HU221988B1 - Eljárások és készítmények angiogenezis gátlására - Google Patents
Eljárások és készítmények angiogenezis gátlására Download PDFInfo
- Publication number
- HU221988B1 HU221988B1 HU9602541A HU9602541A HU221988B1 HU 221988 B1 HU221988 B1 HU 221988B1 HU 9602541 A HU9602541 A HU 9602541A HU 9602541 A HU9602541 A HU 9602541A HU 221988 B1 HU221988 B1 HU 221988B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- preparation
- angiogenesis
- use according
- tissue
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 91
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 30
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 title description 22
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 181
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 105
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 226
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 207
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 135
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 104
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 104
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 89
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 62
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 58
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 55
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 45
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 36
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 33
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 33
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 33
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 25
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 claims description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 23
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 19
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 19
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 18
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 claims description 8
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 6
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 6
- HGFOOLONGOBCMP-IBGZPJMESA-N (3s)-3-(6-methoxypyridin-3-yl)-3-[2-oxo-3-[3-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)propyl]imidazolidin-1-yl]propanoic acid Chemical compound C1=NC(OC)=CC=C1[C@H](CC(O)=O)N1C(=O)N(CCCC=2N=C3NCCCC3=CC=2)CC1 HGFOOLONGOBCMP-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 claims description 4
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 claims description 4
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 claims description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 9
- VFRSADQPWYCXDG-LEUCUCNGSA-N ethyl (2s,5s)-5-methylpyrrolidine-2-carboxylate;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.CCOC(=O)[C@@H]1CC[C@H](C)N1 VFRSADQPWYCXDG-LEUCUCNGSA-N 0.000 claims 3
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 claims 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 206010054827 Peritoneal lesion Diseases 0.000 claims 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims 1
- 101500027988 Mus musculus ADGRV1 subunit beta Proteins 0.000 abstract 1
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 165
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 134
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 125
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 105
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 87
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 87
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 86
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 74
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 59
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 52
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 47
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 44
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 44
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 37
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 37
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 35
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 35
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 30
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 27
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 27
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 25
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 24
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 24
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 20
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 20
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 15
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 15
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 14
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 14
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 12
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 11
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 10
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 10
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical class OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 8
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 8
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 8
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 108010045325 cyclic arginine-glycine-aspartic acid peptide Proteins 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 7
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 7
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 6
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 6
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 6
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 6
- LAWVRGYBVSVDED-JYJNAYRXSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-phenylethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LAWVRGYBVSVDED-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 5
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 5
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108010048673 Vitronectin Receptors Proteins 0.000 description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- -1 acetic Chemical class 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 5
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 5
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ARNGIGOPGOEJCH-KKUMJFAQSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-phenylethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ARNGIGOPGOEJCH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 3
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 3
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 108010057412 arginyl-glycyl-aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 3
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 125000004492 methyl ester group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 3
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 3
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- GPPIDDWYKJPRES-YDHLFZDLSA-N Asp-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GPPIDDWYKJPRES-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010048623 Collagen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 125000002038 D-arginyl group Chemical group N[C@@H](C(=O)*)CCCNC(=N)N 0.000 description 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100025305 Integrin alpha-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108010000851 Laminin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000219739 Lens Species 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 229940012466 egg shell membrane Drugs 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004959 laryngeal benign neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 2
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 2
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N thiocyanic acid Chemical compound SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 2
- OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N (2s)-2-azanyl-5-[bis(azanyl)methylideneamino]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- RGNVSYKVCGAEHK-GUBZILKMSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RGNVSYKVCGAEHK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPYXQYWILNVAU-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 DFPYXQYWILNVAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFFMLCVRJBZUDZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbutane Chemical group CC(C)C(C)C ZFFMLCVRJBZUDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYQUWEHEBOMRPH-RYLXDESZSA-N 2-[(2S,5S,8R,11S)-5-benzyl-11-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-3,6,9,12,15-pentaoxo-8-propan-2-yl-1,4,7,10,13-pentazacyclopentadec-2-yl]acetic acid Chemical compound CC(C)[C@H]1NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC1=O YYQUWEHEBOMRPH-RYLXDESZSA-N 0.000 description 1
- OJOVBVONXDWCFW-CBHOWOPOSA-N 2-[(2s,5r,8s,11s,14s)-5-benzyl-11-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-14-methyl-3,6,9,12,15-pentaoxo-8-propan-2-yl-1,4,7,10,13-pentazacyclopentadec-2-yl]acetic acid Chemical compound N1C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1CC1=CC=CC=C1 OJOVBVONXDWCFW-CBHOWOPOSA-N 0.000 description 1
- YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 2-azanyl-3-sulfanyl-propanoic acid Chemical compound SCC(N)C(O)=O.SCC(N)C(O)=O YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USNSOPDIZILSJP-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O USNSOPDIZILSJP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UWFOMGUWGPRVBW-GUBZILKMSA-N Asn-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC(=O)N)N UWFOMGUWGPRVBW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N Asp-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SFJUYBCDQBAYAJ-YDHLFZDLSA-N Asp-Val-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SFJUYBCDQBAYAJ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000645291 Bos taurus Metalloproteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241001433879 Camarea Species 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N Cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N 0.000 description 1
- 229940122097 Collagenase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- VVNCNSJFMMFHPL-VKHMYHEASA-N D-penicillamine Chemical compound CC(C)(S)[C@@H](N)C(O)=O VVNCNSJFMMFHPL-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- ISXJHXGYMJKXOI-GUBZILKMSA-N Glu-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ISXJHXGYMJKXOI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JPXNYFOHTHSREU-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CN JPXNYFOHTHSREU-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010050006 Gly-Asp-Gly-Arg Proteins 0.000 description 1
- KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N Gly-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 1
- 108060004056 Integrin alpha Chain Proteins 0.000 description 1
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 241001580017 Jana Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- 102000002297 Laminin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000699696 Meriones Species 0.000 description 1
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- XEQLGWAGMYUVTR-UHFFFAOYSA-N O=C1NC=NC2=C1NC=N2.C1=CN=C2C(=O)NC(NN)=NC2=N1 Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.C1=CN=C2C(=O)NC(NN)=NC2=N1 XEQLGWAGMYUVTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077077 Osteonectin Proteins 0.000 description 1
- 102000009890 Osteonectin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710184612 Protein slit Proteins 0.000 description 1
- 101000781681 Protobothrops flavoviridis Disintegrin triflavin Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- ZUUDNCOCILSYAM-KKHAAJSZSA-N Thr-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZUUDNCOCILSYAM-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- 102220514960 Vacuolar protein sorting-associated protein 4B_A15D_mutation Human genes 0.000 description 1
- MNSSBIHFEUUXNW-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N MNSSBIHFEUUXNW-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- ZHWZDZFWBXWPDW-GUBZILKMSA-N Val-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O ZHWZDZFWBXWPDW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010047141 Vasodilatation Diseases 0.000 description 1
- JOOSFXXMIOXKAZ-UHFFFAOYSA-H [Au+3].[Au+3].[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O Chemical compound [Au+3].[Au+3].[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O JOOSFXXMIOXKAZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CNC=N1 Chemical compound [N].C1=CNC=N1 GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 230000000964 angiostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 108010091818 arginyl-glycyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940087373 calcium oxide Drugs 0.000 description 1
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 125000002668 chloroacetyl group Chemical group ClCC(=O)* 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 235000013985 cinnamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930016911 cinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- 239000002442 collagenase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical compound C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010083321 cyclic(arginyl-alanyl-aspartyl-phenylalanyl-valyl) Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 230000000437 effect on angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002169 ethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004887 ferric hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010037389 glutamyl-cysteinyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010034892 glycyl-arginyl-glycyl-aspartyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 208000014617 hemorrhoid Diseases 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 102000017777 integrin alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M iron(3+);oxygen(2-);hydroxide Chemical compound [OH-].[O-2].[Fe+3] IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N methyl p-hydroxycinnamate Natural products OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1 PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000023578 negative regulation of cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 239000012053 oil suspension Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 235000010603 pastilles Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000002683 reaction inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 230000021419 recognition of apoptotic cell Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000004276 retinal vascularization Effects 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- ODCWYMIRDDJXKW-UHFFFAOYSA-N simazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NCC)=N1 ODCWYMIRDDJXKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004206 stomach function Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A sucralfate Chemical compound O[Al](O)OS(=O)(=O)O[C@@H]1[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H]1O[C@@]1(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)O1 MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A 0.000 description 1
- 229960004291 sucralfate Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMUKCGUDVKEQPL-UHFFFAOYSA-K triiodoindigane Chemical compound I[In](I)I RMUKCGUDVKEQPL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N valinyl-arginine Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 230000009790 vascular invasion Effects 0.000 description 1
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical class C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70546—Integrin superfamily
- C07K14/70557—Integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Mycology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát olyan eljárások és készítmények képezik, amelyek –az ?v?3-vitronektin-receptor antagonistáinak alkalmazásával – szövetekangiogenezisének gátlására alkalmazhatók. A találmány tárgyát képezitovábbá egy eljárás kialakult tumor visszafejlesztésére, továbbáeljárás apoptózis indukálására egy szövetben kialakult újérhálózatban. ŕ
Description
A találmány szerinti megoldás a gyógyászat tárgykörébe tartozik. A találmány tárgyát olyan eljárások és készítmények képezik, amelyek - az avP3-vitronektin-receptor antagonistáinak alkalmazásával - szövetek angiogenezisének gátlására alkalmazhatók. A találmány 5 tárgyát képezi továbbá egy eljárás kialakult tumor visszafejlesztésére, továbbá eljárás apoptózis redukálására egy szövetben kialakult új érhálózatban.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazha- , tó új erek nemkívánatos (például gyulladásos szövetek- 10 ben, tumorokban vagy metasztázisokban történő) képződésének gátlására, a tumomövekedés gátlására, metasztázisok kialakulásának gátlására, kialakult tumorok visszafejlesztésére, valamint - szívkoszorúér-plasztikai műtét után előforduló - restenosis gátlására. 15
Az integrinek a celluláris receptorok olyan csoportját képviselik, amelyekről ismert, hogy az extracelluláris sejtközi állomány proteinjeihez kötődnek, így „sejtsejt” és „sejt-sejtközi állomány” kölcsönhatásokat közvetítenek, melyeket általánosan sejtadhéziós esemé- 20 nyéknek nevezünk. Annak ellenére, hogy a szakirodalomban számos integrint és integrinkötő ligandumot leírtak, sok integrál biológiai funkciója tisztázatlan. Az integrinreceptorok olyan proteinek, melyeknek közös szerkezeti jellemzőjük, hogy - a- és β-alegységeket 25 tartalmazó - heterodimer glikoprotein-komplexekből állnak.
Ismeretes, hogy a vitronektin-receptor elnevezés amely e receptorok azon eredeti tulajdonságából származik, hogy elsősorban a vitronektinhez kötődnek - há- 30 rom különböző integrinre vonatkozik, nevezetesen az a^j-integrinre, az a^3-integrinre és az avp5-integrinre [Horton: Int. J. Exp. Pathol. 71, 741 (1990)]. Az οΐγβι a fibronektint és a vitronektint köti meg. Az ανβ3 különböző ligandumokat köt meg, köztük a fibrint, fib- 35 rinogént, laminint, trombospondint, vitronektint, „von Willebrand”-faktort, osteospontint és a csont-szialoprotein-I-et. Az ανβ5 csak a vitronektinhez kötődik. E három integrál - különböző szövetek celluláris kölcsönhatásaiban játszott - specifikus sejtadhéziós szerepe je- 40 lenleg is kutatás tárgyát képezi, de világos, hogy a különböző integrinek különböző biológiai funkciókat töltenek be.
Sok integrál ligandumában az egyik lényeges felismerési helyet az arginin-glicin-aszparaginsav (RGD) 45 tripeptid-szekvencia képezi. Az RGD a vitronektin-receptorintegrinek fentebb említett valamennyi ligandumában megtalálható. Ez az RGD felismerési hely olyan polipeptidekkel („peptidekkel”) utánozható, amelyek RGD-szekvenciát tartalmaznak. Az ilyen RGD- 50 peptidek az integrinműködés ismert inhibitorai. Lényeges, hogy a gátlás specifitása - az RGD-peptid szekvenciájától és szerkezetétől függően - specifikus integrinek megcélzása érdekében módosítható.
Az RGD felismerési hely leírását illetően lásd 55 Pierschbacher és munkatársai: Natúré 309, 30 (1984); és Pierschbacher és munkatársai: Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81, 5985 (1984). Különböző, eltérő integrinspecifitású RGD-polipeptideket mások is leírtak [lásd Grant és munkatársai: Cell 58, 933 (1989); Che- 60 resh és munkatársai: Cell 58, 945 (1989); Aumailley és munkatársai: FEBS Letts. 291, 50 (1991); Pfaff és munkatársai: J. Bioi. Chem. 269, 20233 (1994); valamint a 4,517,686; 4,578,079; 4,589,881; 4,614,517; 4,661,111; 4,792,525; 4,683,291; 4,879,237; 4,988,621; 5,041,380 és 5,061,693 számú egyesült államokbeli közzétételi iratok].
Az angiogenezis a szövet véredényképzési folyamata, melynek során a szövetbe újonnan kialakuló vérerek hatolnak be. Ezt a folyamatot „neovascularisatió”-nak (új erek képződése) is nevezik. A folyamatot az endotélsejtek és a simaizomsejtek beszűrődése (infiltrációja) közvetíti, és feltételezhetően a következő három lehetőség szerint zajlik: az új véredények már létező véredényekből fejlődnek („saijadzanak”) ki; az új véredények prekurzorsejtekből de novo képződnek („vasculogenesis”); már létező kisebb véredények átmérője megnő [Blood és munkatársai: Bioch. Biophys. Acta 1032, 89 (1990)]. Ismeretes, hogy az érfal endotélsejtjei legalább öt RGD-függő integrált tartalmaznak; ezek: a vitronektin-receptor ανβ3 vagy a^5); az I. és IV. típusú kollagénreceptor (ομβ]); a lamininreceptor (α2βι); a fibronektin/laminin/kollagén receptor (α3β,) és a fibronektin-receptor (α5β)) [Davis és munkatársai: J. Cell. Biochem. 51, 206 (1993)]. A simaizom-sejtek legalább hat RGD-függő integrint tartalmaznak (köztük az c^j-et,. a^-at és ανβ5-0ί).
Az angiogenezis az újszülöttek fejlődésének fontos folyamata, de nagy jelentősége van a sebgyógyulásban, illetve különböző betegségek [köztük a szöveti gyulladás, arthritis, tumomövekedés, a cukorbetegséggel járó* retinabántalom, a retina - érképződés (neovascularisatio) következtében kialakuló - foltos elfajulásának és hasonló állapotok] patogenezisében. Az angiogenezissel kapcsolatos klinikai megnyilvánulásokat angiogén betegségeknek nevezzük [Folkman és munkatársai: Science 235, 442 (1987)]. Az angiogenezis általában nem jellemző a kifejlett vagy érett szövetekre, bár sebgyógyuláskor és a sárgatest növekedési ciklusában előfordul [lásd például Moses és munkatársai: Science 248, 1408 (1990)].
Korábban javasolták, hogy az angiogenezis gátlása hatékony terápiája lehetne a tumomövekedés korlátozásának. Az angiogenezis gátlásának lehetőségeként a következő módszereket ajánlották: (1) az „angiogén molekulák” (például a fibroblasztnövekedési faktor; βΡΰΡ) felszabadulásának gátlása; (2) az anginogén molekulák semlegesítése (például anti-PFGF-antitestek alkalmazásával); és (3) az endotélsejtek angiogén ingerre adott reakciójának gátlása. Ez utóbbi stratégia felkeltette a figyelmet, és Folkman és munkatársai [Cancer Biology 3, 89 (1992)] több endotélsejtreakció-inhibitort írtak le, köztük a kollagenázinhibitort, alapmembrán-„tumover”-inhibitort, angiosztatikus szteroidokat, gombaeredetű angiogenezis-inhibitorokat, trombocitafaktor-4et, trombospondint, arthritisgyógyszereket (mint például a D-penicill-amint és az arany-tiomalátot) a D3vitamin analógjait, alfa-interferont és hasonló anyagokat, amelyek felhasználhatók az angiogenezis gátlására. További javasolt angiogenezis-inhibitorokat illetően
HU 221 988 Β1 lásd: Blood és munkatársai: Bioch. Biophys. Acta. 1032, 89 (1990); Moses és munkatársai: Science 248, 1408 (1990); Ingber és munkatársai: Láb. Invest. 59, 44 (1988); és az 5,092,885; 5,112,946; 5,192,744 és 5,202,352 számú egyesült államokbeli közzétételi irat. A fenti hivatkozásokban leirt angiogenezis-inhibitorok egyike sem irányul az θνβ3 gátlására.
Leírtak olyan - RGD-szekvenciát tartalmazó - peptideket is, amelyek az a^3-vitronektin-receptort gátolják (Aumailley és munkatársai: FEBS Letts. 291, 50 (1991); Choi és munkatársai: J. Vasc. Sürg. 19, 125 (1994); Smith és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 12267 (1990); és Pfaff és munkatársai: J. Bioi. Chem. 269, 20233 (1994)], azonban találmányunk előtt nem vetették fel az a^3-integrin angiogenezisben betöltött szerepének lehetőségét, és nem is azonosították.
A sejtadhézió - különböző integrál a- vagy βalegységekre specifikus monoklonális antitestek alkalmazásával történő - in vitro gátlása érinti a különböző sejttípusok - köztük a hajszálér-endotélsejtek - sejtadhéziójában szerepet játszó a^3-integrint [Davis és munkatársai: J. Cell. Bioi. 51, 206 (1993)]. Nicosia és munkatársai leírták a „GRGDS” nevű RGD-peptid kollagéngélen tenyésztett patkányaortából „mikrovéredények” („microvessels”) képződésének in vitro gátlására történő - alkalmazását [Nicosia és munkatársai: Am. J. Pathol. 138, 829 (1991)]. A „mikrovéredények” kialakulásának - kollagéngél-tenyészetekben végzett - in vitro gátlása nem jó modellje az angiogenezis szövetekben történő gátlásának, mivel nem igazolt, hogy a mikrovéredények szerkezete azonos lenne a hajszálérkezdemények szerkezetével, vagy hogy a kollagéngél-tenyészetben a mikrovéredények kialakulása azonos lenne az új erek intakt szövetbe (ahol az angiogenezis gátlása kívánatos, például ízületi gyulladásos szövetbe, tumorszövetbe vagy beteg szövetbe) történő behatolásával és növekedésével.
Nincs tudomásunk egyetlen olyan kísérletről sem, amelyben bebizonyították volna, hogy egy szövetben az angiogenezis sejtadhéziós inhibitorok alkalmazásával gátolható. Közelebbről, korábban soha nem bizonyították, hogy szövetekben az a^3-funkció szükséges az angiogenezishez, vagy hogy az a^-antagonisták képesek egy szövetben az angiogenezis gátlására.
Találmányunk leírásában feltárjuk, hogy a szövetekben az angiogenezishez avp3-integrinre van szükség, és az ανβ3 inhibitorai képesek az angiogenezis gátlására. Feltárjuk továbbá, hogy más integrinek (mint például az ανβ5 vagy a^t) antagonistái nem gátolják az angiogenezist, feltehetően azért, mert ezek az angiogenezis bekövetkezése szempontjából nem kulcsfontosságúak.
Ilyenformán, a találmány tárgyát eljárások képezik angiogenezis gátlására egy szövetben, melyek során a szövetbe egy - a^3-antagonista angiogenezist gátló mennyiségét tartalmazó - készítményt adunk be.
Bármilyen szövetet kezelhetünk, amelyben a angiogenezis gátlása kívánatos; kezelhetünk például olyan beteg szöveteket, amelyekben új erek képződése indult meg. Az ilyen szövetek példáiként említhetjük a gyulladásos szöveteket, a kemény tumorokat, metasztázisokat, a restenosison áteső szöveteket és hasonlókat
A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható a^3-antagonista képes az a^3-hoz kötődni és kompetitív módon gátolni az ανβ3 - természetes ligandumához történő - kötődését. Az antagonista az integrinek közül előnyösen az ανβ3-Γ8 specifikus. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint az avfl3-antagonista a fibrinogén vagy más - RGD-szekvenciát tartalmazó - ligandum a^3-hoz történő kötődését gátolja, a fibronektin a^3-hoz történő kötődését azonban nem gátolja jelentős mértékben. a^3-antagonistaként előnyösen polipeptidet vagy monoklonális antitestet (vagy annak funkcionális - az ανβ3-νβ1 immunreakciót mutató - fragmensét) alkalmazzuk.
A következőkben a leírás részét képező ábrák rövid ismertetését írjuk le.
Az 1A-1D. ábrákon a β3 - és β^-integrin-alegységek - normális bőrben és sebgyógyulás folyamatában lévő bőrben (melyet az ábrán satjadzó szövetnek nevezünk) tapasztalható - szöveti eloszlását mutatjuk be. Az β3- és β1-alegység elleni antitestekkel végzett immunhisztokémiai vizsgálatot a 3. példa A) részében leírt módon végeztük. Az 1A. és IB. ábrán az 3ηϋ-β3antitest normális bőrben, illetve sarjadzó szövetben mutatott immunreaktivitása, míg az IC. és ID. ábrán az anti-β,-antitest normális bőrben, illetve sarjadzó szövetben mutatott immunreaktivitása látható.
A 2A-2D. ábrákon az β3-integrin-alegységet megkö-> tő „von Willebrand”-fektor (vWF) és a βι-integrin-alegységet megkötő lamininligandumok - normális bőrben és sebgyógyulás folyamatában lévő bőrben (melyet az ábrán sarjadzó szövetnek nevezünk) tapasztalható - szöveti eloszlását mutatjuk be. A „von Willebrand”-faktor elleni antitesttel (anti-vWF) és a laminin elleni antitesttel (antilaminin) végzett immunhisztokémiai vizsgálatot a 3. példa B) részében leírtak szerint végeztük. A 2A. és 2B. ábrán az anti-vWF normális bőiben, illetve sarjadzó szövetben mutatott immunreaktivitása, a 2C. és 2D. ábrán pedig az antilaminin normális bőrben, illetve sarjadzó szövetben mutatott immunreaktivitása látható.
A 3A-3D. ábrákon a vitronektin integrinreceptora (az θνβ3) - húgyhólyagrák-, vastagbélrák-, emlőrák-, illetve tüdőrákszövetből származó - biopsziákban tapasztalható szöveti eloszlását mutatjuk be. Az θνβ3 elleni LM609-antitest alkalmazásával végzett immunhisztokémiai vizsgálatot a 3. példa C) részében leírtak szerint végeztük.
A 4. ábrán 10 napos csirkeembrióból származó, vérerektől mentes chorioallantois-membrán (CAM) tipikus mikrofényképét mutatjuk be. A CAM előkészítését az 5. példa B) részében írjuk le.
Az 5A-5C. ábrákon a β! és a^3-integrin - találmány szerinti CAM-preparátumban tapasztalható szöveti eloszlását mutatjuk be. Az 5A. ábrán a Pj-alegység 10 napos, kezeletlen CAM-preparátumban mutatott (CSAT alkalmazásával immunfluoreszcencia-immunreaktivitás alapján detektált) eloszlása látható. Az 5B. ábrán az avp3-receptor 10 napos, kezeletlen CAMpreparátumban mutatott - LM609 anti-avp3-antitest al3
HU 221 988 Bl kalmazásával immunfluoreszcencia-immunreaktivitás alapján detektált - eloszlása látható. Az 5C. ábrán az avp3-receptor pFGF-fel kezelt, 10 napos CAMpreparátumban mutatott - LM609 anti-avp3-antitest alkalmazásával immunfluoreszcencia-immunreaktivitás 5 alapján detektált - eloszlása látható. A kezeléseket és az eredményeket az 5. példa C) részében ismertetjük.
A 6. ábrán oszlopgrafikonon mutatjuk be az θνβ3 és β3 - kezeletlen (kontroll), illetve βΡΰΡ-ίβΙ kezelt 10 napos CAM-preparátumokban megfigyelhető - relatív 10 expresszióját (a kísérletet a 6. példa A) részében írjuk le). Az y tengelyen az átlagos fluoreszcenciaintenzitást, az x tengelyen az integrineket tűntettük fel.
A 7A. ábrán egy kezeletlen, 10 napos CAM, a 7B. ábrán egy pFGF-fel kezelt CAM, a 7C. ábrán pedig 15 egy TNFa-val kezelt CAM mikrofényképét mutatjuk be (az eljárások és eredmények leírását lásd a 6. példa
A) részében).
A 8A-8E. ábrákon a helyi antitestkezelés - 10 napos CAM βΡΰΡ-ηκΰ^Ιβ angiogenezisére gyakorolt - 20 hatását mutatjuk be (lásd 7. példa, A)l. rész). A 8A. ábrán vérerektől mentes, kezeletlen CAM-preparátum látható. A 8B. ábrán az új erek - korábban érrendszer nélküli területre történő - behatolása látható (ami PFGFkezelés hatására következik be). A 8C., 8D. és 8E. áb- 25 ián a β[, ανβ5, illetve ανβ3 elleni antitestek (anti-β! CSAT; anti-cqjJ5, P3G2; illetve anti-a^3, LM609) angiogenezisre gyakorolt hatása látható.
A 9A-9C. ábrákon a 66 203-as jelzésű szintetikus peptid intravénás injektálásának - tumorok által indu- 30 kált angiogenezisre gyakorolt - hatását mutatjuk be (lásd 7. példa D)2. rész). A 9A. ábrán egy kontrollpeptiddel végzett intravénás kezelés (kontrollpeptid, tumor) - tumorindukcióból eredő angiogenezisre gyakorolt - gátlóhatásának hiánya látható. A 66 203-as jelzé- 35 sű peptid intravénás injektálásának angiogenezisre gyakorolt gátlóhatása a 9B. ábrán látható (ciklusos RGD, tumor). A 9C. ábrán az látható, hogy a 66 203-as jelzésű peptid intravénás infúziója nem eredményez gátlóvagy citotoxikus hatást a tumorkezelt területtel szom- 40 szédos területen lévő, már létező, érett véredényekkel szemben (ciklusos RGD, szomszédos CAM).
A10A-10C. ábrákon monoklonális antitestek - növekedési faktorral indukált angiogenezisre gyakorolt hatását mutatjuk be. A kísérletet a 7. példa B)l. részé- 45 ben újuk le. Az 10A. ábrán antitestkezelés nélküli, PFGF-fel indukált angiogenezis látható (kontroll).
A 10B. ábrán látható, hogy az angiogenezis gátlása nem következett be, ha pFGF-fel indukált preparátumot P3G2 anti-a^-antitesttel kezeltünk. Az angioge- 50 nezis gátlása az LM609 anti-a^-antitesttel végzett kezelés hatására következett be (10B. ábra).
A 11A-11C. ábrákon az antiintegrin-antitestek helyi alkalmazásának embrionális angiogenezisre gyakorolt hatását mutatjuk be. A kísérletet a 7. példa C) részé- 55 ben újuk le. A 11 A. és 11B. ábrán látható, hogy a hatnapos CAM anti-βι, illetve anti-a^-antitesttel végzett kezelése nem gátolta az angiogenezist. Ezzel szemben, az LM609 anti-avp3-antitesttel végzett kezelés gátolta a vérerek képződését (1 IC. ábra). 60
A 12. ábrán CAM-preparátumban a tumorba behatoló erek számát mutatjuk be. A kísérletet a 7. példa D)l. részében újuk le. Az y tengelyen a - CSAT- (anti-β!, LM609-(anti-a^3), illetve P3G2-antitesttel (antia^5) helyileg kezelt - tumorba hatoló erek számát tüntettük fel.
A 13A-13D. ábrákon 9. példa A)l.a) részében leírt kísérletben a kezelés után 7 nappal mért nedves tumortömeg és a kiindulási tumortömeg összehasonlításait mutatjuk be. Mindegyik oszlop csoportonként
5-10 tumor átlaga ±szórás értéket reprezentál. A kísérletben humán melanoma (M21-L; 13A. ábra), hasnyálmirigyrák (Fg; 13B. ábra), tüdőrák (UCLAP-2; 13C. ábra) és gégerák (HEp3; 13D. ábra) CAM-preparátumokból származó tumorokat alkalmaztunk, melyeket intravénásán PBS-sel, CSAT-antitesttel (antiβ)), illetve LM609-antitesttel (anti-cqjJ3) kezeltünk. Az y tengelyen a CSAT-antitesttel (anti-β!), LM609-antitesttel (anti-a^3), illetve PBS-sel intravénásán kezelt tumorok tömegét tüntettük fel.
A 14A. és 14B. ábrán a P3G2-antitesttel (antiΟνβϊ), illetve LM609-antitesttel (anti-a^3) kezelt tumorok hematoxilinnal és eozinnal festett szövettani metszeteit mutatjuk be. A kísérletet a 9. példa A)l.a) részében újuk le. A 14A. ábrán látható, hogy a kontrollP3G2-antitesttel kezelt tumorok sztrómájában mindenütt számos életképes és aktívan osztódó tumorsejt (melyek jelenlétét a mitózisos alakzatok mutatják, lásd nyílhegyek), valamint sok véredény (nyilak) található. Ezzel szemben, a 14B. ábrán látható, hogy az LM609-antitesttel (anti-a^3) kezelt tumorok metszeteiben alig detektáltunk életképes tumorsejteket vagy vérereket.
A 15A-15E. ábrán - a 9. példa A)l.b) részében leírt eljárás szerint - peptidekkel kezelt M21L-tumorokat mutatunk be. A 15A. ábrán a kontroll ciklusos RAD-peptiddel (69 601) kezelt tumor; a 15B. ábrán a ciklusos RGD-peptiddel (66 203) kezelt tumor; a 15C. ábrán ugyanazon - ciklusos RGD-peptiddel kezelt - embriókból származó, a tumorral szomszédos CAM-szövet látható. A 15D. ábrán a kontroll ciklusos RAD-peptiddel (69 601) kezelt tumor 13-szoros nagyítását, a 15E. ábrán pedig a ciklusos RGD-peptiddel (66 203) kezelt tumor 13-szoros nagyítását mutatjuk be (a nyilak a szétrombolt vérereket mutatják).
A 16A-16C. ábrákon - in vivő nyúlszemmodellben - az érképződés angiogenezis-antagonisták hatására bekövetkező gátlását mutatjuk be (lásd 10. példa). A 16A. és 16B. ábrán a nyúlszemben - βΡΰΡ és monoklonális PlF6-antitest (anti-a^5) jelenlétében bekövetkező angiogenezist mutatjuk be. A 16C., 16D. és 16E. ábrán a nyúlszemben az angiogenezis [FGF és monoklonális LM609-antitest (anti-a^3) jelenlétében megfigyelhető] gátlását mutatjuk be.
A 17. ábrán az in vivő egér:humán kimérikus egérmodell kialakításának folyamatábráját mutatjuk be (lásd 11. ábra A) része). SCID-egér bőrének egy darabját humán újszülött-praeputiummal helyettesítettük. A műtét helyét az átültetés után négy hétig gyógyulni hagytuk. A bőr begyógyulása után az emberi praeputiomot emberi tumorsejtekkel oltottuk be. A következő
HU 221 988 Bl négyhetes időszak alatt mérhető tumor jelenlétét állapítottuk meg, amely - az emberi bőrből az emberi tumorba nőtt - humán érrendszert tartalmazott.
A 18. ábrán a monoklonális antitesttel és peptiddel kezelt CAM-szövetekből származó és „Apop Tag” an- 5 titesttel festett, különálló sejtek százalékos arányát mutatjuk be, amit - a 12. példa A), illetve B) pontjában leírt - FACS-analíssel határoztunk meg. A fekete, illetve a pontozott oszlopok a vizsgálat előtt 24, illetve 48 órával kezelt embriókból származó sejteket reprezentálják. 10 Valamennyi oszlop három ismétléssel végzett kísérlet átlag+szórás értékeit jelenti. A CAM-preparátumokat a
12. példa A)2. pontjában leírtak szerint, LM609 (antiθνβ3) vagy CSAT (anti-β]) monoklonális antitesttel, illetve foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) kezeltük. CAM- 15 preparátumokat a 66 203-as ciklo-RGDfV-peptiddel (melyet az ábrán 203-as pepiidként jelölünk), valamint a 69 601-es kontroll ciklusos peptiddel (ciklo-RADfV, melyet 601-es peptidként jelölünk) is kezeltünk (lásd
12. példa B) pontja). 20
A 19A. és 19B. ábrán CSAT (anti-β! monoklonális antitesttel (19A. ábra) vagy LM609 (anti-a^3) monoklonális antitesttel (19B. ábra) kezelt embriókból származó chorioallantois-szövetek különálló sejtjeiből készített, „Apop Tag” antitesttel és propidium-jodiddal 25 festett és FACS-analízissel vizsgált szuszpenziók egyesített eredményeit mutatjuk be (lásd 12. példa C) pontja). A y tengelyen az ,Λρορ Tag” festődésű sejtek számát (apoptózis), az x tengelyen pedig a propidium-jodidos festődést (DNS-tartalom) tűntetjük fel. A vízszin- 30 tes vonal az ,Λρορ Tag” festődés negatív kapuját reprezentálja. A 19A. ábrán a CSAT (anti-β! monoklonális antitesttel kezelt embriókból származó chorioallantoissejtek, a 19B. ábrán pedig az LM609 (anti-a^3) monoklonális antitesttel kezelt embriókból származó chorio- 35 aliantois-sejtek eredményei láthatók. A sejtciklus-analízist mindegyik kísérleti feltétel esetében hozzávetőleg 8000 esemény vizsgálatával végeztük.
A 20A-20C. ábrákon CSAT-antitesttel (anti-β!) kezelt embriókból származó chonoallantois-membránszö- 40 vetet; a 20D-20F. ábrákon pedig LM609-antitesttel (anti-a^3) kezelt embriókból származó chonoallantois-membránszöveteket mutatunk be, melyek előkészítését a 12. példa C) részében fajuk le. A 20A. és 20D. ábrán az ,Λρορ Tag” antitesttel festett, és D. I. C. 45 képre („image”) szuperinponált fluoreszcencia alapján láthatóvá tett szövetek láthatók. A 20B. és 20E. ábrán az előbbiekkel azonos - LM609-antitesttel festett és fluoreszcenciával (rodamin) láthatóvá tett - szövetek láthatók. A 20C. és 20F. ábrán az előbbiekkel azonos 50 - ,Λρορ Tag” és LM609-antitesttel festett - szövetek összeillesztett képei láthatók, ahol a sárga festődés együttes lokalizációt jelent. A 20C. ábrán lévő vízszintes vonal 15 μτη-nek, a 20F. ábrán lévő vonal pedig 50 pm-nek felel meg. 55
A következőkben a találmány leírásában használt kifejezések meghatározását adjuk meg.
Az „aminosav” kifejezés egy polipeptidből - peptidkötései hidrolízisével - kialakított aminosavakra vonatkozik. A leírásban említett aminosavak előnyösen 60
L-izomerek, azonban az L-aminosavak bármilyen Daminosawal helyettesíthetők, feltéve, hogy a polipeptid kívánt funkcionális tulajdonságai megmaradnak. Az „NH2” jelentése a polipeptid N-terminálisán lévő szabad aminocsoport, míg a „COOH” jelentése a polipeptid C-terminálisán lévő szabad karboxilcsoport. Az aminosavak rövidítéseit - a standard polipeptid-nevezéktannak [lásd J. Bioi. Chem. 243, 3552 (1969); 37. CFR, §1.822 (b) (2)] megfelelően - a következők szerint használjuk.
Rövidítés | Aminosav | |
Egybetűs | Hárombetűs | |
Y | Tyr | Tirozin |
G | Gly | Glicin |
F | Phe | Fenil-alanin |
M | Met | Metionin |
A | Ala | Alanin |
S | Ser | Szerin |
I | Ile | Izoleucin |
L | Leu | Leucin |
T | Thr | Treonin |
V | Val | Valin |
P | Pro | Prolin |
K | Lys | Lizin |
H | His | Hisztidin |
Q | Gin | Glutamin |
E | Glu | Glutaminsav |
Z | Glx | Glu és/vagy Gin |
w | Trp | Triptofán |
R | Arg | Arginin |
D | Asp | Aszparaginsav |
N | Asn | Aszparagin |
B | Asx | Asn és/vagy Asp |
C | Cys | Cisztein |
Z | Xaa | Ismeretlen /egyéb |
Néhány további rövidítés jelentése:
BOC terc-butil-oxi-karbonil-csoport
DCCI diciklohexil-karbodiimid
DMF dimetil-formamid
OMe metoxicsoport
HOBt 1-hidroxi-benzo-triazol
Megjegyezzük, hogy valamennyi aminosavszekvenciát a hagyományos, N-terminális -> C-terminális irányban adjuk meg. Megjegyezzük továbbá, hogy az aminosavszekvencia elején vagy végén feltűntetett kötőjel peptidkötést jelöl, amellyel az adott szekvencia - egy vagy több aminosavból álló - másik aminosavszekvenciához kapcsolódhat.
A „polipeptid” kifejezés - egymáshoz az alfa-aminocsoport és a karboxilcsoport közötti peptidkötésekkel kapcsolódó - aminosavak lineáris láncát jelenti.
A „peptid” kifejezés - ahogy itt használjuk - ötvennél nem több aminosavból álló lineáris láncot jelent, melyben az aminosavak a polipeptid esetében leírtak szerint kapcsolódnak egymással.
A „ciklusos peptid” kifejezés a megfelelő lineáris peptidből származik; olyan peptidet jelent, amelyben nincs szabad N- vagy C-terminális, és amelynek megfelelő lineáris peptid N-terminálisa amidkötést képez saját C-terminálisával.
HU 221 988 Bl
A „protein” kifejezés ötvennél több aminosavból álló lináris láncot jelent, melyben az aminosavak a polipeptid esetében leírtak szerint kapcsolódnak egymással.
A „szintetikus peptid” kifejezés kémiai úton előállított - egymással peptidkötésekkel kapcsolódó aminosavakat tartalmazó láncot jelent, amely nem tartalmaz természetben előforduló proteineket vagy proteinfragmenseket.
A találmány szerinti megoldás azon a felismerésen alapul, hogy az angiogenezist a specifikus ανβ3-νίίτοnektin-receptor közvetíti, és az avP3-funkció gátlása gátolja az angiogenezist. Ez a felismerés azért lényeges, mert az angiogenezis számos különböző betegségben játszik szerepet. Az angiogenezis gátlásával beavatkozhatunk a betegség lefolyásába, enyhíthetjük a tüneteket, és bizonyos esetekben meggyógyíthatjuk a beteget.
Amennyiben az új véredények növekedése egy betegség kialakulásának okát képezi (vagy hozzájárul ahhoz), az angiogenezis gátlásával csökkenthetjük a betegség ártalmas hatásait. Az ilyen betegségek példáiként említhető a reumatoid arthritis, a cukorbetegséggel járó retinabántalom, a gyulladásos betegségek, a restenosis és hasonlók. Ha egy káros szövet növekedésének elősegítéséhez új vérerek növekedésére van szükség, az angiogenezis gátlása csökkentheti a szövet vérellátását, s ezáltal hozzájárulhat a tumor tömegének csökkentéséhez. Az ilyen jellegű esetek példái közé tartoznak az olyan tumomövekedések, melyek során az új erek folyamatos képződésére van szükség ahhoz, hogy a tumor néhány milliméternél vastagabbra nőjön, és kemény metasztázisok alakuljanak ki.
A találmány szerinti eljárások részben azért hatásosak, mert a terápia nagymértékben szelektív az angiogenezisre, miközben más biológiai folyamatokra nem specifikus. Ahogy azt a példákban leírjuk, csak az újonnan képződő erek tartalmaznak jelentős mennyiségű OvP3 integrint, így a terápiás eljárások nem gyakorolnak zavaró hatást az érett erekre. Ezenkívül, az a^-integrin normális szövetekben nem elterjedt; specifikusan az új erekben található, ami biztosítja, hogy a terápiával szelektíven az új erek növekedését célozhassuk meg.
Az a felismerés, hogy önmagában az θνβ3 gátlásával lehetővé válik az angiogenezis gátlása, olyan gyógyszerkészítmények kifejlesztését teszi lehetővé, amelyek nagymértékben specifikusak, s ezáltal viszonylag alacsony toxicitásúak. Ennek megfelelően - bár találmányunkban olyan peptidalapú reagensek alkalmazását tárjuk fel, amelyek képesek egy vagy több integrin gátlására -, egyéb reagensek is kifejleszthetek, amelyek még nagyobb specifitással gátolják az a^3-integrint, s ezáltal - az a^-integrin közvetítette folyamatokon kívül - nem gátolnak más biológiai folyamatokat.
Például, előállíthatunk olyan, az avp3-integrinnel való immunreakcióra nagyon specifikus monoklonális antitesteket, amelyek hasonlóan specifikusak az ανβ3fúnkció gátlására is. Ezenfelül, RGD-szekvenciát tartalmazó peptideket alakíthatunk ki, oly módon, hogy specifikusak legyenek az avfi3-integrin gátlására.
A találmány szerinti megoldás megvalósításához vezető felismerések előtt nem volt ismert, hogy az angiogenezis - és az angiogenezistől függő valamennyi folyamat - in vivő olyan reagensek alkalmazásával gátol5 ható, amelyek az avfi3-integrin biológiai működésének antagonistái.
Eljárások az angiogenezis gátlására
A találmány tárgyát képezi egy eljárás angiogenezis gátlására egy szövetben, amely ezáltal a szövetben leját10 szódó, angiogenezis-fuggő folyamatok gátlására is alkalmas. Az eljárás során, általában olyan készítményt adunk be a szövetbe, amely egy oqji3-antagonista angiogenezist gátló mennyiségét tartalmazza.
Ahogy korábban említettük, az angiogenezis szá15 mos folyamatból áll, beleértve a szövetekben az új erek képződését („neovascularizatio”), például sarjadzással; a „vasculogenezis”-t és az erek megnagyobbodását Valamennyi angiogenezis-folyamatot az a^3-integrin expressziója közvetíti, s mindegyik a^-függő. Úgy véljük, hogy a sérülés miatt létrejött seb gyógyulásán, a sárgatest kialakulásán és az embriogenezis kivételével az angiogenezis-folyamatok jelentős része betegségekkel kapcsolatos, így a találmány szerinti terápiás eljárások szelektívek a betegségre, és nincsenek káros mel25 lékhatásaik.
Számos különféle betegség létezik, melyekben az angiogenezist lényegesnek tartják; ezeket angiogén betegségeknek nevezzük. Az ilyen betegségek közé tartoznak - nem kizárólagosan - a gyulladásos rendellenes30 ségek (mint például az immun- vagy a nem immungyulladás, a krónikus ízületi reuma és a pikkelysömör), az erek elégtelen vagy nem kellő időben történő behatolásával járó betegségek (mint például a cukorbetegséggel járó retinabántalom, a neovascularis glaucoma, a restenosis, az ateroszklerózisos plakkokban lejátszódó hajszálér-proliferáció és a csontritkulás), valamint a rákkal kapcsolatos betegségek, például kemény tumorok, a kemény tumorok metasztázisai, angiofibromák, a retrolerális fibroplázia, hemangiómák, Kaposi-szarkóma és hasonlók, melyeknél a tumor növekedéséhez új erek képződésére van szükség.
Egy megbetegedett szövetben az angiogenezist gátló eljárások enyhítik a betegség tüneteit, és - a betegségtől függően - elősegíthetik a betegség gyógyulását.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint az angiogenezist egy szövetben gátoljuk. A szövetben az angiogenezis mértéke - és ezáltal a találmány szerinti eljárásokkal megvalósított gátlás mértéke - számos módszerrel értékelhető, például, az avP3-immunpozitív, éret50 len és fejlődő érstruktúrák - későbbiekben leírt - immunhisztokémiai detektálásával.
Beteg állapotban a különböző szövetek vagy - szervezett szövetekből álló - szervek bármelyikében (beleértve a bőrt, izmot, beleket, kötőszövetet, ízületeket, csontokat és hasonlókat, melyekbe a vérerek - angiogén ingerek hatására - behatolhatnak) előfordulhat angiogenezis.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmében gyulladt állapotban lévő szövetet kezelünk, melynek során a gyulladt szövetben tapasztalható angio.....................
HU 221 988 Bl genezist kívánjuk gátolni. Ebben a megvalósítási módban az angiogenezist ízületi gyulladásos szövetekben (például krónikus ízületi reumában szenvedő betegben), immun- vagy nem immungyulladásos szövetben, pikkelysömörös szövetben és hasonlókban gátoljuk.
A találmány számos megvalósitási módja értelmében kezelt páciensek előnyösen emberek, azonban a találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható valamennyi emlős esetében, melyeket szintén „páciensként” említünk. Ebben az összefüggésben az „emlős” kifejezésen azokat az emlősfajokat (különösen a mezőgazdasági haszonállat- és háziállatfajokat) értjük, amelyekben az angiogenezissel kapcsolatos betegségek kezelése kívánatos.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint szöveteken cukorbetegséggel járó retinabántalomban, a retina foltos elfajulásában vagy neovascularis glaucomában szenvedő páciens ideghártyaszövetét kezeljük, és az ideghártyaszövet - új erek képződésével járó angiogenezisét gátoljuk.
A találmány egy további megvalósítási módjában szövetként - keményt tumort, metasztázisokat, bőrrákot, emlőrákot hamangiomát, angiofibrómát vagy egyéb rákos daganatokat hordozó páciens tumorszövetét kezeljük, és a tumorszövet - új erek képződésével járó - angiogenezisét gátoljuk. A találmány szerinti eljárásokkal kezelhető, jellemző kemény tumorszövetek közé tartozik a tüdő-, hasnyálmirigy-, emlő-, vastagbél-, gége-, petefészekszövet és hasonlók. A példaként szolgáló tamorszövet-angiogeneziseket és gátlásukat a példákban kjük le.
A tumorszövet-angiogenezis gátlása a találmány különösen előnyös megvalósítási módját képezi, mivel az új erek képződése („neovascularisatio”) fontos szerepet játszik a tumomövekedésben. A tumorszövet „neovascularisatió”-jának hiányában a tumorszövet nem kapja meg a kívánt tápanyagokat, növekedési sebessége csökken, majd növekedése leáll, a tumor visszafejlődik, végül elhal.
Más szavakkal, a találmány leírásában feltárunk egy eljárást tumor-neovascularisatio gátlására, melynek során a tumorban lejátszódó angiogenezist a találmány szerinti eljárások szerint gátoljuk. Hasonlóan, a találmány leírásában feltárunk egy eljárást tumomövekedés gátlására, melynek során az angiogenezist gátló eljárásokat alkalmazzuk.
A találmány szerinti eljárások különösen hatásosan alkalmazhatók metasztázisok kialakulásának gátlására, mivel (1) a metasztázisok kialakulásához a primer tumorban új erek képződésére van szükség, hogy a metasztázisos ráksejtek elhagyhassák a primer tumort; és (2) a metasztázisok másodlagos helyen történő megtelepedéséhez szintén új erek képződésére van szükség, ami elősegíti a metasztázisok növekedését.
A találmány egy további megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti eljárást más gyógykezelésekkel (például a kemény tumorok ellen és a metasztázisok kialakulásának megakadályozására irányuló, hagyományos kemoterápiával) együtt alkalmazzuk. Az angiogenezis-inhibitor beadását rendszerint a kemoterápiával egyidejűleg vagy azt követően végezzük, bár olyan esetekben, amikor a tumorszövet a toxikus támadásra angiogenezis indukálásával reagál (hogy a vér- és tápanyagellátás biztosításával „megmeneküljön”), az angiogenezist előnyösen a kemoterápia után gátoljuk. Ha a kemény tumorokat a metasztázisok kialakulásának megelőzése céljából eltávolítottak, szintén előnyös, ha az angiogenezis-gátlási eljárásokat a műtét után alkalmazzuk.
Amennyiben a találmány szerinti eljárásokat tumorneovascularisatio (a tumorban új erek képződése) gátlására alkalmazzuk, az eljárások tumomövekedés gátlására, metasztázisok kialakulásának gátlására, és kialakult tumorok visszafejlesztésére is alkalmasak. A példák15 bán leltjük egy kialakult tumor - találmány szerinti avP3-antagonista egyszeri, intravénás beadását követő - visszafejlődését.
A restenosis a simaizom-sejtek - perkután transzlumináris szívkoszorúér-plasztikai műtét helyén megfi20 gyelhető - vándorlási folyamata, ami akadályozza az érplasztika sikerét. A simazisom-sejtek restenosisos vándorlása és proliferációja angiogenezises folyamatnak tekinthető, amely a találmány szerinti eljárások alkalmazásával gátolható. Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi a restenosis gátlása is, melynek során érplasztikai műtéten átesett páciensben a találmány szerinti eljárások szerint gátoljuk az angiogenezist. A restenosis gátlása céljából az a^-antagonistát rendszerint az érplasztikai beavatkozás után kb. 2-28 napig, előnyösen a be30 avatkozást követő első 14 napig adagoljuk.
A szöveti angiogenezis gátlásának (és az angiogenezissel kapcsolatos betegségek kezelésének) találmány szerinti eljárásainak gyakorlati megvalósítása során egy szövetet - amelyben angiogenezis figyelhető meg, vagy amely az angiogenezis veszélyének van kitéve olyan készítménnyel érintkeztetünk, amely egy avp3-antagonista gyógyászati szempontból hatásos (az természetes ligandumához történő kötődésének gátlására képes) mennyiségét tartalmazza. Az ilyen eljárás során egy páciensnek - egy találmány szerinti avp3-antagonistát tartalmazó - fiziológiailag elfogadható készítmény gyógykezelési szempontból hatásos mennyiségét adjuk be.
Az avp3-antagonista beadásához alkalmazott dózis45 tartomány az antagonista alakjától és hatékonyságától függ (mely tényezőket a későbbiekben részletesen ismertetjük), és előnyösen olyan mennyiséget alkalmazunk, amely elégséges a kívánt hatás (vagyis az angiogenezis gátlása és az angiogenezis által közvetített be50 tegségek enyhítése) eléréséhez. A beadott mennyiség nem lehet akkora, hogy káros mellékhatásokat (például híperviszkozitási tüneteket, tüdőödémát, vértolulás által előidézett szívelégtelenséget és hasonlókat) okozzon. Az adagolás általában a páciens korának, kondí55 ciójának, nemének, illetve a betegség súlyosságának függvényében változhat, és pontos meghatározása szakember feladata. Az adagolást - komplikáció előfordulása esetén - a kezelőorvos is meghatározhatja.
Az avp3-antagonista gyógykezelési szempontból ha60 tásos mennyisége olyan mennyiség, amely elégséges a
HU 221 988 Β1 kezelt szövetben az angiogenezis mérhető gátlásának előidézéséhez. Az ilyen mennyiséget angiogenezist gátló mennyiségnek nevezzük. Az angiogenezis gátlása in situ a találmány leírásában ismertetett immunhisztokémiai eljárással vagy más, szakember számára ismert el- 5 járásokkal mérhető.
Amennyiben avp3-antagonistaként avp3-t utánzó reagenst, RGD-szekvenciát tartalmazó peptidet, antiανβ3 monoklonális antitestet vagy annak fragmensét alkalmazzuk, a hatékonyság, és ezáltal a „gyógykezelési 10 szempontból hatásos” mennyiség változhat, azonban - ahogy azt a vizsgálati eljárásokkal kimutatjuk - egy találmány szerinti, lehetséges avp3-antagonista hatékonysága egyszerűen értékelhető.
Az eívPj-antagonisták hatékonyságát számos eljá- 15 rással mérhetjük; ezek közé tartozik az angiogenezis gátlásának mérése CAM-vizsgálatban, in vivő nyúlszemvizsgálatban, in vivő kimérikus egér:humán vizsgálatban, illetve a természetes ligandum avP3-hez való kötődése gátlásának mérése (mely vizsgálatok mind- 20 egyikét ismertetjük a találmány leírásában) és hasonló vizsgálatok.
Az előnyös avP3-antagonisták - 0,5 μΜ-nál, előnyösen 0,1 μΜ-nál, még előnyösebben 0,05 μΜ-nál kisebb koncentrációban - alapvetően képesek gátolni a 25 természetes ligandumok (például fibrinogén vagy vitronektin) avp3-hoz való kötődését. Az „alapvető” kifejezés azt jelenti, hogy az avp3-antagonista jelenlétében a fibrinogén kötődésének legalább 50%-os csökkenése figyelhető meg. Az avp3-antagonista 50%-os gátláshoz 30 tartozó koncentrációját ICS0-értéknek nevezzük.
Egy előnyösebb aj^-antagonista az integrinek közül az avp3-integrinre szelektív. Az ilyen előnyös θνβ3antagonista alapvetően gátolja a fibrinogén avp3-hoz való kötődését, de nem gátolja jelentősen a fibrinogén 35 más integrinekhez (például Ογβρ, otyPs* vagy anbP3'’n“ tegrinhez) való kötődését. Különösen előnyös az az a^3-antagonista, amely a fibrinogén aJIj-integrinhez való kötődésének gátlásakor 10-100-szor kisebb IC50aktivitást mutat, mint a fibrinogén más integrinhez való 40 kötődésének gátlása esetében. Az IC50-aktivitás mérési eljárásait a példákban írjuk le.
Egy találmány szerinti - monoklonális antitestként alkalmazott - a^3-antagonista gyógykezelési szempontból hatásos mennyisége jellemzően olyan mennyi- 45 ség, amely - fiziológiai szempontból elfogadható készítményben beadva - elégséges a vérplazmában kb.
0,01 pg/ml és kb. 100 pg/ml közötti, előnyösen kb.
pg/ml és kb. 5 pg/ml közötti, rendszerint kb. 5 pg/ml a^-antagonista-koncentráció biztosításához. Más mó- 50 dón megfogalmazva, a beadott mennyiség - napi egy vagy több dózisban, egy vagy több napon keresztül beadva - kb. 0,1 mg/kg-tól kb. 300 mg/kg-ig, előnyösen kb. 0,2 mg/kg-tól kb. 200 mg/kg-ig, legelőnyösebben kb. 0,5 mg/kg-tól kb. 20 mg/kg-ig terjedhet. 55
Ha a^3-antagonistaként monoklonális antitestfragmenst alkalmazunk, a beadott mennyiséget a fragmens tömegének a teljes antitest tömegéhez viszonyított aránya alapján könnyen meghatározhatjuk. A vérplazmában az antitestantagonista előnyös koncentrációja kb. 60 μΜ-tói kb. 5 μΜ-tg, előnyösebben kb. 100 pM-tól kb. 1 mM-ig terjed.
Egy találmány szerinti - polipeptid vagy más, hasonlóan kisméretű a^3-utánzó molekula alakjában álló - aji3-antagonista gyógykezelési szempontból hatásos mennyisége rendszerint a polipeptid azon mennyisége, amely fiziológiailag elfogadható készítményben beadva elégséges ahhoz, hogy a vérplazma a^3-antagonista-koncentrációját kb. 0,1 pg/ml és kb. 200 pg/ml közötti, előnyösen kb. 1 pg/ml és kb. 150 pg/ml közötti tartományban biztosítsa. 500 g/mol molekulatömegű polipeptidet tekintve alapul, a vérplazma előnyös ανβ3antagonista-koncentrációja kb. 2 μΜ-tói kb. 5 mM-ig, előnyösebben kb. 100 μΜ-tói kb. 1 mM-ig terjed. Más módon, a testtömegre vonatkoztatott adagolás - napi egy vagy több dózisban, egy vagy több napon keresztül - kb. 0,1 mg/kg-tól kb. 300 mg/kg-ig, előnyösen kb. 0,2 mg/kg-tól kb. 200 mg/kg-ig terjed.
A találmány szerinti monoklonális antitestek vagy polipeptidek parenterális úton, injektálással vagy infúzióval adhatók be. Bár a hatóanyag a kezelni kívánt szövetet rendszerint szisztémás beadásnak köszönhetően éri el, s emiatt a gyógyszerkészítményeket leggyakrabban intravénásán adagoljuk, más szövetek és beadási módok is alkalmazhatók, melyeknél valószínű, hogy a megcélzott szövet tartalmazza a célmolekulát. Ilyenformán, a találmány szerinti monoklonális antitestek és polipeptidek intravénásán, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, szubkután, intrakavitálisan, transzdermálisan és perisztaltikus módszerekkel adhatók be.
A találmány szerinti monoklonális antitestet vagy polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítményeket rendszerint intravénásán - például, egységdózis formájában, injektálással - adjuk be. A találmány szerinti gyógyszerkészítménnyel kapcsolatban alkalmazott „egységdózis” kifejezés fizikailag diszkrét egységekre vonatkozik, amelyek egységes dózisként adhatók be a páciensnek, és mindegyik egység az aktív hatóanyag előre meghatározott - a kívánt gyógykezelési hatás eléréséhez kiszámított - mennyiségét kívánt hígítószerrel, például hordozóval vagy vivőanyaggal együtt tartalmazza.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint az avp3-antagonistát egységdózis alakban, intravénásán adjuk be.
A készítményeket a dóziskészítménynek megfelelő módon, gyógykezelési szempontból hatásos mennyiségben adjuk be. A beadandó mennyiség és az időzítés a kezelni kívánt pácienstől, a páciens anyagcseréjének aktív hatóanyagot feldolgozó képességétől és a terápiás hatás kívánt mértékétől függ. Az aktív hatóanyag beadandó pontos mennyisége a kezelőorvos döntésétől függ, és minden egyes páciensre egyénileg jellemző. A szisztémás beadáshoz alkalmas dózistartományokat (melyek a beadás módjától függően változhatnak) a találmány leírásában ismertetjük. Az alkalmas beadási rendek is változóak, de jellemzően egy kezdeti beadást követően - egy vagy több órás időközönként, injektálással vagy más módon - ismételt dózisokat adunk be. Más módon, folyamatos intravénás infúzió is alkalmaz8
HU 221 988 Β1 ható, amely elégséges a vérben hatóanyag - in vivő gyógykezeléshez meghatározott - koncentrációtartományának fenntartásához.
Ahogy azt a példákban bemutatjuk, az angiogenezis gátlása és a tumor visszafejlődése (regressziója) már az 5 antagonista megcélzott szövettel történő érintkeztetését követő 7. napon bekövetkezik. Az antagonista további vagy meghosszabbított érintkeztetésének ideje hét naptól hat hétig, előnyösen kb. 14 naptól 28 napig teljed.
A példákban bemutatjuk az a^-integrin gátlása és 10 az új éihálózat - a^-integrint hordozó - sejtjei apoptózisának índukálása közötti összefüggést. Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás egy szövet új érhálózata apoptózisának gátlására. Az eljárást lényegében az angiogenezis gátlásához leírtak 15 szerint, és az ahhoz alkalmazott feltételek szerint végezzük; az egyetlen jelentős különbség a hatás időzítése, mivel az apoptózis gyorsan - rendszerint az antagonista érintkeztetése után 48 órán belül - megnyilvánul, míg az angiogenezis gátlása és a tumor visszafejlődése 20 lassabban következik be. Ez a különbség a terápiás rendet a beadás időzítése és a kívánt hatás tekintetében érinti. Az új érhálózat apoptózisa érdekében az antagonista beadását rendszerint 24 órától kb. négy hétig, előnyösen 48 órától hét napig terjedő ideig végezzük. 25 Gyógyszerkészítmények
A találmány további tárgyát képezik az olyan gyógyszerkészítmények, amelyek alkalmasak a találmány szerinti gyógykezelési eljárások megvalósítására. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények fiziológiai szem- 30 pontból elfogadható hordozót, és - aktív hatóanyagként - a hordozóban oldott vagy diszpergált, találmány szerinti ovp3-antagonistát tartalmaznak. A találmány egy előnyös megvalósítási módja értelmében az θνβ3antagonistát tartalmazó gyógyszerkészítmény - emlős- 35 nek vagy embernek gyógykezelési célból adagolva nem immunogén hatású.
Ahogy a leírásban használjuk, a „gyógyászati szempontból elfogadható”, „fiziológiailag elfogadható” vagy „fiziológiai szempontból elfogadható” kifejezéseket és szinonimáikat - amennyiben készítményekre, hordozókra, hígitószerekre és reagensekre vonatkoznak - egymással helyettesíthető módon alkalmazzuk, és azt jelentik, hogy az adott anyag egy emlősnek anélkül adható be, hogy nemkívánatos fiziológiai hatásokat (például hányingert, szédülést, rendetlen gyomorműködést és hasonlókat) okozna.
Egy - oldott vagy diszpergált állapotban aktív hatóanyagokat tartalmazó - gyógyászati készítmény többféle alakban, ismert módszerekkel állítható elő. Az ilyen készítményeket rendszerint injektálható alakban - folyékony oldatok vagy szuszpenziók formájában - állítjuk elő, azonban szilárd alakok is előállíthatók, amelyekből a felhasználás előtt oldatok vagy szuszpenziók készíthetők. A készítmény emulgeált állapotban is előállítható.
Az aktív hatóanyagot a találmány szerinti gyógykezelési eljárásokban történő alkalmazáshoz megfelelő mennyiségben, gyógyászati szempontból elfogadható - az aktív hatóanyaggal kompatibilis - hordozóval és egyéb segédanyaggal elegyíthetjük. Az alkalmas hordozók közé tartozik, például, a víz, sóoldat, dextróz, glicerin, etanol és hasonlók, valamint ezek kombinációi. A készítmény, kívánt esetben, kis mennyiségben tartalmazhat kiegészítő anyagokat is, például nedvesítővagy emulgeálószereket, puffereket és hasonlókat, melyek fokozzák az aktív hatóanyag hatékonyságát.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények az alkalmazott komponensek - gyógyászati szempontból elfogadható - sóit is tartalmazhatják. Az alkalmas, gyógyászati szempontból elfogadható sók közé tartoznak a savaddíciós sók, melyek a polipeptidből és - szabad aminocsoportjával reagáló - savból képződnek; a savak lehetnek szervetlen savak (például sósav vagy foszforsav) vagy szerves savak (például ecetsav, borkősav, mandulasav és hasonlók). A polipeptidek szabad karboxilcsoportjaival képzett sók szintén származhatnak szervetlen bázisokból, például nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium- vagy vas(III)-hidroxidból, illetve szerves bázisokból, például izopropil-aminból, trimetilaminból, 2-etil-amino-etanolból, hisztidinből, prokainból és hasonlókból.
Ciklusos a^3-antagonist-polipeptidek készítményeiben különösen előnyösen alkalmazhatók a TFA és sósav sói. A peptidek jellemző sóit a példákban ismertetjük.
A fiziológiai szempontból elfogadható hordozók a szakirodalomból jól ismertek. A folyékony hordozók példái közé tartoznak a steril vizes oldatok, amelyek az aktív hatóanyagon és a vízen kívül más anyagot nem tartalmaznak, vagy amelyek puffért (például fiziológiai pH-értéket biztosító nátrium-foszfát-puffert), sóoldatot vagy puffért és sóoldatot (például foszfátpufferelt sóoldatot) is tartalmaznak. A vizes hordozók tartalmazhatnak több puffersót, továbbá egyéb sókat (mint például nátrium- és kálium-kloridot), dextrózt, polietilénglikolt és egyéb oldott anyagokat is.
A folyékony készítmények a vízen kívül vagy a víz helyett tartalmazhatnak egyéb folyékony fázisokat is, 40 melyek példáiként a glicerin, a növényi olajok (például gyapotmagolaj) és víz-olaj szuszpenziók említhetők.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmény egy találmány szerinti a^3-antagonista angiogenezist gátló mennyiségét tartalmazza. A készítményt általában úgy 45 állítjuk elő, hogy a készítmény teljes tömegére vonatkoztatva legalább 0,1 tömeg% a^3-antagonistát tartalmazzon, ami azt jelenti, hogy a készítmény 100 g-ja 0,1 g inhibitort tartalmaz.
Az a.$3-integrin antagonistái
A találmány szerinti eljárásokban az a^3-antagonistákat a szövetekben lezajló angiogenezis gátlására alkalmazzuk. Különböző olyan vegyületek léteznek, amelyek az a^3-integrinnel úgy lépnek kölcsönhatásba, hogy megakadályozzák az a^3-integrin természetes a^3-ligandumokkal bekövetkező, funkcionális kölcsönhatását. A példaként szolgáló antagonisták közé tartoznak az ανβ3 ligandumkötő helyéből származó α^-analógok; az α^-integrint vagy az avp3-integrin természetes ligandumát utánzó molekulák, amelyek az a^3-integrin és liganduma kötődési interakcióiban sze9
HU 221 988 Bl repet játszó strukturális régiókat utánozzák; az ανβ3-ίηtegrinre specifikus természetes ligandum funkcionális kötődoménjének (különösen az avp3-integrin természetes ligandumának RGD-tartalmú doménjének) megfelelő szekvenciát tartalmazó polipeptidek; valamint az a^3-integrinnel vagy természetes doménjével immunreakcióba lépő antitestek (a felsorolt antagonisták közös jellemzője, hogy a leírásban meghatározott antagonistaaktivitást mutatnak.
Polipeptidek
A találmány egyik megvalósítási módja szerint az a^-antagonistákat polipeptidek alakjában alkalmazzuk. Egy a^-antagonista-polipeptid az a^3-integrin vagy az a^3-integrin természetes liganduma szekvenciajellemzőit mutathatja (az avP3-ligandum kölcsönhatásban szerepet játszó régióban), és a^3-antagonistaaktivitású. Egy előnyös avp3-antagonista peptid RGDtripeptidet tartalmaz, és szekvenciája a természetes ligandum RGD-tartalmú régiója szekvenciájának megfelelő.
Az előnyös RGD-tartalmú polipeptidek aminosavszekvenciája az a^3-integrin természetes liganduma (mint például a fibrinogén, vitronektin, „von Willebrand”-faktor, laminin, trombospondin és hasonlók) RGD-tartalmú régiójának felel meg. Ezen avp3-ligandumok szekvenciája jól ismert. Ilyenformán, az a^3antagonista-peptidek bármilyen természetes ligandumból származhatnak, de a fibrinogénből és vitronektinből származó antagonista peptidek előnyösek.
Az egyik különösen előnyös a^3-antagonista-peptid (más, fentebb említett integrinekkel szemben) elsősorban az θνβ3 - természetes ligandumához (ligandumaihoz) való - kötődését gátolja. Az ilyen ανβ3specifikus peptidek abból a szempontból mindenképpen előnyösek, hogy a^3-specifitásuk csökkenti a nemkívánatos mellékhatások (mint például egyéb integrinek gátlása) előfordulását. Az a^-specifitású ανβ3antagonista-peptidek hagyományos kötődési gátlás vizsgálattal (például a példákban leírt ELISA-vizsgálattal) könnyen azonosíthatók.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében olyan polipeptidet alkalmazunk, amely legfeljebb kb. 100 aminosavat, előnyösen legfeljebb kb. 60 aminosavat, előnyösebben legfeljebb kb. 30 aminosavat tartalmaz. Lineáris vagy ciklusos peptideket egyaránt alkalmazhatunk, bár a ciklusos peptidek különösen előnyösek. Az előnyös ciklusos és lineáris peptideket és jelölésüket az 1. táblázatban mutatjuk be.
Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti polipeptidnek nem kell szükségszerűen azonosnak lennie a természetes avp3-ligandum aminosavszekvenciájával, feltéve, hogy a polipeptid a kívánt szekvenciát tartalmazza, és - megfelelő vizsgálatban - képes avP3-antagonistaként működni.
Egy találmány szerinti polipeptid magában foglalja (a leírásban bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó) polipeptid bármilyen analógját, fragmensét vagy kémiai származékát, feltéve, hogy a polipeptid avp3-antagonista tulajdonságú. Ennek megfelelően, egy találmány szerinti polipeptid különböző módosításoknak, szubsztitúcióknak, inszercióknak és delécióknak vethető alá, ha az ilyen módosítások a polipeptid alkalmazhatóságában bizonyos előnyöket biztosítanak. Ebben a vonatkozásban a találmány szerinti avp3-antagonista-polipeptid egy ismertetett peptid aminosavszekvenciájának megfelelő (és nem azonos azzal), amelyben egy vagy több módosítás található, és amely - egy vagy több, itt leírt vizsgálatban - megtartja a^3-antagonista működését.
Ennek megfelelően, bármilyen peptidszármazékot alkalmazhatunk; például, amidokat, proteinekkel képzett konjugátumokat, gyűrűvé zárt peptideket, polimerizált peptideket, analógokat, fragmenseket, kémiailag módosított peptideket és hasonló származékokat
Az „analóg” kifejezésen olyan polipeptideket értünk, amelyek aminosavszekvenciája lényegében azonos egy olyan - a leírásban ismertetett - aminosavszekvenciával, amelyben egy vagy több aminosav funkcionálisan azonos aminosavval konzervatívan szubsztituált, és amely a^3-antagonista-aktivitást képes kifejteni. A konzervatív szubsztitúciók példái közé tartoznak azok a szubsztitúciók, melyek során apoláros (hidrofób) aminosavakat (például izoleucint, valint, leucint vagy metionint) helyettesítünk egymással; amikor poláros (hidrofil) aminosavakat helyettesítünk egymással, például arginint lizinnel, glutamint aszparaginnal, glicint szerinnel; amikor bázisos aminosavakat (például lizint, arginint vagy hisztidint) helyettesítünk egymással^ vagy ha savas aminosavakat (például aszparaginsavat vagy glutaminsavat) helyettesítünk egymással.
A „konzervatív szubsztitúció” kifejezés magában foglalja azt az esetet is, amikor egy aminosav helyett kés miailag derivatizált aminosavat alkalmazunk (feltéve,, hogy az így kapott polipeptid továbbra is megtartja kívánt gátló aktivitását).
A „kémiai származék” kifejezés olyan találmány szerinti polipeptidre vonatkozik, amely egy vagy több - funkciós csoportján kémiai úton derivatizált - aminosavat tartalmaz. Az ilyen derivatizált molekulák közé tartoznak például, azok, amelyekben a szabad aminocsoportokat úgy (Privatizáltuk, hogy amin-hidrokloridokat, p-toluolszulfonil-csoportokat, karbobenz-oxicsoportokat, t-butil-oxi-karbonil-csoportokat, klór-acetil-csoportokat vagy formilcsoportokat alkossanak. A szabad karboxilcsoportok sókká, metil- és etil-észterekké vagy más észterekké, illetve hidrazidokká, a szabad hidroxilcsoportok O-acil- vagy O-alkil-származékokká derivatizálhatók. A hisztidin imidazol-nitrogénjét úgy derivatizálhatjuk, hogy N-imbenzil-hisztidint kapjunk. Szintén a kémiai származékok közé tartoznak azok a peptidek, amelyek a húsz standard aminosav egy vagy több, természetben előforduló aminosavszármazékát tartalmazzák. Az ilyen származékok például, prolin helyett 4-hidroxi-prolint; lizin helyett 5hidroxi-lizint; hisztidin helyett 3-metil-hisztidint; szerin helyett homoszerint, lizin helyett omitint tartalmazhatnak. A találmány szerinti polipeptidek közé tartoznak az olyan polipeptidek is, amelyek a találmány leírásában ismertetett polipeptid aminosavszekvenciájától egy vagy több aminosav addíciója és/vagy delé10
HU 221 988 Bl ciója miatt különböznek, feltéve, hogy megtartják kívánt aktivitásukat.
A „fragmens” kifejezés olyan, találmány szerinti polipeptidekre vonatkozik, amelyek rövidebb aminosavszekvenciát tartalmaznak, mint azok a polipeptidek, me- 5 lyeknek aminosavszekvenciáját a leírásban ismertetjük.
Ha a találmány szerinti polipeptid olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely nem azonos a természetes Ov^-liganduméval, annak rendszerint az az oka, hogy a polipeptid egy vagy több (konzervatív vagy nem kon- 10 zervatív) szubsztitúciót tartalmaz, melyek általában az aminosavak legfeljebb kb. 30%-át, előnyösen legfeljebb kb. 10%-át érintik. Kapcsolószekvencia („linker”) kialakítása érdekében a polipeptid bármely végéhez további aminosavak kapcsolhatók, melyek révén a talál- 15 mány szerinti polipeptidek jelölőanyaghoz, szilárd közeghez vagy hordozóhoz rögzíthetők.
A találmány szerinti polipeptidekhez alkalmazható jelölőanyagokat, szilárd közegeket és hordozókat a későbbiekben ismertetjük. 20
Az aminosav kapcsolószekvenciák legalább egy aminosavból állnak, de tartalmazhatnak 40 vagy több aminosavat is; rendszerint 1-10 aminosavból állnak, és nem képeznek avP3-ligandum-epitópot. A kapcsoláshoz jellemzően alkalmazott aminosavak közé tartozik 25 a tirozin, cisztein, lizin, glutaminsav, aszparaginsav és hasonlók. A találmány szerinti polipeptid - ha másképpen nem jelezzük - terminális aminocsoportjának acilezése (például acetilezése vagy tioglikolsavas aminálása) révén, vagy (például ammóniával vagy me- 30 til-aminnal) végzett terminális karboxiaminálása miatt, illetve hasonló terminális módosítások következtében is eltérhet az avp3-ligandum természetes szekvenciájától. Jól ismert, hogy a terminális módosítások hasznosak a proteinázos emésztésre mutatott fogékonyság 35 csökkentésében, ezáltal oldatokban - különösen olyan biológiai folyadékokban, melyekben előfordulhatnak proteázok - fokozzák a polipeptidek felezési idejét. E tekintetben a polipeptid gyűrűvé zárása szintén hasznos terminális módosítás, és különösen előnyös, mivel 40 a gyűrűvé zárás stabil szerkezetet biztosít, és az ilyen ciklusos peptidek magas szintű biológiai aktivitást fejtenek ki.
A találmány szerinti peptidek bármelyike alkalmazható gyógyászati szempontból elfogadható só alakjá- 45 bán. A találmány szerinti peptidekkel sókat képező savak közé szervetlen és szerves savak egyaránt tartoznak; ilyenek például a trifluor-ecetsav (TFA), sósav (HC1), hidrogén-bromid, perklórsav, salétromsav, tiociánsav, kénsav, foszforecetsav, propionsav, glikolsav, 50 tejsav, piroszőlősav, oxálsav, malonsav, borostyánkősav, maleinsav, fumársav, antranilsav, fahéjsav, naflalin-szulfonsav, szulfanilsav és hasonlók. Különösen előnyösek a HC1- és TFA-sók.
A találmány szerinti peptidekkel sóképzésre alkal- 55 más bázisok közé szervetlen bázisok (például nátriumhidroxid, ammónium-hidroxid, kálium-hidroxid és hasonlók), illetve szerves bázisok - mono-, di- és trialkilés aril-aminok (például trietil-amin, diizopropil-amin, metil-amin, dimetil-amin és hasonlók), és adott esetben 60 szubsztituált etanol-aminok (például etanol-amin, dietanol-amin és hasonlók) egyaránt tartoznak.
A találmány szerinti peptidek bármilyen, szakember számára ismert eljárással - ideértve a rekombináns DNS-technikákat - szintetizálhatok. Előnyösek a szintetikus kémiai technikák (mint például a szilárd fázisú „Merrifíeld”-féle szintézis), mivel alkalmazásukkal nagy tisztaság és antigénspecifitás érhető el, nem képződnek nemkívánatos melléktermékek, és a peptidek könnyen előállíthatók. A rendelkezésre álló számos eljárás leírását lásd (a szilárd fázisú peptidszintézist illetően): Steward és munkatársai: „Solid Phase Peptide Synthesis”, W. H. Freeman Co., San Francisco (1969); Bodanszky és munkatársai: „Peptide Synthesis”, John Wiley & Sons, II. kiadás (1976); J. Meienhofer: „Hormonal Proteins and Peptides” 2. kötet, 46. old., Academic Press (New York, 1983); Merrifleld: Adv. Enzymol. 32, 221 (1969); Fields és munkatársai: Int. J. Peptide Protein Rés. 35, 161 (1990); és 4,244,946 számú egyesült államokbeli közzétételi irat; (a klasszikus, oldatban végzett peptidszintézist illetően pedig): Schroder és munkatársai: „The Peptides”, 1. kötet, Academic Press (New York, 1965) (valamennyi hivatkozást teljes egészében a kitanítás részének kell tekinteni). A peptidszintézis során alkalmazható védőcsoportok leírását lásd a fenti forrásokban, illetve J. F. W. McOmie: „Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, New York (1973), melyet szintén a kitanítás részének, kell tekinteni.
A szilárd fázisú szintézis során, általában, egymást; követően egy vagy több aminosavat (vagy megfelelői! védőcsoporttal ellátott aminosavat) adunk a növekvő peptidlánchoz. Normális esetben az első aminosav amino- vagy karboxilcsoportját egy megfelelő, szelektíven eltávolítható védőcsoporttal védjük. A reaktív oldalcsoportot tartalmazó aminosavak (mint például a lizin) esetében másféle, szelektíven eltávolítható védőcsoportot alkalmazunk.
Szilárd fázisú szintézis alkalmazásakor a védett vagy derivatizált aminosavat - nem védett karboxilvagy aminocsoportjánál - inért, szilárd hordozóhoz kapcsoljuk. Ezután az amino- vagy karboxilcsoport védőcsoportját szelektív módon eltávolítjuk, és a sorban következő - amino- vagy karboxilcsoportján megfelelően védett - aminosavat a szilárd hordozóhoz kapcsolt aminosawal elegyítjük és reagáltatjuk, olyan körülmények között, melyek alkalmasak a két aminosav közötti amidkötés kialakulásához. Az új aminosav amino- vagy karboxilcsoportjáról eltávolítjuk a védőcsoportot, majd hozzáadjuk a következő, megfelelően védett aminosavat stb. Miután valamennyi, kívánt aminosavat - megfelelő sorrendben - összekapcsoltuk, egymást követően vagy egyszerre eltávolítjuk a terminális és oldalcsoportok védőcsoportjait (valamint a szilárd hordozót), miáltal a kívánt, lineáris polipeptidet kapjuk.
A - például - fentiek szerint előállított lineáris polipeptideket megfelelő ciklusos peptidjeik kialakítása érdekében tovább reagáltathatjuk. A peptidek gyűrűvé zárásának egyik - példaként szolgáló - eljárását Zimmer és munkatársai írták le [Peptides 1992, 393. old.,
HU 221 988 Β1
ESCOM Science Publishers, Β. V. (1993)]. A gyűrűvé záráshoz rendszerint terc-butoxi-karbonil-csoporttal védett peptid-metil-észtert metanolban oldunk, nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá, és az elegyet 20 °C-on reagáltatjuk, hogy hidrolízissel eltávolítsuk a metil-ész- 5 tér védőcsoportot. Az oldószer elpárologtatósa után a terc-butoxi-karbonil-csoporttal védett pepiidet - savanyított vizes oldószerből - etil-acetáttal extraháljuk, majd dioxán közös oldószerben, enyhén savas környezetben eltávolítjuk a terc-butoxi-karbonil-csoportot. Az 10 így kapott, szabad N- és C-terminálisú lineáris peptidet úgy alakítjuk ciklusos peptiddé, hogy híg oldatát diklór-metán és dimetil-formamid elegyében - 1-hidroxi-benzotriazol és N-metil-morfolin jelenlétében - diciklohexil-karbodiimiddel reagáltatjuk. A kapott ciklu- 15 sós peptidet kromatográfiával tisztítjuk.
A ciklusos peptidek előállításának különösen előnyös eljárását Gurrath és munkatársai írták le [Eur. J. Biochem. 210, 911 (1992)], melyet a példákban ismertetünk.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításá- 20 bán alkalmazható, különösen előnyös peptidek közé tartozik a c-(GrGDFV) (4. azonosító számú szekvencia); c(RGDfV) (5. azonosító számú szekvencia); c-(RADfV) (6. azonosító számú szekvencia); c-(RGDFv (7. azonosító számú szekvencia), és a lineáris YTAECKPQVTRG- 25 DVF-peptid (8. azonosító számú szekvencia) („c” jelentése ciklusos peptid; a nagybetűk az L-aminosavakat, a kisbetűk a D-aminosavakat jelölik). E peptidek aminosavszekvenciáit a szekvencialista 4., 5., 6., 7., illetve 8. azonosító számú szekvenciájaként mutatjuk be. 30
Monotíonális antitestek
A találmány egyik megvalósítási módja szerint OvPj-antagonistaként monoklonális antitesteket alkalmazunk, melyek immunreakcióba lépnek az OvPj-integrinnel, és gátolják természetes ligandumához való kötő- 35 dését. A találmányban feltárjuk az ilyen antitesteket termelő sejtvonalakat, az ilyen sejtvonalak előállítására alkalmas eljárásokat, valamint a monoklonális antitestek előállítási eljárásait is.
A találmány szerinti monoklonális antitest olyan an- 40 titestmolekulákból áll, melyek (1) immunreakcióba lépnek az izolált OvPj-integrinnel, és (2) gátolják a fibrinogén Ovpj-integrinhez való kötődését. A specifikusan a^-integrinhez kötődő, előnyös monoklonális antitestek közé azok tartoznak, amelyek - az ATCC- 45 HB-9537 hibridóma-sejtvonal által szekretált - monoklonális LM609-antitest immunreaktív sajátságait mutatják. Az ATCC-HB-9537 hibridóma-sejtvonalat a Budapest Szerződés értelmében, 1987. szeptember 15én az,American Type Culture Collection” (ATCC) in- 50 tézetnél (1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) helyeztük letétbe.
Az „antitest” vagy ’antitestmolekula”kifejezésen a leírásban immunglobulin-molekulákat és/vagy immunglobulin-molekulák immunológiailag aktív részét ért- 55 jük, vagyis olyan molekulákat, amelyek „antitestkombinálódási helyet” („antibody combining site”) vagy paratopot tartalmaznak.
Az „antitestkombinálódási hely” az antitestmolekula azon strukturális része, amely nehéz és könnyű Ián- 60 cú, variábilis és hipervariábilis régiókból áll, és amely specifikusan kötődik az antigénhez.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában alkalmazható antitestek példái közé tartoznak az ép immunglobulin-molekulák, a lényegében ép immunblogulin-molekulák és az immunglobulin-molekulák paratopot tartalmazó részei, köztük a „Fab”, „Fab”’, F(ab’)j és F(v) néven ismert régiók, melyeket antitestfragmenseknek is nevezünk.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint egy találmány szerinti monoklonális antitestből származó Fab-fragmenst tartalmazó, rövidített immunglobulint alkalmazunk. Az Fc-receptor nélküli Fab-ffagmens oldékony, és a vérszérumban mutatott felezési ideje miatt terápiás előnyöket, felhasználási lehetőségei miatt pedig diagnosztikai előnyöket biztosít Az oldható Fab-fragmens előállítása szakember számára ismert, és számos eljárással megvalósítható.
Az antitestek Fab- és F(ab’)2-fragmensei, például, lényegében ép antitestek papainnal, illetve pepszinnel végzett proteolitikus reakciójával, jól ismert eljárások alkalmazásával állíthatók elő [lásd például 4,342,566 számú egyesült államokbeli közzétételi irat (Theofilopolous és Dixon)]. A Fab’-antitestfragmensek szintén jól ismertek, és a F(ab’)2-ffagmensek nehéz láncait összekötő diszulfidkötések (például merkapto-etanollal végzett) re-» dukálásával, majd a képződött protein-merkaptán (pék dául jód-acetamiddal végzett) alkilezésével állíthatók · elő. Előnyösen ép immunglobulin-molekulákat tartalmazó antitestet alkalmazunk.
A „monoklonális antitest” kifejezés olyan antitestmolekulák csoportjára vonatkozik, amelyek csak egyféle antitestkombinálódási helyet tartalmaznak, amely csak egy bizonyos epitóppal képes immunreakcióba lépni. Ennek megfelelően, a monoklonális antitestek jellemzően bármely epitóp felé (amellyel immunreakcióba lépnek) egyféle kötési affinitást mutatnak. Következésképpen, egy monoklonális antitest tartalmazhat olyan antitestmolekulát, amely számos antitestkombinálódási helyet hordoz, melyek mindegyike különböző epitópra immunspecifikus (például bispecifikus monoklonális antitest).
Egy monoklonális antitest jellemzően egyetlen sejt (hibridóma) kiónjai által termelt antitestekből áll, mely hibridómasejt csak egyféle antitestmolekulát szekretál (termel). A hibridómasejt egy antitesttermelő sejt és egy mieloma- (vagy más, önfenntartó) sejtvonal fúziójával állítható elő. Az ilyen antitestek előállítását elsőként Kohler és Milstein írták le [Natúré 256, 495 (1975), mely leírást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni]. További eljárások leírását lásd Zola: „Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques”, CRC Press, Inc. (1987). A hibridómából nyert felülúszót olyan az avP3-integrinnel immunreakcióba lépő antitestmolekulák jelenlétére és az Oypj-integrin - természetes ligandumaihoz való - kötődésének gátlására vizsgálhatjuk.
Röviden; olyan hibridóma kialakítása érdekében, amelyből antitest állítható elő, egy mieloma-sejtvonalat (vagy más, önfenntartásra képes sejtvonalat) - egy
HU 221 988 Β1 a^-forrással, például humán M21-melanoma-sejtvonalból izolált avp3-integrinnel [Cheresh és munkatársai:
J. Bioi. Chem. 262, 17703 (1987)] - hiperimmunizált emlős lépéből nyert limfocitákkal fuzionálunk.
A hibridóma előállításához előnyösen ugyanabból a 5 fajból származó mieloma-sejtvonalat alkalmazunk, amelyből a limfocitákat nyeljük (ilyen emlősként előnyösen a 129-GlX+-törzsbe tartozó egeret alkalmazunk). A találmány szerinti alkalmazáshoz megfelelő egérmielomák közé tartozik a hipoxantin-aminopterin- 10 timidin-szenzitív (HAT-szenzitív) P3X63-Ag8.653- és Sp2/0-Agl4-sejtvonal. Ez a két sejtvonal az .American Type Culture Collection” intézetnél (Rockville, MD) CRL-1580, illetve CRL-1581 jelzésű sejtvonalként férhető hozzá. 15
A szplenocitákat rendszerint polietilénglikol(PEG)-1500 alkalmazásával fuzionáljuk a mielomasejtekkel. A fuzionált hibrideket HAT-szenzitivitásuk alapján szelektáljuk. A találmány szerinti monoklonális antitestet termelő hibridómákat a példákban leírtak sze- 20 rint enzimkötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA) azonosítjuk.
A találmány szerinti monoklonális antitestek - megfelelő tápközegben kívánt specifitású antitestmolekulákat szekretáló hibridómát tartalmazó - monoklonális 25 hibridómatenyészet kialakításával is előállíthatók. A tenyésztést annyi ideig és olyan feltételekkel végezzük, amelyek elégségesek annak biztosítására, hogy a hibridóma antitestmolekulákat szekretáljon a tápközegbe.
A tenyésztés után az antitesteket tartalmazó tápközeget 30 összegyűjtjük, és az antitestmolekulákat ismert eljárásokkal izoláljuk.
Az ilyen készítmények előállításához alkalmas közegek szintén jól ismertek, és kereskedelmi forgalomban beszerezhetők; ilyenek például a szintetikus tenyésztő 35 tápközegek, a beltenyésztett egerek és hasonlók. Az egyik példaként szolgáló szintetikus tápközeg a 4,5 g/1 glükózzal, 20 mM glutaminnal és 20% magzati boíjúszérummal kiegészített - ,JXilbecco”-féle minimál esszenciális tápközeg (DMEM) [Dulbecco és mun- 40 katársai: Virol. 8,396 (1959)]. A beltenyésztett egértörzsek példájaként a Balb/c-törzs említhető.
A monoklonális antitestek, hibridómasejtek vagy hibridóma-sejttenyészetek előállítási eljárásai szakember számára jól ismertek [lásd például Sastry és munka- 45 társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5728 (1989); Huse és munkatársai: Science 246,1275 (1989)].
A találmány leírásában feltárjuk a találmány szerinti monoklonális antitest előállításához alkalmazott hibridómasejteket és az ilyen hibridómasejteket tartalmazó te- 50 nyészeteket is. Különösen előnyös az a hibridóma-sejtvonal, amely az ATCC-HB-9537 jelzésű monoklonális LM609-antitestet szekretálja. A monoklonális LM609antitestet Cheresh és munkatársai leírása szerint állítottuk elő [Cheresh és munkatársai: J. Bioi. Chem. 262, 17 703 55 (1987)]. Az előállítási eljárást a példákban is leírjuk.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében olyan monoklonális antitestet alkalmazunk, amely az LM609 monoklonális antitest immunreaktív tulajdonságaival bír. 60
Elvárható mennyiségű kísérleti munka elvégzésével megállapítható, hogy egy adott monoklonális antitest azonos specifitású-e a találmány szerinti monoklonális antitesttel (vagyis egyenértékű-e vele), oly módon, hogy megbizonyosodunk arról, vajon az előbbi megakadályozza-e az utóbbit, hogy egy előre kiválasztott célmolekulához kötődjön. Amennyiben a tesztelt monoklonális antitest verseng a találmány szerinti monoklonális antitesttel (amit standard kompetíciós vizsgálatban, szilárd fázisban a találmány szerinti monoklonális antitest célmolekulához való kötődésének csökkenése jelez), valószínűsíthető, hogy a két monoklonális antitest ugyanahhoz - vagy közeli rokonságban álló epitóphoz kötődik.
Egy másik eljárás szerint - mellyel szintén meghatározható, hogy egy adott monoklonális antitest azonos specifitású-e a találmány szerinti monoklonális antitesttel - a találmány szerinti monoklonális antitestet azzal a célmolekulával inkubáljuk, amellyel normális esetben reaktív, majd hozzáadjuk a tesztelni kívánt monoklonális antitestet, hogy meghatározzuk, vajon gátolt-e a tesztelt monoklonális antitest célmolekulához való kötődési képessége. Amennyiben a kötődés gátolt, valószínű, hogy a tesztelt antitest azonos - vagy funkcionálisan egyenértékű - epitópspecifitású, mint a találmány szerinti monoklonális antitest.
Egy további eljárás szerint - mellyel szintén meghatározható, hogy egy adott monoklonális antitest azonos» specifitású-e a találmány szerinti monoklonális antitesttel - meghatározzuk a kérdéses antitestek CRD-régióinak aminosavszekvenciáját. Azok az antitestmoleku»lák, amelyek CDR-régiójukban azonos vagy funkcionálisan egyenértékű aminosavszekvenciát tartalmaznak, azonos kötési specifitásúak. A polipeptidek szekvenálási eljárásai szakember számára jól ismertek.
Egy antitest immunspecifitását, célmolekulájának kötési kapacitását, illetve az antitest epitóp felé mutatott affinitását az az epitóp határozza meg, amellyel az antitest immunreakcióba lép. Az epitópspecifitást - legalább részben - az immunglobulin nehéz lánca variábilis régiójának aminosavszekvenciája, részben pedig a könnyű lánc variábilis régiójának aminosavszekvenciája határozza meg.
Az „azonos kötési specifitású” kifejezés azt jelenti, hogy az egyenértékű monoklonális antitestek hasonló vagy azonos immunreaktív (kötési) jellemzőket mutatnak, és egy előre kiválasztott célmolekulához történő kötődés során egymással kompetícióban állnak.
A humanizált monoklonális antitestek előnyösebbek, mint az egér monoklonális antitestek, elsősorban azért, mert emberek gyógykezelése során is alkalmazhatók. Az emberi antitestek nem ürülnek ki a keringésből olyan gyorsan, mint az „idegen” antigének, és nem aktiválják úgy az immunrendszert, mint az idegen antigének és az idegen antitestek. A „humanizált” antitestek általános előállítási eljárásai jól ismertek, és ezek alkalmazhatók a találmány szerinti antitestek előállítására is.
Ilyenformán, a találmány egyik megvalósítási módja szerint olyan, találmány szerinti monoklonális an13
HU 221 988 Β1 titestet alkalmazunk, amelyet átültetéssel („grafting”) humanizáltunk, annak érdekében, hogy az emberi immunrendszer komponenseit anélkül lehessen bevinni, hogy jelentősen befolyásolnánk az antitest antigénkötő képességét. 5 ajfcspecifikus utánzómolekulák
A találmány leírásában bemutatjuk, hogy a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában általánosan alkalmazhatók az a^-antagonisták - melyek lehetnek polipeptidet, antitestek és egyéb moleku- 10 Iák, melyeket „utánzómolekuláknak” nevezünk -, amelyek gátolják az avP3-integrin működését. Különösen előnyösek azok az antagonisták, amelyek specifikusan az avp3-integrin működését akadályozzák, más integrinekét azonban nem. 15
A találmány szerinti eljárásokban számos különféle reagens alkalmazható, feltéve, hogy a kívánt biológiai aktivitással bírnak. Ezeket a reagenseket általában utánzómolekuláknak nevezzük, mivel képesek „utánozni” a receptor-ligandum kölcsönhatásban szerepet játszó 20 - az avp3-integrinen vagy az avp3-ligandumon lévő kötődomént, s ezáltal akadályozza (azaz gátolja) a normális működést.
Az avp3-utánzómolekula (antitest- vagy ligandumeredetű peptid kivételével) bármilyen - fenti tulajdonsá- 25 gokat mutató - molekula lehet; például, egy peptid szintetikus analógja, az említett kötődőmén kötőhelyéhez hasonló alakú vegyület, vagy egyéb molekula.
Egy ovp3-utánzómolekula tervezéséhez a gyógyszertervezés jól ismert, strukturális vizsgálati módsze- 30 rei - mint például a molekuláris modellezés; kétdimenziós mágneses magrezonancia-spektroszkópia (2-D NMR); röntgensugaras krisztallográfia; peptid-, peptidanalóg- vagy más kémiai polimerkönyvtárak random szkrínelése; és hasonló gyógyszertervezési technoló- 35 giák) bármelyikét alkalmazhatjuk.
A leírásban strtukturáhs szempontból bebizonyítjuk, hogy egy a^-antagonista egyaránt lehet kisméretű polipeptid vagy monoklonális antitest (vagyis két, teljesen eltérő kémiai struktúra), melyek közös funkcioná- 40 lis tulajdonsága, hogy szelektíven gátolják az ανβ3-ΐηtegrint. Ennek megfelelően, a találmány szerinti eljárásokban - találmány szerinti α^-antagonistaként bármilyen, fentebb meghatározott avP3-utánzómolekula alkalmazható. 45
Eljárások az a$rantagonisták azonosítására
A találmány leírásában feltáljuk a találmány szerinti eljárásokban alkalmazható, lehetséges avP3-antagonisták azonosítási eljárásait is. Az ilyen vizsgálati eljárásokban a kiszemelt molekulákat az avp3-integrin 50 természetes ligandumaihoz való kötődésének gátlási képességére, illetve egy szövetben az angiogenezis gátlásának képességére értékeljük.
Az első vizsgálatban az avp3-integrin természetes ligandumához való közvetlen kötődésének gátlását mér- 55 jük (a példákban részletesen leírjuk e vizsgálat egy előnyös megvalósítási módját). E vizsgálat során - ELISAanalízissel - egy természetes ligandum (például a fibrinogén) szilárd fázisban lévő, izolált avP3-integrinhez való kötődésének gátlását méljük. 60
Ez a vizsgálat felhasználható azoknak a vegyületeknek az azonosítására is, amelyek specifikusak az ανβ3-ίηtegrinre, de a természetes ligandumok egyéb integrinekhez történő kötődését nem gátolják. A specifitási vizsgálatot két párhuzamos ELISA-vizsgálattal végezzük, melynek során két vizsgálati edényben az ανβ3-ίηtegrint és az egyéb integrineket egyidejűleg arra vizsgáljuk, hogy képesek-e megkötni a természetes ligandumot, a kiszemelt antagonista vegyületet pedig arra vizsgáljuk, hogy gátolja-e az integrinek előre kiválasztott ligandumhoz történő kötődését. A vizsgálatok kivitelezésének előnyös módszereit a példákban mutatjuk be.
A második vizsgálati eljárásban csirkechorioallantois-membránban (CAM) mérjük az angiogenezist. Ezt a vizsgálatot CAM-vizsgálatnak nevezzük. Ezt a vizsgálatot korábban más kutatók már leírták, és tumorszövetekben az angiogenezis és a neovascularisatio mérésére alkalmazták [lásd Ausprunk és munkatársai: Am. J.
Pathol. 79, 597 (1975) és Ossonski és munkatársai:
Cancer Rés. 40, 2300 (1980)].
A CAM-vizsgálat az in vivő angiogenezis széles körben elfogadott vizsgálati modellje, mivel a teljes szövet neovascularisatiója bekövetkezik, és a tényleges csirkeembrió-véredények belenőnek a chorioallantoismembránba (vagy a membránon fejlődött szövetbe).
A CAM-vizsgálat a neovascularisatio gátlását az újj , :
vérerek növekedésének mennyisége és mértéke alapján . , jellemzi. Ezenkívül, alkalmazásával könnyen nyomon követhető a membránra transzplantált bármely szöveti χ (például tumorszövet) növekedése, λ/égül, ez a vizsgá- j lat különösen alkalmas, mivel a toxicitás belső kontrollt >
ját biztosítja, ugyanis - a csirkeembriót a tesztelt reá? { gens hatásának kitéve - az embrió egészségi állapota 4 jelzi a toxicitás nagyságát. Γ
A harmadik vizsgálati eljárással az angiogenezist in | vivő nyúlszemmodellben vizsgáljuk (ezt az eljárást } nyúlszemvizsgálatnak nevezzük). A vizsgálatot koráb- bán más kutatók már részletesen leírták, és angiogéninhibitorok (mint például „thalidomide”) jelenlétében angiogenezis és neovascularisatio mérésére alkalmazták [lásd D’Amato és munkatársai: Proc. Natl. Acad.
Sci. 91, 4082 (1994)].
A nyúlszemvizsgálat az in vivő angiogenezis elfogadott vizsgálati modellje, mivel a neovascularisatio folyamata (a vérerek szaruhártyaszegélytől a szaruhártya belsejébe történő növekedése) - a természeténél fogva átlátszó szaruhártyán keresztül - egyszerűen megfigyelhető. Ezenkívül, az idő függvényében könnyen ellenőrizhető a neovascularisatio serkentésének vagy gátlásának, illetve a neovascularisatio visszafejlődésének mértéke és nagysága.
A nyulak bármilyen tesztelt reagenssel kezelhetők, így a nyulak egészségi állapota jelzi az adott reagens toxicitását.
A negyedik vizsgálati eljárásban (melyet kimérikus egérvizsgálatnak nevezünk) az angiogenezist kimérikus egér: humán egérmodellben mérjük. Az eljárást ko- , rábban mások már leírták [lásd Yan és munkatársai: J.
Clin. Invest. 91, 986 (1993)]; a találmány leírásában az angiogenezis, a neovascularisatio és a tumorszövetek
HU 221 988 Β1 visszafejlődésének mérésére történő alkalmazását ismertetjük. A kimérikus egerek alkalmazásával végzett vizsgálat hasznos vizsgálati modellje az in vivő angiogenezisnek, mivel az átültetett idegen bőrszövet szövettanilag nagyon közel áll a normális emberi bőrszövet- 5 hez, és a teljes szövet neovascularisatiója bekövetkezik, melynek során az átültetett emberi bőrből valódi emberi véredények nőnek - az átültetett emberi bőr felületén lévő - emberi tumorszövetbe. Az átültetett emberi szövetben kialakult új érhálózat eredete az érháló- 10 zat - humánspecifikus endotélsejtmarkerek alkalmazásával végzett - immunhisztokémiai festésével igazolható.
A kimérikus egérmodell-vizsgálat az új árnövekedés visszaesésének nagysága és mértéke alapján mutat- 15 ja ki a neovascularisatio visszafejlődését. Ezzel a vizsgálattal könnyen nyomon követhető az átültetett bőrre transzplantált bármilyen szövet (például tumorszövet) növekedésére gyakorolt hatás. Végül, a vizsgálat további előnye, hogy a kimérikus egérnek bármilyen tesztelt 20 reagenst beadhatunk, így az egér egészségi állapota jelzi a reagens toxicitását.
Az alábbiakban a találmány előnyös megvalósítási módjait kísérleti példákon keresztül fogjuk szemléltetni, ami természetesen nem jelenti azt, hogy a találmány 25 szerinti megoldás csak a bemutatott módokon valósítható meg. A találmány leírása alapján szakember számára kézenfekvő, hogy az általunk feltárt speciális megvalósítási módokban számos olyan változtatás hajtható végre, melyekkel továbbra is azonos vagy hasonló eredmé- 30 nyék nyerhetők. Nyilvánvaló, hogy az ilyen megoldások nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől és az igényelt oltalmi körön belül maradnak.
1. példa 35
Szintetikus peptidek előállítása
Az 1. táblázatban felsorolt, lineáris és ciklusos polipeptideket hagyományos szilárd fázisú eljárásokkal szintetizáltuk [lásd például Merrifield: Adv. Enzymol.
32, 221 (1969); Fields, G. B. és Noble, R. L.: Int. J. 40 Peptide Protein Rés. 35, 161 (1990)].
Először 20 g BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-ValOMe peptidet (1. azonosító számú szekvencia) 60 ml metanolban oldottunk, amelyhez 1,5 ml 2 N nátriumhidroxid-oldatot adtunk. A kapott elegyet 20 °C-on há- 45 rom óra hosszat kevertük, majd bepárlás után a visszamaradt anyagot vízben felfogtuk, híg sósavval pH=3ra savanyítottuk, és etil-acetáttal extraháltuk. Az extraktumot nátrium-szulfáton szárítottuk, ismét bepároltuk, és a kapott BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH pép- 50 tidet (2. azonosító számú szekvencia) - 20 ml 2 N sósavval együtt - dioxánban 20 °C-on két óra hosszat kevertük. A kapott elegyet bepárolva a H-Gly-D-ArgGly-Asp-Phe-Val-OH peptidet (3. azonosító számú szekvencia) kaptuk, melyet 1800 ml diklór-metán és 55 200 ml dimetil-formamid (DMF) elegyében feloldottunk, majd 0 °C-ra hűtöttünk. Az elegyhez ezután, keverés közben, egymás után 0,5 g diciklohexil-karbodiimidet (DCCI), 0,3 g 1-hidroxi-benzo-triazolt (HOBt) és 0,23 ml N-metil-morfolint adtunk. 60
A kapott elegyet 0 °C-on 24 óra hosszat, majd 20 °C-on további 48 óra hosszat kevertük. Az oldatot bekoncentráltuk, és a sók eltávolítása érdekében kevert ágyas ioncserélő gyantával kevertük össze. Miután a gyantát szűréssel eltávolítottak, a leszűrt oldatot bepároltuk, és a visszamaradt anyagot kromatográfiával tisztítottuk, miáltal a ciklo-(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) peptidet (4. azonosító számú szekvencia) kaptuk. A következő (az 1. táblázatban egybetűs rövidítések és a peptidazonosító számok alkalmazásával megadott) peptideket szintén a fent leírt eljárással állítottuk elő: cildo-(ArgGly-Asp-D-Phe-Val) (5. azonosító számú szekvencia); ciklo-(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (6. azonosító számú szekvencia); ciklo-(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (9. azonosító számú szekvencia); ciklo-(Arg-Gly-Asp-Phe-DVal) (7. azonosító számú szekvencia). A 66 203 jelzésű peptid - amely a 62 184-es peptidével azonos szekvenciát tartalmaz - csak annyiban különbözik az utóbbitól, hogy TFA-só helyett HCl-sót tartalmaz. A 7. példában leírt angiogenezis-gátlási vizsgálatban (ahol a szintetikus peptideket alkalmaztuk) a 66 203-as peptid (HC1só) csekély mértékben hatásosabban gátolta az angiogenezist, mint a 62 184-es peptid.
1. táblázat
Peptid azonosító száma | Aminosav- szekvencia* | Szekvencia- azonosító szám |
62181 | ciklo (GrGDFV) | 4. |
62184 | ciklo (RGDfV) | 5. |
62185 | ciklo (RADfV) | 6. |
62187 | ciklo(RGDFv) | 7. |
62 880 | YTAECKPQVTRGDVF | 8. |
62186 | ciklo(RaDFV) | 9. |
62175 | ciklo(ARGDfL) | 10. |
62179 | ciklo (GRGDfL) | 11. |
62 411 | TRQVVCDLGNPM | 12. |
62 503 | GCCRNNEALARLS | 13. |
62 502 | TDVNGDGRHDL | 14. |
* A kisbetűk D-aminosavakat, a nagybetűk L-aminosavakat jelölnek.
A 69 601-es jelzésű peptid (amely a 62 185-ös peptidével azonos szekvenciát tartalmaz) csak annyiban tér el az utóbbitól, hogy TFA-só helyett HCl-sót tartalmaz.
2. példa
Monoklonális antitestek
Az ATCC-HB-9537 számú hibridóma által szekretált monoklonális LM609-antitestet standard hibridómaeljárással állítottuk elő, melynek során „Sepharose”lencselektin-gyöngyökön adszorbeált, izolált ανβ3-ϊηtegrinnel immunizálását végeztünk. Az a^j-integrint emberi M21-melanomasejtekből izoláltuk, és az antitesteket Cheres és munkatársai leírása szerint állítottuk elő [lásd Cheresh és munkatársai: J. Bioi. Chem.
HU 221 988 Bl
262, 17703 (1987)]. Az M21-sejteket Dr. D. L. Morton („University of Califomia at Los Angeles”, CA) bocsátotta rendelkezésünkre. A sejteket - 2 mM L-glutamint, 50 mg/ml gentamicint és 10% magzati boíjúszérumot tartalmazó - RPMI-1640-tápközegben, szuszpen- 5 ziótenyészetben növesztettük.
A monoklonális LM609-antitestról bebizonyosodott, hogy specifikus immunreakcióba lép az avp3-komplexszel, az Oy- vagy ^-alegységgel, illetve más integrinekkel azonban nem. 10
3. példa
Az a^j-expresszió szöveti eloszlásának jellemzése A) Immunfluoreszcencia-vizsgálat antiintegrinreceptor-antitestek alkalmazásával 15
A sebgyógyulás során a vérerek alapmembránjai több adhéziós proteint (például „von Willebrand”faktort, fibronektint és fibrint) expresszálnak. Ezenkívül, tenyésztett simaizom- és endotélsejtek felületén az adhéziós receptorok integrincsaládjának több tagja is 20 expresszálódik [Cheresh: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6471 (1987); Janat és munkatársai: J. Cell Physiol. 151, 588 (1992); és Cheng és munkatársai: J.
Cell Physiol. 139, 275 (1989)]. Ezen integrinek közül az ανβ3 a „von Willebrand”-faktor, a fibrinogén (fib- 25 rin) és a fibronektin endotélsejt-receptora [Cheresh: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6471 (1987)]. Ez az integrál egy kalciumfiíggö jelölési („signaling”) reakcióutat indít be, ami az endotélsejtek migrációjához vezet, ezáltal úgy tűnik, alapvető szerepet játszik az érfali 30 sejtek biológiájában [lásd Leavelsey és munkatársai: J.
Cell. Bioi. 121,163 (1993)].
Az avP3-integrin - angiogenezis során bekövetkező - expressziójának vizsgálata céljából, önkéntes személyektől sebben található saijadzó szövetet és a sebet 35 körülvevő normális szövetet vágtunk ki. A szöveteket 1 ml foszfátpufferelt sóoldattal lemostuk, és „O.T.C” tápközegbe (Tissue Tek) ágyaztuk. A beágyazott szöveteket 30-45 másodpercre, folyékony nitrogénben hirtelen lehűtöttük. A fagyasztott szövetekből - kriosztát 40 metszetvágóval - 6 pm vastagságú metszeteket készítettünk, és a metszeteket - p3-integrinekre (θνβ3 vagy αιη,β3), illetve az integrinek β1-családjára specifikus antitestek alkalmazásával - immunperoxidázos festésnek vetettük alá. 45
A normális emberi bőr, illetve a sebsaijadzásos szövettel kapott eredményeket az 1A-1D. ábrákon mutatjuk be. A fagyasztott metszetek immunhisztokémiai analíziséhez a 33-integrinek elleni AP3 monoklonális antitestet, illetve a β1-integrinek elleni LM534 mono- 50 klonális antitestet alkalmaztuk. A különböző donorokból származó szövetekkel végzett kísérletek azonos eredményeket adtak. Az ábrákon a mikrofényképeket 300-szoros nagyításban mutatjuk be.
Az a^-integrin a sarjadzásos szövetben lévő vér- 55 erekben nagy mennyiségben expresszálódott (1B. ábra), ugyanazon donor egészséges bőrének irhájában és epitéliumában azonban nem volt detektálható (1A. ábra). Ezzel szemben, a β1-integrinek mind az egészséges bőrben, mind a sarjadzásos szövetben lévő vérerekben és 60 sztrómasejtekben nagy mennyiségben expresszálódtak (IC., illetve ID. ábra) és az expresszió - ahogy azt Adams és munkatársai [Cell 63,425 (1991)] leírták - az epitéliumon belüli bazális sejtekben is megfigyelhető volt.
B) Immunfluoreszcencia-vizsgálat antiligandumantitestek alkalmazásával
A normális emberi bőr és a saijadzó szövet - előző pontban leírtak szerint készített - újabb metszeteit a β3- és β]-integrinek ligandumainak („von Willebrand”faktor, illetve laminin) jelenlétére vizsgáltuk. A „von Willebrand”-faktor normális bőrben és saijadzó szövetben a vérerekben (2A., illetve 2B. ábra) lokalizálódik, míg a laminin mindkét szövetpreparátumban a vérerekben és az epiteliális alapmembránban is megtalálható (2C., illetve 2D. ábra).
C) Az anti-a$j-antitestek eloszlása rákszövetben
A fenti vizsgálatokon kívül, beteg személyekből származó rákszövet-biopsziákat az ανβ3 jelenlétére és eloszlására vizsgáltunk. A szöveteket a 3. példa A) részében leírtak szerint készítettük elő, azzal a különbséggel, hogy a 2. példában előállított - az a^3-receptorkomplexre specifikus - monoklonális LM609-antitesttel festettük őket. Ezenkívül, mikroszkópos szövettani vizsgálatokhoz is készítettünk tumorpreparátumokat; a megfelelő tumormintákat „Bulins” fixálószerben 8 óra; hosszat fixáltuk, sorozatmetszeteket vágtunk ki, és a metszeteket hematoxilinnal és eozinnal („H&E”) festettük.
A húgyhólyagrák-, vastagbélrák-, emlőrák-, illetve*, tüdőrákszövetek immunperoxidázos festésével kapott eredményeket a 3A-3D. ábrákon mutatjuk be. Az Ογβ? csak a vizsgált négy rákbiopsziában lévő vérereken expresszálódik nagy mennyiségben, a szövetekben lévő egyéb sejteken nem.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ανβ3-ϊηtegrinreceptor szelektíven olyan szövettípusokban (nevezetesen a saijadzó szövetekben, metasztázisos szövetekben és egyéb szövetekben) expresszálódik, amelyekben angiogenezis játszódik le; e receptor nem expresszálódik azokban a normális szövetekben, amelyekben az új vérerek képződése már leállt. Ennek megfelelően, az angiogenezist mutató szövetek - gyógykezelési szempontból - a találmány szerinti megoldás ideális célpontjait képezik.
4. példa
A kimutatott, ttjfij-specifikus, szintetikus peptidek azonosítása ligandum-receptor kötési vizsgálattal Az 1. példában leírtak szerint előállított szintetikus peptideket annak alapján vizsgáltuk, hogy tisztított ligandum-receptor kötési vizsgálatban képesek-e az ανβ3- és am$3-receptorok kötődését gátolni. A kötési vizsgálat megvalósítására alkalmazott eljárás leírását lásd Barbas és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10 003 (1993); Smith és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 11 008 (1990); és Pfaff és munkatársai: J. Bioi. Chem. 269, 20 233 (1994); mely hivatkozásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni].
HU 221 988 Bl
A következőkben egy eljárást írunk le antagonisták - ligandum-receptor kötési vizsgálatban történő - azonosítására. A vizsgálatban szilárd hordozón rögzített receptort alkalmazunk, míg a ligandum és az antagonista oldott állapotú. Bemutatunk egy olyan ligandum-receptor kötési vizsgálatot is, melyben a szilárd hordozón a ligandum van rögzítve, és a receptor és az antagonista van oldatban.
Röviden „Titertek” mikrotitertálcák üregeiben szelektált, tisztított integrineket rögzítettünk (egymástól függetlenül, üregenként 50 ng mennyiségben). A ligandum-receptor kötési vizsgálatokban alkalmazott receptorok tisztítási eljárásai szakember számára jól ismertek. 4 °C-on, 18 óra hosszat végzett inkubálás után a tálca nemspecifikus kötőhelyeit trisz-pufferelt sóoldatban 10 mg/ml koncentrációjú szarvasmarha-szérumalbuminnal blokkoltuk. A gátlási vizsgálatokhoz a 1. táblázatban felsoroltak közül kiválasztott peptideket különböző koncentrációkban azon képességükre teszteltük, hogy gátolják-e a 125I-vitronektin vagy a 125I-fibrinogén és aubPj-integrinreceptorhoz történő kötődését. Bár ezek a ligandumok egy adott integrinhez optimálisan kötődnek (a vitronektin az oq$3-hoz, a fibrinogén pedig az aIIbp3-hoz), a kötődés gátlásának - a fibrinogén bármelyik receptorhoz történő kötődését gátló peptidek alkalmazásával végzett - vizsgálata lehetővé tette a peptid azon mennyiségének μΜ nagyságrendű meghatározását, amely a receptor ligandumhoz történő kötődésének 50%-os gátlásához szükséges. A radioaktív izotóppal jelölt ligandumokat 1 nM koncentrációban alkalmaztuk, és a kötődést - külön-külön - jelöletlen szintetikus peptidekkel igyekeztünk gátolni.
Háromórás inkubálás után a szabad ligandumot mosással eltávolítottuk, és a kötött ligandumot gammaszámlálóval detektáltuk. Azokból a vizsgálatokban, amelyekben a radioaktívan jelölt fibrinogén - külön-külön immobilizált ανβ3-, illetve ctm^-receptorhoz történő kötődésének gátlásához az 1. táblázatban felsorolt, kiválasztott ciklusos peptideket alkalmaztuk, igen jól reprodukálható adatokat kaptunk, és az adatpontok közötti hiba jellemzően 11% alatt maradt. Az ICjo-értékeket (μΜ) a kétszeri ismétléssel végzett kísérlet adatpontjainak átlaga+szórás értékekként fejezzük ki (lásd 2. táblázat).
2. táblázat
Peptid azonosító száma | θνβ3 (IC50, μΜ) | ®IlbP3 (K-50> PM) |
62181 | 1,96+0,62 | 14,95+7,84 |
62 184 | 0,05+0,001 | 0,525+0,10 |
62 185 | 0,885+0,16 | 100+0,001 |
62 187 | 0,05+0,001 | 0,26+0,056 |
62186 | 57,45+7,84 | 100+0,001 |
62175 | 1,05+0,07 | 0,63+0,18 |
62 179 | 0,395+0,21 | 0,055+0,007 |
Az eredmények alapján látható, hogy az RGD-tartalmú vagy RGD-derivatizált, ciklusos peptidek (62 181, 62 184, 62 185 és 62 187) (melyek mindegyike tartalmaz egy D-aminosavat) elsősorban a fibrinogén a^-receptorhoz történő kötődését gátolták, amit az mutat, hogy az aIIbP3-receptor esetében az 50%-os gátlás eléréséhez szükséges peptidkoncentrációk alacsonyabbak, mint az a^3-receptor esetében. Ezzel szemben, a többi RGD-tartalmú vagy RGD-derivatizált, ciklusos peptid (62 186, 62 175 és 62 179) vagy egyik receptor esetében sem gátolta hatásosan a fibrinogén kötődését, vagy a fibrinogén amJ^-receptorhoz történő kötődését gátolta nagyobb specifitással. Ezek az eredmények összhangban vannak a Pfaff és munkatársai által publikált eredményekkel [J. Bioi. Chem. 269, 20233 (1994)]; kísérleteikben az RGDFV ciklusos peptid (amelyben F D-aminosavat jelöl) a fibrinogén avp3-integrinhez (és nem az αιη>β3- vagy o^j-integrinhez) történő kötődését gátolta specifikusan. Hasonló kötődésgátlási vizsgálatokat lineáris (RGD-motívumot tartalmazó vagy nem tartalmazó) peptidekkel is, melyek szekvenciája az receptor-alegységből, anb-receptor-alegységből vagy a vitronektin-ligandum aminosavszekvenciájából származott. E lineáris peptidek szekvenciáit [62 880 (a VNszekvencia 35-49. aminosavai); 62 411 (az av-szekvencia 676-687. aminosavai); 62 503 (az Ov-szekvencia 655-667. aminosavai); és 62 502 (az ajjb-szekvencia 296-306. aminosavai)] az 1. táblázatban mutatjuk be. Valamennyi peptidet külön vizsgálatban a vitronektin (VN) vagy a fibrinogén (FG) a^3- vagy a^3-receptorhoz való kötődésének gátlására alkalmaztuk. Az egyes kísérletekben egy vizsgálatra kapott ICS0-értékeket (μΜ) a 3. táblázatban mutatjuk be.
3. táblázat
Peptid száma | “nbfb IC» (pM) | o^ICso/pM) | ||
FG | VN | FG | VN | |
62 880 | 4,2 | 0,98 | <0,1 | 0,5 |
62 411 | >100 | >100 | >100 | >100 |
62 503 | >100 | >100 | >100 | >100 |
62 502 | 90 | 5 | >100 | >100 |
A ligandumok kiválasztott integrinreceptorokhoz történő kötődésének lineáris peptidekkel végzett gátlásának vizsgálatai során kapott eredmények azt mutatják, hogy csak a 62 880-as peptid gátolta hatásosan az fibrinogén és a vitronektin cq]33-receptorhoz történő kötődését, mivel e receptor esetén a peptid alacsonyabb koncentrációja volt elégséges az 50%-os gátlás kiváltásához. A ligandumok a^3-receptorhoz történő kötődésének gátlásában a többi lineáris peptid közül egy sem volt hatásos, bár a 62 502-es peptid hatásosan gátolta a vitronektin απ(,β3-1ιοζ való kötődését.
5. példa
Kezeletlen csirkechorioallantois-membrán (CAM) karakterizálása
A) Csirkechorioallantois-membrán (CAM) előkészítése
Csirkechorioallantois-membránban - miután a normális embrionális angiogenezis érett vérerek kialakulá17
HU 221 988 Β1 sát eredményezte - angiogenezist indukálhatunk. Kimutatták, hogy az angiogenezis indukciója specifikus citokinekre vagy tumordarabokra adott reakció következménye [Leibovich & munkatársai: Natúré 329, 630 (1987); Ausprunk és munkatársai: Am. J. Pathol. 79, 597 5 (1975)]. A 6. és 7. példában leirt angiogenezis-indukciós és -gádási vizsgálatokhoz csirkeembriókból chorioallantois-membránokat preparáltunk. A „Mclntyre Poultry”tól (Lakeside, CA) 10 napos csirkeembriókat kaptunk, melyeket - 60%-os páratartalom mellett - 37 °C-on in- 10 kubáhunk. A tojások végén, közvetlenül a légzsák felett, kis kézifúróval (Dremel, Division of Emerson Electric Co., Racine, WI) lyukat fúrtunk. A tojások oldalán
- embrionális vérerektől mentes területen (amit lámpázással állapítottunk meg) - egy másik lyukat fúrtunk. 15 Az első lyuknál vákuumot létesítettünk, miáltal a chorioallantois-membrán levált a tojáshéjmembránról, és a CAM körül hamis légzsák keletkezett. A tojáshéjon - a levált CAM felett - modellező csiszolókoronggal (Dremel) 1,0 cmxl,0 cm-es ablakot vágtunk. Ezen a 20 nyíláson közvetlenül hozzáférhető a chorioallantoismembrán.
A CAM-preparátumokat további kezelés nélkül az embriógenezis 6. napján, az aktív neovascularisatio stádiumában (ez képezi az embrionális neovascularisatio 25 modelljét) vagy az embriogenezis 10. napján (amikor az angiogenezis leáll) alkalmaztuk. Az utóbbi preparátumot - a 6. példában leírtak szerint - citokinkezeléssel vagy tumorérintkeztetéssel indukált új angiogenezis vizsgálatára alkalmaztuk. 30
B) A chorioallantois-membrán (CAM) szövettana
A csirkeembrió-CAM-ok és/vagy a csirkeembriókból kivágott emberi tumorok (lásd 8. példa) mikroszkópikus szerkezetének vizsgálata érdekében a chorioallantois-membránokat és a tumorokat - a 3. példa A) ré- 35 szében leírt módon - fagyasztásos metszetek kialakítására készítettük elő. A fagyasztott tömbökből - kriosztát metszetvágóval - 6 pm vastagságú metszeteket készítettünk, melyeket immunfluoreszcens vizsgálattal analizáltunk. 40
A 4. ábrán egy kezeletlen, 10 napos CAM vérerektől mentes területének tipikus mikrofényképe látható. Mivel a CAM-rendszerben az angiogenezis az embriogenezis e stádiumában már leáll, ez a rendszer alkalmas
- a szomszédos területeken már létező vérerekből a vér- 45 ereket nem tartalmazó CAM-területek felé - új érhálózat kialakulásának serkentésére.
C) A CAM - immunfluoreszcenciával detektált - integrinprofiljai
A CAM-szövetekben lévő integrinreceptorok szőve- 50 ti eloszlásának vizsgálata céljából - tumorszövetből és csirkeembrió CAM-szövetből vágott - 6 pm-es fagyasztott metszeteket 30 másodpercig acetonban fixáltunk és 10 pg/ml monoklonális CSAT-antitesttel (amely az β,-integrin-alegységre specifikus) [lásd 55 Buck és munkatársai: J. Cell Bioi. 107, 2351 (1988)] vagy a 2. példában előállított LM609-antitesttel festettünk. A CSAT-antitesttel festett metszeteket kontrollként alkalmaztuk. A primer festés után a metszeteket
- rodaminnal jelölt - 1:250 hígítású kecske antiegér 60 másodlagos antitesttel (Tago) festettük, hogy lehetővé tegyük a primer immunreakciótermék detektálását. A metszeteket Zeiss immunfluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk.
Az immunfluoreszcencia-analízis eredményei azt mutatják, hogy a 10 napos, kezeletlen csirkeembrióban lévő érett vérerek a βι-integrin-alegységet expresszálták (5A. ábra). Ezzel szemben, az 5A. ábrán látható szövet sorozatmetszeteiben az LM609-antitesttel nem tapasztaltunk immunreaktivitást (5B. ábra), ami arra utal, hogy az a^-integrin - melyet az LM609-antitest detektálna - a 10 napos, kezeletlen csirkeembrió érett vérereiben nem expresszálódik aktívan. A CAM-modell és a következő példák alapján látható, hogy a normális embriogenezis során lejátszódó vagy a citokinek, vagy tumorok által indukált angiogenezis ideje alatt a vérerek a^-integrint expresszálnak. Az aktív neovascularisatio után - vagyis a vérerek fejlődésének leállása után - az a^j-expresszió olyan szintre csökken, amely immunfluoreszcencia-analízissel nem mutatható ki. Az angiogenezis folyamatában lévő vérerekben az a^3-expresszió ilyen szabályozásának köszönhetően a találmány szerinti megoldás egyedülálló lehetőséget biztosít az angiogenezis kontrollálására és gátlására, amit a következő példákban, a CAM-angiogenezis-modell alkalmazásán keresztül mutatunk be részletesen.
6. példa
CAM-angiogenezis-vizsgálat A) Növekedési faktorok által indukált angiogenezis
Kimutatták, hogy az angiogenezist citokinek vagy növekedési faktorok indukálják [lásd Leibovich és munkatársai: Natúré 329, 630 (1987); Ausprunk és munkatársai: Am. J. Pathol. 79, 597 (1975)]. Az e példában leírt kísérletekben - az 5. példában leírt - CAM-prepará-» hunban az angiogenezist a CAM vérerein topikálisan alkalmazott növekedési faktorokkal indukáltuk. Az angiogenezis indukálása érdekében 10 napos csirkeembrió chorioallantois-membránjának vérerektől mentes területére - Hanks-féle egyensúlyi sóoldattal (HBSS; Gibco, Grand Island NY) vagy 150 pg/ml rekombináns bázisos fibroblaszt növekedési faktort ^FGF; Genzyme, Cambridge, MA) tartalmazó HBSS-oldattal telített 5x5 mm-es „Whatman’-szűrőpapír korongot („Whatman Filter paper No. 1”) helyeztünk, és a tojáshéjon vágott ablakot ragtapasszal lezártuk. Más vizsgálatokban 125 pg/ml koncentrációjú pFGF is hatásos volt a vérerek növekedésének indukálására. Az angiogenezist 72 óra elteltével, fénymikroszkópos vizsgálattal követtük nyomon. A chorioallantois-membránokat hirtelen lefagyasztottuk, 6 pm-es kriosztát metszeteket készítettünk, azokat acetonban fixáltuk, majd az 5. példa C) részében leírtak szerint, 10 pg/ml anti-β, monoklonális CSAT-antitest vagy LM609-antitest alkalmazásával, immunfluoreszcens módszerrel festettük.
A 5C. ábrán bemutatott immunfluoreszcens mikrofényképen látható, hogy a CAM-preparátumban a βΡϋΡindukálta angiogenezis során fokozott szintű a^3-expresszió tapasztalható, ezzel szemben, a kezeletlen CAMpreparátumban nem figyelhető meg a^j-expresszió
HU 221 988 Bl (lásd 5B. ábra). A pFGF-fel kezelt CAM-preparátumokban lévő vérerek jelentős hányadában (75-80%-ában) könnyen detektálható volt az Oypj-expresszió. Ezenfelül, a Pj-integrin expressziója a kezeletlen CAM esetében tapasztalható szinttől nem tért el, mivel a βι-integrin a sti- 5 mulált vérereken is könnyen detektálható volt.
Az Ονβ3- és β1-integrin relatív expresszióját - a fagyasztott CAM-metszetek konfokális lézeres képelemzésével („laser confocal image analysis”) - mennyiségi meghatározásnak vetettük alá. A festett metszeteket Ze- 10 iss lézeres konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. Véletlenszerű eloszlású területekről 25 - LM609-antitesttel -, illetve 15 - CSAT-antitesttel - festett véredényt (350-3500 mm2, átlagos méret kb. 1200 mm2) választottunk ki, és konfokális lézeres képelemzéssel (önké- 15 nyes egységek alkalmazásával) minden egyes véredényre meghatároztuk az egységnyi területre jutó átlagos rodamin-fluoreszcenciát. Az adatokat a vérerek - önkényes egységekben megadott - átlagos fluoreszcenciaintenzitása iszórás értékben adjuk meg. 20
A 6. ábrán bemutatott eredmények alapján látható, hogy a βΡΰΡ-ίβΙ kezelt CAM-metszetekben az o^J33 festődése - Wilcoxon-féle sorozatösszegteszt („Wilcoxon Ránk Sum Test”) (p<0,0001) alapján meghatározva - lényegesen nagyobb (négyszeres) szintű, mint 25 a kontrollmetszetekben, miközben a β] festődését a βΡΟΡ^βζεΙέβ nem befolyásolta jelentősen.
A CAM-vizsgálatot egy másik hatásos angiogenezis-indukáló szer - a tumomekrózis-faktor-α (TNFa) β,- és β3-integrinek expressziójára gyakorolt hatásának 30 vizsgálatára is felhasználtuk. Azt tapasztaltuk, hogy a 10 napos embriókból származó chonoállantois-membránokra helyezett - βΡΰΡ-ίεΙ vagy TNFa-val impregnált - szűrőpapír korongok 72 óra elteltével helyi angiogenezist indukáltak. 35
E kísérlet eredményei a kezeletlen, βΡΟΡ-ίβ! kezelt, illetve TNFa-val kezelt chorioallantois-membránok mikrofényképein (7A., 7B., illetve 7C. ábra) láthatók. A vérerek mind a OFGF-fel, mind a TNFa-val kezelt preparátumokban jól láthatók, a kezeletlen prepará- 40 tumban azonban nincsenek jelen. Ez azt jelenti, hogy a növekedési faktor, illetve a citokin helyi alkalmazása azt eredményezte, hogy az eredetileg vérerektől mentes területre a szomszédos területeken lévő érett erekből angiogenezis indukálódott. A TNFa-val végzett kezelés 45 - az angiogenezis, és a velejáró a^3-expresszió indukálását illetően - hasonló hatású, mint a 3FGF-fel végzett kezelés (5C. ábra).
Ezek a felismerések arra utalnak, hogy az angiogenezisben szerepet játszó vérerek - emberben és csirké- 50 ben - fokozott szintű a^3-expressziót mutatnak. Ezzel összhangban, tenyésztett endotélsejtekben az ανβ3-εχρresszió különböző citokinekkel in vitro indukálható [lásd Janat és munkatársai: J. Cell Physiol. 757, 588 (1992); Enenstein és munkatársai: Exp. Cell Rés. 203, 55 499 (1992); és Swerlick és munkatársai: J. Invest. Derm. 99, 715 (1993)].
Az antitestek és inhibitor peptidek - növekedési faktor által indukált angiogenezisre gyakorolt - hatását a 7. példa A) és B) részében ismertetjük. 60
B) Embrionális angiogenezis
Az angiogenezis-inhibitoroknak az embrionális érrendszer természetes kialakulására gyakorolt hatásának értékelésére - ahogy azt fentebb említettük - a 6 napos csirkeembrióból készített CAM-preparátumot alkalmaztuk. A fejlődés e stádiumában a vérerek de novo növekednek, így ez a modell hatásosan alkalmazható annak meghatározására, hogy az a^3-integrin részt vesz-e az embrionális angiogenezisben. A CAM-rendszert a fentebb leírtak szerint készítettük elő, azzal a különbséggel, hogy a vizsgálatot a 6., és nem a 10. napon végeztük. A találmány szerinti antitestekkel és peptidekkel végzett kezelés embrionális angiogenezisre gyakorolt hatását a 7. példa C) részében újuk le.
C) Tumorok által indukált angiogenezis
Az a^3-integrin tumor indukálta angiogenezisben betöltött szerepének vizsgálata érdekében a CAMvizsgálatban különböző, avp3-negatív emberi melanoma- és karcinómadarabokat alkalmaztunk, melyeket előzetesen 17 napos csirkeembrióból chorioallantoismembránján növesztettünk, majd azokról izoláltunk [lásd Brooks és munkatársai: J. Cell Bioi. 122, 1351 (1993)]. A tumordarabok puffer jelenlétében nagymértékű neovascularisatiót eredményeztek.
A CAM-vizsgálati rendszerben az angiogenezist a tumordarabok chorioallantois-membránra történő közvetlen felhelyezésével indukáltuk. A csirkeembrióCAM-ot a fentebb leírtakkal azonos módon készítettük elő. A preparátumokra szűrőpapír korongok helyett va- : lamilyen avP3-negatív emberi tumor - M21L emberi , melanomatumor; UCLAP-3 emberi tüdőtumor; FG em- » béri hasnyálmirigyrák-sejtvonal [Cheresh és munkatár- * sai: Cell 58, 945 (1989)] vagy HEp3 emberi gégeráksejtvonal - 50-55 mg-os darabját helyeztük. ?
A csirkeembriók chorioallantois-membránján ke- »J mény emberi tumorok növesztéséhez az M21L emberi j melanomatumor-sejtvonalat, az UCLAP-3 emberi tüdő- j ráksejtvonalat, az FG emberi hasnyáhnirigyrák-sejtvonalat, illetve a HEp3 emberi gégeráksejtvonalat (melyek mindegyike aJ33-negatív) alkalmaztuk. A CAMpreparátumokra először steril HBSS-ben, 30 μΐ össztérfogatban 8χ 106 M21L-, UCLAP-3- vagy FB-sejtet, illetve 5 χ 105 HEp3-sejtet helyeztünk. A tojáshéjon lévő ablakot ragtapasszal lezártuk, és az embriókat - a humán tumorok növesztése érdekében - hét napig inkubáltuk. A 7. nap végén (amikor az embriók már 17 naposak voltak) a tumorokat kivágtuk a CAM-okból, és megtisztítottuk a rajtuk maradt CAM-szövettől. A tumorokat 50-55 mg-os darabokra vágtuk, és ezeket az angiogenezis vagy a tumomövekedés vizsgálatára alkalmaztuk. A tumordarabokat újabb 10 napos csiikeembrió-CAM-preparátumok - vérerektől mentes területére
- helyeztük (lásd 6. példa A) pontja).
A csirkeembrió-CAM-okon in vivő nőtt tumorokat az avp3-expresszió vizsgálata érdekében, a 3. példa A) pontjában leírtak szerint, monoklonális LM609-antitesttel festettük. A tumorsejtek specifikus festődését nem fi- , gyeltük meg, ami az aj^-expresszió hiányára utal. 5
A CAM-tumorpreparátumokat később, az antitestek és peptidek tumor indukálta angiogenezisre gyakorolt
HU 221 988 Bl hatásának meghatározása érdekében, a 7. példa D) és E) részében leírtak szerint kezeltük. A CAM-tumorpreparátumokat az antitestek és peptidek - tumorok visszafejlődésére és az angiogén vérerek és érsejtek apoptózisára gyakorolt - hatásainak vizsgálata érdekében a 5
8., 9. és 12. példában leírtak szerint is kezeltük.
7. példa
Az angiogenezis gátlásának mérése CAMvizsgálatban 10
A) A növekedési faktor által indukált angiogenezis gátlása inhibitorok helyi alkalmazásával
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
Annak meghatározása érdekében, hogy az ανβ3-ίηtegrin aktív szerepet játszik-e az angiogenezisben, a 15 CAM-preparátumokra βΡΰΕ-ίβΙ vagy TNFa-val impregnált szűrőpapír korongokat helyeztünk, majd a preparátumokat a^3-ra specifikus LM609 monoklonális antitesttel, βι-re specifikus CSAT monoklonális antitesttel, illetve ανβ5-Γβ specifikus P3G2 monoklonális 20 antitesttel kezeltük.
A 10 napos csirkeembriókból származó CAM-okban az angiogenezist βΡϋΡ-ίεΙ impregnált szűrőpapír korongokkal indukáltuk. A korongokat a 0., 24. és 48. órában - 50 ml HBSS-oldatban 25 mg monoklonális antitestet 25 tartalmazó - 25 μΐ össztérfogatú steril HBSS-oldattal kezeltük. A 72. órában a chorioallantois-membránokat összegyűjtöttük és 35 mm-es Petri-csészébe helyeztük, és 1 ml foszfátpufferelt sóoldattal mostuk. A szűrőpapír alsó oldalát és a CAM-szövetet „Olympus” sztereomik- 30 roszkóp alatt, két megfigyelővel, „dupla vak” vizsgálati rendszerben vizsgáltuk. Az angiogenezis gátlását akkor tekintettük jelentős mértékűnek, ha a chorioallantoismembránok - közvetlenül a szűrőpapír korong alatti területébe a vérerek beszűrődése (infiltrációja) 50%-nál 35 nagyobb mértékben volt gátolt. A kísérleteket mindegyik antitesttel négyszer ismételtük meg (mindegyik esetben 6-7 embrió alkalmazásával).
A monoklonális antitestekkel végzett kezelések βΡΟΡ-ύκΗ^Ηη angiogenezisre gyakorolt hatásait a 40 8A-8E. ábrákon mutatjuk be. A 8A. ábrán vérerek nélküli, kezeletlen (kontroll) CAM-preparátum látható; ehhez hasonlítottuk a βΡΟΡ-ίβΙ indukált angiogenezist (8B. ábra), valamint az alkalmazott monoklonális antitestek angiogenezisre gyakorolt hatását (8C-8D. áb- 45 rák). A monoklonális LM609-antitesttel kezelt CAMszövetek kb. 75%-ában figyeltük meg az angiogenezis 50%-osnál nagyobb gátlását (lásd 8E. ábra), az ilyen szövetek közül sokban vérerek nem szűrődtek be a szűrőpapír korong alatti területre. Ezzel szemben, a 50 kontrollszövet és a CSAT-antitesttel (8C. ábra), illetve P3G2-antitesttel kezelt szövetek (8D. ábra) nagymértékű angiogenezist mutattak.
Hasonló eredményeket kaptunk, amikor az angiogenezist TNFa-val indukáltuk. Annak érdekében, hogy a 55 fenti antitestek - CAM-szövetek érmentes területei melletti területeken a normális érképződésből származó - érett vérerekre gyakorolt hatásait vizsgáljuk, napos csirkeembriókból származó (citokinnal helyileg nem kezelt) chorioallantois-membránok erekkel át- 60 szőtt területeire monoklonális antitestekkel impregnált szűrőpapír korongokat helyeztünk. Sztereomikroszkópos megfigyeléssel megállapítottuk, hogy a három alkalmazott monoklonális antitest egyike sem befolyásolta a már létező ereket. Ilyenformán, az LM609 monoklonális antitest csak az új erek növekedését gátolja szelektíven, és nem befolyásolja a szomszédos területeken lévő érett vérereket. A szintetikus peptidek (akár helyi, akár intravénás) alkalmazása esetén ugyanilyen hatást figyeltünk meg (lásd 7. példa A)2„ illetve E)2. pontja).
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
A találmány szerinti szintetikus peptidekkel is végeztünk CAM-vizsgálatokat, melyekkel az volt a célunk, hogy meghatározzuk a ciklusos és lineáris peptidek növekedési faktorral indukált - érképződésre gyakorolt hatását. A peptideket az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. 25 μΐ össztérfogatú steril HBSS-oldatban 80 pg peptidet oldottunk. A peptidoldatot szűrőpapíron a CAM-preparátum elkészítésekor, majd 24 és 48 óra elteltével vittük fel a CAM-szövetre. A 72. óra után a szűrőpapírt és a környező CAM-szövetet kivágtuk, és a fentiek szerint, sztereomikroszkóppal vizsgáltuk.
A vizsgálat eredményei hasonlóak voltak a 7. példa E)2. pontjában leírt kísérlet (melynek során a szintetikus peptideket tumor indukálta vérerekbe intravénásán injektáltuk) eredményeihez (lásd 9A-9C. ábrák), A 62 186-os kontrollpeptiddel végzett kezelés esetében' a βΡϋΡ-ίβΙ indukált vérerek zavartalanok voltak (lásd 9A. ábra). Ezzel szemben, amikor a 62 814-es ciklusost RGD-peptidet vittük fel a szűrőpapír korongra, az ér-képződés gátlás alá került, és új érhálózat nélküli terü-r let maradt vissza. Ez a hatás hasonló volt a 9B. ábrán bemutatotthoz (lásd 7. példa E)2. pontja). Ezenfelül*, ahogy az a 9C. ábrán az intravénásán injektált peptidek esetében látható, a növekedési faktorral impregnált szűrőpapír korong felhelyezésétől távolabbi területeken, ahol kialakult vérerek találhatók, a szintetikus peptidekkel végzett helyi kezelés nem gyakorolt hatást az ilyen erekre. Ilyenformán, a peptidek angiogenezisre gyakorolt gátlóhatása csak azokra a területekre korlátozódik, ahol az angiogenezist a növekedési faktorok indukálták. A peptidek nem befolyásolják a szomszédos területeken lévő, már kialakult, érett ereket, és ezeken a területeken nem okoznak káros citotoxicitást.
Az 1. példában leírtak szerint előállított - és az 1. táblázatban felsorolt - egyéb szintetikus peptidekkel hasonló kísérleteket végeztünk.
B) Növekedési faktorral indukált angiogenezis gátlása intravénáson alkalmazott inhibitorokkal
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósíthatósága szempontjából értékeltük a CAM-preparátumba intravénásán injektált monoklonális antitestek növekedési faktorral indukált - angiogenezisre gyakorolt hatásait is.
Az intravénás injektáláshoz a csirkeembrió-CAMpreparátumokat - néhány módosítás beiktatásával - lényegében a 7. példa A) pontjában leírtak szerint végeztük. A tojások lámpázása során kiválasztottuk a jól látható vérereket, és ezeket a tojás héján megjelöltük. A to20
HU 221 988 Bl jások kifúrását, a chorioallantois-membrán leválasztását és a PFGF-fel impregnált szűrőpapír korongok felhelyezését a fentebb leírtak szerint végeztük. A tojáson vágott ablakokat steril ragtapasszal lezártuk, és az embriókat visszahelyeztük az inkubátorba. 24 óra elteltével a 5 tojáshéjon - közvetlenül a korábban megjelölt, jól látható vérerek felett - újabb ablakot vágtunk. A külső tojáshéjat óvatosan eltávolítottak, miközben az embrionális membránt sértetlenül hagytuk. A tojáshéjmembránt kis csepp ásványi olajjal (Perkin-Elmer Corp., Nor- 10 walk, CT) átlátszóvá tettük, ezáltal a vérerek könnyen megfigyelhetőkké váltak. Közvetlenül a vérerekbe
- 30-as tűvel, embriónként 100 μΐ össztérfogatú steril PBS-ben 200 μg IgG-dózissal - tisztított, steril monoklonális antitesteket, illetve a fentebb leírt szintetikus 15 peptideket injektáltuk. Az ablakokat ragasztószalaggal lezártuk, és az embriókat 72 óra hosszat inkubáltuk.
A szűrőpapír korongokat és a környező CAM-szöveteket a fentebb leírtak szerint vizsgáltuk.
Az előzetesen LM609 monoklonális antitesttel intra- 20 vénásan beoltott CAM-szövetekben vagy tumorszövetekben az LM609 monoklonális antitest eloszlásának meghatározása érdekében a fixált metszeteket HBSS-oldatban 2,5% BSA-val, szobahőmérsékleten egy óra hosszat blokkoltuk, majd 1:250 hígítású, rodaminnal je- 25 lölt kecske antiegér másodlagos antitesttel (Tago) festettük. A metszeteket „Zeiss” immunfluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk.
Az CAM-preparátumokban az intravénás antitestkezelés - pFGF-fel indukált - angiogenezisre gyako- 30 rolt hatásának eredményeit a 10A-10C. ábrákon mutatjuk be. A 10A. ábrán a pFGF-fel végzett kezeléssel indukált angiogenezis eredménye látható. A P3G2 monoklonális antitest (amely anti-avp3-antitest) intravénás beadásának hatására a pFGF-fel indukált érhálózat meg- 35 jelenésében semmilyen változást nem tapasztaltunk (lásd 10B. ábra). Ezzel szemben, az LM609 monoklonális antitesttel (amely anti-avp3-antitest) végzett kezelés a fiFGF-fel indukált új vérerek szűrőpapír alatti területre történő növekedésének teljes gátlását eredményezte 40 (lásd 10C. ábra). Látható, hogy az angiogenezis gátlását az LM609 (anti-avp3-specifikus) monoklonális antitest a^-receptor-aktivitást gátló hatása eredményezte. Mivel az cq$5-receptor gátlása nem akadályozta meg az új érhálózat szűrőpapír alatti területre történő 45 növekedését, megállapíthatjuk, hogy az avp5-integrin
- a vérerek növekedése tekintetében -, az avp3-integrinhez képest nem kulcsfontosságú receptor.
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
Az 1. példában leírtak szerint előállított szintetikus 50 peptideket az előző pontban leírtak szerint, egymástól függetlenül, intravénásán injektáltuk a CAM-preparátumok növekedési faktorral indukált vérereibe. A peptideknek az erek életképességére gyakorolt hatását szintén az előző pontban leírtakhoz hasonlóan értékeltük. 55
C) Az embrionális angiogenezis gátlása helyi kezeléssel
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
Annak meghatározása érdekében, hogy az ανβ3-ίηtegrin szerepet játszik-e az embrionális angiogenezis- 60 ben, hatnapos (aktív neovascularisatióval jellemezhető; lásd 5. példa A) pontja) embriókból készített CAMpreparátumokban az LM609 monoklonális antitest
- vérerek de novo növekedésére gyakorolt - hatását vizsgáltuk. A CAM-vizsgálatot a 6. példa C) pontjában leírtak szerint végeztük. A hatnapos embriók chorioallantois-membránjára (melyet citokinekkel nem kezeltünk) monoklonális antitestekkel impregnált szűrőpapír korongokat helyeztünk. Három nap múlva a membránokat kivágtuk és lefényképeztük. Mindegyik kísérletben csoportonként hat embriót alkalmaztunk, és a kísérleteket kétszer ismételtük.
A kísérletben az LM609-antitest megakadályozta az erek növekedését (lásd 11C. ábra), a CSAT- és P3G2-antitest azonban nem (11 A., illetve 11B. ábra). Ez azt jelzi, hogy az a^-integrin jelentős szerepet játszik - a hozzáadott növekedési faktoroktól független embrionális angiogenezisben.
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
Az 5. példa A)2. pontjában leírtak szerint előkészített embrionális CAM-preparátumokat az 1. példában előállított szintetikus peptidekkel, egymástól függetlenül, helyileg vagy intravénásán kezeltük. A peptideknek az erek életképességére gyakorolt hatását szintén a fentebb leírtakhoz hasonlóan értékeltük.
D) Tumor indukálta angiogenezis gátlása helyi kezeléssel
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
A fentebb leírt angiogenezis-vizsgálatokon kívül (melyekben az a^3-antagonista LM609 monoklonális; antitest, valamint a 62 181-es, 62 184-es, 62 185-ös, 62 187-es és 62 880-as peptid embrionális angiogenezisre gyakorolt hatásait vizsgáltuk) olyan kísérleteket is végeztünk, melyekben az a^3-integrin tumor indukálta angiogenezisben játszott szerepét értékeltük. Angiogenezist kiváltó anyagként 17 napos csirkeembrió chorioallantois-membránján növesztett és arról izolált
- a^3-negatív - humán M21-L-melanoma-darabokat alkalmaztunk. A tumordarabokat a 6. példa C) pontjában leírtak szerint készítettük.
Ahogy azt a 7. példa A)l. pontjában fentebb leírtuk, a monoklonális antitesteket egymástól függetlenül, 25 μΐ HBSS-oldatban 25 pg antitestkoncentrációban, helyileg vittük fel a tumordarabokra, és a tojásokon lévő ablakokat ragasztószalaggal lezártuk. A monoklonális antitestekkel végzett kezelést a 24. és 48. órában, azonos módon, megismételtük. A 72. órában a tumorokat és a környező CAM-szöveteket a 7. példa A)l. pontjában leírtak szerint vizsgáltuk.
Ahogy a 6. példa C) pontjában leírtuk, a tumorokat úgy kaptuk, hogy - a^3-integrint nem expresszáló tenyésztett M21-L-sejteket [Feldina-Habermann és munkatársai: J. Clin. Invest. 89, 2018 (1992)] 10napos csirkeembriók chorioallantois-membránjára ültettünk. Az így kapott, <x^3-negatív tumordarabok puffer, illetve CSAT (anti-pj) vagy P3G2 (ζηίϊ-ανβ5) monoklonális antitest jelenlétében élénk angiogenezist indukáltak, ezzel szemben, az LM609 (anti-a^3) monoklonális antitest megakadályozta, hogy a vérerek a tumortömegbe és a környező CAM-szövetbe hatoljanak.
HU 221 988 Bl
A monoklonális antitestek tumor indukálta angiogenezisre gyakorolt hatásának kvantitatív meghatározása érdekében, a CAM fokális síkján belül a tumorba hatoló vérereket sztereomikroszkóppal, két megfigyelővel, „dupla vak” vizsgálati rendszerben számoltuk. A 12. áb- 5 rán bemutatott adatoszlopok - kétszeres ismétléssel végzett kísérletben, csoportonként 12 CAM-preparátumban - a vérerek átlagos száma ± szórás értékeket reprezentálnak.
Ezzel a kvantitatív vizsgálattal kimutattuk, hogy az 10 LM609 monoklonális antitesttel kezelt tumorokba hatoló vérerek száma mindössze harmada a pufferrel, illetve a P3G2- vagy CSAT-antitesttel kezelt tumorokba hatoló erek számának (p<0,0001; „Wilcoxon”-féle sorozatösszegteszt alapján). Az a tény, hogy az M21-L-tu- 15 morok nem expresszálnak avp3-integrint, azt jelzi, hogy az LM609-antitest közvetlenül a vérerek - és nem a tumorsejtek - befolyásolása révén gátolja az angiogenezist. Ezek az eredmények összhangban állnak az avp3-integrin - rákszövet-biopsziákban megfigyel- 20 hető - szövettani eloszlásával (lásd 3A-3D. ábrák), ahol az avp3-integrin eloszlása a tumorban lévő vérerekre korlátozódott, és magukban a tumorsejtekben nem volt jelen.
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés 25
A tumor indukálta CAM-rendszerben az 1. példában leírtak szerint előállított szintetikus peptideket helyileg alkalmaztuk. A peptideknek az erek életképességére gyakorolt hatását a fentebb leírtak szerint vizsgáltuk. 30
E) Tumor indukálta angiogenezis gátlása intravénás kezeléssel
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
A fenti, D)l. pontban előállított preparátumokat intravénás injektálással beadott monoklonális antitestek- 35 kel is kezeltük. A tumorokat a D)l. pontban leírtak szerint helyeztük a CAM-preparátumokra, az ablakokat ragasztószalaggal lezártuk, majd 24 óra múlva a csirkeembrió vérereibe, a fentebb leírtak szerint, 200 pg tisztított monoklonális antitestet injektáltunk. A csirkeemb- 40 riókat ezután hét napig inkubáltuk. Az angiogenezis mértékét a fentiek szerint figyeltük meg. E kísérlet után a tumorokat kimetszettük, és az antitest tumomövekedésre vagy annak gátlására gyakorolt hatásának meghatározása érdekében megmértük a tömegüket 45 (lásd 8. példa).
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
A CAM-vizsgálati rendszerben a peptidek - tumor indukálta érrendszerre gyakorolt - hatásait is értékeltük. A tumor-CAM-preparátumot a fentiek szerint alkal- 50 máztuk, azzal a különbséggel, hogy a monoklonális antitestek injektálása helyett - az 1. példában és a 7. példa A)2. pontjában leírtak szerint előállított - szintetikus peptideket injektáltuk a látható vérerekbe.
A HCl-sót tartalmazó 66 203-as ciklusos pepiiddel 55 és a 62 186-os kontrollpeptiddel végzett CAM-vizsgálatok eredményeit a 9A-9C. ábrákon mutatjuk be.
A 9A. ábrán látható, hogy a kontrollpeptiddel végzett kezelés nem gyakorolt hatást azokra a nagy vérerekre, amelyek a tumorkezelés miatt a CAM eredetileg erek 60 nélküli területére nőttek. Ezzel szemben, amikor a
203-as, ciklusos (avP3-antagonista) RGD-peptidet helyeztük a szűrőpapírra, a vérerek képződése gátolt volt, s a CAM ezen területe új erektől mentes maradt (lásd 9B. ábra). Az RGD-tartalmú peptid gátlóhatása specifikus és lokalizált volt, amit az bizonyít, hogy a tumor helye körüli vérerekre nem gyakorolt káros hatásokat. Ennek megfelelően, amikor az inhibitor peptideket intravénásán injektáltuk a CAM-preparátumba, a CAM
- tumor helyétől távolabbi - területein a már létező, érett vérereken semmilyen káros hatást nem figyeltünk meg (9C. ábra). A már létező ereket az inhibitor peptid (amely áthaladt ezeken az ereken) nem befolyásolta, miközben gátolta az új erek - már létező erekből a tumortömegbe történő - növekedését. Mindezek értelmében, a 66 203-as és 62 184-es szintetikus pepiidről (melyekről a 4. példában leírt ligandum-receptor vizsgálatokban már kimutattuk, hogy a^-antagonisták) bebizonyítottuk, hogy gátolják a fejlődő erek növekedését, a már létező, érett erekét azonban nem. Ezenfelül, megállapítottuk azt is, hogy a peptidek intravénás infúziója a környező területeken nem okoz semmilyen káros citotoxicitást (amit a 9C. ábrán látható, ép érhálózat bizonyít).
Az 1. példában előállított és 1. táblázatban felsorolt peptidekkel hasonló vizsgálatokat végeztünk.
8. példa
A tumorszövet növekedésének gátlása a CAM- j vizsgálatban, afij-antagonisták alkalmazásával
Ahogy az a 7. példa D)l. pontjában említettük, az I anti-avp3-antagonisták - növekedési faktor vagy tumor f által indukált angiogenezisre gyakorolt - hatását a vizű- ; i ális megfigyelés mellett a tumortömeg - kezelést köve- f tő - változásainak mérésével is értékeltük. Ehhez a ( vizsgálathoz a tumor indukálta angiogenezis CAM- | rendszerét a 6. példa C) pontjában és a 7. példa D) pont- í jában leírtak szerint készítettük elő. A hétnapos inkubálás végén a kapott tumorokat kimetszettük a chorioallantois-membránokról, levágtuk róluk a CAM-szövetmaradványokat, majd 1 ml foszfátpufferelt sóoldattal mostuk, és megmértük mindegyik tumor nedves tömegét.
A mikroszkópos, szövettani vizsgálathoz a tumorok jellemző mintáit „Bulins” fixálószerben 8 óra hosszat fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk. A tumorokból sorozatmetszeteket készítettünk, melyeket - a mikroszkópos vizsgálathoz - hematoxilinnal és eozinnal („H&E”) festettünk [Gladson és munkatársai: J. Clin. Invest. 88,
1924 (1991)]. A metszeteket „Olympus” mikroszkópon,
250-szeres nagyítással fényképeztük.
A) Helyi kezelés
A kontrollpuffer (HBSS), valamint a P3G2 (antiος,βί) és LM609 (anti-avp3) monoklonális antitest helyi alkalmazásának tipikus emberi melanomatumor (M21L) tömegére gyakorolt hatásának eredményeit a 4. táblázatban foglaljuk össze. Mindegyik kísérletben több embriót értékeltünk, és az egyes kísérleti csoportokra érvényes, átlagos tumortömegeket a táblázat alján, a szórással együtt adjuk meg.
HU 221 988 Β1
4. táblázat végső soron pedig a tumortömeg csökkenését eredmé-
nyezi. | ||||||
Embrió száma | Kezelés | Tumortömeg (mg) | B) Intravénás kezelés | |||
Az UCLAP-3 karcinómatumor tömegének - puf- | ||||||
1. | HBSS | 108 | 5 | Eerrel (foszfátpufferelt sóoldat), illetve CSAT- (anti-βι | ||
2. | 152 | vagy LM609-antitesttel (anti-a^3) végzett intravénás | ||||
3. | 216 | kezelés hatására bekövetkező - alakulását az 5. táblá- | ||||
4 | 270 | zatban foglaljuk össze. Mindegyik kísérletben több | ||||
embriót értékeltünk, és az egyes kísérleti csoportokra | ||||||
5. | 109 | 10 | érvényes, átlagos tumortömegeket a táblázat alján, a | |||
6. | 174 | szórással együtt adjuk meg. | ||||
1. | P3G2 | 134 | 5. táblázat | |||
2. | 144 | |||||
3. | 408 | 15 | Embrió száma | Kezelés | Tumortömeg (mg) | |
4. | 157 | 1. | PBS | 101 | ||
5. | 198 | 2. | 80 | |||
6. | 102 | 3. | 67 | |||
7. | 124 | 20 | 4. | 90 | ||
8. | 99 | 1. | CSAT | 151 | ||
1. | LM609 | 24 | 2. | 92 | ||
2. | 135 | 3. | 168 | |||
3. | 17 | 25 | 4. | 61 | ||
4. | 27 | 5. | 70 | |||
5. | 35 | 1. | LM609 | 16 | ||
6. | 68 | 2. | 54 | |||
7. | 48 | 30 | 3. | 30 | ||
8. | 59 | 4. | 20 | |||
Kezelés | Átlagos tumortömeg (mg) | 5. | 37 | |||
HBSS-kontroll | 172+26 | 6. | 39 | |||
P3G2 | 171+36 | 35 | 7. | 12 | ||
LM609 | 52+13 |
Ha a CAM-vizsgálati rendszerben emberi (ανβ3negatív) melanomatumort LM609 antitesttel kezeltünk, az átlagos tumortérfogat a kontroll 172+26 mg értékről 52+13 mg értékre csökkent. A P3G2 antitest a tumortömegre nem gyakorolt hatást. Megállapíthatjuk, hogy a a^3-receptor - a^3-specifikus LM609antitest helyi kezelésével végzett - gátlása a tumortömeg csökkenését (valamint az angiogenezis gátlását, lásd előző példák) eredményezte. A P3G2-antitesttel végzett kezeléskor a tumorok mért átmérője hozzávetőleg 8-10 mm volt, ezzel szemben, az LM609-antitesttel kezelt tumorok átmérője csupán átlagosan 2-3 mm volt.
E tumorok fagyasztott metszeteinek mikroszkópos megfigyelésével megállapítottuk, hogy a P3G2-antitesttel kezelt tumorok celluláris szerkezete sértetlen volt, míg az LM609-antitesttel kezelt tumorokban hiányzott a szervezett celluláris szerkezet. Ennek megfelelően, az a^3-receptor-aktivitás az a^3-negatív tumorokban kulcsfontosságú a tumor - a^3-receptort expresszáló új érhálózat fejlődése által táplált - tömegének fenntartása szempontjából. Az avP3-integrin - találmány szerinti a^3-antagonistákkal történő gátlása a tumorba hatoló erek fejlődésének gátlását,
Kezelés Átlagos tumortömeg (mg)
PBS-kontroll 85+7
CSAT 108+22
LM609 30+6
Ha a CAM-vizsgálati rendszerben emberi (ανβ3negatív) karcinómatumort LM609 antitesttel kezeltünk, az átlagos tumortérfogat a kontroll 85+7 mg értékről 30+6 mg értékre csökkent. A CSAT-antitest nem befo45 lyásolta jelentősen a tumortömeget. Megállapíthatjuk, hogy a avp3-receptor - avp3-specifikus LM609-antitest helyi kezelésével végzett - gátlása a karcinóma visszafejlődését (valamint az angiogenezis gátlását, lásd előző példák) eredményezte. Ezenfelül, az
LM609 intravénás injektálása hasonlóan gátolta az emberi melanomatumor növekedését is.
9. példa
Tumorszövet növekedésének visszaszorítása CAM55 vizsgálatban, a$3-antagonisták alkalmazásával
Az a^3-antagonisták - tumorok növekedésre és fennmaradására gyakorolt - hatásainak értékelése céljából emberi melanoma-, tüdő-, hasnyálmirigy- és gégetumordarabokat 10 napos csirkeembriók chorioallantois60 membránjára helyeztünk (lásd 5. példa A) pontja).
i
i.
-i
HU 221 988 Bl
A) Intravénás alkalmazás
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
a) Kezelés IM609-(anti-avP3) és CSAT-antitesttel (anti-Pj) napos csirkeembriók chorioallantois-membrán- 5 jára avp3-negatív emberi M21-L-melanoma-, FG hasnyálmirigytumor-, UCLAP-3 emberi tüdőtumor-, illetve H£p3 emberi gégetumordarabokat helyeztünk.
óra elteltével az embriókat intravénásán PBS-sel, illetve egy dózisban (300 pg/μΐ) LM609 (anti-a^3) mo- 10 noklonális antitesttel vagy CSAT (anti-βι) monoklonális antitesttel oltottuk. A tumorokat további hat napig hagytuk fejlődni. Az inkubálás után a tumorokat óvatosan kimetszettük a membránból, és a környező CAMszövetet levágtuk róluk. A tumorok kimetszését két ku- 15 taté végezte, és csak a könnyen azonosítható, kemény tumortömeget vágtuk ki. A tumoroknak jól meghatározható szélük volt, így a kemény tumortól jól megkülönböztethető, vékony, félig átlátszó chorioallantoismembránt a tumortömeg károsítása nélkül tudtuk eltá- 20 volítani. A kimetszett tumorok tömegét lemértük, és morfológiai, valamint szövettani vizsgálatokat végeztünk.
A 7. nap végén meghatározott nedves tumortömegeket a kezelés előtt mért tömegekhez viszonyítot- 25 tűk (lásd 13. ábra). Az ábrán látható oszlopok csoportonként 5-10 tumor átlaga iszórás értékeket reprezentálnak. Az LM609-antitest - valamennyi tesztelt tumor esetében - a kontrolihoz képest jelentős mértékben gátolta a tumomövekedést (p< 0,001). A PBS-sel vagy 30 CSAT-antitesttel kezelt tumorok valamennyi esetben proliferálódtak. Ezzel szemben, az LM609-antitest nemcsak megakadályozta a tumorok növekedését, hanem a legtöbb esetben - a tumorok jelentős mértékű visszafejlődését is kiváltotta. Lényeges, hogy ezek a tumor- 35 sejtek nem expresszálnak avP3-integrint, ami arra utal, hogy a tumomövekedés gátlása az antitest angiogenezis elleni hatásának, és nem a tumorsejtekre gyakorolt közvetlen hatásának köszönhető.
b) Kezelés LM609- (anti-a^f és P3G2-antitesttel 40 (anti-aJPs)
Emberi M21-L-melanoma tumordarabokat (50 mg) napos csirkeembriók chorioallantois-membránjára ültettünk (lásd 5. példa A) pontja). 24 óra elteltével az embriókat intravénásán PBS-sel, illetve egy dózisban 45 (300 pg/μΐ) LM609 (anti-avp3) monoklonális antitesttel vagy P3G2 (anti-OvPj) monoklonális antitesttel oltottuk. A tumorokat a fenti a) pontban leírtak szerint inkubáltuk, majd morfológiai és szövettani vizsgálatokat végeztünk. 50
A P3G2- vagy LM609-antitesttel kezelt M21-L-tumorokat morfológiailag vizsgáltuk. A P3G2-vel kezelt tumorok nagy méretűek (8 mm-es átmérő) és dús érhálózatúak voltak, míg az LM609-antitesttel kezelt tumorok mérete jóval kisebb (3 mm-es átmérő) volt, és 55 vérereket nem találtunk bennük.
A tumorok további vizsgálata céljából szövettani metszetek készítettünk, melyeket a 9. példa A)l.a) pontjában leírtak szerint hematoxilinnal és eozinnal festettünk. A P3G2-antitesttel kezelt tumorokban számos élet- 60 képes és aktívan osztódó tumorsejtet találtunk, amit a tumorok egész sztrómájában látható mitotikus képletek (lásd 14A. ábra, nyílhegyek), valamint a számos véredény (14A. ábra, nyilak) jelez. Ezzel szemben, az LM609-antitesttel kezelt tumorokban tumorsejtekét vagy vérereket nem - vagy alig - találtunk (14B. ábra). Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az avP3-integrin antagonistái gátolják a tumor indukálta angiogenezist, ami in vivő a különböző emberi tumorok növekedésének leállását és a tumorok visszafejlődését eredményezi. Lényeges rámutatni, hogy a tumomövekedés hetedik napja után vizsgált (17 napos) embriók növekedése normális volt, függetlenül attól, hogy kaptak-e a^-antagonista kezelést. Ez arra utal, hogy az avP3-antagonisták nem toxikusak a fejlődő embriókra.
2. Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
Emberi M21-L-melanoma tumordarabokat (50 mg) 10 napos csirkeembriók chorioallantois-membránjára ültettünk (lásd 5. példa (A) pontja). 24 óra elteltével az embriókat intravénásán 300 pg/μΐ dózisú ciklo-RADfV(69 601), illetve ciklo-RGDfV-peptiddel (66 203) oltottuk. Összesen 72 óra elteltével a tumorokat eltávolítottak, morfológiai vizsgálatokat végeztünk, és a 9. példa
A)l. pontjában leírtak szerinti sztereomikroszkóp alkalmazásával fényképeket készítettünk.
A fényképeket a 15. ábrán mutatjuk be. A 15A. ábrán két, ciklo-RADfV-peptiddel (69 601) kezelt minta; a 15B. ábrán két, ciklo-RGDfV-peptiddel (66 203) kezelt minta; a 15C. ábrán a ciklo-RGDfV-peptiddel (66 203) kezelt embrióból származó, tumorral szomszédos két CAM-szövetminta; a 15D. és 15E. ábrán pedig a kontroll (69 601-es) peptiddel, illetve a 66 203-as cikloRGDfV-peptiddel kezelt tumorok 13-szoros nagyítása látható. A15D. ábrán jól láthatók a kontrollpeptiddel kezelt tumorokban lévő normális vérerek. A 15E. ábrán a 66 203-as peptiddel kezelt tumorokban lévő szétroncsolt vérereket mutatjuk be (lásd nyilak).
Az eredmények azt bizonyítják, hogy csak a 66 203-as peptid gátolta a vérerek képződését, és a tumorral szomszédos CAM-szövetben lévő vérerek nem károsodtak.
10. példa
A tumorszövet növekedésének gátlása avP3-antagonistákkal végzett kezeléssel, in vivő nyúlszemmodell-vizsgálatban
Az avP3-antagonisták - növekedési faktor indukálta - angiogenezisre gyakorolt hatása természetesen átlátszó struktúrákban (mint például a szem szaruhártyájában) jól megfigyelhető. Az új vérerek a szaruhártya - jó vérellátású - peremétől a szaruhártya közepe felé nőnek, melynek normális esetben nincs vérellátása. Az angiogenezis stimulátorai (mint például a PFGF) a szaruhártyán indukálják (az angiogenezis antagonistái pedig gátolják) az új vérerek szaruhártya peremétől kiinduló növekedését. A szaruhártya angiogenezise úgy következik be, hogy az endotélsejtek a szaruhártya peremétől a kemény, kollagénrostos szaruhártyaszövetbe hatolnak, mely folyamat jól látható. A nyúlszemmodell az angiogenezis serkentésének és gátlásának közvetlen megfi24
HU 221 988 Β1 gyelését biztosító in vivő modell, melyben a különböző vegyületeket közvetlenül a szaruhártyára helyezzük.
A) In vivő nyúlszemmodell-vizsgálat
1. Növekedési faktorokkal indukált angiogenezis
Az in vivő nyúlszemmodellben az angiogenezist a pFGF növekedési faktorral indukáltuk, a következők szerint.
a) Növekedési faktort és monoklonális antitesteket tartalmazó „Hydron -pasztillák előállítása
A növekedési faktort és monoklonális antitesteket tartalmazó pasztillákat D’Amato és munkatársai leírása szerint állítottuk elő [Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 4082 (1994)]. Minden egyes pasztilla - a PFGF stabilizálása és a környező szövetekbe történő lassú kibocsátása érdekében „sucralfete”-hoz („Carafet”, Merion Merrel Dow Corporation) kötött - 650 ng PFGF növekedési faktort tartalmazott. Készítettünk olyan „hydrori’-pasztillákat is, amelyek PBS-ben 40 pg LM609 (anti-a^) vagy P1F6 (anti-avP5) monoklonális antitestet tartalmaztak. A pasztillák anyagát speciálisan előkészített, felületükön 2,5 mm-es fúrott magot tartalmazó teflondugókba („peg”) öntöttük. Mindegyik dugóba hozzávetőleg 12 μΐ öntőanyagot tettünk, és a polimerizációt sterilkamrában egy éjszakán át végeztük. A pasztillákat UVsugárzással sterilizáltuk.
b) Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
Mindegyik kísérletben három nyulat használtunk.
A nyulak egyik szemébe pFGF-et vagy LM609-antitestet tartalmazó pasztillát, másik szemébe PFGF-et és P1F6 (anti-avP3) egér monoklonális antitestet tartalmazó pasztillát helyeztünk. Az LM609-antitest P1F6antitesttel és PBS kontrollal történő összehasonlítására alkalmazott páros szemteszt lehetőséget nyújt a vizsgált monoklonális antitestek közötti lényeges különbségek szigorú tesztelésére.
A PlF6-antitest az c^Pj-integrinnei lép immunreakcióba, amely az érfali endotélsejtek felületén található, de feltehetően nem játszik szerepet az angiogenezisben. Annak meghatározása érdekében, hogy a PlF6-antitest hatással befolyásolja-e az angiogenezist, olyan pasztillákat állítottunk elő, amelyek csak ezt az antigént tartalmazták, és az ilyen pasztillákat a következők szerint vizsgáltuk.
Valamennyi tesztelt monoklonális antitestet jól ismert eljárásokkal, „Protein-A Sepharose CL-4B” affinitási oszlopkromatográfía alkalmazásával, hasvízből tisztítottuk Az eluált immunglobulint PBS-sel szemben dializáltuk, majd az endotoxin eltávolítása érdekében „Detoxí’-géllel (Pierce Chemicals) kezeltük. Az endotoxinról bebizonyosodott, hogy hatásos angiogén és gyulladásserkentő szer, ezért a monoklonális antitesteket a „Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay” (Bio-Whittaker) alkalmazásával endotoxin jelenlétére vizsgáltuk, és a nyúlszemmodell-vizsgálatban csak a detektálható endotoxin nélküli monoklonális antitesteket alkalmaztuk.
A nyulak szemén kialakított szaruhártyazsebbe PFGF-et és LM609 (anti-a^j) vagy P1F6 (anti-a^) monoklonális antitestet tartalmazó - „hydrori’-pasztillát helyeztünk, amely a PFGF stabilizálása érdekében „sucralfate”-ot is tartalmazott. Az egyes pasztillákat a szaruhártya kötőszöveti vázának közepén műtéti úton kialakított „zsebekbe” helyeztük. A műtétet - fénytörő lencsével ellátott - „Wild model M691” operáló mikroszkóp alkalmazásával (amelyhez a szaruhártyák lefényképezéséhez fényképezőgépet csatlakoztattunk), steril körülmények között végeztük A szaruhártya kötőszöveti vázában 3x5 mm-es „zsebet” alakítottunk ki, oly módon, hogy egy 69-es ,JBeaver”-pengével a szaruhártya vastagságának feléig 3 mm-es metszést ejtettünk. A kötőszöveti váz kivágott darabját szivárványhártya-spatulával eltávolítottuk, és a pasztillát úgy helyeztük el, hogy perifériás széle a szaruhártya szélétől (limbus) 2 mm-re legyen.
A következő 14 nap során a pFGF és a monoklonális antitest a beültetett pasztillából a környező szövetbe diffundált, miáltal a szaruhártya szegélyéből kiinduló angiogenezist indukált.
Az egyes kezelések jellemző eredményeit a 16A-16E. ábrákon mutatjuk be. A jelen lévő vérerek számát úgy határoztuk meg, hogy a szemet az óra számlapjának megfelelően 12 egyenlő részre osztottuk.
Az „egy óraszámlap-egységnyi véredény” kifejezés a vérerek azon mennyiségét jelenti, amely kitölti a szem egy óra beosztásnak megfelelő részét. Az öt, csak PFGF-fel kezelt nyúl esetében élénk angiogenezist tapasztaltunk, melynek során az új vérerek a szaruhártya szegélyétől a közepe felé nőttek (ahol normális esetben nincsenek erek). E nyulak egyike esetében, csupán egy óraszámlap-egységnyi véredényt figyeltünk meg.? 1
A PFGF-fel és LM609-antitesttel kezelt nyulak közül · kettőben a műtét utáni 14. napig egyáltalán nem figyel- r tünk meg detektálható angiogenezist. E nyulak egyikében, a 14. napon, három gócban vérzéses és bimbózó 1 ereket találtunk. A PFGF-fel és P3G2 (anti-ctyPs) mono- í klonális antitesttel kezelt nyulak közül kettő szaruhár- í tyájában élénk angiogenezist tapasztaltunk, melynek so- í ián az új vérerek a szaruhártya szegélyétől a közepe felé nőttek. E nyulak egyikében csupán egy-két óraszámlapegységnyi véredényt figyeltünk meg.
A nyúlszemmodell-vizsgálattal bebizonyítottuk, hogy az LM609 (anti-o^Pj) monoklonális antitesttel kezelt nyulak szaruhártyájában - PFGF jelenlétében - a szaruhártya széle melletti, normális erek nem állnak angiogén hatás alatt. Ezzel szemben, a P3G2 (anti-Oypj) monoklonális antitesttel kezelt nyulak szaruhártyájában - PFGF jelenlétében - a szaruhártya széle melletti erekben angiogenezist tapasztaltunk. A szaruhártya angiogenezis - LM609 monoklonális antitest által kiváltott - teljes gátlása lényegesen magasabb szintű volt, mint amit a korábban leírt antiangiogén-reagensekkel elértek.
11. példa
A tumorszövet növekedésének in vivő visszaszorítása a$3-antagonistákkal, kimérikus egér .humán vizsgálatban
Az in vivő kimérikus egér:humán modell előállításához SCID-egér bőrének egy részét emberi újszülött- t praeputiummal helyettesítettük (17. ábra). A sikeres bőrátültetés után az emberi praeputiumot karcinómasejtekkel oltottuk be. Mérhető tumor kialakulása után az
HU 221 988 Β1 egér farokvénájába LM609 (anti-avp3) monoklonális antitestet vagy PBS-t injektáltunk. 2-3 hét elteltével a tumorokat kivágtuk, tömegüket megmértük, és szövettani vizsgálatot végeztünk.
A) In vivő kimérikus egér . humán vizsgálat
Az in vivő kimérikus egér:humán modellt lényegében Yan és munkatársai leírása szerint [J. Clin. Invest. 91, 986 (1993)] állítottuk elő. Röviden; 6-8 hetes SCID-egér bőréből eltávolítottunk egy 2 cm2-es darabot, és helyére emberi praeputiumot ültettünk. Az egeret elaltattuk, és hasa szélső részén, mindkét oldalon, 5 cm2-es területről leborotváltuk a szőrt. A bőr - teljes vastagságban, egészen az izompólyáig történő - eltávolításával két cirkuláris transzplantációs ágyat képeztünk, melybe emberi újszülött-praeputiumból származó, azonos terület, teljes vastagságú bőrt ültettünk, melyet hozzávarrtunk az egér bőréhez. A transzplantátumot „Bánd Aid” pólyával fedtük le, melyet a bőrhöz varrtunk. A sebet mikropórusos szövetdarabbal is lefedtük.
Az SCID-egerekre átültetett emberi bőrön a kemény emberi tumorok kialakításához emberi M21L-melanoma-sejtvonalat vagy MDA-23.1-emlőrák-sejtvonalat (ATCC HTB 26; amely a szövetmetszetek LM609 monoklonális antitestekkel mutatott immunreaktivitása alapján avp3-negatív) alkalmaztunk. Az emberi bőrtranszplantátumba - intradermálisan - 5 χ 106 (különálló) M21-L- vagy MDA-23.1-sejtből álló szuszpenziót injektáltunk. Az egereken 2-4 hét elteltével vizsgáltuk az emberi tumorok növekedését.
B) Intravénás kezelés
1. Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
A mérhető tumorok kifejlődése után az - M21L-tumorsejtekkel injektált - SCID-egerek farokvénájába - 2-3 héten keresztül, hetente kétszer - intravénásán 250 pg LM609 (anti-avp3) monoklonális antitestet vagy PBS-t injektáltunk. Ezután a tumorokat levágtuk a bőrről, és megtisztítottuk a környező szövetdaraboktól. Mindegyik kísérletben több egeret értékeltünk; az egyes kezelési kísérletekben kapott átlagos tumortömegeket a 6. táblázat alján adjuk meg.
6. táblázat
M21L-tumor száma | Kezelés | Tumortömeg (mg) |
1. | PBS | 158 |
2. | 192 | |
3. | 216 | |
4. | 227 | |
5. | LM609 | 195 |
6. | 42 | |
7. | 82 | |
8. | 48 | |
9. | 37 | |
10. | 100 | |
11. | 172 |
Kezelés Átlagos tumortömeg (mg)
PBS 198
LM609 113
A kimérikus egér:humán vizsgálati rendszerben az avp3-negatív emberi M21L-tumor átlagos tömege LM609 (anti-avp3) monoklonális antitest hatására a PBS-sel kezelt kontroll 198 mg-os átlagos tömegéről 113 mg-ra csökkent.
Az LM609 (antí-OvPj) monoklonális antitesttel és a PBS-sel kezelt M21L-tumorok jellemző mintáit morfológiailag vizsgáltuk. A PBS-sel kezelt tumorok átmérője 8-10 mm volt, és sok eret tartalmaztak, ezzel szemben, az LM609-antitesttel kezelt tumorok sokkal kisebbek voltak (3-4 mm-es átmérő), és kimutatható ereket nem tartalmaztak.
Az MDA-23.1-sejtekkel beoltott bőrtranszplantátumokon jól megfigyelhető és mérhető tumorok képződtek. A kifejlett tumorok morfológiai vizsgálata azt mutatta, hogy az átültetett emberi szövetből új erek nőttek az MDA-23.1-tumorsejtekbe.
Ilyenformán, ebben a modellben az a^-receptor
- Ovf^-specifikus LM609-antitest intravénás beadása hatására bekövetkező - blokkolása a tumor növekedésének gátlását eredményezte, hasonlóan, mint a 9. példában leírt CAM-modell, illetve a 10. példában leírt nyúlszemmodell-vizsgálat esetében.
12. példa
Az érfali sejtek sejtciklusba történő bekerülésének és apoptózisának serkentése ajfij-integrin jelenlétében, CAM-vizsgálati rendszerben
A vérképződési folyamat egyértelműen a citokinek
- mint például a pFGF és VEGF - érfalsejtek proliferációját serkentő képességétől függ [Mignatti és munkatársai: J. Cell. Biochem. 471, 201 (1991); Takeshita és. munkatársai: J. Clin. Invest. 93, 662 (1994); és Koyama és munkatársai: J. Cell. Physiol. 158, 1 (1994)]. Nyilvánvaló azonban az is, hogy a jelképző („signaling”) események irányíthatják az érfalsejtek érett véredényekké történő differenciálódását, következésképpen, elképzelhető, hogy az angiogenezis folyamatában lévő érfalsejtek szaporodásával vagy differenciálódásával kapcsolatos jelek befolyásolása az angiogenezis megzavarását eredményezi.
Kimutatták, hogy az integrinek ligálódási eseményei mind a sejtek proliferációjában, mind az in vitro apoptózisban vagy programozott sejtpusztulásban részt vesznek [Schwartz: Cancer Rés. 51, 1503 (1993); Meredith és munkatársai: Mól. Bioi. Cell. 4, 953 (1993); Frisch és munkatársai: J. Cell Bioi. 124, 619 (1994)]. Az avp3-antagonisták angiogenezisre gyakorolt hatásainak részletes vizsgálata megszakításos és megrongált (tumorral kapcsolatos) vérerek jelenlétét mutatja. Ilyenformán, lehetséges, hogy a véredények folytonosságának megszűnése az érfalsejtek szelektív pusztulásának vagy apoptózisának következménye.
E lehetőség kivizsgálása érdekében olyan csirkechorioallantois-membránokat (CAM) vizsgáltunk, melyekben pFGF növekedési faktorral, valamint a találmány
HU 221 988 Β1 szerinti monoklonális antitesttel és ciklusos peptidekkel angiogenezist indukáltunk.
A) Monoklonális antitestekkel végzett kezelés
Az apoptózis számos eljárással detektálható, mint például a szövetből izolált DNS - fragmentálódásának 5 detektálását célzó - közvetlen vizsgálatával, valamint ép szövetben a fragmentálódott DNS 3’-OH csoportjainak (3’-OH csoportot specifikusan detektáló antitesttel végzett) kimutatásával.
1. A DNS-fragmentálódás vizsgálata 10 napos embriók chorioallantois-membránjára pFGF-fel impregnált szűrőpapír korongokat helyezve angiogenezist indukáltunk (lásd 6. példa A) pontja).
A CAM-preparátumok LM609 (anti-OyPj) monoklonális antitesttel végzett immunhisztológiai analízise azt 15 mutatta, hogy a vérereken az o^-integrin expressziója az angiogenezis PFGF-fel végzett indukálása utáni
12. és 24. óra között érte el maximumát. Ennek megfelelően, az PFGF-fel végzett indukció után 24 órával az embriókat intravénásán 100 pl PBS-sel, illetve 20 100 μ1-300 pg CSAT (anti-Pj) vagy LM609 (antiανβ3) monoklonális antitestet tartalmazó - PBS-sel oltottuk be.
A DNS-fragmentálódás detektálása céljából, az antitestekkel vagy a pufferrel végzett oltást követően 25 24 vagy 48 órával, közvetlenül a pFGF-fel impregnált szűrőpapír korong alatti területről CAM-szövetet vágtunk ki. A kivágott CAM-szöveteket háromszor steril PBS-sel mostuk, apróra vagdaltuk, majd 0,25%-os bakteriális kollagenázoldatban (Worthington Biochemical; 30 Freehold, NJ) újraszuszpendáltuk, és 37 °C-on - időnként vortexezve - 90 percig inkubáltuk. A DNS-t azonos számú CAM-sejtet tartalmazó egysejtszuszpenzióból, korábbi leírás szerint [Bissonette és munkatársai: Natúré 359, 552 (1992)] vontuk ki. Röviden; azonos 35 számú CAM-sejtet - 10 mM trisz-Cl-puffert (pH=8,0) és lOmM EDTA-t tartalmazó - 0,5 térfogat%-os Triton-X-100-oldatban (Sigma, St. Louis, MO) lizáltunk.
A sejtíizátumokat az oldható, fragmentálódott DNS - ép kromatinüledéktől történő - elkülönítése érdeké- 40 ben 4 °C-on, 16 000xg-vel 15 percig centrifugáltuk.
A fragmentálódott DNS-t mostuk, kicsaptuk, és 1,2 vegyes%-os agarózgélen analizáltuk.
Az oldható, fragmentálódott DNS-t az egyes kísérletekben azonos számú CAM-sejtből izoláltuk, agarózgé- 45 len elektroforézissel elválasztottuk, majd a fragmenseket etidium-bromidos festéssel tettük láthatóvá. A három különböző kezelési csoportból származó CAM-sejtekben - a kezelések után 24 órával - a DNS-fragmentáció relatív mennyiségében nem találtunk jelentős 50 különbséget, ezzel szemben, az LM609 (anti-ctyPj) monoklonális antitesttel végzett kezelés után 48 órával a DNS-fragmentáció jelentős fokozódását figyeltük meg (a CSAT-antitesttel, illetve a csak PBS-sel kezelt mintákhoz viszonyítva). 55
2. Az érfalsejtek sejtciklusba történő belépésének serkentése
Az avp3-integrin e folyamatokban betöltött szerepének kísérletes vizsgálata céljából a - PFGF jelenlétében vagy hiányában - kezelt CAM-szöveteket propi- 60 dium-jodiddal festettük, és LM609 (anti-cq]J3) monoklonális antitesttel reagáltattuk.
Az embriókból az LM609 (anti-avp3) és CSAT (anti-Pj) monoklonális antitesttel, illetve csak PBS-sel végzett kezelés után 24 és 48 órával izolált CAM-szöveteket - a fentebb leírtak szerint bakteriális kollagenázzal végzett inkubálással - különálló sejtek szuszpenziójává disszociáltak. Az szuszpenzióban lévő sejteket permeábilissá tettük, és „Apop Tag Insita Detection” reagenskészlettel (Oncor, Gaithersburg, MD) - a gyártó útmutatásai szerint - festettük. Az ,Αρορ Tag” olyan antitest, amely specifikusan a fragmentálódott DNS szabad 3’-OH csoportját detektálja. Az ilyen szabad 3’OH csoportok detektálása az apoptózisos sejtek kimutatásának ismert eljárása [Gavrieli és munkatársai: J. CellBiol. 779,493(1992)].
Az ,Αρορ Tag” antitesttel festett sejteket 0,1 térfogat%-os Triton-X-100-at tartalmazó PBS-ben öblítettük, majd 0,5 vegyes% BSA-t, 0,02 vegyes% nátriumazidot és 200 pg/ml RN-áz-A-t tartalmazó PBS-ben újraszuszpendáltuk. A sejteket 1,5 óra hosszat inkubáltuk, mostuk, majd fluoreszcencia aktiválta sejtosztályozásnak vetettük alá. A sejtek fluoreszcenciáját „FACScan” áramlásos citométer alkalmazásával mértük, és az adatokat a következők szerint értékeltük.
A sejtfluoreszcenciát„FACScan” áramlásos citométerrel (Becton Dickinson, Mountain View, CA) mértük. Az oldalszóródást („side scatter”; SSC) és az előreszóródást („forward scatter”; FSC) egyidejűleg határoztuk meg, és az adatokat ,,FACScan research” szoftverrel (Becton Dickinson, Mountain View, CA) ellátott „Hewlet Packard HP9000” számítógépben gyűjtöttük össze. Az adatokat „P. C. Lysis version I” szoftver (Becton Dickinson, Mountain View, CA) alkalmazásával analizáltuk. Az ,ΑρθΡ Tag” reagenskészletből származó primer antitestek nélküli sejtszuszpenziók alkalmazásával negatív kontrollkapukat („control gates”) állítottunk fel. Mindkét sejtpopulációhoz azonos kapuzást („gating”) alkalmaztunk, ami a különböző kezelési csoportokban hozzávetőleg 8000-8000 sejt vizsgálatát teszi lehetővé.
A monoklonális antitesttel kezelt és ,Αρορ Tag” antitesttel festett CAM-szövetekből származó különálló sejtek - „FACS”-analízissel meghatározott - százalékos arányát a 18. ábrán mutatjuk be. A fekete oszlopok a vizsgálat előtt 24 órával kezelt embriókból származó sejteket, a pontozott oszlopok pedig a vizsgálat előtt 48 órával kezelt embriókból származó sejteket reprezentálják. Mindegyik oszlop háromszori ismétléssel végzett kísérletek átlag ± szórás értékeit mutatja.
Amint az ábrán látható, a vizsgálat előtt két nappal LM609 (anti-a^3) monoklonális antitesttel kezelt CAM-sejtek az ,Αρορ Tag” festődés intenzitásában - a csak PBS-sel vagy CSAT (anti-βι monoklonális antitesttel kezelt CAM-sejtekhez képest - 3-4-szeres növekedést mutattak.
B) Szintetikus peptidekkel végzett kezelés
A növekedési faktorral indukált angiogenezis CAM-vizsgálatát (lásd 6. példa A) pontja) a találmány
HU 221 988 Bl szerinti szintetikus peptidekkel is elvégeztük, hogy meghatározzuk e peptidek apoptózisra gyakorolt hatását. A ciklo-RGDfV (66 203) és ciklo-RADfV (69 601) pepiidet az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. A peptid oldatokat és a PBS-t 300 pg/ml koncentrációban injektáltuk a CAM-preparátumokba. 24 és 48 óra elteltével a szűrőpapírt és a környező CAM-szövetet kimetszettük, és - az apoptózis detektálása érdekében az előző pontban leírtak szerint ,Αρορ Tag” antitesttel festettük. A 18. ábrán látható, hogy a vizsgálat előtt két nappal a 66 203-as (ciklo-RGDfV) pepiiddel kezelt CAM-sejtek az „Apop Tag” festődés intenzitásában - a csak PBS-sel vagy a 69 601-es kontrollpeptiddel kezelt CAM-sejtekhez képest - 3-4-szeres növekedést mutattak.
C) A monoklonális antitestekkel végzett kezelés hatása az apoptózisra és a sejtciklusra
A különálló sejtek szuszpenzióiban - propidium-jodidos festéssel - meghatároztuk a kromoszomális DNS kópiáinak számát, hogy értékeljük a monoklonális antitestek sejtciklusra gyakorolt hatását, és Apop Tag” reagenskészlettel végzett festéssel vizsgáltuk az apoptózist.
A 24 vagy 48 órával korábban LM609 (anti-avp3) vagy CSAT (anti-βι monoklonális antitesttel kezelt CAM-szövetek különálló sejtjeiből álló szuszpenziókat a 12. példa A)l. pontjában leírtak szerint készítettük.
A sejtek „Apop Tag” antitesttel végzett festése előtt a sejtszuszpenziókat - 2,5 vegyes% BSA-t és 0,25 vegyes% nátrium-azidot tartalmazó - PBS-sel háromszor mostuk. A sejteket 1 vegyes%-os formaldehidet tartalmazó PBS-ben 15 percig fixáltuk, majd az előbbi oldattal újabb három mosást végeztünk. A nem specifikus kötődés megakadályozása érdekében a különálló sejtek szuszpenzióit 4 °C-on, egy éjszakán át - 5 vegyes% BSA-t tartalmazó - PBS-sel blokkoltuk. Ezután a sejteket az előbbiek szerint mostuk, ,Αρορ Tag” antitesttel festettük, és a sejtfluoreszcenciát a 12. példa A) pontjában leírtak szerint, „FACScan” citométer alkalmazásával mértük.
A különböző feltételekkel kezelt sejteket - PBSben 10 pg/ml koncentrációjú - propidium-jodiddal (Sigma, St. Louis, MO) festettük, PBS-sel kétszer mostuk, és az apoptózisra jellemző sejtmagi jellegzetességekre (például kromatinkondenzáció és szegmentáció) vizsgáltuk. Az apoptózisos sejtek százalékos arányát legalább 10-15 véletlenszerűen kiválasztott mikroszkóp-látóterületben lévő sejtek morfológiai analízisével becsültük meg.
A CSAT (anti-Pj) vagy LM609 (anti-avp3) monoklonális antitesttel kezelt embriók CAM-szövetéből származó különálló sejtek - „Apop Tag” antitesttel és propidium-jodiddal kezelt és FACS-analízissel vizsgált - szuszpenziójával kapott kombinált eredményeket a 19. ábrán mutatjuk be. Az y tengelyen az „Apop Tag” festődés (vagyis az apoptózis) mértékét, az x tengelyen pedig a propidium-jodidos festődés mértékét (vagyis a DNS-tartalom nagyságát) mutatjuk be. A vízszintes vonal az ,Αρορ Tag” festődés negatív kapuját jelzi. A bal oldali ábra a CSAT monoklonális antitesttel, a jobb oldali pedig az LM609 monoklonális antitesttel kezelt embriókból származó CAM-sejtek eredményeit mutatja. A sejtciklus-analízist - kísérleti feltételenként - hozzávetőleg 8000 esemény vizsgálatával végeztük, és az eredményeket kontúrdiagramon mutatjuk be.
A propidium-jodiddal festett különálló sejtek mintái azt mutatták, hogy az LM609-antitesttel kezelt CAM-sejtek 25-30%-a (a kezelés után 48 órával) a sejtmagi kondenzáció és/vagy szegmentáció folyamatát mutatták, melyek az apoptózison áteső sejtek jellemzői. Ezzel szemben, a CSAT-antitesttel kezelt CAM-sejtek 90-95%-a mutatott normális sejtmagi festődést.
A 19. ábrán látható, hogy jelentős számban vannak olyan sejtek, amelyekben egynél kevesebb DNS-kópiát tartalmazó csúcs figyelhető meg (Aj). E csúcsról korábban kimutatták, hogy a későbbi stádiumú apoptózisos sejtekben lévő, fragmentálódott DNS-t reprezentálja [Telford és munkatársai: Cytometry 13, 137 (1992)].
Ennek megfelelően, az ilyen A0-sejtek ,Αρορ Tag” antitesttel könnyen festhetők, ami azt igazolja, hogy ez a reagens alkalmas az apoptózisos sejtek detektálására.
Az Ao-sejtek festődésén kívül jelentős számú olyan sejt is festődik az ,Αρορ Tag” antitesttel, amely egynél több DNS-kópiát tartalmaz (19. ábra). Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az LM609-antitest képes elősegíteni a sejtciklusba már bekerült érfalsejtek apop- í tózisát. Ezzel szemben, a kontroll-CAM-szövetekből 1 származó - sejtciklusba már bekerült - sejtek minimé- t lis ,Αρορ Tag” festődést mutattak, ami összhangban | van a kontroll-CAM-szövetekben detektált apoptózis j sejtek kis számával. 1
A pFGF-fel stimulált CAM-szövetek - sejtciklusba | (S és G/M fázis) bekerült - sejtjeinek 70%-a mutatott t pozitív festődést az LM609-antitesttel. Ezzel szemben, !
a pFGF-fel nem kezelt CAM-szövetek sejtciklusba be- r került sejtjeinek csak 10%-a mutatott LM609-festődést. Ez azt jelenti, hogy a pFGF-fel végzett stimulálás után az avP3-hordozó sejtek nagyobb része aktív proliferációt mutat.
E megfigyelések együttesen azt jelzik, hogy az LM609 monoklonális antitest vagy az avp3-antagonista ciklusos peptidek intravénás injektálása csirkeembrió chorioallantois-membránjában - az angiogenezis indukcióját követően - elősegíti az apoptózist.
A CAM-szöveteket szövettanilag - LM609-antitesttel való immunreaktivitása alapján - az avP3-intetgrin expressziójára, illetve - ,Αρορ Tag” antitesttel mutatott immunreaktivitása alapján - az apoptózisos sejtek jelenlétére vizsgáltuk. Az 5. példa A) pontjában leírtak szerint előállított, LM609 (anti-Oy^) vagy CSAT (anti-β]) monoklonális antitesttel, illetve PBS-sel kezelt embriókból készített CAM-metszeteket lemostuk,
OTC-be (Baxter) ágyaztuk, és folyékony nitrogénben hirtelen lehűtöttük. A CAM-szövetekből 6 pm vastagságú metszeteket készítettünk, ezeket 30 másodpercig t acetonban fixáltuk, majd a felhasználásig -70 °C-on tároltuk. A festés előkészítése érdekében a szövetmetsze- teket rövid ideig 70 térfogat%-os etanolban öblítettük,
HU 221 988 Bl foszfátpufferelt sóoldattal háromszor mostuk. Ezután a metszeteket 5 vegyes% szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó foszfátpufferelt sóoldattal két óra hosszat blokkoltuk. A metszeteket ezután lemostuk, majd 1:50 higítású, rodaminnal konjugált kecske antiegér- 5 IgG-vel (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) két óra hosszat inkubáltuk. Az így kezelt metszeteket lemostuk, és a 12. példa A)2. pontjában leírtak szerint „Apop Tag” antitesttel festettük. A festett szövetmetszeteket tárgylemezen rögzítettük, és konfokális immunfluoresz- 10 cens mikroszkóppal vizsgáltuk.
A 20A-20C. ábrákon a CSAT-antitesttel kezelt embriókból származó CAM-szöveteket, a 20D-20F. ábrákon pedig az LM609-antitesttel kezelt embriókból származó CAM-szöveteket mutatjuk be. A 20A-20D. ábrá- 15 kon az „Apop Tag” antitesttel festett és ,J>. 1. C” képre („image”) szuperimponált fluoreszcenciával („FITC”) láthatóvá tett szövetek láthatók. A 20B. és 20E. ábrán azonos - LM609-antitesttel festett és fluoreszcenciával (rodamin) láthatóvá tett - szövetek láthatók. A 20C. és 20 20F. ábrán - ,Λρορ Tag” és LM609 antitesttel egyaránt festett - azonos szövetek összevont képei láthatók; a sárga festődés együttes lokalizációt jelent. A 20C. ábrán a vízszintes vonal 15 pm-nek, a 20D. ábrán pedig 50 pmnek felel meg. 25
A 20A-20C. ábrákon látható, hogy a CSAT-antitest vagy a PBS injektálása után az „Apop Tag” festődés minimális és véletlenszerű volt, ami azt jelzi, hogy a szövetben az apoptózis szintje minimális. Ezzel szemben, az LM609-antitesttel vagy a 203-as ciklusos pép- 30 tiddel kezelt embriók CAM-szövetében a vérerek többsége intenzív „Apop Tag” festődést mutat, miközben a környező, nem érfali sejtek esetében minimális reaktivitást figyeltünk meg (20D-20F. ábrák). Amennyiben a szövetek festéséhez „Apop Tag” és LM609-antitestet 35 egyaránt alkalmaztunk, (20C. és 20F. ábra), e maikerek jelentős együttes lokalizációját csak az a^-antagonistákkal kezelt embriókból származó CAM-szövetek esetében tapasztaltuk (20F. ábra).
Ezek a felismerések azt bizonyítják, hogy az angio- 40 genezis in vivő indukciója után az avp3-integrin inhibitorai szelektíven serkentik az avp3-integrint hordozó vérerek apoptózisát.
Bár az angiogenezis komplex folyamat, amely sok molekuláris és sejtbiológiai eseményt foglal magában, 45 különböző bizonyítékok arra utalnak, hogy az a^-integrin e folyamat viszonylag kései fázisában játszik szerepet. Először; az immunhisztológiai vizsgálat azt mutatja, hogy az érfalsejtekben az avP3-integrin expressziója az angiogenezis pFGF-fel végzett indukáló- 50 sát követően 12-24 órával éri el maximumát. Másodszor; az avp3-antagonisták a különböző aktivátorok által indukált angiogenezis folyamatát gátolják, ami arra utal, hogy ez a receptor a folyamatban talán valamennyi primer jelképző („signaling”) esemény utáni 55 általános reakcióútban játszik szerepet. Harmadszor; az LM609 monoklonális antitesttel vagy ciklusos pepiiddel kezelt chorioallantois-membránok nem mutatnak jelentős mértékű apoptózisnövekedést, amit a kezelés utáni 48. óráig a DNS fragmentálódásának detek- 60 tálásával mértünk. Végül; az avp3-antagonisták elősegítik azon érfalsejtek apoptózisát, amelyek sejtciklusba történő belépése már korábban indukált volt.
A fentiekben feltárt eredmények első közvetlen bizonyítékát biztosítják annak, hogy az integrin ligálódási eseményei in vivő szabályozhatják a sejtek életben maradását. Következésképpen, feltételezzük, hogy az angiogenezis beindulásával az egyes érfalsejtek osztódnak, és az angiogénforrás felé mozognak, majd az avp3-ligálás olyan jelet biztosít, ami a sejt tartós életben maradását teszi lehetővé, ami viszont differenciálódáshoz és érett vérerek kialakulásához vezet Ha azonban az avp3-ligálódást megakadályozzuk, a sejtek nem veszik ezt a molekuláris jelet, és bekövetkezik az apoptózis. Ez az elmélet magában foglalja azt is, hogy a differenciálódás bekövetkezése után az érett vérereknek az életben maradáshoz nincs többé szükségük avp3-jelölésre, és így ellenállóak az avp3-integrin antagonistáival szemben.
A példákban bemutatott eredmények azt bizonyítják, hogy az avp3-integrin antagonistái hatásosan alkalmazhatók a neoplázia vagy más, angiogenezissel jellemezhető betegségek kezelésére. Először is; az avp3-antagonisták rongálják az újonnan képződő vérereket, anélkül, hogy befolyásolná: a már létező érrendszert. Másodszor; az avP3-antagonisták nem gyakorolnak jelentős hatást a csirkeembrió életképességére, ami arra utal, hogy nem toxikusak. Harmadszor; az angiogenezist az angiogén ingertől függetlenül gátolják Végül: az avp3-antagonisták szisztémás beadása a különböző, szövettanilag eltérő emberi tumorok rendkívüli visszafejlődését eredményezi.
Ilyenformán, a fentebb leírt példákban bebizonyítottuk, hogy az avp3-integrin kulcsszerepet játszik a különböző ingerek által indukált angiogenezisben, ezáltal — a neovascularisatióval jellemezhető betegségek kezelése terén értékes terápiás célpontját képezi a találmány szerinti a^-antagonistáknak.
A találmány leírását megfelelőnek tartjuk arra, hogy szakember számára lehetővé tegye a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítását. A találmány oltalmi körét nem kívánjuk a letétbe helyezett sejtvonallal korlátozni, mivel a letétbe helyezett sejtvonal csupán a találmány tárgyának egyik megvalósítási módjának szemléltetésére szolgál. Az általunk letétbe helyezett sejtvonallal funkcionálisan egyenértékű sejtvonalak szintén az igényelt oltalmi körbe tartoznak. A letétbe helyezés nem jelenti azt, hogy a találmány leírása elégtelen lenne a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításához (beleértve annak legelőnyösebb módját). Nyilvánvaló, hogy a találmány leírásával nem kívánjuk az igényelt oltalmi kört a bemutatott, speciális esetekre korlátozni. A találmány leírása alapján szakember számára kézenfekvő, hogy az általunk feltárt speciális megvalósítási módokban számos olyan változtatás hajtható végre, melyekkel továbbra is azonos vagy hasonló eredmények nyerhetők. Nyilvánvaló, hogy az ilyen megoldások nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől, és az igényelt oltalmi körön belül maradnak.
HU 221 988 Β1
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=BOC-GRGDFV-OMe /megjegyzés=, A BOC-jelölés az N-terminális butil-oxi-karbonil védőcsoportot jelenti, az OMe-jelölés a C-terminális metil-észter védőcsoportot; a 2. pozícióban Arginin található.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=OMe /megjegyzés=, Az OMe-jelölés a C-terminális metil-észter védőcsoportot jelenti.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=D-Arg /megjegyzés=, A D-Arg jelölésben a ,JD” azt jelzi, hogy a 2. pozícióban található Arginin D-aminosav.”
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=BOC /megjegyzés=,A BOC-jelölés az N-terminális butil-oxi-karbonil védőcsoportot jelenti.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK:/jelzés=OH /megjegyzés=„Az OH-jelölés szabad C-terminális karboxilcsoportot jelöl.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=D-Arg /megjegyzés=,A D-Arg jelölésben a „D” azt jelzi, hogy a 2. pozícióban található Arginin D-aminosav.”
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
HU 221 988 Β1
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=H /megjegyzés=, A H-jelölés szabad N-terminális amint jelent.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=OH /megjegyzése ,Αζ OH-jelölés szabad C-terminális karboxilcsoportot jelöl.”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=D-Arg /megjegyzés=,A D-Arg jelölésben a „D” azt jelzi, hogy a 2. pozícióban található Arginin D-aminosav.”
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK:/jelzés=cyclo /megjegyzés=,A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 5 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...5
HU 221 988 Β1
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=”A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Gly Asp Phe Val
5
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 5 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...5
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=„F cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Alá Asp Phe Val
5
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 5 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...5
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=„A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Gly Asp Phe Val
5
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 15 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Tyr Thr Alá Glu Cys Lys Pro Gin Val Thr Arg Gly Asp Val Phe
10 15
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 5 aminosav
HU 221 988 Bl
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...5
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=, A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Alá Asp Phe Val
5
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: ciikuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=,A cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Alá Arg Gly Asp Phe Leu
5
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 6 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: cirkuláris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...6
EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=cyclo /megjegyzés=,Λ cyclo-jelölés ciklikus peptidet jelent; a kisbetűvel írt aminosavak D-aminosavak, a nagybetűvel írt aminosavak L-aminosavak.”
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Phe Leu
5
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 12 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris . i„... te,,..: 33
HU 221 988 Β1
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Thr Arg Gin Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met 1 5 10
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 13 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Alá Leu Alá Arg Leu Ser 1 5 10
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 11 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: intemális
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu
Claims (62)
1. avp3-antagonista alkalmazása az ανβ3 közvetítette angiogenezisnek egy szövetben történő gátlására alkalmas, a szövetbe beadható gyógyászati készítmény előállítására.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, mintegy 0,1 mg/kg és mintegy 300 mg/kg közötti dózisban beadható gyógyászati készítmény előállítására.
3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, szilárd tumoros szövet neovascularisatiójának gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint OvPj-antagonistaként a fibrinogén avP3-integrinhez történő kötődését gátló, de a fibrinogén anbp3- vagy ος,β,-integrinhez történő kötődését lényegében nem gátló antagonistát alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a^3-antagonistaként avp3-integrinre immunspecifikus monoklonális antitestet alkalmazunk.
6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint monoklonális antitestként humanizált antitestet alkalmazunk.
7. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint monoklonális antitestként az LM609 monoklonális antitest (ATCC HB 9537) immunreaktív jellemzőivel bíró antitestet alkalmazunk.
8. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a^3-antagonistaként RGD-szekvenciát tartalmazó polipeptidet alkalmazunk.
9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint polipeptidként c-(GiGDFV) (4. azonosító számú szekvencia), c-(RGDfV) (5. azonosító számú szekvencia), c(RGDFv) (7. azonosító számú szekvencia) vagy YTAECKPQVTRGDVF (8. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú peptidet, vagy ezek sóit alkalmazzuk.
10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint peptidsóként hidroklorid- vagy trifluor-acetát-sót alkalmazunk.
11. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, gyulladásban lévő szövetbe adható, gyulladásos szöveti angiogenezis gátlására alkalmas készítmény előállítására.
12. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, ízületi gyulladásban lévő szövetbe adható készítmény előállítására.
13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, reumatoid arthritisben szenvedő emlősben található szövetbe adható készítmény előállítására.
14. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, cukorbetegségből eredő szemideghártya-bántalomban szenvedő
HU 221 988 Bl páciens szemideghártya-szövetébe adható, szemideghártya-angiogenezis gátlására alkalmas készítmény előállítására.
15. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, hemangiomába adható készítmény előállítására. 5
16. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, kemény tumorba vagy kemény tumor metasztázisába adható, tumor-angiogenezis gátlására alkalmas készítmény előállítására.
17. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, karcinómá- 10 ba adható készítmény előállítására.
18. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, tüdő-, pankreász-, mell-, vastagbél- gége- vagy petefészektumorba adható készítmény előállítására.
19. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, az 0^3- 15 antagonistát mintegy 2 μΜ-tól mintegy 5 mM-ig teqedő koncentrációtartományban tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására.
20. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, intravénásán, transzdermálisan, ízületi nedvbe, intramuszkulári- 20 san vagy orálisan beadható gyógyászati készítmény előállítására.
21. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, kemoterápiával kapcsoltan beadható gyógyászati készítmény előállítására. 25
22. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, egyetlen intravénás dózisban beadható gyógyászati készítmény előállítására.
23. avP3-antagonista alkalmazása egy szövetben kialakult tumor visszafejlesztésére alkalmas, a szövetbe 30 beadható gyógyászati készítmény előállítására.
24. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként a fibrinogén avp3-integrinhez történő kötődését gátló, de a fibrinogén «nbPr vagy Ovpj-integrinhez történő kötődését lényegében nem gát- 35 ló antagonistát alkalmazunk.
25. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként avp3-integrinre immunspecifikus monoklonális antitestet alkalmazunk.
26. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, amely sze- 40 rint monoklonális antitestként az LM609 monoklonális antitest (ATCC HB 9537) immunreaktív jellemzőivel bíró antitestet alkalmazunk.
27. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként RGD-szekvenciát tartalmazó 45 polipeptidet alkalmazunk.
28. A 27. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint polipeptidként c-(GrGDFV) (4. azonosító számú szekvencia), c-(RGDfV) (5. azonosító számú szekvencia), c-(RGDFv) (7. azonosító számú szekvencia) vagy 50 YTAECKPQVTRGDVF (8. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú peptidet, vagy ezek sóit alkalmazzuk.
29. A 28. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint peptidsóként hidroklorid- vagy trifluor-acetát-sót al- 55 kalmazunk.
30. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, gyulladásban lévő szövetbe adható, gyulladásos szöveti angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására. 60
31. A 30. igénypont szerinti alkalmazás, ízületi gyulladásos szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
32. A 31. igénypont szerinti alkalmazás, reumatoid arthritisben szenvedő emlősben található szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
33. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, cukorbetegségből eredő szemideghártya-bántalomban szenvedő páciens szemideghártya-szövetébe adható, szemideghártya-angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
34. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, hemangiomába adható gyógyászati készítmény előállítására.
35. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, kemény tumorba vagy kemény tumor metasztázisába adható, tumor-angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
36. A 23. igénypont szerinti igénypont szerinti alkalmazás, az avp3-antagonistát mintegy 2 μΜ-tól mintegy 5 mM-ig terjedő koncentrációtartományban tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására.
37. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, intravénásán, transzdermálisan, ízületi nedvbe, intramuszkulárisan vagy orálisan beadható gyógyászati készítmény előállítására.
38. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, kemoterápiával kapcsoltan adható gyógyászati készítmény előállítására.
39. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, egyetlen intravénás dózisban beadható gyógyászati készítmény előállítására.
40. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, a tumor visszafejlődését beadása után hét nappal kiváltó gyógyászati készítmény előállítására.
41. a„p3-antagonista alkalmazása egy szövet új érrendszerében apoptózis indukálására alkalmas, a szövetbe beadható gyógyászati készítmény előállítására.
42. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként a fibrinogén avp3-integrinhez történő kötődését gátló, de a fibrinogén aIIbp3- vagy Ονβι-integrinhez történő kötődését lényegében nem gátló antagonistát alkalmazunk.
43. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avP3-antagonistaként avp3-integrinre immunspecifikus monoklonális antitestet alkalmazunk.
44. A 43. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint monoklonális antitestként az LM609 monoklonális antitest (ATCC HB 9537) immunreaktív jellemzőivel bíró antitestet alkalmazunk.
45. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint avp3-antagonistaként RGD-szekvenciát tartalmazó polipeptidet alkalmazunk.
46. A 45. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint polipeptidként c-(GrGDFV) (4. azonosító számú szekvencia), c-(RGDfV) (5. azonosító számú szekvencia), c-(RGDFv) (7. azonosító számú szekvencia) vagy YTAECKPQVTRGDVF (8. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú peptidet, vagy ezek sóit alkalmazzuk.
HU 221 988 Β1
47. A 46. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint peptidsóként hidroklorid- vagy trifluor-acetát-sót alkalmazunk.
48. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, gyulladásban lévő szövetbe adható, gyulladásos szöveti angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
49. A 48. igénypont szerinti alkalmazás, ízületi gyulladásos szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
50. A 49. igénypont szerinti alkalmazás, reumatoid arthritisben szenvedő emlősben található szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
51. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, cukorbetegségből eredő szemideghártya-bántalomban szenvedő páciens szemideghártya-szövetébe adható, szemideghártya-angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
52. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, hemangiomába adható gyógyászati készítmény előállítására.
53. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, kemény tumorba vagy kemény tumor metasztázisába adható, tumor-angiogenezis gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
54. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, az 0^3antagonistát mintegy 2 μΜ-tól mintegy 5 mM-ig terjedő koncentrációtartományban tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására.
55. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, intravénásán, transzdermálisan, ízületi nedvbe, intramuszkulárisan vagy orálisan adható gyógyászati készítmény előállítására.
56. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, kemoterápiával kapcsoltan adható gyógyászati készítmény előállítására.
57. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, egyetlen intravénás dózisban beadható gyógyászati készítmény előállítására.
58. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, az apoptózist, beadását követően legalább 48 órán keresztül kiváltó gyógyászati készítmény előállítására.
59. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, szívkoszorúér-plasztikát követő restenosisszal veszélyeztetett szívkoszorúartéria-szövetbe adható gyógyászati készítmény előállítására.
60. Az 59. igénypont szerinti alkalmazás, érplasztikát követően beadható gyógyászati készítmény előállítására.
61. Az 59. igénypont szerinti alkalmazás, szívkoszorúér-plasztikát követően beadható gyógyászati készítmény előállítására.
62. Az 59. igénypont szerinti alkalmazás, humán páciensben található szövetbe beadható gyógyászati készítmény előállítására.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/210,715 US5753230A (en) | 1994-03-18 | 1994-03-18 | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
US08/366,665 US5766591A (en) | 1994-03-18 | 1994-12-30 | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
PCT/US1995/003035 WO1995025543A1 (en) | 1994-03-18 | 1995-03-09 | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9602541D0 HU9602541D0 (en) | 1996-11-28 |
HUT76086A HUT76086A (en) | 1997-06-30 |
HU221988B1 true HU221988B1 (hu) | 2003-03-28 |
Family
ID=22783992
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9602541A HU221988B1 (hu) | 1994-03-18 | 1995-03-09 | Eljárások és készítmények angiogenezis gátlására |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US5753230A (hu) |
EP (3) | EP1410807B1 (hu) |
JP (2) | JP4268222B2 (hu) |
KR (1) | KR100327081B1 (hu) |
CN (1) | CN1161152C (hu) |
AT (3) | ATE255907T1 (hu) |
AU (1) | AU709645B2 (hu) |
CA (1) | CA2184493C (hu) |
CZ (1) | CZ294650B6 (hu) |
DE (2) | DE69532279T3 (hu) |
DK (3) | DK0754059T4 (hu) |
ES (3) | ES2355074T3 (hu) |
FI (1) | FI121916B (hu) |
HK (1) | HK1013960A1 (hu) |
HU (1) | HU221988B1 (hu) |
MX (1) | MX9604145A (hu) |
NO (1) | NO322441B1 (hu) |
NZ (3) | NZ548433A (hu) |
PT (2) | PT1468695E (hu) |
RU (1) | RU2162712C2 (hu) |
SI (1) | SI0754059T2 (hu) |
SK (1) | SK284586B6 (hu) |
UA (1) | UA44729C2 (hu) |
WO (1) | WO1995025543A1 (hu) |
ZA (1) | ZA952214B (hu) |
Families Citing this family (176)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4310643A1 (de) * | 1993-04-01 | 1994-10-06 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Adhäsionsinhibitoren |
US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
US6949511B1 (en) | 1994-04-26 | 2005-09-27 | The Children's Medical Center Corporation | Methods of inhibiting angiogenesis via increasing in vivo concentrations of kringle region fragments of plasminogen |
US5837682A (en) | 1996-03-08 | 1998-11-17 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
US5945403A (en) | 1997-05-30 | 1999-08-31 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
US6660842B1 (en) | 1994-04-28 | 2003-12-09 | Tripep Ab | Ligand/receptor specificity exchangers that redirect antibodies to receptors on a pathogen |
ES2202336T3 (es) * | 1994-12-20 | 2004-04-01 | Merck Patent Gmbh | Anticuerpo monoclonal contra la integrina alfa-v. |
US6440729B1 (en) | 1995-06-30 | 2002-08-27 | University Of Kansas Medical Center | Treating angiogenesis-mediated diseases with the α2 monomer of type IV collagen |
US6358735B1 (en) | 1995-06-30 | 2002-03-19 | University Of Kansas Medical Center | Method for inhibiting angiogenesis and tumors with the isolated NC1 α3 chain monomer of type IV collagen |
CZ40998A3 (cs) * | 1995-08-14 | 1998-09-16 | The Scripps Research Institute | Použití antagonisty anb5 pro výrobu prostředků, schopných inhibovat angiogenezi v tkáních |
AU702487B2 (en) | 1995-08-30 | 1999-02-25 | G.D. Searle & Co. | Meta-guanidine, urea, thiourea or azacyclic amino benzoic acid derivatives as integrin antagonists |
US6100423A (en) * | 1995-08-30 | 2000-08-08 | G. D. Searle & Co. | Amino benzenepropanoic acid compounds and derivatives thereof |
US6346510B1 (en) | 1995-10-23 | 2002-02-12 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions |
BR9611174A (pt) * | 1995-10-23 | 1999-09-14 | Childrens Medical Center | Proteína de endostatina isolada, e composições terapêuticas antiangiogénicas formadas com a mesma. |
US5854205A (en) * | 1995-10-23 | 1998-12-29 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic compositions and methods |
US5854221A (en) * | 1996-12-12 | 1998-12-29 | The Children's Medical Center Corporation | Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use |
US6589755B1 (en) * | 1996-08-15 | 2003-07-08 | Novartis Ag | Assay for quantifying arthritic conditions |
GB9708265D0 (en) * | 1997-04-24 | 1997-06-18 | Nycomed Imaging As | Contrast agents |
ES2321991T3 (es) * | 1996-12-09 | 2009-06-15 | Merck Patent Gmbh | Receptor de adhesion alfavbet3 recombinante soluble. |
US6596850B1 (en) * | 1998-01-30 | 2003-07-22 | Ixsys, Incorporated | Anti-αv3β3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same |
US6590079B2 (en) * | 1997-01-30 | 2003-07-08 | Ixsys, Incorporated | Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same |
US7112338B2 (en) | 1997-03-12 | 2006-09-26 | The Regents Of The University Of California | Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels |
US5837283A (en) | 1997-03-12 | 1998-11-17 | The Regents Of The University Of California | Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells |
ES2234099T3 (es) | 1997-03-12 | 2005-06-16 | Smithkline Beecham Corporation | Anticuerpos monoclanales humanizados anti-alfa beta 3. |
US5994388A (en) * | 1997-03-18 | 1999-11-30 | The Children's Medical Center Corporation | Cytochalasin and isoindolinone derivatives as inhibitors of angiogenesis |
WO1998041158A1 (en) * | 1997-03-19 | 1998-09-24 | Lucid Technologies, Inc. | Cellular surgery utilizing confocal microscopy |
US6193968B1 (en) * | 1997-04-11 | 2001-02-27 | The Burnham Institute | Methods for using anti-αvβ3 integrin antibody |
DK0973550T3 (da) * | 1997-04-11 | 2003-02-10 | Searle & Co | Antagonistiske anti-AVB3-integrin-antistoffer |
US6596276B1 (en) * | 1997-09-30 | 2003-07-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Method for inhibiting tumor angiogenesis in a living subject |
US6372719B1 (en) * | 1998-03-04 | 2002-04-16 | Jay Cunningham | ανβ3 integrin antagonists in combination with chemotherapeutic agents |
US6172256B1 (en) * | 1998-03-04 | 2001-01-09 | G.D. Searle & Co. | Chiral-β-amino acid compounds and derivatives thereof |
US6548663B1 (en) | 1998-03-31 | 2003-04-15 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Benzodiazepine vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
EP1068224B1 (en) | 1998-03-31 | 2005-05-11 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders |
US6524553B2 (en) * | 1998-03-31 | 2003-02-25 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Quinolone vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
US6537520B1 (en) | 1998-03-31 | 2003-03-25 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders |
US6852318B1 (en) * | 1998-05-08 | 2005-02-08 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting and inhibiting angiogenesis |
US6962974B1 (en) | 1998-06-17 | 2005-11-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof |
US7387779B2 (en) * | 1998-06-17 | 2008-06-17 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof |
US6759047B1 (en) * | 1998-06-17 | 2004-07-06 | Beth Israel Deaconess Hospital Corp. | Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof |
DK1520588T3 (en) | 1998-07-13 | 2015-03-23 | Univ Texas | Use of antibodies to aminophospholipids for cancer treatment |
RU2167425C2 (ru) * | 1998-07-17 | 2001-05-20 | Малышев Игорь Юрьевич | Способ определения белков |
US6164281A (en) * | 1998-07-20 | 2000-12-26 | Zhao; Iris Ginron | Method of making and/or treating diseases characterized by neovascularization |
CA2338283A1 (en) * | 1998-08-13 | 2000-02-24 | G.D. Searle & Co. | Multivalent avb3 and metastasis-associated receptor ligands |
US6979697B1 (en) * | 1998-08-21 | 2005-12-27 | Point Therapeutics, Inc. | Regulation of substrate activity |
US6703050B1 (en) * | 1998-09-04 | 2004-03-09 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for the prevention or treatment of cancer |
US6537554B1 (en) | 1998-09-10 | 2003-03-25 | Curagen Corporation | Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis |
US7176289B1 (en) | 1998-09-11 | 2007-02-13 | Vanderbilt University | Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis |
US6248327B1 (en) | 1998-09-11 | 2001-06-19 | Vanderbilt University | Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis |
US6235877B1 (en) | 1999-08-04 | 2001-05-22 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Peptido-mimetic compounds containing RGD sequence useful as integrin inhibitors |
US20030202977A1 (en) * | 1998-11-16 | 2003-10-30 | New York University | Treatment of osteoarthritis |
PT1135153E (pt) * | 1998-11-20 | 2005-09-30 | Genentech Inc | Utilizacoes para antagonistas e agonistas de receptores eph para tratar desordens vasculares |
US6339062B1 (en) * | 1998-11-23 | 2002-01-15 | Inkine Pharmaceutical Company, Inc. | Retroinverso polypeptides that mimic or inhibit thrombospondin activity |
US6160099A (en) * | 1998-11-24 | 2000-12-12 | Jonak; Zdenka Ludmila | Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies |
US6511649B1 (en) | 1998-12-18 | 2003-01-28 | Thomas D. Harris | Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
US6569402B1 (en) * | 1998-12-18 | 2003-05-27 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
WO2000035887A2 (en) * | 1998-12-18 | 2000-06-22 | Du Pont Pharm Co | Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
US6794518B1 (en) * | 1998-12-18 | 2004-09-21 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
US6511648B2 (en) | 1998-12-18 | 2003-01-28 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals |
PL349216A1 (en) * | 1998-12-23 | 2002-07-01 | Searle & Co | Method of using a cyclooxygenase-2 inhibitor and a matrix metalloproteinase inhibitor as a combination therapy in the treatment of neoplasia |
US20050281821A1 (en) * | 1999-01-06 | 2005-12-22 | Flavia Pernasetti | Method and composition for angiogenesis inhibition |
US6521593B1 (en) * | 1999-02-01 | 2003-02-18 | Childrens Hospital Los Angeles | Methods for inhibiting brain tumor growth |
RU2236251C2 (ru) * | 1999-02-12 | 2004-09-20 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Способы лечения опухолей и метастазов с использованием комбинации антиангиогенной терапии и иммунотерапии |
WO2000059532A1 (en) * | 1999-04-01 | 2000-10-12 | Biostratum, Inc. | The use of domains of type iv collagen t inhibit angiogenesis an tumour growth |
WO2000067771A1 (en) * | 1999-05-06 | 2000-11-16 | The Burnham Institute | Antiangiogenic endostatin peptides, endostatin variants and methods of use |
US6890904B1 (en) | 1999-05-25 | 2005-05-10 | Point Therapeutics, Inc. | Anti-tumor agents |
US6531580B1 (en) * | 1999-06-24 | 2003-03-11 | Ixsys, Inc. | Anti-αvβ3 recombinant human antibodies and nucleic acids encoding same |
US6685914B1 (en) | 1999-09-13 | 2004-02-03 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Macrocyclic chelants for metallopharmaceuticals |
MXPA02003079A (es) * | 1999-09-23 | 2004-04-21 | Scripps Research Inst | Metodo y composiciones para inhibir la formacion de adhesion. |
US20080038274A1 (en) | 1999-09-23 | 2008-02-14 | Foster Keith A | Inhibition of secretion from non-neuronal cells |
WO2001024823A1 (en) * | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Chiron Corporation | Cd40 antagonist for treating psoriasis |
RU2271216C2 (ru) | 1999-12-22 | 2006-03-10 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Модуляторы ангиогенеза и проницаемости сосудов |
US7740841B1 (en) | 2000-01-28 | 2010-06-22 | Sunnybrook Health Science Center | Therapeutic method for reducing angiogenesis |
AU781506B2 (en) * | 2000-02-03 | 2005-05-26 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Integrin expression inhibitors |
US7361643B2 (en) | 2000-02-09 | 2008-04-22 | University Of Puerto Rico | Methods for inhibiting angiogenesis |
WO2001058931A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Duke University | Method of treating disorders of the eye |
US6573096B1 (en) * | 2000-04-01 | 2003-06-03 | The Research Foundation At State University Of New York | Compositions and methods for inhibition of cancer invasion and angiogenesis |
US6835806B2 (en) | 2000-04-03 | 2004-12-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | Cell growth regulation system |
EP1272507B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-06-29 | Amersham Health AS | Integrin binding peptide derivatives |
US10293056B1 (en) * | 2000-05-24 | 2019-05-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases |
US7163681B2 (en) * | 2000-08-07 | 2007-01-16 | Centocor, Inc. | Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses |
US7288390B2 (en) * | 2000-08-07 | 2007-10-30 | Centocor, Inc. | Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses |
US20030104573A1 (en) * | 2000-09-11 | 2003-06-05 | Shimkets Richard A. | Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis |
NO20004795D0 (no) | 2000-09-26 | 2000-09-26 | Nycomed Imaging As | Peptidbaserte forbindelser |
US20040105857A1 (en) * | 2000-10-02 | 2004-06-03 | Anthony Montgomery | Methods and compositions for enhancing angiogenesis |
US6632835B2 (en) | 2001-02-22 | 2003-10-14 | Nanodesign Inc. | Dibenzo[c]chromen-6-one derivatives as anti-cancer agents |
DE10109136A1 (de) * | 2001-02-26 | 2002-09-12 | Cytotools Gmbh | Mittel, die die Apoptose bei an der Wundheilung beteiligten Zellen inhibieren |
CA2439852A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Christine Dingivan | Methods of preventing or treating inflammatory or autoimmune disorders by administering integrin alphav beta3 antagonists |
CN1247258C (zh) | 2001-04-24 | 2006-03-29 | 默克专利有限公司 | 使用抗血管生成剂和TNFα的联合疗法 |
SE0101854L (sv) * | 2001-05-28 | 2002-11-29 | Bioneris Ab | Användning av en förening med en negativt laddad region av grupper för behandling av restenos. |
JP4351043B2 (ja) * | 2001-07-09 | 2009-10-28 | エラン ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | アミロイド毒性の阻害方法 |
US7829087B2 (en) * | 2001-07-09 | 2010-11-09 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating cognitive impairment |
AU2002313616A1 (en) | 2001-07-10 | 2003-01-29 | Amersham Health As | Peptide-based compounds for targeting intergin receptors |
US7122517B2 (en) * | 2001-07-27 | 2006-10-17 | Kansas University Medical Center | Crystallized structure of type IV collagen NC1 domain hexamer |
US20060014697A1 (en) * | 2001-08-22 | 2006-01-19 | Travis Mickle | Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse |
WO2003020280A2 (en) * | 2001-09-05 | 2003-03-13 | Minerva Biotechnologies Corporation | Compositions and use thereof in the treatment of cancer |
WO2003059251A2 (en) | 2001-10-22 | 2003-07-24 | The Scripps Research Institute | Antibody targeting compounds |
WO2003068253A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Merck Patent Gmbh | Methods and compositions for the treatment of eye diseases |
CA2474405A1 (en) * | 2002-02-15 | 2003-08-21 | Richard Brunner | Medicament for the treatment of choroidal neovascularisation |
CA2478239A1 (en) * | 2002-03-04 | 2003-09-18 | Medimmune, Inc. | The prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents |
JP2005525368A (ja) * | 2002-03-04 | 2005-08-25 | メディミューン,インコーポレーテッド | インテグリンαvβ3アンタゴニストをHMG−CoA還元酵素阻害剤またはビスフォスフォネートと併用投与する障害の予防または治療方法 |
EP1499352A4 (en) * | 2002-04-12 | 2006-10-11 | Medimmune Inc | ANTI-INTERLEUKIN-9 RECOMBINANT ANTIBODIES |
MX337052B (es) | 2002-07-15 | 2016-02-11 | Univ Texas | Peptidos que se enlazan a fosfatidiletanolamina y sus usos en el tratamiento de infecciones virales y del cancer. |
GEP20074270B (en) * | 2002-07-23 | 2007-12-25 | Univ Michigan | Tetrapropylammonium tetrathiomolybdate and related compounds for anti-angiogenic therapies |
GB0217018D0 (en) * | 2002-07-23 | 2002-08-28 | Bioacta Ltd | Peptide 1 |
RU2359268C2 (ru) * | 2002-11-19 | 2009-06-20 | ДиАрДжи ИНТЕРНЭШНЛ, ИНК. | Способ диагностики заболеваний путем скрининга тканей, крови или жидкостей организма животных или человека на предмет обнаружения нефизиологических уровней гепсидина и его терапевтическое применение |
US8017737B2 (en) | 2002-11-19 | 2011-09-13 | Hasan Kulaksiz | Diagnostic methods for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids; monoclonal antibodies specific to human hepcidin and associated uses therefor |
US7411048B2 (en) | 2002-11-19 | 2008-08-12 | Drg International, Inc. | Diagnostic method for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids |
US20040208869A1 (en) * | 2003-01-30 | 2004-10-21 | Medimmune, Inc. | Uses of anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations |
CA2514653A1 (en) * | 2003-01-30 | 2004-08-12 | Medimmune, Inc. | Uses of integrin alphavbeta3 antagonists |
KR20050099536A (ko) | 2003-02-06 | 2005-10-13 | 트리펩 아베 | 글리코실화된 특이성 교환체 |
US7335359B2 (en) * | 2003-02-06 | 2008-02-26 | Tripep Ab | Glycosylated specificity exchangers |
JP4764818B2 (ja) | 2003-04-11 | 2011-09-07 | メディミューン,エルエルシー | 組換えil−9抗体およびその使用 |
WO2004092379A2 (en) * | 2003-04-18 | 2004-10-28 | The University Of British Columbia | Method for treatment of angiogenic disorders |
US20050239088A1 (en) * | 2003-05-16 | 2005-10-27 | Shepard H M | Intron fusion proteins, and methods of identifying and using same |
CA2527621A1 (en) * | 2003-05-30 | 2004-12-23 | Centocor, Inc. | Method of inhibiting tumor growth with anti-tissue factor antibodies |
US7605235B2 (en) | 2003-05-30 | 2009-10-20 | Centocor, Inc. | Anti-tissue factor antibodies and compositions |
US9708410B2 (en) | 2003-05-30 | 2017-07-18 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-tissue factor antibodies and compositions |
US20050170455A1 (en) * | 2003-06-20 | 2005-08-04 | Qun-Yong Zhou | Novel prokineticin receptor isoforms and methods of use |
US8415364B2 (en) * | 2003-11-26 | 2013-04-09 | Duke University | Method of preventing or treating glaucoma |
MXPA06008293A (es) | 2004-01-22 | 2007-06-11 | Univ Miami | Formulaciones topicas de coenzima q10 y metodos de uso. |
US7271245B2 (en) * | 2004-02-13 | 2007-09-18 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions for inhibition of metastasis |
EP1720910A4 (en) * | 2004-02-17 | 2007-11-21 | Cancervax Corp | METHOD AND COMPOSITION FOR INHIBITING ANGIOGENESIS |
US7351739B2 (en) * | 2004-04-30 | 2008-04-01 | Wellgen, Inc. | Bioactive compounds and methods of uses thereof |
US8187595B2 (en) | 2004-05-07 | 2012-05-29 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-I |
ATE461708T1 (de) * | 2004-05-07 | 2010-04-15 | Univ North Carolina | Verfahren zur verstärkung oder hemmung des insulinähnlichen wachstumsfaktors-i |
US20060286102A1 (en) * | 2004-05-14 | 2006-12-21 | Pei Jin | Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same |
MXPA06014092A (es) | 2004-06-04 | 2007-03-15 | Scripps Research Inst | Composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades neovasculares. |
US7470521B2 (en) * | 2004-07-20 | 2008-12-30 | Critical Therapeutics, Inc. | RAGE protein derivatives |
US20060029544A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-09 | The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer | Receptor-binding cyclic peptides and methods of use |
WO2006023403A2 (en) * | 2004-08-16 | 2006-03-02 | Medimmune, Inc. | Eph receptor fc variants with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity |
CA2585717A1 (en) | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Medimmune Inc. | Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens |
KR100679100B1 (ko) * | 2004-10-29 | 2007-02-06 | 엘지.필립스 엘시디 주식회사 | 수평 전계 인가형 액정 표시 패널 및 그 제조방법 |
CA2593964A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Molmed Spa | Conjugation product |
WO2006111925A2 (en) * | 2005-04-18 | 2006-10-26 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Inhibition of tumorigenesis by inhibition of a6b4 integrin |
US20090170769A1 (en) * | 2005-05-13 | 2009-07-02 | Pei Jin | Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same |
US20060286148A1 (en) * | 2005-05-18 | 2006-12-21 | Ppd, Inc. | Method of forming implants |
WO2006138429A2 (en) | 2005-06-16 | 2006-12-28 | The Feinstein Institute For Medical Research | Antibodies against hmgb1 and fragments thereof |
AU2006261920A1 (en) | 2005-06-23 | 2007-01-04 | Medimmune, Llc | Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles |
WO2007024921A2 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Cell Matrix | Combination therapies for inhibiting integrin-extracellular matrix interactions |
US20090130098A1 (en) | 2006-01-18 | 2009-05-21 | Merck Patent Gmbh | Specific therapy using integrin ligands for treating cancer |
EP2243488B1 (en) | 2006-01-19 | 2013-08-14 | Eyegene Inc. | Pharmaceutical composition for treating vascular-related diseases comprising peptide |
CA2655205A1 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-21 | Receptor Biologix Inc. | Pan-cell surface receptor- specific therapeutics |
US8637469B2 (en) | 2006-07-11 | 2014-01-28 | Roy C. Levitt | Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors |
JP2010500360A (ja) | 2006-08-10 | 2010-01-07 | アルボア コーポレーション | 炎症性サイトカイン阻害剤による下気道炎症疾患の局所療法 |
WO2008045252A2 (en) | 2006-10-04 | 2008-04-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Engineered integrin binding peptides |
ES2399159T3 (es) | 2007-01-18 | 2013-03-26 | Merck Patent Gmbh | Terapia y medicamento específicos usando ligandos de integrinas para el tratamiento del cáncer |
EP2025685B1 (en) * | 2007-08-15 | 2013-06-19 | Canadian Blood Services | Monoclonal antibodies against BETA3 integrins |
JP2011500703A (ja) * | 2007-10-16 | 2011-01-06 | シンフォジェン アクティーゼルスカブ | 最適化されたher1及びher3多量体を含む組成物、及びそれらの使用 |
BRPI0820298A8 (pt) | 2007-11-09 | 2018-05-08 | Affitech Res As | composições e métodos de anticorpos anti-vegf |
US8258111B2 (en) | 2008-05-08 | 2012-09-04 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis |
EP2323679A4 (en) | 2008-07-25 | 2012-08-22 | Univ Colorado | CLIP HEMMER AND METHOD FOR MODULATING THE IMMUNE FUNCTION |
WO2010051531A1 (en) | 2008-10-31 | 2010-05-06 | University Of Louisville Reserch Foundation, Inc. | Olfactory epithelial-derived stem cells and methods of use therefor |
WO2010075058A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Ge Healthcare Limited | Application of 99mtc peptide-based compound as a bone marrow imaging agent |
US8518927B2 (en) | 2009-02-10 | 2013-08-27 | The Scripps Research Institute | Chemically programmed vaccination |
SG176103A1 (en) | 2009-05-25 | 2011-12-29 | Merck Patent Gmbh | Continuous administration of cilengitide in cancer treatments |
FR2949782B1 (fr) * | 2009-09-04 | 2015-10-16 | Isp Investments Inc | Peptide activateur de la transglutaminase et composition cosmetique ou pharmaceutique le contenant. |
US8778888B2 (en) * | 2009-11-06 | 2014-07-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cystine knot peptides binding to alpha IIb beta 3 integrins and methods of use |
CN103153328A (zh) | 2010-07-16 | 2013-06-12 | 默克专利股份有限公司 | 肽在乳腺癌和/或骨转移灶的治疗中的用途 |
PT2672994T (pt) | 2011-02-11 | 2018-10-22 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo anti-integrina alfa-v para o tratamento do cancro da próstata |
US8722044B2 (en) | 2011-03-15 | 2014-05-13 | Janssen Biotech, Inc. | Human tissue factor antibody and uses thereof |
RU2531502C2 (ru) * | 2011-08-09 | 2014-10-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани |
RU2481115C1 (ru) * | 2011-10-13 | 2013-05-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Объединение "Тюменькриобанк" | Средство для заживления ран "целльгель", способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством |
US9775803B2 (en) | 2011-10-19 | 2017-10-03 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Liposome comprising elastin-like polypeptide and tumor cell targeting material and use thereof |
US20140350087A9 (en) | 2012-03-22 | 2014-11-27 | Halozyme, Inc. | Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use |
CN104968796A (zh) * | 2012-06-07 | 2015-10-07 | 庄伟哲 | 经修饰纤维黏连蛋白片段或变体及其用途 |
KR20150047602A (ko) | 2012-08-31 | 2015-05-04 | 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 | 인슐린 유사 성장 인자 1(igf-1)을 증강 또는 억제시키는 모노클로날 항체 |
US9587001B2 (en) | 2012-10-19 | 2017-03-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Conjugated knottin mini-proteins containing non-natural amino acids |
WO2014087429A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Council Of Scientific & Industrial Research | Histidinylated cationic amphiphiles, process for preparation thereof and their liposomal formulation |
EP3919070A1 (en) | 2013-03-14 | 2021-12-08 | Children's Medical Center, Corp. | Use of cd36 to identify cancer subjects for treatment |
US20190144547A1 (en) | 2015-11-23 | 2019-05-16 | Merck Patent Gmbh | Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of fibrosis and/or fibrotic disorders |
EP3576726A1 (en) | 2017-02-06 | 2019-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to glutaminase inhibitors |
EA201992326A1 (ru) | 2017-03-31 | 2020-03-13 | Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния | Композиции и способы оказания направленного воздействия на альфа-v бета-3-положительные раковые стволовые клетки (csc) и лечения (avb3) лекарственно-устойчивых видов рака |
KR102171433B1 (ko) * | 2018-05-25 | 2020-11-02 | 고려대학교 산학협력단 | 조직 재생을 위한 Substance P 펩타이드가 고정된 피브린 젤 및 이의 제조방법 |
CN113557246B (zh) * | 2019-07-24 | 2023-09-01 | 韩国基础科学支援研究院 | 靶向αvβ3整联蛋白的单域抗体 |
US20210032348A1 (en) * | 2019-08-02 | 2021-02-04 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3-positive cancer stem cells (cscs) and treating drug resistant and metastatic cancers |
CA3193273A1 (en) | 2020-08-27 | 2022-03-03 | Enosi Therapeutics Corporation | Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5092885A (en) * | 1987-02-12 | 1992-03-03 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Peptides with laminin activity |
EP0341303A4 (en) * | 1987-11-19 | 1990-06-27 | Scripps Clinic Res | MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST THE RGD-DIRECTED ADHESION RECEPTOR OF ENDOTHELIAL CELLS. |
JPH01169343A (ja) | 1987-12-25 | 1989-07-04 | Nippon Sheet Glass Co Ltd | ガラス板の切口欠点検出装置 |
WO1989006536A1 (en) * | 1988-01-19 | 1989-07-27 | Moses Judah Folkman | Growth inhibiting agent and the use thereof |
US5135919A (en) | 1988-01-19 | 1992-08-04 | Children's Medical Center Corporation | Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis |
US5575815A (en) | 1988-08-24 | 1996-11-19 | Endoluminal Therapeutics, Inc. | Local polymeric gel therapy |
IE901736L (en) * | 1989-05-17 | 1990-11-17 | Fuller H B Licensing Financ | Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion |
US5843897A (en) | 1989-06-16 | 1998-12-01 | Cor Therapeutics, Inc. | Platelet aggregation inhibitors |
US5112946A (en) * | 1989-07-06 | 1992-05-12 | Repligen Corporation | Modified pf4 compositions and methods of use |
US5262520A (en) * | 1989-12-01 | 1993-11-16 | The Scripps Research Institute | Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding |
US5192744A (en) * | 1990-01-12 | 1993-03-09 | Northwestern University | Method of inhibiting angiogenesis of tumors |
US5202352A (en) * | 1990-08-08 | 1993-04-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Intravascular embolizing agent containing angiogenesis-inhibiting substance |
CA2048078A1 (en) * | 1990-11-15 | 1992-05-16 | Wolfgang A. Wrasidlo | Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates |
JP4124480B2 (ja) * | 1991-06-14 | 2008-07-23 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫グロブリン変異体 |
DE69322860T2 (de) * | 1992-04-03 | 1999-07-01 | Genentech Inc | Antikörper gegen alpha v beta 3 integrin |
SK57693A3 (en) * | 1992-06-18 | 1994-07-06 | Merck Patent Gmbh | Linear peptides and pharmaceutical agents on their base |
UA43823C2 (uk) | 1992-07-06 | 2002-01-15 | Мерк Патент Геселлшафт Міт Бесшренктер Хафтунг | ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ІНГІБУВАННЯ ІНТЕГРИН <font face="Symbol">a</font><sub>V</sub><font face="Symbol">b</font><sub>3</sub>-ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ КЛІТИННОЇ АДГЕЗІЇ КЛІТИН ССАВЦІВ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ЗАХВОРЮВАННЯ, АСОЦІЙОВАНОГО З ПОРУШЕННЯМ АДГЕЗІЇ КЛІТИН, СПОСІБ БЛОКУВАННЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ ФІБРИНОГЕНОМ ІНТЕГРИНУ, КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ЗАГОЄННЯ РАН |
JP3490443B2 (ja) | 1992-10-29 | 2004-01-26 | ジ・オーストラリアン・ナショナル・ユニバーシティ | 血管形成阻害性抗体 |
WO1994018221A1 (en) * | 1993-02-02 | 1994-08-18 | The Scripps Research Institute | Methods for producing polypeptide binding sites |
DE4310643A1 (de) | 1993-04-01 | 1994-10-06 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Adhäsionsinhibitoren |
EP1334730A3 (en) † | 1993-11-05 | 2003-12-03 | Centocor, Inc. | Platelet-specific chimeric immunoglobulin and methods of use therefor |
US5981478A (en) | 1993-11-24 | 1999-11-09 | La Jolla Cancer Research Foundation | Integrin-binding peptides |
US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
US5770565A (en) | 1994-04-13 | 1998-06-23 | La Jolla Cancer Research Center | Peptides for reducing or inhibiting bone resorption |
DE19534177A1 (de) | 1995-09-15 | 1997-03-20 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Adhäsionsinhibitoren |
DE19538741A1 (de) | 1995-10-18 | 1997-04-24 | Merck Patent Gmbh | Cyclopeptidderivate |
-
1994
- 1994-03-18 US US08/210,715 patent/US5753230A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-30 US US08/366,665 patent/US5766591A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-09 EP EP03077708A patent/EP1410807B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 DK DK95913644.1T patent/DK0754059T4/da active
- 1995-03-09 WO PCT/US1995/003035 patent/WO1995025543A1/en active IP Right Grant
- 1995-03-09 PT PT03078802T patent/PT1468695E/pt unknown
- 1995-03-09 NZ NZ548433A patent/NZ548433A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 AT AT95913644T patent/ATE255907T1/de active
- 1995-03-09 SK SK1190-96A patent/SK284586B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 ES ES03077708T patent/ES2355074T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 EP EP03078802A patent/EP1468695B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 CA CA2184493A patent/CA2184493C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-09 EP EP95913644A patent/EP0754059B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 CZ CZ19962711A patent/CZ294650B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 HU HU9602541A patent/HU221988B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 MX MX9604145A patent/MX9604145A/es active IP Right Grant
- 1995-03-09 ES ES95913644T patent/ES2211901T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 DE DE69532279T patent/DE69532279T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 KR KR1019960705163A patent/KR100327081B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 RU RU96120204/14A patent/RU2162712C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 AT AT03077708T patent/ATE490784T1/de active
- 1995-03-09 UA UA96093689A patent/UA44729C2/uk unknown
- 1995-03-09 ES ES03078802T patent/ES2376850T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 JP JP52467595A patent/JP4268222B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 CN CNB951931334A patent/CN1161152C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 DK DK03077708.0T patent/DK1410807T3/da active
- 1995-03-09 PT PT95913644T patent/PT754059E/pt unknown
- 1995-03-09 DE DE69536128T patent/DE69536128D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-09 AU AU19952/95A patent/AU709645B2/en not_active Expired
- 1995-03-09 DK DK03078802.0T patent/DK1468695T3/da active
- 1995-03-09 SI SI9530699T patent/SI0754059T2/sl unknown
- 1995-03-09 AT AT03078802T patent/ATE534403T1/de active
- 1995-03-09 NZ NZ511293A patent/NZ511293A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-03-09 NZ NZ283022A patent/NZ283022A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-03-17 ZA ZA952214A patent/ZA952214B/xx unknown
-
1996
- 1996-09-17 NO NO19963894A patent/NO322441B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-09-18 FI FI963692A patent/FI121916B/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-05-19 US US09/081,522 patent/US6887473B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-24 HK HK98115348A patent/HK1013960A1/ not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-07-15 US US10/892,745 patent/US7482007B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-15 US US10/892,789 patent/US7354586B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-15 US US10/892,653 patent/US7329406B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-05-22 JP JP2006142020A patent/JP4758281B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-10-30 US US11/980,211 patent/US7595051B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4268222B2 (ja) | 脈管形成の抑制に有用な方法および組成物 | |
US6500924B1 (en) | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis | |
CA2256543C (en) | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis | |
JP4903921B2 (ja) | αVβ5仲介血管形成の阻止に有効な方法及び組成物 | |
US7053041B1 (en) | Methods and compositions useful for inhibition of αvβ5mediated angiogenesis | |
US20030176334A1 (en) | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20030204 |
|
MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |