ES2376850T3

ES2376850T3 - Procedimientos y composiciones utiles para inhibición de la angiogenesis

Info

Publication number: ES2376850T3
Application number: ES03078802T
Authority: ES
Inventors: Peter Brooks; David A. Cheresh
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1994-03-18
Filing date: 1995-03-09
Publication date: 2012-03-20
Anticipated expiration: 2015-03-09
Also published as: EP1468695B1; CN1161152C; FI963692A0; SK284586B6; ATE255907T1; AU709645B2; NO963894D0; JP2006273862A; PT754059E; KR100327081B1; NZ283022A; EP1410807A1; EP0754059B2; RU2162712C2; CZ271196A3; CA2184493A1; FI121916B; JP4758281B2; UA44729C2; AU1995295A

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que inmunorreacciona con αvß3 y que es un antagonista de αvß3, para su uso en el tratamiento de tumores, la inflamación de tejidos, la artritis, la retinopatía diabética, la degeneración macular, o reestenosis mediante la inhibición de angiogénesis, en el que el tratamiento de tumores se selecciona entre la inhibición de la formación de metástasis de tumor y la regresión de tumores establecidos.

Description

Procedimientos y composiciones útiles para inhibición de la angiogénesis

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, al campo de la medicina, y se refiere específicamente a 5 procedimientos y composiciones para inhibir la angiogénesis de tejidos usando antagonistas del receptor de la vitronectina av

A3.

Antecedentes

Las integrinas son una clase de receptores celulares conocidas que unen proteínas de matriz extracelular y, por lo

10 tanto, participan en las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, generalmente denominados acontecimientos de adhesión celular. Sin embargo, aunque en la literatura se describen muchas integrinas y los ligandos que unen una integrina, la función biológica de muchas de las integrinas permanece sin aclarar. Los receptores de las integrinas constituyen una familia de proteínas con características estructurales compartidas de complejos de glicoproteína heterodimérica no covalente formados por subunidades a y A.

15 El receptor de vitronectina, conocido por su característica original de unión preferencial a la vitronectina, se sabe ahora que hace referencia a tres integrinas diferentes, designadas avA1, avA3 y avA5.Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71:741-759 (1990). avA1 une la fibronectina y la vitronectina. avA3 une una gran variedad de ligandos, incluidos fibrina, fibrinógeno, laminina, trombospondina, vitronectina, factor de Willeband, osteospondina y sialproteína ósea

I. avA5 se une a la vitronectina. Las funciones de adhesión celular específicas que desempeñan estas tres

20 integrinas en las diversas interacciones celulares en los tejidos están todavía investigándose, pero es evidente que hay diferentes integrinas con diferentes funciones biológicas.

Un sitio de reconocimiento importante en el ligando para muchas integrinas es la secuencia tripeptídica de argininaglicina-ácido aspártico (RGD). Se encuentra RGD en todos los ligandos identificados anteriormente para integrinas receptoras de vitronectina. Este sitio de reconocimiento de RGD se puede mimetizar mediante polipéptidos

25 (“péptidos”) que contienen la secuencia RGD, y dichos péptidos RGD son inhibidores conocidos de la función de integrina. Sin embargo, es importante tomar nota de que dependiendo de la secuencia y de la estructura del péptido RGD, la especificidad de la inhibición se puede alterar para dirigirse a integrinas específicas.

Para menciones del sitio de reconocimiento RGD, véase Pierschbacher y col., Nature, 309:30-33 (1984), y Pierschbacher y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5985-5988 (1984). Se han descrito también, diversos

30 polipéptidos RGD de especificada de integrina variable por Grant y col., Cell, 58:933-943 (1989), Cheresh, y col., Cell, 58:945-953 (989), Aumailley y col., FEBS Letts., 291-50-54 (1991), y Pfall y col., J. Biol.. Chem., 269:2023320238 (1994), y en las patentes de los Estados Unidos Números 4.517.686, 4.578.079, 4.589.881, 4.614.517, 4.661.111, 4.792.525, 4.683.291, 4.879.237, 4.988,621, 5.041.380 y 5.061.693.

La angiogénesis es un procedimiento de vascularización de tejidos que implica el crecimiento de nuevo desarrollo

35 de vasos sanguíneos en un tejido, y también se la conoce como neovascularización El procedimiento está mediado por la infiltración de células endoteliales y células de músculo liso. Se cree que el procedimiento progresa de una cualquiera de tres maneras: los vasos pueden surgir a partir de vasos preexistentes, se puede producir un desarrollo de novo de los vasos a partir de células precursoras (vasculogénesis) o se puede ensanchar el diámetro de los vasos pequeños existentes. Blood et al., Bioch, Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990). Se sabe que las células

40 endoteliales vasculares contienen al menos cinco integrinas dependientes de RGD, incluyendo el receptor de vitronectina (avA3 o avA5), el receptor de colágeno de tipo I y IV (a1A1), el receptor de laminina (a2A1), el receptor de fibronectina/laminina/colágeno (a3A1) y el receptor de fibronectina (a5A1). Davis et al., J. Cell. Biochem., 51:206-218 (1993). La célula de músculo liso se conoce por contener al menos seis integrinas RGD-dependientes, incluyendo a5A1, avA3 y avA5.

45 La angiogénesis es un procedimiento importante en el crecimiento neonatal, pero también es importante en la cicatrización de heridas y en la patogénesis de una gran variedad de enfermedades clínicas, que incluyen inflamación de tejidos, artritis, crecimiento tumoral, retinopatía diabética, degeneración macular por neovascularización de la retina y afecciones similares. Estas manifestaciones clínicas asociadas con la angiogénesis se denominan enfermedades angiogénicas. Folkman et al., Science, 235:442-447 (1987). La

50 angiogénesis está generalmente ausente en los tejidos adultos o maduros, aunque se da en la cicatrización de heridas y en el ciclo de crecimiento de cuerpo lúteo. Véase, por ejemplo Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990).

Se ha propuesto que la inhibición de la angiogénesis sería una terapia útil para restringir el crecimiento tumoral. Se ha propuesto que la inhibición de la angiogénesis por (1) inhibición de la liberación de “moléculas angiogénicas” 55 tales como AFGF (Factor de crecimiento de fibroblasto), (2) neutralización de moléculas angiogénicas, tal como por

el uso de anticuerpos anti-AFGF y (3) inhibición de la respuesta de células endoteliales a estímulos angiogénicos.

Esta última estrategia ha llamado la atención y Folkman et al., Cancer Biology, 3:89-96 (1992) han descrito diversos inhibidores de la respuesta de células endoteliales, incluyendo el inhibidor de colagenasa, los inhibidores de la renovación de la membrana basal, esteroides angiostáticos, inhibidores de angiogénesis derivada de hongos, factor 5 4 plaquetario, trombospondina, fármacos contra la artritis tales como peniclilamina D y tiomalato de oro, análogos de la vitamina D3, alfa-interferón y similares que se pueden usar para inhibir la angiogénesis. Para los inhibidores adicionales propuestos de la angiogénesis, véase Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab.Invest., 59:44-51 (1988), y las patentes de Estados Unidos números 5.092.885, 5.112.946, 5.192.744 y 5.202.352. Ninguno de los inhibidores de la angiogénesis descritos en

10 las referencias anteriores se dirige a la inhibición de avA3.

También se han descrito péptidos que contienen RGD que inhiben el receptor de vitronectina avA3. Aumailley et al., FEBS Letts., 291:50-54 (1991), Choi et al., J. Vasc. Surg., 19:125-134 (1994), Smith et al., J. Biol.. Chem., 265:12267-12271 (1990) y Pfaff et al., J. Biol.. Chem. 269:20233-20238 (1994). Sin embargo, la función de la integrina avA3 en la angiogénesis no se ha sugerido ni identificad nunca hasta la presente invención.

15 La inhibición de la adhesión celular in vitro usando anticuerpos monoclonales inmunoespecíficos para diversas subunidades a o A de integrina han implicado a avA3 en la adhesión celular de diversos tipos de células, que incluyen las células endoteliales microvasculares. Davis et al., J. Cell. Biol.., 51:206-218 (1993). Además, Nicosia et al., AM. J. Pathol., 138:829-833 (1991), describen el uso del péptidos RGD GRGDS para inhibir in vitro la formación de “microvasos” a partir de la aorta de rata cultivada en gel de colágeno. Sin embargo, la inhibición de la formación

20 de “microvasos” in vitro en cultivos de gel de colágeno no es un modelo para la inhibición de la angiogénesis en un tejido porque no se ha demostrado que las estructuras de microvaso sean idénticas a los crecimientos capilares ni que la formación del microvaso en cultivo de gel de colágeno sea idéntica al crecimiento neovascular en un tejido intacto, tal como el tejido artrítico, el tejido tumoral o tejido enfermo en los que es deseable la inhibición de la angiogénesis.

25 Por lo tanto, aparte de los estudios mencionados en la presente memoria descriptiva, los solicitantes desconocen cualquier otra demostración de que la angiogénesis se pueda inhibir en un tejido usando inhibidores de la adhesión celular. En particular, nunca se ha demostrado con anterioridad que se requiera la función avA3 para la angiogénesis en un tejido o que los antagonistas de avA3 puedan inhibir la angiogénesis en un tejido.

Breve descripción de la invención

30 La presente divulgación de la invención demuestra que la angiogénesis en los tejidos requiere la integrina avA3, que los inhibidores de avA3 pueden inhibir la angiogénesis. La divulgación demuestra también que los antagonistas de otras integrinas, tales como avA5 o avA1, no inhiben la angiogénesis, presumiblemente porque estas otras integrinas no son esenciales para que se produzca la angiogénesis.

Por lo tanto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que inmunorreacciona

35 con avA3, y que es un antagonista de avA3, para su uso en el tratamiento de tumores, inflamación de tejido, artritis, retinopatía diabética, degeneración macular o restenosis inhibiendo la angiogénesis, en el que el tratamiento de tumores se selecciona de la inhibición de formación de metástasis de tumor y la regresión de tumores establecidos.

El tejido a tratar puede ser cualquier tejido en el que sea deseable la inhibición de la angiogénesis, tal como tejido

40 enfermo en el que se está produciendo la neovascularización. Los tejidos de los ejemplos incluyen tejido inflamado, tumores sólidos, metástasis, tejidos que sufren restenosis, y tejidos similares.

Un antagonista de avA3, que es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, para su uso en el presente procedimiento, puede unirse a avA3 e inhibir competitivamente la capacidad de avA3 de unirse a un ligando natural.

45 Preferiblemente, el antagonista exhibe una especificidad para avA3 sobre otras integrinas.

En una realización particularmente preferida, el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, que es un antagonista de avA3 inhibe la unión del fibrinógeno u otros ligandos que contienen RGB a avA3 pero no inhibe sustancialmente la unión de la fibronectina al avA3. Un antagonista de avA3 preferido puede ser un polipéptido o un

50 anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, que inmunorreacciona con avA3.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos que forman una parte de la presente divulgación.

Las figuras 1A-1D ilustran la distribución del tejido de las subunidades de integrina, A3 y A1, en la piel normal y en la piel en proceso de cicatrización de herida designada como tejido de granulación. La inmunohistoquímica con 55 anticuerpos a A3 y A1 se realizó como se describe en el Ejemplo 3A. Las figuras 1A y 1B ilustran respectivamente la

inmunorreactividad del anti-A3 en la piel normal y en el tejido de granulación. Las figuras 1C y 1D ilustran respectivamente la inmunorreactividad del anti-A1 en la piel normal y en el tejido de granulación

Las figuras 2A-D ilustran la distribución de tedio del factor de von Willebrand y los ligandos de laminina que une respectivamente las subunidades de integrina A3 y A1. en la piel normal y en la piel en proceso de cicatrización de

5 herida designada tejido de granulación. La inmunohistoquímica con anticuerpos a factor de von Willebrand (AntivWF) y laminina (anti-laminina) se realizó como se describe en el Ejemplo 3B. Las figuras 2A y 2B ilustran respectivamente la inmunorreactividad de anti-vWF en la piel normal y en el tejido de granulación. Las figuras 2C y 2D ilustran respectivamente la inmunorreactividad de la anti-laminina en la piel normal y en el tejido de granulación.

Las figuras 3A-3D ilustran la distribución de tejido del receptor de la integrina vitronectina, avA3, en biopsias de tejido

10 de cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de mama y cáncer de pulmón, respectivamente. La inmunohistoquímica con el anticuerpo LM609 contra avA3 se realizó como se describe en el Ejemplo 3C.

La figura 4 ilustra una fotomicrografía de una CAM de la invención desprovista de vasos sanguíneos en un embrión de pollo de 10 días sin tratar. La preparación se describe en el Ejemplo 5B.

Las figuras 5A-5C ilustran la distribución de tejido de las integrinas A1 y avA3 en la preparación de la CAM de esta

15 invención. La figura 5A muestra la distribución de la subunidad A1 en una preparación de CAM de diez días sin tratar detectada por inmunorreactividad de inmunofluorescencia con CSAT, un anticuerpo anti-A1. La figura 5B muestra la distribución del receptor de avA3 en una preparación de CAM de 10 días sin tratar detectada por inmunorreactividad de inmunofluorescencia con LM609, un anticuerpo anti-avA3. La figura 5C muestra la distribución del receptor de avA3 en una preparación de CAM de 10 días tratada con AFGF detectada por inmunorreactividad de

20 inmunofluorescencia con LM609, un anticuerpo anti-avA3. Los tratamientos y los resultados se describen en el Ejemplo 5C.

La figura 6 ilustra la cuantificación en un gráfico de barras de la expresión relativa de avA3 y A1 en CAMs de 10 días tratadas con AFGF y sin tratar descritas en el Ejemplo 6A. La principal intensidad de fluorescencia se representa sobre el eje Y con los perfiles de integrina representados sobre el eje X.

25 Las figuras 7A-7C ilustran el aspecto de una CAM de 10 días sin tratar, una CAM tratada con AFGF, y una CAM tratada con TNFa, respectivamente, cuyos procedimientos y resultados se describen en el Ejemplo 6A.

Las figuras 8A-8E ilustran el efecto del tratamiento tópico con anticuerpo sobre angiogénesis inducida por FGF en una CAM de 10 día como se describe en el Ejemplo 7A1). La figura 8A muestra una preparación de CAM sin tratar que está desprovista de vasos sanguíneos. La figura 8B muestra la infiltración nueva vasculatura en un área

30 previamente desprovista de vasculatura inducida por tratamiento con AFGF. Las figuras 8C, 8D y 8E respectivamente muestran los efectos de los anticuerpos contra A1 (anti-A1; CSAT), avA5 (anti-avA5; P3G2) y avA3 (anti-avA3; LM609).

Las figuras 9A-9C ilustran el efecto de la inyección intravenosa del péptido sintético 66203 sobre la angiogénesis inducida por tumores como se describe en el Ejemplo 7D2). La figura 9A muestra la falta de efecto inhibitorio del

35 tratamiento intravenoso con un péptido de control (tumor de péptido de control) sobre la angiogénesis resultante de la inducción tumoral. La inhibición de tal angiogénesis por inyección intravenosa del péptido 66203 (Tumor RGD cíclico) se muestra en la figura 9B. La falta de efectos inhibitorios o citotoxicidad sobre los vasos preexistentes maduros que siguen a la infusión intravenosa del péptido 66203 en un área adyacente al área tratada del tumor se muestra en la figura 9C (CAM adyacente de RGD cíclico).

40 Las figuras 10A-10C ilustran el efecto de la aplicación intravenosa de anticuerpos monoclonales a la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento como se describe en el Ejemplo 7B1). La figura 10A muestra la angiogénesis inducida por AFGF no expuesta a tratamiento por anticuerpo (control). No se produce inhibición de la angiogénesis cuando se trata una preparación similar con el anticuerpo de avA5 P3G2 como se muestra en la figura 10B. La inhibición de la angiogénesis producida con el tratamiento del anticuerpo de anti-avA3 LM609 se muestra en la

45 figura 10C.

Las figuras 11A-11C ilustran el efecto sobre la angiogénesis embrionaria que sigue a la aplicación tópica de anticuerpos de anti-integrina descrita en el Ejemplo 7C. La angiogénesis no se inhibió por el tratamiento de una CAM de 6 días con anticuerpos anti-A1 y anti-avA5, respectivamente mostrados en las figuras 11A y 11B. En contraste con lo anterior, el tratamiento con el anticuerpo de anti-avA3 LM609 dio como resultado la inhibición de la

50 formación de vasos sanguíneos como se muestra en la figura 11C.

La figura 12 ilustra la cuantificación del número de vasos que entran en un tumor en una preparación de CAM como se describe en el Ejemplo 7D1). El gráfico muestra el número de vasos representados sobre el eje Y resultantes de la aplicación tópica de CSAT (anti-A1), LM609 (anti-avA3) o P3G2 (anti-avA5).

Las figuras 13A-13D ilustran una comparación entre los pesos húmedos de los tumores con un tratamiento de 7 días y los pesos iniciales de los tumores como se describe en el Ejemplo 9A1)a. Cada barra representa el ± SE medio . de 5-10 tumores por grupo. Los tumores se derivaron de las preparaciones de CAM del melanoma humano (M21-L) (Figura 13A), carcinoma pancreático (Fg) (Figura 13B), carcinoma de pulmón (UCLAP-3) (Figura 13C), y

5 carcinoma de laringe (Hep3) (Figura 13D) y se trataron por vía intravenosa con PBS, CSAT (anti-A1), o LM609 (antiavA3). Los gráficos muestran el peso del tumor representado en el eje Y que se produce por una aplicación intravenosa de CSAT (anti-A1), LM609 (anti-avA3) o PBS como se indica en el eje X.

Las figuras 14A y 14B ilustran las secciones histológicas de los tumores tratados con P3G2 (anti-avA5) (Figura 14A) y LM609 (anti-avA3) (Figura 14B), y teñidos con hematoxilina y eosina como se describe en el Ejemplo 9A1)a. Como

10 se muestra en la figura 14A, los tumores tratados con l anticuerpo de control (P3G2) mostraron numerosas células tumorales viables y de división activa indicadas por las figuras mitóticas (puntas de flecha) así como por múltiples vasos sanguíneos (flechas) a través de todo el estroma tumoral. En contraste con lo anterior, se detectaron pocas o ninguna célula tumoral viable o vasos sanguíneo en los tumores tratados con LM609 (anti-avA3) en la figura 14B.

Las figuras 15A-15E corresponden a los tumores M21L tratados con los péptidos descritos en el Ejemplo 9A1)b y

15 son los siguientes: en la figura 15A, péptido RAD cíclico de control (69601); en la figura 15B, péptido RGD cíclico (66203); en la figura 15C, tejido de CAM adyacente tomado de los mismos embriones tratados con péptidos RGD cíclico (66203) y gran ampliación (13x) de los tumores tratados con el RAD de control (69601) en la figura 15D o el péptido RGD cíclico (66203) en la figura 15E. La figura 15D representa los vasos normales del tumor tratado con el péptido de control RAD (69601). La figura 15E describe ejemplos de vasos sanguíneos interrumpidos de tumores

20 (flechas) tratados con el péptido RGD cíclico (66203).

Las figuras 16A-16E representan la inhibición de la angiogénesis por antagonistas de angiogénesis en el ensayo de modelo de ojo de conejo in vivo descrito en el Ejemplo 10. Las figuras 16A y 16B describen la angiogénesis del ojo de conejo en presencia de AFGF y mAb p1F6 (anti-avA5). Las figuras 16D, 16C y 16E describen la inhibición de la angiogénesis del ojo de conejo en presencia de AFGF y mAb LM609 (anti-avA3).

25 La figura 17 representa un diagrama de flujo de cómo se genera el modelo in vivo de ratón quimérico:ratón humano descrito en el Ejemplo 11A. Una porción de piel de un ratón SCID se sustituyó con prepucio neonatal humano y se dejó cicatrizar durante 4 semanas. Después de la cicatrización del injerto, se inoculó el prepucio humano con células tumorales humanas. Durante el siguiente periodo de 4 semanas, se estableció un tumor medible que comprendió un tumor humano con crecimiento de vasculatura humana a partir de la piel humana en el

30 tumor humano.

La figura 18 ilustra el porcentaje de células sencillas derivadas de CAM tratadas con mAb y con péptido y teñidas con Apop Tag determinadas mediante el análisis FACS y descritas en los Ejemplos 12A y 12B, respectivamente. Las barras negras y punteadas representan células de embriones tratadas 24 horas y 48 horas antes del ensayo, respectivamente. Cada barra representa el ± SE. medio de tres replicas. Las CAM se trataron con mAb LM609

35 (anti-avA3), o CSAT (anti-A1), o PBS como se describe en el Ejemplo 12A2). Las CAM también se trataron con el péptido cíclico 69203 (ciclo-RGDfV), indicado como Péptido 203) o el péptido cíclico de control 69601 (ciclo-RADfV, indicado como Péptido 601) como se describe en el Ejemplo 12B.

Las figuras 19A y 19B ilustran los resultados combinados de las suspensiones de células sencillas de CAM de embriones tratadas CSAT (anti-A1) (Figura 19A) o LM609 (anti-avA3) (Figura 19B) teñidas con Apog Tag y yoduro de 40 propidio, y analizadas por FACS como se describe en el Ejemplo 12C. El eje Y representa la tinción con Apop Tag de series de células (Apoptosis), el eje X representa la tinción con yoduro de propidio (Contenido de ADN). La línea horizontal representa la barrera negativa para la tinción con Apop Tag. Los paneles de la izquierda y de la derecha indican las células CAM de embriones tratados con CSAT (anti-A1) (figura 19A) y LM609 (anti-avA3) (figura 19B), respectivamente El análisis de ciclo celular se llevó a cabo mediante el análisis de aproximadamente 8.000 eventos

45 por condición.

Las figuras 20A-20C representan tejido de CAM de embriones tratados con CSAT (anti-A1) y las figuras 20D-20F representan tejido de CAM de embriones tratados con LM609 (anti-avA3) preparado como de describe en el Ejemplo 12C. Las figuras 20A y 20D describen los tejidos teñidos con Apop Tag y visualizados mediante fluorescencia (FITC) superpuestos sobre una imagen D.I.C. Las figuras 20B y 20E describen los mismos tejidos teñidos con mAb

50 LM609 (anti-avA3) y visualizados por fluorescencia. (rodamina). Las figuras 20C y 20F representan imágenes fundidas de los mismos tejidos teñidos tanto con Apop Tag como con LM609 donde la tinción amarillo representa la colocalización. La barra representa 15 y 50 µm en los paneles de la izquierda y de la derecha, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

A.-Definiciones

55 Resto de aminoácido: un aminoácido formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Los restos de aminoácido descritos en la presente memoria descriptiva tienen preferiblemente la forma isomérica de una “L”. Sin embargo, los residuos con forma isomérica de “D” e pueden sustituir por cualquier residuo aminoácido en forma de L, mientras que se retiene la propiedad funcional por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el término amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el término carboxi de un polipéptido. Según la nomenclatura estándar de los polipéptidos (descrita en J. Biol.. Chem., 243:3552-59 (1969) adoptada en 37 CFR §1.822 (b) (2)), las abreviaturas para los restos de aminoácido se muestran en la siguiente Tabla de Correspondencia:

TABLA DE CORRESPONDENCIA

S�?MBOLO: AMINO�?CIDO

1 Letra: 3 letras

Y: Tyr Tirosina

G: Gly Glicina

F: Phe Fenilalanina

M: Met Metionina

A: Ala Alanina

S: Ser Serina

I: Ile Isoleucina

L: Leu Leucina

T: Thr Treonina

V: Val Valina

P: Pro Prolina

K: Lys Lisina

H: His Histidina

Q: Gln Glutamina

E: Glu �?cido glutámico

Z: Glx Glu y/o Gln

W: Trp Triptófano

R: Arg Arginina

D: Asp Acido aspártico

N: Asn Asparagina

B: Asx Asn y/o Asp

C: Cys Cisteína

X: Xaa Desconocido/Otro

Además, los siguientes tienen los siguientes significados

BOC: Terc-butiloxicarbonilo

DCCI: Diciclohexilcarbodiimida

DMF: Dimetilformamida

OMe: Metoxi

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol

Se debe subrayar que todas las secuencia de restos de aminoácido se representan en la presente memoria descriptiva mediante fórmulas cuya orientación a la izquierda y a la derecha es lo es en la dirección convencional

5 del término amino al término carboxi. Además, se debería resaltar que un guión al principio o al final de una secuencia de restos de aminoácido indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o ,más residuos de aminoácido.

Polipéptidos: Se refiere a una serie lineal de restos de aminoácido conectados el uno al otro por enlaces peptídicos entre el grupo alfa-amino y el grupo carboxi de los residuos contiguos de aminoácido

10 Péptido: tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una serie lineal de no más de aproximadamente 50 restos de aminoácido conectados el uno al otro en forma de un polipéptido.

Péptido cíclico: Se deriva de un péptido lineal correspondiente y, se refiere a un péptido en el que no existen términos N o C libres, y del cual los términos N del péptido lineal correspondiente forman un enlace amido con el carboxilato de termino C del péptido lineal correspondiente.

15 Proteína: se refiere a una serie lineal superior a 50 restos de aminoácido conectados el uno al otro en forma de un polipéptido.

Péptido sintético: se refiere a una cadena producida químicamente de restos de aminoácido enlazados juntos por enlaces peptídicos que está libre de proteínas obtenidas de manera natural y fragmentos de las mismas.

B. Consideraciones generales

20 La presente invención se refiere en general al descubrimiento de que la angiogénesis se induce mediante el receptor específico de vitronectina avA3, y que la inhibición de la función avA3 inhibe la angiogénesis. Este descubrimiento es importante a causa de la función que desempeña la angiogénesis en una diversidad de procesos de enfermedad. Mediante la inhibición de la angiogénesis, se puede intervenir en la enfermedad, mejorar los síntomas, y en algunos casos curar la enfermedad.

25 Allí donde el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos es la causa de, o contribuye a, la patología asociada a una enfermedad, la inhibición de la angiogénesis reducirá los efectos deletéreos de la enfermedad. Los ejemplos incluyen la artritis reumatoide, la retinopatía diabética y similares. Allí donde se requiere el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos para soportar el crecimiento de un tejido deletéreo, la inhibición de la angiogénesis reducirá el aporte de sangre al tejido y por lo tanto contribuirá a la reducción de la masa del tejido basada en los requisitos de

30 aporte de sangre. Los ejemplo incluyen el crecimiento de tumores donde la neovascularización es un requisito continuo para que el tumor crezca más allá de unos pocos milímetros de espesor, y para el establecimiento de la metástasis del tumor sólido.

Los usos de la presente invención son eficaces en parte gracias a que la terapia es altamente selectiva para la angiogénesis y no para otros procesos biológicos. Como se muestra en los Ejemplos, sólo el nuevo crecimiento de

35 vasos contiene avA3 sustancia, y por lo tanto los procedimientos terapéuticos no efectúan de manera perjudicial a los vasos maduros. Además, avA3 no se distribuye en gran medida en los tejidos normales, pero se encuentra selectivamente en los nuevos vasos, con lo que se garantiza que la terapia puede dirigirse selectivamente al nuevo crecimiento de vasos.

El descubrimiento de que la inhibición de avA3 sólo, inhibirá eficazmente la angiogénesis permite el desarrollo de las

40 composiciones terapéuticas con una especificidad potencialmente elevada, y por lo tanto una toxicidad relativamente baja. De este modo, aunque la invención describe el uso de reactivos basados en péptidos que tienen la capacidad de inhibir una o más integrinas, se pueden diseñar otros reactivos que inhiban más selectivamente avA3, y por lo tanto no tengan el efecto secundario de inhibir otros procesos biológicos distintos de los inducidos por avA3.

Por ejemplo, como se muestra mediante las presentes enseñanzas, es posible preparar anticuerpos monoclonales altamente selectivos para la inmunorreacción con avA3, que son selectivos de manera similar para la inhibición de la 5 función avA3. Además, los péptidos que contienen RGD se pueden diseñar para que sean selectivos para la inhibición de avA3, como se describe , además, en la presente descripción descriptiva.

Antes de producirse los descubrimiento de la presente invención, no se conocía que la angiogénesis, y ninguno de los procesos dependientes de la angiogénesis, se pudiese inhibir in vivo mediante el uso de los reactivos que antagonizan la función biológica avA3.

10 C. Procedimiento para la inhibición de la angiogénesis.

La invención describe un procedimiento para la inhibición de la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto para inhibir eventos en el tejido que dependen de la angiogénesis. Generalmente, el procedimiento comprende administrar al tejido una composición que comprende una cantidad que inhibe la angiogénesis de un antagonista avA3, en el que el antagonista de avA3 es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que inmunorreacciona con avA3.

15 Como se ha descrito anteriormente, la angiogénesis incluye una diversidad de procesos que implican la vascularización de un tejido que incluye “el crecimiento rápido”, la vasculogénesis o el ensanchamiento de vasos, todos los cuales son procesos de angiogénesis inducidos por y dependientes de la expresión de avA3. Se cree que, con la excepción de la cicatrización de herida traumática, la formación de cuerpo lúteo y la embriogénesis, la

20 mayoría de los procesos de angiogénesis se asocian con procesos de enfermedad y por lo tanto el uso de los presentes procedimientos terapéuticos son selectivos para la enfermedad y no tienen efectos secundarios perjudiciales.

Hay una diversidad de enfermedades en las que se cree que la angiogénesis es importante, conocidas como enfermedad angiogénicas, que incluyen pero no se limitan a, los trastornos inflamatorios tales como la inflamación 25 inmune y no-inmune, el reutamismo articular crónico y la soriasis. Los trastornos asociados con la invasión inapropiada o inoportuna de los vasos tales como la retinopatía diabética, el glaucoma neovascular, la reestenosis, la proliferación capilar en las placas ateroscleróticas y la osteoporosis, y los trastornos asociados con el cáncer, tales como los tumores sólidos, las metástasis de tumores sólidos, los angiofibromas, la fibroplasia retrolental, los angiomas, el sarcoma de Kaposi y los cánceres similares que requieren la neovascularización para soportar el

30 crecimiento tumoral.

De este modo, los procedimientos que inhiben la angiogénesis en un tejido enfermo mejoran los síntomas de la enfermedad, y que dependen de la enfermedad, pueden contribuir a curar la enfermedad. En una realización, la invención contempla la inhibición de angiogénesis, per se, en un tejido. El alcance de la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto el alcance de la inhibición realizada por los presentes procedimientos, se puede evaluar por una

35 diversidad de procedimientos, tales como se describen en los Ejemplos para detectar las estructuras de vasos avA3inmunopositivos inmaduros y nacientes por inmunohistoquímica.

Como se describe en la presente memoria descriptiva, cualquiera de una diversidad de tejidos u órganos constituidos por tejidos organizados, puede soportar la angiogénesis en las afecciones de enfermedad que

40 incluyen la piel, el músculo, el intestino, el tejido conectivo, las articulaciones, los huesos y los tejidos similares los cuales los vasos sanguíneos se pueden invadir al producirse estímulos angiogénicos.

De este modo, en una realización relacionada, un tejido a tratar es un tejido inflamado y la angiogénesis a inhibir es angiogénesis de tejido inflamado cuando existe neovasularización de tejido inflamado. En esta clase el procedimiento contempla la inhibición de angiogénesis en tejidos artríticos, tal como en un paciente con reumatismo

45 articular crónico, en tejidos inflamados inmunes o no inmunes, en tejido psoriático y similares.

El paciente tratado en la presente invención, en sus diversas realizaciones es deseablemente un paciente humano, aunque se ha de entender que los principios de la invención indican que la invención es efectiva en lo relativo a todos los mamíferos, que están destinados a incluirse en el término “paciente”. En este contexto, se entiende que un mamífero incluye cualquier especie de mamífero en la que es deseable el tratamiento de las enfermedades

50 asociadas con la angiogénesis, particularmente especies de mamíferos de la cabaña ganadera y domésticos.

En otra realización relacionada, un tejido a tratar es un tejido retinal de un paciente con retinopatía diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular y la angiogénesis a inhibir es angiogénesis de tejido retinal donde hay neovascularización de tejido retinal.

En una realización relacionada adicional, un tejido a tratar es un tejido tumoral de un paciente con un tumor sólido, 55 una metástasis, un cáncer de piel, un cáncer de mama, un hemangioma o angiofibroma y cáncer similar, y la angiogénesis a inhibir es una angiogénesis de tejido tumoral en la que hay neovascularización de un tejido tumoral. Los tejidos tumorales sólidos típicos tratables por los presentes procedimientos incluyen puñmón, páncreas, mama, colon, laringe, ovario y tejidos similares. En las realizaciones que se relacionan con el tratamiento de tumores, el tratamiento se selecciona entre la inhibición de la formación de metástasis de tumor y la regresión de los tumores

5 establecidos. En los Ejemplos se describe la angiogénesis de tejido tumorales ejemplares y la inhibición de la misma.

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo para uso en el tratamiento de tumores por la inhibición de angiogénesis de tejido tumoral es una realización particularmente preferida debido al papel importante que juega la neovascularización en el crecimiento del tumor. En ausencia de la neovascularización de tejido tumoral, el tejido

10 tumoral no obtiene los nutrientes requeridos, ralentiza el crecimiento, cesa el crecimiento adicional, retrocede y por último se hace necrótico dando como resultado la muerte del tumor.

Dicho en otras palabras, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo para uso en el tratamiento de tumores mediante la inhibición de la neovascularización de tumor de acuerdo con los tratamientos, procedimientos presentes.

15 Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos son también particularmente eficaces contra la formación de metástasis debido a que (1) su formación requiere la vascularización de un tumor primario de manera que las células de cáncer metastático puedan abandonar el tumor primario y (2) y su establecimiento en un sitio

secundario requiere la neovascularización para apoyar el crecimiento de la metastasis.

En una realizaci6n relacionada, la invenci6n contempla la practica del tratamiento junto con otras terapias tal

20 como quimioterapia convencional dirigida contra tumores s6lidos y para el control del establecimiento de

metastasis. La administraci6n de inhibidor de angiogenesis se lleva a cabo durante o despues de la

quimioterapia, aunque es preferible inhibir la angiogenesis despues de un regimen de quimioterapia a veces

cuando el tejido tumoral respondera al avance del t6xico mediante la inducci6n de angiogenesis para recuperar

la provisi6n de un suministro de sangre y nutrientes al tejido tumoral. Ademas, se prefiere administrar los

25 tratamientos de inhibici6n de angiogenesis despues de cirugia cuando los tumores s6lidos se han eliminado

contra una profilaxis contra la metastasis.

En la medida en que se aplican los presentes tratamientos a la inhibici6n de la neovascularizaci6n de tumor, los

tratamientos se aplican a la inhibici6n de la formaci6n de la metastasis de tumor, y a la regresi6n de tumores

30 establecidos. Los ejemplos demuestran la regresi6n de un tumor establecido despues de una sola administraci6n

intravenosa de un antagonista de avA3 de esta invenci6n.

Reestenosis es un proceso de migración de las células de músculo liso (SMC) y la proliferación en el sitio de angioplastia coronaria transluminal que impide el éxito de la angioplastia. La migración y la proliferación de SMC 35 durante la reestenosis se puede considerar un proceso de de angiogénesis que se inhibe por los tratamientos presentes. Por4 lo tanto, la invención también contempla la inhibición de mediante la inhibición de angiogénesis de acuerdo con los tratamientos presentes en un paciente después de los procedimientos de angioplastia. Para la inhibición de reestenosis, el anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo típicamente se administra después del procedimiento de angioplastia durante aproximadamente 2 a aproximadamente 28 días, y más típicamente

40 durante aproximadamente los primeros 14 días después del procedimiento.

El presente tratamiento para la inhibición de la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto para la puesta en práctica del tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, comprende poner en contacto un tejido en el que se produce la angiogénesis, o está en riesgo de de producirse, con una composición que comprende una

45 cantidad terapéuticamente eficaz de de un antagonista de avA3 capaz de inhibir la unión de avA3 a su ligando natural. De este modo el procedimiento comprende la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición fisiológicamente tolerable que contiene un antagonista de avA3 de la invención.

Los intervalos de dosificación para la administración del antagonista de avA3 dependen de la forma del antagonista, 50 y su potencia, como se describe más adelante en la presente memoria descriptiva, y son grandes cantidades suficientes para producir el efecto deseado consiguiendo que la angiogénesis y los síntomas de enfermedad inducidos por angiogénesis mejoren. La dosificación no debería ser tan elevada como para causar efectos secundarios adversos, tales como los síndromes de hiperviscosidad, el edema pulmonar, el fallo cardiaco congestivo, y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, la condición, el sexo y el alcance de la

5 enfermedad en el paciente y se puede determinar por un experto en la técnica. La dosificación también se puede ajustar por un médico particular en caso de darse alguna complicación.

Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de antagonista de avA3 suficiente para producir una inhibición medible de angiogénesis en el tejido que se está tratando, es decir, una cantidad de inhibición de la angiogénesis. La inhibición de la angiogénesis se puede medir in situ por inmunohistoquímica, como se describe en la presente

10 memoria descriptiva, o por otros procedimientos conocidos por un experto en la técnica.

Un antagonista de avA3 puede adoptar la forma de un anticuerpo monoclonal anti-avA3, o un fragmento del mismo y se ha de entender que la potencia, y por lo tanto una expresión de una cantidad “terapéuticamente eficaz” pueden variar. Sin embargo, como se muestra en los presentes procedimentos de ensayo, un experto en la técnica puede evaluar fácilmente la potencia de un antagonista candidato de avA3 de esta invención.

15 La potencia de un antagonista de avA3 se puede medir mediante una diversidad de medios que incluyen la inhibición de la angiogénesis en el ensayo de CAM, en el ensayo in vivo de ojo de conejo, en el ensayo in vivo ratón químerico:ratón humano, y midiendo la inhibición de la unión de ligando natural a avA3, todos descritos en la presente memoria descriptiva, y los ensayos similares.

Un antagonista preferido de avA3 tiene la capacidad de inhibir sustancialmente la unión de un ligando natural tal

20 como el fibrinógeno o la vitronectina a avA3 disuelto en concentraciones de antagonista inferiores a 0,5 micromolares (um), preferiblemente inferior a 0,1 um, y más preferiblemente inferior a 0,05 um. Por “sustancialmente” se entiende que se observa al menos una reducción del 50% en la unión del fibrinógeno mediante la inhibición en la presencia del antagonista de avA3, y al 50% la inhibición se refiere en la presente memoria descriptiva como un valor CI50.

25 Un antagonista más preferido de avA3 exhibe selectividad para avA3 sobre otras integrinas. De este modo, un antagonista preferido de avA3 inhibe sustancialmente la unión de fibrinógeno a avA3 pero no inhibe sustancialmente la unión del fibrinógeno a otras integrinas, tales como avA1, avA5 o aIIbA3. Particularmente preferido es un antagonista de avA3 que exhibe una actividad de CI50 de 10 a 100 veces inferior en la inhibición de la unión del fibrinógeno a avA3 comparado con la actividad de CI50 en la inhibición de la unión del fibrinógeno a otra integrina. Los ensayos

30 ejemplares para medir la actividad de CI50 en la inhibición de la unión de fibrinógeno a una integrina se describen en los Ejemplos.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de avA3 de la invención en forma de un anticuerpo monoclonal es típicamente una cantidad tal que cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable es suficiente para llevar a cabo una concentración de plasma de aproximadamente 0,01 microgramo (ug)

35 por mililitro (ml) a aproximadamente 100 ug/ml, preferiblemente de aproximadamente 1 ug/ml a aproximadamente 5 ug/ml, y normalmente aproximadamente 5 ug/ml. Por el contrario, la dosificación puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días.

40 Cuando el antagonista está en forma de un fragmento de un anticuerpo monoclonal, la cantidad se puede ajustar fácilmente sobre la base de la masa del fragmento respecto de la masa de todo el anticuerpo. Una concentración de plasma preferida en molaridad es de aproximadamente 2 micromolar (uM) a aproximadamente 5 milimolares (mM) y de manera preferible aproximadamente 100 uM a 1 mM de antagonista de anticuerpo.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de avA3 de la invención en forma de un polipéptido, u otro

45 mimético de avA3 de pequeñas molécula de idénticas dimensiones, es típicamente una cantidad de polipéptido talque cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable es suficiente para llevar a cabo una concentración de plasma de aproximadamente 0,1 microgramo (ug) por mililitro (ml) a aproximadamente 200 ug/ml, preferiblemente de aproximadamente 1 ug/ml a aproximadamente 150 ug/ml, Basado en un polipéptido que tienen una masa de aproximadamente 500 gramos por mol, la concentración preferida en molaridad es de

50 aproximadamente 2 micromolares (uM) a aproximadamente 5 milimolares (mM) y de manera preferible aproximadamente 100 uM a 1 mM de antagonista de polipéptido. Por el contrario, la dosificación por peso corporal puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, y preferiblemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días.

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección o por infusión gradual a lo largo del tiempo. Aunque, típicamente se puede acceder al tejido a tratar en el cuerpo por administración sistémica y por lo tanto tratar más a menudo por administración intravenosa de composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y medios de distribución en los que hay una probabilidad de que el tejido

5 apuntado contenga la molécula diana. De este modo los anticuerpos monoclonales o polipéptidos de la invención se pueden administrar por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavital , transdérmica y se puede distribuir por medios peristálticos.

Las composiciones terapéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal o un polipéptido de la invención se administran convencionalmente por vía intravenosa, como por ejemplo una inyección de una dosis unitaria. El

10 término “dosis unitaria” cuando se usa en referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el diluyente requerido; es decir, un excipiente o un vehículo.

En una realización preferida como se muestra en los Ejemplos, el antagonista de avA3 se administra en una única 15 dosificación por vía intravenosa.

Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar y su programación temporal depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y el grado del efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo deseado a administrar dependen del juicio del médico y son peculiares 20 para cada individuo. Sin embargo, las gamas apropiadas de dosificación para la aplicación sistémica se describen en la presente memoria descriptiva y dependen de la vía de administración. Los regímenes apropiados para la administración también son variables, pero se tipifican mediante una administración inicial seguida de repetidas dosis a intervalos de una o más horas por una inyección posterior u otra administración. Alternativamente, también se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones en sangre del orden de los

25 valores especificados para terapias in vivo.

Como se demuestra mediante los presentes Ejemplos, la inhibición de la angiogénesis y la regresión tumoral se produce como muy pronto 7 días después de la inicial toma de contacto con el antagonista. Se prefiere una exposición adicional o prolongada al antagonista durante 7 días a 6 semanas, preferiblemente aproximadamente 14 a 28 días.

30 Los Ejemplos también demuestran la relación entre la inhibición de avA3 y la inducción de la apoptosis en las células de neovasculatura que llevan avA3. Por tanto, también se describen procedimientos para la inhibición de la apoptosis en neurovasculatura de un tejido. El procedimiento se practica sustancialmente como se describe en el presente documento para la inhibición de angiogénesis en todos los tejidos y afecciones descritas para ellos. La única diferencia apreciable es la del desarrollo en el tiempo del efecto, que es que la apoptosis se manifiesta

35 rápidamente, típicamente aproximadamente 48 horas después de entrar en contacto con el antagonista, mientras que la inhibición de la angiogénesis y la regresión tumoral se manifiesta más lentamente, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. La diferencia afecta al régimen terapéutico en términos del tiempo de administración, y del efecto deseado. Típicamente, la administración para la apoptosis de neovasculatura se puede realizar durante 24 horas a aproximadamente 4 semanas, aunque se prefiere el intervalo de 48 horas a 7 días.

40 D. Composiciones terapéuticas

La presente invención contempla composiciones terapéuticas útiles para practicar los tratamientos terapéuticos descritos en la presente memoria descriptiva. Las composiciones terapéuticas de la presente invención contienen un excipiente fisiológicamente tolerable junto con un antagonista de avA3 como se describe en la presente memoria descriptiva, disuelto o disperso en éstas últimas en forma de un ingrediente activo. En una realización preferida, la 45 composición terapéutica del antagonista de avA3 no es inmunogénica cuando se administra a un paciente mamífero

o humano con fines terapéuticos.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos “farmacéuticamente aceptable”, “fisiológicamente tolerable” y sus variaciones gramaticales cuando se refieren a las composiciones, los excipientes, los diluyentes y los reactivos, se usan de manera intercambiable y representan que los materiales pueden administrarse a un

50 mamífero sin producir efectos fisiológicos adversos tal como nauseas, mareos, malestar gástrico y similares.

La preparación de una composición que contiene los ingredientes activos disueltos o dispersos en esta última se conoce bien en la técnica y no necesita limitación sobre la base de su formulación. Típicamente tales composiciones se preparan en forma de inyectables, bien como soluciones líquidas o suspensiones, aunque se pueden preparar formas sólidas para una solución o suspensiones, en líquido antes de su uso. La preparación

55 también se puede emulsionar.

El ingrediente activo se puede mezclar con excipientes que son farmacéuticamente aceptable y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades apropiadas para su uso en los procedimientos terapéuticos descritos en la presente memoria descriptiva. Los excipientes apropiados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similar y las combinaciones de los mismos. Además si se desea, la composición puede contener

5 cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de taponamiento de pH y similares que mejoran la eficacia del ingrediente activo.

La composición terapéutica de la presente invención pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes incluidos en la misma. Las sales farmacéuticamente aceptable incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por

10 ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como el ácido acético, tártarico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de las bases inorgánicas tales como, por ejemplo los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y las bases orgánicas tales como la isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.

Particularmente se prefieren las sales de TFA y HCl, cuando se usan en la preparación de antagonistas de avA3 de 15 polipéptidos cíclicos. En los Ejemplos se describen las sales representativas de los péptidos.

Los vehículos fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de los vehículos líquidos son las soluciones acuosas estériles que no contienen ningún material además de los ingredientes activos y el agua, o contienen un tampón tal como el fosfato de sodio con un valor de pH fisiológico, una solución salina fisiológica o ambos, tal como fosfato-solución salina tamponada. Además, los vehículos acuosos pueden contener

20 más de una sal de tampón, así como sales tales como cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos.

Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y con la exclusión de agua . Un ejemplo de dichas fases líquidas adicionales son la glicerina, los aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón y emulsiones de agua-aceite.

25 Una composición terapéutica contiene una cantidad de inhibición de la angiogénesis de un antagonista de avA3 de la presente invención, típicamente formulada para contener una cantidad de al menos un 0,1 % en peso del antagonista por peso de la composición terapéutica total. Un porcentaje en peso es una relación por peso del inhibidor respecto de la composición total. De este modo, por ejemplo, el 0,1% en peso es 0,1 gramo de inhibidor por 100 gramos de composición total.

30 E. Antagonistas de Integrina avA3

Los antagonistas de avA3 se usan en los presentes procedimientos para inhibir la angiogénesis en los tejidos, y pueden adoptar una diversidad de formas que incluyen los compuestos que interactúan con avA3 de manera que se interfieren las interacciones funcionales con ligandos naturales de avA3. Los antagonistas proporcionados por la invención son anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que inmunorreaccionan con avA3 y que

35 muestran actividad antagonista como define en la presente memoria descriptiva.

1. Polipéptidos

Se describen los antagonistas de avA3 en forma de polipéptidos. Un antagonista de avA3 de polipéptido (péptido) puede tener las características de secuencia del ligando natural del avA3 p del propio avA3 en la región implicada en la interacción avA3-ligando y exhibe actividad antagonista de avA3 tal como se describe en la presente memoria

40 descriptiva. Un péptido antagonista de avA3 preferido contienen el tripéptido RGD y corresponde en secuencia al ligando natural en la región que contienen RGD.

Los polipéptidos preferidos que contienen RGD tienen una secuencia que corresponde a la secuencia de restos de aminoácido de la región que contiene RGD de un ligando natural de avA3 como fibrinógeno, vitronectina, factor de von Willebrand, laminina, trombospondina y ligandos similares. La secuencia de estos ligandos de avA3 son bien

45 conocidos. De este modo, un péptido antagonista de avA3 se puede derivar de cualquiera de los ligandos naturales, aunque se prefiere el fibrinógeno y la vitronectina.

Un péptido antagonista de avA3 particularmente preferido inhibe preferiblemente la unión de avA3 a su(s) ligando(s) cuando se compara con otras integrinas, tal como se ha descrito anteriormente. Se prefieren particularmente los péptidos específicos de avA3 al menos porque la especificidad para avA3 reduce la incidencia de efectos secundarios

50 indeseables tal como la inhibición de otras integrinas. La identificación de los péptidos antagonistas de avA3 preferidos que tienen selectividad para avA3 se pueden identificar fácilmente en una inhibición típica del ensayo de unión, tal como el ensayo ELISA descrito en los Ejemplos.

Opcionalmente, un polipéptido no comprende más de aproximadamente 100 restos de aminoácido, preferiblemente no más de aproximadamente 60 residuos, más preferiblemente no más de aproximadamente 30 residuos. Los péptidos pueden ser lineales o cíclicos, aunque particularmente los péptidos preferidos son cíclicos.

Los péptidos cíclicos y lineales preferidos y sus designaciones se muestran en la Tabla 1 en los Ejemplos.

5 Se debería entender que un polipéptido sujeto no necesita ser idéntico a la secuencia de restos de aminoácido de un ligando natural de avA3, siempre que incluya la secuencia requerida y pueda funcionar como un antagonista de avA3 en un ensayo tal como los descritos en la presente memoria descriptiva.

Un polipéptido objeto incluye cualquier análogo, fragmento o derivado químico de un polipéptido cuya secuencia de restos de aminoácido se muestra en la presente memoria descriptiva, siempre que el polipéptido sea un antagonista

10 de avA3 Por lo tanto, un polipéptido actual se puede someter a diversos cambios, sustituciones, inserciones y supresiones donde tales cambios proporcionan determinadas ventajas en su uso. A este efecto, el polipéptido antagonista de avA3 de la invención corresponde a un péptido mencionado donde se hacen uno o más cambios y retiene la capacidad de funcionar como un antagonista de avA3 en uno o más de los ensayos tal como se definen en la presente memoria.

15 De este modo, un polipéptido puede estar en una diversidad de formas de derivados de péptido, que incluyen amidas, conjugados con proteínas, péptidos ciclados , péptidos polimerizados, análogos, fragmentos, péptidos químicamente modificados y derivados similares.

El término “análogo” incluye cualquier polipéptido que tiene una secuencia de restos de aminoácido sustancialmente idéntica a una secuencia específicamente mostrada en la presente memoria descriptiva en la que 20 se han sustituido de manera conservadora uno o más residuos con un residuo funcionalmente similar y que muestra la actividad antagonista de avA3 tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los ejemplos de sustitución conservadora incluyen la sustitución de un residuo (hidrófobo) no-polar tal como la isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un residuo (hidrófobo) polar por otro tal como entre la arginina y la lisina, entre la glutamina y la aspararagina, entre la glicina y la serina, la sustitución de un residuo básico tal como la

25 lisina, la asparagina o la histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro.

La expresión “sustitución conservadora” también incluye el uso de un residuo químicamente derivado en lugar de un residuo no derivado siempre que dicho polipéptido muestre la actividad de inhibición requerida.

“Derivado químico” se refiere a un polipéptido sujeto que tiene uno o más residuos químicamente derivados por

30 reacción de un grupo lateral funcional. Tales moléculas derivadas incluyen por ejemplo, las moléculas en las que los grupos amino libres se han derivado para formar clorhidratos de amina, grupos p-tolueno sulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres se pueden derivar para formar sales, ésteres de metilo y etilo u otros tipos de ésteres o hidrácidas. Los grupos hidroxilo libres se pueden derivar para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El imidazol nitrógeno de histidina se puede derivar

35 para formar N-imbencilhistidina. También incluidos como derivados químicos se encuentran los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácido producidos naturalmente de los veinte amino ácidos estándares. Por ejemplo: la 4-hidroxyprolina se puede sustituir por prolina; la 5-hidroxilisina se puede sustituir por lisina, la 3metilhistidina se puede sustituir por histidina; la homoserina se puede sustituir por serina; y la ornitina se puede sustituir por lisina. –los polipéptidos de la presente invención también incluyen cualquier polipétido que tenga una o

40 más adiciones y/o deleciones o residuos relativos a la secuencia de un polipéptido cuya secuencia se muestra en la presente memoria descriptiva; siempre que se mantenga la actividad requerida.

El término “fragmento” se refiere a cualquier polipétido sujeto que tenga una secuencia de restos de aminoácido más corta que la de un polipéptido cuya secuencia de restos de aminoácido se muestra en la presente memoria descriptiva.

45 Cuando un polipéptido de la presente invención tiene una secuencia que no es idéntica a la secuencia de un ligando natural de avA3, es típicamente porque se han hecho una o más sustituciones conservadoras o no conservadoras, normalmente no más de aproximadamente un 30%, y preferiblemente no más de un 10% de los restos de aminoácido se sustituyen. Los residuos adicionales también se pueden añadir a uno de los dos términos de un polipéptido para con el fin de proporcionar un “enlazador” mediante el cual los polipéptidos de la invención se

50 pueden fijar adecuadamente a un marcador o matriz sólida, o excipiente.

Los marcadores, las matrices sólidas y los vehículos que se pueden usar con los polipéptidos de la invención se describen más adelante en la presente memoria descriptiva.

Los enlazadores de restos de aminoácido son normalmente al menos un residuo y pueden ser 40 o más residuos, más a menudos de 1 a 10 residuos, pero no forman epitopes de ligando de avA3. Los restos de aminoácido típicos

usados para enlazar son la tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico y ácido aspártico, o similares. Además, un polipéptido sujeto puede diferir, a menos que se especifique otra cosa, de la secuencia natural de un ligando de avA3 mediante la secuencia que se está modificando por la acilación de NH2 terminal, por ejemplo acetilación o la amidación de ácido tioglicólico, por la carboxilamidación terminal, por ejemplo con amoníaco, metilamina y 5 codificaciones terminales similares. Las modificaciones terminales son útiles, como es bien sabido, para reducir la susceptibilidad a la digestión de proteinasa, y por lo tanto sirven para prolongar media vida de los péptidos en soluciones, particularmente fluidos biológicos donde las proteasas pueden estar presentes. Con este fin, la ciclización de polipéptidos también es una modificación terminal útil, y se prefiere particularmente a causa de las estructuras estables formadas por ciclización y en vista de las actividades biológicas observadas de dichos

10 péptidos cíclicos descritos en la presente memoria descriptiva.

Cualquier péptido de la presente invención se puede usar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos apropiados que pueden formar sales con los péptidos de la presente invención incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido trifluoroacético (TFA), ácido clorhídrico (HCl), ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico, ácido fosforícoacético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido

15 pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido cinámico, ácido naftalenosulfónico, ácido sulfanílico o similares. Se prefieren particularmente las sales de HCl y TFA.

Las bases apropiadas capaces de formar sales con los péptidos de la presente invención incluyen bases inorgánicas tales como hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio y similares; y bases orgánicas

20 tales como mono-, di- y tri-alquil y aril aminas (por ejemplo trietilamina, diisopropilamina, metilamina, dimetilamina y similares) y etanolaminas opcionalmente sustituidas (por ejemplo etanolamina, dietanolamina y similares).

Un péptido de la presente invención se refiere también a un polipéptido sujeto, se puede sintetizar mediante cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la técnica de los polipéptidos, incluyendo técnicas de ADN recombinante. Se prefieren las técnicas de química sintética, tales como una síntesis de tipo Merrifield de fase 25 sólida, por razones de pureza, especificidad antigénica, libertada de productos laterales indeseados, facilidad de producción y similares. Se puede encontrar un excelente sumario de las muchas técnicas disponibles en Steward et al., “Solid Phase Peptide Síntesis”, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky, et al., “Peptide Síntesis”, John Wiley & Sons, Segunda edición, 1976; J. Meienhofer, “Hormonal Proteins and Peptides”, Vol. 2, p. 46, Academic Press (Nueva York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-96, 1969; Fields et al., Int. J. Peptide

30 Protein Res., 35:161-214, 1990; y la patente de los Estados Unidos número 4.244.946 para la síntesis de péptidos de fase sólida, y Schoder et al., “The Peptides”, Vol.1; Academic Press (Nueva York), 1965 para la síntesis de solución clásica. Se describen los grupos protectores apropiados utilizable en dicha síntesis en los anteriores textos y en J.F.W. McOmie, “Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, Nueva York, 1973.

En general, los procedimientos de síntesis de fase sólida contemplados comprenden la adición secuencia de uno o

35 más restos de aminoácido o los restos de aminoácido apropiadamente protegidos a una cadena peptídica creciente. Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer resto de aminoácido está protegido por un grupo protector selectivamente eliminable. Se utiliza un grupo protector selectivamente eliminable, diferente para los aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo tal como la lisina.

Al usar por ejemplo una síntesis de fase sólida, el aminoácido protegido o derivado se fija a un soporte sólido inerte

40 a través de su grupo carboxilo o amino desprotegido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina entonces selectivamente y el siguiente aminoácido de la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxi) adecuadamente protegido se mezcla y se hace reaccionar en condiciones apropiadas para formar el enlace amida con el residuo ya fijado al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina entonces del resto de aminoácido recientemente añadido, y entonces se añade el siguiente aminoácido

45 (apropiadamente protegido) y así sucesivamente. Después de haber enlazado todos los aminoácidos deseados en la propia secuencia, se elimina secuencialmente o concurrentemente cualquier grupo terminal o lateral restante (y soporte sólido) para obtener el polipéptido lineal final.

Los polipéptidos lineales resultantes preparados por ejemplo como se describe anteriormente se pueden hacer reaccionar para formar sus péptidos cíclicos correspondientes. Se describe un ejemplo de un procedimiento para 50 ciclizar péptidos en Zimmer et al., Péptidos 1992, pp. 393-394. EXCMO. Science Publishers, B.V., 1993. Típicamente el éster de metilo de péptido protegido de tercbutoxicarbonilo se disuelve en metanol y se añaden soluciones de hidróxido de sodio y la mezcla se hace reaccionar a 20ºC (20C) para eliminar hidrolíticamente el grupo protector de éster de metilo. Después de evaporar el solvente, el péptido protegido de tercbutoxicarbonilo se extrae con acetato de etilo del solvente acuoso acidificado. El grupo protector tercbutoxicarbonilo se elimina 55 entonces en condiciones suavemente ácidas en un cosolvente de dioxano. El péptido lineal desprotegido con los términos amino y carboxi libres así obtenidos se convierte en su péptido cíclico correspondiente haciendo reaccionar una solución diluida del péptido lineal en una mezcla de diclorometano y dimetilformamida, con

diciclohexilcarbodiimida en presencia de 1-hidroxibenzotriazol y N-metilmorfolina. El péptido cíclico resultante se purifica entonces por cromatografía.

Se describe un procedimiento particularmente preferido de síntesis de péptido cíclico en Gurrath et al., Eur. J. Biochem., 210:911-921 (1992), y se describe en los Ejemplos. Particularmente los péptidos preferidos para su

5 utilización en los presentes procedimientos son c-(GrGDFV) (SEQ ID NO 4), c-(RGDFv) (SEQ ID NO 5), c-(RADFv) (SEQ ID NO 6), c-(RGDFv) (SEQ ID NO 7) y el péptido lineal YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO 8), donde “c-“ indica un péptido cíclico, las letras mayúsculas son un simple código de letras para un aminoácido L y las letras minúsculas son un simple código de letras para el aminoácido D- La secuencia de restos de aminoácido de estos péptidos también se conoce en SEQ ID NO 4, 5, 6, 7 y 8, respectivamente.

10 2, Anticuerpos monoclonales

La presente invención describe, en una realización, antagonistas de avA3 en forma de anticuerpos monoclonales que se hacen inmunorreaccionar con avA3 e inhiben la unión de avA3 a su ligando natural tal como se describe en la presente memoria descriptiva. También se describen en la presente memoria descriptiva líneas de células que producen los anticuerpos, procedimientos para producir las líneas de células, y procedimientos para producir los

15 anticuerpos monoclonales.

Un anticuerpo monoclonal de la invención comprende moléculas de anticuerpos que 1) se hacen inmunorreaccionar con avA3 aislado, y 2) inhibir la unión de fibrinógeno a avA3. Los anticuerpos monoclonales preferidos que se unen preferiblemente a avA3 incluyen un anticuerpo monoclonal que tiene las características de inmunorreacción de mAb LM609, segregadas por la línea de células de hibridona ATCC HB 9537. La línea de células de hibridoma ATCC HB

20 9537 se depositó de acuerdo con los requisitos del Tratado de Budapest en La Colección de cultivo tipo americano (ATCC), 1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, el 15 de septiembre de 1987.

El término “anticuerpo o molécula de anticuerpo” en las diversas formas gramaticales se usa en la presente memoria descriptiva como un nombre colectivo que se refiere a una población de moléculas de inmunoglobulina y/o porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un

25 sitio de combinación de anticuerpos o paratope.

Un “sitio de combinación de anticuerpos” es la porción estructural de una molécula de anticuerpo constituida por regiones variables e hipervariable de cadena pesada y ligera que se une específicamente al antígeno.

Los anticuerpos de ejemplo para su uso en la presente invención son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y las porciones de una molécula de inmunoglobulina que

30 contienen el paratope, incluyendo las porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab’, (F(ab)’2 y F(v) y también se refieren a fragmentos de anticuerpo.

En otra realización preferida, la invención contempla una molécula de inmunoglobulina truncada que comprende un fragmento Fab derivado de un anticuerpo monoclonal de la invención. El fragmento Fab, que carece del receptor Fc, es soluble, y consigue ventajas terapéuticas en media vida de suero, y ventajas de diagnóstico en modos de

35 uso del fragmento Fab soluble. La preparación de un fragmento Fab soluble se conoce generalmente en las técnicas inmunológicas y se puede conseguir mediante una diversidad de procedimientos.

Por ejemplo, las porciones (fragmentos) Fab y F(ab’)2 de anticuerpos se preparan mediante la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, sobre los anticuerpos sustancialmente intactos mediante procedimientos bien conocidos. Véase por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 4.342.566 de Theofilopolous y Dixon.

40 Las porciones de anticuerpo Fab también son bien conocidas y se producen a partir de las porciones F(ab’)2 seguidas de la reducción de los enlaces de disulfuro que unen las dos porciones de cadena pesada como con mercaptoetanol, y seguidas por la alquilación del mercaptano de proteína resultante con un reactivo tal como la yodoacetamida. Se prefiere un anticuerpo que contiene moléculas de inmunoglobulina intactas, y se utiliza como se ilustra en la presente memoria descriptiva.

45 La expresión “anticuerpo monoclonal” en sus diversas formas gramaticales se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen sólo una especie de sitio de combinación de anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un epítope particular. Un anticuerpo monoclonal muestra típicamente de este modo una afinidad de única unión para cualquier epítope con el que se hace inmunorreaccionar. Un anticuerpo monoclonal puede, por lo tanto contener una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpo, cada uno

50 inmunoespecífico para un epítope diferente, por ejemplo un anticuerpo monoclonal biespecífico.

Un anticuerpo monoclonal está típicamente compuesto por anticuerpos producidos por clones de una única célula llamada hibridoma que segrega (produce) sólo un tipo de molécula de anticuerpo. La célula hibridoma se forma condensando una célula productora de anticuerpos y un mieloma u otra línea de células autoperpetuadoras. La preparación de tales anticuerpos se describió en primer lugar por Kohler y Milestein, Nature 256:495-497 (1975).

Los procedimientos adicionales se describen por Zola, Monoclonal Antibodies: A manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987). El sobrenadante hibridoma así preparado se puede filtrar para la presencia de moléculas de anticuerpo que se hacen inmunorreaccionar con avA3 y para la inhibición de la unión de avA3 a ligandos naturales.

En resumen, para formar el hibridoma a partir del cual se produce la composición de anticuerpo monoclonal, se

5 condensa un mieloma u otra línea de células autoperpetuadoras con linfocitos obtenidos a partir del bazo de un mamífero hiperinmunizado con una fuente de avA3 tal como avA3 aislado de las células de melanoma humano M21 tal como se describe en Cheresh et al., J. Biol.. Chem., 262:17703-17711 (1987).

Se prefiere que la línea de células de mieloma usada para preparar un hibridoma se haga a partir de la misma especie que los linfocitos. Típicamente, un ratón de cepa 129 GLX+ es el mamífero preferido. Los mielomas de

10 ratón adecuados para su uso en la presente invención incluyen las líneas de células sensibles a la hipoxantinaaminopterina-timidina (HAT) P3X63-Ag8.653, y Sp2/0-Ag14 que están disponible en la Colección de cultivos tipo americano, Rockville, MD, bajo las designaciones CRL 1580 y CRL 1581, respectivamente.

Los esplenocitos se condensan típicamente con las células de mieloma que usan polietilenglicol (PEG) 1500. Los híbridos condensados se seleccionan por su sensibilidad a HAT. Los hibridomas que producen un anticuerpo

15 monoclonal de la invención se identifican usando el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) descrito en los Ejemplos.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención también se puede producir iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio de nutrientes que contiene un hibridoma que segrega moléculas de anticuerpo de especificidad apropiada. El cultivo se mantiene en condiciones y durante un periodo de tiempo

20 suficiente para que el hibridoma segregue las moléculas de anticuerpo en el medio. A continuación se recoge el medio que contiene anticuerpos. A continuación, las moléculas de anticuerpo se pueden, además, aislar mediante técnicas bien conocidas.

Los medios útiles para la preparación de las composiciones son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles e incluyen medios de cultivo sintético, ratones consanguíneos y similares. Un ejemplo

25 de medio sintético es el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396, 1959) suplementado con 4,5 g/l de glucosa, 20 mM de glutamina, y suero 20% fetal de ternero. Un ejemplo de cepa de ratón consanguíneo es el Balb/c.

Otros procedimientos para producir un anticuerpo monoclonal, una célula de hibridoma o un cultivo de células de hibridoma también son conocidos. Véase, por ejemplo, el procedimiento para aislar anticuerpos monoclonales a

30 partir de un repertorio inmunológico tal como se describe en Sastry, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5728-5732 (1989); y Huse et al., Science, 24:1275-1281 (1989).

También se contempla por esta invención la célula de hibridoma y los cultivos que contienen una célula de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención. E prefiere particularmente la línea de células de hibridoma que segrega el anticuerpo monoclonal mAb LM609 designado ATCC HB 9537. El mAb LM609 se

35 preparó como se describe en Cheresh et al., J. Biol.. Chem. 262:17703-1711 (1987), y su preparación también se describe en los Ejemplos.

La invención contempla, en una realización, un anticuerpo monoclonal que tiene las características de inmunorreación de mAb LM609.

También es posible determinar, sin experimentación indebida, si un anticuerpo monoclonal tiene la misma (por

40 ejemplo equivalente) especificidad (características de inmunorreacción) como un anticuerpo monoclonal de la invención determinando si el anterior previene que este último se una a una molécula diana preseleccionada. Si el anticuerpo monoclonal que se están ensayando compite con el anticuerpo monoclonal de la invención, como se muestra mediante una reducción de la unión por parte del anticuerpo monoclonal de la invención en los ensayos de competición estándares para unirse a la molécula diana cuando ésta presente en la fase sólida, a continuación es

45 probable que los dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo epítope o a un epítope estrechamente relacionado.

Todavía otra manera de determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la invención es preincubar el anticuerpo monoclonal de la invención con la molécula diana con la que es normalmente reactivo, y a continuación se añade el anticuerpo monoclonal que se está ensayando para determinar

50 si el anticuerpo que se está ensayando se inhibe en su capacidad para unir la molécula diana. Si el anticuerpo monoclonal que se están ensayando se inhibe, entonces con toda probabilidad, tiene la misma o funcionalmente equivalente, especificidad epitópica que el anticuerpo monoclonal de la invención.

Una manera adicional de determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la invención es determinar la secuencia de residuos de amioácido de las regiones CDR de los anticuerpos en cuestión. Las moléculas de anticuerpo que tienen secuencias de resto de aminoácido idénticas o funcionalmente equivalentes en sus regiones CDR tienen la misma especificidad de unión. Los procedimientos para secuenciar polipéptidos es bien conocida en la técnica.

La inmunoespecificidad de un anticuerpo, su capacidad de unión de molécula diana, y la afinidad correspondiente

5 que exhibe el anticuerpo para el epítope, se definen por el epítope con el que se hace reaccionar el anticuerpo. La especificidad del epítope se define al menos en parte por la secuencia de restos de aminoácido de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina, el anticuerpo, y en parte por la secuencia de restos de aminoácido de región variable de cadena ligera.

El uso de la expresión “tener la especificidad de unión de” indica que los anticuerpos monoclonales equivalentes

10 exhiben la mismas o similares características de inmunorreacción (unión) y compiten para unirse a una molécula diana preseleccionada.

Los anticuerpos monoclonales humanizados ofrecen ventajas particulares sobre los anticuerpos monoclonales murinos, particularmente en la medida en que se pueden usar terapéuticamente en los seres humanos. Específicamente los anticuerpos humanos no se retiran de la circulación tan rápidamente como los antígenos

15 “foráneos”, y no activan el sistema inmune de la misma manera que los antígenos foráneos y los anticuerpos foráneos. Los procedimientos para preparar anticuerpos “humanizados” son bien conocidos en la técnica, y se pueden aplicar fácilmente a los anticuerpos de la presente invención.

De este modo, la invención contempla, en una realización, un anticuerpo monoclonal de la invención que se humaniza por injerto para producir componentes del sistema inmune humano sin interferir sustancialmente con la

20 capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno.

Particularmente se prefieren antagonistas que interfieren de manera específica con la función de avA3, yno interfieren con la función de otras integrinas

F. Procedimientos para identificar antagonistas de avA3

También se describen en la presente memoria descriptiva, procedimientos de ensayo para identificar los

25 antagonistas de avA3 candidatos para su uso según los actuales procedimientos. En estos procedimientos de ensayos las moléculas candidatas se evalúan por su potencia en la inhibición de la unión de avA3 a ligandos naturales, y además se evalúan por su potencia en la inhibición de la angiogénesis en un tejido.

El primer ensayo mide la inhibición de la unión directa del ligando natural a avA3, y se describe en detalle una realización preferida en los Ejemplos. El ensayo mide típicamente el grado de inhibición de la unión de un ligando

30 natural, tal como el fibrinógeno, a avA3 aislado en la fase sólida por ELISA.

El ensayo se puede usar también para identificar los compuestos que exhiben especificidad para avA3 y no inhiben los ligandos naturales de unirse a otras integrinas. El ensayo de especificidad se realiza ejecutando ensayos de ELISA en paralelo en los que tanto avA3 como otras integrinas se detectan concurrentemente en cámaras de ensayo separadas por sus respectivas capacidades de unirse a un ligando natural y por l compuesto candidato para inhibir

35 las respectivas capacidades de las integrinas para unirse a un ligando preseleccionado. Se describen formatos preferidos de ensayo de detección en los Ejemplos.

El segundo ensayo mide la angiogénesis en la membrana corioalantóica de pollo (CAM) y se conoce como el ensayo de CAM. El ensayo de CAM se ha descrito en detalle por otros autores, y además se ha usado para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización de los tejidos tumorales. Véase Ausprunk et al., Am. J. Pathol.,

40 79:597-618 (1975) y Ossonski et al., Cancer Res., 40:2300-2309 (1980).

El ensayo de CAM es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo porque se está realizando la neovascularización de todo el tejido, y los actuales vasos sanguíneos de embrión de pollo están creciendo en la CAM o en el tejido crecido sobre la CAM.

Como se demuestra en la presente memoria descriptiva, el ensayo de CAM ilustra la inhibición de la

45 neovascularización basada tanto en la cantidad como en el alcance del crecimiento de los nuevos vasos. Además, es fácil controlar el crecimiento de cualquier tejido trasplantado sobre la CAM, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es particularmente útil porque hay un control interno de la toxicidad en el sistema de ensayo. El embrión de pollo se expone a cualquier reactivo de ensayo, y por lo tanto la salud del embrión es una indicación de toxicidad.

50 El tercer ensayo mide la angiogénesis en el modelo de ojo de conejo in vivo y se conoce como ensayo de ojo de conejo. El ensayo de ojo de conejo se ha descrito en detalle por otros autores, y se ha usado además, para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización en presencia de inhibidores angiogénicos tales como la talidomida. Véase D’Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:4082-4085 (1994).

El ensayo del ojo de conejo es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo porque el proceso de neovascularización, ejemplificado por los vasos sanguíneos de conejo que crecen desde el borde de la 5 córnea dentro de la córnea, se observa fácilmente a través de la córnea naturalmente transparente del ojo. Además, tanto el alcance como la cantidad de estimulación o inhibición de la neovascularización o la regresión de la

neovascularización se pueden controlar fácilmente en el tiempo.

Finalmente, el conejo se expone a cualquier reactivo de ensayo, y por lo tanto la salud del conejo es una indicación de la toxicidad del reactivo de ensayo.

10 El cuarto ensayo mide la angiogénesis en el modelo de ratón quimérico:ratón humano y se conoce como el ensayo de ratón quimérico. Se ha descrito en ensayo en detalle por otros autores, y además se ha descrito en la presente memoria descriptiva para medir la angiogénesis, la neovascularización, y la regresión de los tejidos tumorales. Véase Yan, et al., J. Clin Invest., 91:896-996 (1993). El ensayo de ratón quimérico es un modelo de ensayo útil para la angiogénesis in vivo porque los injertos de piel transplantada se parecen mucho a la piel humana normal desde

15 el punto de vista histológico y la neovascularización de todo el tejido se produce cuando los vasos sanguíneos humanos actuales están creciendo desde la piel humana injertada en el tejido tumoral humano sobre la superficie de la piel humana injertada. El origen de la neovascularización en el injerto humano se puede demostrar por teñido inmunohistoquímico de la neovasculatura con marcadores de células endoteliales específicas humanas.

Como se demuestra en la presente memoria descriptiva, el ensayo de ratón quimérico demuestra la regresión de la

20 neovascularización basada tanto en la cantidad como en el alcance de la regresión del crecimiento de nuevos vasos. Además, es fácil controlar los efectos sobre el crecimiento de cualquier tejido trasplantado sobre la piel injertada, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es útil porque hay un control interno de la toxicidad en el sistema de ensayo. El ratón quimérico se expone a cualquier reactivo de ensayo, y por lo tanto la salud del ratón es una indicación de la toxicidad.

25 Ejemplos

Los siguientes ejemplos que se refieren a la invención son ilustrativos y no deberían, por supuesto, interpretarse específicamente como limitativos de la invención.

1.-Preparación de los péptidos sintéticos

Este ejemplo no cae dentro del alcance de la invención y solamente se incorpora para propósitos ilustrativos. Los

30 polipéptidos lineales y cíclicos expuestos en la Tabla 1 se sintetizaron usando técnicas convencionales de síntesis de fase sólida, como, por ejemplo, se describe en Merrifield, Adv Enzymol., 32:221-96, (1969), y Fields, G.B. y Noble, R,L., Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214, (1990).

Se disolvieron en primer lugar dos gramos (g) de BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe (SEQ ID NO 1) en 60 mililitros (ml) de metanol al que se añadió 1,5 ml de una solución de hidróxido de sodio 2N para formar una mezcla. 35 La mezcla se agito a continuación durante 3 horas a 20 grados centígrados (20ºC). Después de la evaporación, el residuo se absorbió en agua, se acidifico con un pH 3 con HCl diluido y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se seco sobre Na2SO4, se evaporó de nuevo y el BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO 2) se agitó a 20ºC durante 2 horas con 20 ml de HCl 2N en dioxano. La mezcla resultante se evaporó de nuevo para obtener HGly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO 3) que se disolvió posteriormente en una mezcla de 1.800 ml de

40 diclorometano y 200 ml de dimetilformamida (DMF) seguido de une enfriamiento a 0ºC. Después, se añadieron sucesivamente con agitación 0,5 g de diciclohexilcarbodiimida (DCCI), 0,3 g de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y 0,23 ml de N-metilmorfolina.

La mezcla resultante se agitó durante 24 horas adicionales a 0ºC y a continuación a 20ºC durante otras 48 horas más. La solución se concentró y se trató con un cambiador de iones de lecho mixto para liberarla de sus sales. 45 Después de retirar la resina resultante por filtración, la solución clarificada se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía dando como resultado la recuperación de ciclo(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO 4). Los siguientes péptidos, expuestos en la Tabla 1 que usan abreviaturas para los restos de aminoácido con un código de una única letra y se identifican mediante una designación de número de péptido, se obtuvieron de manera análoga: ciclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO 5); ciclo(Arg-ala-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO 6); ciclo(Arg-D

50 Ala-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO 9); ciclo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID NO 7). Una secuencia designada como 66203, que tiene una secuencia idéntica a la del péptido 62184, que sólo difería de la última porque contiene la sal HCl en lugar de la Sal Tfa presente en 62184. En la inhibición de la angiogénesis se describen los ensayos descritos en el Ejemplo 7 donde se usaron los péptidos sintéticos, el péptidos 66203 que tiene HCl fue ligeramente más eficaz en la inhibición de la angiogénesis que el péptido idéntico en TFA.

Tabla 1

Número de péptido: Secuencia de aminoácido* SEC ID NO

62181 ciclo(GrGDFV) 4 62184 ciclo(RGDFV) 5 62185 ciclo(RADFV) 6 62187 ciclo(RGDFv) 7 62880 YTAECKPQVTRGDVF 8 92186 ciclo(RaDFV) 9 62175 ciclo(ARGDfL) 10 62179 ciclo(GRGDfL) 11 62411 TRQVVCDLGNPM 12 62503 GVVRNNEALARLS 13 62502 TDVNGDGRHDL 14

* Las letras minúsculas indican un aminoácido D; las letras mayúsculas indican un aminoácido L.

Un péptido designado 69601, que tiene una secuencia idéntica a la del péptido 62185, que sólo difería de la última por contener la sal de HCl en lugar de la sal de TFA presente en 62184.

5 Se ha mostrado el péptido cíclico c-RADfV (69601) para inhibir la unión del fibrinógeno a la integrina avA3 y no inhibir la unión del fibrinógeno a las integrinas aIIbA3 o a5A1 (Pfaff, et al., J. Biol.. Chem., 269:20233-20238, 1994). De este modo el péptido c-RADfV es específico para avA3.

2.-Anticuerpos monoclonales

El anticuerpo monoclonal LM609 segregado por el hibridoma ATCC HC 9537 se produjo usando los procedimientos

10 estándares de hibridoma por inmunización con avA3 aislado absorbido sobre esferas de lentil lectina Sefarosa. La avA3 se aisló a partir de células de melanoma humano designadas M21, y el anticuerpo se produjo como se describe en Cheresh et al., J. Biol.. Chem., 262:17703-17111 (1987). Se proporcionaron las células M21 por parte de Dr. D.L. ;Morton (Universidad de California, Los �?ngeles, CA) y crecieron en cultivos de suspensión en un medio de cultivo RPMI 1640 que contiene 2 mM de L-glutamina, 50 mg/ml de sulfato de gentamicina y suero fetal de

15 ternero al 10%.

Se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal LM609 inmunorreacciona específicamente con el complejo de avA3, y no inmunorreacciona con la subunidad av, con la subunidad A3 o con otras integrinas.

3.-Características de la distribución de tejido de la expresión de avA3

A. Inmunofluorescencia con anticuerpos de receptores de anti-integtrina

20 Durante la cicatrización de una herida, las membranas del basamento de los vasos sanguíneos expresan diversas proteínas adhesivas, incluyendo el factor de von Willebrand, la fibronectina y la fibrina. Además diversos miembros de la familia de las integrinas de los receptores de adhesión se expresan sobre la superficie de las células cultivadas endoteliales y del músculo liso. Véase, Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:6471 (1987); Janat et al., J. Cell Physiol., 151:558 (1992); y Cheng et al., J. Cell Physiol., 139:275 (1989). Entre las integrinas esta la

25 avA3, el receptor de células endoteliales para el factor de von Willebrand, el fibrinógeno (fibrina), y la fibronectina como se describe en Cheresh Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:6471 (1987). Esta integrina inicia una vía de señalización dependiente del calcio que conduce a la migración de las células endoteliales, y por lo tanto parece desempeñar una función fundamental en la biología de células vasculares; como se describe en Leavelsey et al., J. Cell Biol.., 121:163 (1993).

5 Para investigar la expresión de avA3 durante la angiogénesis, el tejido humano de granulación de herida o la piel normal adyacente se obtuvo a partir de pacientes consentidores, se lavó con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato y se inserta en el medio O.T.C (Tejido Tek). Los tejidos insertados se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido durante aproximadamente 30 a 45 segundos. Se cortaron secciones de un espesor de 6 micrómetros a partir de los bloques congelados sobre un micrótomo de criostato para un posterior teñido de

10 inmunoperoxidasa con anticuerpos específicos para las integrinas A3 (avA3 o aIIbA3) o la subafimili A1 de integrinas.

Se muestran los resultados de la tinción de la piel humana normal y el tejido de granulación de herida en las figuras 1A-1D. Se usaron los anticuerpos monoclonales AP3 y LM534, dirigido a las integrinas A3 y A1, respectivamente para análisis inmunohistoquímicos de secciones congeladas. Los experimentos con tejido de cuatro diferentes donantes humanos produjeron idénticos resultados. Se muestran las fotomicrografías con una

15 ampliación de 300x.

La integrina avA3 se expresaron abundantemente sobre los vasos sanguíneos en el tejido de granulación (figura 1B) pero no se pudieron detectar en la dermis y el epitelio de la piel normal del mismo donante (figura 1A). en contraste con lo anterior, las integrinas A1 se expresaron abundantemente sobre los vasos sanguíneos y las células normales tanto en la piel normal (figura 1C) como en el tejido de granulación (figura 1D), y como se ha mostrado

20 anteriormente y descrito por Admas et al., Cell, 63:425 (1991), sobre las células basales dentro del epitelio.

B.-Inmunofluorescencia con anticuerpos anti-ligando

Las secciones adicionales de la piel normal humana y los tejidos de granulación preparados anteriormente también se examinaron por la presencia de los ligandos, por las integrinas A3 y A1, el factor de von Willebrandd y la laminina, respectivamente. El factor de von Willebrand se localizó en los vasos sanguíneos en la piel normal (figura 2A) y el

25 tejido de granulación(figura 2B), mientras que la laminina se localizó en todos los vasos sanguíneos así como la membrana del basamento epitelial en ambas preparaciones de tejido (Figura 2C y 2D).

C. Distribución de anticuerpos anti- avA3 sobre tejido canceroso

Además de los anteriores análisis, también se examinaron las biopsias de los tejidos cancerosos de los pacientes humanos también por la presencia y distribución de avA3. Los tejidos se prepararon como se describe en el 30 Ejemplo 1A con la excepción de que se tiñeron con el anticuerpo monoclonal LM609 preparado en el Ejemplo 2 que es específico para el complejo receptor de integrina, avA3. Además se prepararon también tumores para su análisis histológico microscópico fijando los ejemplos representativos de los tumores en fijador Bulins durante 8 horas y se

cortaron secciones en serie y se tiñó con H y E.

Los resultados de la tinción de inmunoperoxidasa de los tejidos cancerosos de la vejiga, el colon, el mama y el

35 pulmón se muestran en las figuras 3A-3D, respectivamente. avA3 se expresa abundantemente sólo sobre los vasos sanguíneos presentes en las cuatro biopsias de cáncer analizadas y no sobre una cualquiera de las otras células presentes en el tejido.

Los resultados descritos en la presente memoria descriptiva muestran de este modo que el receptor de integrina de avA3 se expresa selectivamente en tipos específicos de tejido, concretamente tejidos metastáticos, granulados y

40 otros tejidos en los que la angiogénesis se produce y tejido no normal donde se ha detenido la formación de nuevos vasos sanguíneos. Estos tejidos proporcionan por lo tanto un objetivo ideal para aspectos terapéuticos de la invención

4. Identificación de los péptidos sintéticos específicos de avA3 detectados por un ensayo de unión de ligandoreceptor.

45 Este ejemplo no cae dentro del alcance de la invención y solamente se incorpora para propósitos ilustrativos Los péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo 1 se detectaron midiendo su capacidad para antagonizar la actividad de unión de receptores de avA3 y aIIbA5 en ensayos de unión de ligando-receptor. El procedimiento para estos estudios de unión se ha descrito por Barbas et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10003-10007 (1993), Smith et al., J. Biol.. Chem. 265:11008-11013 (1990), y Plaff et al., J. Biol.. Chem. 269:20233-20238 (1994), cuyas

50 descripciones se incorporan en el presente documento por referencia.

En la presente memoria descriptiva se describe un procedimiento de identificación de antagonistas en un ensayo de unión de ligando- receptor en el que el receptor se inmoviliza en un soporte sólido y el ligando y el antagonista son solubles. También se describe un ensayo de unión de ligando-receptor en el que el ligando se inmoviliza en un soporte sólido y el receptor y el antagonista son solubles.

En resumen, las integrinas purificadas seleccionadas se inmovilizaron por separado en pocillos de microtitración Titertek con una concentración de revestimiento de 50 nanogramos (ng) por pocillo. La purificación de los 5 receptores se usa en los ensayos de unión ligando receptor son bien conocidos en la técnica y se pueden obtener fácilmente con procedimientos familiares a los expertos en la técnica. Después de la incubación durante 18 horas a 4ºC, se bloquearon sitios no específicos de unión sobre la placa con 10 miligramos / mililitro (mg/ml) de albúmina de suero bovino (BSA) en solución salina tris-tamponada. Para los estudios de inhibición, se ensayaron diversas concentraciones de péptidos seleccionados de la Tabla 1 para la capacidad para bloquear la unión de vitronectina 10 125I o fibrinógeno 125I a los receptores de integrina, avA3 y aIIbA3. Aunque los ligandos exhiben la unión óptima para una integrina particular, la vitronectina para avA3 y el fibrinógeno para aIIbA3, los estudios de la inhibición de la unión usando péptidos para bloquear la unión del fibrinógeno a uno de los dos receptores permitidos para la determinación precisa de la cantidad de micromoles (uM) de péptido necesario para inhibir medianamente la unión del receptor al ligando. Los ligandos radiomarcados se usaron con concentraciones de 1 nM y la unión se provocó

15 por separado con péptidos sintéticos no marcados.

Después de una incubación de tres horas, se retiró el ligando libre mediante un lavado y el ligando unido se detectó por recuento gamma. Los datos de los ensayos donde los péptidos cíclicos seleccionados mencionados en la Tabla 1 se usaron para inhibir la unión de los receptores y el fibrinógeno radiomarcado avA3 y aIIbA3 inmovilizados por separado, los receptores se pudieron reproducir con el error entre los puntos de datos, típicamente por debajo

20 del 11%. Los datos de CI50 en micromoles (CI50 uM) se expresaron como la media de los puntos de datos duplicados ± la desviación estándar como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2

Número de péptidos: avA3 (CI50 uM) aIIbA3 (CI50 uM)

62181: 1,96 ± 0,62 14,95 ± 7,84

62184: 0,05 ± 0,001 0,525 ± 0,10

62185: 0,886 ± 0,16 100 ± 0,001

62187: 0,05 ± 0,001 0,26 ± 0,056

62186: 57,45 ± 7,84 100 ± 0,001

62175: 1,05 ± 0,07 0,63 ± 0,18

62179: 0,395 ± 0,21 0,055 ± 0,007

De este modo, los péptidos ciclizados que contienen RGD y derivados de RGD 62181, 62184, 62185 y 62187, 25 teniendo cada uno un resto de aminoácido D, exhibieron una inhibición preferente de la unión de fibrinógeno al receptor de avA3 medida por la menor concentración de péptido requerida para la inhibición media comparada con la del receptor de aIIbA3. en contraste con lo anterior, los otros péptidos cíclicos que contienen RGD o derivados de RGD, 62186, 62175 y 62179, o no fueron tan eficaces en el bloqueo de la unión del fibrinógeno a avA3 o exhibieron una inhibición preferente de la unión del fibrinógeno a aIIbA3 comparado con avA3. Los resultados son consistentes 30 con los recientemente publicados por Pfaff, et al., J. Biol.. Chem., 26920233-20238 (1994) en el que el péptido cíclico RGDFV (en el que F indica un residuo de amino ácido D) inhibió específicamente la unión del fibrinógeno a la integrina avA3 y no a las integrinas aIIbA3 o avA5. Los ensayos similares de inhibición de unión se llevaron a cabo con péptidos linealizados que tienen o carecen de un motivo RGD, cuyas secuencia se derivaron de la subunidad de receptor de av, la subunidad de receptor aIIb o las secuencias de restos de aminoácido d ligando de vitronectina.

35 Las secuencias de los péptidos lineales, 62880 (restos de aminoácido derivados de VN 35-49), 62411 (restos de aminoácido derivados de av 676-687); 62503 (restos de aminoácido derivados de av 655-667); 62 502 (restos de aminoácido derivados de aIIb 296-3006) se exponen en la Tabla 1. Cada uno de los péptidos se usó e n ensayos separados para inhibir la unión de la vitronectina (VN) o el fibrinógeno (FG) a aIIbA3 o avA3. Los datos de CI50 en micromoles (CI50 uM) de un ensayo individual para cada experimento se muestran en la Tabla 3.

40 Tabla 3

Número de péptido: aIIbA3 CI50 (uM) avA3 CI50 (uM)

FG: VN FG VN

62880: 4,2 0,98 <0,1 0,5

62411: >100 >100 >100 >100

62503: >100 >100 >100 >100

62502: 90 5 >100 >100

Los resultados de la inhibición de los ensayos de unión de ligandos para seleccionar los receptores de integrina con péptidos linealizados muestran que sólo el péptido 62880 fue eficaz en la inhibición de la unión media de FG o VN a avA3 medido por la menor concentración de péptidos requerida para la inhibición media comparada con el

5 receptor aIIbA3. Ninguno de los otros péptidos linealizados fue eficaz en el bloqueo de la unión de ligandos a avA3 aunque el péptidos 62502 sea eficaz en el bloqueo de la unión de VN a aIIbA3.

De este modo el ensayo ligando-receptor descrito en la presente memoria descriptiva se puede usar para detectar tanto los péptidos sintéticos circulares como los linealizadores que exhiben una especificidad selectiva para un receptor particular de integrina, específicamente avA3, usados como antagonistas (avA3) de receptor de vitronectina

10 en la práctica de la invención.

5. Caracterización de la membrana corioalantóica de pollo (CAM) sin tratar.

A. Preparación de la CAM

La angiogénesis se puede inducir en la membrana corialantóica de pollo (CAM) después de que la angiogénesis embrionaria normal haya dado como resultado la formación de vasos sanguíneos maduros. La angiogénesis ha 15 demostrado ser inducida en respuesta a citoquinas específicas o fragmentos tumorales descritos por Leibovich et al., Nature, 329:630 (1987) y Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597 (1975). Las CAM se prepararon a partir de embriones de pollo para la posterior inducción de angiogénesis y la inhibición de los mismos como se describe en los Ejemplos 6 y 7, respectivamente. Los embriones de pollo de 10 días se obtuvieron en McIntyre Poultry (Lakeside, CA) y se incubaron a 37ºC con un 60% de humedad. Se hizo un pequeño agujero a través de la cáscara 20 en el extremo del huevo directamente sobre la bolsa de aire con el uso de un pequeño taladro (Dremel, división de Emerson Electric Co. Racine WI). Se taladró un segundo orificio en el lado ancho del huevo en una región carente de vasos sanguíneos embrionarios anteriormente determinada iluminando el huevo. La presión negativa se aplicó al agujero original, que dio como resultado que la CAM (membrana corioalantóica) se separase de la membrana de la cáscara y crease una falsa bolsa de aire sobre la CAM. Se cortó una ventana cuadrada de 1,0 centímetro (cm) x

25 1,0 cm a través de la cáscara sobre la CAM caída con el uso de un pequeño modelo de muela (Dremel). La pecunia ventana permitió un acceso directo a la CAM subyacente.

La preparación de CAM resultante se usó a continuación a 6 días de la embriogénesis de, una etapa marcada por la neovascularización activa, sin tratamiento adicional a la CAM que refleja el modelo usado para evaluar los efectos sobre la neovascularización embrionaria o usada a 10 días de la embriogénesis cuando la angiogénesis se

30 subdivide. Esta última preparación se uso de este modo en la invención para inducir la angiogénesis renovada en respuesta al tratamiento con citoquinas o al contacto del tumor descrita en el Ejemplo 6.

B. Histología de la CAM

Para analizar la estructura microscópica de las CAM de embrión de pollo y/o los tumores humanos que se resecaron a partir de los embriones de pollo descrita en el Ejemplo 8, las CAM y los tumores se prepararon para 35 cortar secciones congeladas. Como se describe en el Ejemplo 3A. Se cortaron secciones con un espesor de seis micrómetros partir de bloques congelados sobre un micrótomo de criostato para el análisis de inmunofluorescencia.

La figura 4 muestra una fotomicrografía típica de un área desprovista de vasos sanguíneos en una CAM de 10 días sin tratar. Al subdividirse la angiogénesis en el sistema de CAM mediante la etapa de embriogénesis, el sistema es útil en la invención para estimular la producción de la nueva vasculatura de los vasos existentes de las áreas

40 adyacentes en las áreas de la CAM que carecen concurrentemente de vasos.

C. Perfiles de integrina en la CAM detectados por inmunofluorescencia Para ver la distribución de tejido de los receptores de integrina presentes en los tejidos de CAM, se fijaron secciones congeladas de 6 micrómetros (um) de espesor tanto de los tejidos tumorales como de los tejidos de CAM de embriones de pollo en acetona durante 30 segundos y se tiñeron mediante inmunofluorescencia con 10 micrógramos/milílitros (ug/ml) mAb CSAT, un anticuerpo monoclonal específico para la subunidad de integrina A1

5 descrita por Buck et al., J. Cell Biol.., 107:2351 (1988) y de este modo se uso para los controles, o LM609 preparado en el Ejemplo 2. Al teñido primario le siguió un teñido con una dilución del 1:250 de anticuerpo secundario marcado de rodamina antiratón de cabra (TAGO) para permitir la detección del producto de inmunorreación primaria. Las secciones se analizaron a continuación con un microscopio con compuesto de inmunofluorescencia Zeiss. .

10 Los resultados del análisis de inmunofluorescencia muestran que los vasos sanguíneos maduros presentes en un embrión de pollo de 10 días sin tratar expresan la subunidad integrina A1 (figura 5A). En contraste con lo anterior, en una sección en serie del tejido mostrada en la figura 5A no se detecto inmunorreactividad con LM609 (figura 5B). De este modo la integrina avA3 detectada por el anticuerpo LM609 no se estaba expresando activamente por los vasos sanguíneos maduros presentes en un embrión de pollo sin tratar de 10 días. Como se muestra en el

15 modelo de CAM y en los siguientes Ejemplos, mientras los vasos sanguíneos experimentan un nuevo crecimiento en una embriogénesois normal o inducida por citoquinas o tumores, los vasos sanguíneos expresan avA3. Sin embargo, después de la neovascularización activa, una vez que los vasos han dejado de desarrollarse, la expresión de avA3 se reduce a niveles no detectables por el análisis de inmunofluorescencia. La regulación de la expresión de avA3 en los vasos sanguíneos que experimentan la angiogénesis una vez contrastada con la carencia

20 de expresión en los vasos maduros proporciona la única capacidad de la invención para controlar e inhibir la angiogénesis como se muestra en los siguientes Ejemplos modelizados usando el sistema de ensayo de angiogénesis de CAM.

6. Ensayo de angiogénesis de CAM

A. Angiogéneis inducida por factores de crecimiento

25 Se ha demostrado que la angiogénesis se induce por citoquinas o factores de crecimiento como se referencia en el Ejemplo 5A. En los experimentos descritos en la presente memoria descriptiva, la angiogénesis en la preparación de CAM descrita en el Ejemplo 5 se indujo por factores de crecimiento que se encontraron tópicamente sobre los vasos sanguíneos de la CAM tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

La angiogénesis se indujo colocando un disco de filtro Whatman de 5 milímetros (mm) x 5 mm (Papel filtrante

30 Whatman nº 1) saturado con Una Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, GIBCO, Grand Island , NY) o HBSS que contenía 150 nanogramos mililitro (ng/ml) de factor de crecimiento de fibroblasto básico recombinante (AFGF) (Genzyma, Cambridge, MA) sobre la CAM de un embrión de pollo de 10 días en una región desprovista de vasos sanguíneos y las ventanas se sellaron más tarde con cinta. En otros ensayos, 125 ng/ml de AFGF fue también eficaz para inducir el crecimiento de los vasos sanguíneos. La angiogénesis se controló por fotomicrografía

35 después de 72 horas. Las CAM se congelaron rápidamente, y se fijaron unas secciones de criostato de 6 um con acetona y se tiñeron con inmunofluorescencia tal como se describe en el Ejemplo 5C con 10 ug/ml de anticuerpo monoclonal anti-A1 CSAT o LM609

La fotomicrografía de inmunofluorescencia de la figura 5C muestra la expresión mejorada de avA3 durante la angiogénesis inducida por AFGF sobre la CAM de pollo en contraste con la ausencia de expresión de avA3 en una

40 CAM de pollo sin tratar como se muestra en la figura 5B. avA3 se pudo detectar fácilmente sobre muchos (75% a 80%) de los vasos sobre las CAM tratada con AFGF. Además, la expresión de la integrina A1 se mantuvo sin cambio respecto de la vista en una CAM sin tratar ya que A1 también se pudo detectar fácilmente sobre los vasos sanguíneos estimulados.

A continuación, se cuantifico la expresión relativa de las integrinas avA3 y A1 durante la angiogénesis inducida por

45 AFGF por análisis de imagen confocal por láser de las secciones de criostato de CAM. Las secciones teñidas se analizaron a continuación con un microscopio confocal láser Zeiss. Se seleccionaron 25 vasos teñidos con LM609 y 15 vasos teñidos con CSAT (tamaño medio de aproximadamente 1200 mm2, gama de 350 a 3.500 mm2) a partir de campos aleatorios y la media de fluorescencia de rodamina para cada vaso por área de unidad se midió en unidades arbitrarias por análisis de imagen confocal láser. Los datos se expresaron como la intensidad de

50 fluorescencia media en unidades arbitrarias de vasos ± error estándar (ES).

Los resultados representados en la Figura 6 muestran que el teñido de avA3 se mejoró significativamente (cuatro veces más) sobre las CAM tratadas con AFGF como se determina mediante el Ensayo de Suma Wilcoxon Rank (P<0,0001), mientras que la tinción con A1 no fue significativamente diferente con el tratamiento con AFGF.

El ensayo de CAM se uso además para examinar el efecto de otro potente inductor de angiogénesis, el factor alfa 55 de necrosis tumoral (TNFa), sobre la expresión de las integrinas A1 y A3. Se descubrió que los discos filtrantes impregnados con AFGF o TNFa y colocados sobre las CAM de embriones de diez días promovían la angiogénesis local después de 72 horas.

Los resultados se muestran en las fotomicrografías de las CAM sin tratar (figura 7A), tratadas con AFGF (figura 7B)

o tratadas con TNFa (figura 7C). Los vasos sanguíneos se observan fácilmente tanto en las preparaciones

5 tratadas con AFGF como con TNFa pero no están presentes en la CAM sin tratar. De este modo, la aplicación tópica de factor de crecimiento/citoquina dio como resultado la inducción de angiogénesis de vasos maduros en un área adyacente dentro del área originalmente desprovista de vasos sanguíneos. A la vista de los vasos sanguíneos inducidos por AFGF y la expresión concomitante de avA3 como se muestra en la figura 5C, el tratamiento de TNFa da como resultado actividades comparables.

10 Estos descubrimientos indican que tanto en los seres humaos como en los pollos, los vasos sanguíneos implicados en angiogénesis muestran una expresión mejorada de avA3 . Según esto, la expresión de avA3 en células endoteliales cultivadas se puede inducir por diversas citoquinas in vitro como se describe en Janat et al., J. Cell Physiol., 151:588 (1992); Einstein et al., Exp. Cell Res., 203:499 (1992) y Swerlick et al.,J. Invest. Derm., 99:715 (1993).

15 El efecto sobre la angiogénesis inducida por factor de crecimiento por los inhibidores de anticuerpos y péptidos se presenta en los Ejemplos 7A y 7B.

B. Angiogénesis embrionaria

La preparación de CAM para evaluar el efecto de los inhibidores de angiogénesis sobre la formación natural de neovasculatura embrionaria fue el embrión de pollo de 6 días anteriormente descrito. En esta etapa de desarrollo,

20 los vasos sanguíneos se someten de nuevo a crecimiento y de este modo proporcionan un sistema útil para determinar si avA3 participa en la angiogénesis. El sistema de CAM se preparó tal como se describe anteriormente con la excepción de que el ensayo se realizó en un embrión de 6 días en lugar de 10 días. El efecto sobre la angiogénesis embrionaria por tratamiento con los anticuerpos y los péptidos de la invención se presentan en el Ejemplo 7C.

25 C. Angiogénesis inducida por tumores

Para investigar la función de avA3 en la angiogénesis inducida por tumores, se usaron diversos fragmentos de melanoma y carcinoma humanos de avA3 negativo en el ensayo de CAM que previamente se hicieron crecer y se aislaron de la CAM de un embrión de pollo de 17 días como se describe en Brooks et al., J. Cell Biol.., 122:1351 (1993) y como se describe en la presente memoria descriptiva. Los fragmentos indujeron una neovascularización

30 extensiva en presencia sólo tampón.

La angiogénesis se indujo en el sistema de ensayo de CAM por la aposición directa de un fragmento de tumor sobre la CAM. La preparación de la CAM de embrión de pollo fue idéntica al procedimiento descrito anteriormente. En lugar de un disco filtrante de papel, se colocó un fragmento de 50 miligramos (mg) a 55 mg de peso de un tumor de melanoma humano M21L, un tumor de carcinoma de pulmón humano UCLAP-3, una línea celular de

35 carcinoma pancreático humano FG (Cheresh et al., Cell 58:945-953, 1989), o una línea celular de carcinoma de laringe humana HEp3, todos los cuales son tumores de avA3 negativo, sobre la CAM en un área originalmente desprovista de vasos sanguíneos.

La línea celular de melanoma humano M21L, la línea celular de carcinoma de pulmón humano UCLAP-3, la línea celular de carcinoma pancreático FG, o la línea celular de carcinoma de laringe humana HEp3, todas de avA3 40 negativo, se usaron para hacer crecer los tumores humanos sólidos sobre las CAM de los embriones de pollo. Una suspensión de células simples de 8 x 106 M21-L, UCLAP-3, y FB o células de 5 x 105 Hep3 se aplicaron en primer lugar a las CAM en un volumen total de 30 micrólitros (ul) de HBSS estéril. Las ventanas se sellaron con cinta y los embriones se incubaron durante 7 días para permitir el crecimiento de lesiones tumorales humanas. Al término de los 7 días, se tenía un embrión de 17 días, y los tumores se resecaron a partir de las CAM y se cortaron libres de

45 tejido de CAM circundante. Los tumores se cortaron en fragmento de 50 mg a 55 mg para su uso en ensayos de angiogénesis o de crecimiento tumoral. Los fragmentos tumor se colocaron sobre una nueva serie de CAM de embriones de pollo de 10 días como se describe en el Ejemplo 6A en un área desprovista de vasos sanguíneos.

Los tumores cultivados in vivo sobre las CAM de embriones de pollo se tiñeron para la expresión de avA3 con mAb LM609 como se describe en el Ejemplo 3A. No se observó ningún teñido específico de las células tumorales que

50 indicasen una carencia de expresión de avA3.

Estas preparaciones de tumor de CAM se trataron a continuación como se describe en los Ejemplos 7D y 7E para medir los efectos de los anticuerpos y los péptidos sobre la angiogénesis inducida por tumores. Las preparaciones de tumor de CAM también se trataron como se describe en los Ejemplos 8, 9 y 12 para medir los efectos de los anticuerpos y los péptidos en la regresión de tumores y la apoptosis de vasos sanguíneos angiogénicos y células vasculares.

7.Inhibición de la angiogénesis medida en el ensayo de CAM

A. Inhibición de la angiogénesis inducida por factor de crecimiento por aplicación tópica de inhibidores.

5 1)Tratamiento con anticuerpos monoclonales

Para determinar si avA3 desempeña una función activa en la angiogénesis, se colocaron discos filtrantes saturados con AFGF o TNFa sobre las CAM, a continuación se añadieron los anticuerpos monoclonales (también denominados mAb), LM609 (específico para avA3), CSAT (específico para A1), o P3G2 (específico para avA5) a la preparación.

10 La angiogénesis se indujo sobre la CAM a partir de embriones de pollo de 10 días mediante discos filtrantes saturados con AFGF, Los discos se trataron a continuación con 50 ml de HBSS que contenía 25 mg de mAb en un volumen total de 25 ul de HBSS estéril en intervalos de 0, 24 y 48 horas. Al cabo de 72 horas, las CAM se recogieron y se colocaron en una placa de Petri de 35 mm y se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada de fosfato. Se analizó el lado inferior del papel filtrante y el tejido de CAM bajo un microscopio estéreo

15 Olympus, con dos observadores de un modo doble ciego. La inhibición de la angiogénesis se consideró significativa cuando las CAM exhibieron una reducción de más del 50% en la infiltración de los vasos sanguíneos de la CAM directamente bajo el disco. Los experimentos se repitieron cuatro veces por anticuerpo, con 6 o 7 embriones por caso.

Los resultados de los efectos del tratamiento con mAb sobre la angiogénesis inducida por AFGF se muestran en las

20 Figuras 8A-8B. Una preparación de CAM sin tratar desprovista de vasos sanguíneos se muestra en la figura 8A para proporcionar una comparación con la inducción de vasos sanguíneos de AFGF mostrada en la figura 8B y los efectos sobre ésta mediante mAb en las figuras 8C-8E. Aproximadamente el 75% de la CAM tratadas con mAb LM609 exhibieron una inhibición de angiogénesis superior al 50% como se muestra en la figura 8E, y muchas de éstas parecen desprovistas de infiltración de vasos. En contraste con lo anterior, el control de tampón (figura 8A) y

25 los discos tratados con mAb CSAT (figura 8C) y P3G2 (figura 8D) mostraron consistentemente una vascularización extensa.

Se obtuvieron resultados idénticos cuando se indujo la angiogénesis con TNFa. Para examinar los efectos de estos mismos anticuerpos sobre vasos sanguíneos maduros preexistentes presentes a partir de un desarrollo normal de los vasos adyacentes a las áreas desprovistas de vasos, se colocaron discos filtrantes saturados con mAb sobre las 30 regiones vascularizadas de las CAM de embriones de 10 días que no recibieron aplicación tópica de citoquina. Ninguno de los tres mAb afectó a los vasos preexistente como se determinó mediante visualización bajo un microscopio estéreo. De este modo mAb LM609 inhibió selectivamente únicamente el nuevo creciiento de vasos sanguíneos y no afecto a los vasos sanguíneos maduros presentes en las áreas adyacentes. Este mismo efecto se observó con la aplicación de péptidos sintéticos aplicados tópicamente o por vía intravenosa como se describe en

35 los Ejemplos 7A2) y 7E2), respectivamente.

2)Tratamiento con péptidos sintéticos

Los ensayos de CAM también se llevaron a cabo con los péptidos sintéticos de la invención para determinar el efecto de los péptidos cíclicos y linealizados sobre la angiogénesis inducida por factor de crecimiento. Los péptidos se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 y se presento 80 ug de péptido en un volumen total de 25 ul de

40 HBSS estéril. La solución de péptidos se aplicó inmediatamente a la preparación de CAM y a continuación de nuevo a las 24 y 48 horas. A las 72 horas el papel filtrante y el tejido de CAM circundante se sometió a disección y se observó como se ha descrito anteriormente.

Los resultados de este ensayo mostraron ser similares a los mostrados en las figuras 9A-9C como se describe en el Ejemplo 7E2) donde los péptidos sintéticos se inyectaron por vía intravenosa en los vasos sanguíneos inducidos 45 por tumor. En este punto, con el péptido de control, 62186, los vasos sanguíneos inducidos por AFGF permanecieron sin cambios, como se muestra en la figura 9A. En contraste con lo anterior, cuando el péptido de RGD cíclico, 62814, se aplicó al filtro, la formación de vasos sanguíneos se inhibió dejando el área desprovista de nueva vasculatura. Este efecto fue similar en apariencia al mostrado en la figura 9B como se describe en el Ejemplo 7E2) más adelante. Además, también como se muestra en la figura 9C para los péptidos inyectados por vía

50 intravenosa, en áreas en las que los vasos sanguíneos maduros estaban presentes e incluso distantes de la colocación del filtro saturado de factor de crecimiento, no se observo ningún efecto con el tratamiento tópico de los péptidos sintéticos sobre los vasos subyacentes. La actividad inhibitoria de los péptidos sobre la angiogénesis se limita de este modo a las áreas de angiogénesis inducidas por factores de creciiento y no afecta a los vasos maduros preexistentes adyacentes o dan como resultado cualquier citotoxicidad deletérea al área circundante.

Se llevaron a cabo ensayos similares con los otros péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo 1 y los representados en la Tabla 1.

B. Inhibición de la angiogénesis inducida por factores de crecimiento por aplicación intravenosa de inhibidores.

1)Tratamiento con anticuerpos monoclonales.

5 El efecto sobre la angiogénesis inducidas por factores de crecimiento con anticuerpos monoclonales inyectados por vía intravenosa en la preparación de CAM también se evaluó para su uso en la presente invención.

La preparación de las CAM de embrión de pollo para inyecciones intravenosas tenían esencialmente como se describe en el Ejemplo 7A algunas modificaciones. Durante los procedimientos de iluminación los vasos sanguíneos prominentes se seleccionaron y se hicieron marcas sobre las cáscara del huevo para indicar sus 10 posiciones. Los agujeros se taladraron en la cáscara y las CAM se cayeron y los papeles filtrantes saturados de AFGF se colocaron sobre las CAM como se ha descrito anteriormente. Las ventanas se sellaron con cinta estéril y los embriones se volvieron a colocar en la incubadora. 24 horas más tarde, se cortó cuidadosamente una segunda ventanita sobre el lateral de la cáscara de huevo directamente sobre los vasos sanguíneos prominentes previamente seleccionados. Se retiró cuidadosamente a cáscara de huevo exterior dejando intactas las 15 membranas embrionarias. La membrana de la cáscara se volvió transparente con una pecunia gota de aceite mineral (Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT) que permitió que los vasos sanguíneos se viesen fácilmente. Los mAb estériles, o los péptidos sintéticos, siendo descritos estos últimos más adelante, se inoculan directamente en los vasos sanguíneos una vez con una aguja de calibre 30 con una dosis de 200 ug de IgG por embrión en un volumen

total de 100 ul de PBS estéril. Las ventanas se sellaron con cinta y los embriones estuvieron incubándose durante 20 72 horas. Los discos filtrantes y los tejidos de CAM circundantes se analizaron tal como se ha descrito anteriormente.

Para determinar la localización de LM609 mAb en los tejidos de CAM o en tejidos tumorales, como se muestra en la presente memoria descriptiva y en los siguientes Ejemplos, que se inocularon previamente con LM609, se bloquearon las secciones con MSA al 2,5% en HBSS durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de la tinción

25 con una dilución al 1:250 de anticuerpo secundario marcado de rodamina antiratón de cabra (Tago). Las secciones se analizaron a continuación con un microscopio de componente de inmunofluorescencia Zeiss.

Los resultados del tratamiento intravenosos con anticuerpos de la preparación CAM de vasos sanguíneos inducida por AFGF se muestran en las figuras 10A-10C. En la figura 10A, se muestra la angiogénesis inducida como una resultado del tratamiento con AFGF. No se observó ningún cambio en la presencia de la vasculatura inducida por 30 AFGF con exposición intravenosa a mAb P3G2. , un anticuerpo anti-avA5 como se muestra en la figura 10B. En contrate con lo anterior, el tratamiento de la preparación CAM de angiogénesis inducida por AFGF con LM609, un anticuerpo anti-avA3, dio como resultado la completa inhibición del crecimiento de nuevos vasos en el área del filtro con se muestra en la figura 10C. El efecto inhibitorio sobre la angiogénesis es de este modo el resultado de la inhibición de la actividad de receptor de avA3 por el anticuerpo específico anti- avA3 LM609. Puesto que el bloqueo

35 de avA5 no inhibe la formación de neovasculatura en el lugar filtrante de las CAM, de este modo avA5 no es esencial, si se compara con avA3 para el crecimiento de nuevos vasos.

2)Tratamiento con péptidos sintéticos.

Los péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo 1 se inyectan de manera intravenosa por separado en los vasos sanguíneos inducidos por el factor de crecimiento en la preparación CAM como se describe anteriormente. El efecto 40 de los péptidos sobre la viabilidad de los vasos se evalúa de manera similar.

C. Inhibición de la angiogénesis embrionaria por aplicación tópica.

1)Tratamiento con anticuerpos monoclonales

Para determinar si avA3 participa en la angiogénesis embrionaria, el efecto de LM609 sobre nuevo crecimiento de los vasos sanguíneos sobre las CAMs se examinó en embriones de 6 días, una etapa marcada por la

45 neovascularización activa tal como se describe en el Ejemplo 5A. El ensayo de CAM se preparó como se describe en el Ejemplo 6C con la posterior aplicación tópica de discos saturados con mAb colocados sobre las CAM de los embriones de 6 días en ausencia de citoquinas. Después de 3 días, las CAM se resecaron y se fotografiaron. Cada experimento incluyó 6 embriones por grupo y se repitió 2 veces.

El anticuerpo LM609 (figura 11C), pero no CSAT (figura 11A) o P3G2 (figura 11B), previno el crecimiento vascular 50 en estas condiciones; esto indica que avA3 desempeña una función sustancial en la neovascularización embrionaria que es independiente de la adición de factores de crecimiento para la inducción de la angiogénesis.

2)Tratamiento con péptidos sintéticos Los péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo 1 se añaden a la preparación CAM embrionaria preparada anteriormente y como se describe en el Ejemplo 5A2) por aplicación tópica a la CAM o aplicación intravenosa a los vasos sanguíneos. El efecto de los péptidos sobre la viabilidad de los vasos se evalúa de manera similar.

D. Inhibición de la angiogénesis inducida por tumores por aplicación tópica

5 1)Tratamiento con anticuerpos monoclonales

Además de los ensayos de angiogénesis descritos anteriormente en los que se evaluaron los efectos de los antagonistas de avA3, LM609 y los péptidos 62181, 62184, 62185, 62187 y 62880, sobre la angiogénesis embrionaria, también se investigó la función de avA3 en la angiogénesis inducida por tumores. Como inductores, se usaron fragmentos de melanoma M21-L humano avA3 negativo previamente cultivados y aislados a partir de la

10 CAM de un embrión de pollo de 17 días. Los fragmentos se prepararon como se describe en el Ejemplo 6C.

Como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7A1), se aplicaron por separado mAb de manera tópica a los fragmentos de tumo con una concentración de 25 ug en 25 ul de HBSS y las ventanas se sellaron con cinta. Se añadieron mAb de nuevo de la misma manera a las 24 horas y a las 48 horas. Después de 72 horas, los tumores y los tejidos de CAM circundantes se analizaron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7A1).

15 Como se ha descrito en el Ejemplo 6C, los tumores se derivaron inicialmente transplantando células M21-L cultivadas, las cuales no expresan la integrina avA3, como se describe en Felding-Habermann et al., J. Clin. Invest., 89:2018 (1992) sobre las CAM de embriones de pollo de 10 días. Estos fragmentos negativos de avA3 indujeron la neovascularización extensiva en presencia de sólo tampón, o mAb CSAT (anti- A1) o P3G2 (anti- avA5) En contraste con lo anterior, mAb LM609 (anti- avA3) suprime la infiltración de la mayoría de los vasos en la masa tumoral y la

20 CAM circundante.

Para cuantificar el efecto de mAb sobre la angiogénesis inducida por tumores, los vasos sanguíneos que entran en el tumo en el interior del plano focal de la CAM se contaron bajo un microscopio estéreo por dos observadores en de una manera doble-ciego. Cada barra de datos presentada en la figura 12 representa el número medio de vasos ± SE de 12 CAM en cada grupo que representa experimentos duplicados.

25 Este análisis cuantitativo revela una reducción de tres veces en el número de vasos que entran en los tumores tratados con mAb LM609 comparado con los tumores tratados con tampón o los otros mAb, P3G2 o CSAT (P< 0,0001) como se determina por el en ensayo de suma de Wilcoxon Rank El hecho de que los tumores M21-L no expresen avA3 indica que mAb LM609 inhibe la angiogénesis afectando directamente los vasos sanguíneos en lugar de las células tumorales. Estos resultados corresponden a la distribución histológica de avA3 en las biopsias de

30 tejidos cancerosos mostradas en las Figuras 3A-3D donde la distribución de avA3 se limitó a los vasos sanguíneos en el tumor y no a las células tumorales en sí.

2)Tratamiento con péptidos sintéticos

Los péptidos sintéticos preparados en el Ejemplo 1 se aplican tópicamente al sistema de ensayo de CAM angiogénico inducido por tumores como se describe anteriormente. El efecto de los péptidos sobre la viabilidad de

35 los vasos se evalúa de manera similar.

E. Inhibición de la angiogénesis inducida por tumores por aplicación intravenosa.

1) Tratamiento con anticuerpos monoclonales

Los vasos sanguíneos inducidos por tumores preparados como se describe en el Ejemplo 7D1) también se trataron con mAb aplicados por inyección intravenosa. Los tumores se colocaron sobre las CAM como se describe en el 40 Ejemplo 7D1) y las ventanas se sellaron con cinta y 24 horas más tarde, se inocularon 200 ug de mAb purificados, una vez, de manera intravenosa en los vasos sanguíneos del embrión de polo como se ha descrito anteriormente. Los embriones de pollo se incubaron durante 7 días. El alcance de la angiogénesis se observó a continuación como se ha descrito anteriormente. Como se describe en el Ejemplo 8 más adelante, después de este periodo de tiempo, los tumores se resecaron y se analizaron por su peso para determinar el efecto de la exposición al anticuerpo

45 respecto del crecimiento o supresión del tumor.

2)Tratamiento con péptidos sintéticos

Se evaluaron también los efectos de la exposición a péptidos respecto de la vasculatura inducida por tumores en el sistema de ensayo CAM. La preparación de tumor-CAM se uso como se ha descrito anteriormente con la excepción de que en lugar de una inyección intravenosa de un mAb, se inyectaron por vía intravenosa por separado péptidos

50 sintéticos preparados como se describe en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 7A2), en vasos sanguíneos visibles.

Los resultados de los ensayos de CAM con el péptido cíclico, 66203 que contiene sal de HCl, y el péptido de control, 62186, se muestran en las figuras 9A-9C. En la figura 9A, el tratamiento con el péptido de control no afecta a los abundantes y grandes vasos sanguíneos que se indujeron por tratamiento con tumores para crecer en un área originalmente desprovista de vasos sanguíneos de la CAM. En contraste con lo anterior, cuando el péptido 5 RGD cíclico, 66203, un antagonista a avA3, se aplicó al filtro, la formación de vasos sanguíneos se inhibió dejando el área desprovista de nueva vasculatura como se muestra en la figura 9B. El efecto inhibitorio del péptido que contiene RGD fue específico y se localizo como se pone en evidencia por una ausencia de cualquier efecto deletéreo sobre los vasos adyacentes al emplazamiento del tumor. De este modo, en la figura 9C, cuando los péptidos inhibitorios se inyectan por vía intravenosa en el interior del sistema de ensayos de CAM, no se observó 10 ningún efecto sobre los vasos maduros preexistentes presentes en la CAM en las áreas adyacentes aunque distantes del emplazamiento del tumo. Los vasos preexistentes en este lugar no e vieron afectado por el péptido inhibitorio que fluía dentro de los vasos, aunque se inhibió la generación de nuevos vasos a partir de los vasos preexistentes en la masa tumoral. De este modo los péptidos sintéticos incluyendo 66203 y 62184, previamente mostrados en los ensayos de ligando-receptor en el Ejemplo 4 para ser antagonistas de avA3, no han demostrado

15 inhibir la angiogénesis que se limita a los vasos que experimentan un desarrollo y no a los vasos preexistentes maduros. Además, la infusión intravenosa de los péptidos no da como resultado ninguna citotoxicidad deletérea respecto del área circundante como se pone en evidencia por la vasculatura intacta en la Figura 9C.

Se realizan ensayos similares con los otros péptidos sintéticos preparados en El Ejemplo 1 y expuestos en la Tabla

1.

20 8. Inhibición del crecimiento de tejido tumoral con antagonistas avA3 como los medidos en el ensayo de CAM

Como se ha descrito en el Ejemplo 7D1, además de evaluar visualmente el efecto de los antagonistas de anti-avA3 sobre la angiogénesis inducida por factores de crecimiento o tumores, el efecto de los antagonistas también se evaluó midiendo cualquier cambio respecto de la masa tumoral que sigue a la exposición. Para este análisis, se preparó el sistema de ensayos de CAM de angiogénesis inducida por tumores como se describe en los Ejemplos

25 6C y 7D. Al final del periodo de 7 días de incubación, los tumores resultantes se resecaron a partir de las CAM y se cortaron permaneciendo libres de cualquier tejido residual de CAM, se lavaron con 1 ml de solución salina tamponada de fosfato y se determinaron los pesos húmedos para cada tumor.

Además, la preparación del tumor para el análisis histológico microscópico incluyó la fijación de los ejemplos representativas de los tumores en Fijador Bulins durante 8 horas y se inserto en parafina. Las secciones en serie

30 se cortaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para sus análisis. Gladson, et al., J. Clin. Invest., 88:1924 (1991). Las secciones se fotografiaron con un microscopio de compuestos Olympus de 250X.

A. Aplicación tópica

Los resultados de los pesos típicos de los tumores de melanoma humano (M21L) que dieron como resultado la aplicación típica del tampón de control (HBSS), P3G2 (anti- avA5) o LM609 (anti- avA3) se exponen en la Tabla 4. Se

35 evaluó una serie de embriones para cada tratamiento, siendo calculado el peso de tumor medio en miligramos (mg) junto con el SE de la media como se muestra en la parte baja de la tabla.

Tabla 4

Número de embrión (mg): Tratamiento con mAb Peso de tumor

1 2 3 4 5 6 1: HBSS P3G2 108 152 216 270 109 174 134

(continuación)

2: 144

3: 408

4: 157

5: 198

6: 102

7: 124

8: 99

1: LM609 24

2: 135

3: 17

4: 27

5: 35

6: 68

7: 48

8: 59

Control de HBSS P3G2 LM609: 172 ± 26 171 ± 36 52 ± 13

La exposición de una masa tumoral de melanoma humano de avA3 negativo en el sistema de ensayo CAM a LM609 causó la reducción del peso medio de tumor sin tratar de 172 mg ± 26 a 52 mg ± 13. El anticuerpo P3G2 no tuvo ningún efecto sobre la masa tumoral. De este modo, el bloqueo del receptor de avA3 por la aplicación tópica del

5 anticuerpo LM609 específico de avA3 dio como resultado una regresión de la masa tumoral junto con una inhibición de la angiogénesis como se muestra en los Ejemplos anteriores. El diámetro medido de la masa tumoral resultante de la exposición a P3G2 era aproximadamente de 8 milímetros a 1 centímetro de media. En contraste con lo anterior, los tumores tratados con LM609 eran de media de 2 a 3 milímetros de diámetro.

Las secciones congeladas de los tumores revelaron una citoarquitectura tumoral intacta para el tumor expuesto a

10 P3G2 en contraste con una carencia de estructura celular organizada en el tumor expuesto a LM609. La actividad del receptor de avA3 es por lo tanto esencial para que un tumor de avA3 negativo mantenga su masa alimentada por el desarrollo de la neovasculatura de expresión de avA3. El bloqueo de avA3 con los antagonistas de avA3 de la invención da como resultado la inhibición de la angiogénesis en el tumor que finalmente da como resultado la reducción de la masa tumoral.

15 B. Aplicación intravenosa

Los resultados de los pesos típicos de los tumores de carcinoma (UCLAP-3) que resultan de la aplicación intravenosa de tampón control (PBS, solución salina tamponada de fosfato), CSAT (anti- A1) o LNM609 (anti-avA3) se exponen en la Tabla 5. Se evaluó una serie de embriones para cada tratamiento, siendo calculado el peso de tumor medio junto con el SE de la media como se muestra en la parte baja de la tabla.

20 Tabla 5

Número de embrión (mg): Tratamiento con mAb Peso de tumor

(continuación)

1: PBS 101

2: 80

3: 67

4: 90

1: CSAT 151

2: 92

3: 168

4: 61

5: 70

1: LM609 16

2: 54

3: 30

4: 20

5: 37

6: 39

7: 12

Control de PBS 85 ± 7 CSAT 108 ± 22 LM609 30 ± 6

La exposición de una masa tumoral de carcinoma humano de avA3 negativo en el sistema de ensayo CAM a LM609 causó la reducción del peso medio de tumor sin tratar de 85 mg ± 7 a 30 mg ± 6. El anticuerpo CSAT no tuvo un efecto significativo sobre el peso de la masa tumoral. De este modo, el bloqueo del receptor de avA3 por la

5 aplicación intravenosa del anticuerpo LM609 específico de avA3 dio como resultado una regresión de un carcinoma como ocurrió con la masa tumoral del melanoma anteriormente junto con una inhibición de la angiogénesis como se muestra en los Ejemplos anteriores. Además el crecimiento tumoral del melanoma humano se inhibió de manera similar por la inyección intravenosa de LM609.

9. Regresión del crecimiento de tejido tumoral con antagonistas de avA3 como se ha medido en el ensayo de CAM

10 Para evaluar los efectos de los antagonistas de avA3 sobre el crecimiento y la supervivencia tumoral ,se colocaron fragmentos de melanoma humano y fragmentos de carcinomas del pulmón, páncreas y laringe sobre las CAM de embriones de 10 días como se describe en el Ejemplo 5A

A. Aplicación intravenosa

1) Tratamiento con anticuerpos monoclonales

15 a) Tratamiento con LM609 (anti-avA3) y CSAT (anti-A1)

Veinte horas después de la implantación de la CAM con los fragmentos de carcinoma de melanoma humano de avA3 negativo M21-L, o el carcinoma pancreático FG, el carcinoma de pulmón humano UCLAP-3, o el carcinoma de laringe humano Hep3, se inyectó a los embriones PBS solo o una única dosis (300 ug/100 ul) de mAb LM609 (antiavA3) o CSAT (anti-A1). Los tumores se propagaron durante seis días más. Al final del periodo de incubación los tumores se resecaron cuidadosamente y se cortaron libre de tejido CAM circundante. Las resecciones de los tumores se realizaron por dos investigadores independientes retirando sólo la masa tumoral sólida fácilmente

5 definible. Los tumores tenían márgenes bien definidos, de este modo, la membrana semitransparente y fina (CAM) que se puede distinguir fácilmente a partir de la masa tumoral sólida se retiró sin alterar la propia masa tumoral. Los tumores resecados se pesaron y se examinaron morfológicamente e histológicamente.

Como se muestra en la figura 13, los pesos húmedos de los tumores al final de los 7 días se determinaron y se compararon con los pesos iniciales de los tumores antes de los tratamientos. Cada barra representa el ± SE. 10 medio de 5-10 tumores por grupo. mAb LM609 inhibió significativamente el crecimiento tumoral(p < 0,001) comparado con los controles en todos los tumores sometidos a ensayo. Los tumores tratados con PBS o CSAT proliferaron en todos los casos. Por el contrario, mAb LM609 no solo previene el crecimiento de estos tumores sino que inducen la regresión extensiva en la mayoría de los casos. Es importante, resaltar que estas células tumorales no expresan la integrina avA3 que demuestra que la inhibición del crecimiento se debió a los efectos anti

15 angiogénicos de este anticuerpo sobre la neovasculatura en lugar de darse directamente sobre las células tumorales.

b) Tratamiento con LM609 (anti-avA3) y P3G2 (anti- avA5)

Los fragmentos tumorales de melanoma M21-L humano (50 mg) se implantaron sobre las CAM de embriones de 10 días como se describe en el Ejemplo 5A. Veinte horas más tarde, se inyectó por vía intravenosa en los embriones

20 PBS solo o una única dosis (300 ug/100 ul) de mAb LM609 (anti-avA3) o P3G2 (anti- avA5). Se dejó que lo tumores se propagasen como se describe en el Ejemplo 9A1) anterior y se examinaron morfológicamente e histológicamente como se describe en la presente memoria descriptiva.

Los ejemplos representativos de los tumores M21-L tratados con mAb P3G2 (anti-avA5) o LM609 (anti-avA3) se examinaron morfológicamente. Los tumores tratados con P3G2 eran grandes (8 mm de diámetro) y bien

25 vascularizados mientras que los tratados con mAb LM609 eran más pequeños (3 mm de diámetro) y carecían de vasos sanguíneos detectables.

Los tumores se examinaron, además, mediante la preparación de las secciones histológicas y la tinción con hematoxilina y eosina como se describe en el Ejemplo 9A1)a. Como se muestra en la figura 14 (panel superior), los tumores tratados con mAb P3G2 (anti-avA5) mostraron numerosas células tumorales viables y en división activa

30 como lo indican las figuras mitóticas (puntas de flecha) así como los múltiples vasos sanguíneos (flechas) a través de todo el estroma tumoral. En contraste con lo anterior, no se detectó ninguna o si acaso muy pocas células tumorales viables ni vasos sanguíneos en los tumores tratados con el mAb LM609 (anti-avA3) (figura 14, panel inferior) Los resultados demuestran que los antagonistas de la integrina avA3 inhiben la angiogénesis inducida por tumores, lo que conduce al cese del crecimiento y a la regresión de una diversidad de tumores humanos in vivo.

35 Es importante destacar que los embriones examinados después de siete días de crecimiento tumoral (embrión de 17 días) parecían normales a simple vista, fueran tratados o no con un antagonista de avA3. Estos descubrimientos indican que los antagonistas de esta integrina parecen no ser tóxicos para los embriones en desarrollo.

2) Tratamiento con péptidos sintéticos

Los fragmentos tumorales del melanoma M21-L humano (50 mg) implantaron sobre las CAM de embriones de 10

40 días como se describe en el Ejemplo 5A. 24 horas más tarde, los embriones recibieron una única inyección intravenosa de 300 ug/100 ul de ciclo-RADfV (69601) y/o ciclo-RGDfV (66203). Después de un total de 72 horas, se extrajeron los tumores, se examinaron morfológicamente y se fotografiaron con un microscopio estéreo como se describe en el Ejemplo 9A1).

Los paneles de las figuras 15A a 15E corresponden a lo siguiente: la figura 15A corresponde a muestras duplicadas

45 tratadas con el péptido ciclo-RADfV (69601); la figura 15B corresponde a muestras duplicadas tratadas con el péptido ciclo-RGDfV (66203); la figura 15C , el tejido de CAM adyacente tomado de los mismos embriones tratados con el péptido ciclo-RGDfV (66203) y las figuras 15D y 15E, corresponden a una gran ampliación (13x) de los rumores tratados con péptidos. La figura 15D representa vasos sanguíneos normales del tumor tratado con el péptido de control (69601). La figura 15E representa ejemplos de vasos sanguíneos interrumpidos de tumores

50 (flechas) tratados con el péptido ciclo-RGDfV (66203).

Los resultados muestran que sólo el péptido 66203 inhibe la formación de vasos y que, además, los vasos del tejido de CAM adyacente al tumor no estaban afectados.

10. Regresión del crecimiento de tejido tumoral con antagonistas de avA3 medido por el ensayo del modelo de ojo de conejo in vivo

El efecto de los antagonistas anti-avA3 sobre la angiogénesis inducida por los factores de crecimiento se puede observar en estructuras transparente de forma natural como se demuestra en los ejemplos de la córnea del ojo. Los nuevos vasos sanguíneos crecen a partir del borde de la córnea, que tiene una rica alimentación en sangre, hacia el centro de la córnea, que normalmente no tiene alimentación sanguínea. Los estimuladores de la angiogénesis, tal 5 como AFGF, cuando se aplican a la córnea inducen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos desde el borde de la córnea. Los antagonistas de la angiogénesis, aplicados a la córnea, inhiben el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos desde el borde de la córnea. De este modo, la córnea experimenta angiogénesis a través de una invasión de células indoteliales desde el borde de la córnea dentro del tejido corneal recubierto de colágeno duro que es fácilmente visible. El ensayo del modelo del ojo de conejo proporciona por lo tanto un modelo in vivo para la

10 observación directa de la estimulación y de la inhibición de la angiogénesis que sigue a la implantación de los compuestos directamente dentro de la córnea del ojo.

A. Ensayo del modelo de ojo de conejo in vivo

1) Angiogénesis inducida por factores de crecimiento

La angiogénesis se indujo en el ensayo del modelo de ojo de conejo in vivo con el factor de crecimiento AFGF y se 15 describe a continuación.

a. Preparación de sedimentos Hydron que contienen el factor de crecimiento y anticuerpos monoclonales.

Los sedimentos de polímero Hydron que contienen factor de crecimiento y mAb se prepararon como lo describe D’AMATO, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:4082-4085 (1994). Los sedimentos individuales contenían 650 ng del factor de crecimiento AFGF unido a sucralfato (Carafet, Marion Merrell DOW Corporation) para estabilizar el FGFA y

20 garantizar su liberación lenta en el tejido circundante. Además, los sedimento de hydron se prepararon conteniendo 40 µg de mAb LM609 (anti- avA3) o mAb P1F6 (anti-avA5) en PBS. Los sedimentos se fundieron en clavijas de Teflón especialmente preparadas que tiene un núcleo de 2,5 mm perforado en sus superficies. Se colocó aproximadamente 12 µl de material de fusión en cada espiga y se polimerizo durante una noche en una campana estéril. A continuación, se esterilizaron los sedimentos por radiación ultravioleta.

25 b. Tratamiento con anticuerpos monoclonales

Cada experimento consistió en tres conejos en los que un ojo recibió un sediento que comprendía AFGF y LM609 y el otro ojo recibió un sedimento que comprendía AFGF y un mAb P1F6 (anti-avA5) de ratón. El uso del ensayo de ojos emparejados para comparar LM609 (anti-avA3) con otros controles mAb y PBs proporciona un medio de ensayo riguroso para demostrar las diferencias significativas entre los mAb ensayados.

30 El mAb P1F6 inmunorreacciona con la integrina avA5 que se encuentra sobre la superficie de las células endoteliales vasculares pero no es presumible que no esté implicado en la angiogénesis. Para determinar si el mAb P1F6 estuvo implicado en la angiogénesis, se prepararon sedimentos que contenían únicamente este mAb y se ensayó como se describe más adelante para confirmar que el mAb no inducía la angiogénesis.

Todos los mAb ensayados se purificaron a partir de fluido de ascites que usan la cromatografía de columna de

35 afinidad Proteína- Sefarosa A CL-4B según procedimientos bien conocidos. La inmunoglobulina eluida se sometió a continuación a diálisis contra PBS y se trató con gel Detoxi (Pierce Chemicals) para eliminar la endotoxina. Se ha demostrado que la endotoxina es una potente estimulante angiogénico e inflamatorio. Se ensayaron por lo tanto, mAb para detectar la presencia de endotoxina con el ensayo de lisado de amebocito de simulo cromogénico (Bio-Whittaker) y se usaron únicamente los mAb sin endotoxina detectable en el ensayo de modelo de ojo de conejo.

40 Se insertó un sedimento de hydron que comprende AFGF y mAb LM609 (anti-avA3) o P1F6 (avA5) en una bolsa corneal formada en el ojo de los conejos. El sedimento de hydron también contenía sucrafalto para estabilizar e AFGF durante el ensayo. Se implantaron sedimentos individuales en “bolsas” creadas quirúrgicamente en el estroma medio de la córnea de los conejos. El procedimiento quirúrgico se hizo con una técnica estéril usando un microscopio de operación Wild modelo M691 equipado con un separador de haces al cual se montó una cámara

45 para grabar fotográficamente las córneas individuales. Se creó una “bolsa” de 3 mm por 5 mm en el estroma corneal haciendo una incisión de 3 mm en la mitad del espesor corneal con una cuchilla 69 Beaver. El estroma se sometió a disección periférica usando una espátula de iris y el sedimento se implanto con su margen periférico a 2 mm del limbo.

Durante los siguientes 14 días, el AFG y el mAb se difundieron a partir del sedimento implantado en el tejido 50 circundante y por lo tanto se efectuó la angiogénesis desde el borde de la córnea.

Los resultados representativos de cada tratamiento se muestran e las figuras 16A a 16E. La cantidad de vasos presentes se cuantifica y se describe en término de horas de reloj que se definen como sigue. El ojo se divide en 12 secciones iguales de la misma manera que un reloj se divide en horas. “Una hora de reloj de vasos” se refiere a la cantidad de vasos que llenan un área del ojo equivalente a una hora en un reloj. Los cinco conejos que recibieron sólo AFGF exhiben angiogénesis florida en la que los nuevos vasos sanguíneos han crecido desde el borde de la córnea hacia el centro de la córnea, que normalmente no tiene vasos sanguíneos. Uno de los conejos tenía sólo 1 hora de reloj de vasos al sedimento. Dos de los conejos que recibieron tanto AFGF como LM609 no tenían en

5 absoluto angiogénesis detectable hasta 14 días después de la cirugía. Uno de los conejos tuvo 3 focos de vasos hemorrágicos en ciernes después del día 14. Dos de los conejos que recibieron AFGF y mAb P3G2 (anti-avA5) mostraron una vascularización extensiva en la que habían crecido nuevos vasos sanguíneos desde el borde de la córnea hacia el centro de la córnea. Una Uno de estos conejos sólo tenía 1 a 2 horas de vasos al sedimento.

Como se puso de manifiesto en el ensayo del modelo del ojo de conejo, no se observó ningún efecto angiogénico

10 sobre los vasos paralimbales en presencia del factor de crecimiento AFGF en los conejos que recibieron mAb LM609 (anti-avA3). En contraste con lo anterior, se observó angiogénesis en los vasos paralimbales en presencia del factor de crecimiento AFGF en los conejos que recibieron mAb P3G2 (anti- avA5). La total inhibición de la angiogénesis corneal por mAb LM609 es sustancialmente mayor que con cualquier reactivo anti-angiogénico previamente mencionado.

15 11. Regresión del crecimiento de tejido tumoral in vivo con los antagonistas de avA3 medida por el ensayo de ratón quimérico: ensayo de seres humanos

En un modelo de ratón quimérico:ser humano in vivo se generó por sustitución de una parte de la piel de un ratón SCID con prepucio neonatal humano (figura 17). Después de realizar el injerto de piel, el prepucio humano se inoculó con células de carcinoma. Después de establecer un tumor medible, se inyectó mAb LM609 (anti-avA3) o

20 PSB en la vena de la cola del ratón. Después de un periodo de 2-3 semanas, el tumor se extirpó y se analizó desde el punto de vista del peso y de la histología.

A. Ensayo ratón quimérico : ensayo de seres humanos

El modelo ratón quimérico: ser humano in vivo se prepara esencialmente como se describe en Yan, et al., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993). En breve, se retiró quirúrgicamente un área cuadrada de 2 cm2 de piel de un ratón SCID 25 (de 6 – 8 semanas) y se sustituyó con un prepucio humano. El ratón se anestesió y se retiro el vello de un área de 5 cm2 de cada lado de la región abdominal lateral rasurándolo. Se prepararon dos capas de injerto circulares de 2 cm2 retirando todo el espesor de la piel hacia abajo hacia la fascia . Todo el espesor de los injertos de piel humana del mismo tamaño derivados de prepucio neonatal humano se colocó sobre loa capas heridas y suturadas in situ. El injerto se cubrió con una tirita que se suturó a la piel. También se aplicó una tira de tejido microporoso para

30 cubrir la herida.

La línea celular de melanoma humano M21L o la línea celular de carcinoma de mama MDA 23.1 (ATTC HTB 26; avA3 negativo por inmunorrreactividad de las secciones de tejido con mAb LM609), donde se usaron para formar los tumores humanos sólidos sobre los injertos de piel humana sobre los ratones SCID. Una única suspensión de células de 5 x 106 de células M21-L o MDA23.1 se inyectó de manera intradérmica en el injerto de piel humana. A

35 continuación se observaron los ratones durante 2 a 4 semanas para permitir un crecimiento de los tumores humanaos medibles.

B.Aplicación intravenosa

1)Tratamiento con anticuerpos monoclonales

Después del creciiento de tumores medibles, los ratones SCID, a los que se había inyectado células tumorales

40 M21L, se les inyectó por vía intravenosa en la vena de la cola 250 µg de mAb LM609 (anti- avA3) o PSB dos veces por semana durante 2 a 3 semanas. Después de este periodo de tiempo, los tumores se resecaron a partir de la piel y se cortaron libres de tejido circundante. Se evaluaron diversos ratones para cada tratamiento, calculándose el peso medio del tumor de cada tratamiento y siendo mostrados en la parte inferior de la Tabla 6.

Tabla 6

Número de Tumor M21L: Tratamiento Peso del Tumor (mg)

1: PBS 158

2: 192

3: 216

(continuación)

4 5 6 7 8 9 10 11: LM609 227 195 42 82 48 37 100 172

Tratamiento: Peso medio del tumor (mg)

PBS LM609: 198 113

La exposición de la masa tumoral del carcinoma humano avA3 negativo en el sistema de ensayo quimérico ratón:ser humano respecto de LM609 (anti- avA3) produjo la reducción de le peso medio de los tumores tratados con PBS de 198 a 113 mg.

5 Los ejemplos representativos de los tumores M21L tratados con el mAb LM609 (anti- avA3) y PBS se examinaron morfológicamente. Los tumores tratados con PBS era grandes (8 a 10 mm de diámetro) y bien vascularizados, mientras que los tratados con mAb LM609 (anti- avA3) eran mucho más pequeños (3 a 4 mm de diámetro) y carecían de vasos sanguíneos detectables.

Los tumores formados en los injertos de piel que se han inyectado con células MDA 23.1 se pudieron detectar y

10 medir. El estudio morfológico de los tumores establecidos reveló que se había producido la neovascularización del tejido humano injertado en las células tumorales MDA 23.1.

De este modo, el bloqueo del receptor de avA3 por la aplicación intravenosa de un anticuerpo LM609 específico de avA3 dio como resultado una regresión de un carcinoma en este sistema modelos de la misma manera que los ensayos de modelos de la CAM y del ojo de conejo como se ha descrito en los Ejemplos 9 y 10, respectivamente.

15 12.Estimulación de las células vasculares para introducir el ciclo celular y experimentar la apoptosis en presencia de los antagonistas de la integrina avA3 medida en los ensayos de CAM

El proceso angiogénico depende claramente de la capacidad de las citoquinas tales como AFGF y VEGF para estimular la proliferación de las células vasculares. Mignatti et al., J. Cell. Biochem., 471:201 (1991); Takeshita et al., J. clin. Invest., 93:662 (1994); y Koyama et al., J. Cell. Physiol., 158 :1 (1994). Sin embargo, también es evidente

20 que los casos de señalización pueden regular la diferenciación de las células vasculares en los vasos sanguíneos maduros. De este modo, se puede concebir que la interferencia con las señales relacionadas con el crecimiento o la diferenciación de las células vasculares que experimentan un nuevo creciiento o angiogénesis puede dar como resultado la perturbación de la angiogénesis.

Se ha demostrado que los casos de unión de integrinas participan tanto en la proliferación celular como en la

25 apoptosis o la muerte celular programada in vitro. Schartz, Cancer Res. 51:1503 (1993); Meredith et al., Mol. Biol.. Cell., 4:953 (1993);: Frisch et al., J. Cell. Biol., 124:619 (1994); y Ruoslahti et al.,, Cell, 77:477 (1994). El estudio minucioso de los efectos de los antagonistas de avA3 sobres la angiogénesis revela la presencia de vasos sanguíneos asociados a tumores interrumpidos y discontinuos. Por lo tanto, es posible que la pérdida de la continuidad de los vasos sanguíneos se pueda deber a la apoptosis o necrosis selectiva de las células vasculares.

30 Para explorar esta posibilidad, Las CAM se estudiaron después de la inducción de la angiogénesis con el factor de crecimiento AFGF y el tratamiento con los péptidos mAb y cíclicos de la presente invención.

A.Tratamiento con anticuerpos monoclonales La apoptosis se puede detectar por una diversidad de procedimientos que incluyen el estudio directo del ADN aislado del tejido para detectar la fragmentación del ADN y la detección de 3’OH en tejido intacto con un anticuerpo que detecta específicamente grupos 3’OH libres de ADN fragmentado.

1) Análisis de fragmentación de ADN

5 La angiogénesis se indujo colocando discos filtrantes saturados con avA3 con AFGF sobre las CAM de embriones de 10 días descrito en el Ejemplo 6A. Los análisis inmunohistológicos de las CAM con LM609 (anti-avA3) revelararon una expresión de pico de avA3 sobre los vasos sanguíneos 12 a 24 horas después del inicio de la angiogénesis con AFGF. De este modo, 24 horas después de la estimulación con AFGF, los embriones se inocularon por vía intravenosa con 100 µl de PBS solo o PBS que contenía 300 µg de mAb CSAT (anti-A1) o LM609 (anti-avA3).

10 La fragmentación del ADN se detectó resecando el tejido de la CAM directamente por debajo de los discos filtrantes saturados de AFGF 24 horas o 48 horas después de las inoculaciones intravenosas con mAb LM609 (anti-avA3), CSAT (anti-A1), o PBS. Los tejidos de CAM resecados se lavaron tres veces con PBS estéril y finalmente se cortaron finos y se volvieron a suspender en colagenasa bacteriana al 0,25% (Worthington Biochemical; Freehold, NJ) y se incubaron durante 90 minutos a 37ºC con agitación de torbellino ocasional. El ADN se extrajo de números

15 iguales de células deCAM a partir de una única suspensión celular como se ha descrito anteriormente. Bisonette, et al., Nature, 359:552 (1992). En breve, los números iguales de células de CAM se lisiaron en 10 mM de tris-Cl, de pH 8,0, 10 mM de EDTA en Triton X100 al 0,5% (v/v) (Sigma, St Louis, MO). Los lisados celulares se centrifugaron a

16.000 vueltas durante 15 minutos a 4ºC para separar el ADN fragmentados soluble del sedimento de cromatina intacto. El ADN fragmentado se lavó, se precipitó y se analizó sobre gel de agarosa al 1,2% (p/v)..

20 El ADN fragmentado soluble se aisló partir de un número igual de células de CAM a partir de cada tratamiento, se separó por electroforesis sobre un gel de goma arábiga y se observó tiñendo con bromuro de etidio. No se detectó ninguna diferencia en la cantidad relativa de la fragmentación de ADN resultante de los tres tratamientos diferentes 24 horas después del tratamiento. Sin embargo, 48 horas después del tratamientos con mAb LM609 (anti-avA3) se observó un aumento significativo en la fragmentación del ADN comparado con los embriones tratados con mAb

25 CSAT (anti-A1) o PBS solo.

2) Estimulación de las células vasculares para introducir el ciclo celular

Para estudiar experimentalmente la función de avA3 en estos procesos, las células derivadas de CAM tratadas con

o sin AFGF se tiñeron con yoduro de propidio y se hicieron inmunorreaccionar con mAb LM609 (anti- avA3).

Las CAM aisladas de los embriones 24 y 48 horas después del tratamiento con mAb LM609 (anti-avA3), CSAT (anti

30 A1), o PBS se disociaron en suspensiones de células simples por incubación con colagenasa bacteriana como se ha descrito anteriormente. A continuación, as células simples se permeabilizaron y se tiñeron con un Kit de detección in situ de Apop Tag según las instrucciones del fabricante (Oncor, Gaitherburg, MD). Apop Gag es un anticuerpo que detecta específicamente los grupos 3’OH libres de ADN fragmentado. La detección de dichos grupos 30OH libres es un procedimiento establecido para la detección de células apópticas. Gavrieli et al., J. Cell.

35 Biol.., 119: 493 (1992).

A continuación, las células teñidas con Apop Tag se aclararon en Triton X-100 al 0,1% (v/v) en PBS y se volvieron a suspender en tampón FACS que contiene BSA al 0,5% (p/v),, azida de sodio al 0,02% (p/v) y 200 µg/ml de Rnasa A en PBS. Las células se incubaron durante una hora y media, se lavaron y se analizaron por clasificación celular activada por fluorescencia. La fluorescencia celular se midió usando un citómetro de flujo FACSan y los datos se

40 analizaron como se describe más adelante.

La fluorescencia celular se midió con un citómetro de flujo GACScan (Vetcon Dickinson, Mountain View, CA). Se determinó la dispersión lateral (SSC) y la dispersión delantera (FSC) simultáneamente y se recocieron todos los datos con un ordenador Hewlet Packard (HP9000) equipado con un software de investigación FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Los datos se analizaron con la versión I del software P.C. Lysis (Becton Dickinson,

45 Mountain View, CA). Se establecieron barreras de control negativo usando suspensiones de células sin la adición de anticuerpos primarios del kit de Apop Tag. Se aplicaron barreras idénticas a ambas poblaciones celulares que dieron como resultado el análisis de aproximadamente 8.000 células por diferente tratamiento celular.

El porcentaje de células simples derivadas de las CAM tratadas con mAb y teñidas con Apop Tag como se ha determinado por el análisis FACS se muestra en la figura 18. La barra negra representa las células de embriones

50 tratadas 24 horas antes del análisis. La barra punteada representa células de embriones tratadas 48 horas antes del análisis. Cada barra representa el ± E.T medio de tres réplicas.

Como se muestra en la figura 18, las CAM tratadas dos días antes con mAb LM609 (anti- avA3) mostraron un aumento de 3 a 4 veces en el teñido con Apop Tag comparado con las CAM tratadas con PBS solo o CSAT (anti-A1).

B.Tratamiento con péptidos sintéticos

Los ensayos de CAM con angiogénesis inducida por factores de creciiento, como se describe en el Ejemplo 6A, también se levaron a cabo con los péptidos sintéticos de la invención para determinar el efecto de los péptidos cíclicos sobre la apoptosis. Los péptidos ciclo-RGDfV (66203) y Ciclo-RADfV (69601) se prepararon como se

5 describe en el Ejemplo 1. Se inyectaron las soluciones de péptidos o PBS en la preparación de CAM con una concentración de 300 µg(ml. A las 24 y 48 horas, el papel filtrante y el tejido de CAM circundante se disecciono y se tiño con Apop Tag para detectar la apoptosis como se describe anteriormente en el Ejemplo 12A2).

Como se muestra en la figura 18, Las CAM tratadas dos días antes don el péptido 69203 (ciclo-RGDfV) mostró un aumento de 3 a 4 veces superior en la tinción de Apop Tag comparado con las CAM tratadas con PBS solo o el

10 péptido cíclico de control 69601 (ciclo-RADfV).

C. Efecto del tratamiento con anticuerpos monoclonales sobre la apoptosis en el ciclo celular

Las suspensiones de células simples se estudiaron para el número de copias de ADN cromosómico tiñendo con yoduro de propidio para determinar el efecto del tratamiento con anticuerpos monoclonales sobre el ciclo celular y para la apoptosis tiñendo con Apop Tag.

15 Las suspensiones de células simples de CAM tratadas 24 o 48 horas antes con mAb LM609 (anti-avA3) o CSAT (anti-A1) o PBS se prepararon como se describe en el Ejemplo 12A1).

Para teñir las células con Apop Tag, las suspensiones celulares se lavaron tres veces con tampón que contenía BSA al 2,5% (p/v) y azida de sodio al 0,25% (p/v) en PBS. A continuación, las células se fijaron en paraformaldehído al 1% (p/s) en PBS durante 15 minutos seguido de tres lavados como se ha descrito

20 anteriormente. Para prevenir la unión no específica, las suspensiones de células simples se bloquearon con BSA al 5% (p/v) en PBS durante una noche a 4ºC. A continuación, las células se lavaron como antes, se tiñeron con Apop Tag, y se midió la fluorescencia celular con un TACScan como el descrito anteriormente en el Ejemplo 12A.

Las células de cada condición experimental se tiñeron con yoduro de propidio (Sigma, St Louis, MO) con una proporción de 10 µg en PBS durante una hora, se lavaron dos veces con PBS, y se analizaron para las

25 características nucleares típicas de la apoptosis, incluyendo la segmentación y condensación de cromatina. El porcentaje de las células apópticas se estimó por el análisis morfológico de la células a partir de al menos 10 a 15 campos microscópicos aleatoriamente seleccionados.

Se proporcionan los resultados combinados de las suspensiones de células simples de CAM de los embriones tratados con CSAT (anti-A1) o LM609 (anti-avA3), teñidas con Apop Tag y yoduro de propidio, y analizadas por

30 FACS , en la figura 19. El eje Y representa la tinción con ApopTag (apoptosis), el eje X representa la tinción con yoduro de propidio (contenido de ADN). La línea horizontal representa la barrera negativa para la tinción con Apop Tag. Los paneles de la izquierda y de la derecha indican las células de CAM de embriones tratados con CSAT y LM609, respectivamente. El análisis del ciclo celular se llevó a cabo por el análisis de aproximadamente 8.000 casos por condición y los datos se representaron en un recuadro de contorno.

35 Las muestras de las células simples obtenidas con el tinte de ADN el yoduro de propidio revelaron que entre el 25 y el 30% de las células de CAM tratadas con LM609 (anti-avA3) 48 horas después del tratamiento evidenciaron una segmentación y/o condensación nuclear. Estos procesos son característicos de las células que experimentan apoptosis. Esto está en contraste con las CAM tratadas con CSAT (anti-A1) donde entre el 90 y el 95 de las células mostraron un teñido nuclear normal.

40 Como se muestra en la figura 19, consecuentemente con la inducción de la apoptosis por LM609, se observó un número significativo de células en un pico que contenía menos de una copia de ADN (AO). Se mostró previamente este pico para representar el ADN fragmentado en las células apópticas de la última etapa. Telford et al., Cytometry,

13:137 (1992). Además, estas células de AO se tiñen fácilmente con Apop Tag que confirma la capacidad de este reactivo para detectar las células apópticas. Sin embargo, además de la tinción de las células de AO, también se

45 tiño con Apop Tag (figura 19) un número significativo de células que contenían más de una copia de ADN. Los resultados demuestran que LM609 tiene la capacidad de promover la apoptosis entre las células vasculares que ya se han introducido en el ciclo celular. Encontraste con lo anterior, las células derivadas de las CAM de control que se han introducido en el ciclo celular mostraron un teñido con Apop Tag mínimo consecuentemente con las pocas células apópticas detectadas en las CAM tratadas de control

50 Entre esas células en las CAM estimuladas con AFGF que se había introducido en el ciclo celular (fase S y G2/M), el 70% mostró un teñido positivo con LM609 (anti-avA3). Esto se comparó con el tenido con LM609 al 10% observado entre las células cicladas de las CAM no tratadas con AFGF. Estos descubrimientos indican que después de la estimulación por AFGF, la mayoría de las células que llevan avA3 muestran una proliferación activa.

Tomados juntos estos descubrimientos indican que la inyección intravenosa de mAb LM609 o del péptido cíclico antagonista de avA3 promueven la apoptosis dentro de la CAM de pollo después de la inducción de la angiogénesis.

Las CAM también se estudiaron histológicamente para la expresión de avA3 por inmunorreactividad con LM609 y para las células que se sometieron a apoptosis por inmunorreactividad con Apop Tag. Las secciones de CAM 5 resecadas de los embriones tratados 48 horas antes con LM609 (anti-avA3), CSAT (anti-A1), o PBS preparadas en el Ejemplo 5A se lavaron, insertaron en OTC (Baxter) y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Se cortaron secciones de seis micrómetros de Tejido de CAM, se fijaron en acetona durante 30 segundos, y se guardaron a -70ºC hasta su uso. Las secciones de tejido se prepararon para la tinción mediante un breve aclarado en etanol al 70% (v/v) (EtOH=) seguido de tres lavados en PBS. A continuación, las secciones se bloquearon con

10 BSAA al 5% (p/v) en PBS durante 2 horas, seguido de la incubación con 10µg/ml de mAb LM609 durante 2 horas. A continuación, las secciones se lavaron y se incubaron con una dilución al 1:50 de rodamina IgG antiratón de cabra conjugado de rodamina (Fischer Scientific Pittsburg, PA) durante 2 horas. Finalmente, las mismas secciones se lavaron y se tiñeron con el Apop Tag como se describe en el Ejemplo 12A2). Las secciones de tejido teñido se montaron y analizaron por microscopía inmunofluorescente confocal.

15 En la figura 20, los paneles A a C representan tejido de CAM de embriones tratados con CSAT (anti-A1) y los paneles D a F representan el tejido de CAM de embriones tratados con LM609 (anti-avA3). Los paneles Am y D representan los tejidos teñidos con Apop Tag y se observan mediante fluorescencia (FITC) superpuesta sobre una imagen DIC. Los paneles B y E representan los mismos tejidos teñidos con mAb LM609 (anti-avA3) y se observan por fluorescencia (rodamina). Los paneles C y F representan imágenes fundidas de los mismos tejidos teñidos

20 tanto con Apop Tag como con LM609 donde la tinción de color amarillo representa la colocalización. La barra representa 15 y 50 µm en los paneles de la izquierda y de la derecha, respectivamente.

Como se muestra en la figura 20 (A-C), después de la inyección intravenosa del control de CSAT o PBS, la tinción con Apop Tag parecía mínimo o aleatorio, indicando un nivel mínimo de apoptosis en el tejido. Encontraste con lo anterior, las CAM de los embriones previamente tratados con LM609 o péptido cíclico 203 mostró una mayoría de 25 los vasos teñidos intensamente con Apop Tag mientras que se observó una mínima reactividad entre las células no vasculares circundantes (figura 20 D-F). Además cuando se usaron tanto Apop Tag como LM609 para teñir estos tejidos (19C y 19F) se observó una colocalización significativa sólo entre los marcadores en las CAM derivadas de los embriones tratados con antagonistas de avA3 (figura 20F). Estos descubrimientos demuestran que después de la inducción de la angiogénesis in vivo, los inhibidores de la integrina avA3 promueven selectivamente la apoptosis de

30 los vasos sanguíneos que llevan avA3.

Mientras que la angiogénesis es un proceso complejo que implica muchos casos biológicos moleculares y celulares, diversas líneas de evidencia sugieren que la integrina celular vascular avA3 desempeña una función relativamente tardía en el proceso. En primer lugar, el análisis revela que la expresión de avA3 sobre las células vasculares alcanzó un máximo de 12-24 horas después de la inducción de la angiogénesis con AFGF. En segundo 35 lugar, los antagonistas de avA3 perturban la angiogénesis inducida por múltiples activadores que sugieren que este receptor está implicado en el paso común descendente del quizás todas los eventos de señalización primaria que llevan a la angiogénesis. En tercer lugar, las CAM tratadas con mAb Lm609 o péptido cíclico no muestran un aumento significativo en la apoptosis medida por escalera de ADN hasta 48 horas después del tratamiento con estos antagonistas. Finalmente, los antagonistas de avA3 promueven la apoptosis de las células vasculares que ya

40 han sido inducidas para introducirse en el ciclo celular.

Los resultados presentados en la presente memoria descriptiva proporcionan la primera evidencia directa de que los eventos de unión de integrina pueden regular la supervivencia celular in vivo. Por lo tanto se puede suponer que una vez que empieza la angiogénesis, las células vasculares individuales se dividen y empiezan a moverse hacia la fuente angiogénica, después de los cual, la unión de avA3 proporciona una señal que permite la supervivencia

45 celular continuada la cual conduce a la diferenciación y la formación de vasos sanguíneos maduros. Sin embargo, si se previene la unión de avA3 entonces las células dejan de recibir esta entrada molecular y las células entran en apoptosis por defecto. Esta hipótesis también predeciría que después de producirse la diferenciación los vasos sanguíneos maduros ya no requerirían la señalización de avA3 para la supervivencia y de este modo son refractarios a los antagonistas de esta integrina.

50 Finalmente, los resultados presentados en la presente memoria descriptiva proporcionan la evidencia de que los antagonistas de la integrina avA3 pueden proporcionar un potente acercamiento terapéutico para el tratamiento de la neoplasia u otras enfermedades caracterizadas por la angiogénesis. En primer lugar, los antagonistas de avA3 interrumpe de nuevo la formación de vasos sanguíneos maduros sin afectar a la vasculatura preexistente. En segundo lugar, estos antagonistas no tenían ningún efecto significativo sobre la viabilidad del embrión de pollo,

55 sugiriendo que no son tóxicos. En tercer lugar, la angiogénesis se bloqueo de manera significativa sin tener en cuenta los estímulos angiogénicos. Finalmente, la administración sistémica de antagonistas de avA3 causa la espectacular regresión de diversos tumores humanos histológicamente distintos.

De este modo, los Ejemplos anteriormente mencionados demuestran que la integrina avA3 desempeña una función clave en la angiogénesis inducida por una diversidad de estímulos y que avA3 es un valioso objetivo terapéutico con los antagonistas de avA3 de la invención para las enfermedades caracterizadas por la neovascularización.

La memoria descriptiva dada anteriormente se considera suficiente para permitir que un experto en la técnica

5 ponga en práctica la invención. La presente invención no ha de limitarse en su alcance a la línea celular registrada, ya que la realización registrada se entiende como una simple ilustración de un aspecto de la invención y cualquier línea celular funcionalmente equivalente entra dentro del alcance de la invención. El registro del material no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente memoria descriptiva sea inadecuada para permitir la puesta en practica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni

10 tampoco ha de interpretarse como una limitación del alcance de las reivindicaciones a la ilustración específica que representa. Además, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente memoria descriptiva serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la anterior descripción y estarán comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

(1) INFORMACIÓN GENERAL

(I) SOLICITANTE

(A): NOMBRE: The Scripps Research Institute 5 (B) CALLE: 10666 North Torrey Pine Road

(C): CIUDAD : La Jolla

(D): ESTADO: California

(E): PAIS: Estados Unidos

(F): CODIGO POSTAL (ZIP): 92037 10 (G) TELEFONO: 619-554-2937

(H) FAX: 619:554:6312

(II) T�?TULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES UTILES PARA LA INHIBICIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS

(III) NUMERO DE SECUENCIAS: 14 15 (IV) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

(B): ORDENADOR: PC compatible IBM

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, VERSIÓN 1,25 (EPO) 20 (V) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US 95/

(B): FECHA DE SOLICITUD: 9 de mazo de 1995

(VI) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/210.715 25 (B) FECHA DE SOLICITUD: 18 de mazo de 1994

(VII) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/366.665

(B): FECHA DE SOLICITUD: 30 de diciembre de 1994

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1 30

(I) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): CADENA: sencilla 35 (D) TOPOLOG�?A: lineal

(II) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(III) HIPOTETICO: No

(IV) ANTI-SENTIDO: No

(V): TIPO DE FRAGMENTO: Interno 5 (IX) CARACTER�?STICA:

(A): NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B): LOCALIZACIÓN: 1..6

(D)OTRA INFORMACIÓN: / Marcador= BOC-GRGDFV.OMe /nota= “BOC significa el

grupo protector en N-terminal butiloxicarbonilo; OMe significa un éster de metilo en C10 terminal; arginina en la segunda posición

(ix) CARACTER�?STICA:

(A): NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B): LOCALIZACIÓN: 1..6

(D)OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = OMe 15 /Nota= “OMe significa el grupo protector en C-terminal éster de metilo”

(ix) CARACTER�?STICA: (A)NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B): LOCALIZACIÓN: 1..6

(D): OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = D-Arg

20 /Nota= “Un prefijo “D” en D-Arg significa que la arginina en posición 2 es un Daminoácido”

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 1:

Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5

25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2

(I) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 6 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido 30 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOG�?A: lineal

(II) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(III) HIPOTETICO: No

(IV) ANTI-SENTIDO: No

35 (V) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (IX)CARACTER�?STICAS:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B)LOCALIZACIÓN: 1..6

(D)OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = BOC-GRGDFV.OMe /nota= “BOC significa el grupo de bloqueo N-terminal terbutiloxicarbonilo.”

(XI): CARACTER�?STICA: 5 (A) NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B)LOCALIZACIÓN: 1..6

(D)OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = OH/Nota= “OH significa un ácido carboxílico C-terminal libre”.

(ix): CARACTER�?STICA: 10 (A)NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B): LOCALIZACIÓN: 1..6

(D): OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = D-Arg/Nota= “Un prefijo “D” en D-Arg significa que la arginina en posición 2 es un D-aminoácido;”

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 2:

15 Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3

(i)CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A)LONGITUD: 6 aminoácidos 20 (B) TIPO: aminoácido

(C)CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: lineal

(II) (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(III) HIPOTETICO: No 25 (IV) ANTI-SENTIDO: No

(V) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (IX)CARACTER�?STICAS:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B)LOCALIZACIÓN: 1..6 30 (D) OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = H/nota= “H significa una mina N-terminal libre”

(ix)CARACTER�?STICA: (A)NOMBRE/CLAVE: Péptido (B)LOCALIZACIÓN: 1..6

35 (D)OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = OH/Nota= “OH significa un ácido carboxílico Cterminal libre”.

(ix) CARACTER�?STICA:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B)LOCALIZACIÓN: 1..6

(D)OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = D-Arg/Nota= “Un prefijo “D” en D-Arg significa que la arginina en posición 2 es un D-aminoácido;”

5 (XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 3:

Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4

(I) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

10 ONGITUD: 6 aminoácidos (B)TIPO: aminoácido (C)CADENA: sencilla (D)TOPOLOG�?A: circular

(II) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 15 (III) HIPOTETICO: No

(IV): ANTI-SENTIDO: No

(V): TIPO DE FRAGMENTO: Interno

(IX): CARACTER�?STICAS:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido 20 (B) LOCALIZACIÓN: 1..6

(D)OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = ciclo/nota= “Ciclo significa un péptido cíclico; las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido”.

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 4:

GLy Arg Gly Asp Phe Val25 1 5

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5

(I) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A)LONGITUD: 5 aminoácidos

(B)TIPO: aminoácido 30 (C) CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: circular

(II) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(III) HIPOTETICO: No

(IV) ANTI-SENTIDO: No 35 (V) TIPO DE FRAGMENTO: Interno

(IX) CARACTER�?STICAS:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B)LOCALIZACIÓN: 1..5

5 (XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 5:

Arg Gly Asp Phe Val 1 5

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6

(I): CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA 10 (A) LONGITUD: 5 aminoácidos

(B)TIPO: aminoácido

(C)CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: circular

(II): TIPO DE MOLÉCULA: péptido 15 (III) HIPOTETICO: No

(IV): ANTI-SENTIDO: No

(V): TIPO DE FRAGMENTO: Interno (IX)CARACTER�?STICAS:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido 20 (B) LOCALIZACIÓN: 1..5

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 6:

Arg Ala Asp Phe Val 25 1 5

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7

(I) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A)LONGITUD: 5 aminoácidos

(B)TIPO: aminoácido 30 (C) CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: circular

(II) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(III) HIPOTETICO: No

(IV) ANTI-SENTIDO: No

35 (V) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (IX)CARACTER�?STICAS:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B)LOCALIZACIÓN: 1..5

5 (XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 7:

Arg Gly Asp Phe Val 1 5

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8

(I): CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA 10 (A) LONGITUD: 15 aminoácidos

(B)TIPO: aminoácido

(C)CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: lineal

(II): TIPO DE MOLÉCULA: péptido 15 (III) HIPOTETICO: No

(IV): ANTI-SENTIDO: No

(V): TIPO DE FRAGMENTO: Interno

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 8:

Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe 20 1 5 10 15

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9

(I) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A)LONGITUD: 5 aminoácidos

(B)TIPO: aminoácido 25 (C) CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: circular

(II) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(III) HIPOTETICO: No

(IV) ANTI-SENTIDO: No

30 (V) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (IX)CARACTER�?STICAS:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B)LOCALIZACIÓN: 1..5

(D)OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = ciclo/nota= “Ciclo significa un péptido cíclico; las

35 letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un Laminoácido”.

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 9

Arg Ala Asp Phe Val 1 5

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10

(I): CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA 5 (A) LONGITUD: 6 aminoácidos

(B)TIPO: aminoácido

(C)CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: circular

(II): TIPO DE MOLÉCULA: péptido 10 (III) HIPOTETICO: No

(IV): ANTI-SENTIDO: No

(V): TIPO DE FRAGMENTO: Interno (IX)CARACTER�?STICAS:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido 15 (B) LOCALIZACIÓN: 1..6

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 10:

Ala Arg Gly Asp Phe Leu 20 1 5

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 11

(VI) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 6 aminoácidos 25 (B) TIPO: aminoácido

(C)CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: circular

(VII) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(VIII) HIPOTETICO: No 30 (IX) ANTI-SENTIDO: No

(X) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (IX)CARACTER�?STICAS:

(A)NOMBRE/CLAVE: Péptido

(B)LOCALIZACIÓN: 1..6

35 (D) OTRA INFORMACIÓN: / Marcador = ciclo/nota= “Ciclo significa un péptido cíclico; las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido”.

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 11:

Gly Arg Gly Asp Phe Leu 1 5

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 12 5 (I) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A)LONGITUD: 12 aminoácidos

(B)TIPO: aminoácido

(C)CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: lineal 10 (II) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(III) HIPOTETICO: No

(IV): ANTI-SENTIDO: No

(V): TIPO DE FRAGMENTO: Interno

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 12:

15 Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met 1 5 10

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 13

(VI) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A)LONGITUD: 13 aminoácidos 20 (B) TIPO: aminoácido

(C)CADENA: sencilla

(D)TOPOLOG�?A: lineal

(VII) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(VIII) HIPOTETICO: No 25 (IX) ANTI-SENTIDO: No

(X) TIPO DE FRAGMENTO: Interno

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 13:

Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser 1 5 10

30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 14

(XI) CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA

(A)LONGITUD: 11 aminoácidos

(B)TIPO: aminoácido

(C)CADENA: sencilla 35 (D) TOPOLOG�?A: lineal

(XII) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(XIII) HIPOTETICO: No

(XIV) ANTI-SENTIDO: No

(XV) TIPO DE FRAGMENTO: Interno

(XI) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 14:

Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu 1 5 10

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que inmunorreacciona con avA3 y que es un antagonista de avA3, para su uso en el tratamiento de tumores, la inflamación de tejidos, la artritis, la retinopatía diabética, la degeneración macular, o reestenosis mediante la inhibición de angiogénesis, en el que el tratamiento de tumores se

5 selecciona entre la inhibición de la formación de metástasis de tumor y la regresión de tumores establecidos.
2.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de artritis.
3.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide.

10 4.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de la retinopatía diabética o la degeneración macular, y dicha angiogénesis es angiogénesis retinal.
5.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de un hemangioma.
6.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el 15 tratamiento de un paciente es riesgo de reestenosis después de angioplastia coronaria.
7.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de un tumor en el que dicha angiogénesis es angiogénesis de tumor.
8.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que inmunorreacciona con avA3, y que es un antagonista de avA3 para uso en la inducción de la regresión en un tumor establecido.

20 9.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que en tratamiento comprende la administración del anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo junto con quimioterapia.
10.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tratamiento comprende la administración del anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo para

25 proporcionar dicho antagonista de avA3 en una cantidad de entre 2 µM y 5 mM.
11.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tratamiento comprende la administración del anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo para proporcionar dicho antagonista de avA3 en una cantidad de entre 0,1 mg por kg y 300 mg por kg.
12. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,

30 en el que el tratamiento comprende la administración del anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo intravenosa, transdérmica, intrasinovial, intramuscular u oral.
13.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el tratamiento comprende la administración del anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo en forma de una única dosis intravenosa por vía intravenosa.

35 14.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la unión del fibrinógeno a avA3 y presenta al menos una actividad CI50 de 10 veces superior en la inhibición de la unión de fibrinógeno a avA3 en comparación con la actividad CI50 en la inhibición de la unión de fibrinógeno a aIIbA3 o avA1.
15.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, 40 en el que dicho anticuerpo o fragmento es inmunoespecífico para avA3.
16.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho anticuerpo monoclonal está humanizado.
17.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho anticuerpo monoclonal es LM609 (ATCC HB 9537).

45 18.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho anticuerpo monoclonal es un LM609 (ATCC HB 9537) humanizado.
19.- Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en el tratamiento de un paciente humano.