JPH10500398A - 脈管形成の抑制に有用な方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ビトロネクチンα_vβ₃拮抗物質を用いて組織における脈管形成を抑制する方法、特に炎症組織および腫瘍組織並びに転移においてα_vβ₃拮抗物質を含む治療用組成物を用いて脈管形成を抑制する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 脈管形成の抑制に有用な方法および組成物技術分野 本発明は、一般に医薬分野に関し、とりわけビトロネクチン(vitronectin)レ セプター（α_vβ₃）の拮抗物質を用いて組織の脈管形成（angiogenesis）を抑制 する方法および組成物に関する。背景 インテグリン（integrin）は、細胞外マトリックス蛋白に結合し、したがって 、細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス相互作用（一般に粘着現象と呼ぶ ）を仲介することが分かっている細胞性レセプター類である。多数のインテグリ ンおよびインテグリンと結合するそのリガンドが文献に記載されているが、しか しながら、多くのインテグリンの生物学的機能は不明のままである。インテグリ ンレセプターは、αおよびβサブユニットから形成される非共有結合異種二量体 糖蛋白複合体という共通の構造特性をもつ蛋白類を構成する。

ビトロネクチンレセプター（ビトロネクチンに優先的に結合するその本来の特 徴のためにこの名がある）は、α_vβ₁、α_vβ₃およびα_vβ₃と呼ばれる３種の異 なるインテグリンと関係を有することが分かった（Horton，Int．J．Exp．Patho l.，71:741-759(1990)）。α_vβ₁は、フィブロネクチン(fibronectin)およびビ トロネクチンに結合する。α_vβ₃は、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン 、スロンボスポンジン(thrombospondin)、ビトロネクチン、ヴォン・ヴイレブラ ンド因子(von Willebrand's factor)、オステオスポンチン(osteospontin)およ び骨唾液腺蛋白Ｉ(bone sialoprotein I)を含むきわめて多様なリガンドと結合 する。α_vβ₅はビトロネクチンと結合する。これら３種のインテグリンが組織の 細胞相互作用で果たす特定の細胞粘着の役割はなお研究中であるが、異なる生物 学的機能を有する異なるインテグリンが存在することは明らかである。

多数のインテグリンにとって、リガンドの重要な１つの認識部位は、アルギニ ン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）のトリペプチド配列である。ＲＧＤは 、 ビトロネクチンレセプターインテグリンとして上記に認定されたリガンドの全て に見出される。このＲＧＤ認識部位は、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（“ペプ チド”）で模倣することができるが、このようなＲＧＤペプチドはインテグリン 機能の既知抑制物質である。ＲＧＤペプチドの配列および構造にしたがって特定 のインテグリンを標的とするこの抑制特異性を変化させることができるというこ とは、しかしながら言及に値する。

ＲＧＤ認識部位の考察については以下の文献を参照されたい：Pierschbacher ら、Nature，309:30-33(1984); Pierschbacherら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ,81:5985-5988(1984)。種々のインテグリン特異性をもつ種々のＲＧＤポリペプ チドはまた下記の文献に記載された:Grantら、Cell，58:933-943(1989);Cheresh ら、Cell，58:945-953(1989);Aumailleyら、FEBS Letts.，291:50-54(1991);Pfa ffら、J．Biol．Chem.，269:20233-20238(1994);さらに米国特許出願第4517686 号、4578079号、4589881号、4614517号、4661111号、4792525号、4683291号、48 79237号、4988621号、5041380号、および5061693号。

脈管形成(angiogenesis)は、新たに発生した血管の組織内への増殖を伴う組織 の血管新生(vascularization)の過程であり、新規血管新生(neo-vascularizatio n)とも呼ばれる。この過程は、内皮細胞および平滑筋細胞の浸潤によって仲介さ れる。この過程は３通りの態様のいずれか１つで進行すると考えられている：血 管は予め存在する血管から成長する、新規な血管発生は前駆細胞から生じる(血 管形成(vasculogenesis))、または存在する小血管の直径が拡大する(Bloodら、B ioch．Biophys．Acta，1023:89-118(1990))。血管内皮細胞は、少なくとも５つ のＲＧＤ依存インテグリンを含むことが知られており、これらには、ビトロネク チンレセプター（α_vβ₃またはα_vβ₅）、コラーゲンＩ型およびＩＶ型レセプタ ー（α₁β₁）、ラミニンレセプター（α₂β₁）、フィブロネクチン／ラミニン／ コラーゲンレセプター（α₃β₁）およびフィブロネクチンレセプター（α₅β₁） が含まれる(Davisら、J．Cell．Biochem.，51:206-218(1993))。平滑筋細胞は、 少なくとも６つのＲＧＤ依存インテグリンを含むことが知られており、これらに は、α₅β₁、α_vβ₃およびα_vβ₅が含まれる。

脈管形成は、新生児の成長では重要な過程であるが、また創傷治癒および種々 の臨床症状（組織の炎症、関節炎、腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、網膜の新規血管 新生による筋変性および同様な症状を含む）の病理発生においても重要である。

脈管形成に付随するこのような症状の発現は、脈管形成性疾患と呼ばれる(Folkm anら、Science，235:442-447(1987))。脈管形成は、一般に成人または成熟組織 では見られないが、創傷治癒および黄体の増殖サイクルにおいては脈管形成が発 生する。例えばモーセスらの論文を参照されたい(Mosesら、Science，248:1408- 1410(1990))。

脈管形成の抑制は、腫瘍増殖を制限するために有用な治療であろうと提言され た。脈管形成の抑制では、（１）例えばβＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）のよう な“脈管形成分子”の遊離の抑制、（２）例えば抗βＦＧＦの使用による脈管形 成分子の中和、（３）脈管形成刺激に対する内皮細胞の反応の抑制が提唱された 。この後者の方法は注目を集め、フォークマンら(Folkmanら、Cancer Biology， 3:89-96(1992))は、いくつかの内皮細胞反応抑制物質を記載したが、これにはコ ラゲナーゼ抑制物質、基底膜代謝回転抑制物質、止血性ステロイド、真菌由来脈 管形成抑制物質、血小板因子４、スロンボスポンジン、関節炎薬剤（例えばＤ− ペニシラミンおよびチオリンゴ酸金）、ビタミンＤ₃類似体、アルファーインタ ーフェロン、および脈管形成の抑制に役立つ可能性があるものが含まれる。さら に、この他に提唱された脈管形成抑制物質については以下の文献を参照されたい :Bloodら、Bioch．Biophys．Acta.，1023:89-118(1990);Mosesら、Science，248 :1408-1410(1990); Ingberら、Lab．Invest.，59:44-51(1988);並びに米国特許 第5092885号、5112946号、5192744号および5202352号。前述の文献に記載された 脈管形成抑制物質のいずれもα_vβ₃の抑制を標的としない。

ヴィトロネクチンレセプターα_vβ₃を抑制するＲＧＤを含むペプチドもまた報 告された(Aumailleyら、FEBS Letts.，291:50-54(1991); Choiら、J．Vasc．Sur g.，19:125-134(1994);Smithら、J．Biol．Chem.，265:12267-12271(1990);およ びPfaffら、J．Biol．Chem.，269:20233-20238(1994))。脈管形成におけるイン テグリンα_vβ₃の役割は、しかしながら、本発明以前には示唆されたこともなく また明らかにされたこともなかった。

種々のインテグリンαまたはβサブユニットに免疫特異的単クローン性抗体を 用いたインビトロでの細胞粘着抑制によって、α_vβ₃が、微小血管内皮細胞を含 む様々な細胞型の細胞粘着に関与していることが示された(Davisら、J．Cell．B iol.，51:206-218(1993))。さらに、インビトロでＲＧＤペプチドＧＲＧＤＳの 使用を報告したニコシアらの論文では、コラーゲンゲルで培養したラット大動脈 からの“微小血管”の形成が抑制された(Nicosiaら、Am．J．Pathol.，138:829- 833(1991))。しかしながら、コラーゲンゲル培養での“微小血管”形成のインビ トロ抑制は、組織における脈管形成抑制のモデルではない。なぜならば、微小血 管の構造が毛細血管芽と同じであるということも、またコラーゲンゲル培養にお ける微小血管の形成が、もとのままの組織（例えば関節炎組織、腫瘍組織または 脈管形成抑制が所望される病的組織）への新規血管の成長と同じであるというこ とは示されていないからである。

したがって、本明細書で報告する研究以外に、本出願人らは、細胞粘着抑制物 質を用いて脈管形成が組織で抑制できることを開示したものを全く知らない。特 に、組織における脈管形成にα_vβ₃機能が必要とされ、またα_vβ₃拮抗物質が組 織における脈管形成を抑制できるということはこれまで開示されたことはなかっ た。発明の簡単な説明 本発明は、組織における脈管形成はインテグリンα_vβ₃を必要とし、α_vβ₃の 抑制物質は脈管形成を抑制することができることを明らかにする。本発明はまた 、他のインテグリン（例えばα_vβ₅またはα_vβ₁）は、おそらくそれらは脈管形 成の発生に必須ではないために、脈管形成を抑制しないことを明らかにする。

したがって、本発明は、脈管形成抑制量のα_vβ₃拮抗物質を含む組成物を組織 に投与することを含む、組織における脈管形成抑制方法を開示する。

処置されるべき組織は、脈管形成抑制が所望されるいずれの組織でもよく、例 えば新規血管新生が発生しつつある病的組織である。代表的な組織は、炎症組織 、固形腫瘍、転移、再狭窄を起こしている組織、および同様な組織を含む。

本発明で使用されるα_vβ₃拮抗物質はα_vβ₃に結合することができ、さらにα_v β₃が本来のリガンドに結合する能力を競合的に抑制することができる。

好ましくは、この拮抗物質は、他のインテグリンの間でα_vβ₃に対して特異性を 示す。特に好ましい具体例では、このα_vβ₃拮抗物質は、フィブリノーゲンまた は他のＲＧＤ含有リガンドのα_vβ₃への結合を抑制するが、フィブロネクチンの α_IIbβ₃への結合を実質的に抑制しない。好ましいα_vβ₃拮抗物質は、ポリペプ チドまたはα_vβ₃と免疫的に反応する単クローン性抗体もしくはその機能的フラ グメントであろう。図面の簡単な説明 本開示の一部分を形成する図面は下記の通りである。

図１Ａ−１Ｄは、正常皮膚および創傷治癒下の皮膚（肉芽形成組織と呼ぶ）に おけるインテグリンサブユニットβ₃およびβ₁の組織分布を示す。β₃およびβ₁ に対する抗体を用いた免疫組織化学的方法が、実施例３Ａで述べるように実施さ れた。図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ、正常皮膚および肉芽形成組織における抗 β₃の免疫活性を示す。図１Ｃおよび１Ｄは、それぞれ、正常皮膚および肉芽形 成組織における抗β₁の免疫活性を示す。

図２Ａ−２Ｄは、正常皮膚および創傷治癒下の皮膚（肉芽形成組織と呼ぶ）に おける、それぞれβ₃およびβ₁に結合するヴォン・ヴィレブランド因子およびラ ミニンリガンドの組織分布を示す。ヴォン・ヴィレブランド因子に対する抗体（ 抗ｖＷＦ）およびラミニンに対する抗体（抗ラミニン）を用いた免疫組織化学的 方法が、実施例３Ｂで述べるように実施された。図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ 、正常皮膚および肉芽形成組織における抗ｖＷＦの免疫活性を示す。図２Ｃおよ び２Ｄは、それぞれ、正常皮膚および肉芽形成組織における抗ラミニンの免疫活 性を示す。

図３Ａ−３Ｄは、それぞれ膀胱癌、大腸癌、乳癌および肺癌の組織生検材料に おけるビトロネクチンインテグリンレセプター、α_vβ₃の分布を示す。α_vβ₃に 対するＬＭ６０９抗体を用いた免疫組織化学的方法は、実施例３Ｃで述べるよう に実施された。

図４は、本発明の未処置１０週齢ニワトリ胎児のＣＡＭの典型的な顕微鏡写真 を示す。その調製は実施例５Ｂで述べる。

図５Ａ−５Ｃは、本発明のＣＡＭ調製物のインテグリンβ₁およびα_vβ₃の 組織分布を示す。図５Ａは、ＣＳＡＴ（抗β₁抗体）を用いて免疫蛍光で免疫活 性を検出した、未処置１０週齢ＣＡＭ調製物におけるβ₁サブユニットの分布を 示す。図５Ｂは、ＬＭ６０９（抗α_vβ₃抗体）を用いて免疫蛍光で免疫活性を検 出した、未処置１０週齢ＣＡＭ調製物におけるα_vβ₃レセプターの分布を示す。

図５Ｃは、ＬＭ６０９（抗α_vβ₃抗体）を用いて免疫蛍光で免疫活性を検出した 、βＦＧＦ処置１０週齢ＣＡＭ調製物におけるα_vβ₃レセプターの分布を示す。

処置および結果は実施例５Ｃで述べる。

図６は、実施例６Ａで述べる未処置およびβＦＧＦ処置１０週齢ＣＡＭのα_v β₃およびβ₁の相対的発現を測定した棒グラフを示す。平均蛍光濃度はＹ軸に、 インテグリンプロフィルはＸ軸にプロットされている。

図７Ａ−７Ｃは、それぞれ未処置、βＦＧＦ処置およびＴＮＦα処置１０週齢 ＣＡＭの外観を示す。その方法および結果は実施例６Ａに記載する。

図８Ａ−８Ｅは、実施例７Ａ１）で述べるように、１０日目ＣＡＭにおけるＦ ＧＦ誘発脈管形成に対する抗体局所処置の効果を示す。図８Ａは、血管を欠く未 処置ＣＡＭ調製物を示す。図８Ｂは、以前に血管構造を欠いていた領域への、β ＦＧＦ処置によって誘発された新しい血管構造の浸潤を示す。図８Ｃ，８Ｄおよ び８Ｅは、それぞれβ₁に対する抗体（抗β₁；ＣＳＡＴ）、α_vβ₅に対する抗体 （抗α_vβ₅；Ｐ３Ｇ２）およびα_vβ₃に対する抗体（抗α_vβ₃：ＬＭ６０９）の 作用を示す。

図９Ａ−９Ｃは、実施例７Ｄ２）で述べるように、腫瘍によって誘発された脈 管形成に対する合成ペプチド６６２０３の静脈内注射の影響を示す。図９Ａは、 腫瘍誘発により生じた脈管形成に対するコントロールペプチドの静脈内処置の抑 制効果の欠如を示す（コントロールペプチド腫瘍）。ペプチド６６２０３の静脈 内注射によるそのような脈管形成の抑制（環状ＲＧＤ腫瘍）は、図９Ｂに示す。

腫瘍処置領域に隣接する領域内の以前から存在する成熟した血管に対する、ペプ チド６６２０３の静脈内輸液後の抑制効果または細胞毒性の欠如は図９Ｃに示す （環状ＲＧＤ隣接ＣＡＭ）。

図１０Ａ−１０Ｃは、実施例７Ｂ１）で述べるように、増殖因子誘発脈管形成 に対する単クローン性抗体の静脈内応用の効果を示す。図１０Ａは、抗体処置に 曝されなかったβＦＧＦ誘発脈管形成を示す（コントロール）。図１０Ｂに示す ように、同じ調製物を抗α_vβ₅抗体Ｐ３Ｇ２で処置したとき脈管形成抑制は生じ なかった。図１０Ｃに示すように、抗α_vβ₃抗体ＬＭ６０９による処置で脈管形 成抑制が生じた。

図１１Ａ−１１Ｃは、実施例７Ｃに述べるように抗インテグリン抗体の局所適 用後の胎児の脈管形成に対する効果を示す。それぞれ図１１Ａおよび１１Ｂで示 すように、脈管形成は、抗β₁および抗α_vβ₅で６週齢ＣＡＭを処置しても抑制 されなかった。対照的に、図１１Ｃに示すように、抗α_vβ₃抗体ＬＭ６０９での 処置は血管形成の抑制をもたらした。

図１２は、実施例７Ｄ１）で述べるように、ＣＡＭ調製物内の腫瘍に進入する 血管数の測定を示す。このグラフでは、ＣＳＡＴ（抗β₁）、ＬＭ６０９（抗α_v β₃）、またはＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）のいずれかを局所的に用いて得られる血管 の数がＹ軸に示されている。

図１３Ａ−１３Ｄは、実施例９Ａ１）ａで述べるように、処置後７日の湿潤腫 瘍重量と最初の腫瘍重量との間の比較を示す。各棒線は、各グループ当たり５− １０個の腫瘍の平均±標準誤差を表す。腫瘍は、ヒトメラノーマ（Ｍ２１−Ｌ） （図１３Ａ）、膵臓癌（Ｆｇ）（図１３Ｂ）、肺癌（ＵＣＬＡＰ−３）（図１３ Ｃ）および喉頭癌（ＨＥｐ３）（図１３Ｄ）ＣＡＭ調製物に由来し、ＰＢＳ、Ｃ ＳＡＴ（抗β₁）、またはＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で静脈内処置を施された。グ ラフでは、Ｘ軸に示したようにＣＳＡＴ（抗β₁）、ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）ま たはＰＢＳのいずれかを静脈内に用いて得られた腫瘍の重量がＹ軸に示されてい る。

図１４Ａおよび１４Ｂは、実施例９Ａ１）ａで述べるように、Ｐ３Ｇ２（抗α_v β₅）（図１４Ａ）およびＬＭ６０９（抗α_vβ₃）（図１４Ｂ）で処置し、ヘマ トキシリンおよびエオシンで染色した腫瘍の組織切片を示す。図１４Ａに示すよ うに、コントロール抗体（Ｐ３Ｇ２）で処置した腫瘍は、腫瘍基質全体に存在す る有糸分裂像（楔形）と同様に多数の血管（矢印）で示されるように、多くの生 命活性を示す活発に分裂する腫瘍細胞を示した。対照的に、ＬＭ６０９（抗α_v β₃）で処置した腫瘍では、あったとしてもごく僅かの生命活性を示す細胞 または血管が検出されただけであった（図１４Ｂ）。

図１５Ａ−１５Ｅは、実施例９Ａ１）ｂで述べるように、ペプチドで処置され たＭ２１Ｌ腫瘍に対応し、下記の通りである。図１５Ａ、コントロール環状ＲＡ Ｄペプチド（６９６０１）；図１５Ｂ、コントロール環状ＲＧＤペプチド（６６ ２０３）；図１５Ｃ、同じ胎児から採取され環状ＲＧＤペプチド（６６２０３） で処置された隣接ＣＡＭ組織；さらに高倍率（×１３）のコントロールＲＡＤ（ ６９６０１）処置腫瘍（図１５Ｄ）および環状ＲＧＤペプチド（６６２０３）処 置腫瘍（図１５Ｅ）。図１５Ｄは、ＲＡＤコントロールペプチド（６９６０１） 処置腫瘍の正常な血管を鮮明に表している。図１５Ｅは、環状ＲＧＤペプチド（ ６６２０３）処置腫瘍の破壊された血管（矢印）の例を示している。

図１６Ａ−１６Ｅは、実施例１０で述べるウサギ眼球のインビボモデルアッセ ーにおける脈管形成拮抗物質による脈管形成の抑制を示す。図１６Ａおよび１６ Ｂは、βＦＧＦおよびｍＡｂＰ１Ｆ６（抗α_vβ₅）の存在下でのウサギの眼の脈 管形成を示す。図１６Ｃ、１６Ｄおよび１６Ｅは、βＦＧＦおよびｍＡｂＬＭ６ ０９（抗α_vβ₃）の存在下でのウサギの眼の脈管形成の抑制を示す。

図１７は、実施例１１Ａのマウス：ヒトキメラ−インビボマウスモデルの作製 方法を示す工程図である。ＳＣＩＤマウスの皮膚の一部分をヒト新生児包皮で置 き換え、４週間治癒させた。移植が治癒した後、ヒト包皮にヒト腫瘍細胞を接種 した。その後の４週間で、ヒトの皮膚からヒトの腫瘍内に増殖したヒト血管構造 をもつヒトの腫瘍を含む測定可能な腫瘍が成長した。

図１８は、それぞれ実施例１２Ａおよび１２Ｂで述べるようにＦＡＣＳ分析で 求めた、ｍＡｂ処置およびペプチド処置ＣＡＭから得られ、アポプトーシスタグ （Apop Tag）で染色された単一細胞の％を示す。斜線棒および点刻棒は、それぞ れアッセーの前２４時間および４８時間処置した胎児の細胞を表す。各々の棒線 は３個の平均±標準誤差を表す。ＣＡＭは、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）、Ｃ ＳＡＴ（抗β₁）またはＰＢＳで実施例１２Ａ２）で述べるように処置された。

ＣＡＭはまた、実施例１２Ｂで述べるように、環状ペプチド６９２０３（サイク ロ−ＲＧＤｆＶ、ペプチド２０３と表示）またはコントロール環状ペプチド６９ ６０１（サイクロ−ＲＡＤｆＶ、ペプチド６０１と表示）で処置された。

図１９Ａおよび１９Ｂは、実施例１２Ｃで述べるように、ＣＳＡＴ（抗β₁） （図１９Ａ）またはＬＭ６０９（抗α_vβ₃）（図１９Ｂ）で処置した胎児のＣＡ Ｍの単一細胞懸濁をアポプトーシスタグおよび沃化プロピジウムで染色し、ＦＡ ＣＳで分析した結果をまとめたものを示す。Ｙ軸は、アポプトーシスタグ染色の 細胞数を表し、Ｘ軸は、沃化プロピジウム染色（ＤＮＡ含有量）を表す。水平線 は、アポプトーシスタグ染色の陰性ゲートを表す。左および右のパネルは、ＣＳ ＡＴ（抗β₁）（図１９Ａ）およびＬＭ６０９（抗α_vβ₃）（図１９Ｂ）処置胎 児のＣＡＭ細胞をそれぞれ示す。細胞サイクルの分析は、各状態当たり約８００ ０例の分析によって実施した。

図２０Ａ−２０Ｃは、実施例１２Ｃで述べるように調製したＣＳＡＴ（抗β₁ ）処置胎児のＣＡＭ組織を表し、図２０Ｄ−２０Ｆは、ＬＭ６０９（抗α_vβ₃） 処置胎児のＣＡＭ組織を表す。図２０Ａおよび２０Ｄは、アポプトーシスタグで 染色し、Ｄ．Ｉ．Ｃ．画像上に重ね合わせて蛍光（ＦＩＴＣ）によって可視化さ せた組織を示す。図２０Ｂおよび２０Ｅは、ｍＡｂのＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で 染色し蛍光（ローダミン）で可視化させた同じ組織を示す。図２０Ｃおよび２０ Ｆは、アポプトーシスタグおよびＬＭ６０９の両方で染色した同じ組織の合併さ せた画像を示し、ここで黄色の染色は共通の存在部位を表す。棒線は、左および 右のパネルでそれぞれ１５および５０μｍを表す。発明の詳細な説明 Ａ．定義 アミノ酸残基：そのポリペプチド結合における化学的消化（加水分解）に際し て形成されるアミノ酸。本明細書で述べるアミノ酸残基は、好ましくは“Ｌ”異 性体形である。しかしながら、所望の機能特性が該ポリペプチドに保持されるか ぎり、“Ｄ”異性体形残基をいずれのＬ−アミノ酸残基とも置換することができ る。ＮＨ₂は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯ ＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。標 準的なポリペプチド命名法（Biol．Chem.，243:3552-59(1969)に記載され、 37CFR §1.822(b)(2)で採用された）に合わせ、アミノ酸残基の略語は下記の対 応表に示す： 本明細書では、全てのアミノ酸残基配列は、その左と右の向きが、アミノ末端 からカルボキシ末端の慣用的方向になっている式で表されているということは留 意されねべならない。さらに、アミノ酸残基配列の始めと終わりのダッシュは、 １つまたは２つ以上のアミノ酸残基のまた別の配列へのペプチド結合を示すこと も留意されるべきである。

ポリペプチド：αアミノ基と隣接するアミノ酸残基のカルボキシ基との間でペ プチド結合によって互いに連結された直線状のアミノ酸残基の列を指す。

ペプチド：本明細書で用いられているように、ポリペプチドとして互いに連結 された５０アミノ酸残基より大きくない直線状のアミノ酸残基の列を指す。

環状ペプチド：対応する直線状ペプチドに由来し、遊離のＮ−末端またはＣ− 末端が存在せず、この場合、対応する直線状ペプチドのＮ−末端が、当該対応す る直線状ペプチドのＣ−末端カルボキシレートとアミド結合を形成する。

蛋白：ポリペプチドの場合のように互いに連結された５０アミノ酸残基より大 きい直線状のアミノ酸残基の列を指す。

合成ペプチド：天然に生じる蛋白およびそのフラグメントにとらわれない、ペ プチド結合で共に連結された化学的に生成されたアミノ酸残基の鎖を指す。

Ｂ．一般的考察 一般に本発明は、脈管形成が特定のビトロネクチンレセプターα_vβ₃によって 仲介され、さらにα_vβ₃機能の抑制は脈管形成を抑制するという発見に関連する 。この発見は、脈管形成が種々の疾患の進行に果たす役割のゆえに重要である。

脈管形成を抑制することによって、これら疾患に介入し、その症状を改善し、い くつかの場合にはこれら疾患を治癒させる。

新しい血管の増殖が、ある疾患に付随する病理の原因となるか、または遠因と なる場合、脈管形成の抑制は、これらの疾患の有害な影響を軽減させるであろう 。類リューマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、炎症疾患、再狭窄などが例に含まれ る。新しい血管の増殖が有害組織の支援に必要とされる場合、脈管形成の抑制は 、該組織への血液供給を低下させ、したがって血液供給の要求で支えられている 組織集団の減少に役立つ。その例には、腫瘍が厚さ数ミリを越えて増殖するため に、さらに固形腫瘍の転移を成立させるために、新規血管新生が持続的な要求と なる腫瘍の増殖が含まれる。

一部には、この治療が脈管形成に対して高度に選択的で、他の生物学的過程に 対してそのようなことはないという理由で、本発明の方法は効果的である。実施 例で示すように、新しい血管の増殖のみが実質的なα_vβ₃を含み、したがって、 この治療方法は成熟血管に副作用を与えない。さらに、α_vβ₃は正常な組織には 広範囲に分布せず、むしろ新しい血管で選択的に見出され、したがって、この治 療法は、新しい血管の増殖を選択的に標的とすることができる。

α_vβ₃のみを抑制することによって脈管形成を効果的に抑制することができる という発見は、潜在的に高い選択性をもち、したがって相対的に毒性が低い治療 組成物の開発を可能にする。したがって、本発明は、１つまたは２つ以上のイン テグリンを抑制する能力を有するペプチドを基本とする試薬の使用を開示するが 、より選択的にα_vβ₃を抑制し、したがってα_vβ₃によって仲介される過程以外 の他の生物学的過程を抑制するという副作用をもたない他の試薬をデザインする ことが可能である。

例えば、本技術によって示されるように、α_vβ₃と免疫的に反応する高度に選 択的な単クローン性抗体で、α_vβ₃機能の抑制について同様に選択的である抗体 を調製することが可能である。さらに、本明細書で述べるように、α_vβ₃の抑制 について選択的であるようにＲＧＤ含有ペプチドをデザインすることが可能であ る。

本発明の発見以前には、α_vβ₃の生物学的機能と拮抗する試薬を用いて、脈管 形成および脈管形成に付属する過程のどれもインビボで抑制することが可能であ ることは知られていなかった。

Ｃ．脈管形成抑制の方法 本発明は、組織の脈管形成の抑制、それによって脈管形成に依存する組織内の 減少を抑制するための方法を提供する。一般に、本方法は、脈管形成抑制量のα_v β₃拮抗物質を含む組成物を組織に投与することを含む。

上記で述べたように、脈管形成は、“発芽(sprouting)”、血管形成または血 管拡大を含む組織の新規血管新生（この脈管形成過程の全てはα_vβ₃の発現によ って仲介され、さらにα_vβ₃発現に依存する）を伴う種々の過程を含む。外傷治 癒、黄体形成および胎児発生を除いて、大半の脈管形成過程は病的過程に付随し 、したがって本治療方法の使用はこれら疾患に対して選択的で、有害な副作用を もたない。

脈管形成が重要であると考えられている種々の疾患が存在する。これらは脈管 形成性疾患と呼ばれ、炎症疾患（例えば免疫および非免疫性炎症、慢性関節性リ ューマチ並びに乾癬）、不適切なまたは時宜を得ない血管の侵襲（例えば糖尿病 性網膜症、血管新生緑内障、再狭窄、アテローム性動脈硬化症プラークの毛細血 管増殖および骨粗鬆症）および癌関連疾患（例えば固形腫瘍、固形腫瘍転移、血 管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、カポジ肉腫、および腫瘍増殖を支援す るために新規血管新生を必要とする同様な癌）を含む。

したがって、病的組織の脈管形成を抑制する方法は、これら疾患の症状を改善 し、疾患によっては、これら疾患の治癒に寄与することができる。一具体例では 、本発明は、組織内の脈管形成それ自体の抑制を意図する。組織内の脈管形成の 程度、したがって本発明によって達成される抑制の程度は種々の方法で測定でき る。これらの方法は、例えば、免疫組織化学によってα_vβ₃免疫陽性の非成熟お よび発生期の血管構造を検出する実施例で詳述される。

本明細書で述べるように、種々の組織または統合された組織を含む種々の器官 （皮膚、筋肉、腸、結合組織、関節部、骨および脈管形成刺激に応じて血管が侵 襲することができる同様な組織を含む）のいずれも、病的状態での脈管形成を支 援することができる。

したがって、関連する具体例では、処置される組織は炎症組織で、抑制される 脈管形成は炎症組織の脈管形成であり、そこには炎症組織の新規血管新生が存在 する。この種類では、本方法は、例えば慢性関節性リュウーマチの患者の関節炎 組織、免疫もしくは非免疫性炎症組織、乾癬組織などの脈管形成の抑制を意図す る。

多くの具体例で本発明にしたがって処置される対象は、望ましくは人間の患者 であるが、本発明の原理は、本発明が、“患者”という用語に含まれることを意 図する全ての哺乳類に関して有効であることを示唆していることは理解されよう 。本明細書では、哺乳類という語が、脈管形成に付随する疾患の治療が所望され る哺乳類のいずれの種も、特に農業用、家畜用哺乳類種も含むことは理解されよ う。

別の関連する具体例では、処置される組織は、糖尿病性網膜症、黄斑の変性ま たは血管新生緑内障の患者の網膜組織であり、抑制される脈管形成は網膜組織の 脈管形成であり、そこには網膜組織の新規血管新生が存在する。

さらに別の関連する具体例では、処置される組織は、固形腫瘍、転移、皮膚癌 、乳癌、血管腫または血管線維腫、および同様な癌をもつ患者の腫瘍組織であり 、抑制される脈管形成は腫瘍組織の脈管形成で、そこには腫瘍組織の新規血管新 生が存在する。本発明によって治療できる代表的な固形腫瘍組織は、肺、膵、乳 房、結腸、喉頭、卵巣および同様な組織である。典型的な腫瘍組織の脈管形成お よびその抑制は実施例で述べる。

腫瘍組織の脈管形成の抑制は、新規血管新生が腫瘍増殖で果たす重要な役割の ために特に好ましい具体例である。腫瘍組織で新規血管新生がない場合、この腫 瘍組織は必要な栄養物を得ることができず増殖が鈍化し退縮し、ついには壊死を 起こして腫瘍死をもたらす。

本発明は、換言すれば、本発明の方法にしたがって腫瘍の脈管形成を抑制する ことによって、腫瘍の新規血管新生を抑制する方法を提供する。同様に、本発明 は、脈管形成を抑制する方法を実施することによって腫瘍の増殖を抑制する方法 を提供する。

これらの方法はまた転移の形成に対して特に効果的である。その理由は、（１ ）転移の形成は、転移癌細胞が原発腫瘍を出ることができるように原発腫瘍の血 管新生を必要とすること、および（２）二次的部位での転移の確立には転移癌の 増殖を支援する新規血管新生が必要とされることである。

関連する具体例では、本発明は、他の治療（例えば固形腫瘍に対抗し、さらに 転移を制御する通常の化学療法）と結合させた方法を実施することを意図する。

脈管形成抑制物質の投与は、典型的には化学療法の間またはそのあとで実施され る。しかし、腫瘍組織が、腫瘍組織への血液供給と栄養の提供により脈管形成の 回復を誘発することによって、脈管形成抑制物質の毒性攻撃に応答している場合 は、一連の化学療法の後で時々脈管形成を抑制することは好ましい。さらに、固 形腫瘍が除去された後、転移の予防として脈管形成抑制物質を投与することは好 ましい。本方法が腫瘍の新規血管新生の抑制に適用される限りにおいて、本方法 はまた、腫瘍組織の増殖抑制、腫瘍転移形成の抑制、成長腫瘍退縮に利用するこ とができる。実施例では、本発明のα_vβ₃拮抗物質のただ１回の静脈投与後に、 成長腫瘍の退縮が示される。

再狭窄は、経皮経管冠状動脈形成術の実施部位での平滑筋細胞（ＳＭＣ）の移 動と増殖の過程であるが、再狭窄は動脈形成術の成功を妨げる。再狭窄時のＳＭ Ｃの移動と増殖は、本発明で抑制可能な脈管形成の過程と考えられる。したがっ て、本発明はまた、動脈形成術処置の後で本方法にしたがって患者の脈管形成を 抑制することによって再狭窄を抑制することを含む。再狭窄の抑制のためには、 典型的にはα_vβ₃拮抗物質は、動脈形成術の処置の後約２日から約２８日間、よ り典型的には当該処置後最初の約１４日間投与される。

組織の脈管形成を抑制するため、したがって脈管形成関連疾患の治療のために 方法を実施するこの方法は、α_vβ₃の天然のリガンドとα_vβ₃が結合することを 抑制することができるα_vβ₃拮抗物質の治療的に有効な量を含む組成物と、脈管 形成が生じているか、または脈管形成が生じる危険性がある組織とを接触させる ことを含む。

α_vβ₃拮抗物質の投与のための用量範囲は、本明細書でさらに述べるように、 拮抗物質の形態およびその効能に左右されるが、脈管形成および脈管形成によっ て仲介される症状が改善される所望の効果をもたらすために十分に多い量である 。この投与量は副作用、例えば高粘性症候群、肺水腫、うっ血性心不全などを生 じるほど多くてはいけない。一般には、用量は、年令、健康状態、性別、および 患者の疾患の程度で変動し、当分野で技術を有する者が決定することが可能であ る。

この用量はまた、いずれかの合併症の出現により個々の内科医が調節することも できる。

治療的に有効な量は、処置される組織の測定可能な脈管形成の抑制を生じるた めに十分なα_vβ₃拮抗物質の量、すなわち脈管形成抑制量である。脈管形成の抑 制は、本明細書で述べるように免疫化学的に、または当業者に既知の他の方法でin situ で測定できる。

α_vβ₃拮抗物質が、α_vβ₃模倣物、ＲＧＤ含有ペプチド、抗α_vβ₃単クローン 性抗体またはそのフラグメントの形態を取ることができるかぎり、効能、したが って“治療的に有効な”量の表示は変動する可能性があることは理解されよう。

しかしながら、本アッセー方法で示されるように、本発明のα_vβ₃拮抗物質候補 の効能を当業者は容易に評価できるであろう。

α_vβ₃拮抗物質の効能は、ＣＡＭアッセーでの脈管形成の抑制、ウサギ眼球イ ンビボアッセー、マウス：ヒトキメラインビボアッセーを含む種々の手段によっ て、さらに天然のリガンドのα_vβ₃への結合抑制（上記の方法は全て本明細書に 記載されている）、および同様なアッセーによって測定できる。

好ましいα_vβ₃拮抗物質は、拮抗物質濃度０．５マイクロモル（ｕｍ）未満、 好ましくは０．１ｕｍ未満、より好ましくは０．０５ｕｍで溶液中で天然のリガ ンド（例えばフィブリノーゲンまたはビトロネクチン）のα_vβ₃への結合を実質 的に抑制する能力を有する。“実質的に”とは、α_vβ₃拮抗物質の存在下におけ る抑制によって、フィブリノーゲンの結合が少なくとも５０％減少するのが観察 されることを意味し、５０％抑制は本明細書ではＩＣ₅₀値と呼ぶ。

より好ましくはα_vβ₃拮抗物質は、他のインテグリンの中でα_vβ₃に対して選 択性を示す。したがって、好ましいα_vβ₃拮抗物質は、実質的にα_vβ₃へのフィ ブリノーゲン結合を抑制するが、別のインテグリン（例えばα_vβ₁、α_vβ₅また はα_IIbβ₃）へのフィブリノーゲンの結合を実質的に抑制しない。特に、好まし いα_vβ₃拮抗物質は、α_vβ₃へのフィブリノーゲン結合抑制のＩＣ₅₀が別のイン テグリンへのフィブリノーゲン結合抑制のＩＣ₅₀活性と比較して１０倍から１０ ０倍低いものである。インテグリンへのフィブリノーゲン結合抑制のＩＣ₅₀活性 を測定する典型的なアッセーは実施例で述べる。

単クローン性抗体形をとる本発明のα_vβ₃拮抗物質の治療的に有効な量は、典 型的には、生理学的に容認できる組成物として投与されたとき、約０．０１マイ クログラム（ｕｇ）／ミリリットル（ｍｌ）から約１００ｕｇ／ｍｌ、好ましく は約１ｕｇ／ｍｌから約５ｕｇ／ｍｌ、通常は約５ｕｇ／ｍｌの血中濃度を達成 するために十分な量である。換言すれば、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３ ００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ、最も 好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇで変動可能で、１日１回ま たは２回以上、１日または数日投与される。

拮抗物質が単クローン性抗体のフラグメント形をとる場合、この量は、完全抗 体の質量と比較したフラグメントの質量を基に容易に調整できる。好ましい血中 モル濃度は、約２マイクロモル（ｕＭ）から約５ミリモル（ｍＭ）、好ましくは 約１００ｕＭから１ｍＭの抗体拮抗物質である。

ポリペプチドまたは他の同様なサイズの小分子α_vβ₃模倣物の形をとる本発明 のα_vβ₃拮抗物質の治療的に有効な量は、典型的には生理学的に容認できる組成 物として投与されたとき、約０．１マイクログラム（ｕｇ）／ミリリットル（ｍ ｌ）から約２００ｕｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｕｇ／ｍｌから約１５０ｕｇ／ｍ ｌの血中濃度を達成するために十分な量である。１グラム分子当たり約５００グ ラムの質量をもつポリペプチドを基にすると、好ましい血中モル濃度は、約２マ イクロモル（ｕＭ）から約５ミリモル（ｍＭ）、好ましくは約１００ｕＭから１ ｍＭのポリペプチド拮抗物質である。換言すれば、体重当たりの用量は、約０． １ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２ ００ｍｇ／ｋｇで変動可能で、１日１回または２回以上、１日または数日投与さ れる。

本発明の単クローン性抗体またはポリペプチドは、注射または時間をかけて徐 々に輸液により非経口的に投与できる。体内の処置される組織は、典型的には全 身的投与によってアクセス可能で、したがってもっとも頻繁には治療用組成物の 静脈内投与によって処置されるが、目的の組織が標的分子を含む蓋然性が高い場 合は他の組織および薬剤送達手段も含まれる。したがって、本発明の単クローン 性抗体またはポリペプチドは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内、経皮的 に投与でき、さらに蠕動的手段によって送達させることができる。

本発明の単クローン性抗体またはポリペプチドを含む治療用組成物は、例えば ユニットドースの注射によって通常の手段で注射される。“ユニットドース”と いう用語は、本発明の治療用組成物に関して用いられるときは、患者に対する単 位投与量として適切な生理的に規定された単位を指す。各単位は、必要な希釈剤 （すなわち担体または賦形剤）と結合させて所望の治療効果を生じるように計算 された予め決定された活性物質の量を含む。

実施例に示すように好ましい具体例では、α_vβ₃拮抗物質は単回投与として静 脈内に投与される。

この組成物は、投与製剤に適合する態様で、さらに治療的に有効な量で投与さ れる。投与される量およびタイミングは処置を受ける患者、患者の活性成分を利 用する系、および治療効果の所望程度に左右される。投与に必要な活性成分の正 確な量は医師の判定にしたがい、各個人に固有である。全身的に適用するために 適切な投与量の範囲は本明細書に開示するが、しかしながら投与ルートに左右さ れる。適切な投与様式もまた変更可能であるが、最初の投与が典型的となり１時 間または１時間以上の間隔で注射または他の投与によるその後の反復投与が続く 。また別には、インビボ治療のために特定された範囲の血中濃度を維持するため に十分な持続的静脈輸液も含まれる。

本実施例で示すように、脈管形成抑制および腫瘍退縮は、拮抗剤との最初の接 触後早くも７日で生じる。拮抗剤へのさらなる接触または延長接触は、好ましく は７日から６週間、より好ましくは約１４から２８日である。

関連する具体例において、本実施例は、α_vβ₃の抑制とα_vβ₃を含む新規血管 系の細胞のアポプトーシス誘発との間の関係を明らかにする。したがって、本発 明はまた、組織内の新規血管系におけるアポプトーシスの抑制方法を含む。この 方法は、全ての組織における脈管形成抑制に関して、さらにそのために記載され た条件に関して実質的に本明細書で開示した通りに実施される。ただ１つの注目 に値する違いは、効果のタイミングの違いである。これは、アポプトーシスは急 激に、典型的には拮抗物質との接触後約４８時間で現れ、一方、本明細書で述べ るように、脈管形成の抑制および腫瘍の退縮はより緩徐に出現する。この違 いは、投与時間および所望する効果に関して治療方法に影響を与える。新規血管 構造のアポプトーシスのためには、典型的には投与は２４時間から約４週間であ るが、４８時間から７日間が好ましい。

Ｄ．治療用組成物 本発明は、本明細書で述べる治療方法の実施に有用な治療用組成物を含む。本 発明の治療用組成物は、本明細書で述べるように、活性な成分として組成物中に 溶解または懸濁させたα_vβ₃拮抗物質とともに、生理的に許容できる担体を含む 。好ましい具体例では、治療用α_vβ₃拮抗物質組成物は、治療の目的で哺乳類ま たは人間の患者に投与したとき抗原性をもたない。

本明細書で用いられるように、組成物、担体、希釈剤および試薬に関して用い るとき、“医薬的に許容できる”、“生理的に許容できる”という用語は、望ま しくない生理的影響（例えば悪心、眩暈、胃の不快感など）を生じることなく哺 乳類に投与することができることを示し、相互に用いられる。

組成物中に溶解または懸濁させた活性成分を含む医薬組成物の調製は当分野で はよく理解されており、製剤によって限定する必要はない。典型的には、そのよ うな組成物は、液体または懸濁物のいずれかとして注射可能なように調製される が、使用前に液体となる溶液または懸濁物に適した固形形態もまた調製できる。

この調製物はまた乳濁物でもよい。

活性成分は、本明細書で述べる治療方法で使用するために適した量で、医薬的 に許容でき、さらに活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、 例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールなど、お よびそれらの組み合わせである。さらに、所望する場合には、少量の補助物質、 例えば湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤など活性成分の効能を高める物質を含 むことができる。

本発明の治療組成物は、該組成物中の成分の医薬的に許容できる塩を含むこと ができる。医薬的に許容できる塩には酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と で形成される）が含まれるが、当該酸付加塩は、例えば塩酸もしくは燐酸のよう な無機酸で形成されるか、または酢酸およびマンデリン酸などの有機酸で形成さ れる。遊離カルボキシル基とで形成される塩はまた、無機塩基（例えば水酸化ナ トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄）で、さらに有機 塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノ ール、ヒスチジン、プロカインなど）で誘導することができる。

環状ポリペプチドα_vβ₃拮抗物質の調製で用いる場合、特に好ましいものはＴ ＦＡおよびＨＣｌの塩である。ペプチドの代表的な塩は実施例で述べる。

生理的に許容できる塩は当分野で周知である。典型的な液体担体は滅菌水溶液 で、これは活性成分および水の他には物質を含まないか、または、生理的ｐＨ値 で例えば燐酸ナトリウムのような緩衝液、生理的食塩水、もしくは両方（例えば 燐酸緩衝食塩水）を含む。また別には、水性担体は、１つ以上の緩衝塩の他、例 えば塩化ナトリウムおよびカリウムのような塩、デキストロース、ポリエチレン グリコール並びに他の溶質を含むことができる。

液体組成物はまた、水とともにまたは水を除いた液相を含むことができる。付 加されるそのような液相の代表例は、グリセリン、植物油（例えば綿実油）およ び水−油乳濁物である。

治療用組成物は、脈管形成抑制量の本発明のα_vβ₃拮抗物質を含み、典型的に は、治療用組成物の総重量当たり少なくとも０．１重量％の量を含むように製剤 化される。重量％は、組成物全体に対する抑制物質の重量比である。したがって 、例えば、０．１重量％は完全な組成物１００グラム当たり０．１グラムの抑制 物質である。

Ｅ．インテグリンα_vβ₃の拮抗物質 α_vβ₃拮抗物質は、組織での脈管形成を抑制するために本方法で用いられ、そ れらは、天然のα_vβ₃リガンドとの機能的な相互作用が干渉されるような態様で α_vβ₃と相互に作用する化合物を含む種々の形態をとることができる。典型的な 拮抗物質は、α_vβ₃のリガンド結合部位に由来するα_vβ₃の類似体、α_vβ₃−リ ガンド結合反応に必要な構造領域を模倣するα_vβ₃もしくはα_vβ₃の天然リガン ドのいずれかの模倣物、α_vβ₃に特異的な天然のリガンドの機能的結合ドメイン に対応する（特にα_vβ₃の天然リガンドのＲＧＤ結合ドメインに対応する）配列 を有するポリペプチド、およびα_vβ₃もしくは天然リガンドのいずれかと免疫反 応を生じる抗体を含むが、本明細書で述べるようにこれ らの全ては拮抗物質活性をもつ。

１．ポリペプチド ある具体例では、本発明は、ポリペプチド形をとるα_vβ₃拮抗物質を意図する 。本明細書に述べるように、ポリペプチド（ペプチド）α_vβ₃拮抗物質は、α_v β₃−リガンド相互作用に必要な領域にα_vβ₃の天然リガンドまたはα_vβ₃自体 のいずれかの特徴的な配列を有し、さらにα_vβ₃拮抗物質活性を示す。好ましい α_vβ₃拮抗物質ペプチドはＲＧＤトリペプチドを含み、さらにＲＧＤ含有領域内 で天然のリガンドと配列として対応する。

好ましいＲＧＤ含有ポリペプチドは、α_vβ₃の天然リガンド（例えばフィブリ ノーゲン、ビトロネクチン、ヴォン・ヴィレブランド因子、ラミニン、スロンボ スポンジンおよび同様な配列）のＲＧＤ含有領域のアミノ酸残基配列に対応する 配列を有する。これらα_vβ₃リガンドの配列は周知である。したがって、α_vβ₃ 拮抗物質ペプチドは、天然リガンドのいずれかに由来することができるが、フィ ブリノーゲンおよびビトロネクチンが好ましい。

特に好ましいα_vβ₃拮抗物質ペプチドは、前述のように他のインテグリンと比 較したとき、その天然のリガンドとα_vβ₃との結合を優先的に抑制する。これら のα_vβ₃特異的ペプチドは、少なくともα_vβ₃に対する特異性が望ましくない副 作用（例えば他のインテグリンの抑制）の発生を減少させるという理由から特に 好ましい。α_vβ₃に対して選択性をもつ好ましいα_vβ₃拮抗物質ペプチドの識別 は、典型的な結合抑制アッセー（例えば実施例で述べるようなＥＬＩＳＡアッセ ー）で容易に明らかにできる。

ある具体例では、本発明のポリペプチドは、約１００アミノ酸残基未満、好ま しくは約６０残基未満、より好ましくは約３０残基未満を含む。ペプチドは直線 でも環状でもよいが、特に好ましいペプチドは環状である。

好ましい環状および直線ペプチド並びにそれらの名称は実施例の表１に示す。

本ポリペプチドは、それが必要な配列を含み、さらに例えば本明細書で述べる ようなアッセーでα_vβ₃拮抗物質として機能することができる限り、α_vβ₃の天 然のリガンドのアミノ酸残基配列と同一である必要はないことは理解されよう。

本ポリペプチドには、それがα_vβ₃拮抗物質である限り、本明細書にそのアミ ノ酸残基配列が示されているポリペプチドのいずれの類似体、フラグメントまた は化学的誘導体も含まれる。したがって、その使用に際して変化が一定の利点を 提供する場合は、本ポリペプチドは、種々の変化、置換、挿入および欠失に付す ことができる。この点に関して、本発明のα_vβ₃拮抗物質ポリペプチドは、列挙 ペプチドの配列と同一であるよりはむしろ対応するものであり、この場合１つま たは２つ以上の変化があり、本明細書で規定されたアッセーの１つまたは２つ以 上でα_vβ₃拮抗物質として機能する能力を保持する。

したがって、ポリペプチドは、ペプチド誘導体の種々の形態のいずれかをとる ことができ、これは、アミド、蛋白との共役物、環状化ペプチド、重合ペプチド 、類似体、フラグメント、化学修飾ペプチドおよび同様な誘導体を含む。

“類似体”という用語は、本明細書に具体的に示した配列と実質的に同一なア ミノ酸残基配列をもついずれのポリペプチドも包含するが、このポリペプチドは 、１つまたは２つ以上の残基が機能的に同様な残基と保存的に置換され、さらに それは本明細書で述べるようにα_vβ₃拮抗物質活性を示す。保存的置換の例には 、１個の非極性（疎水性）残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたは メチオニン）の別のものとの置換、１個の極性（親水性）残基の別のものとの置 換（例えばアルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセ リン間）、１つの塩基性残基（例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジン）の 別のものとの置換、または１つの酸性残基（例えばアスパラギン酸またはグルタ ミン酸）の別のものとの置換を含む。

“保存的置換”という言葉はまた、そのようなポリペプチドが必須の抑制活性 を示すということを条件に、非誘導残基の代わりに化学的に誘導された残基の使 用を包含する。

“化学的に誘導された”とは、官能側鎖基の反応によって化学的に誘導された １つまたは２つ以上の残基を有するポリペプチドを指す。そのような誘導分子は 、例えば、遊離アミノ基が、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルフォニル基、カルボ ベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはフォル ミル基を形成するように誘導された分子を含む。遊離カルボキシ基は、塩、メチ ル およびエチルエステルもしくはエステルの他の種類を形成するように誘導するこ とができる。遊離ヒドロキシ基は、ｏ−アシルまたはｏ−アルキル誘導体を形成 するように誘導することができる。ヒスチジンのイミダゾル窒素は、Ｎ−ｉｍ− ベンジルヒスチジンを形成するように誘導することができる。化学誘導体として 含まれるものはまた、２０種の標準アミノ酸の天然に生じる１つまたは２つ以上 のアミノ酸誘導体を含むペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプ ロリンの代用にできる；５−ヒドロキシリジンはリジンの代用にできる；３−メ チルヒスチジンはヒスチジンの代用にできる；ホモセリンはセリンの代用にでき る；さらにオルニチンはリジンの代用にできる。本発明のポリペプチドはまた、 必須の活性が維持される限り、１つまたは２つ以上の付加および／または欠失、 または本明細書にその配列を示したポリペプチドの配列と関係がある残基をもつ いずれの配列も包含する。

“フラグメンド”という用語は、そのアミノ酸残基配列が本明細書に示されて いるポリペプチドのアミノ酸残基配列より短いアミノ酸残基配列をもつ一切のポ リペプチドを指す。

本発明のポリペプチドが、α_vβ₃の天然のリガンドの配列と同一でない配列を 有する場合、それは、典型的には１つまたは２つ以上の保存的もしくは非保存的 置換が行われたからで、通常は約３０数％未満、好ましくは１０数％未満のアミ ノ酸残基が置換される。付加残基はまた、“リンカー”を提供する目的のために ポリペプチドのいずれかの末端に付加できるが、このリンカーによって本発明の ポリペプチドは都合よく標識もしくは固形マトリックス、または担体に固定する ことができる。

本発明のポリペプチドとともに用いることができる標識、固形マトリックスお よび担体は以下で述べる。

アミノ酸残基リンカーは通常少なくとも１残基で、４０またはそれより多い残 基、もっと頻繁には１から１０残基が可能であるが、α_vβ₃リガンドエピトープ は形成しない。連結に用いられる典型的なアミノ酸残基はチロシン、システイン 、リジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸または同様なものである。さらに 、本ポリペプチドは、別に特定されない場合は、末端−ＮＨ₂のアシル化（例 えばアセチル化またはチオグリコール酸のアミド化）によって、末端のカルボキ シルアミド化（例えばアンモニア、メチルアミンとともに）および同様な末端の 修飾によって修飾された配列のために、α_vβ₃リガンドの天然の配列とは異なっ ていてもよい。周知のように末端の修飾は、プロテイナーゼの消化による感受性 を減少させるために有用で、したがって溶液中、特に生物学的液体（プロテアー ゼが存在する可能性がある）中のポリペプチドの半減期を延長させるために役立 つ。この点について、ポリペプチドの環状化はまた有用な末端修飾で、環状化に よって形成される安定な構造のため、および本明細書で述べるようにそのような 環状ペプチドについて見られる生物学的活性のゆえに特に好ましい。

本発明のいずれのペプチドも、医薬的に許容できる塩の形態で用いることがで きる。本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な酸は、無機酸、例え ばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸 、チオシアン酸、硫酸、燐酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン 酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮 酸、ナフタリンスルホン酸、スルファニル酸などを含む。ＨＣｌおよびＴＦＡ塩 は特に好ましい。

本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な塩基は、無機塩基（例え ば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）、および有機 塩基、例えばモノ−、ジ−、およびトリ−アルキル並びにアリールアミン（例え ばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンな ど）、並びに場合によっては置換されたエタノールアミン（例えばエタノールア ミン、ジエタノールアミンなど）を含む。

本発明のペプチド（本明細書ではまた本ポリペプチドと称される）は、当該ポ リペプチド分野で習熟した者にとって周知の技術（組み換えＤＮＡ技術を含む） のいずれかにより合成できる。合成化学の技術（例えば固相メルリフィールド型 合成）は、純度、抗原的特異性、望ましくない副産物を含まないこと、生成の容 易さなどから好ましい。利用可能な多くの技術についての優れた要約は以下の文 献で見出すことができる:Stewardら、“固相ペプチド合成(Solid Peptide Synth esis”、W.H．Freeman Co.，San Francisco，1969; Bodanszkyら、“ペプ チド合成(Peptide Synthesis)”、John Wiley & Sons，第２版、1976; J．Meien hofer,“ホルモン蛋白およびペプチド(Hormonal Proteins and Peptides)”、第 ２巻、46ページ、アカデミックプレス（ニューヨーク）、1983; Merrifield，Ad v．Enzymol.，32:221-96，1969; Fieldsら、Int．J．Peptide Protein Res.，35 :161-214，1990; 並びに米国特許第4244946号（固相ペプチド合成に関して）お よびSchroderら、“ペプチド(The Peptides)”、１巻、アカデミックプレス（ニ ューヨーク）、1965（古典的溶液合成に関して）。これらの文献の各々は参照に より本明細書に含まれる。そのような合成で用いることができる適切な保護基は 、上記の文献およびマッコーミーの論文(J.F.W．Mcomie，“有機化学の保護基(P rotective Groups in Organic Chemistry)”、Plenum Press，ニューヨーク、19 73（この文献は参照により本明細書に含まれる））に記載されている。

一般に、意図される固相合成方法は、成長ペプチド鎖への１つまたは２つ以上 のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基の連続的付加を含む。通常 は、第一のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが適切な、 選択的に除去可能な保護基で保護されている。種々の、選択的に除去可能な保護 基は、反応側鎖基をもつアミノ酸（例えばリジン）のために利用される。

具体例として固相合成を用いる場合、保護アミノ酸または誘導アミノ酸は、不 活性な固形支持体にその未保護カルボキシルまたはアミノ基を介して附着されて いる。アミノ基またはカルボキシル基の保護基を続いて選択的に除去し、適切に 保護された補完（アミノまたはカルボキシル）基をもつ当該配列の次のアミノ酸 を混合し、固形支持体に既に付着した残基とアミド結合を形成させるために適切 な条件下で反応させる。続いて、アミノまたはカルボキシル基の保護基をこの新 しく付加したアミノ酸残基から除去し、（適切に保護された）次のアミノ酸をそ の後付加し、以下同様に行われる。最後に、所望のアミノ酸が適切な配列で連結 され、一切の残余の末端保護基および側鎖基保護基（および固形支持体）は連続 的にまたは同時に除去されて、最終的な直線状ポリペプチドが得られる。

上記に記載したように具体例として調製した直線状ポリペプチドは、対応する 環状ペプチドを形成させるために反応させることができる。ペプチドを環状化さ せるための典型的な方法は、ジンマーらの論文に記載されている（Zimmerら、 “Peptides 1992”、393-394ページ、ESCOM Science Publishers，B.V.，1993） 。典型的には、ｔ−ブトキシカルボニル保護ペプチドのメチルエステルをメタノ ールに溶解させ、水酸化ナトリウム溶液を加え、混合物を２０°Ｃで反応させ、 メチルエステル保護基を加水分解により除去する。溶媒を蒸発させた後、ｔ−ブ トキシカルボニル保護ペプチドを酸性化水溶液から酢酸エチルで抽出する。続い て、ｔ−ブトキシカルボニル保護基をジオキサン補助溶媒中で穏やかな酸性条件 下で除去する。このようにして得られた遊離アミノおよびカルボキシ末端をもつ 非保護直線状ペプチドをその対応する環状ペプチドに変換させるために、この直 線状ペプチドの希釈溶液をジクロロメタンとジメチルフォルムアミドの混合物中 で、１−ヒドロキシベンゾトリアゾルとＮ−メチルモルフォリンの存在下でジシ クロヘキシルカルボジイミドと反応させる。生じた環状ペプチドはクロマトグラ フィーで精製される。

特に好ましい環状ペプチド合成方法は、ガーラスらの論文(Gurrathら、Eur．J .Biochem.，210:911-921(1992))および実施例に記載されている。本方法で使用 するために特に好ましいペプチドは、ｃ−（ＧｒＧＤＦＶ）（配列番号４）、ｃ −（ＲＧＤｆＶ）（配列番号５）、ｃ−（ＲＡＤｆＶ）（配列番号６）、ｃ−（ ＲＧＤＦｖ）（配列番号７）および直線状ペプチドＹＴＡＥＣＫＰＱＶＴＲＧＤ ＶＦ（配列番号８）であり、ここで“ｃ−”は環状ペプチドを指し、大文字はＬ −アミノ酸の一文字記号で、小文字はＤ−アミノ酸の一文字記号である。これら ペプチドのアミノ酸残基配列はまた、配列番号４、５、６、７および８にそれぞ れ示される。

２．単クローン性抗体 一具体例で、本発明は、α_vβ₃と免疫的に反応し、本明細書で述べるようにα_v β₃の天然のリガンドとα_vβ₃が結合するのを抑制する単クローン性抗体の形態 をとるα_vβ₃拮抗物質を開示する。本発明はまた、この抗体を産生する細胞株、 この細胞株を作製する方法、およびこの単クローン性抗体を生成する方法を開示 する。

本発明の単クローン性抗体は、１）分離α_vβ₃と免疫的に反応し、２）フィブ リノーゲンのα_vβ₃への結合を抑制する抗体分子を含む。優先的にα_vβ₃ と結合する好ましい単クローン性抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＨＢ９ ５３７が分泌するｍＡｂＬＭ６０９の免疫反応特性をもつ単クローン性抗体を含 む。このハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＨＢ９５３７は、ブダペスト条約の要請 にしたがって、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）（1301 Parklawn Drive，Rockvil le，MD，USA）に１９８７年９月１５日に寄託された。

“抗体または抗体分子”という用語は、免疫グロブリン分子の集団および／ま たは免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分（すなわち抗体結合部位またはパラ トープを含む分子）の集団を指す集合名詞として本明細書では用いられる。

“抗体結合部位”とは、抗原と特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変並びに 超可変領域から構成される抗体分子の構造部分である。

本発明で使用する典型的な抗体は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全 な免疫グロブリン分子および、パラトープを含む免疫グロブリン分子の部分（当 分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦ（ｖ）として知られ、また抗 体フラグメントと称される部分を含む）である。

別の好ましい具体例では、本発明は、この発明の単クローン性抗体に由来する Ｆａｂフラグメントを含む短縮免疫グロブリン分子を含む。Ｆｃレセプターを欠 くこのＦａｂフラグメントは可溶性で、血清半減期に関して治療的利点をもち、 さらに可溶性フラグメントを使用するという態様に関して診断的利点をもつ。可 溶性Ｆａｂフラグメントの調製は、免疫学分野で一般に知られており、種々の方 法で達成できる。

例えば、抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂部分（フラグメント）は、周知の 方法（例えば、Theofilopolous & Dixon，米国特許第4342566号を参照のこと） による実質的に完全な抗体のそれぞれパパインおよびペプシンによる蛋白分解反 応によって調製される。Ｆａｂ’抗体部分もまた周知であるが、２つの重鎖部分 を連結するジスルフィド結合を例えばメルカプトエタノールで還元し、生じた蛋 白メルカプタンを例えばヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化してＦ（ ａｂ’）₂部分から生成される。完全な免疫グロブリンを含む抗体が好ましく、 本明細書で詳述するように用いられる。

“単クローン性抗体”という語は、特定のエピトープと免疫的に反応すること ができるただ１種の抗体結合部位を含む抗体分子の集団を指す。したがって、単 クローン性抗体は、それが免疫的に反応するいずれかのエピトープに対して典型 的にはただ１つの結合親和性を示す。それゆえ、単クローン性抗体は、各々は異 なるエピトープに対して免疫的に特異的である、複数の抗体結合部位をもつ抗体 分子を含む可能性がある（例えば二特異性単クローン性抗体）。

単クローン性抗体は、典型的にはただ１種の抗体分子を分泌（産生）するハイ ブリドーマと呼ばれる単一の細胞クローンによって産生される抗体から成る。こ のハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞とミエローマまたは他の自己永続化細胞 株とを融合させて形成される。そのような抗体の調製は、最初コーラーとミルシ ュタイン(Kohler & Milstein，Nature 256:495-497(1975))によって記載され、 その内容は参照により本明細書に含まれる。また別の方法はゾーラによって記載 された（Zola，“単クローン性抗体：術式の手引（Monoclonal Antibodies:A Ma nual of techniques）”CRC Press，Inc．(1987)）。そのように調製したハイブ リドーマの上清をα_vβ₃と免疫的に反応させ、さらに天然のリガンドへのα_vβ₃ 結合を抑制する抗体分子の存在についてスクリーニングすることができる。

簡単に記せば、単クローン性抗体組成物を産生するハイブリドーマを生成する ために、α_vβ₃源（例えば記載(Chereshら、J．Biol．Chem.，262:17703-17711( 1987)にしたがってＭ２１ヒトミエローマ細胞から分離したα_vβ₃）で強化免疫 を施した哺乳類の脾臓から得たリンパ球とミエローマまたは他の自己永続化細胞 株を融合させる。

ハイブリドーマを調製するために用いる細胞株はリンパ球と同じ種に由来する ことが好ましい。典型的には、マウス１２９ＧＬＸ⁺株が好ましい哺乳類である 。本発明で使用する適切なマウスミエローマには、ヒポキサンチン−アミノプテ リン−チミジン−感受性（ＨＡＴ）細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、および Ｓｐ２／０−Ａｇ１４が含まれるが、これらは米国菌収集所(Rockville，MD)か らそれぞれＣＲＬ１５８０およびＣＲＬ１５８１の名称で入手できる。

典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を用いてミエローマ 細胞と脾臓細胞を融合させる。融合ハイブリッドはＨＡＴに対する感受性によっ て選択される。本発明の単クローン性抗体を産生するハイブリドーマは、実施例 で述べるように酵素結合免疫吸着アッセー（ＥＬＩＳＡ）を用いて識別される。

本発明の単クローン性抗体はまた、適切な特異性の抗体分子を分泌するハイブ リドーマを含有する栄養培地を含む単クローン性ハイブリドーマの培養を開始す ることによって製造できる。培養は、ハイブリドーマが抗体分子を培養液中に分 泌するために十分な時間、および条件下で維持される。続いて抗体含有培養液を 採集する。その後、抗体分子を周知の技術でさらに分離する。

これらの組成物の調製のために有用な培地は当分野で周知であり、市販もされ ているが、合成培養液、系統内交配マウスなどを含む。代表的な合成培養液は、 ダルベッコーの最少必須培地(Dulbecco's minimal essential medium)ＤＭＥＭ （Dulbeccoら、Virol．8:396(1959)）で、４．５ｇｍ／ｌのグルコース、２０ｍ Ｍグルタミンおよび２０％ウシ胎児血清が補充される。

単クローン性抗体、ハイブリドーマ細胞、またはハイブリドーマ細胞培養を製 造する他の方法もまた周知である。例えば、以下の論文に記載された免疫学的全 産物からの単クローン性抗体の分離方法を参照されたい：Sastryら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，86:5728-5732(1989); およびHuseら、Science，246:1275-12 81(1989)。

また本発明に含まれるものは、本発明の単クローン性抗体を産生するハイブリ ドーマ細胞およびハイブリドーマ細胞を含む培養である。特に好ましいものは、 単クローン性抗体ｍＡｂＬＭ６０９を分泌するＡＴＣＣＨＢ９５３７と称される ハイブリドーマ細胞株である。ｍＡｂＬＭ６０９はチェレッシュら(Chereshら、 J．Biol．Chem.，262:17703-17711(1987)の記載のように調製されたが、その調 製は実施例でもまた詳述する。

本発明は１具体例で、ｍＡｂＬＭ６０９の免疫反応特性をもつ単クローン性抗 体を含む。

単クローン性抗体が本発明の単クローン性抗体と同じ（すなわち同等な）特異 性（免疫反応特性）をもつか否かは、また、前者が予め選ばれた標的分子に後者 が結合するのを妨げるか否かを調べることによって決定することが可能である。

固相に存在する標的分子の結合に関する標準的競合アッセーで本発明の単クロー ン性抗体によって結合減少が示されるように、もし被検単クローン性抗体が本発 明の単クローン性抗体と競合するならば、その場合、２つの単クローン性抗体は 、おそらく同じかまたは密接に関連するエピトープに結合するであろう。単クロ ーン性抗体が本発明の単クローン性抗体の特異性をもつか否かを決定するまた別 の方法は、通常反応性を有する標的分子と本発明の単クローン性抗体とを予め保 温し、続いて被検単クローン性抗体を加え、被検単クローン性抗体が標的分子に 結合する能力が抑制されるか否かを決定することである。被検単クローン性抗体 が抑制されたならば、おそらく被検単クローン性抗体は、本発明の単クローン性 抗体と同じか、または機能的に同等なエピトープ特異性をもつであろう。

単クローン性抗体が本発明の単クローン性抗体の特異性を有するか否かを決定 するまた別の方法は、問題の抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸残基配列を決定するこ とである。そのＣＤＲ領域に同一または機能的に同等なアミノ酸残基配列もつ抗 体分子は同じ結合特異性を有する。ポリペプチドの配列決定方法は当分野で周知 である。

抗体の免疫特異性、その標的分子結合能および、エピトープに対して抗体が示 す付随する親和性は、この抗体が免疫的に反応するエピトープによって決定され る。エピトープ特異性は、少なくとも部分的には、免疫グロブリンの重鎖の可変 領域のアミノ酸残基配列によって、さらに部分的には軽鎖の可変領域アミノ酸残 基配列によって決定される。

“結合特異性をもつ”という語を用いる場合、同等な単クローン性抗体が同じ かまたは同様な免疫反応（結合）を示し、さらに予め選択された標的分子との結 合に対して競合するということを示す。

ヒト化(humanized)単クローン性抗体は、特に人間に治療的に使用する場合は ネズミの単クローン性抗体より特別な利点を提供する。具体的には、ヒトの抗体 は“外来”抗原のように急激に血液循環から排除されず、さらに外来抗原および 外来抗体と同じ態様で免疫系を活性化させない。“ヒト化”抗体の調製方法は当 分野で一般に周知であり、本発明の抗体に容易に応用できる。

したがって、本発明は、一具体例において抗体の抗原結合能に実質的に干渉す ることなくヒトの免疫系成分を導入するために、移植によりヒト化させた本発明 の単クローン性抗体を含む。

３．α_vβ₃特異的模倣物(mimetics) 本発明は、“模倣物”と称されるポリペプチド、抗体および他の分子を含むα_v β₃拮抗物質は、一般に本発明で用いることができることを示すが、この模倣物 はα_vβ₃機能と干渉する能力を有する。特に好ましいものは、特にα_vβ₃の機能 と干渉し、他のインテグリンの機能には干渉しない。

本明細書では、試薬がその必須の生物学的活性を保有している限り、種々の試 薬が本方法で使用するために適切であることは理解されよう。これらの試薬は包 括的に模倣物と称するが、それは、模倣物が、レセプターとリガンドの機能的相 互作用に必要なα_vβ₃またはα_vβ₃リガンドのいずれかの結合ドメインを“模倣 する”能力を保有し、したがって正常な機能に干渉（すなわち抑制）するからで ある。

α_vβ₃模倣物は、抗体またはリガンド由来ペプチド以外で上記の特性を示すい ずれの分子でもよい。それはペプチドの合成類似体でもよく、上記の結合ドメイ ンの結合ポケットのような形状をした化合物または他の分子でもよい。

α_vβ₃模倣物のデザインは、当分野で既知の薬剤デザインのための様々な構造 分析方法のいずれを用いても実施できる。これらの分析方法には、分子モデリン グ、二次元核磁気共鳴（２−ＤＮＭＲ）分析、Ｘ線結晶学、ペプチドのランダム スクリーニング、ペプチド類似体または他の化学ポリマーライブラリーおよび同 様な薬剤デザイン方法が含まれる。

α_vβ₃拮抗物質は小さなポリペプチドまたは単クローン性抗体（α_vβ₃の選択 的抑制という機能的特性を共有する２種の別々に異なる化学構造）がよいという ことを示す、本明細書で提示した広範囲の構造的証拠から見ると、本方法に有用 なこのα_vβ₃拮抗物質の構造はあまり限定される必要はなく、本明細書で規定さ れるいずれのα_vβ₃模倣物も含むことができる。

Ｆ．α_vβ₃の拮抗物質を識別する方法 本発明はまた、本方法にしたがって使用するα_vβ₃拮抗物質候補を識別する方 法を開示する。これらのアッセー方法では、候補物質は、天然のリガンドへのα_v β₃結合を抑制するその能力を調べられ、さらに、組織における脈管形成の その抑制能が調べられる。

第一のアッセーは、天然リガンドのα_vβ₃への直接結合の抑制を測定するが、 好ましい具体例は実施例で詳細に記載される。このアッセーは典型的には、ＥＬ ＩＳＡによって固相における分離α_vβ₃への天然リガンド（例えばフィブリノー ゲン）の結合抑制の程度を測定する。

このアッセーはまた、α_vβ₃に特異性を示し、天然のリガンドが他のインテグ リンに結合するのを抑制しない化合物を識別するためにも用いられる。この特異 性アッセーは、ＥＬＩＳＡアッセーを平行して行うことによって実施されるが、 この場合、α_vβ₃および他のインテグリンは、天然のリガンドと結合するそれぞ れの能力について、さらに、予め選択したリガンドと結合するインテグリンのそ れぞれの能力を抑制する候補化合物について別々のアッセーチャンバーで同時に スクリーニングされる。好ましいスクリーニングアッセーの様式は実施例で述べ る。

第二のアッセーは、ニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）での脈管形成を測定し、ＣＡ Ｍアッセーと称される。このＣＡＭアッセーは、他の研究者によって詳細に記載 され、さらに腫瘍組織の脈管形成および新規血管新生の両方を測定するために用 いられた(Ausprunkら、Am．J．Pathol.，79:597-618(1975); Ossonskiら、Cance r Res.，40:2300-2309(1980))。

ＣＡＭアッセーは、完全な組織の新規血管新生が生じ、実際のニワトリ胎児の 血管がＣＡＭまたはＣＡＭ上で成長する組織へと増殖していくので、十分に認知 されたインビボの脈管形成のためのアッセーモデルである。

本明細書で示すように、ＣＡＭアッセーは、新規な血管増殖の量と程度の両方 について新規血管新生の抑制を明示する。さらに、ＣＡＭ上に移植されたいずれ の組織（例えば腫瘍組織）の増殖も容易にモニターできる。最後に、このアッセ ーは、アッセー系の中に毒性に対する内部制御が存在するので特に有用である。

ニワトリ胎児はいずれのテスト試薬にも曝すことができ、したがって、胎児の健 康状態は毒性の指標である。

第三のアッセーは、ウサギのインビボ眼球モデルで脈管形成を測定するが、こ れはウサギ眼球アッセーと称される。ウサギ眼球アッセーは、他の研究者によっ て詳細に記載され、さらに脈管形成抑制物質（例えばサリドマイド）の存在下で 脈管形成および新規血管新生の両方を測定するために用いられた(D'Amatoら、Pr oc．Natl．Acad．Sci.，91:4082-4085(1994))。

新規血管新生過程（角膜の辺縁から角膜内へ増殖するウサギの血管によって実 証される）が、眼球の本来透明な角膜を通して容易に見ることができるので、ウ サギ眼球アッセーは、インビボ脈管形成の十分に認知されたアッセーモデルであ る。さらに、新規血管新生もしくは新規血管新生の退行の刺激または抑制の程度 および量の両方が時間経過において容易にモニターできる。

最後に、ウサギはいずれのテスト試薬にも曝すことができ、したがって、ウサ ギの健康状態がテスト試薬の毒性の指標である。

第四のアッセーは、マウス：ヒトキメラ−マウスモデルにおける脈管形成を測 定し、キメラマウスアッセーと称される。このアッセーは、他の研究者によって 詳細に記載され、さらに本明細書で、脈管形成、新規血管新生および腫瘍組織の 退縮を測定するために詳述される(Yanら、J．Clin．Invest.，91:986-996(1993) )。キメラマウスアッセーは、移植された皮膚移植片が正常なヒト皮膚組織と組 織学的に類似し、完全組織の新規血管新生が生じ、この場合、実際のヒトの血管 が移植されたヒトの皮膚から、移植されたヒト皮膚の表面のヒト腫瘍内に増殖し ていくので、インビボの脈管形成の有用なアッセーモデルである。ヒト移植片へ の新規血管新生の起始点は、ヒト特異的内皮細胞マーカーを用いて新規血管新生 の免疫組織化学的染色によって明らかにすることができる。

本明細書で示すように、キメラマウスアッセーは、新しい血管増殖の退行の量 および程度の両方について新規血管新生の退行を明らかにする。さらに、移植皮 膚上に移植されたいずれの組織（例えば腫瘍組織）の増殖に対する影響も容易に モニターできる。最後に、アッセー系の中に毒性に対する内部制御が存在するの でこのアッセーは有用である。キメラマウスはいずれのテスト試薬にも曝すこと ができ、したがって、マウスの健康状態は毒性の指標である。実施例 本発明に関する以下の実施例は説明のためであり、本発明を具体的に限定する ものと解釈されるべきではない。さらにまた、当業者の視野内にある、現時点で 明らかなまたは将来開発される種々の変形も、この後に続く本発明の請求の範囲 内にあると考えられるべきである。

１．合成ペプチドの調製 表１に示した直線状および環状ペプチドを、例えば以下の論文に記載された標 準的固相合成技術を用いて合成した（Merrifield，Adv．Enzymol.，32:221-96(1 969); G.B．Fields & R.L．Noble，Int．J．Peptide Protein Res.，35:161-214 (1990)）。

２グラム（ｇ）のBOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe(配列番号１)を先ず６ ０ミリリットル（ｍｌ）のメタノール（２Ｎの水酸化ナトリウム１．５ｍｌが添 加されている）に溶解して混合物を作製した。続いてこの混合物を２０°Ｃで３ 時間攪拌した。蒸発後、残留物を水にとり、希塩酸でｐＨ３に酸性化し、エチル 酢酸で抽出した。抽出物をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、再度蒸発させて得られたBO C-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH（配列番号２）をジオキサン中の２Ｎ塩酸２０ ｍｌで、２０°Ｃ２時間攪拌した。得られた混合物を蒸発させて、H-Gly-D-Arg- Gly-Asp-Phe-Val-OH（配列番号３）を得、続いて１８００ｍｌのジクロロメタン と２００ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の混合物中に溶解し、その後０ °Ｃに冷却した。続いて、０．５ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ Ｉ）、０．３ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ）および０．２３ ｍｌのＮ−メチルモルフォリンを攪拌しながら連続して加えた。

得られた混合物を０°Ｃでさらに２４時間、２０°Ｃで４８時間攪拌した。こ の溶液を濃縮し、混合ベッドイオン交換器で処理し塩を除去した。生じた樹脂を ろ過で除去した後、清澄溶液を蒸発させ、残留物をクロマトグラフィーで精製し てシクロ(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(配列番号４)を回収した。表１に示した 以下のペプチド（１文字コードのアミノ酸残基略語を用い、ペプチド番号により 区別されている）が同様に得られた：シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(配列番号 ５)；シクロ(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)(配列番号６)；シクロ(Arg-D-Ala-Asp-Phe -Val)(配列番号９)；シクロ(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)(配列番号７)。ペプチド６ ２１８４の配列と同一の配列を有する６６２０３と称するペプチドは、６２１８ ４に存在するＴＦＡの塩と異なりＨＣｌ塩を含むことだけが後者と異な っていた。実施例７（合成ペプチドが用いられている）で述べる脈管形成抑制ア ッセーでは、ＨＣｌをもつこの６６２０３ペプチドは、ＴＦＡをもつ同一のペプ チドより脈管形成抑制でわずかに効果が高かった。

ペプチド６２１８５の配列と同一の配列を有する６９６０１と称するペプチド は、６２１８４に存在するＴＦＡ塩ではなくＨＣｌ塩を含むことだけが後者と異 なる。

環状ペプチドｃ−ＲＡＤｆＶ（６９６０１）はフィブリノーゲンのインテグリ ンα_vβ₃への結合を抑制し、フィブリノーゲンのインテグリンα_IIbβ₃またはα₅ β₁への結合は抑制しないことが示された(Pfaffら、J．Biol．Chem.,269:20233 -20238(1994))。したがって、ペプチドｃ−ＲＡＤｆＶはα_vβ₃に特異的である 。

２．単クローン性抗体 ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ９５３７により分泌される単クローン性抗体Ｌ Ｍ６０９は、セファロース−ヒラマメレクチンビーズに吸着させた分離α_vβ₃を 用いた免疫によって標準的ハイブリドーマ法で製造された。このα_vβ₃は、Ｍ２ １と称するヒトミエローマ細胞から分離し、抗体はチェレッシュらの記載にした がって作製した(Chereshら、J．Biol．Chem.，262:17703-17711(1987))。Ｍ２１ 細胞はモートン博士(Dr．D.L．Morton，University of California，ロサンゼル ス、カリフォルニア)により提供され、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｍｇ／ｍ ｌの硫酸ジェンタマイシンおよび１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０ 培養液で浮遊培養として増殖させた。

単クローン性抗体ＬＭ６０９は、特異的にα_vβ₃複合体と免疫的に反応し、α_v サブユニットともβ₃サブユニットともまたは他のインテグリンとも免疫的に反 応しないことが示された。

３．α_vβ₃発現の組織分布の特徴 Ａ．抗インテグリンレセプター抗体による免疫蛍光 創傷治癒の間、血管の基底膜はいくつかの粘着蛋白（ヴォン・ヴィレブランド 因子、フィブロネクチンおよびフィブリンを含む）を発現させる。さらに、粘着 レセプターのうちのインテグリン類のいくつかは、培養平滑筋細胞および内皮細 胞の表面で発現される(Cheresh、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，84:6471(1987) ;Janatら、J．Cell Physiol.，151:588(1992); Chengら、J.Cell Physiol.,139: 275(1989)を参照のこと)。α_vβ₃（チェレッシュが記載したように（Proc．Natl ．Acad．Sci.，USA，84:6471(1987)）、ヴォン・ヴィレブランド因子、フィブリ ノーゲン（フィブリン）およびフィブロネクチンに対する内皮細胞レセプター） は、これらのインテグリンの中に存在する。このインテグリンは、内皮細胞の移 動へと先導するカルシウム依存性シグナリング経路を開始させ、したがってリー ベルシーら(Leavelseyら、J．Cell Biol.，121:163(1993))が記載したように、 血管細胞生物学において基礎的な役割を果たすように思える。脈管形成中のα_v β₃発現を調べるために、ヒトの創傷の肉芽形成組織または隣接正常皮膚を同意 患者より採取し、１ｍｌの燐酸緩衝食塩水で洗浄し、Ｏ．Ｔ．Ｃ． 培地（Tissue Tek）に包埋した。この包埋組織を液体窒素中で約３０から４５秒 瞬間冷凍した。クリオスタットミクロトーム上のこの冷凍ブロックから６ミクロ ンの厚さの切片を切り出し、続いてβ₃インテグリン（α_vβ₃またはα_IIbβ₃） またはインテグリンのβ₁亜類に特異的な抗体を用いて免疫ペルオキシダーゼ染 色を施した。

正常ヒト皮膚および創傷の肉芽形成組織の染色の結果は図１Ａ−１Ｄに示す。

単クローン性抗体ＡＰ３およびＬＭ５３４（それぞれβ₃およびβ₁インテグリン に対して誘導された）が、冷凍切片の免疫組織化学分析のために用いられた。４ 人の異なる供与者の組織を用いた実験で同一の結果が得られた。光学顕微鏡写真 は３００×の倍率で示されている。

α_vβ₃インテグリンは、肉芽形成組織の血管で豊富に発現されたが（図１Ｂ） 、同じ供与者の正常皮膚の真皮および上皮では検出できなかった（図１Ａ）。対 照的に、β₁インテグリンは、正常皮膚（図１Ｃ）および肉芽形成組織（図１Ｄ ）の両方の血管および支質細胞で、さらにアダムスら(Adamsら、Cell，63:425(1 991))の報告で先に示された通り上皮内の基底細胞で豊富に発現された。

Ｂ．抗リガンド抗体による免疫蛍光 それぞれβ₃およびβ₁インテグリン、ヴォン・ヴィレブランド因子およびラミ ニンに対するリガンドの存在について、上記のように調製したまた別の正常ヒト 皮膚および肉芽形成組織の切片を調べた。ヴォン・ヴィレブランド因子は、正常 ヒト皮膚（図２Ａ）および肉芽形成組織（図２Ｂ）の血管に局在し、一方、ラミ ニンは、両組織の上皮基底膜の他、すべての血管に存在した（図２Ｃおよび２Ｄ ）。

Ｃ．癌組織の抗α_vβ₃抗体の分布 上記の分析に加えて、ヒトの患者から得た癌組織の生検材料もまたα_vβ₃の存 在および分布について調べられた。インテグリンレセプター複合体、α_vβ₃に特 異的な実施例２で調製された単クローン性抗体ＬＭ６０９で染色したという点を 除き、組織は実施例１Ａで述べたように調製された。さらに、代表的な腫瘍例を ブリン固定液(Bulin Fixative)で８時間固定し、連続切片を切り出してＨ＆Ｅ染 色することによって、組織はまた顕微鏡による組織分析用に調製された。

膀胱癌、大腸癌、乳癌および肺癌組織の免疫ペルオキシダーゼ染色の結果は図 ３Ａ−３Ｄに示す。α_vβ₃は、４種の癌生検材料に存在する血管にのみ豊富に発 現し、これら組織に存在する他の細胞には全く存在しない。

ここに詳述した結果は、したがって、α_vβ₃インテグリンレセプターは、特定 の組織型（すなわち肉芽形成組織、転移組織、および脈管形成が生じているその 他の組織）で選択的に発現し、新しい血管の形成が停止している正常な組織では 発現しないことを示している。これらの組織は、それゆえ、本発明の治療面につ いての理想的な標的を提供する。

４．リガンド−レセプター結合アッセーにより検出されるα_vβ₃特異的合成ペプ チドの同定 精製リガンド−レセプター結合アッセーで、α_vβ₃およびα_IIbβ₃レセプター 結合活性と拮抗するそれらの能力を測定することによって、実施例１で調製され た合成ペプチドをスクリーニングした。これら結合実験の方法は以下の論文に記 載されているが(Barbasら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，90:10003-10007(199 3); Smithら、J．Biol．Chem.，265:11008-11013(1990); Pfaffら、J．Biol．Ch em.，269:20233-20238(1994))、これらの内容は参照により本明細書に含まれる 。

ここで述べるのは、レセプターが固形支持体に固定され、拮抗物質が可溶性で あるリガンド−レセプター結合アッセーで拮抗物質を同定する方法である。さら に、リガンドが固形支持体に固定され、レセプターおよび拮抗物質が可溶性であ るリガンド−レセプター結合アッセーも開示する。

簡単に記せば、選択した精製インテグリンを、ウェル当たり５０ナノグラム（ ｎｇ）の被覆濃度でタイターテック(Titertek)微量定量板（マイクロタイター） に別々に固定した。リガンド−レセプター結合アッセーで用いられたレセプター の精製は当分野で周知であり、当業者にとって通常の方法で容易に得ることがで きる。４°Ｃで１８時間保温した後、プレート上の非特異的結合部位をトリス緩 衝食塩水中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１０ミリグラム／ミリリットル（ ｍｇ／ｍｌ））で封鎖した。抑制実験のためには、表１の種々の濃度の選択ペプ チド（¹²⁵Ｉ−ビトロネクチンまたは¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲンのインテグリ ンレセプター）をα_vβ₃およびα_IIbβ₃への結合を妨害する能力について調べた 。これらのリガンドは、特定のインテグリン（α_vβ₃に対するビトロネクチンお よびα_IIbβ₃に対するフィブリノーゲン）について最適の結合を示したが、フィ ブリノーゲンのいずれかのレセプターへの結合を阻害する、ペプチドを用いた結 合抑制実験は、レセプターのリガンドへの結合を１／２最大抑制するために必要 なペプチド量のマイクロモル（ｕＭ）単位での正確な決定を可能にした。放射能 標識リガンドは１ｎＭの濃度で用いられ、結合は非標識合成ペプチドで別々に実 施された。

３時間保温した後、遊離リガンドを洗浄により除去し、結合リガンドをガンマ 計測により検出した。別々に固定したα_vβ₃およびα_IIbβ₃レセプターへのレセ プターおよび放射能標識フィブリノーゲンの結合を抑制するために表１に示した 選択環状ペプチドを用いたアッセーで得られたデータは、データの点数間誤差が 典型的には１１％以下で高度に再現性があった。マイクロモル（ｕＭ）でのＩＣ₅₀ （ＩＣ₅₀ｕＭ）は２つのデータ点数の平均±標準偏差として表２に示したよう に表した。

したがって、ＲＧＤ含有またはＲＧＤ誘導環状ペプチド６２１８１、６２１８ ４、６２１８５および６２１８７（各々１個のＤ−アミノ酸残基をもつ）は、α_IIb β₃レセプターへのフィブリノーゲン結合の抑制と比較したとき１／ ２最大抑制に必要なペプチド濃度はより小さいことで示されるように、α_vβ₃レ セプターへの優先的なフィブリノーゲン結合抑制を示した。対照的に、その他の ＲＧＤ含有またはＲＧＤ誘導環状ペプチド、６２１８６、６２１７５および６２ １７９は、α_vβ₃へのフィブリノーゲン結合阻害において有効でないか、または α_vβ₃と比較してα_IIbβ₃へのフィブリノーゲン結合の優先的抑制を示した。こ れらの結果は、環状ペプチドＲＧＤＦＶ（ここでＦはＤ−アミノ酸残基を示す） は、フィブリノーゲンのα_vβ₃インテグリンへの結合を特異的に抑制するが、α_IIb β₃またはα₅β₁インテグリンへのそれは抑制しないというパフらの最近の報 告(Pfaffら、J．Biol．Chem.，269:20233-20238(1994))と一致する。同様な結合 抑制アッセーをＲＧＤモチーフ（この配列はα_vレセプターサブユニット、α_IIb レセプターサブユニットまたはビトロネクチンリガンドアミノ酸残基配列に由来 した）をもつ、または欠いている直線状ペプチドで実施した。直線状ペプチド、 ６２８８０（ＶＮ由来アミノ酸残基３５−４９）、６２４１１（α_v由来アミノ 酸残基６７６−６８７）、６２５０３（α_v由来アミノ酸残基６５５−６６７） および６２５０２（α_IIb由来アミノ酸残基配列２９６−３０６）の配列は表１ に示す。これらペプチドの各々は、ビトロネクチン（ＶＮ）またはフィブリノー ゲン（ＦＧ）のα_IIbβ₃またはα_vβ₃のいずれかへの結合抑制アッセーに別々に 用いられた。各実験についての個々のアッセーのマイクロモルでのＩＣ₅₀のデー タ（ＩＣ₅₀ｕＭ）は表３に示す。

直線状ペプチドを用いた選択インテグリンレセプターへのリガンド結合抑制ア ッセーの結果は、α_IIbβ₃レセプターへのそれと比較して１／２最大抑制に必要 なペプチド濃度がより小さいことによって示されるように、ペプチド６２８８０ のみが、ＦＧまたはＶＮのα_vβ₃への１／２最大結合を抑制することに有効であ ることを示している。その他の直線状ペプチドのいずれもα_vβ₃へのリガンド結 合を阻害する効果をもたなかった。ただし、ペプチド６２５０２は、α_IIbβ₃へ のＶＮ結合の阻害に有効であった。

したがって、本明細書に記載するリガンド−レセプターアッセーは、本発明の 実施でビトロネクチンレセプター（α_vβ₃）拮抗物質として使用されるように、 特定のインテグリンレセプター（特にα_vβ₃）に対して選択的特異性を示す環状 および直線状合成ペプチドの両方のスクリーニングに用いることができる。

５．未処置ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）の特徴 Ａ．ＣＡＭの調製 脈管形成は、正常な胎児の脈管形成が成熟血管の形成をもたらした後で、ニワ トリの漿尿膜で誘発することができる。文献(Leibovichら、Nature，329:630(19 87);Ausprunkら、Am．J．Pathol.，79:597(1975))に記載されたように、脈管形 成は、特定のサイトカインまたは腫瘍フラグメントに反応して誘発されることが 明らかにされた。ＣＡＭは、実施例６および７でそれぞれ述べるように、引き続 き脈管形成および脈管形成抑制を誘発するためにニワトリ胎児から調製された。

１０日齢のニワトリ胎児はマックインタイヤー養鶏場（McIntyre Poultry，レー クサイド、カリフォルニア）から入手し、６０％の湿度で３７°Ｃで保温した。

小さな工芸用ドリル(Dremel，Division of Emerson Electric Co．レーシーン、 ウィスコンシン)を使って、直接卵の先端の気嚢上の卵殻に小孔を開けた。卵を 光で検卵して予め調べた胎児血管の存在しない領域で卵の広い方の側面上に第二 の孔をドリルで開けた。最初の孔に陰圧をかけ、その結果ＣＡＭ（漿尿膜）を卵 殻膜から引き剥がし、ＣＡＭ上に偽の気嚢を作製した。小さな模型用輪状やすり （Dremel）を使って、１．０ｃｍ×１．０ｃｍの真四角の窓を沈降ＣＡＭの上の 卵殻に開けた。この小さな窓は下に横たわるＣＡＭに直接アクセスすることを可 能にした。

得られたＣＡＭの調製物を続いて以下の２通りのいずれかの時期で用いた： ＣＡＭへの追加の処置を行わない胎児発生６日（活発な新規血管新生が認められ るステージ）、これは胎児の新規血管新生に対する影響を調べるために用いるモ デルとなる；胎児発生１０日、ここでは脈管形成は鎮静化している。後者の調製 物は、したがって、実施例６で述べるようにサイトカイン処置または腫瘍との接 触に反応して脈管形成再開を誘発させるために本発明で用いられた。

Ｂ．ＣＡＭの組織学 ニワトリ胎児ＣＡＭおよび／または、実施例８で述べるようにニワトリ胎児か ら切除したヒトの腫瘍の顕微鏡構造を調べるために、ＣＡＭおよび腫瘍を実施例 ３Ａで述べたように冷凍切片用に調製した。免疫蛍光分析用に冷凍ブロックから クリオスタットミクロトームで６ミクロンの厚さの切片を切り出した。

図４は、未処置１０日齢ＣＡＭの血管のない領域の典型的な光学顕微鏡写真を 示す。ＣＡＭ系の脈管形成は、胎児発生のこのステージまでに鎮静化しており、 この系は、隣接領域からその時点で一切血管が存在しないＣＡＭ領域へと、現存 する血管から新規な血管構造の発生を刺激するために本発明で有用である Ｃ．免疫蛍光で検出されるＣＡＭのインテグリンプロフィル ＣＡＭ組織に存在するインテグリンレセプターの組織分布を見るために、腫瘍 組織およびニワトリＣＡＭ組織の両方の６ミクロン（ｕｍ）の冷凍切片をアセト ンで３０秒固定し、バックらの記載(Buckら、J．Cell Biol.，107:2351(1988)) にしたがって、β₁インテグリンサブユニットに特異的な単クローン性抗体、ｍ ＡｂＣＳＡＴ（したがってコントロールとして使用）の１０マイクログラム／ミ リリットル（uｇ／ｍｌ）、または実施例２で調製したＬＭ６０９で免疫蛍光染 色を施した。一次染色の後、１：２５０希釈のヤギ抗マウスローダミン標識二次 抗体（Tago）で染色し、一次免疫反応生成物を検出した。続いて、この切片をツ ァイス（Zeiss）の免疫蛍光化合物用顕微鏡で調べた。

免疫蛍光分析の結果は、未処置１０日ニワトリ胎児に存在する成熟血管はイン テグリンβ₁サブユニット（図５Ａ）を発現することを示した。対照的に、図５ Ａに示した組織の連続切片では、ＬＭ６０９との免疫反応性は認められなかった （図５Ｂ）。したがって、ＬＭ６０９抗体によって検出されるインテグリンα_v β₃は、１０日齢の未処置ニワトリ胎児に存在する成熟血管では活発に発現 されていなかった。ＣＡＭモデルおよび以下の実施例で示すように、血管が正常 な胎児発生で新規の増殖を行っているか、またはサイトカインもしくは腫瘍によ って誘発を受けているとき、血管はα_vβ₃を発現する。しかしながら活発な新規 血管新生に続いてひとたび血管の成長が停止するや、α_vβ₃の発現は免疫蛍光分 析によっては検出不能のレベルまで減少する。成熟血管における発現の欠如と較 べて、脈管形成を経ている血管におけるこのようなα_vβ₃発現の調節は、ＣＡＭ の脈管形成系を用いたモデル系として以下の実施例で示すように、脈管形成を制 御しさらに抑制するために本発明の固有の能力を提供する。

６．ＣＡＭ脈管形成アッセー Ａ．増殖因子によって誘発される脈管形成 脈管形成は、実施例５Ａで引用したようにサイトカインや増殖因子によって誘 発されることが示された。ここで述べる実験では、実施例５で述べたＣＡＭ調製 物での脈管形成は、この中で説明するようにＣＡＭ血管上に局所的に存在する増 殖因子によって誘発された。

脈管形成は、ハンクス調整塩溶液(Hanks Balanced Salt Solution(ＨＢＳＳ)) (GIBCO，グランドアイランド、ニューヨーク)または１５０ナノグラム／ミリリ ットル（ｎｇ／ｍｌ）の組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（βＦＧＦ）(Genzy me，ケンブリッジ、マサチューセッツ)を含むＨＢＳＳを飽和させた５ミリメー トル（ｍｍ）×５ｍｍのワットマンフィルターディスク(Whatman Filter Paper No.1)を１０日齢のニワトリ胎児の血管のない領域に置くことによって誘発され た。窓は後でテープを使って閉じた。他のアッセーでは、１２５ｎｇ／ｍｌのβ ＦＧＦも血管増殖を誘発するために効果があった。脈管形成は、７２時間後光学 顕微鏡でモニターした。ＣＡＭは瞬間冷凍し、６ｕｍの凍結切片をアセトンで固 定して、１０ｕｇ／ｍｌの抗β₁単クローン性抗体ＣＳＡＴまたはＬＭ６０９の いずれかを用いて、実施例５Ｃで述べたように免疫蛍光によって染色した。

図５Ｃの免疫蛍光光学顕微鏡写真は、図５Ｂに示すように未処置のニワトリＣ ＡＭでのα_vβ₃発現の欠如と対照的に、βＦＧＦ誘発脈管形成時にはニワトリＣ ＡＭ上に増強されたα_vβ₃が発現することを示す。α_vβ₃は、βＦＧＦ 処置ＣＡＭの多くの血管で（７５から８０％）容易に検出できた。さらに、イン テグリンβ₁の発現は、未処置のＣＡＭで認められる発現と変わりなく、β₁はま た刺激血管で容易に検出可能であった。

続いて、ＣＡＭクリオスタット切片のレーザー共焦点画像分析により、βＦＧ Ｆ誘発脈管形成中のα_vβ₃とβ₁インテグリンの相対的発現を定量した。続いて この染色切片をツァイスのレーザー共焦点顕微鏡で調べた。２５個のＬＭ６０９ 染色血管および１５個のＣＳＡＴ染色血管（３５０から３５００ｍｍ²の範囲に あり、平均サイズは〜１２００ｍｍ²）を任意の視野から選び、レーザー共焦点 画像分析による任意単位で単位面積当たりの各血管について平均ローダミン蛍光 を測定した。データは血管の任意単位による平均蛍光量±標準誤差として表した 。

図６に表した結果は、ウィルコクソンの順位合計試験(Wilcoxon Rank Sum Tes t)（Ｐ＜０．０００１）で決定されたように、βＦＧＦ処置ＣＡＭではα_vβ₃染 色は顕著に増強（４倍）されることを示した。一方、β₁染色はβＦＧＦ処置の 場合と顕著には異ならなかった。

さらに、このＣＡＭアッセーを用いて、別の有効な脈管形成誘発物質である腫 瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）のβ₁およびβ₃インテグリンの発現における影響を 調べた。βＦＧＦまたはＴＮＦαのいずれかをしみこませ、１０日齢胎児のＣＡ Ｍ上に静置したフィルターディスクは、７２時間後に局所的脈管形成を促進させ ることが分かった。

これらの結果は、未処置（図７Ａ）、βＦＧＦ処置（図７Ｂ）またはＴＮＦα 処置（図７Ｃ）ＣＡＭの光学顕微鏡写真で示す。血管は、βＦＧＦおよびＴＮＦ α処置調製物では容易に識別できるが、未処置のＣＡＭでは認められない。した がって、増殖因子／サイトカインの局所的適用は、隣接領域の成熟血管から最初 は血管が存在しなかった領域へと脈管形成の誘導をもたらす。図５Ｃで示された ようにβＦＧＦで誘発される血管および同時に発生するα_vβ₃発現から考えると 、ＴＮＦαの処置は匹敵する活性をもたらす。

これらの発見は、ヒトおよびニワトリの両方で、脈管形成中の血管は強化され たα_vβ₃発現を示すことを示唆する。これに一致して、培養内皮細胞上の α_vβ₃発現は、以下の論文に記載されたように(Janatら、J．Cell Physiol.，15 1:588(1992); Enensteinら、Exp．Cell Res.，203:499(1992);およびSwerlickら 、J．Invest．Der.，99:715(1993))、種々のサイトカインによってインビトロで 誘発することができる。

増殖因子誘発脈管形成の抗体およびペプチド抑制物質による影響は、実施例７ Ａおよび７Ｂに示される。

Ｂ．胎児の脈管形成 胎児の新規血管系の自然状態での形成に対する脈管形成抑制物質の効果を調べ るＣＡＭ調製物は、先に述べたように６日齢のニワトリ胎児であった。この発生 段階では、血管は新規の増殖を行っており、したがってα_vβ₃が胎児の脈管形成 に参画するか否かを決定するための有用な系を提供する。このＣＡＭ系は、アッ セーを胎生１０日目ではなく６日目に実施した点を除き上記のように調製された 。本発明の抗体およびペプチドによる処置の胎児脈管形成に対する影響は実施例 ７Ｃに示す。

Ｃ．腫瘍誘発脈管形成 腫瘍誘発脈管形成におけるα_vβ₃の役割を調べるために、先に増殖させ１７日 齢のニワトリ胎児のＣＡＭから分離した種々のα_vβ₃陰性ヒトメラノーマおよび 癌フラグメントを、ブルックスらの論文（Brooksら、J．Cell Biol.，122:1351( 1993)）および本明細書で述べるようにＣＡＭアッセーに用いた。このフラグメ ントは、緩衝液の存在だけで強度の新規血管新生を誘発した。

脈管形成は、腫瘍フラグメントをＣＡＭ上に直接添加することによってＣＡＭ 系で誘発された。ニワトリ胎児ＣＡＭの調製は、上記で述べた方法と同一であっ た。ディスクの代わりに、重量で５０ミリグラム（ｍｇ）から５５ｍｇのヒトメ ラノーマ腫瘍Ｍ２１Ｌ、ヒト肺癌腫瘍ＵＣＬＡＰ−３、ヒト膵臓癌細胞株ＦＧ(C hereshら、cell，58:945-953(1989))、またはヒト喉頭癌細胞株ＨＥｐ３（これ ら全てはα_vβ₃陰性腫瘍である）を、当初は血管が存在しない領域のＣＡＭ上に 静置した。

Ｍ２１Ｌヒトメラノーマ細胞株、ＵＣＬＡＰ−３ヒト肺癌細胞株、ＦＧ膵臓癌 細胞株またはＨＥｐ３ヒト喉頭癌細胞株（全てα_vβ₃陰性）を用いて、ニワト リ胎児のＣＡＭ上に固形ヒト腫瘍を増殖させた。８×１０⁶のＭ２１Ｌ、ＵＣＬ ＡＰ−３およびＦＢまたは５×１０⁵のＨＥｐ３細胞の単一細胞懸濁を、全容積 ３０マイクロリットル（ｕｌ）のＨＢＳＳとしてＣＡＭに用いた。窓をテープで 封じ、胎児を７日間保温して、ヒト腫瘍病巣を増殖させた。７日の終わりに（１ ７日齢胎児）、腫瘍をＣＡＭから切除し、周辺のＣＡＭ組織を切り取った。腫瘍 を５０ｍｇから５５ｍｇの腫瘍フラグメントにスライスし、脈管形成アッセーま たは腫瘍増殖アッセーのいずれかに使用した。実施例６Ａで述べたように、新た な１０日齢のニワトリ胎児ＣＡＭの血管を欠いた領域にこの腫瘍フラグメントを 静置した。

実施例３Ａで述べたように、α_vβ₃発現についてニワトリ胎児ＣＡＭ上のイン ビボ増殖腫瘍をｍＡｂＬＭ６０９で染色した。腫瘍細胞の特異的染色は認められ ず、α_vβ₃発現の欠如を示唆した。

その後続いて、腫瘍誘発脈管形成に対する抗体およびペプチドの影響を測定す るために、実施例７Ｄおよび７Ｅで述べるように処置した。腫瘍の退縮並びに脈 管形成性血管および血管細胞のアポプトーシスに対する抗体およびペプチドの影 響を測定するために、これらＣＡＭ腫瘍調製物をまた実施例８、９および１２で 述べるように処置した。

７．ＣＡＭアッセーで測定された脈管形成の抑制 Ａ．抑制物質の局所適用による増殖因子誘発脈管形成の抑制 １）単クローン性抗体による処置 α_vβ₃が脈管形成で活発な役割を果たすか否かを決定するために、βＦＧＦま たはＴＮＦαで飽和させたディスクをＣＡＭ上に静置し、続いて単クローン性抗 体（ｍＡｂとも称する）、ＬＭ６０９（α_vβ₃に特異的）、ＣＳＡＴ（β₁に特 異的）またはＰ３Ｇ２（α_vβ₅に特異的）をこの調製物に添加した。

脈管形成は、βＦＧＦで飽和させたフィルターディスクで１０日齢胎児のＣＡ Ｍで誘発された。続いて、全容積２５ｕｌの滅菌ＨＳＢＢ中に２５ｍｇのｍＡｂ を含むＨＢＳＳ５０ｍｌでこの円盤フィルターを０、２４および４８時間処理し た。７２時間で、ＣＡＭを採取し３５ｍｍのペトリ皿に入れ、１ｍｌの燐酸緩衝 食塩水で１度洗浄した。続いて、２人の観察者により二重盲検様式で、濾 紙の裏側およびＣＡＭ組織をオリンパス立体顕微鏡で調べた。ディスクの直下の ＣＡＭの血管浸潤でＣＡＭが＞５０％減少を示したとき、脈管形成抑制は顕著で あると考えた。実験は、１条件につき６から７個の胎児を用いて、１抗体につき ４回繰り返された。

βＦＧＦ誘発脈管形成に対するｍＡｂ処置の影響は図８Ａに示す。血管が存在 しない未処置ＣＡＭ調製物は、βＦＧＦ血管誘発（図８Ｂに示す）およびｍＡｂ によるＣＡＭに対する影響（図８Ｃ−８Ｅ）との比較を提供するために図８Ａに 示した。ｍＡｂＬＭ６０９で処理したＣＡＭの約７５％が、図８Ｅに示すように 脈管形成の＞５０％抑制を示し、これらの多くは血管の浸潤を欠いているようで あった。対照的に、緩衝コントロール（図８Ａ）並びにｍＡｂＣＳＡＴ（図８Ｃ ）およびＰ３Ｇ２（図８Ｄ）で処理したフィルターは、常に強度の血管新生を示 した。

同じ結果が脈管形成がＴＮＦαで誘発されたとき得られた。血管を欠く領域近 くの正常な血管の発達から出現する、以前から存在していた成熟血管に対するこ れら同じ抗体の影響を調べるために、ｍＡｂで飽和させたフィルターディスクを 、サイトカインを局所添加していない１０日齢胎児のＣＡＭの血管形成領域に静 置した。立体顕微鏡下で可視化させて調べたとき、３種のｍＡｂのいずれも以前 から存在していた血管に影響を与えなかった。したがって、ｍＡｂＬＭ６０９は 新しい血管増殖のみを選択的に抑制し、隣接領域に存在する成熟血管には影響を 与えなかった。同様な効果は、それぞれ実施例７Ａ２）および７Ｅ２）で述べる ように局所的にまたは静脈内に用いたとき、合成ペプチドでも認められた。

２）合成ペプチドによる処置 増殖因子誘発脈管形成に対する環状および直線状ペプチドの影響を決定するた めに、また本発明の合成ペプチドを用いてＣＡＭアッセーを実施した。実施例１ のようにペプチドを調製し、８０ｕｇのペプチドが全容積２５ｕｌの滅菌ＨＢＳ Ｓ中で提供された。このペプチド溶液を直ちにＣＡＭ調製物に適用し、続いて２ ４時間、および４８時間に再度適用した。７２時間でこの濾紙および周辺ＣＡＭ 組織を切り出し、上記のように観察した。

このアッセーの結果は、合成ペプチドが腫瘍誘発血管に静注された実施例 ７Ｅ２）で詳述する通り、図９Ａ−９Ｃに示したものと同様であった。ここで、 コントロールペプチド６２１８６については、βＦＧＦ誘発血管は図９Ａに示す ように変化しないままであった。対照的に、環状ＲＧＤペプチド６２８１４がフ ィルターに適用されたとき、血管の形成は抑制され、新しい血管構造を欠く領域 が残された。この効果は、下記の実施例７Ｅ２）で述べるように図９Ｂで示され る効果と外観上同様であった。さらに、静注されたペプチドについて図９Ｃでも 示されるように、成熟血管が、増殖因子飽和フィルターが静置された場所から離 れて存在する領域では、これら範囲外の血管に対して合成ペプチドの局所処理で は効果は認められなかった。したがって、脈管形成に対するペプチドの抑制活性 は、増殖因子によって誘発される脈管形成領域に限定され、以前から存在する近 くの成熟血管には影響を与えず、周辺組織にはいかなる有害な細胞毒性ももたら さない。

実施例１で調製し、表１に示した他の合成ペプチドを用いて、同様なアッセー が実施される。

Ｂ．抑制物質の静脈内適用による増殖因子誘発脈管形成の抑制 １）単クローン性抗体を用いた処置 ＣＡＭ調製物に静脈内注射された単クローン性抗体の増殖因子誘発脈管形成に 対する影響もまた、本発明で使用するために調べた。

静脈内注射のためのニワトリ胎児ＣＡＭの調製は、本質的には実施例７Ａで述 べた通りであるがいくつかの修飾を伴う。光で検卵する工程で際立つ血管を選び 、それらの位置を示すために卵殻に印を付けた。卵殻にドリルで孔を開け、さら にＣＡＭを落下させ、βＦＧＦ飽和濾紙を上記のようにＣＡＭに静置した。窓を 滅菌テープで封じ、胎児を孵卵器に戻した。２４時間後、卵殻側面の先に選んだ 際立つ血管上に直接注意深く第二の小孔を開けた。外側の卵殻を注意深く除去し 、胎児膜は傷をつけずにおく。鉱物油(Perkin-Elmer Corp、ノーウォーク、コネ チカット)の小滴で卵殻膜を透明にし、これによって血管を容易に見ることがで きる。精製滅菌ｍＡｂまたは合成ペプチド（後者は下記で詳述される）が、１胎 児当たり全容積１００ｕｌの滅菌ＰＢＳ中の２００ｕｇの投与量でただ１回３０ ゲージの注射針で血管に直接接種された。窓をテープで封じ、胎児を７２時間ま で 保温した。フィルターディスクおよび周辺ＣＡＭ組織を上記に述べたように分析 した。

先にＬＭ６０９が静脈内に接種されたＣＡＭ組織または腫瘍組織におけるＬＭ ６０９ｍＡｂの分布を知るために、本明細書および以下の実施例で示すように、 ＨＢＳＳ中の２．５％ＢＳＡを用いて１時間室温で固定切片を遮断し、続いてヤ ギ抗マウスローダミン標識二次血清（Tago）の１：２５０希釈で染色した。その 後、この切片をツァイスの免疫蛍光化合物顕微鏡で調べた。

ＣＡＭ調製物のβＦＧＦ誘発血管に対する静脈内抗体処理の結果は図１０Ａ− １０Ｃに示す。図１０Ａに、βＦＧＦ処理の結果として誘発された脈管形成を示 す。静脈内でｍＡｂＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅抗体）に曝されたとき、図１０Ｂに示す ようにβＦＧＦ誘発血管構造の状態に対して変化は認められなかった。対照的に 、βＦＧＦ誘発脈管形成ＣＡＭ調製物のＬＭ６０９（抗α_vβ₃抗体）による処理 は、図１０Ｃに示すように新しい血管のフィルター領域への増殖を完全に抑制し た。脈管形成に対するこの抑制効果は、したがってＬＭ６０９抗α_vβ₃特異的抗 体によるα_vβ₃レセプター活性の抑制から生じている。α_vβ₃の遮断はＣＡＭの フィルター部位への新規血管構造形成を抑制しないので、α_vβ₅は、したがって 新規血管の増殖のためのα_vβ₃と比較して必須ではない。

２）合成ペプチドによる処置 上記のＣＡＭ調製物の増殖因子誘発血管に、実施例１で調製した合成ペプチド を別々に静脈内注射する。血管の生存活性に対するこのペプチドの影響を同じよ うに調べる。

Ｃ．局所適用による胎児脈管形成の抑制 １）単クローン性抗体による処置 α_vβ₃が胎児の脈管形成に参画しているか否かを決定するために、ＣＡＭの血 管の新規な成長に対するＬＭ６０９の影響を６日齢の胎児（実施例５Ａで述べる ように活発な新規血管新生を特徴とするステージ）で調べた。ＣＡＭアッセーは 、実施例６Ｃで述べたように調製し、続いてｍＡｂで飽和させたディスクを６日 齢の胎児のＣＡＭにサイトカインの非存在下で局所的に適用した。３日後、ＣＡ Ｍを切り出し写真を撮った。各実験は１群につき６個の胎児を含み、２回繰 り返された。

抗体ＬＭ６０９（図１１Ｃ）はこのような条件下で血管の増殖を防止したが、 ＣＳＡＴ（図１１Ａ）またはＰ３Ｇ２（図１１Ｂ）は防止しなかった。このこと は、α_vβ₃は、脈管形成誘発のための添加増殖因子に依存しなかった胎児の新規 血管新生において基本的な役割を果たすことを示唆している。

２）合成ペプチドによる処置 実施例１で調製した合成ペプチドを上記のように調製したＣＡＭ調製物に、実 施例５Ａ２）で述べたようにＣＡＭへの局所的適用または血管への静脈内適用の いずれかで別々に加える。血管の生存活性に対するペプチドの影響を同じように 調べる。

Ｄ．局所適用による腫瘍誘発脈管形成の抑制 １）単クローン性抗体による処置 抗α_vβ₃拮抗物質、ＬＭ６０９並びにペプチド６２１８１、６２１８４、６２ １８５、６２１８７および６２８８０の胎児脈管形成への影響を調べた上記の脈 管形成アッセーに加え、腫瘍誘発脈管形成におけるα_vβ₃の役割もまた調べられ た。誘発物質として、α_vβ₃陰性ヒトＭ２１−Ｌメラノーマフラグメント（それ より前に増殖させ、１７日齢のニワトリ胎児のＣＡＭから分離されたもの）を用 いた。このフラグメントは実施例６Ｃに述べたように調製した。

実施例７Ａ１）で述べたように、２５ｕｌのＨＢＳＳ中に２５ｕｇの濃度でｍ Ａｂを腫瘍フラグメントに別々に局所適用し、続いて窓をテープで封じた。この ｍＡｂを同じ態様で２４時間および４８時間に再度加えた。７２時間で、腫瘍お よび周辺ＣＡＭ組織を実施例７Ａ１）で述べたように調べた。

実施例６Ｃで述べたように、腫瘍は、培養Ｍ２１−Ｌ細胞（ヘルディング−ハ ーベルマンらの報告のようにインテグリンα_vβ₃を発現しない(Felding-Haberma nnら、J．Clin．Invest.，89:2018(1992))を１０日齢のニワトリ胎児のＣＡＭに 移植することによって先ず誘導された。これらのα_vβ₃陰性フラグメントは、緩 衝液単独で、またはｍＡｂＣＳＡＴ（抗β₁）もしくはＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）の 存在下で強度に新規血管新生を誘発した。対照的に、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_v β₃）は、殆どの血管が腫瘍塊および周辺ＣＡＭに浸潤するのを 停止させた。

腫瘍誘発脈管形成に対するｍＡｂの影響を定量するために、２人の観察者が、 ＣＡＭの病巣面内の腫瘍に入り込む血管を立体顕微鏡下で二重盲検形式によって 数えた。図１２に示した各棒線は、２回の実験で各群１２個のＣＡＭから得た血 管の平均数±標準誤差を示している。

この定量分析は、ウィルコクソンの順位合計試験で求めたとき、緩衝液または 他のｍＡｂ（Ｐ３Ｇ２もしくはＣＳＡＴ）で処置した腫瘍と比較して、ｍＡｂＬ Ｍ６０９で処置した腫瘍に入る血管数は３倍減少することを明らかにした（Ｐ＜ ０．０００１）。Ｍ２１−Ｌ腫瘍はα_vβ₃を発現しないという事実は、ｍＡｂＬ Ｍ６０９は、腫瘍細胞にではなく血管に直接影響を与えることによって脈管形成 を抑制することを示唆している。これらの結果は、図３Ａ−３Ｄに示した癌組織 の生検材料におけるα_vβ₃の組織学的分布と一致するが、これらの図では、α_v β₃の分布は腫瘍内の血管に限定され、腫瘍細胞自体には存在しなかつた。

２）合成ペプチドによる処置 実施例１で調製した合成ペプチドが、上記のように腫瘍誘発脈管形成ＣＡＭア ッセー系に局所的に適用される。血管の生存活性に対するこれらペプチドの影響 が同じように調べられる。

Ｅ．静脈内適用による腫瘍誘発脈管形成の抑制 １）単クローン性抗体による処置 実施例７Ｄ１）で述べるように調製した腫瘍誘発血管をまた、静脈内注射によ りｍＡｂで処置した。実施例７Ｄ１）で述べるように腫瘍をＣＡＭに静置し、テ ープで窓を封じ、２４時間後に２００ｕｇの精製ｍＡｂを先に述べたようにニワ トリ胎児の血管に１回静脈内接種した。ニワトリ胎児をその後７日間保温した。

脈管形成の程度を続いて上記のように観察した。下記実施例８に述べるように、 この期間経過後に腫瘍を切除してそれらの重量を調べ、腫瘍の増殖または退縮に 対する抗体曝露の影響を決定した。

２）合成ペプチドによる処置 ＣＡＭアッセー系の腫瘍誘発血管構造をペプチドに曝したときの影響もまた調 べた。腫瘍−ＣＡＭ調製物を上記のように用いたが、ただしこの場合、ｍＡｂの 静脈内注射の代わりに、実施例１および実施例７Ａ２）で述べたように調製した 合成ペプチドが可視化された血管に別々に静脈内注射された。

ＨＣｌ塩を含む環状ペプチド、６６２０３およびコントロールペプチド６２１ ８６を用いたＣＡＭアッセーの結果は図９Ａ−９Ｃに示す。図９Ａで、コントロ ールペプチドによる処置は、腫瘍処理によって誘発され、ＣＡＭの本来は血管の 存在しない領域に増殖した豊富で太い血管に影響を与えなかった。対照的に、環 状ＲＧＤペプチド、６６２０３（α_vβ₃に対する拮抗物質）がフィルターに適用 されたとき、図９Ｂに示すように血管形成は抑制され、新しい血管構造の無い領 域が残った。腫瘍を配置した場所の近くに位置する血管に対して有害な影響は全 く存在しなかったことによって明らかなように、ＲＧＤ含有ペプチドの抑制効果 は特異的で局在的であった。したがって、図９Ｃでは、抑制ペプチドがＣＡＭア ッセー系に静脈内注射されたとき、腫瘍の配置場所の周辺ではあるが離れた領域 のＣＡＭに以前から存在する成熟血管に対しては影響は認められなかった。この ような場所に以前から存在する血管は、これら血管内に流れている抑制物質によ って影響を受けなかった。ただし、これら以前から存在する血管から腫瘍塊への 新規な血管の形成は抑制された。したがって、実施例４のリガンド−レセプター アッセーでα_vβ₃の拮抗物質であることが以前に示された、６６２０３および６ ２１８４を含む合成ペプチドは、発達しつつある血管に限定される脈管形成を抑 制するが、以前から存在する成熟した血管に対しては脈管形成を抑制しないこと が明らかにされた。さらに、ペプチドの静脈内輸液は、図９Ｃの無傷の血管構造 によって明らかなように、周辺領域に対して有害な細胞毒性を全くもたらさない 。

同じようなアッセーが実施例１で調製し、表１に示す他の合成ペプチドを用い て実施される。

８．ＣＡＭアッセーで測定したα_vβ₃拮抗物質による腫瘍組織の増殖抑制 実施例７Ｄ１）で述べたように増殖因子や腫瘍によって誘発される脈管形成に 対する抗α_vβ₃拮抗物質の影響を視覚で評価することに加え、曝露した後の腫瘍 塊への何らかの影響を測定することによってこの脈管形成への影響をまた測定 した。この分析のために、腫瘍誘発脈管形成ＣＡＭアッセー系を実施例６Ｃおよ び７Ｄで述べたように調製した。７日間の保温期間終了時に生じた腫瘍をＣＡＭ から切除し、一切の残余のＣＡＭ組織を除去して１ｍｌの燐酸緩衝食塩水で洗浄 し、各腫瘍の湿潤重量を求めた。

さらに、顕微鏡による組織分析用腫瘍の調製では、代表的な腫瘍例をブリン固 定液で８時間固定し、パラフィンに包埋した。連続切片を切り出し、ヘマトキシ リンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で顕微鏡分析のために染色した(Gladsonら、J.Cl in．Invest.，88:1924(1991))。切片の写真はオリンパス複合顕微鏡で２５０× で撮影した。

Ａ．局所適用 コントロール緩衝液（ＨＢＳＳ）、Ｐ３Ｇ２（抗α_vβ₅）またはＬＭ６０９（ 抗α_vβ₃）の局所適用で得られた典型的なヒトメラノーマ腫瘍（Ｍ２１Ｌ）の重 量の結果は表４に示す。各処置につき多数の胎児の平均腫瘍重量（ミリグラム、 ｍｇ）を調べ、表の下に示すように平均値の標準誤差と合わせて算出した。

ＣＡＭアッセー系でα_vβ₃陰性ヒトメラノーマ腫瘍塊をＬＭ６０９に曝露する と、未処置の平均腫瘍重量１７２ｍｇ±２６は５２ｍｇ±１３に減少した。Ｐ３ Ｇ２抗体はこの腫瘍塊に影響を与えなかった。したがって、α_vβ₃特異的ＬＭ６ ０９抗体の局所適用によるα_vβ₃レセプターの遮断は、前述の実施例に示したよ うに脈管形成の抑制とともに腫瘍の退縮をもたらした。Ｐ３Ｇ２に曝露すること によって生じた腫瘍塊の測定直径は、平均して約８ｍｍから１ｃｍであった。対 照的に、ＬＭ６０９処置腫瘍は直径が平均して２から３ｍｍであった。

これらの腫瘍の冷凍切片は、Ｐ３Ｇ２に曝された腫瘍については腫瘍細胞構造 は無傷で、対照的にＬＭ６０９に曝された腫瘍では組織化された細胞構造を欠い ていることが明らかとなった。α_vβ₃レセプター活性は、したがってα_vβ₃発現 新規血管構造の発達によって腫瘍塊に栄養を補給し続けるためにα_vβ₃陰性腫瘍 にとって必須である。本発明のα_vβ₃拮抗物質によるα_vβ₃の遮断は、 腫瘍への脈管形成の抑制をもたらし、最終的には腫瘍塊の減少をもたらす。

Ｂ．静脈内適用 コントロール緩衝液（ＰＢＳ、燐酸緩衝食塩水）、ＣＳＡＴ（抗β₁）または ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）の静脈内適用によってもたらされた代表的な癌腫（ＵＣ ＬＡＰ−３）の重量の結果は表５に示す。各処置につき多数の胎児の平均腫瘍重 量を調べ、表の下に示すように平均値の標準誤差を合わせて算出した。

ＣＡＭアッセー系におけるα_vβ₃陰性ヒト癌腫瘍塊のＬＭ６０９への曝露は、 未処置腫瘍の平均重量８５ｍｇ±７を３０ｍｇ±６に減少させた。ＣＳＡＴ抗体 は腫瘍塊重量に顕著な影響を与えなかった。したがって、α_vβ₃特異的ＬＭ６０ ９抗体の静脈内適用によるα_vβ₃の遮断は、そのような処置が前述の実施例で示 したように脈管形成抑制に加えて、上記でメラノーマ腫瘍塊の退縮をもたらした ように癌の退縮をもたらした。さらに、ヒトメラノーマ腫瘍の増殖は、ＬＭ６０ ９の静脈内注射によって同じように抑制された。

９．ＣＡＭアッセーで測定したα_vβ₃拮抗物質による腫瘍組織増殖の退縮 α_vβ₃拮抗物質の腫瘍増殖および生存に対する影響を調べるために、実施例５ Ａで述べたように、１０日齢胎児のＣＡＭにヒトメラノーマフラグメント並びに 肺、膵および喉頭癌フラグメントを静置した。

Ａ．静脈内適用 １）単クローン性抗体による処置 ａ．ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）およびＣＳＡＴ（抗β₁）による処置 α_vβ₃陰性ヒトメラノーマＭ２１−Ｌ、膵癌ＦＧ、ヒト肺癌ＵＣＬＡＰ−３ま たはヒト喉頭癌ＨＥｐ３の癌フラグメントをＣＡＭに移植後２４時間して、胎児 の静脈内にＨＢＳのみ、またはｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）もしくはＣＳＡＴ （抗β₁）のいずれか（３００ｕｇ／１００ｕｌ）を一回注射した。腫瘍をさら に６日間増殖させた。保温期間の終了時に、腫瘍を注意深く切除し、周辺ＣＡＭ 組織を除去した。腫瘍切除は、別々の２人の研究者が容易に区別できる固形腫瘍 塊を切除することによって実施した。これら腫瘍は識別が容易な辺縁を有し、し たがって固形腫瘍塊とは容易に区別できる薄い半透明膜（ＣＡＭ）は、腫瘍塊自 体を傷つけることなく切除された。切除腫瘍の重量を測定し、形態学的および組 織学的に調べた。

図１３に示すように、７日終了時の湿潤腫瘍重量を求め、処置前の最初の腫瘍 重量と比較した。各棒線は１群につき５−１０個の腫瘍の平均±ＳＥを示す。調 べた全ての腫瘍でコントロールと比較して、ｍＡｂＬＭ６０９は顕著に（Ｐ＜０ .００１）腫瘍増殖を抑制した。ＰＢＳまたはＣＳＡＴで処置した腫瘍は全例で 増殖した。対照的に、ｍＡｂＬＭ６０９はこれら腫瘍の増殖を防止しただけでな く、殆どの事例で強度の退縮を誘発した。重要なことには、これらの腫瘍細胞は インテグリンα_vβ₃を発現せず、増殖抑制はこの抗体の新規血管構造に対する抗 脈管形成作用によるものであり、腫瘍細胞に対する直接の作用ではないことを明 示している。

ｂ．ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）およびＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）による処置 実施例５Ａで述べたように、ヒトＭ２１−Ｌメラノーマ腫瘍フラグメント（５ ０ｍｇ）を１０日齢胎児のＣＡＭに移植した。２４時間後、胎児の静脈内にＰＢ Ｓのみ、またはｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）もしくはＰ３Ｇ２（抗α_vβ₃）の いずれかを一回（３００ｕｇ／１００ｕｌ）注射した。実施例９Ａ１）ａで述べ たように、腫瘍を増殖させ、ここで述べるように形態学的および組織学的に調べ た。

ｍＡｂＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）またはＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処置したＭ２１ −Ｌ腫瘍の代表例を形態学的に調べた。Ｐ３Ｇ２処置腫瘍は大きく（直径８ｍｍ ）て良好な血管新生が認められたが、一方、ｍＡｂＬＭ６０９で処置された抗体 は、はるかに小さく（３ｍｍ）、検出可能な血管を欠いていた。

組織学的切片を実施例９Ａ１）ａで述べたように、ヘマトキシリンおよびエオ シンで染色した調製物でこれら腫瘍をさらに調べた。図１４（上）に示すように 、ｍＡｂＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）で処置した腫瘍は、腫瘍基質の多くの血管（矢印 ）の他に分裂像（楔形）でも示唆されるように活発に分裂する多数の生きた腫瘍 細胞を示した。対照的に、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処置した腫瘍では、 元気な腫瘍細胞も血管もほとんど検出されなかった（図１４下）。これらの結果 は、インテグリンα_vβ₃の拮抗物質は腫瘍誘発脈管形成を抑制し、インビボでヒ トの種々の腫瘍の増殖停止および退縮に導くことを示している。７日間の腫瘍増 殖の後（１７日齢胎児）で調べた胎児は、α_vβ₃拮抗物質で処置されたか否かに かかわらず、全体的な検査では正常のようであったということを指摘することは 重要である。これらの発見は、このインテグリンの拮抗物質は発育胎児に毒 性を持たないらしいということを示す。

２）合成ペプチドによる処置 実施例５Ａで述べたように、ヒトＭ２１−Ｌメラノーマ腫瘍フラグメント（５ ０ｍｇ）を１０日齢胎児のＣＡＭに移植した。２４時間後に、胎児は、３００ｕ ｇ／１００ｕｌのシクロ−ＲＡＤｆＶ（６９６０１）またはシクロ−ＲＧＤｆＶ （６６２０３）のいずれかの静脈内注射を１回与えられた。合わせて７２時間し てから腫瘍を切除し、実施例９Ａ１）で述べたように立体顕微鏡で形態学的およ び組織学的に調べた。

図１５Ａから１５Ｅに示した写真は以下のように対応する：図１５Ａ、シクロ ＲＡＤｆＶペプチド（６９６０１）で処置した２組のサンプル；図１５Ｂ、シク ロＲＧＤｆＶペプチド（６６２０３）で処置した２組のサンプル；図１５Ｃ、シ クロＲＧＤｆＶペプチド（６６２０３）で処置した同じ胎児から採取した隣接Ｃ ＡＭ組織；図１５Ｄおよび１５Ｅ、高倍率（１３×）のペプチド処置腫瘍。図１ ５Ｄは、コントロールペプチド（６９６０１）で処置した腫瘍の正常な血管を示 す。図１５Ｅは、シクロ−ＲＧＤｆＶペプチド（６６２０３）で処置した腫瘍の 破壊された血管（矢印）の例を示す。

これらの結果は、ペプチド６６２０３のみが血管形成を抑制し、さらに腫瘍に 隣接するＣＡＭ組織の血管は影響されなかったことを示す。

１０．ウサギ眼球モデルインビボアッセーで測定したα_vβ₃拮抗物質による腫瘍 組織の増殖退行 増殖因子誘発脈管形成に対する抗α_vβ₃拮抗物質の影響は、眼の角膜によって 実証されるように本来透明な構造で観察することができる。新しい血管は角膜の 辺縁（豊富な血液供給を有する）から角膜の中心部（本来血液供給をもたない） に向かって成長する。脈管形成刺激物質（例えばβＦＧＦ）は、角膜に適用され ると角膜辺縁から新しい血管の成長を誘発する。脈管形成拮抗物質は、角膜に適 用されると角膜の辺縁からの新しい血管の成長を抑制する。したがって、角膜は 、角膜辺縁から丈夫なコラーゲンの詰まった角膜組織（これは容易に見ることが できる）へと侵入する内皮細胞を介して脈管形成が進行する。ウサギ眼球モデル アッセーは、したがって化合物を直接眼の角膜に移植した後に続く脈管形成の刺 激 および抑制を直接観察するためのインビボモデルを提供する。

Ａ．ウサギ眼球インビボモデルアッセー １）増殖因子によって誘発される脈管形成 脈管形成は、増殖因子βＦＧＦを用いてウサギ眼球インビボモデルアッセーで 誘発され、以下で詳述する。

ａ．増殖因子および単クローン性抗体を含むヒドロンペレットの調製 増殖因子およびｍＡｂを含むヒドロンポリマーペレットを文献の記載にしたが って調製した(D'Amatoら、Proc．Natl．Acad．Sci.，91:4082-4085(1994))。個 々のペレットは、βＦＧＦを安定化させ、さらに周辺組織への緩徐な遊離を確保 するためにスクラルファート(Carafet，Marion Merrell Dow Corporation)に結 合させた増殖因子βＦＧＦ６５０ｎｇを含んでいた。さらに、ｍＡｂＬＭ６０９ （抗α_vβ₃）またはｍＡｂＰ１Ｆ６（抗α_vβ₅）のいずれか４０μｇをＰＢＳ中 に含むヒドロンペレットを調製した。これらのペレットを、その表面に開けた２ ．５ｍｍの中子を有する特別に調製したテフロンペッグの型に流し込んだ。約１ ２μｌの鋳造材料を各ペッグに入れ、滅菌フードで一晩重合させた。続いてペレ ットを紫外線照射で滅菌した。

ｂ．単クローン性抗体による処置 各実験は、一方の眼球にβＦＧＦおよびＬＭ６０９を含むペレットを、さらに 他方の眼球にβＦＧＦおよびマウスｍＡｂＰ１Ｆ６（抗α_vβ₅）を含むペレット を与えた３匹のウサギから構成された。ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）と他のｍＡｂお よびＰＢＳコントロールを比較するために対を形成する眼球試験を用いることは 、被検ｍＡｂ間での顕著な相違を明らかにすることができる厳密な試験のための 手段を提供する。

Ｐ１Ｆ６ｍＡｂは、血管の内皮細胞の表面に見出されるが、おそらく脈管形成 には必要ではないインテグリンα_vβ₅と免疫的に反応する。このｍＡｂＰ１Ｆ６ が脈管形成に必要か否かを決定するために、このｍＡｂのみを含むペレットを調 製し、下記に述べるよう調べて、このｍＡｂは脈管形成を誘発しないことを確認 した。

検査したｍＡｂの全ては、周知の方法にしたがって蛋白ＡセファロースＣＬ− ４Ｂアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて腹水から精製した。続い て溶出させた免疫グロブリンをＰＢＳに対して透析し、デトキシ−ゲル（Detoxi -gel、Pierce Chemicals）で処理し内毒素を除去した。内毒素は強力な脈管形成 刺激および炎症刺激物質であることが示された。ｍＡｂは、したがって、色素形 成性カブトガニアメーバ様細胞溶解産物アッセー(Chromogenic Limulus Amebocy te Lysate Assay、Bio-Whittaker)を用いて内毒素の存在について検査し、検出 可能な内毒素を含まないｍＡｂのみをウサギ眼球モデルアッセーに用いた。

βＦＧＦおよびｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）またはＰ１Ｆ６（抗α_vβ₅）を 含むヒドロンペレットをウサギの眼球に作製した角膜ポケットに挿入した。この ヒドロンペレットはまたスクラルファートを含み、アッセー中にβＦＧＦを安定 化させる。個々のペレットは、ウサギの角膜の中央間質に外科的に作製した“ポ ケット”に移植された。この外科操作は、個々の角膜を写真により記録するため にカメラを搭載したビームスプリッターを備えたワイルドモデルＭ６９１手術用 顕微鏡を用いて滅菌的術式で実施した。３ｍｍ×５ｍｍの“ポケット”は、６９ ビーバーブレードを用いて角膜の厚さの半分まで３ｍｍの切り目を入れて角膜間 質に作製した。虹彩用へらを用いて間質は周辺で細かく切断され、辺縁から２ｍ ｍの周辺端を用いてペレットを移植した。その後の１４日間にβＦＧＦおよびｍ Ａｂは移植ペレットから周辺組織に拡散し、したがって角膜の辺縁から脈管形成 が生じた。

各処置の代表的な結果は図１６Ａから１６Ｅに示す。出現する血管量を定量し 、以下のように規定される時計時間の様式で記載する。時計が時間に分割される のと同じ様式で、眼を１２等分する。“血管の１時計時間”は、時計の１時間と 同等な眼の領域を満たす血管の量を指す。βＦＧＦのみを与えられた５匹のウサ ギは、新しい血管が角膜の辺縁から角膜の中央に向かって増殖している赤みがか った脈管形成を示したが、これは通常は血管をもたない。これらのウサギの１匹 は、ペレットに対して１時計時間の血管だけしかもたなかった。βＦＧＦおよび ｍＡｂＬＭ６０９の両方を与えられた２匹のウサギには、検出可能な脈管形成が 手術後１４日まで全く存在しなかった。これらのウサギのうちの１匹には、１４ 日までに３つの出血性出芽血管病巣があった。βＦＧＦおよびｍＡｂＰ３Ｇ２ （抗α_vβ₅）を与えられたウサギのうちの２匹は強度の血管新生を示し、ここで は新しい血管は角膜の縁から角膜内に増殖した。これらのウサギのうち１匹には 、ペレットに対して１から２時間の血管が存在しただけであった。ウサギ眼球モ デルアッセーで実証されたように、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）を与えられた ウサギでは、増殖因子βＦＧＦの存在下で正常な周辺血管に対しては脈管形成効 果は認められなかった。対照的に、ｍＡｂＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）を与えられたウ サギでは、増殖因子βＦＧＦの存在下で正常な周辺血管に対して脈管形成が認め られた。ｍＡｂＬＭ６０９による角膜脈管形成の完全な抑制は、以前に報告され たいずれの抗脈管形成試薬よりも実質的に大きい。

１１．マウス：ヒトキメラアッセーで測定したα_vβ₃拮抗物質による腫瘍組織増 殖のインビボ退行 マウス：ヒトキメラインビボモデルをＳＣＩＤマウスの皮膚の一部を新生児の 包皮で置き換えることによって作製した（図１７）。皮膚移植が定着した後、ヒ トの包皮に癌細胞を接種した。測定可能な腫瘍が確立した後、ｍＡｂＬＭ６０９ （抗α_vβ₃）またはＰＢＳのいずれかをマウス尾静脈に注射した。２−３週間し てから、腫瘍を切り出し重量および組織を調べた。

Ａ．マウス：ヒトキメラインビボアッセー マウス：ヒトキメラインビボモデルは、実質的には文献にしたがって調製した (Yanら、J．Clin．Invest.，91:986-996(1993))。簡単に記せば、ＳＣＩＤマウ ス（６−８週齢）から外科的に２ｃｍ²の領域の皮膚を切除し、ヒトの包皮で置 き換えた。マウスを麻酔し、側面腹部領域の各々の側５ｃｍ²の毛を剃った。２ か所の皮膚を筋膜まで完全に除去して２ｃｍ²の円形の移植床を調製した。ヒト 新生児包皮由来の同じ大きさの完全な厚さのヒトの皮膚移植片をこの創傷床に静 置しその場所に縫合した。移植片は皮膚に縫い付けたバンドエイドで被覆した。

微細孔布テープも創傷を被覆するために用いた。

Ｍ２１Ｌヒトメラノーマ細胞株またはＭＤＡ２３．１乳癌細胞株（ＡＴＣＣＨ ＴＢ２６；ｍＡｂＬＭ６０９を用いた組織切片の免疫反応性ではα_vβ₃陰性）を 用いて、ＳＣＩＤマウスのヒト皮膚移植片に固形ヒト腫瘍を形成させた。５×１ ０⁶Ｍ２１−ＬまたはＭＤＡ２３．１細胞の単一細胞浮遊液を経皮的にヒト皮 膚移植片に注射した。続いてマウスを２から４週間観察して、測定可能なヒト腫 瘍を増殖させた。

Ｂ．静脈内適用 １）単クローン性抗体による処置 測定可能な腫瘍が増殖した後、Ｍ２１Ｌ腫瘍細胞を注射したマウスに２５０μｇ のｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）またはＰＢＳを、週に２度２から３週間尾静脈 から静注した。この後、腫瘍を皮膚から切除し、周辺組織を除去した。表６の下 に示したように各処置について数匹のマウスの平均腫瘍重量を調べた。

Ｍ２１Ｌα_vβ₃陰性ヒト癌腫瘍塊をマウス：ヒトキメラアッセー系でＬＭ６０ ９（抗α_vβ₃）に曝すことによって、ＰＢＳ処置腫瘍の平均重量が １９８ｍｇから１１３ｍｇへと減少した。

ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）およびＰＢＳで処置されたＭ２１Ｌ腫瘍の代表 例を形態学的に調べた。ＰＢＳ処置腫瘍は大きく（直径８から１０ｍｍ）血管新 生は良好で、一方、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処置した腫瘍ははるかに小 さく（直径３から４ｍｍ）、検出可能な血管を欠いていた。

ＭＤＡ２３．１を注射した皮膚移植片に形成された腫瘍は検出および測定可能 であった。成長腫瘍の形態学的検査によって、移植ヒト組織からＭＤＡ２３．１ 腫瘍細胞へと新規血管新生が生じたことが明らかにされた。

したがって、α_vβ₃特異的ＬＭ６０９抗体の静脈内適用によるα_vβ₃の遮断は 、実施例９および１０でそれぞれ述べたＣＡＭ系およびウサギ眼球モデル系と同 じ態様でこのモデル系においても癌の退縮をもたらした。

１２．ＣＡＭアッセーで測定される、インテグリンα_vβ₃の拮抗物質の存在下で 細胞サイクルに入り、アポプトーシスが進行する血管細胞の刺激 脈管形成過程は、例えばβＦＧＦおよびＶＥＧＦのようなサイトカインの血管 細胞増殖を刺激する能力に依存する（Mignattiら、J．Cell．Biochem.，471:201 (1991);Takeshitaら、J．Clin．Invest.，93:662(1994); およびKoyamaら、J.Ce ll．Physiol.，158:1(1994)）。しかしながら、シグナリング現象は、これら血 管細胞の成熟血管への分化を調節している可能性もあるようである。したがって 、新規増殖または脈管形成が進行している血管細胞の増殖または分化と関係を有 するシグナルとの干渉は、脈管形成の混乱をもたらすかもしれない。

インテグリン連結(integrin ligation)現象は、アポプトーシスまたはインビ トロのプログラムされた細胞死と同様に細胞増殖にも関与することが示された（ Schwartz、Cancer Res.，51:1503(1993); Meredithら、Mol．Biol．Cell.,4:953 (1993);Frischら、J．Cell Biol.，124:619(1994); およびRuoslahtiら、Cell， 77:477(1994)）。α_vβ₃拮抗物質の脈管形成に対する影響の綿密な調査によって 、不連続で破壊された腫瘍付随血管の存在が明らかになった。したがって、血管 連続性の欠如は血管細胞の選択的壊死またはアポプトーシスのためかもしれない 。

この可能性を調べるために、増殖因子βＦＧＦで脈管形成を誘発した後、本発 明のｍＡｂおよび環状ペプチドによる処置でＣＡＭを調べた。

Ａ．単クローン性抗体による処置 アポプトーシスは種々の方法で検出できるが、これらの方法は、ＤＮＡのフラ グメント化を検出するために組織から分離したＤＮＡの直接検査、さらに、フラ グメント化ＤＮＡの遊離３’ＯＨ基を特異的に検出する抗体を用いた無傷の組織 の３’ＯＨ基の検出を含む。

１）ＤＮＡフラグメント化の分析 脈管形成は、実施例６Ａで述べたように、１０日齢胎児のＣＡＭにβＦＧＦで 飽和させたフィルターディスクを静置することによって誘発された。ＬＭ６０９ （抗α_vβ₃）によるＣＡＭの免疫組織学的分析によって、βＦＧＦによる脈管形 成の開始後１２から２４時間で血管のα_vβ₃の発現は最高になることが明らかに なった。したがって、βＦＧＦによる刺激後２４時間で、胎児の静脈内に１００ μｌのＰＢＳのみ、または３００μｇのｍＡｂＣＳＡＴ（抗β₁）もしくはＬＭ ６０９（抗α_vβ₃）のいずれかを含むＰＢＳを接種した。

ＤＮＡフラグメント化は、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）、ＣＳＡＴ（抗β₁ ）またはＰＢＳの静脈内接種後２４時間または４８時間に、βＦＧＦ飽和フィル ターディスク下のＣＡＭ組織を直接切除することによって検出した。切除ＣＡＭ 組織は滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、細かくきざみ、０．２５％の細菌性コラゲナー ゼ(Worthington Biochemical; フリーホールド、ニュージャージー)に再浮遊さ せ、時々ボルテックスミキサーで攪拌しながら３７°Ｃで９０分保温した。単一 細胞浮遊液から等しい数のＣＡＭ細胞を用いてＤＮＡを以前に報告されたように 抽出した(Bissonetteら、Nature，359:552(1992))。簡単に記せば、等しい数の ＣＡＭ細胞を１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５％（ｖ／ｖ）のトリ トンＸ−１００（シグマ、セントルイス、ミズーリー）中の１０ｍＭＥＤＴＡで 溶解させた。細胞溶解物を４°Ｃで１５分１６０００×ｇで遠心し、可溶性フラ グメント化ＤＮＡを完全なクロマチンペレットから分離させた。フラグメント化 ＤＮＡを洗浄し沈澱させ、１．２％（ｗ／ｖ）アガーロースゲルで分析した。

各処置から得た等しい数のＣＡＭ細胞から可溶性フラグメント化ＤＮＡを分離 し、アガロースゲルで電気泳動的に分離し、臭化エチジウムで染色して可視化さ せた。処置後２４時間で３種の異なる処置から得られたＤＮＡフラグメント化の 相対量には違いは検出されなかった。しかしながら、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_v β₃）による処置後４８時間までに、ｍＡｂＣＳＡＴ（抗β₁）またはＰＢＳ単独 で処置した胎児と比較したとき、ＤＮＡフラグメント化の顕著な増加が認められ た。

２）細胞サイクルに入るための血管細胞の刺激 これらの過程におけるα_vβ₃の役割を実験的に調べるために、βＦＧＦで処置 したＣＡＭまたは未処置のＣＡＭから得た細胞を沃化プロピジウムで染色しさら にｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で免疫的に反応させた。

ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）、ＣＳＡＴ（抗β₁）またはＰＢＳで処置後２ ４時間または４８時間の胎児から分離したＣＡＭを、上記のように細菌性コラゲ ナーゼで保温して単一細胞浮遊液にした。続いて、単一細胞を透過性にし、製造 元（Oncor，ゲイサースバーグ、メリーランド）の指示にしたがいアポプトーシ スタグ・インシトゥ・検出キット(Apop Tag Insitu Detection Kit)で染色した 。アポプトーシスタグは、フラグメント化ＤＮＡの遊離３’ＯＨ基を特異的に検 出する抗体である。そのような遊離３’ＯＨ基の検出は、アポプトーシス細胞の 検出のための確立された方法である（Gavrieliら、L．Cell Biol.，119:493(199 2)。

アポプトーシスタグ染色細胞を続いてＰＢＳ中の０．１％（v／v）トリトンＸ −１００ですすぎ、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナ トリウムおよびＰＢＳ中の２００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡを含むＦＡＣＳ緩衝 液に再浮遊させた。細胞を１．５時間保温し、洗浄して蛍光活性化細胞選別によ って分析した。細胞の蛍光は、ファックスキャンフローサイトメーター（FACSca n flow cytometer）を用いて測定し、データは下記のように分析した。

細胞の蛍光はファックスキャンフローサイトメーター(Becton Dickison、マウ ンテンビュー、カリフォルニア)で測定した。側面分散範囲（Side Scatter、Ｓ ＳＣ）および前方分散範囲(Forward scatter、ＦＳＣ)は同時に決定し、全ての データは、ファクスキャン研究用ソフト(Becton Dickison、マウンテンビュー、 カリフォルニア)を備えたヒューレットパッカード（HP9000）コンピューターで 収集した。データは、Ｐ．ＣリシスヴァージョンＩソフト(P.C Lysis version I )(Becton Dickison、マウンテンビュー、カリフォルニア)で分析した。陰性コン トロールゲートは、アポプトーシスタグキットの一次抗体を添加していない細胞 浮遊液を用いて設定した。同一のゲート設定を両方の細胞集団に用い、異なる細 胞処置につき約８０００細胞を分析した。

ｍＡｂ処置ＣＡＭから得られ、アポプトーシスタグで染色し、ＦＡＣＳ分析で 決定した単一細胞の％は図１８に示す。斜線入り棒線は、分析の２４時間前に処 置した胎児の細胞を表す。点刻棒線は４８時間前に処置した胎児の細胞を表す。

各棒線は、３つの複製の平均±標準誤差を表す。

図１８に示すように、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で２日前に処置したＣＡ Ｍは、ＰＢＳ単独またはＣＳＡＴ（抗β₁）のいずれかで処置したＣＡＭと比較 したときアポプトーシスタグ染色は３から４倍増加した。

Ｂ．合成ペプチドによる処置 アポプトーシスに対する環状ペプチドの影響を決定するために、実施例６Ａで 述べたように、本発明の合成ペプチドを用いて増殖因子誘発脈管形成に関するＣ ＡＭアッセーを実施した。ペプチド、シクロ−ＲＧＤｆＶ（６６２０３）および シクロ−ＲＡＤｆＶ（６９６０１）を実施例１で述べたように調製した。このペ プチド溶液またはＰＢＳをＣＡＭ調製物に３００μｇ／ｍｌの濃度で注射した。

２４および４８時間で濾紙および周辺ＣＡＭ組織を切除してアポプトーシスタグ で染色し、実施例１２Ａ２）で述べたようにアポプトーシスを検出した。

図１８に示したように、ペプチド６９２０３（スクロ−ＲＧＤｆＶ）で２日前 に処置したＣＡＭは、ＰＢＳ単独またはコントロールペプチド６９６０１（シク ロ−ＲＡＤｆＶ）のいずれかで処置したＣＡＭと比較したとき、アポプトーシス タグ染色が３から４倍増加した。

Ｃ．アポプトーシスおよび細胞サイクルに対する単クローン性抗体による処置の 影響 細胞サイクルに対する単クローン性抗体の影響を決定するために、沃化プロピ ジウムで染色することによって染色体ＤＮＡのコピー数について、さらにアポプ トーシスタグで染色することによってアポプトーシスについて単一細胞浮遊液を 調べた。

ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）もしくはＣＳＡＴ（抗β₁）またはＰＢＳで２ ４時間または４８時間前に処置したＣＡＭの単一細胞浮遊液を、実施例１２Ａ１ ）で述べたように調製した。

アポプトーシスタグで細胞を染色するために、２．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよ びＰＢＳ中の０．２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む緩衝液で３回洗浄し た。続いて細胞をＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで１５分固定 し、その後上記のように３回洗浄した。非特異的結合を防止するために、単一細 胞浮遊液をＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで一晩４°Ｃで処理した。続いて細 胞を前述のように洗浄し、アポプトーシスタグで染色し、実施例１２Ａで述べた ようにファックスキャンで細胞の蛍光を測定した。

各実験条件から得た細胞をＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌの沃化プロピジウム（シ グマ、セントルイス、ミズーリー）で１時間染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、アポ プトーシスに典型的な核の特徴（クロマチン凝縮および分断化を含む）について 調べた。アポプトーシス細胞の％を、少なくとも１０から１５個の任意に選んだ 顕微鏡の視野から得た細胞の形態学的検査によって算定した。

ＣＳＡＴ（抗β₁）またはＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理した胎児のＣＡＭの 単一細胞浮遊液をアポプトーシスタグおよび沃化プロピジウムで染色し、ＦＡＣ Ｓで分析した結果はまとめて図１９に示す。Ｙ軸はアポプトーシスタグ染色（ア ポプトーシス）を表し、Ｘ軸は沃化プロピジウム染色（ＤＮＡ含有量）を表して いる。水平線は、アポプトーシスタグ染色の陰性ゲートを表す。左および右の写 真はＣＳＡＴおよびＬＭ６０９処置胎児のＣＡＭ細胞をそれぞれ示す。細胞サイ クル分析は、各条件につき約８０００例の分析によって実施し、データは等高線 図で表した。

ＤＮＡ染料、沃化プロピジウムで染色した単一細胞サンプルによって、ＬＭ６ ０９（抗α_vβ₃）処置後４８時間のＣＡＭ細胞の２５−３０％が核凝縮および／ または分断化を示した。このような過程はアポプトーシスが進行している細胞の 特徴である。これはＣＳＡＴ（抗β₁）処置ＣＡＭと対照的で、この場 合９０−９５％の細胞が正常な核染色を示した。

図１９に示すように、ＬＭ６０９によるアポプトーシスの誘発と一致して、１ コピー未満のＤＮＡを含むピークに極めて多数の細胞が認められた（ＡＯ）。こ のピークは、後期のアポプトーシス細胞のフラグメント化ＤＮＡを表しているこ とが以前に示された(Telfordら、Cytometry，13:137(1992))。さらに、これらの ＡＯ細胞は容易にアポプトーシスタグで染色され、アポプトーシス細胞を検出す るこれら試薬の能力が確認された。しかしながら、ＡＯで細胞が染色されること に加え、１コピーより多いＤＮＡを含む極めて多くの細胞がアポプトーシスタグ でもまた染色された（図１９）。これらの結果は、ＬＭ６０９は、既に細胞サイ クルに入った血管細胞でアポプトーシスを促進する能力を有することを明らかに している。対照的に、細胞サイクルに入ったコントロールＣＡＭから得られた細 胞はごくわずかのアポプトーシスタグ染色を示し、コントロール処置ＣＡＭでは アポプトーシス細胞が殆ど検出されなかったことと一致した。

細胞サイクル（ＳおよびＧ２／Ｍ期）に入ったβＦＧＦ刺激ＣＡＭのこれらの 細胞では、７０％がＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で陽性染色を示した。これは、βＦ ＧＦ未処置CＡＭの細胞サイクルに入った細胞で認められた１０％ＬＭ６０９染 色に準えることができる。これらの発見は、βＦＧＦ刺激の後、α_vβ₃をもつ細 胞の大半が活発な分裂を示していることを示唆する。

これらの結果を合わせると、ｍＡｂＬＭ６０９またはα_vβ₃の環状ペプチド拮 抗物質の静脈内注射は、脈管形成抑制に続いてニワトリのＣＡＭ内でアポプトー シスを促進させることを示唆している。また、ＬＭ６０９との免疫反応性によっ てα_vβ₃の発現および、アポプトーシスタグとの免疫反応性によってアポプトー シスが進行している細胞について組織学的にＣＡＭを調べた。ＬＭ６０９（抗α_v β₃）、ＣＳＡＴ（抗β₁）またはＰＢＳで４８時間前に処置した、実施例５Ａ で調製した胎児から切除したＣＡＭ切片を洗浄し、ＯＴＣ（Baxter）に包埋し、 液体窒素で瞬間冷凍した。ＣＡＭ組織の６ミクロン切片を切り出し、アセトンで ３０秒固定し、使用まで−７０°Ｃで保存した。組織切片は、７０％（ｖ／ｖ） エタノール中で簡単にすすぎ、続いてＰＢＳ中で３回洗浄して、染色用に調製し た。次に、切片をＰＢＳ中の５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡで２時間処理し、 その後１０μｇ／ｍｌのｍＡｂＬＭ６０９で２時間保温した。続いて切片を洗浄 し、１：５０のローダミン共役ヤギ抗マウスＩｇＧ(Fisher Scientific，ピッツ バーグ、ペンシルバニア)で２時間保温した。最後に、同じ切片を洗浄し、実施 例１２Ａ２）で述べたようにアポプトーシスタグで染色した。染色組織をマウン トし供焦点免疫蛍光顕微鏡で調べた。

図２０では、写真ＡからＣはＣＳＡＴ（抗β₁）処置胎児のＣＡＭ組織を表し 、写真ＤからＦはＬＭ６０９（抗α_vβ₃）処置胎児のＣＡＭ組織を表す。写真Ａ およびＤは、アポプトーシスタグで染色し、Ｄ．Ｉ．Ｃ．画像に蛍光（ＦＩＴＣ ）を重焼きして可視化させた組織を示す。写真ＢおよびＥはｍＡｂＬＭ６０９（ 抗α_vβ₃）で染色し、蛍光（ローダミン）で可視化させた同じ組織を示す。写真 ＣおよびＦは、アポプトーシスタグおよびＬＭ６０９の両方で染色した同じ組織 の結合画像を表し、黄色は同時存在を示す。棒線は、左および右の写真でそれぞ れ１５および５０μｍを表している。

図２０（Ａ−Ｃ）に示すように、ＣＳＡＴまたはＰＢＳを静注した後アポプト ーシスタグによる染色はきわめて僅かでさらに無秩序のようであるが、これは組 織内に極めてわずかなレベルしかアポプトーシスが存在しないことを示唆してい る。対照的に、ＬＭ６０９または環状ペプチド２０３で先に処置された胎児のＣ ＡＭは、アポプトーシスタグで濃く染色された多くの血管を示し、一方周辺の非 血管細胞間ではごくわずかな反応性が認められただけである（図２０Ｄ−Ｅ）。

さらに、これらの組織の染色にアポプトーシスタグおよびＬＭ６０９の両方を用 いたとき（１９Ｃおよび１９Ｆ）、顕著な同時存在が、α_vβ₃拮抗物質で処置し た胎児から得たＣＡＭのこれらマーカー間でのみ認められた。これらの発見は、 インビボで脈管形成を誘発した後、インテグリンα_vβ₃の抑制物質は選択的にα_v β₃保有血管のアポプトーシスを促進することを明らかにした。

脈管形成は、多くの分子的および細胞生物学的現象を含む複雑な過程であるが 、一方、実証されたいくつかの流れは、血管細胞インテグリンα_vβ₃はこの過程 で比較的後期における役割を果たすことを提唱している。第一に、免疫組織学的 分析によって、血管細胞におけるα_vβ₃の発現はβＦＧＦによる脈管形成の誘発 後１２−２４時間で最大になることが明らかにされた。第二に、α_vβ₃の拮 抗物質は多数の活性化物質によって誘発される脈管形成を妨害するが、このこと は、このレセプターは、脈管形成へと続くおそらく一次的シグナリングに関する 全ての現象から下流にある共通の経路に含まれることを示唆する。第三に、ｍＡ ｂＬＭ６０９または環状ペプチド処置ＣＡＭは、これら脈管形成拮抗物質による 処置後４８時間まではＤＮＡのほつれによって測定されるアポプトーシスで顕著 な増加を示さなかった。最後に、α_vβ₃拮抗物質は、細胞サイクル進入が既に誘 発された血管細胞のアポプトーシスを促進する。

本明細書に提示した結果は、インテグリン連結現象がインビボで細胞の生存を 調節することができるという最初の直接的証拠を提供する。したがって次のよう な仮説が提唱される：脈管形成がいったん開始すると、個々の血管細胞は分裂し 脈管形成原に向かって移動し始め、その後、α_vβ₃連結は、分化と成熟血管形成 へと進行する持続した細胞生存を可能にするシグナルを提供する。しかしながら 、α_vβ₃連結が妨害されると、これら細胞はこの分子的指示を受け取ることがで きず、不履行によりアポプトーシスに陥る。この仮説はまた、分化が生じた後、 成熟血管はもはやα_vβ₃シグナリングを生存のために必要とせず、したがってこ のインテグリンに対して耐性をもつということを予想させるであろう。

最後に、本明細書に提示した結果は、インテグリンα_vβ₃の拮抗物質は、新形 成または脈管形成を特徴とする他の疾患のための強力な治療方法を提供するであ ろう。第一に、α_vβ₃拮抗物質は、以前から存在する血管構造に影響を与えるこ と無く新しく形成されつつある血管を破壊する。第二にこれらの拮抗物質は、ニ ワトリ胎児の生存活性に顕著な影響を与えず、それらの非毒性を示唆した。第三 に、脈管形成は、脈管形成刺激にもかかわらず顕著に遮断された。最後に、α_v β₃拮抗物質の全身的投与は、種々の組織学的に明瞭なヒト腫瘍の劇的な退縮を もたらした。

したがって前述の実施例によって、インテグリンα_vβ₃は、種々の刺激による 脈管形成において重要な役割をはたし、そのようなα_vβ₃は、新規脈管新生を特 徴とする疾患に対する本発明のα_vβ₃拮抗物質の重要な治療標的であることが明 らかになった。

前述の記載は、当業者が本発明を実施するために十分であろうと考えられる。

本発明は、寄託された細胞株によって範囲が限定されるべきではない。なぜなら ば、寄託された具体例は、本発明の１つの特徴を単に詳述することを目的として おり、機能的に同等ないずれの細胞株も本発明の範疇に入るからである。材料の 寄託は、その最善の態様を含む本明細書中の記載が本発明の実施のためには不適 当であるかもしれないことを承認するものではなく、また本明細書の記載に対し て請求の範囲を制限することを意図したものでもない。実際、本明細書に記載し たものに加え、当業者にとっては前述の記載から種々の修飾が明白であり、それ らは添付の請求の範囲内に含まれるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 チェリッシュ ディヴィッド エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92007 カーディフ シー ヴィレッジ サークル 2108

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．脈管形成抑制量のα_vβ₃拮抗物質を含む組成物を組織に投与することを含む 、組織における脈管形成を抑制する方法。
2. ２．当該α_vβ₃拮抗物質がα_vβ₃へのフィブリノーゲンの結合を抑制し、α_IIb β₃またはα_vβ₁へのフィブリノーゲンの結合を実質的に抑制しない請求の範囲 第１項の方法。
3. ３．当該α_vβ₃拮抗物質が、α_vβ₃に免疫的に特異的な単クローン性抗体である 請求の範囲第１項の方法。
4. ４．当該単クローン性抗体が、単クローン性抗体ＬＭ６０９（ＡＴＣＣＨＢ９５ ３７）の免疫反応特性を有する請求の範囲第３項の方法。
5. ５．当該α_vβ₃拮抗物質がＲＧＤ含有ポリペプチドである請求の範囲第１項の方 法。
6. ６．当該ポリペプチドが、ｃ−（ＧｒＧＤＦＶ）（配列番号４）、ｃ−（ＲＧＤ ｆＶ）（配列番号５）、ｃ−（ＲＧＤＦｖ）（配列番号７）およびＹＴＡＥＣＫ ＰＱＶＴＲＧＤＶＦ（配列番号８）およびその塩から成る群から選ばれる請求の 範囲第５項の方法。
7. ７．当該塩が塩酸塩またはトリフルオロ酢酸塩である請求の範囲第６項の方法。
8. ８．当該組織が炎症を生じており、当該脈管形成が炎症組織の脈管形成である請 求の範囲第１項の方法。
9. ９．当該組織が関節炎である請求の範囲第８項の方法。
10. 10．当該関節炎組織が類リューマチ関節炎の哺乳類に存在する請求の範囲第９項 の方法。
11. 11．当該組織が、糖尿病性網膜症の患者の網膜組織であって、当該脈管形成が網 膜の脈管形成である請求の範囲第１項の方法。
12. 12．当該組織が血管腫である請求の範囲第１項の方法。
13. 13．当該組織が固形腫瘍または固形腫瘍転移であり、当該脈管形成が腫瘍の脈管 形成である請求の範囲第１項の方法。
14. 14．当該脈管形成抑制量が約２ｕＭから５ｍＭである請求の範囲第１項の方法。
15. 15．当該投与が、静脈内、経皮、関節滑液嚢内、筋肉内または経口投与を含む請 求の範囲第１項の方法。
16. 16．当該投与が、化学療法と合わせて実施される請求の範囲第１項の方法。
17. 17．当該投与が、ただ１回の静脈内投与を含む請求の範囲第１項の方法。
18. 18．脈管形成抑制量のα_vβ₃拮抗物質を含む組成物を当該組織に投与することを 含む、組織内に成長した腫瘍を退縮させる方法。
19. 19．当該α_vβ₃拮抗物質がα_vβ₃へのフィブリノーゲンの結合を抑制し、α_IIb β₃またはα_vβ₁へのフィブリノーゲンの結合を実質的に抑制しない請求の範囲 第１８項の方法。
20. 20．当該α_vβ₃拮抗物質がα_vβ₃に免疫的に特異的な単クローン性抗体である請 求の範囲第１８項の方法。
21. 21．当該単クローン性抗体が、単クローン性抗体ＬＭ６０９（ＡＴＣＣ ＨＢ９ ５３７）の免疫反応特性を有する請求の範囲第２０項の方法。
22. 22．当該α_vβ₃拮抗物質がＲＧＤ含有ポリペプチドである請求の範囲第１８項の 方法。
23. 23．当該ポリペプチドが、ｃ−（ＧｒＧＤＦＶ）（配列番号４）、ｃ−（ＲＧＤ ｆＶ）（配列番号５）、ｃ−（ＲＧＤＦｖ）（配列番号７）およびＹＴＡＥＣＫ ＰＱＶＴＲＧＤＶＦ（配列番号８）およびその塩から成る群から選ばれる請求の 範囲第２２項の方法。
24. 24．当該塩が塩酸塩またはトリフルオロ酢酸塩である請求の範囲第２３項の方法 。
25. 25．当該組織が炎症を生じており、当該脈管形成が炎症組織の脈管形成である請 求の範囲第１８項の方法。
26. 26．当該組織が関節炎である請求の範囲第２５項の方法。
27. 27．当該関節炎組織が類リューマチ関節炎の哺乳類に存在する請求の範囲第２６ 項の方法。
28. 28．当該組織が、糖尿病性網膜症の患者の網膜組織であり、当該脈管形成が網膜 の脈管形成である請求の範囲第１８項の方法。
29. 29．当該組織が血管腫である請求の範囲第１８項の方法。
30. 30．当該組織が固形腫瘍または固形腫瘍転移であり、当該脈管形成が腫瘍の脈管 形成である請求の範囲第１８項の方法。
31. 31．当該脈管形成抑制量が約２ｕＭから５ｍＭである請求の範囲第１８項の方法 。
32. 32．当該投与が、静脈内、経皮、関節滑液嚢内、筋肉内または経口投与を含む請 求の範囲第１８項の方法。
33. 33．当該投与が、化学療法と合わせて実施される請求の範囲第１８項の方法。
34. 34．当該投与が、ただ１回の静脈内投与を含む請求の範囲第１８項の方法。
35. 35．当該退縮が、当該脈管形成抑制性拮抗物質の投与後７日で生じる請求の範囲 第１８項の方法。
36. 36．脈管形成抑制量のα_vβ₃拮抗物質を含む組成物を組織に投与することを含む 、組織における新規血管系のアポプトーシスを誘発する方法。
37. 37．当該α_vβ₃拮抗物質がα_vβ₃へのフィブリノーゲンの結合を抑制し、α_IIb β₃またはα_vβ₁へのフィブリノーゲンの結合を実質的に抑制しない請求の範囲 第３６項の方法。
38. 38．当該α_vβ₃拮抗物質が、α_vβ₃に免疫的に特異的な単クローン性抗体である 請求の範囲第３６項の方法。
39. 39．当該単クローン性抗体が、単クローン性抗体ＬＭ６０９（ＡＴＣＣ ＨＢ９ ５３７）の免疫反応特性を有する請求の範囲第３８項の方法。
40. 40．当該α_vβ₃拮抗物質がＲＧＤ含有ポリペプチドである請求の範囲第３６項の 方法。
41. 41．当該ポリペプチドが、ｃ−（ＧｒＧＤＦＶ）（配列番号４）、ｃ−（ＲＧＤ ｆＶ）（配列番号５）、ｃ−（ＲＧＤＦｖ）（配列番号７）およびＹＴＡＥＣＫ ＰＱＶＴＲＧＤＶＦ（配列番号８）およびその塩から成る群から選ばれる請求の 範囲第４０項の方法。
42. 42．当該塩が塩酸塩またはトリフルオロ酢酸塩である請求の範囲第４１項の方法 。
43. 43．当該組織が炎症を生じており、当該脈管形成が炎症組織の脈管形成である請 求の範囲第３６項の方法。
44. 44．当該組織が関節炎である請求の範囲第４３項の方法。
45. 45．当該関節炎組織が類リューマチ関節炎の哺乳類に存在する請求の範囲第４４ 項の方法。
46. 46．当該組織が、糖尿病性網膜症の患者の網膜組織であり、当該脈管形成が網膜 の脈管形成である請求の範囲第３６項の方法。
47. 47．当該組織が血管腫である請求の範囲第３６項の方法。
48. 48．当該組織が固形腫瘍または固形腫瘍転移であり、当該脈管形成が腫瘍の脈管 形成である請求の範囲第３６項の方法。
49. 49．当該脈管形成抑制量が約２ｕＭから５ｍＭである請求の範囲第３６項の方法 。
50. 50．当該投与が、静脈内、経皮、関節滑液嚢内、筋肉内または経口投与を含む請 求の範囲第３６項の方法。
51. 51．当該投与が、化学療法と合わせて実施される請求の範囲第３６項の方法。
52. 52．当該投与が、ただ１回の静脈内投与を含む請求の範囲第３６項の方法。
53. 53．当該アポプトーシスが、当該脈管形成抑制性拮抗物質の投与後少なくとも４ ８時間で生じる請求の範囲第３６項の方法。
54. 54．当該組織が、冠状動脈の血管形成術に続く再狭窄の危険性がある冠状動脈で ある請求の範囲第１項の方法。