JP6854342B2 - ファージ表面上での二重特異性抗体の提示 - Google Patents
ファージ表面上での二重特異性抗体の提示 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2016年9月15日に出願された米国仮出願第62/395,139号の恩恵を主張する。この出願の内容は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は概して、抗体の対を、それらの各々の標的への同時結合に基づいて同時選択できるようにする、抗体ファージ提示の組成物および方法の分野に関する。本発明で具体化される組成物および方法は、二重特異性抗体の開発に有用である。
ファージ提示法は、繊維状バクテリオファージによってコードされかつその表面で発現される変異体の大きなライブラリーから、所望の特徴を有するまれなリガンドを単離できるようにする、強力なインビトロ進化技術である。ファージ提示法を介して特定された多くの抗体が、治療上、または臨床開発で現在使用されている。抗体ファージ提示法は、二重特異性抗体を発見するのに今まで使用されてきたが、そのプロセスは、選択が同時結合に基づくことを保証するようには合理化されていない。さらに、当技術分野において公知である他の技法(例えば、ファージダイアボディ技術)は、同時結合に基づく直接的な選択を目的とした使用はなされておらず、ファージダイアボディ技術は、ダイアボディレパートリーの構築の難しさが原因で、該技術の幅広い適用は実現不可能である可能性がある。ダイアボディの抗原結合部位の幾何形状の、免疫グロブリン分子との違いは、免疫グロブリンに基づく二重特異性抗体型式への変換と引き換えにその有用性を損なう可能性がある。
[本発明1001]
2種のリガンド結合ポリペプチドをファージの表面上に同時に提示するための提示システムであって、該提示システムは、
a.第1の二量体化ドメインとファージの外表面タンパク質とにインフレームで融合している第1のリガンド結合ポリペプチドのコード配列を含むファージミド;
b.第2の二量体化ドメインにインフレームで融合している第2のリガンド結合ポリペプチドのコード配列を含むプラスミド;および
c.ファージをパッケージングするのに必要なすべてのタンパク質のコード配列を含むヘルパーファージ
を含み、
第1のリガンド結合ポリペプチドと第2のリガンド結合ポリペプチドは異なり、かつ異なる標的リガンドにそれぞれ結合するものであり、第1のリガンド結合ポリペプチドの融合体および第2のリガンド結合ポリペプチドの融合体およびすべてのファージタンパク質が適切な宿主細胞中で発現した場合、2種のリガンド結合ポリペプチド融合体がそれらの各々の二量体化ドメインを介して結合し、その結果、ファージの表面上に2種のリガンド結合ポリペプチドが同時に提示される、
前記提示システム。
[本発明1002]
前記第1のリガンド結合ポリペプチドおよび二量体化ドメインが、繊維状バクテリオファージのマイナーコートタンパク質3に融合している、本発明1001の提示システム。
[本発明1003]
前記第1の二量体化ドメインが前記第2の二量体化ドメインと高親和性でヘテロ二量体化する、本発明1001の提示システム。
[本発明1004]
前記第1の二量体化ドメインおよび前記第2の二量体化ドメインがロイシンジッパーである、本発明1003の提示システム。
[本発明1005]
前記第1の二量体化ドメインがSEQ ID NO:1の核酸配列によってコードされ、かつ前記第2の二量体化ドメインがSEQ ID NO:3の核酸によってコードされている、本発明1004の提示システム。
[本発明1006]
前記第1の二量体化ドメインがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含み、かつ前記第2の二量体化ドメインがSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、本発明1004の提示システム。
[本発明1007]
前記第1の二量体化ドメインがSEQ ID NO:5の核酸配列によってコードされ、かつ前記第2の二量体化ドメインがSEQ ID NO:7の核酸によってコードされている、本発明1005の提示システム。
[本発明1008]
前記第1の二量体化ドメインがSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含み、かつ前記第2の二量体化ドメインがSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む、本発明1004の提示システム。
[本発明1009]
前記第1および第2のリガンド結合ポリペプチドが抗原結合ポリペプチドである、本発明1001の提示パッケージ。
[本発明1010]
前記第1および第2のリガンド結合ポリペプチドがscFvである、本発明1009の提示システム。
[本発明1011]
前記第1および第2のリガンド結合ポリペプチドが非免疫グロブリン結合ドメインである、本発明1009の提示システム。
[本発明1012]
前記第1および第2のリガンド結合ポリペプチドがペプチドである、本発明1009の提示システム。
[本発明1013]
前記宿主細胞中で発現した場合、前記ファージの表面上に提示される2種のリガンド結合ポリペプチドが、IgG分子のものに匹敵する幾何形状を有する、本発明1001の提示システム。
[本発明1014]
前記宿主細胞中で発現した場合、前記ファージの表面上に提示される2種のリガンド結合ポリペプチドが、IgG分子のものに匹敵する分子分離距離を有する、本発明1001の提示システム。
[本発明1015]
前記宿主細胞中で発現した場合、前記ファージの表面上に提示される2種のリガンド結合ポリペプチドが、IgG分子のものに匹敵する幾何形状と分子分離距離の両方を有する、本発明1001の提示システム。
[本発明1016]
適切な包装中に本発明1001の提示システムを含む、キット。
[本発明1017]
使用のための指示書をさらに含む、本発明1016のキット。
[本発明1018]
本発明1001の提示システムを適切な宿主細胞中で転写および翻訳させる工程を含む、2種のリガンドポリペプチドをファージの表面上に提示するための方法。
[本発明1019]
1種または複数種の試験作用物質とファージの表面上に提示された2種のリガンド結合ポリペプチドとの間で同時に起こる特異的相互作用を検出する方法であって、以下の工程を含む方法:
a.本発明1018の方法に従って調製される、2種のリガンド結合ポリペプチドを提示するファージを提供する工程;
b.2種のリガンド結合ペプチドと1種または複数種の試験作用物質との間で安定な複合体を生成するのに適した条件下で、該ファージを該作用物質と接触させる工程;および
c.安定な複合体の形成を検出する工程。
[本発明1020]
前記1種または複数種の試験作用物質が、タンパク質、多糖、脂質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記1種または複数種の試験作用物質が抗原またはリガンドである、本発明1020の方法。
本明細書において、ファージ(例えば、繊維状バクテリオファージ)の表面上での2種の異なるリガンド結合ポリペプチド(すなわち、抗体またはその抗原結合断片)の二重提示のためのファージ提示システム、組成物、および方法が提供される。該システムが適切な宿主細胞中で発現した場合、2つのポリペプチドは、インタクトな免疫グロブリンの2つの抗原結合部位のものと似た幾何形状および/または分子分離距離を有する。これらのシステム、組成物、および方法は、大きなナイーブ抗体レパートリーの使用に容易に適合し、使用者が定めた2種の異なる標的を同時結合させるのに使用することができる、二重レプリコンシステムを使用する。
別段定義しない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとし、さらに、文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書において記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリペプチド化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して利用される専門語、ならびにこれらの技法は、当技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。標準的な技法が、組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクチン)に使用される。酵素反応および精製技法は、本明細書において記載されるように、製造者の仕様書に従って、または当技術分野において一般に達成されるように行われる。前述の技法および手順は、一般に、当技術分野において周知である従来の方法に従って、ならびに本明細書全体を通して引用され、論じられている様々な一般的な、およびより具体的な参考文献において本明細書において記載されるように行われる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manualを参照されたい)。
本明細書において、ファージ(すなわち、繊維状バクテリオファージ)の表面上における2種の異なるリガンド結合ポリペプチド(例えば、抗体または抗体断片)の確固たる提示を可能にする提示システムが提供される。適切な宿主細胞中で発現した場合、2つのポリペプチドは、インタクトな免疫グロブリン分子の2つの抗原結合部位のものと似た幾何形状および/または分子分離距離を有する。これらのシステムは、選択された標的分子に特異的に結合することができる二重特異性抗体を特定する方法で使用することができる。
ファージ表面で近接した2種の異なるscFvを提示するために、静電反発力によってホモ二量体化を阻害し、静電引力によってヘテロ二量体化を支持する相補的荷電残基を特色とする、1対のロイシンジッパードメインに基づくシステム(Moll et al., Protein Sci 10:649-655 (2001)を参照されたい)が使用される(図1A、Z1、Z2を参照されたい)。
二重提示の実行可能性を試験するために、特異性が公知の以下の3つの抗体断片を使用した:抗CXCL10(Fagete et al., 1: 288-296 (2009)を参照されたい)、抗インターフェロンγ(抗IFNγ)(Ravn, et al., 2010を参照されたい)、および抗CD3ペプチド(WO2011/121110を参照されたい)。第1の実験では、ファージ成分の発現のために、抗IFNγ-Z1、抗IFNγ-Z2、抗CXCL10-Z1、または抗CXCL10-Z2をコードする、4つのpNDS-DDファージミドコンストラクトを使用した。これらのファージミドは、可溶性成分として抗CD3-Z1または抗CD3-Z2のいずれかをコードするpCDF-1b-DDプラスミドを保有する大腸菌中でレスキューした。8つの異なるファージレスキュー混合物を、固定化されたCD3ペプチド-Fc融合タンパク質に結合するそれらの能力について、ELISAによって評価した(図2を参照されたい)。
ファージのアセンブリの間の可溶性成分scFvのロイシンジッパー媒介性獲得が、その標的に対するパニングのサイクル中にファージ選択を推進するのに十分に頑強であるかどうかを決定するため、ファージ成分として抗IFNγ-Z1または抗IFNγ-Z2のいずれかをコードするpNDS-DDファージミドを、抗CD3-Z1可溶性成分をコードするpCDF-1b-DDを保有する大腸菌中でレスキューした。この方法では、ロイシンジッパーのヘテロ二量体化を介して、抗IFNγ-Z2ファージのみが抗CD3 scFvを獲得することができると考えられる(図3Aを参照されたい)。抗CD3を提示する抗IFNγ-Z2ファージを抗CD3陰性の抗IFNγ-Z1ファージのバックグラウンドから濃縮することができる程度を決定するために、ファージのこの混合物を、固定化されたCD3ペプチド-Fc融合タンパク質に対する選択パニングのラウンドに供した。抗IFNγ-Z1ファージと抗IFNγ-Z2ファージとの間の起こり得る増殖優位性の差が原因で生じる任意の濃縮についての対照実験として、CD3ペプチドのパニング工程なしで感染および増幅のラウンドを行う並行選択実験を行った。
二重提示ファージの選択は、2種の異なる標的エピトープへの同時結合によって推進され得る。例えば、細胞表面レセプターCCR5を、その細胞外N末端ドメインに付加されたCD3ε(1〜15位)ペプチドとともに安定して発現する、クローン細胞株(CHO-CD3-CCR5)を生成した(図4Aおよび図6Aを参照されたい)。この細胞株は、十分に特徴づけられている抗CCR5抗体(PRO-140)(Trkola et al., J. Virol. 75:579-588 (2001)を参照されたい)をscFv断片として再編成したので、抗CCR5-Z1、抗CCR5-Z2、抗IFNγ-Z1、および抗IFNγ-Z2の4種の異なるファージ成分をコードするファージクローンを含む選択実験で使用した。
本明細書において記載される二重レプリコン戦略は、二重提示システムを、ライブラリーに基づく選択に容易に適用できるように設計された。「単一ポット」二重提示ナイーブ抗体ライブラリーは、pNDS-DDファージミドにクローニングすることができ、次いで、使用者が定めた様々な可溶性成分抗体とともに使用することができる。これは、生成される選択された可溶性成分抗体断片を保有し、二重提示ナイーブ抗体ライブラリーによる感染を受け、次いで、ヘルパーファージによるレスキューに供される、新しい細菌系統を必要とする。
1つの標的抗体特異性(可溶性成分)が、各選択実験より前に使用者によって固定されなければならない一態様では、適合性抗体の新規な対を探索するコンビナトリアルスクリーニングは不可能である。しかし、このシステムは、抗体の機能的な対の直接的な選択を可能にするように適合させることができ、そのために、LoxP/Creコンビナトリアル感染/インビボ組換えシステムを使用する(Waterhouse et al., Nucleic Acids Res. 21:2265-2266 (1993)を参照されたい)。このプロセスでは、細菌をドナープラスミドライブラリーで形質転換し、次いで、組換えによってドナープラスミドから配列を獲得することができるファージに感染させる。可溶性抗体とファージ成分抗体の両方をコードするコンビナトリアル二重提示ファージミドライブラリーは、pNDS-DDおよびpCDF-1b-DDベクターを適切な隣接組換え部位を含むように適合させることによって、生成することができる。
二重特異性抗体の発見を合理化する方法
プラスミド、ファージミド、ヘルパーファージおよび細菌系統
プラスミドpCDNA3.1およびpCDF-1bは、それぞれInvitrogenおよびNovagenから購入した。ファージミドベクターpNDSは以前に記載されている(Venet et al., PLoS One 7: e43471 (2012)を参照されたい)。ヘルパーファージM13K07(Vieira et al., Methods Enzymol. 153: 3-11 (1987)を参照されたい)および大腸菌TG1(K-12 supE thi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5,(rk- mk-)F’[traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15])は施設内で生成した。大腸菌XLl-Blue(recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdRl7 supE44 relA1 lac)はAgilent Technologiesから購入した。
抗体
抗ヒトCXCL10抗体(Fagete et al., 1: 288-296(2009)を参照されたい)および抗ヒトIFNγ(Ravn et al., Nucleic Acids Res. 38: e193(2010)を参照されたい)抗体は、標準的なファージ提示選択およびスクリーニング手順を使用して、ナイーブscFvファージ提示ライブラリーから単離した。ヒトCCR5に対する以前に記載された抗体のVHおよびVLドメイン(Trkola et at., J. Virol. 75: 579-588 (2001)を参照されたい)、およびヒトCD3εサブユニットの成熟型の残基1〜15位(WO2011/121110を参照されたい)をコードする遺伝子を合成し(Eurofins)、scFv断片としてアセンブリした。
ヒトプロラクチンリーダー配列およびヒトCD3εサブユニットの成熟型の1〜15位の後にヒトCCR5をコードする融合コンストラクトを、哺乳動物細胞発現ベクターpCDNA3.1にクローニングした。得られたプラスミドを使用してチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞にトランスフェクトし、次いで、これを選択抗生物質G418(Invitrogen、1.2mg/mL)の存在下で増幅させた。細胞選別によって個々のクローンを単離し、それに続いてさらに増殖させ、単一クローンを、CCR5とCD3εサブユニットペプチドエピトープの両方の表面発現についてのフローサイトメトリー解析に基づいて選択した。
成熟タンパク質ヒトCCR5(NCBI参照NM_000579)をコードする遺伝子は、(i)ウシプロラクチン前駆体リーダー配列(NCBI参照NM_173953)、(ii)成熟ヒトCD3εサブユニット(NCBI参照NM_000733.3)の残基1〜15位をN末端に付加するように、PCR伸長によってアセンブリした(添付の図5を参照されたい)。得られた断片を、XbaIおよびNotI制限部位を使用して哺乳動物細胞発現ベクターpcDNA3.1(Invitrogen)にクローニングした。
PCR伸長を使用して、ヒトCD3εの残基1〜15位をコードする配列をヒトγ1Fc領域のN末端に融合し、C末端のAviTag(商標)配列(Avidity)を組み込んだ。この断片を、HindIIIおよびEcoRI部位を使用してPeak8哺乳動物発現ベクター(Edge Biosystems)にクローニングし、以前に記載されているように融合タンパク質を発現させた(Magistrelli et al., Protein Expr. Purif. 72:209-216 (2010)を参照されたい)。CELLineバイオリアクター(Integra)中での10日間の生成後、AKTA Primeクロマトグラフィーシステム(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、収集したタンパク質をプロテインGセファロースカラム(GE healthcare)で精製した。精製したタンパク質を、製造者の指示書に従ってBirA酵素(Avidity)を使用してインビトロでビオチン化し、PD10カラム(GE healthcare)を使用して脱塩し、SDS-PAGEによって純度および完全性について確認した。
二重提示ファージミド(pNDS-DD)
ファージ遺伝子3コード配列とインフレームでSpeIおよびPacI部位を導入し、アンバーコドンを除去するように、QuikChangeクローニング戦略(Agilent Technologies)を使用してファージミドpNDSを改変した。次いで、SpeIおよびPacI部位を使用して、Z1およびZ2ロイシンジッパードメイン(Moll et al., Protein Sci 10: 649-655 (2001)を参照されたい)に対応し、グリシン/セリンリッチスペーサーに隣接する、大腸菌コドンに最適されたコード配列に対応する断片を挿入した。次いで、ファージミド骨格の標準的なSfiIおよびNotI部位を使用して、抗体scFv断片を二重提示ファージミドにクローニングした。
得られたプラスミドを、製造者の指示書に従ってLipofectamine(商標)(ThermoFisher)を使用してチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクトした。1.2mg/mLのジェネテシン(ThermoFisher)の存在下で培養することによって、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択し、個々のクローンを細胞選別によって単離した。抗CCR5抗体(Alexa Fluor 488に直接的にコンジュゲートされたHEK/1/85a mAb、BioLegend)およびフィコエリトリンコンジュゲートマウス抗ヒトFc二次抗体(Clone H2、Southern Biotech)とともに使用される抗CD3ペプチド抗体(Pande et al., 28:849-858 (2010)を参照されたい)(インタクトなヒト免疫グロブリンとしての発現のためにアセンブリされた)を使用して、フローサイトメトリーによって、クローン細胞株を評価した。
QuikChang突然変異誘発(Agilent Technologies)を使用して、pCDF-1bのマルチクローニングサイトの上流にSphI制限部位を挿入した。この部位を、プラスミド骨格のPacI部位とともに使用して、コードscFv-ロイシンジッパー融合タンパク質に対応する、ドナーファージミドベクター由来のSphI-PacI断片を挿入した。最終的なファージミドpNDS-DDを作製するために出発ファージミドpNDSを改変するのに用いられる工程を図7Aおよび7Bに示す。
pCDF-1b-DDプラスミドを保有する大腸菌TG1に導入されたpNDS-DDファージミドを、アンピシリン(100μg/mL)およびカナマイシン(50μg/mL)に加えて、pCDF-1b-DDプラスミドに対する選択抗生物質であるスペクチノマイシン(30μg/mL)を使用したことを除いては、標準的な手順(Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. (1991) 19, 4133-4137を参照されたい)に従って、M13KO7ヘルパーファージを使用してレスキューした。レスキュー上清を、レスキュー上清の体積の30%に相当する体積のポリエチレングリコール8000(20%(w/v)、Acros Organics)/2.5M NaCl溶液とともに4℃で2時間インキュベートすることによって、レスキューしたファージを2回沈殿させた。次いで、1mM EDTAを補充した10mM Tris-HCL緩衝液(pH8.0)(Tris-EDTA緩衝液)中に沈殿物を再懸濁した。
Maxisorpプレート(Nunc)を1μg/mLのストレプトアビジン(Roche)で(4℃で一晩)コーティングし、次いで、0.05% Tween20を補充したPBS(PBS-Tween 0.05%)で洗浄し、3%(w/v)粉ミルク(Sigma)を補充したPBS(PBS-ミルク)でブロッキングした。次いで、プレートをビオチン化CD3ペプチド-Fc(1μg/mL)とともに周囲温度で1時間インキュベートし、次いで、PBS-Tween 0.05%で洗浄し、PBS-ミルク中に懸濁したレスキューしたファージとともに(周囲温度で1時間)インキュベートした。PBS-Tween 0.05%で洗浄後、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗M13抗体(1:5000、Amersham)とともに周囲温度で1時間インキュベートした。プレートをPBS-Tween 0.05%で再び洗浄し、TMB基質(Sigma-Aldrich)を使用して発色させ、20分後に1M H2SO4で反応を停止して、450nmで吸光度を測定した。
ファージ混合物(1012cfu)を1mLのPBS-ミルクに懸濁し、ストレプトアビジン磁気ビーズ(Dynal M-280)に(周囲温度で1時間)事前に吸着させた。ストレプトアビジン磁気ビーズの別々のバッチ(100μL)を周囲温度で1時間PBS-ミルクでブロッキングし、ビオチン化CD3ペプチド-Fcでコーティングした(100nM、周囲温度、1時間)。次いで、ビーズを、最初に0.1% Tween20を補充した1mLのPBS(PBS-Tween 0.1%)で、次いで1mLのPBSで、最後に1mLのPBS-ミルクで洗浄してから、事前に吸着させたファージとともに(周囲温度で2時間)インキュベートした。次いで、ビーズをPBS-Tween 0.1%(5回)、続いてPBS(2回)で洗浄し、次いで、指数関数的に増殖する大腸菌TG1とともに37℃で1時間インキュベートした。次いで、細菌培養物を、アンピシリンおよびグルコースを補充した2×TY寒天を含むプレート上に播いた。
この手順を概略的に表し、図4Bに示す。
ファージ混合物(第1ラウンドについて約1011cfu、次いで、その後のラウンドについて109〜1010cfu)を、ウシ血清アルブミン(3%(w/v)Sigma)を補充した300μLのPBSによって、回転式振盪機(20rpm)の上で、周囲温度で1時間ブロッキングした。
ブロッキングしたファージ混合物を使用して、107個のトランスフェクトされていないCHO細胞を再懸濁し、得られた懸濁液を氷上で1時間維持した。次いで、懸濁液を300g(4℃、3分)で遠心分離し、無細胞ファージを含む上清を回収した。
回収した上清を使用して107個のCHO CCR5-CD3細胞を再懸濁し、得られた懸濁液を回転式振盪機(10rpm)の上で、4℃で2時間インキュベートし、次いで、1mLの氷冷PBS-Tween 0.05%(4回)、続いて1mLの氷冷PBS(2回)で洗浄した。
細胞懸濁液を300g(4℃、3分)で遠心分離し、次いで、500μLのグリシンHCl緩衝液(0.2M、pH2.2)に再懸濁し、氷上に10分間放置してから、Tris-EDTA緩衝液で中和した。これを再び遠心分離し(300g、4℃、3分)、酸溶出されたファージを含む上清と細胞ペレットの両方を別々に回収した。
ペレットにした細胞を500μLのTris-EDTAに再懸濁し、3回の急速凍結融解サイクルを使用して溶解した。酸溶出物と組み合わされるか(選択ラウンド2〜4)、単独で使用されるか(ラウンド1)のいずれかの可溶化液を10mLの指数関数的に増殖する大腸菌TG1細胞に加え、37℃で1時間インキュベートした。得られた細菌培養物を、アンピシリンおよびグルコースを補充した2×TY寒天を含むプレート上に播いた。
各選択ラウンドの後に、個々のファージクローンを保有するユニークな大腸菌TG1のコロニーを選び、アンピシリンおよびグルコースを補充したLBブロス中で一晩培養した。プラスミドのミニプレップを調製し、インサートのシークエンシング(Microsynth)に使用した。得られた配列の解析を使用して、各ファージミドクローンにコードされるscFvとロイシンジッパードメインの両方を決定した。
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、上記の付随する説明に記載されている。本明細書において記載されるものに類似のまたは均等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料は本明細書に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本説明および特許請求の範囲から明らかであろう。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈において別段明記しない限り、複数の指示物を含む。別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書で引用されるすべての特許および刊行物は参照により組み入れられる。
Claims (18)
- 2種のリガンド結合ポリペプチドをファージの表面上に同時に提示するための提示システムであって、該提示システムは、
a.第1の二量体化ドメインとファージの外表面タンパク質とにインフレームで融合している第1のリガンド結合ポリペプチドのコード配列を含むファージミド;
b.第2の二量体化ドメインにインフレームで融合している第2のリガンド結合ポリペプチドのコード配列を含むプラスミド;および
c.ファージをパッケージングするのに必要なすべてのタンパク質のコード配列を含むヘルパーファージ
を含み、
第1のリガンド結合ポリペプチドと第2のリガンド結合ポリペプチドは異なる単鎖可変断片(scFv)であり、かつ異なる標的リガンドにそれぞれ結合するものであり、第1のリガンド結合ポリペプチドの融合体および第2のリガンド結合ポリペプチドの融合体およびすべてのファージタンパク質が適切な宿主細胞中で発現した場合、2種のリガンド結合ポリペプチド融合体がそれらの各々の二量体化ドメインを介して結合し、その結果、ファージの表面上に2種のリガンド結合ポリペプチドが同時に提示され、
前記第1のリガンド結合ポリペプチドおよび二量体化ドメインが、繊維状バクテリオファージのマイナーコートタンパク質3に融合しており、
前記第1の二量体化ドメインおよび前記第2の二量体化ドメインがロイシンジッパーである、
前記提示システム。 - 前記第1の二量体化ドメインが前記第2の二量体化ドメインと高親和性でヘテロ二量体化する、請求項1に記載の提示システム。
- 前記第1の二量体化ドメインがSEQ ID NO:1の核酸配列によってコードされ、かつ前記第2の二量体化ドメインがSEQ ID NO:3の核酸によってコードされている、請求項2に記載の提示システム。
- 前記第1の二量体化ドメインがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含み、かつ前記第2の二量体化ドメインがSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の提示システム。
- 前記第1の二量体化ドメインがSEQ ID NO:5の核酸配列によってコードされ、かつ前記第2の二量体化ドメインがSEQ ID NO:7の核酸によってコードされている、請求項2に記載の提示システム。
- 前記第1の二量体化ドメインがSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含み、かつ前記第2の二量体化ドメインがSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の提示システム。
- 前記第1および第2のリガンド結合ポリペプチドが抗原結合ポリペプチドである、請求項1に記載の提示パッケージ。
- 前記第1および第2のリガンド結合ポリペプチドが非免疫グロブリン結合ドメインである、請求項7に記載の提示システム。
- 前記第1および第2のリガンド結合ポリペプチドがペプチドである、請求項7に記載の提示システム。
- 前記宿主細胞中で発現した場合、前記ファージの表面上に提示される2種のリガンド結合ポリペプチドが、IgG分子のものに匹敵する幾何形状を有する、請求項1に記載の提示システム。
- 前記宿主細胞中で発現した場合、前記ファージの表面上に提示される2種のリガンド結合ポリペプチドが、IgG分子のものに匹敵する分子分離距離を有する、請求項1に記載の提示システム。
- 前記宿主細胞中で発現した場合、前記ファージの表面上に提示される2種のリガンド結合ポリペプチドが、IgG分子のものに匹敵する幾何形状と分子分離距離の両方を有する、請求項1に記載の提示システム。
- 適切な包装中に請求項1に記載の提示システムを含む、キット。
- 使用のための指示書をさらに含む、請求項13に記載のキット。
- 請求項1に記載の提示システムを適切な宿主細胞中で転写および翻訳させる工程を含む、2種のリガンドポリペプチドをファージの表面上に提示するための方法。
- 1種または複数種の試験作用物質とファージの表面上に提示された2種のリガンド結合ポリペプチドとの間で同時に起こる特異的相互作用を検出する方法であって、以下の工程を含む方法:
a.請求項15に記載の方法に従って調製される、2種のリガンド結合ポリペプチドを提示するファージを提供する工程;
b.2種のリガンド結合ペプチドと1種または複数種の試験作用物質との間で安定な複合体を生成するのに適した条件下で、該ファージを該作用物質と接触させる工程;および
c.安定な複合体の形成を検出する工程。 - 前記1種または複数種の試験作用物質が、タンパク質、多糖、脂質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記1種または複数種の試験作用物質が抗原またはリガンドである、請求項17に記載の方法。
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