KR102098462B1

KR102098462B1 - αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체

Info

Publication number: KR102098462B1
Application number: KR1020180029659A
Authority: KR
Inventors: 장기육; 홍관수; 박효은; 김은민; 박은혜; 김찬우; 강권윤; 이현승; 김현민
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2018-03-14
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2020-04-08
Also published as: KR20190108308A; KR102098462B9

Abstract

본 발명은 α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다. 본 발명의 α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체는 종래 항체와 비교하여 신생 혈관과 관련된 α_vβ₃ 인테그린에 높은 결합력, 우수한 조직 침투성 및 생체 안정성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 단일 도메인 항체는 형광 입자와 결합하여 in vitro, in vivo 또는 ex vivo 상에서 간단하게 측정 가능하여, 신생 혈관 검출 및 이와 관련된 질환 진단에 효과적이므로, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체{Single-domain antibody targeting alpha-v beta-3 integrin}

본 발명은 α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다.

인테그린(Integrin)은 세포 부착 및 이동, 분화, 증식 등과 같은 세포의 중요한 생리작용을 조절하는 세포 표면수용체이다. 인테그린은 α와 β 서브 유닛이 비 공유 결합으로 이루어진 헤테로다이머로 작용하며, α와 β 서브 유닛이 쌍을 이루어 22가지의 인테그린 패밀리를 구성하고 있다. 인테그린은 주로 비브로넥틴, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, vWF, 피브리노겐 등의 세포외 메트릭스 단백질에 결합하나, 인테그린의 종류별로 리간드 특이성에 차이가 있으며, 한 종류의 인테그린이 여러 가지 리간드에 동시에 결합할 수 있다. 이 중, 인테그린 α_vβ₃는 피부암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 폐암, 담낭암, 췌장암, 위암을 포함하는 다양한 암들 중 대부분의 공격적인 종양 세포들에서 발현되며, 부착에 의존적인 종양 세포의 성장, 생존과 침투를 조절하여, 다양한 인간 종양들의 악성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 최근에는 β 인테그린이 세포 내 신호 전달을 조절하여 부착에 독립적인 매개체로서 종양의 성장 및 전이를 증가시킨다는 것이 밝혀지기도 하였다 (David A Cheresh et al., Nature Medicine 2009, 15 (10): 1163). 또한, 상기 α_vβ₃인테그린은 신생 미세혈관에서 많이 발현됨이 알려져 있다.

혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 혈관으로부터 새로운 모세혈관이 만들어지는 것을 뜻한다. 정상적인 생리조건에서는 거의 일어나지 않는 엄격히 조절되는 현상이나 수정란 발생과정에서 배아가 발달될 때와 성인의 경우 상처가 치유될 때 그리고 여성의 생식주기에서 생식기계통의 변화 등에서 일어난다. 성인의 경우 모세혈관의 내피세포는 상대적으로 잘 분열하지 않으며 분열속도는 보통 수개월 내지 수년이다. 혈관신생은 여러 종류의 세포와 수용성 인자 및 세포외 기질(extracellular matrix) 성분과의 상호작용에 의한 복잡한 과정으로 일어나며 아직 그 작용기작은 완전히 규명되어 있지 않다. 상기 혈관신생은 여러 질병의 원인이 되고 있다.

현재 상업적으로 이용 중인 항체들은 300,000개 이상이라고 보고되어 있지만 주로 고정화된 세포 내에서만 관찰이 가능하며 이러한 점들 때문에 실시간으로 세포 내에서 단백질의 접힘이나 단백질들 간의 상호작용 등을 관찰할 수 없었다. 또한 기존의 항체들은 너무 크거나 화학적으로 불안정하여 살아있는 세포 내에서 유용하게 사용될 수 없었다. 그러나 1993년에 Hamers-Casterman에 의해 낙타과 동물에서 유래한 항체는 기존의 항체(두개의 중쇄(heavy chain)와 두 개의 경쇄(light chain))와는 다른 구조인 중쇄로만 항체가 구성되어 있지만 기능적으로 완전한 항체역할을 하는 단일 도메인 항체가 보고(Hamers-Casterman, C. et al. 1993. Nature 363:446-448)되었다. 기존의 항체들은 150kDa, 재조합 항체들은 25~50kDa이나 낙타, 라마, 상어에서 유래한 단일 도메인 항체는 12~13kDa으로 가장 작은 크기의 항체여서 세포 내로 쉽게 이동이 가능하며(Cortez-Retamozo, V. et al. 2004. Cancer Res. 64:2853-2857,) 유전적 조작이 용이하여 세균과 효모에서 쉽게 발현이 되는 장점이 있다(Arbabi-Ghahroudii, M. et al. 1997. FEBS Lett. 414:521-526). 또한, 단일 도메인 항체는 높은 수용성이며 극도의 pH조건, 90℃?까지의 온도 조건에서도 안정적인 특징이 있다(Dumoulin, M. et al. 2002. Protein Sciii.11:500-515, Dumoulin, M. et al. 2003. Nature 424:783-788).

본 발명의 목적은 α_vβ₃ 인테그린(Integrin) 표적 단일 도메인 항체(Single-domain antibody)을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 제조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 신생혈관 형성 검출용 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 신생혈관 형성 검출용 키트를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체의 제조 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 신생혈관 형성 관련 질환의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공할 수 있다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 코딩되는, α_vβ₃ 인테그린(Integrin) 표적 단일 도메인 항체(Single-domain antibody)를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (1) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (2) 상기 미생물에서 α_vβ₃ 인테그린에 대한 단일 도메인 항체를 발현시키는 단계;를 포함하는,αvβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체의 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (1) 검체로부터 분리된 생물학적 시료 또는 동물 모델에 분석하고자 하는 후보 약물을 처리하는 단계; (2) 상기 시료에 상기 α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 α_vβ₃ 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 (2)의 단백질의 수준이 대조군과 비교하여 억제 또는 증진된 후보 약물을 선발하는 단계를 포함하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 생물학적 시료에 상기 α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 α_vβ₃ 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 α_vβ₃인테그린 단백질의 수준을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체는 종래 항체와 비교하여 신생 혈관과 관련된 α_vβ₃인테그린에 높은 결합력, 우수한 조직 침투성 및 생체 안정성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 단일 도메인 항체는 형광 입자와 결합하여 in vitro, in vivo 또는 ex vivo 상에서 간단하게 측정 가능하여, 신생 혈관 검출 및 이와 관련된 질환 진단에 효과적이므로, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 단일 도메인 항체 발현 카세트의 증폭을 위하여, 1차 PCR 증폭을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 단일 도메인 항체 발현 카세트의 증폭을 위하여, 2차 PCR 증폭을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 절단된 단일 도메인 유전자의 단편을 확인한 도이다.
도 4는 절단된 파지미드의 단편을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 단일 도메인 항체 클론의 유전자 삽입 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a 내지 6i는 단일 도메인 항체 클론 20개의 DNA 시퀀싱을 수행한 결과 및 이를 정렬한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 α_vβ₃인테그린 표적 효능 확인을 위해 사용된 α_vβ₃인테그린 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 8a 내지 6c는 ELISA 수행 후 강한 양성을 보이는 클론의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 9는 단일 도메인 항체 클론 중 VHH-13, VHH-22 및 VHH-25의 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 10a는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25을 발현 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25)을 나타낸 도이다.
도 10b는 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25을 발현 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25K1)을 나타낸 도이다.
도 11a는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-13의 reduced SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-22의 reduced SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 11c는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25의 reduced SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 11d는 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25의 reduced SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 암세포에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 α_vβ₃ 인테그린 표적 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 종양 부위에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 α_vβ₃인테그린 표적 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 동맥경화 부위에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 α_vβ₃ 인테그린 표적 효과 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 코딩되는, α_vβ₃ 인테그린(Integrin) 표적 단일 도메인 항체(Single-domain antibody)를 제공한다.

본 발명의 용어 "α_vβ₃인테그린(Integrin)"은, 인테그린은 세포 표면에 존재하여 피브로넥틴, 콜라겐 등의 세포외 기질에 세포가 접착할 때 작용하는 수용체 분자이다. α, β 두 소단위의 헤테로 2합체로 구성되는 막관통형 당단백질이며 지금까지 21개 유형의 인테그린의 존재가 밝혀져 있다. 그 중, α_vβ₃ 인테그린은 심혈관계나 골조직의 구조유지에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다.

본 발명의 용어 "단일 도메인 항체(Single-domain antibody)"는 CDR이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체이며, 중쇄 항체, 경쇄가 자연적으로 없는 항체, 종래의 4-쇄 항체에서 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체에서 유래된 것 외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함한다. 4-쇄 면역글로불린의 VH와 구별하기 위하여 VHH(variable region of a heavy chain antibody), 나노바디(nanobody) 또는 sdAb로 불린다.

본 발명의 단일 도메인 항체는 경쇄가 자연적으로 없는 중쇄에서 유래되는 자연 발생 단일 도메인 항체로서, α_vβ₃인테그린에 대한 특이 항체로서, 약 14-15KDa의 분자량을 갖는다. 본 발명의 단일 도메인 항체는 카멜리대(Camelidae)에서 유래된 VHH인 항체이고, 낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카 및 야생라마에서 유래될 수 있으며, 신생혈관과 관련된 α_vβ₃인테그린 표적하기 위한 목적을 달성하기 위해서는 카멜리대 외의 다른 종이 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체로 생산 가능하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 단일 도메인 항체는 IgG 분자보다 약 10배 더 작으며, 이들은 단일 폴리펩티드로서 매우 안정하여 극한 pH와 온도 조건에서도 안정적이다. 또한, 이들은 종래의 항체와는 달리 프로테아제의 작용에 대해 내성을 갖으며, 생체외 발현 시, 높은 수율로 대량 생산이 가능하다.

상기 단일 도메인 항체는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하며, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 또한, 서열번호 1, 2 또는 3에 His6 tag가 포함된 아미노산 서열은 각 서열번호 14, 15 및 16의 아미노산으로 표시될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 낙타에 마우스와 사람에서 cross reactivity를 갖는 재조합 ανβ3 인테그린을 표적 단백질을 주사하여 면역화 시켰다. 이후, 낙타의 혈액에서 분리한 말초임파구(pheripheral lymphocyte)에서 mRNA를 분리 정제하여 cDNA를 합성하였다. 항체 heavy chain-only 항체의 variable domain (VHH)들을 PCR로 증폭시킨 후. M13 bacteriophage gene에 클로닝하였다. immobiized immunogen (phosphatidylserine)을 이용한 파지 디스플레이(phage display)를 시행하여 고정된(immobilized) 항원에 특이적으로 반응하는 파지 클론을 선발하였다.

상기 파지 클론 중에서 40개의 클론 시퀀스를 분석한 결과 10개의 후보군의DNA 시퀀스를 확인하였다. 이 중, 20개의 DNA 시퀀스는 도 6a 내지 6i에 나타내었다. 이 중, 10개의 군에서 높은 반응을 보이는 클론 14, 11, 29, 17, 15, 28, 12, 19, 13, 21, 27, 16, 18, 20, 30, 23, 24, 25, 22, 26을 선발하였고, 이의 아미노산 서열은 도 8a 내지 8c에 나타내었다. 강한 양성을 보이는 클론 VHH-25, VHH-13, VHH-22, VHH-11, VHH-17, VHH-15, VHH-12, VHH-16, VHH-20, VHH-23의 염기서열을 각각 서열번호 1 내지 10으로 나타내었다. 그 중, VHH-25, VHH-13, VHH-22의 아미노산 서열을 각 서열번호 11, 12 또는 13으로 나타내었다.

상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 단일 도메인 항체를 구성하는 단백질을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 본 발명의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다

본 발명의 단일 도메인 항체는, α_vβ₃인테그린을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

상기 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

본 발명의 단일 도메인 항체는 기능성 분자 또는 원소가 추가적으로 결합될 수 있고, 상기 기능성 분자는 무기입자, 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 방사선 동위 원소 및 지질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상 일 수 있다.

상기 무기 입자는 형광 마커 또는 염색 물질이고, GFP(Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), BFP(Blue fluorescent protein), CFP(Cyan fluorescent protein), 아크리딘 염료(Acridine dyes), 사이아닌 염료(Cyanine dyes), 불소 염료(Fluorone dyes), 옥사진 염료(Oxazine dyes), 페난트리딘 염료(Phenanthridine dyes) 및 로다민(Rhodamine dyes)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 방사선 동위 원소는 ¹⁸F(불소), ¹¹C(탄소), ¹⁵O(산소), ¹³N(질소), ⁸⁹Zr(지르코륨), C¹⁵O, ¹³N(암모니아), H₂ ¹⁵O 및 ¹⁸FDG(F-Deoxy Glucose)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화학물질은 신생 혈관과 관련된 질환을 억제하는 물질로서, 이와 관련된 질환을 억제하는 화학 물질은 제한없이 본 발명의 단일 도메인 항체와 결합할 수 있다. 예컨대, 신생혈관억제제, 항암제, 죽상동맥경화 억제제 등과 같은 화학물질일 수 있다.

상기 신생혈관억제제로서 예를 들어, 아바스틴, 이트라코나졸, 카복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole), 수라민(suramin), SU5416, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib), 파조파닙(pazopanib), 에버롤리무스(everolimus) 및 이들의 혼합물이나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항암제로서, 예를 들어, 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5'-플루오로우라실, Fluosol, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁솔 및 이들의 혼합물이나, 이에 한정되지 않는다.

기능성 분자로서 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 특별하게 제한되지 않으며, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는, 본 발명의 단일 도메인 항체에 추가적으로 결합되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A(dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRHII(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin), 지코노타이드, 리신, 리신 A 사슬, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 아브린(abrin), 아브린 A 사슬, 코브라 베놈 인자, 겔로닌(gelonin), 사포린(saporin), 모데신(modeccin), 볼켄신(volkensin), 비스쿠민(viscumin), 클로스트리듐 페르프링겐스 포스포리파제 C 및 보바인 췌장 리보뉴클레아제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 단일 도메인 항체에 결합되는 기능성 분자가 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 경우에 이용되는 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연하게 연장된 구조에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재, 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 파지미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함되며, 바람직하게는 파아지미드 벡터 또는 플라스미드 벡터이다.

상기 재조합 벡터는 도 10a 또는 도 10b의 벡터맵으로 표시할 수 있고, 구체적으로, 도 10a는 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25을 발현 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25)을 나타내고, 도 10b는 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 단일 도메인 항체 VHH-25을 발현 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25K1)을 나타내며, 본 발명의 단일 도메인 항체 발현 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 단일 도메인 항체를 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C.(1984), J. Bacteriol., 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.(1980), Ann. Rev. Genet., 14:399-445)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파아지미드(예: pComb3X), 파아지 (예: λgt4·B, λ-Charon 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 사 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며, 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 E. coli이고 보다 바람직하게는 E.coli ER2537, E. coli ER2738, E. coli XL-1 Blue, E. coli BL21(DE3), E. coli JM109, E. coli DH 시리즈, E. coli TOP10, E. coli TG1 및 E. coli HB101이다. 본 발명에서는 E. coli 을 이용하여 단일 도메인 항체를 과발현 시켜 적은 비용으로 대량 생산이 가능하다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114; 및 Hanahan, D.(1983), J. Mol. Biol., 166:557-580) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al.(1988), Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145) 등에 의해 실시될 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 단일 도메인 항체를 수득할 수 있다.

본 발명에서 용어, "검출"은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용하여 실시할 수 있다. 표지체의 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 또는 방사성 동위원소를 포함한다. 검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I 및 ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

본 발명의 키트는 본 발명의 단일 도메인 항체뿐만 아니라, 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액, 각 반응단계에 사용할 세척액, 효소반응 정지용액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 신생 혈관 형성 관련 질환은 동맥경화증, 암, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 각막 궤양, 원추 박막, 황반 변성, 쇼그렌 증후군, 근시안과 종양, 각막이식 거부반응, 이상 창상 유합, 트라코마(trachoma), 골질환, 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염, 패혈증성 관절염, 혈관종(hemangiomas), 섬유성 혈관종(angiofibroma), 건선(psoriasis), 화농성 육아종(pyogenic granuloma), 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손성에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열증, 염증성 장질환, 치근막질환, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부 노화, 갑상선 과증식 및 그레이브스병(Grave's disease)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 동맥경화증 또는 암이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 암은 담관암, 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 융모암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 다발성 골수종, AIDS-관련 백혈병 및 성인 T-세포 림프종/백혈병, 상피내암, 간암, 폐암, 림프종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 피부암, 고환암, 갑상선암 또는 신세포암이고, α_vβ₃ 인테그린이 발현된 암이라면 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은 (1) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (2) 상기 미생물에서 α_vβ₃ 인테그린에 대한 단일 도메인 항체를 발현시키는 단계;를 포함하는, α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.

상기 미생물은 통상의 배지에서 생육 가능하며, 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한 본 발명은 (1) 검체로부터 분리된 생물학적 시료 또는 동물 모델에 분석하고자 하는 후보 약물을 처리하는 단계; (2) 상기 시료에 상기 α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 α_vβ₃ 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 (2)의 단백질의 수준을 대조군과 비교하여 억제 또는 증진을 유도한 후보 약물을 선발하는 단계를 포함하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 생물학적 시료에 상기 α_vβ₃인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 α_vβ₃ 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 α_vβ₃ 인테그린 단백질의 수준을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 단일 도메인 항체는 기능성 분자와 결합 시, 신생혈관 형성 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 제공할 수 있으며,

본 발명의 약학 조성물에는 단일 도메인 항체 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 단일 도메인 항체 의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 낙타에서 면역 반응 유도 및 혈청 정량

<1-1> 낙타에서 면역 반응 유도

인간 또는 마우스에서 교차 활성을 갖는 재조합 α_vβ₃ 인테그린(intergrin) 단백질을 이용하여 이를 낙타에 접종한 후 면역 반응을 유도하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 2mg/ml 인간 α_vβ₃ 인테그린 ITGAVB3을 항원으로 하여, 1mg/ml PBS에 미리 혼합하고, 4℃에서 EP 튜브 당 800ul에 나누어 넣었다. 어주번트로서 처음에는 완전 프로이드 어주번트(Complete Freund's Adjuvant, CFA) (Sigma)를 사용하고, 이후 불완전 프로이드 어주번트(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)(Sigma)를 이용하였으며, 상기 항원 및 어주번트를 완전히 혼합하여 안정적인 에멀젼(emulsion)을 제조하였다. 낙타(Camelus bacterianus)의 등 주변에 피하 투여하였다. 그 후, 1차 면역은 채취한 혈액 2 ml(1 ml의 면역 전 혈청에서 채취)를 완전 프로이드 어주번트(CFA)와 600㎍ 항원 혼합/낙타로 혼합하여 면역을 유도하였다. 부스트(Boost) 면역은 불완전 프로이드 어주번트(IFA)로 600㎍ 항원 혼합/낙타로 면역을 유도하였으며, 2주 간격으로 총 4번에 걸쳐 수행하였고, 4번째 부스터 면역 수행 15일후에 50ml의 혈액을 채취하였다.

<1-2> 면역유도된 낙타의 혈청 역가(titer)

상기 실시예 1-1의 면역 유도된 낙타의 혈청의 역가를 확인하기 위하여 ELISA를 하기와 같이 수행하였다.

4번째 부스터 면역을 수행한 다음날 혈청 역가를 측정하였으며, 100uL의 표적 단백질(10uL 항원을 포함하는 코팅 버퍼)을 코팅하고 4도에서 밤새 배양하였다. 세척 버퍼(PBST, 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS)로 2회 동안 세척한 후, 350 μL 블로킹 버퍼(PBSM, 4% 우유를 포함하는 PBS)를 이용하여 웰을 블로킹하고 2시간 동안 실온에 두었다. 그 후, 블로킹 버퍼를 털어 내고 세척 버퍼를 이용하여 5회 동안 세척하면서, 페이퍼 타올의 깨끗한 면에 플레이트를 두었다. 100 μL 희석한 혈청을 추가하여 1시간 동안 실온으로 배양하고 세척 버퍼로 5회 세척하였다. 토끼 항-낙타 IgG pAb-HRP를 PBS와 함께 희석하고, 웰 당 100 μL 희석된 항체를 첨가한 후, 1시간 동안 실온에 배양하였다. HRP(horseradish peroxidase) 기질 용액을 다음과 같이 준비하였다: OPD(o-phenylenediamine)의 스톡(stock) 용액은 100 mL의 50 mM 구연산 나트륨, pH 4.0를 포함하여 22 mg OPD (Sigma)를 용해하여 준비하였다. 필터를 소독하고 4도에서 보관한 후, 검출 단계 전에 21 mL OPD 스톡 용액에 36 uL 30% H₂O₂을 첨가하였다. 100 uL 기질 용액을 웰 당 추가하고 30분 동안 실온에서 배양하였다. 490nm로 설정된 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 각 플레이트를 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-1의 면역 유도된 낙타의 혈청은 1/12800의 역가가 나타남을 확인하였다. 따라서, 혈청 역가를 측정한 다음날 마지막 부스터 면역을 수행하고 그 다음날의 말초 혈액 백혈구(PBLs, peripheral blood leukocytes)를 수득하고, 이를 RNA 추출 및 cDNA 분석에 이용하였다.

Dilution	Coating:A5B3
1/400	1.399
1/800	1.052
1/1600	0.714
1/3200	0.416
1/6400	0.262
1/12800*	0.156*
1/25600	0.1
1/51200	0.126
PBS	0.078
[*]: the end titer
a. Coating: A5B3, 0.5 ug/well
b. 1st Ab: antisera
c. 2nd Ab: HRP-rabbit anti-camel IgG

<실시예 2> 단일 도메인 항체의 유전자 증폭 및 유전자 라이브러리 생성

<2-1> 분리된 말초 혈액 백혈구(PBLs)의 RNA 분리 및 cDNA 합성

본 발명의 단일 도메인 항체의 유전자 증폭을 위하여, 분리된 말초 혈액 백혈구(PBLs)의 RNA 분리 및 cDNA 합성을 하기와 같이 수행하였다.

구체적으로, 피콜-하이팩(Ficoll Hypaque)기법을 이용하여 밀도 구배 원심 분리로 상기 실시예 1-1의 면역을 유도한 낙타의 혈액에서 말초 혈액 백혈구(PBLs)을 분리하였다. 총 RNA는 Trizol 방법으로 제조사의 프로토콜에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 펠렛을 건조시키고 100ul DEPC-처리된 물에 용해시킨 후, RT-PCR에 이용하였다.

2ul dNTP mix (Pharmacia, 25 mM 각 dNTP), 2ul Oligo-dT 프라이머(200 pMol), 5ul Super RT 버퍼 및 26.5ul DEPC-처리된 물을 포함하는 RNase-free 0.5 ml 반응 혼합액을 준비하였다. 이 후, 상기 튜브에 분리한 10ul RNA(1.5ug까지의 mRNA 포함)를 첨가하여 혼합하여 피펫팅하였다. 상기 혼합액에 미네랄 오일(Sigma)을 한방울 떨어뜨리고 2차 구조를 파괴하기 위하여 thermocycler (Biometra, Trio Thermoblock)에 67도로 5분간 가열하였다. 그 후, 42도로 식힌 후, 2ul RNAsin(Promega) 및 2.5ul Super RT(HT Biotechnology Ltd, Cambridge, UK)을 추가하여 1시간도 42도로 배양한 후, 100도에서 3분간 열을 가하였다(멸군 바늘로 구멍을 뚫음). 그 후, 단일-가닥 cDNA를 포함하는 생성물을 원심분리한 후, -20도에 보관하였다.

<2-2> 본 발명의 단일 도메인 항체 발현 카세트의 증폭

상기 2-1에서 합성한 cDNA를 UV 분광법으로 정량하였다. VH-CH1-FC/VHH-FC 유전자의 증폭을 위하여, FC 다운스트림(downstream) 프라이머, VH/VHH-FR1 업스트림(upstream) 프라이머 및 200배 희석된 상기 2-1에서 합성한 cDNA를 주형으로 사용하여, VH-CH1-FC/VHH-FC 유전자의 1차 PCR 증폭을 수행하였다. 약 600bp의 상기 1차 PCR 증폭된 DNA 밴드를 모으고, Qiagen Kit를 이용하여 정제하는 Gel purification 과정을 수행하였다. 이 후, VHH 유전자의 증폭을 위하여, VHH-FR4 다운스트림 프라이머, VHH-FR1 업스트림 프라이머 및 상기 정제된 DNA를 이용하여 2차 PCR 증폭을 수행하였다. 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 1차 PCR 증폭을 수행한 결과, 약 600bp 및900bp 의 밴드가 나타남을 확인하였다.

또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 2차 PCR 증폭을 수행한 결과, 약 600bp에서 증폭된 본 발명의 단일 도메인 항체의 DNA 밴드를 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 본 발명의 단일 도메인 항체 라이브러리 제작

상기 실시예 2에서 제작된 단일 도메인 항체 유전자 라이브러리로부터 α_vβ₃ 인테그린을 인지하는 항체의 선택 및 검색은 파지 디스플레이 방법을 사용하여 실시하였고, 단일 도메인 항체 클론 라이브러리를 제작하였다.

<3-1> 본 발명의 단일 도메인 항체 유전자의 파지미드(phagemid)로 삽입 및 형질전환

본 발명의 단일 도메인 항체 유전자 및 파지미드를 절단하고, 절단된 유전자를 파지미드에 삽입한 후, E.coli TG1에 형질전환 시키기 위하여 다음과 같이 수행하였다. 상기 2-2에서 수득한 2차 PCR 생성물 및 pDisplay-3M^TM을 BssHⅡ 및 NheI로 절단하고 Qiagen kit로 동시에 정제하였다. 이 후, DNA 단편을 NEB's T4 DNA ligase를 사용하여 라이게이션한 후, 상기 생성물을 E.coli TG1 세포로 전기-변형하여 형질전환 시켰다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 파지미드 삽입을 위해 절단된 단일 도메인 유전자와, 단일 도메인 항체 유전자를 클로닝하기 위해 절단된 파지미드의 gel-electrophoresis를 확인한 결과, 각 밴드가 뚜렷히 나타남을 확인하였다.

<3-2> 파지 패키징 및 라이브러리 준비

상기 3-1에서 형질전환된 E.coli TG1을 M13K07 헬퍼 파지에 감염시키고, 항원에 특이적으로 결합하는 파지를 증가시키기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.

M13K07 헬퍼 파지를 준비하기 위하여, 지수-증식기(log-phase) TG1 세포와 M13K07 파지를 상이한 희석액으로 30분간 37도의 조건으로 감염시키고, 2TY 플레이트의 한천에 접종하였다. 상기 3 mL 액체 2TY 배지에 작은 플라크(plaque)를 접종하여 배양한 후, 30 μL의 밤새 배양한 TG1 세포를 추가하고 2시간 동안 37도로 배양하였다. 1L 2TY 배지의 배양액을 희석하고 1시간 동안 배양시킨 후, 50㎍/mL 카나마이신을 추가하여 16시간, 37도 조건으로 배양하였다. 원심분리(10분, 5000g)를 수행하여 세포를 제거하고, 0.25 부피의 파지 침전물을 추가하여, 상등액으로부터 파지를 침전시켰다. 얼음에 30분 동안 배양한 후, 원심분리(10분, 5000g)를 수행하여 파지 입자를 수득하였다. 5 mL PBS로 펠렛을 재부유한 후, 0.22-㎛의 필터를 통과시켰다. 100μL TG1(포화된 배양)를 포함하는 상단-아가층을 2TY 플레이트 상의 팔르크-형성 단위(plaque-forming units (pfu))의 수를 세어 헬퍼 파지를 확인하였다. 1Х10¹³ pfu/mL가 되도록 파지 스톡 용액을 희석시킨 후, -20도에 저장하였다.

또한, 라이브러리 파지를 준비하기 위하여, 라이브러리 글리세롤 스톡과 500 mL 2TY-G를 배양하고 600 nm에서 광학 농도가 0.8-0.9에 도달 할 때까지 250 rpm으로 진탕하면서 37도에서 배양하였다. 최종 농도가 5×10⁹ pfu/mL가 되도록 M13KO7 헬퍼 파지를 첨가하고 37도에서 30분 동안 진탕하지 않고 배양한 후, 적당히 진탕(200 rpm)하여 30분 동안 파지 감염을 수행하였다. 이 후, 2200g에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 회수하고 같은 양의 2TY-AK에서 펠렛을 재현탁하였다. 빠른 진탕(300 rpm)을 수행하여 30도에서 밤새 배양하였다. 4도, 15분, 7000g 조건으로 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 파지가 담긴 상등액을 미리 냉각한 1L 병에 수득하였다. 이 후, 0.3 부피의 파지 침전제를 첨가하여 혼합한 후얼음 상에서 파지가 1시간 동안 침전 되도록 하였다. 이 후, 4 도, 15분, 7000g조건으로 2회 원심 분리하여 파지를 펠렛화 하였다. 상등액을 제거하고 8mL PBS로 펠렛을 재현탁하였다. 이 후, 10분, 12,000g로 파지를 원심 분리하고 상등액을 통해 파지를 회수하였다. 마지막으로, 파지 스톡 희석액을 TG1 세포에 감염시켜 2TY-AG에 플레이팅하여 배양한 후, 나타나는 암피실린 내성 콜로니의 수를 확인하였다. 상기 과정을 거쳐 본 발명의 단일 도메인 라이브러리를 구축하였으며, 이의 역가를 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단일 도메인 항체 라이브러리는 5.16×10¹³ pfu/mL의 역가가 나타남을 확인하였다.

<3-3> 본 발명의 단일 도메인 항체 라이브러리에서 유전자 삽입 여부 확인 및 DNA의 정렬

상기 3-2에서 선발한 본 발명의 단일 도메인 라이브러리에서 대표적인 10개의 클론을 선발하여, QC colony PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 10개의 클론 중 9개의 클론은 약 600bp임을 확인하여, 본 발명의 단일 도메인이 올바르게 삽입되어 있는 것임을 확인하였다.

상기와 같은 과정을 통하여, 라이브러리에서 본 발명의 단일 도메인이 올바르게 삽입되어 있는 20개의 클론에 대한 DNA 시퀀싱을 수행하였다. S6 다운스트림 프라이머를 이용하였고, 이를 정렬하였다. 그 결과를 도 6a 및 도 6i에 나타내었다.

도 6a 및 도 6i에 나타낸 바와 같이, 20개의 클론은 다양성이 나타남을 확인하였다.

<실시예 4> 패닝(panning)에 의한 특이적인 항체 선별

상기 실시예 3에서 구축한 본 발명의 단일 도메인 항체 클론 라이브러리에서 패닝을 실시하기 위하여, 5-30㎍/mL의 표적을 코팅하고 4도에서 2 시간 동안 배양하였다. 그 후, 세척 버퍼로 웰을 3회 세척한 후, 블로킹 버퍼를 채우고 4도에서 밤새 배양하고 세척 버퍼로 한 번 세척하였다. 전-블로킹 웰(pre-blocked well)(비-코팅)에 PBS-M(2 % 우유)을 넣어 원래의 라이브러리 파지를 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 그 후, 전-블로킹(코팅된) 웰에 파지를 넣고 실온에서 1시간 배양한다. 세척 버퍼로 10회 세척하고, 트립신 digestion에 의한 결합된 파지를 용출하였다. 용출액을 적정(Titrate)하고 증폭시켰다. 그 결과를 도 7 및 표 3에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 패닝에 의한 특이적 항체 선별에 사용될 α_vβ₃ 인테그린 ITGAVB3 항원을 SDS-PAGE를 이용해 검증하였다.

또한, 표 3에 나타낸 바와 같이, 3단계의 선별과정을 통해 타겟 단백질과 강한 결합을 가지는 파지 라이브러리 후보를 선별하였다.

Round	Conditions	Input	Output	Enriching factor
1st	Target protein: ITGAVB3 30 ug/ml Washing:0.1% PBS-Tween 20, 9 times Elution: Trypsin digestion	1.12×10¹¹	1.61×10⁵	6.96×10⁵
	Pre counter select:2%M-PBS
2nd -P	Target protein: ITGAVB3 30 ug/ml Washing:0.2% PBS-Tween 20, 9 times Elution: Trypsin digestion	9.04×10¹⁰	2.93×10⁴	3.09×10⁶
	Pre counter select:2%M-PBS
2nd -N	Target protein: no coating Washing:0.2% PBS-Tween 20, 9 times Elution: Trypsin digestion	2.26×10¹⁰	2.6×10³	8.69×10⁶
	Pre counter select:2%M-PBS
3rd -P	Target protein: ITGAVB3 30 ug/ml Washing:0.2% PBS-Tween 20, 9 times Elution: Trypsin digestion	1.1×10¹¹	2.0×10⁶	5.5×10⁴
	Pre counter select:2%M-PBS
3rd -N	Target protein: no coating Washing:0.2% PBS-Tween 20, 9 times Elution: Trypsin digestion	2.76×10¹⁰	6.4×10²	4.31×10⁷
	Pre counter select:2%M-PBS

<실시예 5> ELISA를 통한 α _v β ₃ 인테그린 특이적 단일 도메인 항체 분석

상기 실시예 4의 패닝 과정 후 40개의 단일 도메인 항체 파지 클론을 추출하고, α_vβ₃ 인테그린 특이적 단일 도메인 항체와의 결합력을 ELISA법을 이용하여 분석하였다.

구체적으로, 항체-디스플레잉 파지(antibody-displaying phages)의 단일 클론을 준비하기 위하여, 5 mL 2YT-AG 배지에 단일 클론의 용출액을 접종하고 37도에서 밤새 배양하였다. 각 클론에 대한 글리세롤 스톡을 준비하여 밤새 배양하고, 100μL 배양물을 20mL의 2YT-AG 배지에 넣고 배양하였다. OD600의 광학 밀도가 0.4-0.5에 도달 할 때까지 37 도에서 몇 시간 동안 배양하였다. 20개의 다중 감염(즉, 파지 입자/숙주 세포의 수)에서 M13KO7 헬퍼 파지를 첨가하였다. 37도에서 30분간 배양하여 세포를 30분간 흔들어 주면서 감염시켰다. 원심분리(5000g에서 10 분)하여 감염된 세포를 수집하고, 2YT-AK에서 재현탁하고 30도에서 16 시간 동안 배양하였다. 이 후, 상등액에서 파지 입자를 침전시키고, 1mL PBS로 파지 펠렛을 재현탁하며 원심 분리(5000g에서 10 분)하여 세포 파편을 제거하였다. 파지 입자와 관련없는 Ab 단편을 제거하고, 250 μL PBS에 파지 펠렛을 제거하고 원심 분리를 다시 수행하였다.

또한, 파지 ELISA를 수행하기 위하여, 코팅 완충액을 이용하여 2.5-5㎍/mL의 표적 단백질과 대조 단백질을 4도에서 코팅하고, 웰 당 200μL 세척 버퍼로 웰을 3 회 세척한 후, 실온에서 2시간 동안 200μL PBS-M로 웰을 블로킹하였다. 블로킹 완충액을 털어 내고 세척액으로 플레이트를 6 번 씻어내었다. 이 후, 웰 당 세척 완충액에 100μL의 파지 용액을 첨가하고 1~2시간 동안 상온에서 배양하였다. 그 후, 세척 버퍼로 6 회 세척한다. HRP 결합 항-M13 항체(GE healthcare)를 1:5,000의 블로킹 완충액으로 희석한다. 1 웰 당 희석 된 접합체 100 μL를 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 배양하고, 세척 버퍼로 6 회 세척하였다. HRP 기질 용액은 다음과 같이 준비하였다: OPD의 원액은 50mg sodium citrate(pH 4.0) 100mL에 22mg OPD (Sigma)를 용해하여 준비하고, 검출 단계 직전에 OPL 스톡 용액 21 mL에 36 uL 30 % H₂O²를 추가하였다. 웰 당 100 uL의 기질 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 490nm로 설정된 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 분석하였다. 각 클론을 분석한 결과를 표 4에 나타내었다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 40개 클론 모두 α_vβ₃ 인테그린에 강하게 결합함을 확인하였다.

<실시예 6> 본 발명의 단일 도메인 항체 클론의 DNA 시퀀싱 및 정보 분석

본 발명의 단일 도메인 항체 클론의 DNA 시퀀싱을 수행하기 위하여, 5mL LB-A 배지(100㎍/mL 암피실린이 첨가된 LB 배지)에 각 양성 클론(파지 ELISA 및/또는 가용성 ELISA로 측정) 플라스미드가 있는 2μL 글리세롤 스톡 TG1 E.coli 세포를 접종하고 37도로 밤새 배양하였다. Plasmid Isolation Kit(Qiagen Miniprep kit)를 사용하여 상기 세포로부터 각각의 양성 클론에 대한 플라스미드를 분리하였고, L1 및 S6 프라이머를 사용하여 DNA 염기 서열 분석을 수행하였다.

또한, 각 단일 도메인 항체 클론의 정보를 분석하기 위하여, Vector NTI®, Version 10를 이용하여 반환된(returned) 서열을 변환하고, 단백질 배열을 정렬하였다. 그 후, 동일한 단백질 서열을 암호화하는 클론을 그룹화하여 분석하였다. 그 결과를 표 5, 도 8a 내지 도 8c에 나타내었으며, 본 발명의 단일 도메인 항체 클론을 편의 상, VHH로 기재하였다.

표 5에 나타낸 바와 같이, 40개의 클론 시퀀스를 분석한 결과 10개의 후보군 VHH DNA 시퀀스를 확인하였다.

또한, 도 8a 내지 도 8c에 나타낸 바와 같이, 각 10개의 군에서 높은 반응을 보이는 클론 14, 11, 29, 17, 15, 28, 12, 19, 13, 21, 27, 16, 18, 20, 30, 23, 24, 25, 22, 26을 선발하고 이의 아미노산 서열을 나타내었다.

이 중, 강한 양성을 보이는 클론 VHH-25, VHH-13, VHH-22, VHH-11, VHH-17, VHH-15, VHH-12, VHH-16, VHH-20, VHH-23의 염기서열을 각각 서열번호 1 내지 10으로 나타내었다. 그 중, VHH-25, VHH-13, VHH-22의 아미노산 서열을 각 서열번호 11, 12 또는 13으로 나타내었다.

상기 강한 양성을 보이는 클론 VHH-11, VHH-17, VHH-15, VHH-12, VHH-13, VHH-16, VHH-20, VHH-23, VHH-25, VHH-22 중에서, 실시예 5의 ELISA의 방법을 수행하여, 단일 도메인 항체 클론을 선발하였다. 그 결과를 표 6 및 표 7에 나타내었다.

표 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 10개의 VHH 클론 후보 중, VHH-12, VHH-13, VHH-16, VHH-22, VHH-25가 상대적으로 높은 결합력을 나타내었다.

<실시예 7> 본 발명의 단일 도메인 항체 클론의 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석

상기 실시예 6에서 α_vβ₃ 인테그린을 표적으로 하는 단일 도메인 항체 중, VHH-13, VHH-22 및 VHH-25를 선발하고, 종래 α_vβ₃ 인테그린 항체와 비교하여 SPR 분석을 수행하였다.

구체적으로, Dextran이 도포된 CMDH chip(Carboxymethyl Dextran Hydrogel Surface Sensor Chip, Reichert Technologies)을 SPR 장비(Reichert SR7500DC system)에 장착하여, α_vβ₃ 인테그린 항원의 고정화(immobilization) 작업을 수행하였다. 이 후, 선발된 항체의 각 농도별 결합력 (affinity) 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 9 및 표 8에 나타내었다.

도 9 및 표 8에 나타낸 바와 같이, VHH-13, VHH-22 및 VHH-25 항체의 K_D (Equilibrium dissociation constant) 값이 8.8-15.5 nM의 우수한 α_vβ₃ 인테그린 결합력이 나타남을 확인하였다.

<실시예 7> 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-13, VHH-22 및 VHH-25의 발현

상기 실시예 6에서 최종적으로 본 발명의 단일 도메인 항체 클론 중 VHH-13, VHH-22 및 VHH-25가 가장 우수함을 확인하였는 바, 이를 생산하는 벡터를 제작하고, 대장균에 도입하여 단일 도메인 항체 VHH-25를 발현하였다.

구체적으로, 이를 본 발명의 선발된 단일 도메인 항체 클론인 VHH-13, VHH-22 또는 VHH-25 발현을 위하여 His6 tag을 포함하는 벡터를 제작하였으며, VHH-25에 대한 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25)을 도 10a에 나타내었다. 또한, 다른 기능성 분자 또는 원소와의 결합력을 높이기 위하여, 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 벡터를 제작하고, 이에 대한 벡터맵(pALT-Avb3 VHH25K1)은 도 10b에 나타내었다. VHH-25, VHH-13 또는 VHH-22 각 클론에 His6 tag가 포함된 아미노산 서열은 각 서열번호 14, 15 및 16에 나타내었다.

상기 His6 tag을 포함하는 VHH-13, VHH-22 또는 VHH-25 발현 결과를 reduced SDS-PAGE를 수행하여 확인하였으며, 도 11a 내지 도 11c에 나타내었으며, 라이신(Lysin) 및 His6 tag을 포함하는 VHH-25 발현 결과를 도 11d에 나타내었다.

그 결과, VHH-13는 약 15.9 kDa임을 확인하였고(도 11a), VHH-22는 약 14.1kDa임을 확인하였다(도 11b). 또한, VHH-25는 약 14.5kDa이고(도 11c), 라이신 포함 VHH-25는 약 14.2kDa임을 확인하였다(도 11d).

<실시예 8> 암세포에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 α _v β ₃ 인테그린 표적 효과 확인

In vitro 상에서 암세포에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 α_vβ₃인테그린 표적 효과 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 라이신이 포함된 VHH-25-K1 0.5mg과 Cy5.5(sulfo-Cy5.5-NHS, Lumiprobe) 0.25 mg을 2 ml의 borate buffer(pH 8.4)에 녹여 상온에서 30분간 반응을 수행하였다. 반응이 종료한 후 PD-10 column(GE healthcare)을 이용하여 Cy5.5가 도입된 항체 VHH-25-K의 정제를 수행하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, Cy5.5가 도입된 항체 VHH-25-K 합성 및 정제를 SDS-PAGE를 통해 확인하고, α_vβ₃인테그린이 활성화된 U87-MG cell(human glioblastoma)에서 선택적으로 세포 내 흡입(cellular uptake)됨을 확인하였다.

<실시예 9> 종양 부위에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 α _v β ₃ 인테그린 표적 효과 확인

종양 마우스 동물 모델에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 α_vβ₃ 인테그린 표적 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, Athymic nude mice (female, 6-8 weeks old)에 U87-MG cell을 이종이식(inoculation)하여 동물모델을 제작하였다. 종양의 크기가 0.8-1 cm의 크기로 자랐을 때 VHH-25-K에 Cy5.5를 결합하여 꼬리정맥으로 주입(1mg/kg)하여 시간 별로 조영효과를 IVIS(PerkinElmer)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 주입 후 30분이 지난 시점부터 종양 부위에서 조영 효과를 확인할 수 있으며, 4시간 동안 조영 신호가 강하게 나타남을 확인하였다. 그 후, 24시간 동안 종양 부위에서 계속적인 조영신호가 나타남을 확인하였다.

<실시예 10> 동맥경화 부위에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 α _v β ₃ 인테그린 표적 효과 확인

동맥경화 마우스 동물 모델에서 본 발명의 단일 도메인 항체 VHH-25의 α_vβ₃ 인테그린 표적 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, ApoE-/- mice (Female, 10 weeks old)에 36주간 고지방식을 실시하여 혈관내 플라크(plaque)가 형성된 동물모델을 제작한다. 그 후, 상기 실시예 9에서와 동일한 방법으로 준비한 VHH-25-K에 Cy5.5를 결합시키고 꼬리정맥으로 주입(1mg/kg)한 후 4시간 후 마우스를 희생시키고 대동맥을 분리하였다. 분리된 대동맥의 조영 효과를 IVIS를 이용해 분석하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 주입 후 4시간 후, 플라크가 형성된 부위에서 선택적으로 조영 효과가 나타남을 확인하였다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE <120> Single-domain antibody targeting alpha-v beta-3 integrin <130> PN1711-423 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-25 <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtgtag tctctggata cacctgtagc gtctacgaca tgatctggta ccgccagcct 120 ccagggaagg agcgcgagtt cgtctcactc attaatagta atggtagaac aacctacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc caaaacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240 cagatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gcaatgtact actgtcatgc ggcctgctat 300 tcaccctctc ggctgaatta ttggggccag gggacccagg tcactgtctc ctca 354 <210> 2 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-13 <400> 2 catgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggagagtc tctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggata caccgtcagt agctcctgca tggcctggtt ccgccaggct 120 ccaggaaagg agcgcgaggt ggtcgcaact attgttgtta ctagtgatac gaccagcact 180 ttctatgccg actccgtaaa gggccgattc accatctccc cagacaacgc caagaataca 240 ctaaatctgc aaatgaatag cctggaaccg tccgacactg ccatgtacta ctgtgcggca 300 gatcgcaagt ggaacgtttg tagtcgtggt tatcgctaca cccctaattg ggccaaccaa 360 tttacgttct ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct ca 402 <210> 3 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-22 <400> 3 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtgtag tctctggata cacctgtagc gtctacgaca tgatctggta ccgccagcct 120 ccagggaagg agcgcgagtt cgtctcactc attaatagta atggtagaac aacctacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc caaaacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240 cagatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gcaatgtact actgtcatgc ggcctgctat 300 tcaccctctc ggctgaatta ttggggccag gggaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 4 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-11 <400> 4 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggagagtc tctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggata caccgtcagt agctcctgca tggcctggtt ccgccaggct 120 ccaggaaagg agcgcgaggt ggtcgcaact attgttgtta ctagtgatac gaccagcact 180 ttctatgccg actccgtaaa gggccgattc accatctccc cagacaacgc caagaatacg 240 ctaaatctgc aaatgaatag cctggaaccg tccgacactg ccatgtacta ctgtgcggca 300 gatcgcaagt ggaacgtttg tagtcgtggt tatcgctaca cccctaattg ggccaaccaa 360 tttacgttct ggggccaggg gaccttggtc accgtctcct ca 402 <210> 5 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-17 <400> 5 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggagagtc tctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggata caccgtcagt agctcctgca tggcctggtt ccgccaggct 120 ccaggaaagg agcgcgaggt ggtcgcaact attgttgtta ctagtgatac gaccagcact 180 ttctatgccg actccgtaaa gggccgattc accatctccc cagacaacgc caagaatacg 240 ctaaatctgc aaatgaatag cctggaaccg tccgacactg ccatgtacta ctgtgcggca 300 gatcgcaagt ggaacgtttg tagtcgtggt tatcgctaca cccctaattg ggccaaccaa 360 tttacgttct ggggccaggg gaccttggtc accgtctcct ca 402 <210> 6 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-15 <400> 6 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggagagtc tctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggata caccgtcagt agctcctgca tggcctggtt ccgccaggct 120 ccaggaaagg agcgcgaggt ggtcgcaact attgttgtta ctagtgatac gaccagcact 180 ttctatgccg actccgtaaa gggccgattc accatctccc cagacaacgc caagaatacg 240 ctaaatctgc aaatgaatag cctggaaccg cccgacactg ccatgtacta ctgtgcggca 300 gatcgcaagt ggaacgtttg tagtcgtggt tatcgctaca cccctaattg ggccaaccaa 360 tttacgttct ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct ca 402 <210> 7 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-12 <400> 7 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggagagtc tctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggata caccgtcagt agctcctgca tggcctggtt ccgccaggct 120 ccaggaaagg agcgcgaggt ggtcgcaact attgttgtta ctagtgatac gaccagcact 180 ttctatgccg actccgtaaa gggccgattc accatctccc cagacaacgc caagaatacg 240 ctaaatctgc aaatgaatag cctggaaccg tccgacactg ccatgtacta ctgtgcggca 300 gatcgcaagt ggaacgtttg tagtcgtggt tatcgctaca cccctaattg ggccaaccaa 360 tttacgttct ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct ca 402 <210> 8 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-16 <400> 8 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggata caccgtcgag aactcctgca tggcctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgcgaggt ggtcgcaact attgttacta ataatgcgac cggtactttc 180 tatgccgact ccgtgaaggg ccgattcacc gtctcccaag acaacgccaa gaatacgcta 240 aatctgcaaa tgaatagcct ggaacctgag gacacagcca tgtactactg tgcggcagat 300 accaagtgga tagtttgtag tcgtggttat cgctacaccc ctaattgggc caaccaattt 360 aagtactggg gccaggggac ccaggtcacc gtctcctca 399 <210> 9 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-20 <400> 9 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggata caccgtcgat aactcctgca tggcctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgcgaggt ggtcgcaact attgttacta ataatgcgac cagcactttc 180 tatgccgact ccgtgaaggg ccgattcacc gtctcccacg acaacgccaa gaatacgcta 240 aatctgcaaa tgaataccct ggaacctgag gacactgcca tgtactactg tgcggcagat 300 accaagtgga tagtttgtag tcgtggttat cgctacaccc ctaattgggc caaccatttt 360 aattactggg gccaggggac cctggtcacc gtctcctca 399 <210> 10 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-23 <400> 10 catgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcaga ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggata cacctcaagt accgtctaca tggcttggtt ccgccagact 120 ccagggaagc agcgcgaggg ggtcgcagca atttatactg gtggtggtcc tacatactat 180 gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagaca acgccaagaa tacggtgtat 240 ctccaaatga acaccctgaa acctgaagac actgccatgt actactgtgc ggccgatcgc 300 tatgtgtacc ggttagttac taactggtac agaccgtctt tttatacata ctggggccag 360 gggacccagg tcaccgtctc ctca 384 <210> 11 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-25 of amino acid <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Cys Ser Val Tyr 20 25 30 Asp Met Ile Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Leu Ile Asn Ser Asn Gly Arg Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Ala Cys Tyr Ser Pro Ser Arg Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-13 of amino acid <400> 12 His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Ser 20 25 30 Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Ala Thr Ile Val Val Thr Ser Asp Thr Thr Ser Thr Phe Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Pro Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Ser Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Lys Trp Asn Val Cys Ser Arg Gly Tyr Arg 100 105 110 Tyr Thr Pro Asn Trp Ala Asn Gln Phe Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Gln Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 13 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-22 of amino acid <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Cys Ser Val Tyr 20 25 30 Asp Met Ile Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Leu Ile Asn Ser Asn Gly Arg Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Ala Cys Tyr Ser Pro Ser Arg Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-25 with His6 tag for purification <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Cys Ser Val Tyr 20 25 30 Asp Met Ile Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Leu Ile Asn Ser Asn Gly Arg Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Ala Cys Tyr Ser Pro Ser Arg Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 115 120 125 <210> 15 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-13 with His6 tag for purification <400> 15 His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Ser 20 25 30 Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val 35 40 45 Ala Thr Ile Val Val Thr Ser Asp Thr Thr Ser Thr Phe Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Pro Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Ser Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Lys Trp Asn Val Cys Ser Arg Gly Tyr Arg 100 105 110 Tyr Thr Pro Asn Trp Ala Asn Gln Phe Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Gln Val Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 140 <210> 16 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-16 with His6 tag for purification <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Cys Ser Val Tyr 20 25 30 Asp Met Ile Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Leu Ile Asn Ser Asn Gly Arg Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Ala Cys Tyr Ser Pro Ser Arg Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 115 120 125

Claims

서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 코딩되는, α_vβ₃ 인테그린(Integrin) 표적 단일 도메인 항체(Single-domain antibody).
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하며, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는, α_vβ₃인테그린 표적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서,
상기 항체는 카멜리대(Camelidae)에서 유래된 VHH(variable region of a heavy chain antibody)인 것을 특징으로 하는, α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서,
상기 항체는 기능성 분자 또는 원소가 추가적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
제4항에 있어서,
상기 기능성 분자 또는 원소는 무기 입자, 방사선 동위 원소, 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 및 지질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
제5항에 있어서,
상기 무기 입자는 형광 마커 또는 염색 물질인 것을 특징으로 하는, α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
제6항에 있어서,
상기 형광 마커 또는 염색 물질은 GFP(Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), BFP(Blue fluorescent protein), CFP(Cyan fluorescent protein), 아크리딘 염료(Acridine dyes), 사이아닌 염료(Cyanine dyes), 불소 염료(Fluorone dyes), 옥사진 염료(Oxazine dyes), 페난트리딘 염료(Phenanthridine dyes) 및 로다민 염료(Rhodamine dyes)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
제5항에 있어서,
상기 방사선 동위 원소는 ¹⁸F(불소), ¹¹C(탄소), ¹⁵O(산소), ¹³N(질소), ⁸⁹Zr(지르코륨), C¹⁵O, ¹³N(암모니아), H₂ ¹⁵O 및 ¹⁸FDG(F-Deoxy Glucose)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체.
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터.
제9항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제1항의 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 조성물.
제1항의 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 검출용 키트.
제1항의 단일 도메인 항체를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단용 조성물로서,
상기 신생 혈관 형성 관련 질환은 동맥경화증, 암, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 각막 궤양, 원추 박막, 황반 변성, 쇼그렌 증후군, 근시안과 종양, 각막이식 거부반응, 이상 창상 유합, 트라코마(trachoma), 골질환, 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염, 패혈증성 관절염, 혈관종(hemangiomas), 섬유성 혈관종(angiofibroma), 건선(psoriasis), 화농성 육아종(pyogenic granuloma), 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열증, 염증성 장질환, 치근막질환, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부 노화, 갑상선 과증식 및 그레이브스병(Grave's disease)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신생혈관 형성 관련 질환의 진단용 조성물.
삭제
(1) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
(2) 상기 미생물에서 α_vβ₃ 인테그린에 대한 단일 도메인 항체를 발현시키는 단계;를 포함하는,α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체의 제조 방법.
(1) 검체로부터 분리된 생물학적 시료 또는 인간을 제외한 동물 모델에 분석하고자 하는 후보 약물을 처리하는 단계;
(2) 상기 시료에 제1항의 α_vβ₃ 인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 α_vβ₃인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(3) 상기 (2)의 단백질의 수준이 대조군과 비교하여 억제 또는 증진된 후보 약물을 선발하는 단계를 포함하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법.
제16항에 있어서,
상기 (1)의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 세포 또는 조직 시료인 것을 특징으로 하는, 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법.
제16항에 있어서,
상기 (1)의 동물은 래트, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소인 것을 특징으로 하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법.
제16항에 있어서,
상기 (2)의 측정은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 혈관 신생 억제제 또는 촉진제 스크리닝 방법.
(a) 검체로부터 분리된 생물학적 시료에 제1항의 α_vβ₃인테그린 표적 단일 도메인 항체를 결합시키고 α_vβ₃ 인테그린 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 α_vβ₃ 인테그린 단백질의 수준을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계;를 포함하는 신생혈관 형성 관련 질환의 진단을 위한 정보제공 방법으로서,
상기 신생 혈관 형성 관련 질환은 동맥경화증, 암, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 각막 궤양, 원추 박막, 황반 변성, 쇼그렌 증후군, 근시안과 종양, 각막이식 거부반응, 이상 창상 유합, 트라코마(trachoma), 골질환, 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염, 패혈증성 관절염, 혈관종(hemangiomas), 섬유성 혈관종(angiofibroma), 건선(psoriasis), 화농성 육아종(pyogenic granuloma), 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열증, 염증성 장질환, 치근막질환, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부 노화, 갑상선 과증식 및 그레이브스병(Grave's disease)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신생혈관 형성 관련 질환의 진단을 위한 정보제공 방법.