WO2021015336A1 - αVβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체 - Google Patents

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WO2021015336A1
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integrin
vhh
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장기육
홍관수
박효은
김은민
박은혜
김찬우
강권윤
이현승
김현민
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가톨릭대학교 산학협력단
한국기초과학지원연구원
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    • G01N2800/7014—(Neo)vascularisation - Angiogenesis

Definitions

  • the present invention relates to ⁇ v ⁇ 3 integrin target single domain antibodies and various applications thereof.
  • Integrin is a cell surface receptor that regulates important physiological functions of cells such as cell adhesion and migration, differentiation, and proliferation. Integrins act as a heterodimer in which ⁇ and ⁇ subunits are non-covalent bonds, and ⁇ and ⁇ subunits form a pair to form 22 kinds of integrin families. Integrin mainly binds to extracellular matrix proteins such as vibronectin, fibronectin, collagen, laminin, vWF, and fibrinogen, but there is a difference in ligand specificity for each type of integrin, and one type of integrin can bind to various ligands at the same time. have.
  • integrin ⁇ v ⁇ 3 is expressed in most aggressive tumor cells among various cancers including skin cancer, prostate cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, lung cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, and stomach cancer, and is an adhesion-dependent tumor. It is known to improve the malignancy of various human tumors by regulating cell growth, survival and penetration. Recently, it has been shown that ⁇ integrin increases tumor growth and metastasis as a mediator independent of adhesion by regulating intracellular signaling (David A Cheresh et al., Nature Medicine 2009, 15 (10): 1163). In addition, it is known that the ⁇ v ⁇ 3 integrin is frequently expressed in new microvessels.
  • Angiogenesis means the formation of new capillaries from existing blood vessels. It is a strictly controlled phenomenon that rarely occurs under normal physiological conditions, or occurs when the embryo is developed in the process of developing a fertilized egg, when the wound is healed in adults, and when the reproductive system changes in the female reproductive cycle. In adults, endothelial cells in capillaries do not divide relatively well, and the rate of division is usually several months to several years. Angiogenesis occurs as a complex process by the interaction of various types of cells with water-soluble factors and extracellular matrix components, and its mechanism of action has not been fully elucidated. The angiogenesis is a cause of various diseases.
  • the object of the present invention is the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10
  • a recombinant vector comprising at least one selected from the group consisting of may be provided.
  • composition for diagnosis of angiogenesis-related diseases comprising the single domain antibody.
  • the present invention is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 It provides an ⁇ v ⁇ 3 integrin target single domain antibody (Single-domain antibody), which is encoded by at least one selected from the group consisting of the displayed nucleotide sequence.
  • Single-domain antibody Single domain antibody
  • the present invention consists of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10 It provides a recombinant vector comprising at least one selected from the group.
  • the present invention provides a recombinant microorganism transformed with the recombinant vector.
  • the present invention provides a composition for detecting angiogenesis, comprising the single domain antibody.
  • the present invention provides a kit for detecting angiogenesis, comprising the single domain antibody.
  • the present invention provides a composition for diagnosis of angiogenesis-related diseases comprising the single domain antibody.
  • the present invention is a base represented by (1) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 Culturing a recombinant microorganism transformed with a recombinant vector comprising at least one selected from the group consisting of sequences; And (2) expressing a single domain antibody against ⁇ v ⁇ 3 integrin in the microorganism; containing, ⁇ v ⁇ 3 integrin targeting single domain antibody.
  • the present invention comprises the steps of: (1) treating a candidate drug to be analyzed in a biological sample or animal model isolated from the specimen; (2) binding the ⁇ v ⁇ 3 integrin target single domain antibody to the sample and measuring the level of ⁇ v ⁇ 3 integrin protein; And (3) selecting a candidate drug whose protein level of (2) is suppressed or enhanced as compared to a control group, and provides a screening method for an angiogenesis inhibitor or promoter.
  • the present invention comprises the steps of: (a) binding the ⁇ v ⁇ 3 integrin target single domain antibody to a biological sample isolated from the specimen and measuring the level of ⁇ v ⁇ 3 integrin protein; And (b) comparing the level of the ⁇ v ⁇ 3 integrin protein with a reference value obtained from a control sample; provides a method for providing information for diagnosis of angiogenesis-related diseases comprising.
  • the ⁇ v ⁇ 3 integrin target single domain antibody of the present invention exhibits high avidity to ⁇ v ⁇ 3 integrin related to neovascularization, excellent tissue permeability, and biostability compared to conventional antibodies.
  • the single domain antibody of the present invention can be easily measured in vitro, in vivo or ex vivo by binding with fluorescent particles, and is effective in detecting angiogenesis and diagnosing related diseases, so it can be usefully used in related industries. .
  • FIG. 1 is a diagram showing the result of performing the first PCR amplification for amplification of the single domain antibody expression cassette of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the result of performing a second PCR amplification for amplification of the single domain antibody expression cassette of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a fragment of a truncated single domain gene.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a fragment of the cut phagemid.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of confirming whether the gene insertion of the single domain antibody clone of the present invention.
  • 6A to 6I are diagrams showing the results of DNA sequencing of 20 single domain antibody clones and alignment results.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of SDS-PAGE of ⁇ v ⁇ 3 integrin protein used to confirm the ⁇ v ⁇ 3 integrin target efficacy of the present invention.
  • 8A to 6C are diagrams showing amino acid sequences of clones showing strong positivity after ELISA is performed.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of SPR (Surface Plasmon Resonance) analysis of VHH-13, VHH-22 and VHH-25 among single domain antibody clones.
  • 10A is a diagram showing a vector map (pALT-Avb3 VHH25) expressing a single domain antibody VHH-25 containing a His6 tag.
  • Figure 10b is a diagram showing a single domain antibody VHH-25 expression vector map (pALT-Avb3 VHH25K1) containing a lysine (Lysin) and His6 tag.
  • Figure 11a is a diagram showing the result of reduced SDS-PAGE of the single domain antibody VHH-13 containing His6 tag.
  • Figure 11b is a diagram showing the result of reduced SDS-PAGE of the single domain antibody VHH-22 containing His6 tag.
  • Figure 11c is a diagram showing the result of reduced SDS-PAGE of the single domain antibody VHH-25 containing His6 tag.
  • Figure 11d is a diagram showing the result of reduced SDS-PAGE of the single domain antibody VHH-25 containing lysine (Lysin) and His6 tag.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of confirming the ⁇ v ⁇ 3 integrin target effect of the single domain antibody VHH-25 of the present invention in cancer cells.
  • FIG. 13 is a diagram showing the result of confirming the ⁇ v ⁇ 3 integrin target effect of the single domain antibody VHH-25 of the present invention in a tumor site.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of confirming the ⁇ v ⁇ 3 integrin target effect of the single domain antibody VHH-25 of the present invention at the arteriosclerosis site.
  • the present invention is a group consisting of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10 It provides a single domain antibody (Single-domain antibody) targeting ⁇ v ⁇ 3 integrin (Integrin), which is encoded with at least one selected from.
  • ⁇ v ⁇ 3 integrin is a receptor molecule that exists on the cell surface and acts when cells adhere to extracellular matrix such as fibronectin and collagen. It is a transmembrane glycoprotein composed of heterodimers of two subunits of ⁇ and ⁇ , and the existence of 21 types of integrins has been revealed so far. Among them, ⁇ v ⁇ 3 integrin has been reported to play a very important role in maintaining the structure of the cardiovascular system and bone tissue.
  • single-domain antibody of the present invention is an antibody in which the CDRs are part of a single domain polypeptide, heavy chain antibodies, antibodies naturally devoid of light chains, single domain antibodies derived from conventional 4-chain antibodies, engineering Antibodies and single domain scaffolds other than those derived from antibodies. To distinguish it from the VH of the 4-chain immunoglobulin, it is called a variable region of a heavy chain antibody (VHH), a nanobody, or sdAb.
  • VHH heavy chain antibody
  • the single domain antibody of the present invention is a naturally occurring single domain antibody derived from a heavy chain without a light chain naturally, as a specific antibody against ⁇ v ⁇ 3 integrin, and has a molecular weight of about 14-15 KDa.
  • the single domain antibody of the present invention is a VHH antibody derived from Camelidae, and may be derived from camels, dromedaries, llamas, alpaca and wild llamas, and targets ⁇ v ⁇ 3 integrin related to neovascularization
  • species other than Camellia can naturally be produced as heavy chain antibodies without light chains, but is not limited thereto.
  • the single domain antibodies of the present invention are about 10 times smaller than the IgG molecules, and they are very stable as single polypeptides and are stable even under extreme pH and temperature conditions. In addition, unlike conventional antibodies, they are resistant to the action of proteases, and when expressed in vitro, mass production is possible with high yield.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • SEQ ID NO: 3 may encode the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • the amino acid sequence including the His6 tag in SEQ ID NO: 1, 2 or 3 may be represented by amino acids of SEQ ID NOs: 14, 15 and 16, respectively.
  • a camel was immunized by injecting a target protein with a recombinant ⁇ v ⁇ 3 integrin having cross reactivity in mice and humans. Thereafter, mRNA was separated and purified from peripheral lymphocytes isolated from camel blood to synthesize cDNA. After amplifying the variable domains (VHH) of the antibody heavy chain-only antibody by PCR. It was cloned into the M13 bacteriophage gene. Phage display using immobiized immunogen (phosphatidylserine) was performed to select phage clones that react specifically to immobilized antigens.
  • VHH variable domains
  • nucleic acid molecules that can be used as genes encoding proteins constituting the single domain antibody of the present invention are functional equivalents of the nucleic acid molecules constituting the same, for example, some nucleotide sequences of the nucleic acid molecules are deleted or substituted. It is a concept including variants that have been modified by) or insertion, but that can function functionally with the nucleic acid molecule.
  • the gene includes a nucleotide sequence having a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% of the nucleotide sequence of the present invention. can do.
  • the "% of sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally aligned sequences with a comparison region, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include additions or deletions (ie, gaps) compared to (not including).
  • the single domain antibody of the present invention may contain a variant of the amino acid sequence described in the attached Sequence Listing within a range that can specifically recognize ⁇ v ⁇ 3 integrin.
  • changes can be made to the amino acid sequence of an antibody to improve its binding affinity and/or other biological properties.
  • modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • the amino acid mutation is made based on the relative similarity of the amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes.
  • arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are biologically functional equivalents.
  • the hydropathic index of the amino acid can be considered.
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine/cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in imparting an interactive biological function of a protein. It is a known fact that similar biological activities can be retained only by substitution with amino acids having a similar hydrophobicity index. When introducing a mutation with reference to the hydrophobicity index, substitutions are made between amino acids having a hydrophobicity index difference of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophilicity values of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • the single domain antibody of the present invention may be additionally bound to a functional molecule or element, and the functional molecule is at least one selected from the group consisting of inorganic particles, chemicals, peptides, polypeptides, nucleic acids, carbohydrates, radioactive isotopes and lipids.
  • the functional molecule is at least one selected from the group consisting of inorganic particles, chemicals, peptides, polypeptides, nucleic acids, carbohydrates, radioactive isotopes and lipids.
  • the inorganic particles are fluorescent markers or dyeing substances, and are GFP (Green Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), BFP (Blue fluorescent protein), CFP (Cyan fluorescent protein), acridine dyes, cyanine Dyes (Cyanine dyes), fluorine dyes (Fluorone dyes), oxazine dyes (Oxazine dyes), phenanthridine dyes (Phenanthridine dyes) and may be selected from the group consisting of rhodamine (Rhodamine dyes), but is not limited thereto.
  • the radioactive isotopes are 18 F (fluorine), 11 C (carbon), 15 O (oxygen), 13 N (nitrogen), 89 Zr (zirconium), C 15 O, 13 N (ammonia), H 2 15 O And one or more selected from the group consisting of 18 FDG (F-Deoxy Glucose), but is not limited thereto.
  • the chemical substance is a substance that inhibits diseases related to neovascularization, and the chemical substance that suppresses diseases related thereto may bind to the single domain antibody of the present invention without limitation.
  • it may be a chemical substance such as an angiogenesis inhibitor, an anticancer agent, or an atherosclerosis inhibitor.
  • angiogenesis inhibitors for example, avastin, itraconazole, carboxyamidotriazole, suramin, SU5416, thrombospondin, sorafenib, sunitinib, Pazopanib, everolimus and mixtures thereof, but are not limited thereto.
  • anticancer agent for example, acibicin, aclarubicin, acodazole, acronycin, adozelesin, alanosine, aldesleukin, allopurinol sodium, altretamine, aminoglutetimide, amona Pide, ampligen, amsacrine, androgens, anguidine, apidicholine glycinate, asarei, asparaginase, 5-azacytidine, azathioprine, Bacillus calmete-guerine (BCG), Bakers Antipol, Beta-2-dioxythioguanosine, Bisantrene HCl, Bleomycin Sulfate, Bulseophan, Butionine Sulfoximine, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 Mesylate, Cerasemide, Carbetimer, carboplatin, carmustine, chlorambucil, chloroquinoxaline
  • a peptide or a polypeptide is not particularly limited, and a hormone, a hormone analogue, an enzyme, an enzyme inhibitor, a signaling protein or a portion thereof, an antibody or a portion thereof, a single chain antibody, a binding protein or a binding domain thereof, an antigen, an adhesion protein , Structural proteins, regulatory proteins, toxin proteins, cytokines, transcriptional regulatory factors, blood coagulation factors and vaccines, but are not limited thereto.
  • the peptide or polypeptide additionally bound to the single domain antibody of the present invention is insulin, IGF-1 (insulin-like growth factor 1), growth hormone, erythropoietin, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, interleukin-1 alpha and beta, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-2, EGFs (epidermal growth factors), calcitonin, ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), atobisban, buserelin, cetrorelix, deslorerin deslorelin), desmopressin, dynorphin A (1-13), elcatonin, eleidosin, eptifibatide, GHRHII (growth hormone releasing) hormone-
  • the sequence of a suitable peptide linker used may be selected in consideration of the following factors: (a) that can be applied to a flexible elongated structure ability; (b) the ability not to create secondary structures that interact with the epitope; And (c) the absence of a hydrophobic moiety capable of reacting with the epitope or a moiety having a charge, preferred peptide linkers include Gly, Asn and Ser moieties. Other neutral amino acids such as Thr and Ala can also be included in the linker sequence.
  • the present invention consists of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10 It provides a recombinant vector comprising at least one selected from the group.
  • vector refers to a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; Phagemid vector; Cozmid vector; And viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors and adeno-associated virus vectors, and the like, preferably a phagemid vector or a plasmid vector.
  • the recombinant vector is shown in FIG. 10A or 10B. It can be expressed as a vector map, and specifically, Figure 10a shows a single domain antibody VHH-25 expression vector map (pALT-Avb3 VHH25) containing His6 tag, Figure 10b contains lysine (Lysin) and His6 tag
  • the single domain antibody VHH-25 represents an expression vector map (pALT-Avb3 VHH25K1), and is not limited thereto if it is to achieve the purpose of expressing the single domain antibody of the present invention.
  • a nucleic acid molecule encoding a single domain antibody in the vector of the present invention is operatively linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional control factor binding sites) and another nucleic acid sequence, thereby The regulatory sequence controls the transcription and/or translation of the other nucleic acid sequence.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional control factor binding sites
  • the vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods for this are disclosed in Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, This document is incorporated herein by reference.
  • the vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression.
  • the vector of the present invention can be constructed using a prokaryotic cell or a eukaryotic cell as a host.
  • a strong promoter capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., a promoter capable of promoting transcription
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., a ribosome binding site for initiation of translation
  • a transcription/translation termination sequence e.g., a ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription/translation termination sequence.
  • E. coli eg HB101, BL21, DH5 ⁇ , etc.
  • the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C. (1984), J. Bacteriol., 158:1018- 1024) and a left-facing promoter of phage ⁇ (pL ⁇ promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D. (1980), Ann. Rev. Genet., 14:399-445) can be used as a regulatory site.
  • the vector that can be used in the present invention is a plasmid often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14 , pGEX series, pET series and pUC19, etc.), phagemid (eg pComb3X), phage (eg, ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon and M13, etc.), or viruses (eg, SV40, etc.).
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, a metallotionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus eg, adeno Virus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and private promoter of HSV
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, a metallotionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus eg, adeno Virus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and private promoter of HSV
  • the vector of the present invention may be fused with other sequences as necessary to facilitate purification of the protein, and the fused sequence is, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA). ), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) may be used, but are not limited thereto.
  • the expression vector of the present invention may contain an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin , Neomycin and tetracycline resistance genes.
  • the present invention provides a recombinant microorganism transformed with the recombinant vector.
  • Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention may be used any host cell known in the art, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Bacillus thuringen.
  • Bacillus strains such as cis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g. Pseudomonas putida), Proteus mirabilis or Staphylococcus (e.g.
  • it includes, but is not limited to, prokaryotic host cells such as Staphylocus carnosus.
  • the host cell is preferably E. coli, more preferably E. coli ER2537, E. coli ER2738, E.
  • E. coli XL-1 Blue E. coli BL21 (DE3), E. coli JM109, E. coli DH Series, E. coli TOP10, E. coli TG1 and E. coli HB101.
  • E. coli XL-1 Blue E. coli BL21 (DE3), E. coli JM109, E. coli DH Series, E. coli TOP10, E. coli TG1 and E. coli HB101.
  • the method of transporting the vector of the present invention into a host cell is the CaCl2 method (Cohen, SN et al. (1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114), one method (Cohen, SN). et al. (1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114; And Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol., 166:557-580) and electroporation method ( Dower, WJ et al. (1988), Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145).
  • the vector injected into the host cell can be expressed in the host cell, in which case a large amount of the single domain antibody of the present invention can be obtained.
  • the present invention provides a composition for detecting angiogenesis, comprising the single domain antibody.
  • the term "detection" is for detecting an antigen-antibody complex and can be performed using various markers.
  • Specific examples of the label include enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, or radioactive isotopes.
  • Enzymes used as detection markers include acetylcholinesterase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, horseradish peroxidase and ⁇ -latamase, and fluorescent substances include fluorescein.
  • Phosphorus, Eu 3+ , Eu 3+ chelate or cryptate, etc. as a ligand, a biotin derivative, etc., as a luminescent material, an acridinium ester and an isoluminol derivative, etc., and as a microparticle, a colloid It includes gold and colored latex, and the like, and radioactive isotopes include 57 Co, 3 H, 125 I and 125 I-Bonton Hunter's reagent.
  • the present invention provides a kit for detecting angiogenesis, comprising the single domain antibody.
  • the kit of the present invention may include not only the single domain antibody of the present invention, but also a solution of a color development substrate to react with the label, a washing solution to be used in each reaction step, and a solution to stop the enzyme reaction, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for diagnosis of angiogenesis-related diseases comprising the single domain antibody.
  • the neovascularization-related diseases include atherosclerosis, cancer, diabetic retinopathy, neovascular glaucoma, posterior lens fibrosis, proliferative vitreous retinopathy, immature retinopathy, ophthalmic inflammation, corneal ulcers, thin cones, macular degeneration, Sjogren syndrome, Myopia and tumors, corneal graft rejection, abnormal wound union, trachoma, bone disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, septic arthritis, hemangiomas, angiofibroma, psoriasis ), pyogenic granuloma, proteinuria, abdominal aortic aneurysm disease, degenerative cartilage loss due to traumatic joint damage, neuromyelination disease, liver cirrhosis, glomerular disease, immature rupture of the embryonic membrane, inflammatory bowel disease, periodontal disease, re At least one selected from the group consisting of stenosis, inflammatory
  • the cancer is bile duct cancer, bladder cancer, brain tumor, breast cancer, cervical cancer, chorionic cancer, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, gastric cancer, multiple myeloma, AIDS-related leukemia and adult T-cell lymphoma/leukemia, endothelial cancer, Liver cancer, lung cancer, lymphoma, neuroblastoma, oral cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, rectal cancer, sarcoma, skin cancer, testicular cancer, thyroid cancer or renal cell cancer, and ⁇ v ⁇ 3 integrin-expressed cancer is not limited thereto.
  • the present invention is a base represented by (1) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 Culturing a recombinant microorganism transformed with a recombinant vector comprising at least one selected from the group consisting of sequences; And (2) expressing a single domain antibody against ⁇ v ⁇ 3 integrin in the microorganism; containing, ⁇ v ⁇ 3 integrin targeting single domain antibody.
  • culture refers to growing microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the microorganism can grow in a normal medium, and the medium contains nutrients required by the culture target, that is, the microorganism becoming a culture medium in order to cultivate a specific microorganism, and may be a mixture by adding a substance for a special purpose. have.
  • the medium is also referred to as a culture medium or a culture medium, and is a concept including both natural medium, synthetic medium, or selective medium.
  • the medium used for cultivation must meet the requirements of a specific strain in an appropriate manner while controlling temperature, pH, etc. in a conventional medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin, and the like.
  • a carbon source that can be used, a mixed sugar of glucose and xylose is used as the main carbon source.
  • sugars and carbohydrates such as sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut Oils and fats such as oil, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid are included.
  • nitrogen sources examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation products, skim soybean cake or its degradation products, etc. I can. These nitrogen sources may be used alone or in combination.
  • the medium may contain first potassium phosphate, second potassium phosphate, and corresponding sodium-containing salt as personnel.
  • Personnel that may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salt.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, and the like may be used as the inorganic compound.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above substances.
  • precursors suitable for the culture medium may be used.
  • the above-described raw materials may be added in a batch, fed-batch, or continuous manner to the culture during the culture process, but are not particularly limited thereto.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • the present invention comprises the steps of: (1) treating a candidate drug to be analyzed in a biological sample or animal model isolated from the specimen; (2) binding the ⁇ v ⁇ 3 integrin target single domain antibody to the sample and measuring the level of ⁇ v ⁇ 3 integrin protein; And (3) comparing the level of the protein of (2) with a control group to select a candidate drug that induces inhibition or enhancement. It provides an angiogenesis inhibitor or promoter screening method.
  • the present invention comprises the steps of: (a) binding the ⁇ v ⁇ 3 integrin target single domain antibody to a biological sample isolated from the specimen and measuring the level of ⁇ v ⁇ 3 integrin protein; And (b) comparing the level of the ⁇ v ⁇ 3 integrin protein with a reference value obtained from a control sample; provides a method for providing information for diagnosis of angiogenesis-related diseases comprising.
  • the single domain antibody of the present invention can be provided as a pharmaceutical composition for preventing and treating diseases related to angiogenesis when combined with a functional molecule,
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain an adjuvant.
  • an adjuvant Any of the adjuvants known in the art may be used without limitation, but, for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may be further included to increase its effect.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be prepared in a form in which an active ingredient is incorporated in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients, and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention are not limited thereto, but lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, Calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils.
  • compositions of the present invention can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to a conventional method. .
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, in the active ingredient. It can be prepared by mixing and the like. Further, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, and other excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used diluents.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspension propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like may be used.
  • As a base for suppositories witepsol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • composition according to the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, and physical condition of the individual. It is obvious that the concentration of the single domain antibody contained in the pharmaceutical composition can be selected in various ways depending on the subject, and is preferably included in the pharmaceutical composition at a concentration of 0.01 to 5,000 ⁇ g/ml. When the concentration is less than 0.01 ⁇ g/ml, pharmaceutical activity may not appear, and when the concentration exceeds 5,000 ⁇ g/ml, toxicity to humans may occur.
  • ⁇ v ⁇ 3 integrin ITGAVB3 2 mg/ml human ⁇ v ⁇ 3 integrin ITGAVB3 was used as an antigen, mixed in advance in 1 mg/ml PBS, and divided into 800 ul per EP tube at 4°C. Initially, as an adjuvant, Complete Freund's Adjuvant (CFA) (Sigma) was used, and then Incomplete Freund's Adjuvant (IFA) (Sigma) was used, and the antigen and adjuvant were completely mixed. Thus, a stable emulsion was prepared. It was administered subcutaneously around the back of camels ( Camelus bacterianus ).
  • CFA Complete Freund's Adjuvant
  • IFA Incomplete Freund's Adjuvant
  • ELISA was performed as follows to confirm the titer of the serum of the immunity-induced camel of Example 1-1.
  • the serum titer was measured the day after the fourth booster immunization was performed, and 100uL of target protein (coating buffer containing 10uL antigen) was coated and incubated overnight at 4°C. After washing twice with washing buffer (PBST, PBS containing 0.05% Tween-20), block the wells with 350 ⁇ L blocking buffer (PBSM, PBS containing 4% milk) and at room temperature for 2 hours. Put it. Thereafter, the blocking buffer was shaken off, and the plate was placed on a clean side of a paper towel while washing for 5 times using the washing buffer. 100 ⁇ L diluted serum was added, incubated at room temperature for 1 hour, and washed 5 times with a washing buffer.
  • PBST washing buffer
  • PBS containing 0.05% Tween-20 block the wells with 350 ⁇ L blocking buffer (PBSM, PBS containing 4% milk) and at room temperature for 2 hours. Put it. Thereafter, the blocking buffer was shaken off, and the plate was placed on a clean side of a
  • HRP horseradish peroxidase
  • Example 1-1 As shown in Table 1, it was confirmed that the serum of the immune-induced camel of Example 1-1 showed a titer of 1/12800. Therefore, the last booster immunization was performed the day after the serum titer was measured, and peripheral blood leukocytes (PBLs) were obtained on the next day, which were used for RNA extraction and cDNA analysis.
  • PBLs peripheral blood leukocytes
  • RNA isolation and cDNA synthesis of isolated peripheral blood leukocytes PBLs
  • RNA isolation and cDNA synthesis of isolated peripheral blood leukocytes were performed as follows.
  • peripheral blood leukocytes were isolated from the blood of camels inducing immunity of Example 1-1 by density gradient centrifugation using a Ficoll Hypaque technique.
  • Total RNA was isolated using the Trizol method according to the manufacturer's protocol. The separated RNA pellet was dried and dissolved in 100 ul DEPC-treated water, and then used for RT-PCR.
  • RNAsin Promega
  • Super RT HT Biotechnology Ltd, Cambridge, UK
  • the cDNA synthesized in 2-1 was quantified by UV spectroscopy.
  • the FC downstream primer, the VH/VHH-FR1 upstream primer, and the cDNA synthesized in 2-1 diluted 200 times were used as a template.
  • the first PCR amplification of the VH-CH1-FC/VHH-FC gene was performed.
  • the first PCR amplified DNA band of about 600 bp was collected, and a gel purification process of purification using Qiagen Kit was performed. Thereafter, in order to amplify the VHH gene, secondary PCR amplification was performed using the VHH-FR4 downstream primer, the VHH-FR1 upstream primer, and the purified DNA.
  • FIGS. 1 and 2 The results are shown in FIGS. 1 and 2.
  • the selection and search of an antibody that recognizes ⁇ v ⁇ 3 integrin from the single domain antibody gene library prepared in Example 2 was performed using a phage display method, and a single domain antibody clone library was prepared.
  • the single domain antibody gene and phagemid of the present invention were cut, and the cut gene was inserted into the phagemid, and then transformed into E.coli TG1 was performed as follows.
  • the second PCR product and pDisplay-3M TM obtained in 2-2 were digested with BssHII and NheI, and purified simultaneously with Qiagen kit. Thereafter, the DNA fragment was ligated using NEB's T4 DNA ligase, and the product was transformed by electro-transformation into E.coli TG1 cells. The results are shown in FIGS. 3 and 4.
  • M13K07 helper phage In order to prepare M13K07 helper phage, log-phase TG1 cells and M13K07 phage were infected with different dilutions for 30 minutes at 37°C, and inoculated on agar of 2TY plates. After inoculating and culturing small plaques in the 3 mL liquid 2TY medium, 30 ⁇ L of overnight cultured TG1 cells were added and cultured at 37 degrees for 2 hours. After diluting the culture solution of 1L 2TY medium and incubating for 1 hour, 50 ⁇ g/mL kanamycin was added and cultured under conditions of 16 hours and 37°C.
  • phage particles were removed by centrifugation (10 minutes, 5000 g), and 0.25 volume of phage precipitate was added to precipitate phage from the supernatant. After incubation on ice for 30 minutes, centrifugation (10 minutes, 5000 g) was performed to obtain phage particles. After resuspending the pellet with 5 mL PBS, it was passed through a 0.22- ⁇ m filter. The top-agar layer containing 100 ⁇ L TG1 (saturated culture) was identified by counting the number of plaque-forming units (pfu) on a 2TY plate to identify helper phage. The phage stock solution was diluted to 1 ⁇ 10 13 pfu/mL, and then stored at -20 degrees.
  • the library glycerol stock and 500 mL 2TY-G were incubated and incubated at 37 degrees with shaking at 250 rpm until the optical concentration reached 0.8-0.9 at 600 nm.
  • M13KO7 helper phage was added so that the final concentration was 5 ⁇ 10 9 pfu/mL, and incubated at 37°C for 30 minutes without shaking, followed by appropriate shaking (200 rpm) to perform phage infection for 30 minutes. Thereafter, the cells were recovered by centrifugation at 2200 g for 15 minutes, and the pellet was resuspended in the same amount of 2TY-AK. Rapid shaking (300 rpm) was performed and incubated overnight at 30 degrees.
  • ⁇ v ⁇ 3 integrin ITGAVB3 antigen to be used for selection of specific antibodies by panning was verified using SDS-PAGE.
  • an eluate of a single clone was inoculated in 5 mL 2YT-AG medium and cultured overnight at 37°C.
  • a glycerol stock for each clone was prepared and cultured overnight, and 100 ⁇ L culture was put in 20 mL of 2YT-AG medium and cultured. It was incubated for several hours at 37 degrees until the optical density of OD600 reached 0.4-0.5.
  • M13KO7 helper phage was added at 20 multiple infections (ie, number of phage particles/host cells). Incubated at 37°C for 30 minutes, and the cells were infected while shaking for 30 minutes.
  • the infected cells were collected by centrifugation (10 minutes at 5000 g), resuspended in 2YT-AK, and incubated at 30 degrees for 16 hours. Thereafter, phage particles were precipitated in the supernatant, and the phage pellet was resuspended in 1 mL PBS and centrifuged (5000 g for 10 minutes) to remove cell debris. Ab fragments irrelevant to phage particles were removed, phage pellets were removed in 250 ⁇ L PBS, and centrifugation was performed again.
  • the HRP substrate solution was prepared as follows: A stock solution of OPD was prepared by dissolving 22 mg OPD (Sigma) in 100 mL of 50 mg sodium citrate (pH 4.0), and 36 uL 30% H 2 in 21 mL of OPL stock solution just before the detection step. O 2 was added. 100 uL of substrate solution per well was added and incubated for 30 minutes at room temperature. Plates were analyzed using a micro plate reader set at 490 nm. Table 4 shows the results of analyzing each clone.
  • each positive clone (measured by phage ELISA and/or soluble ELISA) in 5 mL LB-A medium (LB medium added with 100 ⁇ g/mL ampicillin) 2 ⁇ L glycerol stock TG1 E.coli cells were inoculated and cultured at 37°C overnight. Plasmids for each positive clone were isolated from the cells using a Plasmid Isolation Kit (Qiagen Miniprep kit), and DNA sequencing was performed using L1 and S6 primers.
  • the returned sequence was transformed using Vector NTI®, Version 10, and the protein sequence was aligned. Thereafter, clones encoding the same protein sequence were grouped and analyzed. The results are shown in Table 5 and FIGS. 8A to 8C, and the single domain antibody clone of the present invention is described as VHH for convenience.
  • clones 14, 11, 29, 17, 15, 28, 12, 19, 13, 21, 27, 16, 18, 20, showing high responses in each of the 10 groups, 30, 23, 24, 25, 22, 26 were selected and their amino acid sequences were shown.
  • the base sequence of clones VHH-25, VHH-13, VHH-22, VHH-11, VHH-17, VHH-15, VHH-12, VHH-16, VHH-20, VHH-23 showing strong positives are represented by SEQ ID NOs: 1 to 10, respectively.
  • the amino acid sequences of VHH-25, VHH-13, and VHH-22 are shown in SEQ ID NOs: 11, 12 or 13, respectively.
  • VHH-12, VHH-13, VHH-16, VHH-22, and VHH-25 showed relatively high binding power.
  • VHH-13, VHH-22 and VHH-25 were selected, and compared with the conventional ⁇ v ⁇ 3 integrin antibody, SPR analysis was performed.
  • CMDH chip Carboxymethyl Dextran Hydrogel Surface Sensor Chip, Reichert Technologies
  • SPR equipment Reichert SR7500DC system
  • Example 6 it was finally confirmed that VHH-13, VHH-22 and VHH-25 were the best among the single domain antibody clones of the present invention.
  • a vector was prepared and introduced into E. coli to obtain a single domain antibody VHH -25 was expressed.
  • a vector containing His6 tag was constructed for expression of VHH-13, VHH-22 or VHH-25, which are the selected single domain antibody clones of the present invention, and a vector map for VHH-25 (pALT-Avb3 VHH25 ) Is shown in FIG. 10A.
  • a vector including Lysin and His6 tag was prepared, and a vector map (pALT-Avb3 VHH25K1) for this is shown in FIG. 10B.
  • the amino acid sequences containing His6 tag in each clone of VHH-25, VHH-13 or VHH-22 are shown in SEQ ID NOs: 14, 15 and 16, respectively.
  • VHH-13, VHH-22 or VHH-25 expression results including the His6 tag were confirmed by performing a reduced SDS-PAGE, and are shown in FIGS. 11A to 11C, and VHH including the Lysin and His6 tag The -25 expression results are shown in Fig. 11D.
  • VHH-13 is about 15.9 kDa (Fig. 11a)
  • VHH-22 is about 14.1 kDa (Fig. 11b).
  • VHH-25 was about 14.5 kDa (Fig. 11c)
  • VHH-25 containing lysine was about 14.2 kDa (Fig. 11d).
  • VHH-25-K1 containing lysine and 0.25 mg of Cy5.5 were dissolved in 2 ml of borate buffer (pH 8.4) and reacted for 30 minutes at room temperature. I did. After the reaction was completed, the antibody VHH-25-K into which Cy5.5 was introduced was purified using a PD-10 column (GE healthcare). The results are shown in FIG. 12.
  • an animal model was produced by xenografting U87-MG cells into Athymic nude mice (female, 6-8 weeks old). When the tumor grew to a size of 0.8-1 cm, Cy5.5 was bound to VHH-25-K and injected into the tail vein (1 mg/kg), and the contrast effect was analyzed using IVIS (PerkinElmer) over time. The results are shown in FIG. 13.
  • an animal model in which intravascular plaques are formed is produced by performing a high fat diet for 36 weeks in ApoE-/- mice (Female, 10 weeks old). Thereafter, Cy5.5 was conjugated to VHH-25-K prepared in the same manner as in Example 9, injected into the tail vein (1 mg/kg), and 4 hours later, the mice were sacrificed and the aorta was separated. The contrast effect of the separated aorta was analyzed using IVIS. The results are shown in FIG. 14.

Abstract

본 발명은 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다. 본 발명의 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체는 종래 항체와 비교하여 신생 혈관과 관련된 αvβ3 인테그린에 높은 결합력, 우수한 조직 침투성 및 생체 안정성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 단일 도메인 항체는 형광 입자와 결합하여 in vitro, in vivo 또는 ex vivo 상에서 간단하게 측정 가능하여, 신생 혈관 검출 및 이와 관련된 질환 진단에 효과적이므로, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

αVβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체
본 발명은 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다.
인테그린(Integrin)은 세포 부착 및 이동, 분화, 증식 등과 같은 세포의 중요한 생리작용을 조절하는 세포 표면수용체이다. 인테그린은 α와 β 서브 유닛이 비 공유 결합으로 이루어진 헤테로다이머로 작용하며, α와 β 서브 유닛이 쌍을 이루어 22가지의 인테그린 패밀리를 구성하고 있다. 인테그린은 주로 비브로넥틴, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, vWF, 피브리노겐 등의 세포외 메트릭스 단백질에 결합하나, 인테그린의 종류별로 리간드 특이성에 차이가 있으며, 한 종류의 인테그린이 여러 가지 리간드에 동시에 결합할 수 있다. 이 중, 인테그린 αvβ3는 피부암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 폐암, 담낭암, 췌장암, 위암을 포함하는 다양한 암들 중 대부분의 공격적인 종양 세포들에서 발현되며, 부착에 의존적인 종양 세포의 성장, 생존과 침투를 조절하여, 다양한 인간 종양들의 악성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 최근에는 β 인테그린이 세포 내 신호 전달을 조절하여 부착에 독립적인 매개체로서 종양의 성장 및 전이를 증가시킨다는 것이 밝혀지기도 하였다 (David A Cheresh et al., Nature Medicine 2009, 15 (10): 1163). 또한, 상기 αvβ3 인테그린은 신생 미세혈관에서 많이 발현됨이 알려져 있다.
혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 혈관으로부터 새로운 모세혈관이 만들어지는 것을 뜻한다. 정상적인 생리조건에서는 거의 일어나지 않는 엄격히 조절되는 현상이나 수정란 발생과정에서 배아가 발달될 때와 성인의 경우 상처가 치유될 때 그리고 여성의 생식주기에서 생식기계통의 변화 등에서 일어난다. 성인의 경우 모세혈관의 내피세포는 상대적으로 잘 분열하지 않으며 분열속도는 보통 수개월 내지 수년이다. 혈관신생은 여러 종류의 세포와 수용성 인자 및 세포외 기질(extracellular matrix) 성분과의 상호작용에 의한 복잡한 과정으로 일어나며 아직 그 작용기작은 완전히 규명되어 있지 않다. 상기 혈관신생은 여러 질병의 원인이 되고 있다.
현재 상업적으로 이용 중인 항체들은 300,000개 이상이라고 보고되어 있지만 주로 고정화된 세포 내에서만 관찰이 가능하며 이러한 점들 때문에 실시간으로 세포 내에서 단백질의 접힘이나 단백질들 간의 상호작용 등을 관찰할 수 없었다. 또한 기존의 항체들은 너무 크거나 화학적으로 불안정하여 살아있는 세포 내에서 유용하게 사용될 수 없었다. 그러나 1993년에 Hamers-Casterman에 의해 낙타과 동물에서 유래한 항체는 기존의 항체(두개의 중쇄(heavy chain)와 두 개의 경쇄(light chain))와는 다른 구조인 중쇄로만 항체가 구성되어 있지만 기능적으로 완전한 항체역할을 하는 단일 도메인 항체가 보고(Hamers-Casterman, C. et al. 1993. Nature 363:446-448)되었다. 기존의 항체들은 150kDa, 재조합 항체들은 25~50kDa이나 낙타, 라마, 상어에서 유래한 단일 도메인 항체는 12~13kDa으로 가장 작은 크기의 항체여서 세포 내로 쉽게 이동이 가능하며(Cortez-Retamozo, V. et al. 2004. Cancer Res. 64:2853-2857,) 유전적 조작이 용이하여 세균과 효모에서 쉽게 발현이 되는 장점이 있다(Arbabi-Ghahroudii, M. et al. 1997. FEBS Lett. 414:521-526). 또한, 단일 도메인 항체는 높은 수용성이며 극도의 pH조건, 90℃까지의 온도 조건에서도 안정적인 특징이 있다(Dumoulin, M. et al. 2002. Protein Sciii.11:500-515, Dumoulin, M. et al. 2003. Nature 424:783-788).
본 발명의 목적은 αvβ3 인테그린(Integrin) 표적 단일 도메인 항체(Single-domain antibody)을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 제조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 신생혈관 형성 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 신생혈관 형성 검출용 키트를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 신생혈관 형성 관련 질환의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공할 수 있다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 코딩되는, αvβ3 인테그린(Integrin) 표적 단일 도메인 항체(Single-domain antibody)를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (2) 상기 미생물에서 αvβ3 인테그린에 대한 단일 도메인 항체를 발현시키는 단계;를 포함하는,αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 검체로부터 분리된 생물학적 시료 또는 동물 모델에 분석하고자 하는 후보 약물을 처리하는 단계; (2) 상기 시료에 상기 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 αvβ3 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 (2)의 단백질의 수준이 대조군과 비교하여 억제 또는 증진된 후보 약물을 선발하는 단계를 포함하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 생물학적 시료에 상기 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 αvβ3 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 αvβ3 인테그린 단백질의 수준을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체는 종래 항체와 비교하여 신생 혈관과 관련된 αvβ3인테그린에 높은 결합력, 우수한 조직 침투성 및 생체 안정성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 단일 도메인 항체는 형광 입자와 결합하여 in vitro, in vivo 또는 ex vivo 상에서 간단하게 측정 가능하여, 신생 혈관 검출 및 이와 관련된 질환 진단에 효과적이므로, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 단일 도메인 항체 발현 카세트의 증폭을 위하여, 1차 PCR 증폭을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 단일 도메인 항체 발현 카세트의 증폭을 위하여, 2차 PCR 증폭을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 절단된 단일 도메인 유전자의 단편을 확인한 도이다.
도 4는 절단된 파지미드의 단편을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 단일 도메인 항체 클론의 유전자 삽입 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a 내지 6i는 단일 도메인 항체 클론 20개의 DNA 시퀀싱을 수행한 결과 및 이를 정렬한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 αvβ3 인테그린 표적 효능 확인을 위해 사용된 αvβ3 인테그린 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 8a 내지 6c는 ELISA 수행 후 강한 양성을 보이는 클론의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 9는 단일 도메인 항체 클론 중 VHH-13, VHH-22 및 VHH-25의 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 10a는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25을 발현 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25)을 나타낸 도이다.
도 10b는 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25을 발현 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25K1)을 나타낸 도이다.
도 11a는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-13의 reduced SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-22의 reduced SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 11c는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25의 reduced SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 11d는 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25의 reduced SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 암세포에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 αvβ3 인테그린 표적 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 종양 부위에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 αvβ3 인테그린 표적 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 동맥경화 부위에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 αvβ3 인테그린 표적 효과 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 코딩되는, αvβ3 인테그린(Integrin) 표적 단일 도메인 항체(Single-domain antibody)를 제공한다.
본 발명의 용어 "αvβ3 인테그린(Integrin)"은, 인테그린은 세포 표면에 존재하여 피브로넥틴, 콜라겐 등의 세포외 기질에 세포가 접착할 때 작용하는 수용체 분자이다. α, β 두 소단위의 헤테로 2합체로 구성되는 막관통형 당단백질이며 지금까지 21개 유형의 인테그린의 존재가 밝혀져 있다. 그 중, αvβ3 인테그린은 심혈관계나 골조직의 구조유지에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다.
본 발명의 용어 "단일 도메인 항체(Single-domain antibody)"는 CDR이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체이며, 중쇄 항체, 경쇄가 자연적으로 없는 항체, 종래의 4-쇄 항체에서 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체에서 유래된 것 외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함한다. 4-쇄 면역글로불린의 VH와 구별하기 위하여 VHH(variable region of a heavy chain antibody), 나노바디(nanobody) 또는 sdAb로 불린다.
본 발명의 단일 도메인 항체는 경쇄가 자연적으로 없는 중쇄에서 유래되는 자연 발생 단일 도메인 항체로서, αvβ3 인테그린에 대한 특이 항체로서, 약 14-15KDa의 분자량을 갖는다. 본 발명의 단일 도메인 항체는 카멜리대(Camelidae)에서 유래된 VHH인 항체이고, 낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카 및 야생라마에서 유래될 수 있으며, 신생혈관과 관련된 αvβ3 인테그린 표적하기 위한 목적을 달성하기 위해서는 카멜리대 외의 다른 종이 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체로 생산 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 단일 도메인 항체는 IgG 분자보다 약 10배 더 작으며, 이들은 단일 폴리펩티드로서 매우 안정하여 극한 pH와 온도 조건에서도 안정적이다. 또한, 이들은 종래의 항체와는 달리 프로테아제의 작용에 대해 내성을 갖으며, 생체외 발현 시, 높은 수율로 대량 생산이 가능하다.
상기 단일 도메인 항체는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하며, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 또한, 서열번호 1, 2 또는 3에 His6 tag가 포함된 아미노산 서열은 각 서열번호 14, 15 및 16의 아미노산으로 표시될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 낙타에 마우스와 사람에서 cross reactivity를 갖는 재조합 αvβ3 인테그린을 표적 단백질을 주사하여 면역화 시켰다. 이후, 낙타의 혈액에서 분리한 말초임파구(pheripheral lymphocyte)에서 mRNA를 분리 정제하여 cDNA를 합성하였다. 항체 heavy chain-only 항체의 variable domain (VHH)들을 PCR로 증폭시킨 후. M13 bacteriophage gene에 클로닝하였다. immobiized immunogen (phosphatidylserine)을 이용한 파지 디스플레이(phage display)를 시행하여 고정된(immobilized) 항원에 특이적으로 반응하는 파지 클론을 선발하였다.
상기 파지 클론 중에서 40개의 클론 시퀀스를 분석한 결과 10개의 후보군의DNA 시퀀스를 확인하였다. 이 중, 20개의 DNA 시퀀스는 도 6a 내지 6i에 나타내었다. 이 중, 10개의 군에서 높은 반응을 보이는 클론 14, 11, 29, 17, 15, 28, 12, 19, 13, 21, 27, 16, 18, 20, 30, 23, 24, 25, 22, 26을 선발하였고, 이의 아미노산 서열은 도 8a 내지 8c에 나타내었다. 강한 양성을 보이는 클론 VHH-25, VHH-13, VHH-22, VHH-11, VHH-17, VHH-15, VHH-12, VHH-16, VHH-20, VHH-23의 염기서열을 각각 서열번호 1 내지 10으로 나타내었다. 그 중, VHH-25, VHH-13, VHH-22의 아미노산 서열을 각 서열번호 11, 12 또는 13으로 나타내었다.
상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 단일 도메인 항체를 구성하는 단백질을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 본 발명의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 단일 도메인 항체는, αvβ3 인테그린을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
상기 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 단일 도메인 항체는 기능성 분자 또는 원소가 추가적으로 결합될 수 있고, 상기 기능성 분자는 무기입자, 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 방사선 동위 원소 및 지질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상 일 수 있다.
상기 무기 입자는 형광 마커 또는 염색 물질이고, GFP(Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), BFP(Blue fluorescent protein), CFP(Cyan fluorescent protein), 아크리딘 염료(Acridine dyes), 사이아닌 염료(Cyanine dyes), 불소 염료(Fluorone dyes), 옥사진 염료(Oxazine dyes), 페난트리딘 염료(Phenanthridine dyes) 및 로다민(Rhodamine dyes)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방사선 동위 원소는 18F(불소), 11C(탄소), 15O(산소), 13N(질소), 89Zr(지르코륨), C15O, 13N(암모니아), H2 15O 및 18FDG(F-Deoxy Glucose)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화학물질은 신생 혈관과 관련된 질환을 억제하는 물질로서, 이와 관련된 질환을 억제하는 화학 물질은 제한없이 본 발명의 단일 도메인 항체와 결합할 수 있다. 예컨대, 신생혈관억제제, 항암제, 죽상동맥경화 억제제 등과 같은 화학물질일 수 있다.
상기 신생혈관억제제로서 예를 들어, 아바스틴, 이트라코나졸, 카복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole), 수라민(suramin), SU5416, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib), 파조파닙(pazopanib), 에버롤리무스(everolimus) 및 이들의 혼합물이나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항암제로서, 예를 들어, 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5'-플루오로우라실, Fluosol, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁솔 및 이들의 혼합물이나, 이에 한정되지 않는다.
기능성 분자로서 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 특별하게 제한되지 않으며, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는, 본 발명의 단일 도메인 항체에 추가적으로 결합되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A(dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRHII(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin), 지코노타이드, 리신, 리신 A 사슬, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 아브린(abrin), 아브린 A 사슬, 코브라 베놈 인자, 겔로닌(gelonin), 사포린(saporin), 모데신(modeccin), 볼켄신(volkensin), 비스쿠민(viscumin), 클로스트리듐 페르프링겐스 포스포리파제 C 및 보바인 췌장 리보뉴클레아제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 단일 도메인 항체에 결합되는 기능성 분자가 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 경우에 이용되는 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연하게 연장된 구조에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재, 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 파지미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함되며, 바람직하게는 파아지미드 벡터 또는 플라스미드 벡터이다.
상기 재조합 벡터는 도 10a 또는 도 10b의 벡터맵으로 표시할 수 있고, 구체적으로, 도 10a는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25을 발현 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25)을 나타내고, 도 10b는 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25을 발현 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25K1)을 나타내며, 본 발명의 단일 도메인 항체 발현 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 단일 도메인 항체를 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C.(1984), J. Bacteriol., 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.(1980), Ann. Rev. Genet., 14:399-445)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파아지미드(예: pComb3X), 파아지 (예: λgt4·B, λ-Charon 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 사 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며, 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 E. coli이고 보다 바람직하게는 E.coli ER2537, E. coli ER2738, E. coli XL-1 Blue, E. coli BL21(DE3), E. coli JM109, E. coli DH 시리즈, E. coli TOP10, E. coli TG1 및 E. coli HB101이다. 본 발명에서는 E. coli 을 이용하여 단일 도메인 항체를 과발현 시켜 적은 비용으로 대량 생산이 가능하다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114; 및 Hanahan, D.(1983), J. Mol. Biol., 166:557-580) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al.(1988), Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145) 등에 의해 실시될 수 있다.
숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 단일 도메인 항체를 수득할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "검출"은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용하여 실시할 수 있다. 표지체의 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 또는 방사성 동위원소를 포함한다. 검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 및 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
또한 본 발명은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 본 발명의 단일 도메인 항체뿐만 아니라, 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액, 각 반응단계에 사용할 세척액, 효소반응 정지용액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
상기 신생 혈관 형성 관련 질환은 동맥경화증, 암, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 각막 궤양, 원추 박막, 황반 변성, 쇼그렌 증후군, 근시안과 종양, 각막이식 거부반응, 이상 창상 유합, 트라코마(trachoma), 골질환, 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염, 패혈증성 관절염, 혈관종(hemangiomas), 섬유성 혈관종(angiofibroma), 건선(psoriasis), 화농성 육아종(pyogenic granuloma), 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손성에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열증, 염증성 장질환, 치근막질환, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부 노화, 갑상선 과증식 및 그레이브스병(Grave's disease)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 동맥경화증 또는 암이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 암은 담관암, 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 융모암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 다발성 골수종, AIDS-관련 백혈병 및 성인 T-세포 림프종/백혈병, 상피내암, 간암, 폐암, 림프종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 피부암, 고환암, 갑상선암 또는 신세포암이고, αvβ3 인테그린이 발현된 암이라면 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 (1) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (2) 상기 미생물에서 αvβ3 인테그린에 대한 단일 도메인 항체를 발현시키는 단계;를 포함하는, αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
상기 미생물은 통상의 배지에서 생육 가능하며, 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한 본 발명은 (1) 검체로부터 분리된 생물학적 시료 또는 동물 모델에 분석하고자 하는 후보 약물을 처리하는 단계; (2) 상기 시료에 상기 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 αvβ3 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 (2)의 단백질의 수준을 대조군과 비교하여 억제 또는 증진을 유도한 후보 약물을 선발하는 단계를 포함하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 생물학적 시료에 상기 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 αvβ3 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 αvβ3 인테그린 단백질의 수준을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 단일 도메인 항체는 기능성 분자와 결합 시, 신생혈관 형성 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 제공할 수 있으며,
본 발명의 약학 조성물에는 단일 도메인 항체 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 단일 도메인 항체 의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 낙타에서 면역 반응 유도 및 혈청 정량
<1-1> 낙타에서 면역 반응 유도
인간 또는 마우스에서 교차 활성을 갖는 재조합 αvβ3 인테그린(intergrin) 단백질을 이용하여 이를 낙타에 접종한 후 면역 반응을 유도하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 2mg/ml 인간 αvβ3 인테그린 ITGAVB3을 항원으로 하여, 1mg/ml PBS에 미리 혼합하고, 4℃에서 EP 튜브 당 800ul에 나누어 넣었다. 어주번트로서 처음에는 완전 프로이드 어주번트(Complete Freund's Adjuvant, CFA) (Sigma)를 사용하고, 이후 불완전 프로이드 어주번트(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)(Sigma)를 이용하였으며, 상기 항원 및 어주번트를 완전히 혼합하여 안정적인 에멀젼(emulsion)을 제조하였다. 낙타(Camelus bacterianus)의 등 주변에 피하 투여하였다. 그 후, 1차 면역은 채취한 혈액 2 ml(1 ml의 면역 전 혈청에서 채취)를 완전 프로이드 어주번트(CFA)와 600㎍ 항원 혼합/낙타로 혼합하여 면역을 유도하였다. 부스트(Boost) 면역은 불완전 프로이드 어주번트(IFA)로 600㎍ 항원 혼합/낙타로 면역을 유도하였으며, 2주 간격으로 총 4번에 걸쳐 수행하였고, 4번째 부스터 면역 수행 15일후에 50ml의 혈액을 채취하였다.
<1-2> 면역유도된 낙타의 혈청 역가(titer)
상기 실시예 1-1의 면역 유도된 낙타의 혈청의 역가를 확인하기 위하여 ELISA를 하기와 같이 수행하였다.
4번째 부스터 면역을 수행한 다음날 혈청 역가를 측정하였으며, 100uL의 표적 단백질(10uL 항원을 포함하는 코팅 버퍼)을 코팅하고 4도에서 밤새 배양하였다. 세척 버퍼(PBST, 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS)로 2회 동안 세척한 후, 350 μL 블로킹 버퍼(PBSM, 4% 우유를 포함하는 PBS)를 이용하여 웰을 블로킹하고 2시간 동안 실온에 두었다. 그 후, 블로킹 버퍼를 털어 내고 세척 버퍼를 이용하여 5회 동안 세척하면서, 페이퍼 타올의 깨끗한 면에 플레이트를 두었다. 100 μL 희석한 혈청을 추가하여 1시간 동안 실온으로 배양하고 세척 버퍼로 5회 세척하였다. 토끼 항-낙타 IgG pAb-HRP를 PBS와 함께 희석하고, 웰 당 100 μL 희석된 항체를 첨가한 후, 1시간 동안 실온에 배양하였다. HRP(horseradish peroxidase) 기질 용액을 다음과 같이 준비하였다: OPD(o-phenylenediamine)의 스톡(stock) 용액은 100 mL의 50 mM 구연산 나트륨, pH 4.0를 포함하여 22 mg OPD (Sigma)를 용해하여 준비하였다. 필터를 소독하고 4도에서 보관한 후, 검출 단계 전에 21 mL OPD 스톡 용액에 36 uL 30% H2O2을 첨가하였다. 100 uL 기질 용액을 웰 당 추가하고 30분 동안 실온에서 배양하였다. 490nm로 설정된 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 각 플레이트를 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-1의 면역 유도된 낙타의 혈청은 1/12800의 역가가 나타남을 확인하였다. 따라서, 혈청 역가를 측정한 다음날 마지막 부스터 면역을 수행하고 그 다음날의 말초 혈액 백혈구(PBLs, peripheral blood leukocytes)를 수득하고, 이를 RNA 추출 및 cDNA 분석에 이용하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2019009144-appb-I000001
<실시예 2> 단일 도메인 항체의 유전자 증폭 및 유전자 라이브러리 생성
<2-1> 분리된 말초 혈액 백혈구(PBLs)의 RNA 분리 및 cDNA 합성
본 발명의 단일 도메인 항체의 유전자 증폭을 위하여, 분리된 말초 혈액 백혈구(PBLs)의 RNA 분리 및 cDNA 합성을 하기와 같이 수행하였다.
구체적으로, 피콜-하이팩(Ficoll Hypaque)기법을 이용하여 밀도 구배 원심 분리로 상기 실시예 1-1의 면역을 유도한 낙타의 혈액에서 말초 혈액 백혈구(PBLs)을 분리하였다. 총 RNA는 Trizol 방법으로 제조사의 프로토콜에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 펠렛을 건조시키고 100ul DEPC-처리된 물에 용해시킨 후, RT-PCR에 이용하였다.
2ul dNTP mix (Pharmacia, 25 mM 각 dNTP), 2ul Oligo-dT 프라이머(200 pMol), 5ul Super RT 버퍼 및 26.5ul DEPC-처리된 물을 포함하는 RNase-free 0.5 ml 반응 혼합액을 준비하였다. 이 후, 상기 튜브에 분리한 10ul RNA(1.5ug까지의 mRNA 포함)를 첨가하여 혼합하여 피펫팅하였다. 상기 혼합액에 미네랄 오일(Sigma)을 한방울 떨어뜨리고 2차 구조를 파괴하기 위하여 thermocycler (Biometra, Trio Thermoblock)에 67도로 5분간 가열하였다. 그 후, 42도로 식힌 후, 2ul RNAsin(Promega) 및 2.5ul Super RT(HT Biotechnology Ltd, Cambridge, UK)을 추가하여 1시간도 42도로 배양한 후, 100도에서 3분간 열을 가하였다(멸군 바늘로 구멍을 뚫음). 그 후, 단일-가닥 cDNA를 포함하는 생성물을 원심분리한 후, -20도에 보관하였다.
<2-2> 본 발명의 단일 도메인 항체 발현 카세트의 증폭
상기 2-1에서 합성한 cDNA를 UV 분광법으로 정량하였다. VH-CH1-FC/VHH-FC 유전자의 증폭을 위하여, FC 다운스트림(downstream) 프라이머, VH/VHH-FR1 업스트림(upstream) 프라이머 및 200배 희석된 상기 2-1에서 합성한 cDNA를 주형으로 사용하여, VH-CH1-FC/VHH-FC 유전자의 1차 PCR 증폭을 수행하였다. 약 600bp의 상기 1차 PCR 증폭된 DNA 밴드를 모으고, Qiagen Kit를 이용하여 정제하는 Gel purification 과정을 수행하였다. 이 후, VHH 유전자의 증폭을 위하여, VHH-FR4 다운스트림 프라이머, VHH-FR1 업스트림 프라이머 및 상기 정제된 DNA를 이용하여 2차 PCR 증폭을 수행하였다. 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 1차 PCR 증폭을 수행한 결과, 약 600bp 및900bp 의 밴드가 나타남을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 2차 PCR 증폭을 수행한 결과, 약 600bp에서 증폭된 본 발명의 단일 도메인 항체의 DNA 밴드를 확인할 수 있었다.
<실시예 3> 본 발명의 단일 도메인 항체 라이브러리 제작
상기 실시예 2에서 제작된 단일 도메인 항체 유전자 라이브러리로부터 αvβ3 인테그린을 인지하는 항체의 선택 및 검색은 파지 디스플레이 방법을 사용하여 실시하였고, 단일 도메인 항체 클론 라이브러리를 제작하였다.
<3-1> 본 발명의 단일 도메인 항체 유전자의 파지미드(phagemid)로 삽입 및 형질전환
본 발명의 단일 도메인 항체 유전자 및 파지미드를 절단하고, 절단된 유전자를 파지미드에 삽입한 후, E.coli TG1에 형질전환 시키기 위하여 다음과 같이 수행하였다. 상기 2-2에서 수득한 2차 PCR 생성물 및 pDisplay-3MTM을 BssHⅡ 및 NheI로 절단하고 Qiagen kit로 동시에 정제하였다. 이 후, DNA 단편을 NEB's T4 DNA ligase를 사용하여 라이게이션한 후, 상기 생성물을 E.coli TG1 세포로 전기-변형하여 형질전환 시켰다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 파지미드 삽입을 위해 절단된 단일 도메인 유전자와, 단일 도메인 항체 유전자를 클로닝하기 위해 절단된 파지미드의 gel-electrophoresis를 확인한 결과, 각 밴드가 뚜렷히 나타남을 확인하였다.
<3-2> 파지 패키징 및 라이브러리 준비
상기 3-1에서 형질전환된 E.coli TG1을 M13K07 헬퍼 파지에 감염시키고, 항원에 특이적으로 결합하는 파지를 증가시키기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.
M13K07 헬퍼 파지를 준비하기 위하여, 지수-증식기(log-phase) TG1 세포와 M13K07 파지를 상이한 희석액으로 30분간 37도의 조건으로 감염시키고, 2TY 플레이트의 한천에 접종하였다. 상기 3 mL 액체 2TY 배지에 작은 플라크(plaque)를 접종하여 배양한 후, 30 μL의 밤새 배양한 TG1 세포를 추가하고 2시간 동안 37도로 배양하였다. 1L 2TY 배지의 배양액을 희석하고 1시간 동안 배양시킨 후, 50㎍/mL 카나마이신을 추가하여 16시간, 37도 조건으로 배양하였다. 원심분리(10분, 5000g)를 수행하여 세포를 제거하고, 0.25 부피의 파지 침전물을 추가하여, 상등액으로부터 파지를 침전시켰다. 얼음에 30분 동안 배양한 후, 원심분리(10분, 5000g)를 수행하여 파지 입자를 수득하였다. 5 mL PBS로 펠렛을 재부유한 후, 0.22-㎛의 필터를 통과시켰다. 100μL TG1(포화된 배양)를 포함하는 상단-아가층을 2TY 플레이트 상의 팔르크-형성 단위(plaque-forming units (pfu))의 수를 세어 헬퍼 파지를 확인하였다. 1Х1013 pfu/mL가 되도록 파지 스톡 용액을 희석시킨 후, -20도에 저장하였다.
또한, 라이브러리 파지를 준비하기 위하여, 라이브러리 글리세롤 스톡과 500 mL 2TY-G를 배양하고 600 nm에서 광학 농도가 0.8-0.9에 도달 할 때까지 250 rpm으로 진탕하면서 37도에서 배양하였다. 최종 농도가 5×109 pfu/mL가 되도록 M13KO7 헬퍼 파지를 첨가하고 37도에서 30분 동안 진탕하지 않고 배양한 후, 적당히 진탕(200 rpm)하여 30분 동안 파지 감염을 수행하였다. 이 후, 2200g에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 회수하고 같은 양의 2TY-AK에서 펠렛을 재현탁하였다. 빠른 진탕(300 rpm)을 수행하여 30도에서 밤새 배양하였다. 4도, 15분, 7000g 조건으로 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 파지가 담긴 상등액을 미리 냉각한 1L 병에 수득하였다. 이 후, 0.3 부피의 파지 침전제를 첨가하여 혼합한 후얼음 상에서 파지가 1시간 동안 침전 되도록 하였다. 이 후, 4 도, 15분, 7000g조건으로 2회 원심 분리하여 파지를 펠렛화 하였다. 상등액을 제거하고 8mL PBS로 펠렛을 재현탁하였다. 이 후, 10분, 12,000g로 파지를 원심 분리하고 상등액을 통해 파지를 회수하였다. 마지막으로, 파지 스톡 희석액을 TG1 세포에 감염시켜 2TY-AG에 플레이팅하여 배양한 후, 나타나는 암피실린 내성 콜로니의 수를 확인하였다. 상기 과정을 거쳐 본 발명의 단일 도메인 라이브러리를 구축하였으며, 이의 역가를 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단일 도메인 항체 라이브러리는 5.16×1013 pfu/mL의 역가가 나타남을 확인하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2019009144-appb-I000002
<3-3> 본 발명의 단일 도메인 항체 라이브러리에서 유전자 삽입 여부 확인 및 DNA의 정렬
상기 3-2에서 선발한 본 발명의 단일 도메인 라이브러리에서 대표적인 10개의 클론을 선발하여, QC colony PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 10개의 클론 중 9개의 클론은 약 600bp임을 확인하여, 본 발명의 단일 도메인이 올바르게 삽입되어 있는 것임을 확인하였다.
상기와 같은 과정을 통하여, 라이브러리에서 본 발명의 단일 도메인이 올바르게 삽입되어 있는 20개의 클론에 대한 DNA 시퀀싱을 수행하였다. S6 다운스트림 프라이머를 이용하였고, 이를 정렬하였다. 그 결과를 도 6a 및 도 6i에 나타내었다.
도 6a 및 도 6i에 나타낸 바와 같이, 20개의 클론은 다양성이 나타남을 확인하였다.
<실시예 4> 패닝(panning)에 의한 특이적인 항체 선별
상기 실시예 3에서 구축한 본 발명의 단일 도메인 항체 클론 라이브러리에서 패닝을 실시하기 위하여, 5-30㎍/mL의 표적을 코팅하고 4도에서 2 시간 동안 배양하였다. 그 후, 세척 버퍼로 웰을 3회 세척한 후, 블로킹 버퍼를 채우고 4도에서 밤새 배양하고 세척 버퍼로 한 번 세척하였다. 전-블로킹 웰(pre-blocked well)(비-코팅)에 PBS-M(2 % 우유)을 넣어 원래의 라이브러리 파지를 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 그 후, 전-블로킹(코팅된) 웰에 파지를 넣고 실온에서 1시간 배양한다. 세척 버퍼로 10회 세척하고, 트립신 digestion에 의한 결합된 파지를 용출하였다. 용출액을 적정(Titrate)하고 증폭시켰다. 그 결과를 도 7 및 표 3에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 패닝에 의한 특이적 항체 선별에 사용될 αvβ3 인테그린 ITGAVB3 항원을 SDS-PAGE를 이용해 검증하였다.
또한, 표 3에 나타낸 바와 같이, 3단계의 선별과정을 통해 타겟 단백질과 강한 결합을 가지는 파지 라이브러리 후보를 선별하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2019009144-appb-I000003
<실시예 5> ELISA를 통한 αvβ3 인테그린 특이적 단일 도메인 항체 분석
상기 실시예 4의 패닝 과정 후 40개의 단일 도메인 항체 파지 클론을 추출하고, αvβ3 인테그린 특이적 단일 도메인 항체와의 결합력을 ELISA법을 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 항체-디스플레잉 파지(antibody-displaying phages)의 단일 클론을 준비하기 위하여, 5 mL 2YT-AG 배지에 단일 클론의 용출액을 접종하고 37도에서 밤새 배양하였다. 각 클론에 대한 글리세롤 스톡을 준비하여 밤새 배양하고, 100μL 배양물을 20mL의 2YT-AG 배지에 넣고 배양하였다. OD600의 광학 밀도가 0.4-0.5에 도달 할 때까지 37 도에서 몇 시간 동안 배양하였다. 20개의 다중 감염(즉, 파지 입자/숙주 세포의 수)에서 M13KO7 헬퍼 파지를 첨가하였다. 37도에서 30분간 배양하여 세포를 30분간 흔들어 주면서 감염시켰다. 원심분리(5000g에서 10 분)하여 감염된 세포를 수집하고, 2YT-AK에서 재현탁하고 30도에서 16 시간 동안 배양하였다. 이 후, 상등액에서 파지 입자를 침전시키고, 1mL PBS로 파지 펠렛을 재현탁하며 원심 분리(5000g에서 10 분)하여 세포 파편을 제거하였다. 파지 입자와 관련없는 Ab 단편을 제거하고, 250 μL PBS에 파지 펠렛을 제거하고 원심 분리를 다시 수행하였다.
또한, 파지 ELISA를 수행하기 위하여, 코팅 완충액을 이용하여 2.5-5㎍/mL의 표적 단백질과 대조 단백질을 4도에서 코팅하고, 웰 당 200μL 세척 버퍼로 웰을 3 회 세척한 후, 실온에서 2시간 동안 200μL PBS-M로 웰을 블로킹하였다. 블로킹 완충액을 털어 내고 세척액으로 플레이트를 6 번 씻어내었다. 이 후, 웰 당 세척 완충액에 100μL의 파지 용액을 첨가하고 1~2시간 동안 상온에서 배양하였다. 그 후, 세척 버퍼로 6 회 세척한다. HRP 결합 항-M13 항체(GE healthcare)를 1:5,000의 블로킹 완충액으로 희석한다. 1 웰 당 희석 된 접합체 100 μL를 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 배양하고, 세척 버퍼로 6 회 세척하였다. HRP 기질 용액은 다음과 같이 준비하였다: OPD의 원액은 50mg sodium citrate(pH 4.0) 100mL에 22mg OPD (Sigma)를 용해하여 준비하고, 검출 단계 직전에 OPL 스톡 용액 21 mL에 36 uL 30 % H2O2를 추가하였다. 웰 당 100 uL의 기질 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 490nm로 설정된 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 분석하였다. 각 클론을 분석한 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 40개 클론 모두 αvβ3 인테그린에 강하게 결합함을 확인하였다.
[표 4]
Figure PCTKR2019009144-appb-I000004
<실시예 6> 본 발명의 단일 도메인 항체 클론의 DNA 시퀀싱 및 정보 분석
본 발명의 단일 도메인 항체 클론의 DNA 시퀀싱을 수행하기 위하여, 5mL LB-A 배지(100㎍/mL 암피실린이 첨가된 LB 배지)에 각 양성 클론(파지 ELISA 및/또는 가용성 ELISA로 측정) 플라스미드가 있는 2μL 글리세롤 스톡 TG1 E.coli 세포를 접종하고 37도로 밤새 배양하였다. Plasmid Isolation Kit(Qiagen Miniprep kit)를 사용하여 상기 세포로부터 각각의 양성 클론에 대한 플라스미드를 분리하였고, L1 및 S6 프라이머를 사용하여 DNA 염기 서열 분석을 수행하였다.
또한, 각 단일 도메인 항체 클론의 정보를 분석하기 위하여, Vector NTI®, Version 10를 이용하여 반환된(returned) 서열을 변환하고, 단백질 배열을 정렬하였다. 그 후, 동일한 단백질 서열을 암호화하는 클론을 그룹화하여 분석하였다. 그 결과를 표 5, 도 8a 내지 도 8c에 나타내었으며, 본 발명의 단일 도메인 항체 클론을 편의 상, VHH로 기재하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 40개의 클론 시퀀스를 분석한 결과 10개의 후보군 VHH DNA 시퀀스를 확인하였다.
또한, 도 8a 내지 도 8c에 나타낸 바와 같이, 각 10개의 군에서 높은 반응을 보이는 클론 14, 11, 29, 17, 15, 28, 12, 19, 13, 21, 27, 16, 18, 20, 30, 23, 24, 25, 22, 26을 선발하고 이의 아미노산 서열을 나타내었다.
이 중, 강한 양성을 보이는 클론 VHH-25, VHH-13, VHH-22, VHH-11, VHH-17, VHH-15, VHH-12, VHH-16, VHH-20, VHH-23의 염기서열을 각각 서열번호 1 내지 10으로 나타내었다. 그 중, VHH-25, VHH-13, VHH-22의 아미노산 서열을 각 서열번호 11, 12 또는 13으로 나타내었다.
[표 5]
Figure PCTKR2019009144-appb-I000005
상기 강한 양성을 보이는 클론 VHH-11, VHH-17, VHH-15, VHH-12, VHH-13, VHH-16, VHH-20, VHH-23, VHH-25, VHH-22 중에서, 실시예 5의 ELISA의 방법을 수행하여, 단일 도메인 항체 클론을 선발하였다. 그 결과를 표 6 및 표 7에 나타내었다.
표 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 10개의 VHH 클론 후보 중, VHH-12, VHH-13, VHH-16, VHH-22, VHH-25가 상대적으로 높은 결합력을 나타내었다.
[표 6]
Figure PCTKR2019009144-appb-I000006
[표 7]
Figure PCTKR2019009144-appb-I000007
<실시예 7> 본 발명의 단일 도메인 항체 클론의 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석
상기 실시예 6에서 αvβ3 인테그린을 표적으로 하는 단일 도메인 항체 중, VHH-13, VHH-22 및 VHH-25를 선발하고, 종래 αvβ3 인테그린 항체와 비교하여 SPR 분석을 수행하였다.
구체적으로, Dextran이 도포된 CMDH chip(Carboxymethyl Dextran Hydrogel Surface Sensor Chip, Reichert Technologies)을 SPR 장비(Reichert SR7500DC system)에 장착하여, αvβ3 인테그린 항원의 고정화(immobilization) 작업을 수행하였다. 이 후, 선발된 항체의 각 농도별 결합력 (affinity) 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 9 및 표 8에 나타내었다.
도 9 및 표 8에 나타낸 바와 같이, VHH-13, VHH-22 및 VHH-25 항체의 KD (Equilibrium dissociation constant) 값이 8.8-15.5 nM의 우수한 αvβ3 인테그린 결합력이 나타남을 확인하였다.
[표 8]
Figure PCTKR2019009144-appb-I000008
<실시예 7> 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-13, VHH-22 및 VHH-25의 발현
상기 실시예 6에서 최종적으로 본 발명의 단일 도메인 항체 클론 중 VHH-13, VHH-22 및 VHH-25가 가장 우수함을 확인하였는 바, 이를 생산하는 벡터를 제작하고, 대장균에 도입하여 단일 도메인 항체 VHH-25를 발현하였다.
구체적으로, 이를 본 발명의 선발된 단일 도메인 항체 클론인 VHH-13, VHH-22 또는 VHH-25 발현을 위하여 His6 tag을 포함하는 벡터를 제작하였으며, VHH-25에 대한 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25)을 도 10a에 나타내었다. 또한, 다른 기능성 분자 또는 원소와의 결합력을 높이기 위하여, 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 벡터를 제작하고, 이에 대한 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25K1)은 도 10b에 나타내었다. VHH-25, VHH-13 또는 VHH-22 각 클론에 His6 tag가 포함된 아미노산 서열은 각 서열번호 14, 15 및 16에 나타내었다.
상기 His6 tag을 포함하는 VHH-13, VHH-22 또는 VHH-25 발현 결과를 reduced SDS-PAGE를 수행하여 확인하였으며, 도 11a 내지 도 11c에 나타내었으며, 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 VHH-25 발현 결과를 도 11d에 나타내었다.
그 결과, VHH-13는 약 15.9 kDa임을 확인하였고(도 11a), VHH-22는 약 14.1kDa임을 확인하였다(도 11b). 또한, VHH-25는 약 14.5kDa이고(도 11c), 라이신 포함 VHH-25는 약 14.2kDa임을 확인하였다(도 11d).
<실시예 8> 암세포에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 αvβ3 인테그린 표적 효과 확인
In vitro 상에서 암세포에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 αvβ3인테그린 표적 효과 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 라이신이 포함된 VHH-25-K1 0.5mg과 Cy5.5(sulfo-Cy5.5-NHS, Lumiprobe) 0.25 mg을 2 ml의 borate buffer(pH 8.4)에 녹여 상온에서 30분간 반응을 수행하였다. 반응이 종료한 후 PD-10 column(GE healthcare)을 이용하여 Cy5.5가 도입된 항체 VHH-25-K의 정제를 수행하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, Cy5.5가 도입된 항체 VHH-25-K 합성 및 정제를 SDS-PAGE를 통해 확인하고, αvβ3 인테그린이 활성화된 U87-MG cell(human glioblastoma)에서 선택적으로 세포 내 흡입(cellular uptake)됨을 확인하였다.
<실시예 9> 종양 부위에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 αvβ3 인테그린 표적 효과 확인
종양 마우스 동물 모델에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 αvβ3 인테그린 표적 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, Athymic nude mice (female, 6-8 weeks old)에 U87-MG cell을 이종이식(inoculation)하여 동물모델을 제작하였다. 종양의 크기가 0.8-1 cm의 크기로 자랐을 때 VHH-25-K에 Cy5.5를 결합하여 꼬리정맥으로 주입(1mg/kg)하여 시간 별로 조영효과를 IVIS(PerkinElmer)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 주입 후 30분이 지난 시점부터 종양 부위에서 조영 효과를 확인할 수 있으며, 4시간 동안 조영 신호가 강하게 나타남을 확인하였다. 그 후, 24시간 동안 종양 부위에서 계속적인 조영신호가 나타남을 확인하였다.
<실시예 10> 동맥경화 부위에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 αvβ3인테그린 표적 효과 확인
동맥경화 마우스 동물 모델에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 αvβ3 인테그린 표적 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, ApoE-/- mice (Female, 10 weeks old)에 36주간 고지방식을 실시하여 혈관내 플라크(plaque)가 형성된 동물모델을 제작한다. 그 후, 상기 실시예 9에서와 동일한 방법으로 준비한 VHH-25-K에 Cy5.5를 결합시키고 꼬리정맥으로 주입(1mg/kg)한 후 4시간 후 마우스를 희생시키고 대동맥을 분리하였다. 분리된 대동맥의 조영 효과를 IVIS를 이용해 분석하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 주입 후 4시간 후, 플라크가 형성된 부위에서 선택적으로 조영 효과가 나타남을 확인하였다.

Claims (20)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 코딩되는, αvβ3 인테그린(Integrin) 표적 단일 도메인 항체(Single-domain antibody).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하며, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는, αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 카멜리대(Camelidae)에서 유래된 VHH(variable region of a heavy chain antibody)인 것을 특징으로 하는, αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 기능성 분자 또는 원소가 추가적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 분자 또는 원소는 무기입자, 방사선 동위 원소, 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 및 지질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 무기 입자는 형광 마커 또는 염색 물질인 것을 특징으로 하는, αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 형광 마커 또는 염색 물질은 GFP(Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), BFP(Blue fluorescent protein), CFP(Cyan fluorescent protein), 아크리딘 염료(Acridine dyes), 사이아닌 염료(Cyanine dyes), 불소 염료(Fluorone dyes), 옥사진 염료(Oxazine dyes), 페난트리딘 염료(Phenanthridine dyes) 및 로다민 염료(Rhodamine dyes)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 방사선 동위 원소는 18F(불소), 11C(탄소), 15O(산소), 13N(질소), 89Zr(지르코륨), C15O, 13N(암모니아), H2 15O 및 18FDG(F-Deoxy Glucose)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
  9. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터.
  10. 제9항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
  11. 제1항의 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 조성물.
  12. 제1항의 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 키트.
  13. 제1항의 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 신생 혈관 형성 관련 질환은 동맥경화증, 암, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 각막 궤양, 원추 박막, 황반 변성, 쇼그렌 증후군, 근시안과 종양, 각막이식 거부반응, 이상 창상 유합, 트라코마(trachoma), 골질환, 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염, 패혈증성 관절염, 혈관종(hemangiomas), 섬유성 혈관종(angiofibroma), 건선(psoriasis), 화농성 육아종(pyogenic granuloma), 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손성에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열증, 염증성 장질환, 치근막질환, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부 노화, 갑상선 과증식 및 그레이브스병(Grave's disease)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신생혈관 형성 관련 질환의 진단용 조성물.
  15. (1) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    (2) 상기 미생물에서 αvβ3 인테그린에 대한 단일 도메인 항체를 발현시키는 단계;를 포함하는,αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체의 제조 방법.
  16. (1) 검체로부터 분리된 생물학적 시료 또는 동물 모델에 분석하고자 하는 후보 약물을 처리하는 단계;
    (2) 상기 시료에 제1항의 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 αvβ3 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)의 단백질의 수준이 대조군과 비교하여 억제 또는 증진된 후보 약물을 선발하는 단계를 포함하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 (1)의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 세포 또는 조직 시료인 것을 특징으로 하는, 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 (1)의 동물은 래트, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소인 것을 특징으로 하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 (2)의 측정은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법.
  20. (a) 검체로부터 분리된 생물학적 시료에 제1항의 αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 αvβ3 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 αvβ3 인테그린 단백질의 수준을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단을 위한 정보제공 방법.
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