CZ271196A3

CZ271196A3 - Použití alfa v beta3 antagonisty pro přípravu léčiva pro prevenci, inhibici a léčení angiogenze v tkáni, regresi vyvinutého nádoru v tkáni nebo indukci apoptózy v neovaskulatarní tkáni

Info

Publication number: CZ271196A3
Application number: CZ962711A
Authority: CZ
Inventors: Peter Brooks; David A. Cheresh
Original assignee: The Scripps Research Institute
Priority date: 1994-03-18
Filing date: 1995-03-09
Publication date: 1998-01-14
Also published as: HU221988B1; US5766591A; ES2211901T5; US20050002936A1; US7354586B2; ATE534403T1; FI121916B; NO322441B1; NO963894D0; AU1995295A; EP0754059A4; CN1161152C; DK1468695T3; MX9604145A; DE69532279D1; NZ283022A; DE69532279T2; US20080175840A1; EP0754059B2; US7329406B2

Description

Použití c(v03 antagonisty pro přípravu léčiva pro prevenci, inhibici a léčení angiogeneze v tkáni, regresi vyvinutého nádoru v tkáni nebo indukci apoptózy v neovaskulaturní tkáni.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně vztahuje k lékařské oblasti a týká se použití antagonistů vintronektinového receptorů <tv&3 pro přípravu léčiva pro prevenci, inhibici a léčení angiogeneze v tkáni, regresi vyvinutého nádoru v tkáni nebo indukci apoptózy v neovaskulaturní tkáni.

Dosavadní stav techniky které vykazuj i heterodimérních

Integriny jsou třídou buněčných receptorů, o kterých je známo, že se vážou na extracelulární proteiny matrixu, a proto zprostředkovávají interakce buňka-buňká a buňka-extracelulární matrix, které patří obecně k buněčným adhezním dějům. Ale i když je v literatuře popsáno mnoho íntegrinů a ligandů, které vážou integrin, biologická funkce mnoha z těchto integrinů zůstává stále neznámou. Integrínové receptory tvoří rodinu proteinů.

strukturální charakteristiky nekovalentních g1ykoprote i nových komp1 exů tvořených a a b podj ednotkam i.

O vitronektinovém receptorů, pojmenovaném tak pro jeho originální charakteristiky týkající se preferenční vazby vitronektinu, je nyní známo, že se vztahuje ke třem odlišným integrinům označeným ctvPi, otvP3 a dv/ίε. Viz Horton= Int. J. Exp. Pathol. , 71, 741-759 (1990). avbi váže fibronektin a vitronektin. a_vb3 váže širokou škálu ligandů včetně fibrinu, fibrinogenu, lamininu, troabospondinu, vitronektinu, von Wi 11ebrandova faktoru, osteospontinu a kostního sialoproteinu I. avbs váže vitronektin. Specifická role buněčné adheze, kterou tyto tří l

integriny hrají v mnoha buněčných interakcích v tkáních, je ještě předmětem vyšetřování, ale je jasné, že jsou to tři odlišné integriny s odlišnými biologickými funkcemi.

Jedním důležitým rozpoznávacím místem ligandu pro mnoho integrinů je tripeptidická sekvence arginin-glycin-kyselina asparagová (RGD). RGD se nalézá ve všech ligandech identifikovaných viz výše pro integriny s vitronektinovým receptorem. Toto rozpoznávací místo RGD mohou napodobit polypeptidy (peptidy), které obsahují sekvenci RGD, a takové RGD peptidy jsou známými inhibitory funkce integrinů. Je však důležité si všimnout, že se v závislosti na sekvenci a struktuře RGD peptidu může specifita inhibice přizpůsobit cílovým specifickým integrinům.

K diskusi rozpoznávacího místa RGD viz Pierschbacher a kol., Nátuře: 309, 30-33 (1984) a Pierschbacher a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA: 81, 6985-5988 (1984). Různé RGD polypeptidy o různé integrinové specifitě byly také popsány Grantem a kol.. Cell: 58, 933-943 (1989), Cheresh a kol., Cell: 68,945-953 (1989), Aumailley a kol., FEBS Letts.: 291, 50-54 (1991) a Pfaff a kol., J. Biol. Chem.: 269,20233-20238 (1994) a U.S. Patent No. 4517686, 4578079, 4589881, 4614517, 4661111, 4 792 525,4 683 291,4 879 237,4 988 621,5 041 380 a 5 061 693.

Angiogeneze je proces prokrvování tkáně cévami, který zahrnuje růst nových vyvíjejících se krevních cév v tkáni a je také znám jako neovaskularizace. Tento proces je zprostředkován infiltrací endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva. Věří se, že tento proces probíhá kterýmkoliv ze tří způsobů: cévy mohou růst z již existujících cév, vývoj cév de-nuovo může nastat z prekursorových buněk (vaskulogeneze) nebo se existující malé cévy mohou zvětšit v průměru. Viz Blood a kol., Bioch. Biophys. Acta: 1032, 89-118 (1990). Cévní endoteliální buňky obsahují nejméně 5 RGD-dependentních integrinů včetně vitronektinového receptorů (α_νβ₃ nebo α_νβ₅), kolagenový receptor typu I a IV (a^), lamininový receptor (a^), fibronektin/laminin/kolagenový receptor (α₃β! a fibronektinový receptor (a^). Viz Davis a kol., J. Cell. Biochem.: 51, 206- 218 (1993). Buňka hladkého svalstva obsahuje nejméně šest RGD-dependentních integrinů včetně α₅β_ν α_νβ₃ a α_νβ₅.

Angiogeneze je důležitý proces v neonatálním růstu, ale také při hojení poranění a v patogenezi široké škály klinických onemocnění včetně zánětu tkáně, artritidy, nádorového bujení, diabetické retinopatie, svalové degenerace způsobené neovaskularizací sítnice apod. Tyto klinické projevy spojené s angiogenezí jsou uváděny jako angiogenní onemocnění. Viz Folkman a kol., Science: 235, 442-447 (1987). Angiogeneze obecně neprobíhá u dospělých nebo ve zralých tkáních, ačkoliv ji lze pozorovat pří hojení poranění a v růstovém cyklu corpea leutea. Viz např. Moses a kol.. Science: 248,1408-1410 (1990).

Bylo navrhnuto využít inhibice angiogeneze v terapii omezující nádorový růst. Provedení inhibice angiogeneze bylo plánováno provést (1) jako inhibici uvolňováním angiogenních molekul jako βFGF (tibroblastový růstový faktor), (2) neutralizaci angiogenních molekul použitím anti^FGF protilátek a (3) inhibici odpovědi endoteliálních buněk na angiogenní podnět. Posledně jmenované strategii byla věnována pozornost a Folkman a kol., Cancer Biology: 3, 89-96 (1992) popsali několik inhibitorů odpovědi endoteliálních buněk, včetně inhibitoru kolagenázy, inhibitorů přeměny základní stavby membrány, angiostatických steroidů, angiogenních inhibitorů pocházejících z hub, faktoru 4 krevních destiček, trombospondínu, léčiv určených k léčbě artritidy jako D-penicillaminu a thiomalátu zlatitého, analog vitamínu D₃, alfa-interferonu apod, které lze využít kinhibici angiogeneze. Další navržené inhibitory angiogeneze viz Blood a kol., Bioch. Biophys. Acta: 1032, 89-118 (1990), Moses a kol., Science: 248, 1408-1410 (1990), Ingber a kol., Lab. Invest.: 59, 44-51 (1988) a US Patent No. 5 092 885,5 112 946,5 192 744 a 5 202 352. Žádný z inhibitorů angiogeneze popsaný v předchozích referencích není zaměřen na inhibici α_νβ₃.

Peptidy obsahující RGD, které inhibují vitronektinový receptor α_νβ₃, byly také popsány. Viz Aumailley a kol., FEBS Letts.: 291, 50-54 (1991), Choi a kol., J. Vasc. Surg.: 19,125-134 (1994), Smith a kol., J. Biol. Chem.: 265, 12267-12271 (1990) a Pfaff a kol., J. Biol. Chem.: 269, 20233-20238 (1994). Až do předložení tohoto vynálezu však nikdy nebyla navržena ani určena role integrinu α_νβ₃ v angiogenezi.

Inhibice buněčné adheze in vitro za použití monoklonálních protilátek ímunospecifických pro různé podjednotky integrinu a nebo β prokázala účast α_νβ₃ v buněčné adhezi mnoha buněčných typů včetně mikrovaskulárních endoteliálních buněk. Davis a kol., J. Cell. Biol.: 51, 206-218 (1993). Navíc Nicosia a kol., Am. J. Pathol.: 138, 829-833 (1991) popsali, že použití RGD peptidu GRGDS inhibuje in vitro tvorbu mikrocév z krysí aorty kultivovaných v kolagenovém gelu. Inhibice tvorby mikrocév in vitro v kulturách v kolagenovém gelu však není modelem inhibice angiogeneze v tkáni, protože není ukázáno, že struktury mikrocév jsou stejné jako výrůstky kapilár, nebo že tvorba mikrocév v kultuře v kolagenovém gelu je stejná jako neovaskulární • ··· • ·· · ' ·· ·· · · ·· · · ·· • · · · · · · • · · · · · · ··· • · · · · · ··· ·· ··· ··· ·· růst v intaktní tkáni jako např. artritické tkáni, nádorové tkáni nebo nemocné tkáni, kde je žádoucí inhibice angiogeneze.

Proto si předkladatelé nejsou kromě již zde uvedených studií vědomi žádné další demonstrace toho, že by angiogeneze mohla být inhibována v tkáni za použití inhibitorů buněčné adbeze. Zvláště pak nikdy dříve nebylo demonstrováno, že k angiogenezi v tkáni je vyžadována funkce <tv&3, nebo že angiogenezi mohou v tkáni i nh i bovat antagon i sté otv03

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález demonstruje. Že angiogeneze v tkáních vyžaduje integrin ctv&3 a že inhibitory <tv&3 mohou angiogenezi inhibovat. Vynález také demonstruje, že antagonisté dalších integrinů jako «víte nebo cfvpi angiogenezi neinhibují patrně proto, že tyto další integriny nejsou pro výskyt angiogeneze esenciální.

Předkládaný vynález proto popisuje použití α_νβ3 antagonisty pro přípravu léčiva pro inhibici angiogeneze v tkáni včetně administrace prostředku do tkáně zahrnující množství ctv&3 antagonisty inhibujicl angiogenezi.

Tkání určenou k léčbě může být jakákoliv tkáš, ve které je žádoucí inhibovat angiogenezi, jako je např. nemocná tkáň s výskytem neovaskularizace. Příklady tkání zahrnují zanícenou tkáň, pevné nádory, metastázy, tkáně s restenozou apod.

Antagonista ctv&3 k použiti podle předkládaného vynálezu je schopen vazby na ctv|33 a kompetitivně inhibovat schopnost <*ν&3 vázat přirozený ligand. Výhodně antagonista vykazuje spécifi tu pro <xv&3 před ostatními integriny. Ve zvláště výhodném provedení inhibuje antagonista α_νβ₃ vazbu fibrinogenu nebo jiných RGD-obsahujících ligandů na α_νβ₃, ale zásadně neinhibuje vazbu fibronektinu na a_)lbp₃. Výhodným antagonistou α_νβ₃ může být polypeptid nebo monoklonální protilátka nebo jejich funkční fragment, který imunoreaguje s α_νβ₃.

Shrnutí obsahu vynálezu

Předkládaný vynález popisuje způsoby inhibice angiogeneze v tkáních a použití vitronektiη-α_νβ₃ antagonistů a zvláště inhibice angiogeneze v zanícených a nádorových tkáních a metastázách za využití terapeutických prostředků obsahujících antagonisty α_νβ₃.

Krátký popis obrázků

Obrázky ilustrují část předkládaného vynálezu.

Obrázky 1A až 1D znázorňují distribuci podjednotek integrinu, β₃ a β_νν tkáni, a to v normální pokožce a pokožce s probíhajícím hojením poranění označené jako granulační tkáň. Imunohistochemie s protilátkami proti β₃α β₁ byla prováděna podle popisu v příkladu 3A. Obrázky 1A a 1B znázorňují imunoreaktivitu anti- β₃ v normální pokožce a granulační tkáni. Obrázky 1C a ID znázorňují imunoreaktivitu anti- β₁v normální pokožce a granulační tkáni.

Obrázky 2A až 2D znázorňují distribuci v tkáni pro von Willebrandův faktor a lamininový ligand, které vážou β₃ a β₁ podjednotky integrinu v normální pokožce a v pokožce s probíhajícím hojením poranění označené jako granulační tkáň. Imunohistochemie s protilátkami proti von Willebrandovu faktoru (anti-vWF) a lamininu (anti-laminin) byla prováděna podle popisu v příkladu 3B. Obrázky 2A a 2B znázorňují imunoreaktivitu anti-vWF v normální pokožce a granulační tkáni. Obrázky 2C a 2D znázorňují imunoreaktivitu anti-lamininu v normální pokožce a granulační tkáni.

Obrázky 3A až 3D znázorňují distribuci integrinu s vitronektinovým receptorem, α_νβ₃, v biopsované tkáni rakoviny močového měchýře, rakoviny tračníku, rakoviny prsu a rakoviny plic. Imunohistochemie s protilátkou LM609 proti α_νβ₃ byla prováděna podle popisu v příkladu 3C.

Obrázek 4 znázorňuje typickou mikrofotografii CAM podle předkládaného vynálezu nemající krevní cévy v 10 dní starém kuřecím embryu nepodrobeném působení. Preparát je popsán v příkladu 5B.

Obrázky 5A až 5C znázorňují distribuci integrinů β! a α_νβ₃ v tkáni v CAM preparátu podle předkládaného vynálezu. Obrázek 5A ukazuje distribuci β_} podjednotky v 10 dnístarém CAM preparátu, který nebyl podroben působení, přičemž distribuce byla detegována imunofluorescencí imunoreaktivity s CSAT, tj. αητί-β₁ protilátkou. Obrázek 5B ukazuje distribuci α_νβ₃ receptorů v 10 dní starém CAM preparátu, který nebyl podroben působení, přičemž distribuce byla detegována imunofluorescencí imunoreaktivity s LM609, tj. αηίι~α_νβ₃protilátkou. Obrázek 5C ukazuje distribuci α_νβ₃ receptorů v 10 dní starém CAM preparátu, který byl podroben působení pFGF, přičemž distribuce byla detegována imunofluorescencí imunoreaktivity sLM609, tj. αητϊ-α_νβ₃ protilátkou. Působení a výsledky jsou popsány v příkladu 5C.

Obrázek 6 znázorňuje ve sloupcovém grafu kvantifikaci relativní exprese α_νβ₃ a β_}ν preparátu nepodrobeném působení a v 10 dní starém CAM preparátu, který byl podroben působení βΕΘΕ, jak je popsáno v příkladu 6A. Průměrná intenzita fluorescence je vynesena na ose Y a profily integrinu na ose X.

Obrázky 7A až C znázorňují vzhled 10 dní starého CAM preparátu nepodrobeného působení, CAM preparátu podrobeného působení βΕΘΡ a CAM preparátu podrobeného působení TNFa, přičemž způsoby a výsledky jsou popsány v příkladu 6A.

Obrázky 8A až 8E znázorňují účinek působení aktuální protilátky na FGF-indukovanou angiogenezi v 10 dní starém CAM preparátu (popsáno v příkladu 7A1). Obrázek 8A ukazuje CAM preparát nepodrobený působení, který nemá krevní cévy. Obrázek 8B ukazuje infiltraci nových cévních svazků do místa dříve bez cév indukovanou působením βΕΘΕ. Obrázky 8C, 8D a 8E ukazují účinky protilátek proti β/αητί-β,; CSAT), α_νβ₅ (anti-α_νβ₅; P3G2)a α_νβ₃ (αητί-α_νβ₃; LM609).

Obrázky 9A až 9C znázorňují účinek intravenózní injekce syntetického peptidů 66203 na angiogenezi indukovanou nádory, jak popisuje příklad 7D2). Obrázek 9A ukazuje, že u intravenózního působení kontrolním peptidem (kontrolní peptid, nádor) chybí inhibiční účinek na angiogenezi vyplývající z indukce nádoru. Inhibice takové angiogeneze intravenózní injekcí peptidů 66203 (cyklický RGD, nádor) je ukázána na obrázku 9B. Chybějící inhibiční účinky nebo cytotoxicita na zralých již existujících cévách následně po intravenózní infúzi peptidů 66203 v místě sousedícím s místem, kde je působení podroben nádor, ukazuje obrázek 9C (cyklický RGD, sousedství sCAM).

Obrázky 10A až 10C znázorňují účinek intravenózní aplikace monoklonálních protilátek na angiogenezi indukovanou růstovým faktorem, jak popisuje příklad 7B1). Obrázek 10A ukazuje pFGF-indukovanou angiogenezi nevystavenou působení protilátky (kontrola). Působením anti~a_vp₅ protilátky P3G2 na podobný preparát nedošlo k žádné inhibici angiogeneze, jak ukazuje obrázek 10B. K inhibici angiogeneze došlo působením antÍ-a_vp₃ protilátky LM609, jak ukazuje obrázek 10C.

Obrázky 11A až 11C znázorňují účinek na angiogenezi embrya následující po místní aplikaci anti-integrinovými protilátkami, jak popisuje příklad 7C. Angiogeneze nebyla inhibována působením anti-β , a anti~a_vp₃ protilátkami na 6 dnů starý CAM preparát, jak ukazují obrázky 11A a 11B. Oproti tomu působení anti-aj^ protilátkou LM609 vedlo k inhibici tvorby krevních cév, jak ukazuje obrázek 11C.

Obrázek 12 znázorňuje kvantifikaci množství cév vstupujích do nádoru v CAM preparátu, jak popisuje příklad 7D1). Graf ukazuje počet cév vynesený na ose Y vyplývající z místní aplikace buď CSAT (anti-βχ, LM609 (anti-a_vp₃) nebo p3G2 (anti-ajy.

Obrázky 13A až 13D znázorňují srovnání hmotností čerstvých nádorů 7 dnů po působení a hmotností počátečních nádorů, jak popisuje příklad 9Al)a. Každý sloupec reprezentuje průměrně +/standardní odchylky 5 až 10 nádorů na skupinu. Nádory pocházely z lidského melanomu (M21-L) (obr. 13A), nádoru pankreasu (Fg) (obr. 13B), nádoru plic (UCLAP-3) (obr. 13C) a nádoru hrtanu (HEp3) (obr. 13D) CAM preparátů a byly podrobeny intravenóznímu působení PBS, CSAT (anti-βρ nebo LM609 (anti-a_vP₃). Na grafech jsou na ose Y vyneseny hmotnosti nádoru vyplývající z intravenozní apliakce buď CSAT (anti-β^, LM609 (αητϊ-α_νβ₃) nebo PBS vyznačených na ose X.

Obrázk 14A a 14B znázorňují histologické řezy nádorů podrobených působení P3G2 (anti-a_vp₅) (obr. 14A) a LM609 (anti~a_vp₃) (obr. 14B), barvené hematoxylinem a eosinem, jak popisuje příklad 9Al)a. Jak je vidět z obrázku 14A, nádory podrobené působení kontrolní protilátky (P3G2) vykazují množství životaschopných a aktivně se dělících nádorových buněk, jak indikují mitotické buňky (viz klínky) i mnohočetné krevní cévy (šipky) skrz stroma nádoru. Naopak (viz obr. 14B) v nádorech podrobených působení LM609 (anti-a_vp₃) je velmi málo (pokud vůbec) životaschopných nádorových buněk nebo krevních cév.

Obrázky Ί5Α až 15E odpovídají M21-L nádorům podrobeným působení peptidy, jak popisuje příklad 9Al)b, a jsou následující: obr. 15A, kontrolní cyklický peptid (69601); obr. 15B, cyklický RGD peptid (66203); obr. 15C, sousední CAM tkáň odebraná ze stejných embryí podrobených působení cyklickým RGD peptidem (66203) a velké zvětšení (13x) nádorů podrobených působení kontrolním RAD (69601) na obr. 15D nebo cyklickým RGD peptidem (66203) na obr. 15E. Obrázek 15D znázorňuje normální cévy v nádoru podrobeném působení RAD kontrolního peptidu (69601). Obrázek 15E znázorňuje příklady rozrušených krevních cév v nádoru podrobeném působení cyklického RGD peptidu (66203) (viz šipky).

Obrázky 16A až 16E znázorňují inhibicí angiogeneze antagonisty angiogeneze stanovením in vivo v králičím modelu oka, jak popisuje příklad 10. Obrázek 16A a 16B znázorňují angiogenezi králičího oka v přítomnosti pFGF a mAb LM609 (anti-a_vp₃).

Obrázek 17 znázorňuje postupový diagram, kde je zaznamenán postup generování modelu chimérická myš in vivo: člověk, jak je popsáno v příkladu 11A. Část kůže SCID myši byla nahrazena lidskou neonatální předkožkou a byla ponechána 4 týdny odhojovat. Po odhojení štěpu byla lidská předkožka zaočkována lidskými nádorovými buňkami. Během následující periody 4 týdnů se vytvořil měřitelný nádor, který zahrnoval lidský nádor s lidskou sítí cév prorůstající z lidské kůže do lidského nádoru.

Obrázek 18 znázorňuje procenta jednotlivých buněk pocházejících z CAM preparátů podrobených působení mAb a peptidu, barvených Apop Tag a stanovených analýzou FACS, jak popisuje příklad 12A a 12B. Černé a tečkované sloupce znázorňují buňky z embryí podrobených působení po dobu 24 hodin, respektive 48 hodin před stanovením. Každý sloupec znázorňuje průměrnou +/střední odchylku tří kopií. CAM preparáty byly podrobeny působení mAb LM609 (anti-ot_vp₃) nebo CSAT (anti-β^ nebo pBS, jak popisuje příklad 12A2, CAM preparáty byly také podrobeny působení cyklického peptidu 66203 (cyklo-RGDfV, označeného jako peptid 203) nebo kontrolního cyklického peptidu 69601 (cyklo-RADfV, označeného jako peptid 601), jak popisuje příklad 12B.

Obrázky 19Aa 19B znázorňují kombinované výsledky jednotlivých buněčných suspenzí CAM preparátů z embryí podrobených působení bud“ CSAT (anti-p^ (obr. 19A) nebo LM609 (anti-tx_vP₃) (obr. 19B) barvených Apop Tag a propidiumjodidem a analyzovaných FACS, jak popisuje příklad 12C. Na ose Y je vyneseno barvení Apop Tag v počtu buněk (apoptóza), na ose X je vyneseno barvení propidiumjodidem (obsah DNA). Horizontální čára znázorňuje negativní přívody pro Apop

Tag barvení. Levý a pravý obrázek vyznačují buňky CAM z embryí podrobených působení CSAT (anti-β^ (obr. 19A), respektive LM609 (anti-a_vp₃) (obr. 19B). Analýza buněčného cyklu byla provedena analýzou přibližně 8 000 cyklů za daných podmínek. Obrázky 20A až 20C znázorňují CAM tkáň z embryí podrobených působení CSAT (anti-β^ a obrázky 20D až 20F znázorňují CAM tkáň z embryí podrobených působení LM609 (αητί-α_νβ₃), jak popisuje příklad 12C. Obrázky 20a a 20D znázorňují tkáně barvené Apop Tag a vizualizované fluorescencí (FITC) vrstvenou na D.I.C. obrazu. Obrázky 20B a 20E znázorňují stejné tkáně barvené mAb LM609 (αητί~α_νβ₃) a vizualizované fluorescencí rhodamin). Obrázky 20C a 20F znázorňují spojené obrazy stejných tkání barvených Apop Tag a LM609, kde žluté barvivo znázorňuje kolokalizaci. Čárka vyznačuje 15 a 50 μη v levém i pravém panelu.

Provedení vynálezu

A. Definice

Aminokyselinový zbytek: Aminokyselina vzniklá chemickým štěpením (hydrolýzou) polypeptidu v jeho peptidické vazbě. Aminokyselinové zbytky zde popsané jsou výhodně v L izomerní formě. Ovšem zbytky v D izomerní formě lze nahradit jakýmkoliv L-aminokyselinovým zbytkem za předpokladu zachování požadovaných funkčních vlastností polypeptidu. NH₂ se vztahuje k volné aminokyselinové skupině přítomné na aminokonci polypeptidu. COOH se vztahuje k volné karboxyskupině přítomné na karboxylovém konci polypeptidu. V souladu se standardním názvoslovím polypeptidů (viz J. Biol. Chem.: 243, 3552-59 (1969) a přijatý CFR §1.822(b)(2)) jsou zkratky aminokyselinových zbytků uvedeny v následujícíTabulce.

Tabulka přiřazení zkratky názvu aminokyseliny

Symbol	Aminokyselina
l-písmenný	3-písmenný
Y	Tyr	ty rosí n
Q	Gly	glycin
F	Phe	fenylalanin
M	Met	methionin
A	Ala	alanin
S	Ser	serin
1	Ile	izoleucin
L	Leu	leucin
T	Thr	threonin
V	Val	valin
P	Pro	prolin
K	Lys	lysin
H	His	histidin
Q	Gin	glutamin
E	Glu	kyselina glutamová
Z	Glx	Glu a/nebo Gin
W	Trp	tryptofan
R	Arg	arginin
D	Asp	kyselina asparagová
N	Asn	asparagin
B	Asx	Asn a/nebo Asp
C	Cys	cystein
X	Xaa	neznámá/jiná

Dalšízkratky znamenají:

BOC	tert-butyloxykarbonyl
DCCI	dicyklohexylkarbodiimid
DMF	dimetylformamid
OMe	metoxy
HOBT	1 -hydroxybenzotriazol

Za povšimnutí stojí, že všechny sekvence aminokyselinových zbytků jsou zde uvedeny vzorcem, jehož levá a pravá orientace je v konvenčním směru od amino-konce ke karboxy-konci. Dále, že pomlčka na začátku nebo konci sekvence aminokyselinového zbytku označuje peptidickou vazbu k další sekvenci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků.

Polypeptid: vztahuje se k lineární řadě aminokyselinových zbytků napojených jeden k druhému peptidickými vazbami mezi alfa-aminoskupinou a karboxyskupinou navazujících aminokyselinových zbytků.

Peptid: tento termín zde označuje lineární řadu ne více než 50 aminokyselinových zbytků napojených jeden k druhému jako v polypeptidu.

Cyklický peptid (cyklopeptid): je odvozen od odpovídajícího lineárního peptídu a označuje peptid, který nemá volný N- nebo C-konec a kde N-konec odpovídajícího lineárního peptídu tvoří amidovou vazbu s karboxylem C-konce tohoto odpovídajícího lineárního peptidu.

Protein: vztahuje se k lineárním radám více než 50 aminokyselinových zbytků napojených jeden k druhému jako v polypeptidů.

Syntetický peptid: vztahuje se k chemicky vyrobenému řetězci aminokyselinových zbytků spojených k sobe peptidickými vazbami který nemá proteiny a jejich fragmenty vyskytující se v přírodě.

B. Obecné úvahy

Předkládaný vynález se týká obecně objevu, že angiogeneze je zprostředkována pomocí specifického vitronektinového receptoru α_νβ₃ a že inhibice funkcí α_νβ₃ inhibuje angiogenezi. Tento objev je důležitý kvůli roli, kterou angiogeneze hraje v široké škále onemocnění a jejich průběhů. Inhibicí angiogeneze lze zasahovat do onemocněni zlepšit symptomy a v některých případech onemocnění léčit.

V případě, že růst nových krevních cév je příčinou, nebo k ní přispívá, patologických projevů spojených s onemocněním, inhibice angiogeneze sníží škodlivé účinky onemocnění. Příklady zahrnují revmatoidní artritidu, diabetickou retinopatii, zánětlivá onemocnění, restenózu apod. V případě, že je růst nových krevních cév vyžadován k podpoře růstu zhoubné tkáně, inhibice angiogeneze sníží přívod krve do tkáně a tím přispěje ke snížení hmoty tkáně založené na požadavku přívodu krve. Příklady zahrnují růst nádorů, kde je neovaskularizace kontinuálním požadavkem z důvodu, že nádor roste do tloušťky přes několik milimetrů a k vytvoření pevných nádorových metastáz. Způsoby podle předkládaného vynálezu jsou zvláště účinné, protože terapie je vysoce selektivní pro angiogenezi a ne pro ostatní biologické pochody. Jak je uvedeno v příkladech, pouze nově rostoucí cévy obsahují značné množství α_νβ₃, a proto nemají terapeutické způsoby nepříznivé účinky na zralé cévy. Navíc α_νβ₃ není široce distribuován v normálních tkáních, ale v dostatečném množství se selektivně nalézá v nových cévách, což zajištuje, že terapii lze selektivně cílit na nově rostoucí cévy.

Objev, že inhibice α_νβ₃ samotného bude účinně inhibovat angiogenezi, umožňuje vývoj terapeutických prostředků s potenciálně vysokou specifitou, a proto nízkou toxicitou. Takže ačkoliv předkládaný vynález popisuje použití prostředků založených napeptidech, které mají schopnost inhibovat jeden nebo více integrinů, lze navrhnout i další prostředky, které selektivněji inhibují α_νβ₃, a proto nemají vedlejší účinky vyvolané inhibicí dalších biologických pochodů kromě pochodů zprostředkovaných α_νβ₃.

Jak ukazuje předkládaný vynález, je např. možné připravit monoklonální protilátky vysoce selektivní k imunoreakci s α_νβ₃, které jsou podobně selektivně inhibují funkci α_νβ₃. Navíc lze peptidy obsahující RGD navrhnout tak, aby selektivně inhibovaly aJ3₃, jak je popsáno viz dále.

V době před objevy předkládaného vynálezu nebylo známo, že by angiogeneze, a jakýkoliv proces závislý na angiogenezi, mohla být inhibována in vivo použitím prostředků, které by mohly mít opačný účinek na biologickou funkci α_νβ₃.

C. Způsoby inhibice angiogeneze

Předkládaný vynález poskytuje způsob inhibice angiogeneze vtkáni, a tím inhibice dějů v tkáni, které závisejí na angiogenezi.

Obecně tento způsob zahrnuje administraci prostředku do tkáně, který zahrnuje α_νβ₃ antagonistu v množství inhibujícím angiogenezi.

Jak již bylo popsáno dříve, angiogeneze zahrnuje množství pochodů, do kterých patří neovaskularizace tkáně včetně pučení, vaskulogeneze nebo rozrůstání cév, přičemž všechny tyto pochody angiogeneze jsou zprostředkovány a závislé na expresi α_νβ₃. S výjimkou traumatického hojení poranění, tvorby corpusu leutea a embryogeneze se věří, že většina pochodů angiogeneze je spojena s průběhy onemocnění, a proto jsou terapeutické způsoby podle předkládaného vynálezu selektivní pro onemocnění a nemají škodlivé vedlejší účinky.

Existuje mnoho onemocnění, u kterých se předpokládá důležitost angiogeneze, která zahrnují, ale nejsou na ně omezena, zánětlivá onemocnění jako je imunitní a neimunitní zánět, chronický artikulární revmatismus a psoriáza, poruchy spojené s nepřiměřenou a nevhodnou invazí cév jako je diabetická retinopatié, neovaskulární glaukom, restenóza, kapilární proliferace v aterosklerotických plácích a osteoporóza a poruchy spojené s rakovinou jako jsou pevné nádory, pevné nádorové metastázy, angiofibromy, retrolentální fibroplazie, hemangiomy, Kaposiho sarkom a podobné rakoviny, které vyžadují neovaskularizaci jako podporu nádorového růstu.

Takže způsoby, které inhibují angiogenezi v nemocné tkáni zlepšují symptomy onemocnění a, v závislosti na typu onemocnění, lze přispět i k léčbě onemocnění. V jednom provedení předkládaného vynálezu je uvažováno o inhibici angiogeneze, per se, vtkáni. Rozšíření angiogeneze v tkáni, a poté rozšíření inhibice dosažené způsoby podle předkládaného vynálezu, lze vyhodnotit mnoha způsoby (popsanými v příkladech) detekce a_vp₃-imunopozitivních nezralých a nascentních cévních struktur pomocí imunohistochemie.

Jak je zde popsáno, jakákoliv z mnoha tkání nebo orgánů sestávajících z organizovaných tkání může za podmínek onemocnění podporovat angiogenezi a to včetně kůže, svalů, střev, pojivových tkání, kostí a podobných tkání, do kterých mohou po angiogenním podnětu pronikat krevní cévy.

V jednom podobném provedení předkládaného vynálezu je tkání určenou k léčbě zanícená tkáň a angiogenezi určenou k inhibici je angiogeneze zanícené tkáně, kde probíhá neovaskularizace zanícené tkáně. V tomto případě daný způsob očekává inhibici angiogeneze v artritických tkáních, tedy u pacientů s chronickým artikulárním revmatem, v imunitně nebo neimunitně zánětlivých tkáních, v tkáních postižených psoriázou apod.

Pacient podrobený léčbě podle předkládaného vynálezu v jeho mnoha provedeních je nejlépe lidský pacient, ačkoliv je zřejmé, že principy předkládaného vynálezu indikují, že předkládaný vynález je účinný, pokud jde o všechny savce zahrnuté do termínu pacient. V tomto kontextu je savcem myšlen jakýkoliv druh savce, u kterého je žádoucí provést léčbu onemocnění spojených s angiogenezi, zvláště druhy zemědělských a domácích druhů savců.

V jiném podobném provedení je tkání určenou k léčbě tkáň sítnice pacienta trpícího diabetickou retinopatií, rozkladem svalové hmoty nebo neovaskulárním glaukomem a angiogenezi určenou k inhibici je angiogeneze v tkáni sítnice, kde probíhá neovaskularizace tkáně sítnice.

V dalším podobném provedení předkládaného vynálezu je tkání určenou k léčbě nádorová tkáň pacienta majícího pevný nádor, metastázy, rakovinu kůže, nádor prsu, hemangiom nebo angiofibrom a podobné typy rakoviny, a angiogenezí určenou k inhibicí je angiogeneze nádorové tkáně, kde probíhá neovaskularizace nádorové tkáně. Typickými tkáněmi s pevným nádorem léčitelnými způsoby podle předkládaného vynálezu jsou plíce, slinivka, prsy, tračník, hrtan, vaječníky a podobné tkáně. Příklady angiogenezí nádorových tkání a jejich inhibice jsou popsány v příkladech.

Inhibice angiogeneze nádorové tkáně je zvláště výhodným provedením předkládaného vynálezu kvůli důležitosti role neovaskularizace, kterou hraje při nádorovém růstu. Chybí-li děj neovaskularizace v nádorové tkáni, nemůže nádorová tkáň získat potřebné živiny, zpomaluje svůj růst, zastavuje další růst, dochází k její regresi a konečně nastává nekróza vedoucí k umrtvení nádoru.

Jinými slovy řečeno předkládaný vynález poskytuje způsob inhibice neovaskularizace nádoru inhibicí angiogeneze nádoru v souladu se způsoby podle předkládaného vynálezu. Podobně předkládaný vynález poskytuje způsob inhibice nádorového růstu použitím způsobů inhibujících angiogenezí.

Tyto způsoby jsou také zvláště účinné proti tvorbě metastáz, protože (1) jejich tvorba vyžaduje vaskularizaci primárního nádoru, takže metastatické nádorové buňky mohou opustit primární nádor a (2) jejich usazení v sekundárním místě vyžaduje neovaskularizaci k podpoře růstu metastáz.

V podobném provedení předkládaný vynález předpokládá použití tohoto způsobu ve spojení s dalšími terapiemi jako je běžná chemoterapie cílená proti pevným nádorům a ke kontrole tvorby metastáz. Administrace inhibitoru angiogeneze je obvykle prováděna během nebo po ukončení chemoterapie, ačkoliv je výhodné inhibovat angiogenezi po chemoterapii v době, kdy bude nádorová tkáň odpovídat na toxický atak indukcí angiogeneze, aby si opět zajistila zásobování krví a živinami. Dále je výhodné použít způsob inhibice angiogeneze po chirurgickém zákroku, kdy byl odstraněn pevný nádor, jako prevenci před vznikem metastáz.

Pokud jsou způsoby podle předkládaného vynálezu použity k inhibici neovaskularizace nádoru, tyto způsoby lze také použít k inhibici růstu nádorové tkáně, k inhibici tvorby nádorových metastáz a ústupu již vzniklých nádorů. Příklady znázorňují regresi vzniklého nádoru s následnou administrací antagonisty α_νβ₃ podle předkládaného vynálezu.

Restenóza je proces migrace a proliferace buněk hladkého svalstva (BHS) v místě perkutánní transluminálni koronární angioplazie, která brání úspěšné angioplazii. Migrace a proliferace BHS během restenózy může být uvažována jako pochod angiogeneze, který je inhibován způsoby podle předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález proto také počítá s inhibici restenózy inhibici angiogeneze v souladu se způsoby podle předkládaného vynálezu u pacienta následně po procedurách angioplazie. K inhibici restenózy je výhodně administrován antagonista α_νβ₃, a to po procedurách angioplazie pod obu od 2 do 28 dní, výhodněji po dobu prvních 14 dnů po proceduře.

Tento způsob inhibice angiogeneze v tkáni, a proto také použití způsobů léčby chorob týkajících se angiogeneze, zahrnuje kontaktování tkáně, kde se angiogeneze vyskytuje nebo existuje riziko jejího výskytu, s prostředkem zahrnujícím terapeuticky účinné množství antagonisty α_νβ₃ schopným inhibovat α_νβ₃ vazbou na jeho přirozený ligand. Takže tento způsob zahrnuje administraci terapeuticky účinného množství fyziologicky tolerovatelného prostředku pacientovi, přičemž prostředek obsahuje antagonistů α_νβ₃ podle předkládaného vynálezu.

Rozsah dávkování pro administraci antagonisty α_νβ₃ závisí na formě antagonisty a jeho účinnosti, jak je posáno viz dále, a množství jsou dostatečně velká tak, aby došlo ke vzniku požadovaného účinku, při kterém se angiogeneze a symptomy onemocnění zprostředkované angiogenezí zlepší. Dávkování by nemělo být tak velké, aby nezpůsobilo nepříznivé vedlejší účinky jako jsou hyperviskozitní syndromy, pulmonární edém, selhání srdce v důsledku jeho překrvení apod. Obecně se bude dávkování lišit podle věku, kondice, pohlaví a rozsahu onemocnění pacienta a lze je určit odborníkem. Dávkování může také upravit sám lékař v případě jakékoliv komplikace.

Terapeuticky účinné množeství je množství antagonisty α_νβ₃dostatečné k produkci měřitelné inhibice angiogeneze v tkáni určené k léčbě, tj. množství inhibující angiogenezí. Inhibice angiogeneze lze měřit in šitu imunohistochemicky, jak je zde popsáno, nebo dalšími způsoby známými osobě obeznámené s problematikou oboru.

Takže pokud je antagonista α_νβ₃ schopen přijmout mimetickou formu α_νβ₃, peptid obsahující RGD, αητί-α_νβ₃ monoklonální protilátku nebo jejich fragment, je nutné si uvědomit, že účinnost, a tedy i výraz terapeuticky účinné množství se může lišit. Ovšem jak ukazují způsoby stanovení podle předkládaného vynálezu, osoba obeznámená s technikou může snadno odhadnout účinnost možného antagonisty α_νβ₃.

Účinnost antagonisty α_νβ₃ lze měřit mnoha způsoby zahrnujícími inhibici angiogeneze v CAM stanovení, v in vivo stanovení v králičím oku, v in vivo stanovení chimérická myš:člověk a měřením inhibice vazby přirozeného ligandu na α_νβ₃ (všechny tyto způsoby jsou popsány zde) apod.

Výhodný antagonista α_νβ₃ má schopnost značně inhibovat vazbu přirozeného ligandu jako je fibrinogen nebo vitronektin na α_νβ₃v roztoku o koncentraci antagonisty menší než 0,5 mikromolární (μτη), výhodně menší než 0,1 gm a výhodněji menší než 0,05 gm. Výrazem značně je míněno to, že je v důsledku inhibice v přítomnosti antagonisty α_νβ₃ pozorováno nejméně 50% snížení vázání fibrinogenu a 50% inhibice je zde označena jako hodnota IC^.

Výhodnější antagonista α_νβ₃ vykazuje selektivitu k α_νβ₃ na rozdíl od ostatních integrinů. Takže výhodný antagonista α_νβ₃ značně inhibuje fibrinogen vázající α_νβ₃, ale neinhibuje dostatečně vazbu fibrinogenu na jiný integrin, jako je α_νβ_μ α_νβ₅ nebo α_ι1όβ₃. Zvláště výhodný je antagonista α_νβ₃, který vykazuje lOx až lOOx nižší IC₅₀aktivitu při inhibici vazby fibrinogenu na α_νβ₃ ve srovnání s IC^ aktivitou při inhibici vazby fibrinogenu na jiný integrin. Příklady stanovení použitých k měření IC₅₀ aktivity při inhibici vazby fibrinogenu na integrin jsou popsány v Příkladech.

Terapeuticky účinné množství antagonisty α_νβ₃ podle předkládaného vynálezu ve formě monoklonální protilátky je obvykle množství, které je, je-li administrováno ve fyziologicky tolerovatelném prostředku, dostatečné k dosažení koncentrace v plazmě od 0,01 mikrogramů (μρ) na mililitr (ml) do ΙΟΟμρ/ηηΙ, výhodně od 1 μg/ml άοδμρ/ηηΙ a obvykle 5μg/ml. Jinak vyjádřeno může být dávkování v rozsahu od 0,1 mg/kg do 300mg/kg, výhodně od 0,2 mg/kg do 200 mg/kg, nejvýhodněji od 0,5 mg/kg do 20 mg/kg, v jedné nebo více dávkách administrovaných denně, po dobu jednoho nebo několika dní.

Je-li antagonista ve formě fragmentu monoklonální protilátky, lze množství snadno upravit způsobem založeným na relativní hmotnosti fragmentu vzhledem k hmotnosti celé protilátky. Výhodná plazmatická koncentrace uvedená jako molarita je od 2 mikromolární (μΜ) do 5 milimolární (mM) a výhodně od 100 μηη do 1 mM antagonisty ve formě protilátky.

Terapeuticky účinné množství antagonisty α_νβ₃ podle předkládaného vynálezu ve formě polypeptidu nebo další velikostí podobné malé molekuly jako mimetické formy α_νβ₃ je obvykle množství polypeptidu takové, které je, je-li administrováno ve fyziologicky tolerovatelném prostředku, dostatečné k dosažení koncentrace v plazmě od 0,1 mikrogramů ^ig) na mililitr (ml) do 200 μg/ml, výhodně od 1 μg/ml do 150 μg/ml. Vztaženo k polypeptidu o hmotnosti 500 g/ml je výhodná koncentrace plazmy v molaritě od 2 mikromolární (μΜ) do 5 milimolární (mM) a výhodně od 100 μίτι do 1 mM antagonisty ve formě peptidu. Jinak vyjádřeno se může dávkování vztažené na tělesnou hmotnost pohybovat v rozsahu od 0,1 mg/kg do 300 mg/kg, výhodně od 0,2 mg/kg do 200 mg/kg, v jedné nebo více dávkách administrovaných denně, po dobu jednoho nebo několika dní.

Monoklonální protilátky nebo polypeptidy podle předkládaného vynálezu lze administrovat parenterálně injekcí nebo postupnou ínfúzí během určené doby. Ačkoliv tkáň určená k léčbě může být v těle obvykle dosažitelná pomocí administrace do krevního oběhu, a proto mnohem častěji léčena intravenózní administrací terapeutických prostředků, ale v případě, že existuje pravděpodobnost, že cílená tkáň obsahuje cílovou molekulu, uvažuje se o jiných tkáních a způsobech doručení. Takže monoklonální protilátky nebo polypeptidy podle předkládaného vynálezu lze administrovat intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulárně, subkutánně, dovnitř dutin, transdermálně a lze je doručovat peristaltickými způsoby.

Terapeutické prostředky obsahující monoklonální protilátku nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu jsou běžně administrovány intravenózně, např. injekcí dávkové jednotky, Termín “dávková jednotka“, je-li použit ve vztahu k terapeutickému prostředku podle předkládaného vynálezu, se týká fyzikálně oddělených jednotek vhodných jako jednotkové dávkování pro daný subjekt, přičemž každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivního materiálu vypočtené tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku spolu s požadovaným rozpouštědlem, tj. nosičem nebo vehíkulem.

V jednom výhodném provedení předkládaného vynálezu je v příkladech ukázáno, že antagonista α_νβ₃ je administrován intravenózně v jednotlivé dávce.

Prostředky jsou administrovány způsobem kompatibilním s dávkovou formou a v terapeuticky účinném množství. Množství určené k administraci a časové rozložení závisí na subjektu, který má být léčen, kapacitě oběhového systému subjektu využít aktivní složku a stupni požadovaného terapeutického účinku. Přesná množství aktivní složky nutné k administraci závisejí na posudku osoby obeznámené s technikou a jsou individální pro každého jednotlivce. Vhodné dávkové rozsahy pro aplikaci do krevního oběhu jsou však uvedeny zde a závisejí na způsobu administrace. Vhodné režimy administrace jsou také variabilní, ale typickým případem je počáteční administrace následovaná opakovanými dávkami v interavlech jedné nebo více hodin, a to postupnou injikací nebo další administarcí, Alternativně je uvažováno o kontinuální intravenozní infúzi dostatečné k dosažení koncentrací v krvi v rozsahu specifických pro terapie in vivo.

Jak znázorňují předkládané Příklady, k inhibicí angiogeneze a regresi nádoru dochází nejdříve 7 dní po počátečním kontaktu santagonistou. Další nebo prodloužené působení antagonistou je výhodné po dobu od 7 dní do ó týdnů, výhodně od 14 do 28 dní.

V obdobném provedení Příklady znázorňují vztah mezi inhibicí α_νβ₃ a indukcí apoptózy v neovaskulárních buňkách dopravujících α_νβ₃. Předkládaný vynález tedy také počítá s využitím způsobů inhibice apoptózy v neovaskulární síti tkáně. Tento způsob je prováděn zásadně, jak je popsáno zde, k inhibicí angiogeneze ve všech tkáních a za podmínek zde popsaných. Jediným důležitým rozdílem je účinek v čase, který u apoptózy probíhá rychle, obvykle 48 hodin po kontaktu s antagonistou, zatímco inhibice angiogeneze a regrese nádoru probíhá mnohem pomaleji, jak je popsáno zde. Tento rozdíl má nepříznivý vliv na terapeutický režim vzhledem kčasu administrace a požadovaného účinku. Obvykle lze provést administraci pro apoptózu neovaskulární sítě od 24 hodin do 4 týdnů, i když výhodné je 48 hodin až 7 dní.

D. Terapeutické prostředky

Předkládaný vynález se zabývá terapeutickými prostředky vhodnými k použití terapeutickými způsoby zde popsanými. Terapeutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič spolu s antagonistou α_νβ₃, jak je zde popsáno, rozpuštěným nebo dispergovaným jako aktivní složka. Ve výhodném provedení terapeutický prostředek obsahující antagonistu α_νβ₃ není imunogenní, je-li administrován savcům nebo lidským pacientům za terapeutickými účely.

Zde použité termíny farmaceuticky přijatelný, fyziologicky tolerovatelný a jeho gramatické obměny se týkají prostředků, nosičů, rozpouštědel a reagencií, jsou zaměnitelné a a znamenají, že dané materiály jsou vhodné k administraci savcům bez nežádoucích fyziologických účinků jako je nechutenství, závratě, žaludeční nevolnost apod.

Příprava farmakologického prostředku, který obsahuje aktivní složky v něm rozpuštěné nebo dispergované, je dobře známa v oboru a není omezena typem prostředku. Takové prostředky jsou obvykle připravovány jako injíkovatelné, a to buď jako kapalné roztoky nebo suspenze, ale lze také připravit pevné formy vhodné k rozpuštění nebo k vytvoření suspenze v roztoku před vlastním použitím. Prostředek také může být emulgovaný.

Aktivní složku lze smíchat s excipienty, které jsou farmaceuticky přijatelné a kompatibilní s aktivní složkou a v množství vhodném k použití v terapeutických způsobech zde popsaných. Vhodnými excipienty je např. voda, fyziologický roztok, dextroza, glycerol, etanol nebo podobně a jejich kombinace. Dále může prostředek obsahovat, je-li to požadováno, minoritní množství pomocných látek jako jsou zvlhčovadla nebo emulgační činidla, tlumivé roztoky k udržování pH apod., které zesilují účinnost aktivní složky.

Terapeutický prostředek podle předkládaného vynálezu zahrnuje farmaceuticky přijatelné soli jeho složek. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují příspěvky solí kyselin (tvořené volnými aminoskupinami polypeptidů), které jsou tvořeny anorganickými kyselinami jako je např. kyselina chlorovodíková nebo orthofosforečná nebo organickými kyselinami jako je kyselina octová, vinná, mandlová apod. Soli tvořené volnými karboxylovými skupinami mohou také pocházet z anorganických baží jako jsou např. sodné, draselné, amonné, vápenaté nebo železité hydroxidy a z organických baží jako je izopropylamin, trimetylamin, 2-etylaminoetanol, hístidin, prokain apod.

Zvláště výhodné jsou soli TFA a HCl, jsou-li použity při přípravě cyklického polypeptidů antagonisty α_νβ₃. Reprezentativní soli peptidů jsou popsány v Příkladech.

Fyziologicky tolerovatelné nosiče jsou v oboru dobře známé. Příkladem kapalných nosičů jsou sterilní vodné roztoky, které kromě aktivních složek a vody neobsahují žádné další materiály, nebo obsahují pufr jako fosforečnan sodný o fyziologickém pH, fyziologický roztok nebo obojí jako je fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok. Dále mohou vodné nosiče obsahovat také více než jednu pufrovací sůl a nebo soli jako je chlorid sodný a draselný, dextroza, polyetylenglykol a další.

Kapalné prostředky mohou také obsahovat kapalné fáze jako přídavek k vodě nebo na úkor vody. Příkaldy takových přídavných kapalných fází jsou glycerin, rostlinné oleje jako bavlníkový olej, a emulze voda-olej.

Terapeutický prostředek obsahuje množství antagonisty α_νβ₃podle předkládaného vynálezu, které inhibuje angiogenezi, obvykle v množství nejméně 0,1% hmotnostních antagonisty na celkovou hmotnost terapeutického prostředku. Hmotnostní procenta jsou poměr hmotnosti inhibitoru ku celkové hmotnosti prostředku. Takže např. 0,% hmotnostních je 0,1 gramu inhibitoru na 100 gramů prostředku.

E. Antagonisté integrinu α_νβ₃

Antagonisté α_νβ₃ jsou ve způsobech podle předkládaného vynálezu použity k inhibici angiogeneze v tkáních a mohou se vyskytovat v mnoha formách, které zahrnují sloučeniny ínteragující s α_νβ₃ tak, že funkční interakce s přirozenými ligandy α_νβ₃ jsou rušeny. Příklady antagonistů zahrnují analogy α_νβ₃ odvozené z vazebného místa pro ligand na α_νβ₃, mimetika buď α_νβ₃ nebo přirozeného ligandu α_νβ₃, které napodobují strukturní oblast zahrnutou ve vazebných interakcích aj}₃-ligand, polypeptidy mající sekvenci odpovídající funkční vazebné doméně přirozeného ligandu specifického pro α_νβ₃, zvláště odpovídající doméně obsahující RGD přirozeného ligandu α_νβ₃a protilátky, které imunoreagují buď s α_νβ₃ nebo s přirozeným ligandem, přičemž všechny vykazují aktivitu antagonisty, jak je zde definováno.

1. Polypeptidy

Jedno provedení předkládaného vynálezu předpokládá použití antagonistů α_νβ₃ ve formě polypeptidů. Polypeptidický (peptídický) anatgonista α_νβ₃ má sekvenční charakteristiky buď přirozeného ligandu α_νβ₃ nebo vlastní α_νβ₃ v oblasti zahrnuté v interakcích a_vp₃~ligand a vykazuje aktivitu antagonisty α_νβ₃, jak je zde popsáno. Výhodný peptidický antagonista α_νβ₃ obsahuje RGD tripeptid a jeho sekvence odpovídá přirozenému ligandu v oblasti obsahující RGD.

Výhodné polypeptidy obsahující RGD mají sekvenci odpovídající sekvenci aminokyselinových zbytků oblasti obsahující RGD přirozeného ligandu α_νβ₃ jako je řibrinogen, vitronektin, von Willebrandův faktor, laminin, trombospondin a podobné ligandy. Takže peptidický antagonista α_νβ₃ může být odvozen z jakýchkoliv přirozených ligandů, i když výhodný je řibrinogen a vitronektin.

Zvláště výhodný peptidický antagonista α_νβ₃ přednostně inhibuje α_νβ₃ tak, že se váže na jeho přirozený ligand (ligandy), je-li sdílen s dalšími integriny, jak bylo popsáno již dříve. Tyto peptidy specifické pro α_νβ₃ jsou zvláště výhodné nejméně proto, že jejich specifita k α_νβ₃snižuje výskyt nežádoucích vedlejších účinků jako je inhibice dalších integrinů, Identifikace výhodných peptidických antagonistů α_νβ₃majících selektivitu k α_νβ₃ lze provést snadno použitím obvyklé inhibice při stanovení vazebnosti jako je stanovení ELISA popsané v Příkladech.

V jednom provedení zahrnuje polypeptid podle předkládaného vynálezu ne více než 100 aminokyselinových zbytků, výhodně ne více než 60 zbytků, výhodněji ne více než 30 zbytků. Peptidy mohou být lineární nebo cyklické, ale zvláště výhodné peptidy jsou cyklické.

Výhodné cyklické a lineární peptidy a jejich označení jsou uvedeny v tabulce 1 v Příkladech.

Je zřejmé, že polypeptid nemusí být identický se sekvencí aminokyselinových zbytků přirozeného ligandu α_νβ₃, pokud zahrnuje požadovanou sekvenci a je schopen fungovat jako antagonista α_νβ₃ve stanovení zde popsaném.

Polypeptid zahrnuje jakýkoliv analog, fragment nebo chemický derivát polypeptidu, jehož aminokyselinová sekvence je zde uvedena, pokud polypeptid je antagonista α_νβ₃ .Proto může polypeptid podle předkládaného vynálezu podléhat různým změnám, substitucím, inzercím a delecím, přičemž použití polypeptidu s takovými změnami má určité výhody. V tomto ohledu polypeptidový antagonista α_νβ₃ podle předkládaného vynálezu odpovídá, spíše než je identický s, sekvenci uvedeného peptidú, kde byly provedeny jedna nebo více změn a přitom si ponechává schopnost fungovat jako antagonista α_νβ₃ v jednom nebo více stanoveních zde definovaných,

Takže polypeptid může být v některé z mnoha forem peptidových derivátů, které zahrnují amidy, konjugáty s proteiny, cyklopeptidy, polymerní peptidy, analogy, fragmenty, chemicky modifikované peptidy a podobné deriváty.

Termín analog zahrnuje jakýkoliv polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků významně z velké části identickou se sekvencí specificky zde uvedenou, v které byl jeden nebo více zbytků konzervativně nahrazen funkčně podobným zbytkem a která vykazuje aktivitu antagonisty α_νβ₃, jak je zde popsáno. Příklady konzervativních substitucí zahrnují substitucí jednoho nepolárního (hydrofobního) zbytku jako je izoleucin, valin, leucin nebo methionin za jiný, substituci jednoho polárního (hydrofilního) zbytku za jiný jako je arginin a lysin, glutamin a asparagin, glycin a serin, substituci jednoho bazického zbytku jako je lysin, arginin nebo histidin za jiný, nebo substituci jednoho kyselého zbytku jako je kyselina asparagová nebo glutamová za jiný.

Termín konzervativní substituce také zahrnuje použití chemicky derivatizovaného zbytku v místě nederivatizovaného zbytku, přičemž takový polypeptid vykazuje požadovanou inhibiční aktivitu.

Chemický derivát se vztahuje k polypeptidu majícímu jeden nebo více zbytků chemicky derivatizovaných reakcí funkční strany skupiny. Takové derivatizované molekuly zahrnují např. molekuly, v kterých byly volné aminoskupiny derivatizovány za vzniku aminhydrochloridů, p-toluensulfonylskupin, benzylkarbonátových skupin, t-butyloxykarbonylskupin, chloracetylskupin nebo formylskupin. Volné karboxylové skupiny lze derivatizovat za vzniku solí, metyl- a etylesterů nebo dalších typů esterů nebo hydrazidů. Volné hydroxylové skupiny lze derivatizovat za vzniku O-acyl- nebo O-alkylderivátů. Imidazolový dusík histidinu lze derivatizovat za vzniku N-im-benzylhistidinu. Jako chemické deriváty jsou zde zahrnuty také ty peptidy, které obsahují jeden nebo více přirozeně se vyskytujících derivátů dvaceti standardních aminokyselin. Např. 4-hydroxyprolinem lze substituovat prolin; 5-hydroxylysinem lze substituovat lysin; 3-metylhistidinem lze substituovat histidin; homoserinem lze substituovat serin; a ornitinem lze substituovat lysin.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu také zahrnují jakýkoliv polypeptid mající jednu nebo více připojených skupin a/nebo delecí nebo zbytků blízkých sekvenci polypeptidů, jehož sekvence je uvedena zde, pokud vykazuje požadovanou aktivitu.

Termín fragment se vztahuje k jakémukoliv polypeptidů majícímu aminokyselinovou sekvenci sekvenci kratší než polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena zde.

Má-li polypeptid podle předkládaného vynálezu sekvenci, která není identická se sekvencí přirozeného ligandu aJ3₃, je to obvykle díky jedné nebo více konzervativním nebo nekonzeravtivním substitucím, které byly provedeny, obvykle je substituováno ne více než 30 procent počtu, výhodně ne více než 10 procent počtu aminokyselinových zbytků. Další zbytky lze připojit buď na konec polypeptidů pro účely vytvoření linkeru, pomocí kterého lze polypeptidy podle předkládaného vynálezu běžně uchytit na značený nebo pevný matrix, nebo nosič.

Značky, pevné matrice nebo nosiče, které lze použít spolu s polypeptidy podle předkládaného vynálezu, jsou uvedeny viz níže.

Aminokyselinové linkery mají obvykle nejméně jeden zbytek a mohou mít 40 nebo více zbytků, častěji od 1 do 10 zbytků, ale netvoří epitopy ligandu α_νβ₃. Typické aminokyselinové zbytky používané ke spojování jsou tyrosin, cystein, lysin, kyselina glutamová a asparagová apod, Navís se polypeptid může lišit, není-li specifikováno jinak, od přirozené sekvence ligandu α_νβ₃ sekvencí modifikovanou acylací koncové NH₂-skupiny, např. acetylací, nebo amidací thioglykolovou kyselinou, koncovou karboxyamidací, např. amoniakem, metylaminem a podobnými koncovými modifikacemi.

Koncové modifikace jsou vhodné, jak je známo, ke snížení náchylnosti ke štěpení proteázou, a proto slouží k prodloužení poloviční doby existence polypeptidu v roztocích, zvláště biologických kapalinách, kde mohou být proteázy přítomné. V tomto ohledu je cyklizace polypeptidu také vhodná koncová modifikace a je zvláště výhodná také kvůli stabilitě struktur vzniklých cyklizací a z hlediska biologických aktivit pozorovaných pro takové cyklické peptidy, jak je zde popsáno.

Jakýkoliv peptid podle předkládaného vynálezu lze použít ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Vhodné kyseliny jsou schopné tvorby solí s peptidy podle předkládaného vynálezu včetně anorganických kyselin jako je trifluoroctová kyselina (TFA), kyselina chlorovodíková (HCl), kyselina bromovodíková, kyselina chloristá, kyselina dusičná, kyselina thiokyanatá, kyselina orthofosforečná, kyselina propionová, kyselina glykolová, kyselina mléčná, kyselina pyrohroznová, kyselina štavelová, kyselina malonová, kyselina jantarová, kyselina maleinová, kyselina tumorová, kyselina anthranilová, kyselina skořicová, kyselina naftalensulfonová, kyselina sulfanilová apod. Zvláště výhodné jsou soli HCl a TFA.

Vhodné báze schopné tvorby solí s peptidy podle předkládaného vynálezu zahrnují anorganické báze jako je hydroxid sodný, hydroxid amonný, hydroxid draselný apod; a organické báze jako mono-, di- a trialkyl- a arylaminy (např. trietylamin, diizopropylamin, metylamin, dimetylamin apod) a volitelně substituované etanolaminy (např. etanolamin, dietanolamin apod.).

Peptid podle předkládaného vynálezu se také vztahuje k polypeptidu, který lze syntetizovat jakýmkoliv způsobem známým v oboru polypeptidů, včetně technik rekombinantní DNA.

Způsoby chemické syntézy, jako je Merrifieldova syntéza na pevné fázi, jsou výhodné z důvodů čistoty, antigenní specifity, nepřítomnosti nežádoucích vedlejších produktů, snadnost přípravy apod. Výborné shrnutí mnoha dostupných způsobů lze nalézt v pracích Stewarda a kol, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco (1969); Bodanszky a kol., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, second edition (1976); J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol, 2, str. 46, Academie Press (New York) (1983); Merrifield, Adv. Enzymol.: 32, 221-96 (1969); Fields a kol., Int. J. Peptide Protein Res.: 35, 161-214 (1990); a U.S. Patent No. 4244946 týkající se syntézy peptidů na pevné fázi a Schroder a kol., The Peptides, Vol. 1, Academie Press (New York) (1965) týkající se klasické syntézy v roztoku, přičemž všechny práce jsou zde uvedeny jako reference. Vhodné chránící skupiny použitelné při takových syntézách jsou popsány v pracích uvedených viz výše a v práci J.F.W. McOmieho, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenům Press, New York (1973), uvedené zde jako reference.

Obecně syntézy na pevné fázi předpokládají zahrnutí postupného přidávání jednoho nebo více aminokyselinových zbytků nebo vhodně chráněných aminokyselinových zbytků k rostoucímu peptidickému řetězci, Obvykle je buď aminoskupina nebo karboxylová skupina prvního aminokyselinového zbytku chráněna vhodnou, selektivně odstranitelnou skupinou. Nebo je selektivně odstranitelná chránící skupina použita pro aminokyseliny obsahující reaktivní vedlejší skupnu, jako např. lysin.

Syntéza na pevné fázi se provádí tak, že chráněná nebo derivatizovaná aminokyselina je připojena k inertnímu pevnému nosiči přes její nechráněnou karboxylovou skupinu nebo aminoskupinu. Chránící skupina aminoskupiny nebo karboxylové skupiny je poté selektivně odstraněna a je přimíšena následující aminokyselina v sekvenci mající vhodně chráněnou komplementární (amino- nebo karboxy-) skupinu a je zreagována za podmínek vhodných ke vzniku amidového spojení se zbytkem již napojeným k pevnému nosiči. Chránící skupina amino- nebo karboxyskupiny je poté z tohoto nově přidaného aminokyselinového zbytku odstraněna, a pak se přidá další aminokyselina (vhodně chráněná) a tak dále. Poté, co byly k vhodné sekvenci připojeny všechny požadované aminokyseliny, byly postupně nebo současně odstraněny zbylé koncové a postranní chránící skupiny ( a pevný nosič) za získání konečného lineárního popypeptidu.

Výsledné lineární polypeptidy připravené podle příkladu popsaného viz výše mohou být podrobeny reakci za vzniku jejich odpovídajících cyklopeptidů. Příklad způsobu cyklizace peptidú je popsán Zimmerem a kol., Peptides, str. 393-394 (1992), ESCOM Science Publishers, B.V. (1993). Obvykle je ř-butoxykarbonylem chráněný metylester peptidú rozpuštěn v metanolu, přidá se roztok hydroxidu sodného a směs je ponechána reagovat při teplotě 20 ’C, přičemž se hydrolyticky odstraní metylesterová chránící skupina. Po odpaření rozpouštědla je ř-butoxykarbonylem chráněný peptid z okyseleného vodného roztoku extrahován etylacetátem. Γ-butoxykarbonyiová chránící skupina je poté za slabě kyselých podmínek odstraněna v roztoku dioxanu přidaného k rozpouštědlu. Takto získaný nechráněný lineární peptid s volnými N- a C-konci je na odpovídající cyklopeptid převeden reakcí zředěného roztoku lineárního peptidú ve směsi dichlormetanu a dimetylformamidu s dicyklohexylkarbodiimidem v přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu a N-metylmorfolinu. Výsledný cyklopeptid je poté chromatograficky purifíkován.

Zvláště výhodný způsob syntézy cyklopeptidu je popsán Guarrathem a kol., Eur. J. Biochem., 210, 911-921 (1992) a je popsán v Příkladech. Zvláště výhodné peptidy k použití způsoby podle předkládaného vynálezu jsou c-(GrGDFV) (SEQ ID NO 4), c-(RGDfV) (SEQ ID NO 5), c-(RADfV) (SEQ ID NO 6), c-(RGDFv) (SEQ ID NO 7) a lineární peptid YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO 8), kde c- označuje cyklopeptid, velká písmena jsou jednopísmenné kódy pro L-aminokyseliny a malá písmena jsou jednopísmenné kódy pro D-aminokyseliny. Sekvence aminokyselinových zbytků těchto peptidů jsou také ukázány v SEQ ID NO 4,5,6,7 a 8.

2. Monoklonální protilátky

Předkládaný vynález popisuje (v jednom jeho provedení) antagonisty α_νβ₃ ve formě monoklonálních protilátek, které imunoreagují s α_νβ₃ a inhibují vazbu α_νβ₃ na jeho přirozený ligand, jak je zde posáno. Vynález také popisuje buněčné linie, které produkují protilátky, způsoby získání buněčných linií a způsoby produkce monoklonálních protilátek.

Monoklonální protilátka podle předkládaného vynálezu zahrnuje molekuly protilátky, které 1) imunoreagují s izolovaným α_νβ₃ a 2) inhibují vazbu fibrinogenu na α_νβ₃. Výhodné monoklonální protilátky, které se přednostně vážou na α_νβ₃, zahrnují monoklonální protilátku mající imunoreakční charakteristiky mAb LM609, sekretovanou hybridomovou buněčnou linií č. ATCC HB 9537. Hybridomová buněčná linie ATCC BH 9537 byla uložena shodně s požadavky Budapešťské dohody a American Type Culture Collection (ATCC), 1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, 15.9. 1987.

Termín protilátka nebo molekula protilátky v různých gramatických tvarech je zde použit jako kolektivní podstatné jméno, které se vztahuje k populaci molekul imunoglobulinu a/nebo imunologicky aktivním částem molekul imunoglobulinu, tj. k molekulám, které obsahují doménu tvořící vazebné místo pro protilátku nebo paratop.

Doména tvořící vazebné místo pro protilátku je strukturní část molekuly protilátky tvořená variabilními a hypervariabilními oblastmi těžkého a lehkého řetězce, která specificky váže antigen.

Příklady protilátek vhodných k použití podle předkládaného vynálezu jsou intaktní imunoglobulinové molekuly, značně intaktní imunoglobulinové molekuly a části imunoglobulinové molekuly, které obsahují paratop, včetně strukturních fragmentů známých v oboru jako Fab, Fab', F(ab')₂ a F(v) a nazývaných také fragmenty protilátky.

V jiném výhodném provedení předkládaný vynález uvažuje zkrácenou imunoglobulinovou molekulu zahrnující fragment Fab pocházející z monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu. Fragment Fab, který nemá Fc receptor, je rozpustný a poskytuje terapeutické výhody z hlediska poloviční doby existence v séru a diagnostické výhody vyplývající ze způsobu použití rozpustného fragmentu Fab. Příprava rozpustného fragmentu Fab je obecně v imunologii známá a lze ji provést mnoha způsoby.

Např. fragmenty protilátek Fab a F(ab')₂ jsou připraveny proteolytickou reakcí papainu, respektive pepsinu, a značně intaktních protilátek dobře známými způsoby. Viz např. U.S. Patent No. 4342 566 Theofílopolouse a Dixona. Fragmenty protilátky Fab' jsou také velmi dobře známé a vzniknou z fragmentů F(ab')₂ podrobených redukci disulfidických můstků pojících dvě části těžkého řetězce za použití merkaptoetanolu, a poté alkylaci vzniklého merkaptanu proteinu za použití reakčního činidla jako je jodacetamíd. Výhodné jsou protilátky obsahující intaktní imunoglobulinové molekuly a jsou použity, jak je zde uvedeno.

Termín monoklonální protilátka v mnoha jeho gramatických tvarech se týká populace molekul protilátky, které obsahují pouze jeden druh domény tvořící vazebné místo pro protilátku schopné imunoreagovat s určitým epitopem. Monoklonální protilátka tak obvykle vykazuje jednoduchou vazebnou afinitu k jakémukoliv epitopu, se kterým imunoreaguje. Monoklonální protilátka proto může obsahovat molekulu protilátky mající velké množství domén tvořících vazebné místo pro protilátku, každou z nich imunospecifickou pro odlišný epitop, jako např. bispecifická monoklonální protilátka.

Monoklonální protilátka je obvykle tvořena protilátkami produkovanými klony jedné buňky zvané hybridom, které sekretují (produkují) pouze jeden druh molekuly protilátky. Hybridomová buňka je tvořena fúzí protilátku-produkující buňky a myelomu nebo další samoobnovující se buněčné linie. Příprava takových protilátek byla poprvé popsána v práci Kohlera a Mílsteina, Nátuře: 256, 495-497 (1975), uvedené zde jako reference. Další způsoby jsou popsány v práci Zoly, Monoklonální protilátky: Manuál technik, CRC Press, lne. (1987). Supernatanty hybridomu takto připravené lze podrobit testům na přítomnost molekul protilátky, které imunoreagují s α_νβ₃, a testům inhibice vazby α_νβ₃ na přirozené ligandy.

Krátce k vytvoření hybridomu, který pak produkuje prostředek obsahující monoklonální protilátku, je myelom nebo další samoobnovující se buněčná linie fúzována s lymfocyty získanými ze sleziny savců hyperimunizovaných zdrojem α_νβ₃ jako je α_νβ₃izolovaný z lidských melanomových buněk M21, jakje popsáno v práci Chereshe a kol,, J. Biol. Chem.: 262,17703-17711 (1987).

Je výhodné použít k přípravě hybridomu myelomovou buněčnou linii ze stejného druhu jako jsou lymfocyty. Obvykle je výhodným savcem myš kmene 129GIX⁺. Vhodné myší myelomy k použití podle předkládaného vynálezu zahrnují hypoxanthin-aminopterin-tymidin-citlivé (HAT) buněnčé linie P3X63~Ag8.653 a Sp2/0-Agl4 které jsou dostupné v American Type Culture Collection, Rockville, MD, pod označením CRL 1580 a CRL 1581.

Splenocyty jsou obvykle fúzovány s buňkami myelomu za použití polyetylenglykolu (PEG) 1500. Fúzované hybridy jsou selektovány pomocí jejich citlivosti na HAT. Hybridomy produkující monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu jsou identifikovány za použití stanovení ELISA popsaného v Příkladech.

Monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu lze také produkovat iniciací monoklonální hybridomové lutktury zahrnující medium s živinami obsahující hybridom, který sekretuje molekuly protilátky o příslušné specifitě. Tato kultura je udržována za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby hybridom sekretoval molekuly protilátky do media. Medium obsahující protilátku je poté shromážděno. Molekuly protilátky lze pak dále izolovat dobře známými způsoby.

Media využitelná k přípravě těchto prostředků jsou obě dobře známá v oboru a komerčně dostupná a zahrnují syntetické kultivační medium, inbrední myši apod. Příkladem syntetického media je Dulbeccovo minimální esenciální medium (DMEM; Dulbecco a kol., Virol.: 8, 396 (1959)) doplněné 4,5 g/l glukózy, 20 mM glutaminu a 20% totálního telecího séra. Příkladem Inbredního myšího kmene je Balb/c.

Další způsoby produkce monoklonální protilátky, hybridomové buňky nebo hybridomové buněčné kultury jsou také dobře známé. Viz např. způsob izolace monoklonálních protilátek z imunologické sbírky, jak je popsáno Sastrym a kol.. Proč. Nati. Acad, Sci. USA: 86,5728-5732 (1989); a Huse a kol.. Science: 246,1275-1281 (1989).

Předmětem předkládaného vynálezu je také hybridomová buňka a kultury obsahující hybridomovou buňku, které produkují monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu, Zvláště výhodná je hybridomová buněčná linie, která sekretuje monoklonální protilátku mAb LM609 označenou ATCCHB9537. mAb LM609 byla připravena podle práce Chereshe a kol., J. Biol. Chem.: 262, 17703-17711 (1987) a její příprava je také popsána v Příkladech.

Předkládaný vynález v jednom provedení počítá s monoklonální protilátkou, která má imunoreakční charakteristiky mAb LM609.

Je také možné určit, bez dlouhých experimentů, zdali má monoklonální protilátka stejnou (tj. ekvivalentní) specifitu (imunoreakční charakteristiky) jako monoklonální protilátka podle předkládaného vynálezu, a to zjištěním, jestli ta první předchází tu druhou při vazbě na předem vybranou cílovou molekulu. Jestliže testovaná monoklonální protilátka bude podle testu kompetovat s monoklonální protilátkou podle předkládaného vynálezu, což se ukáže poklesem vazby monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu ve standardním kompetitivním stanovení vazby na cílovou molekulu, a je-li přítomná v pevné fázi, pak je pravděpodobné, že tyto dvě monoklonální protilátky vážou tentýž, nebo velmi příbuzný, epitop.

Jiným způsobem, jak určit, má-li monoklonální protilátka specifitu monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu, je předem inkubovat monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu s cílovou molekulou, s kterou reaguje normálně, a poté přidat testovanou monoklonální protilátku, aby se určilo, je-li u testované monoklonální protilátky inhibována její schopnost vázat se na cílovou molekulu. Je-li testovaná monoklonální protilátka takto inhibována, má se vší pravděpodobností tutéž, nebo funkčně ekvivalentní, specifitu epitopu jako monoklonální protilátka podle předkládaného vynálezu.

Dalším způsobem určení, jestli má monoklonální protilátka specifitu monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu je určení sekvence aminokyselinových zbytků CDR oblastí zkoumaných protilátek. Molekuly protilátky mající identické nebo funkčně ekvivalentní sekvence aminokyselinových zbytků v jejich CDR oblastech mají tutéž vazebnou specifitu. Způsoby sekvenace polypeptidů jsou v oboru dobře známé.

Imunospecifita protilátky, její kapacita vázat cílovou molekulu a doprovodná afinita, kterou protilátka vykazuje pro epitop, je definována epitopem, s kterým tato protilátka imunoreaguje. Specifita epitopu je definována alespoň částečně sekvencí aminokyselinových zbytků variabilní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinové protilátky a částečně sekvencí aminokyselinových zbytků variabilní oblasti lehkého řetězce.

Použití termínu mající vazebnou specifitu znamená, že odpovídající monoklonální protilátky vykazují stejné nebo podobné imunoreakční (vazebné) charakteristiky a kompotují o vazbu na předem vybranou cílovou molekulu.

Humanizované monoklonální protilátky mají určité výhody oproti myším monoklonálním protilátkám, zvláště pokud je lze terapeuticky použít u lidí. Konkrétně lidské protilátky nejsou vyplaveny z oběhu tak rychle jako cizí antigeny a neaktivují imunitní systém stejným způsobem jako cizí antigeny a cizí protilátky. Způsoby přípravy humanizovaných protilátek jsou v oboru obecně velmi dobře známé a lze je snadno aplikovat na protilátky podle předkládaného vynálezu.

Takže předkládaný vynález v jednom svém provedení zahrnuje monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu, která je humanizována tím, že se naštěpí, aby se mohly vložit složky lidského imunitního systému bez toho, že by zásadně rušily schopnosti protilátky vázat se na antigen.

3. Mimetika specifická pro α_νβ₃

Předkládaný vynález demontruje, že antagonisté α_νβ₃ lze obecně použít podle předkládaného vynálezu, přičemž antagonisté zahrnují polypeptidy, protilátky a další molekuly označené jako mimetika, které mají schopnost rušit funkci α_νβ₃. Zvláště výhodní jsou antagonisté, kteří specificky ruší funkci α_νβ₃ a neruší funkci dalších Integrinů.

V tomto kontextu je zvláště ceněno to, že k použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu lze použít množství vhodných reakčních činidel, pokud mají požadovanou biologickou aktivitu. Tato činidla se obecně nazývají mimetika, protože mají schopnost napodobovat vazebnou doménu buď na α_νβ₃ nebo α_νβ₃ ligandu zahrnutou ve funkčních interakcích receptor a ligand, a tím ruší(tj. inhibují) normální funkci.

Mimetikum α_νβ₃ je jakákoliv molekula, jiná než protilátka nebo peptid pocházející z ligandu, která vykazuje výše popsané vlastnosti. Může to být syntetický analog peptidu, sloučenina, která je ve tvar vazebné kapsy výše popsané vazebné domény, nebo jiná molekula.

Návrh mimetika α_νβ₃ lze odvodit mnoha strukturními analýzami pro návrhy léčiv známými v oboru, včetně molekulárního modelování, dvojrozměrné nukleární magnetické rezonance (2-D NMR), X-paprskové krystalografie, náhodného testováni polypeptidů, peptídových analog nebo dalších chemických polymerních knihoven a podobných způsobů návrhů léčiv. .

V pohledu tohoto širokého strukturního důkazu uváděného v předkládaném vynálezu, který ukazuje, že antagonista α_νβ₃ může být malý polypeptid nebo monoklonální protilátka, dvě zcela odlišné chemické struktury, které sdílejí funkční vlastnost selektivně inhibovat α_νβ₃ a struktura antagonisty α_νβ₃ použitelného ve způsobech podle předkládaného vynálezu tak nemusí být omezena, ale zahrnuje jakékoliv mimetikum definované viz výše.

F. Způsoby identifikace antagonistů α_νβ₃

Předkládaný vynález také popisuje způsoby a stanovení identifikace uvažovaného antagonisty α_νβ₃ k použití v souladu s předkládanými způsoby. V těchto stanoveních jsou molekuly uvažovaných látek vyhodnocovány z hlediska jejich síly inhibovat angiogenezi v tkáni.

První stanovení měří inhibici přímé vazby přirozeného ligandu na α_νβ₃ a výhodné provedení je detailně popsáno v Příkladech. Stanovení obvykle měří stupeň inhibice vazby přirozeného ligandu jako je fibrinogen na izolovaný α_νβ₃ v pevné fázi pomocí ELISA testu.

Stanovení lze také použít k identifikaci sloučenin, které vykazují specifitu pro α_νβ₃ a neinhibují vazbu přirozených ligandů na další integriny. Stanovení specifity je prováděno tak, že pustí paralelní ELISA stanovení, kde jsou α_νβ₃ a další integriny vyhodnocovány současně v oddělených stanovovacích komůrkách a stanovují se jejich schopnosti vázat se na přirozený ligand a zjištuje se možná sloučenina inhibující schopností integrinů vázat se na předem vybraný ligand. Výhodné formáty screeningového stanovení jsou popsány v Příkladech.

Druhé stanovení měří angiogenezi v kuřecí chorioallantoidní membráně (CAM) a nazývá se CAM stanovení. CAM stanovení bylo podrobně popsáno jinými autory a bylo použito k měření angiogeneze i neovaskularizace nádorových tkání. Viz Ausprunk a kol., Am. J. Pathol.: 7X 597-618 (1975) a Ossonski a kol., Cancer. Res.: 40,2300-2309(1980).

CAM stanovení je velmi dobrý model rozeznávání angiogeneze in vivo, protože je pozorována neovaskularizace celé tkáně a aktuální krevní cévy kuřecího embrya prorůstají do CAM nebo do tkáně rostoucí na CAM.

Jak je zde demonstrováno, CAM stanovení znázorňuje inhibicí neovakularizace a je založeno na množtví a rozsahu růstu nových cév. Navíc je snadné sledovat růst jakékoliv tkáně transplantované na CAM, jako je nádorová tkáň. A konečně je toto stanovení zvláště vhodné díky tomu, že v systému stanovení je interní kontrola toxicity. Kuřecí embryo je vystaveno některému testovacímu reakčnímu činidlu, a proto je zdraví embrya indikací toxicity reakčního činidla.

Třetím stanovením měřícím angiogenezi je in vivo králičí model oka a nazývá se stanovení v králičím oku. Stanovení v králičím oku bylo detailně popsáno jinými autory a bylo použito k měření angiogeneze a neovaskularizace v přítomnosti angiogenních inhibitorů jako je thalidomid, Viz D'Amato a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci.: 91, 4082-4085 (1994).

Stanovení v králičím oku je velmi dobrý model rozeznávání angiogeneze in vivo, protože proces neovaskularizace znázorněný králičími krevními cévami rostoucími z kraje rohovky dovnitř rohovky je snadno vizualizovaný díky přirozeně transparentní rohovce oka. Navíc lze rozsah a množství stimulace nebo inhibice neovaskularizace nebo regrese neovaskularizace v průběhu času snadno sledovat.

Nakonec ke králík vystaven některému testovacímu reakčnímu činidlu, a proto je zdraví embrya indikací toxicity testovaného reakčního činidla.

Čtvrté stanovení měří angiogenezi v modelu chimérická myš: člověk a nazývá se stanovení v chimérické myši. Stanovení bylo detailně popsáno jinými autory a dále zde bylo popsáno k měření angiogeneze, neovaskularizace a regrese nádorových tkání. Viz Yan a kol., J. Clin. Invest.: 91, 986-996 (1993). Stanovení v chimérické myši je vhodný model pro angiogenezí in vivo, protože transplantované kousky kůže se histologicky velmi podobají normální lidské kůži a neovaskularizace celé tkáně probíhá tam, kde rostou aktuální lidské krevní tkáně z transplantované lidské kůže do lidské nádorové tkáně na povrchu transplantované lidské kůže. Původ neovaskularizace v lidském transplantátu lze demonstrovat imunohistochemickým barvením neovaskulární sítě markéry specifickými pro lidské endoteliální buňky.

Jak je zde ukázáno, stanovení v chimérické myši demonstruje ústup neovaskularizace založené na množství I rozsahu regrese růstu nových cév. Dále je snadné sledovat účinky na růst jakékoliv tkáně transplantované na již transplantovanou kůži, jako je nádorová tkáň. A konečně je stanovení vhodné, protože v systému stanovení je interní kontrola toxicity. Chimérická myš je vystavena některému testovacímu reakčnímu činidlu, a proto je zdraví myši indikací toxicity reakčního činidla.

Příklady

Následující příklady vztahující se k předkládanému vynálezu jsou ilustrativní a neměly by, samozřejmě, být sestaveny tak aby, konkrétně omezovaly předkládaný vynález. Navíc jsou takové variace předkládaného vynálezu, známé nyní nebo vyvinuté později, které by spadaly do rozsahu znalostí osoby obeznámené s oborem, zahrnuty v rámci předkládaného vynálezu a uvedeny v nárocích viz dále.

Příklad 1. Příprava syntetických peptidů

Lineární a cyklické polypeptidy uvedené v Tabulce 1 byly syntetizovány za použití standardních syntetických způsobů na pevné fázi jako např. popisuje Merrifield, Adv. Enzymol.: 32, 221-96 (1969) a Fields, G.B. a Noble, R.L., Int. J. Peptide Protein. Res.: 35,161-214 (1990).

Dva gramy (g) BOC-Gly-D-Arg-Oly-Asp-Phe-Val-OMe (SEQ ID NO: 1) byly nejprve rozpuštěny v 60 ml metanolu, do kterého bylo přidáno 1,5 ml 2M roztoku hydroxidu sodného za vzniku směsi. Směs pak byla míchána po dobu 3 hodin při teplotě 20 °C. Po odpaření byl odparek rozpuštěn ve vodě, roztok byl zředěnou Hel okyselen na pH 3 a extrahován etylacetátem. Extrakt byl sušen nad Na₂SO₄, odpařen a výsledný BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO: 2) byl míchán při teplotě 20 °C po dobu 2 hodin s 20 ml 2M Hel v dioxanu. Výsledná směs byla odpařena za získání H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO: 3), odparek byl postupně rozpuštěn ve směsi 1800 ml dichlormetanu a 200 ml dimetylformamidu (DMF), a směs byla poté ochlazena na 0 C. Pak bylo postupně za míchání přidáno 0,5 g dicyklohexylkarbodiimidu (DCCI), 0,3 g 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) a 0,23 ml N-metylmorfolinu.

Výsledná směs byla míchána dalších 24 hodin při teplotě 0 °C, a pak ještě dalších 48 hodin. Roztok byl pak zakoncentrován a smísen se smíšeným ložem ionexu, aby byl očištěn od solí. Po odstranění zbývající pryskyřice filtrací byl vyčištěný roztok odpařen, odparek byl purifikován chromatograficky a byl získán cyklo(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO: 4). Následující peptidy uvedené v Tabulce 1 s použitím jednopísmenného kódu zkratek aminokyselinových zbytků a identifikované podle čísla peptidů, byly získány obdobně: cyklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO: 5); cyklo(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO: 6); cyklo(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO: 9);

cyklo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID NO: 7). Peptid označený jako 66203 má identickou sekvenci s peptidem 62184, lišící se od něho tím, že obsahuje sůl HCl, kdežto 62184 obsahuje sůl TFA. Ve stanoveních inhibice angiogeneze popsaných v příkladu 7, kde byly použity syntetické peptidy, byl peptid 66203 mající HCl o něco účinnější při inhibici angiogeneze než identický peptid s TFA.

Tabulka 1

Peptid číslo:	Aminokyselinová sekvence	SEQ ID NO
62 181	cyklo(GrGDFV)	4
62 184	cyklo(RGDfV)	5
62 185	cyklo(RADfV)	6
62 187	cyklo(RGDFv)	7
62 180	YTAECKPQVTRGDVF	8
62 186	cyklo(RaDFV)	9
62 175	cyklo(ARGDfL)	10
62179	cyklo(GRGDfL)	11
62411	TRQVVCDLGNPM	12
62 503	GVVRNNEALARLS	13
62 502	TDVNGDGRHDL	14

* Malá písmena označují D-aminokyseliny; velká písmena označují L-aminokyseliny.

Peptid označený jako 69601 mající identickou sekvenci s peptidem 62185 se od něj liší pouze tím, že obsahuje sůl HCl na rozdíl od peptidu 62184 obsahujícího sůl TFA.

Bylo zjištěno, že cyklopeptid c-RADfV (69601) inhibuje vazbu fibrinogenu na integrin α_νβ₃ a neinhibuje vazbu fibrinogenu na integriny a_llbp₃ nebo α₅β₁ (Pfaff a kol., J. Biol. Chem.: 269, 20233-20238 (1994)). Takže peptid c-RADfV je specifický pro α_νβ₃.

2. Monoklonální protilátky

Monoklonální protilátka LM609 sekretovaná hybridomem ATCC HB 9537 byla produkována za použití standardních hybridomových způsobů imunizací izolovaným α_νβ₃ adsorbovaným na lektinovou matrici se Sepharosovými čočkami. α_νβ₃ byl izolován z lidských melanomových buněk označených M21 a protilátka byla produkovaná podle popisu v práci Chereshe a kol., J. Biol. Chem.: 262, 17703-17711 (1987). M21 buňky byly poskytnuty Dr. D.L. Mortonem (University of California, Los Angeles, CA) a ponechány růst vsuspenzních kulturách v kultivačním mediu RPMI 1640 obsahujícím 2 mM L-glutamin, 50 mg/ml gentamicinsulfátu a 10% fetálního telecího séra,

Bylo zjištěno, že monoklonální protilátka LM609 specificky imunoreaguje εα_νβ₃ komplexem a neimunoreaguje s a_vpodjednotkou, s β₃ podjednotkou nebo s ostatními integriny.

3. Charakterizace tkáňové distribuce exprese

A. Imunofluorescence s protilátkami proti integrinovému receptorů

Během uzdravování poranění exprimují základní stavby membrány krevních cév různé adhezivní proteiny včetně von Willebrandova faktoru, fibronektinu a fibrinu. Navíc jsou na povrchu kultivovaných buněk hladkého svalstva a endoteliálních buněk exprimovány různé členy integrinové rodiny adhezních receptorů, Viz Cheresh, Proč. Nati. Acad. Sci., USA: 84,6471 (1987); Janat a kol., J. Cell Physiol.: 151,588 (1992); a Cheng a kol., J. Cell Physiol.: 139,275 (1989). Mezi těmito integriny je α_νβ₃, endoteliální buněčný receptor pro von Willebrandův faktor, fibrinogen (fibrin) a fibronektin, jak popisuje Cheresh, Proč. Nati. Acad. Sci., USA: 84, 6471 (1987). Tento integrin iniciuje vápník-dependentní signální cestu vedoucí k migraci endoteliálních buněk, a proto se zdá, že hraje zásadní roli v biologii cévní buňky, jak popisuje Leavelsey a kol., J. Cell Biol.: 121,163 (1993).

K prozkoumání exprese α_νβ₃ během angiogeneze byla od pacientů s jejich souhlasem získána lidská zdravá granulační tkáň nebo sousední normální kůže, která byla promyta 1 ml fosfátového pufrovaného fyziologického roztoku a vložena do O.T.C. media (Tissue Tek.) Tyto tkáně byly zmrazený v kapalném dusíku po dobu 30 až 45 sekund. Ze zmrazených bločků byly na kryostatovém mikrotomu nařezány řezy o tloušíce 6 mikronů, které se postupně barvily imunoperoxidázou s protilátkami specifickými buď pro β₃ integriny (α_νβ₃nebo α_ΙΙόβ₃) nebo β, podrodinu integrinů.

Výsledky barvení normální lidské kůže a zdravé granulační tkáně jsou ukázány na obrázcích IA až ID. Monoklonální protilátky AP3 a

LM534, směrované proti β₃ a β₃ integrinům, byly použity k imunohistochemickým analýzám zmrzených řezů. Experimenty s tkání od čtyřech různých lidských dárců poskytly stejné výsledky. Mikrofotografie jsou ukázány ve zvětšení 300x.

Integrin α_νβ₃ byl hojně exprimován v krevních cévách vgranulační tkáni (obr. 1B), ale nebyl detegovatelný v dermis a epitelu normální kůže stejného dárce (obr. 1A). Naopak integriny β₃byly hojně exprimovány v krevních cévách a stromálních buňkách jak v normální kůži (obr. 1C), tak i v granulační tkáni (obr. 1D) a v bazálních buňkách epitelu, jak již dříve popsal Adamsa kol., Cell: 63,425 (1991).

B. Imunofluorescence s anti-ligandovými protilátkami

Další řezy lidské normální kůže a granulační tkáně připravené viz výše byly také testovány na přítomnost ligandů pro β₃ a β₃ integriny, von Willebrandův faktor a lamininn. Von Willebrandův faktor byl lokalizovaný v krevních cévách v normální kůži (obr. 2A) a granulační tkáni (obr. 2B), zatímco laminin byl lokalizovaný ve všech krevních cévách i v epiteliální základní stavbě membrány u obou tkáňových preparátů.

C. Distribuce anti~aJ3₃ protilátek v nádorové tkáni

Kromě analýz uvedených viz výše byly také testovány biopsie nádorových tkání od lidských pacientů na přítomnost a distribuci α_νβ₃. Tkáně byly připraveny, jak je popsáno v příkladu 1A s tou výjimkou, že byly barveny monoklonální protilátkou LM609 připravenou v Příkladu 2, která je specifická pro integrinový receptorový komplex, α_νβ₃. Navíc nádory byly také připraveny pro mikroskopické histologické analýzy fixací reprezentativních vzorků nádorů ve fixativu Bulins, a to po dobu 8 hodin a byly nařezány na řezy a barveny H&E.

Výsledky imunoperoxidázového barvení nádoru močového měchýře, tračníku, prsu a plic jsou ukázány na obrázcích 3A až 3D. α_νβ₃je hojně exprimován pouze v krevních cévách přítomných ve čtyřech analyzovaných nádorových biopsiích a ne v žádných jiných buňkách přítomných vtkáni.

Výsledky zde popsané tak ukazují, že α_νβ₃ integrinový receptor je selektivně exprimován ve specifických typech tkání, jmenovitě granulovaných, metastazických tkáních a ostatních tkáních, v kterých probíhá angiogeneze a ne v normální tkáni, kde byla zastavena tvorba nových krevních cév. Tyto tkáně jsou proto ideální pro teraputické účely podle předkládaného vynálezu.

4. Identifikace aJ3₃-specifických syntetických peptidú detegovaných stanovením vazby ligand-receptor

Syntetické peptidy připravené v Příkladu 1 byly testovány měřením jejich schopnosti antagonizovat α_νβ₃ a α_ιιόβ₃ receptorovou vazebnou aktivitu v puntíkovaných stanoveních vazby ligand-receptor. Způsob vhodný rpo tyto vazebné studie byl popsán Barbasem a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA: 90, 10003-10007 (1993), Smithem a kol., J. Biol. Chem.: 265,11008-11013 (1990) a Pfaffem a kol., J. Biol. Chem.: 269, 20233-20238 (1994) a tyto práce jsou zde uvedeny jako reference.

Zde je popsán způsob identifikace antagonistů ve stanovení vazby ligand-receptor, ve kterém je receptor imobilizován na pevný nosič a ligand a antagonista jsou rozpustné. Je také popsáno stanovení vazby ligand-receptor, v kterém je ligand imobilizován na pevný nosič a receptor a antagonista jsou rozpustné.

Krátce Tečeno, vybrané purifikované integriny byly odděleně imobilizovány v mikrotitračních jamkách Titertek v koncentraci potahu 50 nanogramů (ng) na jamku. Purifikace receptorů použitých ve stanoveních vazby ligand-receptor jsou v oboru dobře známé a lze je snadno získat způsoby známými osobě obeznámené stechnikou. Po inkubaci trvající 18 hodin při teplotě 4°C byla nespecifická vazebná místa v potahu blokována 10 mg/ml hovězího sérového albuminu (BSA) ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris. Pro použití inhibičních studií byly testovány různé koncentrace vybraných peptidů z Tabulky 1 na schopnost blokovat vazbu ¹²⁵l-vitronektinu nebo ¹²⁵l-fibrinogenu na integrinové receptory, α_νβ₃ a ot_llbp₃. Ačkoliv tyto ligandy vykazují optimální vaznost pro určité integriny, vitronektin pro α_νβ₃ a fibrinogen pro inhibice vazebných studií používajících peptidy k blokování vazby fibrinogenu na druhý receptor umožnila přesné určení množství peptidu v mikromolech (μΜ) nutného k inhibici vazby receptoru na ligand s poloviční maximální hodnotou. Radioaktivně značené ligandy byly použity v koncentracích 1 nM a vazba byla imunologicky testována odděleně s neznačenými syntetickými peptidy.

Po následujících třech hodinách inkubace byl volný ligand odstraněn promýváním a navázaný ligand byl delegován gamma čítačem. Data z těchto stanovení, kde byly vybrané cyklopeptidy uvedené v Tabulce 1 použity k inhibici vazby receptorů a radioaktivně značeného fibrinogenu na odděleně imobilizované α_νβ₃ a α_ι1όβ₃receptory, byla vysoce reprodukovatelná s chybou menší než 11%.

Hodnoty ICgo v mikromolech (IC_K, μΜ) jsou vyjádřeny jako průměr ze dvou naměřených hodnot +/- standardní odchylka, viz Tabulka 2.

Tabulka 2

Peptid číslo:	^aVp3<^IC50^^M)	^ailbP3 (1^50 MM)
62 181	1,96+/-0,62	14,95 +/-7,84
62 184	0,05+/-0,001	0,53+/-0,1
62 185	0,89+/-0,16	100+/-0,001
62 187	0,05+/-0,001	0,26+/-0,056
62 186	57,45+/-7,84	100+/-0,001
62 175	1,05+/-0,07	0,63+/-0,18
62 179	0,4+/-0,21	0,06+/-0,007

Takže RGD-obsahující nebo z RGD odvozené cyklopeptidy 62181, 62184, 62185 a 62187, přičemž každý má jeden D-aminokyselinový zbytek, vykazovaly přednostní inhibici fibrinogenu vázajícího se na α_νβ₃receptor, jak bylo změřeno nízkou koncentrací peptidu požadovanou ke snížení inhibice na polovinu maximální hodnoty, ve srovnání sreceptorem α_ΙΙόβ₃. Naopak ostatní RGD-obsahující nebo z RGD odvozené cyklopeptidy, 62186, 62175 a 62179 buď nebyly tak účinné v blokování fibrinogenu vázajícího se na α_νβ₃ nebo vykazovaly přednostní inhibici fibrinogenu vázajícího se na α_ΙΙόβ₃ ve srovnání s receptorem α_νβ₃. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky publikovanými v práci Pfaffa a kol., J. Biol. Chem.: 269, 20233-20238 (1994), v které cyklopeptid RGDFV (kde F znamená D-aminokyselinový zbytek) specificky inhiboval vazbu fibrinogenu na integrin α_νβ₃ a ne na α„&β₃ nebo α₅β_} infegriny. Podobné inhibice při vazebných stanoveních bylo dosaženo s linearizovanými peptidy majícími nebo postrádajícími motiv RGD, tedy sekvence pocházející z a_vpodjednotky receptorů, a_llb podjednotky receptorů nebo aminokyselinové sekvence vitronektínového ligandu. Sekvence lineárních peptidů 62880 (aminokyselinové zbytky 35-49 pocházející z VN), 62411 (aminokyselinové zbytky 676-687 pocházející z a_v), 62503 (aminokyselinové zbytky 655-667 pocházející z a_v) a 62502 (aminokyselinové zbytky 296-306 pocházející z a_v) jsou uvedeny v Tabulce 1, Každý z těchto peptidů byl použit v samostaném stanovení inhibice vazby buď vitronektinu (VN) nebo fibrinogenu (FG) buď na a_llbp₃ nebo na α_νβ₃. Hodnoty IC₅₀v mikromolech (μΜ) z každého stanovení pro každý experiment jsou uvedeny v Tabulce 3.

Tabulka 3

Peptid číslo:	^aiibP3 ('Cgo μΜ)	^avp3 (^\|C50 μ^Μ>
	FG	VN	FG	VN
62 880	4,2	0,98	<0,1	0,5
62 411	>100	>100	>100	>100
62 503	>100	>100	>100	>100
62 502	90	5	>100	>100

Výsledky inhibice ve stanoveních vazby ligandu na vybrané integrinové receptory s linearizovanými peptidy ukazují, že pouze peptid 62880 byl účinný při inhibici s poloviční maximální hodnotou vazby buď FG nebo VN na α_νβ₃, což bylo změřeno nižší koncentrací peptidů požadovanou k inhibici na polovinu maximální hodnoty ve srovnání s receptorem α_νβ₃. Žádný z dalších linearlzovaných peptidů nebyl účinný při inhibici vazby ligandu na α_νβ₃, i když peptid 62502 byl účinný při blokování vazby VN na α_1)όβ₃.

Takže stanovení vazby ligand-receptor zde popsané lze použít k testování jak cyklických tak i linearizovaných syntetických peptidů, které vykazují selektivní specifitu k určitému integrinovému receptoru, konkrétně α_νβ₃, použité jako antagonisty vitronektínového receptoru (α_νβ₃) podle předkládaného vynálezu.

5. Charakterizace kuřecí chorioallantoidní membrány (CAM), která nebyla podrobena žádnému působení

A. Příprava CAM preparátů

Angiogenezi lze indukovat na kuřecí chorioallantoidní membráně (CAM) poté. co normální embryonická angiogeneze vedla k vytvoření zralých krevních cév. Ukázalo se, že angiogeneze je indukována v odpovědi na specifické cytokiny nebo nádorové fragmenty, jak popsal Leibovich a kol.. Nátuře: 329,630 (1987) a Ausprunk a kol., Am. J. Pathol.: 79, 597 (1975). CAM preparáty byly připraveny z kuřecích embryí a následně byly podrobeny postupně indukci angiogeneze a její inhibici, jak je popsáno v Příkladu 6 a 7. 10 dní stará kuřecí embrya byla získána od Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) a inkubována při teplotě 37 °C a 60% vlhkosti. Na konci vejce byla skrz skořápku udělána malá dírka přímo přes vzduchový vak za použití malých vrtáčků (Dremel, Division of Emerson Electric Co. Racine Wl). Druhá dírka byla vyvrtána na boku vejce v oblasti nemající embryonální krevní cévy určené dříve prosvícením vejce. Na původní dírku byl aplikován negativní tlak, což vedlo k vytlačení CAM (chorioallantoidní membrány) ven z membrány skořápky a vytvoření falešného vzduchového vaku přes CAM. Skrz skořápku přes vyjmutou CAM byl vyříznut otvor o ploše 1,0 cm x 1,0 cm za použití malého modelu mlecího kola (Dremel). Malý otvor umožnil přímý přístup do vlastní CAM.

Výsledný preparát CAM byl pak použit buď k 6 dní trvající embryogenezi, přičemž toto stadium se vyznačovalo aktivní neovaskularizací, bez dalšího působení na CAM zobrazující model použitý k vyhodnocení účinků na embryonální neovaskularizaci, nebo byl použít k 10 dní trvající embryogenezi, kde angiogeneze poklesla. Tento druhý peparát byl tak použit v předkládaném vynálezu k indukci obnovené angiogeneze v odpovědi na působení cytokinem nebo kontaktem s nádorem, jak popisuje Příklad ó.

B. Histologie CAM preparátů

K analýze mikroskopické struktury kuřecích embryonálních CAM a/nebo lidských nádorů vyjmutých z kuřecích embryí, jak popisuje Příklad 8, byly CAM preparáty a nádory připraveny tak, aby mohly být zmrazený a nařezány na řezy, jak popisuje příklad 3A. 6 mikronů silné řezy byly nařezány ze zmrazených bločků na kryostatovém mikrotomu, aby pak byly podrobeny imunofluorescenční analýze.

Obr. 4 ukazuje typický mikrograf oblasti postrádající krevní cévy v 10 dní starém CAM preparátu nepodrobeném působení. Protože angiogeneze v CAM systému v tomto stadiu embryogeneze poklesla, systém je v předkládaném vynálezu vhodný ke stimulaci produkce nové sítě cév z již existujících cév ze sousedních oblastí do oblastí CAM současně postrádajících jakékoliv cévy.

C. Integrinové profily v CAM delegované imunofluorescencí

Aby bylo možno vidět distribuci integrinových receptorů přítomných v CAM tkáních, byly zmrazené řezy o tlouštce 6 mikronů z nádorové tkáně i kuřecích embryonálních CAM tkání fixovány v acetonu po dobu 30 sekund a barveny imunofluorescenčne Ί0μg/ml mAb CSAT, monoklonální protilátkou specifickou pro p! podjednotku integrinů, jak popisuje Buck a kol., J. Cell Biol.: 107, 2351 (1988), a tím vhodnou pro kontroly, nebo LM609 připravenou v Příkladu 2. Primární barvení následovalo barvení kozím anti-myším rhodaminem ve zředění 1:250 značeným sekundární protilátkou (Tágo) k umožnění detekce primárního imunoreakčního produktu. Řezy pak byly analyzovány pomocí Zeiss imunofluorescenčního kombinovaného mikroskopu.

Výsledky imunofluorescenční analýzy ukazují, že zralé krevní cévy přítomné v 10 dní starém kuřecím embryu nepodrobeném působení exprimují β₁ podjednotku integrinů (obr. 5A). Na rozdíl od řezu tkáně ukázaného na obr. 5A nebyla u dalšího řezu zaznamenána žádná ímunoreaktivita sLM609 (obr. 5B), Takže integrin α_νβ₃ delegovaný LM609 protilátkou nebyl zralými krevními cévami přítomnými v 10 dní starém kuřecím embryu nepodrobeném působení aktivně exprimován. Jak je ukázáno na modelu CAM a v následujících příkladech, zatímco krevní cévy v normální embryogenezi procházejí novým růstem nebo jsou indukovány cytokiny nebo nádory, krevní cévy exprimují α_νβ₃. Ovšem po následující aktivní neovaskularizaci, poté, co cévy byly zastaveny ve vývoji, exprese α_νβ₃ klesá na úroveň nedetegovatelnou imunofluorescenční analýzou. Touto regulací exprese α_νβ₃ v krevních cévách prochází angiogeneze v kontrastu stím, že exprese ve zralých cévách chybí, což poskytuje jedinečnou možnost podle předkládaného vynálezu kontrolovat a inhibovat angiogenezí, jak je ukázáno v následujících příkladech, kde modely byly vytvořeny za použití stanovení angiogeneze v CAM systému.

6. Stanovení angiogeneze s využitím CAM

a. Angiogeneze indukovaná růstovými faktory

Ukázalo se že angiogeneze je indukována cytokiny nebo růstovými faktory, viz reference v Příkladu 5A. Ve zde popsaných experimentech byla angiogeneze v CAM preparátu popsaném v Příkladu 5 indukována růstovými faktory, které byly podány místně do CAM krevních cév, jakje popisováno zde.

Angiogeneze byla indukována vložením Whatmanova filtračního kroužku o rozměrech 5 mm x 5 mm (Whatman Filter páper No. 1) nasyceného Hanksovým roztokem s vyváženými solemi - Hanks Baianced Salt Solution (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) nebo HBSS obsahujícím Ί50 ng/ml rekombinantního základního fibroblastového růstového faktoru (pFGF) (Genzyme, Cambridge, MA) na CAM 10 dní starého kuřecího embrya v oblasti nemající krevné cévy a otvor byl později zalepen páskou. V dalším stanovení bylo při indukci růstu krevních cév použité množství 125 ng/ml pFGF také účinné. Angiogeneze byla sledována fotomikroskopicky po 72 hodinách. CAM byly zmrazený a kryostatové řezy o tlouštce 6 gm byly fixovány acetonem a barveny imunofluorescenčně, jak je popsáno v Příkladu 5C 10 gg/ml buďanti-p₁ monoklonální protilátkou CSAT nebo LM609.

Imunofluorescenční mikrofotografie na obr. 5C ukazuje zesílenou expresi α_νβ₃ během angiogeneze indukované βFGF v kuřecím CAM v kontrastu s absencí exprese α_νβ₃ v kuřecím CAM nepodrobeném působení, jak ukazuje obr. 5B. α_νβ₃ byl snadno detegovatelný v mnoha (75 % až 80%) cévách v CAM preparátech podrobených působení βΡΘΕ. Navíc exprese integrinů β₁ se nelišila od výsledku v CAM nepodrobeném působení a β_Ί byl ve stimulovaných krevních cévách také snadno detegovatelný.

Pak byla kvantifikována relativní exprese α_νβ₃ a β_Ί integrinů během angiogeneze indukované βΕΘΕ, a to laserovou konfokální analýzou CAM kryostatových řezů. Barvené řezy byly poté analyzovány Zeiss laserovým konfokálním mikroskopem. Z náhodných polí bylo vybráno 25 cév barvených LM609 a 15 barvených CSAT (průměrná velikost 1200 mm², rozsah 350 až 3500 mm²) a byla v libovolných jednotkách měřena průměrná rhodaminová fluorescence pro každou cévu na jednotku plochy pomocí laserové konfokální analýzy. Data jsou vyjádřena v libovolných jednotkách jako průměr intenzity fluorescence cév +/- standardní odchylka (SO).

Výsledky vynesené na obr. 6 ukazují, že barvení α_νβ₃ bylo významně zesíleno (4x více) u CAM podrobených působení βΡΘΡ, jak bylo určeno Wilcoxonovým testem (p<0,0001), zatímco barvení β₁ se zásadně nelišilo od působení βΡΘΕ.

Stanovení využívající CAM bylo dále použito k vyzkoušení účinku jiného silného induktoru angiogeneze, faktoru-a nekrózy tkáně (tumor necrosis factor-alpha; TNF-a) na expresi integrinů β₁ a β₃. Ukázalo se, že filtrační kroužky napuštěné buď βΡΘΕ nebo TNFa a umístěné na CAM preparáty z 10 dní starých embryí zesilují lokální angiogenezí po 72 hodinách.

Výsledky jsou ukázány na mikrofotografiích CAM preparátů buď nepodrobených působení (obr. 7 A), podrobených působení pFGF (obr. 7B) nebo podrobených působení TNFa (obr. 7C). Krevní cévy jsou zjevně patrné u preparátů podrobených působení pFGF i TNFa, ale nejsou přítomné v preparátech nepodrobených působení. Takže místní aplikace růstového faktoru/cytokinu vedla k indukci angiogeneze ze zralých cév v sousední oblasti do oblasti původně nemající krevní cévy. Z hlediska krevních cév indukovaných pFGF a doprovodné exprese α_νβ₃, jak je ukázáno na obr. 5C, vede působení TNFa ke srovnatelným aktivitám.

Tato zjištění ukazují, že jak u lidí, tak i u kuřat krevní cévy zahrnuté v angiogenezi vykazují zesílenou exprsei α_νβ₃. V souladu s tím lze indukovat expresi α_νβ₃ v kultivovaných endoteliálních buňkách různými cytokiny in vitro, jak popisuje Janat a kol., J. Cell Physiol.: 151, 588 (1992); Enenstein a kol., Exp. Cell Res.: 203,499 (1992) a Swerlick a kol., J. Invest. Derm.: 99,715(1993).

Účinek protilátky a peptidických inhibitorů na angiogenezi indukovanou růstovým faktorem je předložen v Příkladech 7A a 7B.

B. Embryonální angiogeneze

CAM preparátem použitým k vyhodnocení účinku inhibitorů angiogeneze na přirozenou tvorbu embryonální neovaskulatury bylo 6 dní staré kuřecí embryo popsané viz dříve. V tomto stadiu vývoje podstupují krevní cévy růst de nuovo a tak poskytují vhodný systém pro určení, jestli se α_νβ₃ účastní embryonální angiogeneze. Systém CAM byl připraven podle popisu viz výše s výjimkou, že stanovení bylo prováděno spíše v šestém dni stáří embrya než v desátém. Účinek působení protilátek a peptidů podle předkládaného vynálezu na embryonální angiogenezi je prezentován v Příkladu 7C.

C. Angiogeneze indukovaná nádory

Za účelem prozkoumání role α_νβ₃ v angiogenezi indukované nádorem byly v CAM stanovení použity různé a_vp₃-negativní lidské melanomové a nádorové fragmenty, kde CAM předtím rostly a byly vyizolovány z CAM 17 dní starého embrya, jak popisuje Brooks a kol., J. Cell Biol.: 122,1351 (1993) a jak je popsáno zde. Fragmenty indukovaly rozsáhlou neovaskularizaci pouze v přítomnosti samotného pufru.

Angiogeneze byla ve stanovení v CAM systému indukována přímým připojením nádorového fragmentu na CAM. Příprava kuřecího embryonálního preparátu CAM byla identická s postupem popsaným viz výše. Místo filtračního papírového kroužku bylo na CAM v oblasti původně nemající krevní cévy umístěno 50 až 55 mg vážícího fragmentu jednoho z nádorů: lidského melanomového nádoru M21-L, lidského plicního rakovinného nádoru UCLAP-3, lidské pankreatické rakovinné buněčné linie FG (Cheresh a kol.. Cell: 58, 945-953, 1989) nebo lidské hrtanové rakovinné buněčné linie HEp3, což jsou všechno a^₃-negativní nádory.

M21-L lidská melanomová buněčná linie, UCLAP-3 lidská plicní rakovinná buněčná linie nebo Hep3 lidská hrtanová rakovinná buněčná linie, všechny a_vp₃-negatlvní, byly pužity k růstu pevných lidských nádorů na CAM preparátech z kuřecích embryí. Jednotlivé buněčné suspenze o počtu buněk 8 x 10⁶ M21 -L, UCLAP-3 a FB nebo 5 x 10⁵ HEp3 buněk byly nejprve naneseny na CAM preparáty v celkovém objemu 30 mikrolitrů (μΙ) sterilního HBSS. Otvory byly zalepeny páskou a embrya byla inkubována po dobu 7 dní, aby se mohl projevit růst lézí lidského nádoru. Na konci doby 7 dní bylo embryo staré již 17 dní a nádory byly z CAM vyjmuty a očištěny od okolní CAM tkáně. Nádory byly nařezány na fragmenty vážící 50 až 55 mg a připraveny tak k použití bud ve stanovení angiogeneze nebo stanovení nádorového růstu, Nádorové fragmenty byly umístěny na novou sadu CAM preparátů 10 dní starého kuřecího embrya, jak je popsáno v Příkladu 6A, v oblasti nemající krevní cévy.

Nádory, které in vivo vyrostly na kuřecích embryonálních preparátech, byly za účelem stanovení α_νβ₃ exprese barveny mAbLM609, jak popisuje Příklad 3A. Nebylo pozorováno žádné specifické barvení nádorových buněk, které by indikovalo, že chybí exprese α_νβ₃.

Nádorové preparáty CAM pak nyly postupně podrobeny působení podle Příkladů 7D a 7E, aby se změřily účinky protilátek a peptidů na angiogenezi indukovanou nádorem. Nádorové preparáty CAM byly také podrobeny působení podle Příkladů 8, 9 a 12 za účelem měření účinků protilátek a peptidů na potlačení nádorů a apoptózy angiogenních krevních cév a vaskulárních buněk,

7. Inhibice angiogeneze měřená v CAM stanovení

A. Inhibice angiogeneze indukované růstovým faktorem místní aplikací inhibitorů

1) Působení monoklonálních protilátek

Aby bylo možno určit, zdali α_νβ₃ hraje aktivní roli v angiogenezi, byly filtrační kroužky nasycené βΕΘΕ nebo TNFot umístěny na preparáty CAM, a pak byly monoklonální protilátky (také nazývané jako mAb)

LM609 (specifická pro α_νβ₃), CSAT (specifická pro β_}) nebo P3G2 (specifická pro α_νβ₅) přidány k preparátu.

Angiogeneze byla na CAM preparátech pocházejících z 10 dní starých kuřecích embryí indukována filtračními kroužky nasycenými βFGF. Kroužky pak byly podrobeny působení 50 ml HBSS obsahujícího 25 mg mAb v celkovém objemu 25 μΙ sterilního HBSS v 0, 24 a 48 hodinách. Po uplynutí 72 hodin byly CAM preparáty odebrány, umístěny v Petriho miskách o průměru 35 mm a jednou promyty 1 ml fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem. Spodní strana filtračního papíru a CAM tkáně pak byla analyzována pod stereomikroskopem Olympus se dvěma okuláry s dvojím slepým pokusem. Inhibice angiogeneze byla pokládána za významnou, když CAM preparáty vykazovaly >50% snížení pronikání krevních cév z CAM přímo pod kroužek. Experimenty byly opakovány 4x pro každou protilátku, s 6 až 7 embryi podle podmínek.

Výsledky účinků působení mAb na angiognezi indukovanou £FGF jsou uvedeny na obrázcích 8A až 8B. Preparát CAM nepodrobený působení nemající krevní cévy je ukázán na obr. 8A pro srovnání s indukcí krevních cév βΕ&Ε ukázanou na obr. 8B a účinků mAb na obrázcích 8C až 8E. Asi 75% těchto preparátů CAM podrobených působení mAb LM609 vykazovalo >50% inhibice angiogeneze, jak je ukázáno na obr. 8E a u mnoha z nich se zdá, že postrádají pronikání cév, Naopak kontrola s pufrem (obr. 8C) a P3G2 (obr. 8D) souhlasně ukazuje rozsáhlou vaskularizaci.

Identické výsledky byly získány při indukci angiogeneze TNFa. K prozkoumání účinků stejných protilátek na již dříve existující zralé krevní cévy v normálním cévním vývoji sousedící s oblastmi nemajícími cévy byly filtrační kroužky nasycené mAb umístěny na vaskularizované oblasti CAM preparátů pocházejících z 10 dní starých embryí bez místní aplikace cytokinů. Žádná ze tří mAb neměla vliv na již existující cévy, což bylo určeno vizualizací pod stereomikroskopem. Takže mAb LM609 selektivně inhibovala pouze růst nových krevních cév a neúčinkovala na zralé krevní cévy v sousedící oblasti. Stejný účinek byl pozorován při aplikaci syntetických peptidú aplikovaných buď místně nebo íntravenózně, jak popisují Příklady 7A2) a 7E2).

2) Působení syntetických peptidú

CAM stanovení podle předkládaného vynálezu bylo také prováděno se syntetickými peptidy podle předkládaného vynálezu k určení účinku cyklických a linearizovaných peptidú na angiogenezi indukovanou růstovým faktorem. Peptidy byly připraveny podle popisu v Příkladu 1 a v celkovém objemu 25 μΙ sterilního HBSSS bylo přítomno 80 μg peptidú. Peptidický roztok byl ihned nanesen na preparát CAM, a poté opět po 24 a 48 hodinách. Po uplynutí 72 hodin byl filtrační papír a okolí CAM tkáně rozděleny na kousky a vizualizovány podle popisu viz výše.

Výsledky z tohoto stanovení byly podobné těm z obrázků 9A až 9C, jak popisuje Příklad 7E2), kde byly syntetivké peptidy Íntravenózně injikovány do krevních cév indukovaných nádorem. Zde, s kontrolním peptidem 62186 zůstaly krevní cévy indukované pFGF neporušené, jak ukazuje obr. 9A. Naopak byl-li na filtr nanesen cyklický RGD peptid 62814, tvorba krevních cév byla inhibována a zůstala oblast nemající novou vaskulaturu. Tento účinek byl podobný jevu ukázánému na obr. 9B, jak popisuje Příklad 7E2) viz níže. Navíc, jak je také ukázáno na obr.

9C pro intravenózně injikované peptidy, v oblastech, kde již byly přítomné zralé krevní cévy, vzdálených od umístění filtrů nasycených růstovým faktorem, nebyl pozorován žádný účinek vyvolaný místním působením syntetických peptidú na tyto vzdálené cévy. Inhibiční aktivita těchto peptidú na angiogenezi je tak omezena na oblasti angiogeneze indukované růstovými faktor a nemá vliv na sousední již existující zralé cévy nebo vede ke škodlivé cytotoxicitě v okolní oblasti.

Podobná stanovení byla prováděna s ostatními syntetickými peptidy připravenými v Příkladu 1 a uvedené v Tabulce 1.

B. Inhibice angiogeneze indukované růstovým faktorem intravenózní aplikací inhibitorů

1) Působení monoklonálních protilátek

Účinek monoklonálních protilátek intravenózně injikovaných do CAM preparátů na angiogenezi indukovanou růstovým faktorem byl pro použití předkládaného vynálezu také vyhodnocován.

Příprava kuřecích embryonálních preparátů CAM pro intravenózní injikace byla v zásadě stejná jako v Příkladu 7A jen s některými modifikacemi. Během prodlužování byly vybrány vyčnívající krevní cévy a na skořápku vejce byly udělány značky označující jejich pozice. Ve skořápce byly vyvrtány dírky a CAM byly vytlačeny ven a filtrační papíry nasycené pFGF byly vloženy na CAM, jak je popsáno viz výše. Otvory byly uzavřeny sterilní páskou a embrya byla umístěna v inkubátoru. O 24 hodin později bylo na boční straně skořápky vejce opatrně vyříznuto druhé malé okénko přímo přes dříve vybrané vyčnívající krevní cévy. Vnější skořápka vejce byla opatrně odstraněna a zůstaly intaktní embryonální membrány. Membrána skořápky byla zprůhledněna malou kapkou minerálního oleje (Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT), což umožnilo snadno vizualizovat krevní cévy. Purifikované sterilní mAB nebo syntetické polypeptidy (popsané viz níže) byly jedenkrát přímo inokulovány do krevních cév za použití jehly kalibru 30 v dávce 200 gg IgG na embryo v celkovém objemu 100 μΙ sterilního PBS. Otvory byly uzavřeny páskou a embrya byla inkubována po dobu 72 hodin. Filtrační kroužky a okolní CAM tkáně byly analyzovány, jak bylo popsáno viz výše.

K určení lokalizace LM609 mAb v CAM tkáních nebo nádorových tkáních, jak je ukázáno zde a v následujících příkladech, které byly již dříve intravenózně inokulovány LM609, byly fixované řezy blokovány 2,5% BSA v HBSS pod obu 1 hodiny za laboratorní teploty a následovalo barvení roztoku kozího anti-myšího rhodaminu ve zředění 1:250 značeného sekundární protilátkou (Tágo). Řezy pak byly analyzovány za pomocí Zeiss imunofluorescenčního kombinovaného mikroskopu.

Výsledky intravenózního působení protilátky na krevní cévy v CAM preparátu indukované pFGF jsou uvedeny na obr. 10A až 10C. Na obr. 10A je ukázána amgiogeneze indukovaná v důsledku působení pFGF. Při intravenózním působení mAb P3G2, anti-a_vp₅ protilátky, nebyly pozorovány žádné změny v přítomnosti vaskulatury indukované pFGF, jak je ukázáno na obr. 10B. Naopak působení LM609, anti-a_vp₃protilátky, na angiogenezi indukovanou pFGF v CAM preparátu vedlo ke kompletní inhibicí růstu nových cév do oblasti filtru, jak je ukázáno na obr. 10C. Inhibiční účinek na angiogenezi tak vyplývá z inhibice a_vp₅-receptorové aktivity protilátkou LM609 specifickou proti α_νβ₃. Prptože blokování α_νβ₅ neinhibuje tvorbu neovaskulatury v místě CAM filtru, α_νβ₅ tak není pro růst nových krevních cév ve srovnání s α_νβ₃esenciální.

2) Působení syntetických peptidú

Syntetické peptidy připravené v Příkladu 1 byly odděleně intravenózně injikovány do krevních cév indukovaných růstovým faktorem v CAM preparátu, jak je popsáno viz výše. Účinek peptidú na životaschopnost cév byl určen podobně.

C. Inhibice embryonální angiogeneze místní aplikací 1) Působení monoklonálních protilátek

Aby bylo možno určit, zdali se α_νβ₃ účastní embryonální angiogeneze, byl zkoumán účinek LM609 na de nuovo růst krevních cév v CAM preparátech 6 dní starých embryí, přičemž toto stadium se vyznačovalo aktivní neovaskularizací, jak je popsáno v Příkladu 5A. CAM stanovení bylo připraveno podle popisu v Příkladu 6C s následnou místní aplikací kroužků nasycených mAb umístěných na CAM ó dní starých embryí bez přítomnosti cytokinů. Po 3 dnech byly CAM vyjmuty a vyfotografovány. Každý experiment zahrnoval ó embryí na skupinu a byl 2x opakován.

Protilátka LM609 (obr. 11C), ale ne CSAT (obr. 11 A) nebo P3G2 (obr. 11B), zamezila za těchto podmínek růstu cév; to znamená, že α_νβ₃hraje významnou roli v embryonální neovaskularizací, která byla nezávislá na přidaných růstových faktorech určených k indukci angiogeneze.

2) Působenísyntetických peptidů

Syntetické peptidy připravené v Příkladu 1 byly odděleně přidány do embryonálních CAM preparátů připravených viz výše a popsaných v Příkladu 5A2), a to buď místní aplikací do CAM nebo intravenózně do krevních cév. Účinek peptidů na životaschopnost cév byl vyhodnocen podobně.

D. Inhibice angiogeneze indukované nádorem místní aplikací 1) Působení monoklonálních protilátek

Kromě stanovení angiogeneze popsaných viz výše, kde byly vyhodnoceny účinky αητι-α_νβ₃ antagonistů, LM609 a peptidů 62181, 62184, 62185, 62187 a 62880 na embryonální angiogenezi, byla také prozkoumána role α_νβ₃ v angiogenezi indukované nádorem. Jako induktor byly použity o^-negativní lidské M21-L melanomové fragmenty vypěstované a izolované již dříve z CAM 17 dní starého kuřecího embrya. Fragmenty byly připraveny podle Příkladu 6C.

Jak popisuje Příklad 7A1), byly mAb odděleně místně aplikovány do nádorových fragmentů v koncentraci 25 μg v 25 μΙ HBSS a otvory pak byly uzavřeny páskou. Po 24 a 48 hodinách byly opět stejným způsobem přidány mAb. Po 72 hodinách byly analyzovány nádory a okolní CAM tkáně, jak popisuje Příklad 7A1).

Jak popisuje Příklad 6C, nádory byly nejprve připraveny transplantací kultivovaných M21-L buněk, které neexprimují integrin α_νβ₃, jak popisuje Felding-Haberman a kol., J. Clin. Invest.: 89, 2018 (1992), do CAM preparátů 10 dní starých kuřecích embryí. Tyto a^₃-negativní fragmenty indukovaly rozsáhlou neovaskularizaci pouze v přítomnosti samotného pufru nebo mAb CSAT (anti-pý nebo P3G2 (αηΐΊ~α_νβ₅). Naopak mAb LM609 (αηΐί-α_νβ₃) odstranila pronikání většiny cév do nádoru a okolí CAM.

Aby mohl být kvantifikován účinek mAB na angiogenezi indukovanou nádorem, byly pod stereomikroskopem dvěma osobami spočítány krevní cévy vstupující do nádoru v ohniskové rovině CAM s dvojím slepým pokusem. Každý sloupec dat uvedený na obr. 12 reprezentuje průměrný počet cév +/- SO z 12 CAM preparátů v každé skupině reprezentující zdvojené experimenty.

Tato kvantitativní analýza ukázala trojnásobné snížení počtu cév vstupujících do nádorů podrobených působení mAb LM609 ve srovnání s nádory podrobenými působení pufru nebo ostatních mAb, P3C2 nebo CSAT (P<0,0001), určeno Wilcoxonovým testem, Fakt, že nádory M21-L neexprimují α_νβ₃, naznačuje, že mAb LM609 inhibuje angiogenezi přímým působením na krevní cévy než na nádorové buňky. Tyto výsledky odpovídají histologické distribuci α_νβ₃ v biopsiích nádorové tkáně ukázaných na obr. 3A až 3D, kde byla distribuce α_νβ₃omezena na krevní cévy v nádoru a ne na nádorové buňky,

2) Působení syntetických peptidů

Syntetické peptidy připravené v Příkladu 1 vyly místně aplikovány do systému pro CAM stanovení, do CAM s angiogenezi indukovanou nádorem, jak je popsáno viz výše. Účinek peptidů na životaschopnost cév byl hodnocen podobně.

E. Inhibice angiogeneze indukované nádorem intravenózní aplikací

1) Působení monoklonálních protilátek

Krevní cévy indukované nádorem připravené podle popisu v Příkladu 7D1) byly také podrobeny působení mAb aplikovaných intravenózní injekcí. Nádory byly umístěny na CAM preparáty podle popisu v Příkladu 7D1) a otvory byly uzavřeny páskou. Po 24 hodinách bylo 200 μg purifikovaných mAb inokulováno jednou intravenozně do krevních cév kuřecího embrya, jak bylo popsáno dříve. Kuřecí embrya pak byla inkubována po dobu 7 dní. Rozsah angiogeneze byl pak pozorován podle popisu uvedeného viz výše. Jak popisuje Příklaf 8 víz níže, po této době byly nádory vyjmuty a určena jejich hmotnost za účelem určení účinku protilátky na růst nádoru nebo potlačení jeho růstu.

2) Působení syntetických peptidů

Byly také určeny účinky peptidů působících na vaskulaturu indukovanou nádorem v systému CAM. Preparáty CAM-nádor byly použity podle popisu uvedeného viz výše s tou výjimkou, že místo intravenózní injekce mAb byly do viditelných krevních cév jednotlivě injikovány syntetické peptidy připravené v Příkladu 1 a v Příkladu 7A2).

Výsledky CAM stanovení s cyklopeptidem 66203 obsahujícím HCl sůl a kontrolním peptidem 62186 jsou uvedeny na obr. 9A až 9C. Na obr. 9A nemělo působení kontrolním peptidem vliv na značně rozrostlé krevní cévy, které byly indukovány působením nádoru k růstu do oblasti CAM původně nemající krevní cévy. Naopak byl-li aplikován cyklický RCD peptid 66203, antagonista α_νβ₃, na filtr, tvorba krevních cév byla inhibována a zůstala oblast nemající novou vaskulaturu, jak je vidět na obr. 9B. Inhibiční účinek peptidu obsahujícího RGD byl specifický a byl lokalizován tam, kde chyběly škodlivé účinky na cévy v sousedství místa nádoru. Takže na obr. 9C, v případě intravenózní injikace inhibičních peptidů do systému CAM, nebyl pozorován žádný účinek na již dříve existující zralé cévy v CAM v oblastech ještě vzdálených od místa nádoru. Již dříve existující cévy v tomto místě nebyly zasáhnuty vlivem inhibičního peptidů proudícím v těchto cévách, ačkoliv generování nových cév z těchto již dříve existujících cév do nádoru bylo inhibováno. Takže syntetické peptidy zahrnující 66203 a 62184, které již dříve stanovení ligand-recepfor v Příkladu 4 prokázalo jako antagonisty α_νβ₃, se nyní projevily jako inhibitory angiogeneze, přičemž tato inhibice je omezená na cévy ve vývoji a ne ne již dříve existující cévy. Navíc intravenózní infúze peptidů nevede k žádné škodlivé cytotoxicitě na sousedící oblast, jak je vidět z intaktní vaskulatury na obr. 9C.

Podobná stanovení byla provedena i s ostatními syntetickými peptidy připravenými v Příkladu 1 a uvedenými v Tabulce 1.

8. Inhibice růstu nádorové tkáně pomocí antagonistů α_νβ₃ a měřeno pomocí CAM stanovení

Jak je popsáno v Příkladu 7D1), kromě vizuálního stanovení účinku αητί~α_νβ₃ antagonistů na angiogenezi indukovanou růstovým faktorem nebo nádorem, byl účinek těchto antagonistů také určován měřením jakýchkoliv změn hmotnosti nádoru podrobeného působení. Pro tuto analýzu byl připraven CAM systém s angiogenezi indukovanou nádorem, jak popisuje Příklad 6C a 7D. Na konci sedmého dne inkubační periody byly výsledné nádory vyjmuty z CAM preparátů a očíšyěny od zbytkové CAM tkáně, promyty 1 ml fosforečnanem pufrovaným fyziologickým roztokem a byly určeny vlhké hmotnosti každého nádoru.

Navíc příprava nádoru pro mikroskopickou histologickou analýzu zahrnovala fixaci reprezentativních vzorků nádorů ve fixativu Bulins podobu 8 hodin a zapuštění v parafínu. Byla nařezána série řezů a barvena hmatoxylinem a eosinem (H&E) pro mikroskopickou analýzu. Gladson a kol., J. Clin. Invest.: 88,1924 (1991). Řezy byly vytografovány kombinovaným mikroskopem Olympus při zvětšení250x.

A. Místní aplikace

Výsledky hmotností typických lidských melanomových nádorů (M21-L) vyplývající z místní aplikace kontrolního pufru (HBSS), P3G2 (anti-a_vp₅) nebo LM609 (anti~ot_vp₃) jsou uvedeny v Tabulce 4. Pro každý experiment bylo vyhodnoceno množství embryí, s průměrnou hmotností nádoru v mg, přičemž pro každé byla hodnota vypočtená s SO průměru, jakje uvedeno na konci tabulky.

Tabulka 4

Číslo embrya	Působení mAb	Hmotnost nádoru (mg)
	HBSS
1		108
2		152
3		216
4		270
5		109
6		174

	P3G2
1		134
2		144
3		408
4		157
5		198
6		102
7		124
8		99
	LM609
1		24
2		135
3		17
4		27
5		35
6		68
7		48
8		59
Působení mAb	Průměrná hmotnost nádoru (mg)
kontrola HBSS	172 +/-26
P3G2	171+/-36
LM609	52+/-13

Vystavení aJ3₃~negativního lidského melanomového nádoru ve stanovení v CAM systému působení LM609 způsobilo pokles průměrné hmotnosti nádoru nepodrobeného působení z 172 mg +/- 26 na 52 mg +/- 13. Protilátka P3G2 neměla na hmotnost nádoru vliv. Takže blokování receptoru α_νβ₃ místní aplikací aJ3₃-specifické protilátky LM609 vedlo ke snížení hmoty nádoru spolu s inhibici angiogeneze Jak je uvedeno v předchozích příkladech. Průměr nádoru změřený po působení P3G2 byl přibližně 8 mm až 1 cm v průměru. Naopak nádory podrobené působení LM6Q9 měly průměrně 2 až 3 mm v průměru.

Zmrazené Fezy těchto nádorů odhalily intaktní nádorovou cytoarchitekturu nádoru vystaveného působení P3G2 v kontrastu s nádorem vystaveným působení LM609, který ji postrádal nebo měl organizovanou buněčnou strukturu. Aktivita receptoru α_νβ₃ je tedy zásadní pro a^₃-negativní nádor k udržení jeho hmoty vyživované vyvíjející se neovaskulaturou exprimující α_νβ₃. Blokování α_νβ₃antagonistou α_νβ₃ podle předkládaného vynálezu vede k inhibici angiogeneze v nádoru a nakonec vede ke snížení hmoty nádoru.

B. Intravenózníaplikace

Výsledky hmotností typického rakovinného nádoru (UCLAP-3) vypývající z intravenózní aplikace kontrolního pufru (PBS, fosforečnanem pufrovaného fyziologického roztoku), CSAT (anti-β^ nebo LM609 (antl-aJ5₃) jsou uvedeny v Tabulce 5. Pro každý experiment bylo vyhodnoceno množství embryí, s průměrnou hmotností nádoru v mg, přičemž pro každé byla hodnota vypočtená s SO průměru, jak je uvedeno na konci tabulky.

Tabulka 5

Číslo embrya	Působení mAb	Hmotnost nádoru (mg)
	PBS
1		101
2		80
3		67
4		90
	CSAT
1		151
2		92
3		168
4		61
5		70
	LM609
1		16
2		54
3		30
4		20
5		37
6		39
7		12
Působení mAb	Průměrná hmotnost nádoru (mg)
Kontrola PBS	85+/-7
CSAT	108 +/-22
LM609	30+/-6

Vystavení a_vp₃-negativníbo lidského melanomového nádoru ve stanovení v CAM systému působení LM609 způsobilo pokles průměrné hmotnosti nádoru nepodrobeného působení z 85 mg +/- 7 na 30 mg +/- 6. Protilátka CSAT nemela na hmotnost nádoru významný vliv. Takže blokování receptoru α_νβ₃ intravenózní aplikací aJ3₃-specifické protilátky LM609 vedlo ke snížení hmoty rakovinného nádoru jako u melanomového nádoru uvedného viz výše spolu s inhibicí angiogeneze, jak je uvedeno v předchozích příkladech. Navíc byl růst lidského melanomového nádoru podobně inhibován intravenózní injikací LM609.

9. Snížení růstu nádorové tkáně působením antagonisty α_νβ₃měřené v CAM stanovení

Aby bylo možno stanovit účinky antagonistů α_νβ₃ na růst nádorové tkáně a její přežití, byly fragmenty lidského melanomu a fragmenty karcinomů plic, pankreasu a hrtanu umístěny na CAM preparáty 10 dní starých mebryí, jak popisuje Příklad 5A.

A. Intravenózní aplikace

1) Působení monoklonálních protilátek a) Působení LM609 (αητί-α_νβ₃) a CSAT (anti-β _n) hodin po implantaci CAM s fragmenty a^₃-negativního lidského melanomu M21-L, karcinomu FG z pankreasu, lidského plicního karcinomu UCLAP-3 nebo lidského hrtanového karcinomu HEp3 byla embrya injikována intravenózně samotným PBS nebo jednotlivými dávkami (300 gg/100 gl) buď mAb LM609 (αηΐί-α_νβ₃) nebo CSAT (anti-β,). Nádory byly ponechány růst po dobu dalších 6 dnů. Na konci této inkubační doby byly nádory opatrně vyjmuty a očištěny od okolní CAM tkáně. Vyjmutí nádorů bylo provedeno dvěma nezávislými pracovníky, kteří odstranili pouze snadno definovatelnou hmotu pevného nádoru. Nádory měly velmi dobře definované okraje, takže tlouštka poloprůhledné membrány (CAM), která je snadno rozlišitelná od hmoty pevného nádoru, byla odstraněna bez poškození vlastní hmoty nádoru. Vyjmuté nádory byly zváženy a morfologicky a histologicky prozkoumány.

Jak ukazuje obr. 13, byly na konci sedmého dne určeny hmotnosti vlhkých nádorů a srovnány s hmotnostmi nádorů na začátku před působením. Každý sloupec reprezentuje střední hodnotu +/- SO 5 až 10 nádorů ve skupině. mAb LM609 inhíbovala růst nádoru významně (P<0,001) ve srovnání s kontrolami ve všech testovaných nádorech. Nádory podrobené působení PBS nebo CSAT proliferovaly ve všech případech. Naopak mAb LM609 nejen zabránila růstu těchto nádorů, ale ve většině případů indukovala rozsáhlou regresi. Je důležité, že tyto nádorové buňky neexprimujíintegrin α_νβ₃, což ukazuje, že inhibice růstu byla způsobena protiangiogenními účinky této protilátky na neovaskulaturu více než přímo na nádorové buňky.

b) Působení LM609 (αητΐ-α_νβ₃) a P3G2 (anti-a_vp₅). Nádory byly ponechány růst, jak popisuje Příklad 9Al)a viz výše, a poté byly morfologicky a histologicky prozkoumány, jak je zde popsáno.

Reprezentativní vzorky nádorů M21-L podrobené působení mAb P3G2 (αητί-α_νβ₅) nebo LM609 (αητί-α_νβ₃) byly morfologicky zkoumány. Nádory podrobené působení P3G2 byly velké (8 mm v průměru) a dobře vaskularizované, zatímco nádory podrobené působení mAb LM609 byly mnohem menší (3 mm v průměru) a neměly detegovatelné krevní cévy.

Nádory byly dále zkoumány tak, že byly připraveny histologické řezy, které byly barveny hematoxylinem a eosinem, jak popisuje Příklad 9Al)a. Jak ukazuje obr. 14 (horní část), nádory podrobené působení mAb P3G2 (anti-a^) měly mnoho viditelných a aktivně se dělících nádorových buněk, jak je indikováno mitotickými útvary (klínky) stejně jako mnohočetnými krevními cévami (šipky) procházející stromatem nádoru. Oproti tomu bylo v nádorech podrobených působení mAb LM609 (anti-a_vp₃) (obr. 14, spodní část) detegováno jen málo, pokud byly vůbec viditelné, nádorových buněk nebo krevních cév. Tyto výsledky demonstrují, ýe antagonisté integrinů α_νβ₃ inhibují angiogenezí indukovanou nádorem, což vede k zástavě růstu a omezení růstu různých lidských nádorů in vivo. Je důležité zaznamenat, že se embrya zkoumaná po sedmi dnech nádorového růstu (17. den embryonálního vývoje) jevila normální po necitlivém testování zkoumajícím, jestli na embrya působil vliv antagonistů α_νβ₃ nebo ne. Tato zjištění znamenají, že se antagonisté tohoto integrinů zdají být netoxickými vůči vyvíjejícím se embryím.

2) Působení syntetických peptidů

Fragmenty lidského melanomového nádoru (M21-L) (50 mg) byly implantovány na CAM preparáty 10 dní starých embryí, jak popisuje Příklad 5A, O 24 hodin později byla embrya intravenózně jednotlivě injíkována 300 μς/100 μΙ buďcyklo-RADfV (69601) a nebo cyklo-RGDtV (66203). Po uplynutí celkové doby 72 hodin byly nádory odstraněny, morfologicky zkoumány a vyfotografovány a pomoci stereomikroskopu, jak popisuje Příklad 9A1).

Jednotlivé obrázky na obr. 15A až 15E znázorňují: obr. 15A - dva stejné vzorky podrobené působení cyklo-RADfV peptidů (69601); obr. 15B - dva stejné vzorky podrobené působení cyklo-RGDfV peptidů (66203); obr. 15C - tkáň sousedící s CAM odebraná ze stejných embryí podrobených působení cyklo-RGDfV peptidu (66203) a obr. 15D a 15E - velké zvětšení (13x) nádorů podrobených působení peptidu. Obr. 15D znázorňuje normální Irevní cévy z nádoru podrobeného působení kontrolního peptidu (69601). Obr. 15E znázorňuje příklady rozrušených krevních cév z nádoru podrobeného působení cyklo-RGDfV peptidu (66203) (šipky).

Výsledky znázorňují, že pouze peptid 66203 inhiboval tvorbu cév a dále že cévy v CAM tkáni sousedící s nádorem nebyly poškozeny.

10. Omezení růstu nádorové tkáně působením antagonistů α_νβ₃ a měřené stanovením in vivo v králičím modelu oka

Účinek antagonistů α_νβ₃ na angiogenezi indukovanou růstovým faktorem lze pozorovat v přirozeně průhledných strukturách, příkladem je rohovka oka. Nové krevní cévy rostou z okraje rohovky a jsou bohatě zásobovány krví oproti centru rohovky, které normálně nemá přívod krve. Jsou-li stimulátory angiogeneze jako je βΕΟΕ aplikovány do rohovky, indukují růst nových krevníc cév z kraje rohovky. Antagonisté angiogeneze aplikované do rohovky inhibují růst nových krevních cév z kraje rohovky. Takže rohovka podstupuje angiogenezi přes napadnutí endoteliálních buněk z kraje rohovky do tuhé kolagenem obalené tkáně rohovky, která je snadno viditelná. Stanovení v králičím modelu oka proto poskytuje model in vivo pro přímépozorování stimulace a inhibice angiogeneze následující po implantaci látek přímo do rohovky oka.

A. Stanovení in vivo v králičím modelu oka 1) Angiogeneze indukovaná růstovými faktory

Angiogeneze byla indukovaná ve stanovení in vivo v králičím modelu oka růstovým faktorem pFGF a je popsán následovně.

a) Příprava hydronových peletů obsahujících růstový faktor a monoklonální protilátky

Hydronové polymerní pelety obsahující růstový faktor a mAb byly připraveny podle práce D'Amata a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.: 91, 4082-4085 (1994). Jednotlivé pelety obsahovaly 650 ng růstového faktoru pFGF vázaného na sukralfát (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation) ke stabilizaci pFGF a zajištění jeho pomalého uvolňování do okolní tkáně. Navíc byly hydronové pelety připraveny tak, že obsahovaly buď 40 μρ mAb LM609 (anti-a_vp₃) nebo mAb P1F6 (anti-ajy v PBS. Pelety byly odlity ve speciálně připravených Teflonových kolíčkách, které měly 2,5 mm jádro provrtané na jejich povrchy. Přibližně 12 μΙ odlitého materiálu bylo umístěno do každého kolíčku a přes noc polymerizováno ve sterilní digestoři, Pelety byly pak sterilizovány ultrafialovým zářením,

b) Působení monoklonálních protilátek

Každý experiment zahrnoval tři králíky, kde do jednoho oka byl vpraven pelet zahrnující pFGF a LM609 a do dalšího pelet zahrnující pFGF a myší mAb P1F6 (anti~a_vp₅). Použití páru očí testovaných na srovnání LM609 (anti-ot_vp₃) s jinou mAb a kontrolou PBS poskytuje způsoby přesného testování k demonstrování zásadních rozdílů mezi testovanými mAb.

P1F6 imunoreaguje s integrinem α_νβ₅, který se nalézá na povrchu vaskulárních endoteliálních buněk, ale není pravděpodobně zahrnut v angiogenezi. Aby bylo možno určit, byla-li mAb P1F6 zahrnuta v angiogenezi, byly připraveny pelety obsahující pouze tuto mAb a testovány podle popisu viz níže k potvrzení toho, že tato mAb neindukuje angiogenezi.

Všechny testované mAb byly purifiovány z ascitové kapaliny za použití afinitní kolonové chromatografie na Protein-A-Sepharose CL-4B podle dobře známých způsobů. Eluovaný imunoglobulin byl pak dialyzován proti PBS a podroben působení Detoxi-gelu (Pierce Chemicals) k odstranění endotoxinu. Endotoxin byl potvrzen jako silný stimulátor angiogeneze a zánětu. mAb byly proto testovány na přítomnost endotoxinu pomocí Chromogenic Limulus Amebocyte Lysáte Assay (Bio-Whittaker) a pouze mAb bez detegovatelného endotoxinu byly použity ve stanovení v králičím modelu oka.

Hydronový pelet zahrnující pFGF a mAb LM609 (anti-a_vp₃) nebo PIFó (αη1ϊ-α_νβ₅) byl vložen do rohovkové kapsy vytvořené v oku králíků. Hydronový pelet také obsahoval sukralfát ke stabilizaci βΡΘΕ během stanovení. Jednotlivé pelety byly ilmplantovány do chirurgicky vytvořené kapsy vytvořené ve středu stromatu rohovky králíka. Chirurgická procedura byla provedena sterilně za použití Wildova modelu M691 operačního mikroskopu opatřeného děličem světelného paprsku, na který byla namontována kamera, která fotograficky zaznamenávala jednotlivé rohovky. Kapsa ovelikosti 3 až 5 mm byla vytvořena ve stromatu rohovky provedením 3 mm řezu do poloviny tloušťky rohovky 69 Beaverovým nožem. Stroma bylo periferně rozříznuto za použití duhovkové špachtličky a pelet byl implantován do peroferního okraje 2 mm od limbu.

Během následujících 14 dní pFGF a mAb difundovaly z implantovaného peletu do sousední tkáně a tím ovlivňovaly angiogenezi z okraje rohovky.

Reprezentativní výsledky z každého působení jsou znázorněny na obr. 16A až 16E, Množství přítomných cév bylo kvantifikováno a popsáno termínem hodin podle ciferníku definovaným následovně. Oko je rozděleno na 12 ekvivalentních dílů stejným způsobem jako jsou na ciferníku rozděleny hodiny. Jedna hodina cév se vztahuje k množství cév, které vyplňují oblast oka odpovídající jedné hodině na ciferníku hodin, Pět králíků, kteří obdrželi pouze pFGF, vykazovalo plně rozvinutou angiogenezi, kde nové krevní cévy rostly z kraje rohovky proti centru rohovky, které normálně nemá krevní cévy. Jeden z těchto králíků měl cévy v oblasti odpovídající pouze jedné hodině. Dva z králíků, kteří obdrželi pFGF a mAb LM609, vykazovali absolutně nedetegovatelnou angiogenezi 14 dní po chirurgickém zákroku. Jeden z těchto králíků měl ve 14. dni 3 foci hemoragických a rašících cév. Dva z králíků, kteří obdrželi pFGF a mAb P3G2 (anti-a_vp₅), vykazovali rozsáhlou vaskularizaci, kdy nové krevní cévy rostly z kraje rohovky dovnitř rohovky. Jeden z těchto králíků měl pouze oblast 1 až 2 hodin.

Jak bylo zjištěno ve stanovení v králičím modelu oka, nebyl pozorován žádný angiogenní účinek na normální paralimbální cévy v přítomnosti růstového faktoru pFGF u králíků, kteří obdrželi mAb LM609 (αηίί-α_νβ₃). Oproti tomu byla angiogeneze pozorována u paralimbálních cév v přítomnosti růstového faktoru ββΟβ u králíků, kteří obdrželi mAb P3G2 (antl-ajy. Kompletní inhibice rohovkové angiogeneze působením protilátky LM609 je podstatně větší než působením jakéhokoliv dříve popsaného anti-angiogenního reakčního činidla.

11. In vivo snížení růstu nádorové tkáně působením antagonistů α_νβ₃, měřeno ve stanovení v modelu chimérická myš/člověk

In vivo model chimérická myš/člověk byl připraven nahrazením části kůže SCID myši lidskou neonatální předkožkou (obr. 17). Poté, co se transplantát kůže uchytil, byla lidská předkožka inokulována buňkami karcinomu. Poté, co se vytvořil měřitelný nádor, byla do myší ocasní žíly injikována buď protilátka LM609 (αητϊ-α_νβ₃) nebo PBS. Po uplynutí 2-3 týdenní doby byl nádor vyříznut, zvážen a hístologicky analyzován.

A. Stanovení in vivo v modelu chimérická myš/člověk

In vivo model chimérická myš/člověk byl připraven v podstatě podle práce Yana a kol., J. Clin. Invest.: 91_, 986-996 (1993), Krátce shrnuto, 2 cm² plochy kůže bylo chirurgicky odstraněno z SCID myši (staré 6-8 týdnů) a nahrazeno lidskou předkožkou. Myš byla anestezována a z plochy 5 cm² na každé straně podél břišní oblasti byla vyholena srst. Odstraněním kůže v plné tlouštce dolů k fascii byly připraveny dva kroužkové odřezky o velikosti 2 cm². Transplantáty lidské kůže v plné tlouštce o stejné velikosti pocházející z lidské neonatální předkožky byly umístěny na poraněná místa a přišity. Transplantát byl přikryt leukoplastí, která byla také přišita ke kůží. K překrytí poranění byla také použita látková páska s mikropóry.

Ke vzniku pevného nádoru na transplantátu lidské kůže na SCID myši byla použita M21-L lidská melanomová buněčná linie nebo MDA 23.1 buněčná linie prsního karcinomu (ATCC HTB 26;α_νβ₃ s mAb LM609). Suspenze jednotlivých buněk o počtu 5xl0⁶ M21-L nebo MDA 23.1 buněk byla injikována intradermálně do transplantované lidské kůže. Myši pak byly pozorovány po dobu 2 až 4 týdnů tak, aby mohly vyrůst měřitelné lidské nádory.

B. Intravenozní aplikace 1) Působení monoklonálních protilátek

Poté, co SCID myším injikovaným M21-L nádorovými buňkami vyrostly měřitelné nádory, bylo myším intravenózně injikováno do ocasní žíly 250 gg buď mAb LM609 (anti-aJ3₃) nebo PBS, a to dvakrát týdně po dobu 2 až 3 týdnů. Po uplynutí této doby byly nádory vyjmuty z kůže a očištěny od okolní tkáně. Pro každé působení bylo vyhodnoceno několik myší, byla vypočtena průměrná hmotnost nádoru pro každé působení a tyto hodnoty jsou uvedeny v Tabulce 6.

Tabulka 6

Číslo nádoru M21-L	Působení	Hmotnost nádoru (mg)
	PBS
1		158
2		192
3		216
4		227
	LM609
5		195
6		42
7		82

8		48
9		37
10		100
11		172
Působení	Průměrná hmotnost nádoru (mg)
PBS	198
LM609	113

Podrobení M21-L a_vp₃~negativního lidského rakovinného nádoru v systému chimérická myš/člověk působení LM609 (αηΐί-α_νβ₃) způsobilo snížení průměrné hmotnosti nádoru oproti působení PBS ze 198 na 113 mg.

Reprezentativní příklady nádorů M21-L podrobených působení mAb 1_Μ609(αηΐί~α_νβ₃) a PBS byly morfologicky testovány. Nádory podrobené působení PBS byly velké (8 až 10 mm v průměru) a dobře vaskularizovány, zatímco nádory podrobené působení mAb LM609 (anti-aJ3₃) byly mnohem menší (3 až 4 mm v průměru) a postrádaly detegovatel né krevní cévy.

Nádory vzniklé na transplantované kůži, které byly infikovány MDA 23.1 buňkami, byly detegovatelné a měřitelné. Morfologické testování vzniklých nádorů ukázalo, že probíhala neovaskularizace z transplantované lidské tkáně do MDA 23.1 nádorových buněk.

Takže blokování receptorů α_νβ₃ intravenózní aplikací a^₃-specifické protilátky LM609 vedlo ke snížení růstu karcinomu v tomto modelovém systému stejným způsobem jako v CAM a králičím modelu oka, jak popisuje Příklad 9, respektive 10.

12. Stimulace vaskulárních buněk ke vstupu do buněčného cyklu a podstoupení apoptózy v přítomnosti antagonistů integrinů α_νβ₃, měřeno v CAM stanovení

Angiogenní proces zjevně závisí na kapacitě cytokinů jako je βΕΘΕ a VEGF stimulovat proliferaci vaskulárních buněk. Mignatti a kol., J. Cell. Biochem.: 471,201 (1991); Takeshita a kol., J. Clin. Invest., 93,662 (1994); a Koyama a kol., J. Cell. Physiol.: 158, 1 (1994). Ovšem je také zřejmé, že signální děje mohou regulovat diferenciaci těchto vaskulárních buněk ve zralé krevní cévy. Takže je možné, že interference se signály týkajícími se bud růstu nebo diferenciace vaskulárních buněk podstupujících nový růst nebo angiogenezi může vést k perturbaci angiogeneze.

Ukázalo se, že se ligační integrinové děje účastní jak buněčné proliferace, tak i apoptózy nebo programované buněčné smrti in vitro. Schwartz, Cancer Res.: 51,1503 (1993) Meredith a kol.. Mol. Biol. Cell: 4, 953 (1993); Frisch a kol., J. Cell Biol.: 124, 619 (1994); a Ruoslahti a kol., Cell: 77, 477 (1994). Podobné zkoušky účinků antagonistů α_νβ₃na angiogenezi ukázaly přítomnost diskontinuálních a rozrušených krevních cév asociovaných s nádorem. Proto je možné, že ztráta kontinuity krevních cév může nastat v důsledku selektivní nekrózy nebo apoptózy vaskulárních buněk.

K ověření této možnosti byly testovány CAM preparáty po indukci angiogeneze růstovým faktorem (3FGF a podrobení působení mAb a cyklopeptidy podle předkládaného vynálezu.

A. Působení monoklonálních protilátek

Apoptózu lze detegovat různými způsoby, které zahrnují přímé testování DNA izolované z tkáně na detekci fragmentace DNA a detekci 3ΌΗ v intaktní tkání protilátkou, která specificky deleguje volné 3ΌΗ skupiny nebo fragmentovanou DNA.

1) Analýza fragmentace DNA

Angiogeneze byla indukována tak, že byly filtrační kroužky nasycené pFGF umístěny na CAM preparáty 10 dní starých embryí, jak popisuje Příklad 6A. Imunohistologická analýza CAM preparátů s LM609 (anti-a_vp₃) ukázala maximum exprese α_νβ₃ v krevních cévách 12 až 24 hodin po iniciaci angiogeneze βFGF. Takže 24 hodin po stimulaci pFCF byla embrya inokulována intravenózně 100 μΙ samotného PBS nebo PBS obsahujícího 300 μg buď mAb CSAT (αη!ί-β_η) nebo LM609 (anti~a_vp₃).

Fragmentace DNA byla delegována vyjmutím CAM tkáně přímo pod filtračními kroužky nasycenými βFCF 24 nebo 48 hodin po inokulaci mAb LM609 (anti~aJ3₃), CSAT (anti-β,) nebo PBS. Vyříznuté CAM tkáně byly třikrát promyty sterilním PBS a nakonec nadrobno rozkrájeny, resuspendovány v 0,25% bakteriální kolagenáze (Worthington Biochemical; Freehold, NJ) a inkubovány po dobu 90 min při teplotě 37 °C za občasného promíchání. DNA byla extrahována z ekvivalentního počtu CAM buněk z jednotlivých buněčných suspenzí, jak bylo popsáno viz výše. Bissonette a kol.. Nátuře: 359, 552 (1992). Krátce řečeno, určitý počet buněk CAM byl lyžován v 10 mM TRIS-CI, pH 8,0, 10 mM EDTA v 0,5% (objemových) Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO). Buněčbé lyzáty byly centrifugovány při 16 000 g po dobu 15 min při teplotě 4 °C až do oddělení rozpustné fragmentované DNA od intaktního chromatinového peletu. Fragmentovaná DNA byla promyta, vysrážena a analyzována na 1,2% (hmotnostní/objemová) agarozovém gelu.

Rozpustná fragmentovaná DNA byla izolována z ekvivalentního počtu CAM buněk z každého působení, elektoforeticky rozdělena na agarozovém gelu a vizualizována barvením v ethidiumbromidu. V relativním množství fragmentace DNA nebyl určen žádný rozdíl od tří různých působení v době 24 hodin po působení. Ovšem 48 hodin po působení mAb LM609 (anti-a_vp₃) byl pozorován významný vzrůst fragmentace DNA ve srovnání s embryi podrobenými působení buď mAb CSAT (anti-βρ nebo samotného PBS.

2) Stimulace vaskulárních buněk ke vstupu do buněčného cyklu

Aby bylo možno experimentálně ověřit roli α_νβ₃ v těchto pochodech, byly buňky pocházející z CAM preparátů podrobené nebo nepodrobené působení βFCF barveny propidiumjodidem a ponechány imunoreagovat (anti-a_vp₃).

CAM preparáty izolované z embryí 24 a 48 hodin po působení mAb LM609 (anti~a_vp₃), CSAT (αητί-β_Ί) nebo PBS byly disociovány v jednotlivých buněčných suspenzích inkubací s bakteriální kolagenázou, jak je popsáno viz výše. Jednotlivé buňky pak byly permeabilizovány a barveny za použití detekční sady Apop Tag Insítu podle instrukcí výrobce (Oncor, Caíthersburg, MD). Apop Tag je protilátka, která specificky deteguje volné 3ΌΗ skupiny fragmentované DNA. Detekce takových volných 3ΌΗ skupin je zavedeným způsobem detekce apoptotických buněk. Gavrieli a kol., J.Cell Biol.: 119,493(1992).

Buňky barvené Apop Tag byly opláchnuty 0,1% (objemová %) Triton X-100 v PBS a resuspendovány v pufru FACS obsahujícím 0,5% (hmotnostní/objemová) BSA, 0,02% (hmotnostní/objemová) azidu sodného a 200 gg/ml RNázy A v PBS. Buňky byly inkubovány po dobu 1,5 hodiny, promyty a analyzovány fluorescenčně aktivovaným třídičem buněk. Buněčná fluorescence byla měřena za použití FACScan průtokového cytometru a data byla analyzována podle popisu viz dále.

Buněčná fluorescence byla měřena za použití FACScan průtokového cytometru (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Boční rozptyl (SSC) a přední rozptyl (FSC) byly určovány simultánně a všechna data byla shromažďována počítačem Hewlett Packard (HP9000) vybaveným sotwarem FACScan pro výzkumné účely (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Data byla analyzována za pomoci softwaru P, C. Lysis verze I (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Negativní kontrolní přívody byly nastaveny za použití buněčných suspenzí bez přídavku primárních protilátek ze sady Apop Tag. Identický průtok byl aplikován na obě buněčné populace, což vedlo k analýze asi 8 000 buněk pro různé buněčné působení.

Procenta jednotlivých buněk pocházejících z mAb podrobených působení CAM a barvených Apop Tag určená analýzou FACS jsou uvedena na obr. 18. Černý sloupec reprezentuje buňky z embryí podrobených působení 24 hodin před analýzou. Tečkovaný sloupec reprezentuje buňky z embryí podrobených působení 48 hodin před analýzou. Každý sloupec reprezentuje střední průměr +/- SO ze tří opakovaných pokusů.

Jak ukazuje obr. 18, CAM preparáty podrobené působení mAb LM609 (anti-aj^) dva dny před analýzou vykazovaly 3 až 4-násobné zvýšení intenzity barvení Apop Tag ve srovnání s CAM preparáty podrobenými působení buď samotného PBS nebo CSAT (anti-β^.

B. Působení syntetickými peptidy

CAM stanovení angiogeneze indukované růstovým faktorem, jak popisuje Příklad 6A, byla také prováděna se syntetickými peptidy podle předkládaného vynálezu za účelem určení účinku cyklopeptidů na apoptózu. Peptidy cyklo-RGDfV (66203) a cyklo-RADfV (69601) byly připraveny podle popisu v Příkladu 1. Roztoky peptidů nebo PBS byly injikovány do CAM preparátů v koncentraci 300 gg/ml. Po 24 a 48 hodinách byl oddělen filtrační papír a okolní tkáň CAM a barven Apop Tag za účelem detekce apoptózy, jak je popsáno viz výše v Příkladu 12A2),

Jak ukazuje obr. 18, CAM preparáty podrobené působení peptidu 66203 (cyklo-RGDfV) dva dny před analýzou vykazovaly 3 až-násobné zvýšení intenzity barvení Apop Tag ve srovnání se samotným PBS nebo kontrolním cyklopeptidem 69601 (cyklo-RADfV).

C. Účinek působení monoklonálních protilátek na apoptózu a buněčný cyklus

Jednotlivé buněčné suspenze byly testovány také na počet kopií chromozomální DNA, a to barvením propidiumjodidem k určení účinku působení monoklonálních protilátek na buněčný cyklus a apoptózu barvením Apop Tag.

Podle popisu v Příkladu 12A1) byly připraveny jednotlivé buněčné suspenze CAM preparátů podrobené 24 nebo 48 hodin předtím působení mAb LM609 (anti~a_vp₃), CSAT (αητΐ-β_Ί) nebo PBS.

Buněčné suspenze byly promyty třikrát pufrem obsahujícím 2,5% (hmotnostní/objemová) BSA a 0,25% (hmotnostní/objemová) azidu sodného v PBS, aby pak mohly být barveny Apop Tag, Buňky byly poté fixovány v 1% (hm./obj.) paraformaldehydu v PBS po dobu 15 minut a následovaly tří promytí, jak bylo uvedeno víz výše, Aby se předešlo nespecifickým vazbám, byly jednotlivé buněčné suspenze blokovány ó^Chm./obj.) BSA v PBS přes noc při teplotě 4°C. Buňky pak byly promyty podle popisu viz výše, barveny Apop Tag a byla měřena fluorescence buněk za pomoci FACScan, jak popisuje Příklad Ί2Α.

Buňky ze všech experimentálních podmínek byly barveny propidiumjodidem (Sigma, St. Louis, MO) v 10 gg/ml v PBS po dobu 1 hodiny, dvakrát promyty PBS a byly analyzovány jaderné charakteristiky typické pro apoptózu, včetně kondenzace a segmentace chromatinu. Procentické zastoupení apoptotických buněk bylo stanoveno morfologickou analýzou buněk nejméně 10 až 15 náhodně vybraných mikroskopických polí.

Kombinované výsledky jednotlivých buněčných suspenzí CAM z embryí podrobených působení buď CSAT (anti-βρ nebo LM609 (αητί-α_νβ₃), barvených Apop Tag a propidiumjodidem a analyzovány FACS, jsou uvedeny na obr. 19. Osa Y vyznačuje barvení Apop Tag (apoptóza), osa X vyznačuje barvení propidiumjodidem (obsah DNA). Horizontální linie vyznačuje negativní přívody pro barvení Apop Tag.

Oba obrázky vyznačují CAM buňky z embryí podrobených působení CSAT, respektive LM609. Analýza buněčného cyklu byla provedena analýzou asi 8 000 cyklů za daných podmínek a data jsou vynesena ve vrstevnicovém diagramu.

Vzorky jednotlivých buněk barvených propidiumjodidem, tj. barvivém DNA, ukázaly, že 25 až 30% CAM buněk podrobených působení LM609 (anti-a_vp₃) 48 hodin po působení prokázalo jadernou kondenzaci a/nebo segmentaci. Tyto pochody jsou charakteristické pro buňky podstupující apoptózu. To je v kontrastu s CAM preparáty podrobenými působení CSAT (anti-βχ, kde vykazovalo 90 až 95% buněk normální jaderné barvení.

Jak ukazuje obr. 19, v souladu s indukcí apoptózy působením LM609 byl pozorován významný počet buněk v maximu obsahujícím méně než jednu kopii DNA (AO). Toto maximum bylo dříve uvedeno jako reprezentace fragmentované DNA v pozdním stadiu apoptotických buněk. Telford a kol., Cytometry: 13,137 (1992). Dále lze tyto AO buňky snadno barvit Apop Tag, což potvrzuje schopnost této látky detegovat apoptotické buňky. Ovšem kromě barvení buněk vAO byl také pomocí Apop Tag barven významný počet buněk obsahujících více než jednu kopii DNA (obr. 19). Tyto výsledky znázorňují schopnost LM609 podporovat apoptózu mezi vaskulárními buňkami, které už vstoupily do buněčného cyklu. Naopak buňky pocházející z kontrolních preparátů CAM, které již vstoupily do buněčného cyklu vykazují minimální barvení Apop Tag, což je v souladu s několika apoptotickými buňkami detegovanými u kontrolních preparátů CAM podrobených působení.

Mezi buňkami z CAM stimulovanými pFGF, které vstoupily do buněčného cyklu (S a G2/M fáze), vykazovalo 70% pozitivní barvení LM609 (anti-a_vp₃). To bylo srovnáno s 10% LM609 barvených buněk CAM mezi buňkami v cyklu, které nebyly podrobeny působení pFGF. Tato zjištění ukazují, že po stimulaci pFGF vykazoval hlavní podíl buněk nesoucích α_νβ₃ aktivní proliferaci.

Tato zjištění společně naznačují, že intravenózní injekce mAb LM609 nebo cyklického peptidového antagonisty α_νβ₃ podporují apoptózu v kuřecích CAM následně po indukci angiogeneze.

U CAM preparátů byla také histologicky testována exprese α_νβ₃, a to imunoreaktivně s LM609, a buňky podstupující apoptózu, a to imunoreaktivně s Apop Tag. CAM řezy vyříznuté z embryí 48 hodin před podrobením působení LM609 (anti-a_vp₃), CSAT (anti-pj nebo PBS připravené v Příkladu 5A byly promyty, usazeny do OTC (Baxter) a zmrazený v kapalném dusíku. Z CAM tkání byly nařezány ó mikronů silné řezy, fixovány v acetonu po dobu 30 sekund a uchovány při teplotě -70 °C až do použití. Řezy tkáně byly připraveny k barvení krátkým opláchnutím v 70% (obj.) etanolu (EtOH) a následným trojím promytím v PBS. Dále byly řezy blokovány v 5% (hm./obj.) roztoku BSA po dobu 2 hodin, následovala inkubace s 10 gg/ml mAb LM609 podobu 2 hodin. Řezy pak byly promyty a inkubovány v roztoku rhodaminu zředěném 1:50 konjugovaném s kozím anti-myším IgG (Fisher Síentific, Pittsburg, PA) po dobu 2 hodin. Nakonec byly tytéž řezy opláchnuty a barveny Apop Tag, jak popisuje Příklad 12A2). Obarvené řezy tkáně byly připevněny a analyzovány pomocí konfokálního imunofluorescenčního mikroskopu.

Να obr. 20Α až 20Cjsou uvedeny CAM tkáně z embryí podrobených působení CSAT (anti-β^ a na obr. 20D až 20F jsou CAM tkáně z embryí podrobených působení LM609 (αη1ί~α_νβ₃). Obr. A a D znázorňuje tkáně barvené Apop Tag a vizualizované fluorescencí (FITC) na sebe vrstvených DIC obrazů. Obr. B a E znázorňuje stejné tkáně barvené mAb LM609 (αηίι-α_νβ₃) a vizualizované fluorescenčně (rhodamin). Obr. C a F znázorňuje splynulé obrazy stejných tkání barvených Apop Tag i LM609, kde žluté zbarvení znamená kolokalizaci. Sloupec vyznačuje 15 na levé a 50 μηη na pravé straně.

Jak ukazuje obr. 20 (A až C), po intravenozní injekci CSAT nebo kontroly PBS ukázalo barvení Apop Tag minimální a rozptýlenou intenzitu indikující minimální úroveň apoptózy v tkáni. Naopak CAM preparáty z embryí předtím podrobených působení LM609 nebo cyklopeptidu 203 ukázalo většinu cév intenzivně zbarvených Apop Tag, zatímco u okolních nevaskulárních buněk byla pozorována minimální reaktivita (obr. 20D až F). Navíc byly-li k barvení těchto tkání použity Apop Tag i LM609 (obr. 19C a 19F), byla významná kolokalizace pozorována pouze mezi těmito markéry v CAM pocházejících z embryí podrobených působení antagonistů α_νβ₃ (obr. 20F). Tato zjištění ukazují, že po indukcí angiogeneze in vivo inhibitory integrinů α_νβ₃ selektivně podporují apoptózu krevních cév nesoucích α_νβ₃.

Zatímco angiogeneze je komplexní proces zahrnující mnoho molekulárních a buněčných biologických dějů, některé z důkazů předpokládají, že integrin α_νβ₃ vaskulárních buněk v tomto pochodu hraje relativně pozdní roli. Za prvé imunohistologická analýza ukázala, že exprese α_νβ₃ ve vaskulárních buňkách dosáhla maxima 12 až 24 hodin po indukci angiogeneze pFGF. Za druhé antagonisté α_νβ₃ vnesly zmatek do angiogeneze indukované mnohonásobnými aktivátory, což naznačuje, že tento receptor je zahrnut v běžných cestách ve směru od asi všech primárních signálních dějů vedoucích k angiogenezi. Za třetí GAM preparáty podrobené působení mAb LM609 nebo cyklopeptidu nevykazovaly významné zvýšení apoptózy, což bylo měřeno pomocí DNA žebříčkování do 48 hodin po podrobení působení těmito antagonisty. A konečně antagonisté α_νβ₃ podporují apoptózu vaskulárních buněk, které už byly indukovány ke vstupu do buněčného cyklu.

Předkládané výsledky poskytují první přímý důkaz, že ligační integrinové děje mohou regulovat přežití buněk in vivo. Tato hypotéza vznikla proto, že jakmile angiogeneze jednou začne, jednotlivé vaskulární buňky se dělí a začínají se pohybovat proti angiogennímu zdroji, a potom ligace α_νβ₃ poskytuje signál umožňující přetrvávající buněčné přežití, což vede k diferenciaci a tvrobě zralých krevních cév, Ovšem jestliže je ligaci α_νβ₃ bráněno, pak buňky nedokážou přijmout tento molekulární podnět a v důsledku toho zahájí apoptózu. Tato hypotéza by také předpovídala, že poté, co došlo k diferenciaci, zralé krevní cévy už dále k přežití nepotřebují signálizaci α_νβ₃ , a tak na antagonisty tohoto integrinů nereagují.

A konečně výsledky zde předkládané poskytují důkaz, že antagonisté integrinů α_νβ₃ mohou poskytovat důležitý terapeutický přístup k léčbě rakoviny nebo dalších onemocnění charakterizovaných angiogenezi. Z prvé antagonisté a^₃rozrušují nově tvořené krevní cévy bez škodlivého vlivu na již dříve existující vaskulaturu. Za druhé tyto antagonisté nemají významný účinek na životaschopnost kuřecího embrya, takže lze předpokládat, že jsou netoxické. Za třetí byla angiogeneze významně blokována bez ohledu na angiogenní stimulaci. A konečně administrace antagonistů α_νβ₃ do krevního oběhu zapříčinila dramatickou regresi různých histologicky jasných lidských nádorů.

Takže výše uvedené Příklady znázorňují, že íntegrin α_νβ₃ hraje klíčovou roli v angiogenezi indukované různými stimuly a jako takový lze α_νβ₃ spolu s antagonisty α_νβ₃ podle předkládaného vynálezu hodnotně terapeuticky využít při léčbě onemocnění charakterizovaných výskytem neovaskularizace.

Předcházející popis je považován za dostačující k tomu, aby osoba obeznámená s technikou předkládaný vynález uskutečnila v praxi. Předkládaný vynález není omezen na uvedené buněčné linie, protože uvedené Provedení je zamýšleno jako jednoduchá ilustrace jednoho aspektu předkládaného vynálezu a jakákoliv funkčně ekvivalentní buněčná linie je v souladu s předkládaným vynálezem. Uvedený materiál nepřipouští, že by zde uvedené Provedení vynálezu neposkytovalo možnosti uskutečnit jakýkoliv aspekt předkládaného vynálezu v praxi, včetně jeho nejlepší varianty, ani není omezen rozsahem nároků a specifických ilustrací, které ho reprezentují. Naopak osobě obeznámené s technikou budou z dříve uvedeného Provedení a obsahu připojených nároků zřejmé různé modifikace předkládaného vynálezu kromě již uvedených a popsaných.

Přehled sekvencí

1) Obecné informace:

i) předkladatel:

A) jméno: The Scripps Research Institute

B) ulice: 10666 North Torrey Pines Road

C) město: La Jolla

D) stát: Kalifornie

E) země: USA

F) PSČ: 92037

G) telefon: 6195542937

H) fax: 619 554 6312 ii) název vynálezu: Způsoby a prostředky využitelné k inhibici angiogeneze iii) počet sekvencí: 14 iv) použitá počítačová technika:

A) typ media: floppy disk

B) počítač: IBM PC kompatibilní

C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D) software: Patent ln Release #1.0, Version #1.25 (EPO)

v) současné údaje žádosti:

A) číslo žádosti: PCT/US 95/

B) datum registrace: 9.3.1995 vi) dřívější údaje žádosti:

A) číslo žádosti: US 08/210,715

B) datum registrace: 18.3. 1994 vii) dřívější údaje žádosti:

A) číslo žádosti: US 08/366,665

B) datum registrace: 30.12. 1994

2) Informace k SEQ ID NO: 1:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 6 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne

v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: 1..6

D) další informace: /označení = BOC-GRGDFV-OMe /poznámka = BOC znamená N-koncovou chránící skupinu butyloxykarbonyl; OMe znamená C-koncový metylester; arginin ve druhé pozici ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: Peptid

B) umístění: 1..6

D) další informace: /označení = OMe /poznámka = OMe znamená C-koncovou chránícískupinu metylester.

ix) charakteristické znaky:

100

A) jméno/klíč: Peptid

B) umístění: 1..6

D) další informace: /označení = D~Arg /poznámka = Prefix D u D-Arg znamená, že arginin v pozici 2 je D-aminokyselina.

xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5

2) Informace k SEQ ID NO:2:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 6 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: 1.. 6

D) další informace: /označení = BOC /poznámka = BOC znamená N-koncovou blokující skupinu terč. butyloxykarbonyl.

ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: Peptid

101

B) umístění: 1..6

D) další informace: /označení = OH /poznámka = OH znamená volnou C-koncovou karboxylovou kyselinu.

ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: Peptid

B) umístění: 1.. 6

D) další informace: /označení = D-Arg /poznámka = Prefix D u D~Arg znamená, že arginin v pozicí 2 jeD-aminokyselina.

xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5

2) Informace k SEQ ID NO:3:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 6 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: 1..6

102

D) další informace:/označení = Η /poznámka = Ή znamená volný N-koncový amin. ” ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: Peptid

B) umístění: 1.. 6

D) další informace: /označení = OH /poznámka = OH znamená volnou G-koncovou karboxylovou kyselinu.

ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: Peptid

B) umístění: 1..6

D) další informace: /označení = D-Arg /poznámka = Prefix D u D-Arg znamená, že arginin v pozici 2 je D-aminokyselina.

xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5

2) Informace k SEQ ID NO:4:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 6 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: cirkulární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne

103

v) typ fragmentu: vnitrní ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: 1..6

D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-amínokyseiinu; velká písmena označujíL-aminokyselinu, xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5

2) Informace k SEQ ID NO:5:

i) charakteristiky sekvence;

A) délka: 5 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: 1..5

D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu.

104 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

Arg Gly Asp Phe Vol 1 5

2) Informace k SEQ ID NO:6:

1) charakteristiky sekvence:

A) délka: 5 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: Ί..5

D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu. xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Arg Ala Asp Phe Val 1 5

2) Informace k SEQ ID NO: 7:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 5 aminokyselin

105

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: 1,.5

D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu, xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Arg Gly Asp Phe Val 1 5

2) Informace k SEQ ID NO: 8:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 15 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní

106 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gin Val Thr Arg Gly Asp Val Phe 1 5 10 15

2) Informace k SEQ ID NO: 9:

1) charakteristiky sekvence:

A) délka: 5 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: cirkulární ii) typ molekuly : peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne

v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: 1..5

D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu. xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Arg Ala Asp Phe Val 1 5

2) Informace k SEQ ID NO: 10:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 6 aminokyselin

107

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: 1..6

D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu. xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Ala Arg Gly Asp Phe Leu 1 5

2) Informace k SEQ ID NO: 11:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 6 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní

108 ix) charakteristické znaky:

A) jméno/klíč: peptid

B) umístění: 1..6

D) další informace:/označení = cyklo /poznámka = cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu. xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Gly Arg Gly Asp Phe Leu 1 5

2) Informace k SEQ ID NO: 12:

1) charakteristiky sekvence:

A) délka: 12 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ií) typ molekuly : peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Thr Arg Gin Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO: 13:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 13 aminokyselin

109

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO: 14:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 11 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu 1 5

110

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález popisuje způsoby inhibice angiogeneze v tkáních a použití vitronektin-a_vp₃ antagonistů a zvláště inhibice angiogeneze v zanícených a nádorových tkáních a metastázách za využití terapeutických prostředků obsahujících α_νβ₃ antagonisty. Tyto prostředky jsou tedy využitelné jako léčiva.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití oř v 03 antagonisty pro přípravu léčiva pro prevenci, inhibici a léčení angiogeneze v tkáni, regresi vyvinutého nádoru v tkáni nebo indukci apoptózy v neóvaskulaturní tkáni.

2. Použ i t í podle nároku 1, kde <xv03 antagonisty inhibuje vazbu f i br i nogenu na atv03 3. Použití prot i 1átka podle nároku 1. i munospec i f i cká kde antagonista oř v 03 pro oř v 03 . je monoklonální 4. Použití pod1e nároku 3, kde monoklonální prot i 1átka má

imunoreakční charakteristiky monoklonální protilátky LM6O9 ( ATCC HB 9537).
5. Použití podle nároku 1, kde antagonista oř_V03 Je polypeptid obsahující RGD sekvenci.
6. Použití podle nároku 5, kde polypeptid je vybrán ze skupiny sestávající z c-(GrGDFV) (SEQ ID NO: 4), c-(RGDfV) (SEQ ID NO:5), c-(RGDFv) (SEQ ID NO=7) a YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO:8) a je j ich sol i.
7. Použití podle nároku 6, kde sůl je hydrochlorid nebo trifluoracetát.
8. Použití podle nároku 1, kde tkáň je zanícená a angiogeneze je angiogeneze v zanícené tkáni.
9. Použití podle nároku 8, kde tkáň je artritická.

112 •t ····
10. Použili podle nároku 9, kde artritická tkáň je revaatoidní.
11. Použití podle nároku 1, kde tkáni je tkáň sítnice pacienta trpícího diabetickou retinopatií a angiogeneze je sítnicová angiogeneze.
12. Použití podle nároku 1, kde tkání je henangion.
13. Použití podle nároku 1, kde tkání je pevný nádor nebo pevné nádorové netastázy a angiogeneze je nádorová angiogeneze.
14. Použiti podle nároku 1, kde tkání je věníSitá tepna při riziku restenosy následně po koronární angioplazii.