cgttccgggt tctgaacgtt 300
cttacgacct gaccggtctg aaaccgggta ccgaatacac cgtttctatc tacggtgttc 360
ttagaagctt cccaaaggc 379
<210> 16
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (198)..(215)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 16
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180
ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnttyga ctctttcctg atccagtacc 240
aggaatctga aaaagttggt gaagcgatca acctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300
acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttctta 360
gaagcttccc aaaggc 376
<210> 17
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 17
cggcggttag aacgcggcta caattaatac ataaccccat ccccctgttg acaattaatc 60
atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacaggat 120
ctaccatgct g 131
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 18
cggcggttag aacgcggcta caattaatac 30
<210> 19
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 19
ccaagacaga cgggcagagt cttcggtaac gcgagaaaca accaggtttt tcggcgccgg 60
cagcatggta gatcctgttt c 81
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 20
ccgaagactc tgcccgtctg tcttgg 26
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 21
cagtggtctc acggattcct ggtactggat caggaaagag tcgaa 45
<210> 22
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 22
catgcggtct cttccgaaaa agttggtgaa gcgatcgtcc tgaccgttcc gggt 54
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 23
ggtggtgaag atcgcagaca gcgggttag 29
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 24
cggcggttag aacgcggcta c 21
<210> 25
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 25
aagatcagtt gcggccgcta gactagaacc gctgccaccg ccggtggtga agatcgcaga 60
c 61
<210> 26
<211> 485
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (357)..(392)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 26
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180
ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240
aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300
acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntctaaccc gctgtctgcg atcttcacca 420
ccggcggtca ccatcaccat caccatggca gcggttctag tctagcggcc gcaactgatc 480
ttggc 485
<210> 27
<211> 482
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (357)..(389)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 27
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180
ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240
aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300
acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt ctaacccgct gtctgcgatc ttcaccaccg 420
gcggtcacca tcaccatcac catggcagcg gttctagtct agcggccgca actgatcttg 480
gc 482
<210> 28
<211> 479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (357)..(386)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 28
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180
ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240
aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300
acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnntcta acccgctgtc tgcgatcttc accaccggcg 420
gtcaccatca ccatcaccat ggcagcggtt ctagtctagc ggccgcaact gatcttggc 479
<210> 29
<211> 476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (357)..(383)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 29
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180
ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240
aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300
acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntctaacc cgctgtctgc gatcttcacc accggcggtc 420
accatcacca tcaccatggc agcggttcta gtctagcggc cgcaactgat cttggc 476
<210> 30
<211> 473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成
多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (357)..(380)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 30
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180
ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240
aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300
acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tctaacccgc tgtctgcgat cttcaccacc ggcggtcacc 420
atcaccatca ccatggcagc ggttctagtc tagcggccgc aactgatctt ggc 473
<210> 31
<211> 470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (357)..(377)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 31
gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120
caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180
ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240
aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300
acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360
nnnnnnnnnn nnnnnnntct aacccgctgt ctgcgatctt caccaccggc ggtcaccatc 420
accatcacca tggcagcggt tctagtctag cggccgcaac tgatcttggc 470
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 32
Lys Gly Gly His Arg Ser Asn
1 5
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 33
aagaaggaga accggtatgc tgccggcgcc gaaaaac 37
<210> 34
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 34
gagccgccgc caccggttta atggtgatgg tgatggtgac caccggtggt gaagatcgca 60
gacag 65
<210> 35
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 35
Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly
20 25 30
Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala Ala Ser Pro Thr Phe
35 40 45
Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp
50 55 60
Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr
65 70 75 80
Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu
100 105 110
Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
115 120 125
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
130 135 140
Pro Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
145 150 155 160
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
165 170 175
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
180 185 190
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
195 200 205
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
210 215 220
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
225 230 235 240
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
245 250 255
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
260 265 270
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
275 280 285
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
290 295 300
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
305 310 315 320
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
325 330 335
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
340 345 350
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
355 360 365
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
370 375 380
Pro Gly Lys
385
<210> 36
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly
20 25 30
Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala Ala Ser Pro Thr Phe
35 40 45
Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp
50 55 60
Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr
65 70 75 80
Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu
100 105 110
Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
115 120 125
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
130 135 140
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
145 150 155 160
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Ser His His His His His His Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
180 185 190
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
195 200 205
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
210 215 220
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
225 230 235 240
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
245 250 255
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
260 265 270
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
275 280 285
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
290 295 300
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
305 310 315 320
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
325 330 335
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
340 345 350
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
355 360 365
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
370 375 380
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
385 390 395 400
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410
<210> 37
<211> 20
<212> PRT
<213> 未知(unknown)
<220>
<223> 对未知的描述：mIgGK信号肽
<400> 37
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 38
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 39
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 39
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser His His His His His His
20
<210> 40
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp His Thr Ala Thr Asn Ser Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Asp Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Thr Gly Arg Pro Val Ser Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90 95
<210> 41
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Val Lys Arg Pro Asn Ser Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Val Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Gly Arg Pro Arg Trp Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90 95
<210> 42
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Ser Lys Thr Asp Ser Ser Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Val Tyr Ile Glu
65 70 75 80
Gly Asn Pro Val Phe Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90 95
<210> 43
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 43
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Pro Glu Gly Asp Arg Pro Phe Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys Trp Glu
65 70 75 80
Gly Asn Arg Pro Val Ala Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90 95
<210> 44
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 44
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Arg His Glu Thr Ser Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Arg Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Val Val Glu Tyr Asp Ala
65 70 75 80
Ala Gly Asn Pro Lys Tyr Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90 95
<210> 45
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 45
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Ile Pro Asn Pro Ser Ser Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Val Phe Asp Pro
65 70 75 80
Val Gly Phe Pro Ser His Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90 95
<210> 46
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 46
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val His Val Glu Tyr Asp Gln
65 70 75 80
His Gly Arg Pro Arg Trp Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90 95
<210> 47
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 47
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Lys Ala Asn Arg Thr Thr Asp Leu His Phe Asp
20 25 30
Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile
35 40 45
Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Gln
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Gln Gln Pro Leu Tyr Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe
85 90 95
Thr Thr
<210> 48
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 48
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Asn Pro Ser Glu Asp Pro Gln Arg Phe Asp Ser
20 25 30
Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val
35 40 45
Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys Trp
65 70 75 80
Glu Gly Asn Arg Pro Val Ala Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr
85 90 95
Thr
<210> 49
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 49
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Trp Ser Asn Asp Asn Arg Pro Ile Phe Asp Ser
20 25 30
Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val
35 40 45
Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys Trp
65 70 75 80
Glu Gly Asn Arg Pro Val Ala Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr
85 90 95
Thr
<210> 50
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 50
Leu Pro Ala Pro Asn Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Pro Phe Val Ser Gln Asn Lys Pro His Phe Asp
20 25 30
Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile
35 40 45
Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys
65 70 75 80
Trp Glu Gly Asn Arg Pro Val Ala Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe
85 90 95
Thr Thr
<210> 51
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 51
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Gly Gln Tyr Ile Thr Ala Phe Ser Phe Asp Ser
20 25 30
Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val
35 40 45
Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Ala Trp
65 70 75 80
Phe Gln Gly Lys Pro Thr Trp Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr
85 90 95
Thr
<210> 52
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 52
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Ile Lys Asp Gly His Pro Arg His Phe Asp Ser
20 25 30
Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val
35 40 45
Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Val Tyr
65 70 75 80
Asp Arg Gly Gln Leu Ile Ser Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr
85 90 95
Thr
<210> 53
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 53
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Trp Pro Arg Lys Tyr Gln Arg Pro Phe Asp Ser
20 25 30
Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val
35 40 45
Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Ile Glu Trp
65 70 75 80
Ile Gly Asn Arg Pro Ile Ala Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr
85 90 95
Thr
<210> 54
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 54
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Pro Ile Ala Ser Gln Ile His Ser Pro Phe Asp
20 25 30
Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile
35 40 45
Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys
65 70 75 80
Tyr Asp Ile Asp Ser Arg Pro Ile Ser Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile
85 90 95
Phe Thr Thr
<210> 55
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 55
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Lys Lys Arg Glu Tyr Gln Asp Pro Gly Phe Asp
20 25 30
Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile
35 40 45
Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Asp Val Lys
65 70 75 80
Trp Glu Gly Asn Arg Pro Val Ala Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe
85 90 95
Thr Thr
<210> 56
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 56
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Lys
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Ser Asn Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Ala Val Phe Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Ala Phe Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 57
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 57
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Asp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Ala Val Phe Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Pro Leu Ser
65 70 75 80
His Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 58
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 58
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Ser Tyr Pro Glu Tyr Pro Pro Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Phe Gly Val Lys Gly Gly Asp Thr Ser
65 70 75 80
Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 59
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 59
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Ile Phe Glu Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Gln
65 70 75 80
Ser Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 60
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 60
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp
20 25 30
Ile Ser Tyr Pro Glu Trp Pro Pro Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 61
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 61
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Pro Pro Arg Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 62
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 62
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Arg
20 25 30
Ile Gly Tyr Pro Glu Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Gly Glu Ala Ile Val
35 40 45
Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Trp Val Ile Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Glu
65 70 75 80
Asn Ser Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 63
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 63
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Arg
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val Gln Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Leu Ser
65 70 75 80
Pro Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 64
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 64
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp
20 25 30
Ile Ala Tyr Thr Glu Trp Pro Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gly Gln Glu
35 40 45
Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp
50 55 60
Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Trp Val Ser Ile Tyr Gly
65 70 75 80
Val Lys Gly Gly Pro Asn Ser Gln Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90 95
<210> 65
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 65
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Glu Trp Pro Thr Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Ala Val Phe Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Asn Gln Ser
65 70 75 80
Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 66
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 66
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Lys
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Phe Pro Pro Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Tyr Val Ile Ile Ile Gly Val Lys Gly Gly Thr Asp Ser
65 70 75 80
Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 67
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 67
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr
20 25 30
Ile Ser Tyr Pro Glu Trp Pro Val Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Trp Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Ala Leu Ser
65 70 75 80
Val Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 68
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 68
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp
20 25 30
Ile Thr Tyr Pro Glu Trp Pro Asp Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile
65 70 75 80
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85 90
<210> 69
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 69
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Arg
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85
<210> 70
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 70
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr
20 25 30
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65 70 75 80
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<210> 71
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 71
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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20 25 30
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85
<210> 72
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 72
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Leu Pro Leu Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
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85
<210> 73
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 73
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala
20 25 30
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85
<210> 74
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 74
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp
20 25 30
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<210> 75
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 75
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln
20 25 30
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 76
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 77
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 78
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 79
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<210> 80
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 80
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 81
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<210> 82
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 82
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1 5 10 15
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<210> 83
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 83
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 84
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 85
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 86
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 87
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1 5 10 15
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<210> 88
<211> 89
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 88
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1 5 10 15
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<210> 89
<211> 89
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 89
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<210> 90
<211> 89
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 90
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<210> 91
<211> 89
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 91
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<210> 92
<211> 89
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 92
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<210> 93
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 93
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<210> 94
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 94
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1 5 10 15
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85
<210> 95
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 95
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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85
<210> 96
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 96
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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85 90
<210> 97
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 97
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
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85
<210> 98
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 98
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
20 25 30
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Tyr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 99
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 99
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 100
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
Tyr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
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<210> 101
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 101
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
20 25 30
Ile Trp Tyr Ala Glu Tyr Gly Tyr Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Asn Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Asp Val Ala Ile Ser Gly Val Lys Gly Gly Pro Arg Ser
65 70 75 80
Tyr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 102
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 102
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gly
20 25 30
Ile Thr Tyr Trp Glu Ser Pro Tyr Ala Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
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65 70 75 80
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85
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 103
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
20 25 30
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 104
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
20 25 30
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35 40 45
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 105
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 106
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 107
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 108
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 109
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 110
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 111
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 112
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 113
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 114
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 116
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 117
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 118
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 119
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<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 120
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 121
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 122
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<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 123
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<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 124
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 125
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 126
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<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 127
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 128
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 129
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 129
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 130
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 131
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<210> 132
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 132
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<210> 133
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 133
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<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
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<220>
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<400> 142
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<400> 162
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<220>
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<400> 163
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<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 164
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 166
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Leu Pro Leu Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Asp Arg Ser
65 70 75 80
Glu Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 167
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 167
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ile
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Thr Pro Val Arg Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85
<210> 168
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 168
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ser
20 25 30
Ile Ser Tyr Ile Glu Tyr Pro Glu Ile Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 169
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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65 70 75 80
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 170
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr
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Ile Pro Tyr Trp Glu Ser Glu Val Tyr Gly Glu Ala Ile Ala Leu Pro
35 40 45
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85
<210> 171
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 171
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
20 25 30
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85
<210> 172
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 172
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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85
<210> 173
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 173
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr
20 25 30
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35 40 45
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<210> 174
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 174
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr
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<210> 175
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 175
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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85
<210> 176
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 176
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 177
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 178
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 179
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 179
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 180
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 181
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 181
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 182
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 183
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 183
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 184
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 184
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 185
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 185
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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85
<210> 186
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 186
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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85
<210> 187
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 187
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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85
<210> 188
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 188
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 189
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 189
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<210> 190
<211> 89
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 190
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<210> 191
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 191
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<210> 192
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 192
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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50 55 60
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85
<210> 193
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 193
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe His
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85
<210> 194
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 194
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr
20 25 30
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65 70 75 80
Glu Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 195
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 195
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Tyr Pro Ala Leu Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Phe Val Ile Ile Ile Gly Val Lys Gly Gly Asp Glu Ser
65 70 75 80
Phe Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 196
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 196
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Leu Pro Ile Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Ile His Ser
65 70 75 80
Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 197
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 197
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asn
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
Asp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 198
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 198
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln
20 25 30
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35 40 45
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Thr Glu Tyr Tyr Val Trp Ile Pro Gly Val Lys Gly Gly Ala Phe Ser
65 70 75 80
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85
<210> 199
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 199
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Ile Lys Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
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Glu Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 200
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 200
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ile
20 25 30
Tyr Ile Glu Asn Lys Val Asn Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr Val Pro
35 40 45
Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr His Val Thr Ile Gly Gly Val Lys Gly Gly Thr Glu Ser Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 201
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 201
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val Thr Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 202
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 202
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Tyr Pro Ala Leu Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 203
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 203
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr
20 25 30
Ile Ser Tyr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
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85
<210> 204
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 204
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Glu
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Val Asn Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
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65 70 75 80
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85
<210> 205
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 205
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
20 25 30
Ile Ala Tyr Pro Glu Trp Pro Thr Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
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85
<210> 206
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 206
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ser
20 25 30
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 207
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 208
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Glu
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<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 209
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
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<210> 210
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 210
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Glu
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85
<210> 211
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 211
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Asp
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<210> 212
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 212
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 213
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 213
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 214
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 214
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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85
<210> 215
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 215
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 216
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 216
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 217
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 217
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 218
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 218
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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65 70 75 80
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<210> 219
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 219
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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<210> 220
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 220
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 221
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 221
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 222
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 222
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 223
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 223
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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85
<210> 224
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 224
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 225
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 225
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 226
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 226
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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85
<210> 227
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 227
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
20 25 30
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85
<210> 228
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 228
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85
<210> 229
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 229
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln
20 25 30
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65 70 75 80
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85
<210> 230
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 230
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala
20 25 30
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35 40 45
Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 231
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 231
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90
<210> 232
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 232
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
20 25 30
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<210> 233
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 233
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Ala Lys Arg Pro Gly Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
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<211> 90
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 234
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 235
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 237
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 238
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<223> 对人工序列的描述：合成多肽
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<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 240
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<223> 对人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 245
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<223> 对人工序列的描述：合成多肽
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<223> 对人工序列的描述：合成多肽
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<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 255
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 256
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 257
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 258
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 259
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 260
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 261
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 262
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<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 263
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
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<210> 264
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 264
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<220>
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<400> 265
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 266
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
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65 70 75 80
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85 90
<210> 267
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 267
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala
20 25 30
Ile Ala Tyr Ala Glu Trp Pro Pro Gln Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Ser Tyr Ser
65 70 75 80
Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 268
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 268
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp
20 25 30
Ile Thr Tyr Ala Glu Trp Pro Asp Pro Gly Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Phe Val Val Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Glu Ile
65 70 75 80
Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 269
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 269
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gly
20 25 30
Ile Leu Tyr Tyr Glu Pro Val Asp Ser Gly Glu Ala Ile Thr Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Trp Val Val Ile Thr Gly Val Lys Gly Gly Ala Pro Ser
65 70 75 80
Thr Pro Leu Gly Thr Ile Phe Thr Thr
85
<210> 270
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 270
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 271
<211> 276
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 271
Met Arg Asn Gln Ala Pro Gly Arg Pro Lys Gly Ala Thr Ser Pro Pro
1 5 10 15
Pro Leu Pro Thr Gly Ser Arg Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Leu Arg
20 25 30
Ala Glu Pro Arg Pro Gly Glu Arg Val Met Ala Pro Pro Val Thr Ala
35 40 45
Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Gln
50 55 60
Phe Arg Val Ser Pro Leu Gly Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val
65 70 75 80
Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser
85 90 95
Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Thr Ala Ala Arg Pro Thr Phe Leu Leu
100 105 110
Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln
115 120 125
Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr Leu Arg
130 135 140
Asp Phe Arg Gln Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser
145 150 155 160
Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala
165 170 175
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
180 185 190
Thr Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
195 200 205
Ala Gly Gly Ser Val Asn Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
210 215 220
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ala Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
225 230 235 240
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys
245 250 255
Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser Gly Gly Lys Pro Ser Leu Ser
260 265 270
Asp Arg Tyr Val
275
<210> 272
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 272
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 273
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 273
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 274
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 274
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 275
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 275
Ala Pro Ala Pro
1
<210> 276
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 276
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 277
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 277
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro
20
<210> 278
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成多肽
<400> 278
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
35 40
<210> 279
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 279
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala
20 25
<210> 280
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 280
Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp
1 5
<210> 281
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对人工序列的描述：合成肽
<400> 281
Lys Gly Gly His Arg Ser Asn Pro
1 5

Claims (20)

1.一种分离的结合CD8A的FN3蛋白，其包含：
一种氨基酸序列，其序列选自由以下序列所组成的组：SEQ ID NO:68、79、81、83、89、122、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、和269。
2.如权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其中所述分离的结合CD8A的FN3蛋白与包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列的食蟹猴CD8A蛋白交叉反应。
3.如权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其中所述分离的结合CD8A的FN3蛋白与第二分子缀合。
4.如权利要求3所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其中所述第二分子是可检测标记。
5.如权利要求4所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其中所述可检测标记是放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原。
6.如权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其中正如通过酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法所测量的，所述分离的结合CD8A的FN3蛋白不激活体外CD8+T细胞。
7.如权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其中正如通过根据实施例3中所述的条件进行的表面等离子体共振所测量的，所述分离的结合CD8A的FN3蛋白与人CD8A蛋白结合，亲和力(KD)介于约0.02至约6.6nM之间。
8.如权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其还包含在所述分离的结合CD8A的FN3蛋白的N末端的甲硫氨酸。
9.如权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其中所述分离的结合CD8A的FN3蛋白与延长半衰期的部分偶联。
10.如权利要求9所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其中所述延长半衰期的部分是CD8结合分子、白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合分子、聚乙二醇(PEG)、CD8、CD8变体或免疫球蛋白Fc区的至少一部分。
11.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白。
12.一种载体，其包含权利要求11所述的多核苷酸。
13.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求12所述的载体。
14.一种产生与人CD8A蛋白特异性结合的分离的结合CD8A的FN3蛋白的方法，其包括在使得表达所述分离的结合CD8A的FN3蛋白的条件下培养权利要求13所述的分离的宿主细胞，并纯化所述分离的结合CD8A的FN3蛋白。
15.一种诊断试剂盒，其包含权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白。
16.一种诊断剂或捕获剂，其包含权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白。
17.如权利要求16所述的诊断剂，其中所述分离的结合CD8A的FN3蛋白与Zr-89或I-124缀合。
18.如权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其氨基酸序列选自由以下序列所组成的组：SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:89,和SEQ ID NO:122。
19.如权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其氨基酸序列选自由以下序列所组成的组：SEQ ID NO:229,SEQ ID NO:230,SEQ ID NO:231,SEQ ID NO:232,SEQ ID NO:233,和SEQ ID NO:234。
20.如权利要求1所述的分离的结合CD8A的FN3蛋白，其氨基酸序列选自由以下序列所组成的组：SEQ ID NO:235,SEQ ID NO:236,SEQ ID NO:237,SEQ ID NO:238,SEQ ID NO:239,SEQ ID NO:240,SEQ ID NO:241,SEQ ID NO:242,SEQ ID NO:243,SEQ ID NO:244,SEQID NO:245,SEQ ID NO:246,SEQ ID NO:247,SEQ ID NO:251,SEQ ID NO:252,SEQ ID NO:253,SEQ ID NO:254,SEQ ID NO:255,SEQ ID NO:256,SEQ ID NO:257,SEQ ID NO:258,SEQID NO:259,SEQ ID NO:260,SEQ ID NO:261,SEQ ID NO:262,SEQ ID NO:263,SEQ ID NO:264,SEQ ID NO:265,SEQ ID NO:266,SEQ ID NO:267,SEQ ID NO:268,和SEQ ID NO:269。
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