UA44729C2 - Спосіб інгібування ангіогенезу в тканині, спосіб інгібування ангіогенезу в твердій пухлині, спосіб індукції регресії твердої пухлинної тканини, спосіб інгібування росту твердої пухлинної тканини, спосіб зменшення кровопостачання тканини, спосіб інгібування ангіогенезу у запаленій, ангіогенній тканині, спосіб лікування пацієнтів (варіанти) - Google Patents

Спосіб інгібування ангіогенезу в тканині, спосіб інгібування ангіогенезу в твердій пухлині, спосіб індукції регресії твердої пухлинної тканини, спосіб інгібування росту твердої пухлинної тканини, спосіб зменшення кровопостачання тканини, спосіб інгібування ангіогенезу у запаленій, ангіогенній тканині, спосіб лікування пацієнтів (варіанти) Download PDF

Info

Publication number
UA44729C2
UA44729C2 UA96093689A UA96093689A UA44729C2 UA 44729 C2 UA44729 C2 UA 44729C2 UA 96093689 A UA96093689 A UA 96093689A UA 96093689 A UA96093689 A UA 96093689A UA 44729 C2 UA44729 C2 UA 44729C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
angiogenesis
tissue
fact
tumor
specified
Prior art date
Application number
UA96093689A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Пітер Брукс
Питер Брукс
Девід А. Череш
Original Assignee
Скріппс Рісерч Інстітьют
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22783992&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA44729(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Скріппс Рісерч Інстітьют filed Critical Скріппс Рісерч Інстітьют
Publication of UA44729C2 publication Critical patent/UA44729C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C07K14/70557—Integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

Винахід описує способи інгібування ангіогенезу в тканинах з використанням вітронектинових антагоністів, і головним чином, інгібування ангіогенезу у запалених тканинах та пухлинних тканинах та метастазах з використанням терапевтичних композицій, які містять антагоністи інтегрину

Description

Опис винаходу
Область техники, к которой относится данное изобретение 2 Настоящее изобретение относится, главньім образом, к области медицинь и конкретно, Кк способам и композициям, предназначенньм для ингибирования ангиогенеза тканей с использованием антагонистов витронектинового рецептора о/р з.
Мнтегриньії представляют собой класс клеточньїх рецепторов, которье, как известно, связьвают внеклеточнье матричнье белки и, в связи с отим, регулируют взаиймодействия клетка-клетка и 70 клетка-внеклеточная матрица, которье обьічно обозначаются, как собьттия адгезии клеток. Однако, хотя многие интегринь и лигандь, связьівающие интегрин, описань! в литературе биологическая функция многих интегринов остается неопределенной. Мнтегриновье рецепторьі составляют семейство белков с разделенньми структурньмми характеристиками нековалентньїх гетеродимерньїх гликопротеиновьїх комплексов, образованньх из о. и Д субьединиц. т5 Витронектиновьй рецептор, названньй за его первоначальную характеристику преимущественного связьввания с витронектином, как известно в настоящее время, имеет отношение к трем различньїм интегринам, обозначенньм, как оурі, оуВз и оуВв. См. Нопоп Іпі 3). Ехр. Раїної., 71:741-759 (1990). оМВ.- связьвает фибронектин, и витронектин. оуурз связьіваєт большое число лигандов, включая фибрин, фибриноген, ламинин, тромбоспондин, витронектин, фактор Виллебранда, остеоспонтин и костньій сиалопротейин |. оурь5 связьваєт витронектин. Специфические роли в адгезии клеток зти три интегрина играют во многих клеточньх взаймодействиях в тканях исследуемьїх в настоящее время, однако очевидно, что имеются различнье интегриньї с различньмми биологическими функциями.
Одним из важньїх сайтов узнавания в лиганде для многих интегринов является аргинин-глицин-аспаргиновая с об Кислота /кОор/ трипептидная последовательность. КОЮ обнаружена во всех лигандах, идентифицированньх вьше для витронектиновьїх рецепторньїх интегринов. Такой КОЮ - распознающий сайт может бьть і) мимикрирован с помощью полипептидов /"пептидь"/, которне содержат КОЮ последовательность, и такие
КкОоО-пептидьі являются известньми ингибиторами интегриновой функции. Однако, важно отметить, что в зависимости от последовательности и структурь КОЮ -пептида, специфичность ингибирования может Ф зо Мзменяться в отношений мишень-специфичньх интегринов.
Обсуждение КОЮ распознающего сайта можно найти в статье Ріегеспраспег с сотр., в журнале Майшге с 309:30-33/1984/ и Ріегеспраспег с сотр., в журнале Ргос. Май). Асай. 5сі. США, 81:5985-5988 /1984/. Различнье ї-
КОО -полипептидьї различной интегриновой специфичности бьіли также описань! Сгапі с сотр., в сеї, 58:933-943 /1989/ Спегезп с сотр., СеїЇ, 58:945-953 /1989/, АцтайШеу с сотр., РЕВ5 2енв. 291:50-54 /1991/ и «
Ріай с сотр. 9. Віої. Спет. 269:20233-20238 /1994/ а также в патентах США МоМо 4.517.686, 4.578.079, «Е 4.589.881, 4.614.517, 4.661.111, 4.792.525, 4.683.291, 4.879.237, 4.988.621, 5.041.380 и 5.061.693.
Ангиогенез представляет собой процесс васкуляризации ткани, включающий рост вновь развивающихся в ткани кровеносньїх сосудов, и назьшаєтся также неоваскуляризацией. Зтот процесс опосредован инфильтрацией зндотелиальньх клеток и клеток гладкой мьішцьі. Предполагается, что такой процесс « 70 реализуется одним из трех путей: сосудь! могут прорастать из уже существующих сосудов, может иметь место -птв) с де похо развитие сосудов из клеток предшественников /васкулогенез/, либо существующие мелкие сосудь могут увеличиваться в диаметре. См. Віоо4 с сотр. Віосп. Віорпуз. Асіа 1032:89-118 /1990/. Как известно, з сосудистье зндотелиальнье клетки содержат, по крайней мере, пять КОО - зависимьїх интегринов, включая витронектиновьй рецептор /ох/рз или оу/рВв/,; рецепторь!ї коллагенового типа 1 и ІМ /о4 р./, ламининовьй рецептор 702 Ві/, фибронектин /ламинин/ коллагеновьй рецептор /а3рі/ и фибронектиновьй рецептор /х5р.//. См. статью «г» ОСАМІЗ с сотр., в 9. СеїІ. Віоспет, 52:206-218. /1993/, МИзвестно, что клетка гладкой мьішцьі содержит, по ї» крайней мере, шесть КСО -зависимьїх интегринов, включая ор; оуВз И оуВв.
Ангиогенез является важньм процессом неонатального роста, но он столь же важен в заживленийий рани в -І патогенезе большого числа клинических заболеваний, таких как воспаление тканей, артрить!, рост опухолей, юю 50 диабетическая ретинопатия, пятнистая дегенерация в результате неоваскуляризации сетчатки глаза и при родственньїх состояниях. Такие клинические состояния связаннье с ангиогенезом и на них ссьілаются, как на (Че) ангиогенньіе заболевания. См. РоЇКтап с сотр., Зсіепсе 235:442-447 /1987/. Ангиогенез обьічно отсутствует во взросльїх или зрельїх тканях, однако он обьічно присутствует при лечении ран и в цикле роста Согрецйз ІешецЧт.
См., например Мозез с сотр., Зсіепсе, 248:1408-1410 /1990/,
Бьіло предположено, что ингибирование ангиогенеза может служить полезной терапией ограничения роста опухолей. Ингибирование ангиогенеза может осуществляться
ІФ) /1/ ингибированием вьіделения таких "ангиогенньїх молекул", как ДЕСЕ /фактор роста фибробласта)/, іме) /2/ нейтрализацией ангиогенньїх молекул, например путем использования анти- ДЕОЕ антител, и /3/ ингибированием реакции зндотелиальной клетки на ангиогенную стимуляцию. Последнему варианту 60 бло уделено внимание и ЕБоЇКтап с сотр., (Сапсег ВіоЇ оди, 3:89-96, 1992) описал несколько ингибиторов зндотеллиального клеточного ответа, включая коллагеназньй ингибитор, базовьій мембранньй циклический ингибитор, ангиостатические стероидьі, ингибиторьії ангиогенеза грибкового происхождения, тромбоцитньй фактор 4, тромбоспондин, такие артритнье лекарства, как Ю -пеницилламин и тиомолат золота, аналоги витамина Оз, альфа-интерферон и многие другие препарать, которье могут использоваться для ингибирования 65 ангиогенеза. Другие предложеннье ингибиторь ангиогенеза описань Віоо4 с сотр., Віосп. Віори. Асіа, 1032-89-118 /1990/, Мозвевз с сотр. Зсіепсе 248:1408-1410 /1990/, Іпдрег с сотр. 7аб. Іпмегі., 59:44:51 /1988/
и также в патентах США МоМо 5.092.885, 5,112.946, 5.192.744, и 5.202.352. Ни один из ингибиторов ангиогенеза, описанньій ранее, не обладал способностью ингибировать оМрз3 КСО - содержащие пептидьі, ингибирующие витронектиновьй рецептор с оурз, также бьл описан. Ацтаїйеу с сотр. РЕВЗ 7ейцв. 291:50:54 /1991/., Спої с сотр. у. Мазс. Биго., 19:125-134 /1994/, ті с сотр.,, 9. ВіоїЇ. Спет., 265:12267-12271 /1990/ и Ргай с сотр. у. Віої. Спет. 269:20233-20238 /1994/. Однако, до момента создания настоящего изобретения роль интегрина сурз в развитии ангиогенеза не бьіла предположена или установлена.
Ингибирование клеточной адгезии іп мйго с использованием моноклональньхх антител, иммуноспецифичньх для различньїх интегриновьїх субьединиц о или р вовлекаєт оурз в адгезию клеток большого числа типов, 70 включая микрососудистье зндотелиальнье клетки. См. Юаміз с сотр., у). СеїЇ Вісі: 51:206-218 /1993/. Кроме зтого, Місовіа с сотр. Ат. .). Раїйої. 138:829-833 /1991/, описали использование КОЮ -пептида СОВО-О5 для іп мійго ингибирования образования "микрососудов" крьісиной аортьі, культурированной в коллагеновом геле.
Однако, ингибирование образования "микрососудов" іп мйго в коллагеновьїх гелевьїх культурах не является моделью ингибирования ангиогенеза в ткани, поскольку не показано, что микрососудистье структурь 75 аналогичньї капиллярньмм наростам, или что образование микрососудов в коллагеновой гелевой культуре аналогично росту новьїх сосудов в интактной ткани, например в артритной ткани, опухолевой ткани или вольной ткани, где желательно ингибирование ангиогенеза.
Позтому, помимо сообщенньїх вьше исследований, Заявители неожиданно обнаружили другую демонстрацию, того факта, что ангиогенез может ингибироваться в тканях с использованием ингибиторов клеточной адгезии. Главньмм образом, никогда ранее не бьло показано, что о3Вз функция требуется для ангиогенеза в тканях, или что оурВз антагонисть! могут ингибировать ангиогенез в тканях.
В настоящем изобретений продемонстрирован тот факт, что ангиогенез с тканях требует наличия интегрина о3/Вз и что ингибиторьії оурз могут ингибировать ангиогенез. Обнаружение зтого факта также демонстрирует то, что антагонистьі других интегринов, например, оуВвБ или оурі. не ингибируют ангиогенез, с 29 возможно по причине их несущественности для развития ангиогенеза. Го)
В зтой связи, в изобретений описьіваются способьії ингибирования ангиогенеза в тканях, включающие применение на ткани композиции, включающей ангиогенез-ингибирующее количество сур» - антагониста.
Лечению может подвергаться любая ткань, для которой желательно ингибирование ангиогенеза, такая как "больная" ткань, где происходит неоваскуляризация. Примерами таких тканей могут служить воспаленная ткань, Ф 30 твердье опухоли, метастазь, ткани, подверженньсе ретенозу, и другие ткани. Ге!
МИспользуемьй в настоящем изобретений о3урз -антагонист способен связьшвать ооурз и полностью М ингибировать способность оу/рз связьнвваться с природньім лигандом. Предпочтительно, чтобь! такой антагонист обладал специфичностью в отношений о3урз по сравнению с другими интегринами. Согласно особенно з5 предпочтительному воплощению оурз -антагонист ингибирует связьивание фибриногена или другого КОО - « содержащего лиганда с оооурз но онесущественно иингибируєт связьвание офибриногена со/о/46рз.
Предпочтительньм о3рВз - антагонистом может служить полипептид, или моноклональное тело или их функциональньй фрагмент, которьій иммунореагирует с оурз. «
На чертежах, составляющих часть настоящего описания показано следующее: 40 На фиглА - 1Д проиллюстрировано распределение в ткани интегриновьїх субьединиц Дз и р. в случае - с нормальной кожи и кожи в процессе заживления ран, обозначенной, как гранулированная ткань. "з Иммуногистохимия с использованием антител к рз и Д. осуществлялась, как описано в примере ЗА. На фигЛА и " 18, соответственно, проиллюстрирована иммунореактивность анти- Ду в нормальной коже и в гранулированной ткани. На фиг.1С и 10, соответственно, проиллюстрирована иммунореактивность анти- В. в нормальной коже и 45 в гранулированной ткани. о На фиг2А - 20 соответственно показано тканевое распределение фактора фон Виллебранда и ї5» ламининовьх лигандов, которне, соответственно, связьівают интегриновніе субьединиць! Вз и Д/ в нормальной коже и в коже в процессе заживления ран, обозначенной, как гранулированная ткань. Иммуногистохимию с
Ше использованием антител на фактор фон Виллебранда /анти- УМУЕ /и ламинин /анти-ламинин/ осуществляли, как ка 20 описано в Примере ЗВ. На фиг. 2А и 28, соответственно, проиллюстрирована иммунореактивность анти-УМУєЕ в нормальной коже и в гранулированной ткани. Фиг.2С и 2Д, соответственно, показьвают иммунореактивность с анти-ламинина в нормальной коже и в гранулированной ткани.
На фиг.зЗА - ЗД продемонстрировано распределение витронектинового интегринового рецептора, оурз в биопсии ткани рака мочевого пузьря, рака толстой кишки, рака молочной железь и рака легких, соответственно.
Иммуногистохимию с использованием І Мб09 антитела к оу/Вз проводили, как описано в примере ЗС.
ГФ) На фиг.4 показана типичная микрофотография САМ настоящего изобретения лишенной кровеносньх 7 сосудов в необработанном 10-дневном курином змбрионе. Препарат описан в Примере 58.
На фигб5А - 5С проиллюстрировано распределение в ткани интегринов Д. и о3урз в препарате САМ во настоящего изобретения. На фиг.5А показано распределение Др. субьединиць! в необработанном 10-дневном препарате САМ, как детектировано с помощью иммунофлуоресцентной иммунореактивности с использованием
СЗАТ, анти - р. антителом. На фиг. 58 показано распределение оу/Вз рецептора в необработанном 10-дневном препарате САМ, как детектировано с помощью иммунофлуоресцентной иммунореактивности с І Мб609, анти- оудВз антителом. На фиг.5С показано распределение рецептора оурз в обработанном ДЕС 10-дневном б5 препарате САМ, как детектировано с помощью иммунофлуоресцентной иммунореактивности с ІМБбО9, анти- оуВз антителом. Методь лечения и полученнье результать! описань в примере 5С.
На фиг.6б проиллюстрировано количественное определение в столбце диаграммь! относительной зкспрессийи соуВз и рі в необработанньх и обработанньх рЕСЕ 10-дневньїх препаратах САМ, в соответствии с описанньм в Примере бА. Среднее значение интенсивности флуоресценции отложено по оси -У, а интегриновне профили отложень! по оси Х.
На фиг7А - 7С проийллюстрирован внешний вид необработанного 10-дневного САМ, образца САМ, обработанного ДЕСЕ, и образца САМ, обработанного ТМРо, роответственно, методики и результать! описань! в примере 6бА.
Фиг.8А - ВЕ иллюстрируют влияние актуальной обработки антителом на ЕСЕ-индуцированньй ангиогенез на 70 10 день САМ, как зто описано в Примере 7А1/. На фиг.8А показан необработанньй САМ препарат, лишенньй кровеносньїх сосудов. На фиг.8В продемонстрирована инфильтрация новой сосудистой сети в область, предварительно лишенную сосудистой системь), индуцированную ДЕСЕ обработкой. Фиг8С, 8Д и 8Е, соответственно, демонстрируют зффекть антител против р. /антитело- р., СЗАТ/ оу/Вв /анти- ол/В5 РЗС2/ и ох/Вз /анти- оу/Вз; ІМ609/.
На фиг.9А - 9С проиллюстрировано влияние внутривенной иньекции синтетического пептида 66203 на ангиогенез, индуцированньій опухолью, как описано в примере 7Д2. На фиг.9А показано отсутствие ингибиторного зффекта внутривенной обработки контрольньім пептидом /контрольная пептидная опухоль/ на ангиогенез вьізванньій индукцией опухоли. Ингибирование такого ангиогенеза путем внутривенной иньекции пептида 66203 /циклическая КОЮ опухоль/ представлено на фиг.98. Отсутствие ингибирующего зффекта или цитотоксичности на зрелье пресуществующие сосудьі! после внутривенного вливания пептида 66203 в область, примьікающую к опухоль-обработанной области показано на фиг.9С /циклический КОЮ соседствующий с САМ/.
На фиглЛоОА - 10С проиллюстрирован зффект внутривенного применения моноклональньїх антител на ангиогенез, индуцируемьй фактором роста, как зто описано в примере 781. /Фиг1ОА демонстрирует индуцированньй с помощью ДЕСЕ оангиогенез без обработки антителом /контрольньй зксперимент/. СМ 29 Мнгибирование ангиогенеза не имеет место когда аналогичньй препарат бьл обработан анти- оуВо, антителом о
РЗО2, как зто показано на фигуре 108.
Ингибирование ангиогенеза реализуеєется при обработке анти-оурз, антителом І МбО9, как зто показано на фиг. 100.
Фигл1т1А - 11С иллюстрируют зффект на змбрионньй ангиогенез после местного применения о анти-интегриновьїх антител, как описано в примере 7С. Ангиогенез не ингибируется в результате обработки Га б-дневного САМ анти-р., и анти- оурь5 антителами, соответственно, что показано на фиг.11А и 118. Напротив, обработка анти- оурз антителом ІМб609 приводит к ингибированию образования кровеносньїх сосудов, как зто - показано на фиг.11с. чІ
На фиг.12 произведено количественное определение числа сосудов, входящих в опухоль в препарате САМ, как зто описано в примере 7Д1/. На зтом графике число сосудов нанесено на ось У, как результат местного З применения или СЗАТ /анти- р./, ЇГМб609 /анти-оурз или РЗО2/, анти-оу Ва.
Фиг.13А - 13Д иллюстрируют сравнение между весами мокрьїх опухолей через 7 дней после обработки и первоначальньми весами, как описано в примере 9АтТ/а. Каждая полоса представляет среднее 5.Е. 5-10 « 20 опухолей на группу. Используемье опухоли бьіли производньми человеческой меланомь! /М21-І1/ /Фиг.1ЗА/, -в рака поджелудочной железь /Рд/ /Фиг.13В/, легочной карциномь! /УСІ АР-3//Фиг.13с/ и ларингеальной карциномь! - /Нерз/ /Фигура 13Д/, САМ-препаратьь и внутривенно обработаннье РВЗ , СЗАТ /анти-Д./ или /М609 а /анти- о3/Вз/. Графики показьвают вес опухоли, значение которого нанесено на ось У в результате внутривенного применения или СЗАТ /анти-р./, ГМб609 /анти- оураз/ или РВ5З как показано на оси Х.
На фиг.14А и 148 показань гистологические разрезь! опухолей, обработанньїх РЗО2 /анти- охм/Дв/ /фигю14А/ «г» и ГМ609 /анти-охуу/Вз/ фигю14В, и окрашенньхх гематоксилином и зозином, как зто описано в примере 9АТ/а. Как показано на фиг.14А опухоли, обработаннье контрольньім антителом /Р302/, демонстрировали большое число е жизнеспособньїх и активно делящихся опухолевьїх клеток, о чем свидетельствовали митотические значения -І /показань! стрелками сверху/, а также множественнье кровеноснье сосудь! /стрелки/ по всей строме опухоли. Напротив, очень небольшое количество, если оно вообще определялось, жизнеспособньїх опухолевьїх клеток о или кровяньїх сосудов детектировалось в клетках, обработанньх І Мб609 /анти-оу/Вз/ как показано на фигю148. іЧе) Фиг.15А - 15Е соответствуют М21!. опухолям, обработанньім пептидами как описано в Примере 9А1 /Б, и они представляют собой следующее:
Фиг.15А, контрольньій циклический КАО пептид /69601/; фиг.158, циклический КОЮ пептид /6 6203/; фиг.15С, соседняя САМ ткань, взятая из того же змбриона, обработанного циклическим КОЮ пептидом /66203/ и на о фиг.15Д представлено сильное увеличение /13х/ опухолей, обработанньїх контрольньім КАО /69601/, а на 15Е показано увеличение при обработке циклическим КОЮ пептидом /66203/. Фиг.15Д показьшваеєт нормальнье іме) сосудьі из опухоли, обработанной КА контрольньім пептидом 69601/, На фиг.15Е приведеньі примерь! разрушенньїх кровеносньїх сосудов из опухолей, обработанньїх циклическим КОЮ пептидом /66203/ /стрелки/. 60 На фиг.16 - 16Е показано ингибирование антиогенеза под действием антагонистов ангиогенеза в модельном анализе іп мімо на кроличьем глазу, в соответствии с описанньм в примере 10. На фиг.16А и 168 изображен ангиогенез кроличьего глаза в присутствим ВЕСЕ и тАБРІЕб /анти-оурв/. На фиг.1бс, 16Д и 16Е показано ингибирование ангиогенеза кроличьего глаза в присутствий ДЕОЕ и тАБІ-Мб09 /анти-ох/р з/.
На фиг.17 представлена диаграмма показьвающая как можно создать іп мімо мьішь: человек химерную бо мМьішиную модель, что описано в примере 11А. Часть шкурьі мьіши 5СІ1Д заменяли на человеческую неонатальную крайнюю плоть и давали системе залечиваться в течение 4 недель. После залечивания прививки человеческую крайнюю плоть инокулировали клетками человеческой опухоли. В течение следующих 4 недель проявлялась измеримая опухоль, которая состояла из человеческой опухоли с человеческой сосудистой системой, проходящей из человеческой плоти в человеческую опухоль.
На фиг.18 проиллюстрирован процент единичньїх клеток, полученньх от САМ обработанной тАВ и пептидом и окрашенньх Арор Тад, как установлено ГАС анализом и описано в примере 12А и 128, соответственно. Чернье и полосатье столбоцьі представляют собой клетки змбрионов, обработанньх за 24 и 48 часов до анализа, соответственно. Каждьй столбец представляеєет среднее Жж5.Е. трех измерений. САМ обрабатьвали тАБ І/Мб609 /анти- оурз/ или СЗАТ /анти-р.// или РВ5, как описано в Примере 12А2. САМ также 70 обрабатьмвали циклическим пептидом 69203 /цикло-КООТУ, обозначаєемьм, как пептид 203/ или контрольнь!м циклическим пептидом 69601 /цикло-КАСТУ, обозначаемь!м как пептид 601/, как зто описано в примере 128.
На фиг.19А и 198 проийллюстрированьї обьединеннье результатьі суспензий отдельньїх клеток САМ из змбриона обработанного либо СЗАТ /анти-р./ /фиг.19А/ или І. Мб609 /анти-оуДз/ /Фиг.198/, окрашенньїх Арор Тао и йодистьім пропидием и проанализированньїх методом РАСЗ, как описано в Примере 12С. По оси У отложень 75 результатьї окрашивания Арор Тао в числе клеток /Аполтоз/, по оси Х отложень! результать! соответствующие окрашиванию йодистьім опропидием /содержание ДНК/. Горизонтальнье линии представляют собой отрицательньй вход для окрашивания Арор Тао. Левая и правая панели показьвают на клетки САМ, из змбрионов, обработанньх СЗАТ /анти-р./ /Фиг.19А/ и І М609 /анти-оурз/ /Фиг.198/. Осуществляли анализ клеточного цикла, определяя примерно 8.000 собьітий на состояние.
Фиг.20А - 20С Представляют собой изображения САМ ткани из СЗАТ /анти- р// обработанньїх змбрионов, а фигурьі 20Д - 20Р отображают САМ ткани из І Мб609 /анти-о3у/рз/ обработанньхх змбрионов полученньїх как описано в примере 120. Фиг.20А и 20Д демонстрируют ткани, окрашеннье Арор Таа и визуализированнье методом флуоресценции /РІТС/ суперналоженньім на 0.І.С. изображение. На фиг.208В и 20Е показань! те же ткани, окрашеннье тАБ І Мб609 /анти-о3/Вз/ и визуализированнье с помощью флуоресценции /родамин/. На М 29 фиг.20С и 20Е представлень изображения тех же тканей, окрашенньїх как Арор Тад, так и І! Мб609, причем Ге) желтое окрашивание свидетельствует о солокализации. Полосьі в левой и правой панели составляют 15 и
БОмкм, соответственно.
А: Обозначения:
Аминокислотнье остатки: Аминокислота образуется в ходе химического переваривания /гидролиз/ Ме) полипептида по его пептидной связи. Описанньсе в тексте аминокислотнье остатки предпочтительно находятся сч в" изомерной форме. Однако, остатки находящиеся в "ОО" изомерной форме могут бьіть замененьі на любой
Ї-аминокислотньїй остаток, если полипептид сохраняет желаемое функциональное свойство. МН2 относится к - свободной амино-группе на амино-конце полипептида. СООН оотносится к свободной карбокси-группе, « присутствующей на С-конце полипептида. Придерживаясь стандартной полипептидной номенклатурь
Зо Іописанной в 4). Воїї. Спет. 243:3552-59 /1969/ и принятой 37 СЕР 51.822/ь//2/7, сокращеннье названия « аминокислотньїх остатков представленьії в следующей Таблице Соответствия: нин нс нн їх н- с . що 4 ї г 0000 отейцяю, в. ю 2 тю пролян іЧе) нини и НЯ 5 о ю 11111117 врмнин) зо 0 дорівспармновая колота,
В яко лпимлилер б5
Кроме зтого в тексте используются следующие другие сокращения:
вос трет-бутилоксикарбонил
ДССІ дициклогексилкарбодиийимид
ДМЕ диметилформамид
ОоМе метокси
НОВІ 1-гидроксибензотриазол
Следует отметить, что все аминокислотнье последовательности представлень! в тексте формулами, левая и правая ориентация которьіх представлень! в традиционном направлении от амино-конца к карбокси-концу. то Кроме зтого следуєт также отметить, что штрих в начале или конце аминокислотной последовательности указьшнаєт на пептидную связь со следующей последовательностью одного или более аминокислотньх остатков.
Полипептид: отноОосится Кк линейному ряду аминокислотньїх остатков, связанньїх друг с другом пептидньіми связями между алфа-амино группой и карбокси группой непрерьівной аминокислотной последовательностью. т Пептид: зтот термин в контексте изобретения относится Кк линейньм рядам не более примерно 50 аминокислотньх остатков связанньмх друг с другом, как в полипептиде.
Циклический пептид: являєтся производньіїм соответствующего линейного пептида; относится к пептиду, в котором не существуют М- или С-конць и в котором соответствующие линейнье пептиднье М-терминальнье формь! и амидная связь с с- терминальньмМ карбоксилатом существуют, как часть указанного линейного пептида. Термин белок /протеин/: относится Кк линейньм сериям из более, чем 50 аминокислотньмх остатков, связанньх друг с другом, как в полипептиде.
Синтетический пептид: относится к химически полученной цепи аминокислотньїх остатков, связанньх друг с другом пептидньіми связями, которье не содержат встречающиеся в природе белки и их фрагментиь.
В. Общие соображения сч
Настоящее изобретение относится главньм образом к тому открьітию, что ангиогенез опосредован о специфическим витронектиновьім рецептором оурз и что ингибирование оурз функции ингибирует ангиогенез.
Такое открьитие является важньім из-за роли, которую играет ангиогенез в большом числе заболеваний. В результате ингибирования ангиогенеза можно вмешиваться в ход заболевания, улучшать симптомьі и, в ряде Ге! зо случаев, излечивать заболевание.
В том случає, когда рост новьіх кровеносньїх сосудов вьізьіваєется или вносит вклад в патологию, связанную с с заболеванием, ингибирование ангиогенеза будет уменьшать вреднье зффекть! такого заболевания. Примерь їм таких заболеваний включают ревматоидньй артрит, диабетическую ретинопатию, воспалительнье заболевания, рестеноз и т.п. В том случає, когда рост новьіх кровеносньїх сосудов требуется для поддержки « роста вредной ткани, ингибирование ангиогенеза приведет к понижению подачи крови в ткань и тем самьіІім, «Е внесет вклад в уменьшение образовавшейся тканевой массь, основанной на условиях подачи крови. Примерь! такого рода включают рост опухолей, в коториїх неоваскуляризация является постоянньІмМ требованием, с тем, чтобь размер опухоли достиг нескольких миллиметров в толщину и для образования твердьїх опухолевьїх метастазов. «
Способь! настоящего изобретения зффективнь! частично, поскольку такая терапия вьісоко селективна в з отношений ангиогенеза, а не для других биологических процессов. Как показано в примерах, лишь рост новьІХ с сосудов содержит достаточное количество омуВз и позтому терапевтические методьі не оказьзшвают вредного :з» влияния на зрелье сосудьІ!. Кроме зтого, оз не является широко распространенньїм в нормальньх тканяхи в основномМ обнаруживаєтся селективно на новьіх сосудах, что застраховьіваєт тот факт, что такая терапия может селективно избирать мишенью рост новьіх сосудов. їх Открьтие того факта, что ингибирование лишь оурз зффективно ингибирует ангиогенез, позволяет создавать терапевтические композиции с потенциально вьІСОКОйЙ специфичностью и позтому с относительно т- низкКой токсичностью. Таким образом, хотя настоящее изобретение раскрьмваєт использование реагентов на -І базе пептидов, обладающих способностью ингибировать один или более интегринов, можно применять и другие 5о реагентьї, которье более селективно ингибируют о3/В3, и опозтому не оказьвают побочньїх зффектов о ингибирования других биологических процессов, кроме опосредуемьх охур з. (Че) Так, например, как показано в настоящем изобретении, существуеєт возможность получения моноклональньх антител, вьісоко селективньіх в отношений имунной реакции с омВ 3» которне аналогичньім образом, селективньі в ингибирований оурз функции. Кроме зтого, КОЮО-содержащие пептидь! могут применяться в качестве 522 селективньх агентов в ингибирований ор» как будет описано ниже.
ГФ) Перед откритием настоящего изобретения не бьіло известно, что ангиогенез и любье процессьї, зависящие от ангиогенеза, могут ингибироваться іп о мімо с применением реагентов, являющихся антагонистами ді биологической функции оу/рз;
С. Способьї ингибирования ангиогенеза. 60 Настоящее изобретение обеспечиваєт способ ингибирования ангиогенеза в ткани и в результате ингибируются собьітия в ткани, которьге зависят от ангиогенеза. Обьічно такой способ включаєт применение на ткани композиции, включающей ангиогенез-ингибирующее количество омурз-антагониста.
Как указьвалось ранее, ангиогенез ответственен за большое число процессов, включающих неоваскуляризацию ткани, включая "прорастание", васкулогенез или расширение сосудов, причем все такие бо ангиогенезньюе процессьі! опосредовань! и зависят от зкспрессии омВз3. За исключением случаев заживления травматической рань, образования согриз Іешецт и змбриогенеза, полагают, что большая часть ангиогенезньх процессов связана с заболеваниями и позтому использование терапевтических методов настоящего изобретения является селективньм для таких заболеваний и не даєт вредньїх побочньїх зффектов.
Имеется большое число заболеваний, в которьїх предполагаєтся, что важньм их фактором является ангиогенез и в зтом отношений можно сослаться на ангиогеннье заболевания, не ограничиваясь только ими, такие как воспалительнье расстройства, например иммуннье и неиммуннье воспаления, хронический артикулярньійй ревматизм и псориаз, нарушения связаннье с неправильной и несвоевременной инвазией сосудов, такие как диабетическая ретинопатия, неоваскулярная глаукома, рестеноз, капилярная пролиферация /о в атеросклеротических бляшках и остеопороз, а таюке нарушения связаннье с развитием рака, такие как твердье опухоли, метастазь! твердьїх опухолей, ангиофибромьі, ретролентальная фиброплазия, гемангиома, саркома Капоши и подобнье раковье заболевания, которье требуют неоваскуляризации для поддержки роста опухоли.
Таким образом, способьї ингибирующие ангиогенез в заболевших тканях облегчают симптомь! заболевания /5 М, в зависимости от типа заболевания, могут способствовать излечению заболевания. Согласно одному из воплощений, настоящее изобретение охватьшваєт ингибирование ангиогенеза, рег зе, в тканях. Степень ангиогенеза в ткани и позтому степень ингибирования достигаемая настоящими методами, может бьіть оценена большим числом способов, например, теми, что описаньі в Примерах детекции оурз-иммуноположительной зрелости и структурні зародившихся сосудов с помощью иммуногистохимии.
Следует иметь в виду, что большое число тканей или органов, состоящих из организованной ткани, могут поддерживать ангиогенез в болезненном состоянии, причем к таким тканям и органам могут относиться кожа, мьішца, кишки, соединительная ткань, суставь), кости и т.д., то есть те случаий, когда кровеноснье сосудь способнь! вторгаться в систему в результате ангиогенного стимулирования.
Таким образом, в одном из случаев ткань, подвергаемая лечению, представляеєт собой воспаленную тканьи су ов ангиогенез, подвергаемьій иингибированию, представляет собой ангиогенез воспаленной ткани, когда реализуеєтся неоваскуляризация воспаленной ткани. В случає таких нарушений способ изобретения о предусматриваєт ингибирование ангиогенеза в артритньїх тканях, как зто имеет место у пациентов с хроническим артикулярньім ревматизмом, в иммунньїх или не-иммунньїх воспаленньїх тканях, в псориатических тканяхии т.п. Ге»! зо Пациент, подвергаемьшй лечению с помощью метода настоящего изобретения, согласно большинству решений, желательно представляет собой человека, хотя следует иметь в виду, что принципьі изобретения сч показьвают, что оно зффективно в отношений всех млекопитающих, которне подпадают под термин "пациент" р
В зтом контексте под млекопитающим понимаеєтся любая его разновидность для которого желательно лечение заболевания, связанного с ангиогенезом, особенно зто относится к разновидностям сельскохозяйственньх и З
Зз5 домашних млекопитающих. «
Согласно другому родственному решению, ткань подлежащая лечению представляет собой ткань сетчатки пациента больного диабетической ретинопатией, пятнистой дегенерацией или неоваскулярной глаукомой и ангиогенез, подлежащий ингибированию, представляеєт ангиогенез ткани сетчатки, когда реализуется неоваскуляризация ткани сетчатки. «
Согласно другому воплощению, ткань, подлежащая лечению, представляет опухолевую ткань пациента с о00/ШЩ- с твердой оопухолью, метастазами, раком кожи, раком молочной железь, больного гемангиомой или й ангиофибромой и другими видами рака, и ангиогенез, подлежащий ингибированию представляет собой "» ангиогенез опухолевой ткани, в которой реализуєтся неоваскуляризация опухолевой ткани. Типичньми твердьми опухолевьіми тканями, обрабатьваеємьми методами изобретения, могут бьїть ткани легких, поджелудочной железьї, молочной железь!, толстой кишки, гортани, яичников и аналогичнье ткани. Примерь ї» ангиогенеза опухолевьїх тканей и его ингибирование описано в Примерах.
Ингибирование ангиогенеза опухолевой ткани является особенно предпочтительньм воплощением шк изобретения в связи с важной ролью неоваскуляризации в росте опухоли. В отсутствие неоваскуляризации -і опухолевой ткани, такая ткань не получаєт требуемьїх питательньїх веществ, снижаєтся єе рост, прекращаєтся 5р дополнительньй рост, она регрессирует и в конечном счете становится некротической тканью, приводя к гибели о опухоли. (Че) Говоря другими словами, настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования опухолевой неоваскуляризации путем ингибирования ангиогенеза опухоли, в соответствий с методом настоящего изобретения. Аналогичньм образом, изобретение обеспечиваєт способ ингибирования роста опухоли в результате практической реализации методов ингибирования ангиогенеза.
Способьі изобретения особенно зффективнь! при их примененийи против развития метастазов поскольку /1/ іФ) их образование требуєт васкуляризации первичной опухоли так, что метастазньег клетки рака могли бь ко входить в первичную опухоль и /2/ их образование на второй стадии требует неоваскуляризации для поддержки роста метастазов. во Согласно родственному воплощению, настоящее изобретениє охватьіваєт практическую реализацию способа, связанного с другими терапиями, например, с традиционной химиотерапией, направленной против твердь опухолей, и для контроля образования метастазов. Применение ингибитора ангиогенеза обьічно проводится в ходе или после химиотерапии, хотя иногда предпочтительно ингибировать ангиогенез после режима химиотерапии, когда опухолевая ткань будет ответственна за токсичньій "штурм" индукцией ангиогенеза 65 для регенерации при условии подачи к опухолевой ткани крови и питательньїх веществ. Кроме зтого, предпочтительно применять методьі ингибирования ангиогенеза после хирургических операций, в которьх твердье опухоли бьіли удаленьї в качестве профилактики метастазов.
Несмотря на то, что настоящие способьї направлень на ингибирование опухолевой неоваскуляризации такие методьі могут также применяться для ингибирования роста опухолевой ткани, ингибирования образования опухолевьх метастазов и регрессиий образовавшихся опухолей. Представленнье примерь демонстрируют регрессию образовавшихся опухолей после единичного внутривенного применения /-сурз антагониста настоящего изобретения.
Рестеноз представляет собой процесс миграции и пролиферации клеток гладкой мьішцьі /ЗМС/ в место подкожной транслюминальной коронарной ангиопластии, что затрудняет успех ангиопластики. Миграция и 7/0 пролиферация ЗМС в ходе рестеноза может рассматриваться, как процесс ангиогенеза, которьій ингибируется методами настоящего изобретения. Позтому, настоящее изобретение также предусматриваєт ингибирование рестеноза путем ингибирования ангиогенеза, согласно методу изобретения, у пациента после применения методов ангиопластики. Для ингибирования рестеноза оуВз -антагонист обьчно применяют после ангиопластики через 2-28 дней и, как правило, в течение 14 дней после операции.
Настоящий метод ингибирования ангиогенеза в тканях и позтому также предназначенньій для практической реализации методов лечения, связанньїх с ангиогенезом заболеваний, заключаєтся в контактирований ткани с развившимся аутогенезом, или при риске его появления, с композицией, включающей терапевтически зффективное количество антагониста, способного ингибировать оурз осуществляя связьівание с его природнь!м лигандом. Таким образом, такой способ заключается в применений на пациенте терапевтически зффективного количества физиологически переносимой композиции, содержащей оурз-антагонист изобретения.
Дозированнье интерваль! для введения оурз-антагониста зависят от формь! антагониста, и его мощности, как зто описано далее в тексте, и составляют достаточно большие количества для обеспечения желаємого зффекта, согласно которому ангиогенез и симптомь!ї заболевания, опосредованнье ангиогенезом, подвергаются улучшению. Дозировка не должна бьіть столь вьісокой, чтобь! вьізьівать нежелательнье побочнье зффектьі, СМ например, синдромь! гипервязкости, легочную здему, сердечнье нарушения, связаннье с перегрузкой, и т.п. о
Обьічно, дозировка будет меняться в зависимости от возраста, состояния больного, пола и степени заболевания пациента и она может бьть определена специалистом. Такая дозировка также может регулироваться индивидуальнь!м терапевтом в случае осложнений.
Терапевтически зффективное количество представляет собой такое количество оур»з-антагониста, которое (о) достаточно для обеспечения измеримого ингибирования ангиогенеза в обрабатьваемой ткани, например, сч ангиогенез-ингибирующее количество. Ингибирование ангиогенеза может бьть измерено іп зіш методом иммуногистохимии, как описано в настоящем документе или другими методами, известньіми специалистам. в.
Поскольку оурз антагонист может принимать вид мимикрирующего оу3/рВз, и КОО-содержащего пептида, « анти-оуВз моноклонального антитела или его фрагмента, следует убедиться что мощность и позтому зкспрессия "терапевтически зффективного" количества могут изменяться. Однако, как показано методами в анализа изобретения, специалист в данной области может легко оценить мощность оурз-антагониста /кандидата настоящего изобретения.
Мощность оурз-антагониста может бьть измерена множеством способов, включая ингибирование « дю ангиогенеза в анализе САМ, в іп мімо анализе на глазах кролика, в іп мімо анализе с использованием химерного з мьішь-ч-еловека и путем измерения ингибирования связьивания природного лиганда с ооурз, причем все зти с анализьї описань в тексте или с помощью аналогичньїх анализов. :з» Предпочтительньй оурз антагонист обладаєт способностью существенно ингибировать связьівание такого природного лиганда, как фибриноген или витронектин, с оурз в растворе при концентрациях антагониста менее 0,5 микромоля /мкм/, предпочтительно, менее 0,1мкм и более предпочтительно менее 0,05мкм. Под термином їх "существенно" подразумевается, что, по крайней мере, 5095 снижение связьивания фибриногена наблюдается в результате ингибирования в присутствий антагониста и на 5095 ингибирование ссьілаются, как на значение ІСз0, пи Более предпочтительньй оураз-антагонист проявляєт селективность в отношений о3рВз по сравнению с -і другими интегринами. Так например, предпочтительньй оурз антагонист существенно ингибирует связьтвание фибриногена с оуВз, но не существенно ингибирует связьваниє фибриногена с такими другими интегринами, дк как ому» ом/Вв или с41583. Особенно предпочтительньім является оураз антагонист, проявляющий в 10 - 100 раз (Че) более низкую активность по значению ІСво при ингибирований связьівания фибриногена с оу/ру по сравнению с
ІСво активностью при ингибирований связьивания фибриногена с другим интегрином. Примерь! анализов измерения ІС 5о активности при ингибированиий связь'вания фибриногена с интегрином описаньі в Примерах изобретения. о Терапевтически зффективное количество оу/Вз антагониста изобретения в виде моноклонального антитела обьічно составляет такое количество, которое при применениий в физиологически переносимой композиции ко достаточно для достижения концентрации плазмь! в диапазоне от 0,01 микрограмм / цг/ на миллилитр /мл/ до 100Омкг/мл, предпочтительно, мкг/мл - бмкг/мл и обьічно около мкг/мл. ЙИначе говоря, дозировка может 60 изменяться от 0,1мг/кг до ЗбОмг/кг, предпочтительно, от 0,2мг/кг до 200мг/кг, найболее предпочтительно
О,бмг/кг до 20мг/кг, при применений одной или более дозировки ежедневно в. течение одного или нескольких дней.
В том случає, когда антагонист находится в виде фрагмента моноклонального антитела, такое количество может легко регулироваться на оснований отношения массь! фрагмента относительно массь! всего антитела. бо Предпочтительная концентрация плазмьй в молярном вьражениий составляєт от приблизительно 2 микромолярной / ЦМ/ до 5 миллимолярной /тМ/ и, предпочтительно, от около 100мкм до 1тМ антительного антагониста.
Терапевтически зффективное количество оурз-антагониста изобретения в виде полипептида или другого молекулярного оуВз миметика аналогичного малого размера, обьчно составляеєт такое количество полипептида, которое при введений в физиологически толерантной композиции, достаточно для достижения концентрации плазмь от около 0,1 микрограмма /дг/ на миллилитр /мл/ до приблизительно 20О0мкг/мл, предпочтительно, от около мкг/мл до приблизительно 15Омкг/мл. В расчете на полипептид с массой около 50Ог/моль, предпочтительная концентрация плазмь! в молярном вьражений составляет от около 2 70 микромолярной /цМ/ до около 5 миллимолярной /тМ/ и предпочтительно около 100мкМ-тїт М полипептидного антагониста. Иначе говоря, дозировка в расчете на вес тела может изменяться в интервале от около 0,1мг/кг до около ЗООмг/кг, предпочтительно, от около 0,2мг/кг до около 200мг/кг при применениий одной или более доз ежедневно в течение от одного до нескольких дней.
Моноклональнье антитела или полипептидьі изобретения могут бьть введень! парентерально путем 75 иньекции или постепенного вливания в течение времени. Хотя ткань, подлежащая лечению, обьічно доступна в организме в результате системного применения и позтому лечение, как правило, проводят путем внутривенньїх иньекций терапевтических композиций, подразумеваются и другие ткани и распределяющие устройства в том случає, когда существует вероятность того, что целевая ткань содержит молекулу-мишень. Так, например, моноклональнье антитела или полипептидь! изобретения могут применяться внутривенно, внутрибрюшинно, внутримьішечно, подкожно, внутрь полости, трансдермально, и могут вводиться с помощью перистальтических средств.
Терапевтические композиции, содержащие моноклональное антитело, или полипептид изобретения обьічно применяются внутривенно, например путем иньекции единичной дозировки. Термин "единичная дозировка", в том случає, когда он используется в отношений терапевтической композиции настоящего изобретения, с относится к физически дискретньім единицам, используемьм в качестве единичньїх дозировок для субьекта, о причем каждая единичная дозировка содержит определенное количество активного материала, рассчитанное с целью достижения желаемого терапевтического зффекта совместно с требуемьм разбавителем; например носителем или связующим. Согласно одному из предпочтительньїх решений изобретения, как показано в
Примерах, оурз-антагонист применяют внутривенно в виде единичной дозь. б»
Композиции изобретения применяют способом, совместимьм с формой дозировки, и в терапевтически сч зффективном количестве. Количество, подлежащее применению и длительность применения зависят от обьекта применения, емкости системь! субьекта, способной утилизировать активньій ингредиент, и степени - желаемого терапевтического зффекта. Точнье количества активного ингредиента требуемье для применения « зависят от мнения практикующего врача и различньь для каждого индивидуума. Однако, подходящие
Зо дозировочнье интервальь для систематического применения указаньй в описаний и они зависят от типа « применения. Подходящие режимь! применения тоже могут изменяться, но, как правило, производят начальное применение с последующими повторяющимися дозами с интервалами в один или более часов с последующей иньекцией или другими применениями. Однако, с другой стороньї предусматриваются также непрерьівнье « внутривеннье вливания, достаточнье для поддержания концентрации в крови в интервалах, спедифичньїх для іп мімо терапии. о) с Как продемонстрировано настоящими примерами, ингибирование ангиогеназа и регрессия опухоли "» происходят уже на 7 день после начального контактирования с антагонистом. Дополнительное или " пролонгированное воздействие антагониста предпочтительно в период от 7 дней до 6 недель, предпочтительно в период 14-28 дней.
В соответствий с .родственньм решением приведеннье Примерь демонстрируют взаймосвязь между ве ингибированием оу/рз и индуцированием апоптоза в неоваскуляторньїх клетках, несущих о3/Вз. Таким образом, їх настоящее, изобретение также охватьмвает способь! ингибирования апоптоза в неоваскуляторной ткани. На практике осуществлен способ изобретения, включающий ингибирование ангиогенеза во всех тканях и при - условиях описанньх в тексте. Заметньм различием оказалось лишь начало зффекта, которьій в случає ко 20 апоптоза проявляєтся бьістро, обьічно через 48 часов после контактирования с антагонистом, тогда как ингибирование ангиогенеза и регрессия опухоли проявляются более медленно, как зто бьіло указано вьіше. с Такое отличие оказьшшваєет зффект на терапевтический режим в плане времени применения и желаемого зффекта. Обьічно, применение в случае апоптоза неоваскулятора может проводиться в течение времени от 24 часов до 4 недель, хотя период от 48 часов до 7 дней является предпочтительньм.
Д. Терапевтическиє композиции.
ГФ) Настоящее изобретение охватьшаєт терапевтические композиции, используемье для практической реализации описанньїх терапевтических способов. Терапевтические композициинастоящего изобретения о содержат физиологически переносимьй оноситель совместно с оурз-анатагонистом, растворенньй или диспергированньй в нем в качестве активного ингредиента. Согласно предпочтительному воплощению, 60 композиция оурз-антагониста не является иммуногенной при применений на млекопитающих или людях в терапевтических целях.
Используемье в тексте терминьї "фармацевтически применимьй", "физиологически переносимьій" и их грамматические вариантьі, в той мере, в которой они относятся к композициям, носителям, разбавителям и реагентам, являются взаймозаменяемьми и означают, что такие материаль! способньії применяться на бо млекопитающих без нежелательньх физиологических зффектов, таких как тошнота, головокружение,
желудочнье расстройства и т.п.
Приготовление фармакологической композиции, содержащей активнье ингредиенть! раствореннье или диспергированнье в ней, хорошо известно из литературьі и не ограничиваєт типь! рецептур. Обьічно, такие
Композиции готовят в виде растворов для иньекций или жидких растворов, либо суспензий, однако могут таюже готовиться твердье формь! пригоднье для раствора или суспензиий непосредственно в жидкости перед применением. Такие препарать! могут также представлять собой змульсии.
Активньй ингредиент может смешиватьея с зксципиентами, являющимися фармацевтически приемлемьми и совместимьми с активньім ингредиентом, в количествах, подходящих для использования в описанньх 7/0 Терапевтических методах. Подходящими зксципиентами могут служить, например, вода, физиологический раствор, декстроза, глицерин, зтанол и т.п. или их комбинации. Кроме зтого, если желательно, композиция может содержать небольшие количества вспомогательньїх веществ, таких как смачивающие или змульгирующие агентьії, изменяющие рН буферньеє агенть и т.п., которне повьішают зффективность активного ингредиента.
Терапевтическая композиция настоящего изобретения может включать фармацевтически пригемлемье соли компонентов. Фармацевтически приемлемье соли включают соли присоединения кислот /образованнье с участием свободньїх аминогрупп полипептида/, которне готовят с помощью таких неорганических солей, как, например, хлористоводородная или фосфорная кислоть, или таких органических кислот, как уксусная, винная, миндальная и т.п. Соли приготовленнье с участием свободньїх карбоксильньїх групп также могут бьть производньмми таких неорганических оснований, как гидроксидь! натрия, калия, аммония, кальция или железа, или таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-зтиламинозтанол, гистидин, прокаин и т.п.
Особенно предпочтительньми при получений циклических полипептидньх оурз-антагонистов являются соли
ТЕА и НОЇ. Представители солей пептидов описань! в Примерах. с
Физиологически переносимье носители хорошо известньі! в данной области. Примерами жидких носителей являются стерильнье воднье растворьі, несодержащие никаких материалов, кроме активньїх ингредиентов и о водь, или содержащие такой буфер, как натрий фосфатньй при физиологическом значений рн, физиологический раствор или то и другое, т.е. фосфатно-буферньій физиологический раствор. Кроме зтого, воднье носители могут содержать более одной буферной соли или такие соли, как смешаннье хлоридьінатрия /д
М калия, декстрозу, полизтиленгликоль и другие раствореннье вещества.
Жидкие композиции также могут содержать жидкие фазь! в присутствий или в отсутствий водьі. Примерами сч таких дополнительньїх жидких фаз являются глицерин, такие растительнье масла, как хлопковое масло и че змульсиий типа вода в масле.
Терапевтическая композиция содержит ангиогенез-ингибирующее количество оурз антагониста настоящего З 3з5 изобретения, причем она обьічно формируется так, что содержит, по крайней мере, 0,190вес. антагониста в «І расчете на общий вес терапевтической композиции. Весовой процент представляет собой весовое соотношение ингибитора к общему весу композиции. Так например, 0,190овес. представляет собой 0,1г ингибитора на 100г всей композиции. «
Е. Антагонисть Интегрина о/р з. оуВз-антагонистьі используются в настоящих методах для ингибирования ангиогенеза в тканях и можно - с упомянуть большое число форм, включающих соединения, взайимодействующие с оурз таким образом, что они "з препятствуют функциональному взаймодействию с природньми о3рз3з лигандами. Примерами антагонистов " могут служить оуВз аналоги оурз, являющиеся производньми сайта связьшвания лиганда на омВа» -"миметики оурз или природного лиганда ом1/В3; которьій мимикрируєт структурную область, принимающую участиеє во взаймодействиях связьвания оуВз-лиганда, полипептидьі имеющие последовательность, те соответствующую домену функционального связьівания природного лиганда, специфичного к оурз, особенно, т» соответствующую КОСЮО-содержащему домену природного лиганда о3урВз, а также антитела, которье -1 иммунореагируют с оуВз или с природньім лигандом, причем все зти вещества проявляют антагонистическую 50р Вктивность. іме) 1. Полипептидь!
Ге В соответствии с одним из технических решений настоящее изобретение охватьіваєт оурз-антагонисть! в виде полипептидов. Полипептидньй /пептидньй/ оурз антагонист может иметь характеристики последовательности природного лиганда оурз или самого о3урз на участке, принимающем участие во взаймодействий оурз-лиганда и проявляет активность оурз-антагониста. Предпочтительньй оурз антагонист -пептид содержит КОЮ трипептид и соответствует по последовательности природному лиганду в КОО
ІФ) -содержащей области. іме) Предпочтительнье КОЮ -содержащие полипептидьі имеют последовательность, соответствующую последовательности аминокислотньїх остатков КОО-содержащей области природного лиганда оурз; такого бо как фибриноген, витронектин, фактор фон Виллебранда, ламинин, тромбоспондин и подобнье лигандь.
Последовательность таких оурз лигандов хорошо известна.
Так например, оурз -антагонист- пептид может бьіть производньім любого из природньїх лигандов, хотя предпочтительньми являются фибриноген и витронектин.
Особенно предпочтительньсе соураз -антагонистьі-пептидьї преимущественно ингибируют охлрз связьівание с бо их природньмми лигандами по сравнению с другими интегринами, описанньмми вьіше. Зти оурз -специфичнье пептидь! особенно предпочтительнь, по крайней мере, по причине того, что специфичность на оуВз уменьшает возможность нежелательньїх побочньїх зффектов, таких как ингибирование других интегринов. Идентификация предпочтительньїх о3урВз антагонистов-пептидов, обладающих селективностью на оурз может бьть легко осуществлена типичньм анализом на ингибирование связьшшания, например, с помощью анализа ЕГГІЗА, описанного в Примерах.
Согласно одному из воплощений, полипептид настоящего изобретения содержит не более 100 аминокислотньїх остатков, предпочтительно, не более 60 остатков, более предпочтительно, не более 30 остатков. Пептидь! могут бьїть линейньми или циклическими, хотя особенно предпочтительньми являются 70 Цциклические пептидь!.
Предпочтительнье циклические и линейнье пептидьй и их обозначения приведеньй в Таблице 1 и в
Примерах.
Целевой полипептид включаєт аналог, фрагмент или химическое производное полипептида, чья последовательность остатков аминокислот, представленная в описаний свидетельствует о том, что такой 75 полипептид представляєт собой оурз антагонист. Позтому, полипептид изобретения может бьіть обьектом различньхх изменений, замещений, вставок и делеций, если такие изменения обеспечивают некоторье улучшения его применения. В зтом отношений следует отметить, что оурз антагонист-полипептид изобретения соответствует, а не идентичен последовательности описанного пептида, в котором произведено одно или более изменений и он сохраняет способность функционировать как оурз антагонист в одном или более анализов, как то показано в тексте.
Таким образом, полипептид может присутствовать в любой из большого числа форм пептидньх производньїх, включающих амидь!, коньюгатьі с белками, циклические пептидьі, полимеризованнье пептидьї, аналоги, фрагментьї, химически модифицированньсе пептидь, и аналогичнье производньє.
Термин "аналог" включаєт любой полипептид, имеющий последовательность аминокислотньїх остатков СМ идентичную последовательности специально показанной там, где один или более остатков консервативно о замененьї на функционально аналогичньйй остаток и где проявляєтся оурз антагонистическая активность.
Примерьї консервативньхх замен включают замену одного /не-полярного/ гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин на другой, замену одного полярного /гидрофильного/ остатка на другой, как зто имеет место при замене аргинина на лизин, глутамина на аспарагин, глицина на серии, замену одного 9 основного остатка такого, как лизин, аргинин или гистидин на другой, или замену одного кислотного остатка, сч такого как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота на другой.
Фраза "консервативноє замещениє" также подразумеваєт использование химически дериватизированньх Ге остатков вместо не-дереватизированного остатка при условии, что такой полипептид обладает достаточной « ингибирующей активностью.
Зо Термин "химическое производное" относится к целевому полипептиду содержащему один или более « остатков, химически дериватизированньх по реакции функциональньх боковьїх групп. Такие дериватизированнье молекульй включают, например, те молекульі, в которьїх свободнье аминогруппь! бьли преобразованьї с образованием амингидрохлоридов, п-толуол сульфонильньїх групп, карбобензокси групп, « трет.-бутилоксикарбонильньїх групп, хлорацетильньїх групп или формильньїх групп. Свободнье карбоксильнье группьі могут бьіть преобразованьі с образованиєм солей, метиловьх или зтиловьїх зфиров, зфиров других в) с типов или гидразидов. Свободнье гидроксильнье группь! могут бьіть преобразованьі с образованием О-ацил "» или О-алкильньїх производньїх. Имидазольньій азот гистидина может бьіть дериватизирован с образованием " М-имбензилгистидина. Термином "химические производньсе" охватьваются те пептидьі, которье содержат одно или более встречающихся в природе аминокислотньїх производньїх двадцати стандартньїх аминокислот. Так, например, пролин может бьіть заменен на 4-гидроксипролин; лизин - на 5-гидроксилизин; гистидин может бьїть ве заменен на З-метилгистидин; серии может бьіть заменен на гомосерин; а лизин может бьіть заменен на орнитин. їх Полипептидьї настоящего изобретения также включают любой полипептид, имеющий одну или более вставок и/или делеций или остатков с родственной полипептиду последовательностью, показанной в тексте при - условий, что сохраняется необходимая активность. г 20 Термин "фрагмент" относится к любому целевому полипептиду, имеющему последовательность аминокислотньїх остатков более короткую, чем у полипептида, аминокислотная последовательность которого ще показана в тексте.
В том случае, когда полипептид настоящего изобретения имеет последовательность, не идентичную последовательности о3р3 природного лиганда, зто означаєт, что бьли произведеньй одна или более 22 консервативньїх или неконсервативньїх замещений, обьічно в зтом случає заменяют не более 3095 и,
ГФ) предпочтительно, не более 1095 аминокислотньїх остатков. Дополнительньсе остатки также могут добавляться к любому окончанию полипептида в целях обеспечения "линкера", с помощью которого полипептидьі изобретения о могли бьї соответствующим образом прикрепляться к метке твердой матриць или носителя.
Метки, твердье матриць и носители, которве могут использоваться с полипептидами настоящего 60 изобретения описань ниже.
Линкерьї аминокислотньїх остатков обьічно представляют собой, по крайней мере, один остаток и могут содержать 40 или более остатков, чаще 1-10 остатков, но они не образуют зпитопов оурз лиганда. Типичньіми аминокислотньіми остатками, используемьми для связьівания являются тирозин, цистейин, лизин, глутаминовая и аспаргиновая кислотьі или другие остатки. Кроме зтого, целевой полипептид может отличаться, если не бо указано особо, от природной последовательности о3урВ3з лиганда последовательностью, которая модифицирована ацилированием терминальной МН»о-группьї, например, путем ацетилирования или амидированием тиогликолевой кислотьі в результате терминального карбоксиламидирования, например, с помощью аммиака, метиламина, и аналогичньми терминальньми модификациями. Терминальнье модификации, как хорошо известно, используются для снижения восприимчивости к протеийназному перевариванию и позтому они служат для пролонгирования периода полураспада полипептидов в растворе, особенно в биологических жидкостях, где могут присутствовать протеазь. В зтом отношений циклизация полипептида также является ценньім методом терминальной модификации и она особенно предпочтительна из-за устойчивости структур, полученньїх в результате циклизации, и из-за биологических активностей, 70 наблюдаемьіх для таких циклических пептидов, как зто отмечается в описании.
Любой пептид настоящего изобретения может использоваться в виде фармацевтически приемлемой соли.
Подходящие кислотьі, способнье образовьівать соли пептидов настоящего изобретения, включают такие неорганические кислотьї, как трифторуксусную кислоту /ТЕА/ хлористоводородную кислоту /НСІ/, бромистоводородную кислоту, перхлорную кислоту, азотную кислоту, тиоциановую кислоту, серную кислоту, 7/5 фосфоруксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, молочную кислоту, пировиноградную кислоту, оксалиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеийновую кислоту, фумаровую кислоту, антраниловую кислоту, коричную кислоту, нафталинсульфокислоту, сульфанилиновую кислоту и т.п.
Особенно предпочтительньіми являются соли НОСІ и ТЕА.
Подходящие основания, способнье образовьвать соли с пептидами настоящего изобретения, включают гор такие неорганические основания, как гидроксид натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия и т.п.; и такие органические основания, как моно-, ди- и три-алкил и ариламинь /например, тризтиламин, диизопропиламин, метиламин, диметиламин и т.п./ и, необязательно, замещеннье зтаноламинь /например, зтаноламин, дизтаноламин и т.п./.
Пептид настоящего изобретения, на которьйй также ссьлаются, как на целевой пептид может бьть с ов синтезирован любьм методом, известньм специалисту в области полипептидов, например, методами рекомбинантной ДНК. Синтетические химические методьі, например, твердофазнье синтезьі типа Меррифилда і) являются предпочтительньми по причинам чистотьі продуктьї, антигенной специфичности, отсутствия нежелательньїх побочньїх продуктов, простоть! вьіполнения и т.п. Отличное резюме большинства доступньх способов содержится в книге Зіеулагі с сотр. "Твердофазнье пептиднье синтезь", МУ.Н. ЕТеетап, Ге! зо Сан-Франциско, 1969; работе ВодапзекКу с сотр., "Пептиднье синтезь!" Джон Вилей знд сане, второе изд., 1976; 3).
МеїіеппоПйег "Гормональнье протеиньі! и пептидь", т. 2, стр. 46, Академик Пресс /Нью-Йорк/, 1983; в статье с
Мегтійеідй Адм. Еплутої., 32:221-96, 1969; БРівеів с сотр., Іпб 90. Регпіде Ргоїеіп Кевз 35:161-214, 1990 и М патенте США Мо4.244.946, в том, что касается твердофазньїх пептидньїх синтезов, и в книге Зспгодег с сотр., "Пептидь"", т. 1, Академик Пресс /Нью-Йорк, 1965, в том что касается классических синтезов в растворе, причем « з5 на все зти работь! ссьлаются в данном описаний. Подходящие защитнье группьі, используемье в таких «г синтезах, описаньі в приведенньїх вьіше работах и в работе У.Е.М.МсОтіе "Защитнье группьї в органической химии", Пленум Пресс, Нью-Йорк, 1973, причем на зти работь! также ссьілаются в настоящем описаний.
Как правило, используемье методьі! твердофазного синтеза включают последовательное добавление одного или более аминокислотньх остатков или подходящим образом защищенньх аминокислотньїх остатков к « растущей пептидной цепи. Обьічно, каждая амино или карбоксильная группа первого аминокислотного остатка в с защищеньї подходящей, селективно удаляемой защитной группой.
Й Различньюе, селективно удаляемье защитнье группьі используются для аминокислот, содержащих ит реакционноспособную боковую группу, например для лизина.
С использованием твердофазного синтеза в качестве примера, защищенная или дериватизированная аминокислота присоединяєтся к инертному твердому носителю через незащищеннье карбоксильную или ї5» аминогруппу. Защитную группу амино- или карбоксильной группьі затем селективно удаляют и следующую аминокислоту в последовательности с комплиментарной /амино или карбоксильной/ группой, соответствующим ве образом защищенной смешивают с системой и проводят реакцию в условиях подходящих для образования -І амидной связи с остатком уже присоединенньм к твердой подложке. Затем защитную группу амино или карбоксильной группьї удаляют из вновь добавленного аминокислотного остатка и следующую аминокислоту ко /соответствующим образом/ защищенную добавляют к системе и т.д. После того, как все желаемье
Ге аминокислотьі связаньії в надлежащей последовательности, любье оставшиеся терминальнье и побочнье группьї, а также защитнье группьі /и твердьй носитель/ последовательно или параллельно удаляют с образованием целевого линейного полипептида. 5Б Полученнье в результате линейнье полипептидьій полученньі, например, как описано вьше могут реагировать с образованием соответствующих циклических пептидов. Один из примеров методов циклизации (Ф) пептидов описан 7іттег с сотр., Пептидьї 1992, стр. 393-394, Е5 СОМ Сайенс Паблишерс, В.У. 1993. Обьічно ко защищенньій тетрабутоксикарбонилом пептидньій метиловьій зфир растворяют в метаноле и добавляют раствор гидроксида натрия и смеси дают реагировать при 20"С с целью гидролитического удаления бо метилзфирной защитной группьі. После вьіпаривания растворителя, тетрабутоксикарбонил-защищенньй пептид зкстрагируют зтилацетатом из подкисленного водного растворителя. Затем тетрабутоксикарбонильную защитную группу удаляют в мягких кисльїх условиях в диоксановом Корастворителе. Полученньій таким образом незащищенньй линейньй пептид со свободньми амино- и карбокси-концами превращают в соответствующий циклический пептид в результате реакции разбавленного раствора линейного пептида в бб5 смеси дихлорметана и диметилформамида, с о дициклогексилкарбодиимидом в присутствий 1-гидроксибензотриазола и М-метилморфолина. Полученньій в результате циклический пептид затем очищают хроматографией.
Особенно предпочтительньій способ синтеза циклического пептида описан Сиїтгтаїйй с сотр., Еиг. У. Віоспет., 210:911-921 /1922/ и упомянут в примерах. Особенно предпочтительньми пептидами для способов изобретения являются с-/ЗгОДРЕУ/ /последовательность ЗЕО ІД Мо4/, с-/КОДТУ/ /последовательность ЗЕО ІД Моб/, с-/КАДМ/ /Іпоследовательность ЗЕО ІД Моб/, с-/КОДЕу/ /последовательность, ЗЕС ІД Мо/ и линейньй пептид
УТАЕСКРОУТКОСДУР /последовательность ЗЕО |Д Мо8/, где символ "с-- обозначаеєт циклический пептид, заглавнье буквьі в скобках соответствуют однобуквенному коду для І-аминокислоть), а строчнье буквь! в скобках соответствуют однобуквенному коду для ЮО -аминокислот. Последовательности аминокислотньх /о остатков таких пептидов также показань! !Іпоследовательностями ЗЕО ІД МоМо 4,5,6,7 и 8, соответственно. 2. Моноклональнье антитела
Согласно одному из воплощений, в настоящем изобретений описьшваєтся оУурз антагонист в виде моноклональньїх антител, которне иммунореагируют с оурз и ингибируют о3/Вз связьівание с его природньм лигандом, как зто показано в тексте. В настоящем изобретениий также описьмваются линии клеток, 75 продуцирующие такие антитела, способьі продуцирования клеточньїх линий и способь! получения моноклональньх антител.
Моноклональное антитело настоящего изобретения включает молекульь антитела, которье 1/ иммунореагируют с вьіделенньім оурз и 2/ ингибируют связььвание фибриногена с оурВ3. Предпочтительнье моноклональньсе антитела, которне преимущественно связьіваются с оу/рду включают моноклональное антитело, обладающее иммунореакционноспособньми характеристиками тАВ ІМб609, секретированнье гибридомной клеточной линией АТСС НВ 9537. Гибридомная клеточная линия АТСС НВ 9537 депонирована в соответствий с требованиями Будапештского договора в Американской коллегии типовьїх культур /"АТСС/, 1301 Парклаун
Драйв, Рокквилл, МД, США, 15 сентября 1987г.
Термин "антитело" или "молекула антитела" в различньїх грамматических формах используется в тексте в Ге качестве коллективного значения, относящегося к популяции иммуноглобулиновьх молекул , и/или (5) иммунологических активньїх частей иммуноглобулиновьїх молекул, т.е. молекул, содержащих сайт, обьединяющий антитело или паратоп.
Под термином "сайт обеединяющий антитело" подразумеваеєется, что структурная часть молекуль антитела, состоит из вариабельньх или гипервариабельньх участков тяжельх и легких Цепей специфически (о) связьівающих антиген. сч
Примерами антител, используемьх в настоящем изобретении, могут служить интактнье молекульї иммуноглобулина, частично интактнье молекульь иммуноглобулина и те части молекульь иммуноглобулина, їж» которье содержат паратоп, включая части известнье в литературе, как Раь, Раб, Р/аь7 и ЕЛ/ и также « относящиеся к фрагментам антитела.
Согласно другому предпочтительному воплощению, настоящее изобретение охватьвает укороченную « молекулу иммуноглобулина, включающую ГРаь фрагмент, являющийся производньім моноклонального антитела изобретения. Раь фрагмент, в котором отсутствует Ес рецептор, является растворимьмм и обладает терапевтическими прейимуществами в отношений полураспада сьіворотки и диагностическими преимуществами « в отношений способа применения растворимого Гаь фрагмента. Приготовление растворимого Гаь фрагмента обьічно известно в области иммунологии и может осуществляться большим числом методов. - с Так например, Раь и Р/аь/ части /фрагменть/ антител получают протеолитической реакцией папайна и а пепсина, соответственно, на существенно интактньїх антителах с помощью способов хорошо известньїх из є» литературьі. См. например, патент США Мо4342566, вьіданньій на имя Теоїйороїиз и Ріхоп. Части Ра» антитела также хорошо известньї и могут бьть полученьй из фрагментов Б/аь/»2 с последующим восстановлением дисульфидньїх связей, связьвающих участки тяжельх цепей, меркаптозтанолом, после чего проводят т. алкилирование полученного в результате протеин-меркаптана таким реагентом, как иодоацетамид. Антитела, ї» содержащие целье иммуноглобулиновье молекульй являются предпочтительньми и их используют, как проиллюстрировано в тексте. -і Фраза "моноклональное антитело" в различньїх грамматических формах относится к популяции молекул т 50 антител, которье содержат только одну разновидность сайта, обьединяющего антитело, способную иммунореагировать с конкретньім зпитопом. 3е) Таким образом, моноклональное антитело обьічно проявляет единое связьвающее сродство к любому зпитопу, с которьім оно иммунореагирует. Позтому моноклональноге антитело может содержать молекулу антитела, имеющую множество антительньїх комбинирующих сайтов, каждьй из которьіх иммуноспецифичен в отношений различного зпитопа, например биспецифичное моноклональное антитело. о Моноклональное антитело обьічно состоит из антител, продуцированньїх клонами одной клетки, назьіваемой гибридомой, которая секретирует /производит/ лишь один вид молекульй антитела. Гибридомная клетка ко формируется слиянием антитело-продуцирующей клетки и миеломьї или другой бессмертной клеточной линии.
Получение таких антител вначале бьіло описано Копіег и МіЇзіеп, Майте 256:495-497 /1975/, причем на зту бо работу ссьілаются в описании. Дополнительнье способь! описаньі 70і4 моноклональнье антитела: справочник по методам, СКС Пресс, Инк. /1987/. Гибридомньй супернатант, полученньій таким образом, может бьть подвергнут отбору на присутствие молекул антител, иммунореагирующих с оурВз и на ингибирование оурз связьввания с природньіми лигандами.
Короче говоря, для получения гибридомь, из которой продуцируют композицию моноклонального антитела, б5 миелому или другую бессмертную клеточную линию сливают с лимфоцитами, полученньми из селезенки млекопитающего, гипериммунизированного источника оу/рз, например, оурз вьіделенньмм из М21 человеческих мелономньїх клеток, как зто описано СПегеві с сотр., у). Віої. Спет. 262:17703-17711 /1987/.
Предпочтительно, чтобьї миеломная клеточная линия, используемая для получения гибридомьї, бьіла той же разновидности, что лимфоцитьі. Обьчно предпочтительньмм млекопитающим являются мьіши штамма 129
СХ" Подходящие для целей изобретения мМьішинье миеломьі! включают гипоксантин-аминоптерин-тимидин-чувствительнье /НАТ/ клеточнье линии РЗХб3З-А48.653 и 5р2 /О-Ад14, которье полученьі из Американской коллекции типовьїх культур, Роквилл, МД под обозначениями СКІ. 1580 и
СК 1581, соответственно.
Спленоцить! обьічно сливают с миеломньми клетками с использованием полизтиленгликоля. /19Г/1500. 70 Слитье гибридьї подвергают селекции на их чувствительность к НАТ. Гибридомь), производящие моноклональное антитело изобретения, идентифицируют с о использованием /знзим-связанного иммуносорбентного анализа /Е!Г ІЗА/, описанного в примерах изобретения.
Моноклональное антитело настоящего изобретения также может бьть получено инициированием моноклональной гидридомной культурьї,, включающей питательную среду, содержащую гибридому, 75 секретирующую молекуль! антитела соответствующей специфичности. Культуру вбідерживают в таких условиях и в течение такого периода времени, которне достаточнь для того, чтобь! гибридома секретировала молекуль! антитела в среду. Затем собирают антитело-содержащую среду. Далее, молекульь антитела могут бьть дополнительно вьіделень! хорошо известньмми способами.
Средьї, используемье для получения таких композиций, хорошо известньі из литературь!і, вьіпускаются промьшленностью и включают синтетические культурнье средь,: инбредньх мьшей и т.п. Примерами синтетических сред являются минимально необходимая среда Дулбекко /ДМЕМ; Оибібрессо с сотр., Мігої. 8:396, 1959/ дополненная 4,5гм/л глюкозьі, 20мММ глутамина, и 2095 сьіворотки телячьего плода. Примером инбредного мьішиного штамма может служить Ваїв/с.
Другие способьі продуцирования моноклонального антитела, гибридомной клетки или гибридомной с 285 Кклеточной культурьї также хорошо известньі. См., например, способ вьіделения моноклональньїх антител из иммунологического репертуара, описанньій Завігу с сотр., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 86;:5728-5732 /1989/; и і9)
Ниге с сотр. Зсіепсе. 246:1275-1281 /1989/,
Настоящее изобретение также охватьшает гибридомную клетку, и культурьї, содержащие гибридомную клетку, вьірабатьвающую моноклональное тело настоящего изобретения. Особенно предпочтительной Ге»! является гибридомная клеточная линия, секретирующая моноклональное антитело тАь І Мб09, обозначенное как АТСС НВ 9537. тАь 1Мб609 бьло ополучено как описано СПегевзі) с осотр., у. ВіоЇ. СпНет., с 262:17703-17711/1987/ и зто получение также отражено в Примерах изобретения. рч-
Согласно одному из воплощений, настоящее изобретение охватьівает моноклональное антитело, имеющее иммунореакционнье характеристики тАь І Мб609. М
Можно также определить без ненужного зкспериментирования обладаєт ли моноклональное антитело такой «ж же /ге. зквивалентной/ специфичностью /иммунореакционньми характеристиками/, как моноклональное антитело изобретения путем вьіяснения того факта, имеет ли место предотвращение первьм обьектом последнего обьекта от связьвания с предварительно вьібранной молекулой-мишенью. Если испьітуемое « моноклональное антитело конкурирует с моноклональньм антителом изобретения, о чем может 770 свидетельствовать уменьшение степени связьівания моноклональньмм антителом изобретения в стандартньх - с условиях сравнительного анализа на связьвание с мишенью-молекулой при реализации твердофазного й варианта, то существует вероятность того, что два зтих моноклональньх антитела связань! с одним, или близко "» родственньїм ему, зпитопом.
Еще один путь определения того, обладает ли моноклональное антитело, специфичностью Моноклонального антитела изобретения, состоит в предварительной инкубации моноклонального антитела «» изобретения с молекулой-мишенью, с которой оно реагирует в обьічньїх условиях с последующим добавлением испьітуемого моноклонального антитела для определения факта ингибирования способности испьтуемого ве антитела связьівания молекуль-мишени. Если такое ингибирование имеет место, то по всей вероятности оно -І идентично, или функционально зквивалентно зпитопной специфичности моноклонального антитела Мзобретения. о Еще одним путем определения одинаковой спедифичности моноклонального антитела и моноклонального (Че) антитела изобретения является определение последовательности аминокислотньїх остатков СДЕК.-участков сравниваемьх антител. Молекульй антитела, обладающие идентичной функционально-зквивалентной последовательностью аминокислотньїх остатков в их СДК областях, обладают одинаковой связующей специфичностью. Способьі! установления последовательностей полипептидов хорошо известнь из литературньі.
Иммуноспецифичность антитела, его связующая емкость в отношений молекуль-мишени, аффинность о антитела в отношений зпитопа, определяются зпитопом с которьім иммунореагирует антитело. Зпитопная ко специфичность определяется, по крайней мере, частично последовательностью аминокислотньїх остатков вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулинового антитела и частично вариабельньм участком бо легкой цепи последовательности аминокислотньїх остатков.
МИспользование термина "обладающий специфичностью связьівания" указьівает на то, что зквивалентнье моноклональнье антитела обладают одинаковьми или похожими иммунореакционньми /связующими/ характеристиками и конкурируют за связьівание с предварительно отобранной молекулой мишенью.
Гуманизированнье моноклональнье антитела предполагают особье преимущества над мьішиньми 65 Моноклональньми антителами особенно в том плане, что они могут терапевтически применяться на людях.
Говоря конкретно, человеческие антитела не так бьістро подвергаются циркуляции, как "инородньсе" антигень и не активируют иммунную систему тем же образом, что инороднье антигеньі и инороднье антитела. Способь получения "гуманизированньхх" антител обьчно хорошо известньх из литературьі и могут бьїть легко применимьі к антителам настоящим изобретением.
Таким образом, изобретение предусматриваєт, согласно одному из воплощений, моноклональное антитело, которое гуманизируется трансплантацией с целью введения компонентов человеческой иммунной системь! без существенньїх препятствий в отношений способности антитела связьвать антиген.
З. ауВз "Специфичнье миметики.
Настоящее изобретение демонстрирует тот факт, что оураз-антагонистьі обьічно могут использоваться в 70 изобретениий, причем такие антагонистьь могут включать полипептидь, антитела и другие молекуль! обозначеннье, как "миметики", которье обладают способностью препятствовать оурз функции. Особенно предпочтительньми являются антагонисть!, которне специфически препятствуют оурз функционированию и не являются помехой функции других интегринов.
В зтом контексте следует отметить, что большое количество реагентов может подходить для использования 75 в способах изобретения при условийи, что такие реагенть! обладают требуемой биологической активностью. На такие реагенть! ссьілаются, как на миметики, поскольку они обладают способностью "подражать" связьіванию домена на оурз или оуВз лиганде, принимающем участиє в функциональном взаймодействиий рецептора и лиганда и вследствие зтого препятствовать /например, ингибировать/ нормальное функционирование. оуВза миметик представляєт собой любую молекулу, отличную от антитела или лиганд-производного пептида, которая обладаєт описанньми вьіше свойствами. Зто может бьіть синтетический аналог пептида, соединение, имеющее форму связующего кармана, указанного вьіше домена, или другая молекула.
Создание оурз миметиков может осуществляться любьім изПбольшого числа структурно-аналитических методов создания лекарственньх препаратов, известньїх из литературь, включающих молекулярное моделирование, двумерньй ядерньй магнитньй резонанс /2-Д ЯМР/, рентгеновскую кристаллографию, с 29 случайньй скрининг пептида., пептидного аналога или других химических полимерньхх библиотек и другие г) методьї создания лекарств.
На оснований широких структурньїх данньїх, представленньїх в настоящем описаний, которое показьваєет, что оурз-антагонист может бьіть небольшим полипептидом или моноклональньм антителом, бьіл сделан вьівод о наличии двух взаймно различньїх химических структурах, которне разделяют функциональнье свойства о селективного ингибирования сурз, причем структура оурз-антагониста, используемого в настоящем способе, не сі требует такого ограничения, а включаєт любой ох/рз миметик, упомянутьй в описании.
Е. Способь! идентификации антагонистов оху/р з. -
В изобретенийи таюке описьіваются аналитические способь! идентификации кандидатов в оуВз антагонисть, з5 предназначеннье для использования в методах изобретения. В таких способах анализа молекуль-кандидать « оцениваются на их мощность в ингибирований о3/Вз связьівания с нейтральньми лигандами и, кроме зтого, оцениваются на мощность в ингибирований ангиогенеза в тканях.
В первом анализе измеряется ингибирование прямого связьивания природного лиганда с оуВз; а « предпочтительное техническое решение подробно описана в Примерах.
В анализе обьчно измеряєтся степень ингибирования связьівания природного лиганда, например, шщ с фибриногена с изолированньм оу/рз в твердой фазе методом ЕПІЗА. й Такой анализ может также использоваться для идентификации соединений, обладающих специфичностью "» на оурз и не ингибирующих природньсе лигандь от связьівания с другими интегринами. Специфичность анализа проверяется параллельньмм проведением анализов ЕГІЗА, когда оба о3урз и другие интегриньі! отбираются конкурентно в отдельнье аналитические камерьі с целью определения соответствующих способностей к т» связьванию с природньм лигандом, а соединение-кандидат оценивается на способность ингибировать 1» соответствующие способности интегринов Кк о соединению ос предварительно оотобранньм лигандом.
Предпочтительнье формать! скринирующего анализа описаньії в Примерах. -і Согласно второму методу анализа измеряется ангиогенез в куриной хорисаллантоисной мембране /САМ/ и т 50 на зтот анализ ссьлаются как на анализ САМ. САМ анализ бьіл описан подробно в других источниках и позже зтот анализ бьил использован для измерения ангиогенеза и неоваскуляризации опухолевьх тканей. См. (Че) А!Їйзргипк с сотр., Ат. у). Раппої, 79:597-618/1975/ и Оззопекі с сотр.,, Сапзег Кез. 40:2300-2309/1980/.
Анализ САМ является хорошо известньм методом анализа для іп мімо ангиогенеза, поскольку неоваскуляризация ткани имеет место в зтом случае и действительнье кровеноснье сосудь! куриного змбриона прорастают в САМ либо в ткань,, растущую на САМ. о Как продемонстрировано в описаний, САМ - анализ иллюстрирует ингибирование неоваскуляризации, основанной на количестве и степени роста новьїх сосудов. Кроме зтого, легко следить за ростом любой ткани, їмо) трансплантированной на САМ, например, опухолевой ткани. Наконец, такой анализ особенно ценен поскольку осуществляется внутренний контроль токсичности анализируемой системьі. Куриньій змбрион подвергается бо воздействию любого испьтуемого реагента и позтому состояние здоровья змбриона является указанием токсичности.
Третий анализ измерения ангиогенеза представляет собой іп мімо модель на глазах кроликов и на него ссьілаются, как на анализ на глазах кроликов. Такой анализ на глазах кролика подробно описан в других источниках и он дополнительно используется для измерения как ангиогенеза, так и неоваскуляризации в 65 присутствиий таких ангиогенньїх ингибиторов, как талидомид. См. С'Атай с сотр., Ргос. Май. Асай. зсі. 91:4082-4085 /1994/.
Кролично-глазной анализ представляет собой хорошо известную аналитическую модель іп мімо ангиогенеза, поскольку процесс неоваскуляризации, примером которого является рост кровеносньїх сосудов кролика от края роговой оболочки глаза в роговую оболочку легко визуализируется через обьічно прозрачную роговую оболочку глаза.
Кроме зтого, степень и количество стимуляции или ингибирования неоваскуляризации или регрессий неоваскуляризации легко может регистрироваться во времени.
Кроме зтого, кролик может бьіть подвержен действию любого испьітуемого реагента, и позтому состояние здоровья кролика является свидетельством токсичности испьітуемого реагента. 70 В четвертом анализе измеряется ангиогенез в химерной модели мьішь: человек и на зтот анализ ссьлаются, как на химерньй мьшиньй анализ. Зтот анализ подробно описан в других источниках и зтот анализ дополнительно описьівается в тексте, как средство для измерения ангиогенеза, неоваскуляризации и регрессии опухолевой ткани. См. дап с сотр. у. Сііп. Іпмеві. 91:986-996 /1993/,. Химерньй мьішиньй анализ является ценной аналитической моделью для іп мімо ангиогенеза,. поскольку трансплантированная кожа плотно привитая в ходе /5 операции напоминает нормальную человеческую кожу в гистологическом отношений и неоваскуляризация ткани, происходящая в системе, включаєет проращивание действительньїх человеческих кровеносньїх сосудов от привитой человеческой кожи в человеческую опухолевую ткань на поверхности привитой человеческой кожи.
Происхождение неоваскуляризации в человеческую прививку может бьть продемонстрировано иммуногистохимическим окрашиванием неоваскулятурь человеко-спедифичньми /зндотелиальньіми 2о кпеточньми маркерами.
Как продемонстрировано в отексте, химерньй мьшиньй анализ демонстрирует регрессию неоваскуляризации на основе количества и степени регрессии роста новьїх сосудов. Кроме зтого, легко осуществлять наблюдение за зффектами в ходе роста любой ткани, трансплантированной на привитую кожу, например опухолевой ткани. Наконец, такой анализ является ценньм средством поскольку позволяет с осуществлять внешний контроль токсичности аналитической системьі. Химерная мьішь подвергается любому испьітуемому Ореагенту и позтому состояние ее здоровья является индикатором токсичности. і)
Примерь!
Следующие ниже примерь, относящиеся к изобретению носят иллюстративньйс характер и, разумеется, не ограничивают изобретение. Кроме зтого, варианть! изобретения, известнье в настоящее время или те, что б зо будут разработаньі позже в рамках компетенции специалиста в данной области, рассматриваются, как входящие в сферу настоящего изобретения. с 1. Получение синтетических пептидов. ї-
Линейнье и циклические полипептидь), перечисленнье в Таблице 1 синтезировали с использованием стандартньїх методов твердофазного синтеза, как зто, например, описано Меїтійеій Аду. Епгутої., 32:221-96, « з5 71969/ и Рівідв Б.В. и Мобіе К.2. Іпі. 3. Репідо Ргоїеіп Кев., 35:161-214 /1990/. «г
Два грамма // ВОС-Сіуу-Д-Ага-сІу-Авр-Рпе-МаІ-ОМе /последовательность 5ЕО ІЮ Мо1/ вначале растворяли в 60 миллилитрах /мл/ метанола, к которому добавляли 1,5мл 2М раствор гидроксидий натрия с образованием смеси. Такую смесь затем перемешивали в течение З часов при 207С. После вьіпаривания остаток переносили в воду, подкисляли до рН З разбавленной НСІ и зкстрагировали зтилацетатом. Зкстракт сушили над Ма 250,4, « нова вьіпаривали и полученную в результате последовательность ВОС-СІу-Д-Ато-сіу-Азр-РНе- Ма-ОнН /ЗЕСІД 2 с Мо2/ перемешивали при 20"С в течение 2 часов в присутствимй 20мл 2М НСЇ в диоксане. Полученную смесь . вьіпаривали с получением последовательности Е-С1у-Д-АГа-сСіІу-Абзр-Рпе- МаІ-ОН /5ЕО ІД Мо3/, которую далее и?» растворяли в смеси 1800мл дихлорметана и 200мл диметилформамида /ДМЕ/ с последующим охлаждением до
ОС. После озтого, последовательно при перемешиваний добавляли 0,5г дициклогексилкарбодиимида /ДССІ/, 0,Зг 1-гидроксибензотриазола /НОВШ и 0,2Змл М-метилморфолина. Полученную в результате смесь їх перемешивали в течение 24 часов при 07С и затем при 20"С в течение еще 48 часов. Раствор концентрировали и обрабатьівали смешанньім слоем ионообменника для освобождения от солей. После удаления полученной в о результате смоль! фильтрацией, осветленньйй раствор вьіпаривали и остаток очищали методом хроматографии, -І получая цикло/СІу-Д-Агд-СІу-Азр-Рпе-Ма| /последовательность 5ЕБЕСО 10 Мо4/. Следующие пептидь, 5р перечисленнье в Таблице 1 с использованием однобуквенного кода сокращений аминокислотньх остатков о иПидентифицированнье обозначениями номера пептида, получали аналогичньм образом:
Ге) цикло/Агад-СІу-Азр-Д-Рйе- Маі/ /5ЕО ІО Мо5/; цикло/Ага-АІа-Азр-Д-Рпе- Ма /5ЕО ІО Моб/; цикло/Аго-Д-АІа-Азр-РПпе-Уаї/ /«ЗЕО ІЮ Ме9/; цикло/Ага-Сіу-Азр-РПпе-Д-Ма!/ /"«ЗЕО ІЮ Мо7/. Пептид, обозначенньй как 66203, имеющий последовательность идентичную последовательности пептида 62184, отличаєтся от последнего лишь тем, что содержит соль НОСІ, а не соль ТРА, присутствующую в 62184. В анализе по ингибированию ангиогенеза в соответствии с примером 7, в котором использовали синтетические пептидь, (Ф, 66203 пептид, содержащий НС, оказался несколько более зффективньм в ингибированийи ангиогенеза, чем ко идентичньй пептид в ТЕА. 5 вм читовлом в вв 62880 УТАЕСКРОМТВСОМЕ 8 ви 111 читаю 5
Пептид, обозначенньй номером 69601, имеющий идентичную последовательность последовательности пептида 62185, отличается от последнего тем, что содержит соль НОЇ, а не соль ТРА, присутствующую в 62184.
Циклический пептид с-КАОМ /69601/, как. бьіло показано, ингибирует связьівание фибриногена с интегрином оуВз и не ингибируєет связьшваниє фибриногена с интегринами ос44ьбз3 или обр. /РТай с сотр. 4). Віо). 75 Спет. 269:20233-20238 /1994/. Таким образом, пептид с-КАОЕМ специфичен на ох/Дз.- 2. Моноклональньсе антитела
Моноклональное антитело /Мб09, секретированное гибридомой АТСС НВ 9537, бьло получено с использованием стандартньїх гибридомньх методов, в результате иммунизации вьделенной оурз адсорбированного на Сефароза-лентиллектиновьїх шариках. оурз вьіделяли из человеческих меланомньх клеток, обозначеньі, как М21, и антитело получали в соответствии со способом СПегезп с сотр. 9. Віої. Спет, 262:17703-17711/1987/. М21 клетки бьли полученьь д-ром ОО. Її. Могпоп /Калифорнийский университет
Лос-Анжелеса, Ка./ и виіращень в суспензионной культуре в КРМІ 1640 культуральной среде, содержащей 2 тм
І-глутамина, 5Омг/мл гентамицинсульфата и 1095 фетальной телячьей сьіворотки.
Бьло показано, что моноклональное антитело І! Мб60О9 специфически иммунореагируеєт с оудрз Комплексоми є не иммунореагирует с оуу субьединицей, с ВДз субьединицей или с другими интегринами. о
З. Характеристика тканевого распределения оу/ру зкспрессии.
А. Иммунофлуоресцения с анти-интегрин рецепторньїми антителами.
В ходе заживления ран основнье мембраньі кровеносньїх сосудов зкспрессируют несколько адгезивньх протейнов, включающих фактор фон Виллебранда, фибронектин и фибрин. Кроме зтого, некоторье члень! Ме интегринового семейства адгезионньїх рецепторов зкспрессируются на поверхности культивированньйх гладких с мьішц и зндотелиальньїх клеток. См. Спегезп Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 84:6471 /19877/; дапаї с сотр., 9. Сеї
Рпузіої. 151:588 /19927/; а также Спепа .. СеїІ Ріпузіо!., 139:275 /1989/. в.
Среди зтих интегринов присутствуют соурз зндотелиальньй клеточньйй рецептор фактора фон Виллебранда, «Е фибриноген /фибрин/ и фибронектин согласно Спегезп Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 84:6471/1987/. Зти интегринь 39 инициируют кальций-зависимьй сигнальньй путь, ведущий к миграции зндотелиальньх клеток, и, позтому, З по-видимому они играют фундаментальную роль в биологии сосудисньїх клеток в соответствии с 7еамеїЇвеу с сотр., у. Сеї! Віої., 121:163/1993/,
Для исследования зкспрессии оурз в ходе ангиогенеза, человеческую раневую грануляционную ткань или « соседнюю нормальную кожу получали от пациентов-добровольцев, промьівали їмл фосфатного буфферного - т0 раствора и вводили в О.Т.С. среду /Ткань Тек/. Внедреннье ткани замораживали в жидком азоте на 30-45 с секунд. Секциий толщиной шесть микрон вьірезали из замороженньїх блоков на криостатном микротоме для з» последующего иммунопероксидазного окрашивания с оантителами, специфичньми ко Дз интегринам 7 ом Вз или с4чьВз/ или р подсемейству интегринов.
Результать!ї окрашивания нормальной человеческой кожи и раневой грануляционной ткани представлень на їх 15 фигЛА - 1Д. Моноклональнье антитела АРЗ и І М534, направленньюе к Дз и р. интегринам, соответственно, использовали для иммуногистохимического анализа замороженньїх секций. Зксперименть! с тканью от четьірех ве различньїх человеческих доноров дали идентичнье результать!. Фотомикрографии приведень! при увеличений в - ЗбОраз. сурВз интегрин обильно зкспрессировался на кровеносньїх сосудах в грануляционной ткани /фиг.18В/, но не де детектировался в дермисе и зпителий нормальной кожи того же донора /фиг.ТЛА/. В отличие от зтого, оурВз
Ге) интегриньї обильно зкспрессируются на кровеносньїх сосудах и стромальньїх клетках как на нормальной коже /фиг.1С/, так и на грануляционной ткани /фиг.1Д/ и, как предварительно показано и описано Адатв с сотр.,
Сеїї, 63:425/1991/, на базальньїх клетках внутри зпителия.
В. Иммунофлуоресценция в присутствий анти-лигандньх антител
Дополнительнье участки человеческой нормальной кожи и грануляционньїх тканей, полученньїх вьіше
Ф) подвергали также исследованию на присутствие лигандов рз и Ді. интегринов, фактора фон Виллебранда и ко ламинина, соответственно. Фактор фон Виллебранда оказался локализованньм на кровеносньїх сосудах нормальной кожи /фиг.2А/ и грануляционной кожи, /фиг.28/, тогда как ламинин бьіл локализован на всех бо кровеносньх сосудах, а таюже зпителиальной основной мембрань! в обоих препаратах ткани /фиг.2С и 2Д/.
С. Распределение анти оу/рз антител на раковьїх тканях.
Помимо проведенньх вьіше анализов, биопсии раковой ткани человека также исследовали на присутствие и распределение о3/Дз. Ткани получали, как описано в Примере ТА за исключением того, что их окрашивали моноклональньм телом ІМб6бО09, полученньм в Примере 2, специфичньм на интегриновьй рецепторньй б5 комплекс оура. Кроме зтого, также, получали опухоли для микроскопического гистологического анализа путем фиксации представителей опухолей в Виїїпз Ріхайме в течение 8 часов и серийнье секции вьірезали и окрашивали Н 8. Е.
Результать!ї иммунопероксидазного окрашивания пузьірьков, а также раковьіїх тканей толстой кишки, грудной железьі и легких представлень на фиг.ЗА - ЗД, соответственно. оуВ3 обильно зкспрессировались лишь на
Кровеносньїх сосудах, присутствующих в четьірех раковьїх биопсиях, подвергнутьїх анализу, и ни на каких-либо других клетках присутствующих в ткани.
Таким образом, описаннье результатьь показьвают, что о3у8рВз интегриновьій рецептор селективно зкспрессируется на тканях специфических типов, а именно, грануляционньїх, метастатических тканях и других тканях, в которьїх имеет место ангиогенез и в нормальньїх тканях, в которьїх образование новьіх кровеносньїх 70 сосудов прекращено. Позтому такие ткани представляют собой идеальную мишень для терапевтических аспектов изобретения. 4. Мдентификация соурз -специфических синтетических пептидов, . детектируемьїх лиганд-рецепторнь!м связьвванием.
Синтетические пептидь, полученнье в Примере 1, подвергали скринингу, измеряя их способность 75 антагонизировать оурз МИ с41ьВз рецепторную связующую активность в анализах на связьівание между очищенньім лигандом и рецептором. Метод такого изучения связьувания описан Ваграз с сотр., в Ргос. Май.
Асай. Зсі., ОБА 90:10003-10007 /1993/., Зтій с сотр. У. Віої. Спет., 265:11008-11013 /1990/ и Ртак с сотр.,
У. Віоії. Спет., 269:20233-20238 /1994/, причем на содержание зтих работ ссьілаются в настоящем изобретений.
В настоящем описаний описьівается способ идентификации антагонистов в анализе лиганд-рецепторного связьшвания, в котором рецептор иммобилизован на твердой подложке, а лиганд и антагонист находятся в растворенном состоянии. Описьваєтся также анализ на лиганд-рецепторное связьівание, в котором лиганд иммобилизован на твердой подложке, а рецептор и антагонисть! находятся в растворенном состоянии.
Вкратце, отобраннье очищеннье интегринь! по отдельности иммобилизуют в лунках для микротитрования
Тнепек, при концентрации покрьтия 50 нанограммов /пг/ на ампулу. Метод очистки рецепторов, используемьх в. СМ анализах на лиганд-рецепторное связьівание, хорошо известен из литературь! и может бьіть легко осуществлен о специалистами в данной области. После инкубирования в течение 18 часов при 4"С, неспецифичнье связующие сайтьї на пластине блокируются 1Омг/мл альбумина бьічьей сьіворотки /ВБА/ в Трис-буферном растворе. Для изучения ингибирования различнье концентрации пептидов, указанньїх в Таблице 1, испьітьіївали на способность блокировать связьвание 3125 |витронектина или 125-фибриногена с интегриновьми (22) рецепторами ор и о44ьВ3. Хотя такие лигандьї демонстрируют оптимальное связьівание с конкретньм сч интегрином, витронектином в случає оурз и фибриногеном в случає 034533 исследования ингибирования связьмшвания с использованием пептидов с целью блокировки связьвания фибриногена с любьім рецептором - позволяют точно определить количество микромолей пептида, необходимое для половинного ингибирования «І связьишвания рецептора с лигандом. Радиомеченнье лигандь! использовали в концентрациях порядка 1нНМ и связьвание вьізьівалось отдельно немеченньіми синтетическими пептидами. М
Через три часа инкубации свободньїй лиганд удаляли промьівкой, а связанньій лиганд детектировали гамма подсчетом. Даннье анализов, в которьїх отобраннье циклические пептидьії перечисленнье в Таблице 1, использовали для ингибирования связьивания рецепторов и радиомеченного фибриногена с отдельно « иммобилизованньми о3Вз и с4415683 рецепторами бьли вьсоко воспроизводимьми при ошибке между З 70 полученньми значениями обьічно ниже 1195. Данньюе ІС о в микромолях /С 5оМкМ вьражали , как среднее с значение из двух измерений - стандартное отклонение, как зто показано в Таблице 2. ;» в? 2» - му
Фо
Таким образом, КО -содержащие или КОЮ -дереватизированнье циклические пептидь! 62181, 62184, 62185 и 62187, каждьй из которьіїх содержит один ЮО-аминокислотньй остаток, демонстрируют о преймущественное ингибированиє фибриногенного связьвания со о3урз рецептором, как измерено низкой концентрацией пептида, требуемой для полумаксимального ингибирования, по сравнению с зтой величиной для ю с41ьВ3 рецептора. В отличие от зтого КСО -содержащие или КОО-дериватизированнье пептидь! 62186, 62175 и 62179 либо не столь зффективньі в блокирований фибриногенного связьвания со оурз или 60 демонстрируют преимущественное ингибирование фибриногенного связьівания с о41ьвВз по сравнению с оу/рз.
Зти результатьь находятся в соответствии с недавно опубликованньми Рай с сотр. 9/ Віої. Спет., 2690233-20238 /1994/, в которьіїх циклический пептид КООЕМ / где Є обозначаєт Ю -аминокислотньй остаток/ специфически ингибировали связьіваниє фибриногена с интегрином оураз, а не с о44503 или о5рі интегринами.
Аналогичньсе анализь! по ингибированию связьівания проводились с линеаризованньми пептидами, имеющими 65 или не имеющими КОЮ мотив, последовательности которьїх являются производньми оу рецепторной субьединицьі, 0415 рецепторной субьединицьі или последовательностей аминокислотньх остатков витронектинового лиганда. Последовательности линейньїх пептидов, 62880 /Л/;М-производньіе аминокислотнье остатки 35-49/, 62411 /оХ-производнье аминокислотнье остатки 676-687/; 62503 /охХ-производнье аминокислотньюе остатки 655-667/ и 62502 /ох,.-производнье аминокислотнье остатки 296-306/ перечислень! в
Таблице 1. Каждьй из таких пептидов использовали в отдельньїх анализах для ингибирований связьівания либо витронектина //;М/, или фибриногена /Е0/ с о446Вз или оуВз. Значения ІС во, ніраженнье в микромолях ЛсС 5о мМкМ/ индивидуального анализа каждого зксперимента представлень! в Таблице З о
Гваво» во) Б лою лоб)
Результатьі анализов по ингибированию лигандного связьншания вьібранньїх интегриновьїх рецепторов с линеаризованньми пептидами показьвают, что лишь пептид 62880 озффективен при ингибирований полу-максимального связьівания ЕС или М;М с омрз; что измерено низкой концентрацией пептида, требуемого для полу-максимального ингибирования по сравнению с о41ьВз3 рецептором. Никакой другой из линеаризованньїх пептидов не бьіл зффективен в блокировке лигандного связьвания с оурз хотя пептид 62502 оказался зффективньм в блокировке У;М связьвания с с4415р3.
Таким образом, описанньй в тексте лиганд-рецепторньій анализ может использоваться для скрининга как с 22 кольцевьх, так и линеаризованньхх синтетических пептидов, проявляющих селективную специфичность в Го) отношений конкретного интегринового рецептора, особенно оо3урВз при их использований в качестве витронектиновьїх рецепторньх /оу/рз/ антагонистов при практической реализации изобретения. 5. Характеристики необработанной хорисаллантоисной мембрань! цьіпленка /САМ/ Фу
А. Получение САМ
Ангиогенез может индуцироваться на хорисаллантоисной мембране цьшпленка /САМ/ после нормального с змбрионального ангионенеза, приводящего к образованию зрельїх кровеносньїх сосудов. Бьіло показано, что їм ангиогенез индуцируется в ответ на специфический цитокинез фрагментов опухоли, как описано 7еїромісп с сотр., Майте, 329:630 /1987/ и А!йвергипкК с сотр. Ат. У. Раїйої, 79:597/1975/. САМ получали из цьіплячьих « змбрионов с целью последующего индуцирования ангиогенеза и его ингибирования, как описано в примерах б и « 7. Десятидневнье куринье змбрионьі получали с птицеводческой фермь МакиИнтайр /Лзйксайд, КА/ и инкубировали при 377"С при 6095 влажности. Небольшое отверстие продельшвали в оболочке на конце яйца непосредственно над воздушньм мешочком с использованием небольшой дрели /Дремел, Отделение Змерсон злектрик Ко., Расайн УМІ/. Второе отверстие просверливали на широкой стороне яйца в области, лишенной « 20 змбрионньїх кровеносньїх сосудов, что бьло установлено предварительной проверкой яйца на свет. К -о исходному отверстию прилагали отрицательное давление, что приводило Кк вьтягиванию САМ с /хориосаллантоисная мембрана/ из мембраньй оболочки и созданию ложного воздушного мешочка над САМ. :з» Квадратное окно размером 1,0 х 1,0см вьурезали в оболочке над САМ с использованием размальзвающего колеса небольшой модели /Дремел/. Небольшое окошко позволяло осуществлять непосредственньій доступОк находящемуся внизу САМ. їз Полученньій в результате препарат САМ использовали либо через б дней змбриогенеза, стадий отличающейся активной неоваскуляризацией без дополнительной обработки с образованием САМ отражающей ве модель используемую для оценки зффектов змбрионной неоваскуляризации, или использовали через 10 дней -1 змбриогенезиса, когда ангиогенез начинал убьівать. Последний препарат таким образом использовали в изобретении для индуцирования нового ангиогенеза в ответ на цитокиновую обработку или контакт с опухолью, іме) как зто описано в Примере 6.
Ге) В. Гистология САМ.
Для анализа микроскопической структурьі САМ куриньїх змбрионов и/или человеческих опухолей, которье подвергали резекциий из куриного змбриона, как описано в примере 8, САМ и опухоли получали для св Мзготовления срезов в замороженном состоянии, как описано в Примере ЗА. Шестимикроновьсе срезь /по толщине/ внірезали из замороженньїх блоков на криостатном микротоме для иммунофлуоресцентного анализа. (Ф. На фиг4 представлена типичная фотомикрография площади, лишенной кровеносньїх сосудов в
ГІ необработанном САМ через 10 дней. Ангиогенез в САМ-системе уменьшался на зтой стадии змбриогенеза, систему использовали в изобретений для стимуляции продуцирования новой сосудистой системь! из бр буществующих сосудов от соседних участков в участки, где САМ лишен каких-либо сосудов.
С. Профили интегринов в САМ, детектируемой методом иммунофлуоресценции.
Для определения распределения ткани интегриновьїх рецепторов присутствующих в САМ тканях, б-микроннье замороженнье срезьі опухолевой ткани и тканей САМ куриного змбриона фиксировали в течение
ЗО секунд в ацетоне и окрашивали методом иммунофлуоресценции 10 микрограмм/миллилитр /мкг/мл/ тАВ бе СЗАТ, моноклональньм антителом специфичньїм к ВД. интегриновой субьединице в соответствии с описанньм
Виск с сотр., 9. СеїІ. ВіоІ., 107:2351/1988/ и таким образом использовали для контрольньїх образцов или І МбО09 в соответствии с методикой примера 2. Первичное окрашивание сопровождалось окрашиванием 1:250 разбавлением меченного вторичного антитела козьего анти-мьішиного родамина /Тадо/ с целью детекции первичного иммунореактивного продукта. Затем такие срезьь анализировали на микроскопе Цейса в Пприсутствий иммунофлуоресцирующего соединения.
Результатьї иммунофлуоресцентного анализа показьівают, что зрелье кровеноснье сосудьі присутствуют в необработанном 10-дневном курином змбрионе, зкспрессирующем субьединицу интегрина р. /фиг.5А/.. В отличие от зтого, в серийном срезе ткани, показанном на фиг.5А не обнаружено иммунореактивности в присутствим ЇМб609 /фиг.5В/. Таким образом, интегрин о3Вз детектируемьій І МбО9 антителом активно не 70 зкспрессируется зрельми кровеносньми сосудами, присутствующими в 10-дневном необработанном курином змбрионе. Как показано в модели САМ и следующих примерах, хотя кровеноснье сосудь! подвергаются новому росту в ходе нормального змбриогенеза или индуцируются цитокинами или опухолью, кровеноснье сосудь зкспрессируют о/з. Однако, после активного процесса неоваскуляризации, развитие сосудов прекращаеєтся и зкспрессия оурз уменьшаєтся до уровней, не детектируемьх иммунофлуоресцентньм анализом. Такая 75 регуляция оурз зкспрессии в кровеносньїх сосудах, подвергаемьх ангиогенезу, контрастирующая с отсутствием зкспрессийи в зрельїх сосудах, обеспечивает уникальную способность настоящего изобретения контролировать и ингибировать ангиогенез, как зто показано в следующих ниже примерах в качестве модели использующей систему анализа САМ-ангиогенеза. 6. Анализ САМ ангиогенеза.
А. Ангиогенез, индуцированньій факторами роста.
Бьіло показано, что ангиогенез может индуцироваться цитокинами или факторами роста на что ссьлаются в
Примере 5А. В описанньїх зкспериментах ангиогенез в препарате САМ, описанном в Примере 5 индуцировали факторами роста, которне применяли местно на кровеносньїх сосудах САМ.
Ангиогенез индуцировали путем помещения фильтровального диска Ватмана /размером 5 х 5см/ Ватман, с фильтровальная бумага Мо1/, -насьіщщенного сбалансированньїм солевьім раствором Ханкса /НВЗ5 СІВСО Гранд о айлазнд, Нью-Йорк/ или НВЗ5 ,ксодержащим 150 нанограммов миллилитр /нг/мг/ рекомбинантного основного фибробластного фактора роста /ДЕОР/ /Гензим, Камбридж, МА/ на САМ 10-дневного куриного змбриона в области., лишеннной кровеносньїх сосудов, и оокошко далее закрьвали лентой. В других анализах 125нг/мл ДЕР также оказались зффективньми в индуцированиий роста кровеносньїх сосудов. За развитием б» ангиогенеза следили через 72 часа с помощью фотомикроскопии. САМ резко замораживали и бмкм криостатнье «с срезьі фиксировали ацетоном и окрашивали методом иммунофлуоресценции, как описано в примере 5С, 1Омкг/мл анти-р. моноклонального антитела САТ или І Мб609. -
Иммунофлуоресцентная фотомикрография на фиг5С опоказьваєт усиленную зкспрессию омВз во Ж з5 ХоДде ВЕСЕ-индуцированного ангиогенеза на куриной САМ в контрасте с отсутствием оурВз зкспрессиий в « необработанньх куриньхх САМ, как зто показано на фиг.5В. оу/рз легко детектируется на большинстве /75 - 8090/ сосудов ДЕСЕ-обработанньх САМ. Кроме зтого, зкспрессия интегрина Ді не изменяєтся относительно зкспрессии, наблюдаемой в необработанньїх САМ, поскольку р. также легко детектируется на стимулированньх « кровеносньїх сосудах.
Относительную зкспрессию о34В3 и Ді. интегринов далее определяли количественно в - с ходе ВЕСЕ-индуцированного ангиогенеза с помощью анализа лазерного конфокального изображения САМ "» криостатньїх срезов. Затем окрашеннье срезьї анализировали на лазерном конфокальном микроскопе Цейса. " Двадцать пять сосудов, окрашенньїх І Мб09, и 15, окрашенньїх СЗАТ, /средний размер - 1200мм 2, интервал размеров - 350 - ЗБО0мм?/ вьібирали из случайной партий и среднюю родаминовую флуоресценцию для 395 каждого сосуда в расчете на единицу площади измеряли в произвольньїх единицах методом анализа лазерного е конфокального изображения. Полученнье даннье вьіражали, как среднюю интенсивность флуоресценции в с» произвольньїх единицах сосудов 4 стандартная ошибка /ЗЕ/. - Результатьї, представленнье на фиг.б показьівают, что окрашивание оурз, существенно усилено /примерно в 4 раза/ на САМ, обработанньїх ДВЕСЕ в соответствии с определением методом УМіїсохоп Капк ит іеві /Р « іме) 0.0001/, тогда как Д/ окрашивание существенно не менялось при обработке ВЕОЕ.
Ге) Далее САМ-анализ использовали для изучения зффекта другого мощного индуктора ангиогенеза, альфа-фактора некроза опухоли /ТМЕа/, на зкспрессию Ді. и Дз интегринов. Фильтровальнье диски, пропитаннье либо ДЕСЕ, или ТМЕРа и помещеннье на САМ 10-дневньїх змбрионов, как бьіло обнаружено, промотируют локальньй ангиогенез через 72 часа.
Полученнье результать! представлень на фотомикрографиях САМ в необработанном состояний /фиг.7А/, о обработанньх ВЕС /фиг.7В/ или обработанньїх ТМЕРа /фиг.7С/. Кровеноснье сосудьй легко различимь! на іме) препаратах, обработанньх как рЕСЕ, так и ТМРа, но они отсутствуют на необработанном САМ. Таким образом, местное применение системь! фактор роста/цитокин приводит в результате к индуцированию ангиогенеза от бо Зрельмх сосудов на площади соседней с участком, на котором первоначлаьно отсутствовали кровеноснье сосудьі. На оснований ДВЕСЕ-индуцированньїх кровеносньїх сосудов и сопутствующей зкспрессии как показано на фиг.5С, можно сделать вьівод, что обработка ТМЕРа обеспечиваєт сравнимую активность.
Зти результать! указьвают на то, что как у человека, так и у курицьі кровеноснье сосудьі, принимающие участие в ангиогенезе, демонстрируют повьішенную зкспрессию оур з. бо Аналогичньім образом, зкспрессия о3Вз на культивированньїх зндотелиальньїх клетках может вьізьіваться различньми цитокинами іп мійго как зто описано дапаї с сотр., в У. СеїЇ РПузіоіІ., 151:588/1992/, Епепвівїп с сотр., Ехр. СеїЇ Кев., 203:499 /1992/ и 5уепіїсК с сотр., в 3). Іпмеві. ЮОегт., 99:715/1993/,
Влияние на ангиогенез, индуцированньй фактором роста, антитела и пептидного ингибитора продемонстрировано в Примерах 7А и 7В.
В. Змбриональньй ангиогенез.
Получение САМ для оценки зффекта ингибиторов ангиогенеза на естественное образование змбрионной сосудистой системь! осуществлялось с использованием б-дневньїх змбрионньїх куриньїх змбрионов, как бьло описано ранее. На зтой стадии развития, кровеносньіе сосудьі подвергают де помо росту и таким образом 7/0 обеспечивают полезную систему для определения вероятности участия о3урз, в змбрионном ангиогенезе.
САМ-систему готовили как описано вьіше, за ислючением того, что анализ проводили на б-дневньїх змбрионах, а не на 10-й день. Влияние на змбрионньй ангиогенез с помощью обработки антителами и пептидами настоящего изобретения продемонстрировано в примере 7С.
С. Ангиогенез индуцированньїйй опухолями.
С целью исследования роли оурз в ангиогенезе индуцированном оопухолью, различнье оурз -отрицательнье человеческие меланомнье и карциномнье фрагменть! использовали в САМ-анализе, при зтом их предварительно вьіращивали и вьіделяли из САМ 17-дневного куриного змбриона, как зто описано Вгоок5 с сотр., в У. Сеї! Віої., 122:1351 /1993/ и в настоящем тексте. Такие фрагменть! вьізьвали обширную неоваскуляризацию в присутствии лишь буфера.
Ангиогенез индуцировали в САМ-аналитической системе непосредственньм присоединением фрагмента опухоли к САМ. Приготовление САМ куриного змбриона идентично методике, описанной вьіше. Вместо фильтровального бумажного диска, 5Омг - 55мг фрагмент меланомной опухоли человека М211, человеческой опухоли легочной карциномь! ОСІ АР-3, клеточной линии ЕС карциномь! поджелудочной железьі! человека /Спегеві с сотр., СеїЇ, 58:945-953, 1989/, или человеческой ларингеальной карциномной клеточной линии НерЗ, см все из которьіх являются оУурз отрицательньми опухолями, помещали на САМ на площади, которая о первоначлаьно бьіла лишена кровеносньїх сосудов.
Ма211Г. человеческаая меланомная клеточная линия, ОСІ АР-3 человеческая легочная карциномная клеточная линия, БО клеточная линия карциномь! поджелудочной железьі или НерЗ человеческая ларингеальная карциномная клеточная линия, все оу/Ву отрицательнье, использовали для виращивания твердь человеческих /Ф) опухолей на САМ куриногоО змбриона. Суспензию в виде отдельньх клеток 8 х 109М21-1 ОСІ АР-3 и ЕВ или 5 х с 105 НЕрЗ клеток вначале применяли на САМ в общем обьеме 30 микролитров стерильной НВЗ5 . Окошки закрьівали лентой и змбрионьї инкубировали в течение 7 дней для обеспечения роста человеческих опухолевьх - повреждений. По истечений 7 дней, теперь уже 17-дневньіе змбрионнье опухоли подвергали резекций из САМИ «Ж проводили операцию очистки от окружающей САМ ткани. Опухоли нарезали на фрагменть! весом 50 - 55мг для 30 использования в анализе на рост опухоли или ангиогенез. Фрагментьь опухоли помещали на новьій ряд т 10-дневньїх куриньїх змбрионньїх САМ в соответствии с описанньм в примере бА на площади, лишенной кровеносньїх сосудов.
Опухоли растущие іп мімо на куриньїхО змбрионньїх САМ окрашивали для определения оурз зкспрессиий тАВ « дю І М609, как зто описано в примере ЗА. Специфического окрашивания опухолевьїх клеток не наблюдалось, что з свидетельствует об отсутствий оурз зкспрессии. с Такие САМ оопухолевье препарать! далее обрабатьшвали в соответствии с 7Д и 7Е с целью измерения :з» зффектов антител и пептидов на ангиогенез, индуцированньій опухолью. САМ опухолевье препарать! также обрабатьвали, как описано в Примерах 8, 9 и 12 для измерения влияния антител и пептидов на регрессию опухолей и апоптоза ангиогенньїх кровеносньїх сосудов и сосудистьїх клеток. ї» що 7. МИнгибирование автогенеза, измеренное в САМ анализе.
А. Ингибирование ангиогенеза, индуцированного фактором роста путем местного применения ингибиторов. т. 1/ Обработка моноклональньїми антителами. -1 Для определения того, играет ли омВз активную роль в ангиогенезе, фильтровальнье диски, насьщеннье ДЕСЕ или ТКРа помещали на САМ, затем моноклональнье антитела /обозначаемье также, как о мАв/, ЇГМ609 /специфичньсе к сурз/, СЗАТ /специфичньсе к р./, или РЗО2 /специфичньсе к оурз/ добавляли к
Ге) препарату.
Ангиогенез индуцировали на САМ 10-дневньїх куриньїх змбрионах с помощью фильтровальньїх дисков, насьіщенньх ДЕСЕ. Затем такие диски обрабатьвали 50мл НВЗ5, содержащего 25мг мАь в общем обьеме 25МКл стерильного НВ55 через 0,24 и 48 часов. Через 72 часа САМ собирали и помещали в З5мм чаши Петри и однократно промьшали їмл фосфатного буфферного физиологического раствора. Донную сторону о фильтровальной бумаги и САМ ткань далее анализировали с помощью стереомикроскопа Олимпус с ко использованием двух наблюдателей работающих двойньм слепьм /доцбіе-рБіпа/ методом. Ингибирование ангиогенеза считалось значительньмм, когда САМ проявляла » 5096 уменьшение инфильтрации кровеносньх бо сосудов САМ непосредственно под диском. Зксперименть! повторяли четьіре раза в расчете на антитело в присутствий 6 - 7 змбрионов в зависимости от условий.
Результатьі влияния тАВ обрабатьівали на / ВЕсОБ-индуцированньій ангиогенез представлень! на фиг.вА - 88. Необработанньй САМ-препарат, лишенньій кровеносньїх сосудов, показан на фиг.8А с целью сравнения с ДЕсОБ-кровеносно-сосудистой индукцией, показанной на фиг.8В, а на фиг.8С - ВЕ показано влияние действия 65 МАь. Около 75956 таких САМ обработанньїх тАь І! МбО0О9 проявляли » 5095 ингибирование ангиогенеза, как зто показано на фиг.8Е, и во многих образцах не наблюдалась инфильтрация сосудов. В отличие от зтого,
буферньїй контроль /фиг.8А/ и диски, обработаннье мАь СЗАТ /фиг.8С/ и РЗО2 /фиг.8Д/ показали обширную васкуляризацию.
Идентичнье результать! бьіли полученьї при индуцирований ангиогеназа с помощью ТМРа. Для изучения Зффектов тех же антител на предварительно существующие зрелье кровеноснье сосудьі, присутствующие в результате нормального их развития по соседству с участками, лишенньми сосудов, фильтровальнье диски, насьшщеннье мАь, помещали на сосудистье участки САМ 10-дневньїх змбрионов, -на которьіїх не проводили местное применение цитокина. Ни один из трех мЛАь не воздействовал на преварительно существующие сосудь! о чем свидетельствовало визуальног наблюдение с помощью стереомикроскопа. Так мАь І Мб609 селективно 7/0 Мнгибирует только рост новьх кровеносньх сосудов и не влияєт на зрелье кровеноснье сосудь присутствующие на соседних площадях. Тот же зффект наблюдался при применении синтетических пептидов локально или внутривенно, как зто описано в примерах 7А2/ и 7Е2/, соответственно. 2/ Обработка синтетическими пептидами.
САМ-анализь! также осуществлялись с помощью синтетических пептидов изобретения с целью определения /5 Влияния циклических и линеаризованньїх пептидов на ангиогенез, индуцированньій фактором роста. Такие пептидь! готовили как описано в Примере 1 и 8Омкг пептида помещали в общий обьем в 25мкл стерильного
НВЗ5. Пептидньїй раствор применяли на САМ-препарате немедленно и затем снова через 24 и 48 часов. Через 72 часа фильтровальную бумагу и окружающую САМ ткань отсекали и наблюдали, как описано вьіше.
Результать! такого анализа бьіли аналогичнь! тем, что показаньі на фиг.9А - 9С, как описано в Примере 7Е2/ го где синтетические пептидьі внутривенно вводили в кровеноснье сосудь, индуцированнье опухолью. В присутствий контрольного пептида 62186, ДЕСЕ-индуцированнье кровеноснье сосудьі оставались незатронутьми, как показано на фиг.9А. В отличие от зтого, при применении на фильтре циклического КОЮ пептида, 62814, образование кровеносньїх сосудов ингибировалось, оставляя площадь, лишенную новой сосудистой системьі. Зтот зффект по внешним признакам аналогичен зффекту, показанному на фиг.9В, как зто с описано в примере 7Е2/, ниже. Кроме зтого, также, как показано на фиг.9С, для случая внутривенно иньецированньїх пептидов, на площадях, где зрелье кровеносньюе сосудьі находились достаточно далеко от о расположения фильтра, насьщенного фактором роста, зффект от местного применения синтетических пептидов не наблюдался на таких основньїх сосудах. Таким образом, ингибиторная активность пептидов в отношений ангиогенеза ограничена участками ангиогенеза, индуцированньми факторами роста, и при зтом не дФ) зо затрагиваются соседниє предварительно существующие зрелье сосудь и не наблюдаєтся вредной цитотоксичности в отношений окружающей площади. сч
Аналогичнье анализь бьіли осуществлень! с использованием других синтетических пептидов, полученньх в. зр.
Примере 1 и перечисленньмх в Таблице 1.
В. Ингибирование ангиогенеза, индуцированного фактором роста в результате внутривенного применения З ингибиторов. « 1/ Обработка моноклональньми антителами
Зффект на ангиогенез, индуцированньй фактором роста, моноклональньхх антител, внутривенно иньектированньх в САМ препарать, также оценивался в отношений использования в настоящем изобретении.
Получение куриньїх змбрионньїх САМ для внутривенньїх иньекций проводилось практически аналогично « методике Примера 7А при некоторьїх модификациях. В ходе проверки яиц на свет рельефнье кровеноснье 8 с сосудьі подвергали отбору и на оболочке яйца ставили метки для указания их положения. В скорлупе й просверливали отверстия и в них загружалипП САМ, а ДЕСЕ-насьщщеннье фильтровальнье бумаги помещали на "» САМ, как описано вьіше. Окна закрьівали стерильной лентой и змбрионьі! помещали в инкубатор. Через 24 часа второе небольшое окошко тщательно вьірезали в боковой стороне яичной скорлупь! непосредственно над
Ввіступающими кровеносньіми сосудами, отобранньми ранее. Тщательно удаляли внешнюю яичную скорлупу, г» оставляя незатронутьми змбрионнье мембрань». Мембранную оболочку делали прозрачной с помощью небольшой капли минерального масла /Перкин-Злмер Корп., Норволк, СтТ/, что опозволяет легко т визуализировать кровеноснье сосудьі. Очищеннье стерильнье мАь, или синтетические пептидьі, последние из -І которьїх описаньї ниже, инокулировали непосредственно в кровеноснье сосудьі с помощью игль! 30 калибра при дозе 200мкг ІдО- на змбрион в общем обьеме в 100мкл стерильной РВ5. Окна заклеивали лентой и змбрионам о давали инкубироваться в течение 72 часов. Фильтровальнье диски и окружающие САМ ткани анализировали, (Че) как описано вьіше.
Для определения локализации !МбОЗ в САМ тканях или в опухолевьх тканях, как показано в тексте и следующих примерах, которне предварительно инокулировали внутривенно І МбО09, фиксированнье срезь блокировали 2,590 ВЗА в НВ5О5 в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим окрашиванием 1:250 разбавлением козьего анти-мьішиного родамин-меченого вторичного антитела /ГТадо/. Затем срезь і) анализировали с помощью иммунофлуоресцентного микроскопа Цейса. ко Результатьь внутривенной обработки антителом индуцированньх ДЕС кровеносньїх сосудов САМ препаратов представлень на фиг.10А - 100. На фиг.10А показан ангиогенез, индуцированньій в результате бо обработки ДВЕСЕ. Как видно из фиг/10В не наблюдаєтся изменений относительно присутствия /ДЕСЕ индуцированной сосудистой системь! при внутривенном воздействий на мАь РЗО2, анти- оурз-антитело.. В отличие от зтого, обработка САМ препарата ангиогенезиндуцированного ДЕОЕ с помощью І/Мб09, анти- оурз антителом, приводит в результате к полному ингибированию роста новьїх сосудов в фильтровальную область, как зто показано на фиг.10С. Ингибирующее влияние на ангиогенез, таким образом, является результатом бо ингибирования оурз рецепторной активности под воздействием І Мб609 анти-охмрВз-специфичного антитела.
Поскольку блокировка сурз не ингибирует образование сосудистойПсистемь! в САМ фильтрующем сайте, оху/Вз не является существенньім компонентом по сравнению с оурз в отношений роста новьїх сосудов. 2/ Обработка синтетическими пептидами
Синтетические пептидь, полученнье в Примере 1, по отдельности внутривенно иньецировали в кровеноснье сосудь, индуцированнье фактором роста в САМ препаратах, как описано вьіше. Влияние пептидов на жизнеспособность сосудов оценивали аналогичньїм образом.
С. Ингибирование змбрионного ангиогенеза путем местного применения. 1/ Обработка моноклональньїми антителами.
Для определения факта участия о31рВ3 в змбрионном ангиогенезе влияния І МбОЗ на де помо рост кровеносньїх сосудов на САМ изучали на б-дневньїх змбрионах, т.е. на стадии, отмеченной активной неоваскуляризацией, в соответствии с описанньм в Примере БА. САМ анализ проводили в соответствии с методикой примера 6С с последующим местньім применением дисков, насьіщенньїх мАь, помещенньїх на САМ б-дневньїх змбрионов в отсутствие цитокинов. Через З дня САМ подвергали резекциий и фотографировали. 75 Каждьй зксперимент включал 6 змбрионов на группу и повторяли 2 раза.
В таких условиях антититело І Мб09 /фиг.11С/, но не СБАТ /фиг.11А/ или РЗО2 /фиг.118/, предотвращали сосудистьй рост; зто указьіваєт на то, что о3/Вз играет существенную роль в змбрионной неоваскуляризации, которая не зависит от добавленного фактора роста для индукции ангиогенеза. 2/ Обработка синтетическими пептидами 20 Синтетические пептидьї, полученнье в примере 1, по отдельности добавляли в змбрионньй САМ препарат, полученньій вьіше, в соответствий с описанньм в Примере 5А2/, путем местного применения на САМ или внутривенного применения на кровеносньїх сосудах.
Влияние пептидов на жизнеспособность сосудов оценивали аналогичньіїм образом.
Д. Ингибирование ангиогенеза индуцированного опухолью в результате местного применения. Ге! 25 1/ Обработка моноклинальньми антителами (5)
Помимо описанного вьіше анализа на ангиогенез,. в котором оценивали влияние анти- оУурз-антагонистов,
ІЇМ609 и пептидов 62181, 62184, 62185, 62187 и 62880 на змбрионньй ангиогенез, исследовали также роль оуВз в ангиогенезе, индуцированном опухолью. В качестве индуктора использовали оурз негативнье человеческие
М21-Ї. меланомнье фрагментьі, предварительно вьіращенньюе и вьіделеннье из САМ 17-дневного куриного б» 30 змбриона. Зти фрагменть получали в соответствий с методикой примера 6С. с
Как описано вьіше в Примере 7А1, мАь раздельно локально применяли на опухолевьїх фрагментах при концентрациях 25мкг в 25мкл НВ5З5 и затем окна заклеивали лентой. Снова добавляли мАь тем же способом - через 24 и 48 часов. Через 7/2 часа опухоли и окружающие САМ ткани анализировали в соответствий со «г методикой примера 7А1. 3о Как описано в примере 6С, опухоли начально получали трансплантацией культивированньїх М21-Ї. клеток, - которве не зкспрессировали интегрин о3урВз как зто описано Реїдіпу-Нарегптапи с сотр., У. Сііп. Іпмеві,, 89:2018 /1992/ на САМ 10-дневного куриного змбриона. Такие оурз негативнье фрагменть! индуцировали обширную неоваскуляризацию в присутствиий только буфера, или мАь СЗАТ /анти- р/, либо РЗО2 /анти- оурв/. « дю В отличие от зтого мАь І Мб609 /анти-оурз/ снимали инфильтрацию большинства сосудов в опухолевой массе и з окружающей САМ. с С целью количественного определения влияния млАь на ангиогенез, индуцированньй опухолью, кровеноснье :з» сосудьі, входящие в опухоль в рамках фокусной плоскости САМ подсчитьівали с помощью стереомикроскопа двумя наблюдателями двойньїм слепьїм /щдоцбіе-Біїпа/ методом. Каждая полоса данньїх на фиг.12 представлят собой среднее число сосудов «ЗЕ от 12 САМ в каждой группе дублированньїх зкспериментов. їз Такой количественньій анализ обнаруживает трех-кратное понижение числа сосудов, входящих в опухоль, обработанную мАь І! Мб609 по сравнению с опухолями, обработанньми буфером или другими мАь, РЗ3О2 или ве САТ /Р « 0,0001/ в соответствии с разрядньім суммарньім тестом Вилкоксона. Тот факт, что М21-1 опухоли не -І зкспрессируют сурз указьіваєт на то, что тАВ І Мб609 ингибирует ангиогенез - непосредственньім воздействием 5 на кровеноснье сосудь, а не на опухолевье клетки. Зти результатьй согласуются с гистологическим ю распределением оурз в раковой тканевой биопсии, представленной на фиг.ЗА - ЗД, где распределение соурз
Ге) ограничено кровеносньіми сосудами в опухоли, а не самими клетками опухоли. 2/ Обработка синтетическими пептидами
Синтетические пептидь, полученнье в примере 1, локально применяли на опухоль-индуцированной в ангиогенной САМ аналитической системе в соответствии с описанньм вьіше. Аналогичньім образом оценивали влияние пептидов на жизнеспособность сосудов. іФ) Е. Ингибирование ангиогенеза, индуцированного опухолью с помощью внутривенного применения ко 1/ Обработка моноклональньми антителами
Опухоль-индуцированньюе кровеноснье сосудь, полученньепПсогласно методике примера 7ДІ1, также бо обрабатьвали мАь, применяємой путем внутривенной иньекции. Опухоли помещали на САМ, как описано в
Примере 7ДІ, и окна заклеивали лентой и спустя 24 часа 200мкг очищенного тАВ инокулировали внутривенно в кровеноснье сосудьй куриного змбриона, как зто описано вьіше. Затем куринье змбрионьі инкубировали в течение 7 дней. Затем степень ангиогенеза наблюдали, как описано вьіше. Как описано в примере 8, ниже, после зтого периода времени, опухоли подвергали резекции и анализировали их вес для определения влияния б5 воздействия антитела на рост или подавление опухоли. 2/ Обработка синтетическими пептидами
Оценивали также влияние воздействия пептида на сосудистую систему, индуцированную опухолью в САМ аналитической системе. Опухолево-САМ препарат использовали, как описано вьіше за исключением того, что вместо внутривенной иньекции мАь синтетические пептидьії, полученнье в соответствии с методиками примера и примера 7А2, по отдельности внутривенно иньецировали в видимье кровеносньсе сосудь!.
Результать! САМ анализа в присутствиий циклического пептида 66203, содержащего НСІ-соль, и контрольного пептида 62186 представлень на фиг.ЗА - 90. Из фиг.ЗА видно, что обработка контрольньм пептидом не оказьівает влияния на обильное образование крупньїх кровеносньїх сосудов, которне индуцируются обработкой опухолью с ростом в области первоначально лишенной кровеносньїх сосудов САМ. В отличие от зтого в том /о случає, когда циклический КСО пептид, 66203, антагонист на оуВз применяли на фильтре, образование кровеносньїх сосудов ингибировалось, оставляя площадь, лишенную новой сосудистой системь, как зто показано на фиг.98. Ингибирующий зффект КОО-содержащего пептида бьіл специфичньїм и локализованньм, о чем свидетельствует отсутствие каких-либо нежелательньїх зффектов, касающихся сосудов, расположенньйх по соседству с расположением опухоли. Так, согласно фиг.9С, в том случає, когда ингибиторньюе пептидь 7/5 Внутривенно иньецируются в САМ аналитическую систему, не наблюдаєтся зффекта на ранее существовавшие зрелье сосудь, присутствующие в САМ на площадях дистанцированньх от положения опухоли.
Предварительно существующие сосудьі при таком расположениий не подвергают влиянию ингибирующего пептида, которьій протекает внутри таких сосудов, хотя генерация новьїх сосудов из предварительно существующих сосудов в опухолевую массу подвергается ингибированию. Так, синтетические пептидь,
Включающие пептидь! 66203 и 62184, предварительно описаннье в лиганд-рецепторном анализе в Примере 4, являющиеся антагонистами, как бьіло продемонстрировано в настоящее время, ингибируют ангиогенез, которьій ограничен сосудами подверженньми развитию, а не зрельми и предварительно существующими сосудами. Кроме зтого, внутривенноге вливание пептидов не приводит в результате к какому-либо вредному цитотоксическому воздействию на окружающую область, о чем свидетельствует интактная сосудистая система, су показанная на фиг.9с.
Аналогичнье анализьї осуществляли с другими синтетическими пептидами, полученньми в примере 1 и о перечисленньїми в Таблице 1. 8. Ингибирование роста опухолевой ткани с помощью оу/рз-антагонистов, измеренное в САМ анализе
Как показано в примере 7Д1, помимо визуальной оценки влияния анти- оурз-антагонистов на ангиогенез, Ф) индуцированньй фактором роста или опухолью, зффект антагонистов также оценивали измерением любьїх изменений опухолевой массь! после воздействия. Для такого анализа САМ аналитическая система ангиогенеза, см индуцированного опухолью, бьіла получена как описано в Примере 6С и 7Д. К концу 7-го дня инкубационного ї- периода полученньре в результате опухоли подвергали резекции от САМ и обрезали от любой оставшейся САМ ткани, промьівали тїмл фосфатного буферного физиологического раствора и для каждой опухоли определяли З вес во влажном состоянии. «І
Кроме зтого, получение опухоли для микроскопического гистологического анализа включаєет фиксацию представителей опухолей в Виїїпз Ріхайме в течение. 8 часов и погружение в парафин. Серийнье секции внірезали и окрашивали гематоксилином и зозином /Н 4: Е/ для микроскопического анализа. Гладсон с сотр., .). «
Сіїп. Іпмеві,, 88:1924 /1991/, Секции фотографировали с помощью микроскопа Олимпус при 250-кратном увеличении. - с А. Местное применение ц Результать! полученнье при взвешивании типичной человеческой меланомной опухоли /М211 / в результате "» местного применения контрольного буфера /НВ5З5/, РЗС2 /анти- оуВз/ или ГМб609 /анти- оурз/ представлень в
Таблице 4. Число змбрионов оценивали для каждой обработки средним весом опухоли в миллиграммах /мг/, причем каждое значение рассчитьівалось с учетом стандартного отклонения среднего значения, как зто указано т. в конце таблиць. т - юю? пн ЕТ с нин шшиО тю ов нини шши о нишшшшшшим з ові вт 65 вв, пн НЕТ нн І ЕС вві бо 2 135 т т
В вв вві в в 1во
Обработка мАь Средний вес опухоли /мг/ то НВ контроль 172 5 26
РЗС2 171 ж 36
І мбо9 Б2 ж 13
Зкспозиция оурз негативной человеческой меланомной опухолевой массь! в САМ аналитической системе к т І М609 вьїзьівает уменьшение среднего веса необработанной опухоли от значения 172мг хз 26 до 52мг х 13.
РЗО2 антитело не оказьваєт влияния на массу опухоли. Так, блокировка оурз рецептора местньм применением оурВз-специфичного ЇМб6О9 антитела приводит в результате к регрессии опухолевой массь, а также к ингибированию ангиогенеза, как зто показано в предьдущих примерах. Измеренньй диаметр опухолевой массь, полученной в результате воздействия РЗО2, составлял в среднем величину от 8 миллиметров до 1 сантиметра. В отличие от зтого, | МбБ0О9-обработаннье опухоли имели диаметр 2 - Змм.
Замороженньсе срезьі таких опухолей обнаруживали незатронутую цитоархитектуру опухоли, подвергшейся воздействию РЗО2 в отличие от потери организованной клеточной структурьі в опухоли подвергшейся воздействию ІМб609. Позтому оурз рецепторная активность существенна для того, чтобь! оурз негативная сч ов опухоль сохраняла своє питание для поддержания массь в результате развития оуВз-зкспрессирующей сосудистой системь!. Блокировка о3/3 с помощью оурз антагонистов изобретения приводит в результате к о ингибированию ангиогенеза в опухоль, что в конечном счете приводит к уменьшению массь опухоли.
В. Внутривенное применение
Результать! взвешивания типичной карциномной опухоли /ЮСІ АР-3/ в результате внутривенного применения дб) зо Контрольного буфера /РВ5, фосфатньй буферньй физиологический раствор/, СЗАТ /анти-р./ или ГМб609 /анти- оуВз/ представлень в таблице 5. Число змбрионов оценивали для каждой обработки средним весом см опухоли с учетом стандартного отклонения среднего значения, как зто показано в конце таблиць. -
М зв « во ни) во їх 8 с в . вв що ни вт ь нини ї» во нишишшшшшг
В. вв ма 70 вві в іЧе)
Обработка мАь Средний вес опухоли /мг/
РВЗ контроль 85:7
СВАТ 108 ж 22 о І мбо9 ЗО жб іме)
Зкспозиция оурз-негативной человеческой карциномной опухолевой массь! в САМ аналитической системе к 60 І Мб609 вьіїзьівало уменьшение среднего веса необработанной опухоли от значения 85мг х 7 до ЗОмг ж 6. С5АТ антитело не оказьваєт существенного влияния на вес опухолевой массь». Таким образом, блокировка о/з рецептора в результате внутривенного применения о3/Вз-спецфичного ІЇМб609 антитела приводит к регрессии карциномь!, как зто имеет место и в случае меланомной опухолевой массьі описанной вьше, а также к ингибированию ангиогенеза, как зто продемонстрировано в предьддущих примерах. Кроме 65 зтого, рост человеческой меланомной опухоли аналогичньм образом ингибируется внутривенной иньекцией
ГМм609.
9. Регрессия роста опухолевой ткани в присутствий сурз антагонистов, измеренная в САМ анализе.
Для оценки влияния соурз антагонистов на рост опухоли и ее вьіживание, фрагменть! человеческой меланомьі! и фрагментьі! карциномь! легких, поджелудочной железьі и гортани помешали на САМ 10-дневньх змбрионов в соответствий с описанньім в примере 5А.
А. Внутривенное применение. 1/ Обработка моноклональньми антителами а. Обработка І Мб609 /анти-ох/Дз/ и СЗАТ /анти-р../
Через 24 часа после имплантации САМ фрагментами карциномь! сурз -негативной человеческой меланомь! 70... М21-Ї карциномь! поджелудочной железь! ГО, человеческой легсочной карциномь! ОСІ АР-3, или человеческой ларингеальной карциномь! НЕрЗ, змбрионьії внутривенно иньецировали только РВ5 или однократной дозой /З0Омкг/100мкл/ мАь ГМб609 /анти-оууВз/ или СЗАТ /анти-р./. Опухолям давали возможность размножаться еще в течение б дней. К концу периода инкубации опухоли подвергали тщательной резекций и освобождали от окружающей САМ ткани. Резекцию опухоли проводили два независимьїх исследователя, удаляющих только 75 легко определяемую твердую опухолевую массу. Опухоли имели хорошо обозначеннье края и таким образом тонкая полу-прозрачная мембрана /САМ/, которая легко различима с твердой опухолевой массой удалялась без нарушения, самой опухолевой массь. Подвергнутье резекциийи оопухоли взвешивали и подвергали морфологическому и гистологическому изучению.
Как показано на фиг.13 веса влажньх опухолей к концу 7-го дня определяли и сравнивали с исходньім весом опухоли до обработки. Каждая полоса представляеєет собой среднее значение ї « 5Е. для 5-10 опухолей на группу. мАь І М609 значительно ингибирует рост опухоли /р « 0,001/ по сравнению с контрольньіми образцами для всех мспьітуемьїх опухолей. Во всех случаях имела место пролиферация опухолей обработанньїх РВ5 или
СЗАТ. В отличие от зтого, мАь І Мб609 не только предотвращает рост таких опухолей, но индуцирует обширную регресию в большинстве случаєв. Важно оотметить, что клетки таких опухолей не озкспрессируют СМ 29 интегрин оуВз демонстрируя тот факт, что ингибирование роста обязано анти-ангиогенньмм зффектам такого о анти-тела на сосудистую систему, а не на непосредственно опухолевне клетки. ь. Обработка І Мб609 /анти-оу/рз/ РЗО2 /анти-оу/рв/
Человеческие М21-Ї меланомнье опухолевье фрагментьі! /50мг/ имплантировали на САМ 10-дневньх змбрионах, как описано в примере 5А. Через 24 часа змбрионьії внутривенно иньецировали только РВ5 или о однократной дозой /30Омкг/100мкл / мАь ІМб609 /анти-оуВз/ или РЗ(2 /анти-оурб/. Опухолям давали Ге размножаться, как описано в примере 9А1/а, и подвергали морфологическому и гистологическому изучению.
Представители М21-Ї опухолей, обработанньхх мАь РЗО2 /анти-оурв/ или ІГМб609 /анти-оурз/ подвергались ге морфологическому исследованию. Обработаннье РЗО2 опухоли бьіли крупньіми /Ямм в диаметре/ и имели че хорошо вніраженную сосудистую систему, тогда как обработаннье мАь І Мб09 бьіли значительно мельче /Змм в диаметре/ и не содержали детектируемьїх кровеносньїх сосудов. ч
Далее опухоли дополнительно исследовали приготовлением гистологических срезов и окрашиванием гематоксилином и зозином, как описано в примере 9АТ/а. Как показано на фиг.14 / верхняя часть/, опухоли, обработаннье мАь РЗО2 /анти-оурз/ демонстрировали многочисленнье жизнеспособнье и активно делящиеся « 70 пухолевье клетки, как показано митотическими значениями /острие стрелки/ и множеством кровеносньх з сосудов /стрелки/ по всех опухолевой строме. В отличие от зтого, небольшое количество или отсутствие с жизнеспособньїх опухолевьїх клеток или кровеносньїх сосудов детектировалось в опухолях, обработанньїх мАь :з» ІГМ609 /анти-ох;Вз/ /фиг.14, нижняя часть/. Зти результать! демонстрируют тот факт, что антагонисть интегрина оу3/Вз ингибируют индуцированньй опухолью ангиогенез, что приводит к остановке роста и регрессий большого числа человеческих опухолей іп мімо. Важно отметить, что змбрионьї, изученнье через 7 дней роста ї» опухоли /змбрионньй 17-6ій день/ оказались нормальньми в ходе тщательного изучения в независимости от того бьіли ли они обработаньі оурз антагонистом. Зти открьїтия указьівают на то, что антагонисть! такого ть интегрина нетоксичнь!ї в отношений развивающихся змбрионов. -І 2/ Обработка синтетическими пептидами.
Человеческие М21-Ї меланомнье опухолевье фрагментьі! /50мг/ имплантировали на САМ 10-дневньх де змбрионов, как описано в Примере 5А. Через 24 часа змбрионам делали однократную внутривенную иньекцию (Че) ЗбОмкг/10О0мкл цикло КАС /69601/ или цикло КОСУ /66203/. Через 72 часа общего времени опухоли удаляли, подвергали морфологическому изучению и фотографировали стереомикроскопом, как описано в примере 9А1/.
Увеличеннье фотографии, показаннье на фиг.15А - 15Е соответствуют следующему: на фиг15А изображень! дубликатнье образцьі, обработаннье цикло-КАДМ пептидом /69601/; на фиг.158 - дубликатнье образцьі обработаннье цикло-КОДІГ пептидом /66203/; на фиг.15С показана соседняя ткань, взятая с
Ф) некоторьїх змбрионов, обработанньїх цикло-КОДІМ пептидом /66203/ на фиг.15Д и 15Е изображено сильное ко увеличение /13-кратное/ опухоли, обработанной пептидом. На фиг.15Д изображеньі нормальнье кровеноснье сосудьі! опухоли, обработанной контрольньім пептидом /69601/. На фиг.15Е изображень! примерь! разрушенньх бо Кровеносньїх сосудов опухолей обработанньїх цикло-кОДІМ пептидом /66203/ /стрелки/.
Полученнье результатьї иллюстрируют тот факт, что лишь пептид 66203 ингибирует образование сосудов, а также что сосудьі в САМ ткани соседней с опухолью не затрагиваются. 10. Регрессия роста опухолевой ткани в присутствий оурз антагонистов, измеренная іп мімо модельньм анализом на кроличьем глазу. 65 Влияние анти-оу/ Дз антагонистов на ангиогенез, индуцированньй фактором роста, может наблюдаться в природньїх прозрачньїх структурах примерами которьїх может служить роговая оболочка глаза. Нове кровеносньюе сосудьй растут от края роговой оболочки глаза, которьій хорошо снабжаєтся кровью, в направлений центра роговой оболочки, которая в нормальном состоянии не снабжаєтся кровью. Такие стимуляторьі ангиогенеза, как ДЕСОЕ при применений на роговой оболочке глаза индуцируют рост новьх
Кровеносньїх сосудов от края оболочки. Антагонисть! ангиогенеза, применяємье на роговой оболочке глаза ингибируют рост новьїх кровеносньїх сосудов от края оболочки. Так, роговая оболочка подвергается ангиогенезу в результате инвазии зндотелиальньйх клеток от края роговой оболочки в жесткую коллаген-упакованную ткань роговой оболочки, что можно легко наблюдать визуально. Позтому модельньй анализ на кроличьем глазе обеспечиваєт іп мімо модель для непосредственного наблюдения стимуляции и ингибирования ангиогенеза 7/0 после имплантации соединений непосредственно в роговую оболочку глаза.
А. Іп мімо модельньй анализ на кроличьем глазе. 1/ Ангиогенез, индуцированньій факторами роста.
Ангиогенез индуцированньй в іп мімо модельном анализе на кроличьем глазе в присутствиим фактора роста ДЕСЕ, причем подробности такого метода описань! ниже. а. Приготовление гидроновьїх гранул, содержащих фактор роста и моноклональньсе антитела.
Гидроновье полимерньсе гранульі, содержащие фактор роста и мАь получали как описано ЮО'Атайо с сотр., в
Рос. Маї). Асад. зсі., 91:4082-4085 /1994/. Индивидуальнье гранульі, содержащие ббОнг фактора роста ВЕСЕ, связьвали с сукралфатом /Карафет, Марион Меррелл Доу корпорейшн/ с целью стабилизациий ДЕОЕ и обеспечения его медленного вьіделения в окружающую ткань. Кроме зтого, гидроновне грануль! готовили таким образом, чтобьі они содержали 40мкг мАь ІГМб609 /анти- оуДВз/ или мАь РІТЕЄ /анти- оурв/ в РВ5. Грануль отливали в специально приготовленньіе Тефлоновьгсе втулки, которье имели 2,5мм сердцевину, просверленную в их поверхностях.
Примерної2 мкл отлитого материала помещали в каждую втулку и полимеризовали в течение ночи в стерильном колпаке. Затем грануль! стерилизовали облучением ультрафиолетовьім светом. с ь. Обработка моноклональньми антителами. о
В каждом зксперименте использовали по три кролика, в один глаз которьїх помещали гранулу, содержащую ДЕОМ и ІМб09, а в другой глаз загружали гранулу, содержащую ДЕСЕ и мьішиньй мАь Р1Еб /анти- оуВв/. Использование спаренного глазного тестирования для сравнения І МбО09 /анти- ох/Вз/ с другими
МмАь и РВБЗ5 контрольньми образцами обеспечивает средство точного тестирования для демонстрации о значительньх различий между испьітанньіми мАь. Га
РІБбЄ мАь иммунореагирует с интегрином оо3у4Вз, которьій обнаружен на оповерхности сосудистьх к зндотелиальньх клеток но, по-видимому, не участвует в ангиогенезе. Для определения факта участия тАь Р1Еб в ангиогенезе готовили гранульі, содержащие только мАь и анализировали их, как описано ниже, на факт того, «Ж что мАь не индуцирует ангиогенез.
Зо Все испьтуемье мАь очищали от асцитной жидкости с использованием Протеин-д Сефароза С1-48 З аффинной колоночной хроматографии согласно хорошо известньмм способам. Злюированньй иммуноглобулин затем диализировали против РВ5 и обрабатьшали Детокси-гелем /Льерсе Кзмикалс/ с целью удаления зндотоксина. Как бьло показано, зндотоксин является мощньм ангиогенньм и противовоспалительнь!м « дю стимулянтом. Позтому мАь тестировали на присутствие зндотоксина с помощью Хромогенного лимулус -о амебоцитного лизатного анализа (Спготодепіс І ітійз Атербосуїе І уза(їе Аззау) /Био-Виттакер/ и лишь те мАЬ, с которье не содержали детектириуемьх количеств зндотоксина использовали в модельном анализе на :з» кроличьем глазу.
Гидроновую гранулу, содержащую ВЕСЕ и мАь ГМб09 /анти-оуурз/или РІТЕ6 /анти- оуурр/ вставляли в карман роговой оболочки глаза, образованньй на глазах кролика. Гидроновая гранула также содержала сукралфат для їх що стабилизации ДЕСЕ в ходе анализа. Индивидуальнье гранульь имплантировали в созданнье хирургическим путем "кармань", сформированнье в мид-строме роговой оболочки глаз кролика. Хирургические операции ве проводили в стерильньх условиях с использованием операционного микроскопа Вилд модели Мб91, - снабженного пучковьім дробителем, с которьім бьіла смонтирована камера для фотографической регистрации индивидуальньх роговьх оболочек глаза. "Карман" размером З х 5мм создавали в строме роговой оболочки ко делая Змм разрез на половину толщиньї роговой оболочки лезвием 69 Биавер. Строму рассекали
Ге периферически с использованием шпателя для радужной оболочки глаза и гранулу имплантировали по ее периферическим краям на 2мм от лимбуса.
В течение последующих 14 дней / ВЕСОЕ и мАь диффундировали из имплантированной грануль в окружающую ткань и в результате зтого оказьівали влияние на ангиогенез от края роговой оболочки глаза.
Представительнье результатьї каждой обработки изображень на фиг.1б6А - 16Е. Число присутствующих (Ф. сосудов рассчитьівали количественно и вніражали в терминах часов, которне определяли следующим образом. ка Глаз делили на 12 равньїх секторов также, как зто имеет место на циферблате часов. "Один циферблатньй час сосудов" относится к такому количеству сосудов, которое заполняет площадь глаза зквивалентную одному часу во на циферблате. Пять кроликов получивших лишь ВЕСЕ демонстрировали свежий ангиогенез, в котором нове кровеноснье сосудьй росли от края роговой оболочки в направлений ее центра, которьій в нормальном состоянии не имеет кровеносньїх сосудов. Один из таких кроликов имел лишь 1 циферблатньй час сосудов в расчете на гранулу. Два кролика, получивших как ДЕОЕ, так и ГМб609 абсолютно не проявляли ангиогенеза вплоть до 14 дня после хирургического вмешательства. Один из таких кроликов имел З фокуса кровоизлияния и б5 почечнье сосудьі к 14 дню. Два кролика, получивших ДВЕСЕ и мАь РЗОб2 /анти-оурв/ и демонстрировали обширную васкуляризацию, в которой новье кровеноснье сосудь! росли от края роговой оболочки глаза в нее.
Один из таких кроликов имел 1-2 часа сосудов в расчете на гранулу.
Как следует из модельного анализа на кроличьем глазу, ангиогенньій зффект не наблюдается на нормальньїх паралимбальньїх сосудах в присутствиий фактора роста ДВЕСЕ у кроликов, получивших мАь ІМ609 /анти-оурз/. В отличие от зтого, ангиогенез наблюдался на паралимбальньїх сосудах в присутствиий фактора роста ДЕОЕ у кроликов, получивших мАь РЗО2 /анти-о3Вв/. Полное ингибирование ангиогенеза роговой оболочки глаза при воздействий мАь І Мб609 значительно вьіше, чем в присутствий анти-ангиогенньїх реагентов, о которьїх сообщалось ранее. 11. Іп мімо регрессия роста опухолевой ткани в присутствии антагонистов, измеренная химерньім анализом 70 Мьішь-человек.
Іп Мімо химерную модель человек-мьішь генерировали заменой части кожи мьіши линии ЗС1Д человеческой неонатальной крайней плотью /фиг.17/. После укоренения кожного трансплантата человеческую крайнюю плоть инокулировали клетками карциномь». После образования способной к изменению опухоли мАь І/Мб609 /анти-о3уВз/ или РВ5З иньецировали в хвостовую вену мьіши. Через 2-3 недели опухоль вьрезали а 75 анализировали путем взвешивания и гистологии.
А. Іп мімо анализ химерной системь! мьішь человек.
Іп мімо химерную модель мьішь-человек готовили в соответствии с описанньм Хап с сотр., 9). Сііп. Іпмеві., 91:986-996 /1993/. Если говорить вкратце, то 2см? квадратной площади кожи хирургически удаляли у мьішей разновидности ЗСІД /в возрасте 6-8 недель/ и заменяли человеческой крайней плотью. Мьшей 20 анестезировалий с площади 5см? удаляли волось! с каждой стороньі латерального абдоминального участка путем вьібривания. Два кругльїх трансплантанта площадью 2см? готовили путем удаления полной толщинь кожи ниже фасции. Полную толщину человеческих кожньїх трансплантантов того же размера, производньх человеческой неонатальной крайней плоти, помещали на раневье слой и зашивали на место. Трансплантант покрьівали Вапа-Аїа, которьій пришивали к коже. Для покрьїтия рань! также применяли микропористую тканевую сч 29 ленту. Ге)
М21Ї. человеческую клеточную линию или МДА 23.1 клеточную линию карциномь! грудной железьі /" АТС нтв 26; оуудз негативная в соответствии с иммунореактивностью тканевьїх срезов в присутствии мАь ІГМб609/ использовали для образования твердьїх человеческих опухолей на трансплантатах человеческой кожи на ФУ зо Мвішах линий ЗСІД. Одноклеточную суспензию 5 х 109 М21-ї или МДА 23.1 клеток иньецировали интрадермально в трансплантант человеческой кожи. Затем мьішей наблюдали в течениє 2-4 недель с целью СМ оценки роста измеряемой человеческой опухоли. їм
В. Внутривенное применение 1/ Обработка моноклональньїми антителами. « 35 После роста измеряемьх опухолей, мьішей линии ЗСІД, которьім делали иньекции М211!. опухолевьіми « клетками, внутривенно иньецировали в хвостовую вену 250мкг мАь І Мб609 /анти-оурз/ или РВ5 дваждь! в неделю в течение 2-3 недель. После зтого, опухоли подвергали резекции с кожи и обрезали окружающую ткань.
Нескольких мьішей оценивали на каждую из обработок, определяя средний вес опухоли при каждой обработке, причем результать! такого определения представлень в конце Таблицьї 6. « 40 - - ї» во нн нн ІЗ г нн ин нс т в - нн НН НС ще в т
Фо юю 1 1тві
Обработка Средний вес опухоли /мг/ (Ф) РВ 198 г їмбов 113
Воздействие М21Ї. оурз-негативной человеческой карциномной опухолевой массьй в химерной бо аналитической системе мьішь-ч-еловек на І Мб609 /анти-оурз/ вьізьівало уменьшение среднего веса опухоли, обработанной РВ5 от 198мг до 213Змг.
Представители опухолей М211Ї, обработанньх мАь ІМб09 /анти-оурз/ и РВБ5 бьли подвергнуть морфологическому исследованию. РВЗ-обработаннье опухоли бьіли крупньіїми /с диаметром 8 - 10мм/ и хорошо 65 васкуляризованньми, тогда как опухоли, обработаннье млАь І Мб09 /анти-оурз біли значительно более мелкими /с диаметром З - 4мм/ и не содержали детектируемьїх кровеносньїх сосудов.
Опухоли, полученнье в кожньїх трансплантантах, которйше иньецировали МДА 23.1 клетками бьли детектируемьми и измеряемьми. Морфологическое исследование полученньхх опухолей обнаружило, что имеет место неоваскуляризация от трансплантированньїх человеческих тканей в МДА 23.1 опухолевьне клетки.
Таким образом, блокировка оу/ру рецептора внутривенньім введением о3/рз специфичного І Мб609 антитела приводит в результате к регрессии карциномь! в такой модельной системе тем же образом, что и в случае САМ и модельньїхх систем на кроличьих глазах, как зто описано в примерах 9 и 10, соответственно. 12. Стимуляция сосудистьїх клеток с целью вхождения в клеточньій цикл и их вовлечения в апоптоз в присутствийи антагонистов интегрина оурз при измерении с помощью САМ-анализа.
Ангиогенньій процесс явно зависит от способности цитокинов, таких как ДЕОЕ и МЕСЕ стимулировать пролиферацию сосудистьїх клеток. Мідпаці с сотр. 9. СеїЇ, Віоспет., 471:201/1991/; Такезпйа с сотр. У). Сііп.
Іпмеві.,, 93:6 62/1994/; и Коута с сотр. 9. СеїЇ, РпузіоїЇ., 158:1 /1994/. Однако, также следует отметить, что передача сигнала может регулировать дифферециацию таких сосудистьїх клеток в зрелье кровеносньсе сосудьі.
Так, возможно, что интерференция с сигналами, относящимися к росту или дифферециации сосудистьх клеток, 75 подвергающихся новому росту или ангиогенезу, может в результате приводить к расстройству ангиогенеза.
Лигирование интегрина, как бьіло показано, принимает участие как в пролиферации клеток, так и в апоптозе или программированной клеточной смерти іп міо См. Зспугагі7, Сапсег Кез., 51:1503 /1993/; Мегедій с сотр.,
Мої. Віої. СеїЇ, 4:953 /1993/; Ргівспй с сотр., 9. СеїЇ. ВіоЇ.,, 124619 /1994/; и Киовіаніі с сотр., Сеї, 7Т7:АТТ 1994). Аналогичное исследованиє влияния оу3рз антагонистов на ангиогенез обнаружило присутствие прерванньїх и разрушенньїх связанньхх с опухолью кровеносньїх сосудов. Позтому, возможно, что потеря непрерьівности кровеносньїх сосудов может бьіть следствием селективного некроза или апоптоза сосудистьх клеток.
Для исследования такой возможности САМ изучали после индуцирования ангиогенеза в присутствий фактора роста ДЕСЕ и обработки мАь и циклическими пептидами настоящего изобретения. Ге
А. Обработка моноклональньми антителами о
Апоптоз может детектироваться большим числом методов, которне включают непосредственное изучение
ДНК, вьіделенной из ткани для определения фрагментации ДНК, и детекцию З'ОН в интактной ткани с помощью антитела, которое специфически определяет свободную З'ОН группу фрагментированной ДНК. 1/ Анализ фрагментации ДНК (є)
Ангиогенез индуцировали помещениеєм фильтровальньх дисков, насьщенньх ДЕСЕ на САМ 10-дневньх сч змбрионов, как зто описано в Примере бА. Иммуногистологический анализ САМ в присутствим І/Мб609 /анти-о3уВз/ позволил обнаружить пик зкспрессии оурз на кровеносньх сосудах через 12-24 часа после - инициирования ангиогенеза с помощью ДЕС. Так, через 24 часа после стимуляций ДЕС, змбрионь «ф инокулировали внутривенно 100мкл только РВ5 или РВ5З, содержащим Зб0Омкг СЗАТ /анти-В8./ или І М609 /анти-охм/Вз/. т
Фрагментацию ДНК детектировали путем резекций САМ ткани непосредственно ниже о3урз насьщенньх фильтровальньх дисков через 24 или 48 часов после внутривенной инокуляции с помощью мАь І! Мб609 /анти-оуВз/, СЗАТ /анти-р./ или РВЗ . Подвергнутье резекции ткани САМ триждь промьвали стерильной РВЗ и « мелко крошили, ресуспендировали в 0,2595 бактериальной коллагеназе/ /Ворсингтон Биокемикал; Фрихолд, у с Нью-Йорк/ и инкубировали 90 минут при 37"С при периодическом вихревом перемешианиий. ДНК зкстрагировали й из равного числа САМ клеток из одноклеточной суспензии, как описано вьіше, см., Віззопеце с сотр. Майшге «» 359:552 /1992/. Вкратце, равное число клеток САМ лизировали в 10мММ трис-СІ, рН 8.0, 10ММ ЕДТА в 0,595 /об./о6./ Тритона Х-100 /Сигма, Сент-Льюис, МО/. Клеточньій лизат центрифугировали со скоростью 16,000 ха в течение 15 минут при 4"С для отделения растворимьх фрагментов ДНК от интактной хроматиновой грануль!. ї» Фрагментированную ДНК промьівали, осаждали и анализировали на 1,295 /вес.об./ агароза геле.
Растворимую Фрагментированную ДНК вьіделяли из равного числа клеток САМ при каждой обработке, ть разделяли с помощью злектрофореза на агарозном геле и визуализировали путем окрашивания зтидиум -і бромидом. Никаких отличий не наблюдалось в относительной степени ДНК фрагментации в результате трех 5р различньйх обработок через 24 часа после обработки. Однако, через 48 часов после обработки мАь І М609 о /анти о3/В3/, наблюдалось значительное повьшение фрагментаций ДНК по сравнению с змбрионами,
Ге) обработанньіїми либо мАь СЗАТ /анти-р./ или только РВ5. 2/ Стимуляция сосудистьїх клеток для вхождения в клеточньїй цикл
С целью зкспериментального изучения роли оурз в зтих процессах, клетки произведеннье из САМ, обработанньх или не обработанньх рЕСЕ, окрашивали йодистьмм пропидиумом и проводили иммунную о реакцию с млЛь І Мб609 /анти- ох/р з/.
САм, изолированньюе из змбрионов через 24 и 48 часов после обработки мАь І Мб609 /анти-оурз/ СЗАТ о /анти-рі// или РВ5, диссоциировали в одноклеточную суспензию путем инкубации в присутствии бактериальной коллагеназьї, как описано вьше. Единичнье клетки затем подвергались условиям проницаемости и бо окрашивались с помощью детекционного набора Арор Тад іп зйи согласно инструкциям производителя /Онкор,
Гайтерсбург, МД/. Арор Тад представляеєет собой антитело, которое специфически определяет З'ОН группь! фрагментированной ДНК. Детекция таких свободньїх З'ОН групп представляет собой установленньій способ определения апоптотических клеток. См. Самгієїї. с сотр., у. Сеї! Віо!., 119:493/1992/,
Окрашеннье Арор Тад клетки затем промьівали в 0,190 /об./о06./ Тритона Х-100 в РВ5 и ресуспендировали в 62 ЕАОС5 буфере, содержащем 0,595 /вес./об. ВБА, 0,0295 /вес./об./ азида натрия и 200мкг/мл КМазьі А в РВ5.
Клетки инкубировали в течение 1,5 часа, промьшвали и анализировали флуоресцентной сортировкой активированньїх клеток. Флуоресценцию клеток измеряли с использованием РАСзЗсап проточного цитометрати полученнье даннье анализировали, как описано ниже.
Клеточную флуоресценцию измеряли с помощью РАСбсап /сканирующего клеточного сортера с возбуждением флуоресценции прим.пер, /проточного цитометра/ /Бектон Дикинсон, Маунтзйн Вью. Боковое рассеяние //55С/ и переднее рассеяние . /ЕЗс/ определяли одновременно и все полученнье даннье собирали в компьютере Хьюлет-Пакард /НРО0О00, снабженньм ЕБАСбсап исследовательским програмньм обеспечением /Бектон Дикинсон, Маунтзйн Вью, КА/. Даннье анализировали с помощью программь! Р.С. Лизис, версия 1 70 /Бектон Дикинсон, Маунтзйн Вью, КА/. Негативнье контрольнье входь устанавливали с использованием клеточной суспензиийи без добавления первичньїх антител из набора Арор Тад. Аналогичное открьітие мембранного канала применяли на обеих клеточньїх популяциях в результате анализа примерно 8.000 клеток в расчете на различнье обработки клеток.
Процент одиночньїх клеток производньїх от САМ обработанньїх мАь и окрашенньїх Арор Тад в соответствий /5 5 определением методом ГАСЗ анализа изображен на фиг.18. Черная полоса представляет собой клетки из змбрионов обработанньїх за 24 часа до анализа. Пунктирная полоса представляет собой клетки змбрионов обработаннье за 48 часов до анализа. Каждая полоса представляет собой среднее значение ях ЗЕ. при трех параллельньїх измерениях.
Как следует из фиг.18, САМ обработанньеє за 2 дня до воздействия млЛь І Мб09 /анти-оурз/ демонстрируют го З-4-кратное увеличение окрашивания Арор Тад по сравнению с САМ обработанньми только РВ5 или СЗАТ /анти-охм/В47.
В. Обработка синтетическими пептидами.
САМ-анализь! с использованием ангиогенеза, индуцированного фактором роста, как зто описано в примере бА, проводили также с использованием синтетических пептидов изобретения с целью определения влияния Га циклических пептидов на апоптоз. Пептидьі цикло-КОди /66203/ и цикло-КАДМ/ /69601/ получали как описано в примере 1. і)
Пептиднье растворьї или РВЗ иньектировали в САМ препарат с концентрацией ЗО0Омкг/мл. Через 24 и 48 часов фильтровальную бумагу и окружающую САМ ткань вскрьівали и окрашивали Арор Тад для детекции апоптоза, как описано вьіше в примере 12А2/. Ге»)
Как показано на фиг.18, САМ обработанньсе за два дня до взаимодействия с пептидом 69203 /цикло-КОДМ/ демонстрировали 3-4 кратное увеличение окрашивания Арор-Тад по сравнению с САМ обработанньіми или с только РВ5 или контрольньім циклическим пептидом 69601 /цикло-КАДМ//. ч-
С. Влияние обработки моноклональньїми телами на апоптоз и клеточньій цикл
Одноклеточнье суспензий также изучали с целью определения числа копий хромосомньх ДНК путем З окрашивания йодистьім пропидиумом с целью определения зффекта обработки моноклональньми телами на «І клеточньй цикл и на апоптоз путем окрашивания с помощью Арор Тад.
Одноклеточнье суспензий САМ обработаннье за 24 или 48 часов до взаймодействия с мАь І Мб6О09 /анти-оуВз/ или СЗАТ /анти-р./ либо РВЗ готовили, как описано в примере 12А1/. «
Для окрашивания клеток с помощью Арор Тад, клеточнье суспензий триждь промьвали буфером, содержащим 2,595 /вес.об./ ВЗА и 0,2595 /вес.об./ азида натрия в РВ5. Затем клетки фиксировали в 195 /вес./об./ - с параформальдегиде в РВ5 в течение 15 минут с последующим тройньім промьіванием, как описано вьіше. Для и предотвращения неспецифического связьувания одноклеточнье суспензии блокировали 595 /вес.об./ ВЗА в РВ5 є» в течение ночи при 4"С. Затем клетки промьшали как описано вьіше, окрашивали с помощью Арор Тад и клеточную флуоресценцию измеряли с помощью РАСбсап, как описано вьіше в примере 12А. Клетки при каждьх зкспериментальньх условиях окрашивали йодистьм пропидиумом /Сигма, Сент-Льюис, МО/ при т» концентрации 17Омкг/мл в РВ5 в течение 1 часа, дваждьі промьивали РВ5 и анализировали на ядернье ї» характеристики типичнье для апоптоза, включая хроматиновую конденсацию и сегментацию. Процентное количество апоптотических клеток оценивали морфологическим анализом в произвольно вьбранньх -і микроскопических полях имеющих значения, по крайней мере 10-15. т 50 Обьединеннье результать! исследования одноклеточной суспензий САМ из змбрионов, обработанньїх либо
СЗАТ /анти-р./ или ГМб609 /анти-оу/Дз; окрашенньїх Арор Тад и йодистьім пропидиумом и проанализированньх
Ме) методом РАС5 представлень! на фиг.19. На оси ХУ отображено окрашивание с помощью Арор Тад /апоптоз/, на оси Х отображено окрашивание йодистьім пропидиумом /содержание ДНК/. Горизонтальная линия отображаєет негативньій мембранньій канал для окрашивания Арор Тад. Левне и правье панели указьівают САМ клетки из СЗАТ и І Мб609-обработанньїх змбрионов, соответственно. Анализ клеточного цикла осуществляли анализом о примерно 8.000 собьітий в расчете на состояние и полученнье даннье представлень! на контурном графике.
Образцьї единичньїх клеток, окрашенньїх красителем ДНК, йодистьмм пропидиумом позволили установить, ко что 25 - 3095 І Мб609 /анти-оу/Д3/ обработанньїх САМ клеток через 48 часов после обработки демонстрируют ядерную конденсацию и/или сегментацию. Такие процессь!ї характернь! для клеток подвергаемьїхх апоптозу. Зтот 60 факт отличаєтся от САМ, обработанньх СЗАТ /анти- Д./, когда 90 - 9595 клеток демонстрируют нормальное клеточное окрашивание.
Как показано на фиг.19 в соответствии с индукцией апоптоза под действием ІМб09, наблюдается значительное число клеток в пике, содержащем менее одной копии ДНК /АО)/. Зтот пик бьіл показан ранее для отражения фрагментированной ДНК на поздней стадии развития апоптотических клеток. См. Темпога с сотр., бо Суютеїйгу, 13:137/1992/. Кроме зтого, такие АО клетки легко окрашиваются с помощью Арор Тад, что подтверждаєет способность такого реагента детектировать апоптототические клетки. Однако, в дополнение к окрашиванию клеток в АО, значительное число клеток, содержащих более одной копии ДНК, также окрашиваєтся с помощью Арор Тад /фиг.19/. Зти результать! д демонстрируют тот факт, что | М6О9 обладаеєет способностью промотировать апоптоз среди сосудистьїх клеток, которье уже вошли в клеточньй цикл. В отличие от зтого, клетки, производнье от контрольньїх САМ, которье вошли в клеточньій цикл демонстрируют минимальное окрашивание Арор Тад, что соответствует нескольким апоптотическим клеткам определяемьм в контрольньїх обработанньїх САМ.
Среди тех клеток в САМ стимулированньїх ДВЕСЕ, которье вошли в клеточньій цикл /5 и 52/М фаза/, 7090 70 демонстрируют положительное окрашивание І Мб609 /анти-оу/Дз/. Зто значение можно сравнить с 1095 ГМ609 окрашивания, наблюдаємого в циклических клетках из САМ необработанньїх ДВЕСЕ. Зти открьїтия указьівают на то, что после ВІЗ4Ї стимуляции большая часть сурз-несущих клеток демонстрируют активную пролиферацию.
Совместное рассмотрение зтих фактов указьіваєт на то, что внутривенное иньцирование мАь І Мб6О09 или циклического пептида - антагониста о3Вз промотирует апоптоз в курином САМ с последующей индукцией 75 ангиогенеза.
САМ уже изучали гистологически на зкспрессию ох/рз путем исследования иммунореактивности с І Мб09 и на наличие клеток, подвергающихся апоптозу в результате иммунной реакции с Арор Тад. Срезьї САМ, подвергнутье резекции из змбрионов, обработанньїх за 48 часов І МбО09 /анти-оу/Вз/, СЗАТ /анти-В./ или РВ5, полученньїми в примере 5А, промьівали, погружали в ОТС //Бакстер/ и мгновенно замораживали в жидком азоте.
Шести-микроннье срезьі САМ тканей вьірезали, фиксировали в ацетоне в течениє 30 секунд и хранили при -10"С до дальнейшего использования. Тканевье срезь! готовили для окрашивания бьістрьиім промьіванием в 7090 /об./о06./ зтаноле /'ЕЮЮН/ с последующим тройньїм промьіванием в РВ5. Далее, срезьі блокировали 590 /вес./об./ ВБА в РВ5 в течение 2 часов, после чего проводили инкубацию в присутствии 1Омкг/мл мАь І Мб609 в течение 2 часов. Затем срезьі промьшвали и инкубировали в присутствиий 1:50 разбавления родаминового с коньюгированного козьего анти-мьішиного ІдС- /Фишер Сайнтифик, Питсбург, РА/ в течение 2 часов. Наконец Ге) зти срезьї промьівали и окрашивали с помощью Арор Тад, как описано в Примере 12А2/. Окрашеннье тканевье срезьї превращали в препарать! и анализировали методом конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии.
На фиг.20, панели А-С показьівают САМ-ткань от змбрионов, обработанньхх СЗАТ /анти-р.4/, а панели Д-Е представляют САМ-ткань из І Мб609 /анти- о/р з/, обработанньїх змбрионов. Панели А и Д показьвают ткани, Ме. окрашеннье Арор Тад и визуализированнье флуоресценцией /РІТС/, наложенной на Д.І.С. изображение. СУ
Панели В и Е содержат изображение тех же тканей, окрашенньїх мЛь І Мб609 /анти-оу/рз/ и визуализированньх с помощью флуоресценции /родамин/. Панели С и Р представляют собой слитье изображения тех же тканей, - окрашенньмх Арор Тад и І МбО09, где желтое окрашивание относится к солокализации. Полосьї имеют размерь 15 «Ж и 5Омкм в левой и правой панелях, соответственно.
Как показано на фиг.20/А-С/, после внутривенного иньецирования СЗАТ или РВ5 контрольньїх образцов, З окрашивание Арор Тад бьіло минимальньм и случайньім, что указьівает на минимальньй уровень апоптоза внутри ткани. В отличие от зтого, САМ из змбрионов, предварительно обработанньїх І! Мб609 или циклическим пептидом 203, демонстрировали преимущественное количество сосудов, интенсивно окрашенньїх Арор Тад, « 20 тогда как минимальная реактивность наблюдалась у окружающих несосудистьїх клеток /фиг.20Д-Р/. Кроме зтого, -в в том случає, когда Арор Тад и І! Мб609 использовали для окрашивания таких тканей /19С и 19Г/ значительная с солокализация наблюдалась лишь между зтими маркерами в САМ, являющихся производньіми змбрионов, :з» обработанньїх соурз антагонистами /фиг.20Р/. Зти открьтия демонстрируют тот факт, что после индукции ангиогенеза іп мімо ингибиторь! интегрина оурз селективно промотируют апоптоз оурВз-несущих кровеносньхх сосудов. ї» Хотя ангиогенез представляет собой сложньй процесс, включающий большое число молекулярньїх и клеточньїх биологических собьітий, некоторье черть! доказательств позволяют предположить, что сосудистье ве клеточнье интегриньі ооурз играют относительно опозднюю роль ов таком процессе. Во-первьх, -і иммуногистологический анализ позволил обнаружить, что зкспрессия оурз на сосудистьїх клетках достигаєет 5 максимума через 12-24 часа после индукции ангиогенеза с о помощью /ДЕОБЕ. Во-первьх, по антагонистьі о3/Вз-нарушают ангиогенез, индуцированньй множеством активаторов, что позволяет 3е) предположить, что такой рецептор принимает участие в общем каскаде реакций, протекающих вниз от, возможно, всех первичньїх собьтий по передаче сигнала приводящих к ангиогенезу. В третьих, САМ обработаннье мАь І Мб609 или циклическим пептидом не проявляют значительного усиления апоптозиса, как бьло измерено лестничньмм анализом ДНК через 48 часов после обработки такими антагонистами. Наконец, о антагонистьі промотируют апоптоз сосудистьїх клеток уже подвергнутьх индуцированию для вхождения в клеточньїй цикл. їмо) Представленньє в тексте результать! дают первое прямое доказательство того, что лигирование интегринов может регулировать вьіживание клетки іп мімо. Позтому можно вьісказать гипотезу, что после начала 60о ангиогенеза индивидуальнье соссудистье клетки начинают делиться и двигаться в направлений источника ангиогенеза после чего оурз лигирование обеспечиваєт сигнал непрерьівному вьіживанию клетки, что приводит к дифференциации и ообразованию зрельх кровеносньх сосудов. Однако, если о3урз лигирование предотвращаєтся, то клетки не могут получать такой молекулярньій сигнал и вовлекаются в апоптоз в недостаточном количестве. Такая гипотеза также предсказьвшаєт, что после дифференциации зрелье бо кровеноснье сосудь! больше не требуют оурз передачи сигнала для вьіживания и они становятся устойчивьми в отношений антагонистов такого интегрина.
Наконец, представленнье в тексте результать дают доказательство того, что антагонисть интегрина сурВз могут обеспечивать мощньй терапевтический подход к лечению неоплазии других заболеваний, характеризующихся ангиогенезом. Во-первьїх, антагонисть! оурз нарушают вновь образовавшиеся кровеноснье сосудьі, не оказьівая влияния на уже существующую сосудистую систему. Во-вторьїх, такие антагонисть! не оказьшают значительного влияния на жизнеспособность куриньїх змбрионов, что предполагаеєт их нетоксичность. В третьих, ангиогенез в значительной мере блокируется в независимости от природньх ангиогенньїх стимулов. Наконец, систематическое применение оурз антагонистов вьізьвает драматическую 70 регрессию различньїх гистологических отличающихся человеческих опухолей. Таким образом, приведеннье вьіше Примерь! демонстрируют тот факт, что интегрин оудВз играет ключевую роль в ангиогенезе, индуцируемом множеством остимулов, и такой оо34рВз представляет собой ценную терапевтическую мишень в присутствий оу/рз антагонистов изобретения для заболеваний, характеризующихся неоваскуляризацией.
Приведенное вьіше описание можно считать достаточньїм для того, чтобьї специалист в данной области мог 75 реализовать изобретение на практике. Сфера настоящего изобретения не ограничиваєтся депонированньми клеточньми линиями, поскольку депонированноє воплощение рассматриваєтся как одна из иллюстраций одного аспекта изобретения и любая клеточная линия, функционально зквивалентная описанной вьіше, входит в сферу изобретения. Депонирование материала не означаєт, что приведенное вьіше описание неадекватно для практической реализации любого аспекта изобретения, включая найлучшее его решение, также не имеется в виду, что зтим ограничивается сфера формуль! изобретения в отношений специфической иллюстрации того, что она представляет. Разумеется, что различнье модификации изобретения помимо тех, что показань и описань в тексте станут ясньіми для специалистов в данной области из приведенного описания и они входят в сферу прилагаемой формуль! изобретения. с

Claims (37)

Формула винаходу і)
1. Способ ингибирования ангиогенеза в ткани, включающий введение в указанную ткань композиции, содержащей ангиогенез-ингибирующее количество антагониста интегрина В (22) й с
2. Способ ингибирования ангиогенеза в твердой опухоли пациента, включающий - введение указанному пациенту композиции, содержащей ангиогенез-ингибирующее количество антагониста интегрина в -
3. Способ индукции регрессиий твердой опухолевой ткани у пациента, включающий введение указанному Зо пациенту композиции, содержащей терапевтически зффективное количество ангиогенез-ингибирующего т количества антагониста интегрина достаточного для ингибирования неоваскуляризации твердой сей опухолевой ткани. « дю
4. Способ ингибирования роста твердой опухолевой ткани у пациента, подвергающейся неоваскуляризации, з включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей терапевтически-зффективное количество с ангиогенез-ингибирующего количества антагониста интегрина В достаточного для ингибирования роста хз» Су твердой опухолевой ткани.
5. Способ уменьшения кровоснабжения ткани, необходимого для поддержания новообразования указанной їз ткани у пациента, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей терапевтически-зффективное количество ангиогенез-ингибирующего количества антагониста интегрина пи достаточного для уменьшения кровоснабжения указанной ткани. - суб,
6. Способ ингибирования ангиогенеза в воспаленной, ангиогенной ткани пациента, включающий введение о указанному пациенту композиции, содержащей ангиогенез-ингибирующее количество антагониста интегрина ев
7. Способ лечения пациента, у которого наблюдаєтся неоваскуляризация ретинальной ткани, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей терапевтически-зффективное /количество о ангиогенез-ингибирующего количества антагониста интегрина п, В ко
8. Способ лечения пациента от рестеноза в тканях, когда наблюдаєтся миграция клеток гладкой мьІішць после ангиопластики, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей терапевтически бо зффективное количество антагониста интегрина т, В.
9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанньій антагонист интегрина с, ингибирует связьшание фибриногена с интегрином но не существенно ингибирует связьвание 65 с, ;
фибриногена с интегрином Єедв Оз.
10. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанньій антагонист интегрина суВз представляет собой анти- моноклональное антитело. с,
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что анти- моноклональное антитело специфически є, 70 связьіваєет комплекс интегрина п, В
12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанное антитело обладаеєт иммунореактивньми характеристиками моноклонального антитела І Мб609 с АТСС каталожньім номером НВ 9537.
13. Способ по п. 10, отличающийся тем, что антитело является гуманизированньм.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что гуманизированное антитело обладает иммунореактивньми характеристиками моноклонального антитела І Мб609 имеющего АТСС каталожньйй номер НВ 9537.
15. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанньій антагонист интегрина с, представляет собой КОЮО-содержащий полипептид.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанньй полипептид вьібирают из группьі, состоящей из с-(огООРМ) (5ЕО ІЮ Мо 4), с-(«КОМ) (ЗЕО І Мо 5), с-"КООРМ) (5ЕО ІЮО Мо 7) и УТАЕСКРОМТКООМЕ (5ЕО ІЮ Мо 8) и их солей.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанная соль представляет собой гидрохлорид или трифторацетат. сч 29
18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанньйй антагонист интегрина представляет собой Ге) с, циклический полипептид.
19. Способ по любому из пп. 2-8, огличающийся тем, что пациентом является человек. Фо
20. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанное ангиогенез-ингибирующее количество составляеєт от около 0,1 мг/кг до около З00 мг/кг. с
21. Способ по п. 8, огличающийся тем, что указанное терапевтически зффективное количество составляет їч- от около 0,1 мг/кг до около 300 мг/кг.
22. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанное введение включаєт внутривенноє, Ж з5 Внутрисуставное, трансдермальное, внутримьішечное или перроральное введение. «
23. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанное введение включает перистальтическое введение.
24. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанное введение включает ежедневное введение одной или более доз в течение одного или нескольких дней. « 20
25. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанное введение заключаєется во внутривенном ш-в введений однократной дозь. с
26. Способ по любому из пп. 2-4, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют совместно с :з» химиотерапией.
27. Способ по любому из пп. 2-4, отг'личающийся тем, что опухоль является метастазированной.
28. Способ по любому из пп. 2-4, отличающийся тем, что указанная твердая опухоль ткани представляет їз собой карциному.
29. Способ по любому из пп. 2-4, отличающийся тем, что указанная твердая опухоль ткани представляет ве собой опухоль легкого, поджелудочной железьї, молочной железь, толстой кишки, гортани или яичника. -
30. Способ по любому из пп. 1, 5-6, отличающийся тем, что указанная ткань является артритной тканью.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанная артритная ткань присутствует у млекопитающего с їмо) ревматоидньїм артритом. с
32. Способ по любому из пп. 1, 5-7, отличающийся тем, что указанная ткань представляет собой ретинальную ткань пациента с диабетической ретинопатией, а указанньій ангиогенез представляет собой ретинальньй ангиогенез.
33. Способ по любому из пп. 1, 5-7, отличающийся тем, что ткань представляет собой ретинальную ткань, а ангиогенез представляет собой ретинальньй ангиогенез.
(Ф. 34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанная ретинальная ткань принадлежит пациенту с г диабетической ретинопатией или макулярной дегенерацией.
35. Способ по п. 1 или 8, отличающийся тем, что указанное введение проводят после ангиопластики. во
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанная ангиопластика представляет собой коронарную ангиопластику.
37. Способ по п. 1 или 8, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют у пациента с риском рестеноза после ангиопластики. б5
UA96093689A 1994-03-18 1995-03-09 Спосіб інгібування ангіогенезу в тканині, спосіб інгібування ангіогенезу в твердій пухлині, спосіб індукції регресії твердої пухлинної тканини, спосіб інгібування росту твердої пухлинної тканини, спосіб зменшення кровопостачання тканини, спосіб інгібування ангіогенезу у запаленій, ангіогенній тканині, спосіб лікування пацієнтів (варіанти) UA44729C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/210,715 US5753230A (en) 1994-03-18 1994-03-18 Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US08/366,665 US5766591A (en) 1994-03-18 1994-12-30 Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
PCT/US1995/003035 WO1995025543A1 (en) 1994-03-18 1995-03-09 Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA44729C2 true UA44729C2 (uk) 2002-03-15

Family

ID=22783992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA96093689A UA44729C2 (uk) 1994-03-18 1995-03-09 Спосіб інгібування ангіогенезу в тканині, спосіб інгібування ангіогенезу в твердій пухлині, спосіб індукції регресії твердої пухлинної тканини, спосіб інгібування росту твердої пухлинної тканини, спосіб зменшення кровопостачання тканини, спосіб інгібування ангіогенезу у запаленій, ангіогенній тканині, спосіб лікування пацієнтів (варіанти)

Country Status (25)

Country Link
US (7) US5753230A (uk)
EP (3) EP1468695B1 (uk)
JP (2) JP4268222B2 (uk)
KR (1) KR100327081B1 (uk)
CN (1) CN1161152C (uk)
AT (3) ATE255907T1 (uk)
AU (1) AU709645B2 (uk)
CA (1) CA2184493C (uk)
CZ (1) CZ294650B6 (uk)
DE (2) DE69532279T3 (uk)
DK (3) DK0754059T4 (uk)
ES (3) ES2376850T3 (uk)
FI (1) FI121916B (uk)
HK (1) HK1013960A1 (uk)
HU (1) HU221988B1 (uk)
MX (1) MX9604145A (uk)
NO (1) NO322441B1 (uk)
NZ (3) NZ548433A (uk)
PT (2) PT754059E (uk)
RU (1) RU2162712C2 (uk)
SI (1) SI0754059T2 (uk)
SK (1) SK284586B6 (uk)
UA (1) UA44729C2 (uk)
WO (1) WO1995025543A1 (uk)
ZA (1) ZA952214B (uk)

Families Citing this family (176)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4310643A1 (de) * 1993-04-01 1994-10-06 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
US5753230A (en) 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5945403A (en) * 1997-05-30 1999-08-31 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US6949511B1 (en) 1994-04-26 2005-09-27 The Children's Medical Center Corporation Methods of inhibiting angiogenesis via increasing in vivo concentrations of kringle region fragments of plasminogen
US6660842B1 (en) 1994-04-28 2003-12-09 Tripep Ab Ligand/receptor specificity exchangers that redirect antibodies to receptors on a pathogen
ES2202336T3 (es) * 1994-12-20 2004-04-01 Merck Patent Gmbh Anticuerpo monoclonal contra la integrina alfa-v.
US6358735B1 (en) 1995-06-30 2002-03-19 University Of Kansas Medical Center Method for inhibiting angiogenesis and tumors with the isolated NC1 α3 chain monomer of type IV collagen
US6440729B1 (en) * 1995-06-30 2002-08-27 University Of Kansas Medical Center Treating angiogenesis-mediated diseases with the α2 monomer of type IV collagen
JP4903921B2 (ja) * 1995-08-14 2012-03-28 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート αＶβ５仲介血管形成の阻止に有効な方法及び組成物
US6100423A (en) * 1995-08-30 2000-08-08 G. D. Searle & Co. Amino benzenepropanoic acid compounds and derivatives thereof
CZ293323B6 (cs) 1995-08-30 2004-04-14 G. D. Searle & Co. Meta-guanidinové, močovinové, thiomočovinové nebo azacyklické deriváty aminobenzoové kyseliny jako antagonisty integrinů
US6346510B1 (en) 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
US5854205A (en) * 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
CN1202932A (zh) 1995-10-23 1998-12-23 儿童医学中心公司 治疗用抗血管生成的组合物和方法
US5854221A (en) * 1996-12-12 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use
JP4189033B2 (ja) * 1996-08-15 2008-12-03 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 定量的関節炎状態のアッセイ
GB9708265D0 (en) * 1997-04-24 1997-06-18 Nycomed Imaging As Contrast agents
DE69739295D1 (de) * 1996-12-09 2009-04-23 Merck Patent Gmbh Löslicher, rekombinanter alphaV beta3 Adhäsionsrezeptor
US6590079B2 (en) 1997-01-30 2003-07-08 Ixsys, Incorporated Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
US6596850B1 (en) * 1998-01-30 2003-07-22 Ixsys, Incorporated Anti-αv3β3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
US7112338B2 (en) 1997-03-12 2006-09-26 The Regents Of The University Of California Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels
DE69828154T2 (de) 1997-03-12 2005-06-23 Smithkline Beecham Corp. Anti-alphavbeta3 humanizierte monoklonale antikörper
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
US5994388A (en) * 1997-03-18 1999-11-30 The Children's Medical Center Corporation Cytochalasin and isoindolinone derivatives as inhibitors of angiogenesis
WO1998041158A1 (en) * 1997-03-19 1998-09-24 Lucid Technologies, Inc. Cellular surgery utilizing confocal microscopy
WO1998046265A1 (en) * 1997-04-11 1998-10-22 G.D. Searle & Co. Methods for using antagonistic anti-avb3 integrin antibodies
DE69808609T2 (de) * 1997-04-11 2003-06-12 Searle & Co Antagonistische anti-avb3 integrin antikörper
US6596276B1 (en) * 1997-09-30 2003-07-22 Beth Israel Deaconess Medical Center Method for inhibiting tumor angiogenesis in a living subject
US6372719B1 (en) * 1998-03-04 2002-04-16 Jay Cunningham ανβ3 integrin antagonists in combination with chemotherapeutic agents
US6172256B1 (en) * 1998-03-04 2001-01-09 G.D. Searle & Co. Chiral-β-amino acid compounds and derivatives thereof
US6524553B2 (en) * 1998-03-31 2003-02-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Quinolone vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
EA200001007A1 (ru) 1998-03-31 2001-04-23 Дюпон Фармасьютикалз Компани Фармацевтические препараты для визуализации ангиогенных расстройств
US6548663B1 (en) 1998-03-31 2003-04-15 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Benzodiazepine vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6537520B1 (en) 1998-03-31 2003-03-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders
US6852318B1 (en) 1998-05-08 2005-02-08 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and inhibiting angiogenesis
US7387779B2 (en) 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US6962974B1 (en) 1998-06-17 2005-11-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US6759047B1 (en) 1998-06-17 2004-07-06 Beth Israel Deaconess Hospital Corp. Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof
CA2333147C (en) 1998-07-13 2012-02-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids
RU2167425C2 (ru) * 1998-07-17 2001-05-20 Малышев Игорь Юрьевич Способ определения белков
US6164281A (en) * 1998-07-20 2000-12-26 Zhao; Iris Ginron Method of making and/or treating diseases characterized by neovascularization
WO2000009143A1 (en) * 1998-08-13 2000-02-24 G.D. Searle & Co. Multivalent avb3 and metastasis-associated receptor ligands
US6979697B1 (en) * 1998-08-21 2005-12-27 Point Therapeutics, Inc. Regulation of substrate activity
US6703050B1 (en) * 1998-09-04 2004-03-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the prevention or treatment of cancer
US6537554B1 (en) 1998-09-10 2003-03-25 Curagen Corporation Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis
US6248327B1 (en) 1998-09-11 2001-06-19 Vanderbilt University Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis
US7176289B1 (en) 1998-09-11 2007-02-13 Vanderbilt University Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis
US20030202977A1 (en) * 1998-11-16 2003-10-30 New York University Treatment of osteoarthritis
US6235877B1 (en) 1999-08-04 2001-05-22 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Peptido-mimetic compounds containing RGD sequence useful as integrin inhibitors
IL142921A0 (en) * 1998-11-20 2002-04-21 Genentech Inc USES FOR Eph RECEPTOR ANTAGONISTS AND AGONISTS TO TREAT VASCULAR DISORDERS
US6339062B1 (en) * 1998-11-23 2002-01-15 Inkine Pharmaceutical Company, Inc. Retroinverso polypeptides that mimic or inhibit thrombospondin activity
US6160099A (en) * 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
US6569402B1 (en) * 1998-12-18 2003-05-27 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6794518B1 (en) 1998-12-18 2004-09-21 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
AU2371400A (en) 1998-12-18 2000-07-03 Du Pont Pharmaceuticals Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6511649B1 (en) 1998-12-18 2003-01-28 Thomas D. Harris Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
CN1356913A (zh) 1998-12-18 2002-07-03 杜邦药品公司 玻连蛋白受体拮抗剂药物
IL143901A0 (en) * 1998-12-23 2002-04-21 Searle & Co Use of cyclooxygenase-2- inhibitor, a matrix metallaproteinase inhibitor, an antineoplastic agent and optionally radiation as a combination treatment of neoplasia
US20050281821A1 (en) * 1999-01-06 2005-12-22 Flavia Pernasetti Method and composition for angiogenesis inhibition
US6521593B1 (en) * 1999-02-01 2003-02-18 Childrens Hospital Los Angeles Methods for inhibiting brain tumor growth
DK1156823T3 (da) * 1999-02-12 2009-01-19 Scripps Research Inst Fremgangsmåder til behandling af tumorer og metastaser ved anvendelse af en kombination af anti-angiogene terapier og immunoterapier
WO2000059532A1 (en) * 1999-04-01 2000-10-12 Biostratum, Inc. The use of domains of type iv collagen t inhibit angiogenesis an tumour growth
AU4982200A (en) * 1999-05-06 2000-11-21 Burnham Institute, The Antiangiogenic endostatin peptides, endostatin variants and methods of use
US6890904B1 (en) 1999-05-25 2005-05-10 Point Therapeutics, Inc. Anti-tumor agents
US6531580B1 (en) * 1999-06-24 2003-03-11 Ixsys, Inc. Anti-αvβ3 recombinant human antibodies and nucleic acids encoding same
US6685914B1 (en) * 1999-09-13 2004-02-03 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Macrocyclic chelants for metallopharmaceuticals
US20080038274A1 (en) * 1999-09-23 2008-02-14 Foster Keith A Inhibition of secretion from non-neuronal cells
JP2003509468A (ja) * 1999-09-23 2003-03-11 ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート 癒着形成を阻害する方法および組成物
JP2003510371A (ja) * 1999-10-04 2003-03-18 カイロン コーポレイション 乾癬を処置するためのｃｄ４０アンタゴニスト
EP1250155B1 (en) 1999-12-22 2008-04-16 The Scripps Research Institute Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors
US7740841B1 (en) * 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
EP1258252B1 (en) * 2000-02-03 2010-04-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Integrin expression inhibitors
US7361643B2 (en) 2000-02-09 2008-04-22 University Of Puerto Rico Methods for inhibiting angiogenesis
US20010053766A1 (en) * 2000-02-11 2001-12-20 Janardan Kumar Method of treating disorders of the eye
US6573096B1 (en) * 2000-04-01 2003-06-03 The Research Foundation At State University Of New York Compositions and methods for inhibition of cancer invasion and angiogenesis
US6835806B2 (en) 2000-04-03 2004-12-28 Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Cell growth regulation system
CN1230441C (zh) 2000-04-12 2005-12-07 安盛药业有限公司 结合整联蛋白的肽衍生物
US10293056B1 (en) * 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US7288390B2 (en) * 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US20030104573A1 (en) * 2000-09-11 2003-06-05 Shimkets Richard A. Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis
NO20004795D0 (no) 2000-09-26 2000-09-26 Nycomed Imaging As Peptidbaserte forbindelser
AU2002211824B2 (en) * 2000-10-02 2006-11-02 The Scripps Research Institute Methods and compositions for enhancing angiogenesis
US6632835B2 (en) 2001-02-22 2003-10-14 Nanodesign Inc. Dibenzo[c]chromen-6-one derivatives as anti-cancer agents
DE10109136A1 (de) * 2001-02-26 2002-09-12 Cytotools Gmbh Mittel, die die Apoptose bei an der Wundheilung beteiligten Zellen inhibieren
NZ528076A (en) * 2001-03-02 2005-09-30 Medimmune Inc Methods of preventing or treating inflammatory or autoimmune disorders by administering integrin alphav beta3 antagonists with an immunomodulatory agents, anti-inflammatory agents, TNF-alpha antagonists or CD2 binding molecules
CN1247258C (zh) 2001-04-24 2006-03-29 默克专利有限公司 使用抗血管生成剂和TNFα的联合疗法
SE0101854L (sv) * 2001-05-28 2002-11-29 Bioneris Ab Användning av en förening med en negativt laddad region av grupper för behandling av restenos.
CA2453403C (en) * 2001-07-09 2013-10-08 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting amyloid toxicity
US7829087B2 (en) * 2001-07-09 2010-11-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cognitive impairment
PL207834B1 (pl) 2001-07-10 2011-02-28 Ge Healthcare As Związki na bazie peptydów, ich zastosowanie oraz zawierająca je kompozycja farmaceutyczna
JP2005504037A (ja) * 2001-07-27 2005-02-10 ユニヴァースティ オブ カンザス メディカル センター Ｉｖ型コラーゲンｎｃ１ドメイン六量体の結晶化構造
US20060014697A1 (en) * 2001-08-22 2006-01-19 Travis Mickle Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse
US20030119834A1 (en) * 2001-09-05 2003-06-26 Bamdad Cynthia C. Compositions and methods of treatment of cancer
CN100560131C (zh) 2001-10-22 2009-11-18 斯克里普斯研究学院 抗体靶向化合物
CA2476120A1 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Methods and compositions for the treatment of eye diseases
AU2002306251A1 (en) * 2002-02-15 2003-09-04 Richard Brunner 7s immunoglobulin for treatment of choroidal neovascularisation_
AU2003213682C1 (en) * 2002-03-04 2008-06-12 Medimmune, Inc. Methods of preventing or treating disorders by administering an integrin alphavbeta3 antagonist in combination with an HMG-CoA reductase inhibitor or a bisphosphonate
US20040001835A1 (en) * 2002-03-04 2004-01-01 Medimmune, Inc. Prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents
EP1499352A4 (en) 2002-04-12 2006-10-11 Medimmune Inc ANTI-INTERLEUKIN-9 RECOMBINANT ANTIBODIES
ES2358730T3 (es) 2002-07-15 2011-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Anticuerpos seleccionados y péptidos de duramicina que se enlazan a fosfolípidos aniónicos y aminofosfolípidos y sus usos en el tratamiento de infecciones virales y del cáncer.
GB0217018D0 (en) * 2002-07-23 2002-08-28 Bioacta Ltd Peptide 1
EA008683B1 (ru) * 2002-07-23 2007-06-29 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Мичиган Тетрапропиламмония тетратиомолибдат и родственные соединения для антиангиогенной терапии
US8017737B2 (en) * 2002-11-19 2011-09-13 Hasan Kulaksiz Diagnostic methods for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids; monoclonal antibodies specific to human hepcidin and associated uses therefor
US7411048B2 (en) * 2002-11-19 2008-08-12 Drg International, Inc. Diagnostic method for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids
AU2003295644A1 (en) * 2002-11-19 2004-07-22 Drg International, Inc. Diagnostic method for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids and therapeutic uses therefor
US20040208869A1 (en) * 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Uses of anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
US20040176272A1 (en) * 2003-01-30 2004-09-09 Medimmune, Inc. Uses of integrin alphavbeta3 antagonists
US7335359B2 (en) * 2003-02-06 2008-02-26 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers
JP2007516157A (ja) 2003-02-06 2007-06-21 トリペップ アクチ ボラゲット グリコシル化された抗原／抗体又はリガンド／受容体特異性交換体
KR20120035234A (ko) 2003-04-11 2012-04-13 메디뮨 엘엘씨 재조합 ｉｌ?９ 항체 및 그의 용도
JP2007523839A (ja) * 2003-04-18 2007-08-23 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 血管新生性障害の治療法
US20050239088A1 (en) * 2003-05-16 2005-10-27 Shepard H M Intron fusion proteins, and methods of identifying and using same
US7605235B2 (en) 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
EP1633309A4 (en) * 2003-05-30 2007-06-13 Centocor Inc METHOD FOR INHIBITING TUMOR GROWTH WITH ANTI-TISSUE FACTOR ANTIBODIES
US9708410B2 (en) 2003-05-30 2017-07-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
US20050170455A1 (en) * 2003-06-20 2005-08-04 Qun-Yong Zhou Novel prokineticin receptor isoforms and methods of use
EP1722780A4 (en) * 2003-11-26 2008-12-17 Univ Duke METHOD FOR PREVENTING OR TREATING GLAUCOMA
CA3031283A1 (en) 2004-01-22 2005-08-04 University Of Miami Topical co-enzyme q10 formulations and methods of use
US7271245B2 (en) * 2004-02-13 2007-09-18 The Scripps Research Institute Methods and compositions for inhibition of metastasis
WO2005079508A2 (en) * 2004-02-17 2005-09-01 Cancervax Corporation Method and composition for angiogenesis inhibition
US7351739B2 (en) * 2004-04-30 2008-04-01 Wellgen, Inc. Bioactive compounds and methods of uses thereof
WO2005117936A2 (en) * 2004-05-07 2005-12-15 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-i
US8187595B2 (en) 2004-05-07 2012-05-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-I
JP2008506366A (ja) * 2004-05-14 2008-03-06 レセプター バイオロジックス インコーポレイテッド 細胞表面受容体アイソフォームならびにその同定および使用方法
US7528106B2 (en) 2004-06-04 2009-05-05 The Scripps Research Institute Compositions and methods for treatment of neovascular diseases
WO2006012415A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Rage protein derivatives
US20060029544A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-09 The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer Receptor-binding cyclic peptides and methods of use
CA2577370A1 (en) * 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Inc. Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
AU2005299355A1 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Medimmune, Llc Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
KR100679100B1 (ko) * 2004-10-29 2007-02-06 엘지.필립스 엘시디 주식회사 수평 전계 인가형 액정 표시 패널 및 그 제조방법
CN101124243A (zh) * 2004-12-23 2008-02-13 莫尔梅德股份有限公司 缀合产物
WO2006111925A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Inhibition of tumorigenesis by inhibition of a6b4 integrin
US20090170769A1 (en) * 2005-05-13 2009-07-02 Pei Jin Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
US20060286148A1 (en) * 2005-05-18 2006-12-21 Ppd, Inc. Method of forming implants
WO2006138429A2 (en) 2005-06-16 2006-12-28 The Feinstein Institute For Medical Research Antibodies against hmgb1 and fragments thereof
CA2613512A1 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Medimmune, Inc. Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles
WO2007024921A2 (en) * 2005-08-24 2007-03-01 Cell Matrix Combination therapies for inhibiting integrin-extracellular matrix interactions
EP1973569B1 (en) 2006-01-18 2013-05-22 Merck Patent GmbH Specific therapy using integrin ligands for treating cancer
WO2007083949A1 (en) 2006-01-19 2007-07-26 Eyegene Inc. Pharmaceutical composition for treating vascular-related diseases comprising peptide
AU2007257683A1 (en) * 2006-06-12 2007-12-21 Symphogen A/S Pan-cell surface receptor- specific therapeutics
US8637469B2 (en) 2006-07-11 2014-01-28 Roy C. Levitt Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors
DK2068889T3 (da) 2006-08-10 2020-02-03 Roy C Levitt Anakinra til anvendelse i behandling af bronchiolitis obliterans syndrom
WO2008045252A2 (en) 2006-10-04 2008-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered integrin binding peptides
US20100069302A1 (en) 2007-07-18 2010-03-18 Stefan Krueger Specific therapy and medicament using integrin ligands for treating cancer
DK2025685T3 (da) * 2007-08-15 2013-09-02 Canadian Blood Services Monoklonale antistoffer mod BETA3-integriner.
BRPI0818033A2 (pt) * 2007-10-16 2015-03-24 Symphogen As Composições compreendendo multímeros otimizados de her1 e her3 e métodos para usos dos mesmos
WO2009060198A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf antibody compositions and methods
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
AU2009274512A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 The Regents Of The University Of Colorado Clip inhibitors and methods of modulating immune function
ES2569373T3 (es) 2008-10-31 2016-05-10 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Células madre derivadas del epitelio olfativo y procedimientos para su utilización
WO2010075058A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Ge Healthcare Limited Application of 99mtc peptide-based compound as a bone marrow imaging agent
WO2010093706A2 (en) 2009-02-10 2010-08-19 The Scripps Research Institute Chemically programmed vaccination
JP2012528079A (ja) 2009-05-25 2012-11-12 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 癌を治療するためのインテグリンリガンドの連続投与
FR2949782B1 (fr) * 2009-09-04 2015-10-16 Isp Investments Inc Peptide activateur de la transglutaminase et composition cosmetique ou pharmaceutique le contenant.
US8778888B2 (en) * 2009-11-06 2014-07-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cystine knot peptides binding to alpha IIb beta 3 integrins and methods of use
CA2805338A1 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Merck Patent Gmbh Peptide for use in the treatment of breast cancer and/or bone metastases
JP6320042B2 (ja) 2011-02-11 2018-05-09 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 前立腺癌治療のための抗アルファ−ｖインテグリン抗体
US8722044B2 (en) 2011-03-15 2014-05-13 Janssen Biotech, Inc. Human tissue factor antibody and uses thereof
RU2531502C2 (ru) * 2011-08-09 2014-10-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани
RU2481115C1 (ru) * 2011-10-13 2013-05-10 Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Объединение "Тюменькриобанк" Средство для заживления ран "целльгель", способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством
US9775803B2 (en) 2011-10-19 2017-10-03 Samsung Electronics Co., Ltd. Liposome comprising elastin-like polypeptide and tumor cell targeting material and use thereof
US20140350087A9 (en) 2012-03-22 2014-11-27 Halozyme, Inc. Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use
EP2859113A4 (en) * 2012-06-07 2016-04-13 Univ Nat Cheng Kung FRAGMENTS OR VARIANTS OF MODIFIED FIBRONECTIN AND USES THEREOF
BR112015004119A2 (pt) 2012-08-31 2017-08-08 Univ North Carolina Chapel Hill anticorpos monoclonais para melhorar ou inibir o fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (igf-1)
WO2014063012A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Conjugated knottin mini-proteins containing non-natural amino acids
EP2928871B1 (en) 2012-12-07 2017-02-01 Council of Scientific & Industrial Research Histidinylated cationic amphiphiles, process for preparation thereof and their liposomal formulation
EP3919070A1 (en) * 2013-03-14 2021-12-08 Children's Medical Center, Corp. Use of cd36 to identify cancer subjects for treatment
JP7034914B2 (ja) 2015-11-23 2022-03-14 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 線維症および／または線維性疾患の治療のための抗α－ｖインテグリン抗体
EP3576726A1 (en) 2017-02-06 2019-12-11 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to glutaminase inhibitors
US20200109205A1 (en) 2017-03-31 2020-04-09 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3-positive cancer stem cells (cscs) and treating drug resistant cancers
KR102171433B1 (ko) * 2018-05-25 2020-11-02 고려대학교 산학협력단 조직 재생을 위한 Substance P 펩타이드가 고정된 피브린 젤 및 이의 제조방법
WO2021015336A1 (ko) * 2019-07-24 2021-01-28 가톨릭대학교 산학협력단 αVβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체
US20210032348A1 (en) * 2019-08-02 2021-02-04 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3-positive cancer stem cells (cscs) and treating drug resistant and metastatic cancers
EP4204094A1 (en) 2020-08-27 2023-07-05 Enosi Therapeutics Corporation Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5092885A (en) * 1987-02-12 1992-03-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Peptides with laminin activity
JPH02502156A (ja) * 1987-11-19 1990-07-19 スクリップス　クリニック　アンド　リサーチ　ファウンデーション 内皮細胞のｒｇｄ指向粘着レセプターに対するモノクローナル抗体
JPH01169343A (ja) 1987-12-25 1989-07-04 Nippon Sheet Glass Co Ltd ガラス板の切口欠点検出装置
GR1000597B (el) * 1988-01-19 1992-08-26 Judah Moses Folkman Παραγοντας αναστολης αναπτυξης και χρηση του.
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US5575815A (en) 1988-08-24 1996-11-19 Endoluminal Therapeutics, Inc. Local polymeric gel therapy
IE901736L (en) * 1989-05-17 1990-11-17 Fuller H B Licensing Financ Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion
US5686567A (en) 1989-06-16 1997-11-11 Cor Therapeutics, Inc. Platelet aggregation inhibitors
US5112946A (en) * 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5262520A (en) * 1989-12-01 1993-11-16 The Scripps Research Institute Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding
US5192744A (en) * 1990-01-12 1993-03-09 Northwestern University Method of inhibiting angiogenesis of tumors
ATE130517T1 (de) * 1990-08-08 1995-12-15 Takeda Chemical Industries Ltd Intravaskulär embolisierendes mittel mit gehalt an einem die angiogenesis hemmenden stoff.
CA2048078A1 (en) * 1990-11-15 1992-05-16 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates
JP4124480B2 (ja) * 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
WO1993020229A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 Genentech, Inc. ANTIBODIES TO ALPHAvBETA3 INTEGRIN
SK57693A3 (en) * 1992-06-18 1994-07-06 Merck Patent Gmbh Linear peptides and pharmaceutical agents on their base
UA43823C2 (uk) 1992-07-06 2002-01-15 Мерк Патент Геселлшафт Міт Бесшренктер Хафтунг ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ІНГІБУВАННЯ ІНТЕГРИН <font face="Symbol">a</font><sub>V</sub><font face="Symbol">b</font><sub>3</sub>-ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ КЛІТИННОЇ АДГЕЗІЇ КЛІТИН ССАВЦІВ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ЗАХВОРЮВАННЯ, АСОЦІЙОВАНОГО З ПОРУШЕННЯМ АДГЕЗІЇ КЛІТИН, СПОСІБ БЛОКУВАННЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ ФІБРИНОГЕНОМ ІНТЕГРИНУ, КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ЗАГОЄННЯ РАН
ATE250138T1 (de) 1992-10-29 2003-10-15 Univ Australian Angiogenese-inhibierende antikörper
AU6235294A (en) * 1993-02-02 1994-08-29 Scripps Research Institute, The Methods for producing polypeptide binding sites
DE4310643A1 (de) 1993-04-01 1994-10-06 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
ATE247980T1 (de) † 1993-11-05 2003-09-15 Centocor Inc Verwendung von an glycoprotein gpiib/iiia bindenden substanzen zur vermeidung von stenosis und restenosis
US5981478A (en) 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5753230A (en) 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US5770565A (en) 1994-04-13 1998-06-23 La Jolla Cancer Research Center Peptides for reducing or inhibiting bone resorption
DE19534177A1 (de) 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
DE19538741A1 (de) 1995-10-18 1997-04-24 Merck Patent Gmbh Cyclopeptidderivate

Also Published As

Publication number Publication date
FI121916B (fi) 2011-06-15
US5753230A (en) 1998-05-19
US7595051B2 (en) 2009-09-29
EP1468695A1 (en) 2004-10-20
AU709645B2 (en) 1999-09-02
DK0754059T3 (da) 2004-04-13
EP1410807A1 (en) 2004-04-21
US7482007B2 (en) 2009-01-27
NZ548433A (en) 2008-04-30
ES2211901T3 (es) 2004-07-16
KR100327081B1 (ko) 2002-10-18
EP1468695B1 (en) 2011-11-23
SI0754059T2 (sl) 2011-12-30
DE69532279T3 (de) 2011-11-17
HUT76086A (en) 1997-06-30
JPH10500398A (ja) 1998-01-13
US20050002936A1 (en) 2005-01-06
CZ271196A3 (cs) 1998-01-14
US7354586B2 (en) 2008-04-08
ATE490784T1 (de) 2010-12-15
ES2376850T3 (es) 2012-03-20
NO322441B1 (no) 2006-10-09
RU2162712C2 (ru) 2001-02-10
DK0754059T4 (da) 2011-09-19
NO963894L (no) 1996-11-18
NO963894D0 (no) 1996-09-17
ES2211901T5 (es) 2011-12-12
EP0754059B1 (en) 2003-12-10
DK1468695T3 (da) 2012-02-27
CZ294650B6 (cs) 2005-02-16
AU1995295A (en) 1995-10-09
US6887473B1 (en) 2005-05-03
NZ283022A (en) 2001-05-25
ZA952214B (en) 1996-02-08
PT754059E (pt) 2004-04-30
DE69532279D1 (de) 2004-01-22
EP0754059A4 (en) 1997-07-30
EP0754059A1 (en) 1997-01-22
CA2184493C (en) 2010-05-11
US5766591A (en) 1998-06-16
DE69536128D1 (de) 2011-01-20
PT1468695E (pt) 2012-02-09
JP4758281B2 (ja) 2011-08-24
FI963692A0 (fi) 1996-09-18
SI0754059T1 (en) 2004-06-30
ATE534403T1 (de) 2011-12-15
DK1410807T3 (da) 2011-03-07
US20040265317A1 (en) 2004-12-30
JP4268222B2 (ja) 2009-05-27
US7329406B2 (en) 2008-02-12
WO1995025543A1 (en) 1995-09-28
DE69532279T2 (de) 2004-09-16
EP0754059B2 (en) 2011-08-24
SK284586B6 (sk) 2005-07-01
ES2355074T3 (es) 2011-03-22
SK119096A3 (en) 1997-07-09
CN1151120A (zh) 1997-06-04
JP2006273862A (ja) 2006-10-12
KR970701564A (ko) 1997-04-12
NZ511293A (en) 2005-06-24
MX9604145A (es) 1998-05-31
HK1013960A1 (en) 1999-09-17
US20080175840A1 (en) 2008-07-24
EP1410807B1 (en) 2010-12-08
HU9602541D0 (en) 1996-11-28
FI963692A (fi) 1996-09-18
US20040258691A1 (en) 2004-12-23
HU221988B1 (hu) 2003-03-28
CA2184493A1 (en) 1995-09-28
ATE255907T1 (de) 2003-12-15
CN1161152C (zh) 2004-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA44729C2 (uk) Спосіб інгібування ангіогенезу в тканині, спосіб інгібування ангіогенезу в твердій пухлині, спосіб індукції регресії твердої пухлинної тканини, спосіб інгібування росту твердої пухлинної тканини, спосіб зменшення кровопостачання тканини, спосіб інгібування ангіогенезу у запаленій, ангіогенній тканині, спосіб лікування пацієнтів (варіанти)
US6500924B1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
CA2256543C (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
CA2227265C (en) Methods and compositions useful for inhibition of .alpha.v.beta.5 mediated angiogenesis
EA004270B1 (ru) Способы лечения множественной миеломы и индуцированной миеломой резорбции костей с помощью антагонистов интегрина
US7053041B1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of αvβ5mediated angiogenesis
US20030176334A1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis