CN100560131C - 抗体靶向化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗体靶向化合物，其中通过将靶向制剂共价或非共价连接于抗体结合位点已经将抗体的特异性重新编程。通过这个方法，共价修饰的抗体呈现出靶向制剂的结合特异性。所述化合物可以具有由靶向制剂或分开的生物制剂提供的生物学活性。提供本发明化合物的各种用途。

Description

抗体靶向化合物
发明背景
[0001]本发明涉及用于靶向生物分子的化合物和制备及使用这些化合物的方法。常规开发的药物和生物效应物分子经常由于高毒性在疗法中的应用受到限制。多年来，已采用各种方法改善这样的药物或者效应物的治疗指数。一种方法就是使药物或者效应物偶合于配体靶向制剂例如抗体。在这种情况下，抗体被用来改变药物或者效应物的分布，以使其大部分可以定位于体内最需要的部位。通过使药物或者效应物与大分子量化合物复合，已经达到小分子量药物或者效应物的靶向改善。例如，例如，欧洲专利EP 217577公开通过在体内半抗原修饰剂和抗-半抗原抗体之间形成复合物可达到药物的半衰期增加和靶向增强。类似地，国际专利申请公布WO98/22141公开了治疗剂和半抗原的缀合物。该缀合物被给予患者并且在患者的血流中循环。循环的缀合物被患者体内存在的抗体识别并结合。Shokat和Schultz(J.Am.Chem.Soc.，1991，113：1862-1864)也已公开采用称之为配体介导的免疫原性的方法重新诱导免疫应答的方法。按照这种说法，将不变抗原与特定配体复合并给予患者。那么复合的不变抗原与存在于患者体内的天然来源的抗体结合。
发明简述
[0002]本发明提供用于许多用途的具有独特的特异性和生物学性质的抗体靶向化合物。本发明的抗体靶向化合物包含共价或者非共价连接于抗体结合位点的一个或者更多个靶向制剂或者生物制剂或者一个或者更多个靶向制剂和生物制剂。线性或者分支的接头(linker)优选用于共价或者非共价连接。公开了接头的化学特性。依情况而定，与靶向制剂或者生物制剂共价或者非共价连接后，结合位点的抗体特异性可以被修饰或者消除。在某些实施方案中，共价连接之前的抗体的抗原结合特异性在共价连接之后可以基本上保持不变。
[0003]抗体靶向化合物与那些成分自身相比有多种益处。例如，化合物的抗体部分一般可以延长体积较小的靶向制剂或者生物制剂的体内半衰期。通过增加由化合物的抗体部分提供的效应物功能(例如补体介导的效应物功能)，也可以修饰具体的靶向制剂或者生物制剂的生物潜能(biologica potency)或者其它的生物学特性。另外，靶向制剂或者结合制剂，通过连接于抗体而使其体积增加，可以使靶向制剂以新的能力发挥功能。
[0004]在某些实施方案中，化合物的靶向制剂能够与非免疫球蛋白靶分子结合，或者与免疫球蛋白靶分子于免疫球蛋白结合位点之外结合。因此，在这些实施方案中，靶向制剂对非抗体是特异性的，或者对抗体是特异性的，但与抗体于其结合位点之外结合。在一个优选方法中，催化抗体可以被修饰为可与生物分子特异性结合的化合物。抗体靶向化合物的抗体部分可包括整个抗体或者独特的抗体片段，并且可以具有来源于各种动物物种例如非人免疫球蛋白或者人免疫球蛋白的序列，人免疫球蛋白包括人抗体、人源化抗体或者人嵌合抗体。
[0005]也提供生产本发明的抗体靶向化合物的方法。在一个实施方案中，含靶向制剂和/或生物制剂的制剂-接头化合物连接于含用于与抗体结合位点共价反应的反应基团的接头。在另一种方法中，制备抗体-接头化合物，其中接头包括用于与所述一个或者更多个靶向制剂或者生物制剂反应的反应基团。在再一种方法中，这些制剂和抗体每一个可以连接于含有相适配的反应基团的接头，以便当这两个接头共价结合时形成抗体靶向化合物。
[0006]另外提供含靶向制剂、生物制剂或者两者皆有之的制剂-接头化合物，所述制剂可以共价结合于抗体结合位点。在某些实施方案中，接头包含用于使靶向制剂共价结合于抗体结合位点的反应基团。与抗体结合位点的结合可以是结合于结合位点的活性氨基酸的侧链。在某些实施方案中，活性氨基酸为赖氨酸，而接头反应基团为酮、二酮、β-内酰胺、琥珀酰亚胺活性酯、卤代酮、内酯、酸酐、环氧化物、醛、卤化物、磺酸酯、膦酸酯、胍、脒、亚胺、烯胺、缩酮、缩醛或者马来酰亚胺。
[0007]描述制剂-接头化合物的各种化学特征。在一个实施方案中，接头具有通式X-Y-Z，其中X为含C、H、N、O、P、S、Si、F、Cl、Br和I中任一个或其盐的原子的线性或者分支连接链，并且所述连接链包含介于2-100个单元之间的重复的醚单元；Y为任选且为单一的或者稠合的5或者6元同或者异碳环的饱和的或者不饱和的定位于Z的1-20个原子内的环；且Z为用于使一个或者更多个靶向制剂共价连接于抗体结合位点的活性氨基酸侧链的反应基团。当在靶向制剂-接头化合物中包含多于一个靶向制剂或者生物制剂时，靶向制剂可以连接于X或者Y、或连接于X和Y。
[0008]另外也提供用于非共价连接于抗体结合位点的靶向制剂-接头-抗原化合物。这些化合物包括两个或者更多个靶向制剂、两个或者更多个生物制剂，或者包括至少两个制剂，其中一个为靶向制剂且另一个为生物制剂。这些制剂借助接头共价连接于抗体所识别的抗原。公开了接头和抗原的多种化学特征。
[0009]另外也提供对呈现低的或者无法检测到的对具体靶分子的结合亲合力的抗体加以修饰，以使抗体对具体靶分子的结合特异性增强的方法。在一个实施方案中，对具体靶分子特异的一个或者更多个靶向制剂或者生物制剂共价连接于抗体结合位点，以生成抗体靶向化合物。以这样的方式连接所述制剂，以保留它们结合具体靶分子的能力。在某些这样的实施方案中，共价连接之前的抗体对靶分子的亲和性小于约1×10-5摩尔/升。共价连接之后，靶向化合物可以呈现对靶分子的亲和性大于约1×10-6摩尔/升。
[0010]另外也提供改变靶向制剂或者生物制剂的至少一种物理或者生物学性质的方法。在一个实施方案中，制剂共价连接于抗体结合位点以生成抗体靶向化合物。也提供通过修饰接头的一种或者更多种化学性质，修饰抗体靶向化合物的一种或者更多种物理或者生物学性质的方法。在某些实施方案中，所修饰的物理或者生物学性质包括药动学、药效学、免疫原性、结合亲合力、降解易敏性、溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性和刚性。
[0011]也提供使生物学活性传递至个体的细胞、胞外基质生物分子或者流体生物分子的方法。在一种方法中，将对所述细胞、胞外基质生物分子或者流体生物分子具有生物学活性和特异性的本发明抗原靶向化合物给予所述个体。在另一种方法中，对细胞、组织胞外基质生物分子或者流体生物分子具有特异性的本发明的制剂-接头-抗原化合物和对所述抗原特异性的抗体被分别给予个体，当制剂-接头-抗原化合物与抗体结合位点非共价缔合时，体内形成抗体靶向制剂。
[0012]另外提供治疗或者预防个体的疾病或病症的方法，其中疾病或病症涉及表达靶分子的细胞、组织或者流体。在一种方法中，给予个体治疗有效量的本发明的抗体靶向化合物。在另一种方法中，分别给予个体治疗有效量的本发明制剂-接头-抗原化合物和对所述抗原特异性的抗体，并且当制剂-接头-抗原化合物与抗体结合位点非共价缔合时，体内形成抗体靶向制剂。在这两个方法中，抗体靶向化合物或者制剂-接头-抗原化合物对靶分子都是特异性的，并且化合物或者抗体包括有效抵御疾病或病症的生物学活性。
[0013]也进一步提供在个体中使细胞或者胞外基质造影的方法，其中所述细胞或者胞外基质表达靶分子。在一种方法中，本发明的抗体靶向化合物连接于可检测的标记物并且给予个体。在另一种方法中，分别给予个体制剂-接头-抗原化合物和对抗原特异性的抗体，并且当制剂-接头-抗原化合物与抗体结合位点非共价缔合时，体内形成抗体靶向制剂。在这两个方法中，标记物可以连接于抗体、靶向制剂和/或生物制剂。
[0014]另外提供降低存在于表面的微生物细胞或者病毒颗粒的感染性的方法。按照这些方法，使所述表面与有效量的本发明抗体靶向化合物接触，其中抗体靶向化合物包括对所述微生物细胞或者病毒颗粒上的受体特异性的靶向制剂或者生物制剂。
[0015]也提供筛选受体的激动剂或者拮抗剂的化学文库的方法。该方法包括使化学文库的各成员连接于抗体结合位点，然后根据与受体的结合或者根据对受体与该受体的配体之间结合的抑制，来测试抗体连接的文库。
[0016]另外提供采用本发明的抗体靶向化合物的各种免疫分析。在一个检测或者测量样品中分析物的实施方案中，本发明包括本发明的抗体靶向化合物的用途，其中对分析物的抗体特异性是由靶向制剂引起，该制剂共价连接于抗体结合位点。在另一个涉及采用对分析物特异性的抗体测定分析物存在情况的直接或者间接结合分析的实施方案中，本发明包括采用对分析物特异性的抗体测定分析物的存在情况，其中抗体特异性是由对分析物特异性的非抗体靶向制剂引起，所述靶向制剂连接于抗体结合位点中的活性氨基酸。
[0017]另外也提供抑制或者降低靶向制剂或者生物制剂穿越细胞膜的能力的方法。在这些方法中，通过将自身并不穿透细胞膜的抗体的结合位点共价连接于靶向制剂或者生物制剂，形成抗体靶向化合物，其中所述抗体与所述靶向制剂或者生物制剂连接，降低或者抑制了制剂穿越细胞膜的能力。
[0018]另外提供介导细胞内活性药物的细胞内传递的方法。在这些方法中，制备抗体靶向化合物，其中所述化合物包括通过接头共价连接于抗体结合位点的一个或者更多个靶向制剂、或者一个或者更多个生物制剂、或者这两者。靶向制剂或者生物制剂的特征在于它们可与细胞受体结合并且介导该制剂的内化。抗体靶向化合物也包括有细胞内活性的药物。当表达受体的细胞接触抗体靶向化合物时，发生细胞内药物传递。所述接触导致抗体靶向制剂的内化和所述药物的细胞内传递。在某些实施方案中，细胞内活性药物为前药，当所述药物接触细胞内区室时，它们变得具有活性。抗体靶向化合物可以包括细胞内运输信号，以使被内化的抗体靶向化合物导向具体的细胞内区室。
[0019]本发明另外提供药用组合物或者药物，它们包含本发明的抗体靶向化合物和药学上可接受的载体。
图的简述
[0020]图1显示示例性的整联蛋白靶向制剂，其中小图A-E为RGD肽模拟物，而小图F为RGD肽。核心结构得自如下：美国专利6335330号(小图A)、美国专利5693636号(小图B)、美国专利6040311号(小图C)和美国专利6001117号(小图E)。
[0021]图2显示具有非分支接头的靶向制剂-接头化合物的通用图式(小图A)、以及小图B(SCS-873)、小图C(PST抑制剂二酮基(diketo)接头；化合物26)、小图D(TAK-799二酮基接头；化合物27)和小图E(叶酸配体二酮接头；化合物28)中的具体实施方案。
[0022]图3显示具有分支接头和两个相同靶向制剂的靶向制剂-接头化合物的实施方案的通用图式(小图A)、以及小图B(整联蛋白靶向制剂二酮基接头；化合物29)和小图C(整联蛋白靶向制剂二酮基接头；化合物30)中的具体实施方案。分支点位于接头的连接链部分中。
[0023]图4显示具有分支接头和两个不同靶向制剂的靶向制剂-接头化合物的实施方案的通用图式(小图A)、以及小图B(整联蛋白靶向制剂和叶酸靶向制剂二酮基接头；化合物31)中的具体实施方案。分支点位于接头的连接链部分中。
[0024]图5显示具有分支接头和两个不同靶向制剂的靶向制剂-接头化合物的实施方案的通用图式(小图A)、以及小图B(整联蛋白靶向制剂二酮基接头；化合物32)中的具体实施方案。分支点位于接头的识别基团部分中。
[0025]图6显示接头反应基团的结构。结构A-C与抗体结合位点中的反应亲核基团(例如赖氨酸或者半胱氨酸的侧链)形成可逆共价键(结构A可以形成不可逆共价键，X为N，且如果R1和R3形成环状结构的一部分)。在结构A-C中的R1和R2和R3表示取代基，所述取代基可以为C、H、N、O、P、S、Si、卤素(F、Cl、Br、I)或者它们的盐。X为N、C、Si或者任何其它的杂原子。这些取代基也可以包括基团例如烷基、链烯基、炔基、氧代烷基、氧代链烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基链烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基链烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸链烯基、磷酸炔基。如在结构B和C中所图示说明的，R2和R3可以为环状，而X可以为杂原子。结构D-G与抗体结合位点中的反应亲核基团(例如赖氨酸或者半胱氨酸的侧链)形成不可逆共价键。在这些结构中，R1和R2表示C、O、N、卤化物和离去基团例如甲磺酰基或甲苯磺酰基。
[0026]图7显示适于用抗体的活性氨基酸侧链进行反应修饰的各种亲电试剂。关键词：(A)酰基β-内酰胺；(B)简单二酮；(C)琥珀酰亚胺活性酯；(D)马来酰亚胺；(E)具有接头的卤代乙酰胺；(F)卤代酮；(G)环己基二酮；及(H)醛。R指可以包含靶向制剂、接头或者抗体的其它结构，而X指卤素。
[0027]图8显示接头识别基团(Y)的结构，该识别基团位于反应基团部分与接头的连接链部分之间。小图A显示接头中识别基团Y的关系(参见图2)。小图B-D显示Y至Z、环上的取代基和环成员原子的距离。
[0028]图9显示接头的连接链(X)的结构，如在小图A中所示，连接链一端直接连接于靶向制剂(参见图2)。取代基R2-R4为C、H、N、O、P、S、Si、卤素(F、Cl、Br、I)或其盐，并且可以包括基团例如烷基、链烯基、炔基、氧代烷基、氧代链烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基链烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基链烯基、磺基炔基、磷酸烷基、磷酸链烯基、磷酸炔基以及碳环或者杂环单或者稠和的饱和或者不饱和环结构。小图B：R1为O，R2为C、H、N、O、P、S、Si、卤素(F、Cl、Br、I)或其盐。在结构B和C的连接链中，n、r或者m为1-100。在结构D和E中，n为1、2、4或者更优选为3。
[0029]图10显示流程1，用于SCS-873的胺前体-靶向制剂3或者SCS-胺-的合成流程，关键词：(a)BBr3，CH2Cl2，-20℃，2h；(b)DMF，室温至80℃，3h；(c)BnCOCl，饱和NaHCO3水溶液，乙醚；(d)TBDPSiCl，咪唑，DMF，16h；(e)Pd(OAc)2，(o-tol)3P，i-Pr2EtN，CH3CH2CN，回流，3h；(f)20％(w/w)Pd-C(10％)，H2，EtOH-AcOH(1∶1)，36h；(g)TBAF，THF，室温，1h；(h)DEAD，PPh3，THF-苯(3∶1)，16h；(i)20％(w/w)Pd-C(10％)，环己烯-i-PrOH(1∶1)，90℃，12h；(j)i.2N NaOH水溶液，MeOH-THF(1∶1)，16h，ii.TFAA，苯甲醚，CH2Cl2，0℃，2h。
[0030]图11显示流程2，用于制备化合物4的合成流程(R＝丁氧基羧基氨基己酰基-衍生物)。关键词：(a)DMF，室温；(b)EDC，HOBT，DMF；(c)0.01M在DMSO中，130℃；(d)TFAA，苯甲醚，二氯甲烷；(e)DMF；(f)EDC，HOBT，DMF；(g)(i)步骤d，(ii)2M NaOH，MeOH-THF(1∶1)。
[0031]图12显示流程3，用于制备化合物SCS-873和SCS-1655的合成流程。
[0032]图13显示流程4，用于制备化合物SCS-864和SCS-789的合成流程，关键词：(a)Et3N，DMF，室温，16小时。
[0033]图14显示采用具有马来酰亚胺-二酮反应基团的接头形成靶向制剂-接头化合物的流程。
本发明的详细描述
[0034]本发明提供各种抗体靶向化合物，其中靶向制剂和/或生物制剂共价或者非共价连接于抗体结合位点上。当连接一个或者更多个靶向制剂时，其中至少一个靶向制剂的连接使它能够结合它的靶。这可以通过以下的方式来实现，即以不影响靶向制剂对靶的结合特异性的方式连接靶向制剂，并且使靶向制剂离抗体结合位点的足够距离，以使它能够结合到它的靶而无抗体的空间位阻。这可以通过采用在前面更详细讨论的合适的接头和连接策略来实现。
[0035]当生物制剂也不是靶向制剂时，优选在连接于一个或者更多个生物制剂后，抗体保留至少某些抗原结合特异性。其中一种或者更多种生物制剂连接于抗体结合位点的抗体化合物可以因所连接的生物制剂而呈现生物学活性，如果这样的制剂在连接抗体时是有生物活性的话。这可以通过各种策略，例如通过使抗体结合位点连接于生物制剂上不影响生物学活性的位置来达到。另一个策略是使生物制剂位置远离抗体，以使生物制剂能够与活性必需的另一个分子结合而没有通过抗体的空间位阻。得到连接于抗体结合位点的一个或者更多个生物制剂的生物学活性的其它策略对本领域技术人员是熟知的。在某些实施方案中，生物制剂的生物学活性直到制剂自抗体结合位点释放出来才会实现。这可以在某些实施方案中如前所述借助于不稳定的键来实现。
[0036]在某些实施方案中，共价连接之前存在的抗体的天然抗原结合特异性在共价连接之后将基本不被修饰。换言之，通过共价连接一个或者更多个靶向制剂或者一个或者更多个生物制剂而得到的抗体化合物，可以以与其共价连接之前相似的亲和性与相同的抗原结合。在其它的实施方案中，共价连接之前的抗体的结合特异性在共价连接之后基本上被修饰。由于共价连接导致的抗体结合特异性基本上被修饰可以是因共价连接的抗体结合抗原能够大大降低或者共价连接的抗体结合抗原的能力大大增强所致。在某些实施方案中，抗原结合位点与抗原的结合有足够的减少，以致抗体的最初抗原结合特异性被有效地消除。在某些实施方案中，针对抗原的抗原结合位点有足够的减少，以致抗体的最初抗原结合特异性被有效消除并且被共价结合于抗体结合位点的靶向制剂的特异性有效替代。在抗体的结合特异性被靶向制剂的结合特异性有效替代的实施方案中，在共价连接于靶向制剂后，抗体对靶分子呈现的亲和性大于约1×10-6摩尔/升。
[0037]尽管不希望被任何理论束缚，抗体与抗原的结合大大减少可以因靶向制剂或者生物制剂空间阻碍抗原与抗体结合位点接触而引起。或者，或另外，如果通过共价连接而被修饰的抗体结合位点的氨基酸侧链对与抗原结合是重要的，那么可以导致抗原结合大大减少。当靶向制剂或者生物制剂不空间阻碍抗原与抗体结合位点接触，并且经共价连接而被修饰的抗体结合位点的氨基酸侧链对与抗原结合而言重要时，可以导致抗原与抗体的结合大大增加。
[0038]本发明的靶向化合物可以包含具有单一结合位点的抗体或者抗体片段例如Fab或者Fab’抗体片段。在这样的情况下，靶向制剂将连接于抗体分子的单一结合位点。如果靶向分子的抗体或者抗体片段包含两个或者更多个的结合位点，那么其中至少一个结合位点将包含共价连接的靶向制剂。在某些情况下，抗体的所有或者大多数结合位点都可以共价连接于靶向制剂。如果抗体的多个结合位点要连接靶向制剂，则结合位点全部具有连接于其上的相同靶向制剂，或者可以具有连接于相同抗体的不同靶向制剂。应易于理解，可使多个靶向制剂共价连接于单一抗体结合位点。按照多聚体中靶向制剂的特异性，这样的多聚体靶向制剂可以为异多聚体或者同多聚体。
[0039]在此使用的“靶向制剂”或者“靶向成分”指识别、结合或者附着于位于例如细胞、组织(如胞外基质)、流体、有机体或者其亚群中的靶分子的靶部分的部分。靶向制剂及其靶分子表示分子的结合对，后者通过各种分子力包括例如离子键、共价键、疏水键、范德华力和氢键中的任一种彼此相互作用，以使所述结合对具有彼此特异性结合的性质。特异性结合意指结合对在它们不结合另一个分子的情况下呈现相互结合。结合对的实例为生物素-抗生物素蛋白、激素-受体、受体-配体、酶-底物、IgG-蛋白A、抗原-抗体等。靶向制剂及其关联的靶分子彼此呈现显著缔合。按照本领域熟知的方法，通过测定平衡缔合常数(或者结合常数)，可以评价这种缔合。根据Kd＝koff/kon(koff为解离速率常数，kon为缔合速率常数和Kd为平衡常数)计算亲和性。
[0040]通过在各种浓度(c)下测量标记配体的结合分数(r)，于平衡下可以测定亲和性。采用Scatchard方程式：r/c＝K(n-r)对数据作图：
其中
r＝在平衡时已结合配体的摩尔数/受体的摩尔数；
c＝平衡时游离配体的浓度；
k＝平衡缔合常数；和
n＝每受体分子的配体结合位点数目
通过图解分析法，在Y-轴上对r/c相对于X-轴上的r作图，因此产生Scatchard图。亲和性为曲线的负斜率。通过使已结合标记的配体与未标记的过量配体竞争可以测定koff(参见例如美国专利6316409号)。靶向制剂对其靶分子的亲和性优选为至少约1×10-6摩尔/升，更优选为至少约1×10-7摩尔/升，甚至更优选为至少约1×10- 8摩尔/升，也甚至更优选为至少约1×10-9摩尔/升，最优选至少约1×10-10摩尔/升。
[0041]靶向制剂包括(但不限于)5000道尔顿或者更小的小分子有机化合物，例如药物、蛋白质、肽、肽模拟物、糖蛋白、蛋白聚糖、类脂、糖脂、磷脂、脂多糖、核酸、蛋白聚糖、碳水化合物等。靶向制剂可以包括熟知的治疗化合物，包括抗肿瘤药物。抗肿瘤靶向制剂可以包括targpaclitaxel(紫杉醇)、柔红霉素、多柔比星、去甲柔红霉素、4’-表阿霉素、4-脱甲氧基阿霉素、11-脱氧柔红霉素、13-脱氧柔红霉素、阿霉素-14-苯甲酸酯、阿霉素-14-辛酸酯、阿霉素-14-萘乙酸酯、长春碱、长春新碱、丝裂霉素C、N-甲基丝裂霉素C、博来霉素A2、二脱氮杂四氢叶酸、氨基喋呤、甲氨喋呤、秋水仙素和顺铂等。抗微生物药物包括氨基糖苷，包括庆大霉素、抗病毒化合物例如利福平、3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)和阿昔洛韦、抗真菌药例如唑类包括氟康唑、多烯类(plyre)大环内酯类例如两性霉素B和克念菌素、抗寄生虫化合物例如锑剂等。激素靶向制剂包括毒素例如白喉毒素、细胞因子例如CSF、GSF、GMCSF、TNF、促红细胞生成素、免疫调节剂或者细胞因子例如干扰素或者白细胞介素、神经多肽、生殖激素例如HGH、FSH或者LH、甲状腺激素、神经递质例如乙酰胆碱、及激素受体例如雌激素受体。
[0042]在某些优选实施方案中，靶向制剂不为抗体。在其它的优选实施方案中，靶向制剂不为金属螯合物。与天然免疫球蛋白相比较，靶向制剂优选为小分子。靶向制剂，包括用于使靶向制剂共价结合于抗体结合位点的氨基酸残基所必需的任何连接部分，优选大小为至少约300道尔顿，并且优选大小可为至少400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500或者甚至5000道尔顿，甚至尽可能更大。
[0043]本发明靶向化合物中合适的靶向制剂可以是蛋白质或者肽。“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以相互交换使用，表示氨基酸残基的聚合体。如在此使用的，这些术语适用于氨基酸聚合体，其中一个或者更多个氨基酸残基是相应天然来源的氨基酸的人工化学类似物。这些术语也适用于天然来源的氨基酸聚合体。氨基酸可以以L或者D型存在，只要保留肽的结合功能。肽可以具有可变化的长度，但一般长度介于4-200个氨基酸之间。肽可以是环状，在肽内部两个非相邻氨基酸之间具有分子内键，例如主链-主链、侧链-主链和侧链-侧链环合。通过本领域熟知的方法可以制备环肽。参见美国专利第6013625号。
[0044]对靶分子呈现结合活性的蛋白或者肽靶向制剂是本领域熟知的。例如，靶向制剂可以为病毒肽细胞融合抑制剂。这可包括：T-20HIV-1gp41融合抑制剂，其靶向HIV感染细胞的融合受体(对T-20，参见Kang等的美国专利第6281331号和6015881号；Nagashima等，J.Infectious Diseases 183：1121，2001；对其它的HIV抑制剂参见Barney的美国专利第6020459号和Jeffs等的WO0151673A2)；RSV细胞融合抑制剂(参见Antczak的WO 0164013A2和McKimm-Breschkin，Curr.Opin.Invest.Drugs 1：425-427，2000(VP-14637)；肺病毒属细胞融合抑制剂(参见Nitz等WO 9938508A1)等。靶向制剂也包括肽激素或者肽激素类似物，例如LHRH、铃蟾肽/胃泌素释放肽、生长抑素(例如，RC-121八肽)等，它们可以用于靶向各种癌症，如卵巢、乳房、前列腺、小细胞肺癌、结肠直肠、胃和胰腺癌中的任何一种。参见例如Schally等，Eur.J.Endocrinology，141：1-14，1999。
[0045]采用噬菌体文库体内靶向也可以鉴定适用于本发明靶向化合物的肽靶向制剂，其中噬菌体文库显示肽序列的随机文库(参见例如Arap等，Nature Medicine，20028(2)：121-7；Arap等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 200299(3)：1527-1531；Trepel等，Curr.Opin.Chem.Biol.20026(3)：399-404)。
[0046]在某些实施方案中，靶向制剂对整联蛋白特异性。整联蛋白为杂二聚体跨膜糖蛋白复合物，它在细胞粘附事件和信号传导过程起作用。整联蛋白αvβ3在多种细胞上表达并且已显示介导几种生物学有关的过程，包括破骨细胞粘附于骨基质、血管平滑肌细胞迁移和血管生成。整联蛋白αvβ3拮抗剂同样可用于治疗几种人类疾病，包括涉及新生血管形成的疾病例如类风湿性关节炎、癌症和眼科疾病。
[0047]针对整联蛋白的合适靶向制剂包括RGD肽或者肽模拟物或者非RGD肽或者肽模拟物。如在此使用的，“Arg-Gly-Asp肽”或者“RGD肽”打算指具有一个或者更多个含Arg-Gly-Asp序列的肽，此序列可以作为“受体的Arg-Gly-Asp家族”，例如整联蛋白的受体结合位点起作用。包括α和β亚基的整联蛋白，包括各种类型，包括：α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、α9β1、α1β1、α6β4、α4β7、αDβ2、αDβ2、αLβ2、αMβ2、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、αxβ2、αIIbβ3、αIELbβ7等。序列RGD存在于几种基质蛋白中并且为细胞经整联蛋白结合于基质的靶。血小板含大量的蛋白GP IIb/IIIa的RGD-细胞表面受体，所述受体通过与其它的血小板和受损血管的内皮细胞表面相互作用，主要承担冠状动脉血栓形成的发展。术语RGD肽也包括为其功能等价物的氨基酸(例如RLD或者KGD)，前提是它们与相同的RGD受体相互作用。采用例如自动肽合成仪，例如由Applied Biosystems公司(Foster City，Calif)制造的那些自动肽合成仪，通过本领域熟知的方法由氨基酸可以合成含RGD序列的肽。
[0048]如在此使用的，“非RGD”肽指作为整联蛋白与其配体(例如纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白等)结合的拮抗剂或者激动剂、但不包括RGD结合位点的肽。针对αvβ3(参见例如美国专利第5767071号和5780426号)以及其它的整联蛋白例如α4β1(VLA-4)、α4β7(参见例如美国专利第6365619号；Chang等，Bioorganic & Medicinal Chem Lett，12：159-163(2002)；Lin等，Bioorganic & Medicinal Chem Lett，12：133-136(2002))等的非RGD整联蛋白肽是已知的。
[0049]整联蛋白靶向制剂可以为肽模拟物激动剂或者拮抗剂，其优选为RGD肽或者非RGD肽的肽模拟物激动剂或者拮抗剂。如在此使用的，术语“肽模拟物”为能够模似或者拮抗天然母体肽的生物学作用的、含非肽结构元件的化合物。RGD肽的肽模拟物为保留RGD氨基酸序列的类似肽链药效团、但其在结合位点序列缺乏氨基酸或者肽键的有机分子。同样地，非RGD肽的肽模拟物为保留非RGD结合位点序列的类似肽链药效团、但其在结合位点序列缺乏氨基酸或者肽键的有机分子。“药效团”为化合物产生具体应答或者具有所需活性所需的官能团的特定三维排列。术语“RGD肽模拟物”意指包括含由有机/非肽结构支持的RGD药效团的分子的化合物。应理解RGD肽模拟物(或者非RGD肽模拟物)可以为更大分子的一部分，其本身包括肽键连接的常规或者修饰的氨基酸。
[0050]RGD肽模拟物是本领域熟知的，并已按整联蛋白例如GPIIb/IIIa、αvβ3和αvβ5描述(参见例如Miller等，J.Med.Chem.2000，43：22-26和国际专利申请书WO 0110867、WO 9915178、WO9915170、WO 9815278、WO 9814192、WO 0035887、WO9906049、WO 9724119和WO 9600730；也参见Kumar等，CancerRes.61：2232-2238(2000))。许多这样的化合物对不止一种整联蛋白有特异性。RGD肽模拟物一般基于核心或者模板(也称作“纤维蛋白原受体拮抗剂模板”)，所述核心或模板通过间隔基在核心一端连接酸性基团，而在另一端连接碱性基团。酸性基团通常为羧酸官能团，而碱性基团一般为含N部分例如脒或者胍。通常，核心结构加入酸性部分与碱性氮部分之间的一种刚性间距的形式，并且含一个或者更多个环状结构(例如，吡啶、吲唑等)或者酰胺键，以用于这一目的。对纤维蛋白原受体拮抗剂，RGD肽模拟物的酸性基团与碱性基团的氮之间通常存在约12-15个、更优选13或者14个、间插共价键(借助最短的分子内途径)。对玻连蛋白受体拮抗剂而言，酸性部分与碱性部分之间的间插共价键数目通常更少，为2-5个，优选3或者4个。可以选择具体的核心以得到纤维蛋白原拮抗剂模板的酸性部分与吡啶的氮原子之间的合适间距。通常，纤维蛋白原拮抗剂在酸性部分(例如放出质子或者接受电子对的原子)与碱性部分(例如接受质子或者给予电子对)之间应具有约16埃(1.6nm)的分子内距离，而玻连蛋白拮抗剂在酸性与碱性中心之间应具有约14埃(1.4nm)的分子内距离。在美国专利第6159964号中可以发现自纤维蛋白原受体模拟物转变为玻连蛋白受体模拟物的另外的描述。
[0051]肽模拟物RGD核心可以包括含0-6个双键和含0-6个选自N、O和S的杂原子的5-11元芳族或者非芳族单环或者多环系统。环系统可为未取代的或者可以在碳原子或者氮原子上被取代。具有合适取代基的用于玻连蛋白结合的优选核心结构包括单环和双环基团，例如在WO 98/14192中描述的苯并氮杂草、在U.S.6239168号中描述的苯并二氮杂和在U.S.6008213中描述的稠合三环。
[0052]美国专利号6159964含该文件的表1中的参考文献的广泛条目，其公开了RGD肽模拟物核心结构(称作纤维蛋白原模板)，后者可以用于制备RGD肽模拟物。优选的玻连蛋白RGD和纤连蛋白RGD肽模拟物在以下美国专利号中公开：
Patent Nos.6,335,330；5,977,101；6,088,213；6,069,158；6,191,304；6,239,138；6,159,964；6,117,910；6,117,866；6,008,214；6,127,359；5,939,412；5,693,636；6,403,578；6,387,895；6,268,378；6,218,387；6,207,663；6,011,045；5,990,145；6,399,620；6,322,770；6,017,925；5,981,546；5,952,341；6,413,955；6,340,679；6313,119；6,268,378；6,211,184；6,066,648；5,843,906；6,251,944；5,952,381；5,852,210；5,811,441；6,114,328；5,849,736；5,446,056；5,756,441；6,028,087；6,037,343；5,795,893；5,726,192；5,741,804；5,470,849；6,319,937；6,172,256；5,773,644；6,028,223；6,232,308；6,322,770；5,760,028。
[0053]示例性的RGD肽模拟物整联蛋白靶向制剂以下表示为化合物1、2和3，并且可以用于制备本发明的整联蛋白靶向化合物。在这三个化合物中，接头如所示的连接于七元环的氮。其它的RGD肽模拟物整联蛋白靶向制剂包括化合物33，其中P和L为碳或者氮。接头可以为R1或者R2，而R3基团包括碱基例如-NH基团。在某些实施方案中，R3基团如在结构1、2或者33中所示。在某些实施方案中，R3基团包括杂环基，例如苯并咪唑、咪唑、吡啶基等。在某些这样的实施方案中，R3为烷氧基，例如丙氧基等，其由被烷基氨基例如甲基氨基等取代的杂环基取代，而在其它的实施方案中，R3为烷氧基，例如丙氧基等，由杂环基氨基取代，例如由吡啶基氨基等例如2-吡啶基氨基取代。在其它的实施方案中，R3为式-C(＝O)Rb的基团，其中Rb选自-N(烷基)-烷基-杂环基，例如-N(Me)-CH2-苯并咪唑基等。
Figure C0282563100221
[0054]在图1中显示了其它的示例性整联蛋白肽模拟物靶向制剂和肽靶向制剂。接头可为R1、R2、R3中的任一个，其中R4可以是接头或者可水解基团，例如烷基、链烯基、炔基、氧代烷基、氧代链烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基链烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基链烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸链烯基、磷酸炔基等。本领域技术人员应该容易地意识到其它的整联蛋白激动剂和拮抗剂模拟物(mimetics)也可以用于本发明的靶向化合物。
[0055]靶向化合物的靶向制剂所结合的靶分子优选为非免疫球蛋白分子或者为免疫球蛋白分子，其中靶部分处于免疫球蛋白结合位点的外面。这并不打算从本发明的化合物中排除那些作为抗原起作用并因此结合于免疫球蛋白结合位点的靶向制剂。在此包括这样的靶向制剂，只要所述靶向制剂也结合于非免疫球蛋白分子和/或位于免疫球蛋白分子结合位点外部的靶部分。通常，靶分子可以是任何类型的分子，包括有机物、无机物、蛋白质、类脂、碳水化合物、核酸等。
[0056]靶分子优选为生物分子例如蛋白质、碳水化合物、类脂或者核酸。靶分子可与细胞(“细胞表面表达的”)、或者其它的颗粒(“颗粒子表面表达的”)例如病毒相连，或者可以是细胞外的。如果与细胞或者颗粒相连，靶分子优选以使靶向化合物的靶向制剂从机体的流体相与表面受体接触这样的方式在细胞或者颗粒表面表达。
[0057]在某些优选实施方案中，靶分子为占据优势地或者全部地与病理状况或者疾病细胞、组织或者流体有关。因此，本发明抗体靶向化合物的靶向制剂可以用于通过靶向细胞、胞外基质生物分子或者流体生物分子而传递靶向化合物至染病组织。在下文实施例中公开的示例性的靶分子包括整联蛋白(实施例1)、细胞因子受体(实施例2、3和7)、细胞因子(实施例4)、维生素受体(实施例5)、细胞表面酶(实施例6)和HIV-1病毒和HIV-1病毒感染细胞(实施例8和11)等。
[0058]在其它优选实施方案中，靶分子与感染因子有关并表达在微生物细胞的表面或者病毒颗粒的表面。因此，靶向制剂可结合于细胞表面表达的或者颗粒表达的感染因子的抗体靶向组合物，可以通过靶向机体内部或者个体表面(例如皮肤)的微生物因子用作抗微生物药。在后一种情况下，本发明化合物可以局部使用。
[0059]对微生物靶分子特异性的抗体靶向制剂体外也可以用作抗微生物药。因此，提供降低存在于表面的微生物细胞或者病毒颗粒感染性的方法。某些方法包括使微生物细胞或者病毒颗粒的表面与有效量的本发明靶向化合物接触。这样方法中的靶向化合物包括对微生物细胞或者病毒颗粒上的受体特异性的靶向制剂。可应用的表面为体外任何表面，例如counter top、避孕套等。
[0060]本发明靶向分子的另一个优选靶分子为前列腺特异性抗原(PSA)，一种与各种疾病状态包括前列腺癌、乳腺癌和骨转移有关的丝氨酸蛋白酶。已知结合于PSA活性部位的PSA特异性抑制剂。参见Adlington等，J.Med.Chem.，2001，44：1491-1508和Anderson的WO 98/25895。作为化合物34的具体的PST抑制剂显示如下。
Figure C0282563100241
[0061]靶向制剂，除它结合靶分子的能力以外，可以以具有一种或者更多种生物学活性为特征，每一活性特征在于对细胞器官或者有机体的功能的可检测的生物学影响。因此，除了作为靶向制剂以外，这样的化合物可被认为是生物制剂。例如，以上作为化合物1、2、3和33所示的整联蛋白靶向制剂不仅靶向整联蛋白，而且具有整联蛋白拮抗剂生物学活性。然而，在某些实施方案中，靶向制剂可以为没有生物学活性的纯结合制剂。
[0062]本发明的靶向化合物包括共价连接于抗体结合位点的靶向制剂。这样的靶向化合物可以具有一种或者更多种与靶向化合物有关的生物学活性。生物学活性可以为靶向制剂本身的内在特征，或者可以通过不同于靶向化合物中的靶向制剂的生物制剂提供。生物制剂可以与靶向化合物的其它分子或者部分共价或者非共价相连，尽管共价键为优选。通过本领域熟知的方法，可使生物制剂连接于靶向制剂、抗体或者这两者。例如，参见Kiaris等，Eur.J.Cancer 37：620-628(2001)和Schally等，Eur.J.Endocrin.141：1-14(1989)，它们描述肽激素靶向制剂与多柔比星之间的各种缀合物。也参见Canevari等，Ann Oncol 1994Oct；5(8)：698-701；Rihova，FoliaMicrobiol(Praha)1995；40(4)：367-84；Vitetta，Princess Takamatsu Symp1988；19：333-40；和Ghose等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1987；3(4)：263-359。因此，在某些实施方案中，本发明的抗体-靶向制剂靶向化合物可以包括以具有内在生物学活性的靶向制剂的形式存在的功能成分。在这样的实施方案中，靶向制剂连接于抗体或者抗体片段的结合位点，并且靶向制剂为呈现生物学活性的功能成分。在其它的实施方案中，靶向化合物包括连接于抗体或者抗体片段的结合位点的靶向制剂，并且也包括分开的功能成分，后者优选通过共价键附着或者连接于靶向化合物。
[0063]可以采用在特定条件下不稳定的键，使靶向制剂或者生物制剂连接于本发明的抗体靶向化合物。不稳定键可以处于抗体与靶向制剂或者生物制剂之间，如果接头存在，则不稳定键可以处于抗体与接头之间、靶向制剂或者生物制剂与接头之间、接头之内、或者它们的组合。
[0064]不稳定接头包括可逆共价键、pH敏感键(酸或碱敏感)、酶敏感键、降解敏感键、光敏感键等以及它们的组合。这些特征也是可被认为是不稳定接头类型的前药的特征。先前已设计各种不稳定接头。例如，如在美国专利第5498729号中描述的，采用具有经水解缓慢降解的羧酸部分的化合物可以形成前药。
[0065]不稳定接头的具体设计可用于指导生物制剂在它到达其预定的靶后释放。例如，键可以被设计为在具体的细胞内区室或抗体靶向化合物可以聚集于其中的细胞外区室直接释放。酸不稳定接头，例如顺式-乌头酸接头，可以利用不同细胞内区室(例如在受体介导的胞饮期间遇到的核内体和溶酶体)的酸性环境。参见Shen等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1981)102：1048-1054；Yang等，J.Natl.Canc.Inst.(1988)80：1154-1159。位于接头内或接头末端的肽间隔臂可用于影响靶向制剂或生物制剂通过肽酶例如溶酶体肽酶作用的释放。参见例如Trouet等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1982)79，626-629。
[0066]依它们用途的内容而定，具体的靶向制剂可以具有或者不具有生物学活性。例如，当治疗药物多柔比星(其为DNA嵌入剂)共价连接于抗体并且以无细胞形式应用于DNA时，该治疗药物可以为针对双链DNA的靶向制剂。然而，对于细胞而言可不认为多柔比星是靶向制剂，尽管该药物共价连接于抗体，除非化合物能够被细胞摄取。在后一种情况下，如果药物能够接近在细胞核中的DNA，则多柔比星被摄取后可具有生物学活性。
[0067]生物制剂功能成分包括(但不限于)小分子药物(约5000道尔顿或者更小的药用有机化合物)、有机分子、蛋白质、肽、肽模拟物、糖蛋白、蛋白聚糖、类脂糖脂、磷脂、脂多糖、核酸、蛋白聚糖、碳水化合物等。生物制剂可以为抗肿瘤药、抗微生物药、激素、效应物等。这样的化合物包括熟知的治疗化合物，例如抗肿瘤药物紫杉醇、柔红霉素、多柔比星、去甲柔红霉素、4’-表阿霉素、4-去甲氧基阿霉素、11-脱氧柔红霉素、13-脱氧柔红霉素、阿霉素-14-苯甲酸酯、阿霉素-14-辛酸酯、阿霉素-14-萘乙酸酯、长春碱、长春新碱、丝裂霉素C、N-甲基丝裂霉素C、博来霉素A2、二脱氮杂四氢叶酸、氨基喋呤、甲氨喋呤、秋水仙素和顺铂等。抗微生物药物包括氨基糖苷，包括庆大霉素、抗病毒化合物例如利福平、3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)和阿昔洛韦、抗真菌药例如唑类包括氟康唑、多烯类大环内酯类例如两性霉素B和克念菌素、抗寄生虫化合物例如锑剂等。激素可包括毒素例如白喉类毒素、细胞因子例如CSF、GSF、GMCSF、TNF、促红细胞生成素、免疫调节剂或者细胞因子例如干扰素或者白细胞介素、神经多肽、生殖激素例如HGH、FSH或者LH、甲状腺激素、神经递质例如乙酰胆碱、激素受体例如雌激素受体。也包括非甾体抗炎药，例如吲哚美辛、乙酰水杨酸、布洛芬、舒林酸、吡罗昔康和萘普生及麻醉药或者镇痛药。也包括例如那些用于成像以及用于治疗的放射性同位素。
[0068]用于本发明的靶向化合物的生物制剂功能成分可以是天然来源的或者合成的。生物制剂以其天然状态可为生物学活性的，或者无生物学活性的或者以潜在的前体状态存在并在当生物制剂的部分被水解、裂解或者另外修饰时获得生物学或治疗活性。采用本发明的抗体靶向化合物，可将前药递送至细胞表面或者细胞内，然后其在那里可被激活。关于这一点，生物制剂可以为“前药”，意指能够通过它们结构的某些化学或者酶促修饰而转变为药物(活性治疗化合物)的前药分子。在前药方法中，通过前药的组织特异性激活可以得到部位特异性药物传递，所述组织特异性激活是通过对该组织独有或以更高的浓度(与其它的组织相比较)存在的酶的代谢所致的结果；因此，它更有效地激活前药。
[0069]如先前描述的，可以用光动力学治疗通过裂解光敏感接头或者激活光敏感酶(酰基酶水解)来激活前药(参见美国专利第5114851和5218137号)。光动力学治疗也可以用于在不需要药物活性的部位(例如在非靶向组织)使药物迅速失活。共价修饰药物以形成前药的各种方法是本领域熟知的。
[0070]靶向制剂可直接或通过接头的帮助共价连接于抗体结合位点。可选择合适的接头以提供靶向制剂与抗体结合位点之间的足够距离，以使靶向制剂能够与其靶分子结合。这个距离依几个因素而定，包括：例如抗体结合位点的最外面与结合位点的活性侧链之间的距离及靶向制剂的性质。一般地，接头长度应为约5-10埃(0.5-1nm)，10埃(1.0nm)或10埃以上为更优选，尽管如果氨基酸侧链非常邻近结合位点的最外面部分和/或靶向制剂或者生物制剂包括可以作为接头一部分起作用的片段，则长度约3埃(0.3nm)的更短的接头可为足够的。
[0071]也可以按照线性原子的数目观察接头的长度(通过采用最短的途径计算环状部分例如芳族环等)。在这种测量下的接头长度一般为约10-200个原子并且更通常为约30个或30个以上的原子，尽管如果活性氨基酸侧链非常邻近结合位点的最外面部分，则2或者更多个原子的更短的接头可能是足够的。通常，带有至少约9个原子的线性序列段(stretch)的接头是足够的。其它的接头考虑因素包括对生成的靶向化合物或靶向制剂-接头的物理或者药动学性质的作用、溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(或多或少的稳定性以及计划的降解作用)、刚性、柔性、免疫原性、抗体结合的调节、与靶向制剂的化学适配性、掺入胶束或者脂质体的能力等。
[0072]在其中接头存在于抗体结合位点之间的靶向化合物中，通过几种方法可制备靶向制剂。在一种方法中，用接头可合成靶向制剂-接头化合物和/或生物制剂-接头化合物，所述接头包括一个或更多个被设计用于与抗体的结合位点上的氨基酸侧链共价反应的反应基团。在接头反应基团与氨基酸侧链形成共价键的条件下，将制剂-接头化合物和抗体混合。
[0073]在另一种方法中，通过合成包含抗体和接头的抗体-接头化合物，其中接头包括一个或者更多个设计用于与靶向制剂或生物制剂的合适化学部分共价反应的反应基团，可以实现连接。靶向制剂或生物制剂可需要被修饰以提供用于与接头反应基团反应的合适的部分。在接头反应基团共价连接于靶向和/或生物制剂的条件下，将抗体-接头和靶向制剂和/或生物制剂混合。
[0074]形成本发明的抗体靶向化合物的另一种方法采用双重接头设计。在一个实施方案中，合成制剂-接头化合物，其包含靶向制剂和/或生物制剂和带有反应基团的接头。也可合成抗体-接头化合物，它包含抗体和接头，后者带有易于与第一步骤的制剂-接头的反应基团反应的化学部分。然后，在接头共价结合形成抗体靶向化合物的条件下，使这两个含接头的化合物结合。
[0075]在另一个实施方案中，合成抗体-接头化合物，接头包含抗体和带有反应基团的接头。也可制备靶向制剂和/或生物制剂-接头化合物，它含制剂和接头，后者带有易于与第一步骤的抗体-接头的反应基团反应的化学部分。然后，在接头共价结合形成抗体靶向化合物的条件下，使这两个含接头的化合物结合。在此使用的涉及化学部分的“易敏的(易于)”指化学部分将与适配的反应基团共价结合。因此，亲电基团易于与亲核基团共价结合，反之亦然。
[0076]如讨论的那样，接头可以首先缀合于靶向制剂，然后靶向制剂-接头缀合于抗体结合位点。或者，接头可以首先缀合于抗体结合位点，然后抗体-接头缀合于靶向制剂。本领域熟知的各种方法能够用于使接头与靶向制剂或者抗体结合位点连接。可参与连接的示例性功能基团包括例如酯、酰胺、醚、磷酸酯、氨基、酮基、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、受掩蔽或者保护的二酮(例如缩酮)、内酰胺、卤代酮、醛、硫代氨基甲酸酯、硫代酰胺、硫代酯、硫化物、二硫化物、磷酰胺、磺酰胺、脲、硫脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、羟基酰胺等。
[0077]接头包括来自以下基团C、H、N、O、P、S、Si、卤素(F、Cl、Br、I)的任何原子或其盐。接头也可以包括基团例如烷基、链烯基、炔基、氧代烷基、氧代链烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基链烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基链烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸链烯基、磷酸炔基。接头也可以包括一个或者更多个环结构。如在此使用的“环结构”包括碳环的同或者异单或者稠合的饱和或者不饱和环结构。以上基团和环的组合也可以存在于本发明的靶向化合物的接头中。
[0078]用于制备本发明靶向化合物的非分支接头的实施方案的一般性设计示于图2A中。接头具有下式：
X-Y-Z
其中X为连接链，Y为识别基团和Z为反应基团。图2B-E显示各种带有已鉴定的接头X、Y和Z部分的靶向制剂-接头化合物。接头可以为线性或者分支的。在某些实施方案中，接头具有5-200或者10-200个原子之间的线性序列段，尽管在其它的实施方案中，可使用更长的接头长度。一个或者更多个靶向制剂可连接于X。在某些实施方案中，当连接不止一个靶向制剂并且使用分支接头时，靶向制剂中的某些可以连接于接头的不同分支。然而，应理解在本发明的化合物中使用的接头可以具有一个或者更多个识别基团、一个或者更多个反应基团和一个或者更多个连接链及它们的组合。连接链可以自另一个连接链分支或者自识别基团分支。
[0079]接头的连接链X包括来自基团C、H、N、O、P、S、Si、卤素(F、Cl、Br、I)的任何原子或其盐。X也可以包括基团如烷基、链烯基、炔基、氧代烷基、氧代链烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基链烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基链烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸链烯基、磷酸炔基。在某些实施方案中，X可包括一种或者更多种环结构。在一个优选实施方案中，X包括介于2-100单位之间的重复的醚单元。X的各种实施方案示于图9中。
[0080]接头的识别基团Y为任选的且如果存在则定位于反应基团与连接链之间。在优选的实施方案中，Y定位于距离Z1-20个原子。尽管不希望受任何理论束缚，但相信识别基团可使反应基团适当地定位于抗体结合位点，使它可以与活性氨基酸侧链反应。图8显示各种示例性的识别基团，其带有一个或者更多个5或者6个原子的同或者异的环结构。也可使用更大的环结构。一个或者更多个靶向制剂可连接于Y。在某些实施方案中，接头可用于使靶向制剂与Y连接。在使用两个或者更多个靶向制剂的实施方案中，一个或者更多个可连接于X和Y两者。也可将不止一种靶向制剂连接于Y。
[0081]接头反应基团Z包括任何亲核基团或者亲电基团。在一个优选实施方案中，Z能够与抗体的活性侧链形成共价键。在某些实施方案中，Z包括一个或者更多个C＝O，基团被排列以形成二酮、酰基β-内酰胺、活性酯、卤代酮、环己基二酮基、醛或者马来酰亚胺。其它基团可包括内酯、酸酐和α-卤代乙酰胺或环氧化物。可共价结合于抗体结合位点的反应性亲核基团(例如赖氨酸或者半胱氨酸侧链)的示例性接头亲电反应基团包括酰基β-内酰胺、简单二酮、琥珀酰亚胺活性酯、马来酰亚胺、带有接头的卤代乙酰胺、卤代酮、环己基二酮、醛、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、受掩蔽或者保护的二酮(例如缩酮)、内酰胺、磺酸酯等、掩蔽的C＝O基团例如亚胺、缩酮、缩醛和任何其它已知的亲电基。优选接头反应基团包括一个或者更多个C＝O，基团被排列以形成酰基β-内酰胺、简单二酮、琥珀酰亚胺活性酯、马来酰亚胺、带有接头的卤代乙酰胺、卤代酮、环己基二酮或者醛。
[0082]Z可以为形成可逆或者不可逆共价键的基团。在某些实施方案中，可以采用二酮Z基团例如在图6中所示的那些基团形成可逆共价键。在图6的结构A-C中的R1和R2和R3表示取代基，其可以为C、H、N、O、P、S、Si、卤素(F、Cl、Br、I)或其盐。这些取代基也可以包括基团例如烷基、链烯基、炔基、氧代烷基、氧代链烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基链烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基链烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸链烯基、磷酸炔基。R2和R3也可以形成如在结构B和C中所示的环结构。图6中的X可为杂原子。形成可逆共价键的其它的Z基团包括二酮、脒、亚胺及在图7的结构B和G中所示的其它反应基团。图7也包括其它优选的接头反应基团的结构。
[0083]与抗体结合位点形成不可逆共价键的Z反应基团包括在图6中的结构D-G和在图7中的A、C和D。这样的结构用于使靶向制剂-接头不可逆连接于抗体结合位点的活性亲核基团(例如赖氨酸或者半胱氨酸的侧链)。
[0084]应理解，以上描述的可逆和不可逆共价键化学也可应用于在接头不存在下使靶向制剂或者生物制剂连接于抗体，或者使靶向制剂或者生物制剂连接于接头(例如接头的连接链)。例如，通过在接头或者靶向制剂上放入合适的反应基团Z型元件例如合适的亲核基团或者亲电基团及在两者的其它部分放入合适的反应部分例如氨基或者巯基，靶向制剂可与接头连接形成靶向制剂-接头。
[0085]用于本发明靶向化合物和用于制备靶向制剂-接头化合物的优选接头包括作为Z的1，3-二酮反应基团。另一优选接头为其中连接链X包含介于2-100个单位之间的重复醚单元的接头。优选其中存在识别基团Y的接头，Y优选定位于距离反应基团Z 1-20个原子。连接于整联蛋白靶向RGD肽模拟物部分的核心(例如以上描述的那些)的这样的接头可具有如下所示的结构28，其中n为1-100或者更多且优选为1、2或者4，更优选为3。在某些实施方案中，接头为重复出现的聚合物例如聚乙二醇。
Figure C0282563100321
[0086]选择靶向制剂中可固有存在的接头反应基团或者类似这样的反应基团以用于与特定的抗体结合。例如，用于醛缩酶抗体修饰的化学部分可以为酮、二酮、β-内酰胺、活性酯卤代酮、内酯、酸酐、马来酰亚胺、α-卤代乙酰胺、环己基二酮、环氧化物、醛、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、受掩蔽或者保护的二酮(例如缩酮)、内酰胺、卤代酮、醛等。1，3-二酮构型例如在化合物SCS-873(参见如下)或者SCS-864(参见如下)中所示的二酮，作为用于醛缩酶抗体修饰的底物为特别优选的。
Figure C0282563100331
靶向制剂                        具有1，3二酮基的接头
Figure C0282563100332
靶向制剂                        具有1，3二酮基的接头
SCS864
[0087]适用于经抗体中活性巯基共价修饰的接头反应基团化学部分(Z)可为二硫化物、芳基卤、马来酰亚胺、α-卤代乙酰胺、异氰酸酯、环氧化物、硫代酯、活性酯、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、受掩蔽或者保护的二酮(例如缩酮)、内酰胺、卤代酮、醛等。各种包括带有作为反应基团的1，3-二酮的接头的靶向制剂-接头化合物的化学结构示于图2-5中。
[0088]本领域技术人员应该容易地意识到，在抗体中的活性氨基酸侧链可具有与靶向制剂或其接头上的亲核基团反应的亲电基团，而在其它的实施方案中，在抗体或抗体片段的结合位点的氨基酸侧链中的活性亲核基团与靶向制剂或接头上的亲电基团反应。因此，抗体或抗体片段结合位点侧链可被亲电试剂取代(例如，图6和7)并且这个基团可用于与靶向制剂或其接头(例如NH2)上的亲核试剂反应。在这个实施方案中，抗体和靶向制剂每一个具有在每一端带有合适的活性部分的部分接头，以使部分接头的两端能形成全长接头，因此建立完全的靶向化合物。
[0089]本领域技术人员应该容易地意识到两个或者更多个靶向制剂可以连接于单一的抗体结合位点。就它们对具体靶的特异性而言，两个靶向制剂可以是相同的或者可以是不同。在一个实施方案中，每一靶向制剂可以连接于抗体结合位点中氨基酸的分开的活性侧链。在一个优选实施方案中，两个靶向制剂连接于分支接头或者线性接头，所述接头然后使两个靶向制剂连接于抗体结合位点中相同的活性氨基酸侧链。在某些实施方案中，分支接头的每一分支包含5-100个原子之间的线性序列段。例如，在图3-5中公开的结构显示带有具有1，3-二酮作为活性基团的分支接头的实施方案，其中两个靶向制剂连接于接头的不同分支。如在这些实施方案中所示，分支点可以处于连接链或者处于识别基团中(如果存在)。
[0090]在此使用的“抗体”包括：免疫球蛋白，它为B细胞及其变体；以及T细胞受体(TcR)的产物，它为T细胞及其变体的产物。免疫球蛋白为含一种或者更多种基本上由免疫球蛋白κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因编码的多肽的蛋白。轻链分类为κ或者λ。重链归为γ、μ、α、δ或者ε类，后者依次分别定义免疫球蛋白种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链的亚类也是已知的。例如，人体内的IgG重链可以为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类中的任一种。
[0091]已知典型免疫球蛋白结构单位包含四聚体。每一四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻链”(约25kD)和一个“重链”(约50-70kD)。每一链的N-末端定义约100-110个或者更多个氨基酸的主要担负抗原识别的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
[0092]抗体作为全长完整抗体或者作为各种由多种肽酶或者化学物消化产生的良好表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键下消化抗体以产生F(ab’)2，它是Fab的二聚体，其本身为通过二硫键连接于VH-CH1的轻链。在温和的条件下可以还原F(ab’)2以断裂铰链区的二硫键，因而可使F(ab’)2二聚体转变为Fab’单体。Fab’单体基本上为带有部分铰链区的Fab片段(有关其它抗体片段的更详细地描述，参见Fundamental Immunology，W.E.Paul编辑，Raven Press，N.Y.(1993))。尽管按照完整抗体消化定义各种抗体片段，但本领域技术人员应意识到可以重新化学合成或者采用重组DNA方法学合成各种抗体片段中的任一种。因此，如在此使用的术语抗体也包括由整个抗体修饰或重新化学合成产生的抗体片段或者通过采用重组DNA方法学得到的抗体和片段。
[0093]T细胞受体(TcR)为由α或β链组成或(在少数T细胞上)由γ或者δ链组成的二硫键合的杂化二聚体(heterodimer)。两条链一般于装配抗体铰链区的氨基酸短延伸序列段(stretch)中恰好在T细胞质膜外面通过二硫键连接。每一TcR链由一个抗体样可变区(Vα或Vβ)和一个恒定区(Cα或Cβ)组成。全长TcR具有约95kDa的分子量，各个链的大小在35-47kDa之间变化。也包括在TCR含义中的还有受体的部分，例如能够采用本领域熟知的方法作为可溶性蛋白产生的这一受体的可变区。例如，美国专利6080840号描述了通过把TcR的胞外结构域剪接至Thy-1糖基磷脂酰肌醇(GPI)膜锚定序列而制备的可溶性T细胞受体(TcR)。在CD3不存在下，这个分子表达在细胞表面上并且可通过用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)处理从膜上切下。可溶性TcR也可以基本如在美国专利第5216132号描述的，通过使TcR可变结构域与抗体重链CH2或CH3结构域偶合来制备，或者通过Schusta等Nature Biotech.18，754-759(2000)或者Holler等Proc.Natl.Acad.Sci(USA)97：5387-5392(2000)描述的作为可溶性TcR单链来制备。TcR“抗体”作为可溶性产物可以用于替代抗体，以制备本发明化合物。采用以上对抗体讨论的相同的方法，参考CDR区和其它的构架残基可以鉴定TcR的结合位点。
[0094]重组抗体可以为常规全长抗体、来自蛋白酶消化的已知抗体片段、独特的抗体片段例如Fv或者单链Fv(scFv)、缺失结构域的抗体等。Fv抗体为大约50Kd大小并且包含轻链和重链的可变区。单链Fv(“scFv”)多肽为共价连接的VH::VL杂化二聚体，后者可以由包括直接连接或肽编码接头连接的VH和VL编码序列的核酸表达。参见Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。有多种结构使来自抗体V区的天然聚集但化学分离的轻链和重链多肽转变为scFv分子，后者将会折叠为与抗原结合位点的结构基本类似的三维结构。参见美国专利第5091513、5132405和4956778号。
[0095]结合位点指抗体分子参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。抗体可变区含三个称作“高变区”或者称作“互补性决定区”(CDR)的高度趋异的序列段，它们在称为“构架区”(FR)的更保守的侧翼序列段之间插入。在抗体分子中，轻链的三个高变区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)和重链的三个高变区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)在三维空间彼此相对排列以形成抗原结合表面或者袋。因此，抗体结合位点表示组成抗体的CDR的氨基酸和组成结合位点袋的任何构架残基。
[0096]采用本领域熟知的方法，可测定具体抗体中构成结合位点的氨基酸残基的同一性。例如，抗体CDR可被鉴定为最初由Kabat等(参见，“免疫学问题的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)”，E.Kabat等，U.S.Department of Health andHuman Services；Johnson，G and Wu，TT(2001)，Kabat数据库及其应用：未来方向(Kabat Database and its applications：future directions).Nucleic Acids Research，29：205-206；http://immuno.bme.nwa.edu)限定的高变区。也可以把CDR的位置鉴定为最初由Chothia和其它人描述的结构环状(loop)结构(参见Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196，901(1987)，Chothia等，Nature 342，877(1989)，和Tramontano等，J.Mol.Biol.215，175(1990))。其它的方法包括“AbM定义”，该方法为Kabat和Chothia之间的折衷办法并且采用Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件(now Accelrys)或者由Macallum等(“抗体抗原相互作用：接触分析和结合位点拓扑学(Antibody-antigen interactions：contactanalysis and binding site topography)”，J Mol Biol.1996Oct 11；262(5)：732-45)描述的CDR的“接触定义”而衍化。以下图表基于多种已知的定义鉴定CDR。
Loop    Kabat        AbM          Chothia         接触
----    --------     --------     --------        --------
L1      L24--L34     L24--L34     L24--L34        L30--L36
L2      L50--L56     L50--L56     L50--L56        L46--L55
L3      L89--L97     L89--L97     L89--L97        L89--L96
H1      H31--H35B    H26--H35B    H26--H32..34    H30--H35B
(Kabat编号)
H1      H31--H35     H26--H35     H26--H32        H30--H35
(Chothia编号)
H2      H50--H65     H50--H58     H52--H56        H47--H58
H3      H95--H102    H95--H102    H95--H102       H93--H101
一般指南如下，借此人们可以鉴定仅来自序列的抗体中的CDRs：
LCDR1：
起始-约残基24。
之前的残基总是Cys。
之后的残基总是Trp。通常TRP之后跟随TYR-GLN，但是也可以后接LEU-GLN、PHE-GLN或者TYR-LEU。
长度为10-17个残基。
LCDR2：
起始-L1末端之后16个残基。
之前的序列一般为ILE-TYR，但是也可以为VAL-TYR、ILE-LYS或者ILE-PHE。
长度一般为7个残基。
LCDR3：
起始为L2末端之后33个残基。
之前的残基为Cys。
之后的序列为PHE-GLY-X-GLY。
长度一般为7-11个残基。
HCDR1：
起始-在约残基26(CYS之后4个残基)[Chothia/AbM定义]
随后Kabat定义起始5个残基。
之前的序列为CYS-X-X-X。
之后的残基为TRP，一般之后为VAL，但之后也可以为ILE或者ALA。
长度按照AbM定义为10-12个残基，而Chothia定义排除最后4个残基。
HCDR2：
起始-以CDR-H1的Kabat/AbM定义的末端之后的15个残基。
之前的序列一般为LEU-GLU-TRP-ILE-GLY(SEQ ID NO：1)，但许多变异是可能的。
之后的序列为LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA。
长度按照Kabat定义为16-19个残基(AbM定义提前7个残基终止)。
HCDR3：
起始-CDR-H2末端之后的33个残基(CYS后的两个残基)。
之前的序列为CYS-X-X(一般为CYS-ALA-ARG)。
之后的序列为TRP-GLY-X-GLY。
长度为3-25个残基。
[0097]采用本领域熟知的方法例如分子建模(modeling)和X-射线晶体学，可以测定具体抗体中下述氨基酸残基的同一性，这些残基位于CDR之外，但由于具有作为结合位点内衬一部分的侧链而构成结合位点的部分(即可用于连接于结合位点)。参见例如Riechmann等，(1988)Nature，332：323-327。醛缩酶抗体小鼠mAb 38C2(其具有接近但位于HCDR3之外的活性赖氨酸)为这样抗体的实例。
[0098]例如，当抗体结合位点的反应残基由首先被鉴定为制备该抗体的淋巴细胞中存在的核苷酸编码时，该残基与所述抗体可以为天然相关的。或者，所述氨基酸残基可以通过有意突变以编码该特定残基而产生(参见例如Meares等的WO 01/22922)。在另一种方法中，所述氨基酸残基或者其活性元件(例如亲核氨基或者巯基)可以连接在抗体结合位点中的氨基酸残基。因此，在此使用的“通过抗体结合位点中的氨基酸残基”而发生的与抗体的共价连接，意指可以直接与抗体结合位点的氨基酸残基进行连接或者通过与抗体结合位点中氨基酸残基的侧链连接的化学部分进行连接。
[0099]如讨论的那样，能够用于制备本发明的抗体靶向化合物的抗体需要位于抗体结合位点中的活性侧链。活性侧链可以存在于任何抗体中，或者通过突变而被置于在任何抗体中。催化抗体为这样抗体的优选来源。这样的抗体包括醛缩酶抗体、β-内酰胺酶抗体、酯酶抗体、酰胺酶抗体等。
[00100]位于抗体结合位点中的活性赖氨酸可以共价连接于与靶向制剂或者接头-靶向制剂相连的酮、二酮、β-内酰胺、活性酯卤代酮、内酯、酸酐、马来酰亚胺、环氧化物、醛、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、受掩蔽或者保护的二酮(例如缩酮)、内酰胺、卤代酮、醛等。示例性的和优选的这样的抗体为醛缩酶抗体，例如小鼠单克隆抗体mAb 38C2及其它类催化抗体以及这样抗体的合适的人源化和嵌合形式。小鼠mAb 38C2为通过活性免疫(reactive immunization)和机械模拟天然醛缩酶产生的一类新的催化抗体的原型(Barbas等，Science 278，2085-2092，1997)。采用天然醛缩酶的烯胺机制，通过活性赖氨酸，这些抗体催化羟醛和逆羟醛反应(Wagner等，Science 270，1797-1800，1995；Barbas等，Science 278，2085-2092，1997；Zhong等，Angew.Chem.Int.第38版，3738-3741，1999；Karlstrom等，Proc.Natl.Acad.Sci.U，S.A.，973878-3883，2000)。除它们在合成有机化学中的多用性和效力以外(例如Hoffmann等，1998，J.Am.Chem.Soc.120，2768-2779；Sinha等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，14603-14608，1998)，醛缩酶抗体已用于作为抗癌策略在体外和体内激活喜树碱、多柔比星和依托泊苷前药(Shabat等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96，6925-6930，1999和Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98，7528-7533，2001)。
[00101]在另一个实例中，抗体结合位点的活性氨基酸可以为活性半胱氨酸、丝氨酸或者酪氨酸残基。对于半胱氨酸，得到的抗体可以与含马来酰亚胺的成分或者其它的硫醇-反应基团例如碘代乙酰胺、芳基卤、二巯基化物等形成共价键。如由Janda等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)91，2532-2536，(1994)描述的，可以在硫酯酶催化抗体中发现活性半胱氨酸。对其它的酯酶抗体参见Wirsching等，Science 270：1775-82(1995)。通过本领域熟知的方法，包括使抗体结合位点残基突变以编码活性氨基酸或者用带有含反应基团的接头将抗体结合位点中的氨基酸侧链化学衍化，可以制备含活性氨基酸的抗体。
[00102]通过常规免疫、体内活性免疫，或者通过体外活性选择，例如用噬菌体展示(display)，可以得到适合在此使用的抗体。可以在人或者在其它的动物种类中产生抗体。可以修饰得自一个动物物种的抗体以反映另一个动物物种。例如，人嵌合抗体为其中抗体的至少一个区来自人免疫球蛋白的抗体。一般应理解人嵌合抗体具有得自非-人动物例如啮齿动物的可变区，而恒定区得自人类。与之相反，人源化抗体采用得自非-人抗体的CDR，而大多数或者所有可变构架区和所有的恒定区得自人免疫球蛋白。可以通过本领域熟知的方法，包括CDR移植方法(参见例如美国专利第5843708、6180370、5693762、5585089、5530101号)、链改组策略(参见例如美国专利第5565332号，Rader等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95：8910-8915)、分子模建策略(美国专利第5639641号)等，制备嵌合和人源化抗体。
[00103]不像抗体的常规化学衍生化那样，衍生自活性免疫法的那些抗体可在它们的结合位点中于特定位置被特异性标记，这有助于快速和可控地制备同源产物。另外，不像抗体的化学衍生化那样，那些采用活性免疫法和1，3-二酮衍生的化学衍生化是可逆的。由于这种可逆性，通过与共价结合半抗原JW(Wagner等，1995，Science270，1797-800)或者相关化合物竞争，可自抗体释放结合于mAb 38C2的靶向化合物的二酮衍生物。这使之可在不良反应情况下体内迅速中和该缀合物。或者，例如与醛缩酶抗体和靶向化合物的β-内酰胺衍生物的非可逆共价结合是可能的。不像常规抗-半抗原抗体那样，共价二酮结合抗体具有优点，即二酮与抗体之间形成的共价键对pH大的变化(低的pH 3或者高的pH 11的极端值)是稳定的。这样的pH变迁不会自抗体释放靶向化合物。这对肿瘤靶向是有利的，因为与正常组织相比较，肿瘤一般呈现降低的pH。共价连接于其靶向制剂的共价结合抗体的增加的稳定性应在制剂、传递和长期贮存方面提供另外的有利条件。
[00104]采用本领域熟知的技术，可制备本发明的靶向化合物。一般地，合成也是功能成分(生物制剂)的靶向制剂为第一个步骤。然后将靶向制剂(在这个情况下也为功能成分)衍生化用于与连接成分(接头)连接，然后其与抗体接合。本领域技术人员应该容易地意识到所采用的具体合成步骤应依这三种成分的精确性质而定。
[00105]作为实例，作为第一个步骤，如在流程1(图10)和2(图11)中所示，分别制备作为化合物15和4所示的靶向制剂-接头化合物，作为如在以上化合物1和2中所示的整联蛋白靶向制剂的衍生化形式。通过加入接头(连接成分)的部分，将化合物15和4衍生化(相对于化合物1和2)。流程3(图12)显示另外的合成步骤，通过这些步骤具有二酮反应部分的完全接头被加入到衍生化的靶向制剂化合物15，以得到靶向化合物SCS-873和SCS-1655。
[00106]如在图10(流程1)和图11(流程2)中所示，分别合成如化合物15和4所示的整联蛋白靶向成分。如在流程3(图12)中所示，带有二酮反应性部分的接头被引入到这些靶分子中，以形成靶向化合物-接头分子SCS-873和SCS-1655。自化合物14开始以三个步骤实现SCS-873的合成。如在流程1中所示，在Et3N存在下，在CH3CN-DMF中将化合物14转变为化合物15，并使粗产物与二酮化合物23的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯反应。经硅胶(CH2Cl2-MeOH，9∶1)纯化得到纯的SCS-873。
[00107]以五个步骤自14合成化合物SCS-1655(流程2和3)。脱除化合物14中的BOC基团保护，随后与二价接头24的NHS酯反应，得到化合物25，然后使后者脱保护且如上与23反应，得到SCS-1655。
[00108]整联蛋白靶向成分-接头分子SCS-864和SCS-789的合成示于流程4(图13)中。以一个步骤自化合物4分别合成SCS-864和SCS-789(图13，流程4)。用合适的活化NHS-酯可实现化合物4的连接。
[00109]可用0.5当量的醛缩酶抗体例如mAb 38C2温育靶向制剂-接头化合物，例如其中接头包括二酮反应性部分的SCS-864、SCS-873和SCS-1655，以产生抗体靶向化合物。下面陈述另外的实例。
[00110]也提供用于共价结合于抗体结合位点的靶向制剂-接头化合物。当靶向制剂通过接头连接于抗体时，接头具有足够的长度以使靶向制剂结合于靶分子。在某些实施方案中，靶向制剂-接头化合物包括带有式X-Y-Z的接头的对靶分子具有特异性的一个或者更多个靶向制剂。接头成分X、Y和Z的组成如上所述。如果两个或者更多个靶向制剂被包含在靶向制剂-接头化合物中，各种靶向制剂可以直接连接于接头，或者接头可以是分支的，而靶向制剂连接于不同的接头分支。
[00111]也提供能够与抗体结合位点非共价结合的靶向制剂-接头化合物。这一化合物能够用于与合适的抗体缀合以形成本发明的靶向化合物。这样的靶向制剂-接头化合物含两个或者更多个通过接头共价连接于该抗体所识别抗原的靶向制剂。当靶向制剂通过接头连接于抗体时，接头可以为线性或者分支的并且应该具有足够的长度以使靶向制剂结合于靶分子。
[00112]在某些实施方案中，接头包括C、H、N、O、P、S、Si、F、Cl、Br和I的任一种或其盐。接头也可以包括基团例如烷基、链烯基、炔基、氧代烷基、氧代链烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基链烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基链烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸链烯基、磷酸炔基。接头也可以包括一个或者更多个环结构。以上基团和环的组合也可以存在于本发明靶向化合物的接头中。在某些实施方案中，接头具有2-200个原子的线性序列段，尽管在其它的实施方案中，可使用更长的接头长度。一种或者更多种靶向制剂可连接于接头，并且如果使用分支接头，靶向制剂中的某些可以连接于接头的不同分支。
[00113]在某些实施方案中，靶向制剂-接头化合物的靶向制剂为生物学活性的，而在其它的实施方案中，靶向制剂-接头化合物另外包括分开的生物制剂，后者优选共价连接于靶向制剂。在某些实施方案中，采用用于使靶向制剂连接于接头的基本相同方法或者采用本领域熟知的其它的方法，生物制剂可以连接于靶向制剂或者连接于接头。
[00114]接头中的抗原可为能够由可以得到的抗体结合的任何抗原。抗原为本领域熟知的，并且包括有机化合物、药物、生物分子例如蛋白质、肽、肽模拟物、糖蛋白、蛋白聚糖、类脂、糖脂、核酸、碳水化合物等以及这些分子的组合。
[00115]本发明也包括修饰抗体结合位点以对特定的靶分子产生结合特异性的方法。这样的方法包括使抗体结合位点中的活性氨基酸侧链与靶向制剂-接头化合物的接头上的化学部分共价结合，其中靶向制剂对靶分子具特异性。接头中的所述化学部分与靶向制剂距离足够远，以致于当靶向制剂-接头化合物共价结合于抗体结合位点时，靶向制剂可与靶分子结合。一般认为所述抗体对靶分子不具有特异性。在一个优选实施方案中，共价结合之前的抗体对靶分子的亲和性小于约1×10-5摩尔/升。然而，抗体共价结合于靶向制剂-接头化合物之后，修饰的抗体对靶分子的亲和性优选至少为约1×10- 6摩尔/升，更优选为至少约1×10-7摩尔/升，甚至更优选为至少1×10-8摩尔/升，也甚至更优选为至少1×10-9摩尔/升，最优选至少约1×10-10摩尔/升。
[00116]本发明也包括改变靶向制剂、生物制剂或者接头的至少一种物理或者生物学特性的方法。方法包括如上描述的使靶向制剂或者生物制剂共价连接于抗体结合位点。在某些实施方案中，靶向制剂或者生物制剂通过接头连接于抗体结合位点，其特性如上描述。该方法特别用于连接5Kd或者更小的小靶向或者生物制剂。然而，该方法也用于更大的这样的分子。靶向制剂或者生物制剂的性质可包括结合亲合力、降解(例如被蛋白酶降解)易敏性、药动学、药效学、免疫原性、溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(更大或者更小的稳定性以及按计划的降解)、刚性、柔性、抗体结合的调节等。
[00117]如在此使用的，药动学指一段时间内所给予的化合物在血清中的浓度。药效学指一段时间内所给予的化合物在靶和非靶组织中的浓度和在靶组织(效力)和非靶组织(毒性)中的效应。例如，在药动学或者药效学方面的改善可被设计用于具体的靶向制剂或者生物制剂，例如采用不稳定键或者通过修饰任何接头的化学性质(使溶解性、载荷量等变化)。
[00118]可以修饰本发明的抗体靶向化合物的生物学特性以得到改善的药学特性或者其它特性。这可以通过改变靶向制剂或者生物学制剂、接头或者抗体的一种或者更多种化学性质来实现。一个优选的方法是化学修饰接头的一种或者更多种化学性质。通过改变包含接头的化合物的化学性质，技术人员能够得到改善的特征，例如在药动学、药效学、溶解性、免疫原性等方面的改善。
[00119]本发明的靶向化合物具有许多种用途。例如，靶向化合物的抗体部分一般可以延长体积较小的靶向制剂的体内半衰期。通过增加由靶向化合物的抗体部分提供的效应物功能(例如补体介导的效应物功能)，可以增加特定靶向制剂的生物潜能。另外，靶向制剂，通过连接于抗体使其大小增加，可以使靶向制剂在其它情况下不能用作竞争性抑制剂的情况下作为竞争性抑制剂起作用。因此，一方面，本发明提供增加靶向制剂有效的循环半衰期的方法。方法包括采用以上阐述的连接基团使靶向制剂连接于抗体。另一方面，本发明提供使抗体重新定向(redirecting)于特定靶的方法。方法包括通过以上陈述的接头使抗体连接于靶向制剂。
[00120]本发明也提供治疗或者预防个体内疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症包括表达靶分子的细胞、组织或者流体。方法包括给予受治疗者例如患者治疗有效量的本发明靶向化合物。受治疗者可以是动物例如哺乳动物。在某些实施方案中，受治疗者为人。所述化合物可包括生物制剂，所述生物制剂与靶向制剂相同或者不同并且可以采用在此描述的任何形式或者活性。在某些优选实施方案中，靶分子为整联蛋白且疾病为癌症。整联蛋白表达在癌症中的关系是本领域熟知的(参见例如美国专利第5753230和5766591号，此公开通过引用结合到本文中)。对在人体内的治疗应用，人抗体、人源化抗体或者人嵌合抗体优选作为靶向化合物的抗体成分。如果要求激动剂活性，则带有人IgG4恒定区的抗体也是优选的。
[00121]除治疗应用外，本发明的抗体靶向化合物也可以用于细胞例如肿瘤细胞或者组织(例如胞外基质生物分子)成像，如在本领域中熟知的。因此，提供在个体体内使细胞或者组织(例如细胞外基质生物分子)成像的方法。在这样的方法中，细胞或者组织表达靶分子。方法包括给予患者连接于可检测标记物的本发明抗体靶向化合物。用于这样方法的可检测标记物可为放射性同位素或者可以为非放射性同位素，例如可用于核磁共振(NMR)成像。在后一种情况下，技术人员可以使抗体靶向制剂连接于螯合物，例如基本如Simkins等，Nat.Med.，4(5)：623-6(1998)中描述的必须的顺磁金属钆的二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)。
[00122]对SCS-873和38C2的混合物与人卡波西肉瘤SLK细胞的结合进行了研究。SCS-873有效介导38C2的细胞表面结合。在SCS-873不存在下，未检测到38C2的结合。对照实验证实1，3-二酮部分是SCS-873结合38C2所需要的。在分别独立i.p.和i.v.注射之后，SCS-873和38C2体内形成整联蛋白αvβ3靶向缀合物。在这些实验中，通过结合于38C2，SCS-873的循环半衰期被延长超出两个数量级。SCS-873和38C2的组合有效抑制人卡波西肉瘤的小鼠模型中的肿瘤生长，而单独的SCS-873或者38C2不太有效或者完全无效。
[00123]本发明也提供使生物学活性靶向细胞、组织(例如细胞外基质生物分子)或者患者流体中的生物分子的方法。方法包括给予患者靶向化合物，后者包括对细胞、组织细胞外基质生物分子或者流体生物分子具有特异性的靶向制剂。靶向制剂共价连接于抗体结合位点的氨基酸残基。在某些实施方案中，接头用于使靶向制剂连接于抗体。靶向制剂不为抗体。在某些实施方案中，化合物具有生物学活性，而在其它的实施方案中，不为靶向制剂的生物学活性分子作为化合物的成分被包括在内。或者，靶向化合物的成分部分可以分开给予，然后体内形成共价化合物。在这样一种方法中，靶向制剂可以包括接头/反应部分，或者抗体结合位点可以被适当修饰，以共价结合于靶向制剂。
[00124]本发明的靶向化合物可作为药剂或药物给予，所述药剂或药物包括用药学上可接受的载体配制的本发明的靶向化合物。因此，所述化合物可以用于药物或药用组合物的制备。本发明的药用组合物可以配制为非肠道给药用的溶液或者冻干粉末。可以在临用前通过加入合适的稀释剂或者其它的药学上可接受的载体，对粉末进行重建。液体制剂可以为缓冲溶液、等渗水溶液。粉剂也可以以干燥形式喷雾。合适的稀释剂的实例为正常的等渗盐水，标准的5％葡萄糖水溶液或者缓冲的乙酸钠或乙酸铵溶液。这样的制剂特别适用于非肠道给药，但也可用于口服给药或者包含在用于吹入或吸入的计量吸入器或者喷雾器中。它可以需要加入赋形剂例如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠或者枸橼酸钠。
[00125]或者，化合物可以被装胶囊、压片或者制备成乳剂或者糖浆剂，以用于口服给药。可以加入药学上可接受的固体或者液体载体以增强或者稳定组合物，或者便利于组合物的制备。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、白土、硬脂酸镁或者硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂或者明胶。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐水和水。载体也可以包括缓释材料例如单硬脂酸甘油酯或者二硬脂酸甘油酯，单独或与石蜡一起使用。固体载体的量可变化但优选应介于每剂量单位约20mg-1g之间。按照常规药学技术，包括研磨、混合、制粒和压制，可制备药用制剂，必要时，用于片剂形式、或者研磨、混合和填充硬明胶胶囊形式。当使用液体载体时，制剂应为糖浆、酏剂、乳剂或者含水或非水混悬剂的形式。对直肠给药，本发明化合物可以与赋形剂例如可可脂、甘油、明胶或者聚乙二醇组合并模压成栓剂。
[00126]本发明的化合物可以被配制包括其它的医学上有用的药物或者生物制剂。化合物也可以与用于本发明化合物所针对的疾病或病症的其它药物或者生物制剂联合给予。
[00127]如在此使用的术语“有效量”指足以提供高至足以在其接受者中产生有益作用的浓度的剂量。对任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平应依各种因素而定，包括受治疗的疾病、疾病的严重性、具体化合物的活性、给药途径、化合物的清除率、治疗持续时间、用于与化合物联合或者共同给予的药物、患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况和在医学领域和科学领域中熟知的因素。重视各种通常的考虑以确定“治疗有效量”是本领域技术人员已知的并在例如Gilman等，Goodman和Gilman’s：ThePharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press，1990；和Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing公司，Easton，Pa.，1990中被描述。剂量水平一般处于约0.001至最多可达100mg/kg/天范围内；通常使用约0.05至最多可达10mg/kg/天范围内的水平。化合物可以经非肠道例如血管内、静脉、动脉内、肌内、皮下等给予。也可以经口、鼻、直肠、经皮或者通过气溶胶吸入给药。组合物可以作为大剂量或者缓慢输入给予。
[00128]将抗体-靶向制剂缀合物给予具有免疫能力的个体可以导致抗该缀合物的抗体的产生。这样的抗体可以涉及抗体本身，例如可变区，包括抗体独特型，以及涉及靶向制剂或者用于使靶向制剂与抗体缀合的任何接头。通过本领域熟知的方法，例如通过使基于长链聚乙二醇(PEG)的间隔区等连接于抗体-靶向制剂，可以达到降低抗体-靶向制剂缀合物的免疫原性。已知长链PEG和其它的聚合物具有其掩蔽外源性抗原决定部位的能力，导致显露外源性抗原决定部位的治疗蛋白的免疫原性降低(Katre等，1990，J.Immunol.144，209-213；Francis等，1998，Int.J.Hematol.68，1-18)。值得注意的是，PEG也可为接头，因此在本发明的靶向化合物中提供接头功能并降低免疫原性的两种作用。作为选择，或者另外，已给予抗体-靶向制剂缀合物的个体可被给予免疫抑制剂例如环孢素A、抗-CD3抗体等。
[00129]另外提供筛选受体激动剂或者拮抗剂的化学文库的方法。方法包括使化学文库的各成员连接于抗体结合位点并然后测试抗体连接的文库与受体的结合情况或者对受体与受体的配体之间结合的抑制情况。通过这一方法，本发明的抗体靶向化合物为高通量筛选提供新的方式以鉴定例如作为拮抗剂或者激动剂起作用的候选者小分子化学物质，例如药物肽模拟物、有机化合物等。相对小体积的有用的候选者化学分子一般需要间接筛选例如置换或者竞争方式。如在此提供的，通过使文库中的各药物连接于抗体结合位点，技术人员能够建立在抗体方式上的化学文库。
[00130]通过合成带有合适的含特殊接头部分的接头的化学候选者，可以制备抗体结合位点-标记的文库，其中所述特殊的接头部分被设计为用于与特定的抗体共价相互作用。这样的接头可以包括与在结合位点包括活性赖氨酸的醛缩酶抗体结合使的二酮部分。本领域技术人员应易于理解，在此描述的其它的接头和接头部分(例如生物素)明显可用于这一目的。
[00131]例如，如此制备的抗体结合位点-标记的化学文库可用于例如受体测定或者细胞生物测定，其中通过检测所连接的抗体可以监测文库中每一化合物的结合。通过本领域熟知的抗体检测方法，可以实现每一化合物的抗体部分的检测。例如，抗体可以连接于检测部分例如酶、荧光团、放射性同位素等。也可以采用间接系统例如生物素-链霉抗生物素。能够在细胞或者不纯的抗原例如病毒溶胞产物以及在纯化的抗原上筛选这些文库。例如，采用如在蛋白凝胶上电泳的溶胞产物作为靶，集中分析具体的凝胶谱带，可以测试文库结合或者抑制结合的作用。在受体在细胞上表达的情况下，通过检测所述结合或者抑制结合的下游发生的细胞信号事件(或者如在抑制事件下不发生)，可测定结合或者对结合的抑制作用。辅以本领域熟知的报道基因可检测下游的细胞信号(参见美国专利第5618720和5670113号)。
[00132]抗体标记的化学文库的筛选可以容易地适用于高通量设备。筛选可以在体外或者体内进行。另外，生物展示文库例如肽噬菌体文库可以用来制备抗体结合位点-标记的文库。在这样的情况下，接头部分(例如二酮)的连接位点可为文库与生物载体的融合点。
[00133]也提供测定样品中分析物的量的免疫测定方法。这样的方法包括：
(a)在含样品的介质中，形成分析物与至少一种对分析物具有特异性的抗体之间的复合物；
(b)分析介质以检测复合物的量；和
(c)使复合物的量与样品中分析物的量相关。
这样的方法也可以包括与至少一种对分析物具有特异性的抗体形成复合物。通过共价连接于抗体结合位点的活性氨基酸、对分析物具有特异性的非抗体靶向制剂提供抗体的特异性。因此，本发明的抗体靶向化合物可用于检测和测量样品中分析物的量的免疫测定，如先前用常规制备的多克隆或者单克隆抗体所进行的。这样的测定是本领域熟知的并包括RIA、EIA、蛋白质印迹分析、ELISA等。测定类型可以为竞争性或者非竞争性的并且可以为直接的或者间接的。抗体靶向化合物可用于液相和/或可结合于固相载体。载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、磁铁矿物质等。载体的性质可以是可溶的或者不溶性的。抗体靶向化合物可以以本领域熟知的各种方式中的任一种进行可检测性标记。美国专利第4659678、4780423和4298685号为这样测定的示例。
[00134]按照常规术语，通过在含样品的介质中形成分析物与至少一种对分析物具有特异性的抗体之间的复合物，可测定样品中分析物的量。然后分析介质以测定所形成的复合物的量。最后，使形成的复合物的量与样品中分析物的量相关。如已经描述的，这一通法可采用许多形式，例如直接和间接的、均相或者异相的，以及竞争性和非竞争性的。在所有情况下，本发明的抗体靶向化合物可以用于替代由常规制备的抗体所提供的功能。
[00135]也提供直接或者间接结合测定，其中采用对分析物特异性的抗体测定分析物的存在情况。在这样的方法中，采用对分析物特异性的抗体测定分析物的存在情况。抗体特异性由对分析物特异性的非抗体靶向制剂引起，且靶向制剂共价连接于抗体结合位点中的活性氨基酸。因此，本发明的抗体靶向化合物能够替代常规制备的抗体而用于定量测定。
[00136]显而易见，本发明的化合物不仅可应用人体医学治疗和诊断中，而且也可应用于兽医学、农业、环境和其它的学科。
[00137]也提供抑制或者降低靶向制剂或者生物制剂穿越细胞膜的能力的方法。在这些方法中，通过使本身不穿越细胞膜的抗体的结合位点共价连接于靶向制剂或者生物制剂，形成抗体靶向化合物，其中所述抗体与所述靶向制剂或者生物制剂的连接降低或者抑制药剂穿越细胞膜的能力。不针对细胞表面内在化受体的抗体为不穿越细胞膜的抗体的优选来源。
[00138]另外提供介导细胞内活性药物的细胞内传递的方法。在这些方法中，制备抗体靶向化合物，其中所述化合物包含通过接头共价连接抗体结合位点的一个或者更多个靶向制剂或者一个或者更多个生物制剂或者这两者。靶向制剂或者生物制剂其特征在于它们与细胞受体结合并且介导所述制剂的内在化。抗体靶向化合物也包含细胞内具有活性的药物。当表达该受体的细胞接触抗体靶向化合物时，细胞内药物传递发生。所述接触导致抗体靶向制剂内在化和所述药物传递至细胞内。
[00139]这个方法利用受体介导的胞吞作用(即受体介导的内在化)，以传递抗体靶向化合物至细胞内。介导结合配体内在化的细胞表面受体为本领域所熟知并且包括例如整联蛋白、HER2、EGF受体、叶酸受体等。内在化试验易于得到并且能够采用荧光检测方法评价。
[00140]在某些实施方案中，细胞内活性药物为当所述药物接触细胞内区室时变得有活性的前药。抗体靶向化合物可以包括使内在化抗体靶向化合物导向特定细胞内区室的细胞内运输信号。许多蛋白含一个或者更多个用作运输信号或者使蛋白靶向于正确的细胞内位点的靶向序列。目的地上的受体也可以参与运输过程。
[00141]使蛋白和其它的化合物导向不同的细胞内位点例如内质网、核内体、高尔基体或者细胞核等的序列为本领域所熟知。例如，内质网运输信号包括KDEL或者KKXX序列，高尔基体运输信号包括GRIP结构域(参见Munro等，Curr Biol 9：377-379，1999)，溶酶体运输信号(得自高尔基体)包括甘露糖-6-磷酸修饰的寡糖，以及核定位运输信号，后者包括一个或者两个短的正电荷序列，例如富含赖氨酸或者精氨酸序列(参见Penco等，Biotech Appl Biochem 34：151-1592001)。
[00142]通过以下阐述本发明优选实施方案的实施例阐述本发明的多用性，但不以任何方式限制权利要求或者说明书。
实施例1：含共价连接醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的RGD肽模拟物靶向制剂的抗体靶向化合物
[00143]基于RGD肽模拟物的二酮接头衍生物与小鼠mAb38C2的活性赖氨酸之间的可逆共价键的形成，形成了整联蛋白靶向化合物。小鼠mAb 38C2为由活性免疫和机械模拟天然醛缩酶产生的一类新的催化抗体的原型(Barbas等，Science 278，2085-2092，1997)。这些抗体采用天然醛缩酶的烯胺机制，通过活性赖氨酸，催化醛醇和逆醛醇(retro-aldol)反应(Wagner等，Science 270，1797-1800，1995；Barbas等，Science 278，2085-2092，1997；Zhong等，Angew.Chem.Int.Ed.38，3738-3741，1999)。除它们在合成有机化学中的多用性和有效性以外，醛缩酶抗体作为抗癌策略已被用于喜树碱、多柔比星和依托泊苷前药体内外的活化(Shabat等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96，6925-6930，1999；Shabat等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98，7528-7533，2001)。这些抗体的另外的特征，即它们共价结合二酮的能力在很大程度上仍未进行探索。
[00144]所采用的RGD肽模拟物(参见化合物1)对人整联蛋白具有特异性，在0.9nM下对αvβ3和在0.6nM下对αvβ5具有高的结合亲合性(通过最小aIIbb3结合呈现的特异性)(Miller等，同上)。如上所述制备化合物1的二酮接头修饰的形式，命名为SCS-873。
[00145]已知对αvβ3或者αvβ5结合具有活性的肽模拟物RGD拮抗剂是合乎需要的，因为这些化合物当中的某些化合物结合小鼠和人整联蛋白。这样种交叉反应性提供人体试验前的动物血管形成模型的临床前体内研究。另外，靶向化合物可以用于治疗卡波齐氏肉瘤，后者与αvβ3整联蛋白有关。
[00146]通过以下方法，将SCS-873连接于抗体38C2：将在磷酸缓冲盐水(10mg/ml)中的1毫升抗体38C2加入到12微升的SCS-873的10mg/mL储备液中并在临用前于室温下把生成的混合物维持2小时。
[00147]评价了SCS-873和38C2的混合物与SLK细胞的结合。SCS-873有效介导38C2的细胞表面结合。在SCS-873不存在时，检测不到38C2的结合。对照组实验证实需要接头的二酮部分使SCS-873与38C2结合。已确定SCS-873保留整联蛋白靶向成分的整联蛋白特异性，即未检测到在ELISA中结合aIIbb3，而发现对αvβ3和αvβ3的结合是强烈的。用SCS-873和38C2制备的靶向化合物的独立的腹膜内和静脉注射相对于每一成分单独注射进入小鼠体内证实了体内整联蛋白的靶向性。在这些实验中，通过结合38C2，SCS-873的血清半衰期延长2个数量级以上。未结合于抗体的游离SCS-873仅有数分钟的血清半衰期，而几天后还可从来自眼血中的血清样品中检测出抗体和小分子的结合。
实施例2：含共价连接于醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的作为靶向制剂的IL-4的抗体靶向化合物
[00148]在其它的人内皮肿瘤细胞中，卡波西肉瘤肿瘤细胞表达白介素-4(IL-4)受体，后者可用由IL-4和称为假单胞杆菌内毒素的细菌毒素的截短形式组成的重组嵌合蛋白来靶向(Husain等，1999，Nat.Med.5，817-822)。基于这些研究，制备了用于使mAb 38C2靶向卡波西肉瘤肿瘤细胞的IL-4靶向化合物。采用赖氨酸反应性部分例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，把带有二酮反应基团的接头缀合于IL-2的赖氨酸侧链上。或者，带有加入的游离半胱氨酸的重组IL-4被用来缀合于半胱氨酸反应性部分例如马来酰亚胺。为减少与靶向化合物的接头部分有关的免疫原性，一端的二酮反应基团与另一端的NHS或者马来酰亚胺基团之间的间隔区(即接头连接链)为聚乙二醇(PEG)链。已知长链PEG和其它的聚合物具有掩蔽外源性抗原决定部位的能力，导致显露外源性抗原决定部位的治疗蛋白的免疫原性降低(Katre等，1990，J.Immunol.144，209-213；Francis等，1998，Int.J.Hematol.68，1-18)。为避免交联抗体被清除，不多于1-2个二酮应缀合于IL-4(Rehlaender和Cho，1998，Pharm.Res.15，1652-1656)。其它的白介素例如IL-2可用于替代IL-4作为靶向制剂。虽然IL-4可以主要用作靶向组件(module)，但由于通过它与抗体连接得到的白介素血清半衰期延长所引起的IL-2受体触发，可能导致其药理作用增强(LussoW等，1996，Transplantation 62，1703-1708)。
实施例3：含共价连接醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的作为靶向制剂的VEGF-R2结合肽的抗体靶向化合物
[00149]血管内皮生长因子(VEGF)为肿瘤血管形成的关键调节子。通过低氧诱导，VEGF的表达经由肿瘤中VEGF mRNA转录的诱导被正调节。在肿瘤产生和释放VEGF后，VEGF扩散至邻近的现有血管中展示VEGF(VEGFR)受体的内皮细胞。VEGF结合两个酪氨酸激酶受体，VEGFR-1和VEGFR-2，它们主要表达在内皮细胞上。内皮细胞的激活与VEGF结合于VEGFR-2有关，而VEGR-1可能作为调节VEGF局部浓度的诱饵(decoy)受体起作用(Neufeld等，1999，FASEB J.13，9-22)。内皮细胞在激活后增殖，直接向肿瘤迁移，最后到达并相互连接形成新的血管。干扰VEGF和VEGFR-2相互作用的抗-血管形成药是癌症治疗的理想候选者(Klohs和Hamby，1999，Curr.Opin.Biotechnol.10，544-549)。通过肽库的噬菌体展示，Binetruy-Tournaire等(2000，EMBO J.19，1525-1533)鉴定出线性VEGFR-2结合肽ATWLPPR(SEQ ID NO：2)。ATWLPPR(SEQ IDNO：2)有效干扰VEGF与VEGFR-2的结合并抑制VEGF介导的血管形成。
[00150]通过合成在氨基或者羧基末端带有另外的Cys残基的肽，制备了含VEGFR-2结合肽的抗体靶向化合物，分别产生带有序列ATWLPPRC(SEQ ID NO：3)和CATWLPPR(SEQ ID NO：4)的肽。这些硫醇修饰的肽与马来酰亚胺/二酮接头反应(图14)，产生肽-接头-二酮和二酮基-接头-肽。用mAb 38C2温育这些二酮衍生物，导致VEGFR-2肽与抗体结合位点之间共价连接。得到的抗体-VEGFR-2化合物用于靶向例如在肿瘤血管形成中表达VEGFR-2的内皮细胞。该化合物延长肽的半衰期并使其配备抗体效应物功能。
实施例4：含共价连接醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的作为靶向制剂的中和RNA适体(aptamer)的抗体靶向化合物
[00151]采用SELEX(指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment))的方法，已生成对各种分子靶的RNA和DNA适体(Jayasena，1999，Clin.Chem.45，1628-1650)。例如，描述了包括约25个核苷酸且以100-pM范围内的亲和性结合VEGF的2’-氟代嘧啶RNA适体(Ruckman等，1999，J.Biol.Chem.32，20556-20567)。像在先前实施例中描述的肽那样，发现所述适体干扰VEGF和VEGFR-2之间的相互作用。
[00152]采用市场上可以得到的硫醇-衍生化核苷酸例如5’-硫代磷酸酯，制备含VEGF RNA适体的抗体靶向化合物。硫代磷酸酯基团为用硫原子替代氧原子中的一个的修饰磷酸酯基团。RNA适体中的硫醇-修饰的核苷酸与马来酰亚胺二酮反应(例如图14)，产生RNA适体靶向-二酮接头化合物。或者，采用市场上可以得到的氨基修饰剂，把伯氨基引入RNA适体。RNA适体中被伯氨基标记的核苷酸与具有N-羟基琥珀酰亚胺二酮作为反应基团的接头反应。用mAb38C2温育这些二酮衍生物，导致RNA适体与抗体结合位点之间共价连接。得到的抗体-RNA适体VEGFR-2靶向化合物用于靶向例如在肿瘤血管形成中表达VEGFR-2的内皮细胞。该化合物延长RNA适体的半衰期并使其配有抗体效应物功能。
实施例5：含共价连接醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的作为靶向制剂的叶酸的抗体靶向化合物
[00153]叶酸受体介导叶酸通过胞吞作用而被摄取进入细胞。它在多种上皮肿瘤细胞上过度表达(Leamon和Low，2001，DrugDiscov.Today 6，44-51)。例如，大于90％的卵巢癌表达叶酸受体(Sudimack and Lee，2000，Adv.Drug Deliv.Rev.41，147-162)。针对叶酸受体的单克隆抗体，例如Mov18和Mov19，已被评价为用于卵巢癌治疗的药物(Coney等，1994，Cancer Res.54，2448-2455；Molthoff等，1997，Cancer 80，2712-2720)。过度表达叶酸受体的癌细胞的叶酸-介导的靶向为另一个策略(Leamon和Low，2001，Drug Discov.Today 6，44-51)。例如，化学治疗剂如美登素类(Ladino等，1997，Int.J.Cancer73，859-864)缀合于叶酸以用于选择性化学治疗。
[00154]使在图2E中所示的含有用二酮衍生化的叶酸的靶向制剂-接头化合物连接于mAb 38C2并且用于靶向卵巢癌细胞。因为，除叶酸受体以外，大多数卵巢肿瘤细胞也表达整联蛋白αvβ3和/或αvβ5，双重靶向化合物可以被用于治疗。含叶酸和RGD肽模拟物拮抗剂的靶向制剂-接头化合物用单个二酮基接头一起衍生化，形成在图4B中所示的双重靶向化合物。该靶向制剂-接头连接于mAb 38C2并可用于靶向卵巢癌细胞。
实施例6：含共价连接醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的作为靶向制剂的前列腺酸磷酸酶或者前列腺特异性抗原的抑制剂的抗体靶向化合物
[00155]前列腺酸磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)，一种丝氨酸蛋白酶，在前列腺肿瘤细胞的细胞表面上表达并被用作前列腺癌的标记。长期以来认为针对PAP和PSA的Mab是前列腺癌疗法的有前景的药物(Chang等，1999，Curr.Opin.Urol.9，391-395)。最近，已报道作为PAP(Beers等，1996，Bioorg.Med.Chem.4，1693-1701)和PSA(Adlington等，2001，J.Med.Chem.44，1491-1508)特异性抑制剂的合成小分子。在鉴定特异性小合成分子或者肽靶向制剂后，对前列腺肿瘤细胞特异的其它的细胞表面酶，例如最近鉴定的丝氨酸蛋白酶hepsin(Magee等，2001，Cancer Res.61，5692-5696)，也可被用作靶。
[00156]用二酮接头使含PAP和/或PSA抑制剂的靶向制剂-接头化合物衍生化，形成在图2C中所示的化合物。靶向制剂-接头连接于mAb 38C2并用于靶向前列腺癌。
实施例7：含共价连接醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的血小板生成素模拟肽或者血小板生成素受体的小分子激动剂的抗体靶向化合物
[00157]细胞表面血小板生成素受体(cMp1，TPOR)为造血生长因子受体超家族的一个成员。血小板生成素(TPO)，与血小板生成素受体结合的细胞因子，在巨核细胞生成和血小板产生中起重要作用。在治疗学上，重组TPO正在临床进行实验，以用于治疗因化学治疗引起的血小板减少和骨髓转移。作为治疗化合物，TPO具有相对短的体内半衰期和制备及制剂的缺点。
[00158]可制备TPO靶向制剂抗体化合物以治疗因化学治疗引起的血小板减少和骨髓转移。合成已报道模拟重组TPO活性的具有序列IEGPTLRQWLAARA(SEQ ID NO：5)的TPO模拟肽AF12505(Cwirla等，1997，Science，276：1696-9)，在氨基末端加入额外的Cys残基，产生CIEGPTLRQWLAARA(SEQ ID NO：6)。然后使这个硫醇标记的肽与马来酰亚胺/二酮接头(图14)反应，产生TPO肽-接头(二酮)化合物。用mAb 38C2温育这个二酮衍生物，生成抗体-TPO受体靶向化合物。
[00159]用体外试验证实该靶向抗体结合表达TPOR的活细胞并且以比肽AF12505更大程度刺激巨核细胞克隆形成。其它的TPO模拟肽为本领域已知的并且也可用作TPO受体靶向制剂。另外，Kimura等(FEBS Lett，1998，428(3)：250-4)最近描述的与TPO受体结合的小分子模拟物也可以用于制备TPOR靶向化合物。
[00160]以上方法能够类似地应用于采用具有增加治疗效力的EPO靶向模拟物靶向促红细胞生成素(EPO)受体(Middleton等，J.Biol.Chem.，1999，274(20)：14163-9；Johnson等，Nephrol Dial Transplant.，2000，15(9)：1274-7)。
实施例8：含共价连接醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的结合HIV-1包膜蛋白的T-20肽或小分子的抗体靶向化合物
[00161]T-20，N-乙酰基-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ IDNO：7)，一种对应于HIV-1包膜蛋白的跨膜亚单位区的合成肽，在小于2ng/ml的浓度下体外阻断细胞融合和病毒进入。当静脉给予时，T-20(单一疗法)，该肽降低血浆HIV RNA水平，证实在体内可成功阻断病毒进入。给予T-20可提供与现行批准的抗-逆转录病毒方案相当的对HIV复制的有效抑制作用(Kilby等，Nat.Med.，1998，4(11)：1302-7)。这个肽类药物具有约2小时的短的体内半衰期的缺点。
[00162]制备了采用T-20肽作为靶向制剂的抗体靶向化合物以增加T-20的效价、效力和半衰期。合成了在羧基末端有额外Cys残基的T-20肽，所得到的修饰的T-20肽具有序列N-乙酰基-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFC(SEQ IDNO：8)。这个硫醇标记的肽然后与马来酰亚胺/二酮接头反应(图14)，产生T-20-Cys-接头化合物。用Ab 38C2温育这个靶向制剂-二酮接头，导致肽与抗体之间共价连接。体外试验证实了该靶向抗体表现出抑制HIV-1进入和感染的效力增加。
[00163]除靶向HIV-1包膜蛋白的肽以外，结合包膜蛋白的各种小分子已被描述。例如，桦木酸衍生物IC9564为有效的抗-人免疫缺陷病毒(抗-HIV)化合物，它能抑制HIV原代分离物和适应实验室的毒株。实验证据提示HIV-1gp120在IC9564的抗-HIV-1活性中起重要作用(Holz-Smith等，Antimicrob Agents Chemother.，2001，45(1)：60-6)。基于所选择抗体恒定区，预期其中IC9564为靶向制剂的抗体靶向化合物通过增加效价、半衰期和通过直接免疫杀灭HIV-1染病细胞，而具有超过IC9564本身的增加的活性。类似地，HIV-1包膜糖蛋白gp41核心结构的最新X-射线晶体衍射图测定开辟了新的途径，以发现用于HIV-1感染和AIDS的化学治疗学的抗病毒药。通过加入二酮臂和共价连接抗体，也可以对最适于对接进入gp41核心的疏水腔且与靶点可能的相互作用最大的化合物加以改进。几个这种类型的化合物已被鉴定(Debnath等，J.Med.Chem.，1999，42(17)：3203-9)。
实施例9：通过抗体的转基因表达和给予靶向制剂-接头衍生物体内形成抗体靶向化合物
[00164]本发明的靶向化合物的体内形成在本发明的方法范围内。在一种方法中，自诱导型转基因体内产生mAb 38C2并给予靶向制剂-接头衍生物(例如二酮接头)。采用基因传递载体，例如腺病毒，能够把编码mAb 38C2轻链和重链或者单链片段的cDNA引入到宿主机体内以建立抗体转基因。这个方法使治疗的灵活性增加。例如，有一般癌症风险的患者在实际检测到疾病之前选择接受该转基因。一旦癌症被诊断，则在该患者体内诱导活性抗体(例如mAb38C2)的表达，并且给予靶向制剂-接头衍生物(例如二酮接头)，其中靶向制剂被特别设计为用于靶向和影响所诊断的癌症。理想地，转基因诱导和给予药物两者均口服完成，因此避免住院。
实施例10：具有改善检测性的抗体靶向化合物文库
[00165]可用于检测结合事件的试验，经常阻碍小分子或者肽拮抗剂、激动剂或者简单结合分子的筛选。经常需要置换或者竞争试验，其中小分子取代其它分子、或者与其它分子竞争与靶点的结合。所述试验必须频繁地根据对特定靶分子来进行具体设计。直接检测结合于细胞表面或者蛋白的小分子经常是不可能的。
[00166]通过制备抗体靶向化合物形式的文库可解决这个问题。为此目的，可用所附的反应基团例如二酮或者高亲和性标记物例如生物素合成小分子文库。已标记分子与靶温育使结合事件的检测简单和敏感，它采用酶联抗体或者荧光标记抗体(例如对二酮为38C2)或者链霉抗生物素(对生物素)实现。易于使这些类型的测定适用于化合物和肽文库的高通量筛选。这种直接筛选已标记分子的优点是检测方法敏感并且使超过可能的细胞表面分子和对蛋白或者其它可溶性蛋白靶的多样性进行标准化。一旦鉴定，接头臂的连接部位不须设计，因为它预先存在于标记的分子中。因此，直接加入共价结合抗体就可提供新的治疗剂。在生物素标记物用于检测的情况下，生物素臂易于交换为二酮臂，以用于直接加入共价结合抗体，以提供新治疗剂。如果文库是生物展示文库，例如肽噬菌体文库，则二酮臂的连接位点为肽文库残基连接于噬菌体外壳蛋白的点。
实施例11：含共价连接醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的、结合HIV-1包膜蛋白的TAK-779小分子的抗体靶向化合物
[00167]β-趋化因子受体CCR5对抑制巨噬细胞-向性的(采用CCR5或者R5)HIV-1复制为有吸引力的靶，因为具有非功能性受体(在CCR5编码区的纯合32-bp缺失)的个体似乎是正常的，但对R5HIV-1感染具有抗性。TAK-779为低分子量(Mr 531.13)非肽CCR5拮抗剂(Baba等，(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，5698-5703)。通过用二酮基接头使TAK-779衍生化，得到在图2D中所示的化合物，制备了靶向制剂-接头化合物。用Mab 38C2温育二酮基-TAK-779化合物，生成抗体CCR5靶向化合物(基于TAK-799)。这个化合物呈现高度有效且选择性地抑制R5HIV-1复制并且特异性地结合CCR5表达的细胞。抗体CCR5靶向化合物与TAK-799本身相比也呈现出了增加的效价、增加的生物潜能和增加的血清半衰期。
[00168]也可修饰其它的CCR5拮抗剂(Shiraishi等，2000，J.Med.Chem.，43，2049-2063)以便与共价结合抗体反应，以产生本发明的靶向化合物。采用这种方法也可以修饰广泛范围内的趋化因子受体拮抗剂。
实施例12：含共价连接醛缩酶单克隆抗体38C2的结合位点的LHRH肽的抗体靶向化合物
[00169]使[D-Lys6]LH-RH拮抗剂Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID NO：9)(100微摩尔)溶于1mL无水DMF中。加入1当量的NHS-二酮接头(化合物35)，并搅拌过夜。真空蒸发溶剂，经HPLC纯化产物。得到的[D-Lys6]LH-RH-二酮接头化合物直接用于偶合抗体38C2。得到的共价修饰的抗体特异性地结合已知表达LH-RH受体的OV-1063人上皮卵巢癌系。
Figure C0282563100621
[00170]因此，参照以上描述的代表性实施方案本发明已被广泛公开和阐述。本领域技术人员应意识到对本发明可以做各种改进而不背离其精神和范围。所有的公开、专利申请书和授权的专利在此通过引用结合到本文中，如同每一各自的公开、专利申请书和授权的专利被特别和各自指明通过引用全部结合到本文中一样。但排除通过引用结合到本文中所包含的与本公开相抵触的定义。在此显示的所有结构被构思以提供所有的对映体和互变异构体。

Claims (32)

1.一种化合物，其包含催化抗体，所述抗体的结合位点共价连接于式X-Y-Z的接头，其中X为线性或分支连接链，Y为识别基团，而Z为选自以下的反应性基团：
其中Y指接头的Y基团；且
藉此催化抗体结合位点中活性氨基酸的侧链与反应性基团Z反应，形成不可逆共价键。
2.权利要求1的化合物，其中在共价连接前所述抗体的抗原结合特异性在共价连接后基本上被修饰。
3.权利要求1的化合物，其中催化抗体结合位点中的活性氨基酸残基为赖氨酸残基。
4.权利要求1的化合物，其中所述催化抗体为醛缩酶抗体。
5.权利要求1的化合物，其中所述催化抗体选自醛缩酶抗体、β-内酰胺酶抗体、酯酶抗体和酰胺酶抗体。
6.权利要求1的化合物，其中所述接头通过互补性决定区连接于所述抗体的结合位点。
7.权利要求1的化合物，其中所述接头通过可变构架区连接于所述抗体的结合位点。
8.权利要求1的化合物，其中所述抗体为全长。
9.权利要求1的化合物，其中所述抗体为全长抗体的片段。
10.权利要求9的化合物，其中所述全长抗体的片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或者sFv。
11.权利要求1的化合物，其中所述抗体为人抗体、人源化抗体或者嵌合人抗体。
12.权利要求1的化合物，其中所述接头的X基团为包含C、H、N、O、P、S、Si、F、Cl、Br和I中任一个或其盐的原子的线性或分支连接链。
13.权利要求12的化合物，其中所述接头的X基团包含5-100个原子的线性序列段。
14.权利要求12的化合物，其中所述接头的X基团包含一个或多个选自以下的基团：烷基、链烯基、炔基、氧代烷基、氧代链烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基链烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基链烯基、磺基炔基、磷酸烷基、磷酸链烯基和磷酸炔基。
15.权利要求1的化合物，其中所述接头的X基团为分支的。
16.权利要求15的化合物，其中X基团的分支末端连接不同的分子。
17.权利要求15的化合物，其中X基团的分支末端连接相同的分子。
18.权利要求12的化合物，其中所述接头的X基团包含2-100个单元之间的重复醚单元。
19.权利要求12的化合物，其中所述接头的X基团包含下式的杂烃基结构
Figure C028256310003C1
其中
R2-R4为C、H、N、O、P、S、Si、卤素(F、Cl、Br、I)或其盐；n为1-100；和
m为1-100。
20.权利要求12的化合物，其中所述接头的Y基团包含一个或多个环结构。
21.权利要求20的化合物，其中所述一个或多个环结构包括一个或多个下式的六元环
Figure C028256310004C1
其中
A、Z、Y、X或W独立为C或N。
22.权利要求20的化合物，其中所述一个或多个环结构包括一个或多个下式的五元环
Figure C028256310004C2
其中
A、Z、Y或X独立为C、O、N或S。
23.权利要求1的化合物，其中Y基团包含苯基。
24.权利要求1的化合物，其中所述化合物还包含共价连接于X基团的治疗药物。
25.权利要求1的化合物，其中所述化合物还包含共价连接于X基团的肽。
26.权利要求1的化合物，其中Z选自：
Figure C028256310004C3
27.权利要求1的化合物，其中Z为
Figure C028256310005C1
28.一种制备权利要求1-27中任一项的化合物的方法，所述方法包括使所述催化抗体的结合位点与接头的Z基团不可逆地共价连接。
29.权利要求28的方法，其中Z基团与抗体结合位点中的活性氨基酸残基反应，形成不可逆共价键。
30.权利要求29的方法，其中所述催化抗体为醛缩酶抗体，而所述活性氨基酸残基为赖氨酸残基。
31.权利要求1-27中任一项的化合物在制备用于对个体的细胞或组织进行造影的造影剂中的用途，其中所述细胞或组织表达靶分子，所述化合物与可检测的标记物连接。
32.权利要求1-27中任一项的化合物在制备用于降低存在于表面的微生物细胞或病毒颗粒的感染性的药物中的应用，其中所述化合物包含对在所述微生物细胞或病毒颗粒上的受体具有特异性的靶向制剂。
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