WO2015072750A1 - 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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inflammatory
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김상재
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주식회사 카엘젬백스
김상재
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having anti-inflammatory activity and a composition comprising the same.
  • Inflammation is one of the defense responses of living organisms to prevent damage to biological tissues by external physical stimuli, chemical stimuli such as contact with various allergens or invasion of microorganisms such as bacteria, fungi or viruses.
  • Inflammatory signals are produced through the cyclooxygenase (COX) pathway or the lipoxygenase (LOX) pathway, producing prostaglandins, thromboxanes and the like.
  • COX cyclooxygenase
  • LOX lipoxygenase
  • Inflammation can include acute inflammation (immediate response, nonspecific response, days to weeks), chronic inflammation, delayed response, specific response, several weeks or more, and acute inflammation. Middle stage of chronic inflammation, characterized by the mixed product of multinucleated and monocytes).
  • inflammatory factors include prostaglandins, leukotrienes, lipid factors such as platelet activators, inflammatory synthase, free radicals such as NO (nitric oxide), various cell adhesion molecules, Immune system, coagulation factor is involved.
  • the mechanisms of inflammation known to date are cellular damages caused by external biological causes (bacteria, viruses, parasites), physical causes (mechanical stimulation, heat, radiation, electricity), chemical causes, etc.
  • Vasodilation, increased capillary permeability, and aggregation of macrophages occur in inflammatory sites, resulting in increased blood flow, edema, immune cell and antibody migration, pain, and fever.
  • nonsteroidal anti-inflammatory drugs NSAIDs
  • SAIDs steroidal anti-inflammatory drugs
  • nonsteroidal anti-inflammatory drugs used for the treatment of chronic inflammatory diseases such as acute or rheumatoid arthritis are known to exhibit side effects such as gastrointestinal disorders by inhibiting COX-2 enzyme as well as COX-1 enzyme.
  • telomerase may have anti-inflammatory activity and have completed the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding a novel peptide.
  • Another object of the present invention is to provide a peptide having anti-inflammatory activity.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-inflammatory composition comprising a peptide having anti-inflammatory activity as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a cosmetic composition comprising a peptide having anti-inflammatory activity as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising a peptide having anti-inflammatory activity as an active ingredient.
  • a peptide having an anti-inflammatory activity a peptide comprising an amino acid sequence of any one or more of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof Phosphorus peptides are provided.
  • the fragment may be a fragment consisting of three or more amino acids.
  • the peptide may consist of up to 30 amino acids.
  • the peptide may comprise any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14.
  • the peptide may be derived from human telomerase.
  • a peptide having an anti-inflammatory activity a peptide comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 or a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof
  • Polynucleotides are provided which encode phosphorus peptides.
  • the peptide may be a polynucleotide encoding up to 30 amino acids.
  • the polynucleotide may be a peptide derived from human telomerase.
  • a peptide comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence, or a peptide thereof is a peptide.
  • An anti-inflammatory composition is provided.
  • the peptide may be composed of up to 30 amino acids.
  • the peptide may be composed of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14.
  • the peptide may be derived from human telomerase.
  • the composition may be for the treatment or prevention of inflammatory diseases.
  • the composition may be a cosmetic composition for improving or preventing skin inflammation.
  • the composition may be a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of inflammatory diseases.
  • the composition may be a food composition for the improvement or prevention of inflammation.
  • the inflammatory disease comprises (1) a systemic or local inflammatory disease (eg, allergy; immune complex disease; high fever; hypersensitivity shock; endotoxin shock; cachexia; abnormal high fever) Granulomatosis; or sarcoidosis); (2) gastrointestinal diseases (eg, appendicitis; gastric ulcer; duodenal ulcer; peritonitis; pancreatitis; ulcerative, acute or ischemic colitis; cholangitis; cholecystitis; fatty ecstasy; hepatitis; Crohn's disease; or Whiff's disease); (3) skin-related diseases (eg, psoriasis; burns; sunburn; dermatitis; biliary warts or rashes); (4) cardiovascular diseases (eg, vasculitis; vasculitis; endocarditis; arteritis; atherosclerosis; thrombophlebitis; pericarditis; congestive
  • a systemic or local inflammatory disease
  • eosinophilic granulomas arthritis; arthralgia; osteomyelitis; dermatitis; fasciitis; pagetosis; gout; periodontal disease; rheumatoid arthritis; myasthenia gravis; ankylosing spondylitis) Or synovial inflammation); (7) urogenital diseases (eg, epididymitis; vaginitis; prostatitis; or urethritis); (8) central or peripheral nervous system related diseases (e.g., Alzheimer's disease; meningitis; encephalitis; multiple sclerosis; cerebral infarction; cerebral embolism; Guillain-Barre syndrome; neuritis; neuralgia; spinal cord trauma; paralysis; or Uveitis); (9) virus (eg, influenza; respiratory cell fusion virus; HIV; hepatitis B virus; hepatitis C virus or herpes virus) infectious disease (eg, dengue; or septicemia), fungal infection disease (Eg
  • a method for preventing or treating an inflammatory disease characterized by administering the anti-inflammatory composition mentioned above.
  • a peptide comprising a peptide comprising at least one amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide or a fragment thereof having 80% or more sequence homology with the amino acid sequence, and a composition comprising the same
  • a kit for preventing or treating an inflammatory disease comprising instructions that disclose one or more of the dosage, route of administration, frequency of administration, and indications of the peptide or composition comprising the same.
  • compositions comprising the peptide of the present invention can be used as a pharmaceutical composition or cosmetic composition for the anti-inflammatory effect can be widely used for the treatment and prevention of various inflammatory diseases.
  • 1 to 14 shows that THP-1 cells were treated with 100ng / mL PMA and cultured one day before the experiment so that 2 ⁇ 10 5 cells per well in a 24-well plate, followed by LPS (10 ng / ml) treatment. incubation time, and then a graph showing a result of each of the peptides in Opti-MEM (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 14) for 0.1, 1uM each of the processes performed by the TNF- ⁇ ELISA in the cell culture fluid. (** P ⁇ 0.05.Compared with LPS treated sample.)
  • the present invention may be variously modified and may have various embodiments.
  • the present invention will be described in more detail. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, it should be understood to include all transformations, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.
  • the detailed description of the related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.
  • Telomere is a genetic material repeatedly present at the end of a chromosome and is known to prevent damage to the chromosome or binding to another chromosome. Each time a cell divides, the telomeres become slightly shorter. After a certain number of cell divisions, the telomeres become very short, and the cells stop dividing and die. On the other hand, elongation of telomeres is known to prolong cell life. For example, cancer cells secrete an enzyme called telomerase, which prevents telomeres from shortening, so that cancer cells can continue to proliferate without dying. We have found that numerous peptides derived from telomerase can have anti-inflammatory activity and have completed the present invention.
  • One aspect of the present invention is a peptide having an anti-inflammatory activity, a peptide comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof To provide.
  • SEQ ID NO: 15 is the sequence of human telomerase full length protein.
  • SEQ ID NO: 1 is a peptide derived from telomerase and consists of 16 amino acids.
  • At least one of the peptides set forth in SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 includes a "synthetic peptide" synthesized by selecting a peptide at a corresponding position among peptides contained in telomerase.
  • the term “pep” refers to a peptide having any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, or a peptide having 80% or more sequence homology with the sequence, or a fragment thereof.
  • One aspect of the present invention is a peptide having an anti-inflammatory activity, the peptide comprising an amino acid sequence of any one or more of SEQ ID NO: 2 to 14, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof It provides a polynucleotide.
  • the polynucleotides can be used to mass produce peptides. For example, a large amount of peptides can be produced by culturing a host cell containing a vector containing a polynucleotide encoding a peptide.
  • amino acid changes belong to a property that allows the physicochemical properties of the peptide to be altered.
  • amino acid changes can be made, such as improving the thermal stability of the peptide, altering substrate specificity, changing the optimal pH, and the like.
  • a peptide comprising an amino acid sequence of any one or more of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence, or a peptide thereof is 30 amino acids or less It may be configured as.
  • a peptide having a sequence of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide that is a fragment of the sequence or a peptide having at least 80% sequence homology with the peptide sequence is a telomerase, specifically human ( Homo sapiens ) peptides derived from telomerase.
  • amino acid includes not only the 22 standard amino acids naturally incorporated into peptides, but also D-isomers and modified amino acids. Accordingly, in one aspect of the invention the peptide may be a peptide comprising D-amino acids. Meanwhile, in another aspect of the present invention, the peptide may include a non-standard amino acid or the like which has been post-translational modified.
  • post-translational modifications include phosphorylation, glycosylation, acylation (including, for example, acetylation, myristoylation and palmitoylation), alkylation ), Carboxylation, hydroxylation, glycation, biotinylation, ubiquitinylation, changes in chemical properties (e.g., beta-elimination deimidization) , Deamidation) and structural changes (eg, formation of disulfide bridges). It also includes changes in amino acids, such as changes in amino groups, carboxy groups or side chains, caused by chemical reactions that occur during the linkage with crosslinkers to form peptide conjugates.
  • Peptides disclosed herein can be wild-type peptides identified and isolated from a natural source.
  • the peptides disclosed herein may be artificial variants comprising amino acid sequences in which one or more amino acids have been substituted, deleted and / or inserted compared to peptides that are fragments of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14.
  • Amino acid changes in the wild type polypeptide as well as in artificial variants include conservative amino acid substitutions that do not significantly affect the folding and / or activity of the protein.
  • conservative substitutions include basic amino acids (arginine, lysine and histidine), acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), polar amino acids (glutamine and asparagine), hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine, valine and methionine), aromatic amino acids (phenylalanine, Tryptophan and tyrosine) and small amino acids (glycine, alanine, serine and threonine). Amino acid substitutions that generally do not alter specific activity are known in the art.
  • the most common exchanges are Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, and Asp / Gly, and vice versa.
  • Other examples of conservative substitutions are shown in the following table.
  • residue substitution Ala (A) val; leu; ile Val Arg (R) lys; gln; asn Lys Asn (N) gln; his; asp, lys; arg Gln Asp (D) glu; asn Glu Cys (C) ser; ala Ser Gln (Q) asn; glu Asn Glu (E) asp; gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) asn; gln; lys; arg Arg Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucine Leu Leu (L) norleucine; ile; val; met; ala; phe Ile Lys (K) arg; gln; asn Arg Met (M) leu; phe; ile Leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Tyr
  • Substantial modifications in the biological properties of the peptide include (a) their effect on maintaining the structure of the polypeptide backbone, eg, a sheet or helical conformation, within the substitution region, (b) the charge of the molecule at the target site. Or their effect in maintaining hydrophobicity or (c) their effect in maintaining the bulk of the side chain is carried out by selecting significantly different substitutions. Natural residues are divided into the following groups based on common side chain properties:
  • hydrophobic norleucine, met, ala, val, leu, ile
  • Non-conservative substitutions will be made by exchanging a member of one of these classes for another class. Any cysteine residue that is not involved in maintaining the proper conformation of the peptide can generally be substituted with serine to improve the oxidative stability of the molecule and to prevent abnormal crosslinking. Conversely, cysteine bond (s) can be added to the peptide to improve its stability.
  • Another type of amino acid variant of the peptide is a change in the glycosylation pattern of the antibody.
  • change is meant the deletion of one or more carbohydrate residues found in the peptide and / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the peptide.
  • N-linked refers to a carbohydrate moiety attached to the side chain of an asparagine moiety.
  • Tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline, are recognition sequences for enzymatic attachment of carbohydrate moieties to asparagine side chains.
  • O-linked glycosylation means attaching one of the sugars N-acetylgalactosamine, galactose or xylose to hydroxyamino acids, most commonly serine or threonine, but 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine You can also use
  • glycosylation sites to the peptide is conveniently performed by changing the amino acid sequence to contain one or more of the above mentioned tripeptide sequences (for N-linked glycosylation sites). Such changes may also be made by adding or replacing one or more serine or threonine residues with the sequence of the original antibody (for O-linked glycosylation sites).
  • the polynucleotide may be a naturally occurring or artificial DNA or RNA molecule as a nucleic acid molecule, and may be single stranded or double stranded.
  • the nucleic acid molecule may be one or more, which may be nucleic acid molecules of the same type (eg, having the same nucleotide sequence), or may be nucleic acid molecules of other types. Including, but not limited to, one or more of DNA, cDNA, decoy DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, antisense oligomer, plasmid and other modified nucleic acids It is not.
  • HMGB1 protein in the cell nucleus The amount is increased. This means that a peptide having the sequence, a peptide which is a fragment of the sequence, or a peptide having a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence has an excellent inflammation preventing or suppressing effect.
  • a peptide having a sequence of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 according to an aspect of the present invention, peptide which is a fragment of the sequence or peptide having a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence has a low intracellular toxicity in vivo stability This has the advantage of being high.
  • inflammatory diseases include (1) systemic or local inflammatory diseases (eg, allergies; immune complex diseases; hyperthermia; irritable shock; endotoxin shock; cachexia; abnormal hyperthermia; granulomatosis; or sarcoidosis); (2) gastrointestinal diseases (eg, appendicitis; gastric ulcer; duodenal ulcer; peritonitis; pancreatitis; ulcerative, acute or ischemic colitis; cholangitis; cholecystitis; fatty ecstasy; hepatitis; Crohn's disease; or Whiff's disease); (3) skin-related diseases (eg, psoriasis; burns; sunburn; dermatitis; biliary warts or rashes); (4) cardiovascular diseases (eg, vasculitis; vasculitis; endo
  • eosinophilic granulomas arthritis; arthralgia; osteomyelitis; dermatitis; fasciitis; pagetosis; gout; periodontal disease; rheumatoid arthritis; myasthenia gravis; ankylosing spondylitis) Or synovial inflammation); (7) urogenital diseases (eg, epididymitis; vaginitis; prostatitis; or urethritis); (8) central or peripheral nervous system related diseases (e.g., Alzheimer's disease; meningitis; encephalitis; multiple sclerosis; cerebral infarction; cerebral embolism; Guillain-Barre syndrome; neuritis; neuralgia; spinal cord trauma; paralysis; or Uveitis); (9) virus (eg, influenza; respiratory cell fusion virus; HIV; hepatitis B virus; hepatitis C virus or herpes virus) infectious disease (eg, dengue; or septicemia), fungal infection disease (Eg
  • Treating the inflammatory component of such a disease has been the most important goal of the pharmaceutical industry for decades and numerous useful therapies have been developed.
  • Examples include corticosteroids (a wide range of natural, semisynthetic and synthetic agents designed to simulate the effects of cortisol, including prednisolone, methylprednisolone, dexamethasone, betamethasone, fluticasone, etc.), cyclooxygenase inhibitors (indometacin, Nonselective or cox-1 selectivity, such as sulfasalazine and aspirin, and more recent cox-2 selectivity, such as celecoxib), leukotriene blockers (such as montelukast), and small molecule TNF- ⁇ synthesis (thalidomide) Inhibitors as well as improved monoclonal neutralizing antibodies including Remicade TM and adalimumab (HumiraTm), anti-TNF (such as TNF receptor fusion proteins such as Enbrel
  • an anti-inflammatory composition comprising a peptide comprising an amino acid sequence of any one or more of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence, or a fragment thereof.
  • SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 0.01 g / L to 1 kg / peptide which is a peptide or a fragment thereof having a sequence homology of at least 80% L, specifically, 0.1 g / L to 100 g / L, and more specifically 1 g / L to 10 g / L.
  • composition according to one aspect of the present invention can be applied to all animals including humans, dogs, chickens, pigs, cattle, sheep, guinea pigs or monkeys.
  • the composition comprises a peptide having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide that is a fragment of the sequence or a peptide having at least 80% sequence homology with the peptide sequence as an active ingredient
  • the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention may be administered orally, rectal, transdermal, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intramedullary, intradural or subcutaneous.
  • Formulations for oral administration may be, but are not limited to, tablets, pills, soft or hard capsules, granules, powders, solutions or emulsions.
  • Formulations for parenteral administration may be, but are not limited to, injections, drops, lotions, ointments, gels, creams, suspensions, emulsions, suppositories, patches or sprays.
  • compositions according to one aspect of the invention may include additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, buffers, dispersants, surfactants, colorants, flavoring or sweetening agents as needed.
  • additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, buffers, dispersants, surfactants, colorants, flavoring or sweetening agents as needed.
  • Pharmaceutical compositions according to one aspect of the invention may be prepared by conventional methods in the art.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention will vary depending on the age, sex, weight, pathology and severity of the subject to be administered, the route of administration or the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of one of skill in the art and its daily dosage may be, for example, from 1 ng / kg / day to 10 mg / kg / day, specifically from 10 ng / kg / day to 1 mg / kg. Per day, more specifically 0.1 ⁇ g / kg / day to 100 ⁇ g / kg / day, and more specifically 0.2 ⁇ g / kg / day to 20 ⁇ g / kg / day, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention may be administered once to three times a day, but is not limited thereto.
  • skin inflammation comprising a peptide comprising an amino acid sequence of any one or more of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 ,, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof as a active ingredient
  • a skin external preparation composition for improvement or prevention.
  • a skin comprising a peptide comprising at least one amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence, or a fragment thereof as a active ingredient
  • a cosmetic composition for improving or preventing inflammation.
  • the topical skin composition or cosmetic composition according to one aspect of the present invention may be provided in any formulation suitable for topical application.
  • it may be provided in the form of a solution, an emulsion obtained by dispersing an oil phase in an aqueous phase, an emulsion obtained by dispersing an aqueous phase in an oil phase, a suspension, a solid, a gel, a powder, a paste, a foam, or an aerosol.
  • Such formulations may be prepared according to conventional methods in the art.
  • the cosmetic composition according to one aspect of the present invention may include other ingredients that can give a synergistic effect to the main effect, preferably within the range of not impairing the main effect.
  • the cosmetic composition according to an aspect of the present invention may further include a moisturizer, an emulsifier, a surfactant, a UV absorber, a preservative, a bactericide, an antioxidant, a pH adjuster, an organic or inorganic pigment, a perfume, a cooling agent, or a restriction agent. It may include.
  • the blending amount of the above components can be easily selected by those skilled in the art within the range that does not impair the object and effect of the present invention, the blending amount is 0.01 to 5% by weight, specifically 0.01 to 3% by weight based on the total weight of the cosmetic composition Can be.
  • the composition comprises a peptide having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide that is a fragment of the sequence or a peptide having at least 80% sequence homology with the peptide sequence as an active ingredient It provides a food composition for preventing or inhibiting inflammation.
  • the formulation of the food composition according to one aspect of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, formulated into tablets, granules, powders, solutions, solid preparations, and the like.
  • Each formulation may be appropriately selected and formulated by those skilled in the art according to the formulation or purpose of use, in addition to the active ingredient, and may be synergistic when applied simultaneously with other raw materials.
  • the determination of the dosage of the active ingredient is within the level of one skilled in the art, the daily dosage of which is for example specifically 10 ng / kg / day to 1 mg / kg / day, more specifically 0.1 ⁇ g / kg / day To 100 ⁇ g / kg / day, and more specifically, 0.2 ⁇ g / kg / day to 20 ⁇ g / kg / day, but is not limited thereto, and various factors such as age, health condition, and complications of the subject to be administered. It may vary.
  • the present invention provides a peptide which comprises at least one amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide having at least 80% sequence homology with the amino acid sequence, or a fragment thereof. Provide therapeutic use.
  • a peptide comprising a amino acid sequence of any one or more of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 of the present invention, a peptide having a sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence or a fragment thereof, or a composition comprising the same
  • the composition is a peptide comprising a amino acid sequence of any one or more of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14, a peptide or a fragment comprising a peptide or fragment thereof having 80% or more sequence homology with the amino acid sequence and
  • a kit for preventing or treating an inflammatory disease comprising an indication of one or more of the dosage, route of administration, frequency of administration, and indications of a peptide or composition comprising the same.
  • Preferred embodiments of the invention include the most optimal mode known to the inventors for carrying out the invention. Variations of the preferred embodiments may become apparent to those skilled in the art upon reading the foregoing description. The inventors expect those skilled in the art to make appropriate use of such variations, and the inventors expect the invention to be practiced in a manner different from that described herein. Accordingly, the invention includes all modifications and equivalents of the subject matter referred to in the appended claims, as permitted by patent law. Moreover, any combination of the abovementioned elements within all possible variations is included in the invention unless expressly stated to the contrary or apparently contradictory in context. While the invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments, those skilled in the art will understand that various changes in form and detail may be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the following claims .
  • Tumor necrosis factor in particular TNF- ⁇
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor
  • TNF- ⁇ is known to be released from inflammatory cells causing a variety of cytotoxic, immune and inflammatory responses.
  • TNF- ⁇ is involved in the development and naturalization of many inflammatory diseases and autoimmune diseases, and is known to cause severe sepsis and septic shock when released into the blood and act on the whole body.
  • TNF- ⁇ is a factor broadly involved in the immune system of a living body
  • TNF- ⁇ is biosynthesized in an inactive form and cleaved by protease to become an active form, the enzyme involved in this activation is called tumor necrosis factor converting enzyme (TACE). Therefore, the substance that inhibits TACE can treat, improve, and prevent diseases, conditions, abnormal conditions, poor state, and poor subjective symptoms caused by TNF- ⁇ (KR2011-0060940A).
  • Peptides of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 selected from human telomerase were synthesized.
  • Peptides were prepared according to known solid phase peptide synthesis. Specifically, peptides were synthesized by coupling amino acids one by one from the C-terminus through Fmoc solid phase synthesis (SPPS) using ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon, Korea). As follows, the first amino acid at the C-terminus of the peptides was attached to the resin. For example:
  • Coupling reagent is HBTU [2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] / NMM [4-Methylmorpholine] It was. Fmoc removal was performed using piperidine in DMF in 20% of DMF.
  • Each peptide was synthesized by repeating a process of reacting the amino acids with each other, washing with a solvent, and then deprotecting the amino acid using the state in which the amino acid protecting group was bound to the solid support.
  • the synthesized peptide was separated from the resin and then purified by HPLC, and confirmed by MS and lyophilized.
  • the method of synthesizing the peptide of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 uses the same method as the method of synthesizing the peptide of SEQ ID NO: 1, but the amino acid to attach.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Biocoll Separating Solution Biochrom AG, Berlin, Germany
  • the recovered PBMC was suspended in RPMI 1640 medium to which human serum (20%) was added and transferred to a 100-mm polystyrene cell culture plate coated with human serum for about 30 minutes at 37 ° C. and 5% incubator for 2 hours. Incubated for 2 hours. Afterwards, the monosites attached to the bottom were removed with cold PBS and then RPMI 1640 medium (supplemented with penicillin-streptomycin; 100 mg / ml, human) in a 24 well plate at 2 x 10 5 cells per well. serum (20%) was incubated one day before the experiment.
  • Monosites derived from PBMCs were treated with 100 ng / mL PMA and incubated one day before the experiment in 24-well plates to 2 x 10 5 cells per well. Thereafter, LPS (lipopolysaccharide; 10 ng / ml, Sigma) was treated for 2 hours and washed twice with PBS. Thereafter, the mixture was incubated in OPTI-MEM medium (Invitrogen / Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) for 1 hour, and then each peptide of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 was added to each well at 0.1 and 1 ⁇ M in OPTI-MEM. Incubated for 1 hour after treatment. After incubation, the medium was collected and stored at -80 ° C, and TNF- ⁇ was quantified according to the ELISA (R & D, Minneapolis, MN, USA) kit manual. Specific quantification method is as follows.
  • TNF measurement is performed using a sandwich ELISA method. Add 100 ul of TNF ⁇ primary antibody to a pre-coated 24 well plate and overnight at 4 ° C. The next day, wash with 0.5% tween 20 wash solution three times for 5 minutes, and add 100ul of sample and standard solution to be measured and react at room temperature for 2 hours. After washing as above, each 100 ul of HRP-conjugated secondary antibody was added and allowed to react at room temperature for 2 hours. After washing again, avidin / biotin was added and developed to measure absorbance. The standard curve is calculated from the absorbance of standard and the amount of TNF ⁇ is quantified from the absorbance of each sample.
  • the TNF- ⁇ level of the cell culture was measured by ELISA, and the TNF- ⁇ level was decreased at each peptide concentration or at any concentration in which peptides of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 14 were used compared to the control group treated with LPS only. Confirmed. (FIGS. 1-13)

Abstract

본 발명에서는 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 한 항의 서열을 갖는 펩티드, 상기 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 및 이를 유효 성분으로 포함하는 항염 조성물이 개시된다. 본 발명에 따른 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드는 우수한 염증 예방 또는 억제 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물은 항염증 효과를 위한 약학적 조성물 또는 화장료 조성물로서 사용될 수 있어 다양한 염증성 질환의 치료 및 예방에 널리 이용될 수 있다.

Description

항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
본 발명은 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
염증은 외부의 물리적 자극, 각종 알레르기 유발 물질 접촉을 예로 들 수 있는 화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스와 같은 미생물의 침입 등에 의해 생체 조직이 손상되는 것을 막기 위한 생체의 방어 반응 중 하나이다.
염증 신호는 사이클로옥시게나제(COX) 경로 또는 리폭시게나제(LOX) 경로를 통하여 만들어지며, 프로스타글란딘, 트롬복산 등을 생성한다. 염증 신호가 전달되면 생체 내에서는 여러 가지 변화가 일어나는데, 그 중 하나로 염증이 필요한 부위의 혈관을 확장시켜 혈액 공급이 왕성하게 일어나도록 하여, 호중구 등 염증 반응에 필요한 혈액 세포가 집중 공급되는 현상을 들 수 있다. 그러나 이러한 생체의 방어 반응이 비정상적으로 과도하게 일어나면 여러 염증성 질환들이 발병하게 되므로, 이를 방지하고자 염증 신호 경로의 효소(예를 들어 COX-1, COX-2, 5-LOX, 12-LOX 등)를 억제하여 염증 신호 경로를 차단함으로써, 과도한 염증 반응을 억제할 수 있는 약물들이 개발되고 있다.
염증은 반응기간에 따라서 급성염증(acute inflammation, 즉각적 반응, 비특이적 반응, 수일~수주일), 만성염증(chronic inflammation, 지연된 반응, 특이성 반응, 수주일 이상), 아급성 염증(subacute inflammation, 급성과 만성염증의 중간단계, 다핵구와 단핵구의 혼합형 산출물의 특징)으로 나뉜다.
또한, 염증을 유발하는 인자에는 펩티드성 인자 이외에 프로스타그란딘, 루코트리엔, 혈소판활성인자와 같은 지질성 인자, 염증인자 합성효소, NO(nitric oxide)와 같은 자유라디칼, 여러 종류의 세포접착분자, 면역계, 응고인자 등이 관여한다.
현재까지 알려진 염증의 기전은 외부의 생물학적인 원인(세균, 바이러스, 기생충), 물리학적인 원인(기계적인 자극, 열, 방사선, 전기), 화학적 원인 등으로 인한 세포손상으로 히스타민 및 키닌 등이 방출되어 혈관확장, 모세혈관 투과성 증가 및 염증부위로 대식세포의 집결이 일어나고, 이에 따라서 감염부위의 혈류량 증가, 부종, 면역세포 및 항체 이동, 통증, 발열 등의 현상이 일어난다.
현재 사용되고 있는 염증의 치료제에는 이부프로펜과 같은 합성의약품, 항히스타민제, 스테로이드, 코티손, 면역억제제, 면역 항진제 등이 사용되고 있으나 치료효과가 일시적이거나 단순 증상완화, 과민반응, 면역체계 악화 등의 부작용이 많이 있고 염증의 근본적인 치료가 어렵다. ( KR2012-0130996A)
따라서, 최근 효과적인 염증 완화를 위하여, 상기 염증 관련 단백질의 발현을 억제할 수 있는 물질에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나, 이러한 연구에 의해 개발된 항염물질의 경우 몇 가지 부작용이 문제되고 있다. 비스테로이드성 항염증제(NSAID)와 스테로이드성 항염증제(SAID)를 비롯한 다양한 기전의 염증 억제용 약물들이 개발되어 있으나, 이들은 적지 않은 부작용을 나타낼 뿐만 아니라, 염증 반응을 근본적으로 억제하는 것이 아니기에, 좀 더 효과적이고 안전하며 경제성이 높은 약물에 대한 요구가 여전히 존재한다. 일 예로, 급성 또는 류마티스성 관절염과 같은 만성의 염증 질환의 치료에 사용되는 비스테로이드성 소염 약물들은 COX-2 효소를 억제할 뿐만 아니라 COX-1 효소도 억제함으로써 위장관 장애와 같은 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.(KR2012-0133661A)
본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래되는 펩티드들이 항염 활성을 가질 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 신규 펩티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항염증 활성을 갖는 펩티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항염증 활성을 갖는 펩티드를 유효성분으로 하는 항염증 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항염증 활성을 갖는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항염증 활성을 갖는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 일측면에 따르면, 항염증 활성을 갖는 펩티드로서, 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 펩티드는 서열번호 2 내지 서열번호 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 펩티드는 인간의 텔로머라제로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일측면에 따르면, 항염증 활성을 갖는 펩티드로서, 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따른 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드가 인간의 텔로머라제로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일측면에 따르면, 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에서, 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에서, 상기 펩티드는 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에서, 상기 펩티드는 인간의 텔로머라제로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에서, 상기 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방용일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에서, 상기 조성물은 피부 염증의 개선 또는 예방용 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에서, 상기 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에서, 상기 조성물은 염증의 개선 또는 예방을 위한 식품조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에서, 상기 염증성 질환은 (1) 전신 또는 국소 염증 질환(예를 들어, 알레르기; 면역 복합체 질환; 고초열; 과민성 쇼크; 내독소 쇼크; 악액질(cachexia); 이상 고열; 육아종증; 또는 유육종증); (2) 위장관계 질환(예를 들어, 충수염; 위궤양; 십이지장 궤양; 복막염; 췌장염; 궤양성, 급성 또는 허혈성 대장염; 담관염; 담낭염; 지방 변증; 간염; 크론병; 또는 휘플씨병); (3) 피부 관련 질환(예를 들어, 건선; 화상; 햇볕 화상; 피부염; 담마진성 사마귀 또는 팽진); (4) 심혈관계 질환(예를 들어, 혈관염; 맥관염; 심내막염; 동맥염; 죽상 동맥경화증; 혈전 정맥염; 심막염; 울혈성 심부전; 심근염; 심근 허혈증; 결절성 동맥 주위염; 재발성 협착증; 버거씨병; 또는 류머티즘열); (5) 호흡기계 질환(예를 들어, 천식; 후두개염; 기관지염; 폐기종(emphysema); 비염; 낭포성 섬유증; 간질성 폐렴; 만성폐쇄성 질환(COPD); 성인 호흡 장애 증후군; 진폐증; 폐포염; 세기관지염; 인두염; 늑막염; 또는 부비강염); (6) 뼈, 관절, 근육 및 결합 조직 관련 질환(예를 들어, 호산성 육아종; 관절염; 관절통; 골수염; 피부근염; 근막염; 패젯병; 통풍; 치주 질환; 류머티즘성 관절염; 중증 근무력증; 강직성 척추염; 또는 윤활막염); (7) 비뇨생식계 질환(예를 들어, 부고환염; 질염; 전립선염; 또는 요도염); (8) 중추 또는 말초 신경계 관련 질환(예를 들어, 알츠하이머병; 수막염; 뇌염; 다발성 경화증; 뇌경색; 뇌색전증; 길레인-바르 증후군(Guillain-Barre syndrome); 신경염; 신경통; 척수 외상; 마비; 또는 포도막염); (9) 바이러스(예를 들어, 인플루엔자; 호흡기 세포 융합 바이러스; HIV; B형 간염 바이러스; C형 간염 바이러스 또는 헤르페스 바이러스) 감염 질환(예를 들어, 뎅기열; 또는 패혈증(septicemia)), 진균 감염 질환(예를 들어, 칸디다증), 또는 박테리아, 기생충과 같은 기타 미생물 감염 질환(예를 들어, 산재성 균혈증; 말라리아; 사상충증; 또는 아메바증); (10) 기타 자가 면역성 질환(예를 들어, 갑상선염; 루푸스; 구드패스츄어 증후군; 동종 이식 거부 반응; 이식편 대 숙주병; 또는 당뇨병); 및 (11) 암 또는 종양성 질환(예를 들어, 호지킨병)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일측면에 따르면, 상기 언급된 항염증 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일측면에 따르면, 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드 또는 이를 포함하는 조성물 및 펩티드 또는 이를 포함하는 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 키트가 제공된다.
본 발명에 따른 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드는 우수한 염증 예방 또는 억제 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물은 항염증 효과를 위한 약학적 조성물 또는 화장료 조성물로서 사용될 수 있어 다양한 염증성 질환의 치료 및 예방에 널리 이용될 수 있다.
도 1 내지 도 14는 THP-1세포를 100ng/mL PMA와 함께 처리하여 24－웰 플레이트에 웰 당 2 × 105 셀이 되도록 실험 하루 전에 배양시킨 후, LPS (10 ng/ml) 처리 후 2시간 배양한 다음, Opti-MEM에 각각의 펩티드들(서열번호 1 내지 서열번호 14)을 0.1, 1uM 각 처리하여 그 세포 배양액으로 TNF-α ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.(** P < 0.05. Compared with LPS treated sample.)
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다. 본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래되는 수많은 펩티드들이 항염 활성을 가질 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일측면은 항염증 활성을 갖는 펩티드로서, 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는　펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 제공한다.
서열번호 1 내지 서열번호 14에 기재된 펩티드는 아래 표 1과 같다. 서열번호 15는 인간의 텔로머라제 전장 단백질의 서열이다. 서열번호 1은 텔로머라제로부터 유래된 펩티드로서 16개 아미노산으로 구성된 펩티드이다.
아래 표 1의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 ２ 내지 서열 번호 14에 기재된 펩티드 중 하나 이상의 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 본 명세서에서 "pep"이라 함은 서열번호 ２ 내지 서열번호 14 중 어느 한 서열을 갖는 펩티드, 또는 그 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 상기 서열의 단편을 총칭하는 용어이다.
표 1
Figure PCTKR2014010866-appb-T000001
본 발명의 일측면은 항염증 활성을 갖는 펩티드로서, 서열번호 ２ 내지 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는　펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 펩티드를 대량 생산할 수 있다. 예컨대 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 넣어 배양함으로써, 펩티드를 대량 생산할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드는, 30개 이하의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 서열번호 2 내지 서열번호 14의 서열을 갖는 펩티드, 상기　서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간(Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.
본 명세서에서 “아미노산”이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 2 내지 서열번호 14의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.
표 2
원래 아미노산 예시적인 잔기 치환 바람직한 잔기 치환
Ala (A) val; leu; ile Val
Arg (R) lys; gln; asn Lys
Asn (N) gln; his; asp, lys; arg Gln
Asp (D) glu; asn Glu
Cys (C) ser; ala Ser
Gln (Q) asn; glu Asn
Glu (E) asp; gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) asn; gln; lys; arg Arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucine Leu
Leu (L) norleucine; ile ; val; met; ala; phe Ile
Lys (K) arg; gln; asn Arg
Met (M) leu; phe; ile Leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) tyr; phe Tyr
Tyr (Y) trp; phe ; thr; ser Phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine Leu
펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다
펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.
펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
본 발명의 일측면에서, 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자로서 자연발생적 또는 인공적 DNA 또는 RNA 분자일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데, 동일한 유형의 (예컨대, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고, 다른 유형으로 핵산 분자들일 수 도 있다. DNA, cDNA, decoy DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머(antosense oligomer), 플라스미드(plasmid) 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에 따른 서열번호 2 내지 서열번호 14의 서열을 갖는 펩티드, 상기 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 세포에 처리하면, 세포핵 내 HMGB1 단백질 양이 증가한다. 이는　상기 서열을 갖는 펩티드, 상기 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드가 우수한 염증 예방 또는 억제 효과를 가짐을 의미한다.
또한 본 발명의 일측면에 따른 서열번호 2 내지 서열번호 14의 서열을 갖는 펩티드,　상기 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮아 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다.
본 명세서에서, "염증성 질환"은 염증을 주 원인으로 하는 질환 또는 질환에 의해 염증이 발생하는 질환 등 염증과 관련된 질환을 모두 포함하는 광범위한 개념이다. 구체적으로, 염증성 질환은 (1) 전신 또는 국소 염증 질환(예를 들어, 알레르기; 면역 복합체 질환; 고초열; 과민성 쇼크; 내독소 쇼크; 악액질(cachexia); 이상 고열; 육아종증; 또는 유육종증); (2) 위장관계 질환(예를 들어, 충수염; 위궤양; 십이지장 궤양; 복막염; 췌장염; 궤양성, 급성 또는 허혈성 대장염; 담관염; 담낭염; 지방 변증; 간염; 크론병; 또는 휘플씨병); (3) 피부 관련 질환(예를 들어, 건선; 화상; 햇볕 화상; 피부염; 담마진성 사마귀 또는 팽진); (4) 심혈관계 질환(예를 들어, 혈관염; 맥관염; 심내막염; 동맥염; 죽상 동맥경화증; 혈전 정맥염; 심막염; 울혈성 심부전; 심근염; 심근 허혈증; 결절성 동맥 주위염; 재발성 협착증; 버거씨병; 또는 류머티즘열); (5) 호흡기계 질환(예를 들어, 천식; 후두개염; 기관지염; 폐기종(emphysema); 비염; 낭포성 섬유증; 간질성 폐렴; 만성폐쇄성 질환(COPD); 성인 호흡 장애 증후군; 진폐증; 폐포염; 세기관지염; 인두염; 늑막염; 또는 부비강염); (6) 뼈, 관절, 근육 및 결합 조직 관련 질환(예를 들어, 호산성 육아종; 관절염; 관절통; 골수염; 피부근염; 근막염; 패젯병; 통풍; 치주 질환; 류머티즘성 관절염; 중증 근무력증; 강직성 척추염; 또는 윤활막염); (7) 비뇨생식계 질환(예를 들어, 부고환염; 질염; 전립선염; 또는 요도염); (8) 중추 또는 말초 신경계 관련 질환(예를 들어, 알츠하이머병; 수막염; 뇌염; 다발성 경화증; 뇌경색; 뇌색전증; 길레인-바르 증후군(Guillain-Barre syndrome); 신경염; 신경통; 척수 외상; 마비; 또는 포도막염); (9) 바이러스(예를 들어, 인플루엔자; 호흡기 세포 융합 바이러스; HIV; B형 간염 바이러스; C형 간염 바이러스 또는 헤르페스 바이러스) 감염 질환(예를 들어, 뎅기열; 또는 패혈증(septicemia)), 진균 감염 질환(예를 들어, 칸디다증), 또는 박테리아, 기생충과 같은 기타 미생물 감염 질환(예를 들어, 산재성 균혈증; 말라리아; 사상충증; 또는 아메바증); (10) 기타 자가 면역성 질환(예를 들어, 갑상선염; 루푸스; 구드패스츄어 증후군; 동종 이식 거부 반응; 이식편 대 숙주병; 또는 당뇨병); 또는 (11) 암 또는 종양성 질환(예를 들어, 호지킨병)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 같은 질병의 염증성 요소를 치료하는 것은 수십 년간 전 세계 제약 업계의 가장 중요한 목표였고 수많은 유용한 치료법이 개발되어왔다. 그 예는 코르티코스테로이드(프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손, 플루티카손 등을 포함하여 코티솔의 효과를 모의하도록 고안된 다양한 범위의 천연, 반합성 및 합성 제제), 사이클로옥시게나아제 억제제(인도메타신, 설파살라진 및 아스피린 같이 비선택성 또는 콕스-1(cox-1) 선택성 및 더 최근의 셀레콕시브 같은 콕스-2(cox-2) 선택성), (몬테루카스트 같은) 류코트리엔 차단제 및 (탈리도마이드 같은저분자 TNF-α 합성 억제제뿐만 아니라 인플릭시마브(RemicadeTM) 및 아달리무마브(HumiraTm)를 포함하는 개량 모노클로날 중화 항체, 에타너셉트(EnbrelTM)같은 TNF 수용체 융합 단백질과 같은) 항-TNF를 포함한다.
본 발명의 일측면에서는 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에서는 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는　펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.01g/L 내지 1kg/L, 구체적으로 0.1g/L 내지 100g/L, 더 구체적으로 1 g/L 내지 10g/L 의 함량으로 포함할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.
본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 2 내지 서열번호 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 펩티드, 상기 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 1 ng/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 구체적으로는 10 ng/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 더 구체적으로는 0.1 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일, 보다 더 구체적으로는 0.2 ㎍/kg/일 내지 20 ㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에서는 서열번호 2 내지 서열번호 14　중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는　펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 피부 염증의 개선 또는 예방용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일측면에서는 서열번호 2 내지 서열번호 14　중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는　펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 피부 염증의 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 피부 외용제 조성물 또는 화장료 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 화장료 조성물은 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 일측면에 따른 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 또는 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 2 내지 서열번호 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 펩티드, 상기 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 염증 예방 또는 억제용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 10 ng/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 더 구체적으로는 0.1 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일, 보다 더 구체적으로는 0.2 ㎍/kg/일 내지 20 ㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일측면은 일측면에서는 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는　펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드의 염증성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는　펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드 또는 이를 포함하는 조성물을 대상에게 적용하는 것을 포함하는 대상의 염증성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는　펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드 또는 이를 포함하는 조성물 및 펩티드 또는 이를 포함하는 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).
수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는 한, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.
본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어져서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다 .
종양 괴사 인자 (TNF), 특히 TNF－α 는 염증성 세포로부터 방출되어 다채로운 세포 상해 반응, 면역 반응 및 염증 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. TNF－α 는 많은 염증 질환 및 자기 면역 질환의 발증이나 천연화 (遷延化) 에 관여하고, 또한 혈액 중에 방출되어 전신에 작용하면, 중증의 패혈증 및 패혈증성 쇼크를 일으키는 것이 알려져 있다. 이와 같이 TNF－α 는 생체의 면역계에 광범위하게 관련된 인자이기 때문에, TNF－α 를 억제하는 약제의 개발이 활발히 실시되고 있다. TNF－α 는 불활성형으로 생합성되고 프로테아제에 의해 절단되어 활성형이 되지만, 이 활성화에 관여하는 효소는 종양 괴사 인자 변환 효소 (TACE) 로 불리고 있다. 따라서 이 TACE 를 저해하는 물질은 TNF－α 에서 기인되는 질환, 병태, 이상 상태, 상태가 좋지 않음, 좋지 않은 자각 증상 등을 치료, 개선, 예방할 수 있다(KR2011-0060940A).
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 펩티드의 합성 및 항염 활성 측정
실험예 1: 펩티드의 합성
인간 텔로머라제로부터 선별된 서열번호 2 내지 서열번호 14의 펩타이드를 합성하였다.
펩티드들은 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫 번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Ala-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin
펩타이드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.
커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩타이드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H2O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.
아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
서열번호 １의 Pep 1(EARPALLTSRLRFIPK)을 예로 들어 구체적인 합성 과정을 설명하면 다음과 같다.
1) 커플링
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc 탈보호
20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩타이드 기본 골격 NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin을 만들었다.
4) 절단(Cleavagge): 합성이 완료된 펩타이드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩타이드를 레진에서 분리하였다.
5) 얻어진 mixture에 Cooling diethyl ether를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩타이드를 침전시킨다.
6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 파우더로 제조하였다.
서열번호 2 내지 서열번호 14의 펩티드를 합성하는 방법은 상기 서열번호 1의 펩티드를 합성하는 방법과 같은 방법을 사용하되, 붙여주는 아미노산을 달리하였다.
실험예 2 :TNF α 저해 활성 검증
실험예 2-1 : 세포주 배양
건강한 사람에게서 혈액을 채혈 (50 ml)한 후 Biocoll Separating Solution (Biochrom AG, Berlin, Germany)를 사용하여 PBMC (peripheral blood mononuclear cells) 층을 회수하였다. 회수된 PBMC는 사람의 혈청 (20%)이 첨가된 RPMI 1640 배지에 부유하여 30분 가량 사람의 혈청을 코팅한 100-mm 폴리스티렌(polystyrene) 세포 배양 플레이트에 옮겨 2시간 가량 37℃, 5% 배양기에서 2시간 배양하였다. 그 후 바닥에 붙은 모노사이트(monocytes)들을 차가운 PBS로 떼어낸 후 24 웰 플레이트(well plate)에 웰 당 2 x 105 셀이 되도록 RPMI 1640 배지 (supplemented with penicillin-streptomycin; 100 mg/ml, human serum; 20%)에 부유시켜 실험하기 하루 전에 배양시켜 놓았다.
실험예 2-2: 사이토카인 분석(Cytokine assay)
서열번호 2 내지 서열번호 14의 각 펩티드들이 TNF-α에 대해 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 ELISA 실험을 수행하였다.
PBMC에서 유래한 모노사이트(monocytes)를 100ng/mL PMA와 함께 처리하여 24－웰 플레이트에 웰 당 2 x 105 셀이 되도록 실험 하루 전에 배양시켰다. 그 후 LPS (lipopolysaccharide; 10 ng/ml, Sigma)를 2 시간 처리하고 PBS로 두 번 씻어내었다. 이　후　OPTI-MEM 배지(Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에 넣어 1 시간 동안 배양하였고， 그 후 OPTI-MEM에 서열번호 2 내지 서열번호 14의 각 펩티드를 0.1, 1μM로 각 well에 처리한 후 1시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 배지를 모아서 -80℃에 보관하고 이를 ELISA (R＆D, Minneapolis, MN, USA) 키트 매뉴얼에 따라 TNF-α를 정량하였다. 구체적인 정량방법은 다음과 같다.
TNF 측정은 샌드위치(sandwich) ELISA법을 이용한다. 미리 코팅되어 있는 24 웰 플레이트에 TNFα primary antibody를 100ul 씩 넣고 4℃에서 overnight 한다. 다음날 0.5% tween 20 워시 용액으로 5분씩 3회 세척한 후 측정할 샘플과 standard 용액을 100ul씩 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시킨다. 상기와 같이 wash한 후 HRP-conjugated secondary antibody를 각 100 ul씩 넣고 2시간동안 상온에서 반응시킨다. 이후 다시 wash하고 avidin/biotin을 첨가하여 발색시켜 흡광도를 측정한다. Standard의 흡광도로부터 표준곡선을 구하고 이를 이용하여 각 샘플의 흡광도로부터 TNFα 의 양을 정량한다.
세포 배양액의 TNF-α 레벨을 ELISA로 측정한 결과, LPS만을 처리한 비교군에 비해 서열번호 2 내지 서열번호 14의 펩티드가 사용된 각각의 펩티드 농도 또는 어느 한 농도에서 TNF- α의 레벨을 감소시킴을 확인하였다. (도 1 내지 도 13)
참고로 기출원된 서열번호 1의 펩티드 역시 세포 배양액의 TNF-α 레벨을 ELISA로 측정한 결과, LPS만을 처리한 비교군에 비해 사용된 두 가지의 농도 모두에서 TNF- α의 레벨을 감소시킴을 확인하였다. (도 14)

Claims (19)

  1. 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편인 펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 구성된 펩티드.
  4. 제1항에 있어서. 상기 펩티드는 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  5. 제1항에 있어서. 상기 펩티드는 인간의 텔로머라제로부터 유래된 것인 펩티드.
  6. 항염증 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서,
    서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 펩티드는 인간의 텔로머라제로부터 유래된 것인 폴리뉴클레오티드.
  9. 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
    상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 구성된 것인 항염증 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 항염증 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 펩티드는 인간의 텔로머라제로부터 유래된 것인 항염증 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방용인 항염증 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 피부 염증의 개선 또는 예방용 화장료 조성물인 항염증 조성물.
  15. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학조성물인 항염증 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 염증성 질환은 (1) 전신 또는 국소 염증 질환(예를 들어, 알레르기; 면역 복합체 질환; 고초열; 과민성 쇼크; 내독소 쇼크; 악액질(cachexia); 이상 고열; 육아종증; 또는 유육종증); (2) 위장관계 질환(예를 들어, 충수염; 위궤양; 십이지장 궤양; 복막염; 췌장염; 궤양성, 급성 또는 허혈성 대장염; 담관염; 담낭염; 지방 변증; 간염; 크론병; 또는 휘플씨병); (3) 피부 관련 질환(예를 들어, 건선; 화상; 햇볕 화상; 피부염; 담마진성 사마귀 또는 팽진); (4) 심혈관계 질환(예를 들어, 혈관염; 맥관염; 심내막염; 동맥염; 죽상 동맥경화증; 혈전 정맥염; 심막염; 울혈성 심부전; 심근염; 심근 허혈증; 결절성 동맥 주위염; 재발성 협착증; 버거씨병; 또는 류머티즘열); (5) 호흡기계 질환(예를 들어, 천식; 후두개염; 기관지염; 폐기종(emphysema); 비염; 낭포성 섬유증; 간질성 폐렴; 만성폐쇄성 질환(COPD); 성인 호흡 장애 증후군; 진폐증; 폐포염; 세기관지염; 인두염; 늑막염; 또는 부비강염); (6) 뼈, 관절, 근육 및 결합 조직 관련 질환(예를 들어, 호산성 육아종; 관절염; 관절통; 골수염; 피부근염; 근막염; 패젯병; 통풍; 치주 질환; 류머티즘성 관절염; 중증 근무력증; 강직성 척추염; 또는 윤활막염); (7) 비뇨생식계 질환(예를 들어, 부고환염; 질염; 전립선염; 또는 요도염); (8) 중추 또는 말초 신경계 관련 질환(예를 들어, 알츠하이머병; 수막염; 뇌염; 다발성 경화증; 뇌경색; 뇌색전증; 길레인-바르 증후군(Guillain-Barre syndrome); 신경염; 신경통; 척수 외상; 마비; 또는 포도막염); (9) 바이러스(예를 들어, 인플루엔자; 호흡기 세포 융합 바이러스; HIV; B형 간염 바이러스; C형 간염 바이러스 또는 헤르페스 바이러스) 감염 질환(예를 들어, 뎅기열; 또는 패혈증(septicemia)), 진균 감염 질환(예를 들어, 칸디다증), 또는 박테리아, 기생충과 같은 기타 미생물 감염 질환(예를 들어, 산재성 균혈증; 말라리아; 사상충증; 또는 아메바증); (10) 기타 자가 면역성 질환(예를 들어, 갑상선염; 루푸스; 구드패스츄어 증후군; 동종 이식 거부 반응; 이식편 대 숙주병; 또는 당뇨병); 및 (11) 암 또는 종양성 질환(예를 들어, 호지킨병)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  17. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 염증의 개선 또는 예방을 위한 식품조성물인 항염증 조성물.
  18. 제9항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 항염증 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  19. 서열번호 2 내지 서열번호 14 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드 또는 이를 포함하는 조성물; 및 펩티드 또는 이를 포함하는 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 키트.
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