FI121916B - Menetelmiä ja koostumuksia, jotka ovat käyttökelpoisia angiogeneesin inhibointiin - Google Patents
Menetelmiä ja koostumuksia, jotka ovat käyttökelpoisia angiogeneesin inhibointiin Download PDFInfo
- Publication number
- FI121916B FI121916B FI963692A FI963692A FI121916B FI 121916 B FI121916 B FI 121916B FI 963692 A FI963692 A FI 963692A FI 963692 A FI963692 A FI 963692A FI 121916 B FI121916 B FI 121916B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- angiogenesis
- antagonist
- cam
- tumor
- tissue
- Prior art date
Links
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 182
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 70
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 45
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 108
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 227
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 201
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 125
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 110
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 85
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 70
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 62
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 54
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 44
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 35
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 30
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 29
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 29
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 claims description 28
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 claims description 28
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 22
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical group Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 12
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 8
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 6
- HGFOOLONGOBCMP-IBGZPJMESA-N (3s)-3-(6-methoxypyridin-3-yl)-3-[2-oxo-3-[3-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)propyl]imidazolidin-1-yl]propanoic acid Chemical compound C1=NC(OC)=CC=C1[C@H](CC(O)=O)N1C(=O)N(CCCC=2N=C3NCCCC3=CC=2)CC1 HGFOOLONGOBCMP-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 201000004959 laryngeal benign neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 101500027988 Mus musculus ADGRV1 subunit beta Proteins 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 167
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 114
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 98
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 92
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 73
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 73
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 57
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 43
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 37
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 37
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 34
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 30
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 30
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 29
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 28
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 28
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 26
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 24
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 24
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 22
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 22
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 20
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 17
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 17
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 16
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 13
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 13
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 12
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 12
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 12
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 12
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 11
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 11
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 10
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 9
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 9
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- -1 osteospontin Proteins 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 6
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 108010045325 cyclic arginine-glycine-aspartic acid peptide Proteins 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 6
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 6
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 6
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 6
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- LAWVRGYBVSVDED-JYJNAYRXSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-phenylethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LAWVRGYBVSVDED-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 5
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 5
- 108010048673 Vitronectin Receptors Proteins 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 5
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102220049163 rs35498994 Human genes 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 4
- 101100058944 Gallus gallus CALM gene Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010079105 Shope fibroma virus growth factor Proteins 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 3
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 3
- 108010057412 arginyl-glycyl-aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 3
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 201000005264 laryngeal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 3
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- ARNGIGOPGOEJCH-KKUMJFAQSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-phenylethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ARNGIGOPGOEJCH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenesulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCYJBCKCAPERSE-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N MCYJBCKCAPERSE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108010000851 Laminin Receptors Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101000781681 Protobothrops flavoviridis Disintegrin triflavin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000004492 methyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 2
- 235000011118 potassium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N thiocyanic acid Chemical compound SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N (2s)-2-azanyl-5-[bis(azanyl)methylideneamino]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-YFKPBYRVSA-N (2s)-6-amino-2-(hydroxyamino)hexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- RGNVSYKVCGAEHK-GUBZILKMSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RGNVSYKVCGAEHK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYQUWEHEBOMRPH-NYUBLWNDSA-N 2-[(2s,5r,8s,11s)-5-benzyl-11-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-3,6,9,12,15-pentaoxo-8-propan-2-yl-1,4,7,10,13-pentazacyclopentadec-2-yl]acetic acid Chemical compound N1C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1CC1=CC=CC=C1 YYQUWEHEBOMRPH-NYUBLWNDSA-N 0.000 description 1
- OJOVBVONXDWCFW-CBHOWOPOSA-N 2-[(2s,5r,8s,11s,14s)-5-benzyl-11-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-14-methyl-3,6,9,12,15-pentaoxo-8-propan-2-yl-1,4,7,10,13-pentazacyclopentadec-2-yl]acetic acid Chemical compound N1C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1CC1=CC=CC=C1 OJOVBVONXDWCFW-CBHOWOPOSA-N 0.000 description 1
- YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 2-azanyl-3-sulfanyl-propanoic acid Chemical compound SCC(N)C(O)=O.SCC(N)C(O)=O YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000087 Abdominal pain upper Diseases 0.000 description 1
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- IMMKUCQIKKXKNP-DCAQKATOSA-N Ala-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CCCN=C(N)N IMMKUCQIKKXKNP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- USNSOPDIZILSJP-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O USNSOPDIZILSJP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LTCKTLYKRMCFOC-KKUMJFAQSA-N Asp-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LTCKTLYKRMCFOC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 101000645291 Bos taurus Metalloproteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 241000499489 Castor canadensis Species 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N Cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N 0.000 description 1
- 108010048623 Collagen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 229940122097 Collagenase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- XABFFGOGKOORCG-CIUDSAMLSA-N Cys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XABFFGOGKOORCG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ISXJHXGYMJKXOI-GUBZILKMSA-N Glu-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ISXJHXGYMJKXOI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JPXNYFOHTHSREU-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CN JPXNYFOHTHSREU-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N Gly-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN)C(=O)O XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 108010050006 Gly-Asp-Gly-Arg Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010051151 Hyperviscosity syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 102100025305 Integrin alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- 102000002297 Laminin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 235000011779 Menyanthes trifoliata Nutrition 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYZKJBZEIFWZSR-LURJTMIESA-N N(alpha)-methyl-L-histidine Chemical compound CN[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 CYZKJBZEIFWZSR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000002356 Nectin Human genes 0.000 description 1
- 108060005251 Nectin Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 241000025414 Pentalagus furnessi Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 101800005164 Peptide V Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001693 R-peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIOBCQESNDTDE-FQPOAREZSA-N Tyr-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O XUIOBCQESNDTDE-FQPOAREZSA-N 0.000 description 1
- MNSSBIHFEUUXNW-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N MNSSBIHFEUUXNW-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000009443 Vascular Malformations Diseases 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CNC=N1 Chemical compound [N].C1=CNC=N1 GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000964 angiostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 201000009378 breast hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 235000011116 calcium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009104 chemotherapy regimen Methods 0.000 description 1
- 125000002668 chloroacetyl group Chemical group ClCC(=O)* 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 235000013985 cinnamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930016911 cinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002442 collagenase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 108010083321 cyclic(arginyl-alanyl-aspartyl-phenylalanyl-valyl) Proteins 0.000 description 1
- 108010050963 cyclo(arginyl-glycyl-aspartyl-phenylalanyl-valyl) Proteins 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002169 ethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010034892 glycyl-arginyl-glycyl-aspartyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical class [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009191 jumping Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000006510 metastatic growth Effects 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- CSHFHJNMIMPJST-HOTGVXAUSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 CSHFHJNMIMPJST-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N methyl p-hydroxycinnamate Natural products OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- KTTRNOFNGRWBMM-UHFFFAOYSA-N n,n'-dicyclohexylmethanediimine;n,n-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O.C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 KTTRNOFNGRWBMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1 PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006659 positive regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000032537 response to toxin Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A sucralfate Chemical group O[Al](O)OS(=O)(=O)O[C@@H]1[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H]1O[C@@]1(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)O1 MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A 0.000 description 1
- 229960004291 sucralfate Drugs 0.000 description 1
- 229950000244 sulfanilic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006441 vascular event Effects 0.000 description 1
- 230000009790 vascular invasion Effects 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 description 1
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70546—Integrin superfamily
- C07K14/70557—Integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Mycology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
Description
Menetelmiä ja koostumuksia, jotka ovat käyttökelpoisia I
angiogeneesin inhibointiin - Förfaranden och sammansättnin-gar användbara för inhibering av angiogenes 5
Keksinnön ala
Keksintö liittyy yleisellä tasolla lääketieteen alaan ja se liittyy erityisesti menetelmiin ja koostumuksiin kudosten 10 angiogeneesin inhiboimiseksi avP3-vitronektiinireseptorin antagonisteilla.
Tausta
Integriinit ovat ryhmä solun reseptoreita, joiden tiedetään 15 sitovan soluväliaineen proteiineja ja tästä syystä välittä vän solujen välisiä ja solujen ja soluväliaineen vuorovaikutuksia, joista käytetään yleisesti nimitystä solujen adheesioilmiöt. Vaikka monia integriinejä ja integriiniä sitovia ligandeja on kuvattu alan ammattikirjallisuudessa, 20 niin monien integriinien biologista tehtävää ei silti ole pystytty selvittämään. Integriinireseptorit muodostavat pro-teiiniryhmän, jolla yhteisenä rakenteellisena ominaisuutena ;*·.· ovat a- ja β-alayksiköistä muodostuneet ei-kovalenttiset heterodimeeriset glykoproteiinikompleksit.
25 vitronektiinireseptorin, joka on saanut nimensä alkuperäi- " ; sestä ominaisuudestaan sitoa ensisijaisesti vitronektiiniä, tiedetään nykyisin tarkoittavan kolmea eri integriiniä, '·’ * joista käytetään nimityksiä ανβ!, ανβ3 3a “vPs· Horton, Int.
30 J. Exp. Pathol. 71 (1990) 741 - 759. ανβχ sitoo fibro- nektiiniä ja vitronektiiniä. ανβ3 sitoo suurta määrää useita erilaisia ligandeja, joita ovat fibriini, fibrinogeeni, : laminiini, trombospondiini, vitronektiini, von Willebrand'in tekijä, osteospontiini ja luun sialoproteiini I. ανβ5 sitoo ,;/35 vitronektiiniä. Ne spesifiset tehtävät solujen adheesiossa, » · *·’' joihin nämä kolme integriiniä osallistuvat kudoksissa tapah- tuvissa solujen välisissä monissa vuorovaikutuksissa, ovat • · · 2 vielä tutkimuksen kohteena mutta on selvää on, että on olemassa eri integriinejä, joiden biologiset tehtävät poikkeavat toisistaan.
5 Yksi tärkeä tunnistuskohta monien integriinien ligandissa on arginiini-glysiini-asparagiinihappo (RGD) -tripeptidisek-venssi. RGD:n on havaittu esiintyvän kaikissa niissä ligan-deissa, joiden on edellä mainittu olevan vitronektiini-reseptori-integriinien ligandeja. RGD-sekvenssin sisältävät 10 polypeptidit ("peptidit") voivat jäljitellä tätä RGD:n tunnistuskohtaa ja tällaiset RGD-peptidit ovat tunnettuja integriinien toiminnan inhibiittoreita. On kuitenkin tärkeää panna merkille, että RGD-peptidin sekvenssin ja rakenteen mukaan inhibitiospesifisyyttä voidaan kuitenkin muuttaa sen 15 kohdistamiseksi tiettyihin nimenomaisiin integriineihin.
RGD-tunnistuskohtaa koskevia pohdintoja on esitetty julkaisuissa Pierschbacher, et ai., Nature 309 (1984) 30 - 33 ja Pierschbacher, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 20 (1984) 5985 - 5988. Useita erilaisia RGD-polypeptidejä, joiden integriinispesifisyys vaihtelee, on myös kuvattu julkaisuissa Grant, et ai., Cell 58 (1989) 933 - 943, . . Cheresh, et ai., Cell 58 (1989) 945 - 953, Aumailley, et ai., FEBS Letts. 291 (1991) 50 - 54 ja Pfaff, et ai., J.
*·’ ' 25 Biol. Chem. 269 (1994) 20233 - 20238 ja US-patentti- julkaisuissa nro 4 517 686, 4 578 079, 4 589 881, 4 614 517, «· · : 4 661 111, 4 792 525, 4 683 291, 4 879 237, 4 988 621, 5 041 380 ja 5 061 693.
30 Angiogeneesi on kudosten suonittumisilmiö, johon sisältyy uusien kehittyvien verisuonten kasvu kudokseen ja siitä käytetään myös nimitystä uudissuonittuminen. Tämän ilmiön välikappaleina ovat kudokseen tunkeutuvat endoteelisolut ja sileät lihassolut. Ilmiön ajatellaan etenevän millä tahansa ’·1 2 # 35 kolmesta reaktiotiestä: verisuonet voivat lähteä kasvamaan : i jo olemassa olevista suonista, suonet voivat lähteä kehitty- :***: mään alusta alkaen prekursorisoluista käsin (vaskulogeneesi) · · 2 • · 3 tai olemassa olevien pienten suonten läpimitta voi suurentua. Blood, et ai., Bioch. Biophys. Acta 1032 (1990) 89 -
118. Suonten endoteelisolujen tiedetään sisältävän vähintään viisi RGD-sekvenssistä riippuvaista integriiniä, joita ovat 5 vitronektiinireseptori (ανβ3 tai avjS5) , kollageenityyppien I
ja IV reseptori , laminiinireseptori (c^jSi) » fibro- nektiini/laminiini/kollageenireseptori (or3jSi) ja fibro- nektiinireseptori (α5βχ) . Davis, et ai., J. Cell. Biochem. 51 (1993) 206 - 218. Sileän lihassolun tiedetään sisältävän 10 vähintään kuusi RGD-sekvenssistä riippuvaista integriiniä, joita ovat avj83 ja α^β5.
Angiogeneesi on tärkeä ilmiö neonataalisessa kasvussa, mutta se on myös tärkeä haavojen parantumisessa ja sellaisten 15 useiden erilaisten kliinisten sairauksien patogeneesissa, joita ovat kudosten tulehdus, niveltulehdus, tuumorien kasvu, diabeettinen retinopatia, keltatäplän degeneroituminen verkkokalvon uudissuonittumisen vaikutuksesta ja muut näitä vastaavat sairaustilat. Näistä angiogeneesiin liitty-20 vistä sairauksien kliinisistä ilmenemismuodoista käytetään nimitystä angiogeeniset taudit. Folkman, et ai., Science 235 (1987) 442 - 447. Angiogeneesiä ei tavallisesti esiinny . . aikuisiän kudoksissa tai kypsissä kudoksissa, vaikka sitä « ·« esiintyykin haavojen paranemisessa ja keltarauhasen kasvu- • · · ’·’/ 25 syklissä. Näitä kysymyksiä on käsitelty esimerkiksi jul- • « · ’·'·· kaisussa Moses, et ai., Science 248 (1990) 1408 - 1410.
M · • ·
Angiogeneesin inhibition on ehdotettu olevan tuumorin : kasvun rajoittamiseen soveltuva käyttökelpoinen hoitomuoto.
30 On ehdoteettu, että angiogeneesiä inhiboitaisiin (l) inhi boimalla "angiogeenisten molekyylien", kuten /3FGF:n (fibro-blastikasvutekijä), vapautumista (2) neutraloimalla angio- . .·. geenisiä molekyylejä kuten esimerkiksi käyttämällä (8FGF:ää « · · lii vastaan suunnattuja vasta-aineita, ja (3) inhiboimalla • · *. . 35 angiogeenisten ärsykkeiden aikaansaamaa endoteelisoluvastet- ··* ta. Tämä viimeksi mainittu strategia on saanut osakseen : huomiota ja Folkman, et ai., Cancer Biology 3 (1992) 89 - 4 96, ovat kuvanneet useita endoteelisoluvasteen inhibiitto-reita, joita ovat kollagenaasin inhibiittori, tyvikalvon muodostumis- ja hajoamistapahtuman inhibiittorit, angio-staattiset steroidit, sienistä peräisin olevat angiogeneesin 5 inhibiittorit, verihiutaletekijä 4, trombospondiini, nivel- tulehduslääkkeet, kuten D-penisillamiini ja kultatiomalaat-ti, D3-vitamiinin analogit, alfa-interferoni ja muut näitä vastaavat yhdisteet, joita voitaisiin käyttää inhiboimaan angiogeneesiä. Muita ehdotettuja angiogeneesin inhibiitto-10 reita on tarkasteltu julkaisuissa Blood, et ai., Bioch.
Biophys. Acta. 1032 (1990) 89 - 118, Moses, et ai., Science 248 (1990) 1408 - 1410, Ingber, et ai., Lab. Invest. 59 (1988) 44 - 51 sekä US-patenttijulkaisuissa nro 5 092 885, 5 112 946, 5 192 744 ja 5 202 352. Mitkään näistä edellä 15 olevissa kirjallisuusviitteissä kuvatuista angiogeneesin inhibiittoreista eivät ole suunnattu QfvjS3:n inhibitioon.
On myös kuvattu vitronektiinireseptori av03:a inhiboivia RGD-sekvenssin sisältäviä peptidejä. Aumailley, et ai., FEES 20 Letts. 291 (1991) 50 - 54, Choi, et ai., J. Vasc. Surg. 19 (1994) 125 - 134, Smith, et ai., J. Biol. Chem. 265 (1990) 12267 - 12271 ja Pfaff, et ai., J. Biol. Chem. 269 (1994) ; 20233 - 20238. 0!vj83-integriinillä ei ole kuitenkaan koskaan ehdotettu olevan osuutta angiogeneesissä eikä tällaista • · 1 25 tehtävää ole tunnistettu vasta kuin tässä keksinnössä.
• · • · • · · : Koska useille erilaisille integriinin a- tai /S-alayksiköille immunospesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö on : : : inhiboinut soluadheesiota in vitro -olosuhteissa, niin 30 αν|83:η on otaksuttu aiheuttavan useiden erilaisten solutyyp pien, mukaan lukien mikroverisuonten endoteelisolujen, soluadheesion. Davis, et ai., J. Cell. Biol. 51 (1993) 206 -218. Lisäksi Nicosia, et ai., Am. J. Pathol. 138 (1991) • · 829 - 833, ovat kuvanneet RGD-peptidin GRGDS käyttöä inhi- *.. 35 boimaan "mikroverisuonten" muodostumista kollageenigeelissä • · · ·.· viljellystä rotan aortasta in vitro -olosuhteissa. "Mikro- : verisuonten" muodostumisen inhibitio in vitro -olosuhteissa • · · · « • · · • · 5 kollageenigeeliviljelmissä ei ole kudoksessa tapahtuvan angio-geneesin inhibition malli, koska mikroverisuonirakenteiden ei ole osoitettu vastaavan kehittymässä olevia hiussuonia tai että mikroverisuonen muodostuminen kollageenigeeliviljelmässä 5 vastaisi uudissuonittumiskasvua omalla paikallaan olevaan kudokseen, kuten niveltulehduskudokseen, tuumorikudokseen tai sairastuneeseen kudokseen, jossa angiogeneesiä halutaan inhiboitavan.
10 Tästä syystä tämän patenttihakemuksen tekijät eivät ole tietoisia mistään muista tutkimuksista kuin mitä tässä keksinnössä on raportoitu, jotka osoittaisivat, että angiogeneesiä voitaisiin inhiboida kudoksessa käyttäen solu-adheesion inhibiittoreita. Koskaan aikaisemmin ei ole osoi-15 tettu varsinkaan sitä, että angiogeneesiin kudoksessa tarvittaisiin ανβ3:η toimintaa tai että avp3-antagonistit voisivat inhiboida kudosten angiogeneesiä.
Keksinnön lyhyt kuvaus 20 Tämän keksinnön selitys osoittaa, että kudosten angio- • · ·.*·· geneesiin tarvitaan a„£3-integriiniä ja että ανβ3:η inhibiit- : torit voivat inhiboida angiogeneesiä. Tässä patenttiselityk- : sessä osoitetaan myös, että muiden integriinien, kuten ανβ5:η • ·· tai οίνβχςη, antagonistit eivät inhiboi angiogeneesiä otaksut- • · . 25 tavasti siitä syystä, että nämä muut integriinit eivät ole • · · ::: angiogeneesin tapahtumiselle välttämättömiä.
• · · • · · Tässä keksinnössä kuvataan tästä syystä menetelmiä kudoksessa tapahtuvan angiogeneesin inhiboimiseksi, jotka menetelmät si-*:**: 3 0 sältävät sen, että kudokseen annostellaan koostumusta, jo ka sisältää angiogeneesiä inhiboivan määrän a^3-antagonistia.
··· • · *···* Käsiteltävä kudos voi olla mikä tahansa kudos, kuten sairas :*·.· kudos, jossa esiintyy uudissuonittumista ja angiogeneesiä • · 35 halutaan inhiboitavan. Esimerkkejä kudoksista ovat tulehtunut • ♦ kudos, kiinteät tuumorit, etäpesäkkeet, uudelleen ahtautumassa olevat kudokset ja muut näitä vastaavat kudokset.
6 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi tarkoitettu avP3-antagonisti kykenee sitoutumaan oireen ja inhiboimaan kompetitiivisesti ανβ3:η kyvyn sitoutua luonnolliseen ligandiin. Antagonistissa esiintyy edullisesti spesi-5 fisyyttä ανβ3: a kohtaan muiden integriinien kustannuksella. Erityisen edullisessa sovellutusmuodossa o^3-antagonisti inhiboi fibrinogeenin tai muiden RGD-sekvenssin sisältävien ligandien sitoutumista ανβ3:θθη mutta ei inhiboi huomattavassa määrin fibronektiinin sitoutumista 0ίιη>β3: een. Edullinen ανβ3-10 antagonisti voi olla polypeptidi tai ανβ3:η kanssa immuno-logisesti reagoiva monoklonaalinen vasta-aine tai tämän toiminnallinen fragmentti.
Täsmällisesti keksinnön mukainen käyttö on kuvattu oheisessa patenttivaatimuksessa 1.
15
Piirrosten lyhyt kuvaus
Osan tästä keksinnöstä muodostavissa piirroksissa: kuviot IA - ID kuvaavat integriinin β3- ja βι-alayksikköjen • · ·.*·· jakautumista kudoksessa, normaalissa ihossa ja ihossa, jossa 20 haavan paraneminen on käynnissä ja josta käytetään nimitystä j ;*j jyväiskudos. Immunohistokemialliset analyysit β3:3 ja βι^£ ·♦· vastaan suunnatuilla vasta-aineilla suoritettiin esimerkissä ♦ ♦ l 3A kuvatulla tavalla. Kuvioissa IA ja IB kuvataan anti^3:n • · · J 1 • · · ’** immunologista reagoivuutta normaalissa ihossa ja jyväis- • · ·
*·’ 25 kudoksessa, tässä järjestyksessä ilmoitettuna. Kuviot 1C ja ID
kuvaavat antimiin immunologista reagoivuutta normaalissa *:**ϊ ihossa ja jyväiskudoksessa, tässä järjestyksessä ilmoitettuna.
• · . Kuvioissa 2A - 2D kuvataan von Willebrandin tekijän ja laminiiniligandien, joista edellinen sitoo integriinin β3- ··· Σ : 30 alayksikköä ja jälkimmäinen βχ-alayksikköä, jakautumista .* . kudokseen normaalissa ihossa ja ihossa, jossa haavan pa- • · · ’ * raneminen on käynnissä ja josta käytetään nimitystä jyväis kudos. Immunohistokemialliset analyysit vasta-aineilla, jotka oli suunnattu von Willebrandin tekijää vastaan (anti-vWF) ja 7 laminiinia vastaan (anti-laminiini) , suoritettiin esimerkissä 3B kuvatulla tavalla. Kuvioissa 2A ja 2B kuvataan anti-vWF:n immunologista reagoivuutta normaalissa ihossa ja jyväis-kudoksessa, tässä järjestyksessä ilmoitettuna. Kuvioissa 2C ja 5 2D kuvataan anti-laminiinin immunologista reagoivuutta normaalissa ihossa ja jyväiskudoksessa, tässä järjestyksessä ilmoitettuna.
Kuvioissa 3A - 3D kuvataan vitronektiini-integriinireseptorin 10 ανβ3:η jakautumista kudoksessa rakkosyövän, koolonisyövän, rintarauhassyövän ja keuhkosyövän kudosbiopsioissa, tässä järjestyksessä ilmoitettuna. Immunokemialliset analyysit avP3:a vastaan suunnatulla LM609-vasta-aineella suoritettiin esimerkissä 3C kuvatulla tavalla.
15
Kuvio 4 kuvaa valokuvaa tämän keksinnön mukaisesta tyypillisestä CAM:stä, jossa ei esiinny verisuonia ja joka edustaa käsittelemätöntä 10 päivän ikäistä kanan alkiota. Preparaatti kuvataan esimerkissä 5B.
20 . . Kuvioissa 5A - 5C kuvataan integriinien βχ ja ανβ3 jakautumista • t · *e>· kudokseen tämän keksinnön mukaisessa CAM-preparaatissa. Kuvio • · · *·1 1 5A esittää βχ-alayksikön jakautumista käsittelemättömässä 10 päivän ikäisessä CAM-preparaatissa havaittuna immuno- ♦ · · ί · J 25 fluoresenssin avulla tämän immunologisesta reagoivuudesta
; βχ:tä vastaan suunnatun CSAT-vasta-aineen kanssa. Kuvio 5B
··· esittää ανβ3-reseptorin jakautumista käsittelemättömässä 10 päivän ikäisessä CAM-preparaatissa havaittuna immunofluore-. senssin avulla immunologisesta reagoivuudesta o^ra vastaan ] 30 suunnatun LM609-vasta-aineen kanssa. Kuvio 5C esittää ανβ3- * 1 reseptorin jakautumista βΡΘΡ:1ΐ3 käsitellyssä 10 päivän ikäi- sessä CAM-preparaatissa havaittuna käyttäen immunofluore- ···· .···. senssin avulla tämän immunologisesta reagoivuudesta o^3:a • · 11 vastaan suunnatun LM609-vast a-aineen kanssa. Käsittelyt ja • · ·.1·· 35 tulokset on kuvattu esimerkissä 5C.
• · 8
Kuvio 6 kuvaa pylväskaavion muodossa oiw@3m ja ^:11 suhteellisen ilmentymisen kvantitointia käsittelemättömissä ja i8FGF:lla käsitellyissä 10 päivän ikäisissä CAM-preparaateis-sa esimerkissä 6A kuvatulla tavalla. Fluoresenssin voimak-5 kuuden keskiarvo on esitetty Y-akselilla ja integriini- profiilit on esitetty X-akselilla.
Kuviot 7A - 7C kuvaavat käsittelemättömän 10 päivän ikäisen CAM-preparaatin, |SFGF:lla käsitellyn CAM-preparaatin ja 10 TNFa:11a käsitellyn CAM-preparaatin ulkonäköä, täss järjes tyksessä ilmoitettuna, ja kokeellinen suoritustapa ja tulokset on kuvattu esimerkissä 6A.
Kuviot 8A - 8E kuvaavat paikallisen vasta-ainekäsittelyn 15 vaikutusta FGF:n aikaansaamaan angiogeneesiin 10. päivän
CAM-preparaatissa esimerkissä 7A1) kuvatulla tavalla. Kuvio 8A esittää käsittelemätöntä CAM-preparaattia, jossa ei esiinny verisuonia. Kuvio 8B esittää jSFGF-käsittelyn aikaansaaman uuden suonikasvun tunkeutumisen alueeseen, jossa 20 aikaisemmin ei esiintynyt suonittumista. Kuviot 8C, 8D ja 8E
esittävät tässä järjestyksessä ilmoitettuna jS-^ä vastaan suunnatun vasta-aineen (anti-jSlf· CSAT) , o;vjS5:ttä vastaan : suunnatun vasta-aineen (anti-avjS5; P3G2) ja α^β3·.3. vastaan • · · suunnatun vasta-aineen (anti-θ' /3o; LM609) vaikutusta.
• · • . 25 • · t *·:· Kuviot 9A - 9C kuvaavat synteettisen peptidin 66203 suonen- « · : . sisäisen injektion vaikutusta tuumorien aikaansaamaan angio-
·.·. geneesiin esimerkissä 7D2) kuvatulla tavalla. Kuvio 9A
• · '·/. · osoittaa, että suonensisäisellä käsittelyllä, johon käyte- 30 tään kontrollipeptidiä (kontrollipeptidituumori), ei ole inhiboivaa vaikutusta sellaiseen angiogeneesiin, joka johtuu tuumorin muodostumisen käynnistymisestä. Tällaisen angio-
, .· geneesin inhibitio käyttämällä peptidin 66203 (syklinen RGD
• · ’V. -tuumori) suonensisäistä injektiota on esitetty kuviossa 9B.
• · *. . 35 Kypsiin olemassa oleviin verisuoniin kohdistuvien inhibito- ··· risten vaikutusten tai sytotoksisuuden puuttuminen peptidin • · · : 66203 suonensisäisen infuusion jälkeen alueella, joka on
··· -f ' J
• · • · • · • · • · • · · · 9 tuumorilla käsitellyn alueen vieressä, on esitetty kuviossa 9C (CAM-preparaatin syklinen RGD -vierusalue).
Kuvioissa 10A - 10C kuvataan monoklonaalisilla vasta-aineil-5 la suoritetun suonensisäisen käsittelyn vaikutusta kasvu tekijän aikaansaamaan angiogeneesiin esimerkissä 7B1) kuvatulla tavalla. Kuvio 10A esittää 0FGF:n aikaansaamaa angio-geneesiä ilman vasta-ainekäsittelyä (kontrolli). Samanlaisen preparaatin käsittely Qfvj85:ttä vastaan suunnatulla vasta-10 aineella P3G2 kuviossa 10B esitetyllä tavalla ei johtanut angiogeneesin inhiboitumiseen. Angiogeneesi saatiin inhiboitua suorittamalla käsittely avjS3:aa vastaan suunnatulla vasta-aineella LM609 kuviossa 10C esitetyllä tavalla.
15 Kuviot 11A - 11C kuvaavat niitä vaikutuksia, joita paikal- lisest suoritettu käsittely integriiniä vastaan suunnatuilla vasta-aineilla esimerkissä 7C kuvatulla tavalla aiheuttaa alkion angiogeneesille. 6 päivän ikäisen CAM:n käsittely erikseen /^rtä ja Q!vj85:ttä vastaan suunnatuilla vasta-ai- 20 neilla ei inhiboinut angiogeneesiä, mikä käy ilmi niitä näitä vastaavista kuvioista 11A ja 11B. Tästä poiketen käsittely α^β3:Ά vastaan suunnatulla vasta-aineella LM609
.·.: johti verisuonten muodostumisen inhiboitumiseen kuviossa 11C
• «· ··. kuvatulla tavalla.
* « 1 • · * * . 25 • ·
Kuvio 12 kuvaa tuumoriin tulevien verisuonten lukumäärän • « · • · kvantitointia CAM-valmisteessa esimerkissä 7D1) kuvatulla • * *.ϊ. tavalla. Kuvaaja esittää Y-akselilla niiden verisuonten • » ·.· lukumäärää, jotka ovat tulosta CSATm (anti-i^) , LM609:n 30 (anti-a^) tai P3G2:n (anti-av/35) käytöstä paikallis- käsittelyyn.
. .* Kuviot 13A - 13D kuvaavat 7 päivää käsittelyn jälkeen saatu- ··· .·:* jen tuumorien märkäpainojen vertaamista tuumorien lähtö- • · *· · 35 painoihin esimerkissä 9Al)a kuvatulla tavalla. Kukin palkki • ·· *.* edustaa ryhmää kohti käytettyjen 5-10 tuumorin keskiarvoa «·· *... ± S.E. Tuumorit olivat peräisin humaanimelanooman (M21-L) • ♦ • · t · » · • · i··· 10 (kuvio 13A), haimakarsinooman (FG) (kuvio 13B), keuhko-karsinooman (UCLAP-3) (kuvio 130 ja kurkunpääkarsinooman (HEP3) (kuvio 13D) CAM-preparaateista ja preparaatteja oli käsitelty suonensisäisesti PBS:lla, CSAT:lla (anti-jS]^) tai 5 LM609:lla (anti-av/33) . Kuvaajat esittävät Y-akselilla niiden tuumorien painoja, joka olivat peräisin CSATrn (anti-/^) , LM6O9 : n (anti-QfvjS3) tai PBS:n käytöstä suonensisäisesti X-akselilla esitettyjen merkintöjen mukaisesti.
10 Kuviot 14A ja 14B kuvaavat P3G2:lla (anti-avjS5) (kuvio 14A) ja LM609:llä (anti-aiv|83) (kuvio 14B) käsiteltyjen tuumorien histologisia leikkeitä, jotka on värjätty hematoksyliinilla ja eosiinilla esimerkissä 9Al)a kuvatulla tavalla. Kuten kuvioissa 14A on esitetty, esiintyi kontrollivasta-aineella 15 (P3G2) käsitellyissä tuumoreissa useita elinkykyisiä ja aktiivisesti jakautuvia tuumorisoluja, mitä osoittivat koko tuumorin sisäosien alueella esiintyvät mitoosikuviot (nuolenpäät) sekä useat verisuonet (nuolet). Tästä poiketen havaittiin kuviossa 14B LM609:lla (anti-ofvjS3) käsitellyissä 20 tuumoreissa vain muutama elinkykyinen tuumorisolu tai veri suoni, mikäli näitä havaittiin ollenkaan.
, Kuviot 15A - 15E vastaavat M21L-tuumoreita, jotka oli käsi- • # *’#4 telty peptideillä esimerkissä 9Al)b kuvatulla tavalla, ja ne • i 25 ovat seuraavat: kuvio 15A, syklinen RAD -kontrollipeptidi (69601) ; kuvio 15B, syklinen RGD -peptidi (66203) ; kuvio ·· · • 15C, viereistä CAM-kudosta, joka on otettu samoista alkiois-ta, joita oli käsitelty syklisellä RGD -peptidillä (66203) ja niissä on esitetty suurella suurennoksella (13 x) tuumo- 30 reita, joita oli käsitelty kontrolli-RAD:lla (69601) kuvios sa 15D tai syklisellä RGD-peptidillä (66203) kuviossa 15E. Kuviossa 15D on esitetty normaaleja verisuonia RAD-kontrollipeptidillä (69601) käsitellystä tuumorista. Kuvios- ttt sa 15E on esitetty esimerkkejä vaurioituneista verisuonista, • · . 35 jotka ovat peräisin syklisellä RGD-peptidillä (66203) käsi- tellyistä tuumoreista (nuolet) .
• · · ψ ·· » • · * * • · Ψ 9 • · »·«· 11
Kuviot 16A - 16E edustavat angiogeneesin inhibitiota angio-geneesin antogonisteilla in vivo -olosuhteissa kaniinin silmämalliin perustuvassa määrityksessä esimerkissä 10 kuvatulla tavalla. Kuviot 16A ja 16B esittävät kaniinin 5 silmän angiogeneesiä pFGF:n ja P1F6 mAb:n (anti-avP5) läsnä ollessa. Kuviot 16C, 16D ja 16E esittävät kaniinin silmän angiogeneesin inhibitiota PFGF:n ja LM609 mAb:n (anti-avP3) läsnäollessa.
10 Kuvio 17 edustaa vuokaaviota esimerkissä 11A kuvatun hiiri:ihmiskimeeraan perustuvan in vivo -olosuhteissa käytettävän hiirimallin valmistuksesta. Osa SCID-hiiren ihosta korvattiin vastasyntyneen ihmisen esinahalla ja siirteen annettiin tervehtyä 4 viikon ajan. Kun siirre oli tervehtynyt, 15 niin ihmisen esinahkaan ympättiin humaanituumorisoluja.
Seuraavien 4 viikon aikana syntyi mitattavissa oleva tuumori, joka muodostui humaanituumorista, jossa ihmisen suonitus kasvoi humaanituumoriin ihmisen ihosta käsin.
20 Kuvio 18 kuvaa mAb:lla käsitellyistä ja peptidillä käsitellyistä CAM-preparaateista peräisin olevien ja Apop Tag’ 11a värjättyjen yksittäisten solujen osuutta FACS:lla määritet- • ·
·.1 2.· tynä ja vastaavassa järjestyksessä esimerkeissä 12A ja 12B
kuvattuna. Mustat palkit edustavat 24 tuntia ja pilkutetut : 25 palkit 48 tuntia ennen määäritystä käsitellyistä alkioista • · · peräisin olevia soluja. Kukin palkki edustaa kolmen toiste- • · . .·. tun kokeen keskiarvoa ± S.E. CAM-preparaatteja käsiteltiin • · · LM609 mAbilla (anti-avP3) tai CSAT:lla (anti-P·^ tai PBS:lla • · · * esimerkissä 12A2) kuvatulla tavalla. CAM-preparaatteja 30 käsiteltiin myös syklisellä peptidillä 66203 (syklo-RGDfV, • · · *·!·' josta on käytetty merkintää peptidi 203) tai kontrollina • · · V : käytetyllä syklisellä peptidillä 69601 (syklo-RADfV, josta ;1·1; on käytetty merkintää peptidi 601) esimerkissä 12B kuvatulla • · · ....: tavalla.
• · 35 • · 2 1' Kuviot 19A ja 19B kuvaavat yhdistettyjä tuloksia sellaisista CAM-preparaateista valmistetuista yksisoluisista solu- 12 suspensioista, jotka ovat peräisin alkioista, jotka on käsitelty joko CSAT:lla (anti-^) (kuvio 19A) tai LM609:lla (anti-a;v|83) (kuvio 19B) , värjätty Apop Tag’lla ja propidium-jodidilla ja analysoitu FACS:lla esimerkissä 12C kuvatulla 5 tavalla. Y-akseli edustaa värjäytymistä Apop Tag’lla solujen lukumäärien avulla ilmoitettuna (apoptoosia), X-akseli edustaa värjäytymistä propidiumjodidilla (DNA-pitoisuutta). Vaakasuora viiva edustaa Apop Tag -värjäytymisen suhteen negatiivista kanavaa. Vasemmanpuoleinen osakuvio esittää 10 CSAT:lla (anti-jS]^) (kuvio 19A) ja oikeanpuoleinen LM609:lla (anti-ofvj83) (kuvio 19B) käsitellyistä alkioista peräisin olevia CAM-soluja. Solusyklin analyysi suoritettiin analysoimilla noin 8000 tapahtumaa yhtä koeolosuhdetta kohti.
15 Kuviot 20A - 20C edustavat CSATtlla (anti-jS-^) käsitellyistä alkioista peräisin olevaa CAM-kudosta ja kuviot 20D - 20F edustavat LM609:lla (anti-av/S3) käsitellyistä alkioista peräisin olevaa CAM-kudosta, jotka kudokset oli esikäsitelty esimerkissä 12C kuvatulla tavalla. Kuviot 20A ja 20D kuvaa-20 vat kudoksia, jotka oli värjätty Apop Tag’lla ja visualisoitu fluoresenssin avulla (FITC) D.I.C.-kuvaan yhdistettynä. Kuviot 20B ja 20E kuvaavat samoja kudoksia, jotka on värjät-. · ty mAb LM609:lla (anti-o?vj83) ja visualisoitu fluoresenssilla (rodamiini) . Kuviot 20C ja 20F edustavat samoja kudoksia **\ 25 esittäviä yhdistettyjä kuvia, jotka on värjätty sekä Apop ’··' Tag’lla että LM609:lla ja joissa keltainen värjäytyminen • · ♦ : V edustaa paikantumista samaan kohtaan. Palkki vasemmassa ί.·.: osakuviossa edustaa 15 μτη ja oikeassa 50 μιη.
• · • · · 30 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus A. Määritelmät
Aminohapporyhmä: Aminohappo, joka on muodostunut pölyni peptidin ja sen peptidisidosten kemiallisen pilkkoutumisen . 35 (hydrolyysin) jälkeen. Tässä keksinnössä kuvatut aminohappo- * · · • .ϊ ryhmät ovat edullisesti "L"-isomeerimuotoa. Minkä tahansa L- :***: aminohapporyhmän tilalla voidaan kuitenkin käyttää "D"- • · * ♦ * ♦ · · • · 13 isomeerimuotoisia ryhmiä sikäli kuin peptidi säilyy halutun toiminnallisen ominaisuutensa suhteen ennallaan. NH2 tarkoittaa polypeptidin aminoterminaalisessa päässä sijaitsevaa vapaata aminoryhmää. COOH tarkoittaa polypeptidin karboksi-5 terminaalisessa päässä sijaitsevaa vapaata karboksiryhmää.
Tavallisen polypeptidien nimityskäytännön mukaisesti (tämä on kuvattu julkaisussa J. Biol. Chem. 243 (1969) 3552 - 59 ja otettu säädöskokoelmaan 37 CFR SSI.822(b)(2)) ovat amino-happoryhmien lyhenteet seuraavassa vastaavuustaulukossa 10 esitettyjen merkintöjen mukaiset:
Vastaavuustaulukko
Symboli_ 1-kirjai- 3-kirjai- 15 minen minen Aminohappo_ Y Tyr tyrosiini G Gly glysiini F Phe fenyylialaniini M Met metioniini 20 A Ala alaniini S Ser seriini I Ile isoleusiini L Leu leusiini T Thr treoniini 25 V Vai väliini P Pro proliini K Lys lysiini H His histidiini Q Gin glutamiini 30 E Glu glutamiinihappo · Z Glx Glu ja/tai Gin . W Trp tryptofaani *···' R Arg arginiini D Asp asparagiinihappo 35 N Asn asparagiini B Asx Asn ja/tai Asp C Cys kysteiini X Xaa tuntema ton/muu 40 Seuraavilla lyhenteillä on lisäksi seuraavat merkitykset BOC tert-butoksikarbonyyli DCCI disykloheksyylikarbodi-imidi DMF dimetyyliformamidi : : : OMe metoksi ‘.V. 45 HOBt 1-hydroksibentsotriatsoli • · .1.* On pantava merkille, että tässä keksinnössä esitetään kaikki • · aminohappo ryhmien sekvenssit käyttäen kaavoja, joiden orien- • · ’···’ taatio vasemmalta oikealle on tavanomaiseen tapaan amino- • · • » · • · · • · • · 14 terminaalisesta päästä karboksiterminaalista päätä kohti. Lisäksi on pantava merkille, että aminohapporyhmien sekvenssin alussa tai lopussa oleva tarkoittaa peptidisidosta, joka liittää sekvenssin tämän sekvenssin jatko-osaan tai yhteen 5 tai useampaan muuhun aminohapporyhmään.
Polypeptidi: tämä tarkoittaa lineaarisessa järjestyksessä olevia peräkkäisiä aminohapporyhmiä, jotka ovat liittyneet yhtäjaksoisesti toisiinsa aminohapporyhmien alfa-aminoryhmän 10 ja karboksiryhmän välille syntyneiden peptidisidosten väli tyksellä .
Peptidi: tämä tarkoittaa tässä keksinnössä lineaarisessa järjestyksessä olevia aminohapporyhmiä, joita on korkeintaan 15 noin 50 ja jotka ovat liittyneet toisiinsa polypeptidin tavoin.
Syklinen peptidi: tämä on peräisin vastaavasta lineaarisesta peptidistä ja; täm tarkoittaa peptidiä, jossa ei esiinny 20 vapaata N-terminaalista eikä C-terminaalista päätä ja; ja jonka se pää, joka vastaa lineaarisen peptidin N-terminaa-lista päätä, muodostaa amidisidoksen mainitun vastaavan : lineaarisen peptidin C-terminaalisen karboksylaatin kanssa.
• · • · · • · · • · ' . 25 Proteiini: tämä tarkoittaa lineaarisessa järjestyksessä *··· olevia aminohapporyhmiä, joita on yli 50 ja jotka ovat ί liittyneet toisiinsa polypeptidin tavoin.
·.·.· Synteettinen peptidi: tämä tarkoittaa toisiinsa peptidiin : sidoksin liitetyistä aminohapporyhmistä kemiallisesti val- 30 mistettua ketjua, joka ei sisällä luonnossa esiintyviä proteiineja tai näiden fragmentteja.
, .·. B. Yleiset näkökohdat • · \Y. Tämä keksintö liittyy yleisellä tasolla siihen löytöön, että • 1 . 35 angiogeneesi tapahtuu tietyn nimenomaisen vitronektiini- « · · reseptorin, ανβ3:n, välityksellä ja että 0fvjS3:n toiminnan »«· inhiboiminen inhiboi angiogeneesiä. Tämä löytö on tärkeä sen · • · · • · · • · 15 osuuden johdosta, joka angiogeneesillä on useissa erilaisissa sairausprosesseissa. Inhiboimalla angiogeneesiä voidaan puuttua sairauden kulkuun, lievittää oireita ja joissakin tapauksissa parantaa sairaus.
5
Silloin kun uusien verisuonten kasvu on syynä tai myötävaikuttavana tekijänä sairauteen liittyviin patologisiin ilmiöihin, niin angiogeneesin inhibointi vähentää sairauden haitallisia vaikutuksia. Esimerkkejä näistä ovat nivelreuma, 10 diabeettinen retinopatia, tulehdussairaudet, verisuonten uudelleen ahtautuminen ja muut näitä vastaavat sairaudet. Silloin kun haitallisen kudoksen kasvuun tarvitaan uusien verisuonten kasvua, niin angiogeneesin inhibointi vähentää tämän kudoksen verensaantia ja tästä syystä myötävaikuttaa 15 verensaantia koskevien vaatimusten perusteella kudosmassan pienenemiseen. Esimerkkejä näistä ovat tuumorien kasvu, jossa uudissuonittumisen on oltava jatkuvasti käynnissä, jotta tuumori voisi kasvaa läpimitaltaan muutamia millimetrejä suuremmaksi, mikä pitää paikkansa myös tuumorien 20 kiinteiden etäpesäkkeiden muodostumisen kyseessä ollessa.
Tämän keksinnön mukaiset menetelmät ovat tehokkaita osaksi ; siksi, että hoito on erittäin selektiivistä angiogeneesin • · 1 I..1 suhteen muiden biologisten ilmiöiden kustannuksella. Kuten • · **\ 25 esimerkeissä on esitetty, ainoastaan uusissa kasvavissa • t · ’···' verisuonissa on huomattavia määriä a,j83:a, mistä syystä : terapeuttiset menetelmät eivät vaikuta haitallisesti kypsiin verisuoniin. Lisäksi ανβ3 ei ole jakautunut laajalti normaa- • · leihin kudoksiin vaan pikemminkin esiintyy selektiivisesti 30 uusissa verisuonissa, mikä tämän johdosta varmistaa sen, että hoito voidaan kohdentaa selektiivisesti uusien verisuonten kasvua vastaan.
• • · · • · \Y. Se löytö, että pelkästään avj83:n inhiboiminen inhiboi tehok- • · *.. 35 kaasti angiogeneesiä, antaa mahdollisuuden kehittää uusia M· V terapeuttisia koostumuksia, joiden spesifisyys on mahdolli- • · · sesti korkea, mistä syystä niiden toksisuus on suhteellisen • ··· · « • · • · · • · 16 vähäistä. Siten vaikkakin tässä keksinnössä kuvataan sellaisten peptideihin perustuvien reagenssien käyttöä, jotka kykenevät inhiboimaan yhtä tai useampaa integriiniä, voidaan suunnitella melko selektiivisesti avj83:a inhiboivia muita 5 reagensseja, mistä syystä niillä ei ole sitä sivuvaikutusta, että ne inhiboisivat muita biologisia ilmiöitä kuin niitä, joissa avj03:lla on osuutta.
Tässä keksinnössä esitettyjen neuvojen mukaisesti on esi-10 merkiksi mahdollista valmistaa monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti erittäin selektiivisesti avjS3:n kanssa ja inhiboivat samalla tavoin selektiivisesti o!vjS3:n toimintaa. Lisäksi RGD-sekvenssin sisältävistä peptideistä voidaan tässä keksinnössä yksityiskohtaisemmin kuvat-15 tavalla suunnitella sellaisia, että ne inhiboivat selektiivisesti Ofvjö3:a.
Ennen tässä keksinnössä tehtyjä havaintoja ei tiedetty olevan mahdollista inhiboida angiogeneesiä eikä mitään 20 angiogeneesista riippuvaisista ilmiöistä in vivo -olo suhteissa käyttämällä reagensseja, jotka toimivat αν/?3.·η biologista tehtävää vastaan suunnattuina antagonisteina.
• * • · • · ♦ C. Angiogeneesin inhibitiomenetelmät • · **\ 25 Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmä kudoksessa • · · ’··· tapahtuvan angiogeneesin inhiboimiseksi ja tämän perusteella • · · : V niiden kudoksessa tapahtuvien ilmiöiden inhiboimiseksi, jotka ovat riippuvaisia angiogeneesistä. Tämä menetelmä : : : sisältää tavallisesti sen, että kudokseen annostellaan 30 koostumusta, joka sisältää angiogeneesiä inhiboivan määrän av|S3-antagonistia.
Kuten aikaisemmin kuvattiin, sisältää angiogeneesi useita • · '.*! eri ilmiöitä, joita ovat kudoksen uudissuonittuminen, mukaan • · *.. 35 lukien verisuonten kehittyminen kasvamalla, vaskulogeneesi • ·· tai verisuonen suureneminen, jotka kaikki ovat angiogeneet-tisiä ilmiöitä, jotka tapahtuvat ανβ3:η ilmentymisen vaiku- « · • · • · ♦ · · « · 17 tuksesta ja ovat riippuvaisia tästä. Suurinmman osan angio-geneesi-ilmiöitä arvellaan vamman aiheuttaman haavan paranemista, keltarauhasen muodostumista ja alkionkehitystä lukuun ottamatta liittyvän sairauteen liittyviin ilmiöihin, 5 mistä syystä tämän keksinnön mukaisten hoitomenetelmien käyttö on selektiivistä sairautta kohtaan eikä sillä ole haitallisia sivuvaikutuksia.
On olemassa useita eri sairauksia, joissa angiogeneesin 10 arvellaan olevan tärkeä ja joista käytetään nimitystä angio- geeniset sairaudet, joita ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta tulehdussairaudet, kuten immunologinen ja ei-immunologinen tulehdus, krooninen nivelreuma ja psoriaasi, sairaudet, joihin liittyy verisuonten väärällä tavalla 15 tapahtuva tai väärään aikaan tapahtuva tunkeutuminen kudok seen, kuten diabeettinen retinopatia, neovaskulaarinen glaukooma, suonten uudelleenahtautuminen, hiussuonten määrän lisääntyminen ateroskleroottisissa plakeissa ja osteoporoosissa sekä syöpään liittyvät sairaudet, kuten kiinteät 20 tuumorit, kiinteät tuumorietäpesäkkeet, angiofibroomat, mykiön takainen fibroplasia, hemangioomat, Kaposin sarkooma ja näitä muistuttavat syövät, joissa tarvitaan uudissuonit- .·. . tumista tuumorin kasvun ylläpitämiseksi.
• · 1 ··· • · 25 Siten menetelmät, joilla angiogeneesi sairaassa kudoksessa inhiboituu, lievittävät sairauden oireita ja sairauden • · 1 • ·' mukaan voivat myötävaikuttaa sairauden paranemiseen. Yhdessä • · ► *.ί·1 sovellutusmuodossa tässä keksinnössä ajatellaan käytettäväk- • · ·.· : si kudoksessa tapahtuvan angiogeneesin inhibitiota sinänsä.
30 Angiogeneesin laajuus kudoksessa ja tästä syystä tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä aikaansaatava inhibitio- aste voidaan arvioida useilla eri menetelmillä, kuten mene- ..v telmillä, joita kuvataan esimerkeissä ja jotka on tarkoi- • · · .·;· tettu <Xy/33-immunopositiivisten kypsymättömien ja juuri muo- *· · 35 dostuneiden verisuonirakenteiden havaitsemiseen immunohisto- • · · • · ·.1 kemian avulla.
• · · • · · » · · • · • · • · t · • · 18
Kuten tässä keksinnössä on kuvattu, angiogeneesiä voivat sairauteen liittyvissä olosuhteissa edistää mitkä tahansa useista erilaisista kudoksista tai organisoiduista kudoksista koostuvat elimet, joita ovat iho, lihas, suolisto, side-5 kudos, nivelet, luut ja muut näitä vastaavat kudokset, joihin verisuonet voivat tunkeutua angiogeenisten ärsykkeiden jälkeen.
Siten yhdessä tähän liittyvässä sovellutusmuodossa hoidetta-10 va kudos on tulehtunut kudos ja ehkäistävä angiogeneesi on tulehtuneen kudoksen angiogeneesi, jossa tulehtuneessa kudoksessa esiintyy uudissuonittumista. Tässä ryhmässä menetelmässä ajatellaan angiogeneesiä inhiboitavan nivel-tulehduskudoksessa, kuten kroonista nivelreumaa sairastavas-15 sa potilaassa, immunologisista syistä tai ei-immunologisista syistä tulehtuneessa kudoksessa, psoriaattisessa kudoksessa ja muissa näitä vastaavissa kudoksissa.
Tässä keksinnössä sen monissa sovellutusmuodoissa hoidettava 20 potilas on edullisesti ihminen, vaikkakin on selvää, että tämän keksinnön periaatteet osoittavat keksinnön olevan tehokas kaikkien nisäkkäiden kyseessä ollessa, ja nämä on tarkoitus sisällyttää termiin "potilas". Tässä yhteydessä on • · selvää, että nisäkkäisiin kuuluvat mitkä tahansa nisäkäs- • * 25 lajit, varsinkin maatalouden ja kotieläintalouden piiriin .**! kuuluvat nisäkäslajit, joissa angiogeneesi in liittyvän • · · • ·" sairauden hoito on haluttua.
i · » ♦ · ♦ ·«· • · V * Toisessa tähän liittyvässä sovellutusmuodossa hoidettava 30 kudos on diabeettista retinopatiaa, keltatäplän rappeutumis ta tai neovaskulaarista glaukoomaa sairastavan potilaan verkkokalvokudos ja inhiboitava angiogeneesi on verkkokalvo- . .*· kudoksen angiogeneesi, jossa esiintyy verkkokalvokudoksen ·♦* .·;· uudissuonittumista.
• · *· * 35 ··« • ·
Vielä yhdessä tähän liittyvässä sovellutusmuodossa hoidetta- « * * ·...* va kudos on sellaisen potilaan tuumorikudos, jolla on kiin- « · • * ♦ « • · • · 19 teä tuumori, etäpesäkkeitä, ihosyöpä, rintasyöpä, hemangioo-ma tai angiofibrooma tai jokin muu näitä vastaava syöpä, ja ehkäistävä angiogeneesi on tuumorikudoksen angiogeneesi, jossa tuumorikudoksessa esiintyy uudissuonittumista. Tyypil-5 lisiä tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä hoidettavissa olevia kiinteitä tuumorikudoksia ovat keuhko-, haima-, rintarauhas-, kooloni-, kurkunpää- ja munasarjatuumorikudos ja muut näitä vastaavat kudokset. Esimerkkejä tuumori-kudoksen angiogeneesistä ja tämän inhibitiosta on kuvattu 10 esimerkeissä.
Erityisen edullinen sovellutusmuoto on tuumorikudoksen angiogeneesin inhibitio sen tärkeän osuuden johdosta, mikä uudissuonittumisella on tuumorin kasvussa. Tuumorikudoksen 15 uudissuonittumisen puuttuessa tuumorikudos ei saa tarvittavia ravinteita, se hidastaa kasvuaan, sen kasvun edistyminen lakkaa, se regressoituu ja lopulta joutuu kuolioon, mikä johtaa tuumorin tuhoutumiseen.
20 Tästä keksinnöstä saadaan toisin sanoen käyttöön menetelmä tuumorin uudissuonittumisen inhiboimiseksi inhiboimalla tämän keksinnön mukaisesti tuumorin angiogeneesiä. Samalla : tavoin tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmä tuumorin • · - I..' kasvun inhiboimiseksi käyttämällä angiogeneesiä inhiboivia • · ' 25 menetelmiä.
• · · • · ··· ·· · : . Nämä menetelmät ovat myös erittäin tehokkaita etäpesäkkeiden muodostumista vastaan, koska (1) näiden muodostuminen vaatii • · primaari tuumorin suonittumista, jotta metastasoivat syöpä-30 solut voivat poistua primaarisesta tuumorista ja (2) niiden muodostumiseen pysyviksi toisessa kohdassa tarvitaan uudissuonittumista etäpesäkkeiden kasvun ylläpitämiseksi.
• • ♦ • · YY. Tähän liittyvässä sovellutusmuodossa tässä keksinnössä *. . 35 ajatellaan käytettäväksi tätä menetelmää yhdistettynä muihin • ·· hoitomuotoihin, kuten kiinteitä tuumoreja vastaan ja etä-pesäkkeiden vakiintumista estämään suunnattuun tavanomaiseen • · • · • · • · • · V · ·· • · 20 kemoterapiaan. Angiogeneesin inhibiittoria annetaan tyypillisesti kemoterapian aikana tai tämän jälkeen, vaikkakin on edullista inhiboida angiogeneesiä kemoterapiahoito-ohjelman jälkeen niinä aikoina, jolloin tuumorikudoksen reaktiona 5 myrkkyjen käyttöön on angiogeneesin käynnistäminen toipumista varten tuumorikudoksen saaman veren ja ravinteiden avulla. Lisäksi etäpesäkkeitä vastaan suunnattuna profylaksiana on edullista määrätä käytettäväksi angiogeneesin inhibointimenetelmiä sellaisen leikkauksen jälkeen, jossa on 10 poistettu kiinteitä tuumoreita.
Sikäli kuin tämän keksinnön mukaiset menetelmät soveltuvat tuumorien uudissuonittumisen estämiseen, niin näitä menetelmiä voidaan myös käyttää tuumorikudoksen kasvun inhiboimi-15 seen, tuumorien etäpesäkkeiden muodostumisen inhiboimiseen ja vakiintuneiden tuumorien regression aikaansaamiseen. Esimerkeissä osoitetaan vakiintunen tuumorin regressoitumi-nen sen jälkeen kun potilaalle on annettu yhden kerran suonensisäisesti tämän keksinnön mukaista οίνβ2-antagonistia.
20
Verisuonen uudelleenahtautuminen on ilmiö, jossa sileä lihassolu (SMC) tunkeutuu kohtaan, jossa on suoritettu S' ; sepelvaltimon pallolaajennus, ja lisääntyy täällä, mikä • · 1.. haittaa pallolaajennuksella saavutettavia myönteisiä tulok- • · *·*, 25 siä. SMC-solujen liikkumisen ja lisääntymisen ahtautuman • · « ‘•i* muodostuessa katsotaan olevan angiogeneesi-ilmiö, joka on : *. estettävissä tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä. Tästä « ‘.l. syystä tässä keksinnössä ajatellaan myös ahtauman muodostuta misen inhiboimista inhiboimalla angiogeneesiä tämän keksin- 30 nön mukaisilla menetelmillä potilaalle tehtyjen verisuonten muovaustoimenpiteiden jälkeen. Ahtauman muodostumisen inhi-boimiseksi annetaan ανβ3-antagonistia tyypillisesti muovaus- . ,· toimenpiteen jälkeen noin 2 - noin 28 päivän ajan ja tyypil- « · lisemmin suunnilleen ensimmäisten 14 päivän ajan siitä, kun • · . 35 nämä toimenpiteet on suoritettu.
• ·· • · • · • · ·
A
P
• A A
• · • ·
A A
• · • · M·· « 21 Tämän keksinnön mukainen menetelmä angiogeneesin inhiboimi-seksi kudoksessa ja tästä syystä myös näiden menetelmien käyttämiseksi angiogeneesiin liittyvien sairauksien hoidossa käsittää sen, että kudos, jossa angiogeneesiä tapahtuu, tai 5 jossa esiintyy vaara tämän tapahtumisesta, saatetaan koske tukseen koostumuksen kanssa, joka sisältää terapeuttisesti tehokkaan määrän α!νβ3-antagonistia, joka kykenee inhiboimaan avjS3:n sitoutumisen luonnolliseen ligandiinsa. Siten tämä menetelmä käsittää sen, että potilaalle annetaan terapeutti-10 sesti tehokas määrä fysiologisesti siedettävissä olevaa koostumusta, joka sisältää tämän keksinnön mukaista avj83-antagonistia.
αν03-antagonistin antamiseen soveltuvat annosten suuruudet 15 ovat riippuvaisia antagonistin muodosta ja sen voimakkuudes ta edempänä tarkemmin kuvattavalla tavalla ja nämä ovat määriä, jotka ovat riittävän suuria saamaan aikaan sellaisen halutun vaikutuksen, jonka avulla angiogeneesi heikkenee ja angiogeneesin välityksellä syntyneet sairauden oireet lie-20 venevät. Annos ei saa olla niin suuri, että se saa aikaan haitallisia sivuvaikutuksia, kuten hyperviskositeettioire-yhtymiä, keuhkoedeemaa, kongestiivista sydämen vajaa- . > toimintaa ja muita näitä vastaavia vaikutuksia. Annokset • 1 poikkeavat tavallisesti toisistaan potilaan iän terveyden- t » ’·1, 25 tilan, sukupuolen ja sairauden etenemisasteen mutaan ja tämä • · - '··· annos voidaan määrittää alan ammattikokemuksen perusteella.
·· · : 1. Hoitava lääkäri voi myös muuttaa annosta minkä tahansa komplikaation ilmaannuttua.
« » • · • · 30 Terapeuttisesti tehokas määrä on se määrä o;vjS3-antagonistia, joka on riittävä saamaan aikaan määritettävissä olevan angiogeneesin inhiboitumisen hoidettavassa kudoksessa, ,,1 toisin sanoen angiogeneesiä inhiboiva määrä. Angiogeneesin • 1 t” inhiboituminen voidaan määrittää in situ -olosuhteissa • ♦ 9 · . 35 immunohistokemiaa käyttäen tässä keksinnössä kuvattavalla *·» V tavalla tai muilla alan ammattikokemuksen perusteella tunne- ·»» tuilla menetelmillä.
» · » · • · « · • · ··· 22
Sikäli kun αν03-antagonisti voi esiintyä α^β2:Ά jäljittelevän yhdisteen muodossa, RGD-sekvenssin sisältävän peptidin muodossa, avj83:a vastaan suunnatun monoklonaalisen vasta-aineen muodossa tai tämän fragmentin muodossa, on selvää, 5 että ilmaus "terapeuttisesti tehokas" määrä voi aina tapauk sen mukaan vaihdella. Tämän keksinnön mukaisten määritysmenetelmien osoittamalla tavalla voidaan alan ammattikokemuksen perusteella kuitenkin vaikeuksitta määrittää tämän keksinnön mukaisen ehdolla olevan avjS3-antagonistin 10 tehokkuus.
av(83-antagonistin tehokkuus voidaan määrittää useilla erilaisilla keinoilla, joita ovat angiogeneesin inhiboituminen CAM-määrityksessä, kaniinin silmiin perustuvassa in vivo 15 -olosuhteissa suoritettavassa määrityksessä, hiiri:ihmis- kimeeran käyttöön perustuvassa in vivo -olosuhteissa suoritettavassa määrityksessä, ja määrittämällä luonnollisen ligandin avj83:een tapahtuvan sitoutumisen inhiboituminen, jotka kaikki suoritetaan tässä keksinnössä kuvattavalla 20 tavalla, ja näitä muistuttavilla määrityksillä.
Edullinen o!v|83-antagonisti kykenee inhiboimaan huomattavassa määrin luonnollisen ligandin, kuten fibrinogeenin tai vitro-nektiinin, sitoutumista α!νβ3 :een liuoksessa, jossa antagonis- • · 25 tin konsentraatiot ovat alle 0,5-mikromolaariset (μΜ) , . .·. edullisesti alle 0,1 μΜ ja edullisemmin alle 0,05 μΜ. "Huo- • · · mättävässä määrin" tarkoittaa, että suorittamalla inhibitio • · * * · * I q;V(83-antagonistin läsnäollessa havaitaan f ibrinogeenin sitou- ’;··/ tumisen vähentyneen vähintään 50 %:lla ja 50-%:inen inhibi- *·' 30 tio tarkoittaa tässä keksinnössä IC50-arvoa.
Edullisemmalla q?v/Ö3-antagonistilla on selektiivisyyttä 0!vj83:a kohtaan muiden integriinien kustannuksella. Siten edullinen : avjS3- antagonisti inhiboi huomattavassa määrin f ibrinogeenin 35 sitoutumista avjS3:een mutta ei inhiboi huomattavassa määrin f ibrinogeenin sitoutumista johonkin muuhun integriiniin, • · kuten av|81:een, avjS5:een tai aIIBjS3reen. Erityisen edullinen • · · • * • · * · · ♦ · * • · 23 on sellainen avj83-antagonisti, jonka IC50-aktiivisuus on 10 -100-kertainen anteen tapahtuvan fibrinogeenin sitoutumisen inhiboimisessa verrattuna IC50-aktiivisuuteen johonkin muuhun integriiniin tapahtuvan fibrinogeenin sitoutumisen inhiboi-5 misessa. Esimerkkeinä käytettäviä määrityksiä IC50-aktiivi-suuden määrittämiseksi johonkin integriiniin tapahtuvan fibrinogeenin sitoutumisen määrittämisessä on kuvattu esimerkeissä.
10 Terapeuttisesti tehokas määrä tämän keksinnön mukaista avβ3-antagonistia, joka on monoklonaalisen vasta-aineen muodossa, on tyypillisesti sellainen määrä, joka annosteltuna fysiologisesti siedettävässä koostumuksessa on riittävä saamaan aikaan veriplasman konsentraation, joka on noin 0,01 mikro-15 grammasta (^g) millilitraa (ml) kohti noin 100 mikrogrammaan millilitrassa, edullisesti noin 1 μg/ml - noin 5 ^g/ml ja tavallisesti noin 5 μg/ml. Toisella tavoin ilmoitettuna voi annos olla alueella noin 0,1 mg/kg - noin 300 mg/kg, edullisesti noin 0,2 mg/kg - noin 200 mg/kg, edullisimmin noin 20 0,5 mg/kg - noin 20 mg/kg, annettuna yhden tai useamman kerran päivittäin yhden päivän tai useiden päivien aikana.
Silloin kun antagonisti on monoklonaalisen vasta-aineen .*·,· fragmentin muodossa, niin määrä voidaan vaikeuksitta säätää • · 25 fragmentin ja kokonaisen vasta-aineen massojen välisten • · · suhteen perusteella. Vasta-ainemuotoisen antagonistin edul- • · linen konsentraatio veriplasmassa mol aari suu tena ilmoitettu- # · · ' * na on noin 2-mikromolaarisesta (μΜ) noin 5-millimolaariseen * · · *·:·* (mM) ja edullisesti noin 100 μΜ - 1 mM.
: 30
Terapeuttisesti tehokas määrä polypeptidin tai muun samaa kokoa olevan pienen av|33:a jäljittelevän molekyylin muodossa olevaa tämän keksinnön mukaista avjS3-antagonistia on tyypil-: lisesti sellainen polypeptidimäärä, joka fysiologisesti 35 siedettävässä koostumuksessa annettuna on riittävä aikaan- I I · saamaan veriplasmassa konsentraation, joka on noin • · *;*. 0,1 mikrogrammasta (μg) millilitrassa (ml) noin 200 mikro- • « · ♦ · • ♦ • · ♦ • # » • · 24 grammaan millilitrassa, edullisesti noin l ^g/ml - noin 150 μg/ml. Sellaisen polypeptidin perusteella, jonka massa on noin 500 grammaa moolia kohti, on polypeptidiantagonistin edullinen konsentraatio veriplasmassa molaarisuutena ilmoi-5 tettuna noin 2-mikromolaarisesta (μΜ) noin 5-millimolaari- seen (mM) ja edullisesti noin 100 μΜ - 1 mM. Toisella tavoin ilmoitettuna annos ruumiinpainokiloa kohti voi vaihdella alueella noin 0,1 mg/kg - noin 300 mg/kg ja edullisesti noin 0,2 mg/kg - noin 200 mg/kg yhtenä tai useampana päivittäin 10 annettavana annoksena yhden päivän tai useiden päivien aikana.
Tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita tai polypeptidejä voidaan antaa parenteraalisesti käyttäen 15 injektiota tai vähittäistä infuusiota pitkän ajan kuluessa.
Vaikkakin vaikuttavat aineet pääsevät hoidettavaan kudokseen tyypillisesti ruumiissa käyttämällä systeemistä antotapaa ja tästä syystä potilasta hoidetaan antamalla terapeuttisia koostumuksia suonensisäisesti, tässä keksinnössä ajatellaan 20 käytettäväksi muita kudoksia ja annostelukeinoja silloin kun on todennäköistä, että hoidon kohteena oleva kudos sisältää kohteena olevan molekyylin. Siten tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan antaa suonensisäises-ti, vatsaontelonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaises- • · 25 ti, ruumiinonteloiden sisäisesti, transdermaalisesti ja sitä . .·. voidaan annostella peristalttisin keinoin.
• · • · · • · · # · * ’ Tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta tai • · 1 **·;’ polypeptidiä sisältäviä terapeuttisia koostumuksia annetaan • · · *·' ‘ 30 suonensisäisesti, kuten esimerkiksi injektoimalla kerta- annos. Termi "kerta-annos" silloin, kun sitä käytetään tarkoittamaan tämän keksinnön mukaista terapeuttista koostumusta, tarkoittaa fysikaalisesti erillisiä yksikköjä, jotka : soveltuvat käytettäväksi kerta-annokseksi potilaalle, ja • · 1 .1·1 35 kukin yksikkö sisältää ennalta määrätyn määrän aktiivista * materiaalia, joka laskutoimitusten perusteella saa aikaan • · halutun terapeuttisen vaikutuksen yhdessä tarvittavan lai- • · 1 • · • · · • · · « · « 25 mentimen; toisin sanoen kantaja-aineen tai vehikkelin, yhteydessä.
Yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa esimerkeissä esitet-5 tävällä tavalla annetaan ^183-antagonistia suonensisäisesti yhtenä annoksena.
Koostumuksia annetaan lääkeformulaation suhteen yhteensopivalla tavalla ja käyttämällä terapeuttisesti tehokasta 10 määrää. Annettava määrä ja käytettävä ajoitus on riippuvainen hoidettavasta potilaasta, potilaan elimistön kapasiteetista käyttää hyväksi aktiivista ainesosaa ja halutusta terapeuttisesta vaikutuksesta. Ne tarkat määrät, joita aktiivista ainesosaa on tarpeellista annostella, ovat riip-15 puvaisia hoitavan lääkärin arviosta ja ne ovat potilas kohtaisia. Tässä keksinnössä on kuitenkin kuvattu systeemiseen käyttöön soveltuvia sopivia annosmäärien alueita ja nämä ovat riippuvaisia annostelutiestä. Annosteluun käytettävät aikataulut ovat myös vaihtelevia, mutta näille on 20 tyypillistä, että ensimmäisen antamisen jälkeen toistetaan annoksien antamista yhden tai useamman tunnin välein käyttämällä tämän jälkeen annettavaa injektiota tai muulla tavoin tapahtuvaa antamista. Vaihtoehtoisesti tässä keksinnössä ajatellaan käytettäväksi jatkuvaa suonensisäistä infuusiota, 25 joka on riittävää pitämään yllä veressä konsentraatioita . .·. kuvatuille hoitomuodoille esitettyjen alueiden rajoissa in • · .·1· vivo -olosuhteissa.
• · · • · • · 1 ·/; Kuten tämän keksinnön mukaiset esimerkit osoittavat, tapah- *·’ 30 tuu angiogeneesin inhiboituminen ja tuumorin regressio niinkin pian kuin 7 päivää sen jälkeen kun antagonisti on ensimmäisen kerran saatettu kosketukseen kohteensa kanssa. On edullista, että antagonistikäsittelyä jatketaan tai sitä ::: pidennetään 7 päivästä 6 viikkoon ja edullisesti noin 14 - ;1·’1 35 28 päivän ajan.
• · • · · • · • · · · • · • · · • · • · • · · • · · • · 26 Tähän liittyvässä sovellutusmuodossa on esimerkeissä osoitettu, että Qfvj83:n inhibition ja οι^β3:Ά sisältävissä uudis-suonittuneen kudoksen soluissa tapahtuvan apoptoosin käynnistymisen välillä vallitsee syy- ja seuraussuhde. Siten 5 tässä keksinnössä ajatellaan myös käytettäväksi menetelmiä apoptoosin inhiboimiseksi kudoksen uudissuonittuneessa osassa. Tätä menetelmää käytetään huomattavassa määrin tässä keksinnössä kuvatulla tavalla angiogeneesin inhiboimiseksi kaikissa kudoksissa ja näitä vastaavissa esitetyissä olo-10 suhteissa. Ainoa merkille pantava ero on vaikutuksen ajoi tus, joka on sellainen, että apoptoosi ilmenee nopeasti, tyypillisesti noin 48 tuntia sen jälkeen kun solut on saatettu kosketukseen antagonistin kanssa, kun taas angiogeneesin inhiboituminen ja tuumorin regressoituminen ilmenee 15 hitaammin tässä keksinnössä kuvatulla tavalla. Tämä ero vaikuttaa hoito-ohjelmaan annosteluajan ja halutun vaikutuksen puitteissa. Kudoksen uudissuonittuneen osan apoptoosia varten tarkoitettuun annosteluun voidaan aikaa käyttää tyypillisesti 24 tunnista noin 4 viikkoon vaikkakin edullis-20 ta on käyttää 48 tunnista 7 päivään.
D. Terapeuttiset koostumukset Tässä keksinnössä ajatellaan käytettäväksi terapeuttisia koostumuksia, jotka ovat käyttökelpoisia tässä keksinnössä .'V' 25 kuvattujen terapeuttisten menetelmien käyttämiseksi. Tämän . .·. keksinnön mukaiset terapeuttiset koostumukset sisältävät » · fysiologisesti siedettävissä olevaa kantaja-ainetta sekä • · ’ aktiivisena ainesosana tässä keksinnössä kuvattua 0^83-anta- *·/;’ gonistia siihen liuotettuna tai dispergoituna. Edullisessa • · *·' 1 30 sovellutusmuodossa terapeuttinen a^-antagonistikoostumus ei ole immunogeeninen annettuna terapeuttisiin tarkoituksiin nisäkkäälle tai potilaana olevalle ihmiselle.
; Termejä "farmaseuttisesti hyväksyttävä", "fysiologisesti ;1·’ 35 siedettävissä oleva" sekä niiden kieliopillisia johdoksia käytetään tässä keksinnössä niiden tarkoittaessa koostumuk- • · *·.. siä, kantaja-aineita, laimentimia ja reagensseja, toisiaan • · • · • · • · • · · ·· 27 vastaavasti ja ne edustavat sitä, että näitä materiaaleja kyetään antamaan nisäkkäälle haitallisia fysiologisia vaikutuksia, kuten pahoinvointia, huimausta, mahalaukun kouristuksia ja muita näitä vastaavia vaikutuksia aiheuttamatta.
5
Sellaisen farmakologisen koostumuksen valmistus, joka sisältää siihen liuenneessa tai dispergoituneessa muodossa olevia aktiivisia ainesosia, on tällä alalla selvää eikä sen tarvitse rajoittua formulaation perusteella. Tyypillisesti 10 näitä koostumuksia valmistetaan injektioliuoksiksi joko nestemäisinä liuoksina tai suspensioina, mutta voidaan myös valmistaa kiinteitä muotoja, jotka soveltuvat liuosten tai suspensioiden valmistamiseen nesteeseen ennen käyttöä. Valmiste voidaan myös emulgoida.
15
Aktiivinen ainesosa voidaan yhdistää farmaseuttisesti hyväksyttäviin ja aktiivisen ainesosan kanssa yhteensopiviin lisäaineisiin määrinä, jotka soveltuvat käytettäväksi tässä keksinnössä kuvatuissa terapeuttisissa menetelmissä. Sopivia 20 lisäaineita ovat esimerkiksi vesi, fysiologinen suolaliuos, glukoosi, glyseroli, etanoli tai muut näitä vastaavat lisäaineet ja näiden yhdistelmät. Lisäksi koostumus voi haluttaessa sisältää pieniä määriä apuaineita, kuten kostutus-tai emulgointiaineita, pH:ta puskuroivia aineita ja muita • * .*·* 25 näitä vastaavia apuaineita, jotka voimistavat aktiivisen . .·. ainesosan tehokkuutta.
» » · • · · «· · • · • · I Tämän keksinnön mukainen terapeuttinen koostumus voi sisäl- • · *.** tää sen sisältämien komponenttien farmaseuttisesti hyväksyt- • · 30 täviä suoloja. Farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ovat happoadditiosuolat (nämä on muodostettu käyttäen poly-peptidien vapaita aminoryhmiä), jotka muodostetaan epäorgaanisten happojen, kuten esimerkiksi suolahapon tai fosforihapon, tai orgaanisten happojen, kuten etikkahapon, :T 35 viinihapon, mantelihapon ja muiden näitä vastaavien happo-♦ .'.S jen, kanssa. Vapaiden karboksyyliryhmien kanssa muodostettu- • · I.. ja suoloja voidaan myös saada käyttämällä epäorgaanisia • · · » · • · • · * » · « • · 28 emäksiä, kuten esimerkiksi natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium- tai rautahydroksideja, ja sellaisia orgaanisia emäksiä kuten isopropyyliamiini, trimetyyliamiini, 2-etyyli-aminoetanoli, histidiini, prokaiini ja muut näitä vastaavat 5 emäkset.
Erityisen edullisia ovat TFA- ja HC1-suolat käytettynä syklisten 0^(83-polypeptidiantagonistien valmistuksessa.
Peptidien edustavia suoloja on kuvattu esimerkeissä.
10
Fysiologisesti siedettävissä olevat kantaja-aineet ovat tällä alalla tunnettuja. Esimerkkejä nestemäisistä kantaja-aineista ovat steriilit vesipitoiset liuokset, jotka eivät aktiivisten ainesosien ja veden lisäksi sisällä muita mate-15 riaaleja tai sisältävät puskuria, kuten natriumfosfaattia, jonka pH on fysiologisessa pH-arvossa, fysiologista suolaliuosta, tai näitä molempia, kuten fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta. Tämän lisäksi vesipitoiset kantaja-aineet voivat sisältää vielä useampaa kuin yhtä puskuri-20 suolaa, sekä suoloja, kuten natrium- ja kaliumkloridia, glukoosia, polyetyleeniglykolia ja muita liukoisia aineita.
Nestemäiset koostumukset voivat myös sisältää veden lisäksi käytettäviä ja veden kokonaan korvaavia nestemäisiä faaseja.
25 Esimerkkejä tällaisista muista nestemäisistä faaseista ovat . .·. glyseriini, kasviöljyt, kuten puuvillansiemenöljy, ja vesi- • · yS öljy-emulsiot.
• · • * • · * ***· Terapeuttinen koostumus sisältää angiogeneesiä inhiboivan • * *·* 30 määrän tämän keksinnön mukaista ανβ3-antagonistia, joka on tyypillisesti formuloitu siten, että se sisältää vähintään 0,1 paino-% antagonistia terapeuttisen koostumuksen kokonaispainosta. Paino-% on inhibiittorin painon suhde : koostumuksen kokonaispainoon. Siten esimerkiksi 0,1 paino-% ;*·* 35 on 0,1 grammaa inhibiittoria koostumuksen kokonaispainon kutakin 100 grammaa kohti.
• · • · • ♦ · • * · • · • · • · * · • · 29 E. 0^183-integriinin antagonistit Tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä käytetään αν/83-antagonisteja angiogeneesin inhiboimiseksi kudoksissa ja ne voivat esiintyä useissa eri muodoissa, joita ovat yhdisteet, 5 joilla on sellainen vuorovaikutus q?v/83 :n kanssa, että nämä toiminnalliset vuorovaikutukset luonnollisten 0^/83-ligandien kanssa häiriintyvät. Esimerkkejä antagonisteista ovat av|83:n analogit, jotka ovat peräisin ανβ3:η ligandia sitovasta kohdasta, sellaiset joko a;v/83:a tai αν/83:η luonnollista 10 ligandia jäljittelevät yhdisteet, jotka jäljittelevät sitä rakenteellista aluetta, joka sisältyy avjS3:n ja ligandin sitoutumisessa ilmeneviin vuorovaikutuksiin, polypeptidejä, joissa esiintyy av/83:lle spesifisen luonnollisen ligandin toiminnallista sitomisdomeenia vastaava sekvenssi, erityi-15 sesti sellainen sekvenssi, joka vastaa luonnollisen αν|83:η ligandin RGD-sekvenssin sisältävää domeenia, ja vasta-aineet, jotka reagoivat immunologi sesti joko avj83:n tai luonnollisen ligandin kanssa, joilla kaikilla on tässä keksinnössä kuvattua antagonistista vaikutusta.
20 1. Polvoentidit
Yhdessä sovellutusmuodossa tässä keksinnössä ajatellaan käytettäväksi polypeptidien muodossa olevia avjS3-antagonisteja.
.1. [ Q!vj83-polypeptidi (peptidi) -antagonistin sekvenssin ominai- • · .·:1 25 suudet voivat olla joko samanlaiset kuin α β3:η luonnollisen ‘s, ligandin tai itse av|83:n ominaisuudet aJ33:n ja ligandin • · vuorovaikutukseen sisältyvällä alueella ja siinä esiintyy • 1 • · tässä keksinnössä kuvattua Q!vj83-antagonistiaktiivisuutta.
« · *·1..' Edullinen avjS3-antagonistipeptidi sisältää RGD-tripeptidin ja ·.· 1 30 vastaa sekvenssiltään luonnollista ligandia RGD-sekvenssin sisältävällä alueella. Edullisten RGD-sekvenssin sisältävien polypeptidien sekvenssi vastaa ανβ3:η luonnollisen ligandin, kuten fibrinogeenin, vitronektiinin, von Willebrand'in teki- . jän, laminiinin, trombospondiinin ja muiden näitä vastaavien • · · .·;1 35 ligandien, RGD-sekvenssin sisältävän alueen aminohappo- *;/ sekvenssiä. Näiden ανβ3-ligandien sekvenssi on tunnettu.
• · '·’ Siten Q!vj83: tä vastaan vaikuttava peptidi voi olla peräisin
• · · VJ
· · • · • · • · · • · 1 • · 30 mistä tahansa näistä luonnollisista ligandeista, vaikkakin edullisia ovat fibrinogeeni ja vitronektiini.
Erityisen edullinen avjS3:a vastaan vaikuttava peptidi inhiboi 5 ensisijaisesti tämän luonnollis(t)en ligandi(e)n sitoutumis ta verrattuna muihin integriineihin edellä kuvatulla tavalla. Nämä ανβ3-spesifiset peptidit ovat erityisen edullisia ainakin siksi, että av|83-spesifisyys pienentää haitallisten sivuvaikutusten esiintyvyyttä, kuten muiden integriinien 10 inhiboitumista. Edullisia av/33:a vastaan vaikuttavia peptide jä, joilla on selektiivisyyttä avjS3-.a kohtaan, voidaan tunnistaa vaikeuksitta tyypillisessä sitoutumisinhibitio-määrityksessä, kuten esimerkeissä kuvatussa ELISA-määrityk-sessä.
15
Yhdessä sovellutusmuodossa tämän keksinnön mukainen poly-peptidi sisältää korkeintaan noin 100 aminohapporyhmää ja edullisesti korkeintaan noin 60 ryhmää, edullisemmin korkeintaan noin 30 ryhmää. Peptidit voivat olla lineaarisia 20 tai syklisiä, vaikkakin erityisen edulliset peptidit ovat syklisiä.
Edullisia syklisiä ja lineaarisia peptidejä ja niiden nimi-tykset on esitetty esimerkeissä olevassa taulukossa 1.
25 • · 't· On selvää, että tämän keksinnön kohteena olevan polypeptidin • · .!'* ei tarvitse olla identtinen luonnollisen ligandin Q!vj83:n * * aminohapporyhmän sekvenssin suhteen, sikäli kuin se sisältää *·:·' vaadittavan sekvenssin ja kykenee toimimaan av/33:a vastaan • · *.· 30 vaikuttavana aineena määrityksessä, kuten tässä keksinnössä kuvatuissa määrityksissä.
Tämän keksinnön kohteena oleva polypeptidi sisältää minkä ; ;* tahansa sellaisen polypeptidin analogin, fragmentin tai • · · .·;· 35 kemiallisen johdannaisen, jonka aminohapporyhmien sekvenssi on esitetty tässä keksinnössä, sikäli kuin polypeptidi on • · 0!vj33-antagonisti. Tästä syystä tämän keksinnön mukaiselle ··· • · • · • · • « • · 1 « 31 polypeptidille voidaan suorittaa useita erilaisia muutoksia, substituutioita, insertioita ja deleetioita silloin kun näillä muutoksilla saadaan tiettyjä etuja sen käytössä. Tässä mielessä tämän keksinnön mukainen ofvj83:n antagonistina 5 toimiva polypeptidi pikemminkin vastaa mainitun peptidin sekvenssiä kuin on sen suhteen identtinen, milloin siihen on tehty yksi tai useampi muutos ja se säilyttää kyvyn toimia avjS3:a vastaan vaikuttavana aineena yhdessä tai useammassa tässä keksinnössä esitetyssä määrityksessä.
10
Polypeptidi voi olla siten missä tahansa useissa erilaisista peptidijohdannaisten muodoista, joita ovat amidit, proteiinien kanssa muodostetut konjugaatit, syklisoidut peptidit, polymeroidut peptidit, analogit, fragmentit, kemialli-15 sesti modifioidut peptidit ja muut näitä vastaavat johdan naiset .
Termi "analogi" sisältää minkä tahansa polypeptidin, jonka aminohapporyhmien sekvenssi on huomattavassa määrin identti-20 nen tässä keksinnössä erityisesti esitetyn sekvenssin suhteen, milloin yksi tai useampi ryhmistä on substituoitu konservatiivisesti toiminnallisesti samanlaisella ryhmällä ja tällä esiintyy tässä keksinnössä kuvattua ανβ3-antagonisti- ϊ1·.: aktiivisuutta. Esimerkkejä konservatiivisista substituu- • > 25 tioista ovat yhden ei-polaarisen (hydrofobisen) ryhmän, . kuten isoleusiinin, valiinin, leusiinin tai metioniinin, • · ··,· korvaaminen toisella, yhden polaarisen (hydrof iilisen) ! ryhmän korvaaminen toisella, kuten arginiinin ja lysiinin, • · *** glutamiinin ja asparagiinin, ja glysiinin ja seriinin välil- • · 30 lä suoritetut substituutiot, yhden emäksisen ryhmän, kuten lysiinin, arginiinin tai histidiinin, korvaaminen toisella, tai yhden happamen ryhmän, kuten asparagiinihapon tai gluta-miinihapon, korvaaminen toisella.
t · • · • · · 35 Sanonta "konservatiivinen substituutio" sisältää myös sen, että ryhmää, josta on valmistettu kemiallisesti johdannai- • · nen, käytetään sellaisen ryhmän tilalla, josta ei ole vai- • · · • · • · • · • · • · ··· 32 mistettu johdannaista, edellyttäen, että tällaisella poly-peptidillä esiintyy vaadittavaa inhiboivaa aktiivisuutta.
"Kemiallinen johdannainen" tarkoittaa kohteena olevaa poly-5 peptidiä, jonka yhdestä tai useammasta ryhmästä on muodostettu kemiallisesti johdannainen funktionaalisen sivuryhmän reaktion välityksellä. Tällaisia molekyylejä, joista on muodostettu johdannaisia, ovat esimerkiksi molekyylit, joissa vapaat aminoryhmät on muutettu johdannaisiksi siten, 10 että näistä on muodostunut amiinihydroklorideja, p- tolueenisulfonyyliryhmiä, karbobentsoksiryhmiä, t-butyyli-oksikarbonyyliryhmiä, klooriasetyyliryhmiä tai formyyli-ryhmiä. Vapaista karboksyyliryhmistä voidaan muodostaa johdannaisia suolojen, metyyli- ja etyyliesterien tai muun 15 tyyppisten esterien tai hydratsidien muodostamiseksi. Va paista hydroksyyliryhmistä voidaan muodostaa johdannaisia 0-asyyli- tai 0-alkyylijohdannaisten muodostamiseksi. Histi-diinin imidatsolitypestä voidaan muodostaa johdannainen N-im-bentsyylihistidiinin muodostamiseksi. Tähän termiin 20 sisältyvät myös kemiallisina johdannaisina peptidit, jotka sisältävät yhtä tai useampaa luonnossa esiintyvän kahdenkymmenen tavallisen aminohapon aminohappojohdannaista. Esimerkiksi: proliinin tilalla voidaan käyttää 4-hydroksi-proliinia; lysiinin tilalla voidaan käyttää 5-·*·* 25 hydroksilysiiniä; histidiinin tilalla voidaan käyttää 3- . .*· metyylihistidiiniä; seriinin tilalla voidaan käyttää homo- • · · ;·.· seriiniä; ja lysiinin tilalla voidaan käyttää ornitiinia.
| \ Tämän keksinnön mukaisiin polypeptideihin sisältyy myös mikä • · tahansa polypeptidi, jossa on yksi tai useampi additio • · 30 ja/tai deleetio, tai ryhmiä, jotka muistuttavat sellaisen polypeptidin sekvenssiä, jonka sekvenssi on esitetty tässä keksinnössä sikäli kuin se vielä sisältää vaadittavaa aktiivisuutta.
• · • · ··« 35 Termi "fragmentti" tarkoittaa mitä tahansa keksinnön kohtee- .j.* na olevaa polypeptidiä, jonka aminohapporyhmien sekvenssi on • · • ·· ψ • · · • · • · • 4 • · • · 33 lyhyempi kuin sellaisen polypeptidin sekvenssi, jonka amino-happoryhmien sekvenssi on esitetty tässä keksinnössä.
5 Kun tämän keksinnön mukaisella polypeptidillä on sekvenssi, joka ei ole identtinen luonnollisen o!vj33-ligandin sekvenssin suhteen, tämä johtuu tyypillisesti siitä, että tähän on tehty yksi tai useampi konservatiivinen tai ei-konservatiivinen substituutio, aminohapporyhmistä substituoidaan taval-10 lisesti enintään noin 30 % ja edullisesti enintään 10 %.
Muita ryhmiä voidaan myös lisätä polypeptidin jompaan kumpaan päähän sellaisen "kytkijäsekvenssin" aikaansaamiseksi, jonka avulla tämän keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan kiinnittää kätevästi leimaan tai kiinteään matriksiin tai 15 kantaja-aineeseen.
Edempänä on kuvattu leimoja, kiinteitä matrikseja ja kantaja-aineita joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten polypeptidien kanssa.
20
Aminohapporyhmien kytkijäsekvenssit ovat tavallisesti vähintään yhdessä ryhmässä ja ne voivat koostua 40 tai tätä useammasta ryhmästä, useammin 1-10 ryhmästä mutta ne eivät :**.! muodosta av/33-ligandien epitooppeja. Tyypillisiä kytkentään ·1·1 25 käytettyjä aminohapporyhmiä ovat tyrosiini, kysteiini, . »’ lysiini, glutamiini- ja asparagiinihappo tai muut näitä 9 1» ;·.· vastaavat ryhmät. Lisäksi kohteena oleva polypeptidi voi * 1· poiketa, ellei toisin ole mainittu, αν|83-ligandin luonnolli- f · *** sesta sekvenssistä sen perusteella, että sekvenssiä on 30 modifioitu käyttämällä terminaalisen NH2-ryhmän asylointia, esimerkiksi asetylointia tai amidointia tioglykolihapolla, terminaalisen ryhmän karboksyyliamidointia, esimerkiksi ammoniakilla, metyyliamiinilla ja muilla näitä vastaavilla ί.·/ terminaalisten ryhmien modifikaatioilla. Terminaalisten :1:1 35 ryhmien modifikaatiot ovat käyttökelpoisia tunnettuun tapaan vähentämään herkkyyttä pilkkoutumiselle proteinaasien vaiku- • · I., tuksesta, mistä syystä nämä pidentävät polypeptidien 0 »·· • · • · 0 · # · • · «e· 34 puoliintumisaikaa liuoksissa, erityisesti biologisissa nesteissä, joissa voi esiintyä proteaaseja. Tässä mielessä on polypeptidin syklisointi myös käyttökelpoinen terminaalisten ryhmien modifiointitapa ja se on erityisen edullista 5 myös siitä syystä, että syklisoinnin avulla muodostuu pysyvä rakenne, ja siksi, että tässä keksinnössä kuvatulla tavalla tällaisilla syklisillä peptideillä on havaittu olevan biologisia aktiivisuuksia.
10 Mitä tahansa tämän keksinnön mukaista peptidiä voidaan käyttää farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan muodossa. Sopivia happoja, jotka kykenevät muodostamaan suoloja tämän keksinnön mukaisten peptidien kanssa, ovat epäorgaaniset hapot, kuten trifluorietikkahappo (TFA), suolahappo (HC1), 15 bromivetyhappo, perkloorihappo, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihappo, fosforihappo, etikkahappo, propionihappo, glykolihappo, maitohappo, palorypälehappo, oksaalihappo, malonihappo, meripihkahappo, maleiinihappo, fumaarihappo, antraniilihappo, sinnamihappo, naftaleenisulfonihappo, 20 sulfaniilihappo tai muut näitä vastaavat hapot. Erityisen edullisia ovat Hei- ja TFA-suolat.
• · · m · · • · · » · Sopivia emäksiä, jotka kykenevät muodostamaan suoloja tämän keksinnön mukaisten peptidien kanssa, ovat epäorgaaniset ; 25 emäkset, kuten natriumhydroksidi, ammoniumhydroksidi, kaliumhydroksidi ja muut näitä vastaavat emäkset; ja orgaaniset emäkset, kuten mono-, di- ja trialkyyli- ja -aryyliamiinit (esimerkiksi trietyyliamiini, di-isopropyyli-amiini, metyyliamiini, dimetyyliamiini ja muut näitä vastaa-30 vat emäkset) ja mahdollisesti substituoidut etanoliamiinit (esimerkiksi etanoliamiini, dietanoliamiini ja muut näitä • · · *.· * vastaavat emäkset) .
• · · t · • · .···. Tämän keksinnön mukainen peptidi, josta myös tässä keksin- ’*’· 35 nössä käytetään nimitystä keksinnön kohteena oleva poly- • · peptidi, voidaan syntetoida millä tahansa polypeptidien ·*’· syntetoinnin alan ammattikokemuksen perusteella tunnetulla 35 menetelmällä, mukaan lukien yhdistelmä-DNA-menetelmät. Kemialliset syntetointimenetelmät, kuten Merrifield-tyyppinen kiinteän faasin synteesi, ovat edullisia puhtausasteen, antigeenispesifisyyden, haitallisten sivutuotteiden 5 esiintymättömyyden, valmistuksen vaivattomuuden ja muiden näitä vastaavien syiden perusteella. Monista saatavilla olevista menetelmistä on esitetty erinomaisia yhteenvetoja julkaisuissa Steward, et ai., "Solid Phase Peptide
Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; 10 Bodanszky, et al., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons,
Second Edition, 1976; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983,-Merrifield, Adv. Enzymol., 32 (1969) 221 - 96; Fields, et al., Int. J. Peptide Protein Res. 35 (1990) 161 - 214; ja 15 US-patenttijulkaisu nro 4 244 946 kiinteän faasin peptidi- synteesin kyseessä ollessa ja julkaisussa Schroder, et al., "The Peptides", Voi. 1, Academic Press (New York), 1965 klassisen liuossynteesin kyseessä ollessa, joista kukin on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säännösten 20 nojalla. Asiaankuuluvia suojaavia ryhmiä, joita voidaan • · · '· ” käyttää tällaisessa synteesissä, kuvataan edellä olevissa • · · *.· * oppikirjoissa ja teoksessa J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973, joka liitetään tähän keksintöön siihen oikeuttavien säännösten • · ; 25 nojalla.
• · » • · « » · • · · « Tässä keksinnössä käytettäväksi ajatellut kiinteään faasiin perustuvat synteesimenetelmät sisältävät tavallisesti sen, että yksi tai useampi aminohapporyhmä tai sopivalla tavalla 30 suojattu aminohapporyhmä liitetään peräkkäin kasvavaan *···’ peptidiket juun. Tavallisesti ensimmäisen aminohapporyhmän • · · ·.* amin- tai karboksyy li ryhmä suojataan sopivalla valikoivasti • φ poistettavissa olevalla suoj aavalla ryhmällä. Erilaista, • .···. valikoivasti poistettavissa olevaa suoj aavaa ryhmää käyte- yy 35 tään reagoivan sivuryhmän sisältävien aminohappojen, kuten • · · *·*·* lysiinin, kyseessä ollessa.
36 Käyttäen esimerkkinä kiinteän faasin synteesiä kiinnitetään suojattu aminohappo tai aminohappo, josta on muodostettu johdannainen, reagoimattomaan kiinteään tukimateriaaliin suojaamattoman karboksyyli- tai aminoryhmän välityksellä.
5 Tämän jälkeen amino- tai karboksyyliryhmän suojaava ryhmä poistetaan valikoivasti ja sekvenssissä seuraava aminohappo, jonka komplementaarinen (amino- tai karboksyyli) ryhmä on suojattu sopivalla tavalla, yhdistetään seokseen ja saatetaan reagoimaan olosuhteissa, jotka soveltuvat amidi -10 sidoksen muodostamiseen jo valmiiksi kiinteään kantaja- materiaaliin kiinnitetyn ryhmän kanssa. Tämän jälkeen tästä uudesta lisätystä aminohapporyhmästä poistetaan amino- tai karboksyyliryhmän suojaava ryhmä, ja tämän jälkeen lisätään seuraava aminohappo (tämä on suojattu sopivalla tavalla), ja 15 niin edelleen. Kun kaikki halutut aminohapot on kytketty oikean sekvenssin mukaisesti, niin kaikki mahdollisesti jäljellä olevat terminaalisia ja sivuryhmiä suojaavat ryhmät (ja kiinteä kantajamateriaali) poistetaan peräkkäisessä järjestyksessä tai samanaikaisesti lopullisen lineaarisen 20 polypeptidin aikaansaamiseksi.
• · · • · · • · • · · ' Tulokseksi saadut lineaariset polypeptidit, jotka on valmis- tettu esimerkiksi edellä kuvatulla tavalla, voidaan saattaa • · · j reagoimaan vastaavien syklisten peptidien muodostamiseksi.
: 25 Peptidien syklisointiin esimerkkinä oleva menetelmä on • · · :V; kuvattu julkaisussa Zimmer, et ai., Peptides 1992 pp. 393 - 394, ESCOM Science Publishers, B.V., 1993. Tässä menetellään siten, että tyypillisesti tert-butoksikarbonyylillä suojattu peptidimetyyliesteri liuotetaan metanoliin ja seokseen . 30 lisätään natriumhydroksidiliuosta ja seos saatetaan reagoi- *·”* maan 20 °C:ssa (20C) suoj aavan metyyliesteriryhmän pois tami- • · ’·* seksi hydrolyyttisesti. Kun liuotin on haihdutettu, niin :*·’ tert-butoksikarbonyylillä suojattu peptidi uutetaan etyyli- asetaatilla happameksi tehdystä vesipitoisesta liuottimesta.
.*,· 35 Tämän jälkeen suojaava tert-butoksikarbonyyliryhmä poiste- *·*·’ taan lievästi vaikuttavissa happamissa olosuhteissa dioksaaniapuliuottimessa. Tällä tavoin aikaansaatu suojaama- 37 ton lineaarinen peptidi, jonka amino- ja karboksiterminaali-set päät ovat vapaat, muunnetaan vastaavaksi sykliseksi peptidikseen saattamalla se reagoimaan laimeassa lineaarisen peptidin liuoksessa seoksessa, joka sisältää dikloori-5 metaania ja dimetyyliformamidia, disykloheksyylikarbodi-imidin kanssa 1-hydroksibentsotriatsolin ja N-metyylimorfo-liinin läsnäollessa. Tämän jälkeen tulokseksi saatu syklinen peptidi puhdistetaan kromatografiän avulla.
10 Erityisen edullinen syklisten peptidien synteesimenetelmä on kuvattu julkaisussa Gurrath, et ai., Eur. J. Biochem. 210 (1992) 911 - 921 ja kuvattu esimerkeissä. Erityisen edullisia peptidejä tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä käytettäviksi ovat c-(GrGDFV) (SEKVENSSI ID NO:4), c-(RGDfV) 15 (SEKVENSSI ID N0:5), c-(RADfV) (SEKVENSSI ID NO:6), c-(RGDFv) (SEKVENSSI ID NO:7) ja lineaarinen peptidi YTAECKPQVTRGDVF (SEKVENSSI ID NO:8), joissa "C-" tarkoittaa syklistä peptidiä, isot kirjaimet ovat L-aminohapon yksikirjaiminen koodi ja pienet kirjaimet ovat D-aminohapon . , 20 yksikirjaiminen koodi. Näiden peptidien aminohapporyhmien • · * sekvenssit ovat myös esitetty SEKVENSSEISSÄ ID N0:4, 5, 6, 7 * t « ' ja 8, tässä järjestyksessä ilmoitettuna.
• · · • · • · · • # · • 2. Monoklonaaliset vasta-aineet : :*: 25 Yhdessä sovellutusmuodossa tässä keksinnössä kuvataan sei- • · · laisten monoklonaalisten vasta-aineiden muodossa olevia c^v/S3-antagonisteja, jotka reagoivat immunologisesti α;ν03:η kanssa ja inhiboivat ανβ3:η sitoutumista luonnolliseen ligandiinsa tässä keksinnössä kuvatulla tavalla. Tässä keksinnössä . 30 kuvataan myös solulinjoja, jotka tuottavat näitä vasta- *“* aineita, menetelmiä näiden solulinjojen valmistamiseksi ja • · menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi.
• · ··· • · • · ;***: Tämän keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine sisältää • · · .*.* 35 vasta-ainemolekyylejä, jotka 1) reagoivat immunologisesti • · · ***** eristetyn avjS3:n kanssa, ja 2) inhiboivat f ibrinogeenin sitoutumista QfvjS3 :een. Edullisia monoklonaalisia vasta-ainei- 38 ta, jotka sitoutuvat ensisijaisesti 0^183: een, ovat mono-klonaalinen vasta-aine, jolla on ATCC HB 9537 -hybridooman solulinjan erittämän LM609 mAb:n immunologiset reagointi-ominaisuudet. Hybridoomasolulinja ATCC HB 9537 talletettiin 5 Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti talletuslaitokseen
American Type Culture Collection (ATCC), 1301 Parklawn
Drive, Rockville, MD, USA, 15.9.1987.
Termiä "vasta-aine tai vasta-ainemolekyyli" käytetään tässä 10 keksinnössä useissa erilaisissa kieliopillisissa muodoissaan kollektiivisena pronominina, joka tarkoittaa immuno-globuliinimolekyylien ja/tai immunoglobuliinimolekyylien immunologisesti aktiivisten osien, esimerkiksi vasta-aineen kohdetta sitovan kohdan eli paratoopin sisältävien molekyy-15 lien, populaatiota.
"Vasta-aineen kohdetta sitova kohta" on se vasta-aine-molekyylin rakenneosa, joka koostuu raskaan ja kevyen ketjun vaihtelevista ja runsaasti vaihtelevista alueista, jotka 20 spesifisesti sitovat antigeeniä.
• · · • · · ·.* ' Edustavia esimerkkejä tässä keksinnössä käytettäväksi sovel- tuvista vasta-aineista ovat kokonaiset immunoglobuliini- ·· · ; molekyylit, huomattavassa määrin kokonaiset immuno- : :*· 25 globuliinimolekyylit ja ne immunoglobuliinimolekyylin osat, «·· •V jotka sisältävät paratoopin ja joita ovat ne tällä alalla tunnetut osat Fab, Fab’, F(ab’)2 ja F(v) ja joista myös käytetään nimitystä vasta-ainefragmentit.
. 30 Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa tässä keksin- • · *··· nössä ajatellaan käytettäväksi typistettyä immuno- • · *·* globuliinimolekyyliä, joka sisältää tämän keksinnön mukai- :'·* sesta monoklonaalisesta vasta-aineesta peräisen olevan Fab- .**·. fragmentin. Fab-fragmentti, jolta Fc-reseptori puuttuu, on ·♦ · .*/ 35 liukoinen ja se tuottaa terapeuttisia etuja seerumissa • · · *·*· esiintyvän puoliintumisajan perusteella ja diagnostisia ···· ’ ‘ etuja sellaisissa diagnosointitävöissä, joissa käytetään 39 liukoista Fab-fragmenttia. Liukoisen Fab-fragmentin valmistus on immunologian alalla yleisesti tunnettua ja se voidaan suorittaa käyttäen useita eri menetelmiä.
5 Esimerkiksi vasta-aineiden Fab- ja F(ab’)2-osia (fragment teja) valmistetaan saattamalla huomattavassa määrin kokonaiset vasta-aineet reagoimaan proteolyyttisesti papaiinin ja pepsiinin kanssa, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna, tunnettujen menetelmien mukaisesti. Näitä on käsitelty 10 esimerkiksi Theofilopolouksen ja Dixonin US-patentti- julkaisussa nro 4 342 566. Fab’-vasta-aineosat ovat myös tunnettuja ja niitä valmistetaan F (ab’ )2-osista pelkistämällä ensin kahta raskasketjuosaa yhdistävät disulfidisidokset esimerkiksi merkaptoetanolilla ja alkyloimalla sitten 15 tulokseksi saatu proteiinimerkaptaani sellaisella reagens-silla kuten jodiasetamidi. Kokonaisia immunoglobuliini-molekyylejä sisältävät vasta-aineet ovat edullisia ja näitä käytetään tässä keksinnössä sitä valaisevina esimerkkeinä.
. , 20 Sanonta "monoklonaalinen vasta-aine" tarkoittaa useissa eri • · *· "'· kieliopillisissa muodoissaan sellaisten vasta-aine- • ·· • · ’·* ' molekyylien populaatiota, jotka sisältävät ainoastaan yhden tyyppisen vasta-aineen kohdetta sitovan kohdan, joka kykenee ·· · • reagoimaan immunologisesti tietyn nimenomaisen epitoopin : 25 kanssa. Monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumisaffiniteetti • · · :Y sen epitoopin suhteen, jonka kanssa se reagoi immunologises- ti, on siten tyypillisesti yhdenlainen. Monoklonaalinen vasta-aine voi tästä syystä sisältää vasta-ainemolekyylin, jossa on useita vasta-aineen kohdetta sitovia kohtia, joista . 30 kukin on immunologisesti spesifinen eri epitooppia kohtaan, • « · *;|* esimerkiksi bispesifinen monoklonaalinen vasta-aine.
• · • · • · :*·* Monoklonaalinen vasta-aine koostuu tyypillisesti vasta- aineista, jotka ovat sellaisen hybridoomaksi nimitetyn yhden ·· · .*.* 35 solun kloonien tuottamia, joka erittää (tuottaa) ainoastaan • · *·’· yhden tyyppistä vasta-ainemolekyyliä. Hybridoomasolu muodos- ···« tetaan fuusioimalla vasta-ainetta tuottava solu myelooma- 40 solulinjaan tai johonkin muuhun jatkuvasti itsestään lisääntyvään solulinjaan. Tällaisten vasta-aineiden valmistusta kuvasivat ensimmäiseksi Kohler ja Milstein, Nature 256 (1975) 495 - 497, jonka julkaisun sisältö on liitetty tähän 5 keksintöön siihen oikeuttavien säännösten nojalla. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987), on kuvannut muita menetelmiä. Näin valmistetuista hybridoomasupernatanteista voidaan seuloa esiin ne vasta-ainemolekyylit, jotka reagoivat immunologisesti ανβ3:η 10 kanssa, sekä ne supernatantit, jotka inhiboivat ανβ3:η sitou tumista luonnollisiin ligandeihin.
Lyhyesti mainittuna myeloomasolulinja tai jokin muu itsestään jatkuvasti lisääntyvä solulinja fuusioidaan sellaisen 15 hybridooman muodostamiseksi, josta monoklonaalista vasta-ainekoostumusta muodostuu, sellaisten lymfosyyttien kanssa, jotka on saatu sellaisen nisäkkään pernasta, joka on hyperimmunisoitu av|S3:n lähtömateriaalilla, kuten humaanimelanooma M21-soluista eristetyllä av/33:lla julkaisussa Cheresh, et 20 ai., J. Biol. Chem. 262 (1987) 17703 - 17711, kuvatulla * · : *·: tavalla.
• • · · • · • · · : :*· On edullista, että hybridooman valmistamiseen käytetty • · · :*.*4 myeloomasolulinja on peräisin samasta lajista kuin lymfosyy- • · . .· 25 tit. Edullinen nisäkäs on tyypillisesti 129 GlX+-kannan « i » VJ· hiiri. Sopivia hiiren myeloomia käytettäväksi tässä keksin- • · nössä ovat hypoksantiini-aminopteriini-tymidiini-herkät (HAT) solulinjat P3X63-Ag8.653 ja Sp2/0-Agl4, jotka ovat saatavilla talletuslaitoksesta American Type Culture 30 Collection, Rockville, MD, ja joiden talletusnumerot ovat CRL 1580 ja CRL 1581, mainitussa järjestyksessä ilmoitettu- • ·· • · ma • · Hei · • · • ·· • · • ·
Splenosyytit fuusioidaan tyypillisesti myeloomasoluihin T.35 käyttäen polyetyleeniglykoli (PEG) 1500:aa. Fuusioituneet • · hybridit valitaan sen perusteella, että ne ovat herkkiä •V· HAT:lie. Tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta- 41 ainetta tuottavat hybridoomat tunnistetaan entsyymi-välitteisellä immunosorbenttimäärityksellä (ELISA), joka on kuvattu esimerkeissä.
5 Tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan myös tuottaa valmistelemalla sellainen mono-klonaalisten hybridooman viljelmä, joka sisältää sellaista hybridoomaa sisältävää ravinnemediumia, joka erittää asiaankuuluvan spesifisyyden mukaisia vasta-ainemolekyylejä. 10 Viljelmää kasvatetaan sellaisissa olosuhteissa ja niin pitkän aikaa, että tämä on riittävää siihen, että hybridooma erittää vasta-ainemolekyylejä mediumiin. Tämän jälkeen vasta-ainetta sisältävä medium kootaan talteen. Vasta-aine-molekyylit voidaan tämän jälkeen vielä eristää tunnetuin 15 menetelmin.
Näiden koostumusten valmistamiseen soveltuvat mediumit ovat sekä tunnettuja tällä alalla sekä kaupallisesti ja näitä ovat synteettiset kudosviljelymediumit, sisäsiittoiset , . 20 hiiret ja muut näitä vastaavat materiaalit. Esimerkkinä • · · ’·I1 synteettisestä mediumista on Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM; Dulbecco et ai., Virol. 8 (1959) 396, jota on täydennetty 4,5 g/1 glukoosilla, 20 mM glutamiinilla ja ·· i ! ’ 20-%:isella fetaalisella vasikanseerumilla. Esimerkkinä • · : :1 25 sisäsiittoisesta hiirikannasta on Balb/c.
• · • ·
Muut menetelmät monoklonaalisen vasta-aineen, hybridooma-solun tai hybridoomasoluviljelmän, muodostamiseksi ovat myös tunnettuja. Näistä löytyy tietoa, esimerkiksi menetelmä . 30 monoklonaalisten vasta-aineiden eristämiseksi immunologisten • · •j 1 valintamahdollisuuksien joukosta julkaisuissa Sastry, et :·: ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 5728 - 5732; ja :1;1 Huse, et ai., Science 246 (1989) 1275 - 1281, kuvatulla j'2 tavalla.
• · · · 35 • · *·1· Tämän keksinnön ajatellaan myös koskevan hybridoomasolua ja • ··· 2 ’ sellaista hybridoomasolua sisältäviä viljelmiä, jotka tuot- 42 tavat tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta. Erityisen edullinen on hybridoomasolulinja, joka erittää monoklonaalista vasta-ainetta mAb LM609, jolle on annettu nimitys ATCC HB 9537. mAb LM609 valmistettiin julkaisussa 5 Cheresh, et ai., J. Biol. Chem. 262 (1987) 17703 - 17711 kuvatulla tavalla ja sen valmistus on myös kuvattu esimerkeissä.
Tämän keksinnön ajatellaan yhdessä sovellutusmuodossa koskelo van monoklonaalista vasta-ainetta, jolla on mAb LM609:n immunologiset reaktio-ominaisuudet.
On myös mahdollista määrittää turhiin kokeisiin turvautumatta, onko monoklonaalinen vasta-aine spesifisyydeltään 15 (immunologisilta reagointiominaisuuksiltaan) samanlainen (toisin sanoen ekvivalenttinen) kuin tämän keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine, määrittämällä estääkö edellä mainittu viimeksi mainittua sitoutumasta ennakolta valittuun kohdemolekyyliin. Jos tutkittavana oleva monoklonaalinen 20 vasta-aine kilpailee tämän keksinnön mukaisen monoklonaali- • · * *· ’· sen vasta-aineen kanssa, mikä käy ilmi tämän keksinnön #·· V mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen aikaansaaman sitoutu- *,·.* misen vähentymisenä tavallisessa kompetitiomäärityksessä, :*·’ jolla määritetään tutkittavan aineen sitoutumista kohde- ; 25 molekyyliin silloin kun tämä esiintyy kiinteässä faasissa, ··· .*.* niin on todennäköistä, että nämä keksi monoklonaalista ♦ · vasta-ainetta sitoutuvat saman tai toisiaan läheisesti muistuttavaan, epitooppiin.
. 30 Vielä yksi keino sen määrittämiseksi, onko monoklonaalinen • · ’··· vasta-aine spesifisyydeltään tämän keksinnön mukaista mono- • · V klonaalista vasta-ainetta vastaava, on esi-inkuboida tämän • · ·*·* keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta kohde- ♦ .**· molekyylin kanssa, jonka kanssa se normaalisti reagoi, ja ··· ·#·35 lisätä tämän jälkeen tutkittavaa monoklonaalista vasta- • « ’**· ainetta sen määrittämiseksi, inhiboituuko tutkittavan mono- klonaalisen vasta-aineen kyky sitoa kohdemolekyyliä. Jos 43 tutkittavana oleva monoklonaalinen vasta-aine inhiboituu, niin kaiken todennäköisyyden mukaan sen epitooppispesifisyys on samanlainen kuin tämän keksinnön mukaisen vasta-aineen spesifisyys tai tätä toiminnallisesti vastaava.
5
Vielä yksi keino sen määrittämiseksi, onko monoklonaalinen vasta-aine spesifisyydeltään tämän keksinnön mukaisen mono-klonaalisen vasta-aineen spesifisyyttä vastaava, on määrittää kyseessä olevien vasta-aineiden CDR-alueiden aminohappo-10 ryhmien sekvenssi. Vasta-ainemolekyylit, jotka CDR-alueil- laan sisältävät identtiset tai toiminnallisesti vastaavat aminohapporyhmien sekvenssit, ovat sitoutumisspesifisyydeltään samanlaiset. Menetelmät polypeptidien sekvensoimiseksi ovat tällä alalla tunnettuja.
15
Vasta-aineen immunospesifisyys, sen sitoutumiskapasiteetti kohdemolekyyliä kohtaan ja sen tähän liittyvä affiniteetti, joka vasta-aineella on epitooppiaan kohtaan, määräytyvät sen epitoopin perusteella, jonka kanssa vasta-aine reagoi im-, 20 munologisesti. Epitooppispesifisyys määräytyy ainakin osaksi t · immunoglobuliini-vasta-aineen raskaan ketjun vaihtelevan • · '.· alueen aminohapposekvenssin perusteella ja osaksi kevyen '.·/ ketjun vaihtelevan alueen aminohapporyhmien sekvenssin • * * \ \ perusteella.
: i. 25 ·«· •V Termin "(jollakin) on (jonkin) sitoutumisspesifisyyttä" tarkoittaa sitä, että ekvivalenttisten monoklonaalisten vasta-aineiden immunologiset reagoivuus (sitoutumis-) ominaisuudet ovat samanlaiset ja ne kilpailevat sitoutumisesta . 30 ennakolta valittuun kohdemolekyyliin.
• » 9 « ··« > · t * « '** ^ Humanisoidut monoklonaaliset vasta-aineet tarjoavat erityi- ·*·* siä etuja hiiren monoklonaalisiin vasta-aineisiin verrattuna varsinkin silloin, jos niitä voidaan käyttää terapeuttisesti »>* ,Y 35 ihmisillä. Tarkemmin sanottuna humaani-vasta-aineet eivät • « **’* poistu verenkierrosta yhtä nopeasti kuin "vieraat" anti- ' geenit eivätkä ne aktivoi immuunijärjestelmää samalla tavoin 44 kuin vieraat antigeenit ja vieraat vasta-aineet. Menetelmät "humanisoitujen" vasta-aineiden valmistamiseksi ovat tällä alalla yleisesti tunnettuja ja niitä voidaan vaikeuksitta soveltaa tämän keksinnön mukaisiin vasta-aineisiin.
5 Tässä keksinnössä ajatellaan siten yhdessä sovellutus-muodossa käytettäväksi sellaista siirrostamalla humanisoitua tämän keksinnön mukaista vasta-ainetta, johon on tuotu humaani-immuunijärjestelmän komponentteja vaikuttamatta 10 huomattavassa määrin vasta-aineen kykyyn sitoa antigeeniä.
3. ανβ3-spesifiset jäljittelevät yhdisteet Tässä keksinnössä osoitetaan, että q?vjS3 - antagonisteja voidaan tavallisesti käyttää tässä keksinnössä, joita antagonisteja 15 voivat olla polypeptidit, vasta-aineet ja muut molekyylit joista käytetään nimitystä "jäljittelevät molekyylit", jotka kykenevät estämään θί^β3:n toimintaa. Erityisen edullisia ovat antagonistit, jotka estävät spesifisesti avjS3:n toimintaa eivätkä estä muiden integriinien toimintaa.
20 Tässä yhteydessä on pantava merkille, että tässä keksinnössä .·. : voivat käytettäväksi soveltua useat erilaiset reagenssit sikäli kuin näillä reagensseilla esiintyy vaadittavaa biolo- ’ . gista aktiivisuutta. Näistä reagensseista käytetään genee- • · · 25 ristä nimitystä jäljittelevät molekyylit, koska niillä on : ·’ kyky "jäljitellä" joko a;v/?3:n pinnalla sijaitsevaa sitoutumisdomeenia tai 0!v/33-ligandia, joka osallistuu resep- • · ·*.·' ·“ torin ja ligandin väliseen toiminnalliseen vuorovaikutukseen ja tämän perusteella estää (toisin sanoen inhiboi) normaalia 30 toimintaa.
. 0^3:a jäljittelevä molekyyli on mikä tahansa molekyyli, joka • · · .*:· on jokin muu molekyyli kuin vasta-aine tai ligandista peräi sin oleva peptidi, jolla on edellä kuvattuja ominaisuuksia.
• · · · 35 Se voi olla peptidin synteettinen analogi, yhdiste, joka ♦ · · muodoltaan muistuttaa edellä kuvatun sitovan domeenin sitoutumisuurretta, tai se voi olla jokin muu molekyyli.
• · · ♦ · 45 0ivl83:a jäljitteleviä molekyylejä voidaan suunnitella millä tahansa useista erilaisista tällä alalla tunnetuista lääkeaineiden suunnitteluun rakenteellisen analyysin menetelmistä, joita ovat molekyylimallinnus, kaksisuuntainen ydin-5 magneettiresonanssi (2-D NMR)-analyysi, röntgensäde-kristallografia, peptidikirjastojen, peptidianologikirjasto-jen tai muiden kemiallisten polymeerien kirjastojen sattumanvarainen seulonta ja muut näitä vastaavat lääkeaineiden suunnittelumenetelmät.
10
Koska tässä patenttijulkaisussa on esitetty laajaa rakenteellista todistusaineistoa, joka osoittaa, että «.^-antagonisti voi olla pieni polypeptidi tai monoklonaalinen vasta-aine, niin kahden toisistaan etäällä olevan erilaisen 15 kemiallisen rakenteen, joille yhteistä on ominaisuus, että ne inhiboivat selektiivisesti avjS3:a, ei tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä käyttökelpoisen keksinnön kohteen muodostavan o;v/33-antagonistin rakenteen ole välttämättä rajoituttava tällä tavoin, vaan niihin kuuluvat mikä tahansa 20 tässä keksinnössä kuvattu «vj83:a jäljittelevä molekyyli.
. . F. a?.jS3-antagonistien tunnistusmenetelmät • « · Tässä keksinnössä kuvataan myös määritysmenetelmiä ehdok- • · · *·1 1 kaaksi asetettujen αν)δ3-antagonistien tunnistamiseksi tämän 25 keksinnön mukaisten menetelmien mukaan käytettäviksi. Ehdok- • · · • V kaaksi asetetuista molekyyleistä arvioidaan näissä menetel- : missä se, kuinka voimakkaasti ne inhiboivat ανβ3:n sitoutu- mistä luonnollisiin ligandeihin, ja niistä arvioidaan lisäksi niiden voimakkuus kudoksessa tapahtuvan angiogeneesin 30 inhibitiossa.
. Ensimmäisellä määrityksellä määritetään sitä, kuinka luon- • · · nollisen ligandin suora sitoutuminen avjS3:een inhiboituu ja • · . edullinen sovellutusmuoto on kuvattu yksityiskohdittain 35 esimerkeissä. Tässä määrityksessä määritetään ELISA:n avulla tyypillisesti sitä, missä määrin luonnollisen ligandin, • « · • · • · • · · • · · • · 46 kuten fibrinogeenin, sitoutuminen eristettyyn kiinteässä faasissa olevaan avj83:een inhiboituu.
Tätä määritystä voidaan myös käyttää sellaisten yhdisteiden 5 tunnistamiseksi, joilla esiintyy spesifisyyttä orvj83:a kohtaan ja jotka eivät inhiboi luonnollisia ligandeja sitoutumasta muihin integriineihin. Spesifisyysmääritys suoritetaan suorittamalla rinnakkaisia ELISA-määrityksiä, joissa sekä q;vj33 : sta että muista integriineistä seulotaan samanaikaisesti 10 erillisissä määrityskammioissa esiin niiden oma kyky sitoa luonnollista ligandia ja ehdokkaana olevasta yhdisteestä sitä, kuinka ne inhiboivat integriinien omaa kykyä sitoa ennakolta valittua ligandia. Edullisia seulontamäärityksen muotoja on kuvattu esimerkeissä.
15
Toisessa määrityksessä määritetään angiogeneesiä kanan ravitsemuskalvossa (CAM) ja siitä käytetään nimitystä CAM-määritys. Muut tutkijat ovat kuvanneet CAM-määrityksen yksityiskohdittain ja sitä on lisäksi käytetty sekä angio-20 geneesin että tuumorikudosten uudissuonittumisen määrittämiseen. Tätä kysymystä on käsitelty julkaisuissa Ausprunk, et . . ai., Am. J. Pathol. 79 (1975) 597 - 618 ja Ossonski, et ai., • · «
Cancer Res. 40 (1980) 2300 - 2309.
t · · • · · * 25 CAM-määritys on in vivo -olosuhteissa käytettävä tunnettu • · · : V angiogeneesin määritysmalli, koska siinä tapahtuu koko : : kudoksen uudissuonittuminen ja varsinaiset kanan alkion verisuonet kasvavat CAM:aan tai CAM:n pinnalla kasvavaan kudokseen.
30 CAM-määritys kuvaa tässä keksinnössä osoitetulla tavalla sellaista uudissuonittumisen inhibitioita, joka perustuu • · sekä uusien verisuonten kasvun määrään että sen laajuuteen.
• · **| . Lisäksi on vaivatonta seurata minkä tahansa CAM:n päälle ϊ : 35 siirretyn kudoksen, kuten tuumorikudoksen, kasvua. Lopuksi :***: määritys on erityisen käyttökelpoinen siitä syystä, että * · · .V määritysjärjestelmässä on sisäinen toksisuuskontrolli. Kanan • · » • · 1 · · · · • « 47 alkio altistuu kaikille tutkittaville reagensseille ja tästä syystä alkion elinvoima on merkkinä toksisuudesta.
Kolmas angiogeneesiä määrittävä määritys on in vivo -olo-5 suhteissa käytettävä kaniinin silmien käyttöön perustuva malli ja siitä käytetään nimitystä kaniinin silmien käyttöön perustuva määritys. Muut tutkijat ovat yksityiskohdittain kuvanneet kaniinin silmien käyttöön perustuvaa määritystä ja sitä on lisäksi käytetty sekä angiogeneesin että angiogenee-10 sin uudissuonittumisen määrittämiseen angiogeneesin inhi biittorien, kuten talidomidin, läsnäollessa. Tätä kysymystä on käsitelty julkaisussa D'Amato, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 91 (1994) 4082 - 4085.
15 Kaniinin silmien käyttöön perustuva määritys on hyväksytty määritysmalli angiogeneesin tutkimiseksi in vivo -olosuhteissa, koska uudissuonittumistapahtuma, josta esimerkkinä on kaniinin verisuonten kasvaminen sarveiskalvon ääri-osista sarveiskalvoon, on vaikeuksitta visualisoitavissa 20 silmän luontaisesti läpinäkyvän sarveiskalvon läpi. Lisäksi uudissuonittumisen stimuloitumisen tai inhiboitumisen, tai .·. : uudissuonittumisen regression, sekä laajuutta että määrää • · · λ.- voidaan vaikeuksitta seurata ajan kuluessa.
• · « • · · [··; 25 Lopuksi on mainittava, että kaniini altistui tutkittavalle • # , : ·’ reagenssille ja tästä syystä kaniinin terveydentila on merkkinä tutkittavan reagenssin toksisuudesta.
• · • · · • · ·
Neljännellä määrityksellä määritetään angiogeneesiä hiiri: 30 ihmiskimeera-hiirimallissa ja siitä käytetään nimitystä hiirikimeeramääritys. Muut tutkijat ovat kuvanneet tätä . määritystä yksityiskohdittain ja lisäksi sitä on tässä Λ · · .·:· keksinnössä kuvattu käytettäväksi angiogeneesin, uudis- • m suonittumisen ja tuumorikudosten regression määrittämiseen.
«·« V 35 Näitä kysymyksiä on käsitelty julkaisussa Yan, et ai., J.
♦ ♦ ♦
Clin. Invest. 91 (1993) 986 - 996. Hiirikimeeramääritys on • ♦ .·.·. käyttökelpoinen määritysmalli angiogeneesin tutkimiseksi in • · • · 1 · 48 vivo -olosuhteissa, koska siirretyt ihosiirteet muistuttavat tarkoin histologisesti normaalia ihmisen ihoa ja tässä tapahtuu koko kudoksen uudissuonittumista, jossa todelliset ihmisen verisuonet kasvavat siirretystä ihmisen ihosta 5 siirretyn ihmisen ihon pinnalla olevaan humaanituumori- kudokseen. Ihmissiirteeseen syntyvän uudissuonittumisen alkuperä on osoitettavissa uudissuonittuman immunohisto-kemiallisella värjäyksellä käyttämällä humaanispesifisiä endoteelisolujen markkereita.
10
Kuten tässä keksinnössä on osoitettu, on hiirikimeera-määrityksellä kyetty osoittamaan uudissuonittuman regres-soituvan sillä perusteella, että uusien verisuonten kasvu sekä niiden määrä että esiintymisalue regressoituvat. Lisäk-15 si on helppoa seurata niitä vaikutuksia, jotka kohdistuvat siirretyn ihon pinnalle siirrostetun kudoksen, kuten tuumorikudoksen, kasvuun. Lopuksi on mainittava, että tämä määritys on käyttökelpoinen siitä syystä, että määritys-järjestelmä sisältää sisäisen toksisuuskontrollin. Kimeeri-20 nen hiiri altistuu tutkittavalle reagenssille ja tästä syystä hiiren terveydentila on merkkinä toksisuudesta.
• 1 • · · ’· Esimerkit • · · • · *·* ' Seuraavat tähän keksintöön liittyvät esimerkit ovat kuvaavia 25 eikä niiden luonnollisestikaan ole katsottava tätä keksintöä • · · : V nimenomaan rajoittaviksi. Lisäksi sellaiset tämän keksinnön muunnelmat, jotka ovat nykyisin tunnettuja tai joita myöhem-:V: min tullaan kehittämään, joita alan ammattikokemuksen perus- teella on mahdollista käyttää, on katsottava kuuluvan tämän 30 keksinnön suojapiiriin, joka on jäljempänä olevien patentti vaatimusten mukainen.
• · « ♦ ♦ *** 1. Synteettisten peptidien valmistus • · *·1 . Taulukossa 1 luetellut lineaariset ja sykliset polypeptidit :: 35 syntetoitiin käyttäen tavallisia kiinteän faasin synteesi- :***. menetelmiä, kuten esimerkiksi menetelmiä, joita on kuvattu • · · .Y julkaisussa Merrifield, Adv. Enzymol. 32 (1969) 221 - 96, ja • · • · 2 2 · · · 49
Fields, G.E. ja Noble, R.L., Int. J. Peptide Protein Res. 35 (1990) 161 - 214. 2 grammaa (g) peptidiä BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe (SEKVENSSI ID NO:1) liuotettiin ensin 60 millilitraan (ml) metanolia, johon lisättiin 1,5 ml 2 N 5 natriumhydroksidiliuosta seoksen muodostamiseksi. Tämän jälkeen seosta sekoitettiin 3 tuntia 20 °C.-ssa (20C) . Kun seos oli haihdutettu, jäännös otettiin talteen veteen, tehtiin happameksi laimennetulla HCl:lla siten, että sen pH:ksi tuli 3, ja uutettiin etyyliasetaatilla. Uute kuivat-10 tiin Na2S04:n päällä, haihdutettiin uudelleen ja tulokseksi saatua peptidiä BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEKVENSSI ID NO:2) sekoitettiin 20 °C:ssa 2 tuntia dioksaanissa, joka sisälsi 20 ml 2 N HCl:ää. Tulokseksi saatu seos haihdutettiin peptidien H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEKVENSSI ID 15 NO:3) aikaansaamiseksi, joka tämän jälkeen liuotettiin seokseen, joka sisälsi 1800 ml dikloorimetaania ja 200 ml dimetyyliformamidia (DMF), minkä jälkeen seos jäähdytettiin 0 °C.*een. Tämän jälkeen seokseen lisättiin peräkkäin sitä samalla sekoittaen 0,5 g disykloheksyylikarbodi-imidiä 20 (DCCI) , 0,3 g 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBT) ja 0,23 ml N-metyylimorfoliinia.
• · • « « • · ·
Tulokseksi saatua seosta sekoitettiin vielä 24 tuntia • · • · · * . 0 °C:ssa ja tämän jälkeen 20 °C:ssa vielä 48 tuntia. Liuos • · · 25 konsentroitiin ja sitä käsiteltiin sekakerrosioninvaihtimel- • · · » « ! · la suolojen poistamiseksi siitä. Sen jälkeen kun tulokseksi saatu hartsi oli poistettu, niin suodattamalla selkeytetty • · ’ liuos haihdutettiin ja jäännös puhdistettiin kromatografi- sesti, mistä saatiin talteen peptidi 30 syklo(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEKVENSSI ID NO:4). Seu- raavat peptidit, jotka on lueteltu taulukossa 1 käyttäen . .·. aminohapporyhmien lyhenteinä yksikirjaimisia koodeja ja ,·;· jotka tunnistetaan peptidien numeromerkinnöillä, saatiin • · analogisella tavalla; syklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEKVENS- • · ·
35 SI ID NO:5) ; syklo(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (SEKVENSSI ID
·..] NO: 6) ; syklo (Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (SEKVENSSI ID NO:9); .·!·] syklo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEKVENSSI ID N0:7) . Peptidi, • · 50 jolle oli annettu nimitys 66203, jonka sekvenssi oli identtinen peptidin 62184 sekvenssin suhteen, erosi ainoastaan viimeksi mainitusta sen perusteella, että se sisälsi HC1-suolan 62184:ssa esiintyvän TFA-suolan sijaan. Esimerkissä 7 5 kuvatulla tavalla suoritetuissa angiogeneesin inhibitio-määrityksissä, joissa käytettiin synteettisiä peptidejä, oli HCl:ää sisältävä peptidi hieman tehokkaampi angiogeneesin inhibitiossa kuin identtinen TFArhan valmistettu peptidi.
10
Taulukko 1
Peptidi Aminohapposek- SEKVENSSI
nro_ venssi1_ ID NO_ 15 62181 syklo(GrGDFV) 4 62184 syklo(RGDfV) 5 62185 syklo(RADfV) 6 62187 syklo(RGDFV) 7 62880 YTAECKPQVTRGDVF 8 20 62186 syklo(RaDFV) 9 62175 syklo(ARGDfL) 10 . . 62179 syklo(GRGDfL) 11 • · *;./ 62411 TRQWCDLGNPM 12 • · ♦ • ♦ · * . 62503 GWRNNEAIARLS 13 ♦ ♦ · • · · 25 62502 TDVNGDGRHDL 14 • · · • · • · • · · • · · lii 1 pienet kirjaimet tarkoittavat D-aminohappoa; isot kirjai- · met tarkoittavat L-aminohappoa.
30 • · · • · · ly.' Peptidi, jolle oli annettu nimitys 69601, joka sisälsi • · · *. peptidin 62185 sekvenssin suhteen identtisen sekvenssin, • · · *...· 35 erosi viimeksi mainitusta ainoastaan sen perusteella, että *:**: se sisälsi HCl-suolaa 62184 :ssa esiintyvän TFA-suolan si- :·] jaan.
• ·· ♦ 51 2♦ Monoklonaaliset vasta-aineet
Hybridooman ATCC HB 9537 erittämää monoklonaalista LM 609-vasta-ainetta valmistettiin käyttämällä tavallisia hybri-5 doomamenetelmiä immunisoimalla eristetyllä ανβ3:11a, joka oli adsorboitu Sepharose-linssipapulektiinihelmiin. ανβ3 oli eristetty humaanimelanoomasoluista, joille oli annettu nimitys M21, ja vasta-ainetta tuotettiin julkaisussa Cheresh et ai., J. Biol. Chem. 262 (1987) 17703 - 17711 kuvatulla 10 tavalla. M21-solut oli saatu DR. D. L. Mortonilta (University of California at Los Angeles, CA) ja niitä kasvatettiin suspensioviljelmissä RPMI 1640 -kudosviljely-mediumissa, joka sisälsi 2 mM L-glutamiinia, 50 mg/ml gentamisiinisulfaattia ja 10 % fetaalista vasikanseerumia. 15
Monoklonaalisen vasta-aineen LM609 on osoitettu reagoivan immunologisesti spesifisesti avP3-kompleksin kanssa eikä reagoivan immunologisesti av-alayksikön, P3-alayksikön eikä muiden integriinien kanssa.
20 3. avB3:n ilmentymisen kudoksiin jakautumisen luonnehtiminen A. Immunofluoresenssi integriinireseotoria vastaan suunnat- • · ·.'·· tuien vasta-aineiden avulla • · · • · · • · · ; 25 Haavojen paranemisen aikana ilmentävät verisuonten tyvi- • · · kalvot useita adheesioproteiineja, joita ovat von Wille- • · . .·. brandin tekijä, fibronektiini ja fibriini. Lisäksi viljelty- • · · jen sileiden lihassolujen ja endoteelisolujen pinnalla • · · ' ilmentyy adheesioreseptoreiden integriinimolekyyliperheen 30 useita jäseniä. Näitä kysymyksiä on käsitelty julkaisuissa '···' Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 6471; Janat, • · · V 1 et ai., J. Cell Physiol. 151 (1992) 588; ja Cheng, et ai., J. Cell Physiol. 139 (1989) 275. Näihin integriineihin • · · ....: kuuluu ανβ3, joka on von Willebrandin tekijän, fibrinogeenin 35 (fibriinin) ja fibronektiinin endoteelisolureseptori jul- • · • · · • i 52 kaisussa Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 6471 kuvatulla tavalla. Tämä integriini käynnistää kalsiumista riippuvaisen signaalin kulkutien, joka johtaa endoteeli-solujen liikkumiseen, mistä syystä sillä näyttää olevan 5 perustavaa laatua oleva osuus verisuonisolujen biologiassa Leavelsey, et al.’:n, J. Cell Biol., 121 (1993) 163, kuvaamalla tavalla.
Angiogeneesin aikana tapahtuvan 0!v|33:n ilmentymisen tutkimi-10 seksi otettiin potilaiden haavan jyväiskudosta tai tämän vieressä olevaa normaalia ihoa sairaalassa hoidettavana olevilta potilailta, pestiin 1 ml :11a fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta ja valettiin O.T.C-mediumiin (Tissue Tek). Valetut kudokset jäädytettiin nopeasti neste-15 typessä noin 30 - 45 sekunnin ajan. Pakastetuista kappaleista leikattiin 6 μτη paksuisia kudosleikkeitä kryostaatti-mikrotomissa niille myöhemmin tehtävää immunoperoksidaasi-värjäystä varten, johon käytettiin joko j33-integriineille (αν|83 tai Q!IIbj83) tai integriinien /3-L-alaperheelle spesifisiä 20 vasta-aineita.
• · I Kuvioissa IA - ID on esitetty normaalin ihmisen ihon ja haavan jyväiskudoksen värjäystulokset. Monoklonaalisia ; vasta-aineita AP3 ja LM534, joista ensimmäinen on suunnattu • · · 25 j83- ja jälkimmäinen /81-integriinejä vastaan, käytettiin pakastettujen leikkeiden immunohistokemialliseen analyysiin.
'.Il Kokeet neljältä eri luovuttajalta peräisin olevalla kudok- ♦ · · * sella tuottivat samanlaiset tulokset. Valomikroskoopilla otetut valokuvat on esitetty 300-kertaisena suurennuksella.
30 avjS3-integriini ilmentyi voimakkaasti jyväiskudoksen veri-suonissa (kuvio IB) mutta ei ollut havaittavissa samalta : :** luovuttajalta peräisin olevan normaalin ihon dermiksessä eikä epiteelissä (kuvio IA) . Tästä poiketen /^-integriinit • · · 35 ilmentyivät voimakkaasti verisuonissa ja strooman soluissa • · 1 y. sekä normaalissa ihossa (kuvio 1C) että jyväiskudoksessa • ♦ (kuvio ID) ja aikaisemmin osoitetulla tavalla julkaisussa 53
Adams, et ai., Cell 63 (1991) 425, kuvatulla tavalla epiteelin tyvisoluissa.
B. Immunofluoresenssi käyttäen liaandia vastaan suunnattuna 5 vasta-aineita.
Edellisessä vaiheessa valmistetuista ihmisen normaalin ihon ja jyväiskudosten muista kudosleikkeistä tutkittiin myös β3-ja /31-integriinien ligandit, joista edellinen on von Wille-brandin tekijän ligandi ja jälkimmäinen laminiinin ligandi. 10 von Willebrandin tekijä paikantuu normaalin ihon verisuoniin (kuvio 2A) ja jyväiskudoksen verisuoniin (kuvio 2B) , kun taas laminiini paikantuu kaikkiin verisuoniin sekä endo-teelin tyvikalvoon molemmissa kudospreparaateissa (kuviot 2C ja 2D).
15 C. α,βτ'·3· vastaan suunnattujen vasta-aineiden jakautuminen syöpäkudok s e s s a
Edellä olevien analyysien lisäksi tutkittiin myös potilailta 20 peräisin olevan syöpäkudoksen kudosnäytteistä myös ανβ3:η esiintyminen ja tämän jakautuminen. Kudoksia esikäsiteltiin • · !.*·· esimerkissä IA kuvatulla tavalla lukuun ottamatta sitä, että ne värjättiin monoklonaalisella LM609-vasta-aineella, joka : oli valmistettu esimerkissä 2 ja joka on spesifinen inte- :*.·. 25 griinien reseptorikompleksille, avj83:lle. Lisäksi tuumoreita . .·. esikäsiteltiin myös histologista mikroskopointianalyysiä • · · y.‘. varten kiinnittämällä edustavia esimerkkejä tuumoreista
Bulins Fixative -kiinnitteesssä 8 tunnin ajan ja valmistettiin sarjaleikkeitä, jotka värjättiin H&E:lla.
30
Tulokset rakko-, kooloni-, rinta- ja keuhkosyöpäkudosten immunoperoksidaasivärjäyksestä on esitetty kuviossa 3A - 3D, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Qfv|S3 ilmentyy voimaksi·* kaasti ainoastaan neljässä analysoidussa syöpäkudosnäyttees- #I.. 35 sä esiintyvissä verisuonissa eikä missään muussa kudoksessa *!*. esiintyvässä solussa.
• ·
• * I
• · · « · 54 Tässä keksinnössä kuvatut tulokset osoittavat siten, että 0^/63-integriinireseptori ilmentyy selektiivisesti spesifisissä kudostyypeissä, nimittäin jyväiskudoksissa, metastaatti-sessa kudoksessa ja muissa kudoksissa, joissa angiogeneesi 5 on parhaillaan käynnissä, eikä normaalissa kudoksessa, joissa uusien verisuonten muodostuminen on lakannut. Nämä kudokset tarjoavat tästä syystä käyttöön ihanteellisen kohteen tämän keksinnön mukaisille terapeuttisille kohteille.
10 4. Ligandi-reseptori-sitoutumismäärityksellä havaittavien a.jSn-spesifisten synteettisten peptidien tunnistaminen
Esimerkissä 1 valmistetuille synteettisille peptideille 15 suoritettiin seulonta määrittämällä niiden kyky toimia vastavaikuttajina arvjS3- ja reseptorin sitoutumis- aktiivisuuteen puhdistetun ligandin ja reseptorin sitoutumiseen perustuvissa määrityksissä. Näihin sitoutumistutkimuk-siin soveltuva menetelmä on kuvattu julkaisuissa Barbas, et 20 ai., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 90 (1993) 10003 - 10007,
Smith, et ai., J. Biol. Chem. 265 (1990) 11008 - 11013 ja Pfaff, et ai., J. Biol. Chem. 269 (1994) 20233 - 20238, joiden sisältö on liitetty tähän keksintöön siihen oikeutta- ; ·1. vien säännösten nojalla.
• · · 25 Tässä keksinnössä on kuvattu menetelmä antagonistien tunnis- • · · tamiseksi ligandin ja reseptorin sitoutumiseen perustuvassa * määrityksessä, jossa reseptori immobilisoidaan kiinteään kantaja-aineeseen ja ligandi ja antagonisti ovat liukoisia.
30 Keksinnössä on myös kuvattu ligandin ja reseptorin sitoutu miseen perustuva määritys, jossa ligandi immobilisoidaan kiinteään kantaja-aineeseen ja reseptori ja antagonistit :1:1 ovat liukoisia.
* 1 • · · • ·
• I
35 Lyhyesti mainittuna valittuja puhdistettuja integriinejä φ · immobilisoitiin erikseen Titertek-mikrotiitterilevyn kuop- • · piin käyttäen päällystyskonsentraationa 50 nanogrammaa (ng) · · · · • « 55 kuoppaa kohti. Ligandin ja reseptorin sitoutumiseen perustuvassa määrityksessä käytettyjen reseptorien puhdistus on tällä alalla tunnettua ja nämä ovat hankittavissa vaikeuksitta käyttöön alan ammattikokemuksen perusteella tunnettuja 5 menetelmiä käyttäen. Levyä inkuboitiin ensin 18 tunnin ajan 4 °C:ssa ja levyn epäspesifiset sitoutumiskohdat tehtiin reagoimattomiksi käyttäen Tris’:lla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen valmistettua naudan seerumialbumiinia (BSA), jonka konsentraatio oli 10 milligrammaa millilitrassa 10 (mg/ml). Inhibitiotutkimuksia varten tutkittiin useita taulukosta 1 peräisin olevien valittujen peptidien konsent-raatioista niiden kyky estää 125I-vitronektiinin tai 125I-fibrinogeenin sitoutuminen integriinireseptoreihin, avjS3:een ja Q!IIbj83 :een. Vaikkakin näillä ligandeilla esiintyy optimaa-15 lista sitoutumista tiettyyn nimenomaiseen integriiniin, vitronektiinillä 0^)83 :een ja f ibrinogeenillä aIIbjS3:een, niin sitoutumisen inhibitiotutkimuksilla, joissa käytettiin peptidejä, joilla oli tarkoitus estää fibrinogeenin sitoutuminen kumpaankin reseptoriin, oli mahdollista määrittää 20 tarkasti se mikromolaarisuusarvona (μΜ) ilmoitettu peptidi- määrä, joka tarvittiin estämään reseptorin sitoutuminen • · 5.'·; ligandiin maksimaalisen sitoutumisen puolivälissä. Radio- aktiivisella leimalla varustettuja ligandeja käytettiin : nanomolaarisissa konsentraatioissa ja sitoutuminen tutkit- 25 tiin erikseen käyttämällä leimalla varustamattomia synteet- . .·. tisiä peptidejä.
• · « • · « • ·
Vapaa ligandi poistettiin 3 tunnin inkuboinnin jälkeen pesemällä ja sitoutunut ligandi havaittiin gammalaskennalla. 30 Koetulokset määrityksistä, joissa taulukossa 1 lueteltuja syklisiä peptidejä käytettiin inhiboimaan reseptorien ja radioaktiivisella leimalla varustetun f ibrinogeenin sitoutu-mistä erikseen immobilisoituihin orvj83:een ja orIIbj83-resepto-reihin, olivat erittäin toistettavat, ja koepisteiden väli- • · 35 nen virhe oli tyypillisesti alle 11 %. IC50-koetulokset, jotka on ilmoitettu mikromooleina (IC50 μΜ) , on ilmoitettu • · · 56 kahdesta rinnakkaisesta koepisteestä laskettuna keskiarvona ± standardipoikkeama taulukossa 2 esitetyllä tavalla.
Taulukko 2 5 Peptidin numero avp3 ICsn μΜ aTThp·, IC^n μΚ 62181 1,96 ± 0,62 14,95 ± 7,84 62184 0,05 ± 0,001 0,525 ± 0,10 10 62185 0,885 ± 0,16 100 ± 0,001 62187 0,05 ± 0,001 0,26 ± 0,056 62186 57,45 ± 7,84 100 ± 0,001 62175 1,05 ± 0,07 0,63 ± 0,18 62179 0,395 ± 0,21 0,055 ± 0,007 15
Syklisillä peptideillä, jotka sisälsivät RGD-sekvenssin tai jotka sisälsivät RGD-sekvenssin ja joista oli valmistettu johdannainen, peptideillä 62181, 62184, 62185 ja 62187, jotka kukin sisälsivät yhden D-aminohapporyhmän, esiintyi 20 sellaista fibrinogeeniin kohdistuvaa inhibitiota, joka vaikutti ensisijaisesti avP3-reseptoriin suuntautuvaan sitoutumiseen määritettynä sillä perusteella, että puolimaksimaa-liseen inhibitioon tarvittiin pienempi peptidin konsentraa-tio kuin aIIbP3-reseptoriin suuntautuvan sitoutumisen inhibi- m\·' 25 tioon. Tästä poiketen muut sykliset peptidit, jotka sisälsi-• · « *** vät RGD-sekvenssin tai jotka sisälsivät RGD-sekvenssin ja • · · : ·* joista oli valmistettu johdannainen, peptidit 62186, 62175 • · · *···* ja 62179, eivät olleet yhtä tehokkaita ehkäisemään fibrino- • ·· * geenin sitoutumista avP3:een eikä niillä esiintynyt inhi- 30 bitiota, joka olisi ensisijaisesti vaikuttanut fibrinogeenin :t:[: sitoutumiseen aIIbp3:een käyttäen vertailukohtana avP3:a.
Nämä tulokset ovat yhdenmukaiset Pfaff, et ai.’ :n, J. Biol. Chem. 269: 20233 - 20238 (1994) julkaisemien tulosten suh- • · ***. teen, joissa syklinen peptidi RGDFV (jossa F merkitsee D- 35 aminohapporyhmää) inhiboi spesifisesti fibrinogeenin sitou- tumista avp3-integriiniin eikä aIIbP3- eikä a5P1-integriinei-·;··· hin. Samanlaisia sitoutumisinhibitiomäärityksiä suoritettiin lineaarisilla peptideillä, jotka sisälsivät tai joista 57 puuttui RGD-motiivi ja joiden sekvenssit olivat peräisin av-reseptorialayksiköstä, o;IIb-reseptorialayksiköistä tai vitro-nektiinin ligandin aminohapporyhmien sekvensseistä. Lineaaristen peptidien 62880 (VN:sta peräisin olevat aminohappo-5 ryhmät 35 - 49), 62411 (av:sta peräisin olevat aminohappo- ryhmät 676 - 687); 62503 (o!v:sta peräisin olevat aminohappo-ryhmät 655 - 667) ja 62502 (o;IIb:sta peräisin olevat amino-happoryhmät 296 - 306) sekvenssit on lueteltu taulukossa 1. Kutakin näistä peptideistä käytettiin erillisissä määrityk-10 sissä inhiboimaan joko vitronektiinin (VN) tai fibrinogeenin (FG) sitoutumista joko Q!IIbjS3:een tai 0^183 :een. Taulukossa 3 on esitetty kunkin kokeen yksittäisen määrityksen mikro-mooleina ilmoitetut lC50-koetulokset (IC50 μΜ).
15 Taulukko 3
Peptidin aTIh^ IC^° _ αν03 IC5 0 _
numero _FG VN FG_ VN
62880 4,2 0,98 0,1 0,5 20 62411 >100 >100 >100 >100 62503 >100 >100 >100 >100 • · :.’*i 62502 90 5 >100 >100 • · · • ·
Ligandin sitoutumisinhibitiomääritysten tulokset, joissa • · .**1 25 määrityksissä sitoutuminen tapahtuu valittuihin integriini- • « : ·* reseptoreihin ja joissa käytettiin lineaarisia peptidejä, • · · *·:·* osoittavat, että ainoastaan peptidi 62880 oli tehokas inhi- *.* · boimaan FG:n tai VN:n sitoutumista avjS3:een puolimaksimaa- lisena sitoutumisena ilmoitettuna, määritettynä sen perus- 30 teella, että puolimaksimaaliseen inhibitioon tarvittiin pienempi peptidikonsentraatio verrattuna ofIIbj83-reseptoriin ; tapahtuvan sitoutumisen inhibitioon. Mikään muista lineaari- • · · .*:* sista peptideistä ei ollut tehokas estämään ligandin sitou- ^· · tumista av/83:een, vaikkakin peptidi 62502 oli tehokas estä- • · *·* 35 mään VN:n sitoutumisen Q!IIbj83 :een.
··« .*.* Siten tässä keksinnössä kuvattua 1 igandi-reseptori-määri- ....· tystä voidaan käyttää seulomaan rengasmaisia tai lineaarisia 58 synteettisiä peptidejä, joissa esiintyy selektiivistä spesifisyyttä tiettyä nimenomaista integriinireseptoria, varsinkin αν03:a, kohtaan kun näitä käytetään vitronektiiniresep-tori (avjS3) -antagonisteina tätä keksintöä käytettäessä.
5 5. Käsittelemättömän kanan ravitsemuskalvon (CAM) luonnehtiminen A. CAM:n valmistus 10 Angiogeneesi voidaan saada aikaan kanan ravitsemuskalvossa (CAM) sen jälkeen kun normaali alkion angiogeneesi on johtanut kypsien verisuonten muodostumiseen. Angiogeneesin on osoitettu indusoituvan vasteena spesifisille sytokiineille tai tuumorifragmenteille julkaisuissa Leibovich, et ai., 15 Nature 329 (1987) 630 ja Ausprunk, et ai., Am. J. Pathol. 79 (1975) 597. kuvatulla tavalla. Kanan alkioista valmistettiin CAM-preparaatteja niiden käyttämiseksi tämän jälkeen angiogeneesin käynnistämiseen ja tämän inhibitioon joista edellisistä on kuvattu esimerkissä 6 ja jälkimmäistä esimerkissä 20 7. 10 päivän ikäisiä kanan alkioita hankittiin käyttöön yhtiöstä McIntyre Poultry (Lakeside, CA) ja niitä inkuboi-tiin 37 °C:ssa 60-%:isessa kosteudessa. Munan kuoreen juuri • ‘j*. ilmataskun päällä olevaan kohtaan porattiin askarteluporalla . (Dremel, Division of Emerson Electric Co. Racine WI) pieni • · · 25 reikä. Toinen reikä porattiin munan laakeaan kylkeen alueel- ’ le, joka ei sisältänyt alkion verisuonia munan etukäteen • · I” suoritetun läpivalaisun avulla määritettynä. Alkuperäiseen • · reikään kohdistettiin negatiivista painetta, joka johti siihen, että CAM (ravitsemuskalvo) vetäytyi irti kuoren 30 kalvosta ja muodosti keinotekoisen ilmapussin CAM:n päälle.
Laskeutuneen CAM:n päälle leikattiin kuori lävistäen : ^ 1,0 senttimetri (cm) x 1,0 cm nelikulmainen aukko käyttäen pienoismallien jyrsinterää (Dremel) . Pienen aukon avulla oli y..' mahdollista päästä käsiksi suoraan alla olevaan CAM:ään.
• · 35 •
Tuloksena olevaa CAM-preparaattia käytettiin sitten joko :V. alkion kehityksen kuudennen päivän kohdalla, jolle vaiheelle # · · · * 59 on luonteenomaista aktiivinen uudis suoni ttuminen, joka ilman muuta CAM:lie suoritettua käsittelyä heijastaa alkion uudis-suonittumiseen kohdistuvien vaikutusten arviointiin käytettävää mallia, tai sitä käytettiin alkion kehityksen 10. 5 päivän kohdalla, jolloin angiogeneesi oli laantunut. Viimeksi mainittua preparaattia käytettiin siten tässä keksinnössä angiogeneesin indusoimiseksi uudelleen vasteena sytokiini-käsittelylle tai kosketukseen saattamiselle tuumorin kanssa esimerkissä 6 kuvatulla tavalla.
10 B. CAM:n histologia
Kanan alkion CAM-preparaattien ja/tai kanan alkioista irrotettujen humaanituumorien mikroskooppisen rakenteen analysoimiseksi esimerkissä 8 kuvatulla tavalla valmistettiin 15 CAM-preparaatteja ja tuumoreita jäädytettynä suoritettavaa leikkeiden valmistusta varten esimerkissä 3A kuvatulla tavalla. Kryostaattimikrotomiin kiinnitetyistä jäädytetyistä kappaleista leikattiin 6 mikrometrin paksuisia kudosleikkei-tä immunofluoresenssianalyysiä varten.
20
Kuviossa 4 on esitetty tyypillinen valomikroskoopilla otettu valokuva käsittelemättömässä 10 päivän ikäisessä CAM:ssa olevasta alueesta, joka ei sisällä verisuonia. Koska CAM- ..* järjestelmässä tapahtuva angiogeneesi on tässä alkion- • ·· 25 kehityksen vaiheessa laantumassa, niin tämä järjestelmä on [ käyttökelpoinen tässä keksinnössä uuden suonittumisen muo- • · Γ* dostumisen stimulointiin olemassaolevista verisuonista • · viereisistä alueista käsin sellaisille CAM:n alueille, joissa ei tällä hetkellä ole verisuonia.
30 C. CAM:ssa esiintyvät inteariiniprofiilit immunofluoresens- '•S"' sin avulla määritettynä • ·· • · • « .J.* Jotta integriinireseptorien jakautumista CAM-kudoksiin olisi • · 35 kyetty tarkastelemaan, kiinnitettiin sekä tuumorikudoksesta • · ’·;·* että kanan alkion CAM-kudoksista valmistettuja 6 mikrometrin (Mm) pakastettuja kudosleikkeitä asetonissa 30 sekunnin ajan • 60 ja värjättiin immunofluoresenssitutkimusta varten 10 mikrogrammaa millilitrassa (μ^/ταί) CSAT-MAB: 11a, joka on inte-gr i ini - βλ - ai ayks iköl le spes i f inen monokl onaal inen vasta - aine, julkaisussa Buck, et ai., J. Cell Biol. 107 (1988) 2351, 5 kuvatulla tavalla, ja sitä käytettiin siten kontrolleihin, tai LM609:11a sellaisena kuin tämä on valmistettu esimerkissä 2. Primaarisen värjäyksen jälkeen preparaatit värjättiin suhteessa l : 250 valmistettua vuohessa tehtyä hiirtä vastaan suunnattua rodamiinileimalla varustettua sekundaarista 10 vasta-ainetta (Tago), minkä avulla primaarisen immuuni-reaktion tuote on mahdollista havaita. Tämän jälkeen leikkeet analysoitiin Zeiss-immunofluoresenssiyhdysmikroskoopil-la.
15 Immunofluoresenssianalyysin tulokset osoittavat, että käsit telemättömässä 10 päivän ikäisessä alkiossa esiintyvät kypsät verisuonet ilmentävät integriini βλ-alayksikköä (kuvio 5A). Tästä poiketen kuviossa 5A esitetyissä kudoksen sarja-leikkeissä ei havaita mitään immunologista reagoivuutta 20 LM609:n kanssa (kuvio 5B). Siten 10 päivän ikäisessä käsit telemättömässä kanan alkiossa esiintyvät kypsät verisuonet ί ’.· eivät ilmentäneet aktiivisesti LM609-vasta-aineen avulla • « :1:1 havaittavaa integriini ofvj83:a. Kuten CAM-mallissa ja seuraa- : ·1· vissa esimerkeissä on osoitettu, niin uuden kasvun tapah- ··· :1.· 25 tuessa verisuonissa normaalissa alkion kehityksessä tai joko . sytokiinien tai tuumorien indusoimana ilmentävät verisuonet • ♦ avjS3:a. Aktiivisen uudissuonittumisen jälkeen verisuonten ♦ # < * kehittymisen lakattua ανβ3:η ilmentyminen pienenee kuitenkin niin pieniin määriin, etteivät nämä ole havaittavissa 30 immunof luoresenssianalyysin avulla. Tämä o;vj83:n ilmentymisen säätely verisuonissa, joissa angiogeneesi tapahtuu, vasta- :.j. kohtana ilmentymisen puuttumiselle kypsissä verisuonissa :T tarjoaa käyttöön ainutlaatuisen tämän keksinnön mukaisen ,·|·1 kyvyn säädellä ja inhiboida angiogeneesiä seuraavissa esi- • · l.. 35 merkeissä kuvatulla tavalla mallinnettuna käyttäen tätä CAM- *J\ angiogeneesin määritysjärjestelmää.
• · • · • · • · · · · 61 6. CAM-angiogeneesimääritys A. Kasvutekiiöiden indusoima angiogeneesi
Esimerkissä 5A esitettyjen kirjallisuusviitteiden mukaisesti on angiogeneesin osoitettu käynnistyvän sytokiinien tai 5 kasvutekijöiden vaikutuksesta. Tässä keksinnössä kuvatuissa kokeissa indusoitiin angiogeneesi esimerkissä 5 kuvatussa CAM-preparaatissa kasvutekijöillä, jotka lisättiin paikallisesti CAM:n verisuonten pinnalle tässä keksinnössä kuvatulla tavalla.
10
Angiogeneesi indusoitiin asettamalla 5 millimetriä (mm) x 5 mm suuruinen Whatman-suodatinpaperikiekko (Whatman Filter Paper no.l), joka oli kyllästetty Hanks Balanced Salt Solution -liuoksella (HBSS, Gibco, Grand Island, NY) tai 15 HBSS:11a, joka sisälsi 150 nanogrammaa millilitrassa (ng/ml) emäksistä yhdistelmä-f ibroblastikasvuteki jää (0FGF) (Genzyme, Cambridge, MA) 10 päivän ikäisen kanan alkion CAM:n pinnalle alueelle, joka ei sisältänyt verisuonia, ja aukot suljettiin jälkeenpäin teipillä. /3FGF oli myös kon-20 sentraatiossa 125 ng/ml tehokas muissa määrityksissä indusoimaan verisuonten kasvua. Angiogeneesiä seurattiin valo-mikroskooppisesti 72 tunnin jälkeen. CAM-preparaatit pakas-:‘j* tettiin nopeasti ja 6 μπΐ:η paksuiset kryostaattileikkeet . .* kiinnitettiin asetonilla ja värjättiin immunofluoresenssin ··* ;·.· 25 avulla suoritettavaa tarkastelua varten esimerkissä 5C kuva- [ /· tulla tavalla käyttäen joko /51:tä vastaan suunnattua mono-• · · klonaalista CSAT-vasta-ainetta tai LM609:ää. Kuvion 5C esit- • · * tämä immunofluoresenssimikroskooppivalokuva esittää avj83:n ilmentymisen voimistumista jSFGF:lla aikaansaadun angiogenee- 30 sin aikana kanan CAM:ssa, josta poiketen α^β3:η ilmentymistä ei kuviossa 5B esitetyllä tavalla esiinny käsittelemättömäs- sä kanan CAM:ssa. ανβ3 oli havaittavissa vaikeuksitta useissa :T (75 - 80 %) jSFGF: 11a käsitellyissä CAM-preparaateissa ole- #.j.' vissa verisuonissa. Lisäksi /31-integriinin ilmentyminen ei • · 35 muuttunut siitä, mitä havaittiin käsittelemättömässä • *y, CAM:ssa, koska β1 oli myös vaikeuksitta havaittavissa stimu- : loiduissa verisuonissa.
• · *···’ • · 62 Tämän jälkeen αν/33- ja j81-integriinien suhteellinen ilmentyminen kvantitoitiin |SFGF:lla indusoidun angiogeneesin aikana käyttäen CAM:n kryostaattileikkeiden konfokaalista laser-kuva -analyysiä . Tämän jälkeen värjätyt leikkeet analysoitiin 5 Zeiss’in konfokaalisella lasermikroskoopilla. Satunnaisesti valituista näkökentistä valittiin 25 LM609:lla värjättyä verisuonta ja 15 CSAT:lla värjättyä verisuonta (keskimääräinen koko -1200 mm2, vaihteluväli 350 - 3500 mm2), ja kunkin verisuonen keskimääräinen rodamiinifluoresenssi pinta-ala-10 yksikköä kohti määritettiin mielivaltaisissa yksiköissä kon-fokaalista laser-kuva-analyysiä käyttäen. Koetulokset on ilmoitettu fluoresenssin voimakkuuden keskiarvona verisuonten mielivaltaisissa yksiköissä ± keskivirhe (SE).
15 Kuvioon 6 merkityt tulokset osoittavat, että ανβ3.·η värjäyty minen oli merkittävästi voimistunut (neljä kertaa korkeampi) jSFGF: 11a käsitellyissä CAM-preparaateissa määritettynä Wil-coxonin järjestyslukusummatestiliä (P < 0,0001), kun taas βλ:η värjäytyminen ei eronnut merkittävästi jSFGF:ää käytettä-20 essä.
• CAM-määritystä käytettiin vielä toisen voimakkaan :*:* angiogeneesin indusorin, tuumorinekroositekijä-α (TNFa) j81- ; ;*· ja jS3-integriinien ilmentymiseen kohdistuvan vaikutuksen tut- • « · :*.· 25 kimiseen. Suodatinpaperikiekkojen, joihin oli imeytetty joko • · , ,· j3FGF:ää tai TNFa:aa ja jotka oli asetettu 10 päivän ikäisis- • · » tä alkioista peräisin olevien CAM-preparaattien pinnalle, • · * havaittiin edistävän paikallista angiogeneesiä 72 tunnin jälkeen.
30
Tulokset on esitetty sellaisista CAM-preparaateista otetuis- sa valokuvissa, jotka olivat joko käsittelemättömiä (kuvio 7A) , käsitelty /3FGF:lla (kuvio 7B) tai käsitelty TNFa :11a ,·|·* (kuvio 7C) . Sekä j8FGF:lla että TNFa:11a käsitellyissä prepa- * · 35 raateissa ovat verisuonet vaikeuksitta havaittavissa, mutta *;*. niitä ei esiinny käsittelemättömässä CAM:ssa. Siten paikal- • · linen kasvutekij ä/sytokiinikäsittely johti angiogeneesin t «·» • · 63 käynnistymiseen viereisellä alueella sijaitsevista kypsistä verisuonista käsin sellaiselle alueelle, jossa ei alun perin ollut verisuonia. Ottaen huomioon /3FGF:n aikaansaamien verisuonten muodostumisen ja tämän yhteydessä esiintyneen 5 ανβ3:η ilmentymisen kuviossa 5C kuvatulla tavalla, johtaa TNFa-käsittely tähän verrattaviin aktiivisuuksiin.
Nämä havainnot viittaavat siihen, että sekä ihmisellä että kanalla esiintyy angiogeneesiin liittyvissä verisuonissa 10 ανβ3:n ilmentymisen voimistumista. Tämän suhteen yhdenmukais ta on se, että α;νβ3:η ilmentyminen viljellyissä endoteeli-soluissa voidaan indusoida useilla sytokiineillä in vitro -olosuhteissa julkaisuissa Janat, et ai., J. Cell Physiol. 151 (1992) 588; Enenstein, et ai., Exp. Cell Res. 203(1992) 15 499 ja Swerlick, et ai., J. Invest. Derm. 99 (1993) 715, kuvatulla tavalla.
Esimerkeissä 7A ja 7B on esitetty vasta-aine- ja peptidi-inhibiittorien aikaansaama vaikutus kasvutekijöiden indusoi-20 maan angiogeneesiin.
• · ·.*·; B. Alkion anqioqeneesi • ·· ί.Σ Se CAM-preparaatti, jota käytettiin sen vaikutuksen arvioin- tiin, joka angiogeneesin inhibiittoreilla on alkion uudis-:’**· 25 suonituksen luonnolliseen muodostumiseen, oli aikaisemmin • m . .· kuvattu kuuden päivän ikäinen alkiovaiheen kanan alkio. Täs- • · · .·,· sä kehityksen vaiheessa on verisuonissa tapahtumassa par- € · haillaan de novo -kasvu, ja tämä tarjoaa käyttöön käyttökelpoisen järjestelmän sen määrittämiseksi, osallistuuko avj83 30 alkion angiogeneesiin. CAM-järjestelmä valmistettiin edellä kuvatulla tavalla lukuun ottamatta sitä, että määritys suo-ritettiin alkion kehityksen 6. päivänä 10. päivänä suoritet- • ·· ·.· tavan määrityksen sijaan. Esimerkissä 7C on esitetty tämän • · ,*:* keksinnön mukaisilla vasta-aineilla ja peptideillä suorite- ,··· 35 tun käsittelyn vaikutus alkion angiogeneesiin.
» · · • · • · • · ♦ · • · <·«· » « i 64 C. Tuumorien aikaansaama angiogeneesi
Sen osuuden tutkimiseksi, mikä av/S3:lla on tuumorin aikaansaamassa angiogeneesissä, käytettiin useita erilaisia ofvjS3:n suhteen negatiivisia humaanimelanooma- ja karsinooma-5 fragmentteja CAM-määrityksessä, jossa preparaatti kasvatet tiin etukäteen ja eristettiin 17 päivän ikäisen alkion CAM:sta julkaisussa Brooks, et ai., J. Cell Biol. 122 (1993) 1351, kuvatulla tavalla ja tässä keksinnössä kuvatulla tavalla. Fragmentit indusoivat voimakkaan uudissuonittumisen 10 pelkän puskurin läsnäollessa.
Angiogeneesi indusoitiin CAM-määritysjärjestelmässä asettamalla tuumorifragmentti suoraan CAM:n pinnalle. Kanan alkion CAM:n valmistus tapahtui identtisesti edellä kuvattujen vai-15 heiden suhteen. Suodatinpaperikiekon sijaan asetettiin sel laiselle CAM-alueelle, jossa alun perin ei esiintynyt verisuonia, painoltaan 50 milligrammasta (mg) 55 mg:aan oleva fragmentti, joka oli peräisin tuumoreista, jotka olivat humaanimelanoomatuumori M2 IL, humaanikeuhkokarsinoomatuumori 20 UCLAP-3, humaanihaimakarsinoomasolulinja FG [Cheresh, et ai., Cell 58 (1989) 945 - 953] tai humaani kurkunpääkarsi-\*»> noomasolulinja HEp3, jotka kaikki ovat av|S3-negatiivisia tuu- :T moreita.
• t i » · • I» ··· • V 25 Humaanimelanooma-M21L-solulinjaa, humaanikeuhkokarsinooma- • · , ULCAP-3-solulinjaa, haimakarsinooma-FG-solulinjaa tai • t humaanikurkunpääkarsinooma-HEp3-solulinjaa, jotka kaikki t - olivat ανβ3-negatiivisia, käytettiin kiinteiden humaani-tuumorien kasvattamiseen kanan alkioiden CAM-preparaattien 30 pinnalle. CAM-preparaatteja käsiteltiin ensin yksisolu- suspensioilla, jotka sisälsivät 8 x 106 M21-L-, ULCAP-3- ja 9 FB-solua tai 5 x 105 HEp3-solua steriilissä HBSS:ssa, jonka «·· kokonaistilavuus oli 30 mikrolitraa (μΐ). Aukot suljettiin ,»·· teipillä ja alkioita inkuboitiin 7 päivää, jotta humaani- « · 35 tuumorileesioilla oli mahdollisuus kasvaa. Kun 7 päivää oli Ί*. kulumassa umpeen ja alkio oli tässä vaiheessa 17 päivän a « ‘Λ ikäinen, tuumorit irrotettiin CAM-preparaateista ja niistä «·<· 65 poistettiin ympäröivä CAM-kudos. Tuumorit leikeltiin 50 -55 mg:n painoisiksi tuumorifragmenteiksi käytettäväksi joko angiogeneesimäärityksissä tai tuumorin kasvun määrityksissä. Tuumori fragment it asetettiin uuden 10 päivän ikäisistä kanan 5 alkion CAM-preparaateista koostuvan preparaattiryhmän pin nalle esimerkissä 6a kuvatulla tavalla verisuonettomalle alueelle.
Tuumorit, jotka olivat kasvaneet in vivo -olosuhteissa kanan 10 alkion CAM-preparaattien pinnalla, värjättiin ανβ3:η ilmenty misen havaitsemiseksi LM609-mAb:lla esimerkissä 3A kuvatulla tavalla. Tuumorisoluissa ei havaittu spesifistä värjäytymistä, mikä osoittaa, ettei av03 ilmentynyt.
15 Näitä CAM-tuumoripreparaatteja käsiteltiin sitten myöhemmissä vaiheissa esimerkeissä 7D ja 7E kuvatulla tavalla tuumorin aikaansaamaan angiogeneesiin kohdistuvien vasta-aineiden ja peptidien vaikutusten määrittämiseksi. CAM-tuumoripreparaatteja käsiteltiin myös esimerkeissä 8, 9 ja 12 kuva-20 tulla tavalla niiden vaikutusten määrittämiseksi, joita vas ta-aineilla ja peptideillä on tuumorien regressioon ja angiogeenisten verisuonten ja verisuonten solujen apo- • · ptoosiin.
• · · • · · • · · : : : 25 7, Anaiocreneesin inhibitio CAM-määrityksissä määritettynä A. Kasvutekijän indusoiman angiogeneesin inhibitio inhibiit- . .·. torien paikalliskäsittelvllä • · · .··.·. 1) Käsittely monoklonaalisillä vasta-aineilla • · · 30 Sen määrittämiseksi, onko av|33 :11a aktiivista osuutta angio-geneesissä, asetettiin CAM-preparaattien pinnalle jSFGF:n tai TNFa:n suhteen kylläisiä suodatinpaperikiekkoja, minkä jäi- • · · '·’··' keen preparaatteihin lisättiin monoklonaalisia vasta-aineita • · · : (näistä käytetään myös nimitystä mAb, LM609:ää (spesifinen .··.*_ 35 avjS3:lle), CSAT:ta (spesifinen β1:11θ) tai P3G2:ta (spesifi- .···. nen av|S5 :lle) .
♦ · · • · • ♦ » · ♦ « · 66
Angiogeneesi indusoitiin CAM-preparaatteihin lähtien 10 päivän ikäisistä kanan alkioista käyttämällä /3FGF:n suhteen kylläisiä suodatinpaperikiekkoja. Tämän jälkeen kiekkoja käsiteltiin 50 ml :11a HBS:ää, joka sisälsi 25 mg mAb:tä 5 25 μ1:η kokonaistilavuudessa liuosta, joka sisälsi steriiliä HBSSrää 0, 24 ja 48 tunnin kohdalla. CAM-preparaatit koottiin talteen 72 tunnin kohdalla, ja ne pantiin halkaisijaltaan 35 mm:n suuruiseen petrimaljaan ja pestiin kerran 1 ml:11a fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta. 10 Suodatinpaperin alapuoli ja CAM-kudos analysoitiin tämän jälkeen Olympus-stereomikroskoopilla siten, että tarkastelijoina oli kaksi henkilöä ja koe oli järjestetty kaksois-sokkokokeena. Angiogeneesin inhibition katsottiin olevan merkittävää, kun CAM-preparaateissa esiintyi >50%:inen vä-15 lientyminen niiden CAM:ään tunkeutuvien verisuonten määrässä, jotka tunkeutuivat suoraan kiekon alla olevaan CAM:ään. Kokeet toistettiin neljä kertaa kutakin vasta-ainetta kohti käyttäen kutakin olosuhdetta kohti 6-7 alkiota.
20 Kuvioissa 8A - 8B on esitetty niiden vaikutusten tulokset, jotka mAb-käsittelyllä on /3FGF:n indusoimaan angiogeneesiin. Verisuoneton käsittelemätön CAM-preparaatti on esitetty ku- • · ·.*·: viossa 8A ja sen tehtävänä on toimia vertailukohtana kuvios- • · · ·.’· : sa 8B esitetylle /3FGF:n aikaansaamalle verisuonten muodostu- : : 25 misen käynnistymiselle ja kuvioissa 8C - 8E esitetyille mAb- ·*·*: molekyylien aikaansaamille vaikutuksille tähän. Noin • · . 75 %:ssa näistä CAM-preparaateista, jotka oli käsitelty LM609-mAb:lla, esiintyi >50%:inen angiogeneesin inhibitio kuviossa 8E esitetyllä tavalla ja monissa näistä vaikutti 30 verisuonten tunkeutuminen kudokseen jääneen tapahtumatta.
Tästä poiketen esiintyi yhdenmukaisesti huomattavaa suonit- tumista puskurikontrollissa (kuvio 8A) kiekoilla, jotka oli *.:·* käsitelty CSAT-mAb-molekyyleillä (kuvio 8C) ja P3G2-mAb-mo- • · · ·.· ’ lekyyleillä (kuvio 8D) .
.·*.· 35 • · .···. Kun angiogeneesi oli indusoitu TNFa: 11a, saatiin identtiset *’*· tulokset. Niiden vaikutuksen tutkimiseksi, jotka näillä sa- 67 moilla vasta-aineilla on jo ennestään olemassaoleviin kypsiin verisuoniin, joita esiintyy normaalin verisuonten kehittymisen seurauksena verisuonettomien alueiden vieressä, asetettiin mAb-molekyyleillä kyllästettyjä suodatinpaperi-5 kiekkoja sellaisista 10 päivän ikäisistä alkioista peräisin olevien CAM-preparaattien suonittuneiden alueiden pinnalle, joille ei oltu suoritettu paikallista sytokiinikäsittelyä. Mikään näistä kolmesta mAb-molekyylistä ei vaikuttanut jo ennestään olemassa oleviin verisuoniin määritettynä visuali-10 soimalla stereomikroskoopissa. Siten LM609-mAb inhiboi se lektiivisesti ainoastaan uusien verisuonten kasvua eikä vaikuttanut viereisillä alueilla esiintyviin kypsiin verisuoniin. Tämä sama vaikutus havaittiin käsittelemällä preparaatteja synteettisillä peptideillä joko käytettynä paikal-15 lisesti tai suonensisäisesti esimerkeissä 7A2) ja 7E2) kuvatulla tavalla mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna.
2) Käsittely synteettisillä peptideillä CAM-määrityksiä suoritettiin myös käyttäen tämän keksinnön 20 mukaisia synteettisiä peptidejä sen vaikutuksen määrittämiseksi, joka syklisillä ja lineaarisilla peptideillä on kasvutekijän aikaansaamaan angiogeneesiin. Peptidit valmis- • · · tettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja soluille esitet- • · · V ' tiin steriiliin HBSS:ään valmistettua peptidiä 25 μ1:η koko- 25 naistilavuudessa. CAM-preparaattia käsiteltiin peptidi- : liuoksella välittömästi ja tämän jälkeen 24 ja 48 tunnin : kohdalla. Suodatinpaperi ja ympäröivä CAM-kudos irrotettiin • · · 72 tunnin kohdalla ja näitä tarkasteltiin edellä kuvatulla tavalla.
30
Tulokset, jotka tästä määrityksestä kävivät ilmi, olivat . samanlaiset kuin kuvioissa 9A-9C esitetyt tulokset esi- • « · merkissä 7A2) kuvatulla tavalla, jossa synteettisiä peptide- • · ’·’ jä injektoitiin suonensisäisesti tuumorin aikaansaamiin 35 verisuoniin. Kuten kuviossa 9A on esitetty, jäivät /3FGF:n .***; aikaansaamat verisuonet koskemattomiksi kontrollipeptidiä • · · 62186 käyttäen. Tästä poiketen lisättäessä syklistä RGD-pep- • · · • · · 68 tidiä 62814 suodatinpaperiin inhiboitui verisuonten muodostuminen, ja uuden verisuonituksen syntyminen jäi alueeseen syntymättä. Tämä vaikutus oli ilmenemismuodoltaan samanlainen kuin kuviossa 9B esitetty vaikutus, joka on kuvattu 5 tuonnempana esimerkissä 7E2). Lisäksi kuten kuten kuviossa 9C on suonensisäisesti injektoitujen peptidien kyseessä ollessa osoitettu, niin niillä alueilla, joissa esiintyi kypsiä verisuonia jotka kuitenkin olivat etäällä kasvutekijällä kyllästetyn suodatinpaperin sijaintipaikasta, ei havaittu 10 näihin ulkopuolella sijaitseviin verisuoniin kohdistuvaa vaikutusta käytettäessä synteettisillä peptideillä suoritettua paikallista käsittelyä. Peptidien inhibitorinen aktiivisuus angiogeneesiin rajoittuu siten kasvutekijöiden aikaansaamille angiogeneesialueille eivätkä ne vaikuta viereisiin 15 jo ennestään olemassa oleviin kypsiin verisuoniin eikä kä sittely johda mihinkään ympäröivään alueeseen kohdistuvaan sytotoksisuuteen.
Samanlaisia määrityksiä suoritetaan muilla esimerkissä 1 20 valmistetuilla ja taulukossa 1 kuvatuilla synteettisillä peptideillä.
!.’·· B, Kasvutekijän aikaansaaman angiooeneesin inhibitio käyttä- mällä inhibiittorien suonen sisäistä annostelua • 25 l) Käsittely monoklonaalisilla vasta-aineilla • ·· • · · • · • · , .·. Tässä esimerkissä määritettiin se vaikutus, joka CAM-prepa- • · · e·*·. raattiin suonensisäisesti injektoiduilla monoklonaalisilla • # · vasta-aineilla on kasvutekijän aikaansaamaan angiogeneesiin.
30
Suonensisäisiä injektioita varten suoritettava kanan alkion CAM-preparaattien valmistus suoritettiin vähäisin modifikaa-tioin olennaisesti samalla tavoin kuin mitä on kuvattu esi- • · · '·/· merkissä 7A. Läpivalaisutoimenpiteiden aikana valittiin suu- • · .·;· 35 rimpia verisuonia ja munan kuoreen tehtiin niiden asemia • · S··. esittävät merkinnät. Kuoreen porattiin reiät ja CAM-prepa- raatit vedettiin esiin ja |8FGF: 11a kyllästetyt suodatin- • · * · * • · > • · • · · · • · 69 paperit asetettiin CAM-preparaattien pinnalle edellä kuvatulla tavalla. Aukot suljettiin steriilillä teipillä ja alkiot vietiin takaisin inkubaattoriin. Toinen pieni aukko leikattiin varovasti 24 tuntia myöhemmin munankuoren kyljel-5 le suoraan aiemmin valittujen suurten verisuonten päälle.
Munan kuoren ulko-osa poistettiin varovasti jättäen alkio-kalvot ehyiksi. Kuoren kalvo tehtiin läpinäkyväksi pienellä mineraaliöljypisaralla (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, joka mahdollisti verisuonten visualisoinnin vaivattomasti.
10 Puhdistettuja steriilejä mAb-molekyylejä tai synteettisiä peptidiejä, joista viimeksi mainitut on kuvattu tuonnempana, johdettiin kertakäsittelynä suoraan verisuoniin 30-numeroi-sella neulalla käyttäen 200 jug:n IgG-annosta alkiota kohti steriilissä BPS-liuoksessa, jonka kokonaistilavuus oli 15 100 μΐ. Aukot suljettiin teipillä ja alkioiden annettiin inkuboitua 72 tuntiin asti. Suodatinkiekot ja niiden ympärillä olevat CAM-kudokset analysoitiin edellä kuvatulla tavalla .
20 Sen määrittämiseksi, miten LM609 mAb paikantui tässä esi merkissä ja seuraavissa esimerkissä kuvatulla tavalla CAM- . . kudoksiin tai tuumorikudoksiin, joihin oli aiemmin johdettu • · · **et* suonensisäisesti LM609:ää, tehtiin kiinnitetyt leikkeet rea- • · '·' goimattomaksi HBSS:ään valmistetulla 2,5-%:isella BSA:lla * 25 yhden tunnin ajan huoneenlämmössä, minkä jälkeen preparaatti • · · : V värjättiin suhteessa 1 : 250 tehdyllä vuohessa valmistetun : : hiirtä vastaan suunnatun rodamiinileimalla varustetun sekun- • · · :*:*· daarisen vasta-aineen (Tago) laimennoksella. Leikkeet ana- lysoitiin tämän jälkeen Zeiss-immunofluoresenssi-yhdys-30 mikroskoopilla.
. Kuvioissa 10A - 10C on esitetty tulokset suonensisäisen • · vasta-ainekäsittelyn vaikutuksesta jSFGFrlla aikaansaatuja • · . verisuonia sisältävään CAM-preparaattiin. Kuviossa 10A on 35 esitetty jSFGF-käsittelyn johdosta indusoitunut angiogeneesi.
:***: Kuten kuviossa 10 on esitetty, ei mAb P3G2:lla, joka on ··· .V anti-avj85-vasta-aine, suoritetulla suonensisäisellä käsitte- • · • · ··«· .
• ·
J
70 lyllä havaittu syntyvän mitään muutosta jSFGFrlla aikaansaadun suonituksen esiintymiseen preparaatissa. Tästä poiketen sellaisen CAM-preparaatin käsittely anti-avjS3-vasta-ai-neella LM609, jossa angiogeneesi oli saatu aikaan jSFGF: 11a, 5 johti siihen, että uusien verisuonten kasvu suodattimen alueelle inhiboitui täydellisesti, mikä käy ilmi kuviosta 10C. Angiogeneesiin kohdistuva inhibitorinen vaikutus johtuu siten anti-afvjS3-spesifisen LM609-vasta-aineen aikaansaamasta avlS3-reseptoriaktiivisuuden inhibitiosta. Koska av|S5:n toi-10 minnan estäminen ei inhiboi uudissuonituksen muodostumista CAM-preparaattien suodattimen sisältävään kohtaan, niin orv/35 ei siten ole välttämätön av03:een verrattuna uusien verisuonten kasvulle.
15 2) Käsittely synteettisillä peptideillä
Esimerkissä yksi valmistettuja synteettisiä peptidejä injektoidaan erikseen suonen sisäisesti CAM-preparaatin kasvutekijän aikaansaamiin verisuoniin. Samalla tavoin määritetään peptidien vaikutus verisuonten pysyvyyteen.
20 C. Alkion angiogeneesin inhibitio paikalliskäsittelyn vaikutuksesta • · 1) Käsittely monoklonaalisilla vasta-aineilla ··· t · t · • : :* 25 Sen määrittämiseksi, osallistuuko av/33 alkion angiogenee- siin, tutkittiin LM609:n vaikutusta CAM-preparaattien veri- • · . suonten de novo -kasvuun 6. päivän ikäisissä alkioissa, joi- • · · • · · le vaiheelle on luonteenomaista aktiivinen uudissuonittumi- • · nen esimerkissä 5A kuvatulla tavalla. CAM-määritys valmis-30 teltiin esimerkissä 6C kuvatulla tavalla ja preparaatteja käsiteltiin paikallisesti käyttäen mAb-molekyyleille kyllästettyjä kiekkoja, jotka oli asetettu kuuden päivän ikäisten :.J. alkioiden CAM-preparaattien pinnalle sytokiinien poissa- ··· V ollessa. Kolmen päivän kuluttua CAM-preparaatit irrotettiin • · .*:* 35 ja valokuvattiin. Kussakin kokeessa käytettiin kuutta ai- .··· kiota ryhmää kohti ja nämä toistettiin kaksi kertaa.
• · · • · • · • « • · · • · • · · · • · 71 LM609-vasta-aine (kuvio 11C) toisin kuin CSAT (kuvio 11A) tai P3G2 (kuvio HB) , esti verisuonten kasvun näissä olosuhteissa. Tämä osoittaa, että οινβ3:lla on huomattavan suuri osuus alkion uudissuonittumisessa, joka tapahtui angiogenee-5 sin käynnistymiseen tarkoitetuista lisätyistä kasvutekijöis tä riippumattomasti.
2) Käsittely synteettisillä peptideillä
Esimerkissä 1 valmistettuja synteettisiä peptidejä lisätään 10 erikseen alkion CAM-preparaattiin, joka on valmistettu edel lä ja esimerkissä 5A2) kuvatulla tavalla käyttämällä joko CAM-preparaatin paikallista käsittelyä tai johtamalla näitä suonensisäisesti verisuoniin. Peptidien vaikutus verisuonten pysyvyyteen arvioidaan samalla tavoin.
15 D. Tuumorin aikaansaaman anaiogeneesin inhibitio paikallista käsittelyä käyttäen.
1) Käsittely monoklonaalisilla vasta-aineilla 20 Niiden edellä kuvattujen angiogeneesimääritysten lisäksi, joissa määritettiin anti-0^)83-antagonistien, LM609 ja peptidien 62181, 62184, 62185, 62187 ja 62880 vaikutukset alkion • · *· *· angiogeneesiin, tutkittiin myös avj83:n osuutta tuumorin V aikaansaamassa angiogeneesissä. Indusorina käytettiin av03- ϊ.·.' 25 negatiivisen humaani M21-L-melanooman fragmentteja, jota i*^ tuumoria oli aikaisemmin kasvatettu ja joka oli eristetty • 17 päivän ikäisen kanan alkion CAM:sta. Fragmentit valmis-• · · .*.* tettiin esimerkissä 6C kuvatulla tavalla.
• · 30 Kuten edellä esimerkissä 7A1) on kuvattu, käsiteltiin tuumorifragmentteja erikseen paikallisesti mAb-molekyyleil-. lä, joiden konsentraatiooli 25 ^g 25 μΐ-.ssa. HBSSrää, ja au- • · '··· kot suljettiin tämän jälkeen teipillä. mAb-molekyylejä li- • ♦ *.’ sättiin uudelleen samalla tavoin 24 tunnin ja 48 tunnin koh- • * :’·* 35 dalla. Tuumorit ja ympäröivät CAM-kudokset analysoitiin .**· 72 tunnin kohdalla edellä esimerkissä 7A1) kuvatulla taval- ··· la.
• · • · • ♦ 72
Kuten esimerkissä 6C on kuvattu, saatiin tuumorit ensiksi siirtämällä viljeltyjä M21-L-soluja, jotka eivät ilmennä integriini avj83:aa, julkaisussa Felding-Habermann, et ai., J. Clin. Invest. 89 (1992) 2018, kuvatulla tavalla 10 päivän 5 ikäisten kanan CAM-preparaatteihin. Nämä 0!v|83-negatiiviset fragmentit indusoivat voimakasta uudissuonittumista pelkän puskurin läsnäollessa tai CSAT (anti-/^) tai P3G2-(anti-α^β5)-vasta-aineiden läsnäollessa. Tästä poiketen sai LM609 mAb (anti-av/33) aikaan sen, että useimpien verisuonten tun-10 keutuminen tuumorimassaan ja ympäröivään CAM .-aan estyi täy sin.
Sen vaikutuksen kvantitoimiseksi, joka mAb-molekyyleillä on tuumorin aikaansaamaan angiogeneesiin, suoritti kaksi tark-15 kailijaa kaksoissokkokokeena stereomikroskoopilla niiden verisuonten laskennan, jotka tunkeutuivat tuumoriin ja jotka esiintyivät polttopisteen tasossa. Kuviossa 2 esitetty kukin koetulospalkki esittää verisuonten lukumäärän keskiarvoa ± keskivirhettä kussakin ryhmässä käytetyistä kahdestatoista 20 CAM-preparaatista, jotka edustavat kahta rinnakkaista koet ta .
*. Tästä kvantitatiivisesta analyysistä kävi ilmi, että LM609 ··« V mAb:11a käsiteltyihin tuumoreihin tunkeutuvien verisuonten * ϊφ·, 25 lukumäärä oli vähentynyt kolminkertaisesti verrattuna tuumo- :1·’ reihin, joita oli käsitelty puskurilla tai muilla mAb-mole- • ;1- kyyleillä P3G2:lla tai CSATrlla (P < 0,0001) määritettynä ··· .1.1 Wilcoxonin järjestyslukusummatestillä. Se tosiseikka, että M21-L-tuumorit eivät ilmennä ofvjS3:aa viittaa siihen, että 30 LM609 mAb inhiboi angiogeneesiä vaikuttamalla suoraan veri suoniin tuumori solujen sijaan. Nämä tulokset vastaavat av|S3:n , histologista jakaantumista kuvioissa 3A - 3D esitetyissä • ♦ *··· syöpäkudosnäytteissä, joissa οϋν|83:η jakaantuminen oli rajoit- ·** tunut tuumorissa esiintyviin esiintyviin verisuoniin eikä • » ;1·' 35 varsinaisiin tuumorisoluihin.
« * ·· · • · • ♦ • » « · • · 73 2) Käsittely synteettisillä peptideillä
Esimerkissä 1 valmistettuja synteettisiä peptidejä levitetään paikallisesti tuumorin aikaansaamaan angiogeeniseen CAM-määritysjärjestelmään edellä kuvatulla tavalla. Pepti-5 dien vaikutus verisuonten pysyvyyteen määritetään samalla tavoin.
E. Tuumorin aikaansaaman anoiogeneesin inhibitio suonen sisäistä käsittelyä käyttäen 10 1) Käsittely monoklonaalisillä vasta-aineilla
Tuumorin aikaansaamia verisuonia, jotka oli valmistettu esimerkissä 7D1) kuvatulla tavalla, käsiteltiin myös mAb-mole-kyyleillä, jotka johdettiin kudokseen suonen sisäistä injek-15 tiota käyttäen. Tuumorit asetettiin CAM-preparaattien pin nalle esimerkissä 7D1) kuvatulla tavalla ja aukot suljettiin teipillä 24 tunnin kuluttua, kanan alkion verisuoniin johdettiin suonensisäisesti 200 /ig puhdistettuja mAb-molekyyle-jä edellä kuvatulla tavalla. Tämän jälkeen kanan alkioiden 20 annettiin inkuboitua seitsämän päivän ajan. Angiogeneesin laajuutta tarkasteltiin tämän jälkeen edellä kuvatulla tavalla. Kuten tuonnempana olevassa esimerkissä 8 on kuvattu, irrotettiin tuumorit tämän käsittelyäjän jälkeen ja ne ana-lysoitiin niiden painon perusteella sen määrittämiseksi, 25 mikä vaikutus vasta-aine käsittelyllä oli tuumorin kasvuun tai tämän kasvun estoon.
• · · • · · • · · • · · • ; 2) Käsittely synteettisillä peptideillä • · · *·1··1 Arvioitiin myös peptidikäsittelyn vaikutukset tuumorin *.1 1 30 aikaansaamaan verisuonitukseen CAM-määritysjärjestelmässä.
Tuumori-CAM-preparaattia käytettiin edellä kuvatulla tavalla lukuun ottamatta sitä, että mAb-molekyylin suonen sisäisen injektion sijaan injektoitiin suonen sisäisesti erikseen : näkyvillä oleviin verisuoniin esimerkissä 1 ja esimerkissä «»· .1:1· 35 7A2) kuvatulla tavalla valmistettua synteettisiä peptidejä.
· • · · 74
Kuvioissa 9A - 9C on esitetty sellaisten CAM-määritysten tulokset, jotka on saatu käyttäen syklistä peptidiä, 66203, joka sisältää HCl-suolan, ja kontrollipeptidiä 62186. Kuviossa 9A on ei käsittely kontrollipeptidillä vaikuttanut 5 runsaana esiintyviin suuriin verisuoniin, jotka tuumori- käsittely oli saanut kasvamaan alunperin verisuonettomaan CAM:n alueeseen. Tästä poiketen inhiboitui verisuonten muodostuminen käsiteltäessä suodatinta syklisellä RGD-peptidil-lä, 66203, joka on av03:n antagonisti, minkä seurauksena täl-10 lä alueella ei kuviossa 9B esitetyllä tavalla esiintynyt uutta suonitusta. RGDrtä sisältävän peptidin inhiboiva vaikutus oli spesifistä ja paikallista, mistä todisteena olivat haitallisten vaikutusten puuttuminen tuumorin sijaintikohdan vieressä sijaitseviin verisuoniin. Siten kuviossa 9 ei inhi-15 bitorisia peptidejä CAM-määritysjärjestelmään suonen sisäisesti injektoitaessa havaittu vaikutusta jo aikaisemmin olemassa oleviin kypsiin CAM-preparaatissa oleviin verisuoniin alueilla, jotka sijaitsevat tuumorin sijaintipaikan vieressä mutta jonkin matkan päässä tästä. Ne inhibitoriset 20 peptidit, jotka kulkivat näissä verisuonissa, eivät vaikuttaneet tässä paikassa sijaitseviin jo ennestään esiintyviin verisuoniin vaikkakin uusien verisuonten muodostuminen näistä jo ennestään olemassa olevista verisuonista tuumori-massaan inhiboitui. Siten tässä keksinnössä on osoitettu 25 synteettisten peptidien, joita ovat 66203 ja 62984, joiden . on aikaisemmin esitetty ligandi-reseptorimäärityksissä esi- • · · ;·.·. merkissä 4 olevan av|S3:n antagonisteja, inhiboivan angio- • · geneesiä, joka rajoittuu kehittymässä oleviin verisuoniin • · · eikä jo ennestään olemassa oleviin kypsiin verisuoniin. Li- • · · *** 30 säksi peptidien suonensisäinen infuusio ei johda ympäröivään alueeseen kohdistuvaan sytotoksisuuteen, mistä todisteena ovat kuviossa 9C esiintyvä vahingoittumaton suonitus.
Samanlaisia määrityksiä suoritetaan muilla esimerkissä 1 :1:2 35 valmistetuilla ja taulukossa 1 luetelluilla synteettisillä peptideillä.
• · • · · « · 2 • · 75 8. Tuumorikudoksen kasvun inhibointi 01.183-antagonisteilla CAM-määritvksessä määritettynä
Kuten esimerkissä 7D1) on kuvattu, niin sen lisäksi, että 5 avj33:aa vastaan suunnattujen antagonistien vaikutus kasvu tekijän tai tuumorin aikaansaamaan angiogeneesiin arvioidaan visuaalisesti, määritettiin antagonistien vaikutus myös määrittämällä kaikki ne muutokset, jotka koskivat tuumorin massaa käsittelyn jälkeen. Tätä analyysiä varten valmisteltiin 10 tuumorin aikaansaaman angiogeneesin CAM-määritys esimerkeis sä 6C ja 7D kuvatulla tavalla. Syntyneet tuumorit irrotettiin 7 päivän inkubointiajan lopussa CAM-preparaateista ja niistä poistettiin kaikki jäljellä oleva CAM-kudos, ne pestiin 1 ml :11a fosfaatilla puskuroitua fysiologista suola-15 liuosta ja kunkin tuumorin märkäpaino määritettiin.
Lisäksi tuumorin esikäsittely mikroskooppista histologista analyysiä varten sisälsi sen, että edustavia esimerkkejä 20 tuumoreista kiinnitettiin Bulins Fixative -kiinnitteessä kahdeksan tunnin ajan ja näytteet valettiin parafiiniin.
Valmistettiin sarja kudosleikkeitä ja ne värjättiin hematok- syliinillä ja eosiinillä (H&E) mikroskopointianalyysiä var- : ten. Gladson, et ai., J. Clin. Invest. 88 (1991) 1924.
• · 1 25 Kudosleikkeet valokuvattiin Olympus-yhdistelmämikroskoopilla • · ’ . 250-kertaisena suurennoksella.
• · · • · • · · • · ♦ • · *· ·’ A. Paikallinen käsittely *.:·1 Taulukossa 4 on lueteltu tulokset, jotka koskevat sellaisen *·.1· : 30 tyypillisen humaanimelanoomatuumorin (M2IL) painoja, jotka olivat tuloksena paikalliskäsittelystä, jossa käytettiin kontrollipuskuria (HBSS) , P3G2:ta (anti-0!vjS5) tai LM609:ää (anti-0^3) . Kustakin käsittelystä määritettiin tuumorin pai- . no tietystä määrästä alkioita ja taulukon alaosassa on esi- # · · .·:1 35 tetty määritysten keskiarvo milligrammoina (mg) keskiarvon • · ’· · keskivirheen (SE) ohella.
• · · • · • · • · · • · · • · 76
Taulukko 4 Alkion mAb-kä- nro sittely Tuumorin paino (mg) 5 1 HBSS 108 2 152 3 216 4 270 5 109 10 6 174 1 P3G2 134 2 144 3 408 4 157 15 5 198 6 102 7 124 8 99 1 LM609 24 20 2 135 3 17 . . 4 27 • ♦ 1 • · · 5 35 « t ' • · 1 Λ·. 6 68 25 7 48 • · 8 59 • · · • · ·
Tuumorin keskimäräinen mAb-käsittely_ paino (mg)_ HBSS kontrolli 172 ± 26 30 P3G2 171 ± 36 . LM609 52 ± 13 * 1 1 • · · ··« ;1:1 Kun avj83-negatiivista humaanimelanoomatuumorimassaa käsitel- tiin CAM-määritysjärjestelmässä LM609:llä, niin käsittele- » · 35 mättömän tuumorin keskimääräinen paino pieneni 172 ± • · 1·« • ♦ * · · • · · « · · 77 26 mg:sta 52 ± 13 mg:aan. P3G2-vasta-aine ei vaikuttanut lainkaan tuumorimassaan. Kun 01^3-reseptorin toiminta oli siten arvj33-spesifisen LM609-vasta-aineen paikallisen annostelun vaikutuksesta estynyt, niin tuumorimassan koko pieneni 5 angiogeneesin estymisen myötä edellä olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla. P3G2-altistuksen jälkeen tuumorimassan mitattu läpimitta vaihteli keskimäärin noin 8 millimetristä 1 senttimetriin. Sitä vastoin LM609:llä käsiteltyjen tuumorien läpimitta oli keskimäärin 2-3 millimetriä.
10 Näistä tuumoreista tehdyillä pakastetuilla kudosleikkeillä tehdyistä tutkimuksista kävi ilmi, että P3G2:lle altistetun tuumorin solurakenne oli ehjä toisin kuin mikä oli asianlaita LM606:llä käsiteltyjen tuumorien kyseessä ollessa, 15 joista puuttui järjestäytynyt solurakenne. Näin ollen 0^183- reseptoriaktiivisuus on olennaisen tärkeää sille, että 0^183-negatiivinen tuumori pystyy säilyttämään av/S3:a ilmentävien uudissuonten ravitseman massansa. Kun avj83:n toiminta estetään tämän keksinnön mukaisilla ανβ3-antagonisteilla tuumorin 20 angiogeneesi estyy, mikä lopulta saa aikaan tuumorin massan pienenemisen.
B. Laskimonsisäinen annostelu
Taulukossa 5 on lueteltu tulokset, jotka koskevat sellaisen 25 tyypillisen karsinoomatuumorin (UCLAP-3) painoja, jotka oli- • · /.·. vat tuloksena suonensisäisestä käsittelystä, jossa käytet- • · .Γ1. tiin kontrollipuskuria (PBS, fosfaatilla puskuroitu fysiolo- • · * 1 ginen suolaliuos), CSAT:ta (anti-|81) tai LM609:ää (anti- ’··· avjS3) · Kustakin käsittelystä määritettiin tuumorin paino tie- *·’ 1 30 tystä määrästä alkioita ja taulukon alaosassa on esitetty määritysten keskiarvo milligrammoina (mg) keskiarvon keskivirheen (SE) ohella.
• 9 · • · · • · · • « · • · • · • · · * · « · • · · • · • · · • · ·· · • · • · • · 78
Taulukko 5 Alkion mAb-kä- nro_ sittely Tuumorin paino (mg) 5 1 PBS 101 2 80 3 67 4 90 1 CSAT 151 10 2 92 3 168 4 61 5 70 1 LM609 16 15 2 54 3 30 4 20 5 37 6 39 20 7 12
Tuumorin keskimäräinen mAb-käsittely paino (mg) • · 1 1 — 1 - • · 1 *· "1 PBS-kontrolli 85 + 7 ··· • · CSAT 108 + 22 • 1 1 25 LM609 30 ± 6 • « 1 • · . .1 Kun ανβ3-negatiivinen humaanikarsinoomatuumorimassa altistet- ··· .·.· tiin CAM-määritysjärjestelmässä LM609 :lie, käsittelemättömän • · tuumorin keskimääräinen paino pieneni 85 ± 7 mg:sta 30 ± 30 6 mg:aan. CSAT-vasta-aine ei vaikuttanut merkitsevästi tuumorimassan painoon. Kun avjS3-reseptorin toiminta näin ollen estettiin antamalla laskimonsisäisesti «.^-spesifistä • · 1 '··· LM609-vasta-ainetta, niin karsinooman koko pieneni ··· V melanoomatuumorin tavoin angiogeneesin estymisen myötä edel- • · .1:1 35 lä olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla. Lisäksi suonen- • · ··· ♦ ♦ ♦ • · ♦ 1 • · ♦ • · • · · · · • · 79 sisäisenä injektiona annettu LM609 esti humaanimelanooma-tuumorin kasvua.
9. Tuumorikudoksen kasvun pieneneminen ο?νβ3-antagonistien 5 vaikutuksesta CAM-määritvksellä määritettynä αν|83-antagonistien tuumorin kasvuun ja elinkykyyn kohdistuvien vaikutusten määrittämiseksi humaanimelanoomasta otettuja fragmentteja ja keuhko- ja haimakarsinoomasta ja kurkunpää-10 karsinoomasta otettuja fragmentteja johdettiin 10 päivän ikäisistä alkioista koostuviin CAM-preparaatteihin esimerkissä 5A kuvatulla tavalla.
A. Laskimonsisäinen annostelu 15 1) Käsittely monoklonaalisillä vasta-aineilla a. Käsittely LM609:llä (anti-o?../^) ia CSAT:illa (anti-fl·^
Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun CAM-prepareettei- hin oli siirretty avjS3-negatiivisesta humaanimelanoomasta 20 M21-L, haimakarsinoomasta FG, humaanikeuhkokarsinoomasta UCLAP-3 tai humaani-kurkunpääkarsinoomasta Hep3 peräisin olevia karsinoomafragmentteja, alkioihin injektoitiin laskimonsisäisesti pelkkää PBS:ää tai yksi annos
(300 μg/100 μΐ) joko LM609 mAb:tä (anti-avjS3) tai CSAT
.*:* 25 mAb:tä (anti-jS-L) . Tuumorien annettiin kasvaa vielä kuuden . .·. päivän ajan. Inkubaatiojakson lopussa tuumorit irrotettiin • · .”· varovasti ja niistä poistettiin ympärillä oleva CAM-kudos.
I Tuumorin irrottamisen suorittivat kaksi riippumatonta tutki- • · · jaa, jotka poistivat ainoastaan selvästi erottuvan kiinteän • · *·* ’ 30 tuumorimassan. Tuumorien reunat erottuivat selvästi, joten ohut puoliksi läpinäkyvä membraani (CAM), joka erottuu selvästi kiinteästä tuumorimassasta, poistettiin varsinaista tuumorimassaa vahingoittamatta. Irti leikatut tuumorit pun-: nittiin ja ne tutkittiin morfologisesti ja histologisesti.
:*:* 35 «
Tumorien märkäpainot 7 päivän kuluttua määritettiin kuviossa 13 esitetyllä tavalla ja niitä verrattiin tuumorien alku- ··· • ♦ • · • · • · • · • ··· 80 painoon ennen käsittelyjä. Kukin pylväs edustaa yhden ryhmän 5-10 tuumorista saatua keskiarvoa ± keskivirhe. Kaikissa tutkituissa tuumoreissa mAh LM609 esti tuumorin kasvua merkittävästi (p < 0,001) kontrolleihin verrattuna. PBS:llä tai 5 CSAT:illa käsitellyt tuumorit kasvoivat kaikissa tapauksissa. Tätä vastoin sen lisäksi, että mAb LM609 esti näiden tuumorien kasvun, useimmissa tapauksissa se sai aikaan huomattavaa pienenemistä. On merkittävää, että nämä tuumori-solut eivät ilmennä integriini-0^/83: a, mikä osoittaa sen, 10 että kasvun estyminen johtui tämän vasta-aineen anti-angio- geenisesta vaikutuksesta uudissuonitukseen eikä suoraan tuumorisoluihin kohdistuvasta vaikutuksesta.
b. Käsittely LM609:llä (anti-a.jgn) ia P3G2:lla (anti-g.j85) 15 Humaanimelanoomatuumorin M21-L fragmentteja (50 mg) siirret tiin 10 päivän ikäisten alkioiden CAM-preparaatteihin esimerkissä 5A kuvatulla tavalla. Kahdenkymmenenneljän tunnin kuluttua alkioihin injektoitiin laskimonsisäisesti pelkkää PBS: ää tai yksi annos (300 jug/100 μΐ) joko mAB LM609:ää 20 (anti-a,^) tai P3G2:ta (anti-Q!v|S5) . Tuumorien annettiin kas vaa edellä kuvatussa esimerkissä 9Al)a kuvatulla tavalla ja ne tutkittiin morfologisesti ja histologisesti tässä keksinnössä kuvatulla tavalla.
• • · • «· *... 25 Monoklonaalisillä vasta-aineilla P3G2 (anti-a„j8c:) tai LM609
t · VJ
*·*, (anti-a-y.^) käsitellyistä M21-L-tuumoreista valitut edustavat • · · '··· esimerkit tutkittiin morf ologisesti. P3G2:lla käsitellyt ***** : tuumorit olivat suuria (läpimitaltaan 8 mm) ja hyvin suoni- *·.·.* tettuja kun taas mAb LM609:llä käsitellyt tuumorit olivat • · : : · 30 huomattavasti pienempiä (läpimitaltaan 3 mm) eikä niissä ollut havaittavia verisuonia.
Tuumoreita tutkittiin edelleen valmistamalla niistä histolo-gisia leikkeitä ja värjäämällä ne hematoksyliinillä ja • · 35 eosiinilla esimerkissä 9Al)a kuvatulla tavalla. Kuten ku- • · * * . viosta 14 käy ilmi (ylempi osakuvio), oli mAb P3G2:lla *·· V (anti-Q!vj85) käsitellyissä tuumoreissa mitoosikuvioiden • · · • · · • · • · • · • · • · ·♦·· • * 81 (nuolenpäät) perusteella lukuisia elinkykyisiä ja aktiivisesti jakautuvia tuumorisoluja sekä useita verisuonia (nuolet) kaikkialla tuumorin stroomassa. Tätä vastoin LM609:llä (anti-avjS3) käsitellyissä tuumoreissa havaittiin vain muuta-5 mia tai ei lainkaan elinkykyisiä tuumorisoluja tai veri suonia (kuvio 14, alempi paneeli). Nämä tulokset osoittavat, että integriini-avjS3 :n antagonistit estävät tuumorin aikaan saamaa angiogeneesiä, mikä saa aikaan monissa erilaisissa humaanituumoreissa kasvun pysähtymisen ja koon pienenemisen 10 in vivo -olosuhteissa. On tärkeää huomata, että alkiot, jot ka tutkittiin seitsemän päivän tuumorikasvun jälkeen (alkion 17. kasvupäivä), vaikuttivat normaaleilta karkeasti tarkasteltuna siitä huolimatta oliko ne käsitelty ανβ3-antagonistilla tai ei. Nämä havainnot osoittavat, että tämän integ-15 riinin antagonistit vaikuttavat olevan ei-toksisia kehittyville alkioille.
2) Käsittely synteettisillä peptideillä
Humaanimelanoomatuumorin M21-L fragmentteja (50 mg) siirret-20 tiin 10 päivän ikäisistä alkioista koostuviin CAM:eihin esi merkissä 5A kuvatulla tavalla. Kahdenkymmenenneljän tunnin kuluttua alkioille annettiin yksi laskimonsisäinen injektio, joka sisälsi 300 μg/l00 μΐ joko syklo-RADfV:tä (69601) ja/tai syklo-RGDfV:tä (66203). Yhteensä 72 tunnin kuluttua .”· 25 tuumorit poistettiin, niiden morfologia tutkittiin ja ne • · /,·, valokuvattiin steromikroskoopilla esimerkissä 9A1) kuvatulla tavalla.
• « • i • · ·
Kuvioissa 15A - 15E esitetyt paneelit vastaavat seuraavia • · *.* 30 tapauksia: Kuvio 15A, kahtena kappaleena tehdyt näytteet, jotka on käsitelty syklo-RADfV-peptidillä (69601); Kuvio 15C, viereinen CAM-kudos, joka on otettu samoista alkioista, jotka on käsitelty syklo-RGDfV-peptidillä (66203), ja kuvat ; 15D ja 15E, suuri suurennos (13 x) peptidillä käsitellyistä ··· .*·' 35 tuumoreista. Kuviossa 15D on esitetty normaalit verisuonet kontrollipeptidillä (69601) käsitellystä tuumorista. Kuvios- • ♦ • · • « · ♦ « • · • · • · • ♦ • · ··**, 82 sa 15E on kuvattu esimerkkejä syklo-RGDfV-peptidillä (66203) käsiteltyjen tuumorien (nuolet) hajonneista verisuonista.
Nämä tulokset merkitsevät sitä, että ainoastaan peptidi 5 66203 estää verisuonten muodostumista ja lisäksi sitä, että peptidillä ei ollut vaikutusta tuumorin vieressä olleisiin alkion CAM-kudoksen sisältämiin verisuoniin.
10. Tuumorikudoksen kasvun regressio et!?-;-antagonisteilla 10 määritettynä kaniinin silmämalliin perustuvassa määritykses sä in vivo -olosuhteissa οίν/83 :a vastaan suunnattujen antagonistien vaikutusta kasvutekijöiden aikaansaamaan angiogeneesiin voidaan tarkastella 15 luontaisesti läpinäkyvissä rakenteissa, joista esimerkkinä on silmän sarveiskalvo. Uudet verisuonet kasvavat verta runsaasti saavalta sarveiskalvon reunalta sarveiskalvon keskustaa kohti, johon ei tavallisesti tule verta. Angiogeneesin stimulaattorit, kuten 0FGF, saavat sarveiskalvoon lisättyinä 20 aikaan sen, että uusia verisuonia lähtee kasvamaan sarveis kalvon reunalta käsin. Sarveiskalvon käsittely angiogeneesin antagonisteilla inhiboi sarveiskalvon reunalta käsin tapahtuvaa uusien verisuonten kasvua. Siten sarveiskalvossa ta-pahtuu angiogeneesiä sen vaikutuksesta, että endoteelisoluja • > .·:* 25 tunkeutuu sarveiskalvon reunalta kollageenin tiiviisti täyt- . .· tämään sarveiskalvokudokseen, jota voidaan vaikeuksitta tar- • · kastella. Tästä syystä kaniinin silmämalliin perustuva mää- * * ritys tarjoaa käyttöön mallin, joka on käytettävissä in vivo • » *;·· -olosuhteissa sen angiogeneesin stimulaation huolellista • · '·* 30 tarkastelua varten, joka tapahtuu sen jälkeen kun yhdisteitä on lisätty suoraan silmän sarveiskalvoon.
• · • · • ·· • · · • · • · 4 • · *·· t * • ·
«•I
• · · • · • · • · « · • ·
Ml* 83 A. Kaniinin silmämalliin perustuva määritys in vivo -olosuhteissa 1) Kasvutekijöiden indusoima angiogeneesi 5 Angiogeneesi indusoitiin kaniinin silmämalliin perustuvassa määrityksessä in vivo -olosuhteissa jSFGF-kasvutekijällä, mitä kuvataan seuraavaksi.
a. Kasvutekijää ~ia monoklonaalisia vasta-aineita sisältävien 10 hydronrakeiden valmistus
Valmistettiin kasvutekijää ja mAb-molekyylejä sisältäviä hydronpolymeerirakeita julkaisussa D'Amato, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 91 (1994) 4082 - 4085, kuvatulla tavalla. 15 Yksittäiset rakeet sisälsivät 650 ng jSFGF-kasvutekijää, joka oli sidottu sukralfaattiin (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation) 0FGF:n stabiloimiseksi ja sen varmistamiseksi, että tätä vapautuu hitaasti ympäröivään kudokseen. PBS:ään valmistettiin lisäksi hydronrakeita, jotka sisälsivät joko 20 40 ^g LM609 mAb:tä (anti-avjS3) tai P1F6 mAb:tä (anti-Qfvj85) .
Rakeet valettiin tietyllä nimenomaisella tavalla valmistettuihin teflonalustoihin, jotka sisälsivät keskellä olevan 2,5 mm:n suuruisen syvennyksen, joka oli porattu suoraan niiden pintaan. Noin 12 μΐ valumateriaalia pipetoitiin ku- • · ,·:* 25 hunkin alustaan ja polymeroitumisen annettiin tapahtua yön • · ... yli steriilissä vetokaapissa. Tämän jälkeen rakeet steriloi- c i „Υ\ tiin säteilyttämällä niitä ultraviolettivalossa.
• » • · ’·*· b. Käsittely monoklonaalisilla vasta-aineilla • · V 30 Kuhunkin kokeeseen kuului kolme kaniinia, joille yhteen sil mään pantiin (SFGF:ää ja LM609:ää sisältävä rae ja toiseen silmään pantiin 0FGF:ää ja hiiren P1F6 mAb:tä (anti-avjS5) sisältävä rae. Kahden silmän käyttöön perustuvan tutkimuksen ; s* käyttö LM609 mAb:n (anti-θ' /3·,) vertaamiseksi muihin mAb- ja .*·* 35 PBS-kontrolleihin tarjoaa käyttöön eksaktin tutkimuskeinon 4 merkittävien erojen osoittamiseksi tutkittavien mAb-molekyy- t * lien välillä.
* ·· ** · • « • « • · 9 · * · • ··· 84
PlF6-mAb reagoi immunologisesti av|85-integriinin kanssa, joka esiintyy verisuonten endoteelisolujen pinnalla mutta joka otaksuttavasti ei liity angiogeneesiin. Sen määrittämiseksi, osallistuuko mAb P1F6 angiogeneesiin, valmistettiin 5 pelkästään tätä mAb-molekyyliä sisältäviä rakeita ja näistä suoritettiin määritykset edempänä kuvattavalla tavalla sen varmistamiseksi, että tämä mAb ei indusoinut angiogeneesiä.
Kaikki tutkittavat mAb-molekyylit puhdistettiin askites-10 nesteestä käyttäen proteiini-A Sepharose-CL-4B -affini-teettikolonnikromatografiaa tunnettujen menetelmien mukaisesti. Eluoitunut immunoglobuliini dialysoitiin sitten PBS:ää vastaan ja käsiteltiin Detoxi-Gel’illä (Pierce Chemicals) endotoksiinin poistamiseksi. Endotoksiinin on 15 osoitettu olevan voimakas angiogeneesiä ja tulehdusta stimuloiva aine. Tästä syystä mAb-molekyyleistä tutkittiin endotoksiini Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay -määritystestipakkauksella (Bio-Whittaker) ja ainoastaan niitä mAb-molekyylejä, joissa ei ollut havaittavissa olevaa 20 endotoksiinia, käytettiin kaniinin silmämalliin perustuvassa määrityksessä.
• « • · j8FGF:ää ja LM609 mAb:tä (anti-0^3) tai PlF6:tta (anti-a.^) . .·. sisältävä hydronrae sijoitettiin kaniinien silmään muodos- 25 tettuun sarveiskalvotaskuun. Hydronrae sisälsi myös sukral- ‘ I faattia, jSFGF:n stabiloimiseksi määrityksen aikana. Yksit- täiset rakeet siirrettiin kirurgisella toimenpiteellä val-*·’ ’ mistettuihin "taskuihin", jotka oli tehty kaniinien sarveis kalvon keskiosan keskikohtaan. Kirurginen toimenpide suori-30 tettiin steriilitekniikkaa käyttäen käyttämällä Wild’in mal lin M691 -leikkausmikroskooppia, joka oli varustettu valon-: : säteen jakajalla, johon oli kiinnitetty kamera yksittäisten sarveiskalvojen tallentamiseksi valokuvaamalla. Sarveis-kalvon keskustaan muodostettiin 3 mm x 5 mm suuruinen "tas- • · 35 ku" tekemällä syvyyssuunnassa sarveiskalvon puoliväliin *·;·* ulottuva 3 mm:n viilto 69-numeroisella Beaver-veitsellä.
Keskusta leikattiin ääriosia kohti käyttäen värikalvo- • · 85 spaattelia ja rae asetettiin paikoilleen siten, että sen äärireuna oli 2 mm:n etäisyydellä sarveiskalvon ulkoreunasta.
5 jSFGF ja mAb diffusoituivat seuraavien 14 päivän aikana siir retystä rakeesta ympäröivään kudokseen ja saivat tämän vaikutuksesta aikaan vaikutuksia sarveiskalvon reunalta käsin leviävään angiogeneesiin.
10 Edustavia tuloksia kustakin käsittelystä on esitetty kuvi oissa 16A - 16E. Esiintyvien verisuonten määrä kvantitoidaan ja kuvataan käyttäen kellotunteja, jotka on määritelty seuraavasti. Silmä jaetaan 12.-een yhtä suureen osaan samaan tapaan kuin kellotaulu on jaettu tunteihin. "Yhden kello-15 tunnin määrä verisuonia" tarkoittaa sitä verisuonimäärää, joka täyttää yhtä kellon tuntia vastaavan osan silmää. Viidellä kaniinilla, joille annettiin ainoastaan jSFGF: ää, esiintyi kukintoa muistuttava angiogeneesi, jossa uusia verisuonia oli kasvanut sarveiskalvon reunalta sarveiskalvon 20 keskustaa kohti, jossa tavallisesti ei esiinny verisuonia.
Yhdellä näistä kaniineista oli ainoastaan yksi kellotunti raetta kohti suuntautuvia verisuonia. Kahdella kaniineista, « · joille annettiin sekä /3FGF:ää että LM609 mAb:tä, ei ollut . .·, absoluuttisesti lainkaan havaittavissa olevaa angiogeneesiä • · · 25 14 päivään asti leikkaustoimenpiteestä. Yhdellä näistä kol- * ; mesta kaniinista oli 14 päivään mennessä kehittynyt kolme • · · **j·* pesäkettä, jotka sisälsivät verta vuotavia ja muodostumassa '·'‘ olevia verisuonia. Kahdella niistä kaniineista, joille an nettiin jöFGFrää ja P3G2 mAb:tä (anti-avjS5) esiintyi laaja-30 mittaista suonittumista, jossa uudet verisuonet olivat kasvaneet sarveiskalvon reunasta sarveiskalvoon. Yhdellä näistä : kaniineista oli ainoastaan 1-2 tunnin verran raetta kohti suuntautuvia verisuonia.
35 Kuten kaniinin silmämalliin perustuvassa määrityksessä saatu • · · *··.* todistusaineisto osoittaa, ei mitään angiogeenistä vaikutus- • · ta havaittu normaaleihin sarveiskalvoa kehystäviin ve- • · 86 risuoniin /3FGF-kasvutekijän läsnäollessa kaniineissa, joille annettiin LM609 mAbrtä (anti-avjS3) . Tästä poiketen havaittiin angiogeneesiä sarveiskalvon reunan verisuonissa jSFGF-kasvu-tekijän läsnäollessa kaniineissa, joille annettiin P3G2-5 mAb:tä (anti-ofv|S5) . LM609 mAbm aikaansaama sarveiskalvon angiogeneesin täydellinen inhiboituminen on huomattavasti voimakkaampaa kuin millään aikaisemin raportoidulla angiogeneesiä vastaan suunnatulla reagenssilla.
10 11. Tuumorikudoksen kasvun regressio 0(..163-antagonisteilla in vivo -olosuhteissa hiiri-ihmiskimeeramäärityksellä määrityttynä
Valmistettiin in vivo -olosuhteissa käytettävä hiiririhmis- 15 kimeeraan perustuva malli korvaamalla osa SCID-hiiren ihoa neonataalisella humaaniesinahana (kuvio 17). Kun ihosiirre oli kiinnittynyt ja toimintakunnossa, niin humaaniesinahkaan ympättiin karsinoomasoluja. Määritettävissä olevan tuumorin ilmaannuttua injektoitiin hiiren häntälaskimoon joko LM609 20 mAbrtä (Οίν|δ3) tai PBSrää. Tuumori irrotettiin 2-3 viikon kuluttua ja se analysoitiin määrittämällä sen paino ja suo- :*·.· rittamalla siitä histologinen tutkimus.
• · • · · • · · . A. In vivo -olosuhteissa suoritettava hiiri:ihmiskimeeraan 25 perustuva määritys • * • · · *“·* Hiiri:ihmiskimeeraan perustuva malli, jota käytetään in vivo • · ’·* * -olosuhteissa, valmistetaan käyttöön olennaisesti julkaisus sa Yan, et ai., J. Clin. Invest., 91 (1993) 986 - 996 kuva-30 tulla tavalla. Lyhyesti mainittuna SCID-hiireltä (näiden ikä on 6 - 8 viikkoa) poistetaan kirurgisella toimenpiteellä : neliömäinen 2 cm2:n suuruinen nahka-alue ja sen tilalle ase- • · · tetaan humaani esinahkaa. Hiiri nukutettiin ja se ajeltiin .*/ paljaaksi vatsapuolella molemmilla kyljillä sijaitsevilta *·^ 35 5 cm2:n suuruisilta alueilta. Valmistettiin kaksi pyöreää pinta-alaltaan 2 cm2:n suuruista siirteen pohjaa poistamalla nahka koko paksuudelta faskiaan asti. Samansuuruiset ja ihon « · 87 täyttä paksuutta edustavat ihmisen ihosiirteet, jotka olivat peräisin ihmisen neonataalisesta esinahasta, asetettiin haavapohjiin ja ommeltiin paikoilleen. Siirre peitettiin Band Aid’ilia, joka ommeltiin ihoon. Haavan peittämiseksi 5 käytettiin myös Micropore-kangaslaastaria.
Kiinteiden humaanituumorien muodostamiseksi SCID-hiirissä olevien humaani-ihosiirteiden pinnalle käytettiin humaani-melanooma M21L-solulinjaa tai MDA 32.1 rintarauhas-10 karsinoomasolulinjaa (ATCC HBT 26; a^-negatiiivinen määri tettynä kudosleikkeiden immunologisen reagoinnin perusteella ML609 mAb:n kanssa). Yksisolususpensio, joka sisälsi 5 x 106 M21L tai MDA23.1 -solua injektoitiin intradermaalisesti humaani-hiiri- siirteeseen . Hiiriä tarkkailtiin tämän jälkeen 15 2-4 viikkoa, minkä tarkoituksena oli antaa humaani- tuumoreille tilaisuus kasvaa määritettävissä olevaan kokoon.
B. Suonensisäinen käsittely 1) Käsittely monoklonaalisilla vasta-aineilla 20
Sen jälkeen kun tuumorit olivat kasvaneet määritettävissä :\· olevaan kokoon, niin SCID-hiiriin, joihin oli injektoitu • · M2 IL-tuumori soluja, injektoitiin häntälaskimoon suonen- . ,·, sisäisesti 250 jug joko LM609 mAb:tä {οίΎβ3) tai PBSrää kaksi • · · 25 kertaa viikossa 2-3 viikon ajan. Tämän ajan umpeuduttua tuumorit irrotettiin ihosta ja niistä poistettiin ympäröivä kudos. Useista hiiristä tutkittiin kunkin käsittelyn vaiku-"·’ ’ tukset ja kustakin käsittelystä peräisin olevien tuumorien painon keskiarvo laskettiin ja tämä esitettiin taulukon 6 30 alaosassa.
• · · • · · • · · • · · • · • · • · 1 • · • · • 1 1 • · · • · • · » * · · « · » · · · 88
Taulukko 6 M2IL-tuumori Käsittely Tuumorin paino (mg) I PBS 158 5 2 192 3 216 4 227 5 LM609 195 6 42 10 7 82 8 48 9 37 10 100 II 172 15 Käsittely Tuumorin keskimääräinen paino (mg) PBS 198 LM609 113 20 Kun hiiri:ihmiskimeeraan perustuvan määritysjärjestelmän ανβ3-negatiivinen M21L-karsinoomatuumorimassa käsiteltiin LM609:11a (anti-aiv/?3) , niin tämä sai aikaan sen, että PBS- käsittelystä peräisin olevan tuumorin painon keskiarvo aleni . .·. 198 g:sta 113 g:aan.
• · « • · · ··.·. 25
Edustavia esimerkkejä LM609 mAb:lla (anti-avjS3) ja PBS:lla käsitellyistä M2IL-tuumoreista tutkittiin morfologisesti.
• · '·* ’ PBS :11a käsitellyt tuumorit olivat suuria (läpimitta 8 - 10 mm) ja hyvin suonittuneita, kun taas LM609 mAb:lla (anti- 30 a;v|83) käsitellyt tuumorit olivat paljon pienempiä (läpimitta 3-4 mm) ja niistä puuttui havaittavissa olevat verisuonet.
• » · ;*·' Tuumorit, jotka olivat muodostuneet ihosiirteisiin, joihin 011 injektoitu MDA 23.1 -soluja, olivat havaittavissa ja • · 35 määritettävissä. Vakiintuneiden tuumorien morfologinen tar-*···’ kastelu paljasti sen, että uudissuonittuminen siirretystä :Y: humaanikudoksesta MDA 23.1 -tuumorisoluihin oli tapahtunut.
»••«I
89
Siten orv/33 - reseptorin toiminnan estäminen antamalla suonensisäisesti οί^β3~spesifistä LM609 vasta-ainetta johti kar-sinooman regressioon tässä mallijärjestelmässä samaan tapaan kuin CAM-järjestelmässä ja kaniinin silmämalliin perustuvas-5 sa järjestelmässä esimerkeissä 9 ja 10, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna, kuvatulla tavalla.
12. Solusykliin siirtymiseen ia apoptoosiin johtava veri suoni solui en stimulaatio integriini α„β3:η antagonistien 10 läsnäollessa CAM-määrityksessä määritettynä
Angiogeneesi-ilmiö on selvästi riippuvainen sytokiinien, kuten jSFGF:n ja VEGF:n kapasiteetista stimuloida verisuonten solujen lisääntymistä. Mignatti, et ai., J. Cell. Biochem. 15 471 (1991) 201; Takeshita, et ai., J. Clin. Invest. 93 (1994) 662; ja Koyama, et ai., J. Cell. Physiol. 158 (1994) 1. On kuitenkin myös ilmeistä, että signaalien lähetys- ja vastaanottoilmiöt voivat säädellä näiden verisuonisolujen erilaistumista kypsyneiksi verisuoniksi. On siten ajatelta-20 vissa, että sellaisten verisuonisolujen, joissa on tapahtumassa uutta kasvia tai angiogeneesiä joko kasvuun tai erilaistumiseen liittyvien signaalien estäminen voi johtaa angiogeneesin häiriintymiseen.
• · · • i · . 25 Integriinin ligaatiotapahtumien on osoitettu osallistuvan • · · ;·.· sekä solujen lisääntymiseen että apoptoosiin eli solujen ’ .* ohjelmoituun kuolemaan in vitro -olosuhteissa. Schwartz, I*! Cancer Res. 51 (1993) 1503; Meredith, et ai., Mol. Biol.
'· Cell. 4 (1993) 953; Frisch, et ai., J. Cell Biol. 124 (1994) 30 619; ja Ruoslahti, et al., Cell 77 (1994) 477. Kun avj83-anta- gonistien vaikutuksia angiogeneesiin tarkastellaan huolellisesti, niin tästä käy selville, että tuumoreihin assosioi-tuneiden verisuonten joukossa esiintyy epäjatkuvia ja hajon- :*:* neita verisuonia. Tästä syystä on mahdollista, että se, että 35 verisuonet ovat menettäneet yhtäjaksoisuutensa, voi johtua verisuonten solujen joutumisesta valikoivasti kuolioon eli **·*. apoptoosista.
• · · • · « • · · · 90 Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi tutkittiin CAM-preparaat-teja sen jälkeen kun niihin oli indusoitu angiogeneesi /3FGF-kasvutekijällä ja niitä oli käsitelty tämän keksinnön mukaisella mAb:lla ja syklisillä peptideillä.
5 A: Käsittely monoklonaalisilla vasta-aineilla Apoptoosi voidaan havaita useilla erilaisilla menetelmillä, joita ovat kudoksesta eristetyn DNA:n suora tarkastelu DNA:n fragmentoitumisen havaitsemiseksi ja 3'0H:n havaitseminen 10 kudoksesta kudosta vahingoittamattomin keinoin vasta-aineella, jolla fragmentoituneen DNA:n vapaat 3'OH-ryhmät havaitaan spesifisesti.
1) DNA:n fragmentoitumisen analysointi 15 Angiogeneesi indusoitiin asettamalla 0FGF:n suhteen kylläiseksi tehdyt suodatinpaperikiekot 10 päivän ikäisten alkioiden CAM-preparaattien pinnalle esimerkissä 6A kuvatulla tavalla. Kun CAM-preparaatit analysoitiin immunohistologisesti käyttäen LM609 mAb:a (anti-avj83) , niin tästä kävi ilmi, että 20 αν|33:η ilmentymisen huippu verisuonissa oli 12 - 24 tuntia |SFGF:llä tapahtuneen angiogeneesin käynnistymisen jälkeen. :*·.· Alkioihin injektoitiin 24 tuntia jSFGF-stimulaatiosta suonen- sisäisesti 100 μΐ pelkkää PBS:ää tai PBS:ää, joka sisälsi . .·. 300 μg joko CSAT mAb:tä (anti-jSx) tai LM609 mAb:tä (anti- 25 av03) .
• · • · · DNA:n fragmentoituminen havaittiin irrottamalla suoraan • · jSFGF:n suhteen kylläisen suodatinpaperin alla oleva CAM kudos 24 tai 48 tuntia siitä, kun preparaatteihin oli ruisku-30 tettu suonensisäisesti LM609-mAb:tä (anti-oivj33) , CSAT-mAb:tä (anti-|81) tai PBS:ää. Irrotetut CAM-kudokset pestiin kolme : ;* kertaa steriilillä PBS:llä ja ne jauhettiin hienoksi, sus- • · · ;*j’ pendoitiin uudelleen 0,25-%:iseen bakteeriperäiseen kolla- genaasiin (Worthington Biochemical; Freehold, NJ) ja niitä • · 35 inkuboitiin 90 minuuttia 37 °C:ssa sekoittaen seoksia aika ··· *···’ ajoin pyörresekoittajalla. DNA uutettiin yksisoluisesta sus- pensiosta peräisin olevista yhtä suurista CAM-solumääristä • · • · · · 91 aikaisemmin kuvatulla tavalla. Bissonette, et ai., Nature 359 (1992) 552. Lyhyesti mainittuna lukumäärältään yhtä suuret määrät CAM-soluja hajotettiin seoksessa, joka sisälsi 10 mM tris-Cl:ää, pH 8,0 ja 10 mM EDTA:a 0,5-%:isessa (v/v) 5 Triton X-100:ssa (Sigma, St. Louis, MO). Solulysaatit sent- rifugoitiin 16 000 x g:n voimalla 15 minuutin ajan 4 °C:Ssa liukoisen fragmentoituneen DNA:n erottamiseksi kokonaista kromatiinia sisältävästä napista. Fragmentoitunut DNA pestiin, saostettiin ja se analysoitiin l,2-%:isessa (w/v) 10 agaroosigeelissä.
Lukumäärältään samansuuruisista määristä CAM-soluja, jotka olivat peräisin kustakin käsittelystä, eristettiin liukoinen fragmentoitunut DNA, tämä erotettiin komponentteihinsa 15 elektroforeettisesti agaroosigeelissä ja visualisoitiin värjäämällä etidiumbromidilla. Kolmesta eri käsittelystä tulok sena olevan DNA:n fragmentoitumisen suhteellisessa laajuudessa ei 24 tunnin käsittelyn jälkeen havaittu eroja. 48 tuntia mAb LM609: llä mAb (anti-a^) suoritetun käsittelyn 20 jälkeen havaittiin kuitenkin merkittävää DNA:n frgamentoitu- misen lisääntymistä verrattuna alkioihin, jotka oli käsitel- :\j ty joko CSAT mAb:llä (anti-/?-,^ tai pelkällä PBS:llä.
• * · • » · . .· 2. Solusykliin siirtymiseen johtava verisuonisoluien stimu- • · 25 laatio ♦ · * · · *···' Jotta α^β^ιη osuutta näissä ilmiöissä olisi kyetty tutkimaan • · *·* ‘ kokeellisesti, värjättiin soluja, jotka olivat peräisin |8FGF:llä käsitellyistä tai tällä käsittelemättömistä CAM-30 preparaateista, propidiumjodidilla ja nämä saatettiin rea goimaan immunologisesti LM609 mAb:n (anti-avjS3) kanssa.
♦ · · • · • · · ;*·* CAM-preparaatit, jotka oli eristetty alkioista 24 ja 48 tun- tia sellaisen käsittelyn jälkeen, jossa oli käytetty LM609 » · 35 mAb:ta (anti-0^(83) , CSAT:ta (anti-jS^ tai PBS:ää, hajotettiin • *···# yksisoluisiksi suspensioiksi inkuboimalla niitä bakteeri- peräisen kollagenaasin kanssa edellä kuvatulla tavalla.
• · « · · · 92
Yksittäiset solut tehtiin läpäiseviksi ja värjättiin Apop Tag Insitu Detection Kit reagenssipakkauksella valmistajan (Oncor, Gaithersburg, MD) ohjeiden mukaisesti. Apop Tag on vasta-aine, jolla fragmentoituneen DNA:n vapaat 3'OH-ryhmät 5 havaitaan spesifisesti. Tällaisten vapaiden 3'OH-ryhmien havaitseminen on hyväksytty menetelmä apoptoottisten solujen havaitsemiseksi. Gavrieli, et ai., J. Cell Biol. 119 (1992) 493 .
10 Apop Tag’lla värjätyt solut huuhdeltiin sitten PBS:ään valmistetussa 0,l-%:isessa (v/v) Triton X-lOO.-ssa ja suspendoi-tiin uudelleen FACS-puskuriin, joka sisälsi 0,5 % (w/v) BSA:ta, 0,02 % (w/v) natriumatsidia ja 200 Mg/ml RNaasi A:ta PBS:ssä. Soluja inkuboitiin 1,5 tuntia, ne pestiin ja ana-15 lysoitiin fluoresenssilla aktivoituvalla solulajittelulla.
Solujen fluoresenssi määritettiin käyttäen FACScan virtaus-sytometriaa ja koetulokset analysoitiin tuonnempana kuvattavalla tavalla.
20 Solujen fluoresenssi määritettiin FACScan virtaussytometril- lä (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Sivulle suuntautu- va sironta (SSC) ja eteenpäin suuntautuva sironta (FCS) mää- .*:· ritettiin samanaikaisesti ja kaikki koetulokset koottiin • · .*.· käyttäen Hewlett Packard (HP9000) -tietokonetta, joka oli • » .1". 25 varustettu FACScan -tutkimusohjelmistolla (Becton Dickinson, * * Mountain View, CA). Koetulokset analysoitiin P. C Lysis ver- sion I ohjelmistolla (Becton Dickinson, Mountain View, CA) .
*·* ‘ Negatiivisina kontrolleina käytettäviin kanaviin tehtiin asetukset käyttäen solususpensioita, joihin ei oltu lisätty 30 Apop Tag -reagenssipakkauksesta peräisin olevia primaarisia vasta-aineita. Molempiin solupopulaatioihin käytettiin : identtisiä kanava-asetuksia, ja näiden tuloksena saatiin » · · analysoitua noin 8000 solua kutakin erilaista solujen käsit-telyä kohti.
• · ··* 35 • · ·
Kuviossa 18 on esitetty mAb-molekyyleillä käsitellyistä ja :Y Apop Tag’lla värjätyistä CAM-preparaateista peräsin olevien • · • · « · 93 yksittäisten solujen prosenttimäärät FACscan-analyysilla määritettynä. Musta palkki edustaa soluja, jotka ovat peräisin 24 tuntia ennen analyysiä käsitellyistä alkioista. Pilkutettu palkki edustaa soluja, jotka ovat peräisin 48 tuntia 5 ennen analyysiä käsitellyistä alkioista. Kukin palkki edus taa kolmen rinnakkaismäärityksen keskiarvoa ± S.E.
Kuten kuviossa 18 on esitetty, esiintyi kaksi päivää aikaisemmin LM609 mAb:llä (anti-oivj83) käsitellyissä CAM-preparaa-10 teissä 3 - 4-kertainen värjäytyminen Apop Tag’11a joko pel källä PBS : llä tai CSAT:11a (anti-/?!) käsiteltyihin CAM-prepa-raatteihin verrattuna.
B. Käsittely synteettisillä peptideillä 15 CAM-määrityksiä, joissa angiogeneesi oli indusoitu kasvu tekijällä esimerkissä 6A kuvatulla tavalla, suoritettiin myös käyttäen tämän keksinnön mukaisia synteettisiä peptidejä sen vaikutuksen määrittämiseksi, mikä syklisillä peptideillä on apoptoosiin. Peptidit syklo-RGDfV (66302) ja syk-20 lo-RADfV (69601) valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla ta valla. Peptidiliuoksia tai PBS:ää injektoitiin CAM-prepa-raattiin konsentraatiossa 300 ^g/ml. Suodatinpaperi ja ympä-röivä CAM-kudos irrotettiin 24 ja 48 tunnin kohdalla ja nämä . värjättiin Apop Tag’lla apoptoosin havaitsemiseksi edellä * « 25 esimerkissä 12A2) kuvatulla tavalla.
• · ♦ · ·
Kuten kuviossa 18 on esitetty, esiintyi peptidillä 69203 • · (syklo-RGDfV) kaksi päivää aikaisemmin käsitellyissä CAM-preparaateissa 3 - 4-kertainen Apop Tag -värjäytymisen li-30 sääntyminen verrattuna CAM-preparaatteihin, joita oli käsi telty joko pelkällä PBS:llä tai kontrollina käytetyllä syk- :;1 lisellä peptidillä 69601 (syklo-RADfV).
* · · ·«· • · « · • 1 · * · « « • « · * · • · « · * f • · · « · 94 C. Monoklonaalisilla vasta-aineilla suoritetun käsittelyn vaikutus apootoosiin ia solusykliin
Yksisoluisista solususpensioista tutkittiin myös kromosomaa-5 lisen DNA:n yksikkömäärä solua kohti värjäämällä solut propidiumjodidilla sen vaikutuksen määrittämiseksi, mikä monokonaalisilla vasta-aineilla suoritetulla käsittelyllä on solusykliin ja Apop Tag’ -värjäyksellä määritettävään apoptoosiin .
10 LM609 mAb:llä (anti-^183) tai CSATrllä (anti-jS-,^ tai BSA:lla 24 tai 48 tuntia aikaisemmin käsiteltyjen CAM-preparaattien yksisoluisia solususpensioita valmistettiin esimerkissä 12A1) kuvatulla tavalla.
15
Solujen värjäämiseksi Apop Tag’:11a solususpensiot pestiin kolme kertaa puskurilla, joka sisälsi 2,5 % (w/v) BSA:ta ja 0,25 % (w/v) natriumatsidia PBS:ssa. Solut kiinnitettiin sitten PBS:ään valmistetussa l-%:isessa (w/v) paraformalde- 20 hydissä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen suoritettiin kolme pesua edellä kuvatulla tavalla. Epäspesifisen sitoutumisen ehkäisemiseksi yksisoluiset solususpensiot tehtiin reagoi- .·;· mattomiksi 5-%:isella (w/v) BSA:lla PBS:ssa yön yli * « 4 °C:ssa. Tämän jälkeen solut pestiin edellä kuvatulla ta- t · .*** 25 valla, värjättiin Apop Tag’11a ja solujen fluoresenssi mää- • ·
* ; ritettiin FACScan-laitetta käyttäen edellä esimerkissä 12A
• · · '··· kuvatulla tavalla.
• · • · • · •
Kustakin kokeellisesta olosuhteesta peräisin olevat solut 30 värjättiin propidiumjodidilla (Sigma, St. Louis MO), jonka konsentraatio oli 10 μg/ml, PBS:ssa 1 tunnin ajan, pestiin 2 . .* kertaa PBS:lla ja niistä analysoitiin apoptoosille tyypilli- • · · .·;· set tuman ominaisuudet, mukaan lukien kromatiinin kondensoi- • · tuminen ja segmentoituminen. Apoptoottisten solujen prosent- • · *·* 35 timäärä arvioitiin suorittamalla soluille morfologinen ana- • · · ·...· lyysi vähintään 10 - 15 sattumanvaraisesti valitusta mikro- • · .*.* skoopin näkökentästä.
• · «··· 95
Kuviossa 19 on esitetty yhdistetyt koetulokset, jotka koskevat sellaisista alkioista peräisin olevien CAM-preparaattien yksisoluisia solususpensioita, joita oli käsitelty joko CSAT-mAb.-lla (anti-/^) tai LM609-mAb:lla (anti-0^3) , värjät-5 ty Apop Tag’lla ja propidiumjodidilla ja analysoitu FACS’11a. Y-akseli edustaa värjäytymistä Apop Tag’lla (apop-toosia) , X-akseli edustaa värjäytymistä propidiumjodidilla (DNA-pitoisuutta). Vaakasuora viiva edustaa Apop Tag -vär-jäytymisen suhteen negatiivista kanavaa. Vasemmanpuoleinen 10 ja oikeanpuoleinen osakuvio esittävät CAM-soluja, jotka ovat peräisin CSAT:lla ja LM609:lla käsitellyistä alkioista, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Solusyklin analyysi suoritettiin analysoimalla noin 8000 tapahtumaa olosuhdetta kohti ja koetulokset on esitetty ääriviivakuvaajaa käyttäen. 15 DNA-väriaineella, propidiumjodidilla, värjättyjen yksittäisten solujen näytteistä kävi ilmi, että 25 - 30 %:lla LM609 :11a (anti-avjS3) käsitellyistä CAM-soluista esiintyi 48 tuntia käsittelyn jälkeen todisteita tuman kondensoitumisesta 20 ja/tai segmentoitumisesta. Nämä ilmiöt ovat luonteenomaisia soluille, joissa apoptoosi on parhaillaan käynnissä. Tämä on päinvastainen tulos niihin CAM-preparaatteihin verrattuna, ·*·* joita oli käsitelty CSAT:lla (anti-jS-L) , joissa 90 - 95 %:lla . .·. soluista esiintyi normaali tuman värjäytyminen.
• · · :·.· 25 t I l Kuten kuviossa 19 on esitetty ja yhdenmukaisesti sen suh- • · teen, että soluissa oli käynnistynyt LM609:n indusoima apop- • · toosi, havaittiin merkittävä määrä soluja piikissä, jonka sisältämien solujen DNA-määrä oli täyttä määrää pienempi 30 (AO) . Tämän piikin on aikaisemmin esitetty edustavan frag- mentoitunutta DNA:ta apoptoosin loppuvaihetta lähestyvissä soluissa. Telford, et ai., Cytometry 13 (1992) 137. Lisäksi :*:* nämä AO-solut värjäytyvät vaikeuksitta Apop Tag’lla, mikä varmistaa sen, että tällä reagenssilla kyetään havaitsemaan • · 35 apoptoottisia soluja. AO:ssa olevien solujen värjäytymisen lisäksi Apop Tag’lla värjäytyi kuitenkin merkittävä määrä :Y soluja, jotka sisälsivät täyttä DNA-määrää enemmän DNA:ta.
• · · · 96 Nämä tulokset osoittavat, että LM609 kykenee edistämään apoptoosia verisuonten soluissa, joissa solun jakautumis-kierto on käynnistynyt. Tästä poiketen esiintyi kontrolli-CAM-preparaateista peräisin olevissa soluissa, joissa solun 5 jakautumiskierto oli käynnistynyt, vähäistä värjäytymistä
Apop Tag’lla, mikä oli yhdenmukaista sen suhteen, että kontrollilla käsitellyissä CAM-preparaateissa havaittiin vain muutamia apoptoottisia soluja.
10 Niiden 0FGF:llä stimuloiduissa CAM-preparaateissa olevien solujen joukossa, joissa solunjakautumiskierto oli käynnistynyt (S ja G2/M -vaihe) esiintyi 70 %:lla positiivista värjäytymistä LM609:lla (anti-0!v/33) . Vertailukohtana tälle on 10 % värjäytyminen LM609:lla, mikä havaittiin sellaisissa 15 soluissa, joissa solun jakautumiskierto oli käynnistynyt ja jotka olivat peräisin CAM-preparaateista, joita ei oltu käsitelty /0FGF: llä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että sen jälkeen kun soluja on käsitelty |3FGF:llä, niin suurimmalla osalla ανβ3:Ά sisältävistä soluista esiintyy aktiivista li-20 sääntymistä.
.·. · Nämä havainnot viittaavat yhdessä siihen, että LM609 mAb:n ,·;· tai av/33:n antagonistina toimivan syklisen peptidin injektio • · #*t. edistää apoptoosia kanan CAM-preparaatissa angiogeneesin • · ,*” 25 indusoitumisen jälkeen.
• « « « · • * '·'· CAM-preparaateista tutkittiin myös histologisesti Qrv/S3 :n il- ·.* mentyminen käyttäen immunologista reagoivuutta LM609:n kans sa ja solut, joissa apoptoosi oli parhaillaan käynnissä, 30 käyttämällä immunologista reagoivuutta Apop Tag’n kanssa.
CAM-kudosleikkeet, jotka oli valmistettu alkioista, joita ; .* oli käsitelty 48 tuntia aikaisemmin LM609 mAbrlla (anti- • · « .·;· αν|33) , CSAT:lla (antijS·^ tai PBS:lla, ja jotka oli valmistet- '·'· tu esimerkissä 5A, pestiin, valettiin OTC:hen (Baxter) ja • · *.* 35 pakastettiin nopeasti nestetypessä. Valmistettiin 6 μτη:η • · · paksuisia CAM-kudosleikkeitä, näitä kiinnitettiin asetonissa • · .*.* 30 sekunnin ajan ja varastoitiin -70 °C:ssa siihen asti kun- • · • · · · 97 nes ne otettiin käyttöön. Kudosleikkeitä esikäsiteltiin värjäystä varten huuhtelemalla niitä lyhyesti 70-%:isessa (v/v) etanolissa (ETOH), minkä jälkeen ne pestiin kolme kertaa PBSrssa. Tämän jälkeen kudosleikkeiden reagoivat kohdat teh-5 tiin reagoimattomiksi PBSrään valmistetulla 5-%:isella (w/v) BSA:11a 2 tunnin ajan, minkä jälkeen niitä inkuboitiin 2 tunnin ajan mAb LM609:n kanssa, jonka konsentraatio oli 10 ^g/ml. Tämän jälkeen leikkeet pestiin ja niitä inkuboitiin suhteessa 1 : 50 valmistetun rodamiiniin konjugoidun 10 vuohessa tehdyn hiirtä vastaan suunnatun IgG:n (Fisher
Scientific, Pittsburg, PA) laimennoksella 2 tunnin ajan. Lopuksi nämä samat kudosleikkeet pestiin ja värjättiin Apop Tag’lla esimerkissä 12A2) kuvatulla tavalla. Värjätyt kudos-leikkeet kiinnitettiin aluslasille ja analysoitiin kon-15 fokaalisella immunofluoresenssimikroskopialla.
Kuviossa 20 edustavat osakuviot A - C CSAT:llä (anti/3x) käsitellyistä alkioista peräisin olevaa CAM-kudosta, ja osa-kuviot D - F edustavat LM609 mAb: 11a (anti-av/33) käsitellyis-20 tä alkioista peräisin olevaa CAM-kudosta. Osakuvioissa A ja D on kuvattu kudoksia, jotka on värjätty Apop Tag’lla ja visualisoitu fluoresenssin avulla (FITC) D.I.C.-kuvan päälle • · .*:* asetettuna. Osakuviot B ja E kuvaavat samoja kudoksia, jotka . .·. on värjätty LM609 mAb:11a (anti-av|S3) ja visualisoitu fluo- ;Γ* 25 resenssilla (rodamiini). Osakuviot C ja F edustavat samoja \ kudoksia esittäviä kuvia, jotka on värjätty sekä Apop • · > *·* Tag’lla että LM609:lla ja joissa värjäytyminen keltaisella • · värillä edustaa paikantumista samaan kohtaan. Vasemmanpuoleisessa ja oikeanpuoleisessa osakuvioissa esitetyt pal-30 kit edustavat 15 ja 50 μιη, vastaavassa järjestyksessä ilmoi tettuna .
• · • · • · · :*|* Kuten kuviossa 20 (A - C) on esitetty, näytti värjäytyminen «
Apop Tag’:11a olevan vähäistä ja sattumanvaraista CSAT:n ja 35 PBS-kontrollin suonensisäisen injektion jälkeen, mikä viit- • *«· taa siihen, että tässä kudoksessa esiintyy erittäin vähän :V apoptoosia. Tästä poiketen CAM-preparaateilla, jotka olivat ···« 98 peräisin aikaisemmin LM609:lla tai syklisellä peptidillä 203 käsitellyistä alkioista, esiintyi suurimmassa osassa verisuonista voimakasta värjäytymistä Apop Tag’lla, kun taas ympäröivissä soluissa, jotka eivät olleet verisuonisoluja, 5 esiintyi vähäistä reagoivuutta (kuviot 20D - F). Lisäksi silloin kun sekä Apop Tag’ia että LM609:ää käytettiin näiden kudosten värjäämiseen (19C ja 19F), havaittiin näiden mark-kerien välillä merkittävää paikantumista samaan kohtaan ainoastaan niissä CAM-preparaateissa, jotka olivat peräisin 10 antagonisteilla käsitellyistä alkioista. Nämä havainnot osoittavat, että in vivo -olosuhteissa suoritetun angio-geneesin indusoinnin jälkeen o;vj83-integriinin inhibiittorit edistävät valikoivasti Q?vj83:a sisältävien verisuonien apop-toosia.
15
Vaikkakin angiogeneesi on monimutkainen ilmiö, johon liittyy monia molekulaarisia ja solubiologisia tapahtumia, viittaa-vat monet todisteet siihen, että verisuonten solujen integ-riini οινβ3 osallistuu tähän ilmiöön suhteellisen myöhäisessä 20 vaiheessa. Ensimmäiseksi on mainittava, että immunohistolo- gisen analyysin perusteella on käynyt ilmi, että avjS3:n il-mentyminen verisuonisoluissa saavuttaa maksimaalisen tasonsa * .·;· 12 - 24 tuntia sen jälkeen kun angiogeneesi on indusoitu • « ,*,· /3FGF: 11a. Toiseksi ανβ3:η antagonistit estävät useilla akti- • » .1”. 25 vaattoreilla aikaansaatua angiogeneesiä, mikä viittaa sii- * ; hen, että tämä reseptori liittyy yhteiseen reaktiotiehen, • · *·*· joka on myötäsuuntaan ehkä kaikkien angiogeneesiin johtavien • · primaaristen signaalin lähetys- ja vastaanottotapahtumien suhteen. Kolmanneksi LM609 mAb:lla tai syklisillä peptideil-30 lä käsitellyissä CAM-preparaateissa ei esiinny merkittävää apoptoosin lisääntymistä määritettynä DNA-tikapuiden muodos- • j* tumisella ennen kuin 48 tuntia näillä antagonisteilla suori- • · · .*:* tetun käsittelyn jälkeen. Lopuksi οινβ3:η antagonistit edistä- ,·/ vät sellaisten verisuonisolujen apoptoosia, jotka ovat jo • * 35 indusoitu siirtymään solusykliin.
··♦ • · • · • · « · • · I·*· 99 Tässä keksinnössä esitetyt tulokset antavat ensi käden suoraa todistusaineistoa sille, että integriinin ligaatioilmiöt voivat säädellä solujen eloonjäämistä in vivo -olosuhteissa. Tästä syystä tässä keksinnössä esitetään se hypoteesi, että 5 angiogeneesin käynnistyttyä yksittäiset verisuonisolut ja kautuvat ja alkavat liikkua angiogeenisen ärsykkeen lähdettä kohti, minkä jälkeen ανβ3:η ligaatio muodostaa signaalin, joka mahdollistaa solujen pysymisen jatkuvasti elossa, mikä johtaa erilaistumiseen ja kypsien verisuonten muodostumi-10 seen. Kuitenkin jos av03:n ligaatio ehkäistyy, niin solut eivät onnistu saamaan käyttöönsä tätä molekulaarista toimintaohjetta ja solut siirtyvät oletusarvoisesti apoptoo-sin. Tämän hypoteesin perusteella olisi myös ennustettavissa, että erilaistumisen tapahduttua eivät kypsät verisuonet 15 tarvitsisi orv/33een perustuvaa signaalia elinkykynsä säilyttämiseen ja siten ne eivät reagoisi tämän integriini antagonisteille .
Lopuksi tässä keksinnössä esitetyt tulokset muodostavat 20 todistusaineistoa sille, että integriini avj83:n antagonis teista voidaan saada käyttöön tehokkaasti hyväksi käytettä- •\ vissä oleva terapeuttinen ratkaisu neoplasian ja muiden sei- • · .‘Γ laisten sairauksien hoitoon, joille angiogeneesi on luon- . teenomaista. Ensimmäiseksi a;v|33:n antagonistit hajottavat ·»*· 25 uusia muodostumassa olevia verisuonia olemassa olevaan suo- » j I nitukseen vaikuttamatta. Toiseksi näillä antagonisteilla ei **** ole merkittävää vaikutusta kana alkion elinkykyyn, mikä • · *·' viittaa siihen, että ne ovat ei-toksisia. Kolmanneksi angio geneesi estyi merkittävässä määrin angiogeeniseen ärsykkee-30 seen katsomatta. Lopuksi αν|83:η antagonistien antaminen sys- teemisesti saa aikaan useiden erilaisten histologisesti toi- j :* sistaan poikkeavien humaanituumorien silmiinpistävän regres- ··· soitumisen.
4 • 4 f ·· 4 · 35 Siten edellä mainitut esimerkit osoittavat, että o?v/33-integ- • *··· riinillä on ratkaiseva osuus useiden eri ärsykkeiden aikaan- :V saamassa angiogeneesissä ja avjS3 on sellaisenaan arvokas te- «Ml 100 rapeuttinen kohde käytettäessä tämän keksinnön mukaisia :n antagonisteja sairauksiin, joille uudissuonittuminen on ominaista.
5 Edellä olevan kirjallisesti esitetyn patenttiselityksen kat sotaan olevan riittävän seikkaperäinen, jotta tätä keksintöä kyetään alan ammattikokemuksen perusteella käyttämään. Talletettu solulinja ei rajoita tämän keksinnön suojapiiriä, koska talletetun sovellutusmuodon tarkoituksena on toimia 10 yhtenä tämän keksinnön yhtä kohdetta kuvaavana esimerkkinä ja tämän keksinnön suojapiiriin kuuluvat tätä solulinjaa toiminnallisesti vastaavat solulinjat. Materiaalin talletusta ei ole lupa tulkita siten, että jotakin tämän keksinnön kohteista, sen paras käyttötapa mukaan lukien, ei olisi mah-15 dollista käyttää tässä keksinnössä kirjallisessa muodossa esitetyn patenttiselityksen puutteellisuuden johdosta, eikä tämän ole katsottava rajoittavan patenttivaatimusten suoja-piiriä siihen tiettyyn nimenomaiseen kuvaavaan esimerkkiin, jota se edustaa. Edellä olevan patenttiselityksen perusteel-20 la ovat useat tämän keksinnöt erilaiset modifikaatiot, nii den lisäksi, joita tässä keksinnössä on esitetty ja kuvattu, alan ammattikokemuksen perusteella ilmeisiä ja nämä kuuluvat oheistettujen patenttivaatimusten suojapiiriin.
• · • · · » · • · • · · • · » • · · • · · • · 1 • · · · • · 1 • · · 101 SEKVENSSILISTAUS (1) YLEISET TIEDOT: (1) HAKIJA: (A) NIMI: The Scripps Research Institute (B) KATU: 10666 North Torrey Pines Road (C) KAUPUNKI: La Jolla
(D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: CA
(E) MAA: USA
(F) POSTINUMERO: 92037 (G) PUHELIN: 619-554-2937 (H) TELEFAX: 619-554-6312 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Menetelmiä ja koostumuksia, jotka ovat käyttökelpoisia angiogeneesin inhibointiin (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 14 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (v) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: PCT/US 95/ (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 09-03-1995 (vi) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/210 715 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 18-03-1994 (vi) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/366 665 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 30-12-1994 • · • · · (2) SEKVENSSIN ID NO:1 TIEDOT: • · · • · · . (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ]···" (A) PITUUS: 6 aminohappoa :1·1: (B) TYYPPI: aminohappo [ '1' (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • φ · *·1 ' (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): Ei
(iv) ANTI-SENSE: EI
: : “· (v) FRAGMENTTI TYYPPI: sisäinen • · · ··· ! (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi V (B) ASEMA: 1..6 (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= BOC-GRGDFV-OMe · • · · • · 102 /huomautus= "BOC merkitsee N-terminaalista suojaavaa butyyli-oksikarbonyyliryhmää; OMe merkitsee C-terminaalista metyyli-esteriä; arginiini sijaitsee toisessa asemassa (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: 1..6 (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= OMe /huomautus= "OMe merkitsee C-terminaalista suojaavaa etyyli-esteriryhmää".
(ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: 1..6 (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= D-Arg /huomautus= "Etuliite "D" D-Arg:ssa merkitsee, että asemassa 2 oleva arginiini on D-aminohappo".
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:l:
Gly Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 6 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
: (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen • · · (ix) OMINAISPIIRTEET: :1·1: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi \ l' (B) ASEMA: 1..6
(D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= BOC
/huomautus= "BOC merkitsee N-terminaalista reagoinnin estävää tert-butyylioksikarbonyyliryhmää".
(ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: 1..6
(D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= OH
/huomautus= "OH merkitsee vapaata C-terminaalista karboksyyli- .·:· happoa".
» · • (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi .1··; (B) ASEMA: 1..6 • · · · • · · • · · • · 103 (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= D-Arg /huomautus= "Etuliite "D" D-Arg:ssa merkitsee, että asemassa 2 oleva arginiini on D-aminohappo".
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2:
Gly Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 6 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
(v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: 1..6
(D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= H
/huomautus= "H merkitsee vapaata N-terminaalista amiinia".
(ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: 1..6
. . (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= OH
:/··. /huomautus= "OH merkitsee vapaata C-terminaalista karboksyyli- happoa".
: (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi :V (B) ASEMA: 1..6 . .·. (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= D-Arg /huomautus= "Etuliite "D" 2-asemassa olevassa D-Arg:ssa merkit-see, että arginiini on D - aminohappo".
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3:
Gly Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: • · · • · , (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ,·:· (A) PITUUS: 6 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen • · · 1 · • · · • · » • · 104 (D) TOPOLOGIA: rengasmainen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
(v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: 1..6 (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= syklo /huomautus= "Syklo merkitsee syklistä peptidiä; pienet kirjaimet esittävät D-aminohappoa; isot kirjaimet esittävät L-amino-happoa".
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:4:
Gly Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 5 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: rengasmainen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
:/.i (iv) ANTI-SENSE: EI
• · · : (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen • · · (ix) OMINAISPIIRTEET: :*·*: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi * .·. (B) ASEMA: 1..5 (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= syklo :*j*; /huomautus= "Syklo merkitsee syklistä peptidiä; pienet kirjai- * met esittävät D-aminohappoa; isot kirjaimet esittävät L-amino-happoa".
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:5: . Arg Gly Asp Phe Vai : : * 1 5 ·«« ··♦ (2) SEKVENSSIN ID NO: 6 TIEDOT: ♦ · ««· V (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 5 aminohappoa • · · • · • · • · • · · • · • · · · 105 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: rengasmainen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
(v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: 1..5 (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= syklo /huomautus= Syklo merkitsee syklistä peptidiä; pienet kirjaimet esittävät D-aminohappoa; isot kirjaimet esittävät L-amino-happoa".
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:6:
Arg Ala Asp Phe Vai 1 5 SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 5 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: rengasmainen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
• · ·
' (iv) ANTI-SENSE: EI
• · · (V) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen • 1 · ' • · • · t (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: 1..5 ·1 (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= syklo /huomautus= "Syklo merkitsee syklistä peptidiä; pienet kirjaimet esittävät D-aminohappoa; isot kirjaimet esittävät L-amino-happoa".
. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:7: « · • · .·;· Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 • ♦ ♦ ·· V (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: • · · • 1 • · · « · • · • · • · • · 1·· 106 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 15 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (li) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
(v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:8:
Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gin Vai Thr Arg Gly Asp Vai Phe 15 10 15 (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 5 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: rengasmainen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi ' (B) ASEMA: 1..5 . .· (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= syklo *··· /huomautus= "Syklo merkitsee syklistä peptidiä; pienet kirjai-:*·*. met esittävät D-aminohappoa; isot kirjaimet esittävät L-amino- 1 happoa".
• « · • · · .·.· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 9 : • · ·
Arg Ala Asp Phe Vai 1 5 (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: .··* (A) PITUUS: 6 aminohappoa *.* (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen V (D) TOPOLOGIA: rengasmainen ··· • · • · ♦ • * « ♦ • ♦ • ♦ • · m··· • · 107 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
(v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: 1..6 (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= syklo /huomautus= "Syklo merkitsee syklistä peptidiä; pienet kirjaimet esittävät D-aminohappoa; isot kirjaimet esittävät L-amino-happoa".
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:10:
Ala Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 (2) SEKVENSSIN ID NO:11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 6 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: rengasmainen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
:’·.! (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen • · V · (ix) OMINAISPIIRTEET: . .·. (A) NIMI/SELITYS: Peptidi *·*·· (B) ASEMA: 1..6 ·*·* (D) LISÄTIEDOT: /merkintätapa= syklo ‘ /huomautus= "Syklo merkitsee syklistä peptidiä; pienet kirjai- ·.·.· met esittävät D-aminohappoa; isot kirjaimet esittävät L-amino-.·.· happoa".
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:11:
Gly Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 : :*· (2) SEKVENSSIN ID NO: 12 TIEDOT: • · · • · · V (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa V (B) TYYPPI: aminohappo .··· (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen • · · • · • · • · • · « · • · · · 108 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
(v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:12:
Thr Arg Gin Vai Vai Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met 15 10 (2) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 13 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
(v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:13:
Gly Vai Vai Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser 15 10 • ·
• I
(2) SEKVENSSIN ID NO: 14 TIEDOT: e · • · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *·:· (A) PITUUS: li aminohappoa ;1·' (B) TYYPPI: aminohappo • 1. (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ·.:.2 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • « ' (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
: :1· (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen • · · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 14: • ♦ V Thr Asp Vai Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu .···. 15 10 • · · « · • · • · • · « · ··· · 2 • ·
Claims (17)
1. ανβ3-antagonistin käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi kiinteän keuhko-, haima-, rintarauhas-, 5 kooloni-, kurkunpää- tai munasarjatuumorin hoitamiseksi, jolloin farmaseuttinen koostumus sisältää angiogeneesiä inhiboivan määrän mainittua avP3-antagonistia, joka ανβ3-antagonisti on ανβ3 spesifinen vasta-aine tai RGD-sekvenssin sisältävä polypeptidi. 10
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen avP3-antagonistin käyttö, jolloin mainittu kudos on kiinteä tuumori tai kiinteän tuumorin etäpesäke ja mainittu angiogeneesi on tuumorin angiogenee-si. 15
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen avP3-antagonistin käyttö, jolloin mainittu farmaseuttinen koostumus on tarkoitettu annettavaksi kemoterapian yhteydessä.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen avP3-antagonistin käyttö, jolloin mainittu farmaseuttinen koostumus on tarkoi-. . tettu annettavaksi siten, että se saa aikaan mainitun α β,- ·.** antagonistin plasmapitoisuuden 2 μΜ - 5 mM. • · · • · ·
5 IC50-aktiivisuuteen f ibrinogeenin sitoutumisen aIIbP3:een tai avP3:een inhibitiooon verrattuna.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen avP3-antagonistin • · · : ’.· käyttö, jolloin mainittu farmaseuttinen koostumus on tarkoi- tettu annettavaksi siten, että mainittua avP3-antagonistia annetaan määränä 0,1 mg per kg - 300 mg per kg. .**·. 30
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen avP3-antagonistin • · · käyttö, jolloin mainittu farmaseuttinen koostumus on topikaa- • · • liseen, suonensisäiseen, transdermaaliseen, nivelensisäiseen, • · • · · : lihaksensisäiseen tai oraaliseen antamiseen sopivassa • · · ·...· muodossa. 35 • · ·
7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen avP3-antagonistin käyttö, jolloin mainittu farmaseuttinen koostumus on kerta-annoksena, suonensisäiseen antamiseen sopivassa muodossa. • ·
8. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen käyttö, jolloin mainittu av33-antagonisti inhiboi fibrinogeenin sitoutumista avP3:een, ja sillä on vähintään kymmenkertainen IC50-aktiivisuus fibrinogeenin sitoutumisen avP3:een inhibitiossa
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen a^3-antagonistin käyttö, jolloin mainittu av£3-antagonisti on ανβ3:η suhteen 10 immunospesifinen monoklonaalinen vasta-aine.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen avP3-antagonistin käyttö, jolloin mainittu monoklonaalinen vasta-aine on humanisoitu.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen avP3-antagonistin käyttö, jolloin mainittu monoklonaalinen vasta-aine on LM609 (ATCC HB 9537) .
12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen a^3-antagonistin käyttö, 20 jolloin mainittu monoklonaalinen vasta-aine on humanisoitu LM609 (ATCC HB 9537).
• · • · · *·#** 13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen avP3-antagonistin • · · käyttö, jolloin mainittu αβ.-antagonisti on RGD-sekvenssin • VJ • · · *·ί·1 25 sisältävä polypeptidi. • · · • · · • · • ·
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen a^3-antagonistin käyttö, : :1j jolloin mainittu polypeptidi on syklinen peptidi. .1··. 30
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen α β,-antagonistin käyttö, • · VJ • · · jolloin mainittu polypeptidi on valittu joukosta, jonka • · muodostavat c-(GrGDFVj (SEKVENSSI ID NO:4), c-(RGDfV) • · : (SEKVENSSI ID NO:5), C-(RGDFv) (SEKVENSSI ID NO:7) tai :...! YTAECKPQVTRGDVF (SEKVENSSI ID NO: 8) tai tämän suola. :·. 35 • · ·
16. Patenttivaatimuksen 15 mukaisen a^3-antagonistin suolan käyttö, jolloin mainittu suola on vetykloridi tai trifluoro-asetaatti. • · Ill
17. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen «^-antagonistin käyttö, jolloin mainittu farmaseuttinen koostumus on tarkoitettu ihmispotilaan hoitoon. 5 • · • · · • ·· • · • · · • · · • · · • · · • · · ··· • · · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · • · · * · · • · · • · • · • · · • · • · • · · • · · • ·· · • · · • · • · • · · 1 • · · • · • · ·
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21071594 | 1994-03-18 | ||
| US08/210,715 US5753230A (en) | 1994-03-18 | 1994-03-18 | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| US36666594 | 1994-12-30 | ||
| US08/366,665 US5766591A (en) | 1994-03-18 | 1994-12-30 | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| PCT/US1995/003035 WO1995025543A1 (en) | 1994-03-18 | 1995-03-09 | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| US9503035 | 1995-03-09 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI963692A0 FI963692A0 (fi) | 1996-09-18 |
| FI963692A FI963692A (fi) | 1996-09-18 |
| FI121916B true FI121916B (fi) | 2011-06-15 |
Family
ID=22783992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI963692A FI121916B (fi) | 1994-03-18 | 1996-09-18 | Menetelmiä ja koostumuksia, jotka ovat käyttökelpoisia angiogeneesin inhibointiin |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US5753230A (fi) |
| EP (3) | EP0754059B2 (fi) |
| JP (2) | JP4268222B2 (fi) |
| KR (1) | KR100327081B1 (fi) |
| CN (1) | CN1161152C (fi) |
| AT (3) | ATE490784T1 (fi) |
| AU (1) | AU709645B2 (fi) |
| CA (1) | CA2184493C (fi) |
| CZ (1) | CZ294650B6 (fi) |
| DE (2) | DE69536128D1 (fi) |
| DK (3) | DK0754059T4 (fi) |
| ES (3) | ES2211901T5 (fi) |
| FI (1) | FI121916B (fi) |
| HK (1) | HK1013960A1 (fi) |
| HU (1) | HU221988B1 (fi) |
| MX (1) | MX9604145A (fi) |
| NO (1) | NO322441B1 (fi) |
| NZ (3) | NZ511293A (fi) |
| PT (2) | PT1468695E (fi) |
| RU (1) | RU2162712C2 (fi) |
| SI (1) | SI0754059T2 (fi) |
| SK (1) | SK284586B6 (fi) |
| UA (1) | UA44729C2 (fi) |
| WO (1) | WO1995025543A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA952214B (fi) |
Families Citing this family (176)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4310643A1 (de) * | 1993-04-01 | 1994-10-06 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Adhäsionsinhibitoren |
| US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| US6949511B1 (en) | 1994-04-26 | 2005-09-27 | The Children's Medical Center Corporation | Methods of inhibiting angiogenesis via increasing in vivo concentrations of kringle region fragments of plasminogen |
| US5945403A (en) * | 1997-05-30 | 1999-08-31 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
| US5837682A (en) * | 1996-03-08 | 1998-11-17 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
| US6660842B1 (en) | 1994-04-28 | 2003-12-09 | Tripep Ab | Ligand/receptor specificity exchangers that redirect antibodies to receptors on a pathogen |
| DE69531187T2 (de) * | 1994-12-20 | 2004-04-22 | Merck Patent Gmbh | Monoklonaler Antikörper gegen das Alpha-V-Integrin |
| US6440729B1 (en) * | 1995-06-30 | 2002-08-27 | University Of Kansas Medical Center | Treating angiogenesis-mediated diseases with the α2 monomer of type IV collagen |
| US6358735B1 (en) | 1995-06-30 | 2002-03-19 | University Of Kansas Medical Center | Method for inhibiting angiogenesis and tumors with the isolated NC1 α3 chain monomer of type IV collagen |
| AU726793B2 (en) * | 1995-08-14 | 2000-11-23 | Scripps Research Institute, The | Methods and compositions useful for inhibition of alpha v beta 5 mediated angiogenesis |
| US6100423A (en) * | 1995-08-30 | 2000-08-08 | G. D. Searle & Co. | Amino benzenepropanoic acid compounds and derivatives thereof |
| MX9801716A (es) | 1995-08-30 | 1998-05-31 | Searle & Co | Derivados de meta-guanidina, urea, tiourea o acido aminobenzoico azaciclico, como antagonistas de integrina. |
| US6346510B1 (en) | 1995-10-23 | 2002-02-12 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions |
| CZ117798A3 (cs) | 1995-10-23 | 1998-08-12 | The Children's Medical Center Corporation | Antiangiogenní kompozice a způsoby léčby |
| US5854205A (en) * | 1995-10-23 | 1998-12-29 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic compositions and methods |
| US5854221A (en) * | 1996-12-12 | 1998-12-29 | The Children's Medical Center Corporation | Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use |
| US6589755B1 (en) * | 1996-08-15 | 2003-07-08 | Novartis Ag | Assay for quantifying arthritic conditions |
| GB9708265D0 (en) * | 1997-04-24 | 1997-06-18 | Nycomed Imaging As | Contrast agents |
| ES2321991T3 (es) * | 1996-12-09 | 2009-06-15 | Merck Patent Gmbh | Receptor de adhesion alfavbet3 recombinante soluble. |
| US6590079B2 (en) | 1997-01-30 | 2003-07-08 | Ixsys, Incorporated | Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same |
| US6596850B1 (en) * | 1998-01-30 | 2003-07-22 | Ixsys, Incorporated | Anti-αv3β3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same |
| WO1998040488A1 (en) * | 1997-03-12 | 1998-09-17 | Smithkline Beecham Corporation | Anti-alphabeta3 humanized monoclonal antibodies |
| US7112338B2 (en) | 1997-03-12 | 2006-09-26 | The Regents Of The University Of California | Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels |
| US5837283A (en) | 1997-03-12 | 1998-11-17 | The Regents Of The University Of California | Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells |
| US5994388A (en) * | 1997-03-18 | 1999-11-30 | The Children's Medical Center Corporation | Cytochalasin and isoindolinone derivatives as inhibitors of angiogenesis |
| EP1003429B1 (en) * | 1997-03-19 | 2008-09-24 | Lucid, Inc. | Cellular surgery utilizing confocal microscopy |
| AU6954498A (en) * | 1997-04-11 | 1998-11-11 | G.D. Searle & Co. | Methods for using antagonistic anti-avb3 integrin antibodies |
| DE69808609T2 (de) * | 1997-04-11 | 2003-06-12 | G.D. Searle & Co., Chicago | Antagonistische anti-avb3 integrin antikörper |
| US6596276B1 (en) * | 1997-09-30 | 2003-07-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Method for inhibiting tumor angiogenesis in a living subject |
| US6172256B1 (en) * | 1998-03-04 | 2001-01-09 | G.D. Searle & Co. | Chiral-β-amino acid compounds and derivatives thereof |
| US6372719B1 (en) * | 1998-03-04 | 2002-04-16 | Jay Cunningham | ανβ3 integrin antagonists in combination with chemotherapeutic agents |
| US6537520B1 (en) | 1998-03-31 | 2003-03-25 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders |
| SK13952000A3 (sk) | 1998-03-31 | 2001-12-03 | Dupont Pharmaceuticals Company | Farmaceutické zlúčeniny na zobrazovanie porúch angiogenézy |
| US6524553B2 (en) * | 1998-03-31 | 2003-02-25 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Quinolone vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
| US6548663B1 (en) | 1998-03-31 | 2003-04-15 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Benzodiazepine vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
| US6852318B1 (en) * | 1998-05-08 | 2005-02-08 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting and inhibiting angiogenesis |
| US6962974B1 (en) | 1998-06-17 | 2005-11-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof |
| US7387779B2 (en) * | 1998-06-17 | 2008-06-17 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof |
| US6759047B1 (en) | 1998-06-17 | 2004-07-06 | Beth Israel Deaconess Hospital Corp. | Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof |
| AU2004202605B2 (en) | 1998-07-13 | 2007-10-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids |
| RU2167425C2 (ru) * | 1998-07-17 | 2001-05-20 | Малышев Игорь Юрьевич | Способ определения белков |
| US6164281A (en) * | 1998-07-20 | 2000-12-26 | Zhao; Iris Ginron | Method of making and/or treating diseases characterized by neovascularization |
| JP2002522504A (ja) * | 1998-08-13 | 2002-07-23 | ジー・ディー・サール・アンド・カンパニー | 多価ａｖｂ３および転移関連レセプター・リガンド |
| US6979697B1 (en) * | 1998-08-21 | 2005-12-27 | Point Therapeutics, Inc. | Regulation of substrate activity |
| US6703050B1 (en) * | 1998-09-04 | 2004-03-09 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for the prevention or treatment of cancer |
| US6537554B1 (en) | 1998-09-10 | 2003-03-25 | Curagen Corporation | Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis |
| US6248327B1 (en) | 1998-09-11 | 2001-06-19 | Vanderbilt University | Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis |
| US7176289B1 (en) | 1998-09-11 | 2007-02-13 | Vanderbilt University | Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis |
| US6235877B1 (en) | 1999-08-04 | 2001-05-22 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Peptido-mimetic compounds containing RGD sequence useful as integrin inhibitors |
| US20030202977A1 (en) * | 1998-11-16 | 2003-10-30 | New York University | Treatment of osteoarthritis |
| ATE293989T1 (de) * | 1998-11-20 | 2005-05-15 | Genentech Inc | Verwendung von eph-rezeptor-antagonisten und agonisten zur behandlung von vaskulären krankheiten |
| US6339062B1 (en) * | 1998-11-23 | 2002-01-15 | Inkine Pharmaceutical Company, Inc. | Retroinverso polypeptides that mimic or inhibit thrombospondin activity |
| US6160099A (en) * | 1998-11-24 | 2000-12-12 | Jonak; Zdenka Ludmila | Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies |
| US6569402B1 (en) * | 1998-12-18 | 2003-05-27 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
| CA2349333A1 (en) * | 1998-12-18 | 2000-06-22 | Du Pont Pharmaceuticals Company | Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
| US6511649B1 (en) * | 1998-12-18 | 2003-01-28 | Thomas D. Harris | Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
| US6794518B1 (en) * | 1998-12-18 | 2004-09-21 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
| BR9917079A (pt) | 1998-12-18 | 2001-10-30 | Du Pont Pharm Co | Compostos antagonistas de receptor devitronectina, kit, composição metalofarmacêuticade diagnóstico ou terapêutica, composição deagente de contraste para ultra-som, composiçãoradiofarmacêutica terapêutica, composiçãofarmacêutica de diagnóstico, método detratamento da artrite reumatóide, do cancêr e darestenose em um paciente, método de formação deimagem da angiogênese terapêutica, do câncer, denovos vasos sanguìneos, da arteriosclerose, darestenose, da isquemia e da lesão por reperfusãodo miocárdio em um paciente |
| WO2000038715A2 (en) * | 1998-12-23 | 2000-07-06 | G.D. Searle & Co. | Use of an integrin antagonist and radiation in the treatment of neoplasia |
| US20050281821A1 (en) * | 1999-01-06 | 2005-12-22 | Flavia Pernasetti | Method and composition for angiogenesis inhibition |
| US6521593B1 (en) * | 1999-02-01 | 2003-02-18 | Childrens Hospital Los Angeles | Methods for inhibiting brain tumor growth |
| RU2236251C2 (ru) * | 1999-02-12 | 2004-09-20 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Способы лечения опухолей и метастазов с использованием комбинации антиангиогенной терапии и иммунотерапии |
| WO2000059532A1 (en) * | 1999-04-01 | 2000-10-12 | Biostratum, Inc. | The use of domains of type iv collagen t inhibit angiogenesis an tumour growth |
| AU4982200A (en) * | 1999-05-06 | 2000-11-21 | Burnham Institute, The | Antiangiogenic endostatin peptides, endostatin variants and methods of use |
| US6890904B1 (en) * | 1999-05-25 | 2005-05-10 | Point Therapeutics, Inc. | Anti-tumor agents |
| US6531580B1 (en) * | 1999-06-24 | 2003-03-11 | Ixsys, Inc. | Anti-αvβ3 recombinant human antibodies and nucleic acids encoding same |
| US6685914B1 (en) * | 1999-09-13 | 2004-02-03 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Macrocyclic chelants for metallopharmaceuticals |
| BR0014222A (pt) * | 1999-09-23 | 2003-02-25 | Scripps Research Inst | Método e composições para inibir a formação de adesão |
| US20080038274A1 (en) * | 1999-09-23 | 2008-02-14 | Foster Keith A | Inhibition of secretion from non-neuronal cells |
| JP2003510371A (ja) * | 1999-10-04 | 2003-03-18 | カイロン コーポレイション | 乾癬を処置するためのｃｄ４０アンタゴニスト |
| AU781444B2 (en) | 1999-12-22 | 2005-05-26 | Scripps Research Institute, The | Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors |
| US7740841B1 (en) * | 2000-01-28 | 2010-06-22 | Sunnybrook Health Science Center | Therapeutic method for reducing angiogenesis |
| HUP0300544A3 (en) | 2000-02-03 | 2005-03-29 | Eisai Co Ltd | Pharmaceutical compositions containing integrin expression inhibitors |
| US7361643B2 (en) | 2000-02-09 | 2008-04-22 | University Of Puerto Rico | Methods for inhibiting angiogenesis |
| US20010053766A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-12-20 | Janardan Kumar | Method of treating disorders of the eye |
| US6573096B1 (en) * | 2000-04-01 | 2003-06-03 | The Research Foundation At State University Of New York | Compositions and methods for inhibition of cancer invasion and angiogenesis |
| US6835806B2 (en) | 2000-04-03 | 2004-12-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | Cell growth regulation system |
| ES2244607T3 (es) | 2000-04-12 | 2005-12-16 | Amersham Health As | Derivados peptidicos de union a integrina. |
| US10293056B1 (en) * | 2000-05-24 | 2019-05-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases |
| US7288390B2 (en) * | 2000-08-07 | 2007-10-30 | Centocor, Inc. | Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses |
| US7163681B2 (en) | 2000-08-07 | 2007-01-16 | Centocor, Inc. | Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses |
| US20030104573A1 (en) * | 2000-09-11 | 2003-06-05 | Shimkets Richard A. | Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis |
| NO20004795D0 (no) | 2000-09-26 | 2000-09-26 | Nycomed Imaging As | Peptidbaserte forbindelser |
| JP2005508831A (ja) * | 2000-10-02 | 2005-04-07 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 血管新生促進のための方法および組成物 |
| US6632835B2 (en) | 2001-02-22 | 2003-10-14 | Nanodesign Inc. | Dibenzo[c]chromen-6-one derivatives as anti-cancer agents |
| DE10109136A1 (de) * | 2001-02-26 | 2002-09-12 | Cytotools Gmbh | Mittel, die die Apoptose bei an der Wundheilung beteiligten Zellen inhibieren |
| CA2439852A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Christine Dingivan | Methods of preventing or treating inflammatory or autoimmune disorders by administering integrin alphav beta3 antagonists |
| AU2002316855B2 (en) | 2001-04-24 | 2008-03-13 | Merck Patent Gmbh | Combination therapy using anti-angiogenic agents and TNFalpha |
| SE0101854L (sv) * | 2001-05-28 | 2002-11-29 | Bioneris Ab | Användning av en förening med en negativt laddad region av grupper för behandling av restenos. |
| US7829087B2 (en) * | 2001-07-09 | 2010-11-09 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating cognitive impairment |
| AU2002312566A1 (en) * | 2001-07-09 | 2003-01-29 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of inhibiting amyloid toxicity |
| HU230901B1 (hu) | 2001-07-10 | 2019-01-28 | Ge Healthcare Limited | Peptidalapú vegyületek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények |
| MXPA04000204A (es) * | 2001-07-27 | 2004-03-18 | Univ Kansas Medical Center | Estructura cristalizada de colageno tipo iv del hexamero de dominio nc1. |
| US20060014697A1 (en) * | 2001-08-22 | 2006-01-19 | Travis Mickle | Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse |
| US20030119834A1 (en) * | 2001-09-05 | 2003-06-26 | Bamdad Cynthia C. | Compositions and methods of treatment of cancer |
| KR20040058229A (ko) | 2001-10-22 | 2004-07-03 | 더 스크립스 리서치 인스티튜트 | 항체 표적화 화합물 |
| CN1658894A (zh) * | 2002-02-14 | 2005-08-24 | 默克专利股份有限公司 | 用于治疗眼病的方法和组合物 |
| JP2005522451A (ja) * | 2002-02-15 | 2005-07-28 | リヒャルト ブルンネル | 脈絡膜の新生血管形成の治療のための７ｓ免疫グロブリン |
| WO2003075741A2 (en) * | 2002-03-04 | 2003-09-18 | Medimmune, Inc. | METHODS OF PREVENTING OR TREATING DISORDERS BY ADMINISTERING AN INTEGRIN αvβ3 ANTAGONIST IN COMBINATION WITH AN HMG-CoA REDUCTASE INHIBITOR OR A BISPHOSPHONATE |
| US20040001835A1 (en) * | 2002-03-04 | 2004-01-01 | Medimmune, Inc. | Prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents |
| AU2003226065B2 (en) * | 2002-04-12 | 2009-02-26 | Ludwig Institute For Cancer Research, Ltd | Recombinant anti-interleukin-9 antibodies |
| NZ584715A (en) | 2002-07-15 | 2011-12-22 | Univ Texas | Peptides binding to phosphatidylethanolamine and their use in treating viral infections and cancer |
| GB0217018D0 (en) * | 2002-07-23 | 2002-08-28 | Bioacta Ltd | Peptide 1 |
| JP2005538093A (ja) * | 2002-07-23 | 2005-12-15 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ ミシガン | 抗血管形成療法のための、テトラポリアンモニウムテトラチオモリブデートおよび関連化合物 |
| US7411048B2 (en) | 2002-11-19 | 2008-08-12 | Drg International, Inc. | Diagnostic method for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids |
| WO2004058044A2 (en) * | 2002-11-19 | 2004-07-15 | Drg International, Inc. | Diagnostic method for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids and therapeutic uses therefor |
| US8017737B2 (en) | 2002-11-19 | 2011-09-13 | Hasan Kulaksiz | Diagnostic methods for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids; monoclonal antibodies specific to human hepcidin and associated uses therefor |
| US20040176272A1 (en) * | 2003-01-30 | 2004-09-09 | Medimmune, Inc. | Uses of integrin alphavbeta3 antagonists |
| US20040208869A1 (en) * | 2003-01-30 | 2004-10-21 | Medimmune, Inc. | Uses of anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations |
| AU2004209457A1 (en) | 2003-02-06 | 2004-08-19 | Tripep Ab | Antigen/antibody or ligand/receptor glycosylated specificity exchangers |
| US7335359B2 (en) * | 2003-02-06 | 2008-02-26 | Tripep Ab | Glycosylated specificity exchangers |
| WO2004091510A2 (en) * | 2003-04-11 | 2004-10-28 | Medimmune, Inc. | Recombinant il-9 antibodies and uses thereof |
| JP2007523839A (ja) * | 2003-04-18 | 2007-08-23 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | 血管新生性障害の治療法 |
| JP2007525187A (ja) * | 2003-05-16 | 2007-09-06 | レセプター・バイオロジクス・インコーポレイテッド | イントロン融合タンパク質、ならびにその同定方法および使用方法 |
| US7605235B2 (en) | 2003-05-30 | 2009-10-20 | Centocor, Inc. | Anti-tissue factor antibodies and compositions |
| BRPI0410875A (pt) * | 2003-05-30 | 2006-07-04 | Centocor Inc | método de inibição do crescimento de tumor com anticorpos de fator antitecido |
| US9708410B2 (en) | 2003-05-30 | 2017-07-18 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-tissue factor antibodies and compositions |
| US20050170455A1 (en) * | 2003-06-20 | 2005-08-04 | Qun-Yong Zhou | Novel prokineticin receptor isoforms and methods of use |
| WO2005053683A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-06-16 | Duke University | A method of preventing or treating glaucoma |
| ES2410587T3 (es) | 2004-01-22 | 2013-07-02 | University Of Miami | Formulaciones tópicas de coenzima Q10 y métodos de uso |
| US7271245B2 (en) * | 2004-02-13 | 2007-09-18 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions for inhibition of metastasis |
| US20050271650A1 (en) * | 2004-02-17 | 2005-12-08 | Cellmatrix, Inc. | Method and composition for angiogenesis inhibition |
| US7351739B2 (en) * | 2004-04-30 | 2008-04-01 | Wellgen, Inc. | Bioactive compounds and methods of uses thereof |
| US8187595B2 (en) | 2004-05-07 | 2012-05-29 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-I |
| WO2005117936A2 (en) * | 2004-05-07 | 2005-12-15 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Method for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-i |
| AU2005245896A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-01 | Receptor Biologix, Inc. | Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same |
| EP1765362B1 (en) | 2004-06-04 | 2012-03-28 | The Scripps Research Institute | Compositions and methods for treatment of neovascular diseases |
| EP1771565B1 (en) * | 2004-07-20 | 2012-09-05 | The Feinstein Institute for Medical Research | Rage protein derivatives |
| US20060029544A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-09 | The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer | Receptor-binding cyclic peptides and methods of use |
| US7659374B2 (en) * | 2004-08-16 | 2010-02-09 | Medimmune, Llc | Eph receptor Fc variants with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity |
| EP2422811A2 (en) | 2004-10-27 | 2012-02-29 | MedImmune, LLC | Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens |
| KR100679100B1 (ko) * | 2004-10-29 | 2007-02-06 | 엘지.필립스 엘시디 주식회사 | 수평 전계 인가형 액정 표시 패널 및 그 제조방법 |
| EP2364995A1 (en) * | 2004-12-23 | 2011-09-14 | Molmed SpA | Conjugation product |
| US20080317752A1 (en) * | 2005-04-18 | 2008-12-25 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Inhibition of Tumorigenesis by Inhibition of a6b4 Integrin |
| US20090170769A1 (en) * | 2005-05-13 | 2009-07-02 | Pei Jin | Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same |
| US20060286148A1 (en) * | 2005-05-18 | 2006-12-21 | Ppd, Inc. | Method of forming implants |
| WO2006138429A2 (en) | 2005-06-16 | 2006-12-28 | The Feinstein Institute For Medical Research | Antibodies against hmgb1 and fragments thereof |
| US20070110757A1 (en) | 2005-06-23 | 2007-05-17 | Ziping Wei | Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles |
| WO2007024921A2 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Cell Matrix | Combination therapies for inhibiting integrin-extracellular matrix interactions |
| ES2425396T3 (es) | 2006-01-18 | 2013-10-15 | Merck Patent Gmbh | Terapia específica usando ligandos de integrinas para el tratamiento del cáncer |
| US20090220463A1 (en) | 2006-01-19 | 2009-09-03 | Doo-Sik Kim | Pharmaceutical Composition For Treating Vascular-Related Diseases Comprising Peptide |
| AU2007257683A1 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-21 | Symphogen A/S | Pan-cell surface receptor- specific therapeutics |
| EP2043603A4 (en) | 2006-07-11 | 2010-10-27 | Arubor Corp | PREVENTION AND THERAPY OF RHINOSINUSITIS WITH PROINFLAMMATORY CYTOKINHERMERS |
| AU2007284690A1 (en) | 2006-08-10 | 2008-02-21 | Roy C. Levitt | Localized therapy of lower airways inflammatory disorders with proinflammatory cytokine inhibitors |
| WO2008045252A2 (en) * | 2006-10-04 | 2008-04-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Engineered integrin binding peptides |
| DK2101805T3 (da) | 2007-01-18 | 2013-01-21 | Merck Patent Gmbh | Integrinligander til anvendelse i behandling af cancer |
| DK2025685T3 (da) * | 2007-08-15 | 2013-09-02 | Canadian Blood Services | Monoklonale antistoffer mod BETA3-integriner. |
| EP2205629A2 (en) * | 2007-10-16 | 2010-07-14 | Symphogen A/S | Compositions comprising optimized her1 and her3 multimers and methods of use thereof |
| KR20100102110A (ko) | 2007-11-09 | 2010-09-20 | 페레그린 파마수티컬즈, 인크 | 항-ｖｅｇｆ 항체 조성물 및 방법 |
| US8258111B2 (en) | 2008-05-08 | 2012-09-04 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis |
| CA2737146A1 (en) | 2008-07-25 | 2010-01-28 | The Regents Of The University Of Colorado | Clip inhibitors and methods of modulating immune function |
| EP2352817B1 (en) | 2008-10-31 | 2016-01-27 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Olfactory epithelial-derived stem cells and methods of use therefor |
| EP2374002A1 (en) | 2008-12-23 | 2011-10-12 | GE Healthcare UK Limited | Application of 99mtc peptide-based compound as a bone marrow imaging agent |
| US8518927B2 (en) | 2009-02-10 | 2013-08-27 | The Scripps Research Institute | Chemically programmed vaccination |
| JP2012528079A (ja) | 2009-05-25 | 2012-11-12 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 癌を治療するためのインテグリンリガンドの連続投与 |
| FR2949782B1 (fr) * | 2009-09-04 | 2015-10-16 | Isp Investments Inc | Peptide activateur de la transglutaminase et composition cosmetique ou pharmaceutique le contenant. |
| US8778888B2 (en) * | 2009-11-06 | 2014-07-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cystine knot peptides binding to alpha IIb beta 3 integrins and methods of use |
| CN103153328A (zh) | 2010-07-16 | 2013-06-12 | 默克专利股份有限公司 | 肽在乳腺癌和/或骨转移灶的治疗中的用途 |
| PL2672994T3 (pl) | 2011-02-11 | 2018-11-30 | Merck Patent Gmbh | Przeciwciało przeciwko integrynie alfa-v do leczenia raka prostaty |
| US8722044B2 (en) | 2011-03-15 | 2014-05-13 | Janssen Biotech, Inc. | Human tissue factor antibody and uses thereof |
| RU2531502C2 (ru) * | 2011-08-09 | 2014-10-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани |
| RU2481115C1 (ru) * | 2011-10-13 | 2013-05-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Объединение "Тюменькриобанк" | Средство для заживления ран "целльгель", способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством |
| US9775803B2 (en) | 2011-10-19 | 2017-10-03 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Liposome comprising elastin-like polypeptide and tumor cell targeting material and use thereof |
| US20140350087A9 (en) | 2012-03-22 | 2014-11-27 | Halozyme, Inc. | Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use |
| TWI580692B (zh) * | 2012-06-07 | 2017-05-01 | 國立成功大學 | 經修飾纖維黏連蛋白片段或變體及其用途 |
| WO2014036385A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor 1 (igf-1) |
| WO2014063012A1 (en) | 2012-10-19 | 2014-04-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Conjugated knottin mini-proteins containing non-natural amino acids |
| WO2014087429A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Council Of Scientific & Industrial Research | Histidinylated cationic amphiphiles, process for preparation thereof and their liposomal formulation |
| US9921224B2 (en) * | 2013-03-14 | 2018-03-20 | Children's Medical Center Corporation | Use of CD36 to identify cancer subjects for treatment |
| JP7034914B2 (ja) | 2015-11-23 | 2022-03-14 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 線維症および／または線維性疾患の治療のための抗α－ｖインテグリン抗体 |
| US10786471B2 (en) | 2017-02-06 | 2020-09-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to glutaminase inhibitors |
| KR102630070B1 (ko) | 2017-03-31 | 2024-01-26 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 알파-v 베타-3-양성인 암 줄기 세포(csc)를 표적화하여 사멸시키고 약물 내성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 |
| KR102171433B1 (ko) * | 2018-05-25 | 2020-11-02 | 고려대학교 산학협력단 | 조직 재생을 위한 Substance P 펩타이드가 고정된 피브린 젤 및 이의 제조방법 |
| EP3916014A4 (en) * | 2019-07-24 | 2022-10-26 | Korea Basic Science Institute | SINGLE DOMAIN ANTIBODIES TARGETED AGAINST AVSS3 INTEGRIN |
| AU2020324391A1 (en) * | 2019-08-02 | 2022-01-20 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3 -positive cancer stem cells (CSCS) and treating drug resistant and metastatic cancers |
| KR20230078657A (ko) | 2020-08-27 | 2023-06-02 | 에노시 테라퓨틱스 코퍼레이션 | 자가면역 질환 및 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5092885A (en) * | 1987-02-12 | 1992-03-03 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Peptides with laminin activity |
| JPH02502156A (ja) * | 1987-11-19 | 1990-07-19 | スクリップス クリニック アンド リサーチ ファウンデーション | 内皮細胞のｒｇｄ指向粘着レセプターに対するモノクローナル抗体 |
| JPH01169343A (ja) | 1987-12-25 | 1989-07-04 | Nippon Sheet Glass Co Ltd | ガラス板の切口欠点検出装置 |
| US5135919A (en) | 1988-01-19 | 1992-08-04 | Children's Medical Center Corporation | Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis |
| DE68910113T2 (de) * | 1988-01-19 | 1994-03-17 | Childrens Hospital Corp | Wachstuminhibierendes mittel und dessen verwendung. |
| US5575815A (en) | 1988-08-24 | 1996-11-19 | Endoluminal Therapeutics, Inc. | Local polymeric gel therapy |
| IE901736L (en) * | 1989-05-17 | 1990-11-17 | Fuller H B Licensing Financ | Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion |
| US5686566A (en) | 1989-06-16 | 1997-11-11 | Cor Therapeutics, Inc. | Platelet aggregation inhibitors |
| US5112946A (en) * | 1989-07-06 | 1992-05-12 | Repligen Corporation | Modified pf4 compositions and methods of use |
| US5262520A (en) * | 1989-12-01 | 1993-11-16 | The Scripps Research Institute | Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding |
| US5192744A (en) * | 1990-01-12 | 1993-03-09 | Northwestern University | Method of inhibiting angiogenesis of tumors |
| EP0470569B1 (en) * | 1990-08-08 | 1995-11-22 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Intravascular embolizing agent containing angiogenesis inhibiting substance |
| CA2048078A1 (en) * | 1990-11-15 | 1992-05-16 | Wolfgang A. Wrasidlo | Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates |
| LU91067I2 (fr) * | 1991-06-14 | 2004-04-02 | Genentech Inc | Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines |
| JP3353209B2 (ja) | 1992-04-03 | 2002-12-03 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | αｖβ３インテグリンに対する抗体 |
| SK57693A3 (en) * | 1992-06-18 | 1994-07-06 | Merck Patent Gmbh | Linear peptides and pharmaceutical agents on their base |
| UA43823C2 (uk) | 1992-07-06 | 2002-01-15 | Мерк Патент Геселлшафт Міт Бесшренктер Хафтунг | ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ІНГІБУВАННЯ ІНТЕГРИН <font face="Symbol">a</font><sub>V</sub><font face="Symbol">b</font><sub>3</sub>-ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ КЛІТИННОЇ АДГЕЗІЇ КЛІТИН ССАВЦІВ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ЗАХВОРЮВАННЯ, АСОЦІЙОВАНОГО З ПОРУШЕННЯМ АДГЕЗІЇ КЛІТИН, СПОСІБ БЛОКУВАННЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ ФІБРИНОГЕНОМ ІНТЕГРИНУ, КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ЗАГОЄННЯ РАН |
| ATE250138T1 (de) | 1992-10-29 | 2003-10-15 | Univ Australian | Angiogenese-inhibierende antikörper |
| WO1994018221A1 (en) * | 1993-02-02 | 1994-08-18 | The Scripps Research Institute | Methods for producing polypeptide binding sites |
| DE4310643A1 (de) | 1993-04-01 | 1994-10-06 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Adhäsionsinhibitoren |
| WO1995012412A1 (en) † | 1993-11-05 | 1995-05-11 | Centocor, Inc. | Platelet-specific chimeric immunoglobulin and methods of use therefor |
| US5981478A (en) | 1993-11-24 | 1999-11-09 | La Jolla Cancer Research Foundation | Integrin-binding peptides |
| US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| US5770565A (en) | 1994-04-13 | 1998-06-23 | La Jolla Cancer Research Center | Peptides for reducing or inhibiting bone resorption |
| DE19534177A1 (de) | 1995-09-15 | 1997-03-20 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Adhäsionsinhibitoren |
| DE19538741A1 (de) | 1995-10-18 | 1997-04-24 | Merck Patent Gmbh | Cyclopeptidderivate |
-
1994
- 1994-03-18 US US08/210,715 patent/US5753230A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-30 US US08/366,665 patent/US5766591A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-09 ES ES95913644T patent/ES2211901T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 CA CA2184493A patent/CA2184493C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-09 KR KR1019960705163A patent/KR100327081B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 DK DK95913644.1T patent/DK0754059T4/da active
- 1995-03-09 CZ CZ19962711A patent/CZ294650B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 AU AU19952/95A patent/AU709645B2/en not_active Expired
- 1995-03-09 SI SI9530699T patent/SI0754059T2/sl unknown
- 1995-03-09 DK DK03078802.0T patent/DK1468695T3/da active
- 1995-03-09 DE DE69536128T patent/DE69536128D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 UA UA96093689A patent/UA44729C2/uk unknown
- 1995-03-09 MX MX9604145A patent/MX9604145A/es active IP Right Grant
- 1995-03-09 EP EP95913644A patent/EP0754059B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 WO PCT/US1995/003035 patent/WO1995025543A1/en active IP Right Grant
- 1995-03-09 EP EP03078802A patent/EP1468695B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 PT PT03078802T patent/PT1468695E/pt unknown
- 1995-03-09 ES ES03077708T patent/ES2355074T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 NZ NZ511293A patent/NZ511293A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 NZ NZ283022A patent/NZ283022A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 AT AT03077708T patent/ATE490784T1/de active
- 1995-03-09 DE DE69532279T patent/DE69532279T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 AT AT03078802T patent/ATE534403T1/de active
- 1995-03-09 PT PT95913644T patent/PT754059E/pt unknown
- 1995-03-09 SK SK1190-96A patent/SK284586B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 JP JP52467595A patent/JP4268222B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 DK DK03077708.0T patent/DK1410807T3/da active
- 1995-03-09 ES ES03078802T patent/ES2376850T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 HU HU9602541A patent/HU221988B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 AT AT95913644T patent/ATE255907T1/de active
- 1995-03-09 EP EP03077708A patent/EP1410807B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 RU RU96120204/14A patent/RU2162712C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 NZ NZ548433A patent/NZ548433A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 CN CNB951931334A patent/CN1161152C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-17 ZA ZA952214A patent/ZA952214B/xx unknown
-
1996
- 1996-09-17 NO NO19963894A patent/NO322441B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-09-18 FI FI963692A patent/FI121916B/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-05-19 US US09/081,522 patent/US6887473B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-24 HK HK98115348A patent/HK1013960A1/ not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-07-15 US US10/892,789 patent/US7354586B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-15 US US10/892,653 patent/US7329406B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-15 US US10/892,745 patent/US7482007B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-05-22 JP JP2006142020A patent/JP4758281B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-10-30 US US11/980,211 patent/US7595051B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI121916B (fi) | Menetelmiä ja koostumuksia, jotka ovat käyttökelpoisia angiogeneesin inhibointiin | |
| US6500924B1 (en) | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis | |
| JP4903921B2 (ja) | αＶβ５仲介血管形成の阻止に有効な方法及び組成物 | |
| CA2256588A1 (en) | Methods and compositions useful for inhibition of .alpha.v.beta.5 mediated angiogenesis | |
| US7053041B1 (en) | Methods and compositions useful for inhibition of αvβ5mediated angiogenesis | |
| US20030176334A1 (en) | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 121916 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |