CN100528229C - 用抗组织因子抗体抑制肿瘤生长的方法 - Google Patents

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Abstract

一种使用组织因子拮抗剂治疗特征是新血管形成的增殖性疾病的方法，所述疾病如癌症、类风湿性关节炎、牛皮癣或者增殖性视网膜病，或者黄斑变性。能够通过外在途径快速防止血液凝固的组织因子拮抗剂也能够抑制哺乳动物中肿瘤生长。

Description

用抗组织因子抗体抑制肿瘤生长的方法
发明背景
发明领域
本发明涉及使用组织因子(TF)拮抗剂治疗癌症的方法，通过特异防止或抑制肿瘤细胞生长实现所述治疗。本发明更具体地涉及通过以有效抑制肿瘤生长的量使用TF拮抗剂治疗此类疾病的方法，所述TF拮抗剂如针对TF的抗体，包括对至少一种TF蛋白质或者其片段特异的所述抗体的特定部分或者变体。
组织因子(IF)
血液凝固包括反应的级联系列，其导致形成血纤蛋白。凝固级联由两个重叠的途径组成，这两个途径都是止血所需的。内在途径包含存在于循环血液中的蛋白质因子，而外在途径需要组织因子(TF)，其在应答血管损伤时在多种组织的细胞表面上表达(Davie等人，1991，Biochemistry 30：10363)。当暴露于血液时，TF发动激活步骤的潜在的爆炸性级联，其导致形成不可溶的血纤蛋白凝块。已经研究了作为抗凝血治疗靶的TF。
TF是单链、263个氨基酸的膜糖蛋白，其作为因子VII和VIIa的受体起作用并且从而启动应答血管损伤的凝固级联的外在途径。TF是跨膜细胞表面受体，其作为因子VIIa的受体以及辅因子，在细胞表面上形成蛋白酶解活性TF:VIIa复合体(Ruf等人，(1992)J.Biol。Chem 267：6375-6381)。除了其在保持止血中的作用之外，过量TF已经与病理状况有关。具体而言，TF的合成和细胞表面表达与血管疾病(Wilcox等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci，86：2839)和革兰氏阴性脓毒性休克(Warr等人，1990，Blood 75：1481)有关。
TF拮抗剂
已知多种抗-TF抗体。例如，Carson等人，(1987，Blood 70：490-493)公开了产生单克隆抗体的杂交瘤，其通过用TF免疫小鼠制备，所述TF通过固定的因子VII上的亲和层析所纯化。Ruf等人，(1991，Thrombosis and Haemostasis 66：529)表征了针对人TF的鼠单克隆抗体的抗凝血潜力。靶向TF上FVII结合位点的单克隆抗体的能力取决于它们与FVII竞争结合TF和形成TF/VIIa复合体的能力，当TF接触血浆时快速形成TF/VIIa复合体。从而此类抗体是血浆中TF的相对低抑制剂。一种单克隆抗体TF8-5G9能够抑制TF/VIIa复合体，从而提供了血浆中立即抗凝血效果。该抗体公开在美国专利6,001,978、5,223,427和5,110,730。Ruf等人(上文)提出失活TF/VIIa复合体而不是防止其形成的机制可以提供体内中断凝固的策略。与其他能抑制因子VII和TF的结合的抗体相比，TF8-5G9对因子VII或VIIa与受体的结合仅显示出微妙和间接效果。TF8-5G9以纳摩尔结合常数结合TF的胞外结构域以阻断TF:F.VIIa:F.X三元起始复合体的形成(Huang等人，J.Mol.Biol.275：873-894 1998)。
已经表明抗-TF单克隆抗体抑制多种物种中的TF活性(Morissey等人，1988，Thromb.Res.52：247-260)，并且已经表明中和抗-TF抗体可以防止脓毒症的狒狒模型中的死亡(Taylor等人，Cifc.Shock，33：127(1991))，并减弱内毒素诱导兔中的DIC(Warr等人，(1990)Blood 75：1481)。
WO96/40921公开了衍生自TF8-5G9抗体的CDR-移植的抗-TF抗体。在Presta等人，Thromb Haemost 85：379-389(2001)、EP1069185、WO 01/70984和WO03/029295中公开了其他人源化或人抗-TF抗体。
TF在癌中的角色
在多种恶性肿瘤和分离的人肿瘤细胞系上也超表达组织因子，表明其在肿瘤生长和存活中的作用。TF不是由正常血管内衬的健康内皮细胞产生的，而是表达于肿瘤血管的这些细胞上。它似乎在正常和恶性成年组织中血管发生、新血管形成、正发育的动物和血管生成、从现有动脉长出新的毛细血管中均起作用。因此，抑制或者靶向TF可能是有用的抗肿瘤策略，其可通过抑制TF介导的细胞信号传导或者其他活性直接影响超表达TF的肿瘤细胞的生存。此外，该方法可以通过抑制表达TF的肿瘤内内皮细胞的生长或功能通过抗血管生成机制间接防止肿瘤生长。
TF和血管生成
血管生成是产生新的毛细血管的过程并且来源于内皮细胞的受激活的增殖。新血管形成受到密切调节，并且仅在胚胎发育、组织重塑、伤口愈合和黄体发育的周期循环期间发生(Folkman和Cotran，Relation of vascular proliferation to tumor growth，Int.Rev.Exp.Pathol.′16，207-248(1976))。
现在大量证据表明肿瘤生长和癌发展需要血管生成和新血管形成、血管生长和延伸，以便为肿瘤组织提供营养物和氧，以带走废产物和作为肿瘤细胞转移到远处部位的管道(Folkman，等人，N Engl JMed 285：1181-1186，1971和Folkman，等人，N Engl J Med 333：1757-1763，1995)。然而，组织和肿瘤血管生成和新血管形成代表由细胞产生的因子的相互作用介导的复杂过程，所述因子包括TNFα、VEGF和组织因子。研究表明导致VEGF和TF上调的途径重叠(Chen J.等人(2001)Thromb.Haemost.86-334-5)，所述途径是新血管形成的起始中的两个主要成员。
内皮细胞通常比身体中的其他类型的细胞增殖慢得多。然而，如果这些细胞的增殖速率不受调控，那么可以导致病理性血管生成。病理性血管生成与多种疾病有关。例如，心血管疾病，如血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形、动脉粥样硬化、粘连和水肿硬化；和眼科疾病，如角膜植入后新血管形成、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、血管生成性角膜病、黄斑变性、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维组织增生和颗粒性结膜炎与血管生成有关。慢性炎症疾病如关节炎；皮肤病如牛皮癣、毛细血管扩张、脓性肉芽肿、脂溢性皮炎、静脉曲张性溃疡、痤疮、酒渣鼻(红斑痤疮或者红斑狼疮(erythematosa))、疣(瘊)、湿疹、血管瘤、淋巴管生成(lymphangiogenesis)也是依赖血管生成的。
视力可以由于其中玻璃体液受到毛细血管血液浸润的多种眼病而受到损害或者丧失。糖尿病性视网膜病可以呈现两种形式之一：非增殖性或增殖性。增殖性视网膜病的特征是异常新的血管形成(新血管形成)，所述血管在玻璃体表面生长或者延伸到玻璃体腔。在晚期疾病中，可以发生新血管膜，从而导致牵引性视网膜脱离。新血管形成可以导致玻璃体出血。视力症状表现出变化。当存在玻璃体内出血时，可以突然发生严重的视力丧失。如果与严重视网膜缺血、广泛新血管形成或者广泛纤维组织形成相关，那么更需当心具有增殖性视网膜病的视力预后。黄斑变性同样呈现两种形式：干燥和湿润的。在渗出性黄斑变性(湿润形式)(其是较不常见的形式)中，形成脉络膜新血管形成的视网膜下(subretinal)网络，其通常与视网膜内出血、视网膜下流体、色素上皮脱离和色素沉着有关。最后，该复合体收缩并在后极留下明显升高的疤痕。年龄相关的黄斑变性的两种形式都通常是两侧的并且之前为黄斑区的脉网膜小疣。与血管生成病原学相关的视力丧失的另一种原因是虹膜损伤。导致虹膜隆起形成角度的两种最常见的状况是诸如糖尿病患者中新生血管性青光眼中膜的收缩或者视网膜中心静脉闭塞或者与葡萄膜炎相关的炎性沉淀物，其使得虹膜隆起形成角度(Ch.99.The Merck Manual第17版1999)。
类风湿性关节炎是一种炎性疾病，也导致不适宜的血管生成。滑膜腔中血管内皮细胞的生长由炎性细胞因子激活，并导致软骨破坏和关节中用血管翳的替代(Koch AK，Polverini PJ和Leibovich SJ.Arthritis Rheum.29，471-479(1986)；Stupack DG，Storgard CM和Cheresh DA，Braz.J.Med.Biol.Res.，32，578-581(1999)；Koch AK，Arthritis Rheum，41，951 962(1998))。
牛皮癣由皮肤细胞的不受控制的增殖导致。快速生长的细胞需要足够血液供应，并且在牛皮癣中诱导异常血管生成(Folkman J.，J.Invest.Dermatol.，59，40-48(1972))。
WO94/05328中公开了使用抗-TF抗体抑制转移的发作和发展，通过消除微脉管系统中转移细胞的长期粘着从而抑制转移来实现所述抑制，但是没有公开对已确立的肿瘤细胞生长的任何作用。考虑到调节肿瘤血管形成的因子的复杂性以及对组织因子作为介导肿瘤生长和伤口愈合中细胞生长的受体的不完全理解，可能TF的阻断在特征是不适宜的血管生成活性的癌症或者其他疾病的发病机理中起关键或者冗余作用。
因此理解针对TF的抗体是否可以用作伴随着新血管形成和血管生成机制的人类癌症以及其他增殖性疾病的治疗中的初步或者辅助治疗将是有益的。
发明概述
本发明涉及使用TF的拮抗剂抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述TF的拮抗剂包括针对TF的抗体、和特异于至少一种TF蛋白质或者该蛋白质片段的所述抗体的特定部分或者变体。此类TF拮抗剂如抗体可以通过它们能够以防止与癌组织，尤其实体瘤的生长相关的事件的方式结合TF的能力发挥作用。
另一方面，本发明提供了治疗特征是血管形成组织增加的疾病的方法，其包括施用有效量的组织因子拮抗剂以抑制所述组织增加。
附图简述
图1图示了皮下植入到无胸腺小鼠的胁腹并在第0天开始每周一次施用CNTO 859、不相关的hIg或者HBSS的人乳腺癌细胞的肿瘤生长速率(体积改变)。
图2图示对于在第14天开始每周一次施用CNTO 859或者hIg的小鼠组，来自与图1相同实验的数据。
图3图示了来自对照动物、用PBS或者对照人Ig治疗的动物和用CNTO 859治疗的动物的肿瘤体积的改变。
图4是条形图，其代表来自对照动物、用PBS或者对照IgG治疗的动物和用CNTO 859治疗的动物的最终肿瘤体积的平均值和标准差。
图5显示了在肿瘤细胞植入当天开始用PBS、对照Ig或者CNTO859治疗的动物中肿瘤发生率。
图6显示用PBS、对照人Ig或者多种剂量的CNTO 859治疗的动物中通过体积测量的MDA MB 231异种移植物的肿瘤发展。CNTO 859能够在所有浓度下抑制肿瘤生长。肿瘤抑制为0.1mg/kg下90％(分别为p＝0.0012和p＝0.0106，Wilcoxon双样品检验，使用t分布)到高于0.1mg/kg的任意浓度下95％抑制。
图7是散点图，其显示了用PBS、对照人Ig或者多种剂量的CNTO859(0.1、1、5、10和20mg/kg)治疗的动物的最终肿瘤体积的分布。
图8是对于一个实验，随时间推移肿瘤体积的图，所述实验使用同位植入(乳组织中)于小鼠的人乳腺癌细胞MDA MB 231异种移植物，并且其中用PBS、对照人Ig、CNTO 859Ala/Ala或者多种剂量(0.01、0.1和1mg/kg)CNTO 859和CNTO 860治疗小鼠。
图9显示了来自与图8相同实验的四组的平均值和标准差，仅显示了对照和0.1mg/kg下的CNTO 859和CNTO 860。
图10是与图8相同的实验中每组的个体最终肿瘤体积和平均值的图示代表。
图11显示了来自与图8相同的实验的肿瘤发生率数据。
图12显示了植入小鼠中的BxPC-3人胰腺肿瘤细胞的肿瘤生长速率(体积改变)，所述小鼠在第二天开始用CNTO 859进行治疗。肿瘤生长受到46.9％抑制(p＜0.0012)。
图13显示了在用CNTO 859治疗确立的肿瘤时，植入小鼠中的BxPC-3人胰腺肿瘤细胞的肿瘤生长速率(体积改变)。肿瘤生长受到35％抑制(p＜0.0001)。
图14是条形图，其显示人的抗鼠TF抗体(PHD 127)使PANC-1人胰腺肿瘤细胞诱导的血管生成减少88％(p＜0.05)，所述血管生成通过小鼠中MATRIGEL中血管长度来测量。
发明详述
本发明的TF拮抗剂可以用于抑制和防止肿瘤生长。通过用本发明方法中的TF拮抗剂治疗改善了涉及许多形式的实体原发肿瘤的许多病理。
肿瘤
可以用本发明的抗-TF抗体治疗良性和恶性肿瘤，包括多种癌症，如宫颈癌、肛门和口癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、脑/中枢神经系统(cns)癌(例如，神经胶质瘤)、头和颈癌、眼癌、咽喉癌、皮肤黑素瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、尤因肉瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、肾母细胞瘤、成神经细胞瘤、口/咽癌、食道癌、喉癌、肾癌和淋巴瘤等等。
从而，本发明提供了调节或者治疗细胞、组织、器官、动物或者患者中至少一种恶性疾病的方法，所述疾病包括但不限于至少以下一种：乳腺癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多病、肿瘤相关病症/恶性高钙血症、实体瘤、腺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、血管瘤、转移病等等。这种方法可以任选通过在施用此类TF拮抗剂之前、同时或之后与放射治疗、抗血管生成剂、化学治疗剂、法尼基转移酶抑制剂、蛋白体抑制剂等等联合。
TF拮抗剂
文中所用术语“TF拮抗剂”指抑制或者中和TF活性的物质。此类拮抗剂以多种方式实现所述作用。一类TF拮抗剂将以足够亲和力结合TF蛋白质并特异中和TF的作用。该类分子包括抗体和抗体片段(例如，F(ab)或者F(ab’)2分子)。从而，文中所用“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。另一类TF拮抗剂是TF蛋白质的片段、突变蛋白或者小有机分子，即肽模拟物(peptidomimetics)，它们将结合TF配体，从而抑制TF的活性或者抑制TF导致细胞内信号传导的能力。TF拮抗剂可以是这些类别的任一种，只要它是抑制TF抗肿瘤活性或者抗血管生成活性的物质。TF拮抗剂包括TF抗体、经修饰的TF、反义TF和TF的部分肽。
在尤其优选的实施方案中，TF拮抗剂是鼠的、嵌合的、人源化的或者人单克隆抗体或者它们的片段，所述抗体或片段具有下列性质之一：防止因子VIIa结合TF，从而防止凝固的继续，防止形成TF:FVIIa:FX复合体，或者防止TF通过其细胞内结构域的信号传导。此类抗体是本领域已知的并且可以用于本发明的方法中。针对TF的鼠单克隆抗体在例如，美国专利6,001,978、5,223,427和5,110,730中已知。WO96/40921公开了从TF8-5G9抗体衍生的CDR-移植的抗TF抗体，其中来自小鼠抗体TF8-5G9的可变区的互补决定区(CDR)移植到人抗体的可变区并结合到人抗体的恒定区。能够防止TF抗凝剂和受体介导的活性的其他人源化抗-TF抗体在Presta等人，ThrombHaemost 85：379-389(2001)和EP1069185中公开。将前面的每一篇参考文献并入本申请作为参考。
组合物和它们的用途
根据本发明，所述中和性抗-TF单克隆抗体可以用于抑制肿瘤生长。待治疗的个体可以是任意哺乳动物并且优选为需要此类治疗的人类患者。所施用的单克隆抗体的量将根据其使用目的和施用方法而变。
可以通过任意多种方法施用本发明的TF抗体，所述方法在其中希望防止或者停止生长的肿瘤组织中引起某种效果。此外，本发明的抗TF抗体不需要局部存在以赋予抗肿瘤效果，因此，它们可以施用于可以实现接近含有TF的身体区室或体液的任何地方。对于恶性组织，这些方法可以包括直接施用含有抗体的制剂。此类方法包括静脉内施用液体组合物、皮下或者经皮施用液体或者固体制剂、经口、局部施用，或者间质或者手术间(inter-operative)施用。
还可以经口或者通过局部注射到肿瘤或者组织进行施用，但是通常，静脉内施用单克隆抗体。通常，剂量范围为约0.01mg/kg到约12.0mg/kg。这可以是快速灌注或者缓慢或者连续输注，其可以通过微处理器控制的和可编程的泵装置控制。
备选地，可以从杂交瘤细胞分离优选编码所述单克隆抗体片段的DNA并将其施用于哺乳动物。DNA可以以裸露形式施用或者插入到重组载体，例如，痘苗病毒，所插入方式导致所述DNA在患者的细胞中表达并递送所述抗体。
可以用于本发明方法的单克隆抗体可以按配制药物组合物的任一种确认的方法，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，1985中描述的方法配制。为了容易施用，单克隆抗体通常与药学上可接受的载体组合。此类载体包括水、生理盐水或者油。
适于肠胃外施用的制剂包括含水和不含水无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与计划的受体的血液等渗的溶质；和含水和不含水无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。除了在任意常规介质与所述活性成分和其计划的用途不相容的情况之外，预期所述任意常规介质都可以用于任意组合物中。
制剂可以在单位剂量或者多次剂量容器，例如，密封安瓿和小瓶中给出，或者可以保存在冷冻干燥(冻干)条件下，其仅需要在施用前即刻加入无菌液体载体，例如，注射用水。
与TF拮抗剂的组合
通过将本发明的TF拮抗剂与具有抗肿瘤作用或者体内抑制血管生成的不同机制的一种或多种其他试剂组合可以实施本发明方法，所述试剂包括，但不限于化学治疗剂。
此外，TF抗体可以与一种或多种抗血管生成剂组合。血管生成的特征是平滑肌和内皮细胞的侵入、迁移和增殖。已知αvβ3整联蛋白(也称作玻连蛋白受体)在多种状况或疾病状态中起作用，所述状况或疾病状态包括肿瘤转移、实体瘤生长(瘤形成)、骨质疏松症、Paget氏病、恶性体液高钙血症、血管生成(包括肿瘤血管发生)、视网膜病(包括黄斑变性)、关节炎(包括类风湿性关节炎)、牙周病、牛皮癣和平滑肌细胞迁移(例如，再狭窄)。
粘着受体整联蛋白αvβ3结合玻连蛋白、血纤蛋白原、冯·维勒布兰德因子(von Willebrand Factor)、层粘连蛋白、血小板反应蛋白和其他类似配体。鉴定αvβ3是鸡和人中的血管生成性血管标记，并且在血管生成或者新血管形成中起关键作用。αvβ3的拮抗剂通过选择性促进新脉管系统中细胞的编程性细胞死亡抑制所述过程。因此，αvβ3拮抗剂将是治疗与新血管形成有关的此类状况的有用的治疗靶(Brooks等人，Science，卷264，(1994)，569-571)。此外，肿瘤细胞侵入通过三个步骤发生：1)肿瘤细胞附着到细胞外基质；2)机制的蛋白酶解溶解；和3)细胞移动穿过溶解的屏障。该过程可以重复发生并可以导致转移到离最初肿瘤很远的部位。已经表明αvβ3整联蛋白在肿瘤细胞侵入以及血管生成中起作用。
由于αvβ3的拮抗剂和中和性抗-TF抗体都靶向肿瘤但通过不同的机制起作用，所以抗整联蛋白抗体与抗-TF抗体的联合将导致尤其强力且有效的组合治疗，其具有很小的正常组织毒性。从而，在本发明的一个实施方案中，提供了抑制肿瘤生长的方法，其包括在需要此类治疗的患者中施用整联蛋白拮抗剂和抗-TF抗体的组合。选择性结合整联蛋白或者整联蛋白亚基的其他抗体，尤其是结合αV亚基的抗体在美国专利5,985,278和6,160,099中公开。抑制αVβ3与其含有三肽精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)的天然配体结合的Mab在US 5,766,591和WO0078815中公开。防止含有αV亚基的整联蛋白结合玻连蛋白、血纤蛋白原或者其他配体的其他抗体在预防血管生成中具有相似的效用。此类抗体包括在GEN 095或CNTO 95已知和在公开为WO02012501的申请人的共同未决申请中描述的抗体。
根据本发明，其他已知的抗-血管生成剂，如沙立度胺也可以与抗-TF抗体组合使用。
缩写
ATCC-美国典型培养物保藏中心
CO2-二氧化碳
DMEM-Dulbeccos改良的Eagles培养基
EDTA-乙二胺四乙酸
FBS-胎牛血清
FVIIa-因子VIIa(有活性的FVII)
FX-因子X(无活性)
FXa-因子Xa(活化的FX)
hIg-人Ig
LNN-2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸
PBS-磷酸缓冲盐溶液
SQ-皮下
IV-静脉内
IP-腹膜内
TF-组织因子
尽管已经一般性描述了本发明，但是将在下面的实施例中进一步公开本发明的实施方案。
实施例1
抑制乳腺癌异种移植物中的肿瘤生长
该实施例证明抗组织因子IgG抗体抑制在无胸腺小鼠中植入的MDA-MB-231乳腺癌异种移植物的肿瘤生长的能力
材料和方法 从Charles River Laboratories得到50只4-6周龄雌性无胸腺小鼠(Cr1：NU/NU-CD1)并在实验前适应10-14天。根据National Institutes of Health Guide for the Care and Useof Laboratory Animals将小鼠饲养在Centocor，Inc.的动物设施中。
从ATCC(Rockville，MD，Catalog #HTB-26)得到人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。将细胞于37℃，5％CO2培养在补加25mM HEPES、10％FBS和1％LNN的DMEM培养基中。在对数生长期用胰蛋白酶-EDTA收获细胞并以5×107个细胞/mL重悬浮在无菌HBSS中。
抗体：CNTO 859，CDR移植的TF8-5G9抗体，公开在WO96/40921中，原液浓度3.75mg/mL；hIg，ZLB Bioplasma，AG，Berne瑞士。原液浓度：无菌USP水中30mg/mL。所有测试物品都设定为在无菌HBSS中2mg/mL的工作浓度。所有测试物品和对照都具有＜1.0EU/mg的LAL值。
在第0天，将小鼠随机分配到5个组的每一组中，每组10只小鼠。将细胞以5×106个MDA-MB-231肿瘤细胞/0.2mL体积(0.1mL溶于HBSS中的细胞与0.1mL混合)的浓度皮下植入无胸腺小鼠的胁腹。如表1中描述的对小鼠组每周一次给药。
表1
  组号(治疗)   N   开始给药   最初剂量<u>(mg/kg)</u>   抗体浓度   维持剂量<u>(mg/kg)</u>
  1.HBSS   10   第0天   0.2mL   N/A   0.1mL
  2.hIg对照   10   第0天   20   2mg/mL   10mg/kg
  3.CNTO 859 IgG   10   第0天   20   2mg/mL   10mg/kg
  4.hIg对照 10   第14天(或者100mm<sup>3</sup>的平均肿瘤大小)   20   2mg/mL   10mg/kg
  5.CNTO 859 IgG 10   第14天(或者100mm<sup>3</sup>的平均肿瘤大小)   20   2mg/mL   10mg/kg
在研究的第0天，将50只研究小鼠分成5组(10只小鼠/组，根据表1)。所有动物都在胸腔(rib cage)区的右侧皮下注射0.2mL含有5×106个细胞的MDA-MB-231细胞悬浮液(溶于HBSS的细胞悬浮液与
Figure C20048002149300132
的1∶1混合物)。在第0天，组1、2和3中的所有动物都接受腹膜内注射10mL/kg测试物品或者HBSS(表1)。组4和5中的动物在第14天或者100mm3的平均肿瘤大小时接受腹膜内注射10mL/kg测试物品。最初腹膜内注射后，所有动物都每周一次接受测试物品或者对照的腹膜内(5mL/kg)剂量直到第80天。
基于最近的在前体重值计算第一次给药的20mg/kg剂量和随后给药的10mg/kg剂量。在每周周一对动物腹膜内给药直到第80天或者直到肿瘤达到2,000mm3的体积。每周测量动物体重和肿瘤体积一次直到研究结束。在第0天开始时对动物称重，而仅在一旦可以触觉到就记录肿瘤体积。用卡钳以三维测量肿瘤并基于式V＝(LxWxT)/2计算肿瘤体积，其中L＝长度，W＝宽度，而T＝厚度。
计划当肿瘤达到～2000mm3的平均体积时结束研究，如果动物的健康没有受到损害，那么可以任选延长研究。结束时，通过CO2窒息对动物实施安死术并切下和称重肿瘤。然后将个体肿瘤切成两半，一半在OCT中骤冻，而另一半在10％福尔马林中固定。通过心脏穿刺从结束时每只动物采集血清样品。
结果 将每个治疗组的生长速率作为肿瘤体积(mm3)对时间(植入后天数)的函数作图(图1和2)。在所有组中存在100％采用率。在第0天(图1)或第14天(图2)用hIg对照治疗动物相对于HBSS阴性对照不显著影响肿瘤生长(分别为P＝0.779，P＝0.979)。
在第0天用CNTO 859治疗的动物中肿瘤生长受到62％的抑制(P＜0.0001)(图1)。当在第14天用CNTO 859开始治疗时，当平均肿瘤大小为100mm3时，肿瘤生长速率受到47％抑制(P＜0.0001)(图2)。
CNTO 859的总体组合的治疗效果相对于hIg对照的总体治疗效果也是显著的(P＜0.0001)。在治疗的第17天后通常实现了天与天之间的显著性，其定义为P＜0.005。
结果证明CNTO 859抑制肿瘤生长速率最高达62％。这是首次证明抗人组织因子IgG抗体能够体内抑制人来源的肿瘤生长。用CNTO859早期(第0天)和晚期(第14天)治疗都显著抑制了肿瘤生长速率。
实施例2
同位异种移植物模型中抗-TF抗体对人乳腺癌的作用
在本实施例中，使用同位肿瘤生长模型试验CNTO 859的抗肿瘤效果，所述模型使用注射到SCID/Beige小鼠的乳脂肪垫中的人乳腺癌细胞系MDA MB 231。此外，比较抗组织因子抗体的结构的变异的作用：一个差异在于人类别特性CNTO 859(IgG4)和CNTO 860(IgG1)；且FcR结合区CNTO859的修饰，称作CNTO 859 ala/ala。
材料和方法 从Charles River Laboratories得到4周龄雌性SCID/Beige小鼠(C.B.-17/IcrCrl-scid-bgBR)并在实验前适应10-14天。将小鼠以7-8只/笼关在顶部有过滤器的笼中并随意提供高压灭菌的食物和酸化水，其含有Bactrum(0.13mg/mL三甲氧苄二氨嘧啶/0.66mg/mL磺胺甲噁唑)。通过在研究开始前5天放置的分别编号的耳朵标签识别动物。将标记有来源、性别、动物数目、动物ID号、组号、治疗、研究号和IACUC方案号的笼子卡片固定到笼子上。根据National Institutes of Health Guide for the Care and Useof Laboratory Animals在Centocor，Inc.，Radnor，PA的动物园实施所有动物研究。
从Centocor的细胞保藏室得到人乳腺癌细胞系MDA MB 231，并且认为其是无菌和无支原体的。将细胞于37℃，5％CO2培养在补加10％FBS和1％LNN的DMEM培养基中。在对数生长期用胰蛋白酶-EDTA收获细胞并以5×107个细胞/mL重悬浮在无血清的DMEM中并以50μL的体积植入(右侧腹股沟#2/3)乳脂肪垫中。
试验和对照抗体如下：CNTO 859，3.75mg/mL原液浓度；CNTO 859，10.29mg/mL原液；CNTO 860，2.4mg/mL原液；CNTO 859 Ala/Ala，C1081，1mg/mL原液；人Ig，ZLB Bioplasma AG，Berne瑞士，30mg/mL原液浓度。
以PBS中适宜的浓度提供抗体。已经测试所有对照和受试物品的内毒素都是＜1 EU/mg的并且将其静脉内施用。
以7-8只小鼠/组随机化动物。在第0天，使用30g针头将溶于50uL体积中的2.5×106个MDA MB 231细胞注射到动物的乳脂肪垫。在第3天开始静脉内抗体治疗。分别在表2、3和4中详述三种研究的每一种的给药方案和浓度。
表2
表1
  组   小鼠/组   细胞   抗体   每周一次×8
  1   8   -   PBS   200uLs
  2   8   231   PBS   200uLs
  3   8   231   CNTO 859   20mg/kg
  4   8   231   人Ig   20mg/kg
表3
表2
  组   小鼠/组   细胞   抗体   每周一次×8
  1   8   231   PBS   200uLs
  2   8   231   人Ig   20mg/kg
  3   8   231   CNTO 859   0.1mg/kg
  4   8   231   CNTO 859   1mg/kg
  5   8   231   CNTO 859   5mg/kg
  6   8   231   CNTO 859   10mg/kg
  7   8   231   CNTO 859   20mg/kg
表4
表3
  组   小鼠/组   细胞   抗体   每周一次×8
  1   7   231   PBS   200uLs
  2   7   231   人Ig   1mg/kg
  3   7   231   CNTO 859   1mg/kg
  4   7   231   CNTO 859   0.1mg/kg
  5   7   231   CNTO 859   0.01mg/kg
  6   7   231   CNTO 860   1mg/kg
  7   7   231   CNTO 860   0.1mg/kg
  8   7   231   CNTO 860   0.01mg/kg
  9   7   231   CNTO 859Ala/Ala   1mg/kg
每周对小鼠称重并记录肿瘤体积一次，持续8-9周。以(L×W2)/2计算肿瘤体积。肿瘤细胞接种后约8到9周结束研究。对于经历快速体重减轻、呼吸困难或者在终点前垂死的任何动物，研究辅助人员对该动物实施安死术。通过CO2窒息对动物进行安死术然后称重。手术取出肺和腋淋巴结，在冷PBS中洗涤，印迹，称重并立即在布安氏液中固定。切除原发肿瘤，称重，然后在BZT溶液中固定以进行组织学分析。
初步抗肿瘤作用 在研究期间每周监控并记录一次肿瘤体积。结束时，从CO2安死术处理的SCID/Beige小鼠手术切除原发肿瘤并称重。将肿瘤体积和最终质量对时间作图(图3和4)。当用CNTO 859治疗动物时，相对于PBS或者对照IgG治疗的动物，肿瘤生长受到95％以上的抑制。(p＝0.0039和p＝0.0126，双尾参数(two-tailedparametric)t检验，n＝8)。
在第二种研究中，检查剂量效果。CNTO 859在低至0.1mg/kg，每周施用一次的剂量下抑制肿瘤生长。与PBS和人Ig对照组相比，用0.1、1、5、10或20mg/kg CNTO 859治疗的动物中肿瘤发展(以肿瘤体积改变表示)(图6)和个体最终肿瘤重量(图7)都显著降低。
在三种浓度下CNTO 859和CNTO 860的比较研究中，显示我们的抗组织因子抗体的IgG1形式不仅在预防肿瘤生长，而且在预防肿瘤发生率方面更佳(图8-11)。各组的每一组的肿瘤体积在图8中显示为随时间推移的组中平均肿瘤重量(图8)和个体最终重量和平均值(图10)。
对肿瘤发生率的影响 CNTO 859治疗还表明在受治疗的动物中肿瘤发生率的显著不同。在第一个研究中，细胞能够贴壁和在乳脂肪垫中接种(如通过注射部位结节的触诊观察的)，但是太小而直到约第38天才能测量，此时一个肿瘤具有可测量的大小。相反，在PBS或者对照人Ig治疗的动物中可测量的肿瘤在第17天开始出现。图5显示了用PBS、对照Ig或者CNTO 859治疗的动物中的肿瘤发生率。从该同位MDA MB 231肿瘤生长模型得到的结果表明CNTO 859是肿瘤发生率、生长和发展的高度有效的抑制剂。与载体对照或者Ig对照相比，CNTO 859使肿瘤生长减小95％(p＝0.0039和p＝0.0126，双尾参数t检验，n＝8)，并使肿瘤发生率减小87.5％(p＝0.0017对PBS和p＝0.0086对对照人Ig，双尾参数t检验，n＝8)。
在CNTO 859和CNTO 860的比较研究中，很显然当使用0.1mg/kg的剂量时，CNTO 860与PBS和人Ig对照组相比能够延迟最初肿瘤发作44和37天。类似地，CNTO 859能够延迟最初肿瘤发作23和16天。此外，到研究结束时，在CNTO 860组中无肿瘤的动物超过70％，相比较而言在CNTO 859组中仅15％。到第44天时，PBS、人Ig和CNTO 859 ala/ala组中所有动物都具有肿瘤(图11)。
总结 使用该异种移植物模型在一系列实验中比较了CNTO 859和两种变体在防止肿瘤生长和发展中的功效。在第一种研究中，当在肿瘤植入后第3天开始每周一次以20mg/kg的浓度施用时，CNTO 859高度有效地防止肿瘤生长，从而导致与PBS或者对照Ig治疗组相比95％的生长抑制率(分别为p＝0.0039和p＝0.0126)。我们还观察到与PBS或者对照Ig治疗组相比用CNTO 859治疗的动物中肿瘤发生率减小87.5％(分别为p＝0.0017和p＝0.0086)。
在第二种研究中，以从0.1mg/kg到20mg/kg的一系列剂量每周一次施用CNTO 859。结果表明用CNTO 859的抗TF-单克隆抗体治疗甚至在0.1mg/kg的极低剂量下也高效抑制肿瘤发展，从而导致与PBS或者对照Ig治疗组相比90％以上的肿瘤抑制(分别为p＝0.0012和p＝0.0106，Wilcoxon双样品检验，使用t分布)。1、5、10和20mg/kg的剂量显著抑制肿瘤生长95％以上。
最后，在单独的研究中，针对CNTO 860(CNTO 859的IgG1形式)和ADCC最小化形式CNTO 859 ala/ala评估CNTO 859的功效。IgG4或者IgG1治疗抗体的0.01mg/kg剂量与PBS、人Ig对照或者CNTO 859ala/ala的没有不同。相反，CNTO 859或者CNTO 860的1mg/kg剂量能够抑制肿瘤生长95％以上。有趣的是，在0.1mg/kg剂量水平，CNTO 859对CNTO 860的效果是有区别的，因为CNTO 860在该低剂量水平抑制肿瘤生长95％以上，而CNTO 859治疗的肿瘤显示出逃脱治疗的迹象，导致仅～85％抑制。此外，当以0.1mg/kg使用时，CNTO860比CNTO 859更有效地减慢肿瘤发展，可能是由于额外的ADCC活性。
实施例3
抑制胰腺腺癌异种移植物中肿瘤生长
在该实施例中，我们证明抗组织因子抗体对SCID小鼠胁腹中胰腺腺癌细胞系BxPC-3生长的生长抑制作用。最初20mg/kg的负载剂量后以10mg/kg每周一次施用CNTO 859。在肿瘤植入后1天开始用CNTO 859治疗的组中，BxPC-3肿瘤的生长受到46.9％抑制(p＜0.001)。在平均肿瘤体积为50-100mm3开始治疗的组中，肿瘤受到轻微抑制，但是没有实现统计学显著性(p＝0.6280)。
材料和方法 从Charles River Laboratories(Wilmington)得到6-8周龄雌性SCID小鼠并在实验前适应10-14天。将小鼠以10只/笼关在顶部有过滤器的笼中并随意提供高压灭菌的食物和酸化水，其含有Bactrum(0.13mg/mL三甲氧苄二氨嘧啶/0.66mg/mL磺胺甲噁唑)。通过在研究开始前7天放置的分别编号的耳朵标签识别动物。将标记来源、性别、动物数目、动物ID号、组号、治疗、研究号和IACUC方案号的笼子卡片固定到笼子上。根据NationalInstitutes of Health Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals在Centocor，Inc.，Radnor，PA的动物园实施所有动物研究。
从ATCC(Rockville，MD，Catalog#CRL-1687)得到人BxPC-3胰腺腺癌细胞系。检测它们没有病毒或者支原体污染，并由Centocor’sCell Biology Services保藏。将细胞于37℃，5％CO2培养在补加10％FBS和1％ LNN的RPMI 1640培养基中。在对数生长期用胰蛋白酶-EDTA收获细胞并以1.5×107个细胞/mL重悬浮在无菌PBS中。
在Centocor，Inc.产生的CNTO 859以3.75mg/mL的原液浓度使用；hIg，ZLB Bioplasma，AG，Berne瑞士以无菌USP水中的30mg/mL原液浓度使用，和PBS，pH7.1，Gibco BRL。所有测试物品都用无菌HBSS稀释到2mg/mL的工作浓度。
在第0天，将小鼠随机分配到5组，每组10只。用0.2mL体积的PBS或者仅PBS(组1)在小鼠胁腹皮下接种3x106 BXPC-3肿瘤细胞。治疗方案在表5中详述。
在第1天，组1中动物接受0.2mL PBS(腹膜内)，组2接受20mg/kghIg对照抗体，而组3接受20mg/kg CNTO 859抗体。随后以10mg/kg每7天一次施用抗体。每7天1次施用0.2mL PBS。对照组4的动物接受20mg/kg CNTO 859腹膜内给药治疗，一旦肿瘤达到约50mm3到100mm3则然后以10mg/kg每7天1次施用。组5的动物接受腹膜内给药的20mg/kg人Ig的治疗，当肿瘤大小达到约50mm3到100mm3时，然后以10mg/kg每7天1次施用。
表5
  组   治疗   抗体浓度(mg/mL)   最初抗体剂量(mg/kg)   随后抗体剂量(mg/kg)   开始标准
  1   PBS   0   0   0   第1天
  2   hIg   2   0   10   第1天
  3   CNTO 859   2   0   10   第1天
  4   CNTO 859   2   0   10   50-100mm<sup>3</sup>
  5   hIg   2   0   10   50-100mm<sup>3</sup>
每周一次监控动物的重量和肿瘤体积直到研究结束。在第0天开始对动物称重，而仅在一旦可触知肿瘤时记录肿瘤体积。用卡钳以三维测量肿瘤并基于式V＝(LxWxT)/2计算肿瘤体积，其中L＝长度，W＝宽度，T＝厚度。
计划当肿瘤达到～2000mm3的平均体积时结束研究，如果动物的健康没有受到损害，那么可以任选延长研究。结束时，通过CO2窒息对动物实施安死术并切除和称重肿瘤。然后将个体肿瘤切成两半，一半在OCT中骤冻，而另一半在10％福尔马林中固定。通过心脏穿刺从结束时每只动物采集血清样品。
结果 显示了每个治疗组的肿瘤生长速率，将其以肿瘤体积(mm3)对时间(植入后天数)作图(图12)。对于在第1天用hIg治疗的小鼠，在第29天平均肿瘤体积达到40mm3。然而，在用CNTO859治疗的小鼠中，平均肿瘤体积直到第36天才达到～40mm3。
在第1天用CNTO 859治疗动物导致肿瘤生长的46.9％抑制(P＜0.0001)(见图12)。对约50-100mm3的肿瘤的治疗导致28％的轻微但是不显著的抑制(P＝0.6280)(见图13)。
应该注意到在第14天CNTO 859治疗组中，7只小鼠中的2只由于溃疡肿瘤而不得不在肿瘤植入后第18天处死。这些动物的最终肿瘤体积分别为129.97mm3和461.10mm3。在第14天hIg治疗组中，8只动物在第18天减少到7只。由于这些原因，在第25天结束研究的晚期治疗分支。
总结 CNTO 859抑制肿瘤生长速率最高达46.9％。根据我们的知识，这是首次证明抗人组织因子抗体能够抑制胰腺腺癌的肿瘤生长。用CNTO 859早期治疗导致相对于hIg对照抗体对肿瘤生长速率的显著抑制(P＜0.0001)。用CNTO 859的晚期治疗抑制肿瘤生长速率28％，但不是统计学上显著的(P＝0.6280)。
实施例4
在MATRIGEL血管生成模型中抑制PANC-1胰腺腺癌诱导的血管生成
在该实施例中，我们证明了在MATRIGEL血管生成模型中抗鼠组织因子抗体抑制PANC-1人胰腺腺癌细胞诱导的血管生成的作用。使用转化成全长mIgG2a抗体的人抗体序列的噬菌体文库的定向选择得到抗鼠组织因子的抗体。称作PHD 126和PHD 127的人抗小鼠TF抗体都通过与CNTO 859及其类似物相同的机制抑制小鼠组织因子的活性。具体地，PHD 126和PHD 127是FX的竞争性抑制剂，并且抑制由TF、因子VIIa和酶促活性因子Xa形成的三元复合体的形成。两种抗体都抑制鼠TF促进的凝固并且相对于人TF对鼠TF更具选择性。
材料和方法 从Charles River Laboratories(Wilmington)得到4-6周龄雌性无胸腺(Nu/Nu CD1)小鼠并在实验前适应10-14天。将小鼠(7只/笼)关在顶部有过滤器的笼中并提供高压灭菌的食物和水。通过在研究开始前至少7天放置的编号的耳朵标签或者纹身认别动物。所有动物笼都以IACUC方案号、研究号、动物数目和治疗来认别。在Centocor，Inc.，Radnor，PA的动物园实施所有动物研究。
从ATCC(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)得到人胰腺腺癌细胞系PANC-1。已经检验了其没有病毒或者支原体污染，并且由Centocor’s Cell Biology Services保藏。
在Centocor工程化改造和克隆抗体的完整IgG形式：PHD126原液为1.7mg/ml，PHD原液为0.62mg/mL，且不相关的对照抗体cVaM为10.09mg/ML。已经测试了所有抗体并且它们的LAL＜4EU/mg。
通过胰蛋白酶处理收获对数期的PANC-1细胞，然后将其在完全培养基中洗涤一次并在HBSS中洗涤一次。将PANC-1细胞(3.2×107)重悬浮在8.0mL冰冷的无菌HBSS中并与24mL冰冷的MATRIGEL(Becton Dickson)混合(终浓度为1×106个细胞/mL)。Matrigel的终浓度为10mg/mL。
将小鼠随机分成5组(7只小鼠/组)。用氯胺酮/甲苄噻嗪(90/10mg/kg，腹膜内)麻醉小鼠并称重。对小鼠两个部位的每一个注射0.5ml具有肿瘤细胞悬浮液的Matrigel(组1到4)。仅用Matrigel注射组5动物。
注射部位位于最后一根肋骨尾部约0.5英寸的背侧和距离每侧脊柱0.5英寸处。将一个手指放在注射部位处加速Matrigel聚合并防止任何可能的泄漏。由于使用麻醉和注射冷物质，所以保持体温直到动物苏醒。在这些条件下，缓慢释放抗血管生成因子，从而刺激血管生成过程和新血管形成。在12-48小时内发生血管对凝胶塞的侵入，并且新血管形成持续最长达Matrigel注射后7-10天。
在肿瘤/Matrigel植入后第1天和第5天，对动物注射0.2cc(10mg/kg)每种受试物品或者10mL/kg对照。
表6
  组   治疗   抗体浓度<u>(mg/ml)</u>   IP剂量<u>(mg/kg)</u>   治疗频率   开始标准
  1   HBSS   n/a   10mL/kg   第1、5天   第1天
  2   PHD 126   1   10   第1、5天   第1天
  3   PHD 127   1   10   第1、5天   第1天
  4   cVaM   1   10   第1、5天   第1天
  5   HBSS   n/a   10mL/kg   第1、5天   第1天
在第1、5和9天(研究结束)对所有动物称重。结束时，切除Matrigel塞并对其称重。在第9天，通过CO2窒息对所有动物实施安死术。将动物转移到密闭容器(空的微量分离器(microisolator)笼或者密闭塑料袋)中并送到肿瘤学实验室。在动物园外时，在生物安全通风厨中处理动物。当工作完成时将尸体返回到密闭塑料袋并送到动物园冷藏柜中。手术除去塞子并以盲的方式称重。对塞子照像并处理得到血红蛋白含量和血管长度。
如果在研究期间任何时间动物变得垂死(＞15％体重减轻、呼吸困难、共济失调、震颤等等)，则将通知PI并时动物实施安死术。由PI处置尸体。
总结 血管密度分析后，我们发现相对于对照抗体，PHD126抑制PANC-1诱导的血管生成约60％(不是统计学显著的)，而PHD127抑制血管生成约88％(p＜0.05)。
PHD127抑制血管生成率最高达66％(p＜0.05，one-way ANOVA)，证明抗组织因子抗体能够抑制血管生成。在相同模型中用PHD126治疗也抑制血管生成约45％，尽管结果不是统计学上显著的(图14)。
这些数据证明增殖的细胞产生宿主TF介导的宿主应答，导致血管生成，并因此，产生允许肿瘤生长的条件。

Claims (13)

1.与单克隆抗体TF8-5G9竞争结合人组织因子的人组织因子单克隆抗体或其片段在制备用于抑制有需要的哺乳动物中的人乳腺或胰腺肿瘤生长的药物中的用途，其中所述生长的特征在于血管形成组织增加。
2.根据权利要求1的用途，其中所述抗体片段是Fab、Fab’或者F(ab’)2片段或者其衍生物。
3.根据权利要求1的用途，其中所述抗体或者其片段防止在血浆中形成组织因子：因子VIIa：因子X复合体。
4.根据权利要求1的用途，其中静脉内施用所述单克隆抗体。
5.根据权利要求1的用途，其中以0.05mg/kg到12.0mg/kg体重的量施用所述单克隆抗体。
6.根据权利要求1的用途，其中以快速灌注剂量施用所述单克隆抗体后输注所述抗体。
7.根据权利要求1的用途，其中所述哺乳动物是人类患者。
8.权利要求1的用途，其中所述抗体与第二种抗血管生成剂联合施用。
9.权利要求8的用途，其中所述第二种抗血管生成剂是能够特异结合含有αV的粘着分子的Mab。
10.权利要求8的用途，其中所述第二种抗血管生成剂是能够结合或者功能性阻断参与导致血管生成的细胞信号传导途径的其他靶的mAb。
11.权利要求1的用途，其中所述抗体与抗体治疗、放射治疗、化学治疗剂、蛋白体抑制剂或者法尼基转移酶试剂联合施用。
12.权利要求1的用途，其中所述单克隆抗体选自IgG4和IgG1单克隆抗体。
13.权利要求12的用途，其中所述单克隆抗体是IgG1单克隆抗体。
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