HU221988B1 - Eljárások és készítmények angiogenezis gátlására - Google Patents

Eljárások és készítmények angiogenezis gátlására Download PDF

Info

Publication number
HU221988B1
HU221988B1 HU9602541A HU9602541A HU221988B1 HU 221988 B1 HU221988 B1 HU 221988B1 HU 9602541 A HU9602541 A HU 9602541A HU 9602541 A HU9602541 A HU 9602541A HU 221988 B1 HU221988 B1 HU 221988B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
preparation
angiogenesis
use according
tissue
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
HU9602541A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT76086A (en
HU9602541D0 (en
Inventor
Peter Brooks
David A. Cheresh
Original Assignee
The Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22783992&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU221988(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by The Scripps Research Institute filed Critical The Scripps Research Institute
Publication of HU9602541D0 publication Critical patent/HU9602541D0/hu
Publication of HUT76086A publication Critical patent/HUT76086A/hu
Publication of HU221988B1 publication Critical patent/HU221988B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C07K14/70557—Integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát olyan eljárások és készítmények képezik, amelyek –az ?v?3-vitronektin-receptor antagonistáinak alkalmazásával – szövetekangiogenezisének gátlására alkalmazhatók. A találmány tárgyát képezitovábbá egy eljárás kialakult tumor visszafejlesztésére, továbbáeljárás apoptózis indukálására egy szövetben kialakult újérhálózatban. ŕ

Description

A találmány szerinti megoldás a gyógyászat tárgykörébe tartozik. A találmány tárgyát olyan eljárások és készítmények képezik, amelyek - az avP3-vitronektin-receptor antagonistáinak alkalmazásával - szövetek angiogenezisének gátlására alkalmazhatók. A találmány 5 tárgyát képezi továbbá egy eljárás kialakult tumor visszafejlesztésére, továbbá eljárás apoptózis redukálására egy szövetben kialakult új érhálózatban.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazha- , tó új erek nemkívánatos (például gyulladásos szövetek- 10 ben, tumorokban vagy metasztázisokban történő) képződésének gátlására, a tumomövekedés gátlására, metasztázisok kialakulásának gátlására, kialakult tumorok visszafejlesztésére, valamint - szívkoszorúér-plasztikai műtét után előforduló - restenosis gátlására. 15
Az integrinek a celluláris receptorok olyan csoportját képviselik, amelyekről ismert, hogy az extracelluláris sejtközi állomány proteinjeihez kötődnek, így „sejtsejt” és „sejt-sejtközi állomány” kölcsönhatásokat közvetítenek, melyeket általánosan sejtadhéziós esemé- 20 nyéknek nevezünk. Annak ellenére, hogy a szakirodalomban számos integrint és integrinkötő ligandumot leírtak, sok integrál biológiai funkciója tisztázatlan. Az integrinreceptorok olyan proteinek, melyeknek közös szerkezeti jellemzőjük, hogy - a- és β-alegységeket 25 tartalmazó - heterodimer glikoprotein-komplexekből állnak.
Ismeretes, hogy a vitronektin-receptor elnevezés amely e receptorok azon eredeti tulajdonságából származik, hogy elsősorban a vitronektinhez kötődnek - há- 30 rom különböző integrinre vonatkozik, nevezetesen az a^j-integrinre, az a^3-integrinre és az avp5-integrinre [Horton: Int. J. Exp. Pathol. 71, 741 (1990)]. Az οΐγβι a fibronektint és a vitronektint köti meg. Az ανβ3 különböző ligandumokat köt meg, köztük a fibrint, fib- 35 rinogént, laminint, trombospondint, vitronektint, „von Willebrand”-faktort, osteospontint és a csont-szialoprotein-I-et. Az ανβ5 csak a vitronektinhez kötődik. E három integrál - különböző szövetek celluláris kölcsönhatásaiban játszott - specifikus sejtadhéziós szerepe je- 40 lenleg is kutatás tárgyát képezi, de világos, hogy a különböző integrinek különböző biológiai funkciókat töltenek be.
Sok integrál ligandumában az egyik lényeges felismerési helyet az arginin-glicin-aszparaginsav (RGD) 45 tripeptid-szekvencia képezi. Az RGD a vitronektin-receptorintegrinek fentebb említett valamennyi ligandumában megtalálható. Ez az RGD felismerési hely olyan polipeptidekkel („peptidekkel”) utánozható, amelyek RGD-szekvenciát tartalmaznak. Az ilyen RGD- 50 peptidek az integrinműködés ismert inhibitorai. Lényeges, hogy a gátlás specifitása - az RGD-peptid szekvenciájától és szerkezetétől függően - specifikus integrinek megcélzása érdekében módosítható.
Az RGD felismerési hely leírását illetően lásd 55 Pierschbacher és munkatársai: Natúré 309, 30 (1984); és Pierschbacher és munkatársai: Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81, 5985 (1984). Különböző, eltérő integrinspecifitású RGD-polipeptideket mások is leírtak [lásd Grant és munkatársai: Cell 58, 933 (1989); Che- 60 resh és munkatársai: Cell 58, 945 (1989); Aumailley és munkatársai: FEBS Letts. 291, 50 (1991); Pfaff és munkatársai: J. Bioi. Chem. 269, 20233 (1994); valamint a 4,517,686; 4,578,079; 4,589,881; 4,614,517; 4,661,111; 4,792,525; 4,683,291; 4,879,237; 4,988,621; 5,041,380 és 5,061,693 számú egyesült államokbeli közzétételi iratok].
Az angiogenezis a szövet véredényképzési folyamata, melynek során a szövetbe újonnan kialakuló vérerek hatolnak be. Ezt a folyamatot „neovascularisatió”-nak (új erek képződése) is nevezik. A folyamatot az endotélsejtek és a simaizomsejtek beszűrődése (infiltrációja) közvetíti, és feltételezhetően a következő három lehetőség szerint zajlik: az új véredények már létező véredényekből fejlődnek („saijadzanak”) ki; az új véredények prekurzorsejtekből de novo képződnek („vasculogenesis”); már létező kisebb véredények átmérője megnő [Blood és munkatársai: Bioch. Biophys. Acta 1032, 89 (1990)]. Ismeretes, hogy az érfal endotélsejtjei legalább öt RGD-függő integrált tartalmaznak; ezek: a vitronektin-receptor ανβ3 vagy a^5); az I. és IV. típusú kollagénreceptor (ομβ]); a lamininreceptor (α2βι); a fibronektin/laminin/kollagén receptor (α3β,) és a fibronektin-receptor (α5β)) [Davis és munkatársai: J. Cell. Biochem. 51, 206 (1993)]. A simaizom-sejtek legalább hat RGD-függő integrint tartalmaznak (köztük az c^j-et,. a^-at és ανβ5-0ί).
Az angiogenezis az újszülöttek fejlődésének fontos folyamata, de nagy jelentősége van a sebgyógyulásban, illetve különböző betegségek [köztük a szöveti gyulladás, arthritis, tumomövekedés, a cukorbetegséggel járó* retinabántalom, a retina - érképződés (neovascularisatio) következtében kialakuló - foltos elfajulásának és hasonló állapotok] patogenezisében. Az angiogenezissel kapcsolatos klinikai megnyilvánulásokat angiogén betegségeknek nevezzük [Folkman és munkatársai: Science 235, 442 (1987)]. Az angiogenezis általában nem jellemző a kifejlett vagy érett szövetekre, bár sebgyógyuláskor és a sárgatest növekedési ciklusában előfordul [lásd például Moses és munkatársai: Science 248, 1408 (1990)].
Korábban javasolták, hogy az angiogenezis gátlása hatékony terápiája lehetne a tumomövekedés korlátozásának. Az angiogenezis gátlásának lehetőségeként a következő módszereket ajánlották: (1) az „angiogén molekulák” (például a fibroblasztnövekedési faktor; βΡΰΡ) felszabadulásának gátlása; (2) az anginogén molekulák semlegesítése (például anti-PFGF-antitestek alkalmazásával); és (3) az endotélsejtek angiogén ingerre adott reakciójának gátlása. Ez utóbbi stratégia felkeltette a figyelmet, és Folkman és munkatársai [Cancer Biology 3, 89 (1992)] több endotélsejtreakció-inhibitort írtak le, köztük a kollagenázinhibitort, alapmembrán-„tumover”-inhibitort, angiosztatikus szteroidokat, gombaeredetű angiogenezis-inhibitorokat, trombocitafaktor-4et, trombospondint, arthritisgyógyszereket (mint például a D-penicill-amint és az arany-tiomalátot) a D3vitamin analógjait, alfa-interferont és hasonló anyagokat, amelyek felhasználhatók az angiogenezis gátlására. További javasolt angiogenezis-inhibitorokat illetően
HU 221 988 Β1 lásd: Blood és munkatársai: Bioch. Biophys. Acta. 1032, 89 (1990); Moses és munkatársai: Science 248, 1408 (1990); Ingber és munkatársai: Láb. Invest. 59, 44 (1988); és az 5,092,885; 5,112,946; 5,192,744 és 5,202,352 számú egyesült államokbeli közzétételi irat. A fenti hivatkozásokban leirt angiogenezis-inhibitorok egyike sem irányul az θνβ3 gátlására.
Leírtak olyan - RGD-szekvenciát tartalmazó - peptideket is, amelyek az a^3-vitronektin-receptort gátolják (Aumailley és munkatársai: FEBS Letts. 291, 50 (1991); Choi és munkatársai: J. Vasc. Sürg. 19, 125 (1994); Smith és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 12267 (1990); és Pfaff és munkatársai: J. Bioi. Chem. 269, 20233 (1994)], azonban találmányunk előtt nem vetették fel az a^3-integrin angiogenezisben betöltött szerepének lehetőségét, és nem is azonosították.
A sejtadhézió - különböző integrál a- vagy βalegységekre specifikus monoklonális antitestek alkalmazásával történő - in vitro gátlása érinti a különböző sejttípusok - köztük a hajszálér-endotélsejtek - sejtadhéziójában szerepet játszó a^3-integrint [Davis és munkatársai: J. Cell. Bioi. 51, 206 (1993)]. Nicosia és munkatársai leírták a „GRGDS” nevű RGD-peptid kollagéngélen tenyésztett patkányaortából „mikrovéredények” („microvessels”) képződésének in vitro gátlására történő - alkalmazását [Nicosia és munkatársai: Am. J. Pathol. 138, 829 (1991)]. A „mikrovéredények” kialakulásának - kollagéngél-tenyészetekben végzett - in vitro gátlása nem jó modellje az angiogenezis szövetekben történő gátlásának, mivel nem igazolt, hogy a mikrovéredények szerkezete azonos lenne a hajszálérkezdemények szerkezetével, vagy hogy a kollagéngél-tenyészetben a mikrovéredények kialakulása azonos lenne az új erek intakt szövetbe (ahol az angiogenezis gátlása kívánatos, például ízületi gyulladásos szövetbe, tumorszövetbe vagy beteg szövetbe) történő behatolásával és növekedésével.
Nincs tudomásunk egyetlen olyan kísérletről sem, amelyben bebizonyították volna, hogy egy szövetben az angiogenezis sejtadhéziós inhibitorok alkalmazásával gátolható. Közelebbről, korábban soha nem bizonyították, hogy szövetekben az a^3-funkció szükséges az angiogenezishez, vagy hogy az a^-antagonisták képesek egy szövetben az angiogenezis gátlására.
Találmányunk leírásában feltárjuk, hogy a szövetekben az angiogenezishez avp3-integrinre van szükség, és az ανβ3 inhibitorai képesek az angiogenezis gátlására. Feltárjuk továbbá, hogy más integrinek (mint például az ανβ5 vagy a^t) antagonistái nem gátolják az angiogenezist, feltehetően azért, mert ezek az angiogenezis bekövetkezése szempontjából nem kulcsfontosságúak.
Ilyenformán, a találmány tárgyát eljárások képezik angiogenezis gátlására egy szövetben, melyek során a szövetbe egy - a^3-antagonista angiogenezist gátló mennyiségét tartalmazó - készítményt adunk be.
Bármilyen szövetet kezelhetünk, amelyben a angiogenezis gátlása kívánatos; kezelhetünk például olyan beteg szöveteket, amelyekben új erek képződése indult meg. Az ilyen szövetek példáiként említhetjük a gyulladásos szöveteket, a kemény tumorokat, metasztázisokat, a restenosison áteső szöveteket és hasonlókat
A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható a^3-antagonista képes az a^3-hoz kötődni és kompetitív módon gátolni az ανβ3 - természetes ligandumához történő - kötődését. Az antagonista az integrinek közül előnyösen az ανβ3-Γ8 specifikus. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint az avfl3-antagonista a fibrinogén vagy más - RGD-szekvenciát tartalmazó - ligandum a^3-hoz történő kötődését gátolja, a fibronektin a^3-hoz történő kötődését azonban nem gátolja jelentős mértékben. a^3-antagonistaként előnyösen polipeptidet vagy monoklonális antitestet (vagy annak funkcionális - az ανβ3-νβ1 immunreakciót mutató - fragmensét) alkalmazzuk.
A következőkben a leírás részét képező ábrák rövid ismertetését írjuk le.
Az 1A-1D. ábrákon a β3 - és β^-integrin-alegységek - normális bőrben és sebgyógyulás folyamatában lévő bőrben (melyet az ábrán satjadzó szövetnek nevezünk) tapasztalható - szöveti eloszlását mutatjuk be. Az β3- és β1-alegység elleni antitestekkel végzett immunhisztokémiai vizsgálatot a 3. példa A) részében leírt módon végeztük. Az 1A. és IB. ábrán az 3ηϋ-β3antitest normális bőrben, illetve sarjadzó szövetben mutatott immunreaktivitása, míg az IC. és ID. ábrán az anti-β,-antitest normális bőrben, illetve sarjadzó szövetben mutatott immunreaktivitása látható.
A 2A-2D. ábrákon az β3-integrin-alegységet megkö-> tő „von Willebrand”-fektor (vWF) és a βι-integrin-alegységet megkötő lamininligandumok - normális bőrben és sebgyógyulás folyamatában lévő bőrben (melyet az ábrán sarjadzó szövetnek nevezünk) tapasztalható - szöveti eloszlását mutatjuk be. A „von Willebrand”-faktor elleni antitesttel (anti-vWF) és a laminin elleni antitesttel (antilaminin) végzett immunhisztokémiai vizsgálatot a 3. példa B) részében leírtak szerint végeztük. A 2A. és 2B. ábrán az anti-vWF normális bőiben, illetve sarjadzó szövetben mutatott immunreaktivitása, a 2C. és 2D. ábrán pedig az antilaminin normális bőrben, illetve sarjadzó szövetben mutatott immunreaktivitása látható.
A 3A-3D. ábrákon a vitronektin integrinreceptora (az θνβ3) - húgyhólyagrák-, vastagbélrák-, emlőrák-, illetve tüdőrákszövetből származó - biopsziákban tapasztalható szöveti eloszlását mutatjuk be. Az θνβ3 elleni LM609-antitest alkalmazásával végzett immunhisztokémiai vizsgálatot a 3. példa C) részében leírtak szerint végeztük.
A 4. ábrán 10 napos csirkeembrióból származó, vérerektől mentes chorioallantois-membrán (CAM) tipikus mikrofényképét mutatjuk be. A CAM előkészítését az 5. példa B) részében írjuk le.
Az 5A-5C. ábrákon a β! és a^3-integrin - találmány szerinti CAM-preparátumban tapasztalható szöveti eloszlását mutatjuk be. Az 5A. ábrán a Pj-alegység 10 napos, kezeletlen CAM-preparátumban mutatott (CSAT alkalmazásával immunfluoreszcencia-immunreaktivitás alapján detektált) eloszlása látható. Az 5B. ábrán az avp3-receptor 10 napos, kezeletlen CAMpreparátumban mutatott - LM609 anti-avp3-antitest al3
HU 221 988 Bl kalmazásával immunfluoreszcencia-immunreaktivitás alapján detektált - eloszlása látható. Az 5C. ábrán az avp3-receptor pFGF-fel kezelt, 10 napos CAMpreparátumban mutatott - LM609 anti-avp3-antitest alkalmazásával immunfluoreszcencia-immunreaktivitás 5 alapján detektált - eloszlása látható. A kezeléseket és az eredményeket az 5. példa C) részében ismertetjük.
A 6. ábrán oszlopgrafikonon mutatjuk be az θνβ3 és β3 - kezeletlen (kontroll), illetve βΡΰΡ-ίβΙ kezelt 10 napos CAM-preparátumokban megfigyelhető - relatív 10 expresszióját (a kísérletet a 6. példa A) részében írjuk le). Az y tengelyen az átlagos fluoreszcenciaintenzitást, az x tengelyen az integrineket tűntettük fel.
A 7A. ábrán egy kezeletlen, 10 napos CAM, a 7B. ábrán egy pFGF-fel kezelt CAM, a 7C. ábrán pedig 15 egy TNFa-val kezelt CAM mikrofényképét mutatjuk be (az eljárások és eredmények leírását lásd a 6. példa
A) részében).
A 8A-8E. ábrákon a helyi antitestkezelés - 10 napos CAM βΡΰΡ-ηκΰ^Ιβ angiogenezisére gyakorolt - 20 hatását mutatjuk be (lásd 7. példa, A)l. rész). A 8A. ábrán vérerektől mentes, kezeletlen CAM-preparátum látható. A 8B. ábrán az új erek - korábban érrendszer nélküli területre történő - behatolása látható (ami PFGFkezelés hatására következik be). A 8C., 8D. és 8E. áb- 25 ián a β[, ανβ5, illetve ανβ3 elleni antitestek (anti-β! CSAT; anti-cqjJ5, P3G2; illetve anti-a^3, LM609) angiogenezisre gyakorolt hatása látható.
A 9A-9C. ábrákon a 66 203-as jelzésű szintetikus peptid intravénás injektálásának - tumorok által indu- 30 kált angiogenezisre gyakorolt - hatását mutatjuk be (lásd 7. példa D)2. rész). A 9A. ábrán egy kontrollpeptiddel végzett intravénás kezelés (kontrollpeptid, tumor) - tumorindukcióból eredő angiogenezisre gyakorolt - gátlóhatásának hiánya látható. A 66 203-as jelzé- 35 sű peptid intravénás injektálásának angiogenezisre gyakorolt gátlóhatása a 9B. ábrán látható (ciklusos RGD, tumor). A 9C. ábrán az látható, hogy a 66 203-as jelzésű peptid intravénás infúziója nem eredményez gátlóvagy citotoxikus hatást a tumorkezelt területtel szom- 40 szédos területen lévő, már létező, érett véredényekkel szemben (ciklusos RGD, szomszédos CAM).
A10A-10C. ábrákon monoklonális antitestek - növekedési faktorral indukált angiogenezisre gyakorolt hatását mutatjuk be. A kísérletet a 7. példa B)l. részé- 45 ben újuk le. Az 10A. ábrán antitestkezelés nélküli, PFGF-fel indukált angiogenezis látható (kontroll).
A 10B. ábrán látható, hogy az angiogenezis gátlása nem következett be, ha pFGF-fel indukált preparátumot P3G2 anti-a^-antitesttel kezeltünk. Az angioge- 50 nezis gátlása az LM609 anti-a^-antitesttel végzett kezelés hatására következett be (10B. ábra).
A 11A-11C. ábrákon az antiintegrin-antitestek helyi alkalmazásának embrionális angiogenezisre gyakorolt hatását mutatjuk be. A kísérletet a 7. példa C) részé- 55 ben újuk le. A 11 A. és 11B. ábrán látható, hogy a hatnapos CAM anti-βι, illetve anti-a^-antitesttel végzett kezelése nem gátolta az angiogenezist. Ezzel szemben, az LM609 anti-avp3-antitesttel végzett kezelés gátolta a vérerek képződését (1 IC. ábra). 60
A 12. ábrán CAM-preparátumban a tumorba behatoló erek számát mutatjuk be. A kísérletet a 7. példa D)l. részében újuk le. Az y tengelyen a - CSAT- (anti-β!, LM609-(anti-a^3), illetve P3G2-antitesttel (antia^5) helyileg kezelt - tumorba hatoló erek számát tüntettük fel.
A 13A-13D. ábrákon 9. példa A)l.a) részében leírt kísérletben a kezelés után 7 nappal mért nedves tumortömeg és a kiindulási tumortömeg összehasonlításait mutatjuk be. Mindegyik oszlop csoportonként
5-10 tumor átlaga ±szórás értéket reprezentál. A kísérletben humán melanoma (M21-L; 13A. ábra), hasnyálmirigyrák (Fg; 13B. ábra), tüdőrák (UCLAP-2; 13C. ábra) és gégerák (HEp3; 13D. ábra) CAM-preparátumokból származó tumorokat alkalmaztunk, melyeket intravénásán PBS-sel, CSAT-antitesttel (antiβ)), illetve LM609-antitesttel (anti-cqjJ3) kezeltünk. Az y tengelyen a CSAT-antitesttel (anti-β!), LM609-antitesttel (anti-a^3), illetve PBS-sel intravénásán kezelt tumorok tömegét tüntettük fel.
A 14A. és 14B. ábrán a P3G2-antitesttel (antiΟνβϊ), illetve LM609-antitesttel (anti-a^3) kezelt tumorok hematoxilinnal és eozinnal festett szövettani metszeteit mutatjuk be. A kísérletet a 9. példa A)l.a) részében újuk le. A 14A. ábrán látható, hogy a kontrollP3G2-antitesttel kezelt tumorok sztrómájában mindenütt számos életképes és aktívan osztódó tumorsejt (melyek jelenlétét a mitózisos alakzatok mutatják, lásd nyílhegyek), valamint sok véredény (nyilak) található. Ezzel szemben, a 14B. ábrán látható, hogy az LM609-antitesttel (anti-a^3) kezelt tumorok metszeteiben alig detektáltunk életképes tumorsejteket vagy vérereket.
A 15A-15E. ábrán - a 9. példa A)l.b) részében leírt eljárás szerint - peptidekkel kezelt M21L-tumorokat mutatunk be. A 15A. ábrán a kontroll ciklusos RAD-peptiddel (69 601) kezelt tumor; a 15B. ábrán a ciklusos RGD-peptiddel (66 203) kezelt tumor; a 15C. ábrán ugyanazon - ciklusos RGD-peptiddel kezelt - embriókból származó, a tumorral szomszédos CAM-szövet látható. A 15D. ábrán a kontroll ciklusos RAD-peptiddel (69 601) kezelt tumor 13-szoros nagyítását, a 15E. ábrán pedig a ciklusos RGD-peptiddel (66 203) kezelt tumor 13-szoros nagyítását mutatjuk be (a nyilak a szétrombolt vérereket mutatják).
A 16A-16C. ábrákon - in vivő nyúlszemmodellben - az érképződés angiogenezis-antagonisták hatására bekövetkező gátlását mutatjuk be (lásd 10. példa). A 16A. és 16B. ábrán a nyúlszemben - βΡΰΡ és monoklonális PlF6-antitest (anti-a^5) jelenlétében bekövetkező angiogenezist mutatjuk be. A 16C., 16D. és 16E. ábrán a nyúlszemben az angiogenezis [FGF és monoklonális LM609-antitest (anti-a^3) jelenlétében megfigyelhető] gátlását mutatjuk be.
A 17. ábrán az in vivő egér:humán kimérikus egérmodell kialakításának folyamatábráját mutatjuk be (lásd 11. ábra A) része). SCID-egér bőrének egy darabját humán újszülött-praeputiummal helyettesítettük. A műtét helyét az átültetés után négy hétig gyógyulni hagytuk. A bőr begyógyulása után az emberi praeputiomot emberi tumorsejtekkel oltottuk be. A következő
HU 221 988 Bl négyhetes időszak alatt mérhető tumor jelenlétét állapítottuk meg, amely - az emberi bőrből az emberi tumorba nőtt - humán érrendszert tartalmazott.
A 18. ábrán a monoklonális antitesttel és peptiddel kezelt CAM-szövetekből származó és „Apop Tag” an- 5 titesttel festett, különálló sejtek százalékos arányát mutatjuk be, amit - a 12. példa A), illetve B) pontjában leírt - FACS-analíssel határoztunk meg. A fekete, illetve a pontozott oszlopok a vizsgálat előtt 24, illetve 48 órával kezelt embriókból származó sejteket reprezentálják. 10 Valamennyi oszlop három ismétléssel végzett kísérlet átlag+szórás értékeit jelenti. A CAM-preparátumokat a
12. példa A)2. pontjában leírtak szerint, LM609 (antiθνβ3) vagy CSAT (anti-β]) monoklonális antitesttel, illetve foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) kezeltük. CAM- 15 preparátumokat a 66 203-as ciklo-RGDfV-peptiddel (melyet az ábrán 203-as pepiidként jelölünk), valamint a 69 601-es kontroll ciklusos peptiddel (ciklo-RADfV, melyet 601-es peptidként jelölünk) is kezeltünk (lásd
12. példa B) pontja). 20
A 19A. és 19B. ábrán CSAT (anti-β! monoklonális antitesttel (19A. ábra) vagy LM609 (anti-a^3) monoklonális antitesttel (19B. ábra) kezelt embriókból származó chorioallantois-szövetek különálló sejtjeiből készített, „Apop Tag” antitesttel és propidium-jodiddal 25 festett és FACS-analízissel vizsgált szuszpenziók egyesített eredményeit mutatjuk be (lásd 12. példa C) pontja). A y tengelyen az ,Λρορ Tag” festődésű sejtek számát (apoptózis), az x tengelyen pedig a propidium-jodidos festődést (DNS-tartalom) tűntetjük fel. A vízszin- 30 tes vonal az ,Λρορ Tag” festődés negatív kapuját reprezentálja. A 19A. ábrán a CSAT (anti-β! monoklonális antitesttel kezelt embriókból származó chorioallantoissejtek, a 19B. ábrán pedig az LM609 (anti-a^3) monoklonális antitesttel kezelt embriókból származó chorio- 35 aliantois-sejtek eredményei láthatók. A sejtciklus-analízist mindegyik kísérleti feltétel esetében hozzávetőleg 8000 esemény vizsgálatával végeztük.
A 20A-20C. ábrákon CSAT-antitesttel (anti-β!) kezelt embriókból származó chonoallantois-membránszö- 40 vetet; a 20D-20F. ábrákon pedig LM609-antitesttel (anti-a^3) kezelt embriókból származó chonoallantois-membránszöveteket mutatunk be, melyek előkészítését a 12. példa C) részében fajuk le. A 20A. és 20D. ábrán az ,Λρορ Tag” antitesttel festett, és D. I. C. 45 képre („image”) szuperinponált fluoreszcencia alapján láthatóvá tett szövetek láthatók. A 20B. és 20E. ábrán az előbbiekkel azonos - LM609-antitesttel festett és fluoreszcenciával (rodamin) láthatóvá tett - szövetek láthatók. A 20C. és 20F. ábrán az előbbiekkel azonos 50 - ,Λρορ Tag” és LM609-antitesttel festett - szövetek összeillesztett képei láthatók, ahol a sárga festődés együttes lokalizációt jelent. A 20C. ábrán lévő vízszintes vonal 15 μτη-nek, a 20F. ábrán lévő vonal pedig 50 pm-nek felel meg. 55
A következőkben a találmány leírásában használt kifejezések meghatározását adjuk meg.
Az „aminosav” kifejezés egy polipeptidből - peptidkötései hidrolízisével - kialakított aminosavakra vonatkozik. A leírásban említett aminosavak előnyösen 60
L-izomerek, azonban az L-aminosavak bármilyen Daminosawal helyettesíthetők, feltéve, hogy a polipeptid kívánt funkcionális tulajdonságai megmaradnak. Az „NH2” jelentése a polipeptid N-terminálisán lévő szabad aminocsoport, míg a „COOH” jelentése a polipeptid C-terminálisán lévő szabad karboxilcsoport. Az aminosavak rövidítéseit - a standard polipeptid-nevezéktannak [lásd J. Bioi. Chem. 243, 3552 (1969); 37. CFR, §1.822 (b) (2)] megfelelően - a következők szerint használjuk.
Rövidítés Aminosav
Egybetűs Hárombetűs
Y Tyr Tirozin
G Gly Glicin
F Phe Fenil-alanin
M Met Metionin
A Ala Alanin
S Ser Szerin
I Ile Izoleucin
L Leu Leucin
T Thr Treonin
V Val Valin
P Pro Prolin
K Lys Lizin
H His Hisztidin
Q Gin Glutamin
E Glu Glutaminsav
Z Glx Glu és/vagy Gin
w Trp Triptofán
R Arg Arginin
D Asp Aszparaginsav
N Asn Aszparagin
B Asx Asn és/vagy Asp
C Cys Cisztein
Z Xaa Ismeretlen /egyéb
Néhány további rövidítés jelentése:
BOC terc-butil-oxi-karbonil-csoport
DCCI diciklohexil-karbodiimid
DMF dimetil-formamid
OMe metoxicsoport
HOBt 1-hidroxi-benzo-triazol
Megjegyezzük, hogy valamennyi aminosavszekvenciát a hagyományos, N-terminális -> C-terminális irányban adjuk meg. Megjegyezzük továbbá, hogy az aminosavszekvencia elején vagy végén feltűntetett kötőjel peptidkötést jelöl, amellyel az adott szekvencia - egy vagy több aminosavból álló - másik aminosavszekvenciához kapcsolódhat.
A „polipeptid” kifejezés - egymáshoz az alfa-aminocsoport és a karboxilcsoport közötti peptidkötésekkel kapcsolódó - aminosavak lineáris láncát jelenti.
A „peptid” kifejezés - ahogy itt használjuk - ötvennél nem több aminosavból álló lineáris láncot jelent, melyben az aminosavak a polipeptid esetében leírtak szerint kapcsolódnak egymással.
A „ciklusos peptid” kifejezés a megfelelő lineáris peptidből származik; olyan peptidet jelent, amelyben nincs szabad N- vagy C-terminális, és amelynek megfelelő lineáris peptid N-terminálisa amidkötést képez saját C-terminálisával.
HU 221 988 Bl
A „protein” kifejezés ötvennél több aminosavból álló lináris láncot jelent, melyben az aminosavak a polipeptid esetében leírtak szerint kapcsolódnak egymással.
A „szintetikus peptid” kifejezés kémiai úton előállított - egymással peptidkötésekkel kapcsolódó aminosavakat tartalmazó láncot jelent, amely nem tartalmaz természetben előforduló proteineket vagy proteinfragmenseket.
A találmány szerinti megoldás azon a felismerésen alapul, hogy az angiogenezist a specifikus ανβ3-νίίτοnektin-receptor közvetíti, és az avP3-funkció gátlása gátolja az angiogenezist. Ez a felismerés azért lényeges, mert az angiogenezis számos különböző betegségben játszik szerepet. Az angiogenezis gátlásával beavatkozhatunk a betegség lefolyásába, enyhíthetjük a tüneteket, és bizonyos esetekben meggyógyíthatjuk a beteget.
Amennyiben az új véredények növekedése egy betegség kialakulásának okát képezi (vagy hozzájárul ahhoz), az angiogenezis gátlásával csökkenthetjük a betegség ártalmas hatásait. Az ilyen betegségek példáiként említhető a reumatoid arthritis, a cukorbetegséggel járó retinabántalom, a gyulladásos betegségek, a restenosis és hasonlók. Ha egy káros szövet növekedésének elősegítéséhez új vérerek növekedésére van szükség, az angiogenezis gátlása csökkentheti a szövet vérellátását, s ezáltal hozzájárulhat a tumor tömegének csökkentéséhez. Az ilyen jellegű esetek példái közé tartoznak az olyan tumomövekedések, melyek során az új erek folyamatos képződésére van szükség ahhoz, hogy a tumor néhány milliméternél vastagabbra nőjön, és kemény metasztázisok alakuljanak ki.
A találmány szerinti eljárások részben azért hatásosak, mert a terápia nagymértékben szelektív az angiogenezisre, miközben más biológiai folyamatokra nem specifikus. Ahogy azt a példákban leírjuk, csak az újonnan képződő erek tartalmaznak jelentős mennyiségű OvP3 integrint, így a terápiás eljárások nem gyakorolnak zavaró hatást az érett erekre. Ezenkívül, az a^-integrin normális szövetekben nem elterjedt; specifikusan az új erekben található, ami biztosítja, hogy a terápiával szelektíven az új erek növekedését célozhassuk meg.
Az a felismerés, hogy önmagában az θνβ3 gátlásával lehetővé válik az angiogenezis gátlása, olyan gyógyszerkészítmények kifejlesztését teszi lehetővé, amelyek nagymértékben specifikusak, s ezáltal viszonylag alacsony toxicitásúak. Ennek megfelelően - bár találmányunkban olyan peptidalapú reagensek alkalmazását tárjuk fel, amelyek képesek egy vagy több integrin gátlására -, egyéb reagensek is kifejleszthetek, amelyek még nagyobb specifitással gátolják az a^3-integrint, s ezáltal - az a^-integrin közvetítette folyamatokon kívül - nem gátolnak más biológiai folyamatokat.
Például, előállíthatunk olyan, az avp3-integrinnel való immunreakcióra nagyon specifikus monoklonális antitesteket, amelyek hasonlóan specifikusak az ανβ3fúnkció gátlására is. Ezenfelül, RGD-szekvenciát tartalmazó peptideket alakíthatunk ki, oly módon, hogy specifikusak legyenek az avfi3-integrin gátlására.
A találmány szerinti megoldás megvalósításához vezető felismerések előtt nem volt ismert, hogy az angiogenezis - és az angiogenezistől függő valamennyi folyamat - in vivő olyan reagensek alkalmazásával gátol5 ható, amelyek az avfi3-integrin biológiai működésének antagonistái.
Eljárások az angiogenezis gátlására
A találmány tárgyát képezi egy eljárás angiogenezis gátlására egy szövetben, amely ezáltal a szövetben leját10 szódó, angiogenezis-fuggő folyamatok gátlására is alkalmas. Az eljárás során, általában olyan készítményt adunk be a szövetbe, amely egy oqji3-antagonista angiogenezist gátló mennyiségét tartalmazza.
Ahogy korábban említettük, az angiogenezis szá15 mos folyamatból áll, beleértve a szövetekben az új erek képződését („neovascularizatio”), például sarjadzással; a „vasculogenezis”-t és az erek megnagyobbodását Valamennyi angiogenezis-folyamatot az a^3-integrin expressziója közvetíti, s mindegyik a^-függő. Úgy véljük, hogy a sérülés miatt létrejött seb gyógyulásán, a sárgatest kialakulásán és az embriogenezis kivételével az angiogenezis-folyamatok jelentős része betegségekkel kapcsolatos, így a találmány szerinti terápiás eljárások szelektívek a betegségre, és nincsenek káros mel25 lékhatásaik.
Számos különféle betegség létezik, melyekben az angiogenezist lényegesnek tartják; ezeket angiogén betegségeknek nevezzük. Az ilyen betegségek közé tartoznak - nem kizárólagosan - a gyulladásos rendellenes30 ségek (mint például az immun- vagy a nem immungyulladás, a krónikus ízületi reuma és a pikkelysömör), az erek elégtelen vagy nem kellő időben történő behatolásával járó betegségek (mint például a cukorbetegséggel járó retinabántalom, a neovascularis glaucoma, a restenosis, az ateroszklerózisos plakkokban lejátszódó hajszálér-proliferáció és a csontritkulás), valamint a rákkal kapcsolatos betegségek, például kemény tumorok, a kemény tumorok metasztázisai, angiofibromák, a retrolerális fibroplázia, hemangiómák, Kaposi-szarkóma és hasonlók, melyeknél a tumor növekedéséhez új erek képződésére van szükség.
Egy megbetegedett szövetben az angiogenezist gátló eljárások enyhítik a betegség tüneteit, és - a betegségtől függően - elősegíthetik a betegség gyógyulását.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint az angiogenezist egy szövetben gátoljuk. A szövetben az angiogenezis mértéke - és ezáltal a találmány szerinti eljárásokkal megvalósított gátlás mértéke - számos módszerrel értékelhető, például, az avP3-immunpozitív, éret50 len és fejlődő érstruktúrák - későbbiekben leírt - immunhisztokémiai detektálásával.
Beteg állapotban a különböző szövetek vagy - szervezett szövetekből álló - szervek bármelyikében (beleértve a bőrt, izmot, beleket, kötőszövetet, ízületeket, csontokat és hasonlókat, melyekbe a vérerek - angiogén ingerek hatására - behatolhatnak) előfordulhat angiogenezis.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmében gyulladt állapotban lévő szövetet kezelünk, melynek során a gyulladt szövetben tapasztalható angio.....................
HU 221 988 Bl genezist kívánjuk gátolni. Ebben a megvalósítási módban az angiogenezist ízületi gyulladásos szövetekben (például krónikus ízületi reumában szenvedő betegben), immun- vagy nem immungyulladásos szövetben, pikkelysömörös szövetben és hasonlókban gátoljuk.
A találmány számos megvalósitási módja értelmében kezelt páciensek előnyösen emberek, azonban a találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható valamennyi emlős esetében, melyeket szintén „páciensként” említünk. Ebben az összefüggésben az „emlős” kifejezésen azokat az emlősfajokat (különösen a mezőgazdasági haszonállat- és háziállatfajokat) értjük, amelyekben az angiogenezissel kapcsolatos betegségek kezelése kívánatos.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint szöveteken cukorbetegséggel járó retinabántalomban, a retina foltos elfajulásában vagy neovascularis glaucomában szenvedő páciens ideghártyaszövetét kezeljük, és az ideghártyaszövet - új erek képződésével járó angiogenezisét gátoljuk.
A találmány egy további megvalósítási módjában szövetként - keményt tumort, metasztázisokat, bőrrákot, emlőrákot hamangiomát, angiofibrómát vagy egyéb rákos daganatokat hordozó páciens tumorszövetét kezeljük, és a tumorszövet - új erek képződésével járó - angiogenezisét gátoljuk. A találmány szerinti eljárásokkal kezelhető, jellemző kemény tumorszövetek közé tartozik a tüdő-, hasnyálmirigy-, emlő-, vastagbél-, gége-, petefészekszövet és hasonlók. A példaként szolgáló tamorszövet-angiogeneziseket és gátlásukat a példákban kjük le.
A tumorszövet-angiogenezis gátlása a találmány különösen előnyös megvalósítási módját képezi, mivel az új erek képződése („neovascularisatio”) fontos szerepet játszik a tumomövekedésben. A tumorszövet „neovascularisatió”-jának hiányában a tumorszövet nem kapja meg a kívánt tápanyagokat, növekedési sebessége csökken, majd növekedése leáll, a tumor visszafejlődik, végül elhal.
Más szavakkal, a találmány leírásában feltárunk egy eljárást tumor-neovascularisatio gátlására, melynek során a tumorban lejátszódó angiogenezist a találmány szerinti eljárások szerint gátoljuk. Hasonlóan, a találmány leírásában feltárunk egy eljárást tumomövekedés gátlására, melynek során az angiogenezist gátló eljárásokat alkalmazzuk.
A találmány szerinti eljárások különösen hatásosan alkalmazhatók metasztázisok kialakulásának gátlására, mivel (1) a metasztázisok kialakulásához a primer tumorban új erek képződésére van szükség, hogy a metasztázisos ráksejtek elhagyhassák a primer tumort; és (2) a metasztázisok másodlagos helyen történő megtelepedéséhez szintén új erek képződésére van szükség, ami elősegíti a metasztázisok növekedését.
A találmány egy további megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti eljárást más gyógykezelésekkel (például a kemény tumorok ellen és a metasztázisok kialakulásának megakadályozására irányuló, hagyományos kemoterápiával) együtt alkalmazzuk. Az angiogenezis-inhibitor beadását rendszerint a kemoterápiával egyidejűleg vagy azt követően végezzük, bár olyan esetekben, amikor a tumorszövet a toxikus támadásra angiogenezis indukálásával reagál (hogy a vér- és tápanyagellátás biztosításával „megmeneküljön”), az angiogenezist előnyösen a kemoterápia után gátoljuk. Ha a kemény tumorokat a metasztázisok kialakulásának megelőzése céljából eltávolítottak, szintén előnyös, ha az angiogenezis-gátlási eljárásokat a műtét után alkalmazzuk.
Amennyiben a találmány szerinti eljárásokat tumorneovascularisatio (a tumorban új erek képződése) gátlására alkalmazzuk, az eljárások tumomövekedés gátlására, metasztázisok kialakulásának gátlására, és kialakult tumorok visszafejlesztésére is alkalmasak. A példák15 bán leltjük egy kialakult tumor - találmány szerinti avP3-antagonista egyszeri, intravénás beadását követő - visszafejlődését.
A restenosis a simaizom-sejtek - perkután transzlumináris szívkoszorúér-plasztikai műtét helyén megfi20 gyelhető - vándorlási folyamata, ami akadályozza az érplasztika sikerét. A simazisom-sejtek restenosisos vándorlása és proliferációja angiogenezises folyamatnak tekinthető, amely a találmány szerinti eljárások alkalmazásával gátolható. Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi a restenosis gátlása is, melynek során érplasztikai műtéten átesett páciensben a találmány szerinti eljárások szerint gátoljuk az angiogenezist. A restenosis gátlása céljából az a^-antagonistát rendszerint az érplasztikai beavatkozás után kb. 2-28 napig, előnyösen a be30 avatkozást követő első 14 napig adagoljuk.
A szöveti angiogenezis gátlásának (és az angiogenezissel kapcsolatos betegségek kezelésének) találmány szerinti eljárásainak gyakorlati megvalósítása során egy szövetet - amelyben angiogenezis figyelhető meg, vagy amely az angiogenezis veszélyének van kitéve olyan készítménnyel érintkeztetünk, amely egy avp3-antagonista gyógyászati szempontból hatásos (az természetes ligandumához történő kötődésének gátlására képes) mennyiségét tartalmazza. Az ilyen eljárás során egy páciensnek - egy találmány szerinti avp3-antagonistát tartalmazó - fiziológiailag elfogadható készítmény gyógykezelési szempontból hatásos mennyiségét adjuk be.
Az avp3-antagonista beadásához alkalmazott dózis45 tartomány az antagonista alakjától és hatékonyságától függ (mely tényezőket a későbbiekben részletesen ismertetjük), és előnyösen olyan mennyiséget alkalmazunk, amely elégséges a kívánt hatás (vagyis az angiogenezis gátlása és az angiogenezis által közvetített be50 tegségek enyhítése) eléréséhez. A beadott mennyiség nem lehet akkora, hogy káros mellékhatásokat (például híperviszkozitási tüneteket, tüdőödémát, vértolulás által előidézett szívelégtelenséget és hasonlókat) okozzon. Az adagolás általában a páciens korának, kondí55 ciójának, nemének, illetve a betegség súlyosságának függvényében változhat, és pontos meghatározása szakember feladata. Az adagolást - komplikáció előfordulása esetén - a kezelőorvos is meghatározhatja.
Az avp3-antagonista gyógykezelési szempontból ha60 tásos mennyisége olyan mennyiség, amely elégséges a
HU 221 988 Β1 kezelt szövetben az angiogenezis mérhető gátlásának előidézéséhez. Az ilyen mennyiséget angiogenezist gátló mennyiségnek nevezzük. Az angiogenezis gátlása in situ a találmány leírásában ismertetett immunhisztokémiai eljárással vagy más, szakember számára ismert el- 5 járásokkal mérhető.
Amennyiben avp3-antagonistaként avp3-t utánzó reagenst, RGD-szekvenciát tartalmazó peptidet, antiανβ3 monoklonális antitestet vagy annak fragmensét alkalmazzuk, a hatékonyság, és ezáltal a „gyógykezelési 10 szempontból hatásos” mennyiség változhat, azonban - ahogy azt a vizsgálati eljárásokkal kimutatjuk - egy találmány szerinti, lehetséges avp3-antagonista hatékonysága egyszerűen értékelhető.
Az eívPj-antagonisták hatékonyságát számos eljá- 15 rással mérhetjük; ezek közé tartozik az angiogenezis gátlásának mérése CAM-vizsgálatban, in vivő nyúlszemvizsgálatban, in vivő kimérikus egér:humán vizsgálatban, illetve a természetes ligandum avP3-hez való kötődése gátlásának mérése (mely vizsgálatok mind- 20 egyikét ismertetjük a találmány leírásában) és hasonló vizsgálatok.
Az előnyös avP3-antagonisták - 0,5 μΜ-nál, előnyösen 0,1 μΜ-nál, még előnyösebben 0,05 μΜ-nál kisebb koncentrációban - alapvetően képesek gátolni a 25 természetes ligandumok (például fibrinogén vagy vitronektin) avp3-hoz való kötődését. Az „alapvető” kifejezés azt jelenti, hogy az avp3-antagonista jelenlétében a fibrinogén kötődésének legalább 50%-os csökkenése figyelhető meg. Az avp3-antagonista 50%-os gátláshoz 30 tartozó koncentrációját ICS0-értéknek nevezzük.
Egy előnyösebb aj^-antagonista az integrinek közül az avp3-integrinre szelektív. Az ilyen előnyös θνβ3antagonista alapvetően gátolja a fibrinogén avp3-hoz való kötődését, de nem gátolja jelentősen a fibrinogén 35 más integrinekhez (például Ογβρ, otyPs* vagy anbP3'’n“ tegrinhez) való kötődését. Különösen előnyös az az a^3-antagonista, amely a fibrinogén aJIj-integrinhez való kötődésének gátlásakor 10-100-szor kisebb IC50aktivitást mutat, mint a fibrinogén más integrinhez való 40 kötődésének gátlása esetében. Az IC50-aktivitás mérési eljárásait a példákban írjuk le.
Egy találmány szerinti - monoklonális antitestként alkalmazott - a^3-antagonista gyógykezelési szempontból hatásos mennyisége jellemzően olyan mennyi- 45 ség, amely - fiziológiai szempontból elfogadható készítményben beadva - elégséges a vérplazmában kb.
0,01 pg/ml és kb. 100 pg/ml közötti, előnyösen kb.
pg/ml és kb. 5 pg/ml közötti, rendszerint kb. 5 pg/ml a^-antagonista-koncentráció biztosításához. Más mó- 50 dón megfogalmazva, a beadott mennyiség - napi egy vagy több dózisban, egy vagy több napon keresztül beadva - kb. 0,1 mg/kg-tól kb. 300 mg/kg-ig, előnyösen kb. 0,2 mg/kg-tól kb. 200 mg/kg-ig, legelőnyösebben kb. 0,5 mg/kg-tól kb. 20 mg/kg-ig terjedhet. 55
Ha a^3-antagonistaként monoklonális antitestfragmenst alkalmazunk, a beadott mennyiséget a fragmens tömegének a teljes antitest tömegéhez viszonyított aránya alapján könnyen meghatározhatjuk. A vérplazmában az antitestantagonista előnyös koncentrációja kb. 60 μΜ-tói kb. 5 μΜ-tg, előnyösebben kb. 100 pM-tól kb. 1 mM-ig terjed.
Egy találmány szerinti - polipeptid vagy más, hasonlóan kisméretű a^3-utánzó molekula alakjában álló - aji3-antagonista gyógykezelési szempontból hatásos mennyisége rendszerint a polipeptid azon mennyisége, amely fiziológiailag elfogadható készítményben beadva elégséges ahhoz, hogy a vérplazma a^3-antagonista-koncentrációját kb. 0,1 pg/ml és kb. 200 pg/ml közötti, előnyösen kb. 1 pg/ml és kb. 150 pg/ml közötti tartományban biztosítsa. 500 g/mol molekulatömegű polipeptidet tekintve alapul, a vérplazma előnyös ανβ3antagonista-koncentrációja kb. 2 μΜ-tói kb. 5 mM-ig, előnyösebben kb. 100 μΜ-tói kb. 1 mM-ig terjed. Más módon, a testtömegre vonatkoztatott adagolás - napi egy vagy több dózisban, egy vagy több napon keresztül - kb. 0,1 mg/kg-tól kb. 300 mg/kg-ig, előnyösen kb. 0,2 mg/kg-tól kb. 200 mg/kg-ig terjed.
A találmány szerinti monoklonális antitestek vagy polipeptidek parenterális úton, injektálással vagy infúzióval adhatók be. Bár a hatóanyag a kezelni kívánt szövetet rendszerint szisztémás beadásnak köszönhetően éri el, s emiatt a gyógyszerkészítményeket leggyakrabban intravénásán adagoljuk, más szövetek és beadási módok is alkalmazhatók, melyeknél valószínű, hogy a megcélzott szövet tartalmazza a célmolekulát. Ilyenformán, a találmány szerinti monoklonális antitestek és polipeptidek intravénásán, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, szubkután, intrakavitálisan, transzdermálisan és perisztaltikus módszerekkel adhatók be.
A találmány szerinti monoklonális antitestet vagy polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítményeket rendszerint intravénásán - például, egységdózis formájában, injektálással - adjuk be. A találmány szerinti gyógyszerkészítménnyel kapcsolatban alkalmazott „egységdózis” kifejezés fizikailag diszkrét egységekre vonatkozik, amelyek egységes dózisként adhatók be a páciensnek, és mindegyik egység az aktív hatóanyag előre meghatározott - a kívánt gyógykezelési hatás eléréséhez kiszámított - mennyiségét kívánt hígítószerrel, például hordozóval vagy vivőanyaggal együtt tartalmazza.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint az avp3-antagonistát egységdózis alakban, intravénásán adjuk be.
A készítményeket a dóziskészítménynek megfelelő módon, gyógykezelési szempontból hatásos mennyiségben adjuk be. A beadandó mennyiség és az időzítés a kezelni kívánt pácienstől, a páciens anyagcseréjének aktív hatóanyagot feldolgozó képességétől és a terápiás hatás kívánt mértékétől függ. Az aktív hatóanyag beadandó pontos mennyisége a kezelőorvos döntésétől függ, és minden egyes páciensre egyénileg jellemző. A szisztémás beadáshoz alkalmas dózistartományokat (melyek a beadás módjától függően változhatnak) a találmány leírásában ismertetjük. Az alkalmas beadási rendek is változóak, de jellemzően egy kezdeti beadást követően - egy vagy több órás időközönként, injektálással vagy más módon - ismételt dózisokat adunk be. Más módon, folyamatos intravénás infúzió is alkalmaz8
HU 221 988 Β1 ható, amely elégséges a vérben hatóanyag - in vivő gyógykezeléshez meghatározott - koncentrációtartományának fenntartásához.
Ahogy azt a példákban bemutatjuk, az angiogenezis gátlása és a tumor visszafejlődése (regressziója) már az 5 antagonista megcélzott szövettel történő érintkeztetését követő 7. napon bekövetkezik. Az antagonista további vagy meghosszabbított érintkeztetésének ideje hét naptól hat hétig, előnyösen kb. 14 naptól 28 napig teljed.
A példákban bemutatjuk az a^-integrin gátlása és 10 az új éihálózat - a^-integrint hordozó - sejtjei apoptózisának índukálása közötti összefüggést. Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás egy szövet új érhálózata apoptózisának gátlására. Az eljárást lényegében az angiogenezis gátlásához leírtak 15 szerint, és az ahhoz alkalmazott feltételek szerint végezzük; az egyetlen jelentős különbség a hatás időzítése, mivel az apoptózis gyorsan - rendszerint az antagonista érintkeztetése után 48 órán belül - megnyilvánul, míg az angiogenezis gátlása és a tumor visszafejlődése 20 lassabban következik be. Ez a különbség a terápiás rendet a beadás időzítése és a kívánt hatás tekintetében érinti. Az új érhálózat apoptózisa érdekében az antagonista beadását rendszerint 24 órától kb. négy hétig, előnyösen 48 órától hét napig terjedő ideig végezzük. 25 Gyógyszerkészítmények
A találmány további tárgyát képezik az olyan gyógyszerkészítmények, amelyek alkalmasak a találmány szerinti gyógykezelési eljárások megvalósítására. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények fiziológiai szem- 30 pontból elfogadható hordozót, és - aktív hatóanyagként - a hordozóban oldott vagy diszpergált, találmány szerinti ovp3-antagonistát tartalmaznak. A találmány egy előnyös megvalósítási módja értelmében az θνβ3antagonistát tartalmazó gyógyszerkészítmény - emlős- 35 nek vagy embernek gyógykezelési célból adagolva nem immunogén hatású.
Ahogy a leírásban használjuk, a „gyógyászati szempontból elfogadható”, „fiziológiailag elfogadható” vagy „fiziológiai szempontból elfogadható” kifejezéseket és szinonimáikat - amennyiben készítményekre, hordozókra, hígitószerekre és reagensekre vonatkoznak - egymással helyettesíthető módon alkalmazzuk, és azt jelentik, hogy az adott anyag egy emlősnek anélkül adható be, hogy nemkívánatos fiziológiai hatásokat (például hányingert, szédülést, rendetlen gyomorműködést és hasonlókat) okozna.
Egy - oldott vagy diszpergált állapotban aktív hatóanyagokat tartalmazó - gyógyászati készítmény többféle alakban, ismert módszerekkel állítható elő. Az ilyen készítményeket rendszerint injektálható alakban - folyékony oldatok vagy szuszpenziók formájában - állítjuk elő, azonban szilárd alakok is előállíthatók, amelyekből a felhasználás előtt oldatok vagy szuszpenziók készíthetők. A készítmény emulgeált állapotban is előállítható.
Az aktív hatóanyagot a találmány szerinti gyógykezelési eljárásokban történő alkalmazáshoz megfelelő mennyiségben, gyógyászati szempontból elfogadható - az aktív hatóanyaggal kompatibilis - hordozóval és egyéb segédanyaggal elegyíthetjük. Az alkalmas hordozók közé tartozik, például, a víz, sóoldat, dextróz, glicerin, etanol és hasonlók, valamint ezek kombinációi. A készítmény, kívánt esetben, kis mennyiségben tartalmazhat kiegészítő anyagokat is, például nedvesítővagy emulgeálószereket, puffereket és hasonlókat, melyek fokozzák az aktív hatóanyag hatékonyságát.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények az alkalmazott komponensek - gyógyászati szempontból elfogadható - sóit is tartalmazhatják. Az alkalmas, gyógyászati szempontból elfogadható sók közé tartoznak a savaddíciós sók, melyek a polipeptidből és - szabad aminocsoportjával reagáló - savból képződnek; a savak lehetnek szervetlen savak (például sósav vagy foszforsav) vagy szerves savak (például ecetsav, borkősav, mandulasav és hasonlók). A polipeptidek szabad karboxilcsoportjaival képzett sók szintén származhatnak szervetlen bázisokból, például nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium- vagy vas(III)-hidroxidból, illetve szerves bázisokból, például izopropil-aminból, trimetilaminból, 2-etil-amino-etanolból, hisztidinből, prokainból és hasonlókból.
Ciklusos a^3-antagonist-polipeptidek készítményeiben különösen előnyösen alkalmazhatók a TFA és sósav sói. A peptidek jellemző sóit a példákban ismertetjük.
A fiziológiai szempontból elfogadható hordozók a szakirodalomból jól ismertek. A folyékony hordozók példái közé tartoznak a steril vizes oldatok, amelyek az aktív hatóanyagon és a vízen kívül más anyagot nem tartalmaznak, vagy amelyek puffért (például fiziológiai pH-értéket biztosító nátrium-foszfát-puffert), sóoldatot vagy puffért és sóoldatot (például foszfátpufferelt sóoldatot) is tartalmaznak. A vizes hordozók tartalmazhatnak több puffersót, továbbá egyéb sókat (mint például nátrium- és kálium-kloridot), dextrózt, polietilénglikolt és egyéb oldott anyagokat is.
A folyékony készítmények a vízen kívül vagy a víz helyett tartalmazhatnak egyéb folyékony fázisokat is, 40 melyek példáiként a glicerin, a növényi olajok (például gyapotmagolaj) és víz-olaj szuszpenziók említhetők.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmény egy találmány szerinti a^3-antagonista angiogenezist gátló mennyiségét tartalmazza. A készítményt általában úgy 45 állítjuk elő, hogy a készítmény teljes tömegére vonatkoztatva legalább 0,1 tömeg% a^3-antagonistát tartalmazzon, ami azt jelenti, hogy a készítmény 100 g-ja 0,1 g inhibitort tartalmaz.
Az a.$3-integrin antagonistái
A találmány szerinti eljárásokban az a^3-antagonistákat a szövetekben lezajló angiogenezis gátlására alkalmazzuk. Különböző olyan vegyületek léteznek, amelyek az a^3-integrinnel úgy lépnek kölcsönhatásba, hogy megakadályozzák az a^3-integrin természetes a^3-ligandumokkal bekövetkező, funkcionális kölcsönhatását. A példaként szolgáló antagonisták közé tartoznak az ανβ3 ligandumkötő helyéből származó α^-analógok; az α^-integrint vagy az avp3-integrin természetes ligandumát utánzó molekulák, amelyek az a^3-integrin és liganduma kötődési interakcióiban sze9
HU 221 988 Bl repet játszó strukturális régiókat utánozzák; az ανβ3-ίηtegrinre specifikus természetes ligandum funkcionális kötődoménjének (különösen az avp3-integrin természetes ligandumának RGD-tartalmú doménjének) megfelelő szekvenciát tartalmazó polipeptidek; valamint az a^3-integrinnel vagy természetes doménjével immunreakcióba lépő antitestek (a felsorolt antagonisták közös jellemzője, hogy a leírásban meghatározott antagonistaaktivitást mutatnak.
Polipeptidek
A találmány egyik megvalósítási módja szerint az a^-antagonistákat polipeptidek alakjában alkalmazzuk. Egy a^-antagonista-polipeptid az a^3-integrin vagy az a^3-integrin természetes liganduma szekvenciajellemzőit mutathatja (az avP3-ligandum kölcsönhatásban szerepet játszó régióban), és a^3-antagonistaaktivitású. Egy előnyös avp3-antagonista peptid RGDtripeptidet tartalmaz, és szekvenciája a természetes ligandum RGD-tartalmú régiója szekvenciájának megfelelő.
Az előnyös RGD-tartalmú polipeptidek aminosavszekvenciája az a^3-integrin természetes liganduma (mint például a fibrinogén, vitronektin, „von Willebrand”-faktor, laminin, trombospondin és hasonlók) RGD-tartalmú régiójának felel meg. Ezen avp3-ligandumok szekvenciája jól ismert. Ilyenformán, az a^3antagonista-peptidek bármilyen természetes ligandumból származhatnak, de a fibrinogénből és vitronektinből származó antagonista peptidek előnyösek.
Az egyik különösen előnyös a^3-antagonista-peptid (más, fentebb említett integrinekkel szemben) elsősorban az θνβ3 - természetes ligandumához (ligandumaihoz) való - kötődését gátolja. Az ilyen ανβ3specifikus peptidek abból a szempontból mindenképpen előnyösek, hogy a^3-specifitásuk csökkenti a nemkívánatos mellékhatások (mint például egyéb integrinek gátlása) előfordulását. Az a^-specifitású ανβ3antagonista-peptidek hagyományos kötődési gátlás vizsgálattal (például a példákban leírt ELISA-vizsgálattal) könnyen azonosíthatók.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében olyan polipeptidet alkalmazunk, amely legfeljebb kb. 100 aminosavat, előnyösen legfeljebb kb. 60 aminosavat, előnyösebben legfeljebb kb. 30 aminosavat tartalmaz. Lineáris vagy ciklusos peptideket egyaránt alkalmazhatunk, bár a ciklusos peptidek különösen előnyösek. Az előnyös ciklusos és lineáris peptideket és jelölésüket az 1. táblázatban mutatjuk be.
Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti polipeptidnek nem kell szükségszerűen azonosnak lennie a természetes avp3-ligandum aminosavszekvenciájával, feltéve, hogy a polipeptid a kívánt szekvenciát tartalmazza, és - megfelelő vizsgálatban - képes avP3-antagonistaként működni.
Egy találmány szerinti polipeptid magában foglalja (a leírásban bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó) polipeptid bármilyen analógját, fragmensét vagy kémiai származékát, feltéve, hogy a polipeptid avp3-antagonista tulajdonságú. Ennek megfelelően, egy találmány szerinti polipeptid különböző módosításoknak, szubsztitúcióknak, inszercióknak és delécióknak vethető alá, ha az ilyen módosítások a polipeptid alkalmazhatóságában bizonyos előnyöket biztosítanak. Ebben a vonatkozásban a találmány szerinti avp3-antagonista-polipeptid egy ismertetett peptid aminosavszekvenciájának megfelelő (és nem azonos azzal), amelyben egy vagy több módosítás található, és amely - egy vagy több, itt leírt vizsgálatban - megtartja a^3-antagonista működését.
Ennek megfelelően, bármilyen peptidszármazékot alkalmazhatunk; például, amidokat, proteinekkel képzett konjugátumokat, gyűrűvé zárt peptideket, polimerizált peptideket, analógokat, fragmenseket, kémiailag módosított peptideket és hasonló származékokat
Az „analóg” kifejezésen olyan polipeptideket értünk, amelyek aminosavszekvenciája lényegében azonos egy olyan - a leírásban ismertetett - aminosavszekvenciával, amelyben egy vagy több aminosav funkcionálisan azonos aminosavval konzervatívan szubsztituált, és amely a^3-antagonista-aktivitást képes kifejteni. A konzervatív szubsztitúciók példái közé tartoznak azok a szubsztitúciók, melyek során apoláros (hidrofób) aminosavakat (például izoleucint, valint, leucint vagy metionint) helyettesítünk egymással; amikor poláros (hidrofil) aminosavakat helyettesítünk egymással, például arginint lizinnel, glutamint aszparaginnal, glicint szerinnel; amikor bázisos aminosavakat (például lizint, arginint vagy hisztidint) helyettesítünk egymással^ vagy ha savas aminosavakat (például aszparaginsavat vagy glutaminsavat) helyettesítünk egymással.
A „konzervatív szubsztitúció” kifejezés magában foglalja azt az esetet is, amikor egy aminosav helyett kés miailag derivatizált aminosavat alkalmazunk (feltéve,, hogy az így kapott polipeptid továbbra is megtartja kívánt gátló aktivitását).
A „kémiai származék” kifejezés olyan találmány szerinti polipeptidre vonatkozik, amely egy vagy több - funkciós csoportján kémiai úton derivatizált - aminosavat tartalmaz. Az ilyen derivatizált molekulák közé tartoznak például, azok, amelyekben a szabad aminocsoportokat úgy (Privatizáltuk, hogy amin-hidrokloridokat, p-toluolszulfonil-csoportokat, karbobenz-oxicsoportokat, t-butil-oxi-karbonil-csoportokat, klór-acetil-csoportokat vagy formilcsoportokat alkossanak. A szabad karboxilcsoportok sókká, metil- és etil-észterekké vagy más észterekké, illetve hidrazidokká, a szabad hidroxilcsoportok O-acil- vagy O-alkil-származékokká derivatizálhatók. A hisztidin imidazol-nitrogénjét úgy derivatizálhatjuk, hogy N-imbenzil-hisztidint kapjunk. Szintén a kémiai származékok közé tartoznak azok a peptidek, amelyek a húsz standard aminosav egy vagy több, természetben előforduló aminosavszármazékát tartalmazzák. Az ilyen származékok például, prolin helyett 4-hidroxi-prolint; lizin helyett 5hidroxi-lizint; hisztidin helyett 3-metil-hisztidint; szerin helyett homoszerint, lizin helyett omitint tartalmazhatnak. A találmány szerinti polipeptidek közé tartoznak az olyan polipeptidek is, amelyek a találmány leírásában ismertetett polipeptid aminosavszekvenciájától egy vagy több aminosav addíciója és/vagy delé10
HU 221 988 Bl ciója miatt különböznek, feltéve, hogy megtartják kívánt aktivitásukat.
A „fragmens” kifejezés olyan, találmány szerinti polipeptidekre vonatkozik, amelyek rövidebb aminosavszekvenciát tartalmaznak, mint azok a polipeptidek, me- 5 lyeknek aminosavszekvenciáját a leírásban ismertetjük.
Ha a találmány szerinti polipeptid olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely nem azonos a természetes Ov^-liganduméval, annak rendszerint az az oka, hogy a polipeptid egy vagy több (konzervatív vagy nem kon- 10 zervatív) szubsztitúciót tartalmaz, melyek általában az aminosavak legfeljebb kb. 30%-át, előnyösen legfeljebb kb. 10%-át érintik. Kapcsolószekvencia („linker”) kialakítása érdekében a polipeptid bármely végéhez további aminosavak kapcsolhatók, melyek révén a talál- 15 mány szerinti polipeptidek jelölőanyaghoz, szilárd közeghez vagy hordozóhoz rögzíthetők.
A találmány szerinti polipeptidekhez alkalmazható jelölőanyagokat, szilárd közegeket és hordozókat a későbbiekben ismertetjük. 20
Az aminosav kapcsolószekvenciák legalább egy aminosavból állnak, de tartalmazhatnak 40 vagy több aminosavat is; rendszerint 1-10 aminosavból állnak, és nem képeznek avP3-ligandum-epitópot. A kapcsoláshoz jellemzően alkalmazott aminosavak közé tartozik 25 a tirozin, cisztein, lizin, glutaminsav, aszparaginsav és hasonlók. A találmány szerinti polipeptid - ha másképpen nem jelezzük - terminális aminocsoportjának acilezése (például acetilezése vagy tioglikolsavas aminálása) révén, vagy (például ammóniával vagy me- 30 til-aminnal) végzett terminális karboxiaminálása miatt, illetve hasonló terminális módosítások következtében is eltérhet az avp3-ligandum természetes szekvenciájától. Jól ismert, hogy a terminális módosítások hasznosak a proteinázos emésztésre mutatott fogékonyság 35 csökkentésében, ezáltal oldatokban - különösen olyan biológiai folyadékokban, melyekben előfordulhatnak proteázok - fokozzák a polipeptidek felezési idejét. E tekintetben a polipeptid gyűrűvé zárása szintén hasznos terminális módosítás, és különösen előnyös, mivel 40 a gyűrűvé zárás stabil szerkezetet biztosít, és az ilyen ciklusos peptidek magas szintű biológiai aktivitást fejtenek ki.
A találmány szerinti peptidek bármelyike alkalmazható gyógyászati szempontból elfogadható só alakjá- 45 bán. A találmány szerinti peptidekkel sókat képező savak közé szervetlen és szerves savak egyaránt tartoznak; ilyenek például a trifluor-ecetsav (TFA), sósav (HC1), hidrogén-bromid, perklórsav, salétromsav, tiociánsav, kénsav, foszforecetsav, propionsav, glikolsav, 50 tejsav, piroszőlősav, oxálsav, malonsav, borostyánkősav, maleinsav, fumársav, antranilsav, fahéjsav, naflalin-szulfonsav, szulfanilsav és hasonlók. Különösen előnyösek a HC1- és TFA-sók.
A találmány szerinti peptidekkel sóképzésre alkal- 55 más bázisok közé szervetlen bázisok (például nátriumhidroxid, ammónium-hidroxid, kálium-hidroxid és hasonlók), illetve szerves bázisok - mono-, di- és trialkilés aril-aminok (például trietil-amin, diizopropil-amin, metil-amin, dimetil-amin és hasonlók), és adott esetben 60 szubsztituált etanol-aminok (például etanol-amin, dietanol-amin és hasonlók) egyaránt tartoznak.
A találmány szerinti peptidek bármilyen, szakember számára ismert eljárással - ideértve a rekombináns DNS-technikákat - szintetizálhatok. Előnyösek a szintetikus kémiai technikák (mint például a szilárd fázisú „Merrifíeld”-féle szintézis), mivel alkalmazásukkal nagy tisztaság és antigénspecifitás érhető el, nem képződnek nemkívánatos melléktermékek, és a peptidek könnyen előállíthatók. A rendelkezésre álló számos eljárás leírását lásd (a szilárd fázisú peptidszintézist illetően): Steward és munkatársai: „Solid Phase Peptide Synthesis”, W. H. Freeman Co., San Francisco (1969); Bodanszky és munkatársai: „Peptide Synthesis”, John Wiley & Sons, II. kiadás (1976); J. Meienhofer: „Hormonal Proteins and Peptides” 2. kötet, 46. old., Academic Press (New York, 1983); Merrifleld: Adv. Enzymol. 32, 221 (1969); Fields és munkatársai: Int. J. Peptide Protein Rés. 35, 161 (1990); és 4,244,946 számú egyesült államokbeli közzétételi irat; (a klasszikus, oldatban végzett peptidszintézist illetően pedig): Schroder és munkatársai: „The Peptides”, 1. kötet, Academic Press (New York, 1965) (valamennyi hivatkozást teljes egészében a kitanítás részének kell tekinteni). A peptidszintézis során alkalmazható védőcsoportok leírását lásd a fenti forrásokban, illetve J. F. W. McOmie: „Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, New York (1973), melyet szintén a kitanítás részének, kell tekinteni.
A szilárd fázisú szintézis során, általában, egymást; követően egy vagy több aminosavat (vagy megfelelői! védőcsoporttal ellátott aminosavat) adunk a növekvő peptidlánchoz. Normális esetben az első aminosav amino- vagy karboxilcsoportját egy megfelelő, szelektíven eltávolítható védőcsoporttal védjük. A reaktív oldalcsoportot tartalmazó aminosavak (mint például a lizin) esetében másféle, szelektíven eltávolítható védőcsoportot alkalmazunk.
Szilárd fázisú szintézis alkalmazásakor a védett vagy derivatizált aminosavat - nem védett karboxilvagy aminocsoportjánál - inért, szilárd hordozóhoz kapcsoljuk. Ezután az amino- vagy karboxilcsoport védőcsoportját szelektív módon eltávolítjuk, és a sorban következő - amino- vagy karboxilcsoportján megfelelően védett - aminosavat a szilárd hordozóhoz kapcsolt aminosawal elegyítjük és reagáltatjuk, olyan körülmények között, melyek alkalmasak a két aminosav közötti amidkötés kialakulásához. Az új aminosav amino- vagy karboxilcsoportjáról eltávolítjuk a védőcsoportot, majd hozzáadjuk a következő, megfelelően védett aminosavat stb. Miután valamennyi, kívánt aminosavat - megfelelő sorrendben - összekapcsoltuk, egymást követően vagy egyszerre eltávolítjuk a terminális és oldalcsoportok védőcsoportjait (valamint a szilárd hordozót), miáltal a kívánt, lineáris polipeptidet kapjuk.
A - például - fentiek szerint előállított lineáris polipeptideket megfelelő ciklusos peptidjeik kialakítása érdekében tovább reagáltathatjuk. A peptidek gyűrűvé zárásának egyik - példaként szolgáló - eljárását Zimmer és munkatársai írták le [Peptides 1992, 393. old.,
HU 221 988 Β1
ESCOM Science Publishers, Β. V. (1993)]. A gyűrűvé záráshoz rendszerint terc-butoxi-karbonil-csoporttal védett peptid-metil-észtert metanolban oldunk, nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá, és az elegyet 20 °C-on reagáltatjuk, hogy hidrolízissel eltávolítsuk a metil-ész- 5 tér védőcsoportot. Az oldószer elpárologtatósa után a terc-butoxi-karbonil-csoporttal védett pepiidet - savanyított vizes oldószerből - etil-acetáttal extraháljuk, majd dioxán közös oldószerben, enyhén savas környezetben eltávolítjuk a terc-butoxi-karbonil-csoportot. Az 10 így kapott, szabad N- és C-terminálisú lineáris peptidet úgy alakítjuk ciklusos peptiddé, hogy híg oldatát diklór-metán és dimetil-formamid elegyében - 1-hidroxi-benzotriazol és N-metil-morfolin jelenlétében - diciklohexil-karbodiimiddel reagáltatjuk. A kapott ciklu- 15 sós peptidet kromatográfiával tisztítjuk.
A ciklusos peptidek előállításának különösen előnyös eljárását Gurrath és munkatársai írták le [Eur. J. Biochem. 210, 911 (1992)], melyet a példákban ismertetünk.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításá- 20 bán alkalmazható, különösen előnyös peptidek közé tartozik a c-(GrGDFV) (4. azonosító számú szekvencia); c(RGDfV) (5. azonosító számú szekvencia); c-(RADfV) (6. azonosító számú szekvencia); c-(RGDFv (7. azonosító számú szekvencia), és a lineáris YTAECKPQVTRG- 25 DVF-peptid (8. azonosító számú szekvencia) („c” jelentése ciklusos peptid; a nagybetűk az L-aminosavakat, a kisbetűk a D-aminosavakat jelölik). E peptidek aminosavszekvenciáit a szekvencialista 4., 5., 6., 7., illetve 8. azonosító számú szekvenciájaként mutatjuk be. 30
Monotíonális antitestek
A találmány egyik megvalósítási módja szerint OvPj-antagonistaként monoklonális antitesteket alkalmazunk, melyek immunreakcióba lépnek az OvPj-integrinnel, és gátolják természetes ligandumához való kötő- 35 dését. A találmányban feltárjuk az ilyen antitesteket termelő sejtvonalakat, az ilyen sejtvonalak előállítására alkalmas eljárásokat, valamint a monoklonális antitestek előállítási eljárásait is.
A találmány szerinti monoklonális antitest olyan an- 40 titestmolekulákból áll, melyek (1) immunreakcióba lépnek az izolált OvPj-integrinnel, és (2) gátolják a fibrinogén Ovpj-integrinhez való kötődését. A specifikusan a^-integrinhez kötődő, előnyös monoklonális antitestek közé azok tartoznak, amelyek - az ATCC- 45 HB-9537 hibridóma-sejtvonal által szekretált - monoklonális LM609-antitest immunreaktív sajátságait mutatják. Az ATCC-HB-9537 hibridóma-sejtvonalat a Budapest Szerződés értelmében, 1987. szeptember 15én az,American Type Culture Collection” (ATCC) in- 50 tézetnél (1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) helyeztük letétbe.
Az „antitest” vagy ’antitestmolekula”kifejezésen a leírásban immunglobulin-molekulákat és/vagy immunglobulin-molekulák immunológiailag aktív részét ért- 55 jük, vagyis olyan molekulákat, amelyek „antitestkombinálódási helyet” („antibody combining site”) vagy paratopot tartalmaznak.
Az „antitestkombinálódási hely” az antitestmolekula azon strukturális része, amely nehéz és könnyű Ián- 60 cú, variábilis és hipervariábilis régiókból áll, és amely specifikusan kötődik az antigénhez.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában alkalmazható antitestek példái közé tartoznak az ép immunglobulin-molekulák, a lényegében ép immunblogulin-molekulák és az immunglobulin-molekulák paratopot tartalmazó részei, köztük a „Fab”, „Fab”’, F(ab’)j és F(v) néven ismert régiók, melyeket antitestfragmenseknek is nevezünk.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint egy találmány szerinti monoklonális antitestből származó Fab-fragmenst tartalmazó, rövidített immunglobulint alkalmazunk. Az Fc-receptor nélküli Fab-ffagmens oldékony, és a vérszérumban mutatott felezési ideje miatt terápiás előnyöket, felhasználási lehetőségei miatt pedig diagnosztikai előnyöket biztosít Az oldható Fab-fragmens előállítása szakember számára ismert, és számos eljárással megvalósítható.
Az antitestek Fab- és F(ab’)2-fragmensei, például, lényegében ép antitestek papainnal, illetve pepszinnel végzett proteolitikus reakciójával, jól ismert eljárások alkalmazásával állíthatók elő [lásd például 4,342,566 számú egyesült államokbeli közzétételi irat (Theofilopolous és Dixon)]. A Fab’-antitestfragmensek szintén jól ismertek, és a F(ab’)2-ffagmensek nehéz láncait összekötő diszulfidkötések (például merkapto-etanollal végzett) re-» dukálásával, majd a képződött protein-merkaptán (pék dául jód-acetamiddal végzett) alkilezésével állíthatók · elő. Előnyösen ép immunglobulin-molekulákat tartalmazó antitestet alkalmazunk.
A „monoklonális antitest” kifejezés olyan antitestmolekulák csoportjára vonatkozik, amelyek csak egyféle antitestkombinálódási helyet tartalmaznak, amely csak egy bizonyos epitóppal képes immunreakcióba lépni. Ennek megfelelően, a monoklonális antitestek jellemzően bármely epitóp felé (amellyel immunreakcióba lépnek) egyféle kötési affinitást mutatnak. Következésképpen, egy monoklonális antitest tartalmazhat olyan antitestmolekulát, amely számos antitestkombinálódási helyet hordoz, melyek mindegyike különböző epitópra immunspecifikus (például bispecifikus monoklonális antitest).
Egy monoklonális antitest jellemzően egyetlen sejt (hibridóma) kiónjai által termelt antitestekből áll, mely hibridómasejt csak egyféle antitestmolekulát szekretál (termel). A hibridómasejt egy antitesttermelő sejt és egy mieloma- (vagy más, önfenntartó) sejtvonal fúziójával állítható elő. Az ilyen antitestek előállítását elsőként Kohler és Milstein írták le [Natúré 256, 495 (1975), mely leírást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni]. További eljárások leírását lásd Zola: „Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques”, CRC Press, Inc. (1987). A hibridómából nyert felülúszót olyan az avP3-integrinnel immunreakcióba lépő antitestmolekulák jelenlétére és az Oypj-integrin - természetes ligandumaihoz való - kötődésének gátlására vizsgálhatjuk.
Röviden; olyan hibridóma kialakítása érdekében, amelyből antitest állítható elő, egy mieloma-sejtvonalat (vagy más, önfenntartásra képes sejtvonalat) - egy
HU 221 988 Β1 a^-forrással, például humán M21-melanoma-sejtvonalból izolált avp3-integrinnel [Cheresh és munkatársai:
J. Bioi. Chem. 262, 17703 (1987)] - hiperimmunizált emlős lépéből nyert limfocitákkal fuzionálunk.
A hibridóma előállításához előnyösen ugyanabból a 5 fajból származó mieloma-sejtvonalat alkalmazunk, amelyből a limfocitákat nyeljük (ilyen emlősként előnyösen a 129-GlX+-törzsbe tartozó egeret alkalmazunk). A találmány szerinti alkalmazáshoz megfelelő egérmielomák közé tartozik a hipoxantin-aminopterin- 10 timidin-szenzitív (HAT-szenzitív) P3X63-Ag8.653- és Sp2/0-Agl4-sejtvonal. Ez a két sejtvonal az .American Type Culture Collection” intézetnél (Rockville, MD) CRL-1580, illetve CRL-1581 jelzésű sejtvonalként férhető hozzá. 15
A szplenocitákat rendszerint polietilénglikol(PEG)-1500 alkalmazásával fuzionáljuk a mielomasejtekkel. A fuzionált hibrideket HAT-szenzitivitásuk alapján szelektáljuk. A találmány szerinti monoklonális antitestet termelő hibridómákat a példákban leírtak sze- 20 rint enzimkötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA) azonosítjuk.
A találmány szerinti monoklonális antitestek - megfelelő tápközegben kívánt specifitású antitestmolekulákat szekretáló hibridómát tartalmazó - monoklonális 25 hibridómatenyészet kialakításával is előállíthatók. A tenyésztést annyi ideig és olyan feltételekkel végezzük, amelyek elégségesek annak biztosítására, hogy a hibridóma antitestmolekulákat szekretáljon a tápközegbe.
A tenyésztés után az antitesteket tartalmazó tápközeget 30 összegyűjtjük, és az antitestmolekulákat ismert eljárásokkal izoláljuk.
Az ilyen készítmények előállításához alkalmas közegek szintén jól ismertek, és kereskedelmi forgalomban beszerezhetők; ilyenek például a szintetikus tenyésztő 35 tápközegek, a beltenyésztett egerek és hasonlók. Az egyik példaként szolgáló szintetikus tápközeg a 4,5 g/1 glükózzal, 20 mM glutaminnal és 20% magzati boíjúszérummal kiegészített - ,JXilbecco”-féle minimál esszenciális tápközeg (DMEM) [Dulbecco és mun- 40 katársai: Virol. 8,396 (1959)]. A beltenyésztett egértörzsek példájaként a Balb/c-törzs említhető.
A monoklonális antitestek, hibridómasejtek vagy hibridóma-sejttenyészetek előállítási eljárásai szakember számára jól ismertek [lásd például Sastry és munka- 45 társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5728 (1989); Huse és munkatársai: Science 246,1275 (1989)].
A találmány leírásában feltárjuk a találmány szerinti monoklonális antitest előállításához alkalmazott hibridómasejteket és az ilyen hibridómasejteket tartalmazó te- 50 nyészeteket is. Különösen előnyös az a hibridóma-sejtvonal, amely az ATCC-HB-9537 jelzésű monoklonális LM609-antitestet szekretálja. A monoklonális LM609antitestet Cheresh és munkatársai leírása szerint állítottuk elő [Cheresh és munkatársai: J. Bioi. Chem. 262, 17 703 55 (1987)]. Az előállítási eljárást a példákban is leírjuk.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében olyan monoklonális antitestet alkalmazunk, amely az LM609 monoklonális antitest immunreaktív tulajdonságaival bír. 60
Elvárható mennyiségű kísérleti munka elvégzésével megállapítható, hogy egy adott monoklonális antitest azonos specifitású-e a találmány szerinti monoklonális antitesttel (vagyis egyenértékű-e vele), oly módon, hogy megbizonyosodunk arról, vajon az előbbi megakadályozza-e az utóbbit, hogy egy előre kiválasztott célmolekulához kötődjön. Amennyiben a tesztelt monoklonális antitest verseng a találmány szerinti monoklonális antitesttel (amit standard kompetíciós vizsgálatban, szilárd fázisban a találmány szerinti monoklonális antitest célmolekulához való kötődésének csökkenése jelez), valószínűsíthető, hogy a két monoklonális antitest ugyanahhoz - vagy közeli rokonságban álló epitóphoz kötődik.
Egy másik eljárás szerint - mellyel szintén meghatározható, hogy egy adott monoklonális antitest azonos specifitású-e a találmány szerinti monoklonális antitesttel - a találmány szerinti monoklonális antitestet azzal a célmolekulával inkubáljuk, amellyel normális esetben reaktív, majd hozzáadjuk a tesztelni kívánt monoklonális antitestet, hogy meghatározzuk, vajon gátolt-e a tesztelt monoklonális antitest célmolekulához való kötődési képessége. Amennyiben a kötődés gátolt, valószínű, hogy a tesztelt antitest azonos - vagy funkcionálisan egyenértékű - epitópspecifitású, mint a találmány szerinti monoklonális antitest.
Egy további eljárás szerint - mellyel szintén meghatározható, hogy egy adott monoklonális antitest azonos» specifitású-e a találmány szerinti monoklonális antitesttel - meghatározzuk a kérdéses antitestek CRD-régióinak aminosavszekvenciáját. Azok az antitestmoleku»lák, amelyek CDR-régiójukban azonos vagy funkcionálisan egyenértékű aminosavszekvenciát tartalmaznak, azonos kötési specifitásúak. A polipeptidek szekvenálási eljárásai szakember számára jól ismertek.
Egy antitest immunspecifitását, célmolekulájának kötési kapacitását, illetve az antitest epitóp felé mutatott affinitását az az epitóp határozza meg, amellyel az antitest immunreakcióba lép. Az epitópspecifitást - legalább részben - az immunglobulin nehéz lánca variábilis régiójának aminosavszekvenciája, részben pedig a könnyű lánc variábilis régiójának aminosavszekvenciája határozza meg.
Az „azonos kötési specifitású” kifejezés azt jelenti, hogy az egyenértékű monoklonális antitestek hasonló vagy azonos immunreaktív (kötési) jellemzőket mutatnak, és egy előre kiválasztott célmolekulához történő kötődés során egymással kompetícióban állnak.
A humanizált monoklonális antitestek előnyösebbek, mint az egér monoklonális antitestek, elsősorban azért, mert emberek gyógykezelése során is alkalmazhatók. Az emberi antitestek nem ürülnek ki a keringésből olyan gyorsan, mint az „idegen” antigének, és nem aktiválják úgy az immunrendszert, mint az idegen antigének és az idegen antitestek. A „humanizált” antitestek általános előállítási eljárásai jól ismertek, és ezek alkalmazhatók a találmány szerinti antitestek előállítására is.
Ilyenformán, a találmány egyik megvalósítási módja szerint olyan, találmány szerinti monoklonális an13
HU 221 988 Β1 titestet alkalmazunk, amelyet átültetéssel („grafting”) humanizáltunk, annak érdekében, hogy az emberi immunrendszer komponenseit anélkül lehessen bevinni, hogy jelentősen befolyásolnánk az antitest antigénkötő képességét. 5 ajfcspecifikus utánzómolekulák
A találmány leírásában bemutatjuk, hogy a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában általánosan alkalmazhatók az a^-antagonisták - melyek lehetnek polipeptidet, antitestek és egyéb moleku- 10 Iák, melyeket „utánzómolekuláknak” nevezünk -, amelyek gátolják az avP3-integrin működését. Különösen előnyösek azok az antagonisták, amelyek specifikusan az avp3-integrin működését akadályozzák, más integrinekét azonban nem. 15
A találmány szerinti eljárásokban számos különféle reagens alkalmazható, feltéve, hogy a kívánt biológiai aktivitással bírnak. Ezeket a reagenseket általában utánzómolekuláknak nevezzük, mivel képesek „utánozni” a receptor-ligandum kölcsönhatásban szerepet játszó 20 - az avp3-integrinen vagy az avp3-ligandumon lévő kötődomént, s ezáltal akadályozza (azaz gátolja) a normális működést.
Az avp3-utánzómolekula (antitest- vagy ligandumeredetű peptid kivételével) bármilyen - fenti tulajdonsá- 25 gokat mutató - molekula lehet; például, egy peptid szintetikus analógja, az említett kötődőmén kötőhelyéhez hasonló alakú vegyület, vagy egyéb molekula.
Egy ovp3-utánzómolekula tervezéséhez a gyógyszertervezés jól ismert, strukturális vizsgálati módsze- 30 rei - mint például a molekuláris modellezés; kétdimenziós mágneses magrezonancia-spektroszkópia (2-D NMR); röntgensugaras krisztallográfia; peptid-, peptidanalóg- vagy más kémiai polimerkönyvtárak random szkrínelése; és hasonló gyógyszertervezési technoló- 35 giák) bármelyikét alkalmazhatjuk.
A leírásban strtukturáhs szempontból bebizonyítjuk, hogy egy a^-antagonista egyaránt lehet kisméretű polipeptid vagy monoklonális antitest (vagyis két, teljesen eltérő kémiai struktúra), melyek közös funkcioná- 40 lis tulajdonsága, hogy szelektíven gátolják az ανβ3-ΐηtegrint. Ennek megfelelően, a találmány szerinti eljárásokban - találmány szerinti α^-antagonistaként bármilyen, fentebb meghatározott avP3-utánzómolekula alkalmazható. 45
Eljárások az a$rantagonisták azonosítására
A találmány leírásában feltáljuk a találmány szerinti eljárásokban alkalmazható, lehetséges avP3-antagonisták azonosítási eljárásait is. Az ilyen vizsgálati eljárásokban a kiszemelt molekulákat az avp3-integrin 50 természetes ligandumaihoz való kötődésének gátlási képességére, illetve egy szövetben az angiogenezis gátlásának képességére értékeljük.
Az első vizsgálatban az avp3-integrin természetes ligandumához való közvetlen kötődésének gátlását mér- 55 jük (a példákban részletesen leírjuk e vizsgálat egy előnyös megvalósítási módját). E vizsgálat során - ELISAanalízissel - egy természetes ligandum (például a fibrinogén) szilárd fázisban lévő, izolált avP3-integrinhez való kötődésének gátlását méljük. 60
Ez a vizsgálat felhasználható azoknak a vegyületeknek az azonosítására is, amelyek specifikusak az ανβ3-ίηtegrinre, de a természetes ligandumok egyéb integrinekhez történő kötődését nem gátolják. A specifitási vizsgálatot két párhuzamos ELISA-vizsgálattal végezzük, melynek során két vizsgálati edényben az ανβ3-ίηtegrint és az egyéb integrineket egyidejűleg arra vizsgáljuk, hogy képesek-e megkötni a természetes ligandumot, a kiszemelt antagonista vegyületet pedig arra vizsgáljuk, hogy gátolja-e az integrinek előre kiválasztott ligandumhoz történő kötődését. A vizsgálatok kivitelezésének előnyös módszereit a példákban mutatjuk be.
A második vizsgálati eljárásban csirkechorioallantois-membránban (CAM) mérjük az angiogenezist. Ezt a vizsgálatot CAM-vizsgálatnak nevezzük. Ezt a vizsgálatot korábban más kutatók már leírták, és tumorszövetekben az angiogenezis és a neovascularisatio mérésére alkalmazták [lásd Ausprunk és munkatársai: Am. J.
Pathol. 79, 597 (1975) és Ossonski és munkatársai:
Cancer Rés. 40, 2300 (1980)].
A CAM-vizsgálat az in vivő angiogenezis széles körben elfogadott vizsgálati modellje, mivel a teljes szövet neovascularisatiója bekövetkezik, és a tényleges csirkeembrió-véredények belenőnek a chorioallantoismembránba (vagy a membránon fejlődött szövetbe).
A CAM-vizsgálat a neovascularisatio gátlását az újj , :
vérerek növekedésének mennyisége és mértéke alapján . , jellemzi. Ezenkívül, alkalmazásával könnyen nyomon követhető a membránra transzplantált bármely szöveti χ (például tumorszövet) növekedése, λ/égül, ez a vizsgá- j lat különösen alkalmas, mivel a toxicitás belső kontrollt >
ját biztosítja, ugyanis - a csirkeembriót a tesztelt reá? { gens hatásának kitéve - az embrió egészségi állapota 4 jelzi a toxicitás nagyságát. Γ
A harmadik vizsgálati eljárással az angiogenezist in | vivő nyúlszemmodellben vizsgáljuk (ezt az eljárást } nyúlszemvizsgálatnak nevezzük). A vizsgálatot koráb- bán más kutatók már részletesen leírták, és angiogéninhibitorok (mint például „thalidomide”) jelenlétében angiogenezis és neovascularisatio mérésére alkalmazták [lásd D’Amato és munkatársai: Proc. Natl. Acad.
Sci. 91, 4082 (1994)].
A nyúlszemvizsgálat az in vivő angiogenezis elfogadott vizsgálati modellje, mivel a neovascularisatio folyamata (a vérerek szaruhártyaszegélytől a szaruhártya belsejébe történő növekedése) - a természeténél fogva átlátszó szaruhártyán keresztül - egyszerűen megfigyelhető. Ezenkívül, az idő függvényében könnyen ellenőrizhető a neovascularisatio serkentésének vagy gátlásának, illetve a neovascularisatio visszafejlődésének mértéke és nagysága.
A nyulak bármilyen tesztelt reagenssel kezelhetők, így a nyulak egészségi állapota jelzi az adott reagens toxicitását.
A negyedik vizsgálati eljárásban (melyet kimérikus egérvizsgálatnak nevezünk) az angiogenezist kimérikus egér: humán egérmodellben mérjük. Az eljárást ko- , rábban mások már leírták [lásd Yan és munkatársai: J.
Clin. Invest. 91, 986 (1993)]; a találmány leírásában az angiogenezis, a neovascularisatio és a tumorszövetek
HU 221 988 Β1 visszafejlődésének mérésére történő alkalmazását ismertetjük. A kimérikus egerek alkalmazásával végzett vizsgálat hasznos vizsgálati modellje az in vivő angiogenezisnek, mivel az átültetett idegen bőrszövet szövettanilag nagyon közel áll a normális emberi bőrszövet- 5 hez, és a teljes szövet neovascularisatiója bekövetkezik, melynek során az átültetett emberi bőrből valódi emberi véredények nőnek - az átültetett emberi bőr felületén lévő - emberi tumorszövetbe. Az átültetett emberi szövetben kialakult új érhálózat eredete az érháló- 10 zat - humánspecifikus endotélsejtmarkerek alkalmazásával végzett - immunhisztokémiai festésével igazolható.
A kimérikus egérmodell-vizsgálat az új árnövekedés visszaesésének nagysága és mértéke alapján mutat- 15 ja ki a neovascularisatio visszafejlődését. Ezzel a vizsgálattal könnyen nyomon követhető az átültetett bőrre transzplantált bármilyen szövet (például tumorszövet) növekedésére gyakorolt hatás. Végül, a vizsgálat további előnye, hogy a kimérikus egérnek bármilyen tesztelt 20 reagenst beadhatunk, így az egér egészségi állapota jelzi a reagens toxicitását.
Az alábbiakban a találmány előnyös megvalósítási módjait kísérleti példákon keresztül fogjuk szemléltetni, ami természetesen nem jelenti azt, hogy a találmány 25 szerinti megoldás csak a bemutatott módokon valósítható meg. A találmány leírása alapján szakember számára kézenfekvő, hogy az általunk feltárt speciális megvalósítási módokban számos olyan változtatás hajtható végre, melyekkel továbbra is azonos vagy hasonló eredmé- 30 nyék nyerhetők. Nyilvánvaló, hogy az ilyen megoldások nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől és az igényelt oltalmi körön belül maradnak.
1. példa 35
Szintetikus peptidek előállítása
Az 1. táblázatban felsorolt, lineáris és ciklusos polipeptideket hagyományos szilárd fázisú eljárásokkal szintetizáltuk [lásd például Merrifield: Adv. Enzymol.
32, 221 (1969); Fields, G. B. és Noble, R. L.: Int. J. 40 Peptide Protein Rés. 35, 161 (1990)].
Először 20 g BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-ValOMe peptidet (1. azonosító számú szekvencia) 60 ml metanolban oldottunk, amelyhez 1,5 ml 2 N nátriumhidroxid-oldatot adtunk. A kapott elegyet 20 °C-on há- 45 rom óra hosszat kevertük, majd bepárlás után a visszamaradt anyagot vízben felfogtuk, híg sósavval pH=3ra savanyítottuk, és etil-acetáttal extraháltuk. Az extraktumot nátrium-szulfáton szárítottuk, ismét bepároltuk, és a kapott BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH pép- 50 tidet (2. azonosító számú szekvencia) - 20 ml 2 N sósavval együtt - dioxánban 20 °C-on két óra hosszat kevertük. A kapott elegyet bepárolva a H-Gly-D-ArgGly-Asp-Phe-Val-OH peptidet (3. azonosító számú szekvencia) kaptuk, melyet 1800 ml diklór-metán és 55 200 ml dimetil-formamid (DMF) elegyében feloldottunk, majd 0 °C-ra hűtöttünk. Az elegyhez ezután, keverés közben, egymás után 0,5 g diciklohexil-karbodiimidet (DCCI), 0,3 g 1-hidroxi-benzo-triazolt (HOBt) és 0,23 ml N-metil-morfolint adtunk. 60
A kapott elegyet 0 °C-on 24 óra hosszat, majd 20 °C-on további 48 óra hosszat kevertük. Az oldatot bekoncentráltuk, és a sók eltávolítása érdekében kevert ágyas ioncserélő gyantával kevertük össze. Miután a gyantát szűréssel eltávolítottak, a leszűrt oldatot bepároltuk, és a visszamaradt anyagot kromatográfiával tisztítottuk, miáltal a ciklo-(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) peptidet (4. azonosító számú szekvencia) kaptuk. A következő (az 1. táblázatban egybetűs rövidítések és a peptidazonosító számok alkalmazásával megadott) peptideket szintén a fent leírt eljárással állítottuk elő: cildo-(ArgGly-Asp-D-Phe-Val) (5. azonosító számú szekvencia); ciklo-(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (6. azonosító számú szekvencia); ciklo-(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (9. azonosító számú szekvencia); ciklo-(Arg-Gly-Asp-Phe-DVal) (7. azonosító számú szekvencia). A 66 203 jelzésű peptid - amely a 62 184-es peptidével azonos szekvenciát tartalmaz - csak annyiban különbözik az utóbbitól, hogy TFA-só helyett HCl-sót tartalmaz. A 7. példában leírt angiogenezis-gátlási vizsgálatban (ahol a szintetikus peptideket alkalmaztuk) a 66 203-as peptid (HC1só) csekély mértékben hatásosabban gátolta az angiogenezist, mint a 62 184-es peptid.
1. táblázat
Peptid azonosító száma Aminosav- szekvencia* Szekvencia- azonosító szám
62181 ciklo (GrGDFV) 4.
62184 ciklo (RGDfV) 5.
62185 ciklo (RADfV) 6.
62187 ciklo(RGDFv) 7.
62 880 YTAECKPQVTRGDVF 8.
62186 ciklo(RaDFV) 9.
62175 ciklo(ARGDfL) 10.
62179 ciklo (GRGDfL) 11.
62 411 TRQVVCDLGNPM 12.
62 503 GCCRNNEALARLS 13.
62 502 TDVNGDGRHDL 14.
* A kisbetűk D-aminosavakat, a nagybetűk L-aminosavakat jelölnek.
A 69 601-es jelzésű peptid (amely a 62 185-ös peptidével azonos szekvenciát tartalmaz) csak annyiban tér el az utóbbitól, hogy TFA-só helyett HCl-sót tartalmaz.
2. példa
Monoklonális antitestek
Az ATCC-HB-9537 számú hibridóma által szekretált monoklonális LM609-antitestet standard hibridómaeljárással állítottuk elő, melynek során „Sepharose”lencselektin-gyöngyökön adszorbeált, izolált ανβ3-ϊηtegrinnel immunizálását végeztünk. Az a^j-integrint emberi M21-melanomasejtekből izoláltuk, és az antitesteket Cheres és munkatársai leírása szerint állítottuk elő [lásd Cheresh és munkatársai: J. Bioi. Chem.
HU 221 988 Bl
262, 17703 (1987)]. Az M21-sejteket Dr. D. L. Morton („University of Califomia at Los Angeles”, CA) bocsátotta rendelkezésünkre. A sejteket - 2 mM L-glutamint, 50 mg/ml gentamicint és 10% magzati boíjúszérumot tartalmazó - RPMI-1640-tápközegben, szuszpen- 5 ziótenyészetben növesztettük.
A monoklonális LM609-antitestról bebizonyosodott, hogy specifikus immunreakcióba lép az avp3-komplexszel, az Oy- vagy ^-alegységgel, illetve más integrinekkel azonban nem. 10
3. példa
Az a^j-expresszió szöveti eloszlásának jellemzése A) Immunfluoreszcencia-vizsgálat antiintegrinreceptor-antitestek alkalmazásával 15
A sebgyógyulás során a vérerek alapmembránjai több adhéziós proteint (például „von Willebrand”faktort, fibronektint és fibrint) expresszálnak. Ezenkívül, tenyésztett simaizom- és endotélsejtek felületén az adhéziós receptorok integrincsaládjának több tagja is 20 expresszálódik [Cheresh: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6471 (1987); Janat és munkatársai: J. Cell Physiol. 151, 588 (1992); és Cheng és munkatársai: J.
Cell Physiol. 139, 275 (1989)]. Ezen integrinek közül az ανβ3 a „von Willebrand”-faktor, a fibrinogén (fib- 25 rin) és a fibronektin endotélsejt-receptora [Cheresh: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6471 (1987)]. Ez az integrál egy kalciumfiíggö jelölési („signaling”) reakcióutat indít be, ami az endotélsejtek migrációjához vezet, ezáltal úgy tűnik, alapvető szerepet játszik az érfali 30 sejtek biológiájában [lásd Leavelsey és munkatársai: J.
Cell. Bioi. 121,163 (1993)].
Az avP3-integrin - angiogenezis során bekövetkező - expressziójának vizsgálata céljából, önkéntes személyektől sebben található saijadzó szövetet és a sebet 35 körülvevő normális szövetet vágtunk ki. A szöveteket 1 ml foszfátpufferelt sóoldattal lemostuk, és „O.T.C” tápközegbe (Tissue Tek) ágyaztuk. A beágyazott szöveteket 30-45 másodpercre, folyékony nitrogénben hirtelen lehűtöttük. A fagyasztott szövetekből - kriosztát 40 metszetvágóval - 6 pm vastagságú metszeteket készítettünk, és a metszeteket - p3-integrinekre (θνβ3 vagy αιη,β3), illetve az integrinek β1-családjára specifikus antitestek alkalmazásával - immunperoxidázos festésnek vetettük alá. 45
A normális emberi bőr, illetve a sebsaijadzásos szövettel kapott eredményeket az 1A-1D. ábrákon mutatjuk be. A fagyasztott metszetek immunhisztokémiai analíziséhez a 33-integrinek elleni AP3 monoklonális antitestet, illetve a β1-integrinek elleni LM534 mono- 50 klonális antitestet alkalmaztuk. A különböző donorokból származó szövetekkel végzett kísérletek azonos eredményeket adtak. Az ábrákon a mikrofényképeket 300-szoros nagyításban mutatjuk be.
Az a^-integrin a sarjadzásos szövetben lévő vér- 55 erekben nagy mennyiségben expresszálódott (1B. ábra), ugyanazon donor egészséges bőrének irhájában és epitéliumában azonban nem volt detektálható (1A. ábra). Ezzel szemben, a β1-integrinek mind az egészséges bőrben, mind a sarjadzásos szövetben lévő vérerekben és 60 sztrómasejtekben nagy mennyiségben expresszálódtak (IC., illetve ID. ábra) és az expresszió - ahogy azt Adams és munkatársai [Cell 63,425 (1991)] leírták - az epitéliumon belüli bazális sejtekben is megfigyelhető volt.
B) Immunfluoreszcencia-vizsgálat antiligandumantitestek alkalmazásával
A normális emberi bőr és a saijadzó szövet - előző pontban leírtak szerint készített - újabb metszeteit a β3- és β]-integrinek ligandumainak („von Willebrand”faktor, illetve laminin) jelenlétére vizsgáltuk. A „von Willebrand”-faktor normális bőrben és saijadzó szövetben a vérerekben (2A., illetve 2B. ábra) lokalizálódik, míg a laminin mindkét szövetpreparátumban a vérerekben és az epiteliális alapmembránban is megtalálható (2C., illetve 2D. ábra).
C) Az anti-a$j-antitestek eloszlása rákszövetben
A fenti vizsgálatokon kívül, beteg személyekből származó rákszövet-biopsziákat az ανβ3 jelenlétére és eloszlására vizsgáltunk. A szöveteket a 3. példa A) részében leírtak szerint készítettük elő, azzal a különbséggel, hogy a 2. példában előállított - az a^3-receptorkomplexre specifikus - monoklonális LM609-antitesttel festettük őket. Ezenkívül, mikroszkópos szövettani vizsgálatokhoz is készítettünk tumorpreparátumokat; a megfelelő tumormintákat „Bulins” fixálószerben 8 óra; hosszat fixáltuk, sorozatmetszeteket vágtunk ki, és a metszeteket hematoxilinnal és eozinnal („H&E”) festettük.
A húgyhólyagrák-, vastagbélrák-, emlőrák-, illetve*, tüdőrákszövetek immunperoxidázos festésével kapott eredményeket a 3A-3D. ábrákon mutatjuk be. Az Ογβ? csak a vizsgált négy rákbiopsziában lévő vérereken expresszálódik nagy mennyiségben, a szövetekben lévő egyéb sejteken nem.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ανβ3-ϊηtegrinreceptor szelektíven olyan szövettípusokban (nevezetesen a saijadzó szövetekben, metasztázisos szövetekben és egyéb szövetekben) expresszálódik, amelyekben angiogenezis játszódik le; e receptor nem expresszálódik azokban a normális szövetekben, amelyekben az új vérerek képződése már leállt. Ennek megfelelően, az angiogenezist mutató szövetek - gyógykezelési szempontból - a találmány szerinti megoldás ideális célpontjait képezik.
4. példa
A kimutatott, ttjfij-specifikus, szintetikus peptidek azonosítása ligandum-receptor kötési vizsgálattal Az 1. példában leírtak szerint előállított szintetikus peptideket annak alapján vizsgáltuk, hogy tisztított ligandum-receptor kötési vizsgálatban képesek-e az ανβ3- és am$3-receptorok kötődését gátolni. A kötési vizsgálat megvalósítására alkalmazott eljárás leírását lásd Barbas és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10 003 (1993); Smith és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 11 008 (1990); és Pfaff és munkatársai: J. Bioi. Chem. 269, 20 233 (1994); mely hivatkozásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni].
HU 221 988 Bl
A következőkben egy eljárást írunk le antagonisták - ligandum-receptor kötési vizsgálatban történő - azonosítására. A vizsgálatban szilárd hordozón rögzített receptort alkalmazunk, míg a ligandum és az antagonista oldott állapotú. Bemutatunk egy olyan ligandum-receptor kötési vizsgálatot is, melyben a szilárd hordozón a ligandum van rögzítve, és a receptor és az antagonista van oldatban.
Röviden „Titertek” mikrotitertálcák üregeiben szelektált, tisztított integrineket rögzítettünk (egymástól függetlenül, üregenként 50 ng mennyiségben). A ligandum-receptor kötési vizsgálatokban alkalmazott receptorok tisztítási eljárásai szakember számára jól ismertek. 4 °C-on, 18 óra hosszat végzett inkubálás után a tálca nemspecifikus kötőhelyeit trisz-pufferelt sóoldatban 10 mg/ml koncentrációjú szarvasmarha-szérumalbuminnal blokkoltuk. A gátlási vizsgálatokhoz a 1. táblázatban felsoroltak közül kiválasztott peptideket különböző koncentrációkban azon képességükre teszteltük, hogy gátolják-e a 125I-vitronektin vagy a 125I-fibrinogén és aubPj-integrinreceptorhoz történő kötődését. Bár ezek a ligandumok egy adott integrinhez optimálisan kötődnek (a vitronektin az oq$3-hoz, a fibrinogén pedig az aIIbp3-hoz), a kötődés gátlásának - a fibrinogén bármelyik receptorhoz történő kötődését gátló peptidek alkalmazásával végzett - vizsgálata lehetővé tette a peptid azon mennyiségének μΜ nagyságrendű meghatározását, amely a receptor ligandumhoz történő kötődésének 50%-os gátlásához szükséges. A radioaktív izotóppal jelölt ligandumokat 1 nM koncentrációban alkalmaztuk, és a kötődést - külön-külön - jelöletlen szintetikus peptidekkel igyekeztünk gátolni.
Háromórás inkubálás után a szabad ligandumot mosással eltávolítottuk, és a kötött ligandumot gammaszámlálóval detektáltuk. Azokból a vizsgálatokban, amelyekben a radioaktívan jelölt fibrinogén - külön-külön immobilizált ανβ3-, illetve ctm^-receptorhoz történő kötődésének gátlásához az 1. táblázatban felsorolt, kiválasztott ciklusos peptideket alkalmaztuk, igen jól reprodukálható adatokat kaptunk, és az adatpontok közötti hiba jellemzően 11% alatt maradt. Az ICjo-értékeket (μΜ) a kétszeri ismétléssel végzett kísérlet adatpontjainak átlaga+szórás értékekként fejezzük ki (lásd 2. táblázat).
2. táblázat
Peptid azonosító száma θνβ3 (IC50, μΜ) ®IlbP3 (K-50> PM)
62181 1,96+0,62 14,95+7,84
62 184 0,05+0,001 0,525+0,10
62 185 0,885+0,16 100+0,001
62 187 0,05+0,001 0,26+0,056
62186 57,45+7,84 100+0,001
62175 1,05+0,07 0,63+0,18
62 179 0,395+0,21 0,055+0,007
Az eredmények alapján látható, hogy az RGD-tartalmú vagy RGD-derivatizált, ciklusos peptidek (62 181, 62 184, 62 185 és 62 187) (melyek mindegyike tartalmaz egy D-aminosavat) elsősorban a fibrinogén a^-receptorhoz történő kötődését gátolták, amit az mutat, hogy az aIIbP3-receptor esetében az 50%-os gátlás eléréséhez szükséges peptidkoncentrációk alacsonyabbak, mint az a^3-receptor esetében. Ezzel szemben, a többi RGD-tartalmú vagy RGD-derivatizált, ciklusos peptid (62 186, 62 175 és 62 179) vagy egyik receptor esetében sem gátolta hatásosan a fibrinogén kötődését, vagy a fibrinogén amJ^-receptorhoz történő kötődését gátolta nagyobb specifitással. Ezek az eredmények összhangban vannak a Pfaff és munkatársai által publikált eredményekkel [J. Bioi. Chem. 269, 20233 (1994)]; kísérleteikben az RGDFV ciklusos peptid (amelyben F D-aminosavat jelöl) a fibrinogén avp3-integrinhez (és nem az αιη>β3- vagy o^j-integrinhez) történő kötődését gátolta specifikusan. Hasonló kötődésgátlási vizsgálatokat lineáris (RGD-motívumot tartalmazó vagy nem tartalmazó) peptidekkel is, melyek szekvenciája az receptor-alegységből, anb-receptor-alegységből vagy a vitronektin-ligandum aminosavszekvenciájából származott. E lineáris peptidek szekvenciáit [62 880 (a VNszekvencia 35-49. aminosavai); 62 411 (az av-szekvencia 676-687. aminosavai); 62 503 (az Ov-szekvencia 655-667. aminosavai); és 62 502 (az ajjb-szekvencia 296-306. aminosavai)] az 1. táblázatban mutatjuk be. Valamennyi peptidet külön vizsgálatban a vitronektin (VN) vagy a fibrinogén (FG) a^3- vagy a^3-receptorhoz való kötődésének gátlására alkalmaztuk. Az egyes kísérletekben egy vizsgálatra kapott ICS0-értékeket (μΜ) a 3. táblázatban mutatjuk be.
3. táblázat
Peptid száma “nbfb IC» (pM) o^ICso/pM)
FG VN FG VN
62 880 4,2 0,98 <0,1 0,5
62 411 >100 >100 >100 >100
62 503 >100 >100 >100 >100
62 502 90 5 >100 >100
A ligandumok kiválasztott integrinreceptorokhoz történő kötődésének lineáris peptidekkel végzett gátlásának vizsgálatai során kapott eredmények azt mutatják, hogy csak a 62 880-as peptid gátolta hatásosan az fibrinogén és a vitronektin cq]33-receptorhoz történő kötődését, mivel e receptor esetén a peptid alacsonyabb koncentrációja volt elégséges az 50%-os gátlás kiváltásához. A ligandumok a^3-receptorhoz történő kötődésének gátlásában a többi lineáris peptid közül egy sem volt hatásos, bár a 62 502-es peptid hatásosan gátolta a vitronektin απ(,β3-1ιοζ való kötődését.
5. példa
Kezeletlen csirkechorioallantois-membrán (CAM) karakterizálása
A) Csirkechorioallantois-membrán (CAM) előkészítése
Csirkechorioallantois-membránban - miután a normális embrionális angiogenezis érett vérerek kialakulá17
HU 221 988 Β1 sát eredményezte - angiogenezist indukálhatunk. Kimutatták, hogy az angiogenezis indukciója specifikus citokinekre vagy tumordarabokra adott reakció következménye [Leibovich & munkatársai: Natúré 329, 630 (1987); Ausprunk és munkatársai: Am. J. Pathol. 79, 597 5 (1975)]. A 6. és 7. példában leirt angiogenezis-indukciós és -gádási vizsgálatokhoz csirkeembriókból chorioallantois-membránokat preparáltunk. A „Mclntyre Poultry”tól (Lakeside, CA) 10 napos csirkeembriókat kaptunk, melyeket - 60%-os páratartalom mellett - 37 °C-on in- 10 kubáhunk. A tojások végén, közvetlenül a légzsák felett, kis kézifúróval (Dremel, Division of Emerson Electric Co., Racine, WI) lyukat fúrtunk. A tojások oldalán
- embrionális vérerektől mentes területen (amit lámpázással állapítottunk meg) - egy másik lyukat fúrtunk. 15 Az első lyuknál vákuumot létesítettünk, miáltal a chorioallantois-membrán levált a tojáshéjmembránról, és a CAM körül hamis légzsák keletkezett. A tojáshéjon - a levált CAM felett - modellező csiszolókoronggal (Dremel) 1,0 cmxl,0 cm-es ablakot vágtunk. Ezen a 20 nyíláson közvetlenül hozzáférhető a chorioallantoismembrán.
A CAM-preparátumokat további kezelés nélkül az embriógenezis 6. napján, az aktív neovascularisatio stádiumában (ez képezi az embrionális neovascularisatio 25 modelljét) vagy az embriogenezis 10. napján (amikor az angiogenezis leáll) alkalmaztuk. Az utóbbi preparátumot - a 6. példában leírtak szerint - citokinkezeléssel vagy tumorérintkeztetéssel indukált új angiogenezis vizsgálatára alkalmaztuk. 30
B) A chorioallantois-membrán (CAM) szövettana
A csirkeembrió-CAM-ok és/vagy a csirkeembriókból kivágott emberi tumorok (lásd 8. példa) mikroszkópikus szerkezetének vizsgálata érdekében a chorioallantois-membránokat és a tumorokat - a 3. példa A) ré- 35 szében leírt módon - fagyasztásos metszetek kialakítására készítettük elő. A fagyasztott tömbökből - kriosztát metszetvágóval - 6 pm vastagságú metszeteket készítettünk, melyeket immunfluoreszcens vizsgálattal analizáltunk. 40
A 4. ábrán egy kezeletlen, 10 napos CAM vérerektől mentes területének tipikus mikrofényképe látható. Mivel a CAM-rendszerben az angiogenezis az embriogenezis e stádiumában már leáll, ez a rendszer alkalmas
- a szomszédos területeken már létező vérerekből a vér- 45 ereket nem tartalmazó CAM-területek felé - új érhálózat kialakulásának serkentésére.
C) A CAM - immunfluoreszcenciával detektált - integrinprofiljai
A CAM-szövetekben lévő integrinreceptorok szőve- 50 ti eloszlásának vizsgálata céljából - tumorszövetből és csirkeembrió CAM-szövetből vágott - 6 pm-es fagyasztott metszeteket 30 másodpercig acetonban fixáltunk és 10 pg/ml monoklonális CSAT-antitesttel (amely az β,-integrin-alegységre specifikus) [lásd 55 Buck és munkatársai: J. Cell Bioi. 107, 2351 (1988)] vagy a 2. példában előállított LM609-antitesttel festettünk. A CSAT-antitesttel festett metszeteket kontrollként alkalmaztuk. A primer festés után a metszeteket
- rodaminnal jelölt - 1:250 hígítású kecske antiegér 60 másodlagos antitesttel (Tago) festettük, hogy lehetővé tegyük a primer immunreakciótermék detektálását. A metszeteket Zeiss immunfluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk.
Az immunfluoreszcencia-analízis eredményei azt mutatják, hogy a 10 napos, kezeletlen csirkeembrióban lévő érett vérerek a βι-integrin-alegységet expresszálták (5A. ábra). Ezzel szemben, az 5A. ábrán látható szövet sorozatmetszeteiben az LM609-antitesttel nem tapasztaltunk immunreaktivitást (5B. ábra), ami arra utal, hogy az a^-integrin - melyet az LM609-antitest detektálna - a 10 napos, kezeletlen csirkeembrió érett vérereiben nem expresszálódik aktívan. A CAM-modell és a következő példák alapján látható, hogy a normális embriogenezis során lejátszódó vagy a citokinek, vagy tumorok által indukált angiogenezis ideje alatt a vérerek a^-integrint expresszálnak. Az aktív neovascularisatio után - vagyis a vérerek fejlődésének leállása után - az a^j-expresszió olyan szintre csökken, amely immunfluoreszcencia-analízissel nem mutatható ki. Az angiogenezis folyamatában lévő vérerekben az a^3-expresszió ilyen szabályozásának köszönhetően a találmány szerinti megoldás egyedülálló lehetőséget biztosít az angiogenezis kontrollálására és gátlására, amit a következő példákban, a CAM-angiogenezis-modell alkalmazásán keresztül mutatunk be részletesen.
6. példa
CAM-angiogenezis-vizsgálat A) Növekedési faktorok által indukált angiogenezis
Kimutatták, hogy az angiogenezist citokinek vagy növekedési faktorok indukálják [lásd Leibovich és munkatársai: Natúré 329, 630 (1987); Ausprunk és munkatársai: Am. J. Pathol. 79, 597 (1975)]. Az e példában leírt kísérletekben - az 5. példában leírt - CAM-prepará-» hunban az angiogenezist a CAM vérerein topikálisan alkalmazott növekedési faktorokkal indukáltuk. Az angiogenezis indukálása érdekében 10 napos csirkeembrió chorioallantois-membránjának vérerektől mentes területére - Hanks-féle egyensúlyi sóoldattal (HBSS; Gibco, Grand Island NY) vagy 150 pg/ml rekombináns bázisos fibroblaszt növekedési faktort ^FGF; Genzyme, Cambridge, MA) tartalmazó HBSS-oldattal telített 5x5 mm-es „Whatman’-szűrőpapír korongot („Whatman Filter paper No. 1”) helyeztünk, és a tojáshéjon vágott ablakot ragtapasszal lezártuk. Más vizsgálatokban 125 pg/ml koncentrációjú pFGF is hatásos volt a vérerek növekedésének indukálására. Az angiogenezist 72 óra elteltével, fénymikroszkópos vizsgálattal követtük nyomon. A chorioallantois-membránokat hirtelen lefagyasztottuk, 6 pm-es kriosztát metszeteket készítettünk, azokat acetonban fixáltuk, majd az 5. példa C) részében leírtak szerint, 10 pg/ml anti-β, monoklonális CSAT-antitest vagy LM609-antitest alkalmazásával, immunfluoreszcens módszerrel festettük.
A 5C. ábrán bemutatott immunfluoreszcens mikrofényképen látható, hogy a CAM-preparátumban a βΡϋΡindukálta angiogenezis során fokozott szintű a^3-expresszió tapasztalható, ezzel szemben, a kezeletlen CAMpreparátumban nem figyelhető meg a^j-expresszió
HU 221 988 Bl (lásd 5B. ábra). A pFGF-fel kezelt CAM-preparátumokban lévő vérerek jelentős hányadában (75-80%-ában) könnyen detektálható volt az Oypj-expresszió. Ezenfelül, a Pj-integrin expressziója a kezeletlen CAM esetében tapasztalható szinttől nem tért el, mivel a βι-integrin a sti- 5 mulált vérereken is könnyen detektálható volt.
Az Ονβ3- és β1-integrin relatív expresszióját - a fagyasztott CAM-metszetek konfokális lézeres képelemzésével („laser confocal image analysis”) - mennyiségi meghatározásnak vetettük alá. A festett metszeteket Ze- 10 iss lézeres konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. Véletlenszerű eloszlású területekről 25 - LM609-antitesttel -, illetve 15 - CSAT-antitesttel - festett véredényt (350-3500 mm2, átlagos méret kb. 1200 mm2) választottunk ki, és konfokális lézeres képelemzéssel (önké- 15 nyes egységek alkalmazásával) minden egyes véredényre meghatároztuk az egységnyi területre jutó átlagos rodamin-fluoreszcenciát. Az adatokat a vérerek - önkényes egységekben megadott - átlagos fluoreszcenciaintenzitása iszórás értékben adjuk meg. 20
A 6. ábrán bemutatott eredmények alapján látható, hogy a βΡΰΡ-ίβΙ kezelt CAM-metszetekben az o^J33 festődése - Wilcoxon-féle sorozatösszegteszt („Wilcoxon Ránk Sum Test”) (p<0,0001) alapján meghatározva - lényegesen nagyobb (négyszeres) szintű, mint 25 a kontrollmetszetekben, miközben a β] festődését a βΡΟΡ^βζεΙέβ nem befolyásolta jelentősen.
A CAM-vizsgálatot egy másik hatásos angiogenezis-indukáló szer - a tumomekrózis-faktor-α (TNFa) β,- és β3-integrinek expressziójára gyakorolt hatásának 30 vizsgálatára is felhasználtuk. Azt tapasztaltuk, hogy a 10 napos embriókból származó chonoállantois-membránokra helyezett - βΡΰΡ-ίεΙ vagy TNFa-val impregnált - szűrőpapír korongok 72 óra elteltével helyi angiogenezist indukáltak. 35
E kísérlet eredményei a kezeletlen, βΡΟΡ-ίβ! kezelt, illetve TNFa-val kezelt chorioallantois-membránok mikrofényképein (7A., 7B., illetve 7C. ábra) láthatók. A vérerek mind a OFGF-fel, mind a TNFa-val kezelt preparátumokban jól láthatók, a kezeletlen prepará- 40 tumban azonban nincsenek jelen. Ez azt jelenti, hogy a növekedési faktor, illetve a citokin helyi alkalmazása azt eredményezte, hogy az eredetileg vérerektől mentes területre a szomszédos területeken lévő érett erekből angiogenezis indukálódott. A TNFa-val végzett kezelés 45 - az angiogenezis, és a velejáró a^3-expresszió indukálását illetően - hasonló hatású, mint a 3FGF-fel végzett kezelés (5C. ábra).
Ezek a felismerések arra utalnak, hogy az angiogenezisben szerepet játszó vérerek - emberben és csirké- 50 ben - fokozott szintű a^3-expressziót mutatnak. Ezzel összhangban, tenyésztett endotélsejtekben az ανβ3-εχρresszió különböző citokinekkel in vitro indukálható [lásd Janat és munkatársai: J. Cell Physiol. 757, 588 (1992); Enenstein és munkatársai: Exp. Cell Rés. 203, 55 499 (1992); és Swerlick és munkatársai: J. Invest. Derm. 99, 715 (1993)].
Az antitestek és inhibitor peptidek - növekedési faktor által indukált angiogenezisre gyakorolt - hatását a 7. példa A) és B) részében ismertetjük. 60
B) Embrionális angiogenezis
Az angiogenezis-inhibitoroknak az embrionális érrendszer természetes kialakulására gyakorolt hatásának értékelésére - ahogy azt fentebb említettük - a 6 napos csirkeembrióból készített CAM-preparátumot alkalmaztuk. A fejlődés e stádiumában a vérerek de novo növekednek, így ez a modell hatásosan alkalmazható annak meghatározására, hogy az a^3-integrin részt vesz-e az embrionális angiogenezisben. A CAM-rendszert a fentebb leírtak szerint készítettük elő, azzal a különbséggel, hogy a vizsgálatot a 6., és nem a 10. napon végeztük. A találmány szerinti antitestekkel és peptidekkel végzett kezelés embrionális angiogenezisre gyakorolt hatását a 7. példa C) részében újuk le.
C) Tumorok által indukált angiogenezis
Az a^3-integrin tumor indukálta angiogenezisben betöltött szerepének vizsgálata érdekében a CAMvizsgálatban különböző, avp3-negatív emberi melanoma- és karcinómadarabokat alkalmaztunk, melyeket előzetesen 17 napos csirkeembrióból chorioallantoismembránján növesztettünk, majd azokról izoláltunk [lásd Brooks és munkatársai: J. Cell Bioi. 122, 1351 (1993)]. A tumordarabok puffer jelenlétében nagymértékű neovascularisatiót eredményeztek.
A CAM-vizsgálati rendszerben az angiogenezist a tumordarabok chorioallantois-membránra történő közvetlen felhelyezésével indukáltuk. A csirkeembrióCAM-ot a fentebb leírtakkal azonos módon készítettük elő. A preparátumokra szűrőpapír korongok helyett va- : lamilyen avP3-negatív emberi tumor - M21L emberi , melanomatumor; UCLAP-3 emberi tüdőtumor; FG em- » béri hasnyálmirigyrák-sejtvonal [Cheresh és munkatár- * sai: Cell 58, 945 (1989)] vagy HEp3 emberi gégeráksejtvonal - 50-55 mg-os darabját helyeztük. ?
A csirkeembriók chorioallantois-membránján ke- »J mény emberi tumorok növesztéséhez az M21L emberi j melanomatumor-sejtvonalat, az UCLAP-3 emberi tüdő- j ráksejtvonalat, az FG emberi hasnyáhnirigyrák-sejtvonalat, illetve a HEp3 emberi gégeráksejtvonalat (melyek mindegyike aJ33-negatív) alkalmaztuk. A CAMpreparátumokra először steril HBSS-ben, 30 μΐ össztérfogatban 8χ 106 M21L-, UCLAP-3- vagy FB-sejtet, illetve 5 χ 105 HEp3-sejtet helyeztünk. A tojáshéjon lévő ablakot ragtapasszal lezártuk, és az embriókat - a humán tumorok növesztése érdekében - hét napig inkubáltuk. A 7. nap végén (amikor az embriók már 17 naposak voltak) a tumorokat kivágtuk a CAM-okból, és megtisztítottuk a rajtuk maradt CAM-szövettől. A tumorokat 50-55 mg-os darabokra vágtuk, és ezeket az angiogenezis vagy a tumomövekedés vizsgálatára alkalmaztuk. A tumordarabokat újabb 10 napos csiikeembrió-CAM-preparátumok - vérerektől mentes területére
- helyeztük (lásd 6. példa A) pontja).
A csirkeembrió-CAM-okon in vivő nőtt tumorokat az avp3-expresszió vizsgálata érdekében, a 3. példa A) pontjában leírtak szerint, monoklonális LM609-antitesttel festettük. A tumorsejtek specifikus festődését nem fi- , gyeltük meg, ami az aj^-expresszió hiányára utal. 5
A CAM-tumorpreparátumokat később, az antitestek és peptidek tumor indukálta angiogenezisre gyakorolt
HU 221 988 Bl hatásának meghatározása érdekében, a 7. példa D) és E) részében leírtak szerint kezeltük. A CAM-tumorpreparátumokat az antitestek és peptidek - tumorok visszafejlődésére és az angiogén vérerek és érsejtek apoptózisára gyakorolt - hatásainak vizsgálata érdekében a 5
8., 9. és 12. példában leírtak szerint is kezeltük.
7. példa
Az angiogenezis gátlásának mérése CAMvizsgálatban 10
A) A növekedési faktor által indukált angiogenezis gátlása inhibitorok helyi alkalmazásával
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
Annak meghatározása érdekében, hogy az ανβ3-ίηtegrin aktív szerepet játszik-e az angiogenezisben, a 15 CAM-preparátumokra βΡΰΕ-ίβΙ vagy TNFa-val impregnált szűrőpapír korongokat helyeztünk, majd a preparátumokat a^3-ra specifikus LM609 monoklonális antitesttel, βι-re specifikus CSAT monoklonális antitesttel, illetve ανβ5-Γβ specifikus P3G2 monoklonális 20 antitesttel kezeltük.
A 10 napos csirkeembriókból származó CAM-okban az angiogenezist βΡϋΡ-ίεΙ impregnált szűrőpapír korongokkal indukáltuk. A korongokat a 0., 24. és 48. órában - 50 ml HBSS-oldatban 25 mg monoklonális antitestet 25 tartalmazó - 25 μΐ össztérfogatú steril HBSS-oldattal kezeltük. A 72. órában a chorioallantois-membránokat összegyűjtöttük és 35 mm-es Petri-csészébe helyeztük, és 1 ml foszfátpufferelt sóoldattal mostuk. A szűrőpapír alsó oldalát és a CAM-szövetet „Olympus” sztereomik- 30 roszkóp alatt, két megfigyelővel, „dupla vak” vizsgálati rendszerben vizsgáltuk. Az angiogenezis gátlását akkor tekintettük jelentős mértékűnek, ha a chorioallantoismembránok - közvetlenül a szűrőpapír korong alatti területébe a vérerek beszűrődése (infiltrációja) 50%-nál 35 nagyobb mértékben volt gátolt. A kísérleteket mindegyik antitesttel négyszer ismételtük meg (mindegyik esetben 6-7 embrió alkalmazásával).
A monoklonális antitestekkel végzett kezelések βΡΟΡ-ύκΗ^Ηη angiogenezisre gyakorolt hatásait a 40 8A-8E. ábrákon mutatjuk be. A 8A. ábrán vérerek nélküli, kezeletlen (kontroll) CAM-preparátum látható; ehhez hasonlítottuk a βΡΟΡ-ίβΙ indukált angiogenezist (8B. ábra), valamint az alkalmazott monoklonális antitestek angiogenezisre gyakorolt hatását (8C-8D. áb- 45 rák). A monoklonális LM609-antitesttel kezelt CAMszövetek kb. 75%-ában figyeltük meg az angiogenezis 50%-osnál nagyobb gátlását (lásd 8E. ábra), az ilyen szövetek közül sokban vérerek nem szűrődtek be a szűrőpapír korong alatti területre. Ezzel szemben, a 50 kontrollszövet és a CSAT-antitesttel (8C. ábra), illetve P3G2-antitesttel kezelt szövetek (8D. ábra) nagymértékű angiogenezist mutattak.
Hasonló eredményeket kaptunk, amikor az angiogenezist TNFa-val indukáltuk. Annak érdekében, hogy a 55 fenti antitestek - CAM-szövetek érmentes területei melletti területeken a normális érképződésből származó - érett vérerekre gyakorolt hatásait vizsgáljuk, napos csirkeembriókból származó (citokinnal helyileg nem kezelt) chorioallantois-membránok erekkel át- 60 szőtt területeire monoklonális antitestekkel impregnált szűrőpapír korongokat helyeztünk. Sztereomikroszkópos megfigyeléssel megállapítottuk, hogy a három alkalmazott monoklonális antitest egyike sem befolyásolta a már létező ereket. Ilyenformán, az LM609 monoklonális antitest csak az új erek növekedését gátolja szelektíven, és nem befolyásolja a szomszédos területeken lévő érett vérereket. A szintetikus peptidek (akár helyi, akár intravénás) alkalmazása esetén ugyanilyen hatást figyeltünk meg (lásd 7. példa A)2„ illetve E)2. pontja).
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
A találmány szerinti szintetikus peptidekkel is végeztünk CAM-vizsgálatokat, melyekkel az volt a célunk, hogy meghatározzuk a ciklusos és lineáris peptidek növekedési faktorral indukált - érképződésre gyakorolt hatását. A peptideket az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. 25 μΐ össztérfogatú steril HBSS-oldatban 80 pg peptidet oldottunk. A peptidoldatot szűrőpapíron a CAM-preparátum elkészítésekor, majd 24 és 48 óra elteltével vittük fel a CAM-szövetre. A 72. óra után a szűrőpapírt és a környező CAM-szövetet kivágtuk, és a fentiek szerint, sztereomikroszkóppal vizsgáltuk.
A vizsgálat eredményei hasonlóak voltak a 7. példa E)2. pontjában leírt kísérlet (melynek során a szintetikus peptideket tumor indukálta vérerekbe intravénásán injektáltuk) eredményeihez (lásd 9A-9C. ábrák), A 62 186-os kontrollpeptiddel végzett kezelés esetében' a βΡϋΡ-ίβΙ indukált vérerek zavartalanok voltak (lásd 9A. ábra). Ezzel szemben, amikor a 62 814-es ciklusost RGD-peptidet vittük fel a szűrőpapír korongra, az ér-képződés gátlás alá került, és új érhálózat nélküli terü-r let maradt vissza. Ez a hatás hasonló volt a 9B. ábrán bemutatotthoz (lásd 7. példa E)2. pontja). Ezenfelül*, ahogy az a 9C. ábrán az intravénásán injektált peptidek esetében látható, a növekedési faktorral impregnált szűrőpapír korong felhelyezésétől távolabbi területeken, ahol kialakult vérerek találhatók, a szintetikus peptidekkel végzett helyi kezelés nem gyakorolt hatást az ilyen erekre. Ilyenformán, a peptidek angiogenezisre gyakorolt gátlóhatása csak azokra a területekre korlátozódik, ahol az angiogenezist a növekedési faktorok indukálták. A peptidek nem befolyásolják a szomszédos területeken lévő, már kialakult, érett ereket, és ezeken a területeken nem okoznak káros citotoxicitást.
Az 1. példában leírtak szerint előállított - és az 1. táblázatban felsorolt - egyéb szintetikus peptidekkel hasonló kísérleteket végeztünk.
B) Növekedési faktorral indukált angiogenezis gátlása intravénáson alkalmazott inhibitorokkal
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósíthatósága szempontjából értékeltük a CAM-preparátumba intravénásán injektált monoklonális antitestek növekedési faktorral indukált - angiogenezisre gyakorolt hatásait is.
Az intravénás injektáláshoz a csirkeembrió-CAMpreparátumokat - néhány módosítás beiktatásával - lényegében a 7. példa A) pontjában leírtak szerint végeztük. A tojások lámpázása során kiválasztottuk a jól látható vérereket, és ezeket a tojás héján megjelöltük. A to20
HU 221 988 Bl jások kifúrását, a chorioallantois-membrán leválasztását és a PFGF-fel impregnált szűrőpapír korongok felhelyezését a fentebb leírtak szerint végeztük. A tojáson vágott ablakokat steril ragtapasszal lezártuk, és az embriókat visszahelyeztük az inkubátorba. 24 óra elteltével a 5 tojáshéjon - közvetlenül a korábban megjelölt, jól látható vérerek felett - újabb ablakot vágtunk. A külső tojáshéjat óvatosan eltávolítottak, miközben az embrionális membránt sértetlenül hagytuk. A tojáshéjmembránt kis csepp ásványi olajjal (Perkin-Elmer Corp., Nor- 10 walk, CT) átlátszóvá tettük, ezáltal a vérerek könnyen megfigyelhetőkké váltak. Közvetlenül a vérerekbe
- 30-as tűvel, embriónként 100 μΐ össztérfogatú steril PBS-ben 200 μg IgG-dózissal - tisztított, steril monoklonális antitesteket, illetve a fentebb leírt szintetikus 15 peptideket injektáltuk. Az ablakokat ragasztószalaggal lezártuk, és az embriókat 72 óra hosszat inkubáltuk.
A szűrőpapír korongokat és a környező CAM-szöveteket a fentebb leírtak szerint vizsgáltuk.
Az előzetesen LM609 monoklonális antitesttel intra- 20 vénásan beoltott CAM-szövetekben vagy tumorszövetekben az LM609 monoklonális antitest eloszlásának meghatározása érdekében a fixált metszeteket HBSS-oldatban 2,5% BSA-val, szobahőmérsékleten egy óra hosszat blokkoltuk, majd 1:250 hígítású, rodaminnal je- 25 lölt kecske antiegér másodlagos antitesttel (Tago) festettük. A metszeteket „Zeiss” immunfluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk.
Az CAM-preparátumokban az intravénás antitestkezelés - pFGF-fel indukált - angiogenezisre gyako- 30 rolt hatásának eredményeit a 10A-10C. ábrákon mutatjuk be. A 10A. ábrán a pFGF-fel végzett kezeléssel indukált angiogenezis eredménye látható. A P3G2 monoklonális antitest (amely anti-avp3-antitest) intravénás beadásának hatására a pFGF-fel indukált érhálózat meg- 35 jelenésében semmilyen változást nem tapasztaltunk (lásd 10B. ábra). Ezzel szemben, az LM609 monoklonális antitesttel (amely anti-avp3-antitest) végzett kezelés a fiFGF-fel indukált új vérerek szűrőpapír alatti területre történő növekedésének teljes gátlását eredményezte 40 (lásd 10C. ábra). Látható, hogy az angiogenezis gátlását az LM609 (anti-avp3-specifikus) monoklonális antitest a^-receptor-aktivitást gátló hatása eredményezte. Mivel az cq$5-receptor gátlása nem akadályozta meg az új érhálózat szűrőpapír alatti területre történő 45 növekedését, megállapíthatjuk, hogy az avp5-integrin
- a vérerek növekedése tekintetében -, az avp3-integrinhez képest nem kulcsfontosságú receptor.
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
Az 1. példában leírtak szerint előállított szintetikus 50 peptideket az előző pontban leírtak szerint, egymástól függetlenül, intravénásán injektáltuk a CAM-preparátumok növekedési faktorral indukált vérereibe. A peptideknek az erek életképességére gyakorolt hatását szintén az előző pontban leírtakhoz hasonlóan értékeltük. 55
C) Az embrionális angiogenezis gátlása helyi kezeléssel
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
Annak meghatározása érdekében, hogy az ανβ3-ίηtegrin szerepet játszik-e az embrionális angiogenezis- 60 ben, hatnapos (aktív neovascularisatióval jellemezhető; lásd 5. példa A) pontja) embriókból készített CAMpreparátumokban az LM609 monoklonális antitest
- vérerek de novo növekedésére gyakorolt - hatását vizsgáltuk. A CAM-vizsgálatot a 6. példa C) pontjában leírtak szerint végeztük. A hatnapos embriók chorioallantois-membránjára (melyet citokinekkel nem kezeltünk) monoklonális antitestekkel impregnált szűrőpapír korongokat helyeztünk. Három nap múlva a membránokat kivágtuk és lefényképeztük. Mindegyik kísérletben csoportonként hat embriót alkalmaztunk, és a kísérleteket kétszer ismételtük.
A kísérletben az LM609-antitest megakadályozta az erek növekedését (lásd 11C. ábra), a CSAT- és P3G2-antitest azonban nem (11 A., illetve 11B. ábra). Ez azt jelzi, hogy az a^-integrin jelentős szerepet játszik - a hozzáadott növekedési faktoroktól független embrionális angiogenezisben.
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
Az 5. példa A)2. pontjában leírtak szerint előkészített embrionális CAM-preparátumokat az 1. példában előállított szintetikus peptidekkel, egymástól függetlenül, helyileg vagy intravénásán kezeltük. A peptideknek az erek életképességére gyakorolt hatását szintén a fentebb leírtakhoz hasonlóan értékeltük.
D) Tumor indukálta angiogenezis gátlása helyi kezeléssel
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
A fentebb leírt angiogenezis-vizsgálatokon kívül (melyekben az a^3-antagonista LM609 monoklonális; antitest, valamint a 62 181-es, 62 184-es, 62 185-ös, 62 187-es és 62 880-as peptid embrionális angiogenezisre gyakorolt hatásait vizsgáltuk) olyan kísérleteket is végeztünk, melyekben az a^3-integrin tumor indukálta angiogenezisben játszott szerepét értékeltük. Angiogenezist kiváltó anyagként 17 napos csirkeembrió chorioallantois-membránján növesztett és arról izolált
- a^3-negatív - humán M21-L-melanoma-darabokat alkalmaztunk. A tumordarabokat a 6. példa C) pontjában leírtak szerint készítettük.
Ahogy azt a 7. példa A)l. pontjában fentebb leírtuk, a monoklonális antitesteket egymástól függetlenül, 25 μΐ HBSS-oldatban 25 pg antitestkoncentrációban, helyileg vittük fel a tumordarabokra, és a tojásokon lévő ablakokat ragasztószalaggal lezártuk. A monoklonális antitestekkel végzett kezelést a 24. és 48. órában, azonos módon, megismételtük. A 72. órában a tumorokat és a környező CAM-szöveteket a 7. példa A)l. pontjában leírtak szerint vizsgáltuk.
Ahogy a 6. példa C) pontjában leírtuk, a tumorokat úgy kaptuk, hogy - a^3-integrint nem expresszáló tenyésztett M21-L-sejteket [Feldina-Habermann és munkatársai: J. Clin. Invest. 89, 2018 (1992)] 10napos csirkeembriók chorioallantois-membránjára ültettünk. Az így kapott, <x^3-negatív tumordarabok puffer, illetve CSAT (anti-pj) vagy P3G2 (ζηίϊ-ανβ5) monoklonális antitest jelenlétében élénk angiogenezist indukáltak, ezzel szemben, az LM609 (anti-a^3) monoklonális antitest megakadályozta, hogy a vérerek a tumortömegbe és a környező CAM-szövetbe hatoljanak.
HU 221 988 Bl
A monoklonális antitestek tumor indukálta angiogenezisre gyakorolt hatásának kvantitatív meghatározása érdekében, a CAM fokális síkján belül a tumorba hatoló vérereket sztereomikroszkóppal, két megfigyelővel, „dupla vak” vizsgálati rendszerben számoltuk. A 12. áb- 5 rán bemutatott adatoszlopok - kétszeres ismétléssel végzett kísérletben, csoportonként 12 CAM-preparátumban - a vérerek átlagos száma ± szórás értékeket reprezentálnak.
Ezzel a kvantitatív vizsgálattal kimutattuk, hogy az 10 LM609 monoklonális antitesttel kezelt tumorokba hatoló vérerek száma mindössze harmada a pufferrel, illetve a P3G2- vagy CSAT-antitesttel kezelt tumorokba hatoló erek számának (p<0,0001; „Wilcoxon”-féle sorozatösszegteszt alapján). Az a tény, hogy az M21-L-tu- 15 morok nem expresszálnak avp3-integrint, azt jelzi, hogy az LM609-antitest közvetlenül a vérerek - és nem a tumorsejtek - befolyásolása révén gátolja az angiogenezist. Ezek az eredmények összhangban állnak az avp3-integrin - rákszövet-biopsziákban megfigyel- 20 hető - szövettani eloszlásával (lásd 3A-3D. ábrák), ahol az avp3-integrin eloszlása a tumorban lévő vérerekre korlátozódott, és magukban a tumorsejtekben nem volt jelen.
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés 25
A tumor indukálta CAM-rendszerben az 1. példában leírtak szerint előállított szintetikus peptideket helyileg alkalmaztuk. A peptideknek az erek életképességére gyakorolt hatását a fentebb leírtak szerint vizsgáltuk. 30
E) Tumor indukálta angiogenezis gátlása intravénás kezeléssel
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
A fenti, D)l. pontban előállított preparátumokat intravénás injektálással beadott monoklonális antitestek- 35 kel is kezeltük. A tumorokat a D)l. pontban leírtak szerint helyeztük a CAM-preparátumokra, az ablakokat ragasztószalaggal lezártuk, majd 24 óra múlva a csirkeembrió vérereibe, a fentebb leírtak szerint, 200 pg tisztított monoklonális antitestet injektáltunk. A csirkeemb- 40 riókat ezután hét napig inkubáltuk. Az angiogenezis mértékét a fentiek szerint figyeltük meg. E kísérlet után a tumorokat kimetszettük, és az antitest tumomövekedésre vagy annak gátlására gyakorolt hatásának meghatározása érdekében megmértük a tömegüket 45 (lásd 8. példa).
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
A CAM-vizsgálati rendszerben a peptidek - tumor indukálta érrendszerre gyakorolt - hatásait is értékeltük. A tumor-CAM-preparátumot a fentiek szerint alkal- 50 máztuk, azzal a különbséggel, hogy a monoklonális antitestek injektálása helyett - az 1. példában és a 7. példa A)2. pontjában leírtak szerint előállított - szintetikus peptideket injektáltuk a látható vérerekbe.
A HCl-sót tartalmazó 66 203-as ciklusos pepiiddel 55 és a 62 186-os kontrollpeptiddel végzett CAM-vizsgálatok eredményeit a 9A-9C. ábrákon mutatjuk be.
A 9A. ábrán látható, hogy a kontrollpeptiddel végzett kezelés nem gyakorolt hatást azokra a nagy vérerekre, amelyek a tumorkezelés miatt a CAM eredetileg erek 60 nélküli területére nőttek. Ezzel szemben, amikor a
203-as, ciklusos (avP3-antagonista) RGD-peptidet helyeztük a szűrőpapírra, a vérerek képződése gátolt volt, s a CAM ezen területe új erektől mentes maradt (lásd 9B. ábra). Az RGD-tartalmú peptid gátlóhatása specifikus és lokalizált volt, amit az bizonyít, hogy a tumor helye körüli vérerekre nem gyakorolt káros hatásokat. Ennek megfelelően, amikor az inhibitor peptideket intravénásán injektáltuk a CAM-preparátumba, a CAM
- tumor helyétől távolabbi - területein a már létező, érett vérereken semmilyen káros hatást nem figyeltünk meg (9C. ábra). A már létező ereket az inhibitor peptid (amely áthaladt ezeken az ereken) nem befolyásolta, miközben gátolta az új erek - már létező erekből a tumortömegbe történő - növekedését. Mindezek értelmében, a 66 203-as és 62 184-es szintetikus pepiidről (melyekről a 4. példában leírt ligandum-receptor vizsgálatokban már kimutattuk, hogy a^-antagonisták) bebizonyítottuk, hogy gátolják a fejlődő erek növekedését, a már létező, érett erekét azonban nem. Ezenfelül, megállapítottuk azt is, hogy a peptidek intravénás infúziója a környező területeken nem okoz semmilyen káros citotoxicitást (amit a 9C. ábrán látható, ép érhálózat bizonyít).
Az 1. példában előállított és 1. táblázatban felsorolt peptidekkel hasonló vizsgálatokat végeztünk.
8. példa
A tumorszövet növekedésének gátlása a CAM- j vizsgálatban, afij-antagonisták alkalmazásával
Ahogy az a 7. példa D)l. pontjában említettük, az I anti-avp3-antagonisták - növekedési faktor vagy tumor f által indukált angiogenezisre gyakorolt - hatását a vizű- ; i ális megfigyelés mellett a tumortömeg - kezelést köve- f tő - változásainak mérésével is értékeltük. Ehhez a ( vizsgálathoz a tumor indukálta angiogenezis CAM- | rendszerét a 6. példa C) pontjában és a 7. példa D) pont- í jában leírtak szerint készítettük elő. A hétnapos inkubálás végén a kapott tumorokat kimetszettük a chorioallantois-membránokról, levágtuk róluk a CAM-szövetmaradványokat, majd 1 ml foszfátpufferelt sóoldattal mostuk, és megmértük mindegyik tumor nedves tömegét.
A mikroszkópos, szövettani vizsgálathoz a tumorok jellemző mintáit „Bulins” fixálószerben 8 óra hosszat fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk. A tumorokból sorozatmetszeteket készítettünk, melyeket - a mikroszkópos vizsgálathoz - hematoxilinnal és eozinnal („H&E”) festettünk [Gladson és munkatársai: J. Clin. Invest. 88,
1924 (1991)]. A metszeteket „Olympus” mikroszkópon,
250-szeres nagyítással fényképeztük.
A) Helyi kezelés
A kontrollpuffer (HBSS), valamint a P3G2 (antiος,βί) és LM609 (anti-avp3) monoklonális antitest helyi alkalmazásának tipikus emberi melanomatumor (M21L) tömegére gyakorolt hatásának eredményeit a 4. táblázatban foglaljuk össze. Mindegyik kísérletben több embriót értékeltünk, és az egyes kísérleti csoportokra érvényes, átlagos tumortömegeket a táblázat alján, a szórással együtt adjuk meg.
HU 221 988 Β1
4. táblázat végső soron pedig a tumortömeg csökkenését eredmé-
nyezi.
Embrió száma Kezelés Tumortömeg (mg) B) Intravénás kezelés
Az UCLAP-3 karcinómatumor tömegének - puf-
1. HBSS 108 5 Eerrel (foszfátpufferelt sóoldat), illetve CSAT- (anti-βι
2. 152 vagy LM609-antitesttel (anti-a^3) végzett intravénás
3. 216 kezelés hatására bekövetkező - alakulását az 5. táblá-
4 270 zatban foglaljuk össze. Mindegyik kísérletben több
embriót értékeltünk, és az egyes kísérleti csoportokra
5. 109 10 érvényes, átlagos tumortömegeket a táblázat alján, a
6. 174 szórással együtt adjuk meg.
1. P3G2 134 5. táblázat
2. 144
3. 408 15 Embrió száma Kezelés Tumortömeg (mg)
4. 157 1. PBS 101
5. 198 2. 80
6. 102 3. 67
7. 124 20 4. 90
8. 99 1. CSAT 151
1. LM609 24 2. 92
2. 135 3. 168
3. 17 25 4. 61
4. 27 5. 70
5. 35 1. LM609 16
6. 68 2. 54
7. 48 30 3. 30
8. 59 4. 20
Kezelés Átlagos tumortömeg (mg) 5. 37
HBSS-kontroll 172+26 6. 39
P3G2 171+36 35 7. 12
LM609 52+13
Ha a CAM-vizsgálati rendszerben emberi (ανβ3negatív) melanomatumort LM609 antitesttel kezeltünk, az átlagos tumortérfogat a kontroll 172+26 mg értékről 52+13 mg értékre csökkent. A P3G2 antitest a tumortömegre nem gyakorolt hatást. Megállapíthatjuk, hogy a a^3-receptor - a^3-specifikus LM609antitest helyi kezelésével végzett - gátlása a tumortömeg csökkenését (valamint az angiogenezis gátlását, lásd előző példák) eredményezte. A P3G2-antitesttel végzett kezeléskor a tumorok mért átmérője hozzávetőleg 8-10 mm volt, ezzel szemben, az LM609-antitesttel kezelt tumorok átmérője csupán átlagosan 2-3 mm volt.
E tumorok fagyasztott metszeteinek mikroszkópos megfigyelésével megállapítottuk, hogy a P3G2-antitesttel kezelt tumorok celluláris szerkezete sértetlen volt, míg az LM609-antitesttel kezelt tumorokban hiányzott a szervezett celluláris szerkezet. Ennek megfelelően, az a^3-receptor-aktivitás az a^3-negatív tumorokban kulcsfontosságú a tumor - a^3-receptort expresszáló új érhálózat fejlődése által táplált - tömegének fenntartása szempontjából. Az avP3-integrin - találmány szerinti a^3-antagonistákkal történő gátlása a tumorba hatoló erek fejlődésének gátlását,
Kezelés Átlagos tumortömeg (mg)
PBS-kontroll 85+7
CSAT 108+22
LM609 30+6
Ha a CAM-vizsgálati rendszerben emberi (ανβ3negatív) karcinómatumort LM609 antitesttel kezeltünk, az átlagos tumortérfogat a kontroll 85+7 mg értékről 30+6 mg értékre csökkent. A CSAT-antitest nem befo45 lyásolta jelentősen a tumortömeget. Megállapíthatjuk, hogy a avp3-receptor - avp3-specifikus LM609-antitest helyi kezelésével végzett - gátlása a karcinóma visszafejlődését (valamint az angiogenezis gátlását, lásd előző példák) eredményezte. Ezenfelül, az
LM609 intravénás injektálása hasonlóan gátolta az emberi melanomatumor növekedését is.
9. példa
Tumorszövet növekedésének visszaszorítása CAM55 vizsgálatban, a$3-antagonisták alkalmazásával
Az a^3-antagonisták - tumorok növekedésre és fennmaradására gyakorolt - hatásainak értékelése céljából emberi melanoma-, tüdő-, hasnyálmirigy- és gégetumordarabokat 10 napos csirkeembriók chorioallantois60 membránjára helyeztünk (lásd 5. példa A) pontja).
i
i.
-i
HU 221 988 Bl
A) Intravénás alkalmazás
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
a) Kezelés IM609-(anti-avP3) és CSAT-antitesttel (anti-Pj) napos csirkeembriók chorioallantois-membrán- 5 jára avp3-negatív emberi M21-L-melanoma-, FG hasnyálmirigytumor-, UCLAP-3 emberi tüdőtumor-, illetve H£p3 emberi gégetumordarabokat helyeztünk.
óra elteltével az embriókat intravénásán PBS-sel, illetve egy dózisban (300 pg/μΐ) LM609 (anti-a^3) mo- 10 noklonális antitesttel vagy CSAT (anti-βι) monoklonális antitesttel oltottuk. A tumorokat további hat napig hagytuk fejlődni. Az inkubálás után a tumorokat óvatosan kimetszettük a membránból, és a környező CAMszövetet levágtuk róluk. A tumorok kimetszését két ku- 15 taté végezte, és csak a könnyen azonosítható, kemény tumortömeget vágtuk ki. A tumoroknak jól meghatározható szélük volt, így a kemény tumortól jól megkülönböztethető, vékony, félig átlátszó chorioallantoismembránt a tumortömeg károsítása nélkül tudtuk eltá- 20 volítani. A kimetszett tumorok tömegét lemértük, és morfológiai, valamint szövettani vizsgálatokat végeztünk.
A 7. nap végén meghatározott nedves tumortömegeket a kezelés előtt mért tömegekhez viszonyítot- 25 tűk (lásd 13. ábra). Az ábrán látható oszlopok csoportonként 5-10 tumor átlaga iszórás értékeket reprezentálnak. Az LM609-antitest - valamennyi tesztelt tumor esetében - a kontrolihoz képest jelentős mértékben gátolta a tumomövekedést (p< 0,001). A PBS-sel vagy 30 CSAT-antitesttel kezelt tumorok valamennyi esetben proliferálódtak. Ezzel szemben, az LM609-antitest nemcsak megakadályozta a tumorok növekedését, hanem a legtöbb esetben - a tumorok jelentős mértékű visszafejlődését is kiváltotta. Lényeges, hogy ezek a tumor- 35 sejtek nem expresszálnak avP3-integrint, ami arra utal, hogy a tumomövekedés gátlása az antitest angiogenezis elleni hatásának, és nem a tumorsejtekre gyakorolt közvetlen hatásának köszönhető.
b) Kezelés LM609- (anti-a^f és P3G2-antitesttel 40 (anti-aJPs)
Emberi M21-L-melanoma tumordarabokat (50 mg) napos csirkeembriók chorioallantois-membránjára ültettünk (lásd 5. példa A) pontja). 24 óra elteltével az embriókat intravénásán PBS-sel, illetve egy dózisban 45 (300 pg/μΐ) LM609 (anti-avp3) monoklonális antitesttel vagy P3G2 (anti-OvPj) monoklonális antitesttel oltottuk. A tumorokat a fenti a) pontban leírtak szerint inkubáltuk, majd morfológiai és szövettani vizsgálatokat végeztünk. 50
A P3G2- vagy LM609-antitesttel kezelt M21-L-tumorokat morfológiailag vizsgáltuk. A P3G2-vel kezelt tumorok nagy méretűek (8 mm-es átmérő) és dús érhálózatúak voltak, míg az LM609-antitesttel kezelt tumorok mérete jóval kisebb (3 mm-es átmérő) volt, és 55 vérereket nem találtunk bennük.
A tumorok további vizsgálata céljából szövettani metszetek készítettünk, melyeket a 9. példa A)l.a) pontjában leírtak szerint hematoxilinnal és eozinnal festettünk. A P3G2-antitesttel kezelt tumorokban számos élet- 60 képes és aktívan osztódó tumorsejtet találtunk, amit a tumorok egész sztrómájában látható mitotikus képletek (lásd 14A. ábra, nyílhegyek), valamint a számos véredény (14A. ábra, nyilak) jelez. Ezzel szemben, az LM609-antitesttel kezelt tumorokban tumorsejtekét vagy vérereket nem - vagy alig - találtunk (14B. ábra). Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az avP3-integrin antagonistái gátolják a tumor indukálta angiogenezist, ami in vivő a különböző emberi tumorok növekedésének leállását és a tumorok visszafejlődését eredményezi. Lényeges rámutatni, hogy a tumomövekedés hetedik napja után vizsgált (17 napos) embriók növekedése normális volt, függetlenül attól, hogy kaptak-e a^-antagonista kezelést. Ez arra utal, hogy az avP3-antagonisták nem toxikusak a fejlődő embriókra.
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
Emberi M21-L-melanoma tumordarabokat (50 mg) 10 napos csirkeembriók chorioallantois-membránjára ültettünk (lásd 5. példa (A) pontja). 24 óra elteltével az embriókat intravénásán 300 pg/μΐ dózisú ciklo-RADfV(69 601), illetve ciklo-RGDfV-peptiddel (66 203) oltottuk. Összesen 72 óra elteltével a tumorokat eltávolítottak, morfológiai vizsgálatokat végeztünk, és a 9. példa
A)l. pontjában leírtak szerinti sztereomikroszkóp alkalmazásával fényképeket készítettünk.
A fényképeket a 15. ábrán mutatjuk be. A 15A. ábrán két, ciklo-RADfV-peptiddel (69 601) kezelt minta; a 15B. ábrán két, ciklo-RGDfV-peptiddel (66 203) kezelt minta; a 15C. ábrán a ciklo-RGDfV-peptiddel (66 203) kezelt embrióból származó, tumorral szomszédos két CAM-szövetminta; a 15D. és 15E. ábrán pedig a kontroll (69 601-es) peptiddel, illetve a 66 203-as cikloRGDfV-peptiddel kezelt tumorok 13-szoros nagyítása látható. A15D. ábrán jól láthatók a kontrollpeptiddel kezelt tumorokban lévő normális vérerek. A 15E. ábrán a 66 203-as peptiddel kezelt tumorokban lévő szétroncsolt vérereket mutatjuk be (lásd nyilak).
Az eredmények azt bizonyítják, hogy csak a 66 203-as peptid gátolta a vérerek képződését, és a tumorral szomszédos CAM-szövetben lévő vérerek nem károsodtak.
10. példa
A tumorszövet növekedésének gátlása avP3-antagonistákkal végzett kezeléssel, in vivő nyúlszemmodell-vizsgálatban
Az avP3-antagonisták - növekedési faktor indukálta - angiogenezisre gyakorolt hatása természetesen átlátszó struktúrákban (mint például a szem szaruhártyájában) jól megfigyelhető. Az új vérerek a szaruhártya - jó vérellátású - peremétől a szaruhártya közepe felé nőnek, melynek normális esetben nincs vérellátása. Az angiogenezis stimulátorai (mint például a PFGF) a szaruhártyán indukálják (az angiogenezis antagonistái pedig gátolják) az új vérerek szaruhártya peremétől kiinduló növekedését. A szaruhártya angiogenezise úgy következik be, hogy az endotélsejtek a szaruhártya peremétől a kemény, kollagénrostos szaruhártyaszövetbe hatolnak, mely folyamat jól látható. A nyúlszemmodell az angiogenezis serkentésének és gátlásának közvetlen megfi24
HU 221 988 Β1 gyelését biztosító in vivő modell, melyben a különböző vegyületeket közvetlenül a szaruhártyára helyezzük.
A) In vivő nyúlszemmodell-vizsgálat
1. Növekedési faktorokkal indukált angiogenezis
Az in vivő nyúlszemmodellben az angiogenezist a pFGF növekedési faktorral indukáltuk, a következők szerint.
a) Növekedési faktort és monoklonális antitesteket tartalmazó „Hydron -pasztillák előállítása
A növekedési faktort és monoklonális antitesteket tartalmazó pasztillákat D’Amato és munkatársai leírása szerint állítottuk elő [Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 4082 (1994)]. Minden egyes pasztilla - a PFGF stabilizálása és a környező szövetekbe történő lassú kibocsátása érdekében „sucralfete”-hoz („Carafet”, Merion Merrel Dow Corporation) kötött - 650 ng PFGF növekedési faktort tartalmazott. Készítettünk olyan „hydrori’-pasztillákat is, amelyek PBS-ben 40 pg LM609 (anti-a^) vagy P1F6 (anti-avP5) monoklonális antitestet tartalmaztak. A pasztillák anyagát speciálisan előkészített, felületükön 2,5 mm-es fúrott magot tartalmazó teflondugókba („peg”) öntöttük. Mindegyik dugóba hozzávetőleg 12 μΐ öntőanyagot tettünk, és a polimerizációt sterilkamrában egy éjszakán át végeztük. A pasztillákat UVsugárzással sterilizáltuk.
b) Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
Mindegyik kísérletben három nyulat használtunk.
A nyulak egyik szemébe pFGF-et vagy LM609-antitestet tartalmazó pasztillát, másik szemébe PFGF-et és P1F6 (anti-avP3) egér monoklonális antitestet tartalmazó pasztillát helyeztünk. Az LM609-antitest P1F6antitesttel és PBS kontrollal történő összehasonlítására alkalmazott páros szemteszt lehetőséget nyújt a vizsgált monoklonális antitestek közötti lényeges különbségek szigorú tesztelésére.
A PlF6-antitest az c^Pj-integrinnei lép immunreakcióba, amely az érfali endotélsejtek felületén található, de feltehetően nem játszik szerepet az angiogenezisben. Annak meghatározása érdekében, hogy a PlF6-antitest hatással befolyásolja-e az angiogenezist, olyan pasztillákat állítottunk elő, amelyek csak ezt az antigént tartalmazták, és az ilyen pasztillákat a következők szerint vizsgáltuk.
Valamennyi tesztelt monoklonális antitestet jól ismert eljárásokkal, „Protein-A Sepharose CL-4B” affinitási oszlopkromatográfía alkalmazásával, hasvízből tisztítottuk Az eluált immunglobulint PBS-sel szemben dializáltuk, majd az endotoxin eltávolítása érdekében „Detoxí’-géllel (Pierce Chemicals) kezeltük. Az endotoxinról bebizonyosodott, hogy hatásos angiogén és gyulladásserkentő szer, ezért a monoklonális antitesteket a „Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay” (Bio-Whittaker) alkalmazásával endotoxin jelenlétére vizsgáltuk, és a nyúlszemmodell-vizsgálatban csak a detektálható endotoxin nélküli monoklonális antitesteket alkalmaztuk.
A nyulak szemén kialakított szaruhártyazsebbe PFGF-et és LM609 (anti-a^j) vagy P1F6 (anti-a^) monoklonális antitestet tartalmazó - „hydrori’-pasztillát helyeztünk, amely a PFGF stabilizálása érdekében „sucralfate”-ot is tartalmazott. Az egyes pasztillákat a szaruhártya kötőszöveti vázának közepén műtéti úton kialakított „zsebekbe” helyeztük. A műtétet - fénytörő lencsével ellátott - „Wild model M691” operáló mikroszkóp alkalmazásával (amelyhez a szaruhártyák lefényképezéséhez fényképezőgépet csatlakoztattunk), steril körülmények között végeztük A szaruhártya kötőszöveti vázában 3x5 mm-es „zsebet” alakítottunk ki, oly módon, hogy egy 69-es ,JBeaver”-pengével a szaruhártya vastagságának feléig 3 mm-es metszést ejtettünk. A kötőszöveti váz kivágott darabját szivárványhártya-spatulával eltávolítottuk, és a pasztillát úgy helyeztük el, hogy perifériás széle a szaruhártya szélétől (limbus) 2 mm-re legyen.
A következő 14 nap során a pFGF és a monoklonális antitest a beültetett pasztillából a környező szövetbe diffundált, miáltal a szaruhártya szegélyéből kiinduló angiogenezist indukált.
Az egyes kezelések jellemző eredményeit a 16A-16E. ábrákon mutatjuk be. A jelen lévő vérerek számát úgy határoztuk meg, hogy a szemet az óra számlapjának megfelelően 12 egyenlő részre osztottuk.
Az „egy óraszámlap-egységnyi véredény” kifejezés a vérerek azon mennyiségét jelenti, amely kitölti a szem egy óra beosztásnak megfelelő részét. Az öt, csak PFGF-fel kezelt nyúl esetében élénk angiogenezist tapasztaltunk, melynek során az új vérerek a szaruhártya szegélyétől a közepe felé nőttek (ahol normális esetben nincsenek erek). E nyulak egyike esetében, csupán egy óraszámlap-egységnyi véredényt figyeltünk meg.? 1
A PFGF-fel és LM609-antitesttel kezelt nyulak közül · kettőben a műtét utáni 14. napig egyáltalán nem figyel- r tünk meg detektálható angiogenezist. E nyulak egyikében, a 14. napon, három gócban vérzéses és bimbózó 1 ereket találtunk. A PFGF-fel és P3G2 (anti-ctyPs) mono- í klonális antitesttel kezelt nyulak közül kettő szaruhár- í tyájában élénk angiogenezist tapasztaltunk, melynek so- í ián az új vérerek a szaruhártya szegélyétől a közepe felé nőttek. E nyulak egyikében csupán egy-két óraszámlapegységnyi véredényt figyeltünk meg.
A nyúlszemmodell-vizsgálattal bebizonyítottuk, hogy az LM609 (anti-o^Pj) monoklonális antitesttel kezelt nyulak szaruhártyájában - PFGF jelenlétében - a szaruhártya széle melletti, normális erek nem állnak angiogén hatás alatt. Ezzel szemben, a P3G2 (anti-Oypj) monoklonális antitesttel kezelt nyulak szaruhártyájában - PFGF jelenlétében - a szaruhártya széle melletti erekben angiogenezist tapasztaltunk. A szaruhártya angiogenezis - LM609 monoklonális antitest által kiváltott - teljes gátlása lényegesen magasabb szintű volt, mint amit a korábban leírt antiangiogén-reagensekkel elértek.
11. példa
A tumorszövet növekedésének in vivő visszaszorítása a$3-antagonistákkal, kimérikus egér .humán vizsgálatban
Az in vivő kimérikus egér:humán modell előállításához SCID-egér bőrének egy részét emberi újszülött- t praeputiummal helyettesítettük (17. ábra). A sikeres bőrátültetés után az emberi praeputiumot karcinómasejtekkel oltottuk be. Mérhető tumor kialakulása után az
HU 221 988 Β1 egér farokvénájába LM609 (anti-avp3) monoklonális antitestet vagy PBS-t injektáltunk. 2-3 hét elteltével a tumorokat kivágtuk, tömegüket megmértük, és szövettani vizsgálatot végeztünk.
A) In vivő kimérikus egér . humán vizsgálat
Az in vivő kimérikus egér:humán modellt lényegében Yan és munkatársai leírása szerint [J. Clin. Invest. 91, 986 (1993)] állítottuk elő. Röviden; 6-8 hetes SCID-egér bőréből eltávolítottunk egy 2 cm2-es darabot, és helyére emberi praeputiumot ültettünk. Az egeret elaltattuk, és hasa szélső részén, mindkét oldalon, 5 cm2-es területről leborotváltuk a szőrt. A bőr - teljes vastagságban, egészen az izompólyáig történő - eltávolításával két cirkuláris transzplantációs ágyat képeztünk, melybe emberi újszülött-praeputiumból származó, azonos terület, teljes vastagságú bőrt ültettünk, melyet hozzávarrtunk az egér bőréhez. A transzplantátumot „Bánd Aid” pólyával fedtük le, melyet a bőrhöz varrtunk. A sebet mikropórusos szövetdarabbal is lefedtük.
Az SCID-egerekre átültetett emberi bőrön a kemény emberi tumorok kialakításához emberi M21L-melanoma-sejtvonalat vagy MDA-23.1-emlőrák-sejtvonalat (ATCC HTB 26; amely a szövetmetszetek LM609 monoklonális antitestekkel mutatott immunreaktivitása alapján avp3-negatív) alkalmaztunk. Az emberi bőrtranszplantátumba - intradermálisan - 5 χ 106 (különálló) M21-L- vagy MDA-23.1-sejtből álló szuszpenziót injektáltunk. Az egereken 2-4 hét elteltével vizsgáltuk az emberi tumorok növekedését.
B) Intravénás kezelés
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
A mérhető tumorok kifejlődése után az - M21L-tumorsejtekkel injektált - SCID-egerek farokvénájába - 2-3 héten keresztül, hetente kétszer - intravénásán 250 pg LM609 (anti-avp3) monoklonális antitestet vagy PBS-t injektáltunk. Ezután a tumorokat levágtuk a bőrről, és megtisztítottuk a környező szövetdaraboktól. Mindegyik kísérletben több egeret értékeltünk; az egyes kezelési kísérletekben kapott átlagos tumortömegeket a 6. táblázat alján adjuk meg.
6. táblázat
M21L-tumor száma Kezelés Tumortömeg (mg)
1. PBS 158
2. 192
3. 216
4. 227
5. LM609 195
6. 42
7. 82
8. 48
9. 37
10. 100
11. 172
Kezelés Átlagos tumortömeg (mg)
PBS 198
LM609 113
A kimérikus egér:humán vizsgálati rendszerben az avp3-negatív emberi M21L-tumor átlagos tömege LM609 (anti-avp3) monoklonális antitest hatására a PBS-sel kezelt kontroll 198 mg-os átlagos tömegéről 113 mg-ra csökkent.
Az LM609 (antí-OvPj) monoklonális antitesttel és a PBS-sel kezelt M21L-tumorok jellemző mintáit morfológiailag vizsgáltuk. A PBS-sel kezelt tumorok átmérője 8-10 mm volt, és sok eret tartalmaztak, ezzel szemben, az LM609-antitesttel kezelt tumorok sokkal kisebbek voltak (3-4 mm-es átmérő), és kimutatható ereket nem tartalmaztak.
Az MDA-23.1-sejtekkel beoltott bőrtranszplantátumokon jól megfigyelhető és mérhető tumorok képződtek. A kifejlett tumorok morfológiai vizsgálata azt mutatta, hogy az átültetett emberi szövetből új erek nőttek az MDA-23.1-tumorsejtekbe.
Ilyenformán, ebben a modellben az a^-receptor
- Ovf^-specifikus LM609-antitest intravénás beadása hatására bekövetkező - blokkolása a tumor növekedésének gátlását eredményezte, hasonlóan, mint a 9. példában leírt CAM-modell, illetve a 10. példában leírt nyúlszemmodell-vizsgálat esetében.
12. példa
Az érfali sejtek sejtciklusba történő bekerülésének és apoptózisának serkentése ajfij-integrin jelenlétében, CAM-vizsgálati rendszerben
A vérképződési folyamat egyértelműen a citokinek
- mint például a pFGF és VEGF - érfalsejtek proliferációját serkentő képességétől függ [Mignatti és munkatársai: J. Cell. Biochem. 471, 201 (1991); Takeshita és. munkatársai: J. Clin. Invest. 93, 662 (1994); és Koyama és munkatársai: J. Cell. Physiol. 158, 1 (1994)]. Nyilvánvaló azonban az is, hogy a jelképző („signaling”) események irányíthatják az érfalsejtek érett véredényekké történő differenciálódását, következésképpen, elképzelhető, hogy az angiogenezis folyamatában lévő érfalsejtek szaporodásával vagy differenciálódásával kapcsolatos jelek befolyásolása az angiogenezis megzavarását eredményezi.
Kimutatták, hogy az integrinek ligálódási eseményei mind a sejtek proliferációjában, mind az in vitro apoptózisban vagy programozott sejtpusztulásban részt vesznek [Schwartz: Cancer Rés. 51, 1503 (1993); Meredith és munkatársai: Mól. Bioi. Cell. 4, 953 (1993); Frisch és munkatársai: J. Cell Bioi. 124, 619 (1994)]. Az avp3-antagonisták angiogenezisre gyakorolt hatásainak részletes vizsgálata megszakításos és megrongált (tumorral kapcsolatos) vérerek jelenlétét mutatja. Ilyenformán, lehetséges, hogy a véredények folytonosságának megszűnése az érfalsejtek szelektív pusztulásának vagy apoptózisának következménye.
E lehetőség kivizsgálása érdekében olyan csirkechorioallantois-membránokat (CAM) vizsgáltunk, melyekben pFGF növekedési faktorral, valamint a találmány
HU 221 988 Β1 szerinti monoklonális antitesttel és ciklusos peptidekkel angiogenezist indukáltunk.
A) Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
Az apoptózis számos eljárással detektálható, mint például a szövetből izolált DNS - fragmentálódásának 5 detektálását célzó - közvetlen vizsgálatával, valamint ép szövetben a fragmentálódott DNS 3’-OH csoportjainak (3’-OH csoportot specifikusan detektáló antitesttel végzett) kimutatásával.
1. A DNS-fragmentálódás vizsgálata 10 napos embriók chorioallantois-membránjára pFGF-fel impregnált szűrőpapír korongokat helyezve angiogenezist indukáltunk (lásd 6. példa A) pontja).
A CAM-preparátumok LM609 (anti-OyPj) monoklonális antitesttel végzett immunhisztológiai analízise azt 15 mutatta, hogy a vérereken az o^-integrin expressziója az angiogenezis PFGF-fel végzett indukálása utáni
12. és 24. óra között érte el maximumát. Ennek megfelelően, az PFGF-fel végzett indukció után 24 órával az embriókat intravénásán 100 pl PBS-sel, illetve 20 100 μ1-300 pg CSAT (anti-Pj) vagy LM609 (antiανβ3) monoklonális antitestet tartalmazó - PBS-sel oltottuk be.
A DNS-fragmentálódás detektálása céljából, az antitestekkel vagy a pufferrel végzett oltást követően 25 24 vagy 48 órával, közvetlenül a pFGF-fel impregnált szűrőpapír korong alatti területről CAM-szövetet vágtunk ki. A kivágott CAM-szöveteket háromszor steril PBS-sel mostuk, apróra vagdaltuk, majd 0,25%-os bakteriális kollagenázoldatban (Worthington Biochemical; 30 Freehold, NJ) újraszuszpendáltuk, és 37 °C-on - időnként vortexezve - 90 percig inkubáltuk. A DNS-t azonos számú CAM-sejtet tartalmazó egysejtszuszpenzióból, korábbi leírás szerint [Bissonette és munkatársai: Natúré 359, 552 (1992)] vontuk ki. Röviden; azonos 35 számú CAM-sejtet - 10 mM trisz-Cl-puffert (pH=8,0) és lOmM EDTA-t tartalmazó - 0,5 térfogat%-os Triton-X-100-oldatban (Sigma, St. Louis, MO) lizáltunk.
A sejtíizátumokat az oldható, fragmentálódott DNS - ép kromatinüledéktől történő - elkülönítése érdeké- 40 ben 4 °C-on, 16 000xg-vel 15 percig centrifugáltuk.
A fragmentálódott DNS-t mostuk, kicsaptuk, és 1,2 vegyes%-os agarózgélen analizáltuk.
Az oldható, fragmentálódott DNS-t az egyes kísérletekben azonos számú CAM-sejtből izoláltuk, agarózgé- 45 len elektroforézissel elválasztottuk, majd a fragmenseket etidium-bromidos festéssel tettük láthatóvá. A három különböző kezelési csoportból származó CAM-sejtekben - a kezelések után 24 órával - a DNS-fragmentáció relatív mennyiségében nem találtunk jelentős 50 különbséget, ezzel szemben, az LM609 (anti-ctyPj) monoklonális antitesttel végzett kezelés után 48 órával a DNS-fragmentáció jelentős fokozódását figyeltük meg (a CSAT-antitesttel, illetve a csak PBS-sel kezelt mintákhoz viszonyítva). 55
2. Az érfalsejtek sejtciklusba történő belépésének serkentése
Az avp3-integrin e folyamatokban betöltött szerepének kísérletes vizsgálata céljából a - PFGF jelenlétében vagy hiányában - kezelt CAM-szöveteket propi- 60 dium-jodiddal festettük, és LM609 (anti-cq]J3) monoklonális antitesttel reagáltattuk.
Az embriókból az LM609 (anti-avp3) és CSAT (anti-Pj) monoklonális antitesttel, illetve csak PBS-sel végzett kezelés után 24 és 48 órával izolált CAM-szöveteket - a fentebb leírtak szerint bakteriális kollagenázzal végzett inkubálással - különálló sejtek szuszpenziójává disszociáltak. Az szuszpenzióban lévő sejteket permeábilissá tettük, és „Apop Tag Insita Detection” reagenskészlettel (Oncor, Gaithersburg, MD) - a gyártó útmutatásai szerint - festettük. Az ,Αρορ Tag” olyan antitest, amely specifikusan a fragmentálódott DNS szabad 3’-OH csoportját detektálja. Az ilyen szabad 3’OH csoportok detektálása az apoptózisos sejtek kimutatásának ismert eljárása [Gavrieli és munkatársai: J. CellBiol. 779,493(1992)].
Az ,Αρορ Tag” antitesttel festett sejteket 0,1 térfogat%-os Triton-X-100-at tartalmazó PBS-ben öblítettük, majd 0,5 vegyes% BSA-t, 0,02 vegyes% nátriumazidot és 200 pg/ml RN-áz-A-t tartalmazó PBS-ben újraszuszpendáltuk. A sejteket 1,5 óra hosszat inkubáltuk, mostuk, majd fluoreszcencia aktiválta sejtosztályozásnak vetettük alá. A sejtek fluoreszcenciáját „FACScan” áramlásos citométer alkalmazásával mértük, és az adatokat a következők szerint értékeltük.
A sejtfluoreszcenciát„FACScan” áramlásos citométerrel (Becton Dickinson, Mountain View, CA) mértük. Az oldalszóródást („side scatter”; SSC) és az előreszóródást („forward scatter”; FSC) egyidejűleg határoztuk meg, és az adatokat ,,FACScan research” szoftverrel (Becton Dickinson, Mountain View, CA) ellátott „Hewlet Packard HP9000” számítógépben gyűjtöttük össze. Az adatokat „P. C. Lysis version I” szoftver (Becton Dickinson, Mountain View, CA) alkalmazásával analizáltuk. Az ,ΑρθΡ Tag” reagenskészletből származó primer antitestek nélküli sejtszuszpenziók alkalmazásával negatív kontrollkapukat („control gates”) állítottunk fel. Mindkét sejtpopulációhoz azonos kapuzást („gating”) alkalmaztunk, ami a különböző kezelési csoportokban hozzávetőleg 8000-8000 sejt vizsgálatát teszi lehetővé.
A monoklonális antitesttel kezelt és ,Αρορ Tag” antitesttel festett CAM-szövetekből származó különálló sejtek - „FACS”-analízissel meghatározott - százalékos arányát a 18. ábrán mutatjuk be. A fekete oszlopok a vizsgálat előtt 24 órával kezelt embriókból származó sejteket, a pontozott oszlopok pedig a vizsgálat előtt 48 órával kezelt embriókból származó sejteket reprezentálják. Mindegyik oszlop háromszori ismétléssel végzett kísérletek átlag ± szórás értékeit mutatja.
Amint az ábrán látható, a vizsgálat előtt két nappal LM609 (anti-a^3) monoklonális antitesttel kezelt CAM-sejtek az ,Αρορ Tag” festődés intenzitásában - a csak PBS-sel vagy CSAT (anti-βι monoklonális antitesttel kezelt CAM-sejtekhez képest - 3-4-szeres növekedést mutattak.
B) Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
A növekedési faktorral indukált angiogenezis CAM-vizsgálatát (lásd 6. példa A) pontja) a találmány
HU 221 988 Bl szerinti szintetikus peptidekkel is elvégeztük, hogy meghatározzuk e peptidek apoptózisra gyakorolt hatását. A ciklo-RGDfV (66 203) és ciklo-RADfV (69 601) pepiidet az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. A peptid oldatokat és a PBS-t 300 pg/ml koncentrációban injektáltuk a CAM-preparátumokba. 24 és 48 óra elteltével a szűrőpapírt és a környező CAM-szövetet kimetszettük, és - az apoptózis detektálása érdekében az előző pontban leírtak szerint ,Αρορ Tag” antitesttel festettük. A 18. ábrán látható, hogy a vizsgálat előtt két nappal a 66 203-as (ciklo-RGDfV) pepiiddel kezelt CAM-sejtek az „Apop Tag” festődés intenzitásában - a csak PBS-sel vagy a 69 601-es kontrollpeptiddel kezelt CAM-sejtekhez képest - 3-4-szeres növekedést mutattak.
C) A monoklonális antitestekkel végzett kezelés hatása az apoptózisra és a sejtciklusra
A különálló sejtek szuszpenzióiban - propidium-jodidos festéssel - meghatároztuk a kromoszomális DNS kópiáinak számát, hogy értékeljük a monoklonális antitestek sejtciklusra gyakorolt hatását, és Apop Tag” reagenskészlettel végzett festéssel vizsgáltuk az apoptózist.
A 24 vagy 48 órával korábban LM609 (anti-avp3) vagy CSAT (anti-βι monoklonális antitesttel kezelt CAM-szövetek különálló sejtjeiből álló szuszpenziókat a 12. példa A)l. pontjában leírtak szerint készítettük.
A sejtek „Apop Tag” antitesttel végzett festése előtt a sejtszuszpenziókat - 2,5 vegyes% BSA-t és 0,25 vegyes% nátrium-azidot tartalmazó - PBS-sel háromszor mostuk. A sejteket 1 vegyes%-os formaldehidet tartalmazó PBS-ben 15 percig fixáltuk, majd az előbbi oldattal újabb három mosást végeztünk. A nem specifikus kötődés megakadályozása érdekében a különálló sejtek szuszpenzióit 4 °C-on, egy éjszakán át - 5 vegyes% BSA-t tartalmazó - PBS-sel blokkoltuk. Ezután a sejteket az előbbiek szerint mostuk, ,Αρορ Tag” antitesttel festettük, és a sejtfluoreszcenciát a 12. példa A) pontjában leírtak szerint, „FACScan” citométer alkalmazásával mértük.
A különböző feltételekkel kezelt sejteket - PBSben 10 pg/ml koncentrációjú - propidium-jodiddal (Sigma, St. Louis, MO) festettük, PBS-sel kétszer mostuk, és az apoptózisra jellemző sejtmagi jellegzetességekre (például kromatinkondenzáció és szegmentáció) vizsgáltuk. Az apoptózisos sejtek százalékos arányát legalább 10-15 véletlenszerűen kiválasztott mikroszkóp-látóterületben lévő sejtek morfológiai analízisével becsültük meg.
A CSAT (anti-Pj) vagy LM609 (anti-avp3) monoklonális antitesttel kezelt embriók CAM-szövetéből származó különálló sejtek - „Apop Tag” antitesttel és propidium-jodiddal kezelt és FACS-analízissel vizsgált - szuszpenziójával kapott kombinált eredményeket a 19. ábrán mutatjuk be. Az y tengelyen az „Apop Tag” festődés (vagyis az apoptózis) mértékét, az x tengelyen pedig a propidium-jodidos festődés mértékét (vagyis a DNS-tartalom nagyságát) mutatjuk be. A vízszintes vonal az ,Αρορ Tag” festődés negatív kapuját jelzi. A bal oldali ábra a CSAT monoklonális antitesttel, a jobb oldali pedig az LM609 monoklonális antitesttel kezelt embriókból származó CAM-sejtek eredményeit mutatja. A sejtciklus-analízist - kísérleti feltételenként - hozzávetőleg 8000 esemény vizsgálatával végeztük, és az eredményeket kontúrdiagramon mutatjuk be.
A propidium-jodiddal festett különálló sejtek mintái azt mutatták, hogy az LM609-antitesttel kezelt CAM-sejtek 25-30%-a (a kezelés után 48 órával) a sejtmagi kondenzáció és/vagy szegmentáció folyamatát mutatták, melyek az apoptózison áteső sejtek jellemzői. Ezzel szemben, a CSAT-antitesttel kezelt CAM-sejtek 90-95%-a mutatott normális sejtmagi festődést.
A 19. ábrán látható, hogy jelentős számban vannak olyan sejtek, amelyekben egynél kevesebb DNS-kópiát tartalmazó csúcs figyelhető meg (Aj). E csúcsról korábban kimutatták, hogy a későbbi stádiumú apoptózisos sejtekben lévő, fragmentálódott DNS-t reprezentálja [Telford és munkatársai: Cytometry 13, 137 (1992)].
Ennek megfelelően, az ilyen A0-sejtek ,Αρορ Tag” antitesttel könnyen festhetők, ami azt igazolja, hogy ez a reagens alkalmas az apoptózisos sejtek detektálására.
Az Ao-sejtek festődésén kívül jelentős számú olyan sejt is festődik az ,Αρορ Tag” antitesttel, amely egynél több DNS-kópiát tartalmaz (19. ábra). Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az LM609-antitest képes elősegíteni a sejtciklusba már bekerült érfalsejtek apop- í tózisát. Ezzel szemben, a kontroll-CAM-szövetekből 1 származó - sejtciklusba már bekerült - sejtek minimé- t lis ,Αρορ Tag” festődést mutattak, ami összhangban | van a kontroll-CAM-szövetekben detektált apoptózis j sejtek kis számával. 1
A pFGF-fel stimulált CAM-szövetek - sejtciklusba | (S és G/M fázis) bekerült - sejtjeinek 70%-a mutatott t pozitív festődést az LM609-antitesttel. Ezzel szemben, !
a pFGF-fel nem kezelt CAM-szövetek sejtciklusba be- r került sejtjeinek csak 10%-a mutatott LM609-festődést. Ez azt jelenti, hogy a pFGF-fel végzett stimulálás után az avP3-hordozó sejtek nagyobb része aktív proliferációt mutat.
E megfigyelések együttesen azt jelzik, hogy az LM609 monoklonális antitest vagy az avp3-antagonista ciklusos peptidek intravénás injektálása csirkeembrió chorioallantois-membránjában - az angiogenezis indukcióját követően - elősegíti az apoptózist.
A CAM-szöveteket szövettanilag - LM609-antitesttel való immunreaktivitása alapján - az avP3-intetgrin expressziójára, illetve - ,Αρορ Tag” antitesttel mutatott immunreaktivitása alapján - az apoptózisos sejtek jelenlétére vizsgáltuk. Az 5. példa A) pontjában leírtak szerint előállított, LM609 (anti-Oy^) vagy CSAT (anti-β]) monoklonális antitesttel, illetve PBS-sel kezelt embriókból készített CAM-metszeteket lemostuk,
OTC-be (Baxter) ágyaztuk, és folyékony nitrogénben hirtelen lehűtöttük. A CAM-szövetekből 6 pm vastagságú metszeteket készítettünk, ezeket 30 másodpercig t acetonban fixáltuk, majd a felhasználásig -70 °C-on tároltuk. A festés előkészítése érdekében a szövetmetsze- teket rövid ideig 70 térfogat%-os etanolban öblítettük,
HU 221 988 Bl foszfátpufferelt sóoldattal háromszor mostuk. Ezután a metszeteket 5 vegyes% szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó foszfátpufferelt sóoldattal két óra hosszat blokkoltuk. A metszeteket ezután lemostuk, majd 1:50 higítású, rodaminnal konjugált kecske antiegér- 5 IgG-vel (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) két óra hosszat inkubáltuk. Az így kezelt metszeteket lemostuk, és a 12. példa A)2. pontjában leírtak szerint „Apop Tag” antitesttel festettük. A festett szövetmetszeteket tárgylemezen rögzítettük, és konfokális immunfluoresz- 10 cens mikroszkóppal vizsgáltuk.
A 20A-20C. ábrákon a CSAT-antitesttel kezelt embriókból származó CAM-szöveteket, a 20D-20F. ábrákon pedig az LM609-antitesttel kezelt embriókból származó CAM-szöveteket mutatjuk be. A 20A-20D. ábrá- 15 kon az „Apop Tag” antitesttel festett és ,J>. 1. C” képre („image”) szuperimponált fluoreszcenciával („FITC”) láthatóvá tett szövetek láthatók. A 20B. és 20E. ábrán azonos - LM609-antitesttel festett és fluoreszcenciával (rodamin) láthatóvá tett - szövetek láthatók. A 20C. és 20 20F. ábrán - ,Λρορ Tag” és LM609 antitesttel egyaránt festett - azonos szövetek összevont képei láthatók; a sárga festődés együttes lokalizációt jelent. A 20C. ábrán a vízszintes vonal 15 pm-nek, a 20D. ábrán pedig 50 pmnek felel meg. 25
A 20A-20C. ábrákon látható, hogy a CSAT-antitest vagy a PBS injektálása után az „Apop Tag” festődés minimális és véletlenszerű volt, ami azt jelzi, hogy a szövetben az apoptózis szintje minimális. Ezzel szemben, az LM609-antitesttel vagy a 203-as ciklusos pép- 30 tiddel kezelt embriók CAM-szövetében a vérerek többsége intenzív „Apop Tag” festődést mutat, miközben a környező, nem érfali sejtek esetében minimális reaktivitást figyeltünk meg (20D-20F. ábrák). Amennyiben a szövetek festéséhez „Apop Tag” és LM609-antitestet 35 egyaránt alkalmaztunk, (20C. és 20F. ábra), e maikerek jelentős együttes lokalizációját csak az a^-antagonistákkal kezelt embriókból származó CAM-szövetek esetében tapasztaltuk (20F. ábra).
Ezek a felismerések azt bizonyítják, hogy az angio- 40 genezis in vivő indukciója után az avp3-integrin inhibitorai szelektíven serkentik az avp3-integrint hordozó vérerek apoptózisát.
Bár az angiogenezis komplex folyamat, amely sok molekuláris és sejtbiológiai eseményt foglal magában, 45 különböző bizonyítékok arra utalnak, hogy az a^-integrin e folyamat viszonylag kései fázisában játszik szerepet. Először; az immunhisztológiai vizsgálat azt mutatja, hogy az érfalsejtekben az avP3-integrin expressziója az angiogenezis pFGF-fel végzett indukáló- 50 sát követően 12-24 órával éri el maximumát. Másodszor; az avp3-antagonisták a különböző aktivátorok által indukált angiogenezis folyamatát gátolják, ami arra utal, hogy ez a receptor a folyamatban talán valamennyi primer jelképző („signaling”) esemény utáni 55 általános reakcióútban játszik szerepet. Harmadszor; az LM609 monoklonális antitesttel vagy ciklusos pepiiddel kezelt chorioallantois-membránok nem mutatnak jelentős mértékű apoptózisnövekedést, amit a kezelés utáni 48. óráig a DNS fragmentálódásának detek- 60 tálásával mértünk. Végül; az avp3-antagonisták elősegítik azon érfalsejtek apoptózisát, amelyek sejtciklusba történő belépése már korábban indukált volt.
A fentiekben feltárt eredmények első közvetlen bizonyítékát biztosítják annak, hogy az integrin ligálódási eseményei in vivő szabályozhatják a sejtek életben maradását. Következésképpen, feltételezzük, hogy az angiogenezis beindulásával az egyes érfalsejtek osztódnak, és az angiogénforrás felé mozognak, majd az avp3-ligálás olyan jelet biztosít, ami a sejt tartós életben maradását teszi lehetővé, ami viszont differenciálódáshoz és érett vérerek kialakulásához vezet Ha azonban az avp3-ligálódást megakadályozzuk, a sejtek nem veszik ezt a molekuláris jelet, és bekövetkezik az apoptózis. Ez az elmélet magában foglalja azt is, hogy a differenciálódás bekövetkezése után az érett vérereknek az életben maradáshoz nincs többé szükségük avp3-jelölésre, és így ellenállóak az avp3-integrin antagonistáival szemben.
A példákban bemutatott eredmények azt bizonyítják, hogy az avp3-integrin antagonistái hatásosan alkalmazhatók a neoplázia vagy más, angiogenezissel jellemezhető betegségek kezelésére. Először is; az avp3-antagonisták rongálják az újonnan képződő vérereket, anélkül, hogy befolyásolná: a már létező érrendszert. Másodszor; az avP3-antagonisták nem gyakorolnak jelentős hatást a csirkeembrió életképességére, ami arra utal, hogy nem toxikusak. Harmadszor; az angiogenezist az angiogén ingertől függetlenül gátolják Végül: az avp3-antagonisták szisztémás beadása a különböző, szövettanilag eltérő emberi tumorok rendkívüli visszafejlődését eredményezi.
Ilyenformán, a fentebb leírt példákban bebizonyítottuk, hogy az avp3-integrin kulcsszerepet játszik a különböző ingerek által indukált angiogenezisben, ezáltal — a neovascularisatióval jellemezhető betegségek kezelése terén értékes terápiás célpontját képezi a találmány szerinti a^-antagonistáknak.
A találmány leírását megfelelőnek tartjuk arra, hogy szakember számára lehetővé tegye a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítását. A találmány oltalmi körét nem kívánjuk a letétbe helyezett sejtvonallal korlátozni, mivel a letétbe helyezett sejtvonal csupán a találmány tárgyának egyik megvalósítási módjának szemléltetésére szolgál. Az általunk letétbe helyezett sejtvonallal funkcionálisan egyenértékű sejtvonalak szintén az igényelt oltalmi körbe tartoznak. A letétbe helyezés nem jelenti azt, hogy a találmány leírása elégtelen lenne a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításához (beleértve annak legelőnyösebb módját). Nyilvánvaló, hogy a találmány leírásával nem kívánjuk az igényelt oltalmi kört a bemutatott, speciális esetekre korlátozni. A találmány leírása alapján szakember számára kézenfekvő, hogy az általunk feltárt speciális megvalósítási módokban számos olyan változtatás hajtható végre, melyekkel továbbra is azonos vagy hasonló eredmények nyerhetők. Nyilvánvaló, hogy az ilyen megoldások nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől, és az igényelt oltalmi körön belül maradnak.
HU 221 988 Β1
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=BOC-GRGDFV-OMe /megjegyzés=, A BOC-jelölés az N-terminális butil-oxi-karbonil védőcsoportot jelenti, az OMe-jelölés a C-terminális metil-észter védőcsoportot; a 2. pozícióban Arginin található.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=OMe /megjegyzés=, Az OMe-jelölés a C-terminális metil-észter védőcsoportot jelenti.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=D-Arg /megjegyzés=, A D-Arg jelölésben a ,JD” azt jelzi, hogy a 2. pozícióban található Arginin D-aminosav.”
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=BOC /megjegyzés=,A BOC-jelölés az N-terminális butil-oxi-karbonil védőcsoportot jelenti.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK:/jelzés=OH /megjegyzés=„Az OH-jelölés szabad C-terminális karboxilcsoportot jelöl.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=D-Arg /megjegyzés=,A D-Arg jelölésben a „D” azt jelzi, hogy a 2. pozícióban található Arginin D-aminosav.”
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
HU 221 988 Β1
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=H /megjegyzés=, A H-jelölés szabad N-terminális amint jelent.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=OH /megjegyzése ,Αζ OH-jelölés szabad C-terminális karboxilcsoportot jelöl.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=D-Arg /megjegyzés=,A D-Arg jelölésben a „D” azt jelzi, hogy a 2. pozícióban található Arginin D-aminosav.”
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK:/jelzés=cyclo /megjegyzés=,A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 5 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...5
HU 221 988 Β1
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=”A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Gly Asp Phe Val
5
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 5 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...5
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=„F cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Alá Asp Phe Val
5
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 5 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...5
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=„A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Gly Asp Phe Val
5
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 15 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Tyr Thr Alá Glu Cys Lys Pro Gin Val Thr Arg Gly Asp Val Phe
10 15
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 5 aminosav
HU 221 988 Bl
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...5
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=, A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Alá Asp Phe Val
5
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: ciikuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=,A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Alá Arg Gly Asp Phe Leu
5
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=,Λ cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Leu
5
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 12 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris . i„... te,,..: 33
HU 221 988 Β1
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Thr Arg Gin Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met 1 5 10
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 13 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Alá Leu Alá Arg Leu Ser 1 5 10
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 11 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu

Claims (62)

1. avp3-antagonista alkalmazása az ανβ3 közvetítette angiogenezisnek egy szövetben történő gátlására alkalmas, a szövetbe beadható gyógyászati készítmény előállítására.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, mintegy 0,1 mg/kg és mintegy 300 mg/kg közötti dózisban beadható gyógyászati készítmény előállítására.
3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, szilárd tumoros szövet neovascularisatiójának gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint OvPj-antagonistaként a fibrinogén avP3-integrinhez történő kötődését gátló, de a fibrinogén anbp3- vagy ος,β,-integrinhez történő kötődését lényegében nem gátló antagonistát alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a^3-antagonistaként avp3-integrinre immunspecifikus monoklonális antitestet alkalmazunk.
6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint monoklonális antitestként humanizált antitestet alkalmazunk.
7. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint monoklonális antitestként az LM609 monoklonális antitest (ATCC HB 9537) immunreaktív jellemzőivel bíró antitestet alkalmazunk.
8. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a^3-antagonistaként RGD-szekvenciát tartalmazó polipeptidet alkalmazunk.
9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint polipeptidként c-(GiGDFV) (4. azonosító számú szekvencia), c-(RGDfV) (5. azonosító számú szekvencia), c(RGDFv) (7. azonosító számú szekvencia) vagy YTAECKPQVTRGDVF (8. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú peptidet, vagy ezek sóit alkalmazzuk.
10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint peptidsóként hidroklorid- vagy trifluor-acetát-sót alkalmazunk.
11. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, gyulladásban lévő szövetbe adható, gyulladásos szöveti angiogenezis gátlására alkalmas készítmény előállítására.
12. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, ízületi gyulladásban lévő szövetbe adható készítmény előállítására.
13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, reumatoid arthritisben szenvedő emlősben található szövetbe adható készítmény előállítására.
14. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, cukorbetegségből eredő szemideghártya-bántalomban szenvedő
HU 221 988 Bl páciens szemideghártya-szövetébe adható, szemideghártya-angiogenezis gátlására alkalmas készítmény előállítására.
15. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, hemangiomába adható készítmény előállítására. 5
16. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, kemény tumorba vagy kemény tumor metasztázisába adható, tumor-angiogenezis gátlására alkalmas készítmény előállítására.
17. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, karcinómá- 10 ba adható készítmény előállítására.
18. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, tüdő-, pankreász-, mell-, vastagbél- gége- vagy petefészektumorba adható készítmény előállítására.
19. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, az 0^3- 15 antagonistát mintegy 2 μΜ-tól mintegy 5 mM-ig teqedő koncentrációtartományban tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására.
20. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, intravénásán, transzdermálisan, ízületi nedvbe, intramuszkulári- 20 san vagy orálisan beadható gyógyászati készítmény előállítására.
21. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, kemoterápiával kapcsoltan beadható gyógyászati készítmény előállítására. 25
22. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, egyetlen intravénás dózisban beadható gyógyászati készítmény előállítására.
23. avP3-antagonista alkalmazása egy szövetben kialakult tumor visszafejlesztésére alkalmas, a szövetbe 30 beadható gyógyászati készítmény előállítására.
24. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként a fibrinogén avp3-integrinhez történő kötődését gátló, de a fibrinogén «nbPr vagy Ovpj-integrinhez történő kötődését lényegében nem gát- 35 ló antagonistát alkalmazunk.
25. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként avp3-integrinre immunspecifikus monoklonális antitestet alkalmazunk.
26. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, amely sze- 40 rint monoklonális antitestként az LM609 monoklonális antitest (ATCC HB 9537) immunreaktív jellemzőivel bíró antitestet alkalmazunk.
27. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként RGD-szekvenciát tartalmazó 45 polipeptidet alkalmazunk.
28. A 27. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint polipeptidként c-(GrGDFV) (4. azonosító számú szekvencia), c-(RGDfV) (5. azonosító számú szekvencia), c-(RGDFv) (7. azonosító számú szekvencia) vagy 50 YTAECKPQVTRGDVF (8. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú peptidet, vagy ezek sóit alkalmazzuk.
29. A 28. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint peptidsóként hidroklorid- vagy trifluor-acetát-sót al- 55 kalmazunk.
30. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, gyulladásban lévő szövetbe adható, gyulladásos szöveti angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására. 60
31. A 30. igénypont szerinti alkalmazás, ízületi gyulladásos szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
32. A 31. igénypont szerinti alkalmazás, reumatoid arthritisben szenvedő emlősben található szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
33. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, cukorbetegségből eredő szemideghártya-bántalomban szenvedő páciens szemideghártya-szövetébe adható, szemideghártya-angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
34. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, hemangiomába adható gyógyászati készítmény előállítására.
35. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, kemény tumorba vagy kemény tumor metasztázisába adható, tumor-angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
36. A 23. igénypont szerinti igénypont szerinti alkalmazás, az avp3-antagonistát mintegy 2 μΜ-tól mintegy 5 mM-ig terjedő koncentrációtartományban tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására.
37. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, intravénásán, transzdermálisan, ízületi nedvbe, intramuszkulárisan vagy orálisan beadható gyógyászati készítmény előállítására.
38. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, kemoterápiával kapcsoltan adható gyógyászati készítmény előállítására.
39. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, egyetlen intravénás dózisban beadható gyógyászati készítmény előállítására.
40. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, a tumor visszafejlődését beadása után hét nappal kiváltó gyógyászati készítmény előállítására.
41. a„p3-antagonista alkalmazása egy szövet új érrendszerében apoptózis indukálására alkalmas, a szövetbe beadható gyógyászati készítmény előállítására.
42. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként a fibrinogén avp3-integrinhez történő kötődését gátló, de a fibrinogén aIIbp3- vagy Ονβι-integrinhez történő kötődését lényegében nem gátló antagonistát alkalmazunk.
43. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avP3-antagonistaként avp3-integrinre immunspecifikus monoklonális antitestet alkalmazunk.
44. A 43. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint monoklonális antitestként az LM609 monoklonális antitest (ATCC HB 9537) immunreaktív jellemzőivel bíró antitestet alkalmazunk.
45. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként RGD-szekvenciát tartalmazó polipeptidet alkalmazunk.
46. A 45. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint polipeptidként c-(GrGDFV) (4. azonosító számú szekvencia), c-(RGDfV) (5. azonosító számú szekvencia), c-(RGDFv) (7. azonosító számú szekvencia) vagy YTAECKPQVTRGDVF (8. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú peptidet, vagy ezek sóit alkalmazzuk.
HU 221 988 Β1
47. A 46. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint peptidsóként hidroklorid- vagy trifluor-acetát-sót alkalmazunk.
48. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, gyulladásban lévő szövetbe adható, gyulladásos szöveti angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
49. A 48. igénypont szerinti alkalmazás, ízületi gyulladásos szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
50. A 49. igénypont szerinti alkalmazás, reumatoid arthritisben szenvedő emlősben található szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
51. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, cukorbetegségből eredő szemideghártya-bántalomban szenvedő páciens szemideghártya-szövetébe adható, szemideghártya-angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
52. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, hemangiomába adható gyógyászati készítmény előállítására.
53. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, kemény tumorba vagy kemény tumor metasztázisába adható, tumor-angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
54. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, az 0^3antagonistát mintegy 2 μΜ-tól mintegy 5 mM-ig terjedő koncentrációtartományban tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására.
55. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, intravénásán, transzdermálisan, ízületi nedvbe, intramuszkulárisan vagy orálisan adható gyógyászati készítmény előállítására.
56. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, kemoterápiával kapcsoltan adható gyógyászati készítmény előállítására.
57. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, egyetlen intravénás dózisban beadható gyógyászati készítmény előállítására.
58. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, az apoptózist, beadását követően legalább 48 órán keresztül kiváltó gyógyászati készítmény előállítására.
59. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, szívkoszorúér-plasztikát követő restenosisszal veszélyeztetett szívkoszorúartéria-szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
60. Az 59. igénypont szerinti alkalmazás, érplasztikát követően beadható gyógyászati készítmény előállítására.
61. Az 59. igénypont szerinti alkalmazás, szívkoszorúér-plasztikát követően beadható gyógyászati készítmény előállítására.
62. Az 59. igénypont szerinti alkalmazás, humán páciensben található szövetbe beadható gyógyászati készítmény előállítására.
HU9602541A 1994-03-18 1995-03-09 Eljárások és készítmények angiogenezis gátlására HU221988B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/210,715 US5753230A (en) 1994-03-18 1994-03-18 Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US08/366,665 US5766591A (en) 1994-03-18 1994-12-30 Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
PCT/US1995/003035 WO1995025543A1 (en) 1994-03-18 1995-03-09 Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9602541D0 HU9602541D0 (en) 1996-11-28
HUT76086A HUT76086A (en) 1997-06-30
HU221988B1 true HU221988B1 (hu) 2003-03-28

Family

ID=22783992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9602541A HU221988B1 (hu) 1994-03-18 1995-03-09 Eljárások és készítmények angiogenezis gátlására

Country Status (25)

Country Link
US (7) US5753230A (hu)
EP (3) EP1410807B1 (hu)
JP (2) JP4268222B2 (hu)
KR (1) KR100327081B1 (hu)
CN (1) CN1161152C (hu)
AT (3) ATE534403T1 (hu)
AU (1) AU709645B2 (hu)
CA (1) CA2184493C (hu)
CZ (1) CZ294650B6 (hu)
DE (2) DE69536128D1 (hu)
DK (3) DK0754059T4 (hu)
ES (3) ES2376850T3 (hu)
FI (1) FI121916B (hu)
HK (1) HK1013960A1 (hu)
HU (1) HU221988B1 (hu)
MX (1) MX9604145A (hu)
NO (1) NO322441B1 (hu)
NZ (3) NZ548433A (hu)
PT (2) PT1468695E (hu)
RU (1) RU2162712C2 (hu)
SI (1) SI0754059T2 (hu)
SK (1) SK284586B6 (hu)
UA (1) UA44729C2 (hu)
WO (1) WO1995025543A1 (hu)
ZA (1) ZA952214B (hu)

Families Citing this family (176)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4310643A1 (de) * 1993-04-01 1994-10-06 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
US5753230A (en) * 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US6949511B1 (en) 1994-04-26 2005-09-27 The Children's Medical Center Corporation Methods of inhibiting angiogenesis via increasing in vivo concentrations of kringle region fragments of plasminogen
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5945403A (en) 1997-05-30 1999-08-31 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US6660842B1 (en) 1994-04-28 2003-12-09 Tripep Ab Ligand/receptor specificity exchangers that redirect antibodies to receptors on a pathogen
DE69531187T2 (de) * 1994-12-20 2004-04-22 Merck Patent Gmbh Monoklonaler Antikörper gegen das Alpha-V-Integrin
US6440729B1 (en) * 1995-06-30 2002-08-27 University Of Kansas Medical Center Treating angiogenesis-mediated diseases with the α2 monomer of type IV collagen
US6358735B1 (en) 1995-06-30 2002-03-19 University Of Kansas Medical Center Method for inhibiting angiogenesis and tumors with the isolated NC1 α3 chain monomer of type IV collagen
KR100516322B1 (ko) * 1995-08-14 2005-12-26 더 스크립스 리서치 인스티튜트 αVβ5매개혈관형성의억제를위해유용한조성물
US6028223A (en) 1995-08-30 2000-02-22 G. D. Searle & Co. Meta-guanidine, urea, thiourea or azacyclic amino benzoic acid compounds and derivatives thereof
US6100423A (en) * 1995-08-30 2000-08-08 G. D. Searle & Co. Amino benzenepropanoic acid compounds and derivatives thereof
US5854205A (en) * 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US6346510B1 (en) 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
ATE248912T1 (de) 1995-10-23 2003-09-15 Childrens Medical Center Therapeutische antiangiogenische zusammensetzungen und verfahren
US5854221A (en) * 1996-12-12 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use
WO1998007035A1 (en) * 1996-08-15 1998-02-19 Novartis Ag Assay for quantifying arthritic conditions
GB9708265D0 (en) * 1997-04-24 1997-06-18 Nycomed Imaging As Contrast agents
EP0846702B1 (en) * 1996-12-09 2009-03-11 MERCK PATENT GmbH Soluble recombinant alphaV beta3 adhesion receptor
US6596850B1 (en) 1998-01-30 2003-07-22 Ixsys, Incorporated Anti-αv3β3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
US6590079B2 (en) 1997-01-30 2003-07-08 Ixsys, Incorporated Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
US7112338B2 (en) 1997-03-12 2006-09-26 The Regents Of The University Of California Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels
EP1491632A3 (en) * 1997-03-12 2006-01-04 Smithkline Beecham Corporation Anti-alphavbeta3 humanized monoclonal antibodies
US5994388A (en) * 1997-03-18 1999-11-30 The Children's Medical Center Corporation Cytochalasin and isoindolinone derivatives as inhibitors of angiogenesis
AU6569198A (en) * 1997-03-19 1998-10-12 Lucid Technologies, Inc. Cellular surgery utilizing confocal microscopy
US6193968B1 (en) * 1997-04-11 2001-02-27 The Burnham Institute Methods for using anti-αvβ3 integrin antibody
CA2284726A1 (en) * 1997-04-11 1998-10-22 G.D. Searle & Co. Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies
US6596276B1 (en) * 1997-09-30 2003-07-22 Beth Israel Deaconess Medical Center Method for inhibiting tumor angiogenesis in a living subject
US6372719B1 (en) * 1998-03-04 2002-04-16 Jay Cunningham ανβ3 integrin antagonists in combination with chemotherapeutic agents
US6172256B1 (en) * 1998-03-04 2001-01-09 G.D. Searle & Co. Chiral-β-amino acid compounds and derivatives thereof
US6524553B2 (en) * 1998-03-31 2003-02-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Quinolone vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6537520B1 (en) 1998-03-31 2003-03-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders
ATE295369T1 (de) 1998-03-31 2005-05-15 Bristol Myers Squibb Pharma Co Pharmazeutika zur bildgebung der angiogenischen krankheiten
US6548663B1 (en) 1998-03-31 2003-04-15 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Benzodiazepine vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6852318B1 (en) * 1998-05-08 2005-02-08 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and inhibiting angiogenesis
US6962974B1 (en) 1998-06-17 2005-11-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US7387779B2 (en) 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US6759047B1 (en) * 1998-06-17 2004-07-06 Beth Israel Deaconess Hospital Corp. Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof
WO2000002584A2 (en) 1998-07-13 2000-01-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids
RU2167425C2 (ru) * 1998-07-17 2001-05-20 Малышев Игорь Юрьевич Способ определения белков
US6164281A (en) * 1998-07-20 2000-12-26 Zhao; Iris Ginron Method of making and/or treating diseases characterized by neovascularization
WO2000009143A1 (en) * 1998-08-13 2000-02-24 G.D. Searle & Co. Multivalent avb3 and metastasis-associated receptor ligands
US6979697B1 (en) * 1998-08-21 2005-12-27 Point Therapeutics, Inc. Regulation of substrate activity
US6703050B1 (en) * 1998-09-04 2004-03-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the prevention or treatment of cancer
US6537554B1 (en) 1998-09-10 2003-03-25 Curagen Corporation Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis
US7176289B1 (en) * 1998-09-11 2007-02-13 Vanderbilt University Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis
US6248327B1 (en) 1998-09-11 2001-06-19 Vanderbilt University Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis
US6235877B1 (en) * 1999-08-04 2001-05-22 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Peptido-mimetic compounds containing RGD sequence useful as integrin inhibitors
US20030202977A1 (en) * 1998-11-16 2003-10-30 New York University Treatment of osteoarthritis
AU766077C (en) * 1998-11-20 2004-10-07 Genentech Inc. Uses for Eph receptor antagonists and agonists to treat vascular disorders
US6339062B1 (en) * 1998-11-23 2002-01-15 Inkine Pharmaceutical Company, Inc. Retroinverso polypeptides that mimic or inhibit thrombospondin activity
US6160099A (en) * 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
US6569402B1 (en) * 1998-12-18 2003-05-27 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
NZ511677A (en) 1998-12-18 2003-10-31 Du Pont Pharm Co Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6794518B1 (en) 1998-12-18 2004-09-21 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
TR200101757T2 (tr) 1998-12-18 2001-12-21 Dupont Pharmaceuticais Company Vitronektin reseptör antagonisti farmasötikler
US6511649B1 (en) * 1998-12-18 2003-01-28 Thomas D. Harris Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
KR20010109275A (ko) * 1998-12-23 2001-12-08 로저 에이. 윌리암스 종양치료의 병용치료로서 사이클로옥시게나제-2 억제제와기질 금속단백분해효소 억제제를 사용하는 방법
US20050281821A1 (en) * 1999-01-06 2005-12-22 Flavia Pernasetti Method and composition for angiogenesis inhibition
US6521593B1 (en) * 1999-02-01 2003-02-18 Childrens Hospital Los Angeles Methods for inhibiting brain tumor growth
AU776790B2 (en) * 1999-02-12 2004-09-23 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Methods for treatment of tumors and metastases using a combination of anti-angiogenic and immuno therapies
AU4187200A (en) * 1999-04-01 2000-10-23 Biostratum, Inc. The use of domains of type iv collagen t inhibit angiogenesis an tumour growth
WO2000067771A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 The Burnham Institute Antiangiogenic endostatin peptides, endostatin variants and methods of use
US6890904B1 (en) * 1999-05-25 2005-05-10 Point Therapeutics, Inc. Anti-tumor agents
US6531580B1 (en) * 1999-06-24 2003-03-11 Ixsys, Inc. Anti-αvβ3 recombinant human antibodies and nucleic acids encoding same
US6685914B1 (en) * 1999-09-13 2004-02-03 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Macrocyclic chelants for metallopharmaceuticals
US20080038274A1 (en) * 1999-09-23 2008-02-14 Foster Keith A Inhibition of secretion from non-neuronal cells
CN1399554A (zh) * 1999-09-23 2003-02-26 斯克里普斯研究学院 抑制粘连形成的方法和组合物
ATE363290T1 (de) * 1999-10-04 2007-06-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Cd40 antagonist zur behandlung von psoriasis
PL356815A1 (en) 1999-12-22 2004-07-12 The Scripps Research Institute Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors
US7740841B1 (en) * 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
KR100767000B1 (ko) 2000-02-03 2007-10-15 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 인테그린 발현 저해제
US7361643B2 (en) 2000-02-09 2008-04-22 University Of Puerto Rico Methods for inhibiting angiogenesis
WO2001058931A1 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Duke University Method of treating disorders of the eye
US6573096B1 (en) * 2000-04-01 2003-06-03 The Research Foundation At State University Of New York Compositions and methods for inhibition of cancer invasion and angiogenesis
US6835806B2 (en) 2000-04-03 2004-12-28 Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Cell growth regulation system
PT1272507E (pt) 2000-04-12 2005-11-30 Amersham Health As Derivados de peptidos para ligacao a integrina
US10293056B1 (en) * 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US7288390B2 (en) * 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US20030104573A1 (en) * 2000-09-11 2003-06-05 Shimkets Richard A. Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis
NO20004795D0 (no) 2000-09-26 2000-09-26 Nycomed Imaging As Peptidbaserte forbindelser
AU1182402A (en) * 2000-10-02 2002-04-15 Scripps Research Inst Methods and compositions for enhancing angiogenesis
US6632835B2 (en) 2001-02-22 2003-10-14 Nanodesign Inc. Dibenzo[c]chromen-6-one derivatives as anti-cancer agents
DE10109136A1 (de) * 2001-02-26 2002-09-12 Cytotools Gmbh Mittel, die die Apoptose bei an der Wundheilung beteiligten Zellen inhibieren
EP1372720A4 (en) * 2001-03-02 2006-07-26 Medimmune Inc PREVENTING OR TREATING INFLAMMATORY OR AUTOIMMUNE DISORDERS BY ADMINISTERING ANTAGONISTS OF INTEGRIN ALPHA V BETA 3
PL363311A1 (en) 2001-04-24 2004-11-15 Merck Patent Gmbh Combination therapy using anti-angiogenic agents and tnfalpha
SE0101854L (sv) * 2001-05-28 2002-11-29 Bioneris Ab Användning av en förening med en negativt laddad region av grupper för behandling av restenos.
US7829087B2 (en) * 2001-07-09 2010-11-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cognitive impairment
CA2453403C (en) * 2001-07-09 2013-10-08 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting amyloid toxicity
MXPA04000173A (es) 2001-07-10 2004-03-18 Amersham Health As Compuestos basados en peptidos.
WO2003012122A2 (en) * 2001-07-27 2003-02-13 University Of Kansas Medical Center Crystallized structure of type iv collagen nc1 domain hexamer
US20060014697A1 (en) * 2001-08-22 2006-01-19 Travis Mickle Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse
EP1434584A2 (en) * 2001-09-05 2004-07-07 Minerva Biotechnologies Corporation Compositions and methods of treatment of cancer
CN100560131C (zh) 2001-10-22 2009-11-18 斯克里普斯研究学院 抗体靶向化合物
PL371281A1 (en) * 2002-02-14 2005-06-13 Merck Patent Gmbh Methods and compositions for the treatment of eye diseases
AU2002306251A1 (en) * 2002-02-15 2003-09-04 Richard Brunner 7s immunoglobulin for treatment of choroidal neovascularisation_
CA2478317A1 (en) * 2002-03-04 2003-09-18 Medimmune, Inc. Methods of preventing or treating disorders by administering an integrin .alpha.v.beta.3 antagonist in combination with an hmg-coa reductase inhibitor or a bisphosphonate
EP1487492A4 (en) * 2002-03-04 2008-10-01 Medimmune Inc PREVENTION OR TREATMENT OF CANCER USING INTEGRIN ALPHAVBETA3 ANTAGONISTS COMBINED WITH OTHER AGENTS
CA2481747A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Medimmune, Inc. Recombinant anti-interleukin-9 antibodies
NZ596825A (en) 2002-07-15 2013-06-28 Univ Texas Duramycin peptides and their use in imaging
GB0217018D0 (en) * 2002-07-23 2002-08-28 Bioacta Ltd Peptide 1
MXPA05000875A (es) * 2002-07-23 2005-09-30 Univ Michigan Tetratiomolibdato de tetrapropilamonio y compuestos relacionados para terapias anti-angiogenicas.
US7411048B2 (en) 2002-11-19 2008-08-12 Drg International, Inc. Diagnostic method for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids
AU2003295644A1 (en) 2002-11-19 2004-07-22 Drg International, Inc. Diagnostic method for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids and therapeutic uses therefor
US8017737B2 (en) * 2002-11-19 2011-09-13 Hasan Kulaksiz Diagnostic methods for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids; monoclonal antibodies specific to human hepcidin and associated uses therefor
US20040176272A1 (en) * 2003-01-30 2004-09-09 Medimmune, Inc. Uses of integrin alphavbeta3 antagonists
US20040208869A1 (en) * 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Uses of anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
KR20050099536A (ko) 2003-02-06 2005-10-13 트리펩 아베 글리코실화된 특이성 교환체
US7335359B2 (en) * 2003-02-06 2008-02-26 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers
EP1613273B1 (en) * 2003-04-11 2012-06-13 MedImmune, LLC Recombinant il-9 antibodies and uses thereof
WO2004092379A2 (en) * 2003-04-18 2004-10-28 The University Of British Columbia Method for treatment of angiogenic disorders
CA2525969A1 (en) * 2003-05-16 2005-02-24 Receptor Biologix, Inc. Intron fusion proteins, and methods of identifying and using same
US7605235B2 (en) 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
US9708410B2 (en) 2003-05-30 2017-07-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
CA2527621A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-23 Centocor, Inc. Method of inhibiting tumor growth with anti-tissue factor antibodies
WO2004113361A2 (en) * 2003-06-20 2004-12-29 The Regents Of The University Of California Novel prokineticin receptor isoforms and methods of use
JP2007512347A (ja) * 2003-11-26 2007-05-17 デューク・ユニバーシティー 緑内障を予防するかまたは治療する方法
CN102258503B (zh) 2004-01-22 2019-08-16 迈阿密大学 局部辅酶q10制剂及其使用方法
US7271245B2 (en) * 2004-02-13 2007-09-18 The Scripps Research Institute Methods and compositions for inhibition of metastasis
AU2005215017A1 (en) * 2004-02-17 2005-09-01 Cancervax Corporation Method and composition for angiogenesis inhibition
US7351739B2 (en) * 2004-04-30 2008-04-01 Wellgen, Inc. Bioactive compounds and methods of uses thereof
ES2343424T3 (es) * 2004-05-07 2010-07-30 The University Of North Carolina At Chapel Hill Procedimiento para potenciar o inhibir el factor de crecimiento 1 similar a la insulina.
US8187595B2 (en) 2004-05-07 2012-05-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-I
AU2005245896A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Receptor Biologix, Inc. Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
ES2382661T3 (es) 2004-06-04 2012-06-12 The Scripps Research Institute Composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades neovasculares
WO2006012415A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Rage protein derivatives
WO2006017619A2 (en) * 2004-08-06 2006-02-16 The Regents Of The University Of California Receptor-binding cyclic peptides and methods of use
US20060040325A1 (en) * 2004-08-16 2006-02-23 Medimmune, Inc. Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytoxicity activity
EP1809326A4 (en) 2004-10-27 2009-11-04 Medimmune Inc MODULATION OF ANTIBODY SPECIFICITY BY MEASURING ADAPTATION OF ITS AFFINITY TO AN APPARENT ANTIGEN
KR100679100B1 (ko) * 2004-10-29 2007-02-06 엘지.필립스 엘시디 주식회사 수평 전계 인가형 액정 표시 패널 및 그 제조방법
EP1831254B1 (en) * 2004-12-23 2012-06-06 Molmed SpA Conjugation product
WO2006111925A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Inhibition of tumorigenesis by inhibition of a6b4 integrin
US20090170769A1 (en) * 2005-05-13 2009-07-02 Pei Jin Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
US20060286148A1 (en) * 2005-05-18 2006-12-21 Ppd, Inc. Method of forming implants
EP2364998A1 (en) 2005-06-16 2011-09-14 The Feinstein Institute for Medical Research Antibodies against HMGB1 and fragments thereof
WO2007002543A2 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Medimmune, Inc. Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles
EP1928497A2 (en) * 2005-08-24 2008-06-11 Cell-Matrix, Inc. Combination therapies for inhibiting integrin-extracellular matrix interactions
JP2009523813A (ja) 2006-01-18 2009-06-25 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 癌を治療するためにインテグリンのリガンドを使用する特異的な治療法
EP2243488B1 (en) 2006-01-19 2013-08-14 Eyegene Inc. Pharmaceutical composition for treating vascular-related diseases comprising peptide
US20100055093A1 (en) * 2006-06-12 2010-03-04 Receptor Biologix Inc. Pan-cell surface receptor-specific therapeutics
WO2008008373A2 (en) 2006-07-11 2008-01-17 Arubor Corp Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors
CA3177366A1 (en) 2006-08-10 2008-02-21 Roy C. Levitt Localized therapy of lower airways inflammatory disorders with proinflammatory cytokine inhibitors
WO2008045252A2 (en) 2006-10-04 2008-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered integrin binding peptides
EA017864B1 (ru) 2007-01-18 2013-03-29 Мерк Патент Гмбх Специфическая терапия и лекарственное средство на основе интегриновых лигандов для лечения рака
DK2025685T3 (da) * 2007-08-15 2013-09-02 Canadian Blood Services Monoklonale antistoffer mod BETA3-integriner.
MX2010003757A (es) * 2007-10-16 2010-04-27 Symphogen As Composiciones que comprenden multimeros optimizados de her1 y her3 y sus metodos de uso.
EP2219672B1 (en) 2007-11-09 2016-02-17 Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf antibody compositions and methods
WO2009137807A2 (en) 2008-05-08 2009-11-12 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
AU2009274512A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 The Regents Of The University Of Colorado Clip inhibitors and methods of modulating immune function
WO2010051531A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 University Of Louisville Reserch Foundation, Inc. Olfactory epithelial-derived stem cells and methods of use therefor
US20110256055A1 (en) 2008-12-23 2011-10-20 Ge Healthcare Limited Application of 99mtc peptide-based compound as a bone marrow imaging agent
US8518927B2 (en) 2009-02-10 2013-08-27 The Scripps Research Institute Chemically programmed vaccination
SG176103A1 (en) 2009-05-25 2011-12-29 Merck Patent Gmbh Continuous administration of cilengitide in cancer treatments
FR2949782B1 (fr) * 2009-09-04 2015-10-16 Isp Investments Inc Peptide activateur de la transglutaminase et composition cosmetique ou pharmaceutique le contenant.
US8778888B2 (en) * 2009-11-06 2014-07-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cystine knot peptides binding to alpha IIb beta 3 integrins and methods of use
CA2805338A1 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Merck Patent Gmbh Peptide for use in the treatment of breast cancer and/or bone metastases
PT2672994T (pt) 2011-02-11 2018-10-22 Merck Patent Gmbh Anticorpo anti-integrina alfa-v para o tratamento do cancro da próstata
US8722044B2 (en) 2011-03-15 2014-05-13 Janssen Biotech, Inc. Human tissue factor antibody and uses thereof
RU2531502C2 (ru) * 2011-08-09 2014-10-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани
RU2481115C1 (ru) * 2011-10-13 2013-05-10 Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Объединение "Тюменькриобанк" Средство для заживления ран "целльгель", способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством
US9775803B2 (en) 2011-10-19 2017-10-03 Samsung Electronics Co., Ltd. Liposome comprising elastin-like polypeptide and tumor cell targeting material and use thereof
US20140350087A9 (en) 2012-03-22 2014-11-27 Halozyme, Inc. Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use
KR20150041619A (ko) * 2012-06-07 2015-04-16 디씨비-유에스에이 엘엘씨 변형된 피브로넥틴 단편 또는 이의 변이체 및 용도
EP2890716A4 (en) 2012-08-31 2016-06-08 Univ North Carolina MONOCLONAL ANTIBODIES INCREASING OR INHIBITING INSULIN-1 GROWTH FACTOR (IGF-1)
US9587001B2 (en) 2012-10-19 2017-03-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Conjugated knottin mini-proteins containing non-natural amino acids
WO2014087429A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Council Of Scientific & Industrial Research Histidinylated cationic amphiphiles, process for preparation thereof and their liposomal formulation
CN118028463A (zh) * 2013-03-14 2024-05-14 儿童医学中心公司 Cd36鉴定癌症对象以用于治疗的用途
US20190144547A1 (en) 2015-11-23 2019-05-16 Merck Patent Gmbh Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of fibrosis and/or fibrotic disorders
US10786471B2 (en) 2017-02-06 2020-09-29 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to glutaminase inhibitors
WO2018183894A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3-positive cancer stem cells (cscs) and treating drug resistant cancers
KR102171433B1 (ko) * 2018-05-25 2020-11-02 고려대학교 산학협력단 조직 재생을 위한 Substance P 펩타이드가 고정된 피브린 젤 및 이의 제조방법
US20220133913A1 (en) * 2019-07-24 2022-05-05 Korea Basic Science Institute SINGLE DOMAIN ANTIBODY TARGETING aVB3 INTEGRIN
EP4007579A4 (en) * 2019-08-02 2023-08-09 The Regents of the University of California COMPOSITIONS AND METHODS FOR TARGETING AND DESTRUCTING ALPHA-V BETA-3-POSITIVE CANCER STEM CELLS (CSC) AND TREATING DRUG-RESISTANT AND METASTATIC CANCERS
WO2022047243A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Enosi Life Sciences Corp. Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5092885A (en) * 1987-02-12 1992-03-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Peptides with laminin activity
WO1989005155A1 (en) * 1987-11-19 1989-06-15 Scripps Clinic And Research Foundation Monoclonal antibody against the rgd-directed adhesion receptor of endothelial cells
JPH01169343A (ja) 1987-12-25 1989-07-04 Nippon Sheet Glass Co Ltd ガラス板の切口欠点検出装置
GR1000597B (el) * 1988-01-19 1992-08-26 Judah Moses Folkman Παραγοντας αναστολης αναπτυξης και χρηση του.
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US5575815A (en) 1988-08-24 1996-11-19 Endoluminal Therapeutics, Inc. Local polymeric gel therapy
IE901736L (en) * 1989-05-17 1990-11-17 Fuller H B Licensing Financ Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion
US5770564A (en) 1989-06-16 1998-06-23 Cor Therapeutics, Inc. Platelet aggregation inhibitors
US5112946A (en) * 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5262520A (en) * 1989-12-01 1993-11-16 The Scripps Research Institute Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding
US5192744A (en) * 1990-01-12 1993-03-09 Northwestern University Method of inhibiting angiogenesis of tumors
EP0470569B1 (en) * 1990-08-08 1995-11-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Intravascular embolizing agent containing angiogenesis inhibiting substance
CA2048078A1 (en) * 1990-11-15 1992-05-16 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates
WO1992022653A1 (en) * 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ATE175241T1 (de) * 1992-04-03 1999-01-15 Genentech Inc Antikörper gegen alpha v beta 3 integrin
SK57693A3 (en) * 1992-06-18 1994-07-06 Merck Patent Gmbh Linear peptides and pharmaceutical agents on their base
UA43823C2 (uk) 1992-07-06 2002-01-15 Мерк Патент Геселлшафт Міт Бесшренктер Хафтунг ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ІНГІБУВАННЯ ІНТЕГРИН <font face="Symbol">a</font><sub>V</sub><font face="Symbol">b</font><sub>3</sub>-ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ КЛІТИННОЇ АДГЕЗІЇ КЛІТИН ССАВЦІВ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ЗАХВОРЮВАННЯ, АСОЦІЙОВАНОГО З ПОРУШЕННЯМ АДГЕЗІЇ КЛІТИН, СПОСІБ БЛОКУВАННЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ ФІБРИНОГЕНОМ ІНТЕГРИНУ, КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ЗАГОЄННЯ РАН
ATE250138T1 (de) 1992-10-29 2003-10-15 Univ Australian Angiogenese-inhibierende antikörper
US6955900B1 (en) * 1993-02-02 2005-10-18 The Scripps Research Institute Methods for producing polypeptide binding sites, monoclonal antibodies and compositions thereof
DE4310643A1 (de) 1993-04-01 1994-10-06 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
NZ502819A (en) † 1993-11-05 2002-09-27 Centocor Inc Inhibiting stenosis and/or restenosis using for platelets and a human constant region
US5981478A (en) 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5753230A (en) * 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US5770565A (en) 1994-04-13 1998-06-23 La Jolla Cancer Research Center Peptides for reducing or inhibiting bone resorption
DE19534177A1 (de) 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
DE19538741A1 (de) 1995-10-18 1997-04-24 Merck Patent Gmbh Cyclopeptidderivate

Also Published As

Publication number Publication date
US5766591A (en) 1998-06-16
ES2211901T5 (es) 2011-12-12
US20050002936A1 (en) 2005-01-06
US7354586B2 (en) 2008-04-08
ATE534403T1 (de) 2011-12-15
FI121916B (fi) 2011-06-15
NO322441B1 (no) 2006-10-09
NO963894D0 (no) 1996-09-17
AU1995295A (en) 1995-10-09
EP0754059A4 (en) 1997-07-30
CN1161152C (zh) 2004-08-11
DK1468695T3 (da) 2012-02-27
MX9604145A (es) 1998-05-31
DE69532279D1 (de) 2004-01-22
NZ283022A (en) 2001-05-25
DE69532279T2 (de) 2004-09-16
US20080175840A1 (en) 2008-07-24
EP0754059B2 (en) 2011-08-24
US7329406B2 (en) 2008-02-12
WO1995025543A1 (en) 1995-09-28
UA44729C2 (uk) 2002-03-15
EP0754059A1 (en) 1997-01-22
ATE490784T1 (de) 2010-12-15
EP1468695A1 (en) 2004-10-20
CZ271196A3 (cs) 1998-01-14
JPH10500398A (ja) 1998-01-13
CZ294650B6 (cs) 2005-02-16
HUT76086A (en) 1997-06-30
SK284586B6 (sk) 2005-07-01
ES2355074T3 (es) 2011-03-22
EP0754059B1 (en) 2003-12-10
CA2184493C (en) 2010-05-11
EP1410807A1 (en) 2004-04-21
US7482007B2 (en) 2009-01-27
JP2006273862A (ja) 2006-10-12
SI0754059T1 (en) 2004-06-30
US5753230A (en) 1998-05-19
ES2376850T3 (es) 2012-03-20
ZA952214B (en) 1996-02-08
NZ511293A (en) 2005-06-24
FI963692A (fi) 1996-09-18
NO963894L (no) 1996-11-18
FI963692A0 (fi) 1996-09-18
SK119096A3 (en) 1997-07-09
US6887473B1 (en) 2005-05-03
CN1151120A (zh) 1997-06-04
KR970701564A (ko) 1997-04-12
EP1410807B1 (en) 2010-12-08
DK1410807T3 (da) 2011-03-07
ES2211901T3 (es) 2004-07-16
KR100327081B1 (ko) 2002-10-18
HU9602541D0 (en) 1996-11-28
DE69532279T3 (de) 2011-11-17
DK0754059T3 (da) 2004-04-13
JP4268222B2 (ja) 2009-05-27
NZ548433A (en) 2008-04-30
DK0754059T4 (da) 2011-09-19
RU2162712C2 (ru) 2001-02-10
CA2184493A1 (en) 1995-09-28
DE69536128D1 (de) 2011-01-20
PT1468695E (pt) 2012-02-09
US20040258691A1 (en) 2004-12-23
EP1468695B1 (en) 2011-11-23
HK1013960A1 (en) 1999-09-17
SI0754059T2 (sl) 2011-12-30
JP4758281B2 (ja) 2011-08-24
ATE255907T1 (de) 2003-12-15
US20040265317A1 (en) 2004-12-30
PT754059E (pt) 2004-04-30
AU709645B2 (en) 1999-09-02
US7595051B2 (en) 2009-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4268222B2 (ja) 脈管形成の抑制に有用な方法および組成物
US6500924B1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
CA2256543C (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
JP4903921B2 (ja) αＶβ５仲介血管形成の阻止に有効な方法及び組成物
US7053041B1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of αvβ5mediated angiogenesis
US20030176334A1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20030204

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees