CN109071676A - 使用免疫调节剂的组合的癌症治疗 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在一个方案中靶向细胞以便耗尽的方法，所述细胞包括但不限于癌细胞，所述方案包括使靶细胞与免疫调节剂的组合接触。所述靶细胞的耗尽水平相对于使用单剂的方案是提高的；且效果相对于使用单剂的方案可能是协同的。

Description

使用免疫调节剂的组合的癌症治疗
相关申请案
本申请要求2016年1月21日提交的美国临时专利申请号62/281,571和2016年3月1日提交的美国临时专利申请号62/301,981的权益，这些申请以引用的方式整体并入本文。
发明背景
免疫系统监测并破坏异常细胞的天然能力可预防许多癌症的发展。然而，癌细胞有时能逃避免疫系统的监测和破坏。癌细胞可减少肿瘤抗原在其表面上的表达，使得免疫系统更难以监测它们；在其表面上表达诱导免疫细胞失活的蛋白质；和/或在微环境中诱导细胞以释放抑制免疫应答并促进肿瘤细胞增殖和存活的物质。
已开发了癌症免疫疗法以便通过刺激免疫系统的特定组分或通过抵消由抑制免疫应答的癌细胞产生的信号来增强对肿瘤的免疫应答。
一种方式是阻断免疫检查点蛋白质，这限制了免疫应答的强度和持续时间。这些蛋白质通常通过防止应答过强来保持免疫应答在控制中，过强的应答既可能损伤正常细胞也可能损伤异常细胞。阻断免疫检查点蛋白质的活性将对免疫系统释放“制动(brakes)”，使其破坏癌细胞的能力提高。
在当前临床使用中的免疫检查点抑制剂包括易普利单抗，其阻断CTLA4的活性，CTLA4在激活的细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达。CTLA4充当“开关”以使这些T细胞失活，由此降低免疫应答的强度；对其的抑制增强了细胞毒性T细胞应答。两种其它FDA批准的检查点抑制剂纳武单抗和派姆单抗以类似的方式工作，但它们靶向PD-1。
其它形式的免疫疗法使用通常有助于调节或调控免疫系统活性以增强机体抗癌的免疫应答的蛋白质，例如白介素和干扰素。靶向肿瘤细胞抗原的抗体也在临床中使用。
其它形式的免疫疗法利用先天性免疫系统。健康细胞上的细胞表面蛋白CD47及其吞噬细胞受体SIRPα的接合构成了关键的“别吃我”信号，该信号可关闭由多种模式介导的内吞，包括凋亡细胞清除和FcR介导的吞噬。阻断吞噬细胞上SIRPα的CD47介导的接合或CD47表达在敲除小鼠中的丧失可引起活细胞和非老化红血球的去除。或者，阻断SIRPα识别也允许通常不被吞噬的靶标的内吞。抗CD47抗体治疗还显示不仅能够实现癌症的巨噬细胞吞噬，而且也可引发抗肿瘤细胞毒性T细胞免疫应答。
相关出版物包括"Engineered Sirp alpha Variants As ImmunotherapeuticAdjuvants To Anticancer Antibodies."Science 341(6141):88-91；Willingham,S.B.,J.P.Volkmer,等人(2012)."The Cd47-Signal Regulatory Protein Alpha(Sirpa)Interaction Is A Therapeutic Target For Human Solid Tumors."Proc Natl AcadSci U S A 109(17):6662-6667.Chao,M.P.,A.A.Alizadeh,等人(2010)."Anti-Cd47Antibody Synergizes With Rituximab To Promote Phagocytosis And Eradicate Non-Hodgkin Lymphoma."Cell 142(5):699-713。
发明概要
提供了在一个方案中靶向细胞以便耗尽的方法，所述细胞包括但不限于肿瘤细胞，所述方案包括使靶细胞和效应细胞与两种或更多种调控免疫调节信号传导的剂的组合接触。在一些实施方案中，所述接触是在体内进行。在一些实施方案中，所述接触是在体外进行，例如以便致敏免疫效应细胞，然后向受试者施用。在一些实施方案中，剂的组合相对于作为单一疗法的剂的施用提供协同效应。在各种实施方案中，在治疗方案中施用免疫调节剂的组合，所述治疗方案包括常规治疗，例如，靶向的抗肿瘤抗体、化疗、放疗、手术等。
本发明的益处可以是相对于单一免疫调节剂或在不存在CD47阻断下免疫调节剂的组合所需的剂量，使用较低剂量的剂。本发明的益处也可或替代地为相对于单一免疫调节剂或在不存在CD47阻断下免疫调节剂的组合治疗所需的时间长度，治疗所需时间长度的缩短。本发明的益处也可或替代地为相对于单一免疫调节剂或在不存在CD47阻断下免疫调节剂的组合的治疗之后观察到的反应，增强的反应。
免疫调节剂包括(i)阻断CD47活性的剂；和(ii)激动免疫共刺激分子(例如CD40、OX40等)的一种或多种剂；和/或(iii)拮抗免疫抑制性分子(例如CTLA-4、PD1、PDL1等)的剂。活性剂是在一定时间内施用以在宿主中对癌细胞的耗尽产生附加或协同效应。施用可为包括但不限于以下的施用方法：全身施用、肿瘤内施用等。通常，活性剂(i)在与剂(ii)和/或(iii)相距以下的时间段内施用：约45天、约30天、约21天、约14天、约10天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天、约1天或基本上同一天。在一些实施方案中，剂(i)是在剂(ii)和/或(iii)之前施用。在一些实施方案中，剂(i)是在剂(ii)和/或(iii)之后施用。如果施用方案是如此以使得两种剂的血清水平同时在治疗水平下，那么这两种剂可认为是组合的。为了耗尽癌细胞群，必要时可重复施用。
在一些实施方案中，选择单一的癌症以便用本发明的组合疗法进行治疗，因为所述癌症是对以下检查点抑制剂有反应的癌症类型，例如PD1拮抗剂、PDL1拮抗剂、CTLA4拮抗剂、TIM-3拮抗剂、BTLA拮抗剂、VISTA拮抗剂、LAG3拮抗剂等。在一些实施方案中，这种免疫调节剂是CTLA-4、PD1或PDL1拮抗剂，例如艾维单抗(avelumab)、纳武单抗、派姆单抗、易普利单抗等。在一些这类实施方案中，癌症是但不限于黑色素瘤或小细胞肺癌。在一些这类实施方案中，癌症是具有高的新抗原或诱变负荷的类型，参见Vogelstein等人(2013)Science339(6127):1546-1558，其明确地以引用方式并入本文)。在其它实施方案中，癌症是具有低的新抗原负荷的类型。在一些这类实施方案中，本发明的组合疗法提高了检查点抑制剂的活性。在其它实施方案中，当单一的癌症对检查点抑制剂单独没有反应时，组合疗法提供治疗反应。
在一些实施方案中，选择单一的癌症以便用本发明的组合疗法进行治疗，因为所述癌症是对以下免疫应答激动剂有反应的癌症类型，例如CD28激动剂、OX40激动剂、GITR激动剂、CD137激动剂、CD27激动剂、HVEM激动剂等。在一些实施方案中，这种免疫调节剂是OX40、CD137或GITR激动剂，例如替西木单抗等。在一些这类实施方案中，癌症是但不限于黑色素瘤或小细胞肺癌。在一些这类实施方案中，癌症是具有高的新抗原或诱变负荷的类型。在其它实施方案中，癌症是具有低的新抗原负荷的类型。在一些这类实施方案中，本发明的组合疗法提高了激动剂的活性。在其它实施方案中，当单一的癌症对激动剂单独没有反应时，组合疗法提供治疗反应。
在一些实施方案中，选择单一的癌症以便用本发明的组合疗法进行治疗，因为所述癌症是对趋化因子受体拮抗剂(例如CCR2、CCR4等)有反应的癌症类型。在一些这类实施方案中，所述癌症是但不限于淋巴瘤，包括但不限于T细胞淋巴瘤，例如皮肤T细胞淋巴瘤。在一些这类实施方案中，癌症是具有高的新抗原或诱变负荷的类型。在其它实施方案中，癌症是具有低的新抗原负荷的类型。在一些这类实施方案中，本发明的组合疗法提高了抗趋化因子受体拮抗剂的活性。在其它实施方案中，当单一的癌症对拮抗剂单独没有反应时，组合疗法提供治疗反应。
本发明的方法还可包括施用特异性地结合至靶细胞或抑制性免疫细胞的剂，例如抗体或其生物活性片段或衍生物。靶细胞(例如癌细胞)、抑制性免疫细胞(包括但不限于调节性T细胞)的耗尽水平。许多抗体目前在临床中用于治疗癌症，且其它处于临床开发的不同阶段。本发明的方法所关注的抗体可经由ADCC起作用，并且可对肿瘤细胞具有选择性，不过本领域技术人员还认识到一些临床上有用的抗体作用于非肿瘤细胞，例如CD20等。
在一些实施方案中，在向个体施用治疗有效剂量的抗CD47剂之前施用致敏剂(primer agent)。合适的致敏剂包括红细胞生成刺激剂(ESA)和/或致敏剂量的抗CD47剂。在施用致敏剂且容许有效使网织红细胞产生增加的一段时间之后，施用治疗剂量的抗CD47剂。可以许多不同的方式施用治疗剂量。在一些实施方案中，在施用致敏剂之后施用两个或更多个治疗有效剂量。在一些实施方案中，抗CD47剂的治疗有效剂量是作为两个或更多个浓度渐增的剂量来施用，在其它中，剂量是相等的。
在一些实施方案中，将本发明剂的组合的施用与有效剂量的提高患者血细胞比容的剂组合，例如促红细胞生成素刺激剂(ESA)。这类剂是已知的且用于本领域中，包括，例如(阿法达贝泊汀)、NF/NF(阿法依泊汀)、(peginesatide)、等。
用于本发明方法中的抗CD47剂干扰癌细胞上呈递的CD47与吞噬细胞上呈递的SIRPα之间的结合。这种方法增加了癌细胞的吞噬。合适的抗CD47剂包括可溶性SIRPα多肽；可溶性CD47；抗CD47抗体；抗SIRPα抗体等，其中术语抗体涵盖抗体片段和其变体，如本领域中已知的。在一些实施方案中，抗CD47剂为抗CD47抗体。在一些实施方案中，抗CD47抗体为非溶血性抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含人IgG4 Fc区。
附图简述
图1.组合的CD40激动剂和CD47拮抗剂的效应。
图2.(A-C)组合的抗CTLA-4和CD47拮抗剂的效应。
具体实施方式
提供了用于在受试者中靶向耗尽癌细胞的方法，其中在与以下剂的组合接触之后通过针对肿瘤细胞的免疫细胞应答而选择性地切除癌细胞：(i)阻断CD47信号；和(ii)激动免疫共刺激分子(例如CD40、OX40、CD28、GITR、CD137、CD27、HVEM等)的一种或多种剂；和/或(iii)拮抗免疫抑制性分子(例如CTLA-4、PD1、PDL1、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3等)的剂。
为了有助于理解本发明，以下定义了许多术语。
在描述本发明的活性剂和方法之前，应理解本发明不限于所述的具体方法、产品、设备和因素，因为这些方法、设备和制剂当然可以变化。还应该理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意图限制本发明的范围，因为本发明的范围只受所附权利要求书的限制。
应注意除非文中另外清楚陈述，如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。因此，例如，提及“药物候选物”是指这类候选物中的一个或混合物，且提及“方法”包括提及本领域技术人员已知的等效步骤和方法，诸如此类。
除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文中提及的所有出版物以引用的方式并入本文，目的在于描述和公开在出版物中所述且可能与本文所述发明相关联使用的装置、制剂和方法。
当提供一个数值范围时，应该理解的是介于该范围的上下限间的每一个中间值(除非文中另外清楚地指出，所述中间值是下限单位的十分之一)和任何其它所说明的或者在所说明的范围中的中间值都被包括在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地被包括在该较小的范围中，且在所说明范围内明确地排除极限值的条件下也被包括在本发明内。当所述范围包括所述限值中的一个或两个时，排除了那些所包括的上下限中的一个或两个的范围也包括在本发明范围内。
在下面的描述中，阐述了许多具体的细节，以便更透彻地理解本发明。然而，对本领域技术人员显而易见的是，本发明可在没有这些细节中的一个或多个的情况下实践。在其它情况下，未对本领域技术人员所熟知的特征和工序加以描述，以免使本发明不清楚。
一般地，本发明使用了本领域中惯用的蛋白质合成、重组细胞培养和蛋白质分离、及重组DNA技术等方法。这些技术在以下文献中充分说明，参见，例如Maniatis,Fritsch&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Sambrook,Russell andSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2001)；Harlow,Lane和Harlow,Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No.I,Cold SpringHarbor Laboratory(1998)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory；(1988)。
定义
抗-CD47剂。CD47是广泛表达的跨膜糖蛋白，其具有单个Ig样结构域和5个跨膜区，其用作SIRPα经由SIRPα的NH2-末端V样结构域介导的结合的细胞配体。SIRPα主要在骨髓细胞上表达，包括巨噬细胞、粒细胞、髓样树突状细胞(DC)、肥大细胞及它们的前体，包括造血干细胞。SIRPα上介导CD47结合的结构决定簇在Lee等人(2007)J.Immunol.179:7741-7750；Hatherley等人(2008)Mol Cell.31(2):266-77；Hatherley等人(2007)J.B.C.282:14567-75中论述；且SIRPα顺式二聚化在CD47结合中的作用在Lee等人(2010)J.B.C.285:37953-63中论述。与CD47抑制正常细胞的吞噬的作用一致，有证据表明其刚好在移行期之前和期间在造血干细胞(HSC)和祖细胞上被瞬时上调，并且在这些细胞上的CD47水平确定其在体内被吞没的可能性。
如本文所用，术语“抗CD47剂”或“为CD47阻断而提供的剂”是指减少CD47(例如，在靶细胞上)与SIRPα(例如，在吞噬细胞上)的结合的任何剂。合适的抗CD47剂的非限制性实例包括SIRPα剂，包括但不限于高亲和力SIRPα多肽、抗SIRPα抗体、可溶性CD47多肽及抗CD47抗体或抗体片段。在一些实施方案中，合适的抗CD47剂(例如，抗CD47抗体、SIRPα剂等)特异性地结合CD47以减少CD47与SIRPα的结合。
在一些实施方案中，合适的抗CD47剂(例如，抗SIRPα抗体、可溶性CD47多肽等)特异性地结合SIRPα以减少CD47与SIRPα的结合。结合SIRPα的合适的抗CD47剂不激活SIRPα(例如，在表达SIRPα的吞噬细胞中)。合适的抗CD47剂的功效可通过分析所述剂来评估。在一个示例性测定中，将靶细胞在候选剂存在或不存在下且在效应细胞(例如巨噬细胞或其它吞噬细胞)存在下孵育。用于本发明方法中的剂将吞噬与在所述剂不存在下的吞噬相比上调了至少5％(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少120％、至少140％、至少160％、至少180％、至少200％、至少500％、至少1000％)。类似地，与在候选剂不存在下观察到的磷酸化相比，SIRPα的酪氨酸磷酸化水平的体外测定显示出磷酸化减少了至少5％(例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％)。
在一些实施方案中，抗CD47剂一旦结合不会激活CD47。当CD47被激活时，可发生类似细胞凋亡(即程序性细胞死亡)的过程(Manna和Frazier,Cancer Research,64,1026-1036,2004年2月1日)。因此，在一些实施方案中，抗CD47剂不直接诱导表达CD47的细胞的死亡。
在一些实施方案中，在向个体施用治疗有效剂量的抗CD47剂之前施用致敏剂。合适的致敏剂包括红细胞生成刺激剂(ESA)和/或致敏剂量的抗CD47剂。在施用致敏剂且容许对网织红细胞产生增加有效的一段时间之后，施用治疗剂量的抗CD47剂。可根据同时待审的专利申请USSN 14/769,069中所述的方法进行施用，该专利明确地以引用方式并入本文。
SIRPα剂。SIRPα剂包含SIRPα足以在可识别的亲和力下结合CD47的部分，该部分通常位于信号序列与跨膜结构域或其片段之间，并且保留结合活性。合适的SIRPα剂减轻(例如，阻断、防止等)天然蛋白SIRPα与CD47之间的相互作用。SIRPα剂通常至少包含SIRPα的d1结构域。
在一些实施方案中，本发明的抗CD47剂是“高亲和力SIRPα剂”，其包括SIRPα源多肽及其类似物(例如，CV1-hIgG4和CV1单体)。高亲和力SIRPα剂描述于国际申请PCT/US13/21937中，该申请明确地据此以引用的方式并入。高亲和力SIRPα剂是天然SIRPα蛋白的变体。提供提高的亲和力的氨基酸变化位于d1结构域中，且因此高亲和力SIRPα剂包含人SIRPα的d1结构域，其中相对于d1结构域内的野生型序列具有至少一个氨基酸变化。这种高亲和力SIRPα剂任选地包含额外的氨基酸序列，例如抗体Fc序列；野生型人SIRPα蛋白的除d1结构域外的部分，包括但不限于天然蛋白的残基150至374或其片段，通常与d1结构域邻接的片段；等等。高亲和力SIRPα剂可为单体或多聚体，即二聚体、三聚体、四聚体等。在一些实施方案中，高亲和力SIRPα剂是可溶性的，其中多肽缺乏SIRPα跨膜结构域且相对于野生型SIRPα序列包含至少一个氨基酸变化，且其中所述氨基酸变化提高了SIRPα多肽结合至CD47的亲和力，例如使解离率降低了至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更多。
任选地，SIRPα剂是融合蛋白，例如，与第二多肽框内融合。在一些实施方案中，第二多肽能够增加融合蛋白的尺寸，例如，由此融合蛋白不能快速地从循环中清除。在一些实施方案中，第二多肽是免疫球蛋白Fc区的部分或全部。Fc区通过提供“吃我”信号促进吞噬，这增强了由高亲和力SIRPα剂提供的“别吃我”信号的阻断。在其它实施方案中，第二多肽是大致类似于Fc的任何合适的多肽，例如，提供增加的尺寸、多聚化结构域和/或与Ig分子的额外结合或相互作用。
抗-CD47抗体。在一些实施方案中，本发明的抗CD47剂为一种抗体，其特异性地结合CD47(即抗CD47抗体)并减轻一种细胞(例如受感染的细胞)上的CD47与另一种细胞(例如吞噬细胞)上的SIRPα之间的相互作用。在一些实施方案中，合适的抗CD47抗体一旦结合不会激活CD47。一些抗CD47抗体不减少CD47与SIRPα的结合(且因此在本文中被视为“抗CD47剂”)且这种抗体可被称为“非阻断抗CD47抗体”。作为“抗CD47剂”的合适的抗CD47抗体可被称为“CD47-阻断抗体”。合适的抗体的非限制性实例包括克隆B6H12、5F9、8B6和C3(例如，如国际专利公布WO 2011/143624中所述，其明确地以引用方式并入本文)。合适的抗CD47抗体包括这类抗体的全人、人源化或嵌合型式。人源化抗体(例如，hu5F9-G4)尤其适于人的体内应用，这归因于它们的低抗原性。类似地，犬源化、猫源化等抗体尤其分别适于狗、猫及其它物种中的应用。所关注的抗体包括人源化抗体、或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化等抗体及其变体。
在一些实施方案中，抗CD47抗体包含人IgG Fc区，例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4恒定区。在一个优选实施方案中，IgG Fc区为IgG4恒定区。IgG4铰链可通过氨基酸取代S241P而稳定(参见Angal等人(1993)Mol.Immunol.30(1):105-108，其明确地以引用方式并入本文)。
抗SIRPα抗体。在一些实施方案中，本发明的抗CD47剂是一种抗体，其特异性地结合SIRPα(即抗SIRPα抗体)并减轻一种细胞(例如受感染的细胞)上的CD47与另一种细胞(例如吞噬细胞)上的SIRPα之间的相互作用。合适的抗SIRPα抗体可在不激活或刺激经由SIRPα的信号传导的情况下结合SIRPα，因为SIRPα的激活将抑制吞噬。相反，合适的抗SIRPα抗体促进受影响细胞与正常细胞相比的优先吞噬。相对于其它细胞(未受感染的细胞)表达较高水平的CD47(例如，受感染的细胞)的那些细胞将优先被吞噬。因此，合适的抗SIRPα抗体特异性地结合SIRPα(而不会激活/刺激足够的信号传导反应以抑制吞噬)并且阻断SIRPα与CD47之间的相互作用。合适的抗SIRPα抗体包括这类抗体的全人、人源化或嵌合型式。人源化抗体尤其适于人的体内应用，这归因于它们的低抗原性。类似地，犬源化、猫源化等抗体尤其分别适于狗、猫及其它物种中的应用。所关注的抗体包括人源化抗体、或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化等抗体及其变体。
可溶性CD47多肽。在一些实施方案中，本发明的抗CD47剂为可溶性CD47多肽，其特异性地结合SIRPα并减轻一种细胞(例如受感染的细胞)上的CD47与另一种细胞(例如吞噬细胞)上的SIRPα之间的相互作用。合适的可溶性CD47多肽可在不激活或刺激经由SIRPα的信号传导的情况下结合SIRPα，因为SIRPα的激活不会抑制吞噬作用。相反，合适的可溶性CD47多肽促进受感染的细胞与未受感染细胞相比的优先吞噬。相对于正常的、非靶细胞(正常细胞)表达较高水平的CD47(例如，受感染细胞)的那些细胞将优先被吞噬。因此，合适的可溶性CD47多肽特异性地结合SIRPα，而不会激活/刺激足够的信号传导反应以抑制吞噬。
在一些情况下，合适的可溶性CD47多肽可为融合蛋白(例如，在结构上如美国专利公布US20100239579中所述，该专利明确地以引用的方式并入本文)。然而，仅仅不激活/刺激SIRPα的融合蛋白适用于本文所提供的方法。合适的可溶性CD47多肽还包括包含变体或天然存在的CD47序列(例如，胞外结构域序列或胞外结构域变体)的任何肽或肽片段，其可特异性地结合SIRPα并抑制CD47与SIRPα之间的相互作用，而不会刺激足够的SIRPα活性来抑制吞噬。
在某些实施方案中，可溶性CD47多肽包含CD47的胞外结构域，包括信号肽，以使得CD47的胞外部分的长度通常为142个氨基酸。本文所述的可溶性CD47多肽还包括CD47胞外结构域变体，所述变体包含至少65％-75％、75％-80％、80-85％、85％-90％或95％-99％的氨基酸序列(或在65％至100％之间未具体列举的任何同一性百分比)，所述变体在不刺激SIRPα信号传导的情况下保留结合至SIRPα的能力。
在某些实施方案中，信号肽氨基酸序列可被来源于另一种多肽(实例，免疫球蛋白或CTLA4)的信号肽氨基酸序列取代。例如，不同于全长CD47(其为跨过外细胞膜的细胞表面多肽)，可溶性CD47多肽被分泌；因此，编码可溶性CD47多肽的多核苷酸可包括编码与通常从细胞中分泌的多肽有关的信号肽的核苷酸序列。
在其它实施方案中，可溶性CD47多肽包含缺乏信号肽的CD47的胞外结构域。如本文所述，信号肽没有在分泌或跨膜蛋白的细胞表面上暴露，因为信号肽在蛋白质的易位期间裂解或者信号肽仍然锚定于外细胞膜中(这种肽也被称为信号锚定物)。CD47的信号肽序列据信在体内从前体CD47多肽上裂解。
在其它实施方案中，可溶性CD47多肽包含CD47胞外结构域变体。这种可溶性CD47多肽保留在不刺激SIRPα信号传导的情况下结合至SIRPα的能力。CD47胞外结构域变体可具有与天然CD47序列至少65％-75％、75％-80％、80-85％、85％-90％或95％-99％同一(包括在任何一个所述范围之间的任何同一性百分比)的氨基酸序列。
免疫反应调节剂。免疫检查点蛋白是免疫抑制性分子，其用于降低对于靶细胞，特别是本发明方法中的肿瘤细胞的免疫反应性。T细胞对肿瘤的内源性应答可因激活免疫检查点(免疫抑制性蛋白)和抑制共刺激受体(免疫激活蛋白)的肿瘤细胞而失调。在本领域中被称为“免疫检查点抑制剂”的治疗剂类别通过施用抑制性信号的拮抗剂而逆转免疫应答的抑制。其它免疫疗法施用免疫共刺激分子的激动剂以提高反应性。在一些实施方案中，T细胞激活的体外测定(包括但不限于实施例中的测定)被用于确定特定的组合和给药方案。
在临床癌症免疫疗法的背景下最积极地研究的免疫检查点受体，即程序化细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4；也称为CD152)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1；也称为CD279)-两者都是抑制性受体。阻断这些受体中的任一个的抗体的临床活性意味着抗肿瘤免疫力可在多个水平下提高且组合策略可被巧妙设计，由机理考量和临床前模型来指导。
CTLA4仅在T细胞上表达，在其上它主要调节T细胞激活早期的幅度。CTLA4抵消T细胞共刺激受体CD28的活性。CD28和CTLA4共享相同的配体：CD80(也称为B7.1)和CD86(也称为B7.2)。CTLA4的主要生理作用是下调辅助T细胞的活性和提高调节性T(TReg)细胞的免疫抑制活性。CTLA4阻断造成免疫应答的广泛增强。两种完全人源化的CTLA4抗体易普利单抗和替西木单抗在临床试验和使用中。在临床上对免疫检查点阻断剂的反应是缓慢的且在许多患者中，在治疗开始之后延迟高达6个月。在一些情况下，在退化之前，转移性病变的尺寸实际上在计算机断层摄影(CT)或磁共振成像(MRI)扫描上是增加的。
拮抗此抑制性免疫功能的抗CTLA4抗体是非常有效的治疗剂，但具有显著副作用，因为这还能实现T细胞针对其自身的活性，该活性通常通过这些抑制性分子和途径而被抑制。与阻断CD47活性的剂的组合出于以下原因而对使这些副作用最少是有利的。抗CD47剂可在抗CTLA4剂的疗法之前给予并刺激特异性抗肿瘤T细胞应答(Anti-CD47 antibody-mediated phagocytosis of cancer by macrophages primes an effective antitumorT-cell response；Tseng等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2013年7月2日；110(27):11103-8)。后续的抗CTLA4疗法将容许特异性抗肿瘤T细胞的活性和扩增。然而，相对于抗CTLA4单一疗法，可使用较短的治疗时期和/或较低的剂量，因为特异性和有效的抗肿瘤T细胞已在抗CTLA4的治疗之前被诱导且因此抗CTLA4疗法的治疗效果可在较少的副作用下实现。抗CTLA4的治疗可(a)在抗CD47剂之后，潜在地以较低剂量；或(b)与抗CD47剂同时，但以较低剂量。或者，抗CTLA4剂量和治疗持续时间可在常规的水平下，当与抗CD47组合时具有提高的效力。
在一些实施方案中，抗CTLA4剂的剂量被减至使不希望有的副作用最少的水平，例如，以至多约90％的目前批准剂量的剂量，例如至多约80％、至多约70％、至多约60％、至多约50％、至多约40％、至多约30％、至多约20％、至多约10％、至多约5％的常规剂量。在一些实施方案中，剂量的数目是减少的，例如，抗CTLA4剂的给药不超过1X、不超过2X、不超过3X等。作为参照，例如，当前方案通常需要以3mg/kg的剂量施用易普利单抗，每3周施用一次，总共4次给药；任选地与额外的剂组合，例如像氮烯唑胺或替莫唑胺；或与肽疫苗组合。其它方案探究了以10mg/kg的剂量施用易普利单抗作为针对转移性黑色素瘤的单一剂。
替西木单抗是以在0.01mg/kg至15mg/kg范围内的剂量作为单抗体输注来施用。客观反应在3mg/kg及以上的剂量下是明显的。大多数反应是在一个月时实现超过30μg/ml的替西木单抗的持续血浆水平的患者中观察到。已在II期随机化临床试验中进一步研究了每月施用的10mg/kg剂量和每3个月施用的15mg/kg剂量，然而，当更经常用10mg/kg的每月方案给药时，毒性是加倍的。基于这些数据，将每3个月15mg/kg的单剂替西木单抗选出用于临床试验。
对于一些患者，CTLA-4阻断激活免疫系统的能力产生表征为免疫相关不良事件(irAE)的炎性表现。临床上最显著的irAE是小肠结肠炎，其范围可根据严重性来划分；III/IV期小肠结肠炎见于～15％的用10mg/kg易普利单抗治疗的患者中。另外的irAE包括皮疹/搔痒症(>50％)、肝炎(5-10％)、垂体炎(5％)、葡萄膜炎(<2％)、胰腺炎(<2％)和白细胞减少(<2％)。与抗CD47剂的组合可减少这种不良事件。在本发明的一些实施方案中，提供了一种用抑制CTLA-4的剂与抗CD47剂的组合治疗癌症的方法，其中相对于在抗CD47剂不存在下抗CTLA-4所需的给药，剂以组合形式的给药提供了在免疫相关不良事件的临床明显减少情况下的癌症治疗。
CTLA4在抑制T细胞激活和扩增的调节性T细胞上表达并且抗CTLA4抗体阻断它们的抑制性免疫抑制功能。因此，抗肿瘤T细胞可保持活化和扩增的。此效应的一方面是抑制性信号传导途径的抑制，但另一方面是表达CTLA4的调节性T细胞的耗尽。因此，为了得到非常有效的抗肿瘤效应，可能希望增强调节性T细胞的耗尽。所述耗尽是通过ADCP、ADCC和/或CDC介导。抗CD47剂可与靶单克隆抗体协同并增强它们刺激ADCP和ADCC的效力(抗CD47抗体与利妥昔单抗协同以促进吞噬并根除非何杰金氏淋巴瘤，Chao等人,Cell.2010年9月3日；142(5):699-713)。因此，抗CTLA4剂与抗CD47剂的组合可提高该效力。抗CD47可与抗CTLA4一同给予。因为该效力将被提高，所以抗CTLA4疗法的持续时间与当前治疗方案相比可缩短。
其它免疫检查点蛋白是PD1和PDL1。在当前临床中使用的针对这些靶标的抗体包括纳武单抗和派姆单抗。PD1的主要作用是在针对感染的炎性反应之时限制T细胞在外周组织中的活性并限制自身免疫性。当T细胞被激活时，诱导PD1表达。当由其配体中的一个接合时，PD1抑制牵涉于T细胞激活中的激酶。PD1在TReg细胞上高度表达，其中它可在配体存在下增加这些细胞的增殖。因为许多肿瘤高度浸润了TReg细胞，所以PD1途径的阻断也可通过减少肿瘤内TReg细胞的数量和/或降低其抑制活性来增强抗肿瘤免疫反应。
PD1的两个配体是PD1配体1(PDL1；也称为B7-H1和CD274)和PDL2(也称为B7-DC和CD273)。PD1配体通常在来自许多不同的人肿瘤的肿瘤细胞表面上被上调。在来自实体肿瘤的细胞上，表达的主要PD1配体是PDL1。PDL1在癌细胞上表达并且通过结合至T细胞上的其受体PD1，其抑制了T细胞激活/功能。因此，PD1和PDL1阻断剂可克服此抑制性信号传导并且保持或恢复抗肿瘤T细胞功能。抗CD47剂可刺激特异性抗肿瘤T细胞应答(Anti-CD47antibody-mediated phagocytosis of cancer by macrophages primes aneffective antitumor T-cell response；Tseng等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2013年7月2日；110(27):11103-8)。抗PD1/PDL1剂可提高抗CD47剂的功效。CD47剂可与抗PD1/PDL1剂组合或在其之前施用以模拟肿瘤特异性T细胞的致敏，如果抑制性抗PD1/PDL1途径被阻断，那么这些肿瘤特异性T细胞便可扩增。
PDL1在癌细胞上表达并且通过结合至其在T细胞上的受体PD1，其抑制T细胞激活/功能。因此，PD1和PDL1阻断剂可克服此抑制性信号传导并且保持或恢复抗肿瘤T细胞功能。然而，由于PDL1在肿瘤细胞上表达，所以结合并阻断PDL1的抗体也可实现肿瘤细胞的ADCP、ADCC和CDC。抗CD47剂可与靶单克隆抗体协同并增强它们刺激ADCP和ADCC的效力(抗CD47抗体与利妥昔单抗协同以促进吞噬并根除非何杰金氏淋巴瘤，Chao等人,Cell.2010年9月3日；142(5):699-713)。因此，抗PDL1剂与抗CD47剂的组合可提高抗肿瘤效力。这些剂可以一起施用(在同一治疗过程中，不一定是相同的天和频率)。
淋巴细胞活化基因3(LAG3；也称为CD223)、2B4(也称为CD244)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA；也称为CD272)、T细胞膜蛋白3(TIM3；也称为HAVcr2)、腺苷A2a受体(A2aR)和杀伤抑制性受体家族各自都与淋巴细胞活性的抑制有且在一些情况下与淋巴细胞无反应性的诱导有关。靶向这些受体的抗体可用于本发明方法中。
LAG3是增强TReg细胞的功能的CD4同系物。LAG3还抑制CD8+效应T细胞功能，这与其对TReg细胞的作用无关。LAG3的唯一已知的配体是MHC II类分子，其在浸润肿瘤的巨噬细胞和树突细胞上表达。LAG3是各种免疫检查点受体中的一个，这些受体在TReg细胞和无反应性T细胞上协同地上调，并且这些受体的同时阻断可造成相对于一个受体单独的阻断来说此无反应性状态的逆转增强。具体说来，PD1和LAG3通常在无反应性或已耗竭的T细胞上共表达。LAG3和PD1的双重阻断在慢性感染的背景下的肿瘤特异性CD8+T细胞和病毒特异性CD8+T细胞中协同地逆转无反应性。LAG3阻断剂可克服此抑制性信号传导并且保持或恢复抗肿瘤T细胞功能。抗CD47剂可刺激特异性抗肿瘤T细胞应答(Anti-CD47antibody-mediatedphagocytosis of cancer by macrophages primes an effective antitumor T-cellresponse；Tseng等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2013年7月2日；110(27):11103-8.)。因此，LAG3剂可提高抗CD47剂的功效。CD47剂可与抗LAG3剂组合或在其之前给予以刺激肿瘤特异性T细胞的致敏，如果抑制性抗LAG3途径被阻断，那么这些肿瘤特异性T细胞便可扩增。
TIM3抑制T辅助1(TH1)细胞反应，且TIM3抗体提高抗肿瘤免疫力。还据报道TIM3与肿瘤特异性CD8+T细胞上的PD1共表达。Tim3阻断剂可克服此抑制性信号传导并且保持或恢复抗肿瘤T细胞功能。抗CD47剂可刺激特异性抗肿瘤T细胞应答(Anti-CD47 antibody-mediated phagocytosis of cancer by macrophages primes an effective antitumorT-cell response；Tseng等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2013年7月2日；110(27):11103-8)。因此，Tim3剂可提高抗CD47剂的功效。CD47剂可与抗Tim3剂组合或在其之前给予以刺激肿瘤特异性T细胞的致敏，如果抑制性抗Tim3途径被阻断，那么这些肿瘤特异性T细胞便可扩增。
BTLA是T细胞上与TNFRSF14相互作用的抑制性受体。BTLAhi T细胞在其配体存在下受抑制。相互作用分子的系统是复合物：CD160(免疫球蛋白超家族成员)和LIGHT(也称为TNFSF14)，分别介导抑制性和共刺激活性。信号传导可为双向的，这取决于相互作用的特定组合。BTLA和PD1的双重阻断增强抗肿瘤免疫力。
A2aR(其配体是腺苷)抑制T细胞应答，部分地通过促使CD4+T细胞表达FOXP3且由此发育成TReg细胞。此受体的缺失导致针对感染的增强的和有时病理性的炎性反应。A2aR可被阻断腺苷结合的抗体或腺苷类似物抑制。
激动免疫共刺激分子的剂也适用于本发明方法中。这种剂包括激动剂或CD40和OX40。CD40是见于抗原呈递细胞(APC)上的共刺激蛋白并且是其活化所需的。这些APC包括吞噬细胞(巨噬细胞和树突细胞)和B细胞。CD40是TNF受体家族的一部分。CD40的主要激活信号分子是IFNγ和CD40配体(CD40L)。通过CD40的刺激激活了巨噬细胞。CD47阻断剂的重要效应之一是增强巨噬细胞及其它吞噬细胞对靶细胞的吞噬。因此，与各个单一疗法(实施例1)相比，组合激动性CD40配体与抗CD47可提高治疗功效。激动性CD40剂可与抗CD47剂基本上同时施用；或可在抗CD47的治疗之前且与其同时施用以预激活巨噬细胞。
OX40(CD134)是在T细胞上表达的TNFR超家族的一个成员。结合OX40的分子可刺激T细胞的增殖和分化。抗CD47剂可刺激特异性抗肿瘤T细胞应答(Anti-CD47 antibody-mediated phagocytosis of cancer by macrophages primes an effective antitumorT-cell response；Tseng等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2013年7月2日；110(27):11103-8)。激动性OX40剂可提高抗CD47剂的功效。激动性OX40剂可基本上与抗CD47剂同时施用；或可在抗CD47的治疗之前且同时施用以模拟肿瘤特异性T细胞克隆的致敏，所述T细胞克隆可通过OX40剂被扩增。
可根据本文所述的方法与CD47阻断组合施用的其它免疫肿瘤剂包括对趋化因子受体有特异性的抗体，包括但不限于抗CCR4和抗CCR2。所关注的抗CCR4(CD194)抗体包括针对C-C趋化因子受体4(CCR4)的人源化单克隆抗体，其具有潜在的抗炎和抗肿瘤活性。实例是莫加珠单抗(mogamulizumab)，其选择性地结合至CCR4并阻断CCR4的活性，其可抑制CCR4介导的信号传导途径及由此趋化因子介导的细胞迁移和T细胞的增殖及趋化因子介导的血管生成。另外，此剂可诱导针对CCR4阳性T细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。CCR4，一种针对C-C趋化因子(如MIP-1、RANTES、TARC和MCP-1)的G偶联蛋白受体，是在一些类型的T细胞、内皮细胞和一些类型的神经元的表面上表达。CCR4(也称为CD194)可在成人T细胞淋巴瘤(ATL)和外周T细胞淋巴瘤(PTCL)细胞上过度表达。
抗CCR4 Ab可与用于CD47阻断以便于CCR4阳性靶细胞的耗尽增加的剂组合施用，包括但不限于T细胞淋巴瘤，尤其是皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)或DLBCL、乳腺癌、肾细胞癌、结肠癌等。CD47阻断可与靶向癌症的单克隆抗体协同并提高它们对于ADCP和ADCC的功效。在一些这种实施方案中，CD47阻断和抗CCR4可基本上同时施用。
抗CCR4 Ab可与用于CD47阻断的剂组合施用以便使CCR4阳性调节性T细胞的耗尽增加。CCR4在调节性T细胞上表达并且涉及介导调节性T细胞向肿瘤中的募集。调节性T细胞抑制抗肿瘤T细胞的反应且因此需要它们的抑制或耗尽。CD47阻断可与靶单克隆抗体协同并提高它们对于ADCP和ADCC的功效且因此增加调节性T细胞的耗尽。在一些这种实施方案中，CD47阻断和抗CCR4可基本上同时施用。
一旦抗CD47 Ab介导通过抗原交叉呈递的吞噬，巨噬细胞和其它抗原呈递细胞便可引发抗肿瘤T细胞应答。在相关实施方案中，为了保护这些抗肿瘤T细胞以免通过调节性T细胞被抑制或耗尽，将CD47阻断与抗CCR4 Ab疗法组合。在这种实施方案中，抗CD47剂与抗CCR4 Ab可同时施用；抗CD47剂可在抗CCR4抗体之前施用以便在施用抗CCR4 Ab以抑制或耗尽调节性T细胞之前引发T细胞应答；抗CD47剂可在抗CCR4抗体之后给予以便在引发针对肿瘤的T细胞应答之前抑制或耗尽调节性T细胞。
如上所述的组合疗法可与作用于调节性T细胞的其它剂(例如抗CTLA4 Ab)或其它T细胞检查点抑制剂(例如抗PD1、抗PDL1抗体等)组合。
抗CCR2(CD192)Ab。CCR2在可见于各种炎性病状(例如，类风湿性关节炎)中的炎性巨噬细胞上表达；并且还经鉴定为在肿瘤促进巨噬细胞上表达。结合至CCR2的趋化因子(例如CCL2)可募集并激活炎性巨噬细胞。用抗CCR2抗体抑制通过CCR2的趋化因子信号传导可通过抑制募集或抗体依赖性耗尽造成不希望有的自身免疫或肿瘤促进巨噬细胞的较低出现率，从而实现自身免疫疾病(像类风湿性关节炎)的缓解或肿瘤生长或转移的抑制。CCR2还在调节性T细胞上表达，并且CCR2配体CCL2介导调节性T细胞向肿瘤中的募集。调节性T细胞抑制抗肿瘤T细胞的反应且因此需要它们的抑制或耗尽。
抗CCR2 Ab与CD47阻断组合施用以便使CCR2阳性靶细胞的耗尽增加。这些靶细胞可为人多发性骨髓瘤、前列腺癌等。CD47阻断可与靶向癌症的单克隆抗体协同并提高它们对于ADCP和ADCC的功效。在一些这种实施方案中，CD47阻断和抗CCR2可基本上同时施用。
抗CCR2 Ab与CD47阻断组合施用以便使CCR2阳性炎性和肿瘤促进巨噬细胞和调节性T细胞的耗尽增加。CCR2在炎性和肿瘤促进巨噬细胞和调节性T细胞上表达，且CCL2(CCR2的配体)介导炎性和肿瘤促进巨噬细胞和调节性T细胞向肿瘤中的募集。炎性(肿瘤相关巨噬细胞)和调节性T细胞抑制抗肿瘤免疫应答，且因此需要它们的抑制或耗尽。CD47 Ab可与靶单克隆抗体协同并提高它们对于ADCP和ADCC的功效且因此增加炎性(肿瘤相关巨噬细胞)和调节性T细胞的耗尽。在一些这种实施方案中，CD47阻断和抗CCR2可基本上同时施用。
将抗CCR2 Ab与用于提高抗肿瘤活性的CD47阻断组合施用。一旦抗CD47介导通过抗原交叉呈递的吞噬，巨噬细胞和其它抗原呈递细胞便可引发抗肿瘤T细胞应答。为了保护这些抗肿瘤T细胞以免通过炎性和肿瘤促进巨噬细胞和调节性T细胞被抑制或耗尽，将抗CD47阻断与抗CCR2 Ab疗法组合。在这种实施方案中，抗CD47剂与抗CCR2 Ab可同时施用；抗CD47剂可在抗CCR2抗体之前施用；抗CD47剂可在抗CCR2之后给予。
如上所述的组合疗法可与作用于调节性T细胞的其它剂(例如抗CTLA4 Ab)或其它T细胞检查点抑制剂(例如抗PD1、抗PDL1抗体等)组合。
如本文所用，“抗体”包括提及与具体抗原在免疫上反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆和单克隆抗体。该术语还包括遗传工程化形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和异缀合抗体。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如，Fab'、F(ab')2、Fab、Fv和rIgG。该术语还指的是重组单链Fv片段(scFv)。术语抗体还包括二价或双特异性分子、双抗体、三抗体和四抗体。
抗体的选择可基于多种标准，包括选择性、亲和力、细胞毒性等。短语“特异性(或选择性)结合”至抗体或“特异性(或选择性)与……有免疫反应性”当涉及蛋白质或肽时，是指在异源蛋白群及其它生物制品中确定蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定抗体以至少两倍于背景且更通常大于10至100倍背景结合至特定的蛋白质序列。通常，本发明的抗体在效应细胞(如天然杀伤细胞或巨噬细胞)存在下结合靶细胞表面上的抗原。效应细胞上的Fc受体识别结合抗体。
与特定的抗原有免疫反应性的抗体可通过重组方法如在噬菌体或类似载体中选择重组抗体文库或通过用抗原或编码所述抗原的DNA使动物免疫而产生。制备多克隆抗体的方法为熟练技术人员所知。或者，抗体可为单克隆抗体。可使用杂交瘤方法制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂对适当的宿主动物进行免疫以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性地结合至免疫剂。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞。
人抗体可使用本领域中已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中而制成，例如，其中内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全灭活的小鼠。攻击后观察人抗体产生，它与在人中见到的所有方面极为相似，包括基因重排、装配和抗体库。
抗体也作为许多由各种肽酶消化产生的充分表征的片段存在。因此，胃蛋白酶在铰链区的二硫键处消化抗体以产生F(ab)'2，一种Fab二聚体，其本身为通过二硫键连接于VH-CH1的轻链。F(ab)'2可在温和条件下被还原以使铰链区的二硫键断裂，由此将F(ab)'2二聚体转化成Fab'单体。Fab'单体是基本上带有铰链区部分的Fab。尽管按照完整抗体的消化定义各种抗体片段，但是技术人员将理解这些片段可通过化学方法或者使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用的术语抗体还包括通过对整个抗体进行修饰所产生、或是使用重组DNA方法(例如，单链Fv)从头合成所得或使用噬菌体展示文库鉴别得到的抗体片段。
“人源化抗体”是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白分子。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和载量的来自非人物种(供者抗体)的CDR残基取代，所述非人物种如小鼠、大鼠或兔。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基取代。人源化抗体还可包含既未见于受者抗体中也未见于输入的CDR或框架序列中的残基。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个、且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有框架(FR)区都是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。
可测试所关注的抗体诱导ADCC(抗体依赖性细胞毒性)或ADCP(抗体依赖性细胞吞噬)的能力。抗体相关ADCC活性可被监测并通过检测标记或乳酸脱氢酶从裂解细胞中的释放或检测降低的靶细胞活力(例如膜联蛋白测定)来定量。用于细胞凋亡的测定可通过末端转脱氧核苷酰酶介导的洋地黄毒苷-11-dUTP切口末端标记(TUNEL)测定来进行(Lazebnik等人,Nature:371,346(1994)。细胞毒性也可通过本领域中已知的检测剂盒直接检测，如来自Roche Applied Science(Indianapolis,Ind.)的细胞毒性检测剂盒。
靶向肿瘤细胞抗原的许多抗体目前在临床中用于治疗癌症，且其它处于临床开发的不同阶段。例如，对于B细胞恶性肿瘤的治疗存在许多抗原及相应的单克隆抗体。一个靶抗原是CD20。利妥昔单抗是针对CD20抗原的嵌合非缀合单克隆抗体。CD20在B细胞激活、增殖和分化中具有重要的功能作用。CD52抗原是由单克隆抗体阿来组单抗所靶向，其被指定用于治疗慢性淋巴细胞性白血病。CD22是由许多抗体所靶向，且近来已显示在化疗耐药性毛细胞白血病中与毒素组合的功效。靶向CD20的两种新单克隆抗体托西莫单抗和替伊莫单抗已提交给食品和药品管理局(FDA)。这些抗体与放射性同位素缀合。将阿来组单抗(阿仑单抗)用于治疗慢性淋巴细胞性白血病；吉妥单抗(Mylotarg)应用于治疗急性髓性白血病；替伊莫单抗(Zevalin)应用于治疗非何杰金氏淋巴瘤；帕尼单抗(Vectibix)应用于治疗结肠癌。
CD52抗原是由单克隆抗体阿来组单抗所靶向，其被指定用于治疗慢性淋巴细胞性白血病；结肠癌和肺癌。CD22是由许多抗体所靶向，且近来已显示在化疗耐药性毛细胞白血病中与毒素组合的功效。
吉妥单抗(Mylotarg)应用于治疗急性髓性白血病；替伊莫单抗(Zevalin)应用于治疗非何杰金氏淋巴瘤；帕尼单抗(Vectibix)应用于治疗结肠癌。
西妥昔单抗(Erbitux)在本发明方法中的使用也受到关注。抗体结合至EGF受体(EGFR)，且已用于治疗实体肿瘤，包括结肠癌及头和颈的鳞状细胞癌(SCCHN)。
适用于本发明方法中用于实体肿瘤的单克隆抗体包括但不限于依决洛单抗和曲妥单抗(赫赛汀)。依决洛单抗靶向结肠和直肠癌中所见的17-1A抗原，且已在欧洲被批准用于这些适应症。曲妥单抗靶向HER-2/neu抗原。此抗原见于25％至35％的乳腺癌中。西妥昔单抗(Erbitux)在本发明方法中的使用也受到关注。抗体结合至EGF受体(EGFR)，且已用于治疗实体肿瘤，包括结肠癌及头和颈的鳞状细胞癌(SCCHN)。
出于本发明的目的，“患者”包括人和其它动物，特别是哺乳动物，包括宠物和实验室动物，例如小鼠、大鼠、兔等。因此，所述方法适用于人的治疗和兽医应用中。在一个实施方案中，患者是哺乳动物，优选是灵长类动物。在其它实施方案中，患者是人。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用且指的是被评估待治疗和/或正被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体。受试者可为人，但还包括其它哺乳动物，特别是那些有效用作人疾病的实验室模型的哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”在本文中可互换使用且指的是表现自主的失控生长的细胞，因此它们表现出细胞增殖明显失控特征的异常生长表型。在本申请中因检测、分析或治疗而受关注的细胞包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移性和非转移性细胞。实际上每个组织的癌症都是已知的。短语“癌症负荷”是指在受试者中癌细胞或癌症体积的总数。降低癌症负荷因此指的是减少受试者中癌细胞或癌症体积的数量。如本文所用的术语“癌细胞”是指作为癌细胞或衍生自癌细胞的任何细胞，例如癌细胞的克隆。许多类型的癌症为本领域技术人员所知，包括实体肿瘤，如癌瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤等；及循环癌症，如白血病。癌症的实例包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、肾癌、癌瘤、黑色素瘤、头和颈癌及脑癌。
如本领域中已知，癌症类型可在突变的平均或特异程度上变化，其中较高水平的突变与新抗原的表达增加有关。参见，例如Vogelstein等人,(2013),上文。低突变负荷可为每肿瘤具有以下平均数量或对于个体肿瘤具有以下特定数量的癌症类型：每肿瘤至多约10、至多约20、至多约30、至多约40、至多约50个非同义突变。高突变负荷可为每肿瘤具有超过约50、超过约75、超过约100、超过约125、超过约150个非同义突变的癌症类型。
选择患者和肿瘤以用拮抗性或激动性免疫疗法进行CD47阻断组合治疗。CD47阻断组合治疗可通过增加抗原加工、呈递和T细胞激活来增强肿瘤对本文所述的拮抗性或激动性免疫疗法的治疗反应并且还增加抑制或消除抗肿瘤T细胞的调节性T细胞的耗尽。因此，肿瘤对这些治疗有反应的抗肿瘤功效是提高的并且无反应的肿瘤的治疗反应能够实现。
将CD47阻断与本文所述的激动性或拮抗性免疫治疗的组合给予患有对这些治疗有反应的肿瘤亚型的患者。这些肿瘤由高频率的突变来定义，产生更多肿瘤抗原，因此具有更大免疫原性，如上所述。在一些实施方案中，用组合疗法治疗的患者对免疫活化剂或检查点抑制剂的治疗有反应；然而，这代表在特定的潜在反应性肿瘤亚型内大约25％患者的子集。在其它实施方案中，用本发明的组合疗法治疗患者，所述患者目前对免疫疗法无反应但患有已知有反应性的肿瘤亚型。这是目前在特定的潜在反应性肿瘤亚型内大约75％患者的子集。
将CD47阻断与本文所述的激动或拮抗疗法的组合给予患有对这些疗法不易感的肿瘤亚型的患者。这是目前大多数的肿瘤亚型。这些肿瘤可由较低频率的突变来定义，产生较少的肿瘤抗原，因此具有较小的免疫原性。
癌症的“病理学”包括损害患者健康的所有现象。这包括但不限于异常或不受控制的细胞生长、转移、干扰邻近细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其它分泌产物、炎性或免疫反应的抑制或恶化、瘤形成、前恶性肿瘤、恶性肿瘤、对周围或远处组织或器官例如淋巴结的侵入等等。
如本文所用，术语“癌症复发”和“肿瘤复发”及其语法变型是指在癌症诊断之后肿瘤或癌细胞的进一步生长。具体来说，可当进一步的癌细胞生长出现在癌组织中时发生复发。类似地，“肿瘤扩散”是当肿瘤细胞播散到局部或远隔组织和器官中时发生；因此，肿瘤扩散包括肿瘤转移。“肿瘤侵入”是当肿瘤生长局部地扩散开以致于由于挤压、破坏或妨碍正常器官功能而损害所累及组织的功能时发生。
如本文所用，术语“转移”是指癌性肿瘤在器官或身体部分中的生长，所述器官或身体部分不与原始癌性肿瘤的器官直接相连。转移应被理解为包括微转移，其是不可检测量的癌性细胞在不与原始癌性肿瘤的器官直接相连的器官或身体部分中的存在。转移也可定义为一个过程的几个步骤，如癌细胞离开原始肿瘤位点，及癌细胞迁移和/或侵入身体的其它部分。
术语“样品”关于患者包括血液及生物来源的其它液体样品，实体组织样品，如活检标本或组织培养物或来源于此的细胞及其子代。该定义还包括在其取得之后以如下任何方式处置的样品：如通过用剂处理；洗涤；或富集某些细胞群，如癌细胞。该定义还包括已富集特定类型的分子(例如，核酸、多肽等)的样品。术语“生物样品”包括临床样品，还包括通过手术切除获得的组织、通过活组织检查获得的组织、培养细胞、细胞上清液、细胞裂解液、组织样品、器官、骨髓、血液、血浆、血清等等。“生物样品”包括由患者癌细胞获得的样品，例如，包含由患者癌细胞获得的多核苷酸和/或多肽的样品(例如，包含多核苷酸和/或多肽的细胞裂解液或其它细胞提取物)；及包含来自患者的癌细胞的样品。包含来自患者的癌细胞的生物样品也可包括非癌性细胞。
本文所用的术语“诊断”是指分子或病理状态、疾病或病状的鉴别，如乳腺癌、前列腺癌或其它类型癌症的分子亚型的鉴别。
术语“预后”在本文中指的是对可归因于癌症的死亡或进展的可能性的预测，包括肿瘤疾病(如卵巢癌)的复发、转移扩散和耐药性。术语“预测”在本文中指的是基于观察、经验或科学推理进行的预示或估计的行为。在一个实例中，医师可以预测患者在手术除去原发性肿瘤和/或化疗一段时间之后将存活而无癌症复发的可能性。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指为了获得一种效果而施用剂或进行操作。该效果可以是完全或部分地抑制疾病或其症状的预防性效果，和/或可以是部分或完全的治愈疾病和/或疾病的症状的治疗性效果。如本文所用的“治疗”可包括治疗哺乳动物(具体来说人)中的肿瘤，并且包括：(a)预防疾病或疾病症状在可易患该疾病但尚未被诊断为患有(例如，可与原发性疾病有关或由原发性疾病引起的疾病)的受试者中出现；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；以及(c)减轻该疾病，即引起该疾病消退。
治疗可指的是成功治疗或改善或妨碍癌症的任何标记，包括任何客观或主观参数，如症状的缓解；缓和；减轻或者使得疾病状况更为患者所耐受；变性或衰弱速率减慢；或使得变性终点衰弱程度较小。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括由医师检查的结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物或剂以预防或延迟、减轻或阻止或抑制与癌症或其它疾病有关的症状或病状的发展。术语“治疗效果”是指疾病、疾病症状或疾病副作用在受试者中的减轻、消除或预防。
“与……组合”、“组合疗法”和“组合产品”在某些实施方案中是指本文所述的剂向患者的同时施用。当组合施用时，各个组分可同时或以任何顺序，在不同时间点依次施用。因此，各个组分可单独施用，但是时间上应充分接近以提供所需的治疗效果。
活性剂在本发明方法中的“伴随施用”意指在使得剂将同时具有治疗效果的时机下这些剂的施用。这种伴随施用可涉及剂的同时(即同时发生)、预先或后续施用。本领域普通技术人员可以毫无困难地确定施用本发明的具体药物和组合物的适当的时机、顺序和剂量。
如本文所用，将为治疗终点赋予本领域中已知且由食品和药品管理局所用的意义。
总存活期被定义为从随机分配到由于任何原因导致死亡之间的时间，并且是在意向治疗人群中测量。存活被认为是最可靠的癌症终点，且当可进行研究以充分评估存活时，其通常为优选终点。此终点是精确的且易于测量，由死亡日期所记录。偏差不是终点测量中的一个因素。存活改善应被分析作为风险-效益分析以评估临床益处。总存活可在随机化对照研究中评价。在总存活方面的统计上显著改善的论证可被认为是临床显著的，如果毒性概况可接受的话，且通常支持新药审批。本发明方法的一个益处可包括患者总存活的增加。
基于肿瘤评估的终点包括DFS、ORR、TTP、PFS和至治疗失败的时间(TTF)。对这些时间依赖性终点的数据的采集和分析是基于间接评估、计算和估计(例如，肿瘤测量)。无疾病存活期(DFS)被定义为从随机分配到肿瘤复发或由任何原因导致死亡之间的时间。此终点的最频繁使用是在明确的手术或放疗之后的辅助治疗时。当大多数患者实现对化疗的完全反应时，DFS也可以是重要的终点。
客观反应率。ORR被定义为具有预定量的肿瘤尺寸减小并持续最少时间的患者的比例。反应持续时间通常是从初始反应到记录的肿瘤进展之间的时间来计算。一般说来，FDA已将ORR定义为部分反应加上完全反应的总和。当以此方式定义时，ORR是药物抗肿瘤活性的直接量度，其可在单组研究(single-arm study)中评价。
至进展的时间和无进展存活期。TTP和PFS已用作药物审批的主要终点。TTP被定义为从随机分配到客观肿瘤进展之间的时间；TTP不包括死亡。PFS被定义为从随机分配到客观肿瘤进展或死亡之间的时间。肿瘤进展的精确定义是重要的且将在方案中仔细地详述。
如本文所用，术语“相关”或“与...相关”及类似术语是指在两个事件的情况之间的统计关联性，其中事件包括数量、数据集等。例如，当事件涉及数量时，正相关(在本文中也称为“直接相关”)意指当一个增加时，另一个也增加。负相关(在本文中也称为“逆相关”)意指一个增加，而另一个减少。
“剂量单位”是指适合以单位剂量形式用于待治疗的特定个体的物理离散单位。各单位可含有根据计算能产生所需治疗效果的预定量的活性化合物和所需的药物载体。剂量单位形式的规格可由以下指示：(a)活性化合物的独特特征和有待实现的具体治疗效果，以及(b)混合此类活性化合物的领域中所固有的限制。
“药学上可接受的赋形剂”意指适用于制备药物组合物的赋形剂，其一般是安全、无毒和必需的，并包括兽用可接受和人体药用的赋形剂。这种赋形剂可为固体、液体、半固体或在气溶胶组合物的情况下为气态的。
“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并且具有所需的药理学性质的盐和酯。此类盐包括其中存在于化合物中的酸性质子能够与无机或有机碱反应而形成的盐。合适的无机盐包括以碱金属形成的那些盐，例如钠和钾、镁、钙和铝。合适的有机盐包括以有机碱形成的那些盐，如胺碱，例如，乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N甲基葡糖胺等。此类盐还包括以无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、马来酸及烷烃磺酸和芳烃磺酸，如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由存在于化合物中的羧基、磺酰氧基和膦酰氧基形成的酯，例如，C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或双盐或酯；且同样当有两个以上的酸性基团存在时，一些或所有此类基团可以成盐或酯化。本发明中提及的化合物可存在未成盐或未酯化形式，或是成盐和/或酯化形式，提及的此类化合物包括原始(未成盐和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。在本发明中提及的某些化合物也可存在1个以上的立体异构形式，且提及的此类化合物旨在包括此类立体异构体的所有单一立体异构体和所有混合物(无论外消旋或其它)。
当谈及组合物、载体、稀释剂和剂时所用的术语“药学上可接受的”、“生理上耐受的”及其语法变型可互换使用，且表示可施用于人或在施用于人后不会产生不希望有的生理作用致使该组合物的施用被禁止的材料。
“治疗有效量”意指当施用于受试者用于治疗疾病时足以实现对于所述疾病的治疗的量。
使用方法
提供了在一个方案中治疗或减轻原发性或转移性癌症的方法，所述方案包括使靶细胞与以下的组合接触：(i)阻断CD47活性的剂；和(ii)激动免疫共刺激分子(例如CD40、OX40等)的一种或多种剂；和/或(iii)拮抗免疫抑制性分子(例如CTLA-4、PD1、PDL1等)的剂。这类方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量或有效剂量的本发明的组合剂，包括但不限于所述剂与化疗药、放疗或ESA的组合。
用激动免疫共刺激分子或拮抗免疫抑制性分子的剂的免疫疗法可诱导免疫细胞针对肿瘤细胞的强应答。这些疗法的副作用对正常组织有毒性，因为由这些疗法引起的抑制的激活或释放没有抗原特异性。CD47阻断使得能够通过巨噬细胞及其它吞噬细胞/抗原免疫细胞实现癌细胞的特异性耗尽。因此，免疫应答或先天性和适应性免疫系统具有提高的抗肿瘤特异性、对正常组织的降低的毒性及由此的剂量或疗法限制性副作用。
免疫调节剂与CD47阻断的组合还可通过促进肿瘤抗原呈递和抑制性免疫细胞的耗尽来提高免疫调节剂的功效。这使得能够缩短治疗期且由此减少潜在毒性和副作用的持续时间和显著性。
CD47阻断能够实现体外吞噬及抗原加工和呈递。在正常组织细胞不存在下在体外促进吞噬细胞对癌细胞的吞噬可引发抗肿瘤限制性免疫反应且因此防止针对正常细胞和组织的毒性。在体外吞噬癌细胞之后，吞噬细胞可转移到患者中以便体内激活抗肿瘤T细胞或可在体外与T细胞一起孵育以便激活针对肿瘤抗原的T细胞且所激活的T细胞可随后转移到患者中。
用于治疗癌症的本发明的组合剂的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者为人抑或动物、其它药物施用、以及治疗为预防性的抑或治疗性的。通常，患者是人，但非人哺乳动物也可被治疗，例如伴侣动物，如狗、猫、马等；实验室哺乳动物，如兔、小鼠、大鼠等；及其类似动物。可调整(titrate)治疗剂量以得到最佳安全性和功效。
在一些实施方案中，每种剂的治疗剂量可在约0.0001至100mg/kg，且更通常在0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每两周或每月或每3至6个月施用一次。本发明的治疗性实体通常多次施用。单次给药之间的时间间隔可为每周、每月或每年。时间间隔也可以是不规则的，这可通过测量治疗性实体在患者中的血液水平来指示。或者，本发明的治疗性实体可作为持续释放制剂来施用，在此情况下需要较低的施用频率。剂量和频率将根据多肽在患者中的半衰期而变化。
在预防应用中，在较长一段时间以相对不频繁的间隔施用相对较低剂量。一些患者在他们的余生持续接受治疗。在其它治疗应用中，有时需要在相对较短间隔下的相对较高剂量直到疾病进展减缓或停止，且优选直到患者显示疾病症状的部分或完全缓解。此后，可向患者施用预防性方案。
在其它实施方案中，本发明方法包括治疗、减轻或预防以下癌症的肿瘤生长、肿瘤转移或肿瘤侵入，包括癌瘤、血液癌症、黑色素瘤、肉瘤、神经胶质瘤等。对于预防性应用，向对疾病易感或处于罹患疾病的风险中的患者施用药物组合物或药剂，其中药物组合物或药剂的量足以消除或降低风险、减轻严重性或延缓疾病(包括疾病的生物化学、组织学和/或行为学的症状、其并发症和疾病发展期间存在的中间病理学表型)的出现。
用于治疗癌症的组合物可通过胃肠外、局部、静脉内、肿瘤内、经口、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内手段施用。典型的施用途径是静脉内或肿瘤内，尽管其它途径可以同样有效。
通常，可注射组合物是作为液体溶液或混悬液来制备；也可制备注射前适于液体媒介物的溶液或液体媒介物的混悬液的固体形式。制剂还可以被乳化或包裹在脂质体或微粒如聚交酯、聚乙交酯或用于增强佐剂效果的共聚物中，如上所论述。Langer,Science249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本发明的剂可以贮库注射液或植入制剂的形式施用，所述贮库注射液或植入制剂可以允许活性成分的持续或脉冲释放的方式配制。药物组合物一般被配制为无菌的、基本上等渗的，并且完全符合美国食品与药品管理局的所有药品生产质量管理规范(GMP)规定。
本文所述的组合剂的毒性可在细胞培养物和/或实验动物中通过标准药物工序来确定，例如，通过测定LD50(50％群体致死的剂量)和LD100(100％群体致死的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究处获得的数据可用于配制供人使用的无毒的剂量范围。本文所述的蛋白质的剂量优选地在循环浓度的范围内，包括几乎没有或没有毒性的有效剂量。剂量可根据所采用的剂型和利用的施用途径在此范围内变化。确切的制剂、施用途径和剂量可由每个医生根据患者的情况来加以选择。
药物组合物可以多种单位剂型施用，这取决于施用方法例如，适用于经口施用的单位剂型包括但不限于粉剂、片剂、丸剂、胶囊和糖锭。认识到本发明的组合物当经口施用时应受到保护以免被消化。这通常可通过将分子与组合物复合以使其耐受酸和酶的水解作用，或通过将分子包封在合适的耐受载体如脂质体或保护屏障中来实现。保护剂以免消化的方式是本领域中公知的。
用于施用的组合物通常将包含溶于药学上可接受的载体、优选水性载体中的抗体或其它烧蚀剂。可使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的且一般不含不合需要的物质。这些组合物可通过常规的众所周知的灭菌技术来杀菌。所述组合物可根据需要含有近似于生理条件的药学上可接受的助剂物质，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。活性剂在这些制剂中的浓度可广泛变化，并且将主要根据所选的具体施用模式和患者需要，基于液体体积、粘度、体重等来选择(例如，Remington's Pharmaceutical Science(第15版,1980)和Goodman&Gillman,ThePharmacological Basis of Therapeutics(Hardman等人编著,1996))。
包括本发明的活性剂及其制剂和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。所述试剂盒可进一步包含至少一种另外的剂，例如化学治疗药物、ESA等。试剂盒通常包括指明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或另外试剂盒所附的任何书面或记录材料。
可施用组合物用于治疗性治疗。将组合物以如上所述足以大致去除靶细胞的量施用于患者。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”，其可提供总存活率的提高。根据所需的和患者耐受的剂量和频率，可以进行组合物的单次或多次施用。治疗所需的具体剂量取决于哺乳动物的医学状况和病史、以及其它因素如年龄、体重、性别、施用途径、效率等。
实验
实施例1
抗CD47抗体与CD40的激动性抗体的组合
将乳腺癌细胞(100K个细胞在25％基质胶中)经由皮下注射到乳房脂肪垫中而注射到小鼠(NSG)中并且容许移入。将动物随机分到四个治疗组中：
●媒介物对照(PBS)
●CD40激动剂单独(激动性抗CD40抗体)
●CD47拮抗剂单独(拮抗性抗CD47抗体)
●CD47拮抗剂加上CD40激动剂
每隔一天给予CD47 ab(5F9)，每周两次给予CD40 ab(FGK)，使用标记的癌细胞(例如荧光素酶阳性细胞)通过荧光素酶生物发光成像监测肿瘤生长。
如图1所示，抗CD47抗体的治疗抑制肿瘤生长。用激动性抗CD40抗体的治疗对肿瘤生长无抑制作用。抗CD47抗体与抗CD40抗体的组合治疗不仅产生肿瘤生长的抑制，而且使得肿瘤消退。
实施例2
体外协同实验
使用小鼠或人NK细胞(效应物)和小鼠或人癌细胞(靶细胞)进行ADCC测定。小鼠NK细胞是从外周血液、骨髓或脾脏中分离；人NK细胞是从外周血液中分离。人癌细胞系或初级样品被标记用作靶细胞(例如用铬或荧光染料)。
将NK细胞和癌细胞在体外合并，并且与以下处理物共培养：
●媒介物对照(例如，PBS)
●检查点抑制剂单独，包括易普利单抗；纳武单抗；和派姆单抗
●CD47拮抗剂单独
●CD47拮抗剂加上检查点抑制剂
ADCC是经由铬释放测定或流式细胞术细胞死亡测定(例如，膜联蛋白V/DAPI染色)来测量。NK细胞细胞因子(例如IFN-γ)释放是经由ELISA测量。在与抗CD47组合的检查点抑制剂存在下细胞死亡与细胞因子释放的变化是相对于以上列举的单疗法来确定。
实施例3
体内实验方案
将癌细胞经由皮下、腹膜后或外周血注射而注射到小鼠中并且容许移入。将动物随机分到四个治疗组中：
●媒介物对照(例如，PBS)
●检查点抑制剂单独，包括易普利单抗；纳武单抗；和派姆单抗
●CD47拮抗剂单独
●CD47拮抗剂加上检查点抑制剂
将小鼠用相应的治疗物每天、每周三次、每周两次或每周一次进行治疗。通过肿瘤体积测量、使用标记的癌细胞(例如荧光素酶阳性细胞)的生物发光和/或外周血液的分析来测量肿瘤负荷。还测量了小鼠的总存活。
实施例4
T细胞测定
抗原呈递测定。对于体外抗原呈递测定，将104个巨噬细胞与相等数量的DLD1-cOVA-GFP癌细胞在无血清的RPMI培养基中共培养过夜。次日，添加等体积的RPMI+20％FCS到培养物中。从OT-I或OT-II TCR转基因小鼠中收获外周淋巴结并用0.5mM CFSE(Molecular Probes)标记。使用生物素化抗CD8或抗CD4抗体分离T细胞，继之用抗生物素磁珠(Miltenyi Biotec)富集。将5x104个T细胞添加到培养物中并在第3天(对于OT-I T细胞)或第4天(对于OT-II T细胞)分析。对于体内抗原呈递测定，将2x106个CFSE标记的OT-I T细胞(CD45.2)静脉内(iv)过继转移到受者小鼠(CD45.1)中。将巨噬细胞从与癌细胞的共培养物中分离并注射到小鼠的足垫中。在第4天针对CD45.2+细胞内的CFSE稀释对腘淋巴结进行分析。
体内细胞杀伤测定。简单地说，将来自C57BL/Ka(CD45.1)小鼠的脾细胞用10μMCFSE(CFSE-高)和1μM CFSE(CFSE-低)标记。在6孔平板中用1μM SIINFEKL肽对CFSE-高脾细胞脉冲1小时。在iv转移之前，将细胞以1:1的比率与非肽脉冲的CFSE-低细胞混合。为了说明在肽特异性裂解不存在下CFSE高/低比率的变化，使对照小鼠接受未用SIINFEKL肽脉冲的CFSE-高脾细胞，之后以1:1比率与CFSE-低脾细胞混合并转移到小鼠中。16小时后分析引流淋巴结。细胞毒性百分比被计算为(1-％CFSE高/％CFSE低)，针对在接受未用SIINFEKL肽脉冲的脾细胞的对照小鼠中的比率进行归一化。
肿瘤攻击。将1x106个CD8富集的OT-I T细胞iv过继转移到受者C57BL/Ka小鼠中。将来自同系基因C57BL/Ka小鼠的巨噬细胞与DLD1-cOVA-GFP癌症共培养，然后通过磁性富集分离并注射到小鼠的足垫中。将肿瘤细胞系E.G7(表达鸡OVA cDNA的EL.4细胞)用于小鼠(ATCC)的肿瘤攻击。将1x105个E.G7细胞以与常规基质胶1:1的比率s.c.注射到小鼠的右后肢中。每天使用精确卡尺测量肿瘤尺寸并且基于长度*宽度*高度*π/6计算体积。
T细胞增殖。成熟的T细胞通过它们的抗原特异性受体(TCR)识别并响应于抗原/MHC复合体。TCR激活的最直接后果是信号传导途径的起始，包括特定蛋白质酪氨酸激酶(PTK)的诱导、磷脂酰肌醇4,5-磷酸氢盐(PIP2)的分解、蛋白激酶C(PKC)的活化及胞内钙离子浓度的上升。这些早期事件被传递给核并造成T细胞的克隆扩增；细胞表面上的激活标记的上调；向效应细胞的分化；细胞毒性或细胞因子分泌的诱导；细胞凋亡的诱导。
通过测量在经由抗原或针对TCR的激动性抗体体外刺激T细胞后的T细胞增殖来评估T细胞激活。此方案写作对于检查经由CD3刺激的小鼠脾T细胞和人外周T细胞的体外增殖的起始点。关键参数包括细胞密度、抗体滴度和活化作用动力学。
制备抗CD3e(145-2C11)在无菌PBS中的5-10μg/mL溶液。计算各实验条件所需的孔的数目并考虑将各条件的样品一式三份。例如，为了包被一半平板(48孔)，需要2.6mL抗体溶液。将50μL抗体溶液分配到96孔测定平板的各孔中。关于对照未刺激的孔，添加50μL的无菌PBS。用ParafilmTM紧密地覆盖平板以避免样品蒸发并在37℃下孵育2小时或提前一天准备平板并在4℃下保持过夜。就在添加细胞之前，用多通道移液器移除50μL抗体溶液。用200μL无菌PBS冲洗各孔并丢弃PBS。
收获脾脏并在无菌条件下制备单细胞悬液并且在所需剂(例如抗CD47、检查点抑制剂等)存在下以106/mL再悬浮于完全RPMI-1640中。添加200μL细胞悬液到各孔中并置于湿润的37℃、5％CO2培养箱中。将可溶性抗CD28以2μg/mL添加到细胞中。孵育2-4天。可收获细胞并加工以进行定量。
实施例5
在晚期恶性肿瘤(JAVELIN Medley)中艾维单抗与CD47阻断组合的研究
这是剂量优化研究，用来评价艾维单抗(MSB0010718C)与CD47阻断及其它癌症免疫疗法组合在患有局部晚期或转移性实体肿瘤[例如，非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤及头和颈的鳞状细胞癌(SCCHN)]的患者中的安全性、药代动力学、药效学和抗肿瘤活性。主要目的是评估与CD47阻断的各种组合的安全性和功效，视情况而定在有限系列的适应症中优化给药方案。最初，该研究将评价艾维单抗(一种抗PD-L1单克隆抗体(mAb))与5F9-G4(阻断CD47与SIRPα之间的相互作用的人源化抗体)组合的安全性和抗肿瘤活性。
主要结果测量：在治疗的头8周(头2个周期)期间出现的具有剂量限制性毒性(DLT)的参与者的数目。
客观反应-具有客观反应(即，根据RECIST版本1.1证实的完全或部分反应)的参与者的数目。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将肿瘤反应时间(TTR)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到客观肿瘤反应的首次记录之间的时间。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将反应持续时间(DR)定义为从客观肿瘤反应的首次记录到客观肿瘤进展的首次记录或到由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将无进展的存活期(PFS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到通过RECIST v1.1指示疾病进展的日期或由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将总存活期(OS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到死亡日期之间的时间。
实施例7
抗OX40抗体与CD47阻断组合用于头和颈癌患者
这是剂量优化研究，用来评价抗OX40抗体MEDI6469以组合形式的安全性、药代动力学、药效学和抗肿瘤活性。主要结果测量：
主要结果测量：在治疗的头8周(头2个周期)期间出现的具有剂量限制性毒性(DLT)的参与者的数目。
客观反应-具有客观反应(即，根据RECIST版本1.1证实的完全或部分反应)的参与者的数目。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将肿瘤反应时间(TTR)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到客观肿瘤反应的首次记录之间的时间。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将反应持续时间(DR)定义为从客观肿瘤反应的首次记录到客观肿瘤进展的首次记录或到由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将无进展的存活期(PFS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到通过RECIST v1.1指示疾病进展的日期或由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将总存活期(OS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到死亡日期之间的时间。
实施例8
4-1BB激动剂PF-05082566加上5F9-G4抗CD47抗体在患有实体肿瘤的患者中的研究
主要结果测量：在治疗的头8周(头2个周期)期间出现的具有剂量限制性毒性(DLT)的参与者的数目。
客观反应-具有客观反应(即，根据RECIST版本1.1证实的完全或部分反应)的参与者的数目。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将肿瘤反应时间(TTR)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到客观肿瘤反应的首次记录之间的时间。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将反应持续时间(DR)定义为从客观肿瘤反应的首次记录到客观肿瘤进展的首次记录或到由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将无进展的存活期(PFS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到通过RECIST v1.1指示疾病进展的日期或由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将总存活期(OS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到死亡日期之间的时间。
实施例9
在黑色素瘤、头和颈癌(SCHNC)、卵巢、肉瘤、何杰金氏淋巴瘤中PF-06801591与5F9-G4组合的研究
主要结果测量：在治疗的头8周(头2个周期)期间出现的具有剂量限制性毒性(DLT)的参与者的数目。
客观反应-具有客观反应(即，根据RECIST版本1.1证实的完全或部分反应)的参与者的数目。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将肿瘤反应时间(TTR)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到客观肿瘤反应的首次记录之间的时间。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将反应持续时间(DR)定义为从客观肿瘤反应的首次记录到客观肿瘤进展的首次记录或到由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将无进展的存活期(PFS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到通过RECIST v1.1指示疾病进展的日期或由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将总存活期(OS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到死亡日期之间的时间。
实施例10
在患有晚期实体肿瘤或淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤)的患者中5F9-G4与莫加珠单抗组合的研究
主要结果测量：在治疗的头8周(头2个周期)期间出现的具有剂量限制性毒性(DLT)的参与者的数目。
客观反应-具有客观反应(即，根据RECIST版本1.1、免疫相关反应标准、国际工作组(International Working Group，IWG)或针对淋巴瘤的定制反应标准(CustomizedResponse Criteria for Lymphoma)证实的完全或部分反应)的参与者的数目。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将肿瘤反应时间(TTR)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到客观肿瘤反应的首次记录之间的时间。对于具有证实的客观反应(CR或PR)的患者，将反应持续时间(DR)定义为从客观肿瘤反应的首次记录到客观肿瘤进展的首次记录或到由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将无进展的存活期(PFS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到通过RECIST v1.1指示疾病进展的日期或由任何原因导致的死亡(无论哪一个先发生)之间的时间。将总存活期(OS)定义为从随机分配(NSCLC)的日期或研究治疗(黑色素瘤和SCCHN)首次给药的日期到死亡日期之间的时间。
实施例11
CD47阻断与包括抗CTLA-4的当前免疫疗法协同。将1x106个MCA肉瘤细胞皮下植入野生型129雄性小鼠中。将小鼠用CD47阻断剂、抗CTLA-4或组合IP治疗。通过卡尺测量值来测量肿瘤尺寸并且当肿瘤在任何方向上超过2cm时对动物施以安乐死。数据示于图2中。A)针对PBS、抗CTLA-4、或CD47阻断/抗CTLA-4组合，来自N＝5只小鼠的蛛网图。B)接受单一或组合疗法的小鼠的存活图。C)单一和组合疗法的肿瘤尺寸(mm3)。
在本说明书中引用的各出版物出于所有目的据此以引用的方式整体并入。
应当理解，本发明不限于所述的具体方法、方案、细胞系、动物的种或属、及剂等，因为这些可以变化。还应该理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意味着限制本发明的范围，因为本发明的范围只受所附权利要求书的限制。
除非文中另外清楚陈述，如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。因此，例如，提及“细胞”包括多个这类细胞且提及“培养物”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种培养物及其等效物，诸如此类。除非另外清楚指出，本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在本说明书中引用的各出版物出于所有目的据此以引用的方式整体并入。
应当理解，本发明不限于所述的具体方法、方案、细胞系、动物的种或属、及剂等，因为这些可以变化。还应该理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意味着限制本发明的范围，因为本发明的范围只受所附权利要求书的限制。
除非文中另外清楚陈述，如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。因此，例如，提及“细胞”包括多个这类细胞且提及“培养物”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种培养物及其等效物，诸如此类。除非另外清楚指出，本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

Claims (22)

1.一种靶向癌细胞以便免疫耗尽的方法，所述方法包括：
使包含靶细胞的细胞群与以有效增加所述靶细胞耗尽的剂量的以下的组合接触：(i)阻断CD47活性的剂；和(ii)一种或多种激动免疫共刺激分子的剂和/或(iii)拮抗免疫抑制性分子的剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述组合包含激动免疫共刺激分子的抗体。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体是CD40的激动剂。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体是OX40的激动剂。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述组合包含拮抗免疫抑制性分子的抗体。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述抗体是CTLA4的拮抗剂。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述抗体是PD1和/或PDL1的拮抗剂。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述抗体是TIM3的拮抗剂。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述抗体是LAG3的拮抗剂。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，还包含结合至靶肿瘤细胞上的抗原的抗体。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述接触是在体外进行。
12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述接触是在单个哺乳动物中在体内进行。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述治疗提供了所述个体的总存活期的增加。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述靶细胞的耗尽相对于在作为单一疗法施用的任何单剂的单一疗法下观察到的耗尽是增强的。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述阻断CD47活性的剂是抗CD47抗体。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述抗CD47抗体包含IgG4Fc区。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述抗体是5F9-G4。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是小鼠。
19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
20.如权利要求12所述的方法，还包括施用致敏剂量的所述阻断CD47活性的剂。
21.如权利要求12所述的方法，还包括施用致敏剂量的促红细胞生成素刺激剂。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中以下剂的组合以有效增加所述靶细胞耗尽的剂量提供了相对于在抗CD47剂不存在下功效所需的给药临床上显著减少的免疫相关不良事件的治疗有效剂量的剂：(i)阻断CD47活性的剂；和(ii)一种或多种激动免疫共刺激分子的剂和/或(iii)拮抗免疫抑制性分子的剂。
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MELISSA N. MCCRACKEN等: "Molecular Pathways: Activating T Cells After Cancer Cell Phagocytosis from Blockade of CD47 "Don’t Eat Me" Signals", 《CLIN CANCER RES》 *

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