CN103254304A - 免疫激动剂偶联体、其制备方法及免疫激动剂偶联体在抗肿瘤中的应用 - Google Patents

免疫激动剂偶联体、其制备方法及免疫激动剂偶联体在抗肿瘤中的应用 Download PDF

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靳广毅
王晓梅
姜文奇
王竹林
林桂淼
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本发明提供一种免疫激动剂偶联体，其由小分子免疫激动剂和生物配体二部分组成，其化学结构通式为[I]，其中括弧中代表小分子免疫激动剂，R2代表各种生物配体。本发明还提供一种免疫激动剂偶联体的制备方法及所述免疫激动剂偶联体的应用。本发明提供的免疫激动剂偶联体可用于恶性肿瘤的免疫治疗和免疫调节，具有良好的治疗效果和调节效果。

Description

免疫激动剂偶联体、其制备方法及免疫激动剂偶联体在抗肿瘤中的应用
技术领域
本发明涉及本发明涉及一种免疫激动剂偶联体，及其制备，以及免疫激动剂偶联体在抗肿瘤中的应用。
背景技术
免疫激动剂和免疫抗原(如疫苗,多肽,蛋白,糖蛋白，多糖,多聚核苷及酸,灭活的细胞和灭活的微生物等)的联合应用或者偶联,往往产生更好的免疫效应(World Chin J Digestol 2005 September15;13(17):2078-2081&Vaccine,Volume 23,Issue 45,1 November 2005,Pages 5263-5270；The J.Cln.Invest.2011,121(5),1782-1796)。
免疫抗原可以是生物配体，生物配体可以是各种肿瘤抗原，各种肿瘤抗原的特性和制备、来源，可参看文献（Clin Cancer Res,2009;15(17),5323-5337）。具体请参见下表：
Figure BDA00001703780300011
Figure BDA00001703780300021
Figure BDA00001703780300031
Figure BDA00001703780300041
由于这些肿瘤抗原一般来说均为弱抗原或者缺乏免疫原性，因此，有必要提供一种免疫激动剂和免疫抗原合成的偶联体，以提高它们的抗原性和免疫原性，提高它们在抗肿瘤中的效用。
发明内容
本发明提供一种免疫激动剂偶联体，及其制备，以及免疫激动剂偶联体在抗肿瘤中的应用。
所述免疫激动剂偶联体由小分子免疫激动剂和生物配体二部分组成，其化学结构通式为[I]，其中括弧中代表小分子免疫激动剂，R2代表各种生物配体：
Figure BDA00001703780300042
通式[I]中:
X1代表SH OH。
R1代表各种直链的或支链的烷基、取代的和未取代的烷基或者烷氧基烷基。
m和n代表数字1-10，m为小分子激动剂的数目，n为生物配体的数目。
R2代表各种生物配体(包括多肽,蛋白,糖蛋白，多糖，多聚核苷及酸,灭活的细胞和灭活的微生物等)。
X2代表苯环上不同位置的酰胺键：
以OCT4、SOX2、NANOG、MUC1，MG7、POSTN、Twist、Anxa1、Akt、CD47、Sp17、PSMA为例的蛋白的偶联体1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、17的结构式代表如下:
Figure BDA00001703780300051
其中OCT4、SOX2、Nanog为肿瘤干细胞抗原蛋白（中国医药导报,2011,8(8):1720;生命科学，2004,16（3），129-134），MG7是胃癌相关抗原蛋白（中国癌症杂志，2010年第20卷第4期，312-313），MUC1为多种肿瘤相关抗原（European Journal of Organic Chemistry,2011,20(21):3685-3689），POSTN是肿瘤相关蛋白（Nature,2012,481:85-89），Twist和Akt均为肿瘤相关抗原（沈阳医学院学报，2010，第12卷，第3期，182-184），Anxa1在多种肿瘤组织中特异表达（PNAS,2011,October 3,19587-19592；癌症进展，20l0年l月，第8卷，第l期，63-66），CD47在几乎每种癌细胞表面都高表达（Science:TranslationalMedicine,22December 2010 Vol 2 Issue 63 63ra94）。Sp17是在卵巢癌细胞异常高表达的肿瘤抗原(PloSONE，2010,5(5),e10471,1-13)。PSMA是前列腺癌的特殊标记物（Cancer,1998,82(11):2256-2261.）。
以偶联化合物1、2、4为例的合成路线(Scheme 1)如下所示:
Figure BDA00001703780300071
本发明通式[1]中的R2所代表的生物配体并不局限于举例说明中的各个肿瘤抗原，上述所述合成方法中的生物配体可以是各种肿瘤抗原（请参见背景技术部分表格中各种抗原），各种肿瘤抗原的特性和制备、来源，可参看文献（Clin Cancer Res,2009;15(17),5323-5337）。
所述免疫激动剂偶联体可用于恶性肿瘤的免疫治疗和免疫调节，其用药方法可为腹腔注射，皮下注射，肌肉注射和静脉注射；或者将所述免疫激动剂偶联体和免疫细胞（如树突状细胞，自然杀伤细胞NK、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞等）共培养后，分离免疫细胞体内回输的方法。
图示说明
图1是本发明提供的偶联化合物4(n＝1)的IFN-γ诱导对比图。
图2是本发明提供的偶联化合物4(n＝1)的IL-12诱导对比图。
具体实施方式
一、偶联化合物1的合成
1、OCT4的表达制备。参照文献《现代生物医学进展》，Pogress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.09MAY.2010，1610-1612。
2、化合物16的制备，具体路线如下：
Figure BDA00001703780300081
化合物16的具体合成方法为：
（1）化合物13的制备，参考文献PCT Int.Appl.,2011134669,03Nov2011。
（2）将化合物13（3.2克，0.01mol）与KOH、H2O及MeOH（重量比1：10：10，计100mL）混合回流加热12小时，减压蒸除甲醇，残余倾入100毫升水，盐酸中和至pH＝3，过滤，水洗，干燥得化合物14（2.55克，质量百分含量75%），ESIMS：344（M+H+）。
（3）将化合物14（1克，0.003mol）和100毫升二氯甲烷混合，室温慢慢加入20毫升溴素，室温搅拌24小时，减压抽去溴素，过滤，水洗，得浅黄色化合物15（3.6克，86%）,ESIMS：422(M+1);424。
（4）将化合物15（2.1克，0.005mol）溶于100毫升甲醇，加入硫脲（0.1mol），加热回流20小时，冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩至较小体积，倾入水中，盐酸调节pH至3，冷却至0度，过滤得化合物16（1.2克，65%）。ESIMS：376(M+1)。
3、偶联化合物1（m=5）的合成。
将10mg的OCT4(平均分子量38216)溶解于2ml的PBS溶液（是否为PBS缓冲液）。50mg化合物16的20mL的二甲基亚砜（DMSO）溶液与等摩尔的N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（混合，加入等摩尔的EDC（缩合剂），于室温搅拌2小时，将OCT4的PBS溶液加入混合搅拌过夜。用PD-10脱盐柱分离(Amershamdisposable PD-1 desalting column),将含产品OCT4偶合物的流出液(用280nM吸收波检测)合并,冷冻干燥。用质谱确定平均分子量为40003，确定偶联化合物1包含了5个化合物16的对应单体。用同样的方法合成了偶联化合物1（m=1，2,3,4）。
二、偶联化合物2、3、5、6、7、8、9、11、12、17的合成
1、化合物10的制备。参考文献PCT Int.Appl.,2010093436,19 Aug2010。具体为：
Figure BDA00001703780300091
2、各种抗原蛋白的制备及取得。
MUC1的制备，参考以下文献方法：
[1]Proc Natl Acad Sci.2011,109(1):261-266.
[2]Angew Chem Int Ed Engl,2010,49(21):3688-3692.
[3]Angew Chem Int Ed Engl,2011,50(7):1635–1639.
[4]European Journal of Organic Chemistry,2011,20(21):3685-3689.
[5]Chemistry,2011,17(23):6396-6406.
POSTN来源：鼠源和人源POSTN cDNA基因克隆和表达及其抗体购自北京义翘神州生物技术有限公司、或美国Adipogen International公司。
SOX2的制备：参考文献Journal of Huazhong Normal University (Nat.Sci.),2008,42(1),102-105。
Twist、Akt,、Anxa1、CD47和Nanog均购置于亚诺法生物技术股份有限公司。
Sp17的制备参考文献（中国病理生理杂志，2001，17（10），1019-1021）。
PSMA的制备参考文献（南京医科大学学报(自然科学版),2010,30(11):1608-1611）。
3、将偶联化合物1合成步骤的第三步中OCT4以SOX2、MUC1、POSTN、Twist、Anxa1、Akt、CD47、Sp17、PSMA、Nanog代替，其余试剂，反应时间，原料及方法步骤相同，可得偶联化合物2、3、5、7、9、11、12、17。将偶联化合物1合成步骤的第三步中OCT4以Twist、Akt代替，化合物16用化合物10代替，其余试剂，反应时间，原料及方法步骤相同，可得偶联化合物6及8。
MUC1的分子量为2967（参考文献[1]中化合物11），质谱鉴定所得偶联化合物3的分子量为3681.7，确定偶联了2个化合物16单体。
POSTN的平均分子量为85kDa（参考文献World J Gastroenterol,2007 October 21;13(39):5261-5266），质谱鉴定所得偶联化合物5的分子量为86787，确定偶联了5个化合物16单体。
SOX2的分子量为34454（参考蛋白库数据http://www.uniprot.org/uniprot/P48432），质谱鉴定SOX2与化合物16偶联后的所得偶联化合物2的分子量为35526.2，确定偶联了3个化合物16单体。
Twist1的分子量为47850，质谱鉴定Twist1与化合物10偶联后的所得偶联化合物6的分子量为49215，确定偶联了4个化合物10单体。
Anxa1的分子量为63800，质谱鉴定所得Anxa1与化合物16偶联后的所得偶联化合物7的分子量为65587，确定偶联了5个化合物16单体。
Akt1的分子量为78540，质谱鉴定所得Akt1与化合物10偶联后的所得偶联化合物8的分子量为80588，确定偶联了6个化合物10单体。
CD47的分子量为35200,质谱鉴定所得CD47与化合物16偶联后的所得偶联化合物9的分子量为35914.8，确定偶联了2个化合物16单体。
Sp17的分子量为17400,质谱鉴定所得Sp17与化合物16偶联后的所得偶联化合物11的分子量为18114.8，确定偶联了2个化合物16单体。
PSMA（with GST-tag）的分子量为107000,质谱鉴定所得PSMA与化合物16偶联后的所得偶联化合物12的分子量为109144.4，确定偶联了6个化合物16单体。
Nanog（with GST-tag）的分子量为61000,质谱鉴定所得Nanog与化合物16偶联后的所得17的分子量为62787，确定偶联了5个化合物16单体。
三、偶联化合物4的合成
1、MG7模拟表位多肽序列为：KPHVHTK(中华消化杂志，2007年8月第27卷第8期，520-524)，由深圳翰宇药业股份有限公司合成，分子量为846。
2、偶联化合物4（n=1）的合成
将化合物10（1mmol）溶解于DMSO(10mL)，加入等摩尔的NHS（N-羟基丁二酰亚胺）和等摩尔的EDC（缩合剂），室温搅拌30分钟，加入等摩尔的MG7表位多肽，室温搅拌过夜，用PD-10脱盐柱水洗脱分离,含偶联化合物4的馏分冷冻干燥的偶联化合物4（n=1）。质谱测分子量为1187，确定偶联了1个化合物10单体。
3、偶联化合物4（n=3）的合成
MG7的三聚合物由深圳翰宇药业股份有限公司合成，分子量为2502.
将偶联化合物4（n=1）的合成方法中的MG7表位多肽改为MG7的三聚合物(1mmol),其余方法相同，得偶联化合物4（n=3）。质谱测分子量为2843，确定偶联化合物4（n=3）偶联了1个化合物10单体。
四、生物活性测试方法
1、免疫因子的测试方法：
方法：ELISA
试剂和条件：
人体外周血单核细胞用重力沉降法离心分离得到。离心机为Ficoll-Hypaque.将分离出的细胞悬浮在RPMI1640媒介中，添加10%的FBS，L-谷氨酸，青霉素/链霉素（RP10,Invitrogen）,植于96井的试板。用本发明中的化合物1-9、11、12、17，在浓度0.1―10μM激发细胞，于37°C，5%的CO2环境下，培养24小时。用Luminex仪（Austin,TX）测量γ－干扰素和白介素12的水平。图1和图2中的所示的结果为平均值。其中，图1中T7为化合物10，T7-MG7为化合物4（n＝1）。图2中T7为偶联化合物16，T7-MG7为化合物4（n＝1）。
2、抗肿瘤效应方法：
以化合物1为例的小鼠体内抗肿瘤实验方法如下：
细胞：F9，小鼠睾丸胚胎癌细胞，1x106个每只。
动物：BALB/C雌雄各半5周。
种瘤：小鼠左/右皮下注射肿瘤细胞。
给药：腹腔注射（0.125mg/只/次，PBS溶液），分别在种瘤前一周、种瘤后当天，第7天共给药3次。
观察小鼠健康状况肿瘤大小（目测）。
14天后杀死老鼠，取血测细胞因子、取肿瘤称重、量长宽计算肿瘤体积。表1为所示为抑制肿瘤效果。
表1抑制肿瘤效果数据表
Figure BDA00001703780300111
由此可见，本技术方案提供的偶联化合物抗肿瘤效果显著。

Claims (8)

1.一种免疫激动剂偶联体，其由小分子免疫激动剂和生物配体二部分组成，其化学结构通式为[I]，其中括弧中代表小分子免疫激动剂，R2代表各种生物配体：
Figure FDA00001703780200011
通式[I]中:
X1为-SH或-OH；
R1为各种直链的或支链的烷基、取代的和未取代的烷基或者烷氧基烷基；
m和n代表数字1-10，m为小分子激动剂的数目，n为生物配体的数目；
R2为生物配体；
X2代表苯环上不同位置的酰胺键
Figure FDA00001703780200012
2.如权利要求1所述的免疫激动剂偶联体，其特征在于，所述生物配体为多肽,蛋白,糖蛋白，多糖，多聚核苷及酸,灭活的细胞或灭活的微生物。
3.如权利要求2所述的免疫激动剂偶联体，其特征在于，所述生物配体为OCT4、SOX2、MUC1、MG7、POSTN、Twist、Anxa1、Akt、CD47、Sp17、PSMA、Nanog。
4.如权利要求1所述的免疫激动剂偶联体，其特征在于，所述X1为-SH，所述R2为OCT4、SOX2、MUC1、MG7、POSTN、Twist、Anxa1、Akt、CD47、Sp17、PSMA、Nanog。
5.一种制备如权利要求1所述的免疫激动剂偶联体的方法，包括步骤：
制备化合物16或者化合物10；
提供或者制备生物配体；以及
将所述化合物16或者化合物10与生物配体偶联，得到所述免疫激动剂偶联体。
6.如权利要求5所述的制备免疫激动剂偶联体的方法，其特征在于，所述生物配体为OCT4、SOX2、MUC1、MG7、POSTN、Twist、Anxa1、Akt、CD47、Sp17、PSMA、Nanog，但是具体生物配体并不局限于举例中的各个肿瘤抗原。
7.利用权利要求1至4任一项所述的免疫激动剂偶联体制成的治疗药物或复方药物以及药学上可接受的载体的复合物或结合物。
8.如权利要求1至4任一项所述免疫激动剂偶联体，用于制作肿瘤免疫调节药物和肿瘤生物免疫治疗中的应用。
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