NO322441B1 - Anvendelse av en alfa-v-beta-3-antagonist ved fremstilling av et medikament for behandling av artritt, diabetisk retinopati, makulos degenerering, retenose, hemangiom eller en fast tumor ved inhibering av angionese. - Google Patents

Description

Teknisk, område

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av en avfi3-antagonist ved fremstilling av et medikament for behandling av artritt, diabetisk retinopati, makuløs degenerering, restenose, hemangiom eller en fast tumor ved inhibering av angiogenese.

Oppfinnelsens bakgrunn

Integriner er en klasse av cellulære reseptorer som binder ekstracellulære matriksproteiner og følgelig formidler celle-celle- og celle-ekstracellulære matriksinteraksjoner, generelt betegnet celleadhesjonsbegivenheter. Selv om mange integriner og ligandene som bindes til et integrin er beskrevet i litteraturen, forblir imidlertid den biologiske funksjon av mange av integrinene uklar. Integrinreseptorene utgjør en familie av proteiner som deler den strukturelle egenskap at de er ikke-kovalente, heterodimere glykoproteinkomplekser dannet av a- og p"-subenheter.

Vitronektinreseptoren, som har fått navn etter sin først oppdagede egenskap, preferensiell binding til vitronektin, vites nå å være tre forskjellige integriner betegnet avPi, avp3 og avp5, Horton, Int. J. Exp. Pathol. , 71:741-759

(1990). av£i binder fibronektin og vitronektin. avP3 binder flere forskjellige ligander, heriblant fibrin, fibrinogen, laminin, trombospondin, vitronektin, von Willebrand-faktor, osteospontin og cialoprotein I fra ben. avPs binder vitronektin. De spesifikke celleadhesjonsroller som disse tre integriner har i de mange cellulære interaksjoner i vev, er fortsatt gjenstand for undersøkelser, men det er klart at de er forskjellige integriner med forskjellige biologiske funk-sjoner.

Ett viktig gjenkjenningssete i liganden for mange integriner er tripeptidsekvensen arginin-glysin-asparaginsyre (RGD). RGD finnes i alle ligandene nevnt ovenfor for vitro-nektinreseptorintegrinene. Dette RGD-gjenkjenningssetet kan etterlignes av polypeptider ("peptider") som inneholder RGD-sekvensen, og slike RGD-peptider er kjente inhibitorer av integrinfunksjon. Det er imidlertid viktig å merke seg at avhengig av sekvensen og strukturen av RGD-peptidet kan spesifisiteten av inhiberingen endres, slik at den rettes mot spesifikke integriner.

For diskusjoner om RGD-gjenkjenningssetet, se Pierschbacher et al., Nature, 305:30-33 (1984), og Pierschbacher et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:5985-5988

(1984) . Forskjellige RGD-polypeptider med varierende integrin-spesifisitet er også beskrevet av Grant et al., Cell, 58:933-943 (1989), Cheresh et al., Cell, 58:945-953 (1989), Aumailley et al., FEBS Letts., 251:50-54 (1991), og Pfaff et al., J. Biol. Chem., 255:20233-20238 (1994), og i US patentskrifter nr. 4 517 686, 4 578 079, 4 589 881, 4 614 517, 4 661 111, 4 792 525, 4 683 291, 4 879 237, 4 988 621, 5 041 380 og 5 061 693. Angiogenese er en vevsvaskulariseringsprosess som omfatter vekst av nyutviklende blodkar inn i et vev, og betegnes også som neovaskularisering. Prosessen formidles ved infiltrasjon av endotelceller og glatte muskelceller. Prosessen antas å forløpe på tre forskjellige måter: Blodkarene kan forgrene seg fra allerede eksisterende kar, denovoutvikling av blodkar kan oppstå fra forløperceller (vaskulogenese), eller eksisterende små blodkar kan utvides i diameter, Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990). Vaskulære endotelceller vites å inneholde minst fem RGD-avhengige integriner, heriblant vitronektinreseptoren (avp\3 eller avp5) , kollagen type I- og IV-reseptor (aip^) , lamininreseptoren (a2fJi) ,• fibronektin/laminin/kollagenreseptoren (03^1) og fibronektinresep-toren (a5Pi) , Davis et al., J. Cell. Biochem., 51:206-218

(1993) . Glatte muskelceller vites å inneholde minst seks RGD-avhengige integriner, heriblant a5Pi, avp3 og avpV

Angiogenese er en viktig prosess i neonatal vekst, men er også viktig i sårheling og i patogenesen til et stort antall kliniske sykdommer, heriblant vevsinflammasjon, artritt, tumorvekst, diabetisk retinopati, makeldegenerering ved neovaskularisering av retina og lignende tilstander. Disse kliniske manifestasjoner forbundet med angiogenese betegnes angiogenetiske sykdommer, Folkman et al., Science, 235:442-447

(1987). Angiogenese forekommer generelt ikke i voksent eller modent vev, selv om det forekommer ved sårheling og i corpus luteums vekstsyklus. Se f.eks. Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990).

Det er foreslått at inhibering av angiogenese kan være en nyttig terapi for å begrense tumorvekst. Inhibering av angiogenese er foreslått oppnådd ved (1) inhibering av fri-gjøring av "angiogene molekyler" som £FGF (fibroblastvekstfaktor), (2) nøytralisering av angiogene molekyler, f.eks. ved å benytte anti-pFGF-antistoffer, og (3) inhibering av endotel-cellerespons på angiogene stimuli. Denne siste strategi har blitt viet oppmerksomhet, og Folkman et al., Cancer Biology, 3:89-96 (1992), har beskrevet flere inhibitorer av endotel-cellerespons, heriblant kollagenaseinhibitor, inhibitorer av basalmembran-turnover, angiostatiske steroider, soppavledete angiogeneseinhibitorer, blodplatefaktor 4, trombospondin, artrittmedikamenter som D-penicillamin og gulltiomalat, vita-min D3-analoger, a-interferon og lignende, som kan benyttes for inhibering av angiogenese. For flere foreslåtte inhibitorer av angiogenesen, se Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410

(1990), Ingber et al., Lab. Invest., 55:44-51 (1988), og

US patentskrifter nr. 5 092 885, 5 112 946, 5 192 744 og 5 202 352. Ingen av angiogeneseinhibitorene beskrevet i referansene ovenfor er rettet mot inhibering av avP3.

NIP J. et al., Journal of Clinical Investigation, bind 90, oktober 1992, s. 1406-1413, beskriver at LM609 immunoreagerer med avf}3 og inhiberer binding av en cellelinje til lymfeknute områder og vitronektinbelagte disker.

EP 0 578 083 A (Merck) beskriver en serie av RGD-peptider.

Nicosia R. F. and E. Bonanno, American Journal of Pathology, bind. 138, 1991, s. 829-833, beskriver in vi tro-anvendelse av et RGD-peptid.

Lafrenie R. M. et al., Cancer Research, bind 52, 15. april 1992,s. 2202-2208, beskriver bindingen av humane lungekarsinomceller A54 9 til monolag av dyrkede humane navlestrengendotelceller.

Caoi et al., januar 1994, Journal of vascular surgery, 19, s. 125-134, beskriver inhibering av neointimal hyperplasi ved blokering av avp3 med en peptidantagonist.

Folkman and Klagsburn, 1987, Science, 235, s. 442-447, diskuterer angiogene faktorer.

EP 1 334 730 A2 beskriver et blodplatespesefikt kimært immunoglobulin for forebyggelse av

blodplateaggregering.

RGD-holdige peptider som inhiberer vitronektinreseptoren av{J3, er også beskrevet, Aumailley et al., FEBS Letts., 291:50-54 (1991), Choi et al., J. Vase. Surg., 15:125-134

(1994), Smith et al., J. Biol. Chem., 255:12267-12271 (1990), og Pfaff et al., J. Biol. Chem., 255:20233-20238 (1994). Imidlertid har det aldri blitt foreslått eller identifisert en rolle for integrin avp3 i angiogenesen inntil foreliggende oppfinnelse .

Inhibering av celleadhesjon in vi tro ved bruk av monoklonale antistoffer som er immunspesifikke for forskjellige integrin-a- eller -p-subenheter, har antydet en rolle for avp3 i celleadhesjon av en rekke celletyper, heriblant mikro-vaskulære endotelceller, Davis et al., J. Cell. Biol., 51:206-218 (1993). I tillegg beskrev Nicosia et al., Am. J. Pathol., 138:829-833 (1991), bruk av RGD-peptidet GRGDS for in vitro-inhibering av dannelsen av "mikroblodkar" fra rotteaorta dyrket i kollagengel. Imidlertid er inhibering av dannelse av "mikroblodkar" in vitro i kollagengelkulturer ingen modell for angiogeneseinhibering i et vev, siden det ikke er vist at mikroblodkarstrukturene er de samme som kapillærforgreninger, eller at dannelsen av mikroblodkarene i kollagengelkultur er det samme som neovaskulær vekst i et intakt vev, f.eks. artrittvev, tumorvev eller sykt vev hvor inhibering av angiogenese er ønskelig.

Bortsett fra undersøkelsene som beskrives her, vet følgelig søkerne ikke om andre påvisninger av at angiogenese kan inhiberes i et vev ved å benytte celleadhesjonsinhibi-torer. Spesielt har det aldri tidligere vært vist at avf33-funksjon kreves for angiogenese i et vev, eller at avp3-antagonister kan inhibere angiogenese i et vev.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av en avJ33-antagonist ved fremstilling av et medikament for behandling av artritt, diabetisk retinopati, makuløs degenerering, restenose, hemangiom eller en fast tumor ved inhibering av angiogenese, hvori antagonisten omfatter en angiogeneseinhiberende mengde av et RGD-inneholdende polypeptid.

Beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse viser at angiogenese i vev krever integrin-av{33, og at inhibitorer av avp3 kan inhibere angiogenese. Beskrivelsen viser også at antagonister av andre integriner, f.eks. avp5 eller avPi, ikke inhiberer angiogenesen, formodentlig fordi disse andre integriner ikke er essensielle for at angiogenesen skal skje.

Det beskrives derfor fremgangsmåter for inhibering av angiogenese i et vev som omfatter tilførsel til vevet av et preparat som omfatter en angiogeneseinhiberende mengde av en avP3-antagonist.

Vevet som skal behandles, kan være ethvert vev i hvilket inhibering av angiogenese er ønskelig, f.eks. sykt vev hvor neovaskularisering forekommer. Eksempler på vev omfatter betent vev, faste tumorer, metastaser, vev som gjennomgår restenose og tilsvarende vev.

En 0^3-antagonist for anvendelse i de her beskrevne fremgangsmåter kan bindes til avP3 og kompetitivt inhibere evnen til av£3 til å bindes til en naturlig ligand. Fortrinnsvis viser antagonisten spesifisitet for avp3 fremfor andre integriner. I en spesielt foretrukket utførelse inhiberer av£3-antagonisten binding av fibrinogen eller andre RGD-holdige ligander til av£3, uten i vesentlig grad å inhibere binding av fibronektin til anbp3. En foretrukket avp3-antagonist kan være et polypeptid eller et monoklonalt antistoff, eller et funksjonelt fragment av dette som immunreagerer med avP3 •

Kort beskrivelse av figurene

Figurene utgjør en del av denne beskrivelse. Figurene IA-ID viser vevsfordelingen av integrinsubenhetene p3 og Pi i normal hud og i hud som gjennomgår sårheling, betegnet granulasjonsvev. Immunhistokjemi med antistoffer mot p3 og Pi ble utført som beskrevet i eksempel 3A. Figurene IA og IB viser immunreaktiviteten av anti-p3 i normal hud henholdsvis granulasjonsvev. Figurene 1C og ID viser immunreaktiviteten av anti-px i normal hud henholdsvis granulasjonsvev. Figurene 2A-2D viser vevsfordelingen av ligandene von Willebrand-faktor og laminin, som bindes til p3- henholdsvis Pi-integrinsubenhetene i normal hud og i hud som gjennomgår sårheling, betegnet granulasjonsvev. Immunhistokjemi med antistoffer mot von Willebrand-faktor (anti-vWF) og laminin (antilaminin) ble utført som beskrevet i eksempel 3B. Figurene 2A og 2B viser immunreaktiviteten av anti-vWF i normal hud henholdsvis granulasjonsvev. Figurene 2C og 2D viser immunreaktiviteten av antilaminin i normal hud henholdsvis granulasjonsvev. Figurene 3A-3D viser vevsfordelingen av vitronektin-integrinreseptoren avp3 i vevsbiopsier fra blærecancer, colon-cancer, brystcancer henholdsvis lungecancer. Immunhistokjemi med antistoffet LM609 rettet mot avp3 ble utført som beskrevet i eksempel 3C. Figur 4 viser et typisk mikrofotografi av et CAM ifølge foreliggende oppfinnelse, fritt for blodkar i et ubehandlet, 10 dager gammelt kyllingembryo. Fremstillingen er beskrevet i eksempel 5B. Figurene 5A-5C viser vevsfordelingen av integrinene Pi og avp3 i CAM-preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 5A viser fordelingen av Po.-subenheten i et ubehandlet, 10 dager gammelt CAM-preparat, påvist ved immunfluorescens-immunreaktivitet med CSAT, et anti-Pi-antistof f. Figur 5B viser fordelingen av avp3-reseptoren i et ubehandlet, 10 dager gammelt CAM-preparat, påvist ved immunfluorescensimmunreakti-vitet med LM609, et anti-avp3-antistoff. Figur 5C viser fordelingen av avp3-reseptoren i et pFGF-behandlet, 10 dager gammelt CAM-preparat, påvist ved immunfluorescensimmunreakti-vitet med LM609, et anti-avp3-antistoff. Behandling og resultater er beskrevet i eksempel 5C. Figur 6 viser i et søylediagram kvantitering av den relative ekspresjon av avJ33 og Pi i ubehandlede og £FGF-behandlede, 10 dager gamle CAM, som beskrevet i eksempel 6A. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet er plottet på Y-aksen, med integrinprofilene plottet på X-aksen.

Figurene 7A-7C viser utseendet av et ubehandlet,

10 dager gammelt CAM, et pFGF-behandlet CAM henholdsvis et TNFa-behandlet CAM, hvor fremgangsmåter og resultater er beskrevet i eksempel 6A. Figurene 8A-8E viser virkningen av topisk antistoffbehandling av FGF-indusert angiogenese i et CAM ved dag 10, som beskrevet i eksempel 7A1). Figur 8A viser et ubehandlet CAM-preparat som er uten blodkar. Figur 8B viser infiltrasjon av nye kar i et område som tidligere var uten blodkar, indusert ved pFGF-behandling. Figurene 8C, 8D og 8E viser virkningen av antistoffer mot p\ (anti-Pi, CSAT) , avp5 (anti-avp5, P3G2) henholdsvis avp3 (anti-avp3, LM609) . Figurene 9A-9C viser virkningen av intravenøs injeksjon av det syntetiske peptid 662 03 på tumorindusert angiogenese, som beskrevet i eksempel 7D2). Figur 9A viser manglende inhibitorisk virkning av intravenøs behandling med et kontrollpeptid (kontrollpeptidtumor) på angiogenese som følge av tumorinduksjon. Inhibering av slik angiogenese ved intravenøs injeksjon av peptid 66203 (syklisk RGD-tumor) er vist i figur 9B. Fravær av inhibitoriske virkninger eller cytotoksisitet på modne, allerede eksisterende blodkar etter intravenøs infusjon av peptid 66203 i et område som grenset opp til det tumorbehandlede området, er vist i figur 9C (syklisk RGD-nærliggende CAM). Figurene 10A-10C viser virkningen av intravenøs til-førsel av monoklonale antistoffer på vekstfaktorindusert angiogenese, som beskrevet i eksempel 7B1). Figur 10A viser pFGF-indusert angiogenese ikke utsatt for antistoffbehandling (kontroll). Ingen inhibering av angiogenese var resultatet når et tilsvarende preparat ble behandlet med anti-avf3s-antistoff P3G2, som vist i figur 10B. Inhibering av angiogenese var resultatet av behandling med anti-avp3-antistoff LM609, som vist i figur 10C. Figurene 11A-11C viser virkningen på embryonal angiogenese etter topisk tilføring av antiintegrinantistoffer, som beskrevet i eksempel 7C. Angiogenesen ble ikke inhibert ved behandling av en 6 dagers CAM med anti-Øi- og ant i- avPs- antistoffer, vist i figur 11A henholdsvis 11B. I motsetning til dette førte behandling med anti-dvp^-antistoffet LM609 til inhibering av blodkardannelse, som vist i figur 11C. Figur 12 viser kvantitering av antall blodkar som går inn i en tumor i et CAM-preparat, som beskrevet i eksempel 7D1). Kurven viser antall blodkar plottet på Y-aksen, som et resultat av topisk tilførsel av enten CSAT (anti-^i) , LM609 (anti-avP3) eller P3G2 (anti-av£5) . Figurene 13A-13D viser en sammenligning mellom våt-tumorvekt 7 dager etter behandling og opprinnelig tumorvekt, som beskrevet i eksempel 9Al)a. Hver søyle representerer middelverdi ± standardfeil for 5-10 tumorer pr. gruppe. Tumorene var avledet fra humant melanom (M21-L) (figur 13A), pankreaskarsinom (Fg) (figur 13B), lungekarsinom (UCLAP-3) (figur 13C) og larynkskarsinom(HEp3)-CAM-preparater (figur 13D), behandlet intravenøst med PBS, CSAT (anti-Pi) eller LM609 (anti-avp3) . Kurvene viser tumorvekt plottet på Y-aksen som en følge av intravenøs tilførsel av enten CSAT (anti-Pi) , LM609 (anti-avP3) eller PBS, som angitt på X-aksen. Figurene 14A og 14B viser histologiske seksjoner av tumorer behandlet med P3G2 (anti-av£5) (figur 14A) og LM609 (anti-o-vp^) (figur 14B) , farget med hematoksylin og eosin, som beskrevet i eksempel 9Al)a. Som vist i figur 14A, viste tumorer behandlet med kontrollantistoff (P3G2) flere levedyktige tumorceller i aktiv deling, noe som vises av mitosefigurer (pilhoder) så vel som flere blodkar (piler) gjennom tumorstroma. I motsetning til dette kunne få, om noen, levedyktige tumorceller eller blodkar påvises i tumorer behandlet med LM609 (anti-avp3) i figur 14B. Figurene 15A-15E tilsvarer M21-L-tumorer behandlet med peptider, som beskrevet i eksempel 9Al)b, på følgende måte: figur 15A: syklisk RAD-peptid som kontroll (69601); figur 15B: syklisk RGD-peptid (66203); figur 15C: nærliggende CAM-vev tatt fra de samme embryoer behandlet med syklisk RGD-peptid (66203), og høy forstørrelse (13 x) av tumorer behandlet med RAD-peptidkontrollen (69601) i figur 15D eller syklisk RGD-peptid (662 03) i figur 15E. Figur 15D viser normale blod-kar fra tumor behandlet med RAD-peptidkontrollen (69601). Figur 15E viser eksempler på sammenbrutte blodkar fra tumorer behandlet med syklisk RGD-peptid (66203) (piler). Figurene 16A-16E viser angiogeneseinhibering av angiogeneseantagonister i in vivo-kaninøyemodellanalysen, som beskrevet i eksempel 10. Figurene 16A og 16B viser angiogenese i kaninøyet i nærvær av {3FGF og mAb P1F6 (anti-avPs) . Figurene 16C, 16D og 16E viser angiogeneseinhibering i kaninøyet i nærvær av {3FGF. og mAb LM609 (anti-avJ33) . Figur 17 viser et flytdiagram over hvordan in vivo-modellen med mus:human kimær mus ble dannet, som beskrevet i eksempel 11A. Et stykke hud fra en SCID-mus ble erstattet med human neonatal forhud og gitt 4 ukers grotid. Etter heling av transplantatet ble den humane forhud inokulert med humane tumorceller. I løpet av de påfølgende 4 uker ble en målbar tumor etablert, som bestod av en human tumor med human blodkardannelse som vokste ut fra den humane hud inn i den humane tumor. Figur 18 viser prosent enkeltceller avledet fra mAb-behandlede og peptidbehandlede CAM farget med Apop-Tag, bestemt ved FACS-analyse og beskrevet i eksempel 12A henholdsvis 12B. Skraverte og prikkede søyler representerer celler fra embryoer behandlet 24 timer henholdsvis 48 timer før analysen. Hver søyle representerer middelverdi ± standardfeil for tre paralleller. CAM-er ble behandlet med mAb LM609 (anti-av£3) , CSAT (anti-Pi) eller PBS, som beskrevet i eksempel 12A2). CAM-er ble også behandlet med syklisk peptid 69203 (syklo-RGDfv, betegnet som peptid 203) eller det sykliske kontrollpeptid 69601 (syklo-RADfv, betegnet som peptid 601), som beskrevet i eksempel 12B. Figurene 19A og 19B viser de kombinerte resultater fra enkeltcellesuspensjoner av CAM fra embryoer behandlet med enten CSAT (anti-Pi) (figur 19A) eller LM609 (anti-avp3) (figur 19B), farget med Apop-Tag og propidiumjodid og analysert ved FACS, som beskrevet i eksempel 12C. Y-aksen viser antall celler farget med Apop-Tag (apoptose), X-aksen viser propi-diumjodidfargingen (DNA-innhold). Den horisontale linje representerer nivået for negativ Apop-Tag-farging. Venstre og høyre felt viser CAM-celler fra CSAT (anti-px)-behandlede embryoer (figur 19A) henholdsvis LM609 (anti-avp3)-behandlede embryoer (figur 19B). Cellesyklusanalyse ble utført ved analyse av tilnærmet 8000 begivenheter pr. betingelse. Figurene 20A-20C viser CAM-vev fra CSAT (anti-^i) - behandlede embryoer, og figurene 20D-20F viser CAM-vev fra LM609(anti-avp3)-behandlede embryoer, fremstilt som beskrevet i eksempel 12C. Figurene 2OA og 2OD viser vev farget med Apop-Tag og synliggjort ved fluorescens (FITC) overlagt et D.I.C.-bilde. Figurene 20B og 20E viser de samme vev farget med mAb-LM609 (anti-avp3) visualisert ved fluorescens (rhodamin). Figurene 2 0C og 2OF viser kombinasjonsbilder av de samme vev farget med både Apop-Tag og LM609, hvor gul farge viser kolokalisering. Søylen representerer 15 og 50 um i venstre henholdsvis høyre felt.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

A. Definisjoner

Aminosyrerest: en aminosyre dannet ved kjemisk kløyving (hydrolyse) av et polypeptid i sine peptidbindinger. Aminosyrerestene som beskrives heri, er fortrinnsvis i den isomere "L"-form. Imidlertid kan aminosyrerester i den isomere "D"-form substitueres for enhver L-aminosyrerest så lenge den ønskede funksjonelle egenskap bibeholdes av polypeptidet. NH2 viser til den frie aminogruppe som foreligger i et polypeptids aminoterminale ende. COOH viser til den frie karboksygruppe som foreligger ved et polypeptids karboksyterminale ende. I samsvar med standard polypeptidnomenklatur (beskrevet i J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), og tatt i bruk ved 37 CFR 1.822 (b) (2)), er forkortelsene for aminosyrerestene vist i følgende tabell:

Symbol

I tillegg har de følgende betydningene nedenfor:

Boe tert.-butyloksykarbonyl

DCCI disykloheksylkarbodiimid

DMF dimetylformamid

OMe metoksy

HOBt 1-hydroksybenzotriazol

Det bør bemerkes at alle aminosyrerestsekvenser angis her ved formler hvis venstre og høyre orientering er i den konvensjonelle retning fra aminoterminal til karboksyterminal ende. Videre bør det bemerkes at en bindestrek ved begynnelsen eller slutten av en aminosyrerestsekvens viser en peptid-binding til en videre sekvens av én eller flere aminosyrerester.

Polypeptid: viser til en lineær serie av aminosyrerester bundet til hverandre ved peptidbindinger mellom a-aminogruppen og karboksygruppen i naboaminosyrerester.

Peptid: som benyttet heri, viser til en lineær serie med ikke mer enn tilnærmet 50 aminosyrerester koblet til hverandre som i et polypeptid.

Syklisk peptid: er avledet fra et tilsvarende lineært peptid og viser til et peptid i hvilket ingen fri N- eller C-terminal ende eksisterer, og i hvilket det tilsvarende lineære peptids N-terminale ende danner en amidbinding til den C-terminale karboksylatgruppe i det samme lineære peptid.

Protein: viser til en lineær serie med flere enn

50 aminosyrerester koblet til hverandre som i et polypeptid.

Syntetisk peptid: viser til en kjemisk fremstilt kjede av aminosyrerester koblet sammen ved peptidbindinger som er frie for naturlig forekommende proteiner og fragmenter av disse.

B. Generelle betraktninger

Foreliggende oppfinnelse gjelder generelt den oppdagelse at angiogenese formidles av den spesifikke vitronektinreseptor avP3, og at inhibering av avP3-funksjon inhiberer angiogenese. Denne oppdagelse er viktig på grunn av den rolle angiogenese spiller i en rekke sykdomsprosesser. Ved å inhibere angiogenesen kan en gripe inn i sykdommen, lette symptomene og i visse tilfeller helbrede sykdommen.

I de tilfeller hvor vekst av nye blodkar forårsaker eller bidrar til patologien forbundet med en sykdom, vil inhibering av angiogenese redusere sykdommens skadelige virkninger. Eksempler på dette omfatter reumatoid artritt, diabetisk retinopati, inflammatoriske sykdommer, restenose og lignende. I de tilfeller hvor vekst av nye blodkar kreves for å understøtte vekst av et skadelig vev, vil inhibering av angiogenese redusere blodtilførselen til vevet og således bidra til reduksjon av vevsmassen basert på blodtilførselen som kreves. Eksempler på dette omfatter tumorvekst, hvor neovaskularisering er et kontinuerlig behov for at tumoren skal vokse til en tykkelse på mer enn noen få millimeter, og for etablering av faste tumormetastaser.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er delvis effektive fordi terapien er svært selektiv for angiogenese og ingen andre biologiske prosesser. Som vist i eksemplene, inneholder bare nyutvokste blodkar vesentlige mengder av o.v£3, °9 de terapeutiske fremgangsmåter vil således ikke ha skadelige virkninger på modne blodkar. Videre har avf33 ingen bred fordeling i normale vev, men finnes snarere selektivt i nye blodkar, noe som sikrer at terapien kan selektivt rettes mot utvekst av nye blodkar.

Oppdagelsen at inhibering av av£3 alene effektivt vil inhibere angiogenese, tillater utvikling av terapeutiske preparater med potensielt høy spesifisitet, og følgelig relativt lav toksisitet. Selv om oppfinnelsen beskriver bruk av peptidbaserte reagenser med evne til å inhibere ett eller flere integriner, kan en følgelig utforme andre reagenser som mer selektivt inhiberer avP3/ og derfor ikke har den bivirkning at de inhiberer andre biologiske prosesser enn dem som formidles av avf33.

For eksempel er det, som vist i den foreliggende beskrivelse, mulig å fremstille monoklonale antistoffer som er svært selektive for immunreaksjon med avP3, og som er tilsvarende selektive for inhibering av av^ >3-funksjon. I tillegg kan RGD-holdige peptider utformes til å være selektive for inhibering av avP3, som beskrevet senere heri.

Forut for oppdagelsene ifølge foreliggende oppfinnelse var det ikke kjent at angiogenese og noen av prosessene som avhenger av angiogenese kunne inhiberes in vivo ved bruk av reagenser som antagoniserer den biologiske funksjon av 0^3.

C. Fremgangsmåter for inhibering av angiogenese

Det beskrives en fremgangsmåte for inhibering av angiogenese i et vev, og følgelig inhibering av begivenheter i vevet som avhenger av angiogenese. Generelt omfatter fremgangsmåten tilførsel til vevet av et preparat som omfatter en angiogeneseinhiberende mengde av en o^-antagonist.

Som beskrevet tidligere, omfatter angiogenesen en rekke prosesser, heriblant neovaskularisering av et vev, inn-befattet "forgrening", vaskulogenese eller karforstørrelse, hvor alle disse angiogeneseprosesser formidles av og er avhengige av ekspresjon av avp3. Bortsett fra traumatisk sårheling, corpus luteumdannelse og embryogenese antas det at de fleste angiogeneseprosesser er forbundet med sykdomsprosesser, og at anvendelse av de foreliggende terapeutiske fremgangsmåter således er selektive for sykdommen og ikke har skadelige bivirkninger.

Det er et stort antall sykdommer, betegnet angiogene sykdommer, hvor angiogenese antas å være viktig, heriblant, men ikke begrenset til, inflammatoriske sykdommer som immunologisk og ikke-immunologisk inflammasjon, kronisk leddreumatisme og psoriasis, forstyrrelser forbundet med uønsket eller ubeleilig invasjon av blodkar, f.eks. diabetisk retinopati, neovaskulært glaukom, restenose, kapillærproliferasjon i arteriosklerotiske plakk og osteoporose, og forstyrrelser forbundet med cancer, f.eks. faste tumorer, metastaser av faste tumorer, angiofibromer, retrolental fibroplasi, hemangiomer, Kaposis sarkom og tilsvarende cancere, som krever neovaskularisering for understøttelse av tumorvekst.

Således vil fremgangsmåter som inhiberer angiogenese i et sykt vev, lette sykdomssymptomene og, avhengig av sykdommen, kunne bidra til helbredelse av sykdommen. I én utførelse beskrives inhibering av angiogenese per se i et vev. Omfanget av angiogenese i et vev, og følgelig inhiberingsgraden som kan oppnås ved de beskrevne fremgangsmåter, kan evalueres ved en rekke fremgangsmåter, f.eks. dem beskrevet i eksemplene for påvisning av avp3-immunpositive, umodne og begynnende vevsstrukturer ved immunhistokjemi.

Som beskrevet heri, kan en rekke vev eller organer som består av organisert vev, understøtte angiogenese ved sykdommer, heriblant hud, muskel, tarm, bindevev, ledd, ben og tilsvarende vev som kan invaderes av blodkar som følge av angiogene stimuli.

Således er i én beslektet utførelse et vev som skal behandles, et inflammert vev, og angiogenesen som skal inhiberes, er angiogenese i inflammert vev, hvor det foregår neovaskularisering av det inflammerte vev. I denne klasse overveier fremgangsmåten inhibering av angiogenese i artrit-iske vev, f.eks. hos en pasient med kronisk leddreumatisme, i immunologisk eller ikke-immunologisk inflammert vev, i psori-atisk vev og lignende.

Pasienten som behandles er fortrinnsvis et menneske, selv om det må forstås at oppfinnelsens prinsipper antyder at oppfinnelsen er effektiv for alle pattedyr som er ment å omfattes av begrepet "pasient". I denne sammenheng er et pattedyr ment å omfatte enhver pattedyrart hvor behandling av sykdommer forbundet med angiogenese er ønskelig, særlig husdyr og pattedyr anvendt i jordbruk.

I en annen beslektet utførelse er vevet som skal behandles, retinavev hos en pasient med diabetisk retinopati, makeldegenerering eller neovaskulært glaukom, og angiogenesen som skal inhiberes, er angiogenese i retinavev hvor det foregår neovaskularisering av retinavevet.

I nok en beslektet utførelse er vevet som skal behandles, tumorvev hos en pasient med en fast tumor, en meta-stase, en hudcancer, en brystcancer, et hemangiom eller angio-fibrom og lignende cancer, og angiogenesen som skal inhiberes, er tumorvevsangiogenese hvor det foregår neovaskularisering av et tumorvev. Typiske faste tumorvev som kan behandles med de foreliggende fremgangsmåter, omfatter lunge, pankreas, bryst, colon, larynks, ovarier og lignende vev. Eksempler på tumorvevsangiogenese og inhibering av denne er beskrevet i eksemplene .

Inhibering av tumorvevsangiogenese er en spesielt foretrukket utførelse grunnet den viktige rolle neovaskularisering spiller i tumorvekst. I fravær av neovaskularisering av tumorvev vil tumorvevet ikke motta de nødvendige næringsstoffer, noe som fører til redusert vekst, opphør av ytterligere vekst, regresjon og endelig nekrose, noe som fører til at tumoren drepes.

Sagt med andre ord berskrives en fremgangsmåte for inhibering av tumorneovaskularisering ved inhibering av tumorangiogenese ifølge foreliggende fremgangsmåter. På lignende vis tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for inhibering av tumorvekst ved å utføre de angiogeneseinhiberende fremgangsmåter.

Fremgangsmåtene er også spesielt effektive for å hindre dannelse av metastaser, siden (1) metastasedannelse krever vaskularisering av en primærtumor, slik at de metastatiske cancerceller kan forlate primærtumoren, og (2) etablering av metastaser i et sekundært sete krever neovaskularisering for å understøtte vekst av metastasene.

I en beslektet utførelse overveies utførelse av fremgangsmåten sammen med andre terapiformer, f.eks. konvensjonell kjemoterapi rettet mot faste tumorer og for kontroll av metastasedannelse. Tilførsel av angiogenese-inhibitoren utføres typisk under eller etter kjemoterapien, selv om det foretrekkes å inhibere angiogenesen etter kjemo-terapibehandling på tidspunkter hvor tumorvevet vil respondere på toksinangrepet ved å indusere angiogenese, slik at den kan komme seg ved hjelp av blodtilførsel og næringsstoffer til tumorvevet. I tillegg foretrekkes det å benytte angiogenese-inhiberingsfremgangsmåtene etter kirurgisk fjerning av faste tumorer for å forebygge metastaser.

I den grad de foreliggende fremgangsmåter kan benyttes til inhibering av tumorneovaskularisering, kan fremgangsmåtene også benyttes til inhibering av tumorvevsvekst, til inhibering av dannelse av tumormetastaser og til regresjon av etablerte tumorer. Eksemplene viser regresjon av en etablert tumor som følge av en enkelt intravenøs tilførsel av en 0^3-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse.

Restenose er en prosess som omfatter migrasjon og proliferasjon av glatte muskelceller (SMC) på setet for per-kutan, transluminal angioplastikk, noe som reduserer virkningen av angioplastikken. Migrasjon og proliferasjon av SMC under restenose kan betraktes som en angiogeneseprosess som kan inhiberes ved de foreliggende fremgangsmåter. Oppfinnelsen overveier derfor også inhibering av restenose ved å inhibere angiogenese ifølge de foreliggende fremgangsmåter hos en pasient etter angioplastiske fremgangsmåter. For inhibering av restenose tilføres av$ 3-antagonisten typisk etter den angioplastiske fremgangsmåte i fra tilnærmet 2 til tilnærmet 28 dager, mer typisk i tilnærmet de første 14 dager etter behandlingen.

Foreliggende fremgangsmåte for inhibering av angiogenese i et vev, og følgelig for utførelse av fremgangsmåtene for behandling av angiogenesebeslektede sykdommer, omfatter tilførsel til et vev i hvilket angiogenese foregår, eller hvor det er fare for angiogenese av et preparat som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en av{33-antagonist i stand til å inhibere avp3-binding til sin naturlige ligand. Fremgangsmåten omfatter således tilførsel til en pasient av en terapeutisk effektiv mengde av et fysiologisk tålbart preparat som inneholder en avp3-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse.

Doseområdene for tilførsel av avf}3-antagonisten avhenger av antagonistens form og effektivitet, som beskrevet senere heri, og er mengder som er tilstrekkelig store til å fremkalle den ønskede virkning, hvor angiogenese og sykdomssymptomene som formidles av angiogenese er fjernet. Dosen bør ikke være så stor at den gir uønskede bivirkninger, som f.eks. hyperviskositetssyndromer, lungeødem, kongestiv hjertesvikt og lignende. Generelt vil dosen variere med alder, tilstand, kjønn og sykdomsomfang hos pasienten, og kan fastslås av en fagmann. Dosen kan også justeres av den enkelte lege dersom komplikasjoner oppstår.

En terapeutisk effektiv mengde er en mengde av en av{33-antagonist som er tilstrekkelig til å fremkalle en målbar inhibering av angiogenese i vevet som behandles, dvs. en angiogeneseinhiberende mengde. Inhibering av angiogenese kan måles in situ ved immunhistokjemi, som beskrevet heri, eller ved andre fremgangsmåter kjent blant fagfolk.

I den grad en av{33-antagonist kan være en av{33-etter-ligner, et RGD-holdig peptid, et monoklonalt anti-avp3-antistoff eller et fragment av dette, vil det forstås at virkningsgraden og følgelig betydningen av en "terapeutisk effektiv" mengde kan variere. Som vist ved de foreliggende analysefremgangsmåter, kan imidlertid en fagmann lett anslå virkningsgraden av en mulig av{33-antagonist ifølge foreliggende oppfinnelse.

Virkningsgraden av en av^3-antagonist kan måles ved en rekke midler, heriblant inhibering av angiogenese i CAM-analysen, ved in vivo-kaninøyeanalysen, ved in vivo-kimær mus:menneskeanalysen og ved å måle inhibering av binding av naturlig ligand til avp3, som alle beskrives heri, og lignende analyser.

En foretrukket a^-antagonist har evnen til i vesentlig grad å inhibere binding av en naturlig ligand,

f.eks. fibrinogen eller vitronektin, til avP3 i løsning ved an-tagonistkonsentrasjoner lavere enn 0,5 mikromolar (uM), fortrinnsvis mindre enn 0,1 uM, mer foretrukket mindre enn 0,05 uM. Med "i vesentlig grad" menes at minst 50 % redusert binding av fibrinogen kan observeres ved inhibering i nærvær av av£l3-antagonisten, og konsentrasjonen som gir 50 % inhibering, betegnes heri som IC50-verdien.

En mer foretrukket a^-antagonist viser selektivitet for avP3 fremfor andre integriner. Således vil en foretrukket avp2-antagonist i vesentlig grad inhibere fibrinogenbinding til avf}3, uten i vesentlig grad å inhibere binding av fibrinogen til et annet integrin, f .eks. avPi, avPs eller a1IBPj. Spesielt foretrukket er en avP3-antagonist som viser 10-100 ganger lavere IC50-aktivitet for inhibering av fibrinogenbinding til avp3 sammenlignet med IC50-aktiviteten for inhibering av fibrinogenbinding til et annet integrin. Eksempler på analyser for å måle I C5o-aktivi tet for inhibering av f ibrinogenbinding til et integrin er beskrevet i eksemplene.

En terapeutisk effektiv mengde av en avP3-antagonist i form av et monoklonalt antistoff er typisk en mengde som ved tilførsel i et fysiologisk aksepterbart preparat er tilstrekkelig til å oppnå en plasmakonsentrasjon fra tilnærmet 0,01 mikrogram (ug) pr. milliliter (ml) til tilnærmet 100 ug/ml, fortrinnsvis fra tilnærmet 1 ug/ml til tilnærmet 5 ug/ml, og vanligvis tilnærmet 5 ug/ml. Uttrykt på en annen måte kan dosen variere fra tilnærmet 0,1 mg/kg til tilnærmet 300 mg/kg, fortrinnsvis fra tilnærmet 0,2 mg/kg til tilnærmet 200 mg/kg, mest foretrukket fra tilnærmet 0,5 mg/kg til tilnærmet 20 mg/kg, ved én eller flere dosetilførsler daglig i én eller flere dager.

Når antagonisten foreligger i form av et fragment av et monoklonalt antistoff, kan mengden lett justeres, basert på massen av fragmentet relativt til massen av det intakte antistoff. En foretrukket plasmakonsentrasjon i molaritet er fra tilnærmet 2 mikromolar (uM) til tilnærmet 5 millimolar (mM), fortrinnsvis fra tilnærmet 100 uM til 1 mM antistoffanta-gonist .

En terapeutisk effektiv mengde av en av^3-antagonist i form av et polypeptid eller en annen lavmolekylær avp\3-etterligner med tilsvarende størrelse er typisk en polypeptid-mengde som ved tilførsel i et fysiologisk aksepterbart preparat er tilstrekkelig til å oppnå en plasmakonsentrasjon fra tilnærmet 0,1 mikrogram (ug) pr. milliliter (ml) til tilnærmet 200 ug/ml, fortrinnsvis fra tilnærmet 1 ug/ml til tilnærmet 150 ug/ml. Basert på et polypeptid med en masse på tilnærmet 500 g pr. mol er den foretrukne molare plasmakonsentrasjon fra tilnærmet 2 mikromolar (uM) til tilnærmet 5 millimolar (mM), fortrinnsvis fra tilnærmet 100 uM til 1 mM polypeptidantagonist. Med andre ord kan dosen pr. kroppsvekt variere fra tilnærmet 0,1 mg/kg til tilnærmet 300 mg/kg, fortrinnsvis fra tilnærmet 0,2 mg/kg til tilnærmet 2 00 mg/kg, med én eller flere dosetilførsler daglig i én eller flere dager.

De monoklonale antistoffer eller polypeptider kan tilføres parenteralt ved injeksjon eller ved gradvis infusjon over lengre tid. Selv om vevene som skal behandles typisk kan nås i kroppen ved systemisk tilførsel, og derfor oftest vil behandles ved intravenøs tilførsel av terapeutiske preparater, overveies andre vev og tilførselsmetoder hvor det er sannsynlig at vevet behandlingen rettes mot inneholder målmolekylet. Således kan monoklonale antistoffer eller polypeptider ifølge oppfinnelsen tilføres "intravenøst, intraperitonealt, intramuskulært, subkutant, intrakavitært, transdermalt, eller ved peristaltiske midler.

De terapeutiske preparater som inneholder et monoklonalt antistoff eller et polypeptid tilføres vanligvis intravenøst, f.eks. ved injeksjon av en enhetsdose. Begrepet "enhetsdose", når det benyttes i forbindelse med et terapeutisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse, viser til fysisk atskilte enheter som er egnet som enhetsdoser for pasienten, hvor hver dose inneholder en på forhånd bestemt mengde aktivt stoff, beregnet å frembringe den ønskede terapeutiske virkning, sammen med det ønskede fortynnings-middel, dvs. bærerstoff eller løsemiddel.

I én foretrukket utførelse, som vist i eksemplene, tilføres avP3~antagonisten i en enkelt intravenøs dose.

Preparatene tilføres på en måte som er forenlig med doseutformingen, og i en terapeutisk effektiv mengde. Mengden som skal tilføres og tidspunktet for tilførsel, avhenger av pasienten som skal behandles, pasientsystemets evne til å ut-nytte den aktive bestanddel og graden av terapeutisk virkning som er ønskelig. De nøyaktige mengder av aktiv bestanddel som må tilføres, avhenger av utførerens vurderinger og vil variere fra individ til individ. Imidlertid beskrives egnede dose-områder for systemisk tilførsel heri, og vil avhenge av til-førselsveien. Egnede tilførselsregimer vil også variere, men vil typisk omfatte en initiell tilførsel fulgt av gjentatte doser med intervaller på én eller flere timer, tilført ved injeksjon eller på annet vis. Alternativt overveies kontinuerlig intravenøs infusjon tilstrekkelig til å opprettholde blod-konsentrasjoner i områdene spesifisert for in vivo-terapier.

Som vist i de foreliggende eksempler, skjer inhibering av angiogenese og tumorregresjon allerede 7 dager etter første kontakt med antagonisten. Det er ønskelig med ytterligere eller forlenget behandling med antagonist i 7 dager til 6 uker, fortrinnsvis i tilnærmet 14-28 dager.

I en beslektet utførelse viser eksemplene sammen-hengen mellom inhibering av av£53 og induksjon av apoptose i neovaskulærcellene som bærer av{33. Således overveier oppfinnelsen også fremgangsmåter for inhibering av apoptose i nydannede blodkar i et vev. Fremgangsmåten utføres i det vesentlige som beskrevet heri for inhibering av angiogenese i alle vev og betingelser beskrevet for dette formål. Den eneste merkbare forskjell gjelder tidspunktet hvor virkningen oppstår, som for apoptose er tidlig, typisk tilnærmet 48 timer etter tilførsel av antagonist, mens inhibering av angiogenese og tumorregresjon først skjer senere, som beskrevet heri. Denne forskjell påvirker det terapeutiske regime når det gjelder tidspunkt for tilførsel og den ønskede virkning. Typisk vil tilførsel for apoptose av nydannede blodkar foregå i tilnærmet 24 timer til tilnærmet 4 uker, selv om 48 timer til 7 dager foretrekkes.

D. Terapeutiske preparater

Foreliggende oppfinnelse overveier terapeutiske preparater anvendbare for utførelse av de terapeutiske fremgangsmåter beskrevet heri. Terapeutiske preparater som beskrevet heri inneholder et fysiologisk anvendbart bærerstoff sammen med en avp3-antagonist, som beskrevet heri, oppløst eller dispergert i dette som en aktiv bestanddel. I en foretrukket utførelse er det terapeutiske avJ33-antagonist-preparat ikke immunogent ved tilførsel til et pattedyr eller en menneskelig pasient for terapeutiske formål.

Som benyttet heri, brukes begrepene "farmasøytisk aksepterbart", "fysiologisk tålbart" og grammatikalske varia-sjoner av disse, når de viser til preparater, bærerstoffer, fortynningsmidler og reagenser, om hverandre og viser til at stoffene kan tilføres til eller på et pattedyr uten at det oppstår uønskede fysiologiske effekter som kvalme, svimmelhet, mageforstyrrelser og lignende.

Fremstilling av et farmakologisk preparat som inneholder aktive bestanddeler, oppløst eller dispergert i dette, er velkjent innen faget og trenger ikke begrenses basert på utforminger. Typisk er slike preparater fremstilt i injiser-bare former, enten som flytende løsninger eller suspensjoner, imidlertid kan faste former egnet for oppløsning eller suspen-sjon i en væske før benyttelse også fremstilles. Preparatet kan også være emulgert.

Den aktive bestanddel kan blandes med eksipienser som er farmasøytisk aksepterbare og forenlige med den aktive bestanddel, og i mengder egnet for benyttelse i de terapeutiske fremgangsmåter som beskrives heri. Egnede eksipienser er f.eks. vann, saltvann, dekstrose, glyserol, etanol eller lignende, og kombinasjoner av disse. I tillegg kan preparatet om ønskelig inneholde mindre mengder av tilleggsstoffer som fuktemidler eller emulgeringsmidler, pH-bufrende midler og lignende, som øker effektiviteten av den aktive bestanddel.

Det terapeutiske preparat kan omfatte farmasøytisk aksepterbare salter av bestanddelene. Farmasøytisk aksepterbare salter omfatter syreaddisjonssaltene (dannet med polypeptidets frie aminogrupper) som dannes med uorganiske syrer som f.eks. saltsyre eller fosforsyrer, eller organiske syrer som eddiksyre, vinsyre, mandelsyre og lignende. Salter dannet med de frie karboksylgrupper kan også avledes fra uorganiske baser som f.eks. natriumhydroksid, kaliumhydroksid, ammoniumhydroksid, kalsiumhydroksid eller jern(III)-hydroksid, og organiske baser som isopropylamin, trimetylamin, 2-etylaminoetanol, histidin, prokain og lignende.

Spesielt foretrukket er saltene av TFA og HCl når de benyttes ved fremstilling av syklisk polypeptid-avJ33-antagonister. Representative peptidsalter er beskrevet i eksemplene .

Fysiologisk tålbare bærerstoffer er velkjent innen faget. Eksempler på flytende bærerstoffer er sterile, vandige løsninger som ikke inneholder andre stoffer enn de aktive bestanddeler og vann, eller som inneholder en buffer som natriumfosfat ved fysiologisk pH-verdi, fysiologisk saltvann eller begge deler, som f.eks. fosfatbufret saltvann. Videre kan vandige bærere inneholde mer enn ett buffersalt så vel som salter som natrium- og kaliumklorid, dekstrose, polyetylenglykol og andre oppløste stoffer.

Flytende preparater kan også inneholde væskefaser i tillegg til eller i stedet for vann. Eksempler på slike væskefaser er glyserin, vegetabilske oljer som bomullsfrøolje og vann-olj eemulsjoner.

Et terapeutisk preparat inneholder en angiogeneseinhiberende mengde av en av$ 3-antagonist som beskrevet heri typisk utformet slik at den inneholder en mengde på minst 0,1 % (vekt/vekt) av antagonist relativt til det totale terapeutiske preparat. Prosent (vekt/vekt) er forholdet mellom vekt av inhibitor og vekt av totalpreparat. Således er f.eks. 0,1 % (vekt/vekt) 0,1 g inhibitor pr. 100 g totalpreparat.

E. Integrin- gvj33- antagonister

avfJ3-antagonist er benyttes i de foreliggende fremgangsmåter for inhibering av angiogenese i vev, og kan ha en rekke former som omfatter forbindelser som interagerer med avP3 på en måte som forstyrrer funksjonelle interaksjoner med naturlige av$ 3-ligander. Eksempler.på antagonister omfatter avP3-analoger avledet fra ligandbindingssetet i avp3, etterlignere av enten avp3 eller en naturlig avf}3-ligand, som etter-ligner det strukturelle området som deltar i avp3-ligand-bindingsinteraksjoner, polypeptider med en sekvens som tilsvarer et funksjonelt bindingsdomene i den naturlige ligand som er spesifikt for avp3, særlig slike som tilsvarer det RGD-holdige domenet i en naturlig avp3-ligand, og antistoffer som immunreagerer med enten avp3 eller den naturlige ligand, som alle vil vise antagonistaktivitet som definert heri.

1. Polypeptider

I én utførelse beskrives av{33-antagonister i form av polypeptider. En polypeptid (peptid) -av£3-antagonist kan ha sekvenskarakteristika fra enten den naturlige av{33-ligand eller fra avP3 selv i området som deltar i 0:^3-ligandinteraks jon, og som viser avP3-antagonistaktivitet som beskrevet heri. Et foretrukket avp3-antagonistpeptid inneholder RGD-tripeptidet og tilsvarer i sekvens den naturlige ligand i det RGD-holdige området.

Foretrukne RGD-holdige polypeptider har en sekvens som tilsvarer aminosyrerestsekvensen i det RGD-holdige området i en naturlig ligand for avp3, f.eks. fibrinogen, vitronektin, von Willebrand-faktor, laminin, trombospondin og lignende ligander. Sekvensen av disse avP3-ligander er kjent. Således kan et dvp^-antagonistpeptid avledes fra enhver av de naturlige ligander, selv om fibrinogen og vitronektin foretrekkes. Et spesielt foretrukket avp\j-antagonistpeptid vil fortrinnsvis inhibere dvp^-binding til sin(e) naturlig (e) ligand (er) sammenlignet med andre integriner, som beskrevet tidligere. Disse avP3-spesifikke peptider foretrekkes spesielt, idet minste fordi spesifisiteten for av^3 reduserer forekomsten av uønskede bivirkninger, som f.eks. inhibering av andre integriner. Identifisering av foretrukne avP3-antagonistpeptider med selektivitet for av£3 kan lett utføres i en typisk analyse av bindingsinhibering, som f.eks. ELISA-analysen beskrevet i eksemplene.

I én utførelse omfatter et polypeptid ikke mer enn tilnærmet 100 aminosyrerester, fortrinnsvis ikke mer enn tilnærmet 60 aminosyrerester, mer foretrukket ikke mer enn tilnærmet 30 aminosyrerester. Peptidene kan være lineære eller sykliske, selv om spesielt foretrukne peptider er sykliske.

Foretrukne sykliske og lineære peptider og deres betegnelser er vist i tabell 1 i eksemplene.

Det bør forstås at et gitt polypeptid ikke nødvendig-vis må ha samme aminosyrerestsekvens som den naturlige av£3-ligand, så lenge som den omfatter den nødvendige sekvens og kan fungere som en avp3-antagonist i en analyse, f.eks. analysene beskrevet heri.

Et polypeptid som beskrevet heri omfatter enhver analog, ethvert fragment eller ethvert kjemisk derivat av et polypeptid hvis aminosyrerestsekvens er vist heri, så lenge som polypeptidet er en 0^3-antagonist. Et gitt polypeptid kan følgelig utsettes for forskjellige endringer, substitusjoner, insersjoner og delesjoner dersom slike endringer gir visse fordeler ved bruk. Slik vil et avfi3-antagonistpolypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse tilsvare, snarere enn å være identisk med, sekvensen til et angitt peptid hvor én eller flere endringer er gjort, og peptidet bibeholder evnen til å fungere som en avp3-antagonist i én eller flere av analysene definert heri.

Således kan et polypeptid foreligge i enhver av en rekke former av peptidderivater, heriblant amider, protein-konjugater, sykliserte peptider, polymeriserte peptider, analoger, fragmenter, kjemisk modifiserte peptider og lignende derivater.

Begrepet "analog" omfatter ethvert polypeptid med en aminosyrerestsekvens som i det vesentlige er identisk med en sekvens spesifikt vist heri, i hvilken én eller flere aminosyrerester er konservativt substituert med en funksjonelt tilsvarende aminosyrerest, og som viser av£J3-antagonistaktiviteten som beskrevet heri. Eksempler på konservative substitusjoner omfatter substitusjon av én ikke-polar (hydrofob) aminosyrerest som isoleucin, valin, leucin eller metionin med en annen, substitusjon av én polar (hydrofil) aminosyrerest med en annen, som mellom arginin og lysin, mellom glutamin og asparagi-n, mellom glysin og serin, erstatning av én basisk aminosyrerest som lysin, arginin eller histidin med en annen, eller substitusjon av én sur aminosyrerest, f.eks. asparaginsyre eller glutaminsyre, med en annen.

Uttrykket "konservativ substitusjon" omfatter også anvendelse av en kjemisk derivatisert aminosyrerest som erstatning for en ikke-derivatisert aminosyrerest, forutsatt at polypeptidet viser den ønskede inhiberingsaktivitet. "Kjemisk derivat" viser til et polypeptid hvor én eller flere aminosyrerester er kjemisk derivatisert ved at en funksjonell side-gruppe har reagert. Slike derivatiserte molekyler omfatter f.eks. molekyler hvor frie aminogrupper har blitt derivatisert slik at aminhydroklorider, p-toluensulfonylgrupper, karboksy-benzoksygrupper, t-butyloksykarbonylgrupper, kloracetylgrupper eller formylgrupper er dannet. Frie karboksylgrupper kan derivatiseres slik at det dannes salter, metyl- og etylestere eller andre estertyper, eller hydrazider. Frie hydroksyl-grupper kan derivatiseres slik at det dannes O-acyl- eller 0-alkylderivater. Nitrogen i histidins imidazolgruppe kan derivatiseres slik at det dannes N-im-benzylhistidin. Også regnet som kjemiske derivater er peptider som inneholder én eller flere naturlig forekommende aminosyrederivater av de 20 vanlige aminosyrer. For eksempel kan 4-hydroksyprolin erstatte prolin; 5-hydroksylysin kan erstatte lysin; 3-metyl-histidin kan erstatte histidin; homoserin kan erstatte.serin; og ornitin kan erstatte lysin. Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også ethvert polypeptid med én eller flere addisjoner og/eller delesjoner av aminosyrerester sammenlignet med sekvensen til et polypeptid, hvis sekvens er vist heri, så lenge den ønskede aktivitet bibeholdes.

Begrepet "fragment" viser til ethvert polypeptid med en aminosyrerestsekvens kortere enn den til et polypeptid hvis aminosyrerestsekvens er vist heri.

Når et polypeptid som beskrevet her har en sekvens som ikke er identisk med sekvensen til en naturlig avp3-ligand, er det typisk fordi én eller flere konservative eller ikke-konservative substitusjoner er gjort. Vanligvis er ikke mer enn 30 %, og fortrinnsvis ikke mer enn 10 %, av aminosyrerestene substituert. Ytterligere aminosyrerester kan også adderes ved en av endene til et polypeptid for å tilveiebringe en "linker" som kan benyttes til kobling av polypeptidene til et merkingsreagens eller et fast støttemiddel, eller en bærersubstans.

Merkingsreagenser, faste støttemidler og bærerstoffer som kan benyttes med polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, er beskrevet nedenfor.

Aminosyrerestlinkere er vanligvis på minst én aminosyrerest og kan inneholde 40 eller flere aminosyrerester, mer vanlig 1-10 aminosyrerester, men danner ikke av{33-ligand-epitoper. Typiske aminosyrerester som benyttes for sammen-kobling, er tyrosin, cystein, lysin, glutaminsyre, asparaginsyre eller lignende. I tillegg kan et polypeptid, dersom ikke annet er angitt, avvike fra den naturlige sekvens til en av^ >3-ligand ved at sekvensen er modifisert ved aminoterminal acylering, f.eks. acetylering eller tioglykolsyreamidering, ved amidering av terminale karboksylgrupper, f.eks. med ammo-niakk, metylamin og lignende terminale modifikasjoner. Som kjent er terminale modifikasjoner anvendbare for å redusere faren for proteinasekløyving, og kan derfor bidra til å for-lenge halveringstiden for polypeptidene i løsning, særlig i biologiske væsker hvor proteaser kan foreligge. I denne sammenheng er syklisering av polypeptidet også en anvendbar terminal modifisering, og er spesielt foretrukket også grunnet de stabile strukturer som dannes ved syklisering, og i lys av de biologiske aktiviteter observert for slike sykliske peptider, som beskrevet heri.

Ethvert peptid som beskrevet heri kan benyttes i form av et farmasøytisk aksepterbart salt. Egnede syrer som kan danne salter med peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter uorganiske syrer som trifluoreddiksyre (TFA), saltsyre (HCl), hydrogenbromid, perklorsyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovelsyre, fosforeddiksyre, propionsyre, glykolsyre, melkesyre, pyrodruesyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, antranilinsyre, kanelsyre, naftalensulfonsyre, sulfanilinsyre eller lignende. HC1- og TFA-salter er spesielt foretrukket.

Egnede baser som kan danne salter med peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter uorganiske baser som natriumhydroksid, ammoniumhydroksid, kaliumhydroksid og lignende; og organiske baser som mono-, di- og trialkyl- og arylaminer (f.eks. trietylamin, diisopropylamin, metylamin, dimetylamin og lignende), og eventuelt substituerte etanol-aminer (f.eks. etanolamin, dietanolamin og lignende).

Et peptid som beskrevet heri kan syntetiseres ved enhver teknikk kjent blant fagfolk innen polypeptidfeltet, heriblant rekombinant DNA-teknikker. Syntetiske kjemiteknikker som fastfase-Merrifield-typesyntese foretrekkes av renhets-grunner, antigenspesifisitet, fravær av uønskede biprodukter, enkel fremstilling og lignende. En fremragende oppsummering av de mange tilgjengelige teknikker kan finnes i Steward et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky et al., "Peptide Synthesis", John Wiley Sc Sons, 2. utgave, 1976; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", bind 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-96, 1969; Fields et al., Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214, 1990; og US patentskrift nr. 4 244 946, for fastfasepeptidsyntese, og Schroder et al., "The Peptides", bind 1, Academic Press (New York), 1965, for klassisk syntese i løsning, som alle inkorporeres heri ved referanse. Passende beskyttelsesgrupper som er anvendbare i slik syntese, er beskrevet i tekstene ovenfor og i J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973, som inkorporeres heri ved referanse.

Generelt omfatter fremgangsmåtene for fastfasesyntese trinnvis addering av én eller flere aminosyrerester eller passende blokkerte aminosyrerester til en voksende peptid-kjede. Normalt vil enten amino- eller karboksylgruppen i den første aminosyrerest være beskyttet med en egnet, selektivt fjernbar, beskyttende gruppe. En forskjellig, selektivt fjernbar, beskyttende gruppe benyttes for aminosyrer som inneholder en reaktiv sidekjedegruppe, f.eks. lysin.

Med fastfasesyntese som eksempel kobles den beskyt-tede eller derivatiserte aminosyre til et ikke-reaktivt fast støttemedium via sin ubeskyttede karboksyl- eller aminogruppe. Beskyttelsesgruppen på amino- eller karboksylgruppen fjernes så selektivt, og neste aminosyre i sekvensen med den tilsvarende (amino eller karboksy) gruppe beskyttet på egnet vis tilsettes og får reagere under betingelser som er egnet for dannelse av amidbindingen til aminosyreresten som allerede er festet til det faste støttemiddel. Beskyttelsesgruppen på amino- eller karboksygruppen fjernes så fra denne nyadderte aminosyrerest, og neste aminosyre (beskyttet på egnet vis) tilsettes så osv. Etter at alle de ønskede aminosyrer har blitt sammenkoblet i den riktige sekvens, fjernes gjenværende terminal- og sidebeskyttende grupper (og det faste støtte-middel) , enten etter hverandre eller samtidig, slik at det endelige lineære polypeptid dannes.

De resulterende lineære polypeptider, fremstilt f.eks. som beskrevet ovenfor, kan få reagere slik at de tilsvarende sykliske peptider dannes. Et eksempel på en fremgangsmåte for syklisering av peptider er beskrevet i Zimmer et al., Peptides 1992, s. 393-394, ESCOM Science Publishers, B.V., 1993. Typisk løses tert.-butoksykarbonylbeskyttet peptidmetylester i metanol, natriumhydroksidløsning tilsettes, og blandingen får reagere ved 20 °C for hydrolytisk fjerning av den beskyttende metylestergruppe. Etter inndamping av løse-midlet ekstraheres det tert.-butoksykarbonylbeskyttede peptid med etylacetat fra det surgjorte, vandige løsemiddel. Den beskyttende tert.-butoksykarbonylgruppe fjernes så under svakt sure betingelser med dioksan som kosolvent. Det således erholdte ubeskyttede lineære peptid med frie amino- og karbok-sylender overføres så til det tilsvarende sykliske peptid ved å la en fortynnet løsning av det lineære peptid, i en blanding av diklormetan og dimetylformamid, reagere med disykloheksylkarbodiimid i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol og N-metyl-morfolin. Det resulterende sykliske peptid renses så ved kromatografi.

En spesielt foretrukket syntesefremgangsmåte for syklisk peptid er beskrevet av Gurrath et al., Eur. J. Biochem., 210:911-921 (1992), og beskrevet i eksemplene. Spesielt foretrukne peptider for anvendelse i de foreliggende fremgangsmåter er c-(GrGDFV) (SEKV.ID. NR. 4), c-(RGDfV)

(SEKV.ID. NR. 5), c-(RADfV) (SEKV.ID. NR. 6), c-(RGDFv)

(SEKV.ID. NR. 7) og lineært peptid YTAECKPQVTRGDVF (SEKV.ID. NR. 8), hvor "c" angir et syklisk peptid, store bokstaver er enbokstavkode for en L-aminosyre, og små bokstaver er enbokstavkode for D-aminosyrer. Aminosyrerestsekvensene til disse peptider er også vist i SEKV.ID. NR. 4, 5, 6, 7 henholdsvis 8.

2. Monoklonale antistoffer

Foreliggende oppfinnelse beskriver i én utførelse avp3-antagonister i form av monoklonale antistoffer som immunreagerer med avp3 og inhiberer avp3-binding til sin naturlige ligand, som beskrevet heri. Oppfinnelsen beskriver også cellelinjer som fremstiller antistoffene, fremgangsmåter for fremstilling av cellelinjene og fremgangsmåter for fremstilling av de monoklonale antistoffer.

Et monoklonalt antistoff som beskrevet heri omfatter antistoffmolekyler som 1) immunreagerer med isolert av{33, og 2) inhiberer fibrinogenbinding til avf33. Foretrukne monoklonale antistoffer som fortrinnsvis bindes til avp3, omfatter et monoklonalt antistoff med samme immunreaktive egenskaper som mAb-LM609, som utskilles av hybridomcellelinjen ATCC HB 95377. Hybridomcellelinjen ATCC HB 95377 ble deponert ifølge Budapest-konvensjonens krav hos American Type Culture Collection (ATCC), 1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, 15. september 1987.

Begrepet "antistoff eller antistoffmolekyl" i forskjellige grammatikalske former benyttes heri som et kollek-tivt substantiv som viser til en populasjon av immunglobulinmolekyler og/eller immunologisk aktive deler av immunglobulinmolekyler, dvs. molekyler som inneholder et antistoffs bindingssete eller paratop.

Et "antistoffs bindingssete" er den strukturelle dei av et antistoffmolekyl som omfatter variable og hypervariable områder fra tung- og lettkjede som spesifikt binder antigen.

Eksempler på antistoffer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er intakte immunglobulinmolekyler, stort sett intakte immunglobulinmolekyler og de deler av et immunglobulinmolekyl som inneholder paratopen, heriblant de deler kjent innen faget som Fab, Fab', F (ab') 2 og F (v) , og som også betegnes som antistoffragmenter.

I en annen foretrukket utførelse beskrives et forkortet immunglobulinmolekyl som omfatter et Fab-fragment avledet fra et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Fab-fragmentet som mangler Fc-reseptor, er løselig og gir terapeutiske fordeler med hensyn til halveringstid i serum og diagnostiske fordeler når det gjelder anvendelsesmåter for det løselige Fab-fragment. Fremstilling av et løselig Fab-fragment er generelt kjent innen det immuno-logiske fagområdet, og kan oppnås ved en rekke fremgangsmåter.

For eksempel kan Fab- og F (ab') 2-deler (fragmenter) av antistoffer fremstilles ved proteolytisk reaksjon av papain henholdsvis pepsin med i det vesentlige intakte antistoffer ved velkjente fremgangsmåter. Se f.eks. US patentskrift nr. 4 342 566, av Theofilopolous og Dixon. Fab<1->antistoffdeler er også velkjente og fremstilles fra F (ab1) 2-deler ved reduksjon av disulfidbindingene som kobler de to tungkjededeler sammen, f.eks. med merkaptoetanol, fulgt av alkylering av det resulterende proteinmerkaptan med et reagens som f.eks. jod-acetamid. Et antistoff som inneholder intakte immunglobulinmolekyler, foretrekkes og benyttes heri for å illustrere oppfinnelsen.

Begrepet "monoklonalt antistoff" i forskjellige grammatikalske former viser til en populasjon av antistoffmolekyler som inneholder kun én type antistoffbindingssete som kan immunreagere med en gitt epitop. Et monoklonalt antistoff viser således typisk en enkelt bindingsaffinitet for enhver epitop med hvilken det immunreagerer. Et monoklonalt antistoff kan derfor inneholde et antistoffmolekyl med flere bindingsseter, hvert av dem immunspesifikt for en forskjellig epitop, f.eks. et bispesifikt monoklonalt antistoff.

Et monoklonalt antistoff består typisk av antistoffer fremstilt av kloner av en enkeltcelle betegnet en hybridom, som utskiller (produserer) kun én type antistoffmolekyl. Hybridomcellen dannes ved fusjon av en antistoffproduserende celle og et myelom eller en annen cellelinje med ubegrenset vekstpotensial. Fremstilling av slike antistoffer ble først beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 55:495-497 (1975), hvis beskrivelse inkorporeres heri ved referanse. Ytterligere fremgangsmåter er beskrevet av Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987). Hybridomsuper-natantene som fremstilles på denne måten, kan gjennomsøkes for nærvær av antistoffmolekyler som immunreagerer med avp3, og for inhibering av avp3-binding til naturlige ligander.

For å danne hybridomen fra hvilken det monoklonale antistoffpreparat produseres, fusjoneres kort beskrevet et myelom eller en annen cellelinje med ubegrenset vekstpotensial med lymfocytter erholdt fra milten hos et pattedyr hyper-immunisert med av]33-kilde, f .eks. avp3 isolert fra de humane melanomceller M21, som beskrevet av Cheresh et al., J. Biol. Chem., 252:17703-17711 (1987).

Det foretrekkes at myelomcellelinjen som benyttes til fremstilling av en hybridom, er fra samme art som lymfocyt-tene. Typisk vil en mus av stamme 129-G1X' være det foretrukne pattedyr. Egnede musemyelomer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter de hypoksantin-aminopterin-tymidin-sensitive (HAT) cellelinjer P3X63-Ag8.653 og Sp2/0-Agl4, som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection, Rockville, MD, under betegnelsene CRL 1580 henholdsvis CRL 1581.

Splenocytter fusjoneres typisk med myelomceller ved bruk av polyetylenglykol (PEG) 1500. Fusjonerte hybrider ut-velges på basis av deres HAT-sensitivitet. Hybridomer som produserer et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, identifiseres ved bruk av enzymkoblet immunsorbent-analyse (ELISA), beskrevet i eksemplene.

Et monoklonalt antistoff som beskrevet heri kan også fremstilles ved å initiere en monoklonal hybridomkultur, som omfatter et næringsmedium som inneholder en hybridom som utskiller antistoffmolekyler med den ønskede spesifisitet. Kulturen opprettholdes under betingelser og i et tidsrom som er tilstrekkelig for at hybridomen utskiller antistoffmolekylene i mediet. Det antistoffholdige medium oppsamles så. Antistoffmolekylene kan så isoleres videre ved velkjente teknikker.

Medier som er egnet for fremstilling av disse preparater, er velkjent innen faget og kommersielt tilgjengelige og omfatter syntetiske dyrkningsmedier, innavlede mus og lignende. Et eksempel på et syntetisk medium er Dulbecco's minimal essential medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396, 1959), tilsatt 4,5 g/l glukose, 20 mM glutamin og 20 % føtalt kalveserum. Et eksempel på en innavlet musestamme er Balb/c.

Andre fremgangsmåter for fremstilling av et monoklonalt antistoff, en hybridomcelle eller en hybridomcelle-kultur er også velkjent. Se f.eks. fremgangsmåten for isoler-ing av monoklonale antistoffer fra et immunologisk repertoar, som beskrevet av Sastry et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:5728-5732 (1989); og Huse et al., Science, 246:1275-1281

(1989) .

Også beskrevet heri er hybridomcellen og kulturer som inneholder en hybridomcelle som produserer et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Spesielt foretrukket er hybridomcellelinjen som utskiller det monoklonale antistoff mAb-LM609, betegnet ATCC HB 95377. mAb-LM609 ble fremstilt som beskrevet av Cheresh et al., J. Biol. Chem., 262:17703-17711 (1987), og dets fremstilling er også beskrevet i eksemplene.

Oppfinnelsen beskriver i én utførelse et monoklonalt antistoff med de immunreaktive egenskaper til mAb-LM609.

Det er også mulig uten svært mye eksperimentering å fastslå hvorvidt et monoklonalt antistoff har samme (dvs. ekvivalent) spesifisitet (immunreaktive egenskaper) som et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse ved å fastslå hvorvidt det hindrer dette i å bindes til et på forhånd bestemt målmolekyl. Dersom det monoklonale antistoff som analyseres konkurrerer med det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen, vist ved redusert binding av det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen i standard konkurranseanalyser for binding til målmolekylet som foreligger i fast fase, er det sannsynlig at de to monoklonale antistoffer bindes til samme, eller en nært beslektet, epitop.

Nok en annen måte å fastslå hvorvidt et monoklonalt antistoff har samme spesifisitet som et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, er å forinkubere det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen med målmolekylet, med hvilket det normalt reagerer, og så tilsette det monoklonale antistoff som skal analyseres for å fastslå om antistoffet som skal analyseres, inhiberes i sin evne til å binde målmolekylet. Dersom det monoklonale antistoff som analyseres inhiberes, har det sannsynligvis samme, eller en funksjonelt ekvivalent, epitopspesifisitet som det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen.

En annen måte å fastslå hvorvidt et monoklonalt antistoff har samme spesifisitet som et monoklonalt antistoff beskrevet heri er å bestemme aminosyrerestsekvensen til CDR-områdene i antistoffene det gjelder. Antistoffmolekyler med identiske eller funksjonelt ekvivalente aminosyrerestsekvenser i CDR-områdene har samme bindingsspesifisitet. Fremgangsmåter for sekvensering av polypeptider er velkjent innen faget.

Et antistoffs immunspesifisitet, dets bindingskapasi-tet for målmolekylet og den medfølgende affinitet som antistoffet viser for epitopen, defineres av epitopen med hvilken antistoffet immunreagerer. Epitopspesifisiteten defineres i det minste delvis av aminosyrerestsekvensen i det variable området i immunglobulinets tungkjede, og delvis av aminosyrerestsekvensen i lettkjedens variable område.

Anvendelse av begrepet "med samme bindingsspesifisitet som" viser til at ekvivalente monoklonale antistoffer viser samme eller lignende immunreaksjons(bindings)egenskaper og konkurrerer om binding til et på forhånd valgt målmolekyl.

Humaniserte, monoklonale antistoffer byr på spesielle fordeler fremfor monoklonale antistoffer fra mus, særlig i og med at de kan benyttes terapeutisk i mennesker. Nærmere bestemt vil ikke humane antistoffer fjernes fra sirkulasjonen så hurtig som "fremmede" antigener, og de aktiverer ikke immun-systemet på samme måte som fremmede antigener og fremmede antistoffer. Fremgangsmåter for fremstilling av "humaniserte" antistoffer er generelt velkjent innen faget, og kan lett anvendes på antistoffene som beskrevet heri.

Således beskrives i én utførelse et monoklonalt antistoff som beskrives heri som er humanisert ved å innføre komponenter fra det humane immunsystem uten i vesentlig grad å forstyrre antistoffets evne til å binde antigen.

3 . Qyfo- spesifikke etterlignere

Foreliggende oppfinnelse viser at av{33-antagonister generelt kan benyttes i foreliggende oppfinnelse, og at de kan omfatte polypeptider, antistoffer og andre molekyler, betegnet "etterlignere", som har evnen til å forstyrre avp3-funksjon. Spesielt foretrukket er antagonister som spesifikt forstyrrer avp3-funksjon uten å forstyrre funksjonen til andre integriner.

I denne sammenheng bør det innses at en rekke reagenser kan være egnet for anvendelse i de foreliggende fremgangsmåter, så lenge de besitter den ønskede biologiske aktivitet. Disse reagenser betegnes generelt som etterlignere, siden de besitter evnen til å "etterligne" et bindingsdomene i enten avp3 eller av£3-liganden som inngår i den funksjonelle interak-sjon mellom reseptor og ligand, hvorved de forstyrrer (dvs. inhiberer) normal funksjon.

En avp3-etterligner er ethvert molekyl, bortsett fra et antistoff eller et ligandavledet peptid, som viser egen-skapene beskrevet ovenfor. Den kan være en syntetisk peptidanalog, en forbindelse som har samme form som bindingslommen i det ovenfor beskrevne bindingsdomene, eller et annet molekyl.

Utformingen av en av]33-etterligner kan utføres ved en rekke forskjellige fremgangsmåter for strukturanalyse og medikament ut forming velkjent innen faget, heriblant molekylær modellering, todimensjonal nukleær, magnetisk resonans (2-D-NMR)-analyse, røntgenkrystallografi, tilfeldig gjennomsøking av peptid-, peptidanalog- eller andre kjemiske polymerbiblio-teker, og tilsvarende metodologier for medikamentutforming.

I lys av det brede strukturelle bevismaterialet som presenteres i foreliggende beskrivelse, som viser at en avp3-antagonist kan være et lite 'polypeptid eller et monoklonalt antistoff - to svært forskjellige kjemiske strukturer som deler den funksjonelle egenskap at de selektivt inhiberer avp3 - vil strukturen av en avp3-antagonist som er anvendbar i de foreliggende fremgangsmåter, ikke være så begrenset,, men vil omfatte enhver avp3-etterligner, som definert heri.

F. Fremgangsmåter for identifisering av antagonister av avga

Oppfinnelsen beskriver også analysefremgangsmåter for identifisering av mulige avp3-antagonister for anvendelse ifølge de beskrevne fremgangsmåter. I disse analysefremgangsmåter evalueres kandidatmolekyler for evne til å inhibere avp3-binding til naturlige ligander, og videre for deres evne til å inhibere angiogenese i et vev.

Den første analyse måler inhibering av direkte binding av naturlig ligand til av£3, og en foretrukket ut-førelse er beskrevet i detalj i eksemplene. Analysen måler typisk inhiberingsgraden av binding av en naturlig ligand, f .eks. fibrinogen, til isolert avfJ3 i fast fase ved ELISA.

Analysen kan også benyttes til identifisering av forbindelser som viser spesifisitet for avp3, og som ikke inhiberer naturlige ligander fra å bindes til andre integriner. Spesifisitetsanalysen utføres ved å kjøre parallelle ELISA-analyser hvor både avp3 og andre integriner screenes samtidig i separate analysekamre for sine evner til å binde en naturlig ligand, og for kandidatforbindelsens evne til å inhibere integrinenes evne til å binde en på forhånd valgt ligand. Foretrukne formater for screeningsanalyse er beskrevet i eksemplene.

Den andre analysen måler angiogenese i korioallantoinmembran hos kylling (CAM) og betegnes som CAM-analysen. CAM-analysen er detaljert beskrevet av andre og har videre blitt benyttet for måling av både angiogenese og neovaskularisering av tumorvev. Se Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597-618 (1975), og Ossonski et al., Cancer Res., 40:2300-2309 (1980) .

CAM-analysen er en anerkjent analysemodell for in vivo-angiogenese, siden neovaskularisering av helt vev foregår, og faktiske kyllingembryoblodkar vokser inn i CAM eller i vevet som dyrkes på CAM.

Som vist heri, illustrerer CAM-analysen inhibering av neovaskularisering basert både på mengde og omfang av ny blodkarvekst. Videre er det lett å følge veksten av ethvert vev som transplanteres på CAM, f.eks. tumorvev. Endelig er analysen spesielt nyttig fordi det foreligger en intern kontroll for toksisitet i analysesysternet. Kyllingembryoet utsettes for ethvert analysereagens, og embryoets helse er følgelig en indikasjon på toksisitet.

Den tredje analysen måler angiogenese i in vivo-kaninøyemodellen og betegnes som kaninøyeanalysen. Kaninøye-analysen er beskrevet i detalj av andre og har videre blitt benyttet til måling av både angiogenese og neovaskularisering i nærvær av angiogeneseinhibitorer som thalidomid. Se D'Amato et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 91:4082-4085 (1994).

Kaninøyeanalysen er en ansett analysemodell for in vivo-angiogenese, siden neovaskulariseringsprosessen, eksemp-lifisert ved at kaninblodkar vokser fra randen av cornea inn i cornea, lett kan ses gjennom øyets naturlig transparente cornea. I tillegg kan både mengde og omfang av stimulering eller inhibering av neovaskularisering eller regresjon av neovaskularisering lett følges over tid.

Endelig utsettes kaninen for analysereagens, og kaninens helse er således en indikasjon på testreagensets toksisitet.

Den fjerde analysen måler angiogenese i kimær mus:menneskemusemodellen og betegnes som kimær mus-analysen. Analysen er beskrevet i detalj av andre og er videre beskrevet heri for måling av angiogenese, neovaskularisering og regresjon av tumorvev. Se Yan et al., J. Clin. Invest., 91:986-996

(1993). Kimær mus-analysen er en nyttig analysemodell for in vivo-angiogenese, da hudtransplantatene har stor likhet med normal human hud histologisk, og siden neovaskularisering av helt vev foregår hvor faktiske humane blodkar vokser fra den transplanterte humane hud inn i det humane tumorvev på overflaten av den transplanterte humane hud. Opphavet til neo-vaskulariseringen inn i det humane transplantat kan demon-streres ved immunhistokjemisk farging av neovaskulaturen med humanspesifikke endotelcellemarkører.

Som vist heri, demonstrerer kimær mus-analysen regresjon av neovaskularisering basert både på mengde og omfang av regresjon av ny blodkarvekst. Videre er det lett å følge effekter på veksten av ethvert vev som transplanteres på den transplanterte hud, f.eks. et tumorvev. Endelig er analysen nyttig, siden det foreligger en intern kontroll for toksisitet i analysesystemet. Den kimære mus utsettes for ethvert test-reagens, og musens helse er således en indikasjon på toksisitet .

Eksempler

1. Fremstilling av syntetiske peptider

De lineære og sykliske polypeptider som er opplistet i tabell 1, ble syntetisert ved bruk av standardteknikker for fastfasesyntese, som f.eks. beskrevet av Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-96 (1969), og Fields, G.B. og Noble, R.L., Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214 (1990).

2 gram (g) BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Ome (SEKV.ID. NR. 1) ble først løst i 60 milliliter (ml) metanol tilsatt 1,5 ml 2 N natriumhydroksidløsning slik at en blanding oppstod. Blandingen ble så omrørt i 3 timer ved 20 °C. Etter inndamping ble restmaterialet løst i vann, surgjort til pH 3

med fortynnet HCl og ekstrahert med etylacetat. Ekstraktet ble tørket over Na2S04, inndampet på nytt, og det dannede BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEKV.ID. NR. 2) ble omrørt ved 20 °C i 2 timer med 20 ml 2 N HCl i dioksan. Blandingen ble inndampet for erholdelse av H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEKV.ID. NR. 3), som så ble løst i en blanding av 1800 ml diklormetan og 200 ml dimetylformamid (DMF), fulgt av avkjøl-ing til 0 °C. Deretter ble 0,5 g disykloheksylkarbodiimid (DCCI), 0,3 g 1-hydroksybenzotriazol (HOBt) og 0,23 ml N-metylmorfolin tilsatt etter hverandre under omrøring.

Den resulterende blanding ble omrørt i ytterligere

24 timer ved 0 °C og deretter ved 20 °C i ytterligere 48 timer. Løsningen ble konsentrert og behandlet med en blandet ionebyt-ter for å fri den for salter. Etter at resinet var fjernet ved filtrering, ble den klarede løsning inndampet, og restmateri-

alet ble renset ved kromatografi som førte til gjenvinning av syklo(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEKV.ID. NR. 4). Følgende peptider, opplistet i tabell 1 med enbokstavaminosyrerest-forkortelser og identifisert ved en peptidnummerbetegnelse, ble erholdt på tilsvarende måte: syklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEKV.ID. NR. 5); syklo(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (SEKV.ID. NR. 6); syklo(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (SEKV.ID. NR. 9); syklo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEKV.ID. NR. 7). Et peptid betegnet 66203, med identisk sekvens til peptid 62184, avvek bare fra det siste ved at det inneholdt saltet HCl snarere enn TFA-saltet som forelå i 62184. Ved angiogeneseinhiberingsanalyser som beskrevet i eksempel 7, hvor de syntetiske peptider ble anvendt, var peptid 66203 med HCl noe mer effektivt til inhibering av angiogenese enn det identiske peptid i TFA.

Små bokstaver angir en D-aminosyre, store bokstaver angir en L-aminosyre

Et peptid betegnet 69601, med identisk sekvens til peptid 62185, avvek bare fra dette ved at det inneholdt saltet HCl snarere enn TFA-saltet som forelå i 62184.

Det sykliske peptid c-RADfV (69601) har blitt vist å inhibere binding av fibrinogen til integrinet av£3, og ikke inhibere binding av fibrinogen til integrinene anBp3 eller a5<p>>i (Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238, 1994). Peptidet c-RADfV er således spesifikt for avp3.

2 . Monoklonale antistoffer

Det monoklonale antistoff LM609, som utskilles av hybridom ATCC HB 9537, ble fremstilt ved bruk av standard hybridomfremgangsmåter ved immunisering med isolert av{33 adsor-bert til Sepharose-linselektinkuler. avp3 var isolert fra humane melanomceller betegnet M21, og antistoff ble fremstilt som beskrevet av Cheresh et al., J. Biol. Chem., 262:17703-17711

(1987) . M21-celler ble erholdt fra dr. D.L. Morton (universitetet i California, Los Angeles, CA) og dyrket i suspensjonskulturer i dyrkningsmediet RPMI 1640 tilsatt 2 mM L-glutamin, 50 mg/ml gentamycinsulfat og 10 % føtalt kalveserum.

Det monoklonale antistoff LM609 er vist å immunreagere spesifikt med avp3-kompi eks, uten å immunreagere med av-subenhet, p3-subenhet eller med andre integriner.

3 . Karakterisering av vevsdistribusjonen for avp3-ekspresjon

A. Immunfluorescens med antiintegrinreseptor

antistoffer

Under sårheling uttrykker basalmembranen i blodkar flere adhesjonsproteiner, heriblant von Willebrand-faktor, fibronektin og fibrin. I tillegg uttrykkes flere medlemmer av integrinfamilien av adhesjonsreseptorer på overflaten av dyrkede glatte muskelceller og endotelceller. Se Cheresh, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:6471 (1987); Janat et al., J. Cell. Physiol., 151:588 (1992); og Cheng et al., J. Cell. Physiol., 139:275 (1989). Blant disse integriner er avp3, endotelcellereseptoren for von Willebrand-faktor, fibrinogen (fibrin) og fibronektin, som beskrevet av Cheresh, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:6471 (1987). Dette integrin initierer en kalsiumavhengig signalvei som fører til endotelcellemigrering og således synes å spille en fundamental rolle i blodkarenes cellebiologi, som beskrevet av Leavelsey et al., J. Cell Biol., 121:163 (1993) .

For å undersøke ekspresjonen av avfl3 under angiogenesen ble humane sårgranulasjonsvev eller nærliggende normal hud erholdt fra frivillige pasienter, vasket med 1 ml fosfatbufret saltvann og nedlagt i O.T.C.-medium (Tissue Tek). De nedlagte vev ble hurtig nedfrosset i flytende nitrogen i tilnærmet 30-45 sekunder. 6 um tykke seksjoner ble utkuttet fra de nedfrosne blokker med en kryostatmikrotom for påfølgende immunperoksidasefarging med antistoffer spesifikke for enten {33-integriner (avp3 eller anBp3) eller Pi-underfamilien av integriner.

Resultatene av farging av normal human hud og sårgranulasjonsvev er vist i figurene IA-ID. De monoklonale antistoffer AP3 og LM534, rettet mot p3- henholdsvis Pi-integriner, ble benyttet for immunhistokjemisk analyse av frosne seksjoner. Eksperimenter med vev fra fire forskjellige humane donorer gav identiske resultater. Mikrofotografiene er vist med forst-ørrelse 300 x.

avp3-integrinet viste høy ekspresjon i blodkar i granulasjonsvev (figur IB), men kunne ikke påvises i dermis og epitel i normal hud fra samme donor (figur IA). I motsetning til dette viste px-integriner rikelig ekspresjon på blodkar og stromaceller både i normal hud (figur 1C) og granulasjonsvev (figur ID) og, som tidligere vist og beskrevet av Adams et al., Cell, 63:425 (1991), på basalcellene i epitelet.

B. Immunfluorescens med antiligandantistoffer Ytterligere seksjoner av human normal hud og granulasjonsvev fremstilt ovenfor ble også undersøkt for nærvær av ligandene til p3- og Px-integrinene, von Willebrand-faktor henholdsvis laminin. Von Willebrand-faktor var lokalisert til blodkarene i normal hud (figur 2A) og granulasjonsvev (figur 2B), mens laminin var lokalisert i alle blodkar så vel som i epitelets basalmembran i begge vevspreparater (figurene 2C og 2D) .

C. Fordeling av antiavJ33- antistoffer i cancervev

I tillegg til analysene ovenfor ble biopsier av cancervev fra humane pasienter også undersøkt for nærvær og fordeling av avfi3. Vevene ble behandlet som beskrevet i eksempel IA, bortsett fra at de ble farget med det monoklonale antistoff LM609, fremstilt i eksempel 2, som er spesifikt for integrinreseptorkomplekset av£3. I tillegg ble tumorer også behandlet for mikroskopisk, histologisk analyse ved fiksering av representative tumorprøver i Bulins fiksativ i 8 timer, kutting av serieseksjoner og H&E-farging.

Resultatene av immunperoksidasefarging av cancervev fra blære, colon, bryst og lunge er vist i figurene 3A-3D. av£3 viser høy ekspresjon bare i blodkarene som foreligger i de fire analyserte cancerbiopsier, og ikke på noen andre celler som foreligger i vevet.

Resultatene som beskrives heri, viser således at avp3-integrinreseptoren uttrykkes selektivt i spesifikke vevs-typer, nemlig granulerte, metastatiske vev og andre vev i hvilke angiogenese foregår, og ikke i normalt vev hvor dannelsen av nye blodkar er opphørt. Disse vev tilveiebringer derfor et ideelt mål for de terapeutiske sider ved foreliggende oppfinnelse .

4 . Identifisering av avp3- spesifikke syntetiske peptider påvist ved en ligandreseptorbindingsanalyse

De syntetiske peptider fremstilt i eksempel 1 ble gjennomsøkt ved å måle deres evne til å motvirke avp3- og QnB-p3-reseptorbindingsaktivitet i bindingsanalyser med renset ligand og reseptor. Fremgangsmåtene for disse bindingsunder-søkelser er beskrevet av Barbas et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:10003-10007 (1993), Smith et al., J. Biol. Chem., 265-:11008-11013 (1990), og Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994), hvis beskrivelser inkorporeres heri ved referanse.

Her beskrives en fremgangsmåte for identifisering av antagonister i en ligandreseptorbindingsanalyse i hvilken reseptoren er immobilisert til et fast støttemiddel og liganden og antagonisten er løselige. Videre beskrives en ligandreseptorbindingsanalyse i hvilken liganden er immobilisert til et fast støttemiddel og reseptoren og antagonistene er løse-lige .

Kort beskrevet ble utvalgte rensede integriner hver for seg immobilisert i Titertek-mikrotiterbrønner ved en konsentrasjon på 50 nanogram (ng) pr. brønn. Rensing av resep-torene som ble benyttet i ligandreseptorbindingsanalysene, er velkjent innen faget og er lett å oppnå ved fremgangsmåter velkjent for gjennomsnittsfagmannen. Etter inkubering i 18 timer ved 4 °C ble ikke-spesifikke bindingsseter på platen blokkert med 10 milligram/milliliter (mg/ml) bovint serumalbu-min (BSA) i Tris-bufret saltvann. For inhiberingsundersøkelser ble forskjellige konsentrasjoner av utvalgte peptider fra tabell 1 analysert for evne til å blokkere binding av <1>25i-vitronektin eller <125>I-fibrinogen til integrinreseptorene av£3 og diIBP3- Selv om disse ligander viser optimal binding for et gitt integrin, vitronektin for av£}3 og fibrinogen for anBp3, tillot undersøkelser over bindingsinhibering ved bruk av peptider til å blokkere binding av fibrinogen til begge reseptorer en nøyaktig bestemmelse av mengden i mikromol (uM) av peptid som trengtes for 50 % inhibering av reseptor-ligandbinding. Radioaktivt merkede ligander ble benyttet ved en konsentrasjon på 1 nM, og challenge av bindingen ble utført separat med umerkede, syntetiske peptider.

Etter 3 timers inkubering ble fri ligand fjernet ved vask, og bundet ligand ble påvist ved gammatelling. Verdiene fra analysene hvor utvalgte sykliske peptider, opplistet i tabell 1, ble benyttet for inhibering av binding av radioaktivt merket fibrinogen til separat immobiliserte av£3- og O-iibP^-reseptorer, var svært reproduserbare, med en standardfeil mellom måleverdiene som typisk lå lavere enn 11 %. IC50-verdiene i mikromol (IC50 uM) er uttrykt som gjennomsnittet av måleverdier i duplikat ± standardavvik, som vist i tabell 2.

Således viste de RGD-holdige eller RGD-derivatiserte sykliske peptider 62181, 62184, 62185 og 62187, som alle har én D-aminosyrerest, preferensiell inhibering av fibrinogenbinding til avP3-reseptoren, noe som vises ved at en lavere peptidkonsentrasjon kreves for 50 % inhibering, sammenlignet med resultatene for anBJ33-reseptoren. I motsetning til dette var de andre RGD-holdige eller RGD-derivatiserte sykliske peptider, 62186, 62175 og 62179, enten ikke så effektive i blokkering av fibrinogenbinding til av^3 eller de viste preferensiell inhibering av fibrinogenbinding til aIIBP3 sammenlignet med avp3. Disse resultater er i samsvar med dem nylig publisert av Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238

(1994), hvor det sykliske peptid RGDFV (hvor F viser en D-aminosyrerest) spesifikt inhiberte binding av fibrinogen til avp3-integrin, og ikke til ansp^- eller a5Pi-integriner. Tilsvarende analyser for bindingsinhibering ble utført med lineariserte peptider med eller uten et RGD-motiv, hvis sekvenser var avledet fra aminosyrerestsekvensene til av-reseptorsubenheten, anB-reseptorsubenheten eller liganden vitronektin. Sekvensene av de lineære peptider, 62880 (VN-avledet, aminosyrerester 35-49), 62411 (av-avledet, aminosyrerester 676-687), 62503 (av-avledet, aminosyrerester 655-667) og 62502 (anB-avledet, aminosyrerester 296-306), er opplistet i tabell 1. Hvert av disse peptider ble anvendt i atskilte analyser av bindingsinhibering av enten vitronektin (VN) eller fibrinogen (FG) til enten anBP3 eller avp>3. IC50-verdiene i mikromol (IC50 uM) for en enkelt analyse for hvert eksperiment er vist i tabell 3.

Resultatene fra analyser av inhibering av ligandbinding til utvalgte integrinreseptorer med lineariserte peptider viser at bare peptid 62 880 gav effektiv inhibering av binding av både FG og VN til avp3, målt ved den lavere peptidkonsentrasjon som krevdes for 50 % inhibering, sammenlignet med resultatet for auBp^-reseptoren. Ingen av de andre lineære peptider gav effektiv blokkering av ligandbinding til av$ 3, selv om peptid 62502 gav effektiv blokkering av VN-binding til

Følgelig kan ligandreseptoranalysen beskrevet heri benyttes for å søke etter både sirkulære og lineariserte, syntetiske peptider som viser selektiv spesifisitet for en gitt integrinreseptor, nærmere bestemt av$ 3l som kan benyttes som vitronektinreseptor (0^3) -antagonister ved utførelse av foreliggende oppfinnelse.

5. Karakterisering av den ubehandlede korioallantoinmembran fra kylling ( CAM)

A. Fremstilling av CAM

Angiogenese kan induseres i korioallantoinmembran fra kylling (CAM) etter at normal embryonal angiogenese har ført til dannelse av modne blodkar. Angiogenese er vist å induseres som respons på spesifikke cytokiner eller tumorfragmenter, som beskrevet av Leibovich et al., Nature, 329:630 (1987), og Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597 (1975). CAM ble fremstilt fra kyllingembryoer for påfølgende angiogeneseinduksjon og inhibering av denne, som beskrevet i eksempel 6 henholdsvis 7. 10 dager gamle kyllingembryoer ble erholdt fra Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) og inkubert ved 37 °C og 60 % luft-fuktighet. Et lite hull ble lagd i skallet ved enden av egget, rett over luftsekken, ved bruk av en liten bormaskin (Dremel, en gruppe i Emerson Electric Co., Racine, WI). Et annet hull ble boret i eggets bredside i et område fritt for embryonale blodkar, på forhånd bestemt ved gjennomlysning av egget. Nega-tivt trykk ble innført i det første hullet, noe som førte til at CAM (korioallantoinmembranen) ble trukket bort fra egg-membranen slik at det ble dannet en falsk luftsekk over CAM.

Et firkantet vindu på 1,0 x 1,0 cm ble kuttet gjennom skallet over det løsnede CAM ved bruk av et slipehjul for modell-bygging (Dremel). Dette lille vinduet tillot direkte adgang til det underliggende CAM.

Det resulterende CAM-preparat ble så enten benyttet

6 dager etter embryogenesen, et stadium som særpreges ved aktiv neovaskularisering, uten ytterligere behandling av CAM, for evaluering av effekter på embryonal neovaskularisering, eller benyttet 10 dager etter embryogenesen, hvor angiogenesen har opphørt. Dette siste preparat ble således benyttet i foreliggende oppfinnelse for indusering av ny angiogenese som respons på cytokinbehandling eller tumorkontakt, som beskrevet i eksempel 6.

B. Histologi av CAM

For å analysere den mikroskopiske struktur av kyllingembryo-CAM og/eller humane tumorer som var resektert fra kyllingembryoene, som beskrevet i eksempel 8, ble CAM og tumorer behandlet for frysekutting, som beskrevet i eksempel 3A. 6 um tykke seksjoner ble kuttet fra de nedfrosne blokker på en kryostatmikrotom for immunfluorescensanalyse.

Figur 4 viser et typisk mikrofotografi av et område uten blodkar i en ubehandlet, 10 dager gammel CAM. Da angiogenesen i CAM-systemet har opphørt på dette stadium av embryogenesen, er systemet anvendbart i foreliggende oppfinnelse for stimulering av produksjon av ny vaskulatur fra eksisterende blodkar i nærliggende områder, inn i CAM-områdene som mangler blodkar.

C. Integrinprofiler i CAM påvist ved immunfluorescens

For å undersøke vevsfordelingen av integrinreseptorer i CAM-vev ble 6 um tykke, nedfrosne seksjoner fra både tumorvev og kyllingembryo-CAM-vev fiksert i aceton i 30 sekunder og farget ved immunfluorescens med 10 mikrogram/milliliter (ug/ml) mAb-CSAT, et monoklonalt antistoff spesifikt for p^-integrinsubenheten, som beskrevet av Buck et al., J. Cell Biol., 107:2351 (1988), og derfor benyttet for kontroller, eller LM609, som fremstilt i eksempel 2. Primærfargingen ble fulgt av farging med en 1:250 fortynning av rhodaminmerket sekundært antimuseantistoff fra geit (Tago) for påvisning av det primære immunreaksjonsprodukt. Seksjonene ble så analysert med et Zeiss-immunfluorescensmikroskop.

Resultatene av immunfluorescensanalysen viser at de modne blodkar som foreligger i et ubehandlet, 10 dager gammelt kyl lingembryo, uttrykte integrin-^i-subenheten (figur 5A) . Derimot ble ingen immunreaktivitet med LM609 påvist i en serieseksjon av vevet vist i figur 5A (figur 5B). Følgelig ble integrin-dvp^, som påvises med LM609-antistoffet, ikke aktivt uttrykt av de modne blodkar i et 10 dager gammelt, ubehandlet kyllingembryo. Som vist i CAM-modellen og i de påfølgende eksempler, uttrykker blodkarene avP3 mens blodkarene gjennomgår ny vekst under normal embryogenese eller etter induksjon med enten cytokiner eller tumorer. Etter aktiv neovaskularisering, når blodkarene først har sluttet å utvikle seg, avtar ekspresjonen av avp3 til nivåer som ikke kan påvises ved immunfluorescensanalyse. Denne regulering av avp3-ekspresjonen i blodkar som gjennomgår angiogenese, i motsetning til manglende ekspresjon i modne blodkar, tilveiebringer foreliggende oppfinnelses enestående evne til å kontrollere og inhibere angiogenese, som vist i de påfølgende eksempler i en modell med CAM-angio-geneseanalysesystemet.

6. CAM- angiogeneseanalyse

A. Angiogenese indusert av vekstfaktorer

Angiogenese er vist å induseres av cytokiner eller vekstfaktorer ifølge referansene i eksempel 5A. I eksperimentene som beskrives her, ble angiogenese i CAM-preparatet beskrevet i eksempel 5 indusert av vekstfaktorer som ble til-ført topisk til CAM-blodkarene, som beskrevet heri.

Angiogenese ble indusert ved å plassere en 5 millimeter (mm) x 5 mm Whatman-filterskive (Whatman-filtrerpapir nr. 1) mettet med Hanks balanserte saltløsning (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) eller HBSS tilsatt 150 nanogram/milliliter (ng/ml) rekombinant basisk fibroblastvekstfaktor (J3FGF) (Gen-zyme, Cambridge, MA) på en CAM fra et 10 dager kyllingembryo,

i et område uten blodkar, og vinduene ble deretter forseglet med tape. I andre analyser var 125 ng/ml £FGF også effektivt for indusering av blodkarvekst. Angiogenesen ble fulgt ved mikrofotografi etter 72 timer. CAM-preparater ble raskt nedfrosset, og 6 um kryostatseksjoner ble fiksert med aceton og farget med immunfluorescens, som beskrevet i eksempel 5C, med 10 ug/ml av enten det monoklonale anti-Px-antistoff CSAT eller LM609.

Immunfluorescensmikrofotografiet i figur 5C viser økt ekspresjon av av£3 under £FGF-indusert angiogenese i kylling-CAM, i motsetning til fravær av av£3-ekspresjon i et ubehandlet kylling-CAM, som vist i figur 5B. av^3 kunne lett påvises i mange (75 % til 80 %) av blodkarene i de £FGF-behandlede CAM-preparater. I tillegg endret ekspresjonen av integrin-Pi seg ikke sammenlignet med ekspresjonen observert i en ubehandlet CAM, siden Pi også lett kunne påvises i stimulerte blodkar.

Den relative ekspresjon av av£}3- og Pi-integriner ble deretter kvantitert under £FGF-indusert angiogenese ved konfokal laserbilledanalyse av CAM-kryostatseksjonene. De fargede seksjoner ble så analysert med et Zeiss-konfokal-lasermikroskop. 25 blodkar farget med LM609 og 15 farget med CSAT (gjennomsnittsstørrelse 1200 mm<2>, spenn fra 350 til

3500 mm<2>) ble utvalgt fra tilfeldige felter, og gjennomsnittlig rhodaminfluorescens for hvert blodkar pr. enhetsareal ble målt i tilfeldige enheter ved konfokal laserbilledanalyse.

Verdiene er uttrykt som gjennomsnittlig fluorescensintensitet av karene i tilfeldige enheter ± standardfeil (SE).

Resultatene fremstilt i figur 6 viser at farging av av£3 var signifikant forhøyet (fire ganger høyere) i CAM-preparater behandlet med aFGF, bestemt ved Wilcoxon Rank Sum-testen (P < 0,0001), mens Pi-farging ikke ble vesentlig endret ved £FGF-behandling.

CAM-analysen ble videre benyttet for å undersøke virkningen av en annen kraftig angiogeneseinduser, tumor-nekrosefakt or-alfa (TNFa) , på ekspresjon av Pi- og p3-integriner. Filterskiver impregnert med enten £FGF eller TNFa og plassert på CAM-preparater fra 10 dager gamle embryoer, ble vist å fremme lokal angiogenese etter 72 timer.

Resultatene er vist i mikrofotografiene av CAM-preparater som enten er ubehandlet (figur 7A), behandlet med pFGF (figur 7B) eller behandlet med TNFa (figur 7C). Blodkar kunne lett oppdages i både det {3FGF-behandlede og TNFa-behandlede preparat, men forelå ikke i den ubehandlede CAM. Følgelig førte topisk tilførsel av en vekstfaktor eller et cytokin til induksjon av angiogenese fra modne blodkar i et nærliggende område inn i området som opprinnelig var uten blodkar. Sammenlignet med de {3FGF-induserte blodkar og den samtidige ekspresjon av avf}3, som er vist i figur 5C, førte behandling med TNFa til tilsvarende aktiviteter.

Disse funn indikerer at blodkar involvert i angiogenese viser forhøyet ekspresjon av avf}3, både hos menneske og kylling. I samsvar med dette kan ekspresjon av avp3 i dyrkede endotelceller induseres med forskjellige cytokiner in vitro, som beskrevet av Janat et al., J. Cell. Physiol., 151:588

(1992); Enenstein et al., Exp. Cell Res., 203:499 (1992), og Swerlick et al., J. Invest. Derm., 99:115 (1993).

Virkningen på vekstfaktorindusert angiogenese av antistoff- og peptidinhibitorer er vist i eksemplene 7A og 7B.

B. Embryonal angiogenese

CAM-preparatet som ble benyttet til evaluering av virkningen av angiogeneseinhibitorer på den naturlige dannelse av embryonal neovaskulatur, var det tidligere beskrevne 6 dager gamle kyllingembryo. På dette utviklingsstadium gjennomgår blodkarene denovovekst, og utgjør således et egnet system for å fastslå hvorvidt av{33 deltar i embryonal angiogenese. CAM-systemet ble fremstilt som beskrevet ovenfor, bortsett fra at analysen ble utført ved dag 6 snarere enn dag 10. Virkningen på embryonal angiogenese av behandling med antistoffer og peptider ifølge foreliggende oppfinnelse vises i eksempel 7C.

C. Angiogenese indusert av tumorer

For å undersøke rollen til av{33 i tumorindusert angiogenese ble det i CAM-analysen benyttet forskjellige avf}3-negative humane melanom- og karsinomfragmenter som på forhånd var dyrket og isolert fra CAM fra et 17 dager gammelt kyllingembryo, som beskrevet av Brooks et al., J. Cell Biol., 122:1351 (1993), og beskrevet heri. Fragmentene induserte omfattende neovaskularisering i nærvær av buffer alene.

Angiogenese ble indusert i CAM-analysesystemet ved direkte plassering av et tumorfragment på CAM-preparatet. Fremstilling av kyllingembryo-CAM var identisk med fremgangsmåten beskrevet ovenfor. I stedet for en filtrerpapir-skive ble et fragment med vekt 50 milligram (mg) til 55 mg fra enten human melanomturnor M21-L, human lungekarsinomturnor UCLAP-3, human pankreatisk karsinomcellelinje FG (Cheresh et al., Cell, 58:945-953 (1989), eller human larynkskarsinomcellelinje HEp3, som alle er avp3-negative tumorer, plassert på CAM-preparatet i et område som opprinnelig var fritt for blod-kar.

Den humane melanomcellelinje M21-L, den humane lunge-karsinomcellelinje UCLAP-3, den pankreatiske karsinomcellelinje FG eller den humane larynkskarsinomcellelinje HEp3, som alle er av{53-negative, ble benyttet for dyrkning av de faste humane tumorer på CAM-preparater fra kyllingembryoer. En enkeltcellesuspensjon med 8 x 10s M21-L, UCLAP-3 og FB eller 5 x IO<5> HEp3-celler ble først tilført CAM-preparatene i et totalvolum på 30 mikroliter (ul) i steril HBSS. Vinduene ble forseglet med tape, og embryoene ble inkubert i 7 dager for vekst av humane tumorlesjoner. Etter 7 dager, da embryoet var 17 dager gammelt, ble tumorene kuttet ut fra CAM-preparatene og befridd for omliggende CAM-vev. Tumorene ble kuttet i fragmenter på 50 mg til 55 mg for anvendelse i enten angiogenese- eller tumorvekstanalyser. Tumorfragmentene ble plassert på et nytt sett med 10 dager gamle kyllingembryo-CAM-preparater, som beskrevet i eksempel 6A, i et område fritt for blodkar.

Tumorer dyrket in vivo i kyllingembryo-CAM ble farget for avp3-ekspresjon med mAb-LM609, som beskrevet i eksempel 3A. Ingen spesifikk farging av tumorceller ble observert, noe som viser manglende avf53-ekspresjon.

Disse CAM-tumorpreparater ble deretter behandlet som beskrevet i eksemplene 7D og 7E for å måle virkningen av antistoffer og peptider på tumorindusert angiogenese. CAM-tumor-preparatene ble også behandlet som beskrevet i eksemplene 8, 9 og 12 for å måle virkningen av antistoffer og peptider på tumorregresjon og apoptose av angiogene blodkar og vaskulære celler.

7. Inhibering av angiogenese målt ved CAM- analysen

A. Inhibering av vekstfaktorindusert angiogenese

ved topisk tilførsel av inhibitorer

1) Behandling med monoklonale antistoffer

For å fastslå hvorvidt av£3 spiller en aktiv rolle i angiogenese ble filterskiver mettet med £FGF eller TNFa plassert på CAM-preparater, hvoretter de monoklonale antistoffer (også betegnet mAb) LM609 (spesifikt for av£3) , CSAT (spesifikt for £i) eller P3G2 (spesifikt for avp5) ble tilsatt preparatet.

Angiogenese ble indusert i CAM-preparater fra

10 dager gamle kyllingembryoer med filterskiver mettet med PFGF. Skivene ble så behandlet med 50 ml HBSS tilsatt 25 mg mAb i et totalvolum på 25 ul steril HBSS ved 0, 24 og 48 timer. Etter 72 timer ble CAM-preparatene høstet og plassert i en 35 mm petriskål og vasket én gang med 1 ml fosfatbufret saltvann. Bunnsiden av filtrerpapiret og CAM-vevet ble så analysert med et Olympus-stereomikroskop, med to

.observatører på dobbel-blindmåte. Angiogeneseinhibering ble

ansett som signifikant dersom CAM-preparatene viste > 50 % reduksjon i blodkarinfiltrasjon i CAM direkte under skiven. Eksperimentene ble gjentatt fire ganger pr. antistoff, med 6-

7 embryoer pr. forsøksbetingelsessett.

Resultatene av mAb-behandling på pFGF-indusert angiogenese er vist i figurene 8A-8B. Et ubehandlet CAM-preparat fritt for blodkar er vist i figur 8A for å kunne sammenlignes med pFGF-blodkarinduksjonen vist i figur 8B, og virkninger på denne av mAb i figurene 8C-8E. Tilnærmet 75 % av disse CAM behandlet med mAb-LM609 viste > 50 % inhibering av angiogenesen, som vist i figur 8E, og mange av disse forekom blottet for blodkarinfiltrering. I motsetning til dette viste bufferkontrollen (figur 8A) og filterskiver behandlet med mAb-CSAT (figur 8C) og P3G2 (figur 8D), gjennomgående omfattende vaskularisering.

Identiske resultater ble oppnådd når angiogenese ble indusert med TNFa. For å undersøke virkningene av disse antistoffer på allerede eksisterende, modne blodkar som forelå som resultat av normal blodkarutvikling nær de blodkarfrie områder, ble filterskiver mettet med mAb plassert på vaskulariserte områder av CAM fra 10 dager embryoer som ikke fikk topisk tilførsel av cytokin. Ingen av de tre mAb påvirket allerede eksisterende blodkar, anslått ved visualisering under et stereomikroskop. Således inhiberte mAb-LM609 selektivt bare ny blodkarvekst, og påvirket ikke modne blodkar i nærliggende områder. Samme virkning ble observert ved tilførsel av syntetiske peptider, enten tilført topisk eller intravenøst, som beskrevet i eksempel 7A2) henholdsvis 7E2).

2) Behandling med syntetiske peptider

CAM-analyser ble også utført med de syntetiske peptider ifølge foreliggende oppfinnelse for å fastslå virkningen av sykliske bg lineariserte peptider på vekstfaktorindusert angiogenese. Peptidene ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1, og 80 ug peptid ble benyttet i et totalvolum på 25 ul steril HBSS. Peptidløsningen ble tilført CAM-preparatet umiddelbart, og så igjen ved 24 og 48 timer. Etter 72 timer ble filtrerpapiret og omliggende CAM-vev kuttet ut og under-søkt som beskrevet ovenfor.

Resultatene fra denne analysen tilsvarte dem vist i figurene 9A-9C, som beskrevet i eksempel 7E2), hvor syntetiske peptider ble intravenøst injisert i tumorinduserte blodkar. Med kontrollpeptidet 62186 forble de J3FGF-induserte blodkar her uforstyrret, som vist i figur 9A. I motsetning til dette ble, når det sykliske RGD-peptid 62814 ble tilført filteret, dannelsen av blodkar inhibert slik at området forble uten ny vaskulatur. Denne virkning tilsvarte i utseende den vist i figur 9B, som beskrevet i eksempel 7E2) nedenfor. I tillegg, også som vist i figur 9C for intravenøst injiserte peptider, i områder hvor modne blodkar forelå et stykke fra det vekst-faktormettede filter, kunne ingen virkning observeres ved topisk behandling med syntetiske peptider på disse utenfor-liggende blodkar. Den inhibitoriske aktivitet av peptidene på angiogenese er således begrenset til områder med angiogenese indusert av vekstfaktorer og påvirker ikke nærliggende, allerede eksisterende, modne vev, og fører heller ikke til skadelig cytotoksisitet i det omliggende området.

Tilsvarende analyser ble utført med de andre syntetiske peptider fremstilt i eksempel 1, og opplistet i tabell 1.

B. Inhibering av vekstfaktorindusert angiogenese

ved intravenøs tilførsel av inhibitorer

1. Behandling med monoklonale antistoffer

Virkningen på vekstfaktorindusert angiogenese av monoklonale antistoffer intravenøst injisert inn i CAM-preparatet ble også undersøkt for anvendelse i foreliggende oppfinnelse .

Fremstilling av kyllingembryo-CAM for intravenøse injeksjoner var i det vesentlige som beskrevet i eksempel 7A med visse modifikasjoner. Under gjennomlysningen ble frem-tredende blodkar utvalgt, og merker ble plassert på eggeskal-let for å angi deres posisjoner. Hullene ble boret i skallet, CAM ble løsnet, og pFGF-mettet filtrerpapir ble plassert på CAM-preparatene som beskrevet ovenfor. Vinduene ble forseglet med steril tape, og embryoene ble på nytt plassert i inkuba-toren. 24 timer senere ble et andre lite vindu forsiktig kuttet ut på eggeskallets laterale side, rett over fremtre-dende blodkar som på forhånd var utvalgt. Det ytre eggeskall ble forsiktig fjernet, mens embryomembranene forble intakte. Skallmembranen ble gjort transparent med en liten dråpe mine-ralolje (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT), som tillot enkel visualisering av blodkarene. Rensede, sterile mAb eller syntetiske peptider som beskrives nedenfor, ble inokulert direkte inn i blodkarene med en 30 gauge kanyle ved en dose på 200 ug IgG pr. embryo i et totalvolum på 100 ul steril PBS. Vinduene ble forseglet med tape, og embryoene ble inkubert i 72 timer. Filterskivene og omliggende CAM-vev ble analysert som beskrevet tidligere.

For å lokalisere mAb-LM609 i CAM-vev eller i tumorvev som på forhånd var inokulert intravenøst med LM609, som vist heri og i de påfølgende eksempler, ble de fikserte seksjoner blokkert med 2,5 % BSA i HBSS i 1 time ved romtemperatur, fulgt av farging med en 1:250 fortynning av rhodaminmerket sekundært antimuseantistoff fra geit (Tago). Seksjonene ble så analysert med et Zeiss-immunfluorescensmikroskop.

Resultatene av intravenøs antistoffbehandling på ØFGF-induserte blodkar i CAM-preparater er vist i figurene 10A-10C. I figur 10A er angiogenesen indusert som resultat av pFGF-behandling vist. Ingen forandring i den J3FGF-induserte vaskulatur ble observert ved intravenøs behandling med mAb-P3G2, et anti-avP5-antistoff, som vist i figur 10B. I motsetning til dette førte behandling av CAM-preparatet med pFGF-indusert angiogenese med LM609, et ant i-av|33-antistof f, til fullstendig inhibering av vekst av nye blodkar inn i filter-området, som vist i figur 10C. Den inhiberende virkning på angiogenesen er således et resultat av inhibering av 0^3-reseptoraktiviteten av det anti-avp3-spesifikke antistoff LM609. Siden blokkering av avp5 ikke fører til inhibering av dannelse av neovaskulatur inn i filtersetet i CAM-preparatene, følger det at avPs ikke er essensiell for vekst av nye blodkar, i motsetning til avp3.

2) Behandling med syntetiske peptider

De syntetiske peptider fremstilt i eksempel 1, injiseres hver for seg intravenøst inn i vekstfaktorinduserte blodkar i CAM-preparatet som beskrevet ovenfor. Virkningen av peptidene på blodkarenes levedyktighet anslås på tilsvarende vis.

C. Inhibering av embryonal angiogenese ved topisk til førsel

1) Behandling med monoklonale antistoffer

For å fastslå hvorvidt av$ 3 deltar i embryonal angiogenese ble virkningen av LM609 på denovovekst av blodkar i CAM-preparater undersøkt i 6 dager gamle embryoer, et stadium som særpreges ved aktiv neovaskularisering, som beskrevet i eksempel 5A. CAM-analysen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 6C, med påfølgende topisk tilførsel av filterskiver mettet med mAb, plassert på CAM fra 6 dager gamle embryoer i fravær av cytokiner. Etter 3 dager ble CAM kuttet ut og fotografert. Hvert eksperiment omfattet 6 embryoer pr. gruppe og ble gjentatt to ganger.

Antistoff LM609 (figur 11C), men ikke CSAT (figur 11A) eller P3G2 (figur 11B), forhindret vaskulær vekst under disse betingelser, dette antyder at av^3 spiller en vesentlig rolle i embryonal neovaskularisering som var uavhengig av til-satte vekstfaktorer for induksjon av angiogenese.

2) Behandling med syntetiske peptider

De syntetiske peptider fremstilt i eksempel 1 tilsettes hver for seg til det embryonale CAM-preparat fremstilt ovenfor, og som beskrevet i eksempel 5A2), ved enten topisk tilførsel til CAM eller intravenøs tilførsel til blodkar. Virkningen av peptidene på blodkarenes levedyktighet anslås på tilsvarende måte.

D. Inhibering av tumorindusert angiogenese ved

topisk tilførsel

1) Behandling med monoklonale antistoffer

I tillegg til angiogeneseanalysene beskrevet ovenfor, hvor virkningen av anti-a^-antagonister, LM609 og peptidene 62181, 62184, 62185, 62187 og 62880 på embryonal angiogenese ble evaluert, ble rollen til avP3 i tumorindusert angiogenese også undersøkt. Som en induser ble av.P3-negative humane M21-L-melanomfragmenter, på forhånd dyrket og isolert fra CAM fra et 17 dager gammelt kyllingembryo, benyttet. Fragmentene ble fremstilt som beskrevet i eksempel 6C.

Som beskrevet ovenfor i eksempel 7A1), ble mAb til-ført topisk hver for seg til tumorfragmentene ved en konsentrasjon på 25 ug i 25 ul HBSS, og vinduene ble så forseglet med tape. mAb ble tilsatt igjen på samme måte ved 24 timer og 48 timer. Etter 72 timer ble tumorene og omliggende CAM-vev analysert som beskrevet ovenfor i eksempel 7A1).

Som beskrevet i eksempel 6C, ble tumorene opprinnelig dannet ved å transplantere dyrkede M21-L-celler som ikke uttrykker integrin-avp3, som beskrevet av Felding-Haberman et al., J. Clin. Invest., 89:2018 (1992), til CAM fra 10 dager gamle kyllingembryoer. Disse avp3-negative fragmenter induserte omfattende neovaskularisering i nærvær av buffer alene eller i nærvær av mAb - CSAT (anti-Pi) eller P3G2 (anti-dvPs) . I motsetning til dette stoppet mAb-LM609 (anti-dvfh) fullstendig infiltrasjon av de fleste blodkar inn i tumormassen og omliggende CAM.

For å kvantitere virkningen av mAb på tumorindusert angiogenese ble blodkar som gikk inn i tumoren i CAM-prepa-ratenes fokalplan, telt under et stereomikroskop av to obser-vatører på dobbel-blindmåte. Hver søyle i figur 12 representerer gjennomsnittlig antall blodkar ± standardfeil fra 12 CAM-preparater i hver gruppe, som representerer duplikat-eksperimenter.

Denne kvantitative analyse viste en tre gangers reduksjon i antall blodkar som går inn i tumorer behandlet med mAb-LM609 sammenlignet med tumorer behandlet med buffer eller med de andre mAb, P3G2 eller CSAT (P < 0,0001), som bestemt ved Wilcoxon Rank Sum-testen. Det faktum at M21-L-tumorer ikke uttrykker avp3, antyder at mAB-LM60 9 inhiberer angiogenesen ved direkte å påvirke blodkar, snarere enn tumorcellene. Disse resultater er i samsvar med den histologiske fordeling av av{33 i cancervevsbiopsier, vist i figurene 3A-3D, hvor fordelingen av av^3 var begrenset til blodkarene i tumoren og ikke til tumorcellene selv.

2) Behandling med syntetiske peptider

De syntetiske peptider fremstilt i eksempel 1, til-føres topisk til CAM-analysesysternet med tumorindusert angiogenese, som beskrevet ovenfor. Virkningen av peptidene på blodkarenes levedyktighet anslås på tilsvarende måte.

E. Inhibering av tumorindusert angiogenese ved

intravenøs tilførsel

1) Behandling med monoklonale antistoffer

Tumorinduserte blodkar fremstilt som beskrevet i eksempel 7D1), ble også behandlet med mAb tilført ved intra-venøs injeksjon. Tumorer ble plassert på CAM-preparater, som beskrevet i eksempel 7D1), og vinduene forseglet med tape, og 24 timer senere ble 2 00 ug rensede mAb injisert intravenøst i blodkar i kyllingembryoet, som beskrevet tidligere. Kyllingembryoene ble så inkubert i 7 dager. Omfanget av angiogenese ble så observert som beskrevet ovenfor. Som beskrevet i eksempel 8 nedenfor, ble tumorene etter dette tidsrom kuttet ut og analysert ved veiing for å fastslå virkningen av antistoffbehandling på tumorvekst eller -suppresjon.

2) Behandling med syntetiske peptider

Virkningen av peptidbehandling på tumorindusert vaskulatur i CAM-analysesystemet ble også undersøkt. Tumor-CAM-preparatet ble benyttet som beskrevet ovenfor, bortsett fra at i stedet for intravenøs injeksjon av et mAb ble syntetiske peptider, fremstilt som beskrevet i eksempel 1 og eksempel 7A2), injisert intravenøst hver for seg inn i synlige blodkar.

Resultatene av CAM-analyser med det sykliske peptid 66203, inneholdende HCl-saltet, og kontrollpeptidet 62186 er vist i figurene 9A-9C. I figur 9A påvirket ikke behandling med kontrollpeptidet de mange og store blodkar som ved tumor-behandlingen ble indusert til å vokse inn i et område av CAM-preparatet som opprinnelig var fritt for blodkar. Når det sykliske RGD-peptid 66203, en avf33 - antagonist, ble påført filteret, ble derimot dannelsen av blodkar inhibert slik at området forble uten ny vaskulatur, som vist i figur 9B. Den inhibitoriske virkning av det RGD-holdige peptid var spesifikk og lokalisert, som vist ved fravær av skadelige virkninger på blodkarene plassert ved siden av tumoren. I figur 9C, hvor inhibitoriske peptider injiseres intravenøst inn i CAM-analysesystemet, kunne således ingen virkning observeres på de allerede eksisterende modne blodkar som forelå i CAM-preparatet i områder nærliggende, men likevel fjernt fra, tumorens plassering. De allerede eksisterende blodkar i denne plassering ble ikke påvirket av det inhibitoriske peptid som strømmet inne i karene, selv om dannelse av nye blodkar fra disse allerede eksisterende blodkar inn i tumormassen ble inhibert. Syntetiske peptider, heriblant 66203 og 62184, som allerede er vist i ligandreseptoranalyser i eksempel 4 å være avP3-antagonister, viser seg nå å inhibere angiogenese på en måte som er begrenset til blodkar som gjennomgår utvikling og ikke omfatter modne, allerede eksisterende blodkar. I tillegg fører intravenøs infusjon av peptider ikke til skadelig cytotoksisitet i det omliggende området, som vist ved den intakte vaskulatur i figur 9C.

Tilsvarende analyser utføres med de andre syntetiske peptider fremstilt i eksempel 1, og opplistet i tabell 1.

8 . Inhibering av tumorvevsvekst med QyP?- antagonister, målt i CAM- analysen

Som beskrevet i eksempel 7D1), ble, i tillegg til visuell vurdering av virkningen av anti-dvp^-antagonister på vekstfaktor- eller tumorindusert angiogenese, virkningen av antagonistene også vurdert ved å måle endringer i tumormassen etter behandling. For denne analyse ble CAM-analysesysternet for tumorindusert angiogenese fremstilt som beskrevet i eksemplene 6C og 7D. Etter den 7 dager lange inkubasjonstiden ble de resulterende tumorer utkuttet fra CAM-preparatet og befridd for gjenværende CAM-vev, vasket med 1 ml fosfatbufret saltvann, hvoretter våtvekten ble bestemt for hver tumor.

I tillegg omfattet forberedelse av tumoren for mikroskopisk, histologisk analyse fiksering av representative tumorprøver i Bulins fiksativ i 8 timer og innstøping i para-fin. Serieseksjoner ble kuttet og farget med hematoksylin og eosin (H&E) for mikroskopisk analyse, Gladson et al., J. Clin. Invest., 88:1924 (1991). Seksjonene ble fotografert med et Olympus-mikroskop ved 250 x.

A. Topisk tilførsel

Resultatene for vekter av typiske humane melanom-tumorer som følge av topisk tilførsel av kontrollbuffer (HBSS) , P3G2 (anti-dvPs) eller LM609 (anti-avJ33) er gitt i tabell 4. Et antall embryoer ble evaluert for hver type behandling, og gjennomsnittstumorvekt i milligram (mg) fra hver behandling er beregnet sammen med middelverdiens standardfeil, som vist nederst i tabellen.

Behandling av en avp3-negativ human melanomtumormasse i CAM-analysesystemet med LM609 førte til en reduksjon fra 172 mg ± 26 for den ubehandlede gjennomsnittstumor til 52 mg 13. P3G2-antistoffet hadde ingen virkning på tumormassen. Således førte blokkering av avp3-reseptoren ved topisk tilførsel av avp3-spesifikt LM609-antistoff til en regresjon av tumormassen sammen med inhibering av angiogenese, som vist i de foregående eksempler. Diameteren for tumoren etter behandling med P3G2 var tilnærmet 8 mm til 1 cm i gjennomsnitt. I motsetning til dette var de LM609-behandlede tumorer gjennomsnittlig 2-3 mm i diameter.

Frosne seksjoner av disse tumorer viste en intakt tumorcytoarkitektur for tumoren behandlet med P3G2, i motsetning til manglende organisert cellulær struktur i tumoren behandlet med LM609. avp3-reseptoraktivitet er følgelig essen-sielt for at en av|33-negativ tumor skal opprettholde sin masse ved å ernæres ved utvikling av avp3-uttrykkende neovaskulatur. Blokkering av avp3 med av{33-antagonistene ifølge foreliggende oppfinnelse fører til inhibering av angiogenese inn i tumoren, noe som endelig fører til reduksjon av tumormassen.

B. Intravenøs tilførsel

Resultatene for vekten av typiske karsinomturnorer (UCLAP-3) som følge av intravenøs tilførsel av kontrollbuffer (PBS, fosfatbufret saltvann) , CSAT (anti-Øa.) eller LM609 (anti-avp3) er gitt i tabell 5. Et antall embryoer ble evaluert for hver behandlingsmåte, og gjennomsnittstumorvekten for hver behandling er beregnet sammen med standardfeilen av middel-verdien, som vist nederst i tabellen.

Behandling av en avpJ3-negativ human karsinomturnor-masse i CAM-analysesysternet med LM609 førte til at vekten ble redusert fra 85 mg + 7 for den ubehandlede gjennomsnittstumor til 30 mg ± 6. CSAT-antistoffet påvirket ikke i vesentlig grad vekten av tumormassen. Således førte blokkering av av^3-reseptoren ved intravenøs tilførsel av ctvp^-spesifikt LM609-antistoff til regresjon av et karsinom, på samme måte som den gjorde for melanomtumormassen ovenfor, sammen med en inhibering av angiogenese, som vist i de foregående eksempler. I tillegg ble human melanomtumorvekst inhibert på tilsvarende måte ved intravenøs injeksjon av LM609.

9. Regresjon av tumorvevsvekst med avj33- antagonister, målt i CAM- analysen

For å vurdere virkningene av avp3-antagonister på tumorvekst og overlevelse ble fragmenter av humant melanom og fragmenter av lungekarsinom, parikreaskarsinom og larynkskarsinom plassert på CAM-preparater fra 10 dager gamle embryoer, som beskrevet i eksempel 5A.

A. Intravenøs tilførsel

1) Behandling med monoklonale antistoffer

a. Behandling med LM609 ( anti- avp3) og CSAT

( anti- Pi)

24 timer etter implantering i CAM av karsinomfragmenter fra avp3-negativ humant melanom M21-L, pankreatisk karsinom FG, humant lungekarsinom UCLAP-3 eller humant larynkskarsinom HEp3 ble embryoer injisert intravenøst med PBS alene eller en enkelt dose (300 ug/100 ul av enten mAb-LM609 (anti-av£3) eller CSAT (anti-{3i) . Tumorene fikk vokse i ytterligere 6 dager. Etter inkubasjonstiden ble tumorene forsiktig kuttet ut og befridd for omliggende CAM-vev. Utkutting av tumorer ble ut-ført av to uavhengige operatører som kun fjernet den lett definerbare faste tumormasse. Tumorene hadde godt definerte grenser, slik at den tynne, semitransparente membran (CAM), som lett kan atskilles fra den faste tumormasse, kunne fjernes uten å forstyrre tumormassen. De utkuttede tumorer ble veid og undersøkt morfologisk og histologisk.

Som vist i figur 13, ble våttumorvekter etter 7 dager bestemt og sammenlignet med den opprinnelige tumorvekt før behandlingen. Hver søyle representerer middelverdi ± standardfeil for 5-10 tumorer pr. gruppe. mAb-LM609 inhiberte tumorvekst signifikant (p < 0,001) sammenlignet med kontroller for alle analyserte tumorer. Tumorer behandlet med PBS eller CSAT vokste i alle tilfeller. I motsetning til dette hindret mAb-LM609 ikke bare vekst av disse tumorer, men induserte også omfattende regresjon i de fleste tilfeller. Det er viktig at disse tumorceller ikke selv uttrykker integrin-avJ33, noe som viser at vekstinhiberingen skyldtes antiangiogenesevirkningene av dette antistoff på neovaskulatur, snarere enn en virkning direkte på tumorcellene.

b. Behandling med LM609 ( anti- avj33) og P3G2

( anti- gvp5)

Fragmenter av human melanomtumor M21-L (50 mg) ble implantert i CAM-preparater fra 10 dager gamle embryoer, som beskrevet i eksempel 5A. 24 timer senere ble embryoene injisert intravenøst med PBS alene eller med en enkelt dose (300 ug/100 ul) av enten mAb-LM609 (anti-avp3) eller P3G2 (anti-civPs) . Tumorene fikk vokse, som beskrevet i eksempel 9Al)a ovenfor, og ble undersøkt morfologisk og histologisk, som beskrevet heri.

Representative eksempler på M21-L-tumorer behandlet med mAb-P3G2 (anti-avp5) eller LM609 (anti-avp3) ble undersøkt morfologisk. De P3G2-behandlede tumorer var store (8 mm diameter) og godt vaskulariserte, mens de behandlet med mAb-LM609 var mye mindre (3 mm diameter) og manglet påvisbare blodkar.

Tumorene ble videre undersøkt ved fremstilling av histologiske seksjoner og farget med hematoksylin og eosin, som beskrevet i eksempel 9Al)a. Som vist i figur 14 (øvre felt) viste tumorer behandlet med mAb-P3G2 (anti-avp5) et stort antall levedyktige og aktivt delende tumorceller, som vist ved mitosefigurer (pilhoder), så vel som flere blodkar (piler) gjennom tumorstroma. I motsetning til dette kunne få, om noen, levedyktige tumorceller eller blodkar påvises i tumorer behandlet med mAb-LM609 (anti-av£3) (figur 14, nedre felt). Disse resultater viser at antagonister av integrin-av£3 inhiberer tumorindusert angiogenese, noe som fører til vekststopp og regresjon hos en rekke humane tumorer in vivo. Det er viktig å bemerke at embryoer undersøkt etter 7 dagers tumorvekst (embryodag 17) virket normale ved visuell undersøkelse, enten de var behandlet med en avp3-antagonist eller ikke. Disse funn antyder at antagonister av dette integrin ikke er toksiske for embryoer i utvikling.

2) Behandling med syntetiske peptider

Humane M21-L-melanomtumorfragmenter (50 mg) ble implantert i CAM-preparater fra 10 dager gamle embryoer, som beskrevet i eksempel 5A. 24 timer senere ble embryoene gitt en enkelt intravenøs injeksjon med 300 ug/100 ul av enten syklo-RADfV (69601) eller syklo-RGDfV (66203). Etter totalt 72 timer ble tumorene fjernet, undersøkt morfologisk og fotografert med et stereomikroskop, som beskrevet i eksempel 9A1).

Feltene vist i figurene 15A-15E viser: figur 15A: prøver i duplikat behandlet med syklo-RADfV-peptid (69601);

figur 15B: prøver i duplikat behandlet med syklo-RGDfV-peptid

(66203); figur 15C: nærliggende CAM-vev tatt fra de samme

embryoer behandlet med syklo-RGDfV-peptid (66203); og figurene 15D og 15E: høy forstørrelse (13 x) av peptidbehandlede tumorer. Figur 15D viser normale blodkar fra kontrollpeptid-(69601)-behandlet tumor. Figur 15E viser eksempler på ødelagte

blodkar fra syklo-RGDfV-peptid(66203)-behandlede tumorer (piler).

Resultatene viser at kun peptid 66203 inhiberte blodkardannelse, og videre at blodkar i CAM-vevet ved siden av tumoren ikke ble påvirket.

10 . Regresjon av tumorvevsvekst med avp3- antagonister, målt ved in vivo- kaninøyemodellanalysen Virkningen av ant i-avp3-antagonist er på vekstfaktorindusert angiogenese kan observeres i naturlig transparente strukturer, f.eks. i øyets cornea. Nye blodkar vokser fra cornearanden, som har rik blodtilførsel, inn mot sentrum av cornea, som normalt ikke har blodtilførsel. Angiogenesestimu-latorer som f.eks. pFGF induserer, når de tilføres cornea, vekst av nye blodkar fra cornearanden. Angiogeneseantagonister tilført cornea inhiberer vekst av nye blodkar fra cornearanden. Således gjennomgår cornea angiogenese ved en invasjon av endotelceller fra cornearanden inn i det tette, kollagen-pakkede corneavev, noe som er lett synlig. Kaninøyemodell-analysen tilveiebringer således en in vivo-modell for direkte

■observasjon av stimulering og inhibering av angiogenese etter implantering av forbindelser direkte inn i øyets cornea.

A. In vi vo- kaninøyemodellanalyse

1) Angiogenese indusert med vekstfaktorer Angiogenese ble indusert i in vi vo-kaninøyemodell analysen med vekstfaktoren pFGF, som beskrevet i det følgende.

a. Fremstilling av hydronkuler tilsatt vekst faktor og monoklonale antistoffer Hydronpolymerkuler med vekstfaktor og mAb ble fremstilt som beskrevet av D'Amato et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 91:4082-4085 (1994). Enkeltkulene inneholdt 650 ng av vekstfaktoren £FGF bundet til sukralfat (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation) for stabilisering av £FGF, og for å gi lang-som frigjøring inn i det omliggende vev. I tillegg ble hydronkuler fremstilt som inneholdt enten 40 pg av mAb-LM609 (anti-avp3) eller mAb-PlF6 (anti-av£5) i PBS. Kulene ble støpt i spesialfremstilte teflonplugger med et 2,5 mm hull boret inn i overflaten. Tilnærmet 12 ul støpemateriale ble plassert i hver plugg og polymerisert over natten i en sterilbenk. Kulene ble så sterilisert ved ultrafiolett bestråling.

b. Behandling med monoklonale antistoffer

Hvert eksperiment omfattet tre kaniner hvor ett øye ble tilført en kule som inneholdt £3FGF og LM609, og det andre øyet en kule som inneholdt J3FGF og mAb-PlF6 (anti-avPs) fra mus. Bruk av øyepar-analyse for sammenligning av LM609 (anti-avp>3) med andre mAb- og PBS-kontroller gir muligheten for rigorøs analyse for å påvise signifikante forskjeller mellom de analyserte mAb.

mAb-PlF6 immunreagerer med integrinet avPs som finnes på overflaten av endotelceller i blodkar, men som antas ikke å delta i angiogenesen. For å fastslå hvorvidt mAB-PlF6 påvirker angiogenesen ble kuler som kun inneholdt dette mAb, fremstilt og analysert som beskrevet ovenfor for å bekrefte at dette mAb ikke induserer angiogenese.

Alle analyserte mAb ble renset fra ascitesvæske ved bruk av protein-A-Sepharose CL-4B-affinitetskolonnekromato-grafi ifølge velkjente fremgangsmåter. Det eluerte immunglobu-lin ble så dialysert mot PBS og behandlet med Detoxi-gel (Pierce Chemicals) for å fjerne endotoksin. Endotoksin er vist å være en kraftig stimulator av angiogenese og inflammasjon. mAb-preparatene ble derfor analysert for nærvær av endotoksin med "Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay" (Bio-Whittaker), og kun mAb-preparater uten påvisbart endotoksin ble benyttet i kaninøyemodellanalysen.

En hydronkule som inneholdt ØFGF og mAb-LM609 (anti-av$3) eller P1F6 (anti-a^s) # ble innsatt i cornealommen som forefinnes i kaninøyne. Hydronkulen inneholdt også sukralfat for å stabilisere pFGF under analysen. Enkeltkuler ble implantert i kirurgisk dannede "lommer" i mellomstroma i kanin-cornea. Den kirurgiske behandling ble utført under sterile betingelser med et Wild Model M691-operasjonsmikroskop utstyrt med en strålesplitter med et montert kamera for fotografisk registrering av de enkelte corneaer. En "lomme" på 3 mm x 5 mm ble dannet i det korneale stroma ved å lage et 3 mm innsnitt på halve corneas tykkelse med et 69 Beaver-blad. Stroma ble dissekert perifert ved bruk av en irisspatel, og kulen ble implantert med sin perifere kant 2 mm fra limbus.

I løpet av de påfølgende 14 dager diffunderte {3FGF og mAb fra den implanterte kule til det omliggende vev, og gav således angiogenese fra randen av cornea.

Representative resultater for hver behandling er av-bildet i figurene 16A-16E. Mengden blodkar som foreligger, kvantiteres og beskrives ved å benytte klokketimer som er definert som følger: Øyet inndeles i 12 like seksjoner på samme måte som en klokke er inndelt i timer. "Én klokketime med blodkar" viser til antall blodkar som fyller et område i øyet som tilsvarer 1 time på en klokke. De fem kaniner som kun ble gitt |3FGF, viste omfattende angiogenese hvor nye blodkar hadde vokst fra cornearanden mot corneas sentrum, som normalt ikke har blodkar. Én av disse kaniner hadde bare én klokketime med blodkar mot kulen. To av kaninene som ble gitt både J3FGF og mAb-LM609, hadde absolutt ingen påvisbar angiogenese opptil 14 dager etter det kirurgiske inngrep. Én av disse kaniner hadde tre områder med blødende, voksende blodkar på dag 14. To av kaninene som ble gitt pFGF og mAb-P3G2 (anti-avPs) , viste omfattende vaskularisering hvor nye blodkar hadde vokst fra cornearanden inn i cornea. Én av disse kaniner hadde bare 1-

2 timer med blodkar mot kulen.

Som det fremgår av kaninøyemodellanalysen, ble ingen angiogen virkning påvist på normale paralimbale blodkar i nærvær av vekstfaktoren £FGF hos kaniner som ble gitt mAb-LM609 (anti-av£3) . I motsetning til dette ble angiogenese observert i paralimbale blodkar i nærvær av vekstfaktoren fJFGF hos kaniner som ble gitt mAb-P3G2 (anti-avp5) . Den fullstendige inhibering av korneal angiogenese med mAb-LM609 er vesentlig større enn for noe tidligere beskrevet antiangiogent reagens.

11. In vivo - regresjon av tumorvevsvekst med avj33- antagonister, målt i kimær mus:menneskeanalysen

En in vivo kimær mus:menneskemodell ble dannet ved å erstatte en del av huden hos en SCID-mus med human neonatal forhud (figur 17). Etter at hudtransplantatet var dannet, ble den humane forhud inokulert med karsinomceller. Etter at en målbar tumor var etablert, ble enten mAb-LM609 (anti-a^) eller PBS injisert i musens halevene. Etter 2-3 uker ble tumoren utkuttet og analysert ved vekt og histologi.

A. In vivo kimær mus:menneskeanalyse

In vivo kimær mus:menneskemodellen fremstilles i det vesentlige som beskrevet av Yan et al., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993). Kort beskrevet fjernes kirurgisk et hud-område på 2 cm<2> fra en SCID-mus (6-8 uker gammel) og erstattes med en human forhud. Musen bedøves, og håret fjernes fra et 5 cm<2> område på hver side av det laterale abdominalområdet ved barbering. To sirkulære transplantasjonsområder på 2 cm<2> fremstilles ved å fjerne huden i sin fulle tykkelse ned til binde-vevshinnen. Humane hudtransplantater i full tykkelse med samme størrelse, avledet fra human neonatal forhud, ble plassert på sårområdene og sydd i posisjon. Transplantatet ble dekket med en bandasje som ble fastsydd til huden. Mikrovevstape ble også påført for å dekke såret.

Den humane melanomcellelinje M21-L eller brystkarsi-nomcellelinjen MDA 23.1 (ATCC HTB 26, avp3-negativ ifølge immunreaktiviteten av vevsseksjoner med mAb-LM609) ble benyttet for å danne faste humane tumorer på de humane hudtransplantater hos SCID-musen. En enkeltcellesuspensjon med 5 x IO<6 >M21-L- eller MDA 23.1-celler ble injisert intradermalt inn i det humane hudtransplantat. Musene ble så observert i 2-4 uker for vekst av målbare humane tumorer.

B. Intravenøs tilførsel

1) Behandling med monoklonale antistoffer

Etter fremvekst av målbare tumorer ble SCID-mus som var injisert med M21-L-tumorceller, gitt en intravenøs injeksjon i halevenen med 250 ug av enten mAb-LM609 (anti-avJ33) eller PBS to ganger i uken i 2-3 uker. Etter dette tidsrom ble tumorene utkuttet fra huden og befridd for omliggende vev. Flere mus ble evaluert for hver behandling, og gjennomsnittlig tumorvekt for hver behandling ble beregnet og vist nederst i tabell 6.

Behandling av den avp3-negative M21-L-humankarsinom-tumormasse i kimær musrmenneskeanalysesystemet med LM609 (anti-avp3) førte til en reduksjon i gjennomsnittlig tumorvekt fra 198 mg for den PBS-behandlede tumor til 113 mg.

Representative eksempler på M21-L-tumorer behandlet med mAB-LM609 (anti-avJ33) og PBS ble undersøkt morfologisk. De PBS-behandlede tumorer var store (8-10 mm i diameter) og godt vaskulariserte, mens de behandlet med mAb-LM609 (anti-av£3) var mye mindre (3-4 mm i diameter) og manglet påvisbare blod-kar.

Tumorer dannet i hudtransplantater som var injisert med MDA 23.1-celler, var påvisbare og målbare. Morfologisk undersøkelse av de etablerte tumorer viste at neovaskularisering fra det transplanterte humane vev inn i MDA 23.1-tumorcellene hadde foregått.

Således førte blokkering av avp3-reseptoren ved intravenøs tilførsel av avpVspesifikt antistoff LM609 til regresjon av et karsinom i dette modellsystem, på samme måte som i CAM- og kaninøyemodellsystemene, som beskrevet i eksempel 9 henholdsvis 10.

12 . Stimulering av vaskulærcellers evne til å gå inn i cellesyklus og gjennomgå apoptose i nærvær av integrin gvj33- antagonister, målt ved CAM- analysen

Den angiogene prosess avhenger klart av evnen til cytokiner som £FGF og VEGF til å stimulere proliferasjon i vaskulærceller, Mignatti et al., J. Cell. Biochem., 471:201

(1991); Takeshita et al., J. Clin. Invest., 93:662 (1994); og Koyama et al., J. Cell. Physiol., 158:1 (1994). Det er imidlertid også klart at signalbegivenheter kan regulere differensiering av disse vaskulærceller til modne blodkar. Således kan det tenkes at forstyrrelse av signaler som gjelder enten vekst eller stimulering av vaskulærceller som gjennomgår ny vekst

eller angiogenese, kan føre til forstyrrelse av angiogenesen.

Integrinligeringshendelser er vist å delta in vitro både i celleproliferasjon og apoptose, eller programmert celledød, Schwartz, Cancer Res., 51:1503 (1993); Meredith et al., Mol. Biol. Cell., 4:953 (1993); Frisch et al., J. Cell. Biol.', 124:619 (1994); og Ruoslahti et al., Cell, 77:477

(1994) . Nærmere undersøkelse av virkningen av av{J3-antagonister på angiogenese viser forekomst av avbrutte og ødelagte tumor-assosierte blodkar. Det er derfor mulig at dette tap av blod-karkontinuitet kan skyldes selektiv nekrose eller apoptose av vaskulærceller.

For å undersøke denne mulighet ble CAM-preparater undersøkt etter induksjon av angiogenese med vekstfaktoren £FGF og behandling med mAb og sykliske peptider ifølge foreliggende oppfinnelse.

A. Behandling med monoklonale antistoffer

Apoptose kan påvises ved en rekke forskjellige fremgangsmåter som omfatter direkte undersøkelse av DNA isolert fra vev for å påvise fragmentering av DNA, og påvisning av 3'0H i intakt vev med et antistoff som spesifikt påviser frie 3'OH-grupper i fragmentert DNA.

1) Analyse av DNA- fragmentering

Angiogenese ble indusert ved å plassere filterskiver mettet med fiFGF på CAM-preparater fra 10 dager gamle embryoer, som beskrevet i eksempel 6A. Immunhistologisk analyse av CAM-preparater med LM609 (anti-avp3) viste høyest ekspresjon av av£3 i blodkar 12-24 timer etter at angiogenesen ble initiert med {5FGF. 24 timer etter stimulering med pFGF ble derfor embryoer inokulert intravenøst med 100 ul av enten PBS alene eller PBS tilsatt 300 ug av enten mAb-CSAT (anti-p^) eller LM609 (anti-av£3) .

DNA-fragmentering ble påvist ved utkutting av CAM-vevet direkte under de pFGF-mettede filterskiver 24 eller 48 timer etter intravenøs inokulering med mAB-LM609 (anti-avp3) , CSAT (anti-Pi) eller PBS. Utkuttet CAM-vev ble vasket tre ganger med sterilt PBS og oppkuttet, resuspendert i 0,25 % bakteriell kollagenase (Worthington Biochemical, Freehold, NJ) og inkubert i 90 minutter ved 37 °C med omblanding av og til. DNA ble ekstrahert fra like antall CAM-celler fra enkeltcellesuspensjoner, som tidligere beskrevet; Bissonette et al., Nature, 359:552 (1992) . Kort beskrevet ble like antall CAM-celler lysert i 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA i 0,5 %

(vol/vol) Triton X-100 (Sigma, St. Lous, MO). Cellelysatene ble sentrifugert ved 16000 x g i 15 minutter ved 4 °C for å skille løselig, fragmentert DNA fra nedsentrifugert intakt kromatin. Fragmentert DNA ble vasket, utfelt og analysert i en 1,2 % (vekt/vol) agarosegel.

Løselig fragmentert DNA ble isolert fra et likt antall CAM-celler fra hver behandling, atskilt elektroforetisk i en agarosegel og visualisert ved farging med etidiumbromid. Ingen forskjell kunne påvises i relativ mengde av DNA-fragmentering som følge av de tre forskjellige behandlinger 24 timer etter behandlingen. 48 timer etter behandling med mAB-LM609 (anti-avf}3) ble imidlertid en signifikant økning i DNA-fragmentering observert, sammenlignet med embryoer behandlet med enten mAb-CSAT (anti-£i) eller PBS alene.

2) Stimulering av vaskulærceller til å gå inn i cellesyklus

3

For eksperimentell undersøkelse av rollen til av{33 i disse prosesser ble celler avledet fra CAM-preparater behandlet med eller uten fJFGF farget med propidiumjodid og immun-reagert med mAb-LM609 (anti-avp3) .

CAM isolert fra embryoer 24 og 48 timer etter behandling med mAb-LM609 (anti-av]33) , CSAT (anti-Øi) eller PBS ble oppdelt til enkeltcellesuspensjoner ved inkubering med bakteriell kollagenase, som beskrevet ovenfor. Enkeltceller ble så permeabilisert og farget med "Apop Tag Insitu Detection Kit" ifølge produsentens instruksjoner (Oncor, Gaithersburg, MD). Apop-Tag er et antistoff som spesifikt påviser frie 3'0H-grupper i fragmentert DNA. Påvisning av slike frie 3'0H-grupper er en etablert fremgangsmåte for påvisning av apoptotiske celler, Gavrielli et al., J. Cell Biol., 119:493 (1992).

Apop-Tag-fargede celler ble så vasket med 0,1 %

(vol/vol) Triton X-100 i BPS og resuspendert i FACS-buffer tilsatt 0,5 % (vekt/vol) BSA, 0,02 % (vekt/vol) natriumazid og 200 ug/ml RNase A i PBS. Cellene ble inkubert i 1,5 time, vasket og analysert ved fluorescensaktivert cellesortering. Cellefluorescens ble målt med et FACScan flow-cytometer og måleverdiene analysert som beskrevet nedenfor.

Cellefluorescens ble målt med et FACScan flow-cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Sidespredning (SSC) og foroverspredning (FSC) ble bestemt samtidig, og alle verdier ble oppsamlet med en Hewlet Packard (HP9000) data-maskin utstyrt med FACScan-forskningsprogramvare (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Verdiene ble analysert med programvaren P.C. Lysis-versjon I (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Negative kontroilporter ble satt ved å benytte cellesuspensjoner uten tilsetning av primærantistoffer fra Apop-Tag-settet. Identiske porter ble benyttet på begge celle-populasjoner, noe som gav analyse av tilnærmet 8000 celler for hver behandling.

Prosent enkeltceller avledet fra mAb-behandlede CAM-preparater og farget med Apop-Tag, bestemt ved FACS-analyse, er vist .i figur 18. Den skraverte søylen viser celler fra embryoer behandlet 24 timer før analysen. Den stiplede søylen viser celler fra embryoer behandlet 48 timer før analysen. Hver søyle angir middelverdi ± standardfeil for prøver i triplikat.

Som vist i figur 18, viste CAM-preparater behandlet

2 dager tidligere med mAb-LM609 (anti-a^) , 3-4 gangers økning 1 Apop-Tag-farging sammenlignet med CAM-preparater behandlet enten med PBS alene eller med CSAT (anti-Øi) .

B. Behandling med syntetiske peptider

CAM-analyser med vekstfaktorindusert angiogenese, som beskrevet i eksempel 6A, ble også utført med de syntetiske peptider ifølge foreliggende oppfinnelse for å fastslå virkningen av sykliske peptider på apoptose. Peptidene syklo-RGDfV

(66203) og syklo-RADfV (69601) ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1. Peptidløsningene eller PBS ble injisert i CAM-preparatet ved en konsentrasjon på 300 ug/ml. Etter 24 og 48 timer ble filtrerpapiret og omliggende CAM-vev utkuttet og farget med Apop-Tag for påvisning av apoptose, som beskrevet ovenfor i eksempel 12A2).

Som vist i figur 18, viste CAM-preparater behandlet

2 dager tidligere med peptid 69203 (syklo-RGDfV) 3-4 gangers økning i Apop-Tag-farging sammenlignet med CAM-preparater behandlet enten med PBS alene eller med det sykliske kontrollpeptid 69601 (syklo-RADfV ). C. Virkning av behandling med monoklonale anti stoffer på apoptose og cellesyklus Enkeltcellesuspensjoner ble også undersøkt for antall kopier av kromosomalt DNA ved farging med propidiumjodid for å fastslå virkningen av behandling med monoklonale antistoffer på cellesyklus og apoptose ved farging med Apop-Tag.

Enkeltcellesuspensjoner fra CAM-preparater behandlet 24 eller 48 timer tidligere med mAb-LM609 (anti-dv^) eller CSAT (anti-{3i) eller PBS, ble fremstilt som beskrevet i eksempel 12A1) .

For farging av celler med Apop-Tag ble cellesuspensjoner vasket tre ganger med buffer tilsatt 2,5 % (vekt/vol) BSA og 0,25 % (vekt/vol) natriumazid i PBS. Cellene ble så fiksert i 1 % (vekt/vol) paraformaldehyd i PBS i 15 minutter, fulgt av tre gangers vask, som beskrevet ovenfor. For å hindre uspesifikk binding ble enkeltcellesuspensjoner blokkert med 5 % (vekt/vol) BSA i PBS over natten ved 4 °C. Cellene ble så vasket som tidligere, farget med Apop-Tag og cellefluorescens målt med et FACScan, som beskrevet ovenfor i eksempel 12A.

Celler fra hver eksperimentelle behandling ble farget med propidiumjodid (Sigma, St. Louis, MO) ved 10 ug/ml i PBS i 1 time, vasket to ganger med PBS og analysert for kjernekarak-teristika typiske for apoptose, heriblant kromatinkondensering og -segmentering. Prosent apoptotiske celler ble anslått ved morfologisk analyse av celler fra minst 10-15 tilfeldig valgte mikroskopiske felt.

De sammenslåtte resultater fra enkeltcellesuspensjoner fra CAM-preparater fra embryoer behandlet med enten CSAT (anti-Px) eller LM609 (anti-avJ33) , farget med Apop-Tag og propidiumjodid og analysert ved FACS, er gitt i figur 19. Y-aksen representerer Apop-Tag-farging (apoptose), mens X-aksen representerer propidiumjodidfarging (DNA-innhold). Den horisontale linjen viser nivået for negativ Apop-Tag-farging. Venstre og høyre felt viser CAM-celler fra CSAT-behandlede henholdsvis LM609-behandlede embryoer. Cellesyklusanalyse ble utført ved analyse av tilnærmet 8000 begivenheter pr. betingelse, og verdiene er vist i et konturplott.

Prøver av enkeltceller farget med DNA-fargen propidiumjodid viste at 25-30 % av de LM609 (anti- avp>3) -behandlede CAM-celler 48 timer etter behandlingen viste tegn på kjerne-kondensering og/eller -segmentering. Disse prosesser er karak-teristiske for celler som gjennomgår apoptose. Dette står i motsetning til CAM-preparater behandlet med CSAT (anti-^i) , hvor 90-95 % av cellene viste normal kjernefarging.

Som vist i figur 19 og i samsvar med at LM609 induserer apoptose, kunne et signifikant antall celler observeres i en topp som inneholder mindre enn én DNA-kopi (AO). Denne topp er tidligere vist å representere fragmentert DNA i apoptotiske celler fra sene stadier, Telford et al., Cytometry, 13:137 (1992). Videre farges disse AO-celler lett med Apop-Tag, noe som bekrefter dette reagens' evne til å påvise apoptotiske celler. I tillegg til at celler i AO ble farget, ble også et signifikant antall celler med mer enn én DNA-kopi også farget med Apop-Tag (figur 19). Disse resultater viser at LM609 har evnen til å fremme apoptose blant vaskulærceller som allerede har gått inn i cellesyklus. I motsetning til dette viste celler avledet fra kontroll-CAM-preparater som hadde gått inn i cellesyklus, minimal Apop-Tag-farging, i samsvar med at få apoptotiske celler kunne påvises i kontrollbehand-lede CAM-preparater.

Blant de celler i £FGF-stimulerte CAM-preparater som hadde gått inn i cellesyklus (S- og G2/M-fasen), viste 70 % positiv farging med LM609 (anti-a^) . Dette kan sammenlignes med 10 % LM609-farging observert blant celler i syklus fra ikke-pFGF-behandlede CAM-preparater. Disse funn viser at et flertall av de avP3-bærende celler viser aktiv proliferasjon etter pFGF-stimulering.

Sammen viser disse funn at intravenøs injeksjon av mAb-LM609 eller en syklisk peptidantagonist av avP3 fremmer apoptose i kylling-CAM etter induksjon av angiogenese.

CAM-preparater ble også undersøkt histologisk for ekspresjon av avJ33 ved immunreaktivitet med LM609, og for celler som gjennomgikk apoptose ved immunreaktivitet med Apop-Tag. CAM-seksjoner utkuttet fra embryoer behandlet 48 timer tidligere med LM609 (antiavp3) , CSAT (anti-£i) eller PBS, fremstilt i eksempel 5A, ble vasket, innstøpt i OTC (Baxter) og hurtig nedfrosset i flytende nitrogen. 6 um tykke seksjoner av CAM-vev ble kuttet, fiksert i aceton i 30 sekunder og lagret ved -70 °C inntil de skulle anvendes. Vevsseksjoner ble for-beredt for farging ved en kort vask med 70 % (vol/vol) etanol (ETOH), fulgt av tre gangers vask med PBS. Deretter ble seksjonene blokkert med 5 % (vekt/vol) BSA i PBS i 2 timer, fulgt av inkubasjon med 10 ug/ml mAb-LM609 i 2 timer. Seksjonene ble så vasket og inkubert med en 1:50 fortynning av rhodaminkonjugert antimuse-IgG fra geit (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) i 2 timer. Endelig ble seksjonene vasket og farget med Apop-Tag, som beskrevet i eksempel 12A2). De fargede vevsseksjoner ble montert og analysert ved konfokal immunfluorescensmikroskopi.

I figur 20 viser feltene A-C CAM-vev fra CSAT(anti-Pi)-behandlede embryoer, mens feltene D-F viser CAM-vev fra LM609 (anti-o-vp^) -behandlede embryoer. Feltene A og D viser vev farget med Apop-Tag og visualisert ved fluorescens (FITC) overlagt et D.I.C.-bilde. Feltene B og E viser de samme vev farget med mAb-LM609 (anti-a^) og synliggjort ved fluorescens (rhodamin). Feltene C og F viser sammenslåtte bilder av de samme vev farget med både Apop-Tag og LM609, hvor gul farge viser kolokalisering. Søylen representerer 15 henholdsvis 50 um i venstre henholdsvis høyre felt.

Som vist i figur 20 (A-C), forekom farging med Apop-Tag etter intravenøs injeksjon av CSAT- eller PBS-kontroller minimal og tilfeldig, noe som tyder på et minimalt apoptose-nivå i vevet. I motsetning til dette viste CAM-preparater fra embryoer som på forhånd var behandlet med LM609 eller syklisk peptid 203, at et flertall av karene gav intens farging med Apop-Tag, mens minimal reaktivitet kunne observeres blant omliggende ikke-vaskulære celler (figur 20D-F). Videre, ved farging med både Apop-Tag og LM609 av vevene (19C og 19F), kunne signifikant kolokalisering kun observeres mellom disse markører i CAM-preparater avledet fra embryoer behandlet med avP3-antagonister (figur 20F). Disse funn viser at etter induksjon av angiogenese in vivo vil inhibitorer av integrin av^3 selektivt fremme apoptose av o^-bærende blodkar.

Selv om angiogenese er en kompleks prosess som omfatter mange molekylære og cellebiologiske hendelser, antyder flere typer bevismateriale at vaskulærcelleintegrinet avP3 spiller en relativt sen rolle i denne prosessen. For det første viser immunhistologisk analyse at ekspresjon av avp3 i vaskulærceller nådde et maksimum 12-24 timer etter induksjon av angiogenese med fJFGF. For det andre forstyrrer o-vp"3-antagonister angiogenesen indusert av flere aktivatorer, noe som tyder på at denne reseptor deltar i en felles reaksjonsvei nedstrøms for kanskje alle primærsignalbegivenneter som fører til angiogenese. For det tredje viste mAb-LM609- eller syklisk peptidbehandlede CAM-preparater ingen signifikant økning i apoptose, målt ved fragmentering av DNA, før 48 timer etter behandling med disse antagonister. Endelig fremmer avi33-antagonister apoptose av vaskulærceller som allerede er indusert til å gå inn i cellesyklus.

Resultatene som gis heri, tilveiebringer de første direkte beviser for at integrinligeringshendelser kan regulere celleoverlevelse in vivo. En mulig hypotese er følgelig at når angiogenesen først starter, vil enkelte vaskulærceller dele seg og begynne å bevege seg mot den angiogene kilde, hvoretter avp3-ligering gir et signal som tillater fortsatt celleoverlevelse, noe som fører til differensiering og dannelse av modne blodkar. Dersom av£3-ligering forhindres, vil imidlertid cellene ikke motta dette molekylære signal, og cellene vil følge normalveien og gå i apoptose. Denne hypotese forutsier også at når først differensiering har inntrådt, vil modne blodkar ikke lenger trenge 0^3-signalisering for overlevelse, og vil således være motstandsdyktige overfor antagonister av dette integrin.

Endelig gir resultatene som presenteres heri, bevismateriale for at integrin 0.^3-anta<g>onist er kan tilveiebringe en effektiv terapeutisk tilnærming for behandling av neoplasi og andre sykdommer karakterisert ved angiogenese. For det første vil av{33-antagonister forstyrre nydannede blodkar uten å påvirke allerede eksisterende vaskulatur. For det andre hadde disse antagonister ingen vesentlig virkning på levedyktighet på kyllingembryoer, noe som tyder på at de ikke er giftige. For det tredje ble angiogenesen blokkert i vesentlig grad, uavhengig av det angiogene stimulus. Endelig gav systemisk tilførsel av av£3-antagonister en dramatisk regresjon av forskjellige, histologisk atskilte, humane tumorer.

Således viser eksemplene gitt ovenfor at integrin av{33 spiller en nøkkelrolle i angiogenese indusert av en rekke forskjellige stimuli, og at avp3 derfor er et verdifullt terapeutisk mål for av{33-antagonistene ifølge foreliggende oppfin-neise for sykdommer karakterisert ved neovaskularisering.

Beskrivelsen gitt ovenfor antas å være tilstrekkelig til å tillate en fagmann å utføre oppfinnelsen. Foreliggende oppfinnelse skal ikke begrenses i området av den deponerte cellelinje, siden den deponerte utførelse er ment å være en enkelt illustrasjon av én side ved oppfinnelsen, og enhver cellelinje som er funksjonelt ekvivalent, vil ligge innenfor oppfinnelsens område. Deponering av materiale utgjør ikke en innrømmelse av at beskrivelsen som gis her, ikke er tilstrekkelig for utførelse av enhver side av oppfinnelsen, heriblant den beste form for utførelse, og skal heller ikke oppfattes som begrensende for kravenes rekkevidde til den spesifikke illustrasjon som beskrivelsen representerer. Faktisk kan forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til dem vist og beskrevet heri, være åpenbare for fagfolk fra beskrivelsen ovenfor, og vil falle innenfor rekkevidden av de ved-lagte krav.

Claims (18)

1. Anvendelse av en avp3-antagonist ved fremstilling av et medikament for behandling av artritt, diabetisk retinopati, makuløs degenerering, restenose, hemangiom eller en fast tumor ved inhibering av angiogenese, hvori antagonisten omfatter en angiogeneseinhiberende mengde av et RGD-inneholdende polypeptid.

2. Anvendelse av en av£3-antagonist ifølge krav 1, hvori medikamentet er for behandling av en tumor og nevnte angiogenese er tumorangiogenese.

3. Anvendelse av en av{33-antagonist ifølge krav 2, hvori tumoren er et karsinom.

4. Anvendelse av en avp3-antagonist ifølge krav 3, hvori nevnte karsinom er en tumor i lunge, bukspyttkjertel, bryst, tarm, strupehode eller ovarie.

5. Anvendelse av en avp3-antagonist ifølge krav 1, hvori medikamentet er for behandling av artritt.

6. Anvendelse av en av{33-antagonist ifølge krav 5, hvori medikamentet er for behandling av reumatoid artritt.

7. Anvendelse av en avfi3-antagonist ifølge krav 1, hvori medikamentet er for behandling av diabetisk retinopati eller makuløs degenerering og nevnte angiogenese er retinal angiogenese.

8. Anvendelse av en avp3-antagonist ifølge krav 1, hvori medikamentet er for behandling av hemangiomer.

9. Anvendelse av en av{J3-antagonist ifølge krav 2, hvori medikamentet er for administrering sammen med kjemo-terapi.

10. Anvendelse av en av£3-antagonist ifølge krav 1, hvori medikamentet er for behandling av en pasient med risiko for restenose etter koronar angioplastikk.

11. Anvendelse av en avP3-antagonist ifølge ethvert av kravene 1 til 10, hvori medikamentet administreres for å tilveiebringe nevnte avp3-antagonist i en mengde fra 2 [ iM til 5 mM i plasma.

12. Anvendelse av en avp3-antagonist ifølge ethvert av kravene 1 til 10, hvori, medikamentet administreres for å tilveiebringe nevnte dvp^-antagonist i en mengde fra 0,1 mg per kg til 3 00 mg per kg.

13. Anvendelse av en avp3-antagonist ifølge ethvert av kravene 1 til 12, hvori medikamentet er i en form som er egnet for topisk, intravenøs, transdermal, intrasynovial, intra-muskulær eller oral administrering.

14. Anvendelse av en avP3-antagonist ifølge krav 9, hvori medikamentet er i en form som er egnet for administrering i form av en intravenøs enkeltdose.

15. Anvendelse av en av$ 3-antagonist ifølge ethvert av kravene 1 til 14, hvori polypeptidet er et syklisk peptid.

16. Anvendelse av en avÉJ3-antagonist ifølge krav 15, hvori peptidet er utvalgt fra gruppen bestående av syklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID nr: 4), syklo(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID nr: 6), syklo (Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID nr: 7), Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe (SEQ ID nr: 8) og et salt derav.

17. Anvendelse av en a^-antagonist ifølge krav 16, hvori saltet er et hydroklorid eller trifluoracetat.

18. Anvendelse av en avfJ3-antagonist ifølge ethvert av foregående krav, hvori medikamentet er for behandling av en human pasient.