JPH02502156A - 内皮細胞のｒｇｄ指向粘着レセプターに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内皮細胞のＲＧＤ指向粘着レセプターに対するモノクローナル抗体 （技術分野） 本発明は内皮細胞のＲＧＤ指向粘着レセプタ（ＥＣｒ）と免疫反応し、それによ りＲＧＤ含有含有マトリクスタンパ上質ビトロネクチンィブリノーゲン及びフォ ノ・ビルブランド因子への内皮細胞の細胞を阻害するモノクローナル抗体に関す る。また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を、亜内皮マトリクスへの内 皮細胞の粘着を阻害し、それにより腫瘍生育を調節するのに用いる治療法に関す る。

（音量） 細胞粘着は、新しい腫瘍組織の形成及び導管化に役割を果しているので腫瘍成長 における重要な過程である。それゆえ、細胞粘着を阻害する試薬は腫瘍成長の阻 害を目的とした治療に使用し得る。

一般に細胞粘着には、細胞表面レセプターによる特異的粘着タンパク質の認識が 関係している。該細胞表面レセプターは、構造の一部としてトリペプチドアミノ 酸残基配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を有する部位を介してマトリクス タンパク質に特異的に結合する。Ｆ７＆レセプターはこの分野でＲＧＤ指向粘着 レセプターとして知られている０個々のＲＧＤ指向粘着レセプターの結合特異性 は、ＲＧＤ）リペプチドが存在する構造環境に依存する。

さらにＲＧＤ指向粘着レセプターは、非共有結合的に会合するα及びβサブユニ ットから成ることを特徴とする。すなわち、これらはへテロニ量体タンパク質複 合体である０代表的ＲＧＤ指向粘着レセプターにはビトロネクチンレセプター、 フィブロネクチンレセプター及びｃｐｎｂ−１ａがあり、これら全てはサブユニ ット組成及び特異的に結合するタンパク賞に基づいて区別し得る。

本発明においては、チェレフシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）等によって最初に発見され （ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ、）　２６２　：１４３４−３７　（１９８７）　）、ＥＣｒと命名された ＲＧＤ指向粘着レセプターが特に興味深い、チェレフシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）等 によるとＭ２１細胞から単離したＥＣｒは、ラウリル硫酸ナトリウムポリアクリ ルアミドゲル電気泳動＜５ＯＳ−ＰＡＧＥ）分析により、還元条件で各々約１３ ０キロダルトン（ｋＤａ）及び１０５ｋＤａの分子量を有するα及びβサブユニ ットから成るヘテロニ量体である。

ＥＣｒと免疫反応し得る２つのモノクローナル抗体が本発明者、デビンド・チェ レフシュ博士により生産され、１９８６年１２月、米国細胞生物学会部会で報告 された。ＬＭ６０９と命名された、これらのモノクローナル抗体のうちの１つが 、Ｍ２１細胞によるフィブリノーゲン、ビトロネクチン及びフォノ・ビル、ブラ ンド因子へ結合を阻害し得ることがチェレフシュによって報告された。

このようにＥＣｒはアミノ酸残基配列の一部としてＲＧＤを含むフィブリノーゲ ン、ビトロネクチン及びフォノ・ビルプラント因子へのＭ２１の粘着を調節する ようである。

最近、ＥＣｒはヒトのヘソ静脈内皮（ＨＵ　Ｖ　Ｅ）細胞表面にも存在すること が報告された。この知見を指示する証拠には少なくとも２つの要素があり、この ことは１９８７年２月フィブロネクチン及び関連タンパク賞に関するゴートン（ Ｇｏｒｄｏｎ）会議でチェレフシュ（Ｃｈｅｒｅｉｂ）により報告された。第１ に、モノクローナル抗体ＬＭ６０９は、Ｍ２１細胞２１から単離したＥＣｒとは 区別し得る分子量を有するα及びβサブユニットを含む、ＨＵＶＥ細胞表面のへ テロニ量体ＲＧＤ指向レセプターと免疫反応する。第２に、モノクローナル抗体 ＬＭ６０９はＨＯＶＥ細胞と免疫反応し、それによりフィブリノーゲン、ビトロ ネクチン及びフォノビルブランド因子へのその結合を阻害する。このことはＬＭ ６０９により認識される、ＨＵＶＥＩｉ胞表面のＲＧＤ指向レセプターは、ＥＣ ｒと同じリガンド特異性（マトリクスタンパク賞結合性）を有する。

ＲＧＤ指向粘着レセプターに対するモノクローナル抗体を用いた、フィブリノー ゲン、ビトロネクチン及びフォノ・ビルブランド因子に対するＨＵｖＥ細胞粘着 の阻害能もシャ口（Ｃｈａｒｏ）等（ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミ ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、）、２６２：９９３５−３８　（１９Ｂ？））により報告された。シ ャ口（Ｃｈａｒｏ）等によると、ヒト血小板上に存在するＲＧＤ指向粘着レセプ ター、ｃｐｎ　　Ｈａに対して作成した７Ｅ３と命名するモノクローナル抗体は ＧｐＴｉａ−１１１ｂのみならず各々約１３０ｋＤａ及び１０５ｋＤａの分子量 を有するα及びβサブユニット、すなわちＥＣｒと同様の分子量を有するが、Ｇ ｐｎａ−ｍｂと区別し得る分子量を有するサブユニットからなるＨＯＶＥ細胞上 のへテロニ量体ＲＧＤ指向粘着レセプターにも免疫反応し得た。

したがって、ＥＣｒ及びＧｐＩＩｂ−Ｈａは、少な（とも１つの免疫的交叉反応 性のエピトープを共有しているらしい。

またモノクローナル抗体７Ｅ３がＨＤＶＢ細胞と免疫反応し、かつそれらのフィ ブリノーゲン及びフォノビルブランド因子を含む基質への粘着を阻害し、並びに 、それらのビトロネクチンへの粘着及びビトロネクチン上での拡散を部分的に阻 害し得ることがシャ口（Ｃｈａｒｏ）等により示された。このことは、ＨＵＶＥ 細胞上で７Ｅ３によりＵｌ議されるレセプターがＥＣｒと同様のマトリクスタン パク質結合様式を有することを示している。

（本発明の概要） 本発明は、ＨＵＶＥＵＶ上に存在するＥＣｒと免疫反応し、それにより該細胞が ビトロネクチン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子と粘着するのを阻 害する抗体分子を含むモノクロ−抗体はＡＴＣＣ名ＨＢ９５３７のバイプリドー マから生産される抗体であることが望ましい。

従って、本発明は、ＨＵＶＥＵＶ上に存在するＥＣｒと免疫反応し、それにより ビトロネクチン、フィブリノーゲン及びフォンビルブランド因子に対して該細胞 が粘着するのを阻害する抗体分子を産生ずるハイプリドーマに関する。

また、本発明は、検体中の腫瘍成長を阻害する方法に関する。

本方法は、医薬的に許容し得る賦形剤中にＨＵ　Ｖ　Ｅｔｉ！ｉ胞上に存在する ＥＣｒと免疫反応し、それにより、ビトロネクチン、フィブリノーゲン及びフォ ンビルブランド因子に対して該細胞が結合するのを阻害する抗体分子を含む、治 療効果量のモノクローナル抗体を投与することを含む。

さらに、本発明は、身体サンプル中のＥＣｒを検定する方法に関する０本方法は 、検定する身体サンプルと本発明のモノクローナル抗体を混合することにより免 疫反応混合物を生成することを含む、この混合物を、サンプル中に存在するＥＣ ｒがモノクローナル抗体と免疫反応して、ＥＣｒ−抗体免疫反応産物を生成する のに十分な時間保持する。こうして生成したＥＣｒ−抗体免疫反応産物の検定は サンプル中のＥＣｒを検出する手段を提供する。

さらに、本発明は、検体中のＥＣｒをインビボで検定する方法に関する０本方法 は、インビボ指示手段に結合し、かつ生理学的に許容し得る賦形剤中に分散され た、診断に動量的な量の本発明のモノクローナル抗体を検体に静脈注射で投与す ることを含む、その後、検体を投与したモノクローナル抗体がインビボで検体中 に存在するＥＣｒと免疫反応し、免疫反応産物を生成するのに十分な所定の時間 維持する。こうして検体中に生成した免疫反応産物の存在、及び好ましくはその 位置を検定することは、インビボにおいてＥＣｒの存在を検出する手段を提供す る。

また、本発明は、本検定法に有用なキット型の診断システムに関する６本システ ムには、少なくとも１回の検定を行うのに十分な量の本発明のモノクローナル抗 体を含む容器が含まれている。

このように本発明にはいくつかの利点及び長所がある０本発明により提供される １つの利点は、本モノクローナル抗体が身体サンプル並びにインビボ検体中のＥ Ｃｒタンパク質の存在を検出する手段を提供することである。さらに、本発明の モノクローナル抗体はＥＣｒ含有細胞がビトロネクチン、フィブリノーゲン及び フォンビルブランド因子と粘着するのを阻害するため、本発明は腫瘍細胞増殖を 阻害する治療組成物を提供する。

本発明により提供される長所は、本発明のモノクローナル抗体がＥＣｒにはある が、ＶＮｒ又はＦＮｒにはない特異性を有することに由来する。従つて、身体サ ンプル並びにインビボにおけるＥＣｒの存在を検出する本方法は、ＥＣｒを、Ｖ Ｎｒ又はＦＮｒなどその他のＲＧＤ指向粘着レセプターとうまく区別し得る。さ らに、本モノクローナル抗体の免疫反応特異性は、細胞粘着阻害効果を、ＥＣｒ 保有細胞のみに制限する。

（図面の簡単な説明） 第１図は、ハイプリドーマＬＭ１４２又はＬＭ６０９により産生される抗体分子 を含むＥＣｒ特異的モノクローナル抗体を用いて、のオートフルオログラムを示 している＊　ＥＣｒを含むＭ２１細胞タンパク質は、５ｓＳ−メチオニンで１０ 分間、Ｍ２１細胞培養物をパルスラベルし、ついで０時間、すなわち０時間細胞 （レーンＡ及びＣ）、又は８時間（レーンＢ及びＤ）、非ラベル化し一メチオニ ンをチェイスすることにより　２％Ｓ−メチオニンラベルした。

この免疫反応物を例４で説明するように７．５％ポリアクリル了ミドゲルを用い 還元状態で電気泳動した。

レーアＡで示されるように、Ｍａｂ　　ＬＭ１４２は、先に、Ｍ２１細胞ＥＣｒ αサブユニットに対する生合成前駆体であることが示されている分子量約１６０ ｋＤａのタンパク質と免疫反応する。チェレッシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）等、ジャ ーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、 ）　、２６２　：　１４３４−３７　（１９８７）参照、メチオニン追加８時間 後、レーンＢは、ＥＣｒは、ＭａｂＬＭ１４２と手段反応し、かつ各々１３０ｋ Ｄａ及び１０５ｋＤａのα及びβサブユニットを含むことを示している。レーン Ｃ及びＤに示されている同様の結果が、Ｍａｂ　　ＬＭ６０９を用いて得られた 。

第２図は、５種のマトリクスタンパク質又はペプチドＧＩＩＧＰＳＰＣ（粘着物 質）のうちの１つでコートしたマイクロプレートウェルへの、Ｍ２１細胞の粘着 速度に関するＭａｂ　　ＬＭ６０９の効果をグラフで示す６枚のパネルを含んで いる。まず、３Ｈ−ロイシンラベルしたＭ２１細胞を各Ｊｒ０．０５＠／ｍＡの Ｍａｂ　　ＬＭ６０９（０）又は非対応抗体Ｍａｂ　　Ｗ６／３２　（０）と免 疫反応させた。

それから、この抗体処理した細胞（Ｍａｂ−細胞免疫反応産物）をコーティング したウェル中にブレーティングし、ついで例５で説明しているように、指示した 時間これを維持して、細胞をウェルに粘着させる。その結果は、結合した細胞総 数が指示した時間後種々のマトリクスタンパク質に結合した分当りの計数（ｃｐ ｓ　Ｘ１０−’）で表わされる細胞中のラベル量の関数となることから、結合細 胞数として表わされる。各点は５回の測定の平均値上標準偏差を示している。下 の三つのパネルは、Ｍａｂ　　ＬＭ６０９がＭ２１と免疫反応し、かつ非対応Ｍ ａｂ　　Ｗ　６　／　３２とは反対にＭａｂ　　ＬＭ６０９について検出される Ｃｐ−値が低いことから証明されるように、左から右に、フォンビルブランド因 子、フィブリノーゲン及びペプチドＧＲＧＤＳＰＣへの、Ｍ２１細胞の粘着を有 意に阻害することを示している。

第３図は、例６で説明しているように、ＧＰＧＤＳＰＫ−セファロースアフィニ ティーカラムで単離したＨＵＶＥ細胞ＥＣｒ（精製Ｅ　Ｃｒ）の溶出プロフィー ルを共に示す、下方のグラフ及び上方のオートフルオログラムからなる合成図で ある。タンパク質を５ＳＳ−メチオニンで代謝的にラベルしたＨＵＶＥ細胞のオ クチルクリコシド抽出物をＧＲＧＤＳＰＫ−セファロースアフィニティー７トリ クスに通し、その中に存在するＲＧＤ指向粘着レセプターをマトリクスに結合さ せる。その後まず、このマトリクスを１■／ｌｓｌのペプチドＧＲＧＥＳＰを含 む溶出バッファで洗浄し、溶出するフラクション１〜１０を採取し、ついでペプ チドＧＲＧＤＳＰを含む溶出バッファを用いてフラクション１１−２０を採取す る。

このグラフは、液体シンチレーションカウンターを用いて、各フラクションの５ ０μ！部分標本中に存在する放射能の分当りの計数（ｃｐｓ）を測定することに よって得た５ＳＳ−メチオニンラベル化タンパク質の溶出プロフィールを示して いる。矢印は、アフィニティーカラムに、指示したペプチドを含む溶出バッファ を流し始めたときのフラクションを示している。

オートフルオログラムは、還元条件下、７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳 動で分析したときのラベル化抽出物の泳動プロフィールを示している。オートラ ジオグラムは、数字と対応しているので、ゲルのレーンは、電気泳動用の５０ｇ １部分標本が由来する溶出フラクシ曹ンの真上に示されている。各々α（上）及 びβ（下）サブユニットを表わす、フラクション１４〜１８中に存在する２つの タンパク質バンドの見かけの分子量はキロダルトンで表わされている。

第４図は、ＨＵＶＥ細胞由来のＥＣｒと免疫反応する、ＭａｂＬＭ６０９（レー ンＡ）　、Ｍａｂｌ　４２　（レーンＢ）及び非対応Ｍａｂ９．２．２７　（レ ーンＣ）の能力を分析するのに用いた７、５％ポリアクリルアミドゲルのオート フルオログラムを示している。

レーンＡ及びＢで示されているように、ＬＭ６０９及びＭａｂ　１４２は各々Ｅ Ｃｒと免疫反応し、各々約１３５ｋＤａ及び１１５ｋＤａの分子量を有するＥＣ ｒα及びβサブユニットを含む免疫反応度物を生成する。レーンＣにタンパク質 が検出されなかったことは、非対応Ｍａｂ９．　２．　２７　（ネガティブ・コ ントロール）がＥＣｒと免疫反応しなかったことを示している。

レーンＡ及びレーンＢに示されているように、Ｍａｂ　　ＬＭ６０９及びＭａｂ 　　ＬＭ１４２の各々は、各々分子量約１３５ｋＤａ及び１１５ｋＤａのα及び βサブユニットから成る内皮ＥＣｒヘテロニ量体複合体と免疫反応する。非対応 抗体９．２．２７は、精製ＥＣｒと免疫反応しない。

第５図は、種のマトリクスタンパク質（粘着物質）に対するＨＵＶＥ細胞の粘着 速度に関するＭａｂ　　ＬＭ６０９の効果を説明するグラフを含む一連の８枚の パネルである。まず、３Ｈ−ロイシンラベルした内皮細胞を０．０５■／■ｌの Ｍａｂ　　ＬＭ６０９（Ｏ）、非対応Ｍａｂ　　Ｗ６／３２　（０）又は生育培 地のみ（）と免疫反応させ、過剰の抗体を洗浄してから、マイクロプレートにブ レーティングした後指示した時間維持して、例８に説明しであるようにマイクロ プレートのウェル上にコーティングしたマトリクスタンパク質に粘着させた。使 用したマトリクスタンパク質はフィブリネクチン（Ａ）、コラーゲンＮ　（Ｂ） 　、ラミニン（Ｃ）、ビトロネクチン（Ｄ）、ＧＲＣ；ＤＳＰＣ（Ｅ）　、フォ ノ・ビルブランド因子（ｖＷＦ）、プールＩ　（Ｆ）　、ｖＷＦ、ブールＩＩ　 （Ｇ）及びフィブリノーゲン（Ｈ）である。

その結果は、第２図と同様の様式で表わされている。

パネルＤ−Ｈは、Ｍａｂ　　ＬＭ　６　Ｇ　９がＨＵＶＥ細胞と免疫反応し、か つ、Ｍａｂ　　ＬＭ　１４２又は非対応ＭａｂＷ６／３２（ネガティブ・コント ロール）とは対照的に、Ｍａｂ　　ＬＭ６０９での処理後の結合する細胞数の減 少から証明されるように、粘着物質ビトロネクチン、フォノビルブランド因子、 フィブリノーゲン及びペプチドＧＲＧＤＳＰＣへのＨＵＶＥ細胞の粘着を有意に 阻害することを示している。

第６図は、アミノ末端の最初の残基を残基１として始まり、左から右にアミノ末 端からカルボキシ末端の方向で、−文字コードを用いて表わされたＭ２１細胞Ｅ Ｃｒタンパク賞のアミノ末端領域の部分的アミノ酸残基配列を示している。ＥＣ ｒの両α及びβサブユニットのアミノ酸残基配列は、例９で説明されているよう に決定した。また、ビトロネクチンレセプターαサブユニット〔ギンスバーグ（ Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　、２６２　：　５４３７−４０（１９８７）） 、ビトロネクチンレセプターβサブユニット〔タナ力（Ｔａｎａｋａ）等、プロ シーディング・イン・ナシッナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　。

１土＝３２３９−４３　（１９８７））、血小板ｃｐｎｂαサブユニット〔ポン ス（Ｐｏａｃｚ）等、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｗ、）　、１１１：　８４７６−８２（１９８７））及び 血小板ＧｐＨａβサブユニットの相同領域の配列も示した。２個の異なるアミノ 酸残基がＥＣｒのαサブユニットの残基位置６．７及び１６番及びβサブユニッ トの５及び１６番に発見された。その他の残基は、発見された位置の直ぐ上に示 した。このデータは、ＥＣｒがビトロネクチンレセプターと領てはいるが同じで はないことを示している。

第７図は、例１０で説明されているようにＥＬ　Ｉ　ＺＡ検定法を用いて測定し た種々の型のＩＩＴＩｊ細胞と、５個のＭａｂの各々との免疫反応性を示す棒グ ラフである。使用したＭａｂには、ＥＣｒ指向のＬＭ１４２及びＬＭ６０９；血 小板ＧｐＵｌａβサブユ＝７ト指向のＡＰ３：フィブロネクチンレセプターβサ ブユニツト指向のＬＭ５°４３；及びヒト組織適合性抗原指向のＷ６／３２が含 まれる。”ＬＭ６０９”の下のパネルに示されているように、Ｍａｂ６０９は、 次に示す細胞系列；Ｍ２１、Ｍ１６Ａ、ＭｌＢ、Ｍ１４、Ａ３７５ＭＭ、メラー （Ｍｅｌｕｒ）及びＷＭ２６６と有意に免疫反応する（＞０．１　０．Ｄ、４９ ｇ）、　”　ＬＭＩ　４２　’の下では、Ｍａｂ　　ＬＭ　１４２が、次に示す 細胞系列；Ｍ２１、Ｍ１６Ａ。

ＭｌＢ、Ｍ１４、Ａ３７５Ｐ、Ａ３７５ＭＭ、メラー（Ｍｅｌｕｒ）、ＷＭ２６ ６、ＷＭ２３９ａ、５Ｋ−Ｎ−ＡＳ％ＵＣＬＡ　　Ｐ３、Ｔ２９１．バクレ（Ｂ ａｃｂｌｅ）　、５ＣＬ−１１８５、：ｌ　ｏ　（Ｃｏｌｏ）３５７　ＦＧ及び Ｕ８７　　ＭＧと有意に免疫反応することが示されている。

第８図は、Ｍａｂ　　ＬＭ　１４２　（パネルＡ）　、　Ｍａｂ　’ＬＭ６０９ （パネルＢ）及びＭａｂ　　ＡＰ３　（パネルＣ）により認識される決定基が複 合体依存であるか否かを決定するため、実験で生成した免疫反応物を分析するの に用いた７、５％ポリアクリルアミドゲルのオートフルオログラムを示している 。パルス−チェイスサンプリング時間は、パネルＢ及びＣの上に分（′）で示さ れている。

サンプリング時間は、パネルＢの真下に示されているパネルに対してもパネルＡ と同様の時間が対応している。

パネルＡにおいて、Ｍａｂ　　ＬＭ１４２は、０時間から２４０分（２４０’） の範囲の時間間隔でｉＩｉ製したＭ２１細胞パルス−チェイス溶解物と免疫反応 させた時、約１６０ｋＤａのＥＣｒαサブユニット前駆体を含む免疫反応産物を 生成することが示されている。

約１２０分（１２０’）のチェイスの後、Ｍａｂ　　ＬＭ　１４２は、各々α及 びβサブユニットに対応する１３０ｋＤａ及び１０５ｋＤａのタンパク質を含む 免疫反応産物を生成した。Ｍａｂ　　ＬＭ１４２はＥＣｒのαサブユニット指向 性であり、かつ複合体非依存性決定基と免疫反応する能力を有することを特徴と する。

パネルＢにおいて、Ｍａｂ　　ＬＭ６０９は、パネルＡと同様のＭ２１細胞パル ス−チェイス溶解物を免疫反応させた時、αサブユニット前駆体を含む免疫反応 産物を生成することが示されている。まずこの前駆体は、０時間後約５分間のチ ェイスで出現し、以後２４０分のチェイス時間まで検出される。また１２０分チ ェイス後、Ｍａｂ　　ＬＭ６０９は、パネルＡで示したＭａｂ　　ＬＭ１４２を 用いた時に検出されたものと同じ１３０ｋＤａ及び１０５ｋＤａのタンパク質を 含む免疫反応産物を生成した。　Ｍａｂ　　ＬＭ６０９は、ヘテロニ量体複合体 ＥＣｒ指同性であり、かつ複合体依存性決定基と免疫反応する能力を有すること を特徴とする。

パネルＣにおいて、ＭａｂＡＰ３は、パネルＡと同様のＭ２１細胞パルス−チェ イス溶解物を免疫反応させた時、αサプユニフト前駆体及び１０５ｋＤａβサブ ユニツトタンパク質の両方を含む免疫反応物を生成した。前駆体及び１０５　ｋ Ｄａのタンパク質の各々は約１０分間（１０’　）のチェイス後に出現し、１２ ０分（１２０’）のチェイス期間まで持続する。Ｍａｂ　　ＡＰ３は血小板糖タ ンパク買ｍａ指向性であるがｓ　ＥＣｒのβサブユニツト上に存在する決定基と も免疫反応することが示された。

（本発明の詳細な説明） Ａ、定義 アミノ酸：ここで同定される全てのアミノ酸は、天然に存在するＬ型である。標 準的ポリペプチド命名法に従かい（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス トリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ銅、）２４３：３５５７−５９　（１９６９）） 、アミノ酸残基の略号を、以下の対応表に示した。

対応表 記号　　　　　　　　　　　　　　　アミノ酸−文字　　　　三文字 Ｙ　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　Ｌ−チロシンｃ　　　　　　Ｇ１７　　　　 　　グリシンＦ　　　　　　Ｐｈｅ　　　　　Ｌ７フエニルアラニンＭ　　　　 　　Ｍｅｔ　　　　　　Ｌ−メチオニンＡ　　　　　　Ａｌａ　　　　　　Ｌ− アラニンＳ　　　　　　Ｓｅｒ　　　　　　Ｌ−セリンＩ　　　　　　ｌｉｅ　 　　　　　Ｌ−イソロイシンＬ　　　　　　Ｌｅｕ　　　　　　Ｌ−ロイシンＴ 　　　　　　Ｔｈ−ｒ　　　　　　Ｌ−スレオニンＶ　　　　　Ｖａｌ　　　　 　　Ｌ−バリンｐ　　　　　　　ｐｒｏ　　　　　　　Ｌ−プロリンＫ　　　　 　　Ｌｙｓ　　　　　　Ｌ−リジン）ｉ　　　　　　１（ｉｓ　　　　　　Ｌ− ヒスチジンＱ　　　　　　Ｇｉｎ　　　　　　Ｌ−グルタミンＥ　　　　　　Ｇ ｌｕ　　　　　　Ｌ−グルタミン酸Ｗ　　　　　　Ｔ　ｒ　ｐ　　　　　　　Ｌ −トリプトファンＲＡｒｇ　　　　　　Ｌ−アルギニン Ｄ　　　　　　ＡｌＩ３）　　　　　　Ｌ−アスパラギン酸Ｎ　　　　　　Ａｓ ｎ　　　　　　Ｌ−アスパラギンＣＣｙｓ　　　　　　Ｌ−システィン Ｘ　　　　　　　　　　　　　未同定残基全てのアミノ酸残基配列は、左から右 に、従来のアミノ末端からカルボキシ末端の方向で示した一般式で表わされるこ とに注意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の初め又は終りにあるダッシ ュは、ポリペプチド鎖総計約５０残基までの範囲内で、１つ以上のアミノ酸残基 の配列に続く結合を示している。

ポリペプチド及びベブチド：ポリペプチド及びペプチドは、隣接するαアミノ基 及びカルボキシル基間のペプチド結合により互いに連結する、多くとも約５０個 の鎖状アミノ酸残基を意味して、互いに同義的に用いられる語である。

タンパク質：タンパク質はポリペプチドと同様、互いに連結する５０残基以上の 鎖状アミノ酸を意味して用いられる語である。

Ｂ、モノクローナル抗体組成物 種々の文法型の“抗体”という語は、免疫グロブリン分子及び、又は免疫グロブ リン分子の免疫学的活性領域群、すなわち、抗体結合部位又はバラトープを含む 分子群を意味する集合名詞として用いられる。

°抗体結合部位”は、特異的に抗原を結合する重鎮及び軽鎖の可変及び超可変領 域を含む抗体分子の構造領域である。

種々の文法型の“抗体分子”という語句は、本来の免疫グロブリン分子及び免疫 グロブリン分子の免疫学的活性領域の両方に関する。

代表的抗体分子には、本来の（Ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリン分子、実質的に本 来の免疫グロブリン分子及び当分野でＦ　ａｂｓ　Ｆ　ａｂ　’、Ｆ（ａｂ’） ｚ及びＦ　（ｖ）として知られている領域を含む、パラトープを含有する免疫グ ロブリン分子の領域がある。

抗体のＦｅｂ及びＦ（ａｂ’）ｘｓＩ域は、従来法により、実質的に本来ノ抗体 の、各々パパイン及びペプシンによるタンパク質分解反応で調製する０例えば、 セオフィロポラス（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ）及びディクソン（Ｄｉｘｏ ｎ）の米国特許第４．３４２．５６６号参照、また、Ｆａｂ’抗体領域もよく知 られており、これはメルカプトエタノールなどにより、２本の重鎮を結合するジ スルフィド結合を還元し、ついでヨードアセトアミドなどの試薬で生成したタン パク質メルカプタンをアルキル化することにより、Ｆ（ａｂ’）ｇｔｄ域から生 成する０本来の抗体分子を含む抗体が好ましいので、ここでは例としてこれを用 いる。

種々の文法型の°モノクローナル抗体°という語句は、決定された（既知の）抗 原特異性ををする一種の抗体分子群を意味する。

モノクローナル抗体には、特定の抗原と免疫反応し得る１種の抗体結合部位のみ が含まれ、従って一般的にその抗原に対して単一の結合アフィニティーを示す、 それゆえ、モノクローナル抗体は、異なる抗原に各々免疫特異性をもつ２つの抗 体結合部位を有する二特異的抗体分子も含まれる。

本発明のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、検出範囲内でここでＥＣｒと呼ばれ ているＲＧＤ指向粘着レセプターと免疫学的に結合（免疫反応）し得る、唯一種 の抗体結合部位を含むことを特徴とする。従って、一般的に本発明のモノクロー ナル抗体中に存在する抗体分子は、たとえＥＣｒ以外のタンパク質を結合し得る 抗体結合部位を含んでいたとしてもＥＣｒに対して単一の結合アフィニティーを 示す。

本発明のモノクローナル抗体は、さらに、以下に説明するビトロネクチンレセプ ター（ＶＮｒ）又はフィブロネクチンレセプター　（ＦＮｒ）と免疫反応する抗 体分子を実質的に含まないことを特徴とすることが望ましい、すなわち、本発明 のモノクローナル抗体は、免疫学的検定操作の限度内で、単離型で又はこれらレ セプターのいずれか１．又は両方を発現する細胞の溶解物中に存在するＶＮｒ又 はＦＮｒと免疫反応しない０両ＶＮｒ及びＦＮｒは当分野でよく知られているも のであり、また、ＡＴＣＣＣＲＬ１４２７という名称で、アメリカンタイプカル チャーコレクシラン（ＭＤ州、ロックビル）から入手し得るヒトオステオザルコ ーマ（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏ＋＊ａ）細胞系列から従来法で単離し得る０例えば 、ビテラ（Ｐｙｔｅｌａ）等、セル（Ｃｅｌｌ）　、工０：１９１−８　（１９ ８５）及びビテラ（Ｐｙｔｅｌａ）等、プロシーディング・イン・ナシヨナル・ アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＞ＵＳＡ。

工２：５７６６−７０　（１９８５）参照。

さらに、本発明のモノクローナル抗体中に存在する抗ＥＣｒ抗体分子は、ＨＵＶ Ｅ細胞、ウシ大動脈内皮（Ｂ　Ａ　Ｅ）細胞、ヒヨコ胎児内皮（ＣＥＥ）細胞な どの内皮細胞と免疫反応し、かつそれによりビトロネクチン、フィブリノーゲン 、フォンビルブランド因子又はアミノ酸残基配列ＣＰＣＤＳＰを有するヘキサペ プチドを特徴とすることがさらに好ましい、すなわち、本発明のモノクローナル 抗体は、ＥＣｒが内皮細胞表面に存在するとき、ＥＣｒと免疫反応しビトロネク チン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子又はヘキサペプチドＧＲＧＤ ＳＰに結合しない細胞−抗体複合体を形成する。

さらに、本発明のモノクローナル抗体中に存在する抗ＥＣｒ抗体分子は、ＥＣｒ 上に存在する複合体依存決定基とは免疫反応する能力ををするが、α及びβサブ ユニットがＥＣｒヘテロニ量体として会合していない場合、これらいずれかのサ ブユニントには免疫反応し得ないことを特徴とすることが好ましい。

°抗原決定基”又は“決定基”とは、抗体結合部位が結合する抗原の構造部分で ある。決定基は、それが非共有結合的に会合するα及びβサブユニットから成る ＥＣｒヘテロニ量体複合体上に存在するとき１複合体依存性”であり、一方サブ ユニットがへテロ二量体に会合していないときのα又はβサブユニツト上に存在 する場合は、複合体依存性ではない。

本発明の好ましいモノクローナル抗体には、ハイブリドーマＬＭ６０９　（ＡＴ ＣＣＨＢ９５３７）から産生され得る抗体、すなわちモノクローナル抗体ＬＭ６ ０９　（Ｍａｂ　　ＬＭ６０９）が含まれる。したがって、本発明のモノクロー ナル抗体を産生ずる好ましい方法には、ハイブリドーマＬＭ６０９の使用が含ま れるが、他方本発明のモノクローナル抗体はその他の従来法によっても産生し得 ることが理解されよう、これらの方法には、ハイブリドーマＬＭ６０９により産 生されるものと機能的に等価な抗ＥＣｒ抗体分子を産生ずる、細胞融合により生 成したハイブリドーマ又はその他の細胞、好ましくは、ハイブリドーマＬＭ６０ ９により産生される抗体ＥＣｒパラトープと免疫学的に交叉反応するパラトープ を有する抗ＥＣｒ抗体を産生ずるハイブリドーマの使用が含まれる。また、これ らの方法には、ハイブリドーマＬＭ６０９に存在する抗ＥＣｒ抗体重又は軽鎖可 変領域コード化ＤＮＡ配列と相同的な免疫グロブリン重又は軽鎖可変頭載コード 化ＤＮＡ配列を含む細胞の使用が含まれる。従って、本発明は、ハイブリドーマ ＬＭ６０９の使用を通して産生される本発明のモノクローナル抗体と機能的に等 しいモノクローナル抗体に関する。

本発明のモノクローナル抗体は、先に説明した免疫特異性を有する抗体分子を分 泌する、ハイブリドーマＬＭ６０９などの本発明のハイブリドーマを含む栄養培 地のモノクローナルハイブリドーマ培養を始めることにより生産し得る。

この培養を、バイプリドーマが培地中に抗体分子を分泌するのに十分な条件下か つ十分な時間維持する。その後、抗体分子含有培地を採集する。さらに、この抗 体分子は従来技術を用いて単離し得る。

これら組成物の調製に有用な培地は当分野ではよく知られており、かつ市販され ており、また、これには合成培養培地、近文系マウスなどが含まれる。代表的合 成培地には、４．５　ｇ　／　１グルコース、２０ｍグルタミン及び２０％ウシ 胎児血清を補ったダルベツコ最小基礎培地（ＤＭＥＭ：ダルベ−）　ニア　（Ｄ ｕｌｂｅｃｃｏ）等、ピロロジー（Ｖｉｒｏｌ、＞　８　：　３９６　（１９５ ９）　）がある。代表的近文系マウス株はＢａ１ｂ／ｃである。

上記方法で生産したモノクローナル抗体は、例えばＥＣｒ含有免疫反応産物の生 成を目的とする診断及び治療に用い得る。

Ｃ，ハイブリドーマ 本発明のハイブリドーマはＥＣｒと免疫反応し得るモノクローナル抗体（Ｍａｂ ）を産生ずることを特徴とする。好ましいハイブリドーマは実質的にＶＮｒ又は ＦＮｒと免疫反応しない抗体を含まないＭａｂを産生ずる。本発明のハイブリド ーマはＨＵＶＥ細胞、ＢＡＢ細胞、ＣＥＥ細胞などと免疫反応するＭａｂを産生 じ、それによりビトロネクチン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子又 はアミノ酸残基配列ＧＲＧＤＳＰを有するヘキサペプチドに対するこれらの細胞 の粘着を阻害し得ることを特徴とすることがより好ましい。さらに、ハイブリド ーマはＥＣｒ上に存在する複合体依存性決定基と免疫反応し得ることを特徴とす ることがより好ましい。

望ましい免疫特異性を有する、すなわち特定のタンパク買上の同定し得るエピト ープと免疫反応し得る抗体分子を分泌するハイブリドーマを産生ずる方法は、当 分野でよく知られている。特に、参考としてここで引用する、ガルフレ（Ｇａｌ ｐｒｅ）等（メソッド・イアーエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｗｏｌ 、）　、７３　：　３−４６（１９８１））のハイプリドーマ技術を使用し得る 。ＰＪ単に言うと、本発明のモノクローナル抗体を産生じ得るバイプリドーマを 作成するため、ミエローマ又は、他の自己増殖細胞系列を免疫効果量のＥＣｒで 高度免疫化したホ乳類の′ｎ臓から得たリンパ球と融合する。

ミエローマ細胞系列は、リンパ球と同種由来であることが好ましい、一般的に、 マウス１２９ＧＩＸ−が好ましいホ乳類である。

本発明で使用するのに通したマウスメラノーマには、各々ＣＲＬ１５８０及びＣ ＲＦ１５８１という名称でＭＤ州コロツクビルアメリカンタイプカルチャーコレ クシランから入手し得るヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン惑受性（Ｈ ＡＴ）細胞系列Ｐ　３　ｘ　６３−Ａｇ８．６５３及びＳｐ２１０−Ａｇ１４が 含まれる。

一般的に牌細胞はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　２０００を用いてミエロ ーマと融合する。融合したハイブリドーマはＩＩＡ丁に対する感受性で選択する ０本発明のモノクローナル抗体を産生じ得るハイブリドーマは、例２で説明され ているスクリーニング法で同定される。まず、ＨＡＴで選択したハイブリドーマ 由来の培養上清をＭ２１細胞と免疫反応し得る抗体分子の存在に関してＥＬ　Ｉ 　ＺＡ法でスクリーニングする０Ｍ２１細胞と免疫学的に結合し得る能力を有す る抗体分子を産生ずるハイブリドーマを確保し、さらにこれらを例５の粘着検定 法を用いて、ＥＣｒ含有細胞のブトロネクチンへの粘着を阻害し得る抗体分子を 産生ずる能力についてスクリーニングする。この検定で粘着阻害抗体分子を産生 ずるハイブリドーマを本発明のハイブリドーマとして確保する。

さらに、本発明の好ましいハイブリドーマを、例１２で説明する方法を用いて、 ＥＣｒヘテロニ量体複合体上に存在する複合体依Ｉ４．へ決”、、ｉ’、ｉｌｌ ’、”　Ｍ　２ＨＭ：、　！’Ｊ：　５ｉ　、１Ｐ１Ｋ　・ｌ”””Ｓ　能力ｊ ：二＝３に、’＊　’）：：f：Ｘ　ニア　ＩＩ　〜＝　：／’／”！、２〉、 。

好、１．１．、、、、いハ・１“７すＶ−？ｌは１９８　”ｌに勺−ｙ１目１． 　！１Ｂ、°、′１“り゛°ベス１１＃、、’ｉｉｌ：’　Ｉ：’、’、’、　 、Ｊｌｋ　””’、’、３　’Ｉ）へ・１＼′：ｈ：”　（Ｉｌｌ　（“、；） 、ニザ・；禾士鼾■P目ル９　Ｊ　＊じ？ぐζ１ ノ”すＶ７１．、、１１１４ｂＯ９”ＱＪ５′；、１、１１、ｉ’；ｌｉ　ｔｋ 　：’ｌ）、）ｌ　（：、Ｔ’治療＄（１　１１５：物本Ｒ　ｊＪ）１　（！３ 　’Ｃ：　、、、Ｉ　・７　ｕ　〜．Ｊ片・抗体はイ゛／ビボＣＥｃｒ，Ｆビト （］ネクア゛／１、ノ，「ノ１）ノーゲ．／及、σ’”、：”　、ｉン１”ル″ ｌランド因イ，ｌ：の結Ｃ相互１乍用を４１．　’；Ｑｊ・ｌ−るのに使ｉｌｌ 　Ｉ，、、、、・優る，１例、゛（は、本発明のｂ−ノタトナル抗体には、内皮 細胞表面１こ存在ゆるｌ・″’．Ｃｒ＋ｊ：免疫反２応ｊ，抗体分Ｙ−Ｅｆｌ： ｒ複合体を形成し５８、イーの結縛；４７、−〇却１胞−゛バじトＵ才、クツ° ソ、フィブリノーゲン又はフォンヒ゛ルブンンドし〜子Ｊ−結合しなくなるよう な抗体分子を含む。従って本発明の千５．ツタ＋：＞−Ｊ小分子は、効果的な量 を静脈注射で投与した時、腫瘍細胞及び血管形成内皮細胞表面上に存在するＥＣ ｒ分子が、内皮下７トリクスの一部として存在するビトロネクチン、フィブリノ ーゲ＝／及びフォンビルブランド因子と結合する能力を阻害しつる医薬的に許容 し得る組成物に使用し得る。この阻害は、露出するビトロネクチン、フィブリノ ーゲン及び７オンビルブランド因子を含む、体内組織に対する、ＥＣｒを含む細 胞の付着を減少させる結果であると考えられている。従って、本発明のモノクロ ーナル抗体組成物のインビボ投与は、腫瘍の増殖が細胞付着に依存する腫瘍増殖 の阻害に使用し得る。

投与される千ツクローナル抗体組成物は、溶液又はシロップの形体をとり、かつ 、０．１〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含む。

活性成分として抗体分子を含む治療組成物の調合は当分野でよく知られている。

一般的に、このような組成物は、溶液又はサスく”／ジョンのようなｎＨ射ｉ． Ｊ．ｌ’　Ｍｌｌなもの４ムｌで調合されるが６、注射前）、溶液ヌ１沫ザ、ス くンζ’＝＋：〆のような液体２創るのＩＩ適し，プ，・固体も調，Ａ，　ｌ− ７得る、ま六１、の諒１合物を一一υ１・う１ン化し，得る、１（、はしは、活 栢治療成分≦・：医薬的（、゛許容１得、が“′）活ｐｌＨ成１分（、゛適合し ；−賦形剤と混合基る。適当な賦Ｗ・剤１：″は、例所、は水、食塩ｄく、デ１ “。

ストロース、グリヤリ、）、Ｊタノール及びこれら複−組合ｅｆ′．：ものがあ る。さら１こ望ましい場合には、組成７物は＆１潤剤、ｃ−　＝冒膣′．；ヨン 化剤又は活性成．分の効宋・（、高めろ１１　ＩＩ錫衝剤なとの？ＩＩｉ肋物質 を少量含み得る。

モノクローナル洗体は、医薬的に許容”し得る中和塩として、治療組成物を調合 し，得る。医薬的に許容し得る塩には、例えば塩酸又はリン酸のような無機酸又 は酢酸、シュウ酸、酒石酸、？ンデル酸などの有機酸により形成される酸イ」加 塩（抗体分子の遊離アミノ基との間で形成する）が含まれる。また遊離カルボン 酸と形成される塩も、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム 又は鉄の水酸化物等の無機塩基又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２ −エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ力イン等の有機塩基から誘導し得 る。

治療用抗体分子含有組成物は、例えば単位投与量の注射などによる静脈注射で簡 便に投与される。

本発明の治療組成物に対して用いられる“単位投与量”という語句は、必要とさ れる希釈剤、すなわちキャリヤー、又はビヒクルと合せて所定量の活性物質を含 む、−回の投与に適した物理的に分離した単位を意味する。

本組成物は、調合物に適した様式で、かつ治療に効果的な量が投与される。投与 量は治療検体、有害な副作用が起こらない範囲の、検体システムの活性成分使用 容量及びＥＣｒ及び適当なマトリクスタンパク質問に望まれる相互作用の阻害度 に依存する。投与する活性成分の精密な量は、医師の判断に依存し、かつ各個人 に特定のものである。しかし、適当な投与範囲は、日当り、ヒトの体重キログラ ム当り活性成分０．１〜１０ミリグラムのオーダーであり、好ましくは１〜５ミ リグラムである．又、初期投与及び二次投与の適切な処方も様々であるが、初期 投与後１時間以上の間隔をおいて、注射又は他の投与法で再び投与するのが典型 的である．別に、血中濃度をＩθナノモル濃度から１０マイクロモル濃度に維持 する継続的静脈注入する方法も考えられる。

Ｅ１診断システム 本発明のキット型の診断システムは、少なくとも１回の検定に十分な量の本発明 のモノクローナル抗体が分包試薬として含まれる．モノクローナル抗体中に存在 する抗ＥＣｒ抗体分子はハイブリドーマＬＭ．６０９により産生されたものであ ることが好ましい。

一般に、パッケージした試薬の使用説明書も含まれている。

所定の診断法において使用される抗体量の適正化法は当分野ではよく知られてい る．一般にインビトロ法は、約１マイクログラムから数ミリグラムの範囲の抗体 タンパク賞を必要とする。また、インビボ法は、−ａに被栓者体重キログラム当 り約１ミリグラムから数百ミリグラムの範囲の抗体タンパク質を必要とする。

一般に“使用説明書”には試薬濃度又は試薬量及び投与を受けるサンプル量、試 薬／サンプル混合物の維持時間、温度、バッファ条件等の、少なくとも１回の検 定におけるパラメーターを記述した物を含む。

好ましい態様において、本発明の診断システムは、さらに本発明のモノクローナ ル抗体とＥＣｒの免疫反応により生成する複合体の生成に知らモ得るラベル又は 指示手段を含む．従って、好ましい診断システムにおいては、本発明のモノクロ ーナル抗体分子中に存在する抗ＥＣｒ抗体分子が指示手段と結合している。

ここで用いられている１複合体２という語は、抗体−抗原又はレセプター−リガ ンド反応等の特異的結合反応の生成物を意味する。

ここで用いられているように、種々の文法型の“ラベル°又は“指示手段”とい う語句は複合体の存在を示すための検出し得るシグナルの生成に直接的又は間接 的に関与する単−原子及び分子を意味する．“インビボ゛ラベル又は指示手段は 、被検者体内で有用なものであり、かつこれらにはＩ　Ｉ　ｌ　１ｎ，雫”ＴＣ ％　”Ｇａｓ　　”’Ｒｅ及び１ｉｌＢが含まれる．ラベル又は指示手段は、本 発明のモノクローナル抗体組成物の一部である抗体分子と結合又は組込まれ得る し、又は別々に使用し得る．またこれらの原子又は分子は単独で、又は他の試薬 と共に使用し得る。これらのラベルは、臨床診断化学の分野においてはよく知ら れており、それらが本発明のタンパク賞、方法及び、又はシステムと共に用いら れる限りにおいて、本発明の一部を構成する。

ラベル手段は、抗体又は抗原を変性することなしにそれらと化学的に結合し、有 用な免疫螢光トレーサーとなる螢光色素を生成する螢光ラベル剤であり得る。適 当な螢光ラベル剤には、フルオレセインイソシアネート（Ｆ　Ｉ　Ｃ）　、フル オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタ レンスルホニルクロライド（ＤＡＮＳＣ）　、テトラメチルローダミンイソチオ シアネート（ＴＲＩＴＣ）、リザミン、ローダミン８２００スルホニルクロライ ド（ＲＢ２００ＳＣ）等の螢光色素がある。

免疫螢光分析技術の説明は、参考として引用した、デル力（ＤｅＬｕｃａ）の“ 免疫螢光分析”「道具としての抗体」マーカロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ） 等線、ジッンウィリー・アンドサンズ版、１８９−２３１頁（１９８２）に見ら れる。

好ましい態様において、指示グループはホースラディツシュパーオキシダーゼ（ ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼなどの酵素である。ＨＲＰ又はグルコースオ キシダーゼのような酵素が基本的な指示グループの場合、バラトープ分子−抗原 複合体の形成を可視化する別の試薬を必要とする。ＨＲＰに対するこれらの付加 試薬には過酸化水素及びジアミノベンジジンなどの酸化色素前駆体が含まれる。

グルコースオキシダーゼに有用な付加試薬は２゜２′−アジノービス−（３−エ チルーベンスチアソーリンースルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。

また放射性元素も有用なラベル化剤であり、かつここで例示的に用いている１代 表的放射性ラベル化剤は、ガンマ線を発する放射性元素である　１１４１％　Ｉ ！Ｊ、１ｕｌｌ、＋ｉｚＩ及び”Ｃｒナトそれ自体ガンマ線を発生する元素は、 一群のガンマ線発生放射性元素指示グループを成している。特にＩ！Ｊが好まし い、！用なラベル化手段の別のグループには、”Ｃ％　”Ｆ％　”Ｏ及び１２Ｎ 等それ自身陽電子を放出する元素がある０発生した陽電子は、動物体内に存在す る電子と衝突してガンマ線を生成する。また、１インジウム又は３Ｈのようなβ 線発生源も有用である。

タンパク質へのラベルの結合は、当分野ではよく知られている。

例えば、ハイブリドーマから生成した抗体は、培養培地中の成分として提供され た放射性同位元素含有アミノ酸の代謝的取込みによってラベル化し得る０例えば 、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｓ）等、メソフズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ 、　ＥｎｚｙＩｌｏｌ、）　、７３　：　３−４６（１９８１）参照、活性化し た官能基を介してのタンパク質結合技術は特に使用し得る９例えば、オーラメア ス（Ａｕｒａ■ｅａｓ）等、スカンジナビアンジャーナル・オブ・イムノロジー （Ｓｃａｎｄ、　Ｊ。

Ｉｗｍｕｎｏｌ、）　％　８　：補７：７−２３　（１９７８）、ロアドウエル （Ｒｏｏｄ　ｗｅｌｌ）バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ、）　、３　＝　 ８８９−８９４（１９８４＞及び米国特許第４．４９３．７９５号参照。

診断システムは、好ましくは分包として、特異的結合試剤も含み得る。“特異的 結合試薬′は、本発明の試薬又はこれを含む複合体と選択的に結合し得るが、本 発明の抗体分子組成物そのものではない分子である０代表的な特異的結合試薬に は第２の抗体分子、補体タンパク質又はその断片、Ｓ、オーレウス（ａｕｒｅｕ ｓ）タンパク質Ａなどがある。特異的結合試薬は結合する分子が複合体の一部と して存在するときに結合することが好ましい。

好ましい態様において、特異的結合試薬はラベル化されている。

しかし、診断システムがラベル化されていない特異的結合試薬を含むとき、この 試薬は一般に増巾手段又は増巾試薬として用いられる。これらの！Ｓ様において 、ラベル化された特異的結合試薬は増巾試薬が結合する試薬を含有する複合体に 結合するとき、特異的にその増巾試薬に結合し得る。

本発明の診断キットは“ＥＬＩＳ”様式で使用し、血清、血漿又は尿などの体液 サンプル中のＥＣｒの存在又は量を検出し得る。

“ＥＬ　Ｉ　ＳＡ″とは、固相に結合した抗体又は抗原及び酵素−抗原又は酵素 −抗体結合体を用い、サンプル中の抗原又は抗体の検出及び定量に用いる酵素結 合免疫吸着検定法である。ＥＬＩＳＡスアラモスのレンジメディカル社版、Ｄ、 Ｐ、サイン（Ｓｉｔｅｓ）等による°基礎及び臨床免疫学゛第４編第２２章、及 び米国特許第３．６５４．０９０号、第３．８５０．７５２号及び第４．０１６ ，０４３号に見られる。

従って、好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体は固体マトリクス に固定化され、本診断システム中、１つのパッケージを有する固体サポートを形 成し得る。

試薬は、当分野でよく知られている他の固定化法も使用し得るが、一般に水性媒 体から吸着により固体マトリクスに固定化し得る。

また有用な固体マトリクスも当分野でよく知られている。このようなマトリクス は非水溶性であり、それには、ファルマシアファインケミカルズ社（ＮＪ州ビス カタウェイ）から５ＥＰＨＡＤＥＸの商標で市販されている架橋デキストラン； アガロースニアボットラポラ）　ＩＪ−ズ社（ＩＬ州北シカゴ）から市販されて いる直径約１ミクロンから約５ミリメートルの′ホリスチレンビーズンポリ塩化 ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース又はナイロ ン製の、シート、板又はヘラ状の織物；又はポリスチレン又はポリ塩化ビニルな どで作られたマイクロプレートのウェルなどがある。

ここで説明する診断システムの特異的結合試薬又は増巾試薬をラベルしたモノク ローナル抗体は液体分散物などの溶液、又は、凍結乾燥形などの実質的に乾燥し た粉末として提供し得る。指示手段が酵素の場合、その酵素の基質もシステム中 分包された形で提供し得る。先に説明したマイクロプレートなどの固体サポート 及び１つ以上のバッファも本診断検定システム中、分包された要素として含まれ 得る。

診断システムに関してここで議論されているパッケージは一般に診断システムで 使用されているものである。このようなパッケージにはガラス及びプラスチック 製（例えばポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート製）のビン、バ イアル、プラスチック及びプラスチックホイルでラミネートしたエンベロープな どが含まれる。

Ｆ、検定法 本発明は、本発明のモノクローナル抗体を用いて免疫反応産物を生成することに よりＥＣｒを検出する方法に関する。使用する抗ＥＣｒ抗体分子はハイブリドー マＬＭ６０９により産生されるものが好ましい。当業者にはこれらの産物を生成 するのに使用し得る、多くの臨床化学的な従来法が存在することが理解できよう 。従って、代表的検定法をここに説明するが、これが本発明を制限するものでは ない。

１、　インビボにおけるＥＣｒの検出 本発明は、被検者体内に含有されるＥＣｒの存在を検出する方法に関する。存在 する抗ＥＣｒ抗体分子がインビボ指示手段に結合している場合、診断に有効な量 の本発明のモノクローナル抗体を被検者に静脈注射する。好ましい態様において 、ラベル化した抗体は、ハイブリドーマＬＭ６０９から分泌されるものである。

一般に診断に有効な量のモノクローナル抗体とは、受容者体重キログラム当り、 医薬的に許容し得る賦形剤中結合抗体約５〜約１０００ミリグラム（■）、好ま しくは約１０〜約２０■／ｋｇの範囲にある。使用するモノクローナル抗体量は 、とりわけ、被検者の状態及び抗体に結合する指示手段のタイプに依存する。

その後、ラベル化抗体が存在するＥＣｒと免疫反応し、かつ免疫反応産物を生成 するのに十分な所定の時間、及び好ましくは未反応の抗体分子が体内から一掃さ れるのに十分な付加的時間、被検者を維持する。それから被検者は、生成したラ ベル化産物の存在及び好ましくはその位置に関して検定を受ける。

２、　身体サンプルにおけるＥＣｒの検出血液などの体液サンプル中又はＭｉ織 断片などの細胞調製物中のＥＣｒの存在及び好ましくはその位置の検出を目的と した、競合的、又は非競合的な、種々の不拘−及び均一検定法が使用し得る０例 えば組織生検は、固定及びグルコースオキシダーゼでラベル化した抗ＥＣｒ抗体 分子を含む本発明のモノクローナル抗体との混合による免疫螢光分析用に調製さ れる。こうして生成した免疫反応混合物を、生物学的検定条件下、サンプル中に 存在するＥＣｒがラベル化した抗体分子と免疫反応し、ラベル化免疫反応産物を 生成するのに十分な時間維持する。それからこのラベル化免疫反応産物を、一般 的には、サンプル中に存在する免疫反応した抗体を有意に除去することなく、全 ての未反応ラベル化抗体分子を洗い流すのに十分な程度、固定化サンプルを洗浄 することにより未反応のラベル化抗体分子から分離する。その後、生成したラベ ル化免疫反応産物の量を測定する。

生物学的検定条件とは、本発明の抗体分子及び検定するＥＣｒの生物学的活性が 維持される条件である。これらの条件には、約４℃から約３７℃の温度範囲、約 ５から約７のｐｌ＋範囲、及び蒸留水から約１モル濃度塩化ナトリウムのイオン 強度範囲、好ましくはおよそ生理食塩水のイオン強度が含まれる。このような条 件を最適化する方法は当分野でよく知られている。

（例） 以下の例は本発明を説明するためのものであって、その制限を意図するものでは ない。

例１．Ｍ２１メラノーマ細胞からのＥＣｒの単離Ｍ２１ヒトメラノーマ細胞は好 意によりり、Ｌ、モートン（Ｍｏｒｔｏｎ）博士（Ｃａ州、ロサンジェルス、カ リフォルニア大学）から提供された。ＥＣｒＯ単離は、チェレソシェ（Ｃｈｅｒ ｅｓｈ）等により報告されている方法で行った（ジャーナル・オブ・バイオロジ カル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　、２’６２　：　４　 １４３４−１４３７　（１９８７））、簡単に説明すると、Ｍ２１細胞を、１０ パ一セントウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を含む生育培地（２ＪＬ−グｌレタミン及 び５０マイクログラム／ミリリットル（■／−ｌ）の硫酸ゲンタマイシンを含む ＲＰＭ１１６４０；全て、ＮＹ州ダグランドアイランドギブコ社製〕中、３７℃ で、７．５％ＣＯ，−空気雰囲気で悲濁培養する。

ミリリフドル当り約３．５Ｘ１０’個Ｍ２１細胞を含む無メチオニン生育培地（ キブコ社製）に１〜２ミリキユーリー（ｓＣ４）／醜ｉとなるように１ＳＳ−メ チオニン（Ｃａ州、アービン、ＩＣＮバイオケミカルズ社；比活性１１４ｏキユ 一リー／ミリモル（Ｃｊ　／ｍｍｏ　ｊ！　ｅ）　）を添加した。この混合物を 、３７℃、４時間維持し；その後ここに含まれる細胞を４００Ｘｇの遠心で収穫 し細胞ペレットとする。ペレット５園ｌに５　ｗｉｌｌの抽出バッファ〔１■門 ＣａＣｆｇ、１ｍＭ　　ＭｇＣｆｚｌｌ　００＋Ｍオクチルβ−Ｄ−グルコピラ ノシド（オクチルグルコシド：ベーゾング・ダイアグノスティクス社（ＣＡ州ラ うッラ））、３ｍＭフェニルメチルスルホニルクロライド（ＰＭＳＦ）を含むリ ン酸緩衝液（ＰＢＳ））を混合した。

この抽出混合物を１５分間４℃に維持し、その後２５．Ｏｏｏｘｇで３０分間遠 心して上滑を回収し３１３ラベル化Ｍ２１細胞抽出物とする。

臭化シアン活性化セファロース（ファルマシア社、ＮＪ３＋ｉ、ビスカタウェイ ）を用い業者の説明書に従って、充填ビーズ１　ｗｈ１当り２０■のペプチドを 含むＧＲＧＤＳＰＫ−セファロースを生成し、セファロースビーズに共存結合し た合成ペプチドＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ　（ ＧＲＧＤＳＰＫ）を含むアフィニティーカラムを作製した。ペプチドＧｕｙ　− Ａｒｇ　−Ｇ’１ｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｒｏ　（ＧＲＣ；ＤＳＰ）及びＧｌｙ −Ａｒｇ−Ｃ；Ｉｙ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｐｒｏ　（ＧＲＧＥＳＰ）に加え、ここ で使用されるペプチドＧＲＧＤＳＰＫは、ベニンスララボラトリーズ（Ｐｅｎｉ ｎｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｓ）　（ＣＡ州、サンカルロス）で合成された ものを、Ｍ、Ｄ、　ピアスバンカー（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ）　（クジ４ ラキヤンサーリサーチフアンデーシツン（Ｌａ　Ｊｏｌｌ、ａ　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦｏｕｒ＋ｄａｔｉｏｎ）　、ＣＡ州、ラジョラ）博士により 提供された。

５　ａｌｌの３Ｓ３ラベル化Ｍ２１細胞抽出物に５−１の充填ビーズを混合し、 ついでこの混合物を１２〜１８時間４℃に維持してＭ２１ＥＣｒをＧＲＧＤＳＰ Ｋ−セファロースに結合させる。その後、ＧＲＧＤＳＰＫ−セファロースを焼結 カラスサポートを含むカラムに移し、５０−ｊオクチルグルコシドを含む抽出バ ッファ２５＠１で洗浄した。キらに、５０ｍＭｔクチルグルコシド及び１■／ｍ Ａ’ペプチドＧＲＧＤＳＰＫを含む抽出バッファをカラムに流し、溶出してくる 各１．．２５＋１のフラクションを回収して溶出フラクションとした。

それから、各溶出フラクションの５０マイクロリツトル（μりを、レムリ　（Ｌ ａｅｓ＊Ｉｉ）の方法（ネイチ中−（Ｎａｔｕｒｅ）　、２２７　：６８０−６ ８５　（１９７０））に従カイ、３％ｓＤｓ及び５％２−メルカブトエタノール を含む７．５％アクリルアミドゲルを用いたラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ、ＧＥ）によって分析した。こ のように分析した溶出フラクション中に含まれるタンパク質は、５Ｄｓ−ＰＡＧ Ｅゲル上、オートラジオグラフィーにより可視化された。

可視化タンパク質の見かけ上の分子量（Ｍｒ）は、ミオシン、２００；β−ガラ クトシダーゼ、１１６；ホスホリラーゼＢ、９４．ウシ血清アルブミン、６７： オバルブミン、４３；及びカーポニフクアンハイドラーゼ、３０　（分子量は全 て、キロダルトン単位である）を含むタンパク質分子量マーカーを同ゲルで分析 した結果と比較して測定した。

約１３０及び１０５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を示す溶出タンパク質を含 むフラクシヨンを採集し、単離ＥＣｒ含有溶液とした。

例２．　メラノーマ細胞から単離したＥＣｒを用いたハイブリドーマの調製 ａ、免疫原の調製 例１で説明している操作において、未うベル化Ｍ２１細胞を用いて調製した単離 ＥＣｒ含有溶液２−１をｌ　ｍｌｌのレンズ豆レクチンーセファロース（ファル マシア社）と混合して、２時間室温に維持する。その後、この混合物を焼結ガラ スサポートを含むカラムに移し、保持されるセファロースビーズを約２ｏ■ｌの 抽出バッファで洗浄して、ＥＣｒ結合セファロースビーズを生成する。

ｂ、ハイブリドーマの作成 ＥＣｒと免疫反応する抗体分子を分泌するハイブリドーマを例２ａで調製された ＥＣｒ結合セファロースビーズによる免疫化により調製した。５０μＪ　　ＰＢ Ｓ及び５０μＪ　　ＥＣｒ結合セファロースビーズを含むサスペンジョン１００ マイクロリツトル（μｌ）をＢａ　ｌ　ｂ／ｃマウスに、１週間毎６週間腹腔内 注射（ｉｐ）　Ｌ、た、最後の注射から３Ｓｉ、これらマウスの肺細胞を切り出 し、この肺細胞のサスペンションを作り、その後、この肺細胞を細胞融合促進剤 （ポリエチレングリコール２０００．ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ 、ＩＮ、インディアナポリス）の存在下、非分泌性マウスミエローマ細胞系列５ ｐ２１０サブクローンＭ５と、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）等の標準ハイブリドー マ技術（メソッド・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、） 　７３．３−４６　（１９８１））を用いて融合し、ハイブリドーマを作成した 。このハイブリドーマを未融合ミエローマ細胞増殖を許さず、かつヒボキサンチ ン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を含む培養培地中での増殖により選 択し、その後限界希釈及び分離容器中での培養を用いてサブクローンした。それ から、各容器中の培養上清を、例２Ｃで説明するＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法を用い、 本来のＭ２１細胞上に存在するＥＣｒと免疫反応（結合）する抗体分子の存在に ついて評価した。

ｃ、Ｍ２１細胞ＥＬ　Ｉ　ＳＡによるハイブリドーマのスクリーニング 例１で説明しているように培養したＭ２１細胞を生理食塩水で２度洗浄し、つい で１０％ＦＣ３を含む生育培地５０ｐｌ中、ウェル当り５Ｘ１０’細胞の濃度で 平底ポリビニルマイクロプレート（ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　、ＶＡ州 、チャンティリー）にブレーティングした。その後このプレートを約１２〜１８ 時間、３７℃に維持して、プレートを乾燥させた。

乾燥プレートを洗浄バッファ（１０ｍＭ　　ＰＢＳ、　ｐ！＋７．４．０．１％ トゥイーン２０　（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー１−）０．０２ ％チメローザル（エチルマーキュリチオサリシル酸ナトリウム）の添加、その後 このプレートの２分間室温維持及び最終的なプレート反転による液体の除去を含 む２度の洗浄により再水和させた。

例２ｂで調製し、さらに例３で説明されているようにタンパク質Ａセファロース を用いて単離されたハイブリドーマ上清中に含まれる抗体分子を希釈バンクｙ　 （１：　１０　（ｖ／ｖ）０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有洗浄バッ ファ）で希釈し、その５０μｌを再水和プレートの各ウェルに加えて免疫反応混 合物を作成した。このプレートをジャイロシェーカー上、４℃で１時間維持し、 ついで反転して振ることにより液体内容物を除去した後、上述のように２回洗浄 して固相結合免疫反応産物を単離した。それから１　：　１０００　（ｖ／ｖ） で希釈したパーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇ（タボ社、ＣＡ州、バーリン ガム）を含む溶液５０μｌをプレートの各ウェルに添加し、４℃に１時間維持し てラベル化免疫反応産物を生成させる。再びプレートを反転し、振ることによっ てウェルを空にし、上述のように２度洗浄してから、新しく調製した色素基質溶 液（４００μｇ／ｗｘｌｏ−フェニレンジアミン（シグマ社、ＭＯ州、セントル イス）、８ｏ■Ｈクエン酸−リン酸ハ、ファ、ｐ）１５．０．０．０１２％（ｖ ／ｖ）ＨｔＯｚ（イーストマンコダック社、ＮＹ州、ロチニスター））５０μｌ を各ウェルに加えた。その後、このプレートを、暗所に３０分間維持してから、 １５μｌの４Ｎ　ＨｆｆｉＳＯ，を各ウェルに添加した。それから、各ウェル中 の溶液の４９２ナノメートルにおける吸光度（Ａ−＊ｚ）をマルチスキャンＥＬ ＩＳＡプレートリーダー（フローラボラトリーズ（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）、ＶＡ州、マクレーン）を用いて測定した。このように検定ささる、 ハイブリドーマ培養により生産される抗体分子は、４９２ナノメートルにおける 光学密度（０，Ｄ、４ｗｔ）が０．１を越える場合陽性と考えた。

上述のハイブリドーマ産生及び単離操作で、各々抗ＥＣｒ抗体分子を分泌する２ つのモノクローナルハイブリドーマ細胞系列ができた。

さらに、ハイブリドーマＬＭ１４２及びＬＭ６０９を、例５で説明する粘着検定 法を用いて、ビトロネクチンへのＭ２１メラノーマ細胞の粘着を阻害し得る抗体 分子を分泌する能力に関してスクリーニングした０本発明の゛ハイブリドーマは 、非対応モノクローナル抗体存在下で付着するＭ２１細胞量（ネガティブコント ロール）と比較したとき５０％以上減少し得る抗ＥＣｒ抗体分子を分泌するもの である。

例３．　モノクローナル抗体の産生 本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞由来の上滑を分離し、無細 胞抗体分子含有溶液を生成することによりハイブリドーマ培養上清から調製する 。別に、モノクローナル抗体は倒２で調製したハイブリドーマを、注射などによ りマウス等のホ乳動物の腹腔内に導入し、後に従来法によりマウスから生成した 腹腔滲出液（Ｉ！！水腫瘍液）を収穫することにより、腹水から生成し得る。

その後、回収した抗血清、腹水液又はハイブリドーマ培養上滑中に存在する抗Ｅ Ｃｒ抗体分子は、さらにタンパク質入−セファロース（バイオラドラボラトリー ズ社、ＣＡ州リすチモンド）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより 、溶出バッファのｐＨを５．０に調整すること以外、業者の推薦する方法に従っ て単離し得る。

一般に、このタンパク質Ａ−セファロース車離した抗体を含有する溶液のタンパ ク質濃度は、業者の説明書に従いバイオ−ラドプロティン検定キット（バイオラ ド社、ＣＡ州、リッチセント）を用いて測定する。

例４．Ｍ２１メラノーマ細胞由来のＥＣｒの免疫沈殿分析免疫沈殿で分析するＥ Ｃｒは、３８３ラベル化Ｍ２１細胞から以下のように調製する。

例１で説明されているＭ２１メラノーマ細胞を、１０％ＦＣ３を含む無メチオニ ン生育培地中、３．５Ｘ１０’細胞／ａｉｌの濃度で３７℃、１５分間維持した 。つづいて、３ｓＳ−メチオニンを０．５〜１　ｍｃｉ／ｍＪの濃度となるよう に細胞と混合した。この細胞を１０分間維持した後、５Ｘ１０’個の細胞を取り 出して０時間細胞と命名した。残りの細胞を４００Ｘｇで遠心して、それらを遊 離の２％Ｓ−メチオニンと分離した後、生成したベレットを４ｍＭの非ラベル化 し一メチオニンを含む生育培地中で４回洗浄した。

最後の洗浄後、５Ｘ１０”個のラベル化細胞を１０％ＦＣ３を含む生育培地に約 ３．５Ｘ１０’細胞１ｗｈｌとなるよう再懸濁し、ついで８時間３７℃に維持し た。その後、ｓｓ３メチオニンラベル化細胞を４００Ｘｇで遠心し、生じたベレ ットを、先に述べたように洗浄し、再び遠心して、ラベル化Ｍ２１細胞ベレット を生成する。

それから、ラベル化Ｍ２１細胞ベレットをＲＩＰＡｔ８解バ７ファ中（０，１Ｍ ）リス−ＨＣｊ！　　（）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンハイドロクロ ライド）ｐＨ７，２，０，１５Ｍ　ＮａＣ１，１％（−／Ｖ）デオキシクロレー ト、１％（ｗ／Ｖ）ノニデントＰ−４０（シグマ社、フェノール当り平均９モル のエチレンオキシドを含むオクチルフェノールエチレンオキシド縮合体）、０． １％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ。

１０％（ｗ／ｖ）アプロチニン（シグマ、製品番号Ａ６２７９）　、２ｍＭ　　 ＰＭＳＦ）　、１０’細胞／−ｌの濃度に再懸濁することにより溶解物を調製し た。この溶解物を１５分間０℃に維持して、最大の細胞溶解を確保し、その後、 ベックマンＴｊ５０ローター（ベンクマン社、ＣＡ州バロアルト）を用いた３５ ０００ｒｐ−の超遠心を行って、細胞破壊物を除いて、３ｓＳ−ラベル化細胞溶 解物を作る。

例３で説明したタンパクｔＡ−セファロースを用いて単離した抗体１０■をｌ　 ｃａｌの臭化シアン活性化セファロースに、業者の説明者に従って共有結合させ 免疫吸着ビーズを作る。１００μｌのＲＩＰＡ溶解バッファ中、１０μｌの充填 免疫吸着ビーズを含むサスペンションを１　ｍｌの清澄ラベル化溶解物と混合し 免疫反応混合物を作った。その後この混合物を一晩４℃に維持して免疫反応産物 を含むＭ２１ＥＣｒ免疫吸着ビーズ複合体を形成させた。

このビーズを２０℃で約１０秒間、１２０００Ｘｇで遠心後、生成したベレット を回収し、０．１％オバルブミン及び０．５％トウイーン２０を含む１ｍβのリ ン酸緩衝液（ｐＨ７，２＞で５回洗浄した。

この免疫反応産物を１００μｌのサンプルバッファ（３０＋＋＋Ｍ　　トリス− ＨＣ１１％ｐＨ６，８，１０％グリセリン及びブロモフェノールブルー）中、３ 分間煮沸１．て溶解ｊ−てから、レム’Ｊ　（Ｌａｅｍｉｌｉ）の方法（ネイチ ャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７　：　６８０−６８５（１９７０））に従かい 還元条件下７．５％ゲルを用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ラベル化タンパ ク質のバンドをＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅゲル上、オートラジオグラフィ・ −で可視化した。可視化したタンパク質の見かけの分子量（財）は、例１で説明 したように測定した。第１図に示したように、ハイブリドーマＬＭ１４２及びＬ Ｍ６０９により産生される抗体分子は各々約１３０及び１０５キロダルトンのα 及びβ号ブユニットを含む、Ｍ２１細胞の３５３−ラベル化ＥＣｒと免疫反応し た。

例５．Ｍ２］細胞粘着検定法 Ｍ２１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣ３）を含むＲＰＭ１１６４０生育培地 中、３７℃、７．５％ＣＯ２／９２．５％雰囲気丁で懸濁培養した。これらの細 胞は、３７℃、７２時間、５０マイクロギューリ−（μｃｉ）　／　ｍＲ’１（ −ｎイシン（ＩＣＮ、ＣＡ州アービン）を含む無ロイシン生育培地中で代謝的に ラベル化した。

その後、ラベル化細胞を１％ＦＣ３を含む生育培地を用いた遠心により洗浄して 、組込まれなかった放射性ラベル化物を除いて、”Ｈ−ロイシンラベル化Ｍ２１ 細胞を生成した。

およそ５Ｘ１０’　　ゝＨ−ロイシンラベル化Ｍ２１細胞をタンパク買Ａ−セフ ァ０−ス精製したＭａｂ　　ＬＭ６０９　（例３）をＯ０５■／ｍｉの濃度で含 む１００μｌの生育培地に再懸濁して免疫反応混合物を作った。コントロールと して、ラベル化細胞を生育培地に懸濁及び維持するか、又は非対応抗体を用いた 。その後、この混合物を１時間、４℃に維持してＭａｂ　　ＬＭ６０９−Ｍ２１ 細胞を形成させた。さらにこの細胞を４００Ｘｇでの低速遠心及び１％ＦＣ３含 有生育培地へのベレット再懸濁により２回洗浄１７た。

その後、細胞を生育培地に再懸濁１．て抗体処理Ｍ２ｍ細胞、：　ｉ、、、、た 。

ポリスチレン製マイクロプレートのウェル（９Ｇ穴、フローラボラトリーズ社、 ＶＡ州ママクレーンを５−２ｏｎｇ／１ａｌｌの粘着物質を含むＰＢＳ　（ｐＨ ７，２）溶液を加えることによりマトリクスタンパク質（粘着物質）でコーティ ングした。このウェル４１晩２５℃に維持してタンパク質をウェルに吸着させた 。使用するマトリクスタンパク質には、Ｅ、フロー　（Ｐｌｏｗ）博士（リサー チインスチチュート・オブスクリブスクリ、”−ツク（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓ ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　５ｅｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ、、ＣＡ州、ラジョラ、以 後ＲＩＳＣ）より提供されたフィブリノーゲン；フォンビルブランド因子及びサ イズ分別化フォンビルブランド因子（ブール１は５　Ｘ　１．　Ｏ３ｋＤａ以上 の多量体を含み、またブール■は２＝５　Ｘ　１０　’ｋｒｌａの多量体を含む 。全てＺ、ルゲリ　（Ｒｕｇｇｅ目）博士及び１゛。ジンマーマン（Ｚｉｍｍｅ ｒ＋＋＋ａｎ）　（ＲＩ　Ｓ　Ｃ）より徒供さｔまた）：、：１ラーゲンＩ型及 び■型（コラボラティブ・リサーチ社、ＭＡ州ベッドフォー１゛）：及びＭ、ビ アスベーカ−（Ｐｉｅｒｓ　ｃｈｂａｃｈｅｒ）博士（ラジョラキャンサーリサ ーチファンデーション（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦ ｏｕｒ＋ｄａｔ、　１ｏｎ）　、ＣＡ州うジョラ、以後ＬＣＲＦ）により提供さ れたヒトフィブリノーゲン、ビトロネクチン及びラミニンが含まれる。

使用した粘着物質が合成ペプチドの場合、このペプチドをプレート上に別の方法 でコーティングする。９６穴のポリスチレン製マイクロプレート（フローラボラ トリーズ社）のウェルにヒトＴ−、グロブリンフラクションＩＮ（２０μｇ／ｃ ａ１．；シグマ社、ＭＯ州セントルイス）を含む約１００μｌのＰＢＳ溶液を加 えた後、このプレートを４時間室温に維持する。その後、プレートを反転させて ウェルを空にし、１００μｌのＰＢＳで３回洗浄してから再び空とした後、５Ｐ ＤＰ　［：３−　（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシ ンイミドエステル］を含む（１ｏｎｇ／ｍｌ　　ＰＢＳ）溶液５０μｌを満して ３０分間室温に維持して５ＰＤＰ活性化プレートを作った。その後、５ＰＤＰ活 性プレートのウェルを前述のように２度洗浄してから、ｌｌ＋１当り１５μｇの ペプチドＧＲＧＤＳＰＣ（ピアスベー力−（Ｐｉｅｒｓｃｈ　ｂａｃｈｅｒ）博 士、ＬＣＲＦ）を含むＰＢＳ溶液５０μｌを満たし、室温に２時間維持した。

それからこのプレートを反転して、ウェルからペプチド含有溶液を除去した。残 存する未コー　ト部位をは、各ウェルに１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加え、つ いでウェルを１時間室温に維持することによりブロックしてペプチド（粘着物質 ）コート化ウェルを作った。

５×１０″個の抗体処理Ｍ２１細胞を含む、５０μｌの生育培地を粘着物質コー ト化ウェルに加え、粘着反応混合物を作った。

この混合物を加湿インキコベター中３７℃に、第２図に示した時間維持し、各時 点でプレートを反転して生育培地及び非粘着細胞を除去した。その後、全てのウ ェルを１５０＋ｊ！のＰＢＳ（ｐＨ７，２）：ｒ２度洗浄し、非粘着細胞の除去 を確実なものにし、た。残存する付着細胞を、各ウェルに１００μｌのトリプシ ン／Ｅｌ）ＴＡ（ＩＸ：ギブコラボラトリーズ社、ＮＹ州ダグランドアイランド を添加し、その細胞を３７℃で３０分間インキュベートした後、取り出して、ス カトロン自動細胞収穫機を業者の説明書に従って使用することによりグラスファ イバーフィルター−Ｆに収穫した。。

フィイバーフィルターディスクを液体シンチレーションカクテル５　ｒａｎを入 れたバイアル中に入れ、存在する放射性ラベル量を液体シンチレーションカウン ター中、分割のカウント数として測定した。結果は、指示時間における総細胞中 （分当りのカウント数）として表わした。

第２図に示されているように、Ｍａｂ　　ＬＭ６０９はＭ２１細胞と免疫反応し 、かつフォンビルブランド因子、フィブリノーゲン及びペプチドＧ　Ｒ，Ｇ　Ｄ 　Ｓ　Ｐ　Ｃへの細胞粘着を有意に阻害したが１、フィブロネクチン及びコラー ゲンＩ型及び■型への付着には全く、又はほとんど効果がなかった。

例６．　ヒト内皮細胞ＥＣｒの単離 代表的にラベル化したヒトのヘソ静脈内皮（ＨＯＶＥ）細胞由来のＥＣｒは、ま ず新鮮なヒトのヘソ静脈からＨＯＶＥ細胞を単離してから、この単離細胞を参考 として引用しているジャフエ（Ｊａｆｆｅ）等の方法に従かい（ジャーナル・オ ブ・クリニカル・インベスチゲーション（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）５２ 　二２７４５−２７５６（１９７３））増殖することにより調製した。その後、 ＨＵＶＥ細胞を、２０１１１の生育培地（１０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１１６４０ ）中、半集密的細胞を含むＴ−１５０組織培養フラスコ（コーニング製、ＮＹ州 コーニンク）に２マイクロキユーリーの５ｓＳ−メチオニン（１２９５Ｃ４／ミ リモル、ニューイングランドニュークリヤー）を添加することによりラベル化し た。それからこの培養液を７２時間３７℃に維持し、５ｓ３−ラベル化ＨＵＶＥ 細胞を生成した。

その後、ラベル化ＨＵＶＥ細胞を、ラベル化細胞単層をカバーするのに十分なバ ーセン（ＰＢＳ中１０ａ＋Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））を加え、３ ７℃で約１ｏ分間もしくは単層細胞が培養フラスコから離脱するまで維持し、及 びその離脱細胞を収集することにより収穫した。それから離脱細胞を臨床遠心機 を用い１５００ｒｐｍで約５分間遠心することによりラベル化ＨＵＶＥ細胞ペレ ットを作った。

ついでこのラベル化ＨＵＶＥ細胞ベレットを例１で調製した等容量のＧＲＧＤＳ ＰＫ−セファロースビーズと混合した。抽出物中に含まれるＥＣｒを単離し、例 １で説明したように５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。およそ１３５　ｋＤａ及び１ １５ｋＤａの相対分子量を有する溶出タンパク質を含むフラクションを精製ＥＣ ｒとして各々保存した。

第３図は、ラベル化ＨＵＶＥ細胞抽出物のＧＲＧＤＳＰＫ−セファロースカラム 溶出曲線を示す。非特異的ペプチドＧＰＧＥＳＰを溶出バッファ中に使用したと き、適当なＳＳＳラベル化ＥＣｒタンパク質は溶出しなかった。しかし、溶出バ ッファにペプチドＧＰＧＤＳＰを添加したとき、フラクション１４−１８から成 る、１３５ｋＤａ及び１１５ｋＤａ　ＥＣｒサブユニットタンパク質を含む単一 ピークが溶出した。

ξ　例７．　ヒト内皮細胞ＥＣｒの免疫沈殿化例６で精製したＥＣｒのフラクシ ョン１４−１６を合せ、そのプールの５０μｌを等容量の２ＸＲＩＰＡ溶解バツ フア（０，１Ｍトリｘ−ＨＣＩＳｐＨ７，２，０，１５Ｍ　　ＮａＣｊ！、　１ ％（ｖ／ｖ）デオキシコラート、１％（ｗ／ｖ）／ニデントＰ−４０，０．１％ （ｗ／ｖ）ＳＤＳ。

１％（Ｗ／Ｖ）アプロチニン、２ｍＭ　　ＰＭＳＦ）と混合した。それからこの 混合物についてＭａｂ　　ＬＭ　６０９又はＭａｂ　　ＬＭ１４２と免疫反応す る能力を例４で説明した免疫沈殿分析により測定した。

第４図に示されているこれらの分析結果は、Ｍａｂ６０９及びＬＭ１４２の両方 が、各々約！３５ｋＤａ及び１１５ｋＤａのα及びβサブユニットから成る精製 内皮ＥＣｒヘテロニ量体複合体と免疫反応することを示している。

同様に、ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞を免疫沈殿分析のためのウシＥＣｒ源と して用いた。ＢＡＥＡ胞は参考としてここで引用しているボイス（Ｂｏｏｙｓｅ ）等の方法（トロンボ・シアセス・ヘモ（Ｔｈｒｏｏ＋ｂ、Ｄｉａｔｈｅｓ、Ｈ ａｅｍｏｒｒｈ）、３４：８２５　（１９７５））によりウシの大動脈から単離 した。単離したＢＡＥＡ胞をレビン（Ｌｅｖ　ｉｎ）等が報告した方法に従かい （トロンビン　リサーチ（Ｔｈｒｏｎ＋ｂ、　　リサーチ）、上５：８６９　（ １９７９））１０バーセン）ＦＣ３を補った修正イーグル培地中で培養した。

培養したＢＡＥＡ胞を例６で説明したように３Ｓｓ−メチオニンでラベル化した 後収穫してラベル化ＢＡＥ細胞ベレットを作った。

その後、例４で説明したように、溶解物調製及び免疫沈殿分析を行った。約１３ ５ｋＤａ、すなわち、ＨＵＶＥ細胞中に検出されるＥＣｒの各々α及びβサブユ ニットに相当する分子量を有するタンパク質が、免疫反応産物中に存在すること により示されるように、Ｍａｂ　　ＬＭ　６０９から調製された免疫吸着物はＢ ＡＥＡ解物中に存在するＥＣｒと免疫反応した。

例８．　ヒト内皮細胞粘着検定法 ヒトのヘソ静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞を例６で説明したように単層培養で生育さ せた。この単層ＨＵＶＥ細胞を、５０１Ｊｃｉ／５Ｊ３Ｈ−ロイシンを含む生育 培地中３７℃で７２時間維持することにより代謝的にラベル化した。このラベル 化細胞を、よく知られているようにトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、単層培 養フラスコから翻脱させた後、１％ＦＣＳを含む生育培地を用いた低速遠心によ り洗浄して、３Ｈ−ロンシンラベル化ＨＵＶＥ細胞を作った。

この３Ｈ−ロンシンラベル化ＨＵＶＥ細胞を、例５のｌ（−。

ンシンラベル化Ｍ２１細胞の分析と同様の方法により粘着検定法で分析した。粘 着物質コート化ウェルに粘着する細胞を収穫した後、そこに含まれる放射能を例 ５で説明されたように測定した。

第５図に示されているように、Ｍａｂ　　ＬＭ６０９は、非対応Ｍａｂ　　Ｗ６ ／３２とは対照的に、Ｉ（ＵＶＥ細胞と免疫反応し、かつフィブリノーゲン、ビ トロネクチン、フォンビルブランド因子及びペプチドＧＲＧＤＳＰＣに対するそ れらの細胞の粘着を有意に阻害したが、フィブリネクチン、コラーゲン■型又は ラミニンに対する粘着には全くあるいはほとんど効果を示さなかった。

例９．Ｍ２１メラノーマ細胞のＥＣｒの部分的アミノ酸配列例１で説明したよう にＭ２１メラノーマ細胞がらＥＣｒを単離した。生成した単＠ＥＣｒ含有溶液を 、ＨＰＬＣ級純水中０．０５％のＳＤＳ溶液を用い、業者の説明書に従かいセン トリコン３ｏマイクロコンセントレータ−（アミコン社製、ＭＡ州デンバース、 製品番号４２０９）によりおよそ２２倍に濃縮した。この濃縮したＥＣｒ含有溶 液を業者の方法に従がい、業者により提供された物質を用いて、シーケンシング プログラム０３ＲＰＴＨを使用した、オンラインＰＴＨ解析装置を搭載したアブ ライドバイオシステムダモデル４フ０シークエネーターによりアミノ酸配列分析 した（アプライドバイオシステムズ社、ＣＡ州ラフオスターシティ）。

濃縮ＥＣｒ含有溶液中のα及びβサブユニットの存在により、所定の位置に２種 のアミノ酸が分析された。ＥＣｒのαサブユニットの配列はＶＮｒ及びＧＰＩ［ ｂ−Ｉ［［ａの既知のβサブユニットの配列に対応する残基を、その各位置に存 在するアミノ酸残基から“差し引く”ことにより得られた。

ＥＣｒの部分的アミノ酸配列を第６図に示す。また、ビトロネクチンレセプター 又はＧｐＩｒｂ−Ｉ［１ａの各サブユニットに対するＥＣｒのα及びβサブユニ ットの部分アミノ酸配列の比較も′Ｍ６図に示した。このアミノ末端の初めのか つ部分的アミノ酸配列は、ＥＣｒがＶＮｒ又はＧｐＩＩｂ−Ｉｌｌａと似てはい るが同一ではないことを示している。

例１０１種々の腫瘍細胞表面上のＥＣｒの検出例２ｃで説明したＥＬ　Ｉ　ＳＡ Ａ定法を用い、多種の腫瘍細胞について、細胞表面上のＥＣｒ及び抗原的に関連 するレセプターを分析した。

本分析で使用するモノクローナル抗体には、例２で調製したＬＭ１４２及びＬＭ ６０９、血小板糖タンパク質ＩＩＩａ指向性［ＧｐＩ［Ｉａ：ニュー７ン（Ｎｅ ｗｍａｎ）等、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、６５：２２７−２３２　（１９８５） ）の、ビーターニューマン博士（Ｏｒ。

Ｐｅｔｅｒ　Ｎｅｗａ＋ａｎ）　　（サウザンウィスコン血液センター、Ｗｌ州 ミルウォーキー）より提供されたＡｒ１：ヒトクラスＩ組織適合性抗原上の下部 決定基と反応する、ピータ−バーハム博士（叶、　ＰｅｔｅｒＰａｒｔ＋ａｍ） 　　（スタンフォード大学、ＣＡ州パロアルト）より提供されたＷ６／３２、及 びＦＮｒβサブユニット指向性の、チェレッシ二博士（叶、　Ｃｈｅｒｅ−ｓｈ ）　（Ｓ　ＣＲＦ　）より提供されたＬＭ５３４が含まれる。

以下に示す細胞系列をＥＬ　ｉ　ＳＡ法による抗体反応性の細胞表面ＥＣｒの分 析に使用した。細胞系列名の後のカッコ内にその由来を示した。メラノーマ：Ｍ ２１、Ｍｌ４、Ｍｌ　６Ａ及びＭｌ８（モートン博士（ＯＲ，Ｍｏｒｔｏｎ）　 、ロサンゼルスカリホルニア大学、以後ＵＣＬＡ）；Ａ３７５ＰはＡ３７５　（ ＡＴＣＣＣＲＬｌ　６１９）のサブクローンであり、フィドラー博士（Ｄｒ、Ｆ ｉｄｌｅｒ）（テキサス大学ヘルスサイエンスセンター、ＴＸ州ヒユーストン） より入手した；　Ａ３７５ＭＭ（Ｊ、フィドラー博士（Ｄｒ、Ｊ、Ｆｉｄｌｅｒ ）　；ＷＭ２６６及びＷＭ２３９ａ（Ｍ、ヒアリン（）Ｉｊｅｒｌｙｎ）博士、 ウィスター研究所、ＰＡ州フィデルフィア）、メラー（Ｕ、コドウスキ＝（Ｋｏ ｄｏｖｓｋｙ）博士、西ドイツ、ドユッセルドルフ）　；神経芽細胞ＩＩ：　５ Ｋ−Ｎ−ＡＳ　（ヘルソン博士（Ｄｒ、　Ｈｅ１ｓｏｎ）　、メモリアルスロー ン・ケフタリングキャンサーセンター（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ−Ｋｅｔｔ ｅｒｉｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｎ　Ｙ州）；５Ｍ５−ＫＣＮＲ。

５Ｍ５−ＫＣＮ、ＮＭＢ−７及びＩＭＲ−６（Ｐ、　レイノルズ博士（叶、　Ｐ 、　Ｒｅｙｒ＋ｏ１．ｄｓ）、ＵＣＬＡ）；ＬＡＮ−１（シーガー博士（Ｄｒ、 　Ｓｅｅｇｅｒ）　、ＵＣＬＡ）　　；小細胞肺がんＩＩＩ：５ＨＰ７７（Ｉ（ 、Ｋ、オー博士（叶、Ｈｌに、　０ｉｅ）、国立がん研究所、ＭＤ州ベセスダ） ；Ｈ６９ｃ　（ＡＴＣＣＨＴＢ１１９）；Ｈ８２及びＨ４１，７（マイナ（Ｍｉ ｎｎａ）及びギヤザー（Ｇａｄｚａｒ）博士、ＮＩＨ。

ＭＤ州ベセスダ）；肺アデノカルシノーマ：ＵＣＬＡ−Ｐ３　（マーチン博士（ ｆｉｒ、　Ｍａｒｔｉｎ）　、ＵＣＬＡ、）　　；　Ｔ２９１　　（サンディエ ゴ、カリホルニア大学）　；ウロコ状細胞肺：バクレ（Ｂａｃｈｌ、ｅ）及びウ ロコ状細胞皮膚：　５ＣＬ−１１８５（ｉ　　ミンチエル（旧ｔｃｈｅ１１）博 士、南カリホルニア大学、バ号デナ）：膵臓がんＩＩ：　　Ｃｏ１ｏ　３５７　 ＦＧ及びＣｏｍａ　３５７　Ｓ　Ｇ　（カジジ博士（Ｄｒ。

Ｋａｊｉｊｉ）　、スクリブスクリニック、ＣＡ州、ラジョラ）；テストロサイ トーマ／グリオ細胞１１１：Ｕ３７３’ＭＧ（ＡＴＣＣ）ＩＴＢ１７）　　；Ｕ １３８ＭＧ　　（ＡＴＣＣＲＴ８１６）　　：Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣＨＴＢ１４ ）：Ｔ細胞リンパｉｔ：　ＨＰＢ−ＡＬＬ　；モルト−４（ＡＴＣＣＣＲＬ１５ ８２）：Ｈ３Ｂ−２（Ｒ，フォックス博士（Ｄｒ、　Ｒ，Ｆａｘ）　％スクリブ スクリニック・アンド・リサーチファンデーシラン、ＣＡ州ラうョラ）、Ｂ細胞 リンパ芽球細胞１１８２１４及び２Ｇ２（ガチ博士（Ｄｒ、　Ｇａｔｉ）　、Ｕ ＣＬＡ）　　；３１６０、：３１０７．１８５７及び３０９８　（ＮＩＧＭＳヒ ューマンジェネテインクミュータントセルレボジトリー、ＮＩＨ１ＭＤ州ベセス ダ）；単球：Ｕ９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）。

第７図は、ＬＭ６０９と免疫反応するＥＣｒ又はその抗原的関連タンパク賞が試 験した全んどのメラノーマ細胞表面及び少量であるがいくつかのその他の腫瘍細 胞上に存在していることを示している。Ｍａｂ　　ＬＭ６０９と有意に免疫反応 する全ての型の細胞はその表面にＥＣｒを含み、従って本発明の治療及び診断法 の代表的標的となると考えられている。

例１１．　　モノクローナル抗体ＬＭ６０９のインビボ投与による腫瘍増殖の阻 害 例１で説明したようにＭ２１メラノーマ細胞を培養した。およそ５Ｘ１０”個の 細胞を４００Ｘｇ、５分間の遠心により収穫し、細胞ベレットとした。このベレ ットを１００μｅのＰＢＳに再懸濁し、Ｂａ　１　ｂ／ｃヌードマウス（スクリ ブスクリニフクビバリうム、ＣＡ州ラうぢう）の耳たぶに皮下注射し７、そのマ ウスを８日間培養して腫瘍を形成させた。８０目及びその後２日間隔で、コント ロールとして１００μｌのＰＢＳ、又は、例２で説明したようにｌｉｌ製したＭ ａｂ　　ＬＭ６０９又はＭａｂ　　ＬＭ１４２　１００μｇを含むＰＢＳ　１０ ０μｉをＩＩＩ瘍を有するマウスに腹腔内汀射した。

その後、各々の場合につい”で５通常腫瘍を継続的に維持したときに伴う大きさ の増加をモニターして、腫瘍の増殖に関するインビボ投与の影響を測定した。

Ｍａｂ　ｉ、ｐ、投与の結果は、ＰＢＳのみ又はＬＭ１４２を受けたマウスのＩ ＩＩ瘍は互いに区別し得すかつ、各々８日目以後その大きさの急速な対数増殖及 び増加を示した。しかし、Ｍａｂ　ＬＭ　６０９を受けたマウスの腫瘍は、同期 間にわたり、非常にゅっとりと増殖した。代表的抗体Ｍａｂ　　ＬＭ　６０９及 びＭａｈ　　ＬＭ１４２を用いた上述の結果から、例８の方法で示されたように 、インビトロでＥＣｒ含有細胞の粘着を阻害する能力を有するＭａｂは、インビ ボでの腫瘍の増殖も阻害し得ることが分る。

例１２．ＥＣｒ上に存在する複合体依存決定基と免疫反応するモノクローナル抗 体の構出法。

ａ、コントロール抗血清の作製 ウサギ抗ＥＣｒ抗血清は、例６で説明したようにｍｌ製した１００マイクログラ ム（μｇ）の精製ＥＣｒタンパク質及び完全フロイントアジェバントを含む組成 物による免疫化で調製した。ＥＣｒの二次免疫注射は、多くの内皮個所に（一般 に４ケ所につき１００μｇを分配する）、さらに３力月間−週間スケジュールに 従って不完全フロインドアジュバントを用いて投与した。それから、抗血清を、 従来法により収穫した。

ｂ、複合体依存モノクローナル抗体を検出する免疫沈殿化分析例１で説明したよ うにＭ２１メラノーマ細胞を入手し、かつ培養した。その後、このＭ２１細胞を ３．５Ｘ１０’細胞／ｗａｌの濃度でｌＯ％ＦＣ３を含む無メチオニン生育培地 （ギブコ製）中、３７℃に１５分間維持した。つづいて、０．５〜ｌ　ａｃｔ／ 　ｍｌの濃度となるように３５３−メチオニンを細胞と混合し、さらにこの培養 物を２分間３７℃に維持してラベル化Ｍ２１細胞を作製【７た。

その後、ラベル化Ｍ２１細胞の培養物の一部を確保し、ラベル化培地を除いてか ら残存する細胞を０時間ラベル化Ｍ２］細胞と命名した。同様に２分間ラベル化 した他の培養物ｉ１２　×ｇ　ｓ　Ｏ−４℃で２分間遠心し、０−４℃に予冷し たハング等張塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｍ、Ａ、バイオプロダクツ社、ＭＤ州ウつ−カ ・・ズビル）に再懸濁した後、上述した遠心を再び行って細胞を洗浄１゜た。こ の洗浄操作を２度繰り返し、た後、５Ｘ１０’個の洗浄済細胞を１０％ＦＣＳを 含む生育培地に約３．５Ｘ１０’細胞／にＩｌ、＝なるように再懸濁することに より培養物を調製した。その後１、：の洗浄細胞を３７℃に、２．５．１０．３ ０．６０．１２０及び２４０分のチェイス時間維持してパルス−チェイスラベル 化細胞を調製した。その後、このラベル化細胞を上述のように洗浄し過剰のラベ ルを除去した後、再び遠心してラベル化Ｍ２１細胞ペレットを作った。

それから溶解物を調製シフ、ついで例１２ａ由来の抗ＥＣｒコントロール抗血清 及び別に問題のモノクローナル抗体を用い、例４で説明したように免疫沈殿化分 析を行う。もし、コントロール抗血清を用いたときの検出時間と比較しで、問題 にし、ているＭ、　ａ　ｂを用いたとき、約１６０キロダルトン（ｋＤａ）のＥ Ｃｒαサブユニット前駆体の検出時間に約５分間の遅延がある場合、そのＭａｂ は複合体依存Ｍａｂ、すなわち、複合体依存決定基と免疫反応するＭａｂと呼ば れる。

例として、複合体依存Ｍａｂの分析結果を第８図に示す。上述のようにパルス− チェイスラベルしたＭ２１細胞の溶解物を、ＭａｂＬＭ１４２（パネルＡ）　、 Ｍａｂ　　ＬＭ６０９　（パネルＢ）又はＭａｂ　　ＡＰ３　（パネルＣ）を用 いた免疫沈殿法により分析した。

Ｍａｂ　　ＬＭ　１４２を用いた免疫沈殿分析により、Ｍ２１細胞パルス−チェ イス溶解物中、約１６０ｋＤａのＥＣｒαサブユニット前駆体が検出された。α サブユニット前駆体は０時間にも検出し得、さらに１２０分までのチェイス時間 を通して継続的に検出し得た。

これと比較して、約５分後及び残りのチェイス時間を通して、Ｍａｂ　　ＬＭ　 ６０９は同様のＭ２１細胞溶解物中のαサブユニット前駆体を検出するが、０時 間には検出しない。この検出の５分間の遅れは、該サブユニットが０時間及び５ 分間のチェイス時間の間にプロセシングされヘテロ二量体複合体となるまでＭａ ｂはαサブユニット前駆体と免疫反応し得ないことを示している。免疫反応分析 により検出された上述の５分間の遅れに基づき、ＭａｂＬＭ１４２は、αサブユ ニット前駆体上に存在する複合体非依存性決定基を免疫反応し得ることを特徴と する一方、ＭａｈＬＭ６０９は、複合体依存決定基と免疫反応する。

Ｍａｂ　　ＡＰ３を用いた免疫沈殿化分析により、Ｍ２１細胞パルス−チェイス 溶解物中のαサブユニット前駆体及び１０５ｋＤａβサブユニツトタンパク質の 両方が検出される。両タンパク買は約１０分間のチェイス時間以後出現し、かつ Ｍ２１細胞において少なくとも１２０分間保持される。それゆえ、βサブユニッ トは、１０分間のチェイス時間抜存在し、かつ、ＭａｂＡＰ３などの、ＥＣｒの βサブユニットと免疫反応するＭａｂを用いた時、１０分間のチェイス時間後Ｅ Ｃｒ含有細胞中に検出し得る。

しかし、複合体依存Ｍａｂ、例えばＬＭ６０９を用いたとき、又はαサブユニッ ト特異的Ｍａｂｓ例えばＬＭ１４２を用いたとき、βサブユニットは同様のＭ２ １細胞溶解物において、１２０分間のチェイス時間以前には検出し得ない。それ ゆえ、複合体依存Ｍａｂは、第８図パネルＢで示されるように、約１２０分間の チェイス時間以前にはＥＣｒのβサブユニットを検出し得ないことを特徴とする 。

例えばパネルＢにおいて、５〜６０分のチェイス時間に示されているように、検 出可能な１０５　ｋＤａのβサブユニットの非存在下、ヘテロ二量体複合体生成 に関する上記の記述は、ヘテロ二量体複合体形成に使用し得るαサブユニットタ ンパク質プールへのラベル取込みと比較した時の、βサブユニツトタンパク質の 細胞内プールへのラベル取込みとの差により説明し得る。βサブユニットは１０ 分のチェイス時間以内にラベルを取込み（パネルＢ。

１０’）、かつそれによりβサブユニット特異的ＭａｂＡＰ３を用いて検出し得 る。しかし、ラベル化βサブユニットは、ヘテロ二量体複合体がαサブユニット 特異的Ｍａｂ　　ＬＭＩ　４２　（パネルＡ）又は複合体依存Ｍａｂ　　ＬＭ６ ０９　（パネルＢ）と免疫反応する約１２０分の時点まで、αサブユニットと会 合してヘテロ二量体複合体を形成することはない。

１２０分間のチェイス時間以前、使用可能なプール中にすでに存在する非ラベル 化βサブユニットはラベル化αサブユニットと複合体を形成する。したがって、 チェイス時間１２０分以前に調製した溶解物から生成する免疫反応産物は、βサ ブユニットが非ラベル種として産物中に存在することから、αサブユニット前駆 体のみを含むようである。

Ｍａｂが複合体依存決定基と免疫反応するという測定は、上述のようにして行な い得るし、又は同様に他の試薬を用いて行ない得る。例えば、ＥＣｒを含む細胞 系列はパルス−チェイスラベル化ＥＣｒ含有溶解物源として使用し得る。このＥ Ｃｒ含有細胞の代表例には、ＢＡＥ細胞、ＨＵＶＥ細胞、Ｍ２１メラノーマ細胞 及びＡ３７５メラノーマ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１９）が含まれる０例１２ａ で産生されるもの等のコントロール抗血清は、複合体依存抗体分子源として使用 し得る。上述のＭ２１細胞溶解物の免疫沈殿化分析で使用するとき、コントロー ル抗血清は、複合体非依存性抗体分子に特徴的な０時間で始まるαサブユニー／ 　）前駆体との免疫反応の時間パターンを示す。

特別のｌｌｌ３ｉ様及び例を含む先に示した明細は、本発明を説明するものであ り、これを制限するものではない、多くの変化及び修正が本発明の真の精神及び 範囲を逸脱することなしに行ない得る。

（Ｍ、×１０°３） ＦＩＧＵＲＥ　　１ ＦＩＧＵＲＥ　　２ ＦＩＧＵＲＥ　　３ ＦＩＧＵＲＥ　　４ ＦＩＧＵＲＥ　　５ ＲＧＤ指向粘着レセプターのアミノ酸配α」５　　　　　　　　：ＬＯ１５２０ ＶＮＲＦＮＬＤＶＸＳＰＡＥＹＳ Ｇｐ工より　　　Ｌ　Ｎ　Ｌ　Ｄ　　Ｐ　Ｖ　Ｑ　　Ｌ　Ｔ　　Ｆ　Ｙ　Ａ　Ｇ 　　Ｐ　Ｎ　Ｇ　　Ｓ　　Ｑ　Ｆ　　Ｇ　　Ｆ　　Ｓ゛ββサブユニ ツトＲＧＰＮ　　工　ＣＴＴＳＧＶＳＳＣＱＧｐエエエａ　　Ｇ　　Ｐ　Ｎ　　 工　ＣＴＴＲＧＶＳＳＣＱＦＩＧＵＲＥ　　６ ＦＩＧＬＩＲＥ　　７ １ＭげＩＯ’３１ ＦＩＧＵＲＥ　　８ 国際調査報告 １ｍ＃ｄｌＪ°Ａ″″″″′″ＷＴＩｎ＜ＲＲ／６４１１ｇ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＵＶＥ細胞と免疫反応し、それにより該細胞がビトロネクチン、フィプ リノーゲン、フォンビルプランド因子又はペプチドＧＲＧＤＳＰと粘着するのを 阻害する抗体結合部位を有する抗体分子を含むモノクローナル抗体であって、該 抗体結合部位がハイプリドーマＨＢ９５３７により産生されるモノクローナル抗 体。
2. （２）前記抗体分子が本来の免疫グロブリン分子である請求項（１）記載のモノ クローナル抗体。
3. （３）ＨＵＶＥ細胞と免疫反応し、それにより前記細胞がビトロネクチン、フィ プリノーゲン、フォンビルブランド因子又はヘキサペプチドＧＲＧＤＳＰと粘着 するのを阻害する抗体分子を産生するハイプリドーマであって、該抗体分子の抗 体結合部位がハイプリドーマＨＢ９５３７により産生されるハイプリドーマ。
4. （４）治療に効果的な量のモノクローナル抗体を投与する、検体中の腫瘍の増殖 を阻害する方法であって、前記モノクローナル抗体が、ＨＵＶＥ細胞と免疫反応 し、それにより該細胞がビトロネクチン、フィプリノーゲン、フォンビルブラン ド因子又はペプチドＧＲＧＤＳＰと粘着するのを阻害する抗体結合部位を有し、 該抗体結合部位がハイプリドーマＨＢ９５３７により産生され、前記モノクロー ナル抗体が医薬的に許容し得る賦形剤中に分散されている方法。
5. （５）前記抗体分子が本来の免疫グロブリン分子である請求項（４）記載の方法 。
6. （６）身体サンプル中のＥＣｒの存在を検定する方法であって、以下の工程： ａ）該身体サンプルを、ＨＵＶＥ細胞中に存在するＥＣｒと免疫反応し、それに より該細胞がビトロネクチン、フィプリノーゲン、フォンピルブランド因子、又 はペプチドＧＲＯＤＳＰと粘着するのを阻害する抗体結合部位を有する抗体分子 を含むモノクローナル抗体であって、該抗体結合部位がハイプリドーマＨＢ９５ ３７により産生されるモノクローナル抗体と混合し；ｂ）該抗体分子が該サンプ ル中に存在するＥＣｒと免疫反応して、免疫反応産物を生放するのに十分な時間 、該混合物を維持し；そして ｃ）工程ｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検出する；ことを含む方法。
7. （７）前記抗体分子が本来の免疫グロブリン分子である請項（６）記載の方法。
8. （８）検体中にＥＣｒの存在をインビボで検定する方法であって、以下の工程： ａ）診断に効果的な量のモノクローナル抗体を該検体に静脈投与する工程であっ て、該モノクローナル抗体が、ＨＵＶＥ細胞上に存在するＥＣｒと免疫反応し、 それにより該細胞がビトロネクチン、フィプリノーゲン、フォンビルブランド因 子又はペプチドＣＲＯＤＳＰと粘着するのを阻害する抗体結合部位を有する抗体 分子を含み、該抗体結合部位がハイプリドーマＨＢ９５３７により産生され、該 抗体分子がインビボ指示手段に結合しかつ生理的に許容し得る賦形剤中に分散さ れている工程；ｂ）該抗体分子が該検体中に存在するＥＣｒと免疫反応して、免 疫反応産物を生成するのに十分な時間、投与検体を維持すろ工程； ｃ）工程ｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検出する工程；を含む方法。
9. （９）前記抗体分子が木来の免疫グロブリン分子である請求項（８）記載の方法 。
10. （１０）身体サンプル中のＥＣｒの存在を検定するキット型の診断システムであ って、該システムが少なくとも１つの容器中に効果的な量の以下の成分：（ａ） ＨＵＶＥ細胞上に存在するＥＣｒと免疫反応し、それにより該細胞がビトロネク チン、フィプリノーゲン、フォンビルブランド因子又はペプチドＣＲＧＤＳＰと 粘着するのを阻害する抗体結合部位を有するモノクローナル抗体であって、該抗 体結合部位がハイプリドーマＨＢ９５３７により産生されモノクローナル抗体及 び（ｂ）該抗体と該ＥＣｒとの免疫反応を知らせる指示手段を含むシステム。
11. （１１）前記抗体分子が本来の免疫グロブリン分子である請求項（１０）記載の 診断システム。