ES2211901T3 - Procedimientos y composiciones utiles para inhibicion de la angiogenesis. - Google Patents
Procedimientos y composiciones utiles para inhibicion de la angiogenesis.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN METODOS PARA INHIBIR LA ANGIOGENESIS EN TEJIDOS UTILIZANDO ANTAGONISTAS DE VITRONECTINA {AL}{SUB,V}{BE}{SUB,3} , Y ESPECIALMENTE PARA INHIBIR LA ANGIOGENESIS EN TEJIDOS INFLAMADOS Y EN TEJIDOS AFECTOS DE TUMORES O METASTASIS CON EL EMPLEO DE COMPOSICIONES TERAPEUTICAS QUE CONTIENEN ANTAGONISTAS {AL}{SUB,V}{BE}{SUB,3}.
Description
Procedimientos y composiciones útiles para
inhibición de la angiogénesis.
La presente invención se refiere, en general, al
campo de la medicina, y se refiere específicamente al uso de los
antagonistas del receptor de la vitronectina
\alpha_{v}\beta_{3}.
Las integrinas son una clase de receptores
celulares para unir proteínas de matriz extracelular, y por lo
tanto inducir interacciones de célula-célula y
célula-matriz extracelular, generalmente conocidas
como eventos de adhesión celular. Sin embargo, aunque se describen
muchas integrinas y los ligandos que unen una integrina en la
literatura, la función biológica de muchas de las integrinas
permanece elusiva. Los receptores de integrina constituyen una
familia de proteínas con características estructurales compartidas
de complejos de glicoproteína heterodimérica
no-covalente formados por subunidades \alpha y
\beta.
El receptor de vitronectina, conocido por sus
características originales de unión preferencial a la vitronectina,
se conoce ahora por referirse a tres integrinas diferentes,
designadas \alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{3}
y \alpha_{v}\beta_{5}. Horton, Int. J. Exp. Pathol.,
71:741-759 (1990). \alpha_{v}\beta_{1}une la
fibronectina y la vitronectina. \alpha_{v}\beta_{3} une una
gran variedad de ligandos, incluyendo la fibrina, el fibrinógeno,
la laminina, la trombospondina, la vitronectina, el factor de
Willeband, la osteospondina y la sialproteína ósea.
\alpha_{v}\beta_{5} une la vitronectina. Las funciones de
adhesión celular específicas que desempeñan estas tres integrinas
en las diversas interacciones celulares en los tejidos están
todavía investigándose, pero es evidente que hay diferentes
integrinas con diferentes funciones biológicas.
Un sitio de reconocimiento importante en el
ligando para muchas integrinas es la secuencia tripeptídica de
arginina-glicina-ácido aspártico (RGD). Se encuentra
RGD en todos los ligandos identificados anteriormente para los
integrinas receptoras de vitronectina. Este sitio de reconocimiento
de se puede mimetizar mediante polipéptidos (péptido) que
contienen la secuencia RGD, y dichos péptidos RGD son inhibidores
conocidos de la función integrina. Sin embargo es importante tomar
nota de que al depender de la secuencia y de la estructura del
péptido RGB, la especificidad de la inhibición se puede alterar
para dirigirse a integrinas específicas.
Para menciones del sitio de reconocimiento RGD,
véase Pierschbacher et al., Nature,
309:30-33 (1984), y Pierschbacher et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5985-5988
(1984). Se han descrito también, diversos polipéptidos RGD de
especificada de integrina variable por Grant et al.,
Cell, 58:933-943 (1989), Cheresh, et
al., Cell, 58:945-953 (989), Aumailley
et al., FEBS Letts.,
291-50-54 (1991), y Pfall et
al., J. Biol.. Chem., 269:20233-20238
(1994), y en las patentes de los Estados Unidos Números 4.517.686,
4.578.079, 4.589.881, 4.614.517, 4.661.111, 4.792.525, 4.683.291,
4.879.237, 4.988,621, 5.041.380 y 5.061.693.
La angiogénesis es un procedimiento de
vascularización de tejidos que implica el crecimiento de un nuevo
desarrollo de vasos sanguíneos en un tejido, y se la conoce como
neo-vascularización El procedimiento se induce
mediante la infiltración de células endoteliales y células de
músculo liso. Se cree que el procedimiento procede de alguna de
las tres maneras: los vasos pueden crecer rápidamente a partir de
los vasos preexistentes: se puede producir un desarrollo
de-novo de los vasos a partir de células
precursoras (vasculogénesis), o se pueden ensanchar el diámetro de
los pequeños vasos existentes. Blood et al., Bioch,
Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990. Las células
endoteliales vasculares son conocidas por contener al menos cinco
integrinas RGD-dependientes, incluyendo el receptor
de vitronectina (\alpha_{v}\beta_{3} o
\alpha_{v}\beta_{5}), El receptor de colágeno de tipo I y IV
(\alpha_{1}\beta_{1}), el receptor de laminina
(\alpha_{2}\beta_{1}), el receptor de
fibronectina/laminina/colágeno (\alpha_{3}\beta_{1}) y el
receptor de fibronectina (\alpha_{5}\beta_{1}). Davis et
al., J. Cell. Biochem., 51:206-218 (1993). La
célula de músculo liso se conoce por contener al menos seis
integrinas RGD-dependientes, incluyendo
\alpha_{5}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{3} y
\alpha_{v}\beta_{5}.
La angiogénesis es un procedimiento importante en
el crecimiento neonatal, pero también es importante en la
cicatrización de heridas y en la patogénesis de una gran variedad
de enfermedades clínicas que incluyen la inflamación de tejidos, la
artritis, el crecimiento tumoral, la retinopatía diabética, la
degeneración macular por neovascularización de la retina y
afecciones similares. Estas manifestaciones clínicas asociadas a la
angiogénesis son conocidas como enfermedades angiogénicas. Folkman
et al., Science, 235:442-447 (1987).
La angiogénesis está generalmente ausente en los tejidos adultos o
maduros, aunque se da en la cicatrización de heridas y en el ciclo
de crecimiento de cuerpo lúteo. Véase, por ejemplo Moses et
al., Science, 248:1408-1410 (1990).
Se ha propuesto que la inhibición de la
angiogénesis fuese una terapia útil para restringir el crecimiento
tumoral. Se ha propuesto la inhibición de la angiogénesis por
(1) inhibición de liberación de "moléculas angiogénicas" tales
como \betaFGF (Factor de crecimiento de fibroblasto), (2)
neutralización de moléculas angiogénicas, tal como por el uso de
anticuerpos anti-\betaFGF, y (3) inhibición de
respuesta de células endoteliales a estímulos angiogénicos. Esta
última estrategia ha llamado la atención, y Folkman et al.,
Cancer Biology, 3:89-96 (1992), han descrito
diversos inhibidores de la respuesta de células endoteliales,
incluyendo el inhibidor de colagenaza, los inhibidores de
renovación de la membrana del basamento, esteroides angiostáticos,
inhibidores de angiogénesis derivada de hongos, factor plaquetario
trombospondina, fármacos contra la artritis tales como peniclilamina
D y tiomalato de oro, los análogos de vitamina D_{3}, el
alfa-interferón y similares que se pueden usar para
inhibir la angiogénesis. Para los inhibidores adicionales
propuestos de angiogénesis, véase Blood et al., Bioch.
Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et
al., Science, 248:1408-1410 (1990),
Ingber et al., Lab.Invest., 59:44-51
(1988), y las patentes de los Estados Unidos números 5.092.885,
5.112.946, 5.192.744 y 5.202.352. Ninguno de los inhibidores de la
angiogénesis descritos en las referencias anteriores se dirige a la
inhibición de \alpha_{v}\beta_{3}.
También se han descrito los péptidos que
contienen RGD que inhiben el receptor de vitronectina
\alpha_{v}\beta_{3}. Aumailley et al., FEBS
Letts., 291:50-54 (1991), Choi et al.,
J. Vasc. Surg., 19:125-134 (1994), Smith
et al., J. Biol.. Chem.,
265:12267-12271 (1990) y Pfaff et al., J.
Biol.. Chem. 269:20233-20238 (1994). Sin
embargo, la función de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} en
la angiogénesis no se ha sugerido ni identificado nunca hasta la
presente invención.
La inhibición de la adhesión celular in
vitro usando anticuerpos monoclonales inmunoespecíficos para
diversas subunidades de integrina \alpha o \beta han implicado
\alpha_{v}\beta_{3}en la adhesión celular de diversos tupos
de células que incluyen las células endoteliales microvasculares.
Davis et al., J. Cell. Biol..,
51:206-218 (1993). Además, Nicosia et al.,
AM. J. Pathol., 138:829-833 (1991), describen
el uso del péptidos RGD GRGDS para inhibir in vitro la
formación de "microvasos" a partir de la aorta de rata
cultivada en gel de colágeno. Sin embargo, la inhibición de la
formación de "microvasos" in vitro en cultivos de gel de
colágeno no es un modelo para la inhibición de la angiogénesis en
un tejido porque no se ha demostrado que las estructuras de
microvaso sean idénticas a los crecimientos capilares o que la
formación del microvaso en cultivo de gel de colágeno sea idéntica
al crecimiento neovascular en un tejido intacto, tal como el tejido
artrítico, el tejido tumoral o tejido enfermo ahí donde es deseable
la inhibición de la angiogénesis.
Por lo tanto, aparte de los estudios mencionados
en la presente memoria descriptiva, los Solicitantes desconocen
cualquier otra demostración de que la angiogénesis se pueda inhibir
en un tejido usando inhibidores de adhesión celular. En particular,
nunca se ha demostrado con anterioridad que se requiera la función
\alpha_{v}\beta_{3} para la angiogénesis en un tejido o que
los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3} puedan inhibir la
angiogénesis en un tejido.
La presente invención demuestra que la
angiogénesis en los tejidos requiere la integrina
\alpha_{v}\beta_{3}, que los inhibidores de
\alpha_{v}\beta_{3} pueden inhibir la angiogénesis. La
invención demuestra también que los antagonistas de otras
integrinas, tales como \alpha_{v}\beta_{5} o
\alpha_{v}\beta_{1}, no inhiben la angiogénesis,
presumiblemente porque estas otras integrinas no son esenciales
para que se produzca la angiogénesis.
La invención proporciona por lo tanto, el uso de
un antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} en la elaboración de
un medicamento para el tratamiento de la artritis, la retinopatía
diabética, la degeneración macular, la restenosis, un hemangioma o
un tumor sólido de pulmón, páncreas, mama, colon, laringe u ovario.
Comprendiendo dicho medicamento una cantidad inhibitoria de
angiogénesis de dicho antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3}..
El tejido a tratar puede ser cualquier tejido en
el que sea deseable la inhibición de la angiogénesis, tal como
tejido enfermo en el que se está produciendo la neovascularización.
Los tejidos de los ejemplos incluyen tumores sólidos, tejidos que
experimentan restenosis y tejidos similares.
Un antagonista de \alpha_{v}\beta_{3}
para su uso en la presente invención puede unirse a
\alpha_{v}\beta_{3} e inhibir competitivamente la capacidad
de \alpha_{v}\beta_{3} de unirse a un ligando natural.
Preferiblemente, el antagonista exhibe una especificidad para
\alpha_{v}\beta_{3} sobre otras integrinas. En una
realización particularmente preferida, el antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} inhibe la unión del fibrinógeno u otros
ligandos que contienen RGB a \alpha_{v}\beta_{3} pero no
inhibe sustancialmente la unión de la fibronectina al
\alpha_{IIb}\beta_{3}. Un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} preferido puede ser un polipéptido o un
anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, que se
hace inmunoreaccionar con \alpha_{v}\beta_{3}.
En los dibujos que forman una parte de la
invención:
Las figuras 1A-1D ilustran la
distribución del tejido de las subunidades de integrina,
\beta_{3} y \beta_{1}, en la piel normal y en la piel en
proceso de cicatrización de herida designada como tejido de
granulación.
La inmunohistoquímica con anticuerpos a
\beta_{3} y \beta_{1} se realizó como se describe en el
Ejemplo 3A. Las figuras 1A y 1B ilustran respectivamente la
inmunoreactividad del anti-\beta_{3}en la piel
normal y en el tejido de granulación.
Las figuras 2A-D ilustran la
distribución de tedio del factor de von Willebrand y los ligandos
de laminina que une respectivamente las subunidades de integrina
\beta_{3} y \beta_{1}. en la piel normal y en la piel en
proceso de cicatrización de herida designada tejido de granulación.
La inmunohistoquímica con anticuerpos a factor de von Willebrand
(Anti-vWF) y laminina
(anti-laminina) se realizó como se describe en el
Ejemplo 3B. Las figuras 2A y 2B ilustran respectivamente la
inmunoreactividad de anti-vWF en la piel normal y en
el tejido de granulación. Las figuras 2C y 2D ilustran
respectivamente la inmunoreactividad de la
anti-laminina en la piel normal y en el tejido de
granulación.
\newpage
Las figuras 3A-3D ilustran la
distribución de tejido del receptor de la integrina vitronectina,
\alpha_{v}\beta_{3}, en biopsias de tejido de cáncer de
vejiga, cáncer de colon, cáncer de mama y cáncer de pulmón,
respectivamente. La inmunohistoquímica con el anticuerpo LM609
contra \alpha_{v}\beta_{3} se realizó como se describe en
el Ejemplo 3C.
La figura 4 ilustra una fotomicrografía de una
CAM de la invención desprovista de vasos sanguíneos en un embrión
de pollo de 10 días sin tratar. La preparación se describe en el
Ejemplo 5B.
Las figuras 5A-5C ilustran la
distribución de tejido de las integrinas \beta_{1} y
\alpha_{v}\beta_{3} en la preparación de la CAM de esta
invención. La figura 5A muestra la distribución de la subunidad
\beta_{1} en una preparación de CAM de diez días sin tratar
detectada por inmunoreactividad de inmunofluorescencia con CSAT,
un anticuerpo anti-\beta_{1}. La figura 5B
muestra la distribución del receptor de \alpha_{v}\beta_{3}
en una preparación de CAM de 10 días sin tratar detectada por
inmunoreactividad de inmunofluorescencia con LM609, un anticuerpo
anti-\alpha_{v}\beta_{3}. L figura 5C
muestra la distribución del receptor de \alpha_{v}\beta_{3}
en una preparación de CAM de 10 días tratada con \betaFGF
detectada por inmunoreactividad de inmunofluorescencia con LM609,
un anticuerpo anti-\alpha_{v}\beta_{3}. Los
tratamientos y los resultados se describen en el Ejemplo 5C.
La figura 6 ilustra la cuantificación en un
gráfico de barras de la expresión relativa de
\alpha_{v}\beta_{3} y \beta_{1} en CAMs de 10 días
tratadas con \betaFGF descritas en el Ejemplo 6A. La principal
intensidad de fluorescencia se representa sobre el eje Y con los
perfiles de integrina representados sobre el eje X.
Las figuras 7A-7C ilustran el
aspecto de una CAM de 10 días sin tratar, una CAM tratada con
\beta_{FGF}, y una CAM tratada con TNF\alpha,
respectivamente, cuyos procedimientos y resultados se describen en
el Ejemplo 6A.
Las figuras 8A-8E ilustran el
efecto del tratamiento tópico con anticuerpo sobre angiogénesis
inducida por FGF en una CAM de 10 día como se describe en el
Ejemplo 741). La figura 8A muestra una preparación de CAM sin
tratar que está desprovista de vasos sanguíneos. La figura 8B
muestra la infiltración nueva vasculatura en un área previamente
desprovista de vasculatura inducida por tratamiento con
\betaFGF. Las figuras 8C, 8D y 8E respectivamente muestran los
efectos de los anticuerpos contra \beta_{1}
(anti-\beta_{1}; CSAT),
\alpha_{v}\beta_{5}
(anti-\alpha_{v}\beta_{5}; P3G2) y
\alpha_{v}\beta_{3}
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}; LM609).
Las figuras 9A-9C ilustran el
efecto de la inyección intravenosa del péptido sintético 66203
sobre la angiogénesis inducida por tumores como se describe en el
Ejemplo 7D2). La figura 9A muestra la falta de efecto inhibitorio
del tratamiento intravenoso con un péptido de control (tumor de
péptido de control) sobre la angiogénesis resultante de la
inducción tumoral. La inhibición de tal angiogénesis por inyección
intravenosa del péptido 66203 (Tumor RGD cíclico) se muestra en
la figura 9B. La falta de efectos inhibitorios o citotoxicidad
sobre los vasos preexistentes maduros que siguen a la infusión
intravenosa del péptido 66203 en un área adyacente al área tratada
del tumor se muestra en la figura 9C (CAM adyacente de RGD
cíclico).
Las figuras 10A-10C ilustran el
efecto de la aplicación intravenosa de anticuerpos monoclonales a
la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento como se
describe en el Ejemplo 7B1). La figura 10A muestra la angiogénesis
inducida por \betaFGF no expuesta a tratamiento por anticuerpo
(control). No se produce inhibición de la angiogénesis cuando se
trata una preparación similar con el anticuerpo de
\alpha_{v}\beta_{5} P3G2 como se muestra en la figura 10B.
La inhibición de la angiogénesis producida con el tratamiento del
anticuerpo de anti-\alpha_{v}\beta_{3} LM609
se muestra en la figura 10B.
Las figuras 11A-11C ilustran el
efecto sobre la angiogénesis embriónica que sigue a la aplicación
tópica de anticuerpos de anti-integrina descrita en
el Ejemplo 7C. La angiogénesis no se inhibió por el tratamiento de
una CAM de 6 días con anticuerpos
anti-\beta_{1} y
anti-\alpha_{v}\beta_{5}, respectivamente
mostrados en las figuras 11A y 11B. en contraste con lo anterior,
el tratamiento con el anticuerpo de
anti-\alpha_{v}\beta_{3} LM609 dio como
resultado la inhibición de la formación de vasos sanguíneos como
se muestra en la figura 11C.
La figura 12 ilustra la cuantificación del número
de vasos que entran en un tumor en una preparación de CAM como se
describe en el Ejemplo 7D1). El gráfico muestra el número de vasos
representados sobre el eje Y resultantes de la aplicación tópica de
CSAT (anti-\beta_{1}), LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) o P3G2
(anti-\alpha_{v}\beta_{5}).
Las figuras 13A-13D ilustran una
comparación entre los pesos húmedos de los tumores con un
tratamiento de 7 días y los pesos iniciales de los tumores como se
describe en el Ejemplo 9A1)a. Cada barra representa el \pm
E.T. medio. de 5-10 tumores por grupo. Los tumores
se derivaron de las preparaciones de CAM del melanoma humano
(M21-L) (Figura 13A), carcinoma pancreático (Fg)
(Figura 13B), carcinoma de pulmón (UCLAP-3) (Figura
13C), y carcinoma de laringe (Hep3) (Figura 13D) y se trataron
intravenosamente con PBS, CSAT (anti-\beta_{1}),
o LM609 (anti-\alpha_{v}\beta_{3}) o PBS
como se indica en el eje X.
Las figuras 14A y 14B ilustran las secciones
histológicas de los tumores tratados con P3G2
(anti-\alpha_{v}\beta_{5}) (Figura 14A) y
LM609 (anti-\alpha_{v}\beta_{3}) (Figura
14B), y teñidos con hematoxilina y eosina como se describe en el
Ejemplo 9ª1)a. Como se muestra en la figura 14A, los tumores
tratados con l anticuerpo de control (P3G2) mostraron numerosas
células tumorales viables y de división activa hincadas por las
figuras mitóticas (puntas de flecha) así como por múltiples vasos
sanguíneos (flechas) a través de todo el estroma tumoral. En
contraste con lo anterior, se detectaron pocas o ninguna célula
tumoral viable o vasos sanguíneo en los tumores tratados con LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) en la figura
14B.
Las figuras 15A-15E corresponden
a los tumores M21L tratados con los péptidos descritos en el
Ejemplo 9A1)b y son los siguientes: en la figura 15A, péptido
RAD cíclico de control (69601); en la figura 15B, péptido RGD
cíclico (66203); en la figura 15C, tejido de CAM adyacente tomado
de los mismos embriones tratados con péptidos RGD cíclico (66203) y
gran ampliación (13x) de los tumores tratados con el RAD de
control (69601) en la figura 15D o el péptido RGD cíclico (66203)
en la figura 15E. La figura 15D representa los vasos normales del
tumor tratado con el péptido de control RAD (69601). La figura 15E
describe ejemplos de vasos sanguíneos interrumpidos de tumores
(flechas) tratados con el péptido RGD cíclico (66203).
Las figuras 16A-16E representan
la inhibición de la angiogénesis por antagonistas de angiogénesis
en el ensayo de modelo de ojo de conejo in vivo descrito en
el Ejemplo 10. Las figuras 16A y 16B describen la angiogénesis del
ojo de conejo en presencia de \betaFGF y mAb p1F6
(anti-\alpha_{v}\beta_{5}). Las figuras 16C,
16C y 16E describen la inhibición de la angiogénesis del ojo de
conejo en presencia de \betaFGF y mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}).
LA figura 17 representa un organigrama de cómo
se genera el modelo in vivo de ratón quimérico: ratón humano
descrito en el Ejemplo 11A. Una porción de piel de un ratón SCID se
sustituyó con prepucio neonatal humano y se dejó cicatrizar
durante 4 semanas. Después de la cicatrización del injerto, se
inoculó el prepucio humano con células tumorales humanas. Durante el
siguiente periodo de 4 semanas, se estableció un tumor medible que
comprendió un tumor humano con crecimiento de vasculatura humana a
partir de la piel humana en el tumor humano.
La figura 18 ilustra el porcentaje de células
sencillas derivadas de CAM tratadas con mAb y con péptido y teñidas
con Apop Tag determinadas mediante el análisis FACs y descritas
en los Ejemplos 12A y 12B, respectivamente. Las barras negras y
punteadas representan células de embriones tratadas 24 horas y 48
horas antes del ensayo, respectivamente. Cada barra representa el
\pm E.T. medio de tres replicas. Las Cam se trataron con eran mAb
LM609 (anti-\alpha_{v}\beta_{3}), o Csat
(anti-\beta_{1}), o PBS como se describe en el
Ejemplo 12A2). Las Cam también se trataron con el péptido cíclico
69203 (ciclo-RGDfV), indicado como Péptido 203) o el
péptido cíclico de control 69601 (ciclo-RADfV,
indicado como Péptido 601) como se describe en el Ejemplo 12B.
Las figuras 19A y 19B ilustran los resultados
combinados de las suspensiones de células sencillas de CAM de
embriones tratadas CSAT (anti-\beta_{1}) (Figura
19A) o LM609 (anti-\alpha_{v}\beta_{3})
(Figura 19B) teñidas con Apog Tag y yoduro de propidio, y
analizadas por FACS como se describe en el Ejemplo 12C. El eje Y
representa el teñido con Apop Tag de series de células (Apóptosis),
el eje X representa el teñido con yoduro de propidio (Contenido de
ADN). La línea horizontal representa la barrera negativa para el
teñido con Apop Tag. Los paneles de la izquierda y de la derecha
indican las células CAM de embriones tratados con CSAT
(anti-\beta_{1}) (figura 19A) y LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) (figura 19B),
respectivamente El análisis de ciclo celular se llevó a cabo
mediante el análisis de aproximadamente 8.000 eventos por
condición.
Las figuras 20A-20C representan
tejido de CAM de embriones tratados con CSAT
(anti-\beta_{1}) y las figuras
20D-20F representan tejido de CAM de embriones
tratados con LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) preparado como
de describe en el Ejemplo 12C. Las figuras 20A y 20D describen los
tejidos teñidos con Apop Tag y visualizados mediante fluorescencia
(FITC) superpuestos sobre una imagen D.I.C. Las figuras 20B y 20E
describen los mismos tejidos teñidos con mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) y visualizados
por fluorescencia. (rodamina). Las figuras 20C y 20F representan
imágenes fundidas de los mismos tejidos teñidos tanto con Apop Tag
como con LM609 donde el teñido amarillo representa la
colocalización. La barra representa 15 y 50 \mum en los paneles
de la izquierda y de la derecha, respectivamente.
Residuo de aminoácido: un aminoácido
formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en
sus enlaces peptídicos. Los residuos de aminoácido descritos en la
presente memoria descriptiva tienen preferiblemente la forma
isomérica de una "L". Sin embargo, los residuos con forma
isomérica de "D" e pueden sustituir por cualquier residuo
aminoácido en forma de L, mientras que se retiene la propiedad
funcional por el polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo amino
libre presente en el término amino de un polipéptido. COOH se
refiere al grupo carboxi libre presente en el término carboxi de un
polipéptido. Según la nomenclatura estándar de los polipéptidos
(descrita en J. Biol.. Chem., 243:3552-59
(1969) adoptada en 37 CFR \NAK1.822 (b) (2)), las abreviaturas
para los residuos de aminoácido se muestran en la siguiente Tabla
de Correspondencia:
Símbolo | Aminoácidos | ||
de 1 letra | de 3 letras | ||
Y | Tyr | tirosina | |
G | Gly | glicina | |
F | Phe | fenilalanina | |
M | Met | metionina | |
A | Ala | alanina | |
S | Ser | serina | |
I | Ile | isoleucina | |
L | Leu | leucina | |
T | Thr | treonina | |
V | Val | valina | |
P | Pro | prolina | |
K | Lis | lisina | |
H | his | histidina | |
Q | Gln | glutamina | |
E | Glu | ácido glutámico | |
Z | Glx | Glu y/o Gln | |
W | Trp | triptofano | |
R | Arg | arginina | |
D | Asp | ácido aspártico | |
N | Asn | asparagina | |
B | Asx | Asn y/o Asp | |
C | Cys | cisteína | |
X | Xaa | desconocido/otro |
Además, los siguientes tienen los siguientes
significados
BOC | terc-butiloxicarbonilo | |
DCCI | dicinohexilcarbodiimida | |
DMF | dimetilformamida | |
OMe | metoxi | |
HOBt | 1-hidroxibezotriazol |
Se debe subrayar que todas las secuencia de
residuos de aminoácido se representan en la presente memoria
descriptiva mediante fórmulas cuya orientación a la izquierda y a
la derecha es lo es en la dirección convencional del término amino
al término carboxi. Además, se debería resaltar que un guión al
principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácido
indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o,
más residuos de aminoácido.
Polipéptidos: Se refiere a una serie
lineal de residuos de aminoácido conectados el uno al otro por
enlaces peptídicos entre el grupo alfa-amino y el
grupo carboxi de los residuos contiguos de aminoácido
Péptido: tal como se usa en la presente
memoria descriptiva se refiere a una serie lineal de no más de
aproximadamente 50 residuos de aminoácido conectados el uno al otro
en forma de un polipéptido.
Péptido cíclico: Se deriva de un péptido
lineal correspondiente y, se refiere a un péptido en el que no
existen términos N o C libres, y del cual los términos N del
péptido lineal correspondiente forman un enlace amido con el
carboxilato de termino C del péptido lineal correspondiente.
Proteína: se refiere a una serie lineal
superior a 50 residuos de aminoácido conectados el uno al otro en
forma de un polipéptido.
Péptido sintético: se refiere a una cadena
producida químicamente de residuos de aminoácido enlazados juntos
por enlaces peptídicos que está de proteínas obtenidas de manera
natural y fragmentos de las mismas.
La presente invención se refiere generalmente al
descubrimiento de que la angiogénesis se induce mediante el
receptor específico de vitronectina \alpha_{v}\beta_{3}, y
que la inhibición de la función \alpha_{v}\beta_{3} inhibe
la angiogénesis. Este descubrimiento es importante a causa de la
función que desempeña la angiogénesis en una diversidad de procesos
de enfermedad. Mediante la inhibición de la angiogénesis, se puede
intervenir en la enfermedad, mejorar los síntomas, y en algunos
casos curar la enfermedad.
Allí donde el crecimiento de nuevos vasos
sanguíneos es la causa de, o contribuye a, la patología asociada a
una enfermedad, la inhibición de la angiogénesis reducirá los
efectos deletéreos de la enfermedad. Los ejemplos incluyen la
artritis reumatoide, la retinopatía diabética, la restenosis y
similares. Allí donde se requiere el crecimiento de nuevos vasos
sanguíneos para soportar el crecimiento de un tejido deletéreo, la
inhibición de la angiogénesis reducirá el aporte de sangre al tejido
y por lo tanto contribuirá a la reducción de la masa del tejido
basada en los requisitos de aporte de sangre. Los ejemplo incluyen
el crecimiento de tumores donde la neovascularización es un
requisito continuo para que el tumor crezca más allá de unos pocos
milímetros de espesor, y para el establecimiento de la metástasis
sólida del tumor.
Los usos de la presente invención son eficaces en
parte gracias a que la terapia es altamente selectiva para la
angiogénesis y no para otros procesos biológicos. Como se muestra en
los Ejemplos, sólo el nuevo crecimiento de vasos contiene
\alpha_{v}\beta_{3} sustancia, y por lo tanto los
procedimientos terapéuticos no efectúan de manera perjudicial a los
vasos maduros. Además, \alpha_{v}\beta_{3} no se distribuye
en gran medida en los tejidos normales, pero se encuentra
selectivamente en los nuevos vasos, con lo que se garantiza que la
terapia puede dirigirse selectivamente al nuevo crecimiento de
vasos.
El descubrimiento de que la inhibición de
\alpha_{v}\beta_{3} sólo, inhibirá eficazmente la
angiogénesis permite el desarrollo de las composiciones
terapéuticas con una especificidad potencialmente elevada, y por lo
tanto una toxicidad relativamente baja. De este modo, aunque la
invención describe el uso de reactivos basados en péptidos que
tienen la capacidad de inhibir una o más integrinas, se pueden
diseñar otros reactivos que inhiban más selectivamente
\alpha_{v}\beta_{3}, y por lo tanto no tengan el efecto
secundario de inhibir otros procesos biológicos distintos de los
inducidos por \alpha_{v}\beta_{3}.
Por ejemplo, como se muestra mediante las
presentes enseñanzas, es posible preparar anticuerpos monoclonales
altamente selectivos para la inmunoreacción de
\alpha_{v}\beta_{3}, que son selectivos de manera similar
para la inhibición de la función \alpha_{v}\beta_{3}.
Además, los péptidos que contienen RGD se pueden diseñar para que
sean selectivos para la inhibición de \alpha_{v}\beta_{3},
como se describe, además, en la presente descripción
descriptiva.
Antes de producirse los descubrimiento de la
presente invención, no se conocía que la angiogénesis, y ninguno de
los procesos dependientes de la angiogénesis, se pudiese inhibir
in vivo mediante el uso de los reactivos que antagonizan la
función biológica \alpha_{v}\beta_{3}.
La invención proporciona un procedimiento para
la inhibición de la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto para
inhibir eventos en el tejido que dependen de la angiogénesis.
Generalmente, el procedimiento comprende administrar al tejido una
composición que comprende una cantidad que inhibe la angiogénesis de
un antagonista \alpha_{v}\beta_{3}.
Como se ha descrito anteriormente, la
angiogénesis incluye una diversidad de procesos que implican la
vascularización de un tejido que incluye "el crecimiento
rápido", la vasculogénesis o el ensanchamiento de vasos, todos
los cuales son procesos de angiogénesis inducidos por y dependientes
de la expresión de \alpha_{v}\beta_{3}. Se cree que, con la
excepción de la cicatrización de herida traumática, la formación de
cuerpo lúteo y la embriogénesis, la mayoría de los procesos de
angiogénesis se asocian con procesos de enfermedad y por lo tanto
el uso de los presentes procedimientos terapéuticos son selectivos
para la enfermedad y no tienen efectos secundarios deletéreos.
Hay una diversidad de enfermedades en las que se
cree que la angiogénesis es importante, conocidas como enfermedad
angiogénicas, que incluyen pero no se limitan a, los trastornos
inflamatorios tales como la inflamación inmune y
no-inmune, el reutamismo articular crónico y la
soriasis. Los trastornos asociados con la invasión inapropiada o
inoportuna de los vasos tales como la retinopatía diabética, el
glaucoma neovascular, la restenosis, la proliferación capilar en
las placas ateroscleróticas y la osteoporosis, y los trastornos
asociados con el cáncer, tales como los tumores sólidos, las
metástasis de tumores sólidos, los angiofibromas, la fibroplasia
retrolental, los angiomas, el sarcoma de Kaposi y los cánceres
similares que requieren la neovascularización para soportar el
crecimiento tumoral.
De este modo, los procedimientos que inhiben la
angiogénesis en un tejido enfermo mejoran los síntomas de la
enfermedad, y que dependen de la enfermedad, pueden contribuir a
curar la enfermedad. El alcance de la angiogénesis en un tejido, y
por lo tanto el alcance de la inhibición realizada por los
presentes procedimientos, se puede evaluar por una diversidad de
procedimientos, tales como se describen en los Ejemplos para
detectar las estructuras de vasos
\alpha_{v}\beta_{3}-inmunopositivos
inmaduros y nacientes por inmunohistoquímica.
Como se describe en la presente memoria
descriptiva, cualquiera de una diversidad de tejidos u órganos
constituidos por tejidos organizados, puede soportar la
angiogénesis en las afecciones de enfermedad que incluyen la piel,
el músculo, el intestino, el tejido conectivo, las articulaciones,
los huesos y los tejidos similares los cuales los vasos sanguíneos
se pueden invadir al producirse estímulos angiogénicos.
El paciente tratado en la presente invención, en
sus diversas realizaciones es deseablemente un paciente humano,
aunque se ha de entender que los principios de la invención indican
que la invención es efectiva en lo relativo a todos los mamíferos,
que están destinados a incluirse en el término "paciente". En
este contexto, se entiende que un mamífero incluye cualquier
especie mamífera en la que es deseable, el tratamiento de las
enfermedades asociadas con la angiogénesis particularmente
especies de mamíferos de la cabaña ganadera y domésticos.
En otra realización relacionada, un tejido a
tratar es un tejido retinal de un paciente con retinopatía
diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular y la
angiogénesis a inhibir es angiogénesis de tejido retinal donde hay
neovascularización de tejido retinal.
En una realización relacionada adicional, un
tejido a tratar es un tejido tumoral de un paciente con un tumor
sólido, un cáncer de mama, un hemangioma o angiofibroma y cánceres
similares, y la angiogénesis a inhibir es una angiogénesis de tejido
tumoral en la que hay neovascularización de un tejido tumoral. Los
tejidos tumorales sólidos típicos tratables por los presentes
procedimientos incluyen tejidos del pulmón, el páncreas, el mama,
el colon, la laringe, el ovario y tejidos similares. En los Ejemplos
se describe la angiogénesis de tejido tumorales ejemplares y la
inhibición de la misma.
La inhibición de la angiogénesis de tejidos
tumorales es una realización particularmente preferida debido a la
importante función de neovascularización que desempeña en el
crecimiento tumoral. En ausencia de neovascularización del tejido
tumoral, el tejido tumoral no consigue los nutrientes requeridos,
ralentiza su crecimiento, detiene el crecimiento adicional,
retrocede y por último se necrosa dando como resultado la muerte
del tumor.
En una realización relacionada, la invención
contempla la puesta en práctica del procedimiento junto con otras
terapias tales como la quimioterapia convencional dirigida contra
los tumores sólidos y para controlar el establecimiento de las
metástasis. La administración del inhibidor de angiogénesis se
lleva a cabo típicamente durante o después de la quimioterapia,
aunque es preferible inhibir la angiogénesis después de un régimen
de quimioterapia en los momentos en los que los tejidos tumorales
respondan al ataque tóxico por la inducción de la angiogénesis para
recuperarse mediante el suministro de un aporte de sangre y
nutriente al tejido tumoral. Además, se prefiere administrar los
procedimientos de inhibición de la angiogénesis después de la
cirugía en la que se han retirado los tumores sólidos en forma de
una profilaxis contra metástasis.
En la medida en que los presentes procedimientos
se aplican a la inhibición de la neovascularización de tumores, los
procedimientos también se pueden aplicar a la inhibición del
crecimiento de tejido tumoral, a la inhibición de formación de
metástasis tumoral, y a la regresión de los tumores establecidos.
Los Ejemplos demuestran la regresión de un tumor establecido
después de una única administración intravenosa de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de la invención.
La restenosis es un proceso de migración y
proliferación de células del músculo liso (SMC) en lugar de
angioplastia coronaria transluminal percutánea que dificulta el
éxito de la angioplastia. La migración y la proliferación de las
SMC durante la restenosis se puede considerar como un proceso de
angiogénesis que se inhibe por los presentes procedimientos. Por lo
tanto, la invención también contempla la inhibición de la
restenosis inhibiendo la angiogénesis en un paciente que sigue a
los procedimientos de angioplastia. Para la inhibición de la
restenosis, el antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} se
administra típicamente después del procedimiento de angioplastia
administrada durante aproximadamente 2 a aproximadamente 28 días, y
más típicamente durante aproximadamente los primeros 14 días que
siguen al procedimiento.
Las gamas de dosificación para la administración
del antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} dependen de la forma
del antagonista, y su potencia, como se describe más adelante en la
presente memoria descriptiva, y son grandes cantidades suficientes
para producir el efecto deseado consiguiendo que la angiogénesis y
los síntomas de enfermedad inducidos por angiogénesis mejoren. La
dosificación no debería ser tan elevada como para causar efectos
secundarios adversos, tales como los síndromes de hiperviscosidad,
el edema pulmonar, el fallo cardiaco congestivo, y similares.
Generalmente, la dosificación variará con la edad, la condición,
el sexo y el alcance de la enfermedad en el paciente y se puede
determinar por un experto en la técnica. La dosificación también se
puede ajustar por un médico particular en caso de darse alguna
complicación.
La cantidad terapéuticamente eficaz es una
cantidad de antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} suficiente
para producir una inhibición medible de angiogénesis en el tejido
que se está tratando, es decir, una cantidad de inhibición de la
angiogénesis. La inhibición de la angiogénesis se puede medir in
situ por inmunohistoquímica, como se describe en la presente
memoria descriptiva, o por otros procedimientos conocidos por un
experto en la técnica.
En la medida en que el antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} puede adoptar la forma de un mimético
de \alpha_{v}\beta_{3}; un péptido que contienen RGD, un
anticuerpo monoclonal
anti-\alpha_{v}\beta_{3}, o un fragmento de
los mismos, se ha de entender que la potencia, y por lo tanto una
expresión de una cantidad "terapéuticamente eficaz" pueden
variar. Sin embargo, como se muestra en los presentes
procedimientos de ensayo, un experto en la técnica puede evaluar
fácilmente la potencia de un antagonista candidato de
\alpha_{v}\beta_{3} de la invención.
La potencia de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} se puede medir mediante una diversidad
de medios que incluyen la inhibición de la angiogénesis en el
ensayo de CAM, en el ensayo in vivo de ojo de conejo, en el
ensayo in vivo ratón químerico: ratón humano, y midiendo la
inhibición de la unión de ligando natural a
\alpha_{v}\beta_{3}, todos descritos en la presente memoria
descriptiva, y los ensayos similares.
Un antagonista preferido de
\alpha_{v}\beta_{3}tiene la capacidad de inhibir
sustancialmente la unión de un ligando natural tal como el
fibrinógeno o la vitronectina a \alpha_{v}\beta_{3}
disuelto en concentraciones de antagonista inferiores a 0,5
micromolares (um), preferiblemente inferior a 0,1 um, y más
preferiblemente inferior a 0,05 um. Por "sustancialmente" se
entiende que se observa al menos una reducción del 50% en la unión
del fibrinógeno mediante la inhibición en la presencia del
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3}, y al 50% la inhibición
se refiere en la presente memoria descriptiva como un valor
IC_{50}.
Un antagonista más preferido de
\alpha_{v}\beta_{3} exhibe selectividad para
\alpha_{v}\beta_{3}sobre otras integrinas. De este modo, un
antagonista preferido de \alpha_{v}\beta_{3} inhibe
sustancialmente la unión de fibrinógeno a
\alpha_{v}\beta_{3} pero no inhibe sustancialmente la
unión del fibrinógeno a otras integrinas, tales como
\alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{5} o
\alpha_{IIb}\beta_{3}. Particularmente preferido es un
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} que exhibe una actividad
de IV_{50} de 10 a 100 veces inferior en la inhibición de la
unión del fibrinógeno a \alpha_{v}\beta_{3} comparado con
la actividad de \alpha_{v}\beta_{3} en la inhibición de la
unión del fibrinógeno a otra integrina. Los ensayos ejemplares para
medir la actividad de IC_{50}en la inhibición de la unión de
fibrinógeno a una integrina se describen en los Ejemplos.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} de la invención en forma
de un anticuerpo monoclonal es típicamente una cantidad tal que
cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable
es suficiente para llevar a cabo una concentración de plasma de
aproximadamente 0,01 microgramo (ug) por mililitro (ml) a
aproximadamente 10 ug/ml, preferiblemente de aproximadamente 1 ug/ml
a aproximadamente 5 ug/ml, y normalmente aproximadamente 5 ug/ml.
Por el contrario, la dosificación puede variar de aproximadamente
0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, preferiblemente de
aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, más
preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20
mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno
o varios días.
Cuando el antagonista está en forma de un
fragmento de un anticuerpo monoclonal, la cantidad se puede ajustar
fácilmente sobre la base de la masa del fragmento respecto de la
masa de todo el anticuerpo. Una concentración de plasma preferida en
molaridad es de aproximadamente 2 micromolares (uM) a
aproximadamente 5 milimolares (mM) y de manera preferible
aproximadamente 100 uM a 1 mM de antagonista de anticuerpo.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} de la invención en forma
de un polipéptido, u otro mimético de \alpha_{v}\beta_{3}
de pequeñas molécula de idénticas dimensiones, es típicamente una
cantidad de polipéptido talque cuando se administra en una
composición fisiológicamente tolerable es suficiente para llevar a
cabo una concentración de plasma de aproximadamente 0,1 microgramo
(ug) por mililitro (ml) a aproximadamente 200 ug/ml, preferiblemente
de aproximadamente 1 ug/ml a aproximadamente 150 ug/ml, Basado en
un polipéptido que tienen una masa de aproximadamente 500 gramos
por mol, la concentración preferida en molaridad es de
aproximadamente 2 micromolares (uM) a aproximadamente 5 milimolares
(mM) y de manera preferible aproximadamente 100 uM a 1 mM de
antagonista de polipéptido. Por el contrario, la dosificación por
peso corporal puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a
aproximadamente 300 mg/kg, y preferiblemente de aproximadamente
0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, en una o más
administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días.
Los anticuerpos monoclonales o polipéptidos de la
invención se pueden administrar por vía parenteral mediante
inyección o por infusión gradual a lo largo del tiempo. Aunque,
típicamente se puede acceder al tejido a tratar en el cuerpo por
administración sistémica y por lo tanto tratar más a menudo por
administración intravenosa de composiciones terapéuticas, se
contemplan otros tejidos y medios de distribución en los que hay
una probabilidad de que el tejido apuntado contenga la molécula
diana. De este modo los anticuerpos monoclonales o polipéptidos de
la invención se pueden administrar por vía intravenosa,
intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavital,
transdérmica y se puede distribuir por medios peristálticos.
Las composiciones terapéuticas que contienen un
anticuerpo monoclonal o un polipéptido de la invención se
administran convencionalmente por vía intravenosa, como por ejemplo
una inyección de una dosis unitaria. El término "dosis
unitaria" cuando se usa en referencia a una composición
terapéutica de la presente invención se refiere a unidades
físicamente discretas apropiadas como dosificación unitaria para el
sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de
material activo calculada para producir el efecto terapéutico
deseado junto con el diluyente requerido; es decir, un excipiente o
un vehículo.
En una realización preferida como se muestra en
los Ejemplos, el antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} se
administra en una única dosificación por vía intravenosa.
Las composiciones se administran de una manera
compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad
terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar y su programación
temporal depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema del
sujeto para utilizar el ingrediente activo, y el grado del efecto
terapéutico deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo
deseado a administrar dependen del juicio del médico y son
peculiares para cada individuo. Sin embargo, las gamas apropiadas
de dosificación para la aplicación sistémica se describen en la
presente memoria descriptiva y dependen de la vía de
administración. Los regímenes apropiados para la administración
también son variables, pero se tipifican mediante una administración
inicial seguida de repetidas dosis a intervalos de una o más horas
por una inyección posterior u otra administración.
Alternativamente, también se contempla la infusión intravenosa
continua suficiente para mantener concentraciones en sangre del
orden de los valores especificados para terapias in vivo.
Como se demuestra mediante los presentes
Ejemplos, la inhibición de la angiogénesis y la regresión tumoral se
produce como muy pronto 7 días después de la inicial toma de
contacto con el antagonista. Se prefiere una exposición adicional o
prolongada al antagonista durante 7 días a 6 semanas,
preferiblemente aproximadamente 14 a 28 días.
En una realización relacionada, los Ejemplos
demuestran la relación entre la inhibición de
\alpha_{v}\beta_{3} y la inducción de la apóptosis en las
células de neovasculatura que llevan \alpha_{v}\beta_{3}.
La apóptosis se manifiesta rápidamente, típicamente aproximadamente
48 horas después de entrar en contacto con el antagonista,
mientras que la inhibición de la angiogénesis y la regresión
tumoral se manifiesta más lentamente, tal como se describe en la
presente memoria descriptiva. La diferencia afecta al régimen
terapéutico en términos del tiempo de administración, y del efecto
deseado. Típicamente, la administración para la apóptosis de
neovasculatura se puede realizar durante 24 horas a aproximadamente
4 semanas, aunque se prefiere el intervalo de 48 horas a 7
días.
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención contiene un excipiente fisiológicamente tolerable junto
con un antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} como se describe
en la presente memoria descriptiva, disuelto o disperso en éstas
últimas en forma de un ingrediente activo. En una realización
preferida, la composición terapéutica del antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} no es inmunogénica cuando se administra
a un paciente mamífero o humano con fines terapéuticos.
Tal como se usa en la presente memoria
descriptiva, los términos "farmacéuticamente aceptable",
"fisiológicamente tolerable" y sus variaciones gramaticales
cuando se refieren a las composiciones, los excipientes, los
diluyentes y los reactivos, se usan de manera intercambiable y
representan que los materiales pueden administrarse a un mamífero
sin producir efectos fisiológicos adversos tal como nauseas, mareos,
malestar gástrico y similares.
La preparación de una composición que contiene
los ingredientes activos disueltos o dispersos en esta última se
conoce bien en la técnica y no necesita limitación sobre la base de
su formulación. Típicamente tales composiciones se preparan en
forma de inyectables, bien como soluciones líquidas o suspensiones,
aunque se pueden preparar formas sólidas para una solución o
suspensiones, en líquido antes de su uso. La preparación también se
puede emulsionar.
El ingrediente activo se puede mezclar con
excipientes que son farmacéuticamente aceptable y compatibles con el
ingrediente activo y en cantidades apropiadas para su uso en los
procedimientos terapéuticos descritos en la presente memoria
descriptiva. Los excipientes apropiados son, por ejemplo, agua,
solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similar y las
combinaciones de los mismos. Además si se desea, la composición
puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales
como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de taponamiento de
pH y similares que mejoran la eficacia del ingrediente activo.
La composición terapéutica de la presente
invención pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de los
componentes incluidos en la misma. Las sales farmacéuticamente
aceptable incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los
grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos
inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o
fosfórico, o ácidos inorgánicos tales como el ácido acético,
tártarico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos
carboxilo libres también se pueden derivar de las bases
inorgánicas tales como, por ejemplo los hidróxidos de sodio,
potasio, amonio, calcio o férrico, y las bases orgánicas tales como
la isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino
etanol, histidina, procaína y similares.
Particularmente se prefieren las sales de TFA y
HCl, cuando se usan en la preparación de antagonistas de
\alpha_{v}\beta_{3} de polipéptidos cíclicos. En los
Ejemplos se describen las sales representativas de los
péptidos.
Los excipientes fisiológicamente tolerables son
bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de los excipientes líquidos
son las soluciones acuosas estériles que no contienen ningún
material además de los ingredientes activos y el agua, o contienen
un tampón tal como el fosfato de sodio con un valor de pH
fisiológico, una solución salina fisiológica o ambos, tal como
fosfato-solución salina tamponada. Además, los
excipientes acuosos pueden contener más de una sal de tampón, así
como sales tales como cloruros de sodio y potasio, dextrosa,
polietilenglicol y otros solutos.
Las composiciones líquidas también pueden
contener fases líquidas además de y con la exclusión de agua. Un
ejemplo de dichas fases líquidas adicionales son la glicerina, los
aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón y
emulsiones de agua-aceite.
La composición terapéutica contiene una cantidad
de inhibición de la angiogénesis de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de la presente invención, típicamente
formulada para contener una cantidad de al menos un 0,1% en peso
del antagonista por peso de la composición terapéutica total. Un
porcentaje en peso es una relación por peso del inhibidor respecto
de la composición total. De este modo, por ejemplo, el 0,1% en peso
es 0,1 gramo de inhibidor por 100 gramos de composición total.
Los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3}
se usan en los presentes procedimientos para inhibir la
angiogénesis en los tejidos, y pueden adoptar una diversidad de
formas que incluyen los compuestos que interactúan con
\alpha_{v}\beta_{3} de manera que se interfieren las
interacciones funcionales con ligandos naturales de
\alpha_{v}\beta_{3}. Los antagonistas de los ejemplos
incluyen los análogos de \alpha_{v}\beta_{3} derivados del
sitio de unión de ligandos sobre \alpha_{v}\beta_{3},
miméticos de \alpha_{v}\beta_{3} o un ligando natural de
\alpha_{v}\beta_{3} que mimetizan la región estructural
implicada en las interacciones de unión de
\alpha_{v}\beta_{3}-ligando, polipéptidos
que tienen una secuencia que corresponde a un dominio de unión
funcional del ligando natural específico para
\alpha_{v}\beta_{3}, que corresponde particularmente al
dominio que contiene RGD de un ligando natural de
\alpha_{v}\beta_{3}, y los anticuerpos que se hacen
inmunoreaccionar con \alpha_{v}\beta_{3} o el ligando
natural, todos los cuales exhiben actividad antagonista como se
define en la presente memoria descriptiva.
En una realización, la invención contempla
antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3} en forma de
polipéptidos. Un antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} de
polipéptido (péptido) puede tener las características de secuencia
del ligando natural del \alpha_{v}\beta_{3} p del propio
\alpha_{v}\beta_{3} en la región implicada en la interacción
\alpha_{v}\beta_{3}-ligando y exhibe
actividad antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} tal como se
describe en la presente memoria descriptiva. Un péptido antagonista
de \alpha_{v}\beta_{3} preferido contienen el tripéptido
RGD y corresponde en secuencia al ligando natural en la región que
contienen RGD.
Los polipéptidos preferidos que contienen RGD
tienen una secuencia que corresponde a la secuencia de residuos de
aminoácido de la región que contiene RGD de un ligando natural de
\alpha_{v}\beta_{3} como fibrinógeno, vitronectina, factor
de von Willebrand, laminina, trombospondina y ligandos similares.
La secuencia de estos ligandos de \alpha_{v}\beta_{3} son
bien conocidos. De este modo, un péptido antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} se puede derivar de cualquiera de los
ligandos naturales, aunque se prefiere el fibrinógeno y la
vitronectina.
Un péptido antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} particularmente preferido inhibe
preferiblemente la unión de \alpha_{v}\beta_{3} a
su(s)
\hbox{ligando(s)}cuando se compara con otras integrinas, tal como se ha descrito anteriormente. Se prefieren particularmente los péptidos específicos de \alpha_{v}\beta_{3} al menos porque la especificidad para \alpha_{v}\beta_{3} reduce la incidencia de efectos secundarios indeseables tal como la inhibición de otras integrinas. La identificación de los péptidos antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3} preferidos que tienen selectividad para \alpha_{v}\beta_{3} se pueden identificar fácilmente en una inhibición típica del ensayo de unión, tal como el ensayo ELISA descrito en los Ejemplos.
En una realización, un polipéptido de la presente
invención no comprende más de aproximadamente 100 residuos de
aminoácido, preferiblemente no más de aproximadamente 60 residuos,
más preferiblemente no más de aproximadamente 30 residuos. Los
péptidos pueden ser lineales o cíclicos, aunque particularmente los
péptidos preferidos son cíclicos.
Los péptidos cíclicos y lineales preferidos y sus
designaciones se muestran en la Tabla 1 en los Ejemplos.
Se debería entender que un polipéptido sujeto no
necesita ser idéntico a la secuencia de residuos de aminoácido de un
ligando natural de \alpha_{v}\beta_{3}, siempre que
incluya la secuencia requerida y pueda funcionar como un
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} en un ensayo tal como
los descritos en la presente memoria descriptiva.
Un polipéptido sujeto incluye cualquier análogo,
fragmento o derivado químico de un polipéptido cuya secuencia de
residuos de aminoácido se muestra en la presente memoria
descriptiva, siempre que el polipéptido sea un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} Por lo tanto, un polipéptido actual se
puede someter a diversos cambios, sustituciones, inserciones y
deleciones donde tales cambios proporcionan determinadas ventajas
en su uso. A este efecto, el polipéptido antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de la invención corresponde a un
péptido mencionado donde se hacen uno o más cambios y retiene la
capacidad de funcionar como un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} en uno o más de los ensayos tal como se
definen en la presente memoria.
De este modo, un polipéptido puede estar en una
diversidad de formas de derivados de péptido, que incluyen amidas,
conjugados con proteínas, péptidos ciclados, péptidos polimerizados,
análogos, fragmentos, péptidos químicamente modificados y derivados
similares.
El término "análogo" incluye cualquier
polipéptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácido
sustancialmente idéntica a una secuencia específicamente mostrada
en la presente memoria descriptiva en la que se han sustituido de
manera conservadora uno o más residuos con un residuo funcionalmente
similar y que muestra la actividad antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} tal como se describe en la presente
memoria descriptiva. Los ejemplos de sustitución conservadora
incluyen la sustitución de un residuo (hidrófobo)
no-polar tal como la isoleucina, valina, leucina o
metionina por otro, la sustitución de un residuo (hidrófobo) polar
por otro tal como entre la arginina y la lisina, entre la glutamina
y la aspararagina, entre la glicina y la serina, la sustitución de
un residuo básico tal como la lisina, la asparagina o la histidina
por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido
aspártico o ácido glutámico por otro.
La expresión "sustitución conservadora"
también incluye el uso de un residuo químicamente derivado en lugar
de un residuo no derivado siempre que dicho polipéptido muestre la
actividad de inhibición requerida.
"Derivado químico" se refiere a un
polipéptido sujeto que tiene uno o más residuos químicamente
derivados por reacción de un grupo lateral funcional. Tales
moléculas derivadas incluyen por ejemplo, las moléculas en las que
los grupos amino libres se han derivado para formar clorhidratos
de amina, grupos p-tolueno sulfonilo, grupos carbobenzoxi,
grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos
formilo. Los grupos carboxilo libres se pueden derivar para formar
sales, ésteres de metilo y etilo u otros tipos de ésteres o
hidrácidas. Los grupos hidroxilo libres se pueden derivar para
formar derivados O-acilo u
O-alquilo. El imidazol nitrógeno de histidina se
puede derivar para formar N-imbencilhistidina.
También incluidos como derivados químicos se encuentran los
péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácido producidos
naturalmente de los veinte amino ácidos estándares. Por ejemplo: la
4-hidroxyprolina se puede sustituir por prolina;
la 5-hidroxilisina se puede sustituir por lisina,
la 3-metilhistidina se puede sustituir por
histidina; la homoserina se puede sustituir por serina; y la
ornitina se puede sustituir por lisina. –Los polipéptidos de la
presente invención también incluyen cualquier polipétido que tenga
una o más adiciones y/o deleciones o residuos relativos a la
secuencia de un polipéptido cuya secuencia se muestra en la presente
memoria descriptiva; siempre que se mantenga la actividad
requerida.
El término "fragmento" se refiere a
cualquier polipétido sujeto que tenga una secuencia de residuos de
aminoácido más corta que la de un polipéptido cuya secuencia de
residuos de aminoácido se muestra en la presente memoria
descriptiva.
Cuando un polipéptido de la presente invención
tiene una secuencia que no es idéntica a la secuencia de un ligando
natural de \alpha_{v}\beta_{3}, es típicamente porque se
han hecho una o más sustituciones conservadoras o no conservadoras,
normalmente no más de aproximadamente un 30%, y preferiblemente no
más de un 10% de los residuos de aminoácido se sustituyen. Los
residuos adicionales también se pueden añadir a uno de los dos
términos de un polipéptido para con el fin de proporcionar un
"enlazador" mediante el cual los polipéptidos de la invención
se pueden fijar adecuadamente a una etiqueta o matriz sólida, o
excipiente.
Las etiquetas, las matrices sólidas y los
excipientes que se pueden usar con los polipéptidos de la invención
se describen más adelante en la presente memoria descriptiva.
Los enlazadores de residuos de aminoácido son
normalmente al menos un residuo y pueden ser 40 o más residuos, más
a menudos de 1 a 10 residuos, pero no forman epitopes de ligando de
\alpha_{v}\beta_{3}. Los residuos de aminoácido típicos
usados para enlazar son la tirosina, cisteína, lisina, ácido
glutámico y ácido aspártico, o similares. Además, un polipéptido
sujeto puede diferir, a menos que se especifique otra cosa, de la
secuencia natural de un ligando de \alpha_{v}\beta_{3}
mediante la secuencia que se está modificando por la acilación de
NH_{2} terminal, por ejemplo acetilación o la amidación de ácido
tioglicólico, por la carboxilamidación terminal, por ejemplo con
amoníaco, metilamina y codificaciones terminales similares. Las
modificaciones terminales son útiles, como es bien sabido, para
reducir la susceptibilidad a la digestión de proteinasa, y por lo
tanto sirven para prolongar media vida de los péptidos en
soluciones, particularmente fluidos biológicos donde las proteasas
pueden estar presentes. Con este fin, la ciclización de
polipéptidos también es una modificación terminal útil, y se
prefiere particularmente a causa de las estructuras estables
formadas por ciclización y en vista de las actividades biológicas
observadas de dichos péptidos cíclicos descritos en la presente
memoria descriptiva.
Cualquier péptido de la presente invención se
puede usar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los
ácidos apropiados que pueden formar sales con los péptidos de la
presente invención incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido
trifluoroacético TFA, ácido clorhídrico HCl, ácido bromhídrico,
ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico,
ácido fosforícoacético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido
láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido
succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido
cinámico, ácido naftalenosulfónico, ácido sulfanílico o similares.
Se prefieren particularmente las sales de HCl y TFA.
Las bases apropiadas capaces de formar sales con
los péptidos de la presente invención incluyen bases inorgánicas
tales como hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de
potasio y similares; y bases orgánicas tales como mono-, di- y
tri-alquil y aril aminas (por ejemplo trietilamina,
diisopropilamina, metilamina, dimetilamina y similares) y
etanolaminas opcionalmente sustituidas (por ejemplo etanolamina,
dietanolamina y similares).
Un péptido de la presente invención se refiere
también a un polipéptido sujeto, se puede sintetizar mediante
cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la técnica
de los polipéptidos, incluyendo técnicas de ADN recombinante. Se
prefieren las técnicas de química sintética, tales como una síntesis
de tipo Merrifield de fase sólida, por razones de pureza,
especificidad antigénica, libertada de productos laterales
indeseados, facilidad de producción y similares. Se puede encontrar
un excelente sumario de las muchas técnicas disponibles en Steward
et al., "Solid Phase Peptide Síntesis", W.H. Freeman
Co., San Francisco, 1969; Bodanszky, et al., "Peptide
Síntesis", John Wiley & Sons, Segunda edición, 1976; J.
Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p. 46,
Academic Press (Nueva York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol.,
32:221-96, 1969; Fields et al., Int. J.
Peptide Protein Res., 35:161- 214, 1990; y la patente de los
Estados Unidos número 4.244.946 para la síntesis de péptidos de
fase sólida, y Schoder et al., "The Peptides", Vol.1;
Academic Press (Nueva York), 1965 para la síntesis de solución
clásica. Se describen los grupos protectores apropiados utilizable
en dicha síntesis en los anteriores textos y en J.F.W. McOmie,
"Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Nueva
York, 1973.
En general, los procedimientos de síntesis de
fase sólida contemplados comprenden la adición secuencia de uno o
más residuos de aminoácido o los residuos de aminoácido
apropiadamente protegidos a una cadena peptídica creciente.
Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer residuo de
aminoácido está protegido por un grupo protector selectivamente
eliminable. Se utiliza un grupo protector selectivamente eliminable,
diferente para los aminoácidos que contienen un grupo lateral
reactivo tal como la lisina.
Al usar por ejemplo una síntesis de fase sólida,
el aminoácido protegido o derivado se fija a un soporte sólido
inerte a través de su grupo carboxilo o amino desprotegido. El
grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina entonces
selectivamente y el siguiente aminoácido de la secuencia que tiene
el grupo complementario (amino o carboxi) adecuadamente protegido
se mezcla y se hace reaccionar en condiciones apropiadas para
formar el enlace amida con el residuo ya fijado al soporte sólido.
El grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina entonces
del residuo de aminoácido recientemente añadido, y entonces se
añade el siguiente aminoácido (apropiadamente protegido) y así
sucesivamente. Después de haber enlazado todos los aminoácidos
deseados en la propia secuencia, se elimina secuencialmente o
concurrentemente cualquier grupo terminal o lateral restante (y
soporte sólido) para obtener el polipéptido lineal final.
Los polipéptidos lineales resultantes preparados
por ejemplo como se describe anteriormente se pueden hacer
reaccionar para formar sus péptidos cíclicos correspondientes. Se
describe un ejemplo de un procedimiento para ciclizar péptidos en
Zimmer et al., Péptidos 1992, pp.
393-394. EXCMO. Science Publishers, B.V., 1993.
Típicamente el éster de metilo de péptido protegido de
tercbutoxicarbonilo se disuelve en metanol y se añaden
soluciones de hidróxido de sodio y la mezcla se hace reaccionar a
20ºC (20C) para eliminar hidrolíticamente el grupo protector de
éster de metilo. Después de evaporar el solvente, el péptido
protegido de tercbutoxicarbonilo se extrae con acetato de etilo del
solvente acuoso acidificado. El grupo protector tercbutoxicarbonilo
se elimina entonces en condiciones suavemente ácidas en un
cosolvente de dioxano. El péptido lineal desprotegido con los
términos amino y carboxi libres así obtenidos se convierte en su
péptido cíclico correspondiente haciendo reaccionar una solución
diluida del péptido lineal en una mezcla de diclorometano y
dimetilformamida, con diciclohexilcarbodiimida en presencia de
1-hidroxibenzotriazol y
N-metilmorfolina. El péptido cíclico resultante se
purifica entonces por cromatografía.
Se describe un procedimiento particularmente
preferido de síntesis de péptido cíclico en Gurrath et al.,
Eur. J. Biochem., 210:911-921 (1992),
y se describe en los Ejemplos. Particularmente los péptidos
preferidos para su utilización en los presentes procedimientos son
c-(GrGDFV) (SEQ ID NO 4), c-(RGDFv) (SEQ ID NO %), c-(RADFv) (SEQ
ID NO 6), c-(RGDFv) (SEQ ID NO 7) y el péptido lineal
YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO 8), donde "c-" indica un péptido
cíclico, las letras mayúsculas son un simple código de letras para
un aminoácido L y las letras minúsculas son un simple código de
letras para el aminoácido D- La secuencia de residuos de aminoácido
de estos péptidos también se conoce en SEQ ID NO 4, 5, 6, 7 y 8,
respectivamente.
La presente invención describe, en una
realización, antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3} en forma
de anticuerpos monoclonales que se hacen inmunoreaccionar con
\alpha_{v}\beta_{3} e inhiben la unión de
\alpha_{v}\beta_{3} a su ligando natural tal como se
describe en la presente memoria descriptiva. También se describen
en la presente memoria descriptiva líneas de células que producen
los anticuerpos, métodos para producir las líneas de células, y
métodos para producir los anticuerpos monoclonales.
Un anticuerpo monoclonal de la invención
comprende moléculas de anticuerpos que 1) se hacen inmunoreaccionar
con \alpha_{v}\beta_{3} aislado, y 2) inhibir la unión de
fibrinógeno a \alpha_{v}\beta_{3}. Los anticuerpos
monoclonales preferidos que se unen preferiblemente a
\alpha_{v}\beta_{3} incluyen un anticuerpo monoclonal que
tiene las características de inmunorreacción de mAb LM609,
segregadas por la línea de células de hibridona ATCC HB 9537. La
línea de células de hibridoma ATCC HB 9537 se depositó de acuerdo
con los requisitos del Tratado de Budapest en La Colección de
cultivo tipo americano (ATCC), 1301 Parklawn Drive, Rockville, MD,
USA, el 15 de septiembre de 1987.
El término "anticuerpo" o molécula de
anticuerpo en las diversas formas gramaticales se usa en la presente
memoria descriptiva como un nombre colectivo que se refiere a una
población de moléculas de inmunoglobulina y/o porciones
inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir,
moléculas que contienen un sitio de combinación de anticuerpos o
paratope.
Un "sitio de combinación de anticuerpos" es
la porción estructural de una molécula de anticuerpo constituida por
regiones variables e hipervariable de cadena pesada y ligera que se
une específicamente al antígeno.
Los anticuerpos de los ejemplos para su uso en la
presente invención son moléculas de inmunoglobulina intactas,
moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y las
porciones de una molécula de inmunoglobulina que contienen el
paratope, incluyendo las porciones conocidas en la técnica como Fab,
Fab', (F(ab)'_{2} y F(v) y también se refieren a
fragmentos de anticuerpo.
En otra realización preferida, la invención
contempla una molécula de inmunoglobulina truncada que comprende un
fragmento Fab derivado de un anticuerpo monoclonal de la invención.
El fragmento Fab, que carece del receptor Fc, es soluble, y consigue
ventajas terapéuticas en media vida de suero, y ventajas de
diagnóstico en modos de uso del fragmento Fab soluble. La
preparación de un fragmento Fab soluble se conoce generalmente en
las técnicas inmunológicas y se puede conseguir mediante una
diversidad de procedimientos.
Por ejemplo, las porciones (fragmentos) Fab y
F(ab')_{2} de anticuerpos se preparan mediante la
reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, sobre
los anticuerpos sustancialmente intactos mediante procedimientos
bien conocidos. Véase por ejemplo, la patente de los Estados Unidos
número 4.342.566 de Theofilopolous y Dixon. Las porciones de
anticuerpo Fab también son bien conocidas y se producen a partir de
las porciones F(ab')_{2} seguidas de la reducción de los
enlaces de disulfuro que unen las dos porciones de cadena pesada
como con mercaptoetanol, y seguidas por la alquilación del
mercaptano de proteína resultante con un reactivo tal como la
yodoacetamida. Se prefiere un anticuerpo que contiene moléculas de
inmunoglobulina intactas, y se utiliza como se ilustra en la
presente memoria descriptiva.
La expresión "anticuerpo monoclonal" en sus
diversas formas gramaticales se refiere a una población de moléculas
de anticuerpo que contienen sólo una especie de sitio de combinación
de anticuerpo capaz de inmunoreaccionar con un epítope particular.
Un anticuerpo monoclonal muestra típicamente de este modo una
afinidad de única unión para cualquier epítope con el que se hace
inmunoreaccionar. Un anticuerpo monoclonal puede, por lo tanto
contener una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad de
sitios de combinación de anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para
un epítope diferente, por ejemplo un anticuerpo monoclonal
biespecífico.
Un anticuerpo monoclonal está típicamente
compuesto por anticuerpos producidos por clones de una única célula
llamada hibridoma que segrega (produce) sólo un tipo de molécula de
anticuerpo. La célula hibridoma se forma condensando una célula
productora de anticuerpos y un mieloma u otra línea de células
autoperpetuadoras. La preparación de tales anticuerpos se describió
en primer lugar por Kohler y Milestein, (1975). Los procedimientos
adicionales se describen por Zola, Monoclonal Antibodies: A
manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987). El sobrenadante
así preparado se puede filtrar para la presencia de moléculas de
anticuerpo que se hacen inmunorreaccionar con
\alpha_{v}\beta_{3} y para la inhibición de la unión de
\alpha_{v}\beta_{3} a ligandos naturales.
En resumen, para formar el hibridoma a partir
del cual se produce la composición de anticuerpo monoclonal, se
condensa un mieloma u otra línea de células autoperpetuadoras con
linfocitos obtenidos a partir del bazo de un mamífero
hiperinmunizado con una fuente de \alpha_{v}\beta_{3} tal
como \alpha_{v}\beta_{3} aislado de las células de melanoma
humano M21 tal como se describe en Cheresh et al., J.
Biol.. Chem., 262:17703-17711 (1987).
Se prefiere que la línea de células de mieloma
usada para preparar un hibridoma se haga a partir de la misma
especie que los linfocitos. Típicamente, un ratón de cepa 129
GLX^{+} es el mamífero preferido. Los mielomas de ratón adecuados
para su uso en la presente invención incluyen las líneas de células
sensibles a la
hipoxantina-aminopterina-timidina
(HAT) P3X63-Ag8.653, y Sp2/0-Ag14
que están disponible en la Colección de cultivos tipo americano,
Rockville, MD, bajo las designaciones CRL 1580 y CRL 1581,
respectivamente.
Los esplenocitos se condensan típicamente con
las células de mieloma que usan polietilenglicol (PEG) 1500. Los
híbridos condensados se seleccionan por su sensibilidad a HAT. Los
hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se
identifican usando el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)
descrito en los Ejemplos.
Un anticuerpo monoclonal de la presente invención
también se puede producir iniciando un cultivo de hibridoma
monoclonal que comprende un medio de nutrientes que contiene un
hibridoma que segrega moléculas de anticuerpo de especificidad
apropiada. El cultivo se mantiene en condiciones y durante un
periodo de tiempo suficiente para que el hibridoma segregue las
moléculas de anticuerpo en el medio. A continuación se recoge el
medio que contiene anticuerpos. A continuación, las moléculas de
anticuerpo se pueden, además, aislar mediante técnicas bien
conocidas.
Los medios útiles para la preparación de las
composiciones son bien conocidos en la técnica y están
comercialmente disponibles e incluyen medios de cultivo sintético,
ratones consanguíneos y similares. Un ejemplo de medio sintético es
el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al.,
Virol. 8:396, 1959) suplementado con 4,5 g/l de glucosa, 20 mM
de glutamina, y suero fetal de ternero. Un ejemplo de cepa de ratón
consanguíneo es el Balb/c.
Otros procedimientos para producir un anticuerpo
monoclonal, una célula de hibridoma o un cultivo de células de
hibridoma también son conocidos. Véase, por ejemplo, el
procedimiento para aislar anticuerpos monoclonales a partir de un
repertorio inmunológico tal como se describe en Sastry, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86:5728-5732 (1989); y Huse et al.,
Science, 24:1275-1281 (1989).
También se contempla por esta invención la célula
de hibridoma y los cultivos que contienen una célula de hibridoma
que producen un anticuerpo monoclonal de la invención. E prefiere
particularmente la línea de células de hibridoma que segrega el
anticuerpo monoclonal mAb LM609 designado ATCC HB 9537. El mAb
LM609 se preparó como se describe en Cheresh et al., J.
Biol.. Chem. 262:17703-1711 (1987), y su
preparación también se describe en los Ejemplos.
La invención contempla, en una realización, un
anticuerpo monoclonal que tiene las características de inmunoreación
de mAb LM609.
También es posible determinar, sin
experimentación indebida, si un anticuerpo monoclonal tiene la misma
(por ejemplo equivalente) especificidad (características de
inmunoreacción) como un anticuerpo monoclonal de la invención
determinando si el anterior previene que este último se una a una
molécula diana preseleccionada. Si el anticuerpo monoclonal que
se están ensayando compite con el anticuerpo monoclonal de la
invención, como se muestra mediante una reducción de la unión por
parte del anticuerpo monoclonal de la invención en los ensayos de
competición estándares para unirse a la molécula diana cuando
ésta presente en la fase sólida, a continuación es probable que
los dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo epítope o a un
epítope estrechamente relacionado.
Otra manera de determinar si un anticuerpo
monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la
invención es preincubar el anticuerpo monoclonal de la invención con
la molécula diana con la que es normalmente reactivo, y a
continuación se añade el anticuerpo monoclonal que se está
ensayando para determinar si el anticuerpo que se está ensayando se
inhibe en su capacidad para unir la molécula diana. Si el anticuerpo
monoclonal que se están ensayando se inhibe, entonces con toda
probabilidad, tiene la misma o funcionalmente equivalente,
especificidad epitópica que el anticuerpo monoclonal de la
invención.
Una manera adicional de determinar si un
anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo
monoclonal de la invención es determinar la secuencia de residuos de
amioácido de las regiones CDR de los anticuerpos en cuestión. Las
moléculas de anticuerpo que tienen secuencias de residuo de
aminoácido idénticas o funcionalmente equivalentes en sus regiones
CDR tienen la misma especificidad de unión. Los procedimientos
para secuenciar polipéptidos es bien conocida en la técnica.
La inmunoespecificidad de un anticuerpo, su
capacidad de unión de molécula diana, y la afinidad correspondiente
que exhibe el anticuerpo para el epítope, se definen por el
epítope con el que se hace reaccionar el anticuerpo. La
especificidad del epítope se define al menos en parte por la
secuencia de residuos de aminoácido de la región variable de la
cadena pesada de la inmunoglobulina, el anticuerpo, y en parte por
la secuencia de residuos de aminoácido de región variable de cadena
ligera.
El uso del término "tener la especificidad de
unión de" indica que los anticuerpos monoclonales equivalentes
exhiben la mismas o similares características de inmunoreacción
(unión) y compiten para unirse a una molécula diana
preseleccionada.
Los anticuerpos monoclonales humanizados ofrecen
ventajas particulares sobre los anticuerpos monoclonales murinos,
particularmente en la medida en que se pueden usar terapéuticamente
en los seres humanos. Específicamente los anticuerpos humanos no se
retiran de la circulación tan rápidamente como los antígenos
"foráneos", y no activan el sistema inmune de la misma manera
que los antígenos foráneos y los anticuerpos foráneos. Los
procedimientos para preparar anticuerpos "humanizados" son
bien conocidos en la técnica, y se pueden aplicar fácilmente a los
anticuerpos de la presente invención.
De este modo, la invención contempla, en una
realización, un anticuerpo monoclonal de la invención que se
humaniza por injerto para producir componentes del sistema inmune
humano sin interferir sustancialmente con la capacidad del
anticuerpo para unirse al antígeno.
La presente invención demuestra que los
antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3} generalmente se pueden
usar en la presente invención, dichos antagonistas pueden incluir
polipéptidos, anticuerpos y otras moléculas, designadas
"miméticos", que tienen la capacidad de interferir con la
función de \alpha_{v}\beta_{3}. Particularmente, se
prefieren los antagonistas que interfieren específicamente con la
función de \alpha_{v}\beta_{3}, y no interfieren con la
función de otras integrinas.
En este contexto, se aprecia que una diversidad
de reactivos pueden ser apropiados para su uso en los actuales
procedimientos, en la medida en que estos reactivos poseen la
actividad biológica requerida. Los reactivos se refieren
genéricamente a unos miméticos porque poseen la capacidad de
"mimetizar" un dominio de unión sobre
\alpha_{v}\beta_{3} o el ligando de
\alpha_{v}\beta_{3} implicado en la interacción funcional
del receptor y del ligando, y por lo tanto interfieren con (es
decir, inhiben) la función normal.
Un mimético de \alpha_{v}\beta_{3} es
cualquier molécula, distinta de un péptido de derivado de un
ligando o un anticuerpo, que exhibe las propiedades anteriormente
mencionadas. Puede ser un análogo sintético de un péptidos, un
compuesto que se conforma como la bolsa de unión del dominio de
unión anteriormente descrito, u otra molécula.
El diseño de un mimético de
\alpha_{v}\beta_{3} se puede realizar por uno cualquiera de
los diversos procedimientos de análisis estructurales para el
diseño de fármacos conocido en la técnica, incluyendo la
modelización molecular, la resonancia magnética nuclear
bidimensional (TMN 2D), cristalografía de rayos X, detección
aleatoria de bibliotecas de péptidos, análogos de péptidos u otros
polímeros químicos y las metodologías similares de diseño de
fármacos.
En vista de la amplia evidencia estructural
presentada en la presente especificación que muestra que un
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} puede ser un pequeño
polipéptido o un anticuerpo monoclonal, dos estructuras químicas
diversamente diferentes que comparten la propiedad funcional de la
inhibición selectiva de \alpha_{v}\beta_{3}, la estructura
de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} sujeto útil en los
presente procedimientos no necesita tener limitaciones, pero
incluye cualquier mimético de \alpha_{v}\beta_{3}, tal como
se define en la presente memoria descriptiva.
También se describen en la presente memoria
descriptiva, procedimientos de ensayo para identificar los
antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3}candidatos para su uso
según los actuales procedimientos. En estos procedimientos de
ensayos las moléculas candidatas se evalúan por su potencia en la
inhibición de la unión de \alpha_{v}\beta_{3} a ligandos
naturales, y además se evalúan por su potencia en la inhibición de
la angiogénesis en un tejido.
El primer ensayo mide la inhibición de la unión
directa del ligando natural a \alpha_{v}\beta_{3}, y se
describe en detalle una realización preferida en los Ejemplos. El
ensayo mide típicamente el grado de inhibición de la unión de un
ligando natural, tal como el fibrinógeno, a
\alpha_{v}\beta_{3}aislado en la fase sólida por ELISA.
El ensayo se puede usar también para identificar
los compuestos que exhiben especificidad para
\alpha_{v}\beta_{3} y no inhiben los ligandos naturales de
unirse a otras integrinas. El ensayo de especificidad se realiza
ejecutando ensayos de ELISA en paralelo en los que tanto
\alpha_{v}\beta_{3} como otras integrinas se detectan
concurrentemente en cámaras de ensayo separadas por sus respectivas
capacidades de unirse a un ligando natural y por l compuesto
candidato para inhibir las respectivas capacidades de las integrinas
para unirse a un ligando preseleccionado. Se describen formatos
preferidos de ensayo de detección en los Ejemplos.
El segundo ensayo mide la angiogénesis en la
membrana corioalantóica de pollo (CAM) y se conoce como el ensayo de
CAM. El ensayo de CAM se ha descrito en detalle por otros autores, y
además se ha usado para medir tanto la angiogénesis como la
neovascularización de los tejidos tumorales. Véase Ausprunk et
al., Am. J. Pathol., 79:597-618 (1975) y
Ossonski et al., Cancer Res.,
40:2300-2309 (1980).
El ensayo de CAM es un modelo de ensayo bien
reconocido para la angiogénesis in vivo porque se está
realizando la neovascularización de todo el tejido, y los actuales
vasos sanguíneos de embrión de pollo están creciendo en la CAM o en
el tejido crecido sobre la CAM.
Como se demuestra en la presente memoria
descriptiva, el ensayo de CAM ilustra la inhibición de la
neovascularización basada tanto en la cantidad como en el alcance
del crecimiento de los nuevos vasos. Además, es fácil controlar el
crecimiento de cualquier tejido trasplantado sobre la CAM, tal como
un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es particularmente útil
porque hay un control interno de la toxicidad en el sistema de
ensayo. El embrión de pollo se expone a cualquier reactivo de
ensayo, y por lo tanto la salud del embrión es una indicación de
toxicidad.
El tercer ensayo mide la angiogénesis en el
modelo de ojo de conejo in vivo y se conoce como ensayo de
ojo de conejo. El ensayo de ojo de conejo se ha descrito en detalle
por otros autores, y se ha usado además, para medir tanto la
angiogénesis como la neovascularización en presencia de inhibidores
angiogénicos tales como la talidomida. Véase D'Amato, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., 91:4082-4085
(1994).
El ensayo del ojo de conejo es un modelo de
ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo porque el
proceso de neovascularización, ejemplificado por los vasos
sanguíneos de conejo que crecen desde el borde de la córnea dentro
de la córnea, se observa fácilmente a través de la córnea
naturalmente transparente del ojo. Además, tanto el alcance como la
cantidad de estimulación o inhibición de la neovascularización o la
regresión de la neovascularización se puede controlar fácilmente en
el tiempo.
Finalmente, el conejo se expone a cualquier
reactivo de ensayo, y por lo tanto la salud del conejo es una
indicación de la toxicidad del reactivo de ensayo.
El cuarto ensayo mide la angiogénesis en el
modelo de ratón quimérico: ratón humano y se conoce como el
ensayo de ratón quimérico. Se ha descrito en ensayo en detalle por
otros autores, y además se ha descrito en la presente memoria
descriptiva para medir la angiogénesis, la neovascularización, y la
regresión de los tejidos tumorales. Véase Yan, et al., J.
Clin Invest., 91:896-996 (1993). El ensayo de
ratón quimérico es un modelo de ensayo útil para la angiogénesis
in vivo porque los injertos de piel transplantada se parecen
mucho a la piel humana normal desde el punto de vista histológico y
la neovascularización de todo el tejido se produce cuando los vasos
sanguíneos humanos actuales están creciendo desde la piel humana
injertada en el tejido tumoral humano sobre la superficie de la piel
humana injertada.
El origen de la neovascularización en el injerto
humano se puede demostrar por teñido inmunohistoquímico de la
neovasculatura con marcadores de células endoteliales específicas
humanas.
Como se demuestra en la presente memoria
descriptiva, el ensayo de ratón quimérico demuestra la regresión de
la neovascularización basada tanto en la cantidad como en el alcance
de la regresión del crecimiento de nuevos vasos. Además, es fácil
controlar los efectos sobre el crecimiento de cualquier tejido
trasplantado sobre la piel injertada, tal como un tejido tumoral.
Finalmente, el ensayo es útil porque hay un control interno de la
toxicidad en el sistema de ensayo. El ratón quimérico se expone a
cualquier reactivo de ensayo, y por lo tanto la salud del ratón es
una indicación de la toxicidad.
Los siguientes ejemplos que se refieren a la
invención son ilustrativos y no deberían, por supuesto,
interpretarse específicamente como limitativos de la invención.
Además, dichas variaciones de la invención, actualmente conocidas o
desarrolladas más adelante, que estarían dentro del ámbito de un
experto en la técnica, han de considerarse que caen dentro del
alcance de la presente invención que se reivindica más
adelante.
Los Ejemplos describen, entre otros, el
tratamiento de los melanomas, dicho tratamiento no se reivindica, y
se describe únicamente con fines ilustrativos.
Los polipéptidos lineales y cíclicos expuestos en
la Tabla 1 se sintetizaron usando técnicas estándares de síntesis de
fase sólida, como, por ejemplo, se describe en Merrifield, Adv
Enzymol., 32:221-96, (1969), y Fields, G.B. y
Noble, R,L., Int. J. Peptide Protein Res.,
35:161-214, (1990).
Se disolvieron en primer lugar dos gramos (g) de
BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe
(SEQ ID NO 1) en 60 mililitros (ml) de metanol al que se añadió
1,5 ml de una solución de hidróxido de sodio 2N para formar una
mezcla. La mezcla se agito a continuación durante 3 horas a 20
grados centígrados (20ºC). Después de la evaporación, el residuo se
absorbió en agua, se acidifico con un pH 3 con HCl diluido y se
extrajo con acetato de etilo. El extracto se seco sobre
Na_{2}SO_{4}, se evaporó de nuevo y el
BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH
(SEQ ID NO 2) se agitó a 20ºC durante 2 horas con 20 ml de HCl 2N
en dioxano. La mezcla resultante se evaporó de nuevo para obtener
H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH
(SEQ ID NO 3) que se disolvió posteriormente en una mezcla de
1.800 ml de diclorometano y 200 ml de dimetilformamida (DMF)
seguido de une enfriamiento a 0ºC. Después, se añadieron
sucesivamente 0,2 g de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt)
y 0,23 ml de N-metilmorfolina agitando.
La mezcla resultante se agitó durante 24 horas
adicionales a 0ºC y a continuación a 20ºC durante otras 48 horas
más. La solución se concentró y se trató con un cambiador de iones
de lecho mixto para liberarla de sus sales. Después de retirar la
resina resultante por filtración, la solución clarificada se
evaporó y el residuo se purificó por cromatografía dando como
resultado la recuperación de
ciclo(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)
(SEQ ID NO 4). Los siguientes péptidos, expuestos en la Tabla 1 que
usan abreviaturas para los residuos de aminoácido con un código de
una única letra y se identifican mediante una designación de número
de péptido, se obtuvieron de manera análoga:
ciclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)
(SEQ ID NO 5);
ciclo(Arg-ala-Asp-D-Phe-Val)
(SEQ ID NO 6);
ciclo(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val)
(SEQ ID NO 9);
ciclo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)
(SEQ ID NO 7). Una secuencia designada como 66203, que tiene una
secuencia idéntica a la del péptido 62184, que sólo difería de la
última porque contiene la sal HCl en lugar de la Sal Tfa presente
en 62184. En la inhibición de la angiogénesis se describen los
ensayos descritos en el Ejemplo 7 donde se usaron los péptidos
sintéticos, el péptidos 66203 que tiene HCl fue ligeramente más
eficaz en la inhibición de la angiogénesis que el péptido idéntico
en TFA.
Número de péptido | Secuencia de aminoácido* | SEQ ID NO |
62181 | ciclo(GrGDFV) | 4 |
62184 | ciclo(RGDFV) | 5 |
62185 | ciclo(RADFV) | 6 |
62187 | ciclo(RGDFv) | 7 |
62880 | YTAECKPQVTRGDVF | 8 |
92186 | ciclo(RaDFV) | 9 |
62175 | ciclo(ARGDfL) | 10 |
62179 | ciclo(GRGDfL) | 11 |
62411 | TRQVVCDLGNPM | 12 |
62503 | GVVRNNEALARLS | 13 |
62502 | TDVNGDGRHDL | 14 |
* Las letras minúsculas indican un aminoácido D; | ||
\hskip1.5mm Las letras mayúsculas indican un aminoácido L. |
Un péptido designado como 69601, que tiene una
secuencia idéntica a la del péptido 62185, que sólo difería de la
última por contener la sal de HCl en lugar de la sal de TFA
presente en 62184.
Se ha mostrado el péptido cíclico
c-RADfV (69601) para inhibir la unión del
fibrinógeno a la integrina \alpha_{v}\beta_{3} y no inhibir
la unión del fibrinógeno a las integrinas
\alpha_{IIb}\beta_{3} o \alpha_{5}\beta_{1} (Pfaff,
et al., J. Biol.. Chem.,
269:20233-20238, 1994). De este modo el péptido
c-RADfV es específico para
\alpha_{v}\beta_{3}.
El anticuerpo monoclonal LM609 segregado por el
hibridoma ATCC HC 9537 se produjo usando los procedimientos
estándares de hibridoma por inmunización con
\alpha_{v}\beta_{3} aislado absorbido sobre esferas de
lentil lectina Sefarosa. La \alpha_{v}\beta_{3} se aisló a
partir de células de melanoma humano designadas M21, y el
anticuerpo se produjo como se describe en Cheresh et al., J.
Biol.. Chem., 262:17703-17111 (1987). Se
proporcionaron las células M21 por parte de Dr. D.L.; Morton
(Universidad de California, Los Ángeles, CA) y crecieron en
cultivos de suspensión en un medio de cultivo RPMI 1640 que
contiene 2 mM de L-glutamina, 50 mg/ml de sulfato
de gentamicina y suero fetal de ternero al 10%.
Se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal
LM609 inmunoreacciona específicamente con el complejo de
\alpha_{v}\beta_{3}, y no inmunoreacciona con la subunidad
\alpha_{v}, con la subunidad \beta_{3} o con otras
integrinas.
Durante la cicatrización de una herida, las
membranas del basamento de los vasos sanguíneos expresan diversas
proteínas adhesivas, incluyendo el factor de von Willebrand, la
fibronectina y la fibrina. Además diversos miembros de la familia de
las integrinas de los receptores de adhesión se expresan sobre la
superficie de las células cultivadas endoteliales y del músculo
liso. Véase, Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:6471
(1987); Janat et al., J. Cell Physiol., 151:558
(1992); y Cheng et al., J. Cell Physiol., 139:275
(1989). Entre las integrinas esta la \alpha_{v}\beta_{3},
el receptor de células endoteliales para el factor de von
Willebrand, el fibrinógeno (fibrina), y la fibronectina como se
describe en Cheresh Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:6471
(1987). Esta integrina inicia una vía de señalización dependiente
del calcio que conduce a la migración de las células endoteliales,
y por lo tanto parece desempeñar una función fundamental en la
biología de células vasculares; como se describe en Leavelsey et
al., J. Cell Biol.., 121:163 (1993).
Para investigar la expresión de
\alpha_{v}\beta_{3}durante la angiogénesis, el tejido
humano de granulación de herida o la piel normal adyacente se
obtuvo a partir de pacientes consentidores, se lavó con 1 ml de
solución salina tamponada con fosfato y se inserta en el medio O.T.C
(Tejido Tek). Los tejidos insertados se congelaron rápidamente en
nitrógeno líquido durante aproximadamente 30 a 40 segundos. Se
cortaron secciones de un espesor de 6 micrómetros a partir de los
bloques congelados sobre un micrótomo de criostato para un
posterior teñido de inmunoperoxidasa con anticuerpos específicos
para las integrinas \beta_{3} (\alpha_{v}\beta_{3} o
\alpha_{IIb}\beta_{3}) o la subafimili \beta_{1} de
integrinas.
Se muestran los resultados del teñido de la piel
humana normal y el tejido de granulación de herida en las figuras
1A-1D. Se usaron los anticuerpos monoclonales AP3 y
LM534, dirigido a las integrinas \beta_{3} y \beta_{1},
respectivamente para análisis inmunohistoquímicos de secciones
congeladas. Los experimentos con tejido de cuatro diferentes
donantes humanos produjeron idénticos resultados. Se muestran las
fotomicrografías con una ampliación de 300x.
La integrina \alpha_{v}\beta_{3} se
expresaron abundantemente sobre los vasos sanguíneos en el tejido
de granulación (figura 1B) pero no se pudieron detectar en la
dermis y el epitelio de la piel normal del mismo donante (figura
1A). en contraste con lo anterior, las integrinas \beta_{1} se
expresaron abundantemente sobre los vasos sanguíneos y las células
normales tanto en la piel normal (figura C) como en el tejido de
granulación (figura 1D), y como se ha mostrado anteriormente y
descrito por Admas et al., Cell, 63:425 (1991), sobre las
células basales dentro del epitelio.
Las secciones adicionales de la piel normal
humana y los tejidos de granulación preparados anteriormente también
se examinaron por la presencia de los ligandos, por las integrinas
\beta_{3} y \beta_{1},el factor de von Willebrandd y la
laminina, respectivamente. El factor de von Willebrand se localizó
en los vasos sanguíneos en la piel normal (figura 2A) y el tejido de
granulación(figura 2B), mientras que la laminina se localizó
en todos los vasos sanguíneos así como la membrana del basamento
epitelial en ambas preparaciones de tejido (Figura 2C y 2D).
Además de los anteriores análisis, también se
examinaron las biopsias de los tejidos cancerosos de los pacientes
humanos también por la presencia y distribución de
\alpha_{v}\beta_{3}. Los tejidos se prepararon como se
describe en el Ejemplo 1A con la excepción de que se tiñeron con el
anticuerpo monoclonal LM609 preparado en el Ejemplo 2 que es
específico para el complejo receptor de integrina,
\alpha_{v}\beta_{3}. Además se prepararon también tumores
para su análisis histológico microscópico fijando los ejemplos
representativos de los tumores en fijador Bulins durante 8 horas y
se cortaron secciones en serie y se tiñó H&E.
Los resultados del teñido de inmunoperoxidasa de
los tejidos cancerosos de la vejiga, el colon, el mama y el pulmón
se muestran en las figuras 3A-3D, respectivamente.
\alpha_{v}\beta_{3} se expresa abundantemente sólo sobre
los vasos sanguíneos presentes en las cuatro biopsias de cáncer
analizadas y no sobre una cualquiera de las otras células
presentes en el tejido.
Los resultados descritos en la presente memoria
descriptiva muestran de este modo que el receptor de integrina de
\alpha_{v}\beta_{3} se expresa selectivamente en tipos
específicos de tejido, concretamente tejidos metastáticos,
granulados y otros tejidos en los que la angiogénesis se produce y
tejido no normal donde se ha detenido la formación de nuevos vasos
sanguíneos. Estos tejidos proporcionan por lo tanto un objetivo
ideal para aspectos terapéuticos de la invención.
Los péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo
1 se detectaron midiendo su capacidad para antagonizar la actividad
de unión de receptores de \alpha_{v}\beta_{3} y
\alpha_{IIb}\beta_{5} en ensayos de unión de
ligando-receptor. El procedimiento para estos
estudios de unión se ha descrito por Barbas et al.,,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10003-10007
(1993), Smith et al., J. Biol.. Chem.,
269:20233-20238 (1994).
En la presente memoria descriptiva se describe un
procedimiento de identificación de antagonistas en un ensayo de
unión de ligando-receptor en el que el receptor se
inmoviliza en un soporte sólido y el ligando y el antagonista son
solubles. También se describe un ensayo de unión de
ligando-receptor en el que el ligando se inmoviliza
en un soporte sólido y el receptor y el antagonista son
solubles.
En resumen, las integrinas purificadas
seleccionadas se inmovilizaron por separado en pocillos de
microtitración Titertek con una concentración de revestimiento de 50
nanogramos (ng) por pocillo. La purificación de los receptores se
usa en los ensayos de unión ligando receptor son bien conocidos en
la técnica y se pueden obtener fácilmente con procedimientos
familiares a los expertos en la técnica. Después de la incubación
durante 18 horas a 4ºC, se bloquearon sitios no específicos de
unión sobre la placa con 10 miligramos / mililitro (mg/ml) de
albúmina de suero bovino (BSA) en solución salina
tris-tamponada. Para los estudios de inhibición, se
ensayaron diversas concentraciones de péptidos seleccionados de la
Tabla 1 para la capacidad para bloquear la unión de vitronectina
^{125}I o fibrinógeno ^{125}I a los receptores de integrina,
\alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{IIb}\beta_{3}. Aunque
los ligandos exhiben la unión óptima para una integrina
particular, la vitronectina para \alpha_{v}\beta_{3} y el
fibrinógeno para \alpha_{IIb}\beta_{3}, los estudios de la
inhibición de la unión usando péptidos para bloquear la unión del
fibrinógeno a uno de los dos receptores permitidos para la
determinación precisa de la cantidad de micromoles (uM) de péptido
necesario para inhibir medianamente la unión del receptor al
ligando. Los ligandos radiomarcados se usaron con concentraciones
de 1 nM y la unión se provocó por separado con péptidos sintéticos
no marcados.
Después de una incubación de tres horas, se
retiró el ligando libre mediante un lavado y el ligando unido se
detectó por recuento gamma. Los datos de los ensayos donde los
péptidos cíclicos seleccionados mencionados en la Tabla 1 se usaron
para inhibir la unión de los receptores y el fibrinógeno
radiomarcado a \pm y \alpha_{IIb}\beta_{3}inmovilizados
por separado, los receptores se pudieron reproducir con el error
entre los puntos de datos, típicamente por debajo del 11%. Los
datos de IC_{50} en micromoles (IC_{50} uM) se expresaron como
la media de los puntos de datos duplicados \pm la desviación
estándar como se muestra en la Tabla 2.
Número de péptidos | \alpha_{v}\beta_{3}(IC_{50}uM) | \alpha_{IIb}\beta_{3} (IC_{50} uM) |
62181 | 1,96 \pm 0,62 | 14,95 \pm 7,84 |
62184 | 0,05 \pm 0,001 | 0,525 \pm 0,10 |
62185 | 0,886 \pm 0,16 | 100 \pm 0,001 |
62187 | 0,05 \pm 0,001 | 0,26 \pm 0,056 |
62186 | 57,45 \pm 7,84 | 100 \pm 0,001 |
62175 | 1,05 \pm 0,07 | 0,63 \pm 0,18 |
62179 | 0,395 \pm 0,21 | 0,055 \pm 0,007 |
De este modo, los péptidos ciclizados que
contienen RGD y derivados de RGD 62181, 62184, 62185 y 62187,
teniendo cada uno un residuo de aminoácido D, exhibieron una
inhibición preferente de la unión de fibrinógeno al receptor de
\alpha_{v}\beta_{3} medida por la menor concentración de
péptido requerida para la inhibición media comparada con la del
receptor de \alpha_{IIb}\beta_{3}.en contraste con lo
anterior, los otros péptidos cíclicos que contienen RGD o derivados
de RGD, 62186, 62175 y 62179, o no fueron tan eficaces en el bloqueo
de la unión del fibrinógeno a \alpha_{v}\beta_{3} o
exhibieron una inhibición preferente de la unión del fibrinógeno a
\alpha_{IIb}\beta_{3} comparado con
\alpha_{v}\beta_{3}. Los resultados son consistentes con los
recientemente publicados por Pfaff, et al., J. Biol..
Chem., 26920233-20238 (1994) en el que el
péptido cíclico RGDFV (en el que F indica un residuo de amino ácido
D) inhibió específicamente la unión del fibrinógeno a la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} y no a las integrinas
\alpha_{IIb}\beta_{3} o \alpha_{v}\beta_{5}. Los
ensayos similares de inhibición de unión se llevaron a cabo con
péptidos linealizados que tienen o carecen de un motivo RGD, cuyas
secuencia se derivaron de la subunidad de receptor de
\alpha_{v}, la subunidad de receptor \alpha_{IIb} o las
secuencias de residuos de aminoácido d ligando de vitronectina. Las
secuencias de los péptidos lineales, 62880 (residuos de aminoácido
derivados de VN 35-49), 62411 (residuos de
aminoácido derivados de \alpha_{v} 676-687);
62503 (residuos de aminoácido derivados de \alpha_{v}
655-667); 62 502 (residuos de aminoácido derivados
de \alpha_{IIb} 296-3006) se exponen en la Tabla
1. Cada uno de los péptidos se usó e n ensayos separados para
inhibir la unión de la vitronectina (VN) o el fibrinógeno (FG) a
\alpha_{IIb}\beta_{3} o \alpha_{v}\beta_{3}. Los
datos de IC_{50} en micromoles (IC_{50} uM) de un ensayo
individual para cada experimento se muestran en la Tabla 3.
Número de péptido | \alpha_{v}\beta_{3} IC_{50} | (uM) | \alpha_{v}\beta_{3} IC_{50} | (uM) |
FG | VN | FG | VN | |
62880 | 4.2 | 0,98 | <0,1 | 0,5 |
62411 | >100 | >100 | >100 | >100 |
62503 | >100 | >100 | >100 | >100 |
62502 | 90 | 5 | >100 | >100 |
Los resultados de la inhibición de los ensayos de
unión de ligandos para seleccionar los receptores de integrina con
péptidos linealizados muestran que sólo el péptido 62880 fue eficaz
en la inhibición de la unión media de FG o VN a
\alpha_{v}\beta_{3} medido por la menor concentración de
péptidos requerida para la inhibición media comparada con el
receptor \alpha_{IIb}\beta_{3}. Ninguno de los otros
péptidos linealizados fue eficaz en el bloqueo de la unión de
ligandos a \alpha_{v}\beta_{3} aunque el péptidos 62502
sea eficaz en el bloqueo de la unión de VN a
\alpha_{IIb}\beta_{3}.
De este modo el ensayo
ligando-receptor descrito en la presente memoria
descriptiva se puede usar para detectar tanto los péptidos
sintéticos circulares como los linealizadores que exhiben una
especificidad selectiva para un receptor particular de integrina,
específicamente \alpha_{v}\beta_{3}, usados como
antagonistas (\alpha_{v}\beta_{3}) de receptor de
vitronectina en la práctica de la invención.
La angiogénesis se puede inducir en la membrana
corialantóica de pollo (CAM) después de que la angiogénesis
embriónica normal haya dado como resultado la formación de vasos
sanguíneos maduros. La angiogénesis ha demostrado ser inducida en
respuesta a citoquinas específicas o fragmentos tumorales descritos
por Leibovich et al., Nature, 329:630 (1987) y
Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597 (1975). Las
CAM se prepararon a partir de embriones de pollo para la posterior
inducción de angiogénesis y la inhibición de los mismos como se
describe en los Ejemplos 6 y 7, respectivamente. Los embriones de
pollo de 10 días se obtuvieron en McIntyre Poultry (Lakeside, CA) y
se incubaron a 37ºC con un 60% de humedad. Se hizo un pequeño
agujero a través de la cáscara en el extremo del huevo directamente
sobre la bolsa de aire con el uso de un pequeño taladro (Dremel,
división de Emerson Electric Co. Racine WI). Se taladró un segundo
orificio en el lado ancho del huevo en una región carente de vasos
sanguíneos embriónicos anteriormente determinada iluminando el
huevo. La presión negativa se aplicó al agujero original, que dio
como resultado que la CAM (membrana corioalantóica) se separase de
la membrana de la cáscara y crease una falsa bolsa de aire sobre la
CAM. Se cortó una ventana cuadrada de 1,0 centímetro (cm) x 1,0 cm
a través de la cáscara sobre la CAM caída con el uso de un pequeño
modelo de muela (Dremel). La pecunia ventana permitió un acceso
directo a la CAM subyacente.
La preparación de CAM resultante se usó a
continuación a 6 días de la embriogénesis de, una etapa marcada por
la neovascularización activa, sin tratamiento adicional a la CAM que
refleja el modelo usado para evaluar los efectos sobre la
neovascularización embriónica o usada a 10 días de la embriogénesis
cuando la angiogénesis se subdivide. Esta última preparación se uso
de este modo en la invención para inducir la angiogénesis renovada
en respuesta al tratamiento con citoquinas o al contacto del tumor
descrita en el Ejemplo 6.
Para analizar la estructura microscópica de las
CAM de embrión de pollo y/o los tumores humanos que se resecaron a
partir de los embriones de pollo descrita en el Ejemplo 8, las CAM
y los tumores se prepararon para cortar secciones congeladas. Como
se describe en el Ejemplo 3ª. Se cortaron secciones con un espesor
de seis micrómetros partir de bloques congelados sobre un micrótomo
de criostato para el análisis de inmunofluorescencia.
La figura 4 muestra una fotomicrografía típica de
un área desprovista de vasos sanguíneos en una CAM de 10 días sin
tratar. Al subdividirse la angiogénesis en el sistema de CAM
mediante la etapa de embriogénesis, el sistema es útil en la
invención para estimular la producción de la nueva vasculatura de
los vasos existentes de las áreas adyacentes en las áreas de la
CAM que carecen concurrentemente de vasos.
Para ver la distribución de tejido de los
receptores de integrina presentes en los tejidos de CAM, se fijaron
secciones congeladas de 6 micrómetros um) de espesor tanto de los
tejidos tumorales como de los tejidos de CAM de embriones de pollo
en acetona durante 30 segundos y se tiñeron mediante
inmunofluorescencia con 10 micrógramos/milílitros (ug/ml) mAb CSAT,
un anticuerpo monoclonal específico para la subunidad de integrina
\beta_{1} descrita por Buck et al., J. Cell
Biol.., 107:2351 (1988) y de este modo se uso para los
controles, o LM609 preparado en el Ejemplo 2. Al teñido primario
le siguió un teñido con una dilución del 1:250 de anticuerpo
secundario marcado de rodamina antiratón de cabra (TAGO) para
permitir la detección del producto de inmunoreación primaria. Las
secciones se analizaron a continuación con un microscopio con
compuesto de inmunofluorescencia Zeiss.
Los resultados del análisis de
inmunofluorescencia muestran que los vasos sanguíneos maduros
presentes en un embrión de pollo de 10 días sin tratar expresan la
subunidad integrina \beta_{1} (figura 5A). En contraste con lo
anterior, en una sección en serie del tejido mostrada en la figura
5A no se detecto inmunoreactividad con LM609 (figura 5B). De este
modo la integrina \alpha_{v}\beta_{3} detectada por el
anticuerpo LM609 no se estaba expresando activamente por los vasos
sanguíneos maduros presentes en un embrión de pollo sin tratar de
10 días. Como se muestra en el modelo de CAM y en los siguientes
Ejemplos, mientras los vasos sanguíneos experimenta un nuevo
crecimiento en una embriogénesois normal o inducida por citoquinas o
tumores, los vasos sanguíneos expresan \alpha_{v}\beta_{3}.
Sin embargo, después de la neovascularizaciónactiva, una vez que
los vasos han dejado de desarrollarse, la expresión de
\alpha_{v}\beta_{3} se reduce a niveles no detectables por
el análisis de inmunofluorescencia. La regulación de la expresión de
\alpha_{v}\beta_{3} en los vasos sanguíneos que
experimentan la angiogénesis una vez contrastada con la carencia de
expresión en los vasos maduros proporciona la única capacidad de la
invención para controlar e inhibir la angiogénesis como se muestra
en los siguientes Ejemplos modelizados usando el sistema de ensayo
de angiogénesis de CAM.
Se ha demostrado que la angiogénesis se induce
por citoquinas o factores de creciiento con se referencia en el
Ejemplo 5A. En los experimentos descritos en la presente memoria
descriptiva, la angiogénesis en la preparación de CAM descrita en el
Ejemplo 5 se indujo por factores de crecimiento que se encontraron
tópicamente sobre los vasos sanguíneos de la CAM tal como se
describe en la presente memoria descriptiva.
La angiogénesis se indujo colocando un disco de
filtro Whatman de 5 milímetros (mm) x 5 mm (Papel filtrante Whatman
nº 1) saturado con Una Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS,
GIBCO, Grand Island, NY) o HBSS que contenía 150
nanogramos(mililitro (ng/ml) de factor de crecimiento de
fibroblasto básico recombinante (\betaFGF) (Genzyma, Cambridge,
MA) sobre la CAM de un embrión de pollo de 0 días en una región
desprovista de vasos sanguíneos y las ventanas se sellaron más
tarde con cinta. En otros ensayos, 125 ng/ml de \betaFGF fue
también eficaz para inducir el crecimiento de los vasos
sanguíneos. La angiogénesis se controló por fotomicrografía después
de 72 horas. Las CAM se congelaron rápidamente, y se fijaron unas
secciones de criostato de 6 um con acetona y se tiñeron con
inmunofluorescencia tal como se describe en el Ejemplo 5c con 19
ug/ml de anticuerpo monoclonal anti-\beta_{1}
CSAT o LM609
La fotomicrografía de inmunofluorescencia de la
figura 5C muestra la expresión mejorada de
\alpha_{v}\beta_{3} durante la angiogénesis inducida por
\betaFGF sobre la CAM de pollo en contraste con la ausencia de
expresión de \alpha_{v}\beta_{3} en una CAM de pollo sin
tratar como se muestra en la figura 5B. \alpha_{v}\beta_{3}
se pudo detectar fácilmente sobre muchos (75% a 80%) de los vasos
sobre las CAM tratada con \betaFGF. Además, la expresión de la
integrina \beta_{1} se mantuvo sin cambio respecto de la vista
en una CAM sin tratar ya que \beta_{1} también se pudo detectar
fácilmente sobre los vasos sanguíneos simulados.
A continuación, se cuantifico la expresión
relativa de las integrinas \alpha_{v}\beta_{3} y
\beta_{1} durante la angiogénesis inducida por \betaFGF por
análisis de imagen confocal por láser de las secciones de criostato
de CAM. Las secciones teñidas se analizaron a continuación con un
microscopio confocal láser Zeiss. Se seleccionaron 25 vasos teñidos
con LM609 y 15 vasos teñidos con CSAT (tamaño medio de
aproximadamente 1200 mm^{2}, gama de 350 a 3,500 mm^{2}) a
partir de campos aleatorios y la media de fluorescencia de rodamina
para cada vaso por área de unidad se midió en unidades arbitrarias
por análisis de imagen confocal láser. Los datos se expresaron como
la intensidad de fluorescencia media en unidades arbitrarias de
vasos \pm error estándar (ES).
Los resultados representados en la Figura 6
muestran que el teñido de \alpha_{v}\beta_{3} se mejoró
significativamente (cuatro veces más) sobre las CAM tratadas con
\betaFGF como se determina mediante el Ensayo de Suma Wilcoxon
Rank (P<0,0001), mientras que el teñido con \beta_{1} no fue
significativamente diferente con el tratamiento con \betaFGF.
El ensayo de CAM se uso además para examinar el
efecto de otro potente inductor de angiogénesis, el factor alfa de
necrosis tumoral (TNF\alpha), sobre la expresión de las
integrinas \beta_{1}y \beta_{3}. Se descubrió que los
discos filtrantes impregnados con \betaFGF o TNF\alpha y
colocados sobre las CAM de embriones de diez días promovían la
angiogénesis local después de 72 horas.
Los resultados se muestran en las
fotomicrografías de las CAM sin tratar (figura 7A), tratadas con
\betaFGF (figura 7B) o tratadas con TNF\alpha (figura 7C). Los
vasos sanguíneos se observan fácilmente tanto en las preparaciones
tratadas con \betaFGF como con TNF\alpha pero no están
presentes en la CAM sin tratar. De este modo, la aplicación tópica
de factor de crecimiento/citoquina dio como resultado la inducción
de angiogénesis de vasos maduros en un área adyacente dentro del
área originalmente desprovista de vasos sanguíneos. A la vista de
los vasos sanguíneos inducidos por \betaFGF y la expresión
concomitante de \alpha_{v}\beta_{3} como se muestra en la
figura 5C, el tratamiento de TNF\alpha da como resultado
actividades comparables.
Estos descubrimientos indican que tanto en los
seres humanos como en los pollos, los vasos sanguíneos implicados
en angiogénesis muestran una expresión mejorada de
\alpha_{v}\beta_{3}. Según esto, la expresión de
\alpha_{v}\beta_{3} en células endoteliales cultivadas se
puede inducir por diversas citoquinas in vitro como se
describe en Janat et al., J. Cell Physiol., 151:588
(1992); Einstein et al., Exp. Cell Res., 203:499
(1992) y Swerlick et al., J. Invest. Derm., 99:715
(1993).
El efecto sobre la angiogénesis inducida por
factor de crecimiento por los inhibidores de anticuerpos y péptidos
se presenta en los Ejemplos 7A y 7B.
La preparación de CAM para evaluar el efecto de
los inhibidores de angiogénesis sobre la formación natural de
neovasculatura embriónica fue el embrión de pollo de 6 días
embriónicos anteriormente descrito. En esta etapa de desarrollo, los
vasos sanguíneos se someten de nuevo a crecimiento y de este modo
proporcionan un sistema útil para determinar si
\alpha_{v}\beta_{3} participa en la angiogénesis. El
sistema de CAM se preparó tal como se describe anteriormente con la
excepción de que el ensayo se realizó en un embrión de 6 días
embriónicos en lugar de 10 días. El efecto sobre la angiogénesis
embriónica por tratamiento con los anticuerpos y los péptidos de la
invención se presentan en el Ejemplo 7C.
Para investigar la función de
\alpha_{v}\beta_{3} en la angiogénesis inducida por
tumores, se usaron diversos fragmentos de melanoma y carcinoma
humanos de \alpha_{v}\beta_{3} negativo en el ensayo de CAM
que previamente se hicieron crecer y se aislaron de la CAM de un
embrión de pollo de 17 días como se describe en Brooks et
al., J. Cell Biol.., 122:1351 (1993) y como se describe
en la presente memoria descriptiva. Los fragmentos indujeron una
neovascularización extensiva en presencia sólo tampón.
La angiogénesis se indujo en el sistema de ensayo
de CAM por la aposición directa de un fragmento de tumor sobre la
CAM. La preparación de la CAM de embrión de pollo fue idéntica al
procedimiento descrito anteriormente. En lugar de un disco
filtrante de papel, se colocó un fragmento de 50 miligramos (mg) a
55 mg de peso de un tumor de melanoma humano M21L, un tumor de
carcinoma de pulmón humano UCLAP-3, una línea
celular de carcinoma pancreático humano FG (Cheresh et al.,
Cell 58:945-953, 1989), o una línea celular
de carcinoma de laringe humana HEp3, todos los cuales son tumores
de \alpha_{v}\beta_{3} negativo, sobre la CAM en un área
originalmente desprovista de vasos sanguíneos.
La línea celular de melanoma humano M21L, la
línea celular de carcinoma de pulmón humano UCLAP-3,
la línea celular de carcinoma pancreático FG, o la línea celular
de carcinoma de laringe humana HEp3, todas de
\alpha_{v}\beta_{3} negativo, se usaron para hacer crecer
los tumores humanos sólidos sobre las CAM de los embriones de
pollo. Una suspensión de células simples de 8 x 10^{6}
M21-L, UCLAP-3, y FB o células de 5
x 10^{5} Hep3 se aplicaron en primer lugar a las CAM en un
volumen total de 30 micrólitros (ul) de HBSS estéril. Las ventanas
se sellaron con cinta y los embriones se incubaron durante 7 días
para permitir el crecimiento de lesiones tumorales humanas. Al
término de los 7 días, se tenía un embrión de 17 días, y los
tumores se resecaron a partir de las CAM y se cortaron libres de
tejido de CAM circundante. Los tumores se cortaron en fragmento de
50 mg a 55 mg para su uso en ensayos de angiogénesis o de
crecimiento tumoral. Los fragmentos tumor se colocaron sobre una
nueva serie de CAM de embriones de pollo de 10 días como se
describe en el Ejemplo 6A en un área desprovista de vasos
sanguíneos.
Los tumores cultivados in vivo sobre las
CAM de embriones de pollo se tiñeron para la expresión de
\alpha_{v}\beta_{3} con mAb LM609 como se describe en el
Ejemplo 3ª. No se observó ningún teñido específico de las células
tumorales que indicasen una carencia de expresión de
\alpha_{v}\beta_{3}.
Estas preparaciones de tumor de CAM se trataron a
continuación como se describe en los Ejemplos 7D y 7E para medir los
efectos de los anticuerpos y los péptidos sobre la angiogénesis
inducida por tumores. Las preparaciones de tumor de CAM también se
trataron como se describe en los Ejemplos 8, 9 y 12 para medir los
efectos de los anticuerpos y los péptidos en la regresión de
tumores y la apóptosis de vasos sanguíneos angiogénicos y células
vasculares.
Para determinar si \alpha_{v}\beta_{3}
desempeña una función activa en la angiogénesis, se colocaron
discos filtrantes saturados con \betaFGF o TNF\alpha sobre las
CAM, a continuación se añadieron los anticuerpos monoclonales
(también denominados mAb), LM609 (específico para
\alpha_{v}\beta_{3}), CSAT (específico para \beta_{1}),
o P3G2 (específico para \alpha_{v}\beta_{5}) a la
preparación.
La angiogénesis se indujo sobre la CAM a partir
de embriones de pollo de 10 días mediante discos filtrantes
saturados con \betaFGF, Los discos se trataron a continuación con
50 ml de HBSS que contenía 25 mg de mAb en un volumen total de 25 ul
de HBSS estéril en intervalos de 0, 24 y 48 horas. Al cabo de 78
horas, las CAM se recogieron y se colocaron en una placa de Petri y
se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada de fosfato.
Se analizó el lado inferior del papel filtrante y el tejido de CAM
bajo un microscopio estéreo Olympus, con dos observadores de un
modo doble ciego. La inhibición de la angiogénesis se consideró
significativa cuando las CAM exhibieron una reducción de más del
50% en la infiltración de los vasos sanguíneos de la CAM
directamente bajo el disco. Los experimentos se repitieron cuatro
veces por anticuerpo, con 6 o 7 embriones por caso.
Los resultados de los efectos del tratamiento de
mAb sobre la angiogénesis inducida por \betaFGF se muestran en las
Figuras 8A-8B. Una preparación de CAM sin tratar
desprovista de vasos sanguíneos se muestra en la figura 8A para
proporcionar una comparación con la inducción de vasos sanguíneos de
\betaFGF mostrada en la figura 8B y los efectos sobre ésta
mediante mAbs en las figuras 8C-8E. Aproximadamente
el 75% de la CAM tratadas con mAb LM609 exhibieron una inhibición de
angiogénesis superior al 50% como se muestra en la figura 8E, y
muchas de éstas parecen desprovistas de infiltración de vasos. En
contraste con lo anterior, el control de tampón (figura 8C) y los
discos tratados con mAbs CSAT (figura 8C) y P3G2 (figura 8D)
mostraron consistentemente una vascularización extensiva.
Se obtuvieron resultados idénticos cuando se
indujo la angiogénesis con TNF\alpha. Para examinar los efectos de
estos mismos anticuerpos sobre vasos sanguíneos maduros
preexistentes presentes a partir de un desarrollo normal de los
vasos adyacentes a las áreas desprovistas de vasos, se colocaron
discos filtrantes saturados con mAbs sobre las regiones
vascularizadas de las CAM de embriones de 10 días que no recibieron
aplicación tópica de citoquina. Ninguno de los tres mAbs afectó a
los vasos preexistente como se determinó mediante visualización
bajo un microscopio estéreo. De este modo mAb LM609 inhibió
selectivamente únicamente el nuevo creciiento de vasos sanguíneos y
no afecto a los vasos sanguíneos maduros presentes en las áreas
adyacentes. Este mismo efecto se observó con la aplicación de
péptidos sintéticos aplicados tópicamente o intravenosamente como se
describe en los Ejemplos 7A2) y 7E2), respectivamente.
Los ensayos de CAM también se llevaron a cabo con
los péptidos sintéticos de la invención para determinar el efecto de
los péptidos cíclicos y linealizados sobre la angiogénesis inducida
por factor de crecimiento. Los péptidos se prepararon como se
describe en el Ejemplo 1 y se presento 80 ug de péptido en un
volumen total de 25 ul de HBSS estéril. La solución de péptidos se
aplicó inmediatamente a la preparación de CAM y a continuación de
nuevo a las 24 y 48 horas. A las 72 horas el papel filtrante y el
tejido de CAM circundante se sometió a disección y se observó como
se ha descrito anteriormente.
Los resultados de este ensayo mostraron ser
similares a los mostrados en las figuras 9A-9C como
se describe en el Ejemplo 7E2) donde los péptidos sintéticos se
inyectaron por vía intravenosa en los vasos sanguíneos inducidos
por tumor. En este punto, con el péptido de control, 62186, los
vasos sanguíneos inducidos por \betaFGF permanecieron sin cambios,
como se muestra en la figura 9A. En contraste con lo anterior,
cuando el péptido de RGD cíclico, 62814, se aplicó al filtro, la
formación de vasos sanguíneos se inhibió dejando el área
desprovista de nueva vasculatura. Este efecto fue similar en
apariencia al mostrado en la figura 9B como se describe en el
Ejemplo 7E2) más adelante. Además, también como se muestra en la
figura 9C para los péptidos inyectados intravenosamente, en áreas
en las que los vasos sanguíneos maduros estaban presentes e incluso
distantes de la colocación del filtro saturado de factor de
crecimiento, no se observo ningún efecto con el tratamiento tópico
de los péptidos sintéticos sobre los vasos subyacentes. La
actividad inhibitoria de los péptidos sobre la angiogénesis se
limita de este modo a las áreas de angiogénesis inducidas por
factores de creciiento y no afecta a los vasos maduros
preexistentes adyacentes o dan como resultado cualquier
citotoxicidad deletérea al área circundante.
Se llevaron a cabo ensayos similares con los
otros péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo 1 y los
representados en la Tabla 1.
El efecto sobre la angiogénesis inducidas por
factores de crecimiento con anticuerpos monoclonales inyectados
intravenosamente en la preparación de CAM también se evaluó para su
uso en la invención.
La preparación de las CAM de embrión de pollo
para inyecciones intravenosas tenían esencialmente como se describe
en el Ejemplo 7A algunas modificaciones. Durante los procedimientos
de iluminación los vasos sanguíneos prominentes se seleccionaron y
se hicieron marcas sobre las cáscara del huevo para indicar sus
posiciones. Los agujeros se taladraron en la cáscara y las CAM se
cayeron y los papeles filtrantes saturados de \betaFGF se
colocaron sobre las CAM como se ha descrito anteriormente. Las
ventanas se sellaron con cinta estéril y los embriones se volvieron
a colocar en la incubadora. 24 horas más tarde, se cortó
cuidadosamente una segunda ventanita sobre el lateral de la cáscara
de huevo directamente sobre los vasos sanguíneos prominentes
previamente seleccionados. Se retiró cuidadosamente a cáscara de
huevo exterior dejando intactas las membranas embriónicas. La
membrana de la cáscara se volvió transparente con una pecunia gota
de aceite mineral (Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT)
que permitió que los vasos sanguíneos se viesen fácilmente. Los mAbs
estériles, o los péptidos sintéticos, siendo descritos estos
últimos más adelante, se inoculan directamente en los vasos
sanguíneos una vez con una aguja de calibre 30 con una dosis de 200
ug de IgG por embrión en un volumen total de 100 ul de PBS estéril.
Las ventanas se sellaron con cinta y los embriones estuvieron
incubándose durante 72 horas. Los discos filtrantes y los tejidos
de CAM circundantes se analizaron tal como se ha descrito
anteriormente.
Para determinar la localización de LM609 mAb en
los tejidos de CAM o en tejidos tumorales, como se muestra en la
presente memoria descriptiva y en los siguientes Ejemplos, que se
inocularon previamente con LM609, se bloquearon las secciones con
MSA al 2,5% en HBSS durante 1 hora a temperatura ambiente seguido
del teñido con una dilución al 1:250 de anticuerpo secundario
marcado de rodamina antiratón de cabra (Tago). Las secciones se
analizaron a continuación con un microscopio de componente de
inmunofluorescencia Zeiss.
Los resultados del tratamiento intravenosos de
anticuerpos a la preparación CAM de vasos sanguíneos inducida por
\betaFGF se muestran en las figuras 10A-10C. En la
figura 10A, se muestra la angiogénesis inducida como una resultado
del tratamiento con \betaFGF. No se observó ningún cambio en la
presencia de la vasculatura inducida por \betaFGF con exposición
intravenosa a mAb P3G2., un anticuerpo
anti-\alpha_{v}\beta_{5} como se muestra en
la figura 10B. En contrate con lo anterior, el tratamiento de la
preparación CAM de angiogénesis inducida por \betaFGF con LM609,
un anticuerpo anti-\alpha_{v}\beta_{3},
dio como resultado la completa inhibición del crecimiento de nuevos
vasos en el área del filtro con se muestra en la figura 10C. El
efecto inhibitorio sobre la angiogénesis es de este modo el
resultado de la inhibición de la actividad de receptor de
\alpha_{v}\beta_{3} por el anticuerpo específico anti-
\alpha_{v}\beta_{3} LM609. Puesto que el bloqueo de
\alpha_{v}\beta_{5} no inhibe la formación de neovasculatura
en el lugar filtrante de las CAM, de este modo
\alpha_{v}\beta_{5} no es esencial, si se compara con
\alpha_{v}\beta_{3} para el crecimiento de nuevos
vasos.
Los péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo
1 se inyectan de manera intravenosa por separado en los vasos
sanguíneos inducidos por el factor de crecimiento en la preparación
CAM como se describe anteriormente. El efecto de los péptidos sobre
la viabilidad de los vasos se evalúa de manera similar.
Para determinar si \alpha_{v}\beta_{3}
participa en la angiogénesis embriónica, el efecto de LM609 sobre
nuevo crecimiento de los vasos sanguíneos sobre las CAMs se examinó
en embriones de 6 días, una etapa marcada por la neovascularización
activa tal como se describe en el Ejemplo 5A. El ensayo de CAM se
preparó como se describe en el Ejemplo 6C con la posterior
aplicación tópica de discos saturados con mAbs colocados sobre las
CAM de los embriones de 6 días en ausencia de citoquinas. Después de
3 días, las CAM se resecaron y se fotografiaron. Cada experimento
incluyó 6 embriones por grupo y se repitió 2 veces.
El anticuerpo LM609 (figura 11C), pero no CSAT
(figura 11A) o P3G2 (figura 11B), previno el crecimiento vascular en
estas condiciones; esto indica que \alpha_{v}\beta_{3}
desempeña una función sustancial en la neovascularización
embriónica que es independiente de la adición de factores de
crecimiento para la inducción de la angiogénesis.
Los péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo
1 se añaden a la preparación CAM embriónica preparada
anteriormente y como se describe en el Ejemplo 5A2) por aplicación
tópica a la CAM o aplicación intravenosa a los vasos sanguíneos. El
efecto de los péptidos sobre la viabilidad de los vasos se evalúa de
manera similar.
Además de los ensayos de angiogénesis descritos
anteriormente en los que se evaluaron los efectos de los
antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3}, LM609 y los péptidos
62181, 62184, 62185, 62187 y 62880, sobre la angiogénesis
embriónica, también se investigó la función de
\alpha_{v}\beta_{3} en la angiogénesis inducida por
tumores. Como inductores, se usaron fragmentos de melanoma
M21-L humano \alpha_{v}\beta_{3} negativo
previamente cultivados y aislados a partir de la CAM de un embrión
de pollo de 17 día. Los fragmentos se prepararon como se describe
en el Ejemplo 6C.
Como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo
7A1), se aplicaron por separado mAb de manera tópica a los
fragmentos de tumor con una concentración de 25 ug en 25 ml de HBSS
y las ventanas se sellaron con cinta. Se añadieron mAbs de nuevo de
la misma manera a las 24 horas y a las 48 horas. Después de 78
horas, los tumores y los tejidos de CAM circundantes se analizaron
como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7A1).
Como se ha descrito en el Ejemplo 6C, los tumores
se derivaron inicialmente transplantando células
M21-L cultivadas, las cuales no expresan la
integrina \alpha_{v}\beta_{3},como se describe en
Felding-Habermann et al., J. Clin.
Invest., 89:2018 (1992) sobre las CAM de embriones de pollo de
10 días. Estos fragmentos negativos de \alpha_{v}\beta_{3}
indujeron la neovascularización extensiva en presencia de sólo
tampón, o mAb CSAT (anti- \beta_{1}) o P3G2 (anti-
\alpha_{v}\beta_{5}) En contraste con lo anterior, mAb
LM609 (anti- \alpha_{v}\beta_{3}) suprime la infiltración
de la mayoría de los vasos en la masa tumoral y la CAM
circundante.
Para cuantificar el efecto de mAb sobre la
angiogénesis inducida por tumores, los vasos sanguíneos que entran
en el tumor en el interior del plano focal de la CAM se contaron
bajo un microscopio estéreo por dos observadores en de una manera
doble-ciego. Cada barra de datos presentada en la
figura 12 representa el número medio de vasos \pm E.T. de 12 CAM
en cada grupo que representa experimentos duplicados.
Este análisis cuantitativo revela una reducción
de tres veces en el número de vasos que entran en los tumores
tratados con mAb LM609 comparado con los tumores tratados con tampón
o los otros mAbs, P3G2 o CSAT (P< 0,0001) como se determina por
el en ensayo de suma de Wilcoxon Rank El hecho de que los tumores
M21-L no expresen \alpha_{v}\beta_{3} indica
que mAb LM609 inhibe la angiogénesis afectando directamente los
vasos sanguíneos en lugar de las células tumorales. Estos
resultados corresponden a la distribución histológica de
\alpha_{v}\beta_{3} en las biopsias de tejidos cancerosos
mostradas en las Figuras 3A-3D donde la distribución
de \alpha_{v}\beta_{3} se limitó a los vasos sanguíneos en
el tumor y no a las células tumorales en sí.
Los péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo
1 se aplican tópicamente al sistema de ensayo de CAM angiogénico
inducido por tumores como se describe anteriormente. El efecto de
los péptidos sobre la viabilidad de los vasos se evalúa de manera
similar.
Los vasos sanguíneos inducidos por tumores
preparados como se describe en el Ejemplo 7D1) también se trataron
con mAbs aplicados por inyección intravenosa. Los tumores se
colocaron sobre las CAM como se describe en el Ejemplo 7D1) y las
ventanas se sellaron con cinta y 24 horas más tarde, se inocularon
200 ug de mAbs purificados, una vez, de manera intravenosa en los
vasos sanguíneos del embrión de polo como se ha descrito
anteriormente. Los embriones de pollo se incubaron durante 7 días.
El alcance de la angiogénesis se observó a continuación como se ha
descrito anteriormente. Como se describe en el Ejemplo 8 más
adelante, después de este periodo de tiempo, los tumores se
resecaron y se analizaron por su peso para determinar el efecto de
la exposición al anticuerpo respecto del crecimiento o supresión
del tumor.
Se evaluaron también los efectos de la
exposición a péptidos respecto de la vasculatura inducida por
tumores en el sistema de ensayo CAM. La preparación de
tumor-CAM se uso como se ha descrito anteriormente
con la excepción de que en lugar de una inyección intravenosa de un
mAb, se inyectaron por separado péptidos sintéticos preparados como
se describe en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 7A2), en vasos sanguíneos
visibles.
Los resultados de los ensayos de CAM con el
péptido cíclico, 66203 que contiene sal de HCl, y el péptido de
control, 62186, se muestran en las figuras 9A-9C.
En la figura 9A, el tratamiento con el péptido de control no afecta
a los abundantes y grandes vasos sanguíneos que se indujeron por
tratamiento con tumores para crecer en un área originalmente
desprovista de vasos sanguíneos de la CAM. En contraste con lo
anterior, cuando el péptido RGD cíclico, 66203, un antagonista a
\alpha_{v}\beta_{3}, se aplicó al filtro, la formación de
vasos sanguíneos se inhibió dejando el área desprovista de nueva
vasculatura como se muestra en la figura 9B. El efecto inhibitorio
del péptido que contiene RGD fue específico y se localizo como se
pone en evidencia por una ausencia de cualquier efecto deletéreo
sobre los vasos adyacentes al emplazamiento del tumor. De este
modo, en la figura 9C, cuando los péptidos inhibitorios se inyectan
intravenosamente en el interior del sistema de ensayos de CAM, no se
observó ningún efecto sobre los vasos maduros preexistentes
presentes en la CAM en las áreas adyacentes aunque distantes del
emplazamiento del tumo. Los vasos preexistentes en este lugar no e
vieron afectado por el péptido inhibitorio que fluía dentro de los
vasos, aunque se inhibió la generación de nuevos vasos a partir de
los vasos preexistentes en la masa tumoral. De este modo los
péptidos sintéticos incluyendo 66203 y 62184, previamente mostrados
en los ensayos de ligando-receptor en el Ejemplo 4
para ser antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3}, no han
demostrado inhibir la angiogénesis que se limita a los vasos que
experimentan un desarrollo y no a los vasos preexistentes
maduros. Además, la infusión intravenosa de los péptidos no da como
resultado ninguna citotoxicidad deletérea respecto del área
circundante como se pone en evidencia por la vasculatura intacta en
la Figura 9C.
Se realizan ensayos similares con los otros
péptidos sintéticos preparados en El Ejemplo 1 y expuestos en la
Tabla 1.
Como se ha descrito en el Ejemplo 7D1, además de
evaluar visualmente el efecto de los antagonistas de
anti-\alpha_{v}\beta_{3} sobre la
angiogénesis inducida por factores de crecimiento o tumores, el
efecto de los antagonistas también se evaluó midiendo cualquier
cambio respecto de la masa tumoral que sigue a la exposición.
Para este análisis, se preparó el sistema de ensayos de CAM de
angiogénesis inducida por tumores como se describe en los Ejemplos
6C y 7D. Al final del periodo de 7 días de incubación, los tumores
resultantes se resecaron a partir de las CAM y se cortaron
permaneciendo libres de cualquier tejido residual de CAM, se
lavaron con 1 ml de solución salina tamponada de fosfato y se
determinaron los pesos húmedos para cada tumor.
Además, la preparación del tumor para el análisis
histológico microscópico incluyó la fijación de los ejemplos
representativas de los tumores en Fijador Bulins durante 8 horas y
se inserto en parafina. Las secciones en serie se cortaron y se
tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para sus análisis.
Gladson, et al., J. Clin. Invest., 88:1924 (1991). Las
secciones se fotografiaron con un microscopio de compuestos Olympus
de 150X.
Los resultados de los pesos típicos de los
tumores de melanoma humano (M21l) que dieron como resultado la
aplicación típica del tampón de control (HBSS), P3G2 (anti-
\alpha_{v}\beta_{5}) o LM609 (anti-
\alpha_{v}\beta_{3}) se exponen en la Tabla 4. Se evaluó una
serie de embriones para cada tratamiento, siendo calculado el peso
de tumor medio en miligramos (mg) junto con el SE de la media como
se muestra en la parte baja de la tabla.
La exposición de una masa tumoral de melanoma
humano de \alpha_{v}\beta_{3} negativo en el sistema de
ensayo CAM a LM609 causó la reducción del peso medio de tumor sin
tratar de 172 mg \pm 26 a 52 mg \pm 13. El anticuerpo P3G2 no
tuvo ningún efecto sobre la masa tumoral. De este modo, el bloqueo
del receptor de \alpha_{v}\beta_{3} por la aplicación
tópica del anticuerpo LM609 específico de
\alpha_{v}\beta_{3} dio como resultado una regresión de la
masa tumoral junto con una inhibición de la angiogénesis como se
muestra en los Ejemplos anteriores. El diámetro medido de la masa
tumoral resultante de la exposición a P3G2 era aproximadamente de 8
milímetros a 1 centímetro de media. En contraste con lo anterior,
los tumores tratados con LM609 eran de media de 2 a 3 milímetros de
diámetro.
Las secciones congeladas de los tumores revelaron
una citoarquitectura tumoral intacta para el tumor expuesto a P3G2
en contraste con una carencia de estructura celular organizada en
el tumor expuesto a LM609. La actividad del receptor de
\alpha_{v}\beta_{3} es por lo tanto esencial para que un
tumor de \alpha_{v}\beta_{3} negativo mantenga su masa
alimentada por el desarrollo de la neovasculatura de expresión de
\alpha_{v}\beta_{3}. El bloqueo de
\alpha_{v}\beta_{3} con los antagonistas de
\alpha_{v}\beta_{3} de la invención da como resultado la
inhibición de la angiogénesis en el tumor que finalmente da como
resultado la reducción de la masa tumoral.
Los resultados de los pesos típicos de los
tumores de carcinoma (UCLAP-3) que resultan de la
aplicación intravenosa de tampón control (PBS, solución salina
tamponada de fosfato), CSAT (anti- \beta) o LNM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) se exponen en la
Tabla 5. Se evaluó una serie de embriones para cada tratamiento,
siendo calculado el peso de tumor medio junto con el SE de la
media como se muestra en la parte baja de la tabla.
La exposición de una masa tumoral de carcinoma
humano de \alpha_{v}\beta_{3} negativo en el sistema de
ensayo CAM a LM609 causó la reducción del peso medio de tumor sin
tratar de 85 mg \pm 7 a 30 mg \pm 6. El anticuerpo CSAT no tuvo
un efecto significativo sobre el peso de la masa tumoral. De este
modo, el bloqueo del receptor de \alpha_{v}\beta_{3} por la
aplicación intravenosa del anticuerpo LM609 específico de
\alpha_{v}\beta_{3} dio como resultado una regresión de un
carcinoma como ocurrió con la masa tumoral del melanoma
anteriormente junto con una inhibición de la angiogénesis como se
muestra en los Ejemplos anteriores. Además el crecimiento tumoral
del melanoma humano se inhibió de manera similar por la inyección
intravenosa de LM609.
Para evaluar los efectos de los antagonistas de
\alpha_{v}\beta_{3}sobre el crecimiento y la supervivencia
tumoral, se colocaron fragmentos de melanoma humano y fragmentos de
carcinomas del pulmón, páncreas y laringe sobre las CAM de
embriones de 10 días como se describe en el Ejemplo 5A
Veinte horas después de la implantación de la CAM
con los fragmentos de carcinoma de melanoma humano de
\alpha_{v}\beta_{3} negativo M21-L, o el
carcinoma pancreático FG, el carcinoma de pulmón humano
UCLAP-3, o el carcinoma de laringe humano Hep3, se
inyectó a los embriones PBS solo o una única dosis (300 ug/100
ul) de mAb LM609 (anti-\alpha_{v}\beta_{3})
o CSAT (anti-\beta_{1}). Los tumores se
propagaron durante seis días más. Al final del periodo de incubación
los tumores se resecaron cuidadosamente y se cortaron libre de
tejido CAM circundante. Las resecciones de los tumores se
realizaron por dos investigadores independientes retirando sólo la
masa tumoral sólida fácilmente definible. Los tumores tenían
márgenes bien definidos, de este modo, la membrana semitransparente
y fina (CAM) que se puede distinguir fácilmente a partir de la masa
tumoral sólida se retiró sin alterar la propia masa tumoral. Los
tumores resecados se pesaron y se examinaron morfológicamente e
histológicamente.
Como se muestra en la figura 13, los pesos
húmedos de los tumores al final de los 7 días se determinaron y se
compararon con los pesos iniciales de los tumores antes de los
tratamientos. Cada barra representa el \pm E.T. medio de
5-10 tumores por grupo. mAb LM609 inhibió
significativamente el crecimiento tumoral(p < 0,001)
comparado con los controles en todos los tumores sometidos a
ensayo. Los tumores tratados con PBS o CSAT no sólo previene el
crecimiento de estos tumores sino que inducen la regresión extensiva
en la mayoría de los casos. Es importante, resaltar que estas
células tumorales no expresan la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} que demuestra que la inhibición del
crecimiento se debió a los efectos
anti-angiogénicos de este anticuerpo sobre la
neovasculatura en lugar de darse directamente sobre las células
tumorales.
Los fragmentos tumorales de melanoma
M21-L humano (50 mg) se implantaron sobre las CAM
de embriones de 10 días como se describe en el Ejemplo 5A. Veinte
horas más tarde, se inyectó intravenosamente a los embriones PBS
sólo o una única dosis (300 ug/100 ul) de mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) o P3G2 (anti-
\alpha_{v}\beta_{5}). Se dejó que lo tumores se propagasen
como se describe en el Ejemplo 9A1) anterior y se examinaron
morfológicamente e histológicamente como se describe en la presente
memoria descriptiva.
Los ejemplos representativos de los tumores
M21-L tratados con mAbs P3G2
(anti-\alpha_{v}\beta_{5}) o LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) se examinaron
morfológicamente. Los tumores tratados con P3G2 eran grandes (8 mm
de diámetro) y bien vascularizados mientras que los tratados con
mAb LM609 eran más pequeños (3 mm de diámetro) y carecían de vasos
sanguíneos detectables.
Los tumores se examinaron, además, por la
preparación de las secciones histológicas y el teñido con
hematoxilina y eosina como se describe en el Ejemplo 9A1ª). Como se
muestra en la figura 14 (panel superior), los tumores tratados con
mAb P3G2 (anti-\alpha_{v}\beta_{5})
mostraron numerosas células tumorales viables y de división activa
como lo indican las figuras mitóticas (puntas de flecha) así como
los múltiples vasos sanguíneos (flechas) a través de todo el
estroma tumoral. En contraste con lo anterior, no se detecto
ninguna o si acaso muy pocas células tumorales viables o vasos
sanguíneos en los tumores tratados con mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) (figura 14,
panel inferior) Los resultados demuestran que los antagonistas de la
integrina \alpha_{v}\beta_{3} inhiben la angiogénesis
inducida por tumores llevando al detenimiento del crecimiento y a
la regresión de una diversidad de tumores humanos in vivo.
Es importante anotar que los embriones examinados después de siete
fías de crecimiento tumoral (17 días embriónicos) parecían normales
a simple vista, habiendo sido éstos tratado o no con un
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3}. Estos descubrimientos
indican que los antagonistas de esta integrina parecen no ser
tóxicos para los embriones en desarrollo.
Los fragmentos tumorales del melanoma
M21-L humano (50 mg) implantaron sobre las CAM de
embriones de 10 días como se describe en el Ejemplo 5A. 24 horas más
tarde, los embriones recibieron una única inyección intravenosa de
300 ug/100 ul de ciclo-RADfV (69601) y/o
ciclo-RGDfV (66203). Después de un total de 72
horas, los tumores se retiraron, se examinaron morfológicamente y
se fotografiaron con un microscopio estéreo como se describe en el
Ejemplo 9A1).
Los paneles de las figuras 15A a 15E
corresponden a lo siguiente: la figura 15ª, corresponde a muestras
duplicadas tratadas con el péptido ciclo-RADfV
(69601); la figura 15B corresponde a muestras duplicadas tratadas
con el péptido ciclo-RGDfV (66203); la figura 15C,
el tejido de CAM adyacente tomado de los mismos embriones tratados
con el péptido ciclo-RGDfV (66203) y las figuras
15D y 15E, corresponden a una gran ampliación (13x) de los rumores
tratados con péptidos. La figura 15D representa vasos sanguíneos
normales del tumor tratado con el péptido de control (69601). La
figura 15E representa ejemplos de vasos sanguíneos interrumpidos de
tumores (flechas) tratados con el péptido
ciclo-RGDfV (66203).
Los resultados muestran que sólo el péptido
66203 inhibe la formación de vasos, y que además, los vasos del
tejido de CAM adyacente al tumo no fueron afectados.
El efecto de los antagonistas anti-
\alpha_{v}\beta_{3} sobre la angiogénesis inducida por los
factores de crecimiento se puede observar en estructuras
transparente de forma natural como se demuestra en los ejemplos de
la córnea del ojo. Los nuevos vasos sanguíneos crecen a partir del
borde de la córnea, que tiene una rica alimentación en sangre,
hacia el centro de la córnea, que normalmente no tiene alimentación
sanguínea. Los estimuladores de la angiogénesis, tal como
\betaFGF, cuando se aplican a la córnea inducen el crecimiento de
nuevos vasos sanguíneos desde el borde de la córnea. Los
antagonistas de la angiogénesis, aplicados a la córnea, inhiben el
crecimiento de nuevos vasos sanguíneos desde el borde de la córnea.
De este modo, la córnea experimenta angiogénesis a través de una
invasión de células indoteliales desde el borde de la córnea
dentro del tejido corneal recubierto de colágeno duro que es
fácilmente visible. El ensayo del modelo del ojo de conejo
proporciona por lo tanto un modelo in vivo para la
observación directa de la estimulación y de la inhibición de la
angiogénesis que sigue a la implantación de los compuestos
directamente dentro de la córnea del ojo.
La angiogénesis se indujo en el ensayo del modelo
de ojo de conejo in vivo con el factor de crecimiento
\betaFGF y se describe a continuación.
Los sedimentos de polímero Hydron que contienen
factor de creciiento y mAb se prepararon como lo describe D'AMATO,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
91:4082-4085 (1994). Los sedimentos individuales
contenían 650 ng del factor de crecimiento \betaFGF unido a
sucralfato (Carafet, Marion Merrell DOW Corporation) para
estabilizar el FGF\beta y garantizar su liberación lenta en el
tejido circundante. Además, los sedimento de hydron se prepararon
conteniendo 40 \mug de mAb LM609 (anti-
\alpha_{v}\beta_{3}) o mAb P1F6 (anti-
\alpha_{v}\beta_{5}) en PBS. Los sedimentos se fundieron en
clavijas de Teflón especialmente preparadas que tiene un núcleo de
2,5 mm perforado en sus superficies. Se colocó aproximadamente 12
\mul de material de fusión en cada espiga y se polimerizo durante
una noche en una campana estéril. A continuación, se esterilizaron
los sedimentos por radiación ultravioleta.
Cada experimento consistió en tres conejos en los
que un ojo recibió un sediento que comprendía \betaFGF y LM609 y
el otro ojo recibió un sedimento que comprendía \betaFGF y un mAb
P1F6 (anti- \alpha_{v}\beta_{5}) de ratón. El uso del
ensayo de ojos emparejados para comparar LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) con otros
controles mAb y PBs proporciona un medio de ensayo riguroso para
demostrar las diferencias significativas entre los mAb
ensayados.
El mAb P1F6 inmunoreacciona con la integrina
\alpha_{v}\beta_{5} que se encuentra sobre la superficie de
las células endoteliales vasculares pero no es presumible que no
esté implicado en la angiogénesis. Para determinar si el mAb P1F6
estuvo implicado en la angiogénesis, se prepararon sedimentos que
contenían únicamente este mAb y se ensayó como se describe más
adelante para confirmar que el mAb no inducía la angiogénesis.
Todos los mAb ensayados se purificaron a partir
de fluido de ascites que usan la cromatografía de columna de
afinidad Proteína- Sefarosa A CL-4B según
procedimientos bien conocidos. La inmunoglobulina eluida se sometió
a continuación a diálisis contra PBS y se trató con gel Detoxi
(Pierce Chemicals) para eliminar la endotoxina. Se ha demostrado que
la endotoxina es una potente estimulante angiogénico e
inflamatorio. Se ensayaron por lo tanto, mAb para detectar la
presencia de endotoxina con el ensayo de lisado de amebocito de
simulo cromogénico (Bio-Whittaker) y se usaron
únicamente los mAb sin endotoxina detectable en el ensayo de modelo
de ojo de conejo.
Se insertó un sedimento de hydron que comprende
\betaFGF y mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) o P1F6
(\alpha_{v}\beta_{5}) en una bolsa corneal formada en el
ojo de los conejos. El sedimento de hydron también contenía
sucrafalto para estabilizar e \betaFGF durante el ensayo. Se
implantaron sedimentos individuales en "bolsas" creadas
quirúrgicamente en el estroma medio de la córnea de los conejos.
El procedimiento quirúrgico se hizo con una técnica estéril usando
un microscopio de operación Wild modelo M691 equipado con un
separador de haces al cual se montó una cámara para grabar
fotográficamente las córneas individuales. Se creó una "bolsa"
de 3 mm por 5 mm en el estroma corneal haciendo una incisión de 3
mm en la mitad del espesor corneal con una cuchilla 69 Beaver. El
estroma se sometió a disección periférica usando una espátula de
iris y el sedimento se implanto con su margen periférico a 2 mm del
limbo.
Durante los siguientes 14 días, el \betaFG y
el mAb se difundieron a partir del sedimento implantado en el
tejido circundante y por lo tanto se efectuó la angiogénesis desde
el borde de la córnea.
Los resultados representativos de cada
tratamiento se muestran e las figuras 16A a 16E. La cantidad de
vasos presentes se cuantifica y se describe en término de horas de
reloj que se definen como sigue. El ojo se divide en 12 secciones
iguales de la misma manera que un reloj se divide en horas. "Una
hora de reloj de vasos" se refiere a la cantidad de vasos que
llenan un área del ojo equivalente a una hora en un reloj. Los
cinco conejos que recibieron sólo \betaFGF exhiben angiogénesis
florida en la que los nuevos vasos sanguíneos han crecido desde el
borde de la córnea hacia el centro de la córnea, que normalmente no
tiene vasos sanguíneos. Uno de los conejos tenía sólo 1 hora de
reloj de vasos al sedimento. Dos de los conejos que recibieron
tanto \betaFGF como LM609 no tenían en absoluto angiogénesis
detectable hasta 14 días después de la cirugía. Uno de los conejos
tuvo 3 focos de vasos hemorrágicos en ciernes después del día 14.
Dos de los conejos que recibieron \betaFGF y mAb P3G2
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) mostraron una
vascularización extensiva en la que habían crecido nuevos vasos
sanguíneos desde el borde de la córnea hacia el centro de la
córnea. Una Uno de estos conejos sólo tenía 1 a 2 horas de vasos al
sedimento.
Como se puso en evidencia en el ensayo del modelo
del ojo de conejo, no se observó ningún efecto angiogénico sobre los
vasos paralimbales en presencia del factor de crecimiento \betaFGF
en los conejos que recibieron mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}). En contraste
con lo anterior, se observó angiogénesis en los vasos paralimbales
en presencia del factor de crecimiento \betaFGF en los conejos
que recibieron mAb P3G2 (anti- \alpha_{v}\beta_{5}). La
total inhibición de la angiogénesis corneal por mAb LM609 es
sustancialmente mayor que con cualquier reactivo
anti-angiogénico previamente mencionado.
En un modelo de ratón quimérico: ser humano in
vivo se generó por sustitución de una parte de la piel de un
ratón SCID con prepucio neonatal humano (figura 17). Después de
realizar el injerto de piel, el prepucio humano se inoculó con
células de carcinoma. Después de establecer un tumor medible, se
inyectó mAb LM609 (anti-\alpha_{v}\beta_{3})
o PSB en la vena de la cola del ratón. Después de un periodo de
1-3 semanas, el tumor se extirpó y se analizó desde
el punto de vista del peso y de la histología.
El modelo ratón quimérico: ser humano in
vivo se prepara esencialmente como se describe en Yan, et
al., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993).
En breve, se retiró quirúrgicamente un área cuadrada de 2 cm^{2}
de piel de un ratón SCID (de 6 - 8 semanas) y se sustituyó con un
prepucio humano. El ratón se anestesió y se retiro el vello de un
área de 5 cm^{2} de cada lado de la región abdominal lateral
rasurándolo. Se prepararon dos capas de injerto circulares de 2
cm^{2} retirando todo el espesor de la piel hacia abajo hacia la
fascia. Todo el espesor de los injertos de piel humana del mismo
tamaño derivados de prepucio neonatal humano se colocó sobre loa
capas heridas y suturadas in situ. El injerto se cubrió
con una tirita que se suturó a la piel. También se aplicó una tira
de tejido microporoso para cubrir la herida.
La línea celular de melanoma humano M21L o la
línea celular de carcinoma de mama MDA 23.1 (ATTC HTB 26;
\alpha_{v}\beta_{3} negativo por inmunorrreactividad de las
secciones de tejido con mAb LM609), donde se usaron para formar los
tumores humanos sólidos sobre los injertos de piel humana sobre los
ratones SCID. Una única suspensión de células de 5 x 10^{6} de
células M21-L o MDA23.1 se inyectó de manera
intradérmica en el injerto de piel humana. A continuación se
observaron los ratones durante 2 a 4 semanas para permitir un
crecimiento de los tumores humanaos medibles.
Después del creciiento de tumores medibles, los
ratones SCID, a los que se había inyectado células tumorales M21L,
se les inyectó intravenosamente en la vena de la cola 250 \mug de
mAb LM609 (anti-\alpha_{v}\beta_{3}) o PSB
dos veces por semana durante 2 a 3 semanas. Después de este periodo
de tiempo, los tumores se resecaron a partir de la piel y se
cortaron libres de tejido circundante. Se evaluaron diversos ratones
para cada tratamiento, calculándose el peso medio del tumor de cada
tratamiento y siendo mostrados en la parte inferior de la Tabla
6.
Número de Tumor M21L | Tratamiento | Peso del Tumor (mg) |
1 | PBS | 158 |
2 | 192 | |
3 | 216 | |
4 | 227 | |
5 | LM609 | 195 |
6 | 42 | |
7 | 82 | |
8 | 48 | |
9 | 37 | |
10 | 100 | |
11 | 172 |
Tratamiento | Peso medio del tumor (mg) | |
PBS | 198 | |
LM609 | 113 |
La exposición de la masa tumoral del carcinoma
humano \alpha_{v}\beta_{3} negativo en el sistema de ensayo
quimérico ratón: ser humano respecto de LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) produjo la
reducción de le peso medio de los tumores tratados con PBS de 198 a
113 mg.
Los ejemplos representativos de los tumores M21L
tratados con el mAb LM609 (anti- \alpha_{v}\beta_{3}) y PBS
se examinaron morfológicamente. Los tumores tratados con PBS era
grandes (8 a 10 mm de diámetro) y bien vascularizados, mientras que
los tratados con mAb LM609 (anti- \alpha_{v}\beta_{3}) eran
mucho más pequeños (3 a 4 mm de diámetro) y carecían de vasos
sanguíneos detectables.
Los tumores formados en los injertos de piel que
se han inyectado con células MDA 23.1 se pudieron detectar y
medir. El estudio morfológico de los tumores establecidos reveló
que se había producido la neovascularización del tejido humano
injertado en las células tumorales MDA 23.1.
De este modo, el bloqueo del receptor de
\alpha_{v}\beta_{3} por la aplicación intravenosa de un
anticuerpo LM609 específico de \alpha_{v}\beta_{3} dio como
resultado una regresión de un carcinoma en este sistema modelos de
la misma manera que los ensayos de modelos de la CAM y del ojo de
conejo como se ha descrito en los Ejemplos 9 y 10,
respectivamente.
El proceso angiogénico depende claramente de la
capacidad de las citoquinas tales como \betaFGF y VEGF para
estimular la proliferación de las células vasculares. Mignatti
et al., J. Cell. Biochem., 471:201 (1991); Takeshita
et al., J. clin. Invest., 93:662 (1994); y Koyama
et al., J. Cell. Physiol., 158 :1 (1994). Sin
embargo, también es evidente que los casos de señalización pueden
regular la diferenciación de las células vasculares en los vasos
sanguíneos maduros. De este modo, se puede concebir que la
interferencia con las señales relacionadas con el crecimiento o la
diferenciación de las células vasculares que experimentan un nuevo
crecimiento o angiogénesis puede dar como resultado la
perturbación de la angiogénesis.
Se ha demostrado que los casos de ligazón de
integrinas participan tanto en la proliferación celular como en la
apóptosis o la muerte celular programada in vitro. Schartz,
Cancer Res. 51:1503 (1993); Meredith et al., Mol.
Biol.. Cell., 4:953 (1993);: Frisch et al., J. Cell.
Biol., 124:619 (1994); y Ruoslahti et al.,, Cell,
77:477 (1994). El estudio minucioso de los efectos de los
antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3} sobres la angiogénesis
revela la presencia de vasos sanguíneos asociados a tumores
interrumpidos y discontinuos. Por lo tanto, es posible que la
pérdida de la continuidad de los vasos sanguíneos se pueda deber a
la apóptosis o necrosis selectiva de las células vasculares.
Para explorar esta posibilidad, Las CAM se
estudiaron después de la inducción de la angiogénesis con el factor
de crecimiento \betaFGF y el tratamiento con los péptidos mAb y
cíclicos de la invención.
La apóptosis se puede detectar por una diversidad
de procedimientos que incluyen el estudio directo del ADN aislado
del tejido para detectar la fragmentación del ADN y la detección de
3'OH en tejido intacto con un anticuerpo que detecta
específicamente grupos 3'OH libres de ADN fragmentado.
La angiogénesis se indujo colocando discos
filtrantes saturados con \alpha_{v}\beta_{3} con \betaFGF
sobre las CAM de embriones de 10 días descrito en el Ejemplo 6A.
Los análisis inmunohistológicos de las CAM con LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) revelararon una
expresión de pico de \alpha_{v}\beta_{3} sobre los vasos
sanguíneos 12 a 24 horas después del inicio de la angiogénesis con
\betaFGF. De este modo, 24 horas después de la estimulación con
\betaFGF, los embriones se inocularon intravenosamente con 100 de
PBS solo o PBS que contenía 300 g de mAb CSAT
(anti-\beta_{1}) o LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}).
La fragmentación del ADN se detectó resecando el
tejido de la CAM directamente por debajo de los discos filtrantes
saturados de \betaFGF 24 horas o 48 horas después de las
inoculaciones intravenosas con mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}), CSAT
(anti-\beta_{1}), o PBS. Los tejidos de CAM
resecados se lavaron tres veces con PBS estéril y finalmente se
cortaron finos y se volvieron a suspender en colagenasa bacteriana
al 0,25% (Worthington Biochemical; Freehold, NJ) y se incubaron
durante 90 minutos a 37ºC con agitación de torbellino ocasional. El
ADN se extrajo de números iguales de células deCAM a partir de una
única suspensión celular como se ha descrito anteriormente.
Bisonette, et al., Nature, 359:552 (1992). En breve,
los números iguales de células de CAM se lisiaron en 10 mM de
tris-Cl, de pH 8,0, 10 mM de EDTA en Triton X100 al
0,5% (v/v) (Sigma, St Louis, MO). Los lisados celulares se
centrifugaron a 16.000 vueltas durante 15 minutos a 4ºC para separar
el ADN fragmentados soluble del sedimento de cromatina intacto. El
ADN fragmentado se lavó, se precipitó y se analizó sobre gel de
agarosa al 1,2% (p/v)..
El ADN fragmentado soluble se aisló partir de un
número igual de células de CAM a partir de cada tratamiento, se
separó por electroforesis sobre un gel de goma arábiga y se observó
tiñendo con bromuro de etidio. No se detectó ninguna diferencia en
la cantidad relativa de la fragmentación de ADN resultante de los
tres tratamientos diferentes 24 horas después del tratamiento. Sin
embargo, 48 horas después del tratamientos con mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) se observó un
aumento significativo en la fragmentación del ADN comparado con
los embriones tratados con mAb CSAT
(anti-\beta_{1}) o PBS solo.
Para estudiar experimentalmente la función de
\alpha_{v}\beta_{3} en estos procesos, las células
derivadas de CAM tratadas con o sin \betaFGF se tiñeron con
yoduro de propidio y se hicieron inmunoreaccionar con mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}).
Las CAM aisladas de los embriones 24 y 48 horas
después del tratamiento con mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}), CSAT
(anti-\beta_{1}), o PBS se disociaron en
suspensiones de células simples por incubación con colagenasa
bacteriana como se ha descrito anteriormente. A continuación, as
células simples se permeabilizaron y se tiñeron con un Kit de
detección in situ de Apop Tag según las instrucciones del
fabricante (Oncor, Gaitherburg, MD). Apop Gag es un anticuerpo que
detecta específicamente los grupos 3'OH libres de ADN fragmentado.
La detección de dichos grupos 30OH libres es un procedimiento
establecido para la detección de células apópticas. Gavrieli et
al., J. Cell. Biol.., 119: 493 (1992).
A continuación, las células teñidas con Apop Tag
se aclararon en Triton X-100 al 0,1% (v/v) en PBS
y se volvieron a suspender en tampón FACS que contiene BSA al 0,5%
(p/v),, azida de sodio al 0,02% (p/v) y 200 \mug/ml de Rnasa A en
PBS. Las células se incubaron durante una hora y media, se lavaron y
se analizaron por clasificación celular activada por fluorescencia.
La fluorescencia celular se midió usando un citómetro de flujo
FACSan y los datos se analizaron como se describe más adelante.
La fluorescencia celular se midió con un
citómetro de flujo GACScan (Vetcon Dickinson, Mountain View, CA). Se
determinó la dispersión lateral (SSC) y la dispersión delantera
(FSC) simultáneamente y se recocieron todos los datos con un
ordenador Hewlet Packard (HP9000) equipado con un software de
investigación FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Los
datos se analizaron con la versión I del software P.C. Lysis (Becton
Dickinson, Mountain View, CA). Se establecieron barreras de control
negativo usando suspensiones de células sin la adición de
anticuerpos primarios del kit de Apop Tag. Se aplicaron barreras
idénticas a ambas poblaciones celulares que dieron como resultado el
análisis de aproximadamente 8.000 células por diferente tratamiento
celular.
El porcentaje de células simples derivadas de las
CAM tratadas con mAb y teñidas con Apop Tag como se ha determinado
por el análisis FACS se muestra en la figura 18. La barra negra
representa las células de embriones tratadas 24 horas antes del
análisis. La barra punteada representa células de embriones
tratadas 48 horas antes del análisis. Cada barra representa el \pm
E.T medio de tres réplicas.
Como se muestra en la figura 18, las CAM tratadas
dos días antes con mAb LM609 (anti- \alpha_{v}\beta_{3})
mostraron un aumento de 3 a 4 veces en el teñido con Apop Tag
comparado con las CAM tratadas con PBS solo o CSAT
(anti-\beta_{1}).
Los ensayos de CAM con angiogénesis inducida por
factores de creciiento, como se describe en el Ejemplo 6A, también
se levaron a cabo con los péptidos sintéticos de la invención para
determinar el efecto de los péptidos cíclicos sobre la apóptosis.
Los péptidos ciclo-RGDfV (66203) y
Ciclo-RADfV (69601) se prepararon como se describe
en el Ejemplo 1. Se inyectaron las soluciones de péptidos o PBS en
la preparación de CAM con una concentración de 300 \mug(ml.
A las 24 y 48 horas, el papel filtrante y el tejido de CAM
circundante se disecciono y se tiño con Apop Tag para detectar la
apóptosis como se describe anteriormente en el Ejemplo 12A2).
Como se muestra en la figura 18, Las CAM tratadas
dos días antes don el péptido 69203 (ciclo-RGDfV)
mostró un aumento de 3 a 4 veces superior en el teñido de Apop Tag
comparado con las CAM tratadas con PBS solo o el péptido cíclico de
control 69601 (ciclo-RADfV).
Las suspensiones de células simples se estudiaron
para el número de copias de ADN cromosómico tiñendo con yoduro de
propidio para determinar el efecto del tratamiento con anticuerpos
monoclonales sobre el ciclo celular y para la apóptosis tiñendo con
Apop Tag.
Las suspensiones de células simples de CAM
tratadas 24 o 48 horas antes con mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) o CSAT
(anti-\beta_{1}) o PBS se prepararon como se
describe en el Ejemplo 12A1).
Para teñir las células con Apop Tag, las
suspensiones celulares se lavaron tres veces con tampón que
contenía BSA al 2,5% (p/v) y azida de sodio al 0,25% (p/v) en PBS.
A continuación, las células se fijaron en paraformaldehído al 1%
(p/s) en PBS durante 15 minutos seguido de tres lavados como se ha
descrito anteriormente. Para prevenir la unión no específica, las
suspensiones de células simples se bloquearon con BSA al 5% (p/v)
en PBS durante una noche a 4ºC. A continuación, las células se
lavaron como antes, se tiñeron con Apop Tag, y se midió la
fluorescencia celular con un TACScan como el descrito anteriormente
en el Ejemplo 12A.
Las células de cada condición experimental se
tiñeron con yoduro de propidio (Sigma, St Louis, MO) con una
proporción de 10 \mu/ml en PBS durante una hora, se lavaron dos
veces con PBS, y se analizaron para las características nucleares
típicas de la apóptosis, incluyendo la segmentación y condensación
de cromatina. El porcentaje de las células apópticas se estimó por
el análisis morfológico de la células a partir de al menos 10 a 15
campos microscópicos aleatoriamente seleccionados.
Se proporcionan los resultados combinados de las
suspensiones de células simples de CAM de los embriones tratados con
CSAT (anti-\beta_{1}) o LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}), teñidas con Apop
Tag y yoduro de propidio, y analizadas por FACS, en la figura 19.
El eje Y representa el teñido con ApopTag (apóptosis), el eje X
representa el teñido con yoduro de propidio (contenido de ADN). La
línea horizontal representa la barrera negativa para el teñido con
Apop Tag. Los paneles de la izquierda y de la derecha indican las
células de CAM de embriones tratados con CSAT y LM609,
respectivamente. El análisis del ciclo celular se llevó a cabo por
el análisis de aproximadamente 8.000 casos por condición y los
datos se representaron en un recuadro de contorno.
Las muestras de las células simples obtenidas con
el tinte de ADN el yoduro de propidio revelaron que entre el 25 y
el 30% de las células de CAM tratadas con LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) 48 horas después
del tratamiento evidenciaron una segmentación y/o condensación
nuclear. Estos procesos son característicos de las células que
experimentan apóptosis. Esto está en contraste con las CAM tratadas
con CSAT (anti-\beta_{1}) donde entre el 90 y
el 95 de las células mostraron un teñido nuclear normal.
Como se muestra en la figura 19, consecuentemente
con la inducción de la apóptosis por LM609, se observó un número
significativo de células en un pico que contenía menos de una copia
de ADN (AO). Se mostró previamente este pico para representar el
ADN fragmentado en las células apópticas de la última etapa. Telford
et al., Cytometry, 13:137 (1992). Además, estas
células de AO se tiñen fácilmente con Apop Tag que confirma la
capacidad de este reactivo para detectar las células apópticas. Sin
embargo, además del teñido de las células de AO, también se tiño
con Apop Tag (figura 19) un número significativo de células que
contenían más de una copia de ADN. Los resultados demuestran que
LM609 tiene la capacidad de promover la apóptosis entre las células
vasculares que ya se han introducido en el ciclo celular.
Encontraste con lo anterior, las células derivadas de las CAM de
control que se han introducido en el ciclo celular mostraron un
teñido con Apop Tag mínimo consecuentemente con las pocas células
apópticas detectadas en las CAM tratadas de control.
Entre estas células en las CAM estimuladas con
\betaFGF que se había introducido en el ciclo celular (fase S y
G2/M), el 70% mostró un teñido positivo con LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}). Esto se comparó
con el tenido con LM609 al 10% observado entre las células cicladas
de las CAM no tratadas con \betaFGF. Estos descubrimientos
indican que después de la estimulación por \betaFGF, la mayoría
de las células que llevan \alpha_{v}\beta_{3} muestran una
proliferación activa.
Tomados juntos estos descubrimientos indican que
la inyección intravenosa de mAb LM609 o del péptido cíclico
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3}promueven la apóptosis
dentro de la CAM de pollo después de la inducción de la
angiogénesis.
Las Cam también se estudiaron histológicamente
para la expresión de \alpha_{v}\beta_{3} por
inmunoreactividad con LM609 y para las células que se sometieron a
apóptosis por inmunoreactividad con Apop Tag. Las secciones de CAM
resecadas de los embriones tratados 48 horas antes con LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}), CSAT
(anti-\beta_{1}), o PBS preparadas en el
Ejemplo 5A se lavaron, insertaron en OTC (Baxter) y se congelaron
rápidamente en nitrógeno líquido. Se cortaron secciones de seis
micrómetros de Tejido de CAM, se fijaron en acetona durante 30
segundos, y se guardaron a -70ºC hasta su uso. Las secciones de
tejido se prepararon para el teñido mediante un breve aclarado en
etanol al 70% (v/v) (EtOH=) seguido de tres lavados en PBS. A
continuación, las secciones se bloquearon con BSAA al 5% (p/v) en
PBS durante 2 horas, seguido de la incubación con 10\mug/ml de mAb
LM609 durante 2 horas. A continuación, las secciones se lavaron y se
incubaron con una dilución al 1:50 de rodamina IgG antiratón de
cabra conjugado de rodamina (Fischer Scientific Pittsburg, PA)
durante 2 horas. Finalmente, las mismas secciones se lavaron y se
tiñeron con el Apop Tag como se describe en el Ejemplo 12A2). Las
secciones de tejido teñido se montaron y analizaron por microscopía
inmunofluorescente confocal.
En la figura 20, los paneles A a C representan
tejido de CAM de embriones tratados con CSAT
(anti-\beta_{1}) y los paneles D a F
representan el tejido de CAM de embriones tratados con LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}). Los paneles Am y
D representan los tejidos teñidos con Apop Tag y se observan
mediante fluorescencia (FITC) superpuesta sobre una imagen DIC. Los
paneles B y E representan los mismos tejidos teñidos con mAb LM609
(anti-\alpha_{v}\beta_{3}) y se observan
por fluorescencia (rodamina). Los paneles C y F representan imágenes
fundidas de los mismos tejidos teñidos tanto con Apop Tag como con
LM609 donde el teñido amarillo representa la colocalización. La
barra representa 15 y 50 \mum en los paneles de la izquierda y de
la derecha, respectivamente. Como se muestra en la figura 20
(A-C), después de la inyección intravenosa del
control de CSAT o PBS, el teñido con Apop Tag parecía mínimo o
aleatorio, indicando un nivel mínimo de apóptosis en el tejido.
Encontraste con lo anterior, las CAM de los embriones previamente
tratados con LM609 o péptido cíclico 203 mostró una mayoría de
los vasos teñidos intensamente con Apop Tag mientras que se observó
una mínima reactividad entre las células no vasculares circundantes
(figura 20 D-F). Además cuando se usaron tanto
Apop Tag como LM609 para teñir estos tejidos (19C y 19F) se observó
una colocalización significativa sólo entre los marcadores en las
CAM derivadas de los embriones tratados con antagonistas de
\alpha_{v}\beta_{3}(figura 20F). Estos
descubrimientos demuestran que después de la inducción de la
angiogénesis in vivo, los inhibidores de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} promueven selectivamente la apóptosis
de los vasos sanguíneos que llevan \alpha_{v}\beta_{3}.
Mientras que la angiogénesis es un proceso
complejo que implica muchos casos biológicos moleculares y
celulares, diversas líneas de evidencia sugieren que la integrina
celular vascular \alpha_{v}\beta_{3} desempeña una función
relativamente tardía en el proceso. En primer lugar, el análisis
revela que la expresión de \alpha_{v}\beta_{3} sobre las
células vasculares alcanzó un máximo de 12-24 horas
después de la inducción de la angiogénesis con \betaFGF. En
segundo lugar, los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3}
perturban la angiogénesis inducida por múltiples activadores que
sugieren que este receptor está implicado en el paso común
descendente del quizás todas los eventos de señalización primaria
que llevan a la angiogénesis. En tercer lugar, las CAM tratadas con
mAb Lm609 o péptido cíclico no muestran un aumento significativo en
la apóptosis medida por escalera de ADN hasta 48 horas después del
tratamiento con estos antagonistas. Finalmente, los antagonistas de
\alpha_{v}\beta_{3} promueven la apóptosis de las células
vasculares que ya han sido inducidas para introducirse en el ciclo
celular.
Los resultados presentados en la presente memoria
descriptiva proporcionan la primera evidencia directa de que los
eventos de ligazón de integrina pueden regular la supervivencia
celular in vivo. Por lo tanto se puede suponer que una vez
que empieza la angiogénesis, las células vasculares individuales se
dividen y empiezan a moverse hacia la fuente angiogénica, después de
los cual, la ligazón de \alpha_{v}\beta_{3} proporciona una
señal que permite la supervivencia celular continuada la cual
conduce a la diferenciación y la formación de vasos sanguíneos
maduros. Sin embargo, si se previene la ligazón de
\alpha_{v}\beta_{3} entonces las células dejan de recibir
esta entrada molecular y las células entran en apóptosis por
defecto. Esta hipótesis también predeciría que después de
producirse la diferenciación los vasos sanguíneos maduros ya no
requerirían la señalización de \alpha_{v}\beta_{3} para la
supervivencia y de este modo son refractarios a los antagonistas de
esta integrina.
Finalmente, los resultados presentados en la
presente memoria descriptiva proporcionan la evidencia de que los
antagonistas de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} pueden
proporcionar un potente acercamiento terapéutico para el
tratamiento de la neoplasia u otras enfermedades caracterizadas por
la angiogénesis. En primer lugar, los antagonistas de
\alpha_{v}\beta_{3} interrumpe de nuevo la formación de
vasos sanguíneos maduros sin afectar a la vasculatura preexistente.
En segundo lugar, estos antagonistas no tenían ningún efecto
significativo sobre la viabilidad del embrión de pollo, sugiriendo
que no son tóxicos. En tercer lugar, la angiogénesis se bloqueo de
manera significativa sin tener en cuenta los estímulos
angiogénicos. Finalmente, la administración sistémica de
antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3} causa la espectacular
regresión de diversos tumores humanos histológicamente
distintos.
De este modo, los Ejemplos anteriormente
mencionados demuestran que la integrina \alpha_{v}\beta_{3}
desempeña una función clave en la angiogénesis inducida por una
diversidad de estímulos y que \alpha_{v}\beta_{3} es un
valioso objetivo terapéutico con los antagonistas de
\alpha_{v}\beta_{3} de la invención para las enfermedades
caracterizadas por la neovascularización.
La anterior memoria descriptiva se considera que
es suficiente para permitir que un experto en la técnica ponga en
práctica la invención. La presente invención no ha de limitarse en
su alcance a la línea celular registrada, ya que la realización
registrada se entiende como una simple ilustración de un aspecto
de la invención y cualquier línea celular funcionalmente
equivalente entra dentro del alcance de la invención. El registro
del material no constituye una admisión de que la descripción
escrita contenida en la presente memoria descriptiva sea inadecuada
para permitir la puesta en practica de cualquier aspecto de la
invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni tampoco ha de
interpretarse como una limitación del alcance de las
reivindicaciones a la ilustración específica que representa.
Además, diversas modificaciones de la invención, además de las
mostradas y descritas en la presente memoria descriptiva se harán
evidente a los expertos en la técnica a partir de la anterior
descripción y entrarán dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- SOLICITANTE
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: The Scripps Research Institute
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 10666 North Torrey Pine Road
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92037
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 619-554-2937
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- FA: 619:554:6312
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES ÚTILES PARA LA INHIBICIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, VERSIÓN 1,25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US 95/
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 9 de mazo de 1995
\vskip0.666000\baselineskip
- (VI)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/210.715
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 18 de mazo de 1994
\vskip0.666000\baselineskip
- (VII)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/366.665
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 30 de diciembre de 1994
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 1
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = BOC-GRGDFV.OMe
- /nota= "BOC" significa el grupo protector N-terminal butiloxicarbonilo; OMe significa un éster de metilo C-terminal; arginina en la segunda posición
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = OMe
- /Nota= "OMe significa el grupo protector C-terminal éster de metilo"
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = D-Arg
- /Nota= "Un prefijo ``D'' en D-Arg significa que la arginina en posición 2 es un D-aminoácido"
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTETICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = BOC-GRGDFV.OMe
- /nota= "BOC significa el grupo de bloqueo N-terminal terbutiloxicarbonilo".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (J)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (K)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)OTRA
- INFORMACIÓN: / Etiqueta = OH
- /Nota= "OH significa un ácido carboxílico C-terminal libre".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = D-Arg
- /Nota= "Un prefijo ``D'' en D-Arg significa que la arginina en posición 2 es un D-aminoácido";
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 3
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = H
- /nota= "H significa una mina N-terminal libre"
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = OH
- /Nota= "OH significa un ácido carboxílico C-terminal libre".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = D-Arg
- /Nota= "Un prefijo ``D'' en D-Arg significa que la arginina en posición 2 es un D-aminoácido";
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = ciclo
- /nota= "Ciclo significa un péptido cíclico; las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{GLy Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 5
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..5
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = ciclo
- /nota= "Ciclo significa un péptido cíclico; las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 6
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..5
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = ciclo
- /nota= "Ciclo significa un péptido cíclico; las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 7
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..5
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = ciclo
- /nota= "Ciclo significa un péptido cíclico; las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 8
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg
Gly Asp Val Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 9
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..5
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = ciclo
- /nota= "Ciclo significa un péptido cíclico; las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 10
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = ciclo
- /nota= "Ciclo significa un péptido cíclico; las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Gly Asp Phe Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 11
\vskip0.666000\baselineskip
- (VI)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (VII)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (VIII)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (X)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / Etiqueta = ciclo
- /nota= "Ciclo significa un péptido cíclico; las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido".
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Asp Phe Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 12
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (V)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro
Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 13
\vskip0.666000\baselineskip
- (VI)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (VII)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (VIII)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (X)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg
Leu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 14
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (XII)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (XIII)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (XIV)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (XV)
- TIPO DE FRAGMENTO: Interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp
Leu}
Claims (22)
1. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de la artritis, la retinopatía diabética, la
degeneración macular, la restenosis, un hemangioma o un tumor
sólido de pulmón, páncreas, colon, mama, laringe u ovario,
comprendiendo dicho medicamento una cantidad inhibidora de la
angiogénesis de dicho antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3}.
2. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que dicho medicamento se destina al tratamiento de un tumor y
dicha angiogénesis es angiogénesis tumoral.
3. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que dicho medicamento se destina al tratamiento de la
artritis.
4. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 3 en
el que dicho medicamento se destina al tratamiento de la artritis
reumatoide.
5. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que dicho medicamento se destina al tratamiento de la
retinopatía diabética o la degeneración macular y dicha angiogénesis
es angiogénesis retinal.
6. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que dicho medicamento se destina al tratamiento de un
hemangioma.
7. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 2 en
el que dicho medicamento se administra conjuntamente con
quimioterapia.
8. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que dicho medicamento se destina al tratamiento de un paciente
con riesgo de restenosis después de una angioplastia coronaria.
9. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 en el que dicho medicamento se administra
para proporcionar dicho antagonista de \alpha_{v}\beta_{3}
en una cantidad de 2\muM a 5 mM en plasma.
10. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 en el que dicho medicamento se administra
para proporcionar dicho antagonista de \alpha_{v}\beta_{3}
en una cantidad de 0,1 mg por kilo a 300 mg por kilo.
11. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 en el que dicho medicamento está en una
forma apropiada para la administración tópica, intravenosa,
transdérmica, intrasinovial, intramuscular u oral.
12. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 7 en
el que dicho medicamento está en una forma apropiada para la
administración en forma de una sola dosis intravenosa.
13. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} inhibe la unión del fibrinógeno a
\alpha_{v}\beta_{3}, y presenta al menos una actividad
IC_{50} de 10 veces superior a la inhibición de la unión de
fibrinógeno a \alpha_{v}\beta_{3} comparado con la
actividad IC_{50} en la inhibición de la unión de fibrinógeno a
\alpha_{IIb}\beta_{3} ó \alpha_{v}\beta_{1}.
14. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} es un anticuerpo monoclonal
inmunoespecífico para \alpha_{v}\beta_{3}.
15. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que dicho anticuerpo monoclonal está humanizado.
16. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que dicho anticuerpo monoclonal es LM609 (ATCC HB 9537).
17. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que dicho anticuerpo monoclonal es un LM609 humanizado (ATCC
HB 9537).
18. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} es un polipéptido que contiene RGD.
19. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que dicho polipéptido es un péptido cíclico.
\newpage
20. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que dicho polipéptido es seleccionado del grupo constituido
por c-(GrGDFV) (SEQ ID Nº 4), c-(RGDfV) (SEQ ID Nº 5), c-(RGDFv) SEQ
ID Nº 7), e YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID Nº 8) y una sal de los
mismos.
21. El uso de una sal de polipéptido según la
reivindicación 20, en el que dicha sal es un clorhidrato o
trifluoroacetato.
22. El uso de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho medicamento se
destina al tratamiento de un paciente humano.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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