KR20160015220A - 특이적 결합 분자의 합성 라이브러리 - Google Patents

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Abstract

본 발명은,
(1) 판새아강(Elasmobranchii) 아부류의 종의 구성원으로부터 RNA를 단리하는 단계; (2) 수득된 RNA로부터 DNA 서열을 증폭시키는 단계; (3) 제조한 데이터베이스로부터 DNA 서열을 선택하는 단계; (4) FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 2개 이상의 연속 펩티드 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키는 단계; (5) 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 형성하기 위해 상기 증폭된 DNA 서열을 함께 연결시키는 단계; (6) 수득된 증폭된 DNA를 디스플레이 벡터에 클로닝하는 단계 및 (7) 숙주를 상기 디스플레이 벡터로 형질전환시켜 상기 항원 특이적 항원 결합 분자의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는, 하기 서열식 I로 나타내어지는 펩티드 도메인 구조를 갖는 항원 특이적 항원 결합 분자의 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다:
[서열식 I]
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4
본 발명은 또한 정의된 항원 특이적 항원 결합 분자의 제조 방법, 이러한 분자를 포함하는 약제학적 조성물 및 의약에서 이의 용도를 제공한다.

Description

특이적 결합 분자의 합성 라이브러리 {SYNTHETIC LIBRARY OF SPECIFIC BINDING MOLECULES}
본 발명은 판새아강(Elasmobranchii) 아부류의 종의 구성원으로부터 유래된 항원 특이적 결합 분자의 합성 라이브러리, 이의 제조 방법 및 상기 라이브러리로부터 단리된 특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
질환을 퇴치하기 위해 특정한 점차 효과적 및 다양한 치료학적 무기에 대한 검색은 종래의 소분자로부터 점증적으로 보다 큰 생물학적 약제까지, 예를 들면, 단일 결합 도메인(10 내지 15kDa)로부터 완전 IgG(약 150kDa)까지 무수한 상이한 양상을 이용하고 있다. 잠재적 치료제로서 현재 연구하의 단일 도메인은 모두 이들의 연관 잇점 및 단점을 갖는 광범위한 상이한 단백질 스캐폴드를 포함한다.
이러한 단일 도메인 스캐폴드는 상이한 종의 단백질 어레이로부터 유래될 수 있다. 면역글로불린 이소형 신규 항원 수용체(IgNAR)은 수염 상어(Ginglymostoma cirratum) 및 기타 상어 및 가오리 종의 혈청에서 본래 발견된 호모이량체성 중쇄 복합체이다. IgNAR은 경쇄를 함유하지 않는다. 각각의 분자는 단일-가변 도메인(VNAR) 및 5개의 불변 도메인(CNAR)로 구성되어 있다. 문헌에서의 명명법은 IgNAR을 면역글로불린 이소형 신규 항원 수용체 또는 면역글로불린 이소형 신규 항원 신 항원 수용체로서 지칭하고, 당해 용어는 동의이다.
면역글로불린 또는 면역글로불린-양 상어 가변 신규 항원 수용체(VNAR)[참조: Fennell, B.J., et al., J Mol Biol, 2010. 400(2): p. 155-70]에 추가하여, 기타 예는 낙타과 가변 중쇄(VHH) 도메인[참조: Wesolowski, J., et al., Med Microbiol Immunol, 2009. 198(3): p. 157-74], 조작된 인간 가변 중쇄(VH) 도메인[참조: Chen, W., et al., J Mol Biol, 2008. 382(3): p. 779-89] 및 불변 중쇄(CH2)[참조: Dimitrov, D.S., MAbs, 2009. 1(1): p. 26-8], 세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA4)[참조: Nuttall, S.D., et al., Proteins, 1999. 36(2): p. 217-27] 도메인, 칠성장어 가변 림프구 수용체(VLR)[참조: Tasumi, S., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(31): p. 12891-6]이다. VNAR 및 낙타과 가변 중쇄(VHH) 단편 사이의 유사성은 디설파이드 결합 및 나노몰 범위의 결합 친화성의 존재를 포함한다.
또한, 피브로넥티 유형 III(FN3)[참조: Bloom, L. and V. Calabro, Drug Discov Today, 2009. 14(19-20): p. 949-55], DARPins, 안티칼린(Anticalins) 및 아피바디(Affibodies)[참조: Gebauer, M. and A. Skerra, Curr Opin Chem Biol, 2009. 13(3): p. 245-55]를 예로서 포함하는 "비-면역글로불린" 도메인의 숙주도 있다. 현재 단일 도메인 생물제는 각종 상이한 징후에 대한 치료제로서 이들의 성공적 적용을 향해 집중적 연구의 대상이다.
현재까지, I, II 및 III으로 공지된 3개의 정의된 유형의 상어 IgNAR이 있다(도 1). 이들은 강력한 선택적 압력하에 있고 따라서 드물게 대체되는 비-표준적 시스테인 잔기의 위치에 기반하여 분류되어 있다.
3개의 모든 유형은, 위치 36에 불변 트립토판과 함께, 표준 면역글로불린 폴드를 안정화시키는 위치 35 및 107에 고전적 면역글로불린 표준 시스테인을 갖는다. 자체로서 정의된 CDR2는 없지만, TCR HV2 및 HV4에 보다 근접하게 비교하는 서열 변화의 영역은 각각 프레임워크 2 및 3에 정의되어 있다. 유형 I은 프레임워크 2 및 프레임워크 4에 생식세포 코딩된 시스테인 잔기 및 CDR3 내에 짝수의 추가 시스테인을 갖는다. 리소자임에 대해 및 이와 복합체로 단리된 유형 I IgNAR의 결정 구조 연구는 이들 시스테인 잔기의 기여를 결정할 수 있게 했다. 프레임워크 2 및 4 시스테인 둘 다는 CDR3 중의 이들과 디설파이드 브릿지를 형성하여, CDR3 루프가 HV2 영역을 향해 단단하게 하향 유지되는 단단하게 밀집된 구조를 형성한다. 현재까지, 유형 I IgNAR은 단지 수염 상어에서 동정되었고, 동일한 목의 구성원을 포함하는 보든 기타 판새아강은 유형 II 또는 이러한 유형의 변이체만을 갖는다.
유형 II IgNAR은 CDR1 및 CDR3에 시스테인 잔기를 갖는 것으로 정의되어 있고, 이는 이들 2개 영역을 근접하게 보유하는 분자내 디설파이드 결합을 형성하여, 결합 포켓 또는 그루브를 조장하는 돌출 CDR3(도 2)를 제공한다. 유형 I 서열은 전형적으로 각각 평균 21 및 15개 잔기를 갖는 유형 II보다 더 긴 CDR3을 갖는다. 이는 이들의 프레임워크 2 및 4 카운터파트와 회합하기 위해 유형 I CDR3 중의 2개 이상의 시스테인 잔기에 대한 강력한 선택적 압력에 기인하는 것으로 생각된다. 체세포 돌연변이의 축적에 대한 연구는 유형 I보다 유형 II의 CDR1에서 보다 큰 수의 돌연변이가 있음을 나타내는 반면, 유형 I의 HV2 영역은 유형 II보다 큰 서열 변이를 나타낸다. 이러한 증거는 항원 결합 부위 내의 이들 영역의 결정 위치와 양호하게 상관한다. 유형 III으로 공지된 제3 IgNAR은 신생아에서 동정되었다. IgNAR 계열의 이러한 구성원은 V-유전자를 갖는 D1 및 D2 영역(CDR3을 형성)의 생식세포 융합에 기인하여 CDR3 내의 다양성을 결여한다. 거의 모든 공지된 클론은 서열 다양성이 거의 또는 전혀 갖지 않는 15개 잔기의 CDR3 길이를 갖는다.
이들의 잠재적 잇점을 강조할 뿐만 아니라 이들의 적용에서 투자 범위를 강조하는 단일 도메인 결합 분자의 임상 실험으로부터 유망한 결과가 있다[참조: Holliger, P. and P.J. Hudson, Nat Biotechnol, 2005. 23(9): p. 1126-36]. 다양한 근거는, 보다 크고 보다 많은 생물 카운터파트, 예를 들면, 완전 IgG와 반대로 작은 단일 도메인 스캐폴드를 선택하기 위해 제안되어 있다. 보다 광범위하게 인용된 것들 중에, 이들의 보다 작은 크기의 결과로서 이들이 혈액 뇌 관문을 통과하고 증가된 조직 침투를 통해 고형 종양을 표적화하기에 보다 용이하게 적합할 수 있다는 일반적 가정이 종종 있다. 일반적으로, 낙타 및 상어 종에 대해 보고된 단일 도메인은 또한 구조적으로 상이한 파라토프를 형성하는 것으로 의심되고, 결과적으로 이들은 효소 활성 부위 등의 크레프트의 표적화를 촉진시킬 수 있다.
그러나, 다수의 이들 특징과 관련하여 정보의 상대적 부족이 여전히 있다는 것에 유의해야 한다. 일부 단일 도메인은 변성 후에 리폴딩 경향에 추가하여 고도의 고유한 열안정성을 입증했다. 이러한 특징은 일반적으로 시장으로 생물학적 치료법을 가져오는데 필요한 대규모 프로세스 개발에 유리할 것이다. 또한, 이들 특징은 단일 도메인 접근법을 약물 전달의 대체 모드에 보다 용이하게 접근할 수 있게 할 것이다. 개개 단위 도메인 접근법를 사용하는 결과는, 또한 복수의 상이한 특이성을 갖는 조합된 다중도메인 방식의 가능성을 제공하는 "빌딩-블록" 합성에 적용할 수 있다.
파지 디스플레이는 고친화성으로 표적 항원에 결합하는 이들 서열을 신속하게 선별할 수 있는 단백질 변이체의 거대 라이브러리의 생성을 가능하게 한다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 바이러스 코트 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 융합된다. 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드의 라이브러리는 랜덤 DNA 서열을 삽입하여 단일 유전자를 변경하거나 관련 유전자의 계열을 클로닝하는 것을 포함하는 다수의 방식으로 제조되어 왔다. 이어서, 라이브러리는 목적하는 특징을 갖는 항체 또는 항원 결합 단백질의 발현을 위해 스크리닝된다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 갖는 항체를 제조하는 종래의 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇가지 잇점을 갖는다. 이 기술은 보다 적은 시간으로 동물의 사용 없이 다양한 서열을 갖는 항체의 거대 라이브러리의 개발을 가능하게 한다.
라이브러리로부터 고친화성 항체의 단리는 라이브러리의 크기, 세포 세포에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 의존한다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합 단백질의 부적절한 폴딩 및 정지 코돈의 존재에 기인하여 생성의 비효율성에 의해 감소된다. 세포 세포에서의 발현은, 항체 또는 항원 결합 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면 또는 선택된 CDR 잔기에서 순차로 잔기를 돌연변이시킴으로써 개선될 수 있다. 프레임워크 영역의 서열은, 항체 파지 라이브러리가 세균 세포에서 생산되는 경우, 적절한 폴딩을 제공하는 요인이다.
항체 또는 항원 결합 단백질의 다양한 라이브러리를 생성하는 것은 또한 고친화성 항체의 단리에 중요하다[참조: 예를 들면, WO 03/102157, WO 03/014161, 및 WO 2005/118629]. CDR3 영역은, 이들이 항원 결합에 관여하는 것으로 종종 알려져 있기 때문에 부분적으로 흥미롭다.
본 발명은 Ig-양 신규 항원 수용체 가변 도메인(VNAR)에 관한 것이다. 그러나, 낙타 VHH 도메인과 다소 유사하게(그러나 상이한 조상 분자 계통), 파지-표시된 라이브러리 작제물 및 특정의 결합제 선택을 기재하는 문헌 보고의 발생은 비교에 의해 천연 상어 레퍼토리를 사용하여 덜 빈번하고 희귀하다[참조: Nuttall, S.D., et al., FEBS Lett, 2002. 516(1-3): p. 80-6; Liu, J.L., et al., Mol Immunol, 2007. 44(7): p. 1775-8]. 현재까지 다수의 단리된 VNAR 도메인은 표적-면역화된[참조: Dooley, H., M.F. Flajnik, and A.J. Porter, Mol Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33; Nuttall, S.D., et al., Proteins, 2004. 55(1): p. 187-97; and Dooley, H., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(6): p. 1846-51], 또는 PCR에 의해 상보성 결정 영역 3(CDR3)에 표적화된 합성 다양성[참조: Nuttall, S.D., et al., Mol Immunol, 2001. 38(4): p. 313-26; Nuttall, S.D., et al., Eur J Biochem, 2003. 270(17): p. 3543-54; and Liu, J.L., G.P. Anderson, and E.R. Goldman, BMC Biotechnol, 2007. 7: p. 78]과 조합된 "천연" 비-면역화된 다양성으로부터의 조직을 사용하여 작제된 파지-표지된 라이브러리로부터 수득되었다.
상어 면역화-전략은 고친화성의 고특이적 VNAR 도메인을 단리하는 강력한 방식이지만, 이 방법은, 요구되는 장기간 면역화 스케쥴 및 상어-종 또는 이소형 인식 시약의 일반적 부족 등과 같은 몇몇 기술적 과제를 제시한다. 따라서, 본 발명은, 상술한 과제를 회피하는 효과에 있어서 임의의 소정 표적에 대한 잠재적 VNAR 치료제를 효과적으로 공급하기 위해 사용될 수 있는 합성 VNAR 라이브러리를 제공한다. 이상적으로, 연구자들은, 인간 및 마우스 항체의 단리에 현재 광범위하게 사용되는 동일한 생물학적 약물 발견 프로세스에서 동물의 필요 없이, VNAR를 신속하게 유도하기 위해 디스플레이 라이브러리 기술을 사용할 수 있어야 한다.
본 발명은 동일한 종 내의 상이한 이소형 및 상이한 판새아강 종에서 상이한 이소형으로부터 2개 이상의 천연 발생 VNAR 서열로부터 작성된 라이브러리로부터 단리한 VNAR의 예상치 않은 다양성, 친화성, 특이성 및 유효성에 기반한다. 상이한 이소형 및 상이한 종 프레임워크를 함께 융합하는 이러한 신규한 접근법은 단일 프레임워크 라이브러리를 사용하여 달성할 수 없는 라이브러리 내의 증가된 다양성을 생성하는 잇점을 갖는다. 잇점은 다음을 포함하지만, 이로써 한정되지 않는다:
ㆍ 상이한 이소형의 융합을 통해 양 CDR 영역, 양 HV 영역 및 프레임워크 영역 내에서 생성된 추가의 다양성
ㆍ 상이한 판새아강 종으로부터 상이한 이소형의 융합을 통해 양 CDR 영역, 양 HV 영역 및 프레임워크 영역 내에서 생성된 추가의 다양성
ㆍ 트리뉴클레오티드(TRM) 올리고를 사용한 지시된 돌연변이유발 및 양 CDR 영역 내의 NNK 올리고의 사용에 의한 랜덤 돌연변이유발을 통해 생성된 추가의 다양성
ㆍ CDR1 및 CDR3 전체에서 쌍을 이루는 고전적 유형 II 시스의 잠재적 부가를 제공하기 때문에, NNK 올리고와 조합하여 천연 발생 CDR1 영역을 사용함으로써 융합된 프레임워크 영역을 초과하여 추가의 이소형 다양성
ㆍ 다양한 CDR3 영역의 상이한 고정 길이의 사용을 통한 추가의 다양성
ㆍ 이전에 보고된 임의의 상어 라이브러리(천연, 면역 또는 합성)보다 2차수 더 큰 >9×1010클론의 증가된 라이브러리 크기
본 발명은 일반적으로 항원 특이적 항원 결합 분자의 라이브러리에 관한 것이다. 상기 라이브러리는, CDR 영역 및 프레임워크 영역 둘 다에서 다양성을 작성함으로써 생성된, 도메인 및/또는 이의 단편을 포함하는 복수의 상이한 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 특히, CDR 영역에서의 다양성은 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 VNAR 서열 및 도메인의 구조적 변동을 최소화하면서 다양성을 최대화하도록 설계된다.
이러한 라이브러리는, 예를 들면, 결합 친화성 및 갈망 등의 목적하는 활성을 갖는 합성 VNAR 클론을 선택 및/또는 스크리닝하는데 유용한 조합 라이브러리를 제공한다. 이들 라이브러리는 임의의 광범위한 표적 항원과 상호작용할 수 있는 서열을 동정하는데 유용하다. 예를 들면, 파지 상에서 표시된 본 발명의 다양한 VNAR 폴리펩티드를 포함하는 라이브러리는 목적하는 항원 결합 분자를 선택 및/또는 스크리닝하는데 특히 유용하고, 이의 높은 처리, 효율적 및 자동화 시스템을 제공한다. 본 발명의 방법은 공급원 또는 주형 분자에 대해 최소 변화를 갖는 표적 항원에 대한 고친화성 결합제를 제공하도록 설계되고, 항체 또는 항원 결합 단편이 세포 배양물에서 생산되는 경우에 우수한 생산 수율을 제공하도록 설계된다.
본 발명은 바람직하게는 선택된 항원에 대해 고친화성을 갖는 신규한 VNAR 또는 이의 단편을 생성 및 단리하는 방법을 제공한다. 복수의 상이한 VNAR 또는 VNAR 도메인은 이들 위치에서 변이체 아미노산을 갖는 VNAR 도메인의 다양한 라이브리러를 생성하기 위해 공급원 주형 VNAR 서열 중의 하나 이상의 선택된 아미노산 위치를 돌연변이(다양화)시킴으로써 제조된다. 아미노산 위치는, 예를 들면, 공급원 VNAR의 구조를 분석함으로써 측정된 바와 같이 접근가능한 용매이고/이거나 공지된 및/또는 천연 발생 VNAR 폴리펩티드 중에서 고도로 다양한 것들이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 도메인(또는 이의 부분)의 융합 폴리펩티드 및 바이러스의 코트 단백질 등의 이종성 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 융합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 복제가능한 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포, 바이러스의 표면 상에서 상기 융합 폴리펩티드를 표시하는 바이러스, 상기 바이러스의 표면 상에 복수의 상이한 융합 폴리펩티드를 표시하는 바이러스의 라이브러리 및 이들 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법 및 조성물은 치료학적으로 또는 시약으로 사용될 수 있는 신규 항원 특이적 항원 결합 분자를 동정하는데 유용하다.
본 발명의 제1 측면에 따르면,
(1) 판새아강(Elasmobranchii) 아부류의 종의 구성원으로부터 RNA를 단리하는 단계;
(2) 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열의 데이터베이스를 작성하기 위해 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 단계(1)에서 수득한 RNA로부터 DNA 서열을 증폭시키는 단계;
(3) 단계(2)에서 제조한 데이터베이스로부터 DNA 서열을 선택하는 단계;
(4) FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 2개 이상의 연속 펩티드 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키는 단계로서, 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인이, 연결되는 경우, 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하고, 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인이 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 복수의 증폭된 DNA 서열을 형성하기 위해 단계(3)에서 선택된 서열에서 CDR1 또는 CDR3 도메인과 상보성인 복수의 이종성 올리고머의 존재하에 단계(3)에서 선택된 적어도 2개의 이종성 DNA 서열로부터 유래하는, 단계;
(5) 서열식 I의 펩티드 도메인을 갖는 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 형성하기 위해 2개 이상의 연속 펩티드 도메인을 코딩하는 상기 증폭된 DNA 서열을 함께 연결시키는 단계;
(6) 단계(3)에서 수득된 증폭된 DNA를 디스플레이 벡터에 클로닝하는 단계 및
(7) 숙주를 상기 디스플레이 벡터로 형질전환시켜 상기 항원 특이적 항원 결합 분자의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는, 하기 서열식 I로 나타내어지는 펩티드 도메인 구조를 갖는 항원 특이적 항원 결합 분자의 라이브러리를 제조하는 방법이 제공된다.
서열식 I
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4
본 발명의 방법에서, RNA는 판새아강 아부류(Elasmobranchii subclass)에서 종(species)의 하나의 구성원 또는 몇몇 상이한 구성원으로부터 단리될 수 있다. 따라서, 판새아강 아부류에서 종의 구성원에 대한 참조는 또한 판새아강 아부류에서 종의 하나 이상의 상이한 구성원에 대한 참조를 포함한다. 따라서, 본 발명의 제1 측면의 단계(1)은 판새아강 아부류에서 종의 구성원 또는 구성원들로부터 RNA를 단리하는 것을 포함한다.
판새아강은 부류 연골어류의 아부류이고, 연골어류, 상어, 가오리 및 홍어를 포함한다. 이러한 아부류의 구성원은 추가로 11개 목으로 추가로 세분될 수 있다: 카르카리니포메스(Carchariniformes); 헤테로돈티포르메스(Heterodontiformes); 헥산키포르메스(Hexanchiformes); 람니포르메스(Lamniformes); 오렉톨로비포르메스(Orectolobiformes); 프리스티포르메스(Pristiformes); 라지포르메스(Rajiformes); 스쿠알리포르메스(Squaliformes); 스쿠아티니포르메스(Squatiniformes); 토르페디니포르메스(Torpediniformes). 이어서, 각각의 목은 다수의 과로 세분될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 2개의 종: 오렉톨로브포르메스목의 깅글리모스토마티다에과의 징글리모스토마 시라툼(Ginglymostoma cirratum) 및 스쿠알리포르메스목의 스쿠알리다에과의 스쿠알루스 아칸티아스(Squalus acanthias)에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 방법에서, 연결되는 경우, FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4로 나타내어지는 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 펩티드 도메인이 사용될 수 있다.
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인은 FW1, CDR1, FW2, HV2, FW3a, HV4, FW3, CDR3 및 FW4, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 2개, 3개, 4개 또는 5개의 이러한 펩티드 도메인이 존재할 수도 있다.
연결되는 경우, 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 연속 펩티드 도메인의 잠재적 조합은 하기 서열식 III의 정의될 수 있다:
서열식 III
P-Q-R,
상기 서열식에서,
P-Q-R는 FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4이고,
각각의 P, Q 및 R은 연속 펩티드 도메인을 나타내고,
임의로, Q 또는 R는 부재한다. 연결되는 경우, 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 연속 펩티드 도메인의 일부 비제한적 예는 하기 표에 제시되어 있다:
Figure pct00001
함께 연결되는 경우, 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 연속 펩티드 도메인의 다른 단편은 편리한 별개의 방식으로 서열식 I에 정의된 펩티드 도메인 서열을 분할함으로써 제조할 수 있다.
각각의 프레임워크(FW) 영역이 별개의 단편에 존재하는 경우, 잠재적으로 4 또는 5개의 펩티드 도메인이 제조될 수 있다. 어느 경우에도, 서열식 III은 다음과 같이 나타내어진다:
P-Q-R-S
여기서, 4개의 별개의 펩티드 도메인이 존재하고, P-Q-R-S는 FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4이고, 각각의 P, Q, R 및 S는 연속 펩티드 도메인을 나타내거나;
P-Q-R-S-T
여기서, 5개의 별개의 펩티드 도메인이 존재하고, P-Q-R-S-T는 FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4이고, 각각의 P, Q, R, S 및 T는 연속 펩티드 도메인을 나타낸다.
이들 대안적 실시형태에 따르는 연속 펩티드 도메인의 예는 하기 표에 제시되어 있다:
Figure pct00002
본 발명의 이러한 측면의 한 가지 실시형태에서, 2개 이상의 연속 펩티드 도메인은 FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4 are FW1, CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b 및 CDR3-FW4로 나타내어지는 3개의 도메인이다.
본 발명의 이러한 실시형태에서, 단계(4)는 (4) 펩티드 도메인 FW1, CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3 및 CDR3-FW4을 코딩하는 복수의 증폭된 DNA 서열을 형성하기 위해 단계(3)에서 선택된 서열에서 CDR1 또는 CDR3에 상보성인 복수의 이종성 올리고머의 존재하에 단계(3)에서 선택된 적어도 2개의 이종성 DNA 서열로부터 펩티드 도메인 FW1, CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3 및 CDR3-FW4을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키는 것으로 정의된다. 결과적으로, 본 발명의 이러한 실시형태에 따르는 단계(5)는 서열식 I의 펩티드 도메인 구조를 갖는 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 형성하기 위해 펩티드 도메인 FW1, CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3 및 CDR3-FW4를 코딩하는 상기 증폭된 DNA 서열을 함께 연결시키는 것으로 정의할 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 상이한 맥락에서 주형 유래 HV2 및 HV4 루프는 각각 유래된 FW1, CDR1 및 CDR3 단편과 쌍을 이루는 주형 유래 HV2 및 HV4를 코딩하는 PCR 단편을 대안적으로 스플라이싱함으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 방법의 단계(3)에 따라 단계(2)에서 제조된 데이터베이스로부터 DNA 서열의 선택은 제조된 DNA 서열에 대한 발현된 아미노산 서열의 분석에 따라 이루어질 수 있다. 번역된 DNA 서열은 CDR3 길이 분포에 추가하여 분석된 모집단 전체에서 아미노산(AA) 함량, 상대 위치 보존 및 빈도의 관점에서 검사할 수 있다.
라이브러리로부터 발현된 서열과 비교된 천연 서열의 데이터베이스에서 발현된 DNA 서열의 분석으로부터, CDR1 및/또는 CDR3 중의 천연 내용물 및 CDR1 및/또는 CDR3에 존재하는 상대 다양성의 정도에 기반하여 DNA 서열을 선택할 수 있다.
천연 서열 내용물은 상응하는 천연 발현된 VNAR 서열과 비교하여 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95%, 예를 들면, 약 80 내지 약 95% 또는 약 85% 내지 약 90%의 서열 동일성으로 정의된다. 고도의 다양성은 상응하는 천연 발현된 VNAR 서열과 비교하여 약 60 내지 약 75%, 적합하게는 약 65% 내지 약 70%의 서열 동일성으로 정의되고, 여기서 약 60 내지 약 65%의 다양성이 적합할 수 있다.
예를 들면, CDR1의 천연 버젼 및 CDR3 상에서 고도의 다양성을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 시스테인 잔기의 부가는 DNA 증폭 프로세스에서 TRM 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자는 기본 구조(본원에 정의된 바와 같음)에 따라 본원에 개시된 다양한 영역에 대한 임의의 아미노산 서열로 작제될 수 있다:
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4
여기서,
각각의 FW1, CDR1, FW2, HV2, FW3a, HV4, FW3b, CDR3 및 FW4는 펩티드 서열을 나타내고, "FW"는 "프레임워크" 영역이고, "CDR1"는 "상보성 결정 영역 1"이고, "HV"는 "초가변" 영역이고, "CDR3"은 "상보성 결정 영역 3"이다. 적합한 펩티드 도메인 서열의 예는 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 특이적 항원 결합 분자는 문헌[참조: Liu et al, Liu et al Mol. Immunol. 44, 1775-1783 (2007) and Liu et al BMC Biotechnology, 7(78) doi:10.1186/1472-6750-7-78 (2007)]에 따라 VNAR의 명명법의 일반 구조에 따라 분류할 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 단계(4)에서 DNA의 증폭은 시스테인을 제외한 임의의 아미노산을 코딩하는 올리고머의 존재하에 수행된다. 달리 말하면, 증폭된 DNA에 의해 코딩된 수득되는 CDR 영역은 시스테인을 포함하지 않는다. 그러나, 다른 실시형태에서, 시스테인은 CDR 영역에 존재할 수도 있다.
모든 VNAR은 고전적 면역글로불린(Ig) 폴드를 생성하는 FW1 및 FW3 중에 2개의 표준 cys 잔기를 함유한다. 또한, 이들은 CDR 및 FW 중에 여분의 시스테인(cys) 잔기의 부가를 특징으로 한다.
유형 I: FW-CDR3 염기쌍이 단단하게 제한된 CDR3 구조를 형성하는 CDR3 중의 2개의 여분 cys에 추가하여 FW2 및 FW4 중의 비-표준 cys 잔기
유형 II: 돌출 위치에서 CDR3 존재를 제공하는 디설파이드 브릿지를 생성하는 CDR1 및 CDR3 중에 비-표준 cys 잔기
유형 III: 유형 II와 같지만 CDR1 중에 보존된 W를 함유하는 비-표준 cys 잔기
상기 모든 유형은 수염 상어 명명법에 기반한다. 본 발명에 있어서, 다음과 같이 "유형 b" 변이체로서 기재되어 있는 기타 신규 이소형이 단리되었다:
유형 IIb: CDR1 및 CDR3 중의 비-표준 cys 잔기 부재 - 매우 유연한 CDR3 제공(2V는 유형 IIb 변이체의 예이다).
유형 IIIb: CDR1 중의 비변이체 W를 갖는 CDR1 및 CDR3 중의 비-표준 cys 잔기 분재(5V는 유형 IIIb 변이체의 예이다).
보다 유연한 CDR3 영역을 제공할 수 있는 CDR1 및 CDR3 중에 비-표준 시스테인(C) 잔기가 부재하는 것을 보장하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 구조는 "유형 IIb" 이소형으로 지칭될 수 있고, 이는 문헌[참조: Liu et al, Liu et al Mol. Immunol. 44, 1775-1783 (2007) and Liu et al BMC Biotechnology, 7(78) doi:10.1186/1472-6750-7-78 (2007)]에 따라 VNAR에 대한 수염 상어 명명법의 일반 구조에 따른다.
대안적 실시형태에서, CDR1 및 CDR3 중에 비-표준 시스테인(C) 잔기가 부재하지만 CDR1 중에 비변이체 트립토판(W)를 갖도록 하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이러한 구조는 "유형 IIIb" 이소형으로 지칭될 수 있고, 이는 문헌[참조: Liu et al (상기 인용됨)]에 따라 VNAR에 대한 수염 상어 명명법의 일반 구조에 따른다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 항원 특이적 항원 결합 분자는 유형 IIb 및 유형 IIIb VNAR로부터 영역 FW1, CDR1, FW2, HV2, FW3a, HV4, FW3b, CDR3 및/또는 FW4의 융합일 수 있다. 융합된 IIb 및 IIIb는 VNAR 구조를 형성하기 위해 필요에 따라 임의의 순서로 연결될 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 선택된 DNA 서열은 도메인 FW3b 중에 최종 3개 아미노산 잔기를 CKA, CRA 또는 CNA로서 갖고, FW4의 최초 3개 아미노산 잔기를 Y 또는 D/G 또는 D/D 또는 A로서 가질 수 있다. 기타 FW3b 서열은 변이체, 예를 들면, CRG, CKV, CKT 및 또는 CHT를 포함할 수 있다.
이소형의 기타 대안적 융합체가 또는 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 유형 I VNAR로부터의 영역은 유형 III VNAR과 융합될 수 있거나, 유형 I VNAR로부터의 영역은 유형 II VNAR과 융합될 수 있다. 이소형 영역 유형 I, 유형 II 및 유형 III의 변이체, 예를 들면, 본 발명에 기재된 바와 같은 유형 Ib, 유형 IIb 및 유형 IIIb의 변이체가 또한 포함된다. 융합체는 또한 VNAR 계열에 대한 임의의 이소형 융합, 즉 판새아강의 임의의 종으로부터 단리된 이소형 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 돔발 상어의 유형 II 영역과 융합된 수염 상어의 유형 II 영역, 또는 돔발 상어의 유형 IIIb와 융합된 수염 상어의 유형 IIb.
본 발명에 따르면, 라이브러리는 동일한 종 내의 상이한 이소형 및 상이한 판새아강 종의 상이한 이소형으로부터 2개 이상의 천연 발생 VNAR 서열로부터 생성될 수 있다. 상이한 이소형 및 상이한 종 프레임워크를 함께 융합시키는 이러한 접근법은 단일 프레임워크 라이브러리를 사용하여 달성할 수 없는 라이브러리 내의 증가된 다양성을 생성하는 잇점을 갖는다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 2개의 상이한 판새아강 종: 스쿠알루스 아칸티아스(Squalus acanthias) 및 징글리모스토마 시라툼(Ginglymostoma cirratum)의 VNAR의 3개의 상이한 이소형이 조합되었다. 프레임워크 융합 작제물은 돔발 상어의 유형 IIb 및 유형 IIIb VNAR 도메인 및 수염 상어의 유형 II VNAR 도메인을 도입하도록 설계되었다.
본 발명의 추가의 실시형태는 고전적 유형 II VNAR 도메인에서 보는 바와 같이 CDR1 대 CDR3 디설파이드 브릿징에 대한 가능성을 생성함으로써 다양성을 증가시키는 CDR 영역에 대한 시스테인(cys) 잔기의 도입이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 판새아강 아부류에서 종의 구성원으로부터 RNA를 단리시키는 단계(1)은 사전에 면역화되지 않은 대상체, 즉 프레임워크 재료의 천연 또는 자연 공급원으로부터 RNA를 단리할 수 있다. 다른 실시형태에서, RNA는 사전에 면역화시킨 대상체로부터 공급될 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따르면,
(1) 본 발명의 제1 측면에 따라 제조한 라이브러리로부터 목적하는 클론을 선택하는 단계;
(2) 이들 클론으로부터 항원 특이적 항원 결합 분자를 단리 및 정제하는 단계;
(3) 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계 및
(4) 숙주를 형질전환시켜 발현 벡터의 발현을 가능하게 하는 단계를 포함하여, 항원 특이적 항원 결합 분자의 생산 방법이 제공된다.
본 발명의 제3 측면에 따르면,
(1) 판새아강(Elasmobranchii) 아부류의 종의 구성원으로부터 RNA를 단리하는 단계;
(2) 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열의 데이터베이스를 작성하기 위해 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 단계(1)에서 수득한 RNA로부터 DNA 서열을 증폭시키는 단계;
(3) 단계(2)에서 제조한 데이터베이스로부터 DNA 서열을 선택하는 단계;
(4) FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 2개 이상의 연속 펩티드 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키는 단계로서, 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인이, 연결되는 경우, 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하고, 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인이 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 복수의 증폭된 DNA 서열을 형성하기 위해 단계(3)에서 선택된 서열에서 CDR1 또는 CDR3 도메인과 상보성인 복수의 이종성 올리고머의 존재하에 단계(3)에서 선택된 적어도 2개의 이종성 DNA 서열로부터 유래하는, 단계;
(5) 서열식 I의 펩티드 도메인을 갖는 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 형성하기 위해 펩티드 도메인 FW1, CDR1-FW2-HV2-FW3a, 및 CDR3-FW4를 코딩하는 상기 증폭된 DNA 서열을 함께 연결시키는 단계;
(6) 단계(5)에서 수득된 증폭된 DNA를 디스플레이 벡터에 클로닝하는 단계;
(7) 숙주를 상기 디스플레이 벡터로 형질전환시켜 상기 항원 특이적 항원 결합 분자의 라이브러리를 생성하는 단계;
(8) 목적하는 클론을 상기 라이브러리로부터 선택하는 단계
(9) 상기 클론으로부터 항원 특이적 항원 결합 분자를 단리 및 정제하는 단계;
(10) 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계 및
(11) 숙주를 형질전환시켜 발현 벡터의 발현을 가능하게 하는 단계를 포함하는, 하기 서열식 I로 나타내어지는 펩티드 도메인 구조를 갖는 항원 특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법.
서열식 I
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4
본 발명의 방법에서, RNA는 판새아강 아부류의 종의 하나의 구성원 또는 몇몇 상이한 구성원으로부터 단리될 수 있다. 따라서, 판새아강 아부류에서 종 구성원에 대한 참조는 또한 판새아강 아부류에서 종의 하나 이상의 상이한 구성원에 대한 참조를 포함한다. 따라서, 본 발명의 제3 측면의 단계(1)은 판새아강 아부류에서 종의 구성원 또는 구성원들로부터 RNA를 단리하는 것을 포함할 수 있다.
단계(3)에서 DNA 서열의 선택은 본 발명의 제1 측면과 관련하여 기재된 바와 같다. 따라서, 본 발명의 이러한 측면은 복수의 이러한 분자의 생산을 포함한다.
단계(4)에서 FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 연속 펩티드 도메인의 조합은 본 발명의 제1 측면과 관련하여 기재된 바와 같다. 본 발명의 이러한 측면의 한 가지 실시형태에 따르는 단계(4)는 펩티드 도메인 FW1, CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3 및 CDR3-FW4를 코딩하는 복수의 증폭된 DNA 서열을 형성하기 위해 단계(3)에서 선택된 서열에서 CDR1 또는 CDR3 도메인에 상보성인 복수의 이종성 올리고머의 존재하에 단계(3)에서 선택된 적어도 2개의 이종성 DNA 서열로부터 펩티드 도메인 FW1, CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b 및 CDR3-FW4를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키는 것으로 정의할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시형태에 따르는 단계(5)는 서열식 I의 펩티드 도메인 구조를 갖는 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 형성하기 위해 펩티드 도메인 FW1, CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3 및 CDR3-FW4를 코딩하는 상기 증폭된 DNA 서열을 연결시키는 것으로 정의할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 판새아강 아부류에서 종의 구성원으로부터 RNA를 단리하는 단계(1)은 사전에 면역화되지 않은 대상체, 즉 프레임워크 재료의 천연 또는 자연 공급원으로부터 RNA를 단리할 수 있다. 다른 실시형태에서, RNA는 사전에 면역화시킨 대상체로부터 공급될 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 단계(4)에서 DNA의 증폭은 시스테인을 제외한 임의의 아미노산의 서열을 코딩하는 올리고머의 존재하에 수행된다. 달리 말하면, 증폭된 DNA에 의해 코딩된 수득되는 CDR 영역을 시스테인을 포함하지 않는다. 그러나, 다른 실시형태에서, 시스테인은 CDR 영역에 존재할 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 따르면, 복수의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 발현가능한 DNA 서열의 라이브러리를 함유하는 형질전환된 숙주를 사용하여 항원 특이적 항원 결합 분자를 생산하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 라이브러리는 적어도 2개의 이종성 이소형 NAR 서열로부터 생성되고, 상기 항원 특이적 항원 결합 분자는 판새아강 아부류에서 종의 구성원에서 발견된 면역글로불린 이소형 NAR의 가변 영역의 복수의 도메인을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 판새아강 아부류에서 종의 구성원으로부터 RNA를 단리하는 단계(1)은 사전에 면역화시키지 않은 대상체, 즉 프레임워크 재료의 천연 또는 자연 공급원으로부터 RNA를 단리할 수 있다. 다른 실시형태에서, RNA는 사전에 면역화시킨 대상체로부터 공급될 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 단계(4)에서 DNA의 증폭은 시스테인을 제외한 임의의 아미노산의 서열을 코딩하는 올리고머의 존재하에 수행된다. 달리 말하면, 증폭된 DNA에 의해 코딩된 수득되는 CDR 영역은 시스테인을 포함하지 않는다. 그러나, 다른 실시형태에서, 시스테인은 CDR 영역에 존재할 수도 있다.
본 발명의 제5 측면에 따르면, 하기 서열식 II로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 50% 상동성인 서열을 포함하는 항원 특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
서열식 II
A-X-B-Y-C
상기 서열식 II에서,
A는 서열번호 1, 서열번호 4 또는 서열번호 7이고,
X는 5, 6 또는 7개 아미노산 잔기의 CDR1 영역이고,
B는 서열번호 2, 서열번호 5 또는 서열번호 8이고,
Y는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 아미노산 잔기의 CDR3 영역이고,
C는 서열번호 3 또는 서열번호 6이고, 여기서,
서열번호 1은 TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDT, TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGA이고,
서열번호 2는 TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKA 또는 TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRA이고,
서열번호 3은 DGAGTVLTVN이고,
서열번호 4는 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDT 또는 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGA이고,
서열번호 5는 TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKA 또는 TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRA이고,
서열번호 6은 YGAGTVLTVN이고,
서열번호 7은 ARVDQTPQTITKETGESLTINCVLRD이고,
서열번호 8은 TYWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRA 또는 TYWYRKNPGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRA이다.
A, X, B, Y 및/또는 C로 나타내어진 아미노산 서열은 판새아강 아부류의 동일하거나 상이한 구성원으로부터 유래할 수 있다. A, X, B, Y 및/또는 C로 나타내어진 아미노산 서열은 또한 VNAR 서열의 동일하거나 상이한 이소형, 예를 들면, 유형 I, 유형 II 및/또는 유형 III(유형 Ib, 유형 IIb 및 유형 IIIb 포함)으로부터 유래할 수 있다. 따라서, 공급원 재료의 임의의 일반적으로 적합한 조합이 가능하다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 서열식 II A-X-B-Y-C는 요소 A, B 및 C가 (i) 서열번호 1, 2 및 3; (ii) 서열번호 1, 2 및 6; (iii) 서열번호 1, 5 및 3; (iv) 서열번호 1, 5 및 6; (v) 서열번호 4, 5 및 6); (vi) 서열번호 4, 5 및 3; (vii) 서열번호 4, 2 및 6; (viii) 서열번호 4, 2 및 3; (ix) 서열번호 7, 8 및 6; (x) 서열번호 1, 8 및 6으로 나타내어지는 서열로 구성될 수 있다.
A가 서열번호 1이고 B가 서열번호 2이고 C가 서열번호 3인 경우, 서열식 I의 서열의 한 가지 실시형태는 도 9에 제시된 바와 같이 서열번호 10이고, 여기서 CDR1 영역은 SYGLYS이고 CDR3 영역은 QSLAISTRSYWY이다.
A가 서열번호 4이고 B가 서열번호 5이고 C가 서열번호 6인 경우, 서열식 I의 서열의 한 가지 실시형태는 도 9에 제시된 바와 같이 서열번호 12이고, 여기서 CDR1 영역은 SYWASS이고 CDR3 영역은 YRMESIAGRGYDV이다.
서열번호 10 및 12는 단백질 서열을 코딩하는 상응하는 핵산 서열이 각각 또한 서열번호 9 및 11로서 제시되어 있는 도 9에 제시된 바와 같다.
CDR1 영역은 도 17에 제시된 바와 같은 임의의 CDR1 영역일 수 있다. CDR3 영역은 도 18에 제시된 바와 같은 임의의 CDR3 영역일 수 있다.
본 발명의 바람직한 항원 특이적 항원 결합 분자(펩티드) 및 본 발명의 라이브러리의 제조에 사용된 핵산 프라이머는 도 9 내지 18에 제시되어 있다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 도면에 제시된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 서열에 의해 나타낸 바와 같이, 프레임워크 영역은 도 11에 제시된 서열을 갖는 2V 및 5V로서 및 서열번호 9, 10, 11 및 12(및 서열번호 1 내지 8을 참조하여 상기 기재됨)로서 명명된 클론으로부터 유래할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면의 한 가지 실시형태에서, 서열식 II로 나타내어진 아미노산 서열 또는 이와 적어도 50% 상동성인 서열을 포함하는 항원 특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
서열식 II
A-X-B-Y-C
상기 서열식 II에서,
A는 서열번호 1 또는 서열번호 4이고,
X는 5, 6 또는 7개 아미노산 잔기의 CDR1 영역이고,
B는 서열번호 2 또는 서열번호 5이고,
Y는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 아미노산 잔기의 CDR3 영역이고,
C는 서열번호 3 또는 서열번호 6이고, 여기서
서열번호 1은 TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDT, TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGA이고,
서열번호 2는 TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKA 또는 TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRA이고,
서열번호 3은 DGAGTVLTVN이고,
서열번호 4는 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDT 또는 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGA이고,
서열번호 5는 TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKA 또는 TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRA이고,
서열번호 6은 YGAGTVLTVN이다.
A, X, B, Y 및/또는 C로 나타내어진 아미노산 서열은 판새아강 아부류의 동일하거나 상이한 구성원으로부터 유래할 수 있다. Z, X, B, Y 및/또는 C로 나타내어진 아미노산 서열은 또한 VNAR 서열의 동일하거나 상이한 이소형, 예를 들면, 유형 I, 유형 II 및/또는 유형 III(유형 Ib, 유형 IIb 및 유형 IIIb 포함)으로부터 유래할 수 있다. 따라서, 공급원 재료의 임의의 일반적으로 적합한 조합이 가능할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 서열식 II A-X-B-Y-C는 요소 A, B 및 C가 (i) 서열번호 1, 2 및 3; (ii) 서열번호 1, 2 및 6; (iii) 서열번호 1, 5 및 3; (iv) 서열번호 1, 5 및 6; (v) 서열번호 4, 5 및 6; (vi) 서열번호 4, 5 및 3; (vii) 서열번호 4, 2 및 6; (viii) 서열번호 4, 2 및 3으로 나타내어지는 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 방법에서, RNA는 사전에 면역화시키지 않은 판새아강 아부류에서 종의 구성원, "천연" 대상체로부터 단리된다. 판새아강 아부류는 상어, 홍어 및 가오리를 포함하는 연골 어류의 아부류이다. 일반적으로 적합한 예는 스쿠알리포르메스 목, 예를 들면, 돔발 상어(Squalus acanthias), 및 또한 오렉톨로비포르메스 목, 예를 들면, 수염 상어(Ginglymostoma cirratum)의 상어를 포함한다.
RNA는 본원에 기재된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 전혈을 포함하는 조직 샘플로부터 단리할 수 있다.
라이브러리를 구축하기 전에, 종합적인 cDNA 서열 데이터베이스는 조직 샘플에서 모든 천연 항원 특이적 항원 결합 분자(면역글로불린 이소형 신규 항원 수용체 또는 IgNAR) 전사체를 나타내는 레퍼토리를 증폭시키기 위해 프라이머 설계 목적으로 제조할 수 있다. 라이브러리의 한 가지 예는 파지 디스플레이 라이브러리이다.
데이터베이스는 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열의 증폭에 의해 생성할 수 있다. 적합하게는, 이 프로세스는 "RACE"(cDNA 말단의 신속한 증폭)에 사용하기 위해 3' RACE 프라이머를 설계하는 부분 서열을 수득하기 위해 축중 PCR로 개시하는 일련의 단계를 포함한다. IgNAR 코딩 서열을 단리하기 위해, 축중 PCR은 공지된 수염 상어 IgNAR 서열 또는 기타 상어 종에 기반한 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다. 이들로부터, 불변 도메인을 단리하고 서열분석하여 5' RACE 프라이머를 설계함으로써 리더로부터 가변 영역을 통해 불변 도메인까지 전장 IgNAR 서열을 완성할 수 있다.
추출된 RNA를 역전사시켜 cDNA를 생성할 수 있다. 돔발 상어 조직으로부터 cDNA 합성은 불변 도메인 1 프라이머로 생성할 수 있다.
천연 면역글로불린 이소형 신규 항원 수용체(IgNAR)은 단일-가변 도메인(VNAR) 및 5개의 불변 도메인(CNAR)로 이루어진 호모이량체성 중쇄 복합체이다. 상기 기재된 바와 같은 축중 PCR 기술에 의해 수득된 IgNAR 서열을 분석하고, 다중 프라이머는 IgNAR 전사체의 3' 말단(3' RACE)의 증폭에 사용하기 위해 설계할 수 있다. 전체 RNA를 단리하고, 3' RACE를 수행할 수 있다. 제1 가닥 cDNA는 적하한 프라이머를 사용하여 전체 RNA로부터 합성할 수 있다. 제1 가닥 cDNA는 PCR 증폭에 사용된다. PCR 생성물은 벡터 내로 클로닝시키고 TA 클로닝시킬 수 있다. 이어서, PCR 생성물을 함유하는 클론을 서열분석할 수 있다.
막관통 특이적 프라이머를 사용하여 cDNA를 코딩하는 신규 항원 수용체(NAR)은 다음과 같이 단리할 수 있다. RNA를 상기 기재된 바와 같이 돔발 상어 조직으로부터 추출하고, 역전사시킬 수 있다. 제1 라운드 PCR은 생성된 3' RACE cDNA, 범용 프라이머 및 돔발 상어 IgNAR 특이적 프라이머로 수행할 수 있다. 수드된 PCR 생성물은 벡터 내로 클로닝시키고, 서열분석할 수 있다.
5' 비해독된 영역, 스플라이스 리더, 가변 도메인 및 부분 불변 도메인을 코딩하는 NAR cDNA 클론은 다음과 같이 수득할 수 있다. 각각의 종에 대해 불변 도메인(상기 기재된 바와 같이 3' RACE에 의해 단리됨)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 보존된 영역을 동정하기 위해 분석할 수 있다.
프라이머는 높은 동일성의 이들 영역에서 설계할 수 있고, 다음과 같이 NAR 코딩 서열의 5' RACE 증폭에 사용할 수 있다. cDNA 말단의 증폭은 5' RACE 시스템을 사용하여 달성할 수 있다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 제1 가닥 cDNA는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 합성한 다음, 올리고-dC 테일에 연결시킬 수 있다. dC-테일 cDNA는 유전자 특이적 프라이머와 조합하여 PCR 증폭에 사용할 수 있다. 정확한 크기의 증폭된 생성물을 정제하고, 벡터 내로 TA 클로닝시키거나 대안적으로 클로닝시킬 수 있다. 이어서, PCR 생성물을 함유하는 클론을 서열분석할 수 있다.
스플라이스 리더 영역, 가변 도메인 및 부분 불변 도메인 1을 코딩하는 NAR cDNA 클론은 다음과 같이 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 5' RACE에 의해 수득된 서열은 스플라이스 리더 서열을 동정하기 위해 분석할 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 정렬시키고, 프라이머를 높은 뉴클레오티드 동일성(지정된 전방 프라이머)의 영역에서 설계할 수 있다. 유사하게는, 3' RACE에 의해 수득한 서열은 프라이머(지정된 역방 프라이머)를 설계하기 위해 불변 도메인에서 높은 뉴클레오티드 동일성의 영역을 동정하기 위해 분석할 수 있다. NAR cDNA 클론을 수득하기 위한 PCR 증폭은 다음과 같이 이들 전방 및 역방 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다.
RNA는 상기 기재된 바와 같이 돔발 상어 조직으로부터 추출할 수 있다. 제1 가닥 cDNA는 전체 RNA로부터 올리고-dT 프라이머를 합성할 수 있다. 전방 및 역방 프라이머는 이로부터 cDNA를 사용하여 NAR 특이적 클론을 PCR 증폭시키기 위해 사용할 수 있다. 정확한 크기의 증폭된 생성물을 정제하고, 벡터 내로 TA 클로닝시키거나 대안적으로 클로닝시키고, 서열분석할 수 있다.
생물정보 분석은 돔발 상어 IgNAR 서열을 동정하고 특성화하기 위해 수행할 수 있다. 개방 판독 프레임의 동정 및 상기 기재된 바와 같이 단리된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 분석은 NAR 코딩 클론의 거대 라이브러리를 작제하기 위해 각 종에 대한 NAR-특이적 프라이머의 설계를 가능하게 할 수 있다. 수염 상어 IgNAR 단백질 서열을 돔발 상어로부터 IgNAR 서열을 정의하기 위해 주형으로 사용할 수 있다. 이어서, 몇몇 종의 수염 상어 IgNAR 서열은 복수의 서열 정렬을 생성하기 위해 선택될 수 있다. 각각의 IgNAR cDNA 서열에 대한 개방 판독 프레임을 동정하고, 아미노산 서열로 번역할 수 있다. 이어서, IgNAR 아미노산 서열을 정렬시키고, IgNAR 도메인(FW1, CDR1, FW2, HV2, FW3A, HV4, FW3B, CDR3 및 FW4)을 동정하기 위해 공지된 수염 상어 IgNAR 유전자 구조와 비교할 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 클론 2V 및 5V(도 9에 제시된 서열)을 디스플레이 벡터(예를 들면, 파지미드 디스플레이 벡터) 내로 클로닝시키고, 라이브러리 주형으로 사용할 수 있다. 적합하게는, 선택된 주형은 고도의 세균 발현을 나타낸다.
포괄적 "천연" 돔발 상어 VNAR 아미노산(AA) 서열 데이터베이스는 본원에 기재된 PCR 증폭된 cDNA를 사용하여 제조할 수 있고, 상기 cDNA는 상이한 돔발 상어 동물 및 조직 유형의 범위로부터 전장 유일한 cDNA VNAR 클론을 포함한다. 규정에 따른 번역된 VNAR 도메인은 CDR3 길이 분포에 추가하여 분석된 모집단에 대하여 아미노산(AA) 함량, 상대적 위치 보존 및 빈도의 관점에서 검사할 수 있다. 따라서, 이러한 분석은 합성 라이브러리 설계를 유도할 수 있다.
CDR1 및 CDR3 루프에서 개시하여, 이들 루프 사이에서의 함량, 인접한 프레임워크 잔기 및 루프 길이 범위 및 분포를 조사하는 것이 편리할 수 있다. 데이터베이스 내의 서열은 길이(n≥100) 풀에 따라 유일한 클론으로 분류할 수 있다. 11 내지 16개 아미노산 범위의 전체 CDR3 루프 길이는 이들이 13±2개 아미노산의 평균 돔발 상어 CDR3 길이에 상응했기 때문에 중점을 둘 수 있다.
본 발명의 이중 주형 설계에 따르면, CDR3에 바로 인접하여 FW3a 위치 -3, -2 및 -1을 조절할 수 있고, 따라서 합성 라이브러리에서 CKA 또는 CRA 모티프를 나타낸다. 이러한 접근법은 데이터베이스에서 발견된 바와 같은 "천연" 아미노산(AA) 서열 다양성의 최대 76%를 나타낼 수 있다. 서열 데이터베이스에서 CDR3 직후의 FW4 잔기는 DGA 모티프 및 보다 적은 정도로 YGA를 포함할 수 있다.
CDR3 루프 자체 내에서, 특정의 연결 또는 J-유전자 세그먼트의 사용은 C-말단 CDR3 말단에서 특정 잔기, 특히 최후로부터 2번째 잔기 및 최후 잔기를 위한 바이어스를 도입할 수 있다.
특이적 돌연변이 올리고뉴클레오티드를 사용한 각각의 주형 영역 플라스미드-함유 2V 및 5V 서열의 PCR은 PCR 증폭을 수행할 수 있다. 3개 일차 PCR 생성물 세트(각각 FW1, CDR1-FW3 및 CDR3-FW4로 이루어진 단편)으로부터 각각의 PCR 생성물을 마스터 혼합물로서 혼합하고, 이어서 스플라이스-바이-오버랩 신장(Splice-by-Overlap Extension: SOE) PCR에 의해 결합시킬 수 있다.
SOE-PCR 생성물은 제한 엔도뉴클레아제로 소화시킬 수 있고, 유사하게 소화된 벡터 내로 연결시킬 수 있다. 4개의 주형 유래 변이체 서브-라이브러리는 SOE-PCR에 의해 작제할 수 있고, 풀은 이들을 작제하기 위해 사용된 CDR1-FW3 및 CDR3-FW4 단편의 기원에 기반하여 정의할 수 있다.
모든 풀에 있어서, 양 주형으로루터 유래된 동일한 양의 FW1 단편은 양 CDR1 및 CDR3 루프에서 부가된 올리고뉴클레오티드-지시된 합성 다양성을 포함할 수 있다. 이어서, 숙주 세포는 적절한 삽입체를 함유하는 연결된 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 서브-라이브러리의 작제에 있어서, 적합하게는 일차 PCR 생성물의 3개 세트가 각각의 본래 주형으로부터 생성될 수 있고, 여기서 주형은 프레임워크 1(FW1), CDR1 및 CDR3을 대부분 포함하는 3개의 상이한 영역으로 분할할 수 있다. 정의된 CDR1 및 CDR3 루프 영역은 주형-특이적 트리뉴클레오티드(TRM) 올리고머를 사용하여 돌연변이시킬 수 있다. TRM 올리고뉴클레오티드는 의도적으로 생략된 시스테인를 제외하여 특정 위치에서 랜덤으로 임의의 (AA)를 도입하도록 설계할 수 있다. TRM 올리고에 추가하여, 추가의 주형-특이적 CDR1-표적화된 올리고(예를 들면, 1, 2 또는 3개)는 돌연변이의 도입에 사용할 수 있다.
설계된 내용물은 "천연" 돔발 상어 VNAR 도메인 서열의 분석을 사용하여 결정할 수 있고, 정의된 축중 코드 및 직접 상동성 코돈을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 라이브러리에 도입할 수 있다.
상기 논의한 바와 같이, 본 발명은 VNAR의 개선된 합성 라이브러리(2개 이상의 천연 발생 VNAR 서열로부터 생성됨) 및 이의 생산 방법을 제공한다. 스쿠알루스 아칸티아스(Squalus acanthias)의 VNAR 레퍼토리의 광범위한 서열분석 분석으로부터, 원핵생물 시스템에서 고도의 발현을 나타내는 2개의 클론을 결정화하고, 이들 라이브러리를 위한 기초로서 사용했다. ELSS1 라이브러리는 도 4에 설명된 CDR1, HV2, HV4 및 CDR3 영역 내의 다양성에 추가하여 프레임워크(FW1, FW2, FW3a, FW3b 및 FW4)에 대한 다양성을 생성하기 위해 조합된 동일한 판새아강 종, 돔발 상어(Squalus acanthias)로부터 2개의 상이한 VNAR 이소형(유형 IIb 및 IIIb)로 구성되어 있다. ELSS2는 도 18에 설명된 바와 같이 판새아강의 제2 종, 수염 상어(Ginglymostoma cirratum)으로부터 제3 VNAR 이소형(유형 II) 프레임워크를 도입함으로써 증가된 프레임워크 다양성의 생성에 기초하여 구성된다.
프레임워크 영역 내에 다양성을 생성하기 위해 중첩 PCR을 사용하는 신규 접근법은 성공적으로 달성되어 2V/5V 또는 2V/5V/E9 하이브리드 서열을 제공했다. 추가의 다양성은 목적하는 아미노산 유형이 도입되는 것을 보장하기 위해 정의된 TRM 올리고 또는 NNK 올리고를 사용하여 CDR3 및 CDR1 영역 둘 다에 도입되었다. 또한, ELSS1 중의 CDR1 다양성은 스쿠알루스 아칸티아스(Squalus acanthias)의 천연 레퍼토리에서 관찰된 것을 나타내기 위해 설계되었고, 설계된 CDR3의 길이는 또한 이들 동물로부터 유래한 서열 데이터베이스 내에서 동정된 천연 발생 CDR3 서열에 기반했다.
이러한 설계를 사용하여, 합성 상어 가변 NAR(VNAR) 도메인 라이브러리(ELSS1 및 ELSS2)는 이전 합성/반-합성 라이브러리 보고에 최대 수준의 기능적 다양성 및 개선을 도입하여 작제했다. 상어 VNAR 라이브러리를 작제하기 위해 이전에 보고된 시도는 통상 면역 조직으로부터 유래된 바와 같이 VNAR 프레임워크(FW) 영역 1 내지 3의 단리된 천연 다양성을 이용했다. 이어서, 이러한 프레임워크는 반-합성 라이브러리를 생성하는 효과에 있어서 CDR3 영역으로 표적화된 합성 다양성에 결합할 것이다.
누탈 및 리우(Nuttall and Liu) 및 이들의 각각의 공동연구자에 의한 2개의 추가의 별개의 연구에서, VNAR 비-표준 시스테인 잔기는 구체적으로는 CDR1-CDR3 디설파이드 연결을 특징으로 하는 이전에 관찰된 유형 II VNAR 구조를 모방하는 시도에 있어서 다양한 CDR 영역으로 도입되었다[참조: Diaz, M., et al., Immunogenetics, 2002. 54(7): p. 501-12]. 또한, 비-표준 시스테인에 대한 유사한 접근법은 샤오(Shao) 라이브러리 설계를 중심으로 했고, 여기서 이들은 유형 I VNAR 구조의 FW2 및 FW4 영역에서 발견된 본래 주형 비-표준 시스테인 잔기를 유지하기 위해 착수했다. 이는 합성 CDR3에서 상보성 시스테인 잔기의 바이어스된 도입을 통해 수행되었다.
각각의 이들 설계 접근법은 최종 라이브러리 중에 고도의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 유도하고 따라서 최종 합성 레퍼토리 내에 기능적 내용물 및 다양성을 절충할 가능성이 있는 것으로 간주된다. 따라서, 이전의 설계와 대조적으로, 본 발명은 비-표준 시스테인 잔기에 의해 제공된 추가의 구고적 복잡성을 회피한다. 돔발 상어의 레퍼토리, 구체적으로는 비-표준 시스테인 잔기를 전혀 함유하지 않는 것들은 본 발명의 방법에서 모방되었다. 그러나, 이러한 유형의 접근법에 대한 한 가지 주목되는 예외는 샤오 및 공동연구자의 문헌[참조: Shao, C.Y., C.J. Secombes, and A.J. Porter, Mol Immunol, 2007. 44(4): p. 656-65]에 기재된 연구였다. 이러한 보고는 단일 주형 도메인 프레임워크로부터 유래된 완전 합성을 기재했고, 유형 I 상어 VNAR 도메인의 CDR3, 클론 5A7 내로 됩된 완전 인공 다양성을 포함했다. 이 클론은 면역-라이브러리로부터 조직학적으로 단리되었고, 닭 난백 리소자임(HEL)에 특이적이다. 샤오 등(Shao et al)은 본래 주형 결합 파트너(HEL)에 대해 고유한 고도의 교차-반응성을 갖는 유일한 렙틴 결합 VNAR의 동정을 보고했다.
본 발명의 추가의 특징적 라이브러리 설계상 특징을 다음을 포함한다:
라이브러리 크기
최종 ELSS1 라이브러리 크기(>9×1010)은 이전에 보고된 임의의 상어 라이브러리(천연, 면역 또는 합성)보다 2차수 더 크다.
다양성
본 발명의 합성 VNAR 라이브러리는 시스테인을 부가하지 않고서 각각의 랜덤화 위치에서 모든 아미노산에 동등한 표현을 제공하는 트리뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 제조한다. 따라서, 본 발명의 합성 라이브러리는 트리뉴클레오티드 다양성을 제공한다.
본 발명의 합성 라이브러리의 맞춤형 다양성은, 특정의 서열 데이터베이스에 기반하여, 트리뉴클레오티드 및 "상동성-스캐닝" 올리고뉴클레오티드의 사용을 통해 VNAR CDR1 내로 도입했고, 이러한 영역에서 표적화했다. CDR1의 상세한 검사로부터, "천연" 다양성은 몇몇 주요 위치, 특히 제2(57% Y 또는 33% C) 또는 제4(83% L 또는 13% W) 위치(카벳 넘버링 도식을 사용하여 완전 VNAR 서열에서 위치 29 및 31)에서 비교적 보전되어 있음에 유의해야 한다.
CDR1에 대한 2개의 대조적 돌연변이 접근법이 적용되었다. 완전 CDR1 랜덤화는 CDR3 루프에 대해 기재된 바와 같이 통상의 트리뉴클레오티드(TRM) 혼합된 코돈 올리고뉴클레오티드(Genelink)를 사용하여 수행했다. 대조적으로, 적용된 맞춤식 함량 접근법은 "천연" 서열 분석에 의해 유도된 바와 같이 정의된 CDR1 위치의 정련된 조절을 수반했다. 구체적으로, 본 발명자들은 특정의 축중 및 "상동성 잔기" 스캔 코돈을 사용하여 각각의 CDR1 위치에서 정의된 "천연" 변동성을 가능한 많이 도입하는 것을 목적으로 했다[참조: Bostrom, J. and G. Fuh, Methods Mol Biol, 2009. 562: p. 17-35; Bostrom, J., et al., Methods Mol Biol, 2009. 525: p. 353-76, xiii].
시스테인 함유는 "천연" 데이터베이스 클론의 33%에서 제2 위치에서 발견된 사실과 무관하게 이전에 언급된 이유로 ELSS1에서 회피되었다. 올리고는 (AA) 함량의 추가의 관련 맞춤으로 본 발명자들의 서열 데이터베이스에서 발견된 바와 같이 최대 가능한 "천연" 문맥의 다양성을 도입 유지하도록 설계했다. 상기 랜덤 및 맞춤형 전략 둘 두에서, 위치 4의 조절은 트립토판 잔기(W)를 유지시키거나 유지시키지 않음으로써 포함시켰다. 이 위치에서, 적어도 2V 및 5V 스캐폴드의 문맥에서 관찰된 바와 같은 W 또는 L 측쇄는 특히 프레임워크 잔기 F66과 중앙 도메인 코어 내에서 소수성 상호작용을 형성하는 것이 의심된다.
전체 8개의 랜덤화 CDR3 길이가 포함된 선택된 CDR3 길이 변이는, 천연 돔발 상어 NAR에서 관찰된 최도 빈도 길이 다양성 범위를 커버하기 위해 부가되었다.
라이브러리 설계
라이브러리 설계 접근법은 구조적으로 중요한 것으로 의심된 CDR 인접 잔기를 유지했다. 이러한 모티프는 FW3b 및 CDR3의 C-말단 말단에서 유사한 면역글로불린(Ig) 가변 도메인의 숙주에서 발견된 것과 유사하다. 이러한 이론적 근거를 뒷받침하는 관찰은 돔발 상어 VNAR 서열의 결정 구조 모델 및 추가의 생물정보 분석을 사용하여 촉진되었다. (도 3)에 제시된 바와 같이 2개의 본래 주형 VNAR 도메인 및 이들의 각각의 분자 모델을 위해 해결된 결정 구조를 갖는 경우, 서열 데이터베이스에서 관찰된 보존된 N- 및 C-말단 CDR 인접 잔기를 맵핑했다. CDR3에 대한 이들의 간격 및 다른 유사한 가변 Ig 도메인에서 이들의 중요성에 기인하여, 특정 강조는 최종 3개 FW3b 잔기 및 최초 2개 FW4 잔기 상에 위치한다. 이 영역 내의 잔기는 일반적으로 보다 보존되는 것으로 밝혀졌다.
프레임워크 융합 스캐폴드 설계
제1 합성 VNAR 라이브러리는 서열 2V 및 5V(유형 IIb 및 IIIb)에 기반하여 이중 스캐폴드 설계를 사용하여 작성하고, 제1 라이브러리는 2개의 상이한 판새아강 종으로부터 기원하는 2개 이상의 VNAR 이소형 프레임워크(유형 II VNAR, E9에 추가하여 2V, 5V)를 사용하여 작성했다. 2개의 주형의 사용은 주요 상이한 프레임워크(FW) 및 초가변(HV) 루프 영역을 셔플링함으로써 추가의 구조적 다양성의 도입을 촉진시켰다. 따라서, 실제로, 수득되는 유도된 클론은 보충 CDR1 및 CDR3 루프 지시된 다양성을 함유하는 야생형 및 신규 스플라이싱 하이브리드 스캐폴드로 구성되었다. ELSS1에서 상이한 맥락에서 주형 유래된 HV2 및 HV4 루프는 각각 유래된 FW1과 쌍을 이루는 주형 유래된 HV2 및 HV4를 코딩하는 대안적 스플라이싱 PCR 단편, 및 CDR1 및 CDR3 단편을 통해 달성되었다. 실제로, 이는 하이브리드 주형-유래 서열 순열로 이루어진 6개의 신규 추가의 하이브리드 스캐폴드를 도입하는 것을 가능하게 했다.
데이터베이스 분석은 2V 주형 상에서 발견된 정확한 HV2 및 HV4 아미노산(AA) 서열이, 각각 모집단의 33%(454/1364) 및 38%(518/1364)에 상응하는, 돔발 상어 VNAR 데이터베이스에서 클론의 최대 비교 그룹화에서 관찰되는 것을 나타냈다. 5V 상에서 발견된 정확한 HV2 및 HV4 서열은 빈번하게 관찰되지 않고, 정확한 HV4는 데이터베이스 모집단의 대략 8%(111/1364)에서 관찰되고 HV2는 <1%(10/1364)에서 관찰되었다. 그러나, 양 HV 루프의 단일 아미노 변이체는 데이터베이스에서 보다 높은 비율의 클론에서 관찰되었다. 이는 2V 및 5V 주형 HV 영역이 가장 생식계열 코딩될 가능성이 있거나 서열에서 생식계열에 근접하다는 것을 의미한다. 실제로, 라이브러리 설계에서 이러한 서열 간격을 셔플링함으로써, 본 발명자들은 동시에 통상적으로 발견된 "천연" 레퍼토리(즉, 서열 2V로부터 유래됨)를 유지했고, 하이브리드 다양성의 생성을 통해 추가의 합성 변이를 도입했다. 추가의 서열 다양성은 양 주형-유래된 FW1 영역을 셔플링함으로써 도입했다.
FW1 아미노 말단의 최초 3 내지 4개 잔기는 VNAR에 대한 결합 특성의 조절에 중요할 수 있다. N-말단 FW1 잔기는 이들의 동족 항원에 대한 VNAR 도메인의 결합 특성에 대한 효과를 가질 수 있고, 이용가능한 구조적 모델을 사용하여 합리화할 때에 놀라운 것이 아닌데, 이는, 파라토프 및 표적 접촉이 매개되는 경우, 초기 N-말단 잔기가 항상 CDR1 및 CDR3 루프와 매우 근접하게 맵핑하기 때문이다. 여기서, 이중 주형 설계의 잇점은 상이한 주형-유래 FW1 코딩된 영역 사이의 셔플을 가능하게 했다. 따라서, 사용된 전체 설계 접근법은 추가의 CDR1 및 CDR3 루프 다양성이 부가될 수 있는 8개의 상이한 스캐폴드를 잠재적으로 수득할 수 있다.
정의
본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자는 본 발명의 방법에 따라 제조된 VNAR 분자의 합성 라이브러리로부터 유래된다. 용어 VNAR, IgNAR 및 NAR은 또한 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
아미노산은 1문자 코드 또는 3문자 코드 또는 둘 다로서 본원에서 나타낸다.
용어 "친화성 정제"는, 파트너 잔기에 결합 또는 유인 상태를 유지하면서 불순물로부터 분자가 분리되도록 하는 조합 또는 복합체를 형성하기 위해 화학적 또는 결합 파트너에 대한 분자의 특이적 유인 또는 결합에 기반한 분자의 정제를 의미한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 CDR(즉, CDR1 및 CDR3)은 이의 존재가 항원 결합에 요구되는 VNAR 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 VNAR은 전형적으로 CDR1 및 CDR3으로 동정된 3개 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프"(HV)로부터의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상보성 결정 영역은 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. VNAR 분자에 대한 일반적으로 허용되는 명명법에 따라, CDR2 영역은 존재하지 않는다.
"프레임워크 영역"(FW)은 CDR 잔기 이외의 VNAR 잔기이다. 각각의 VNAR은 전형적으로 FW1, FW2, FW3a, FW3b 및 FW4로서 동정된 5개 프레임워크 영역을 갖는다.
"코돈 세트"는 목적하는 변이체 아미노산을 코딩하기 위해 사용된 상이한 뉴클레오티드 트리플릿 서열의 세트를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드의 세트는, 예를 들면, 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오티드 트리플릿의 모든 가능한 조합을 나타내고 목적하는 아미노산 그룹을 코딩할 수 있는 서열을 포함하여 고체 상 합성에 의해 합성할 수 있다. 코돈 지정의 표준 형태는 IUB 코드의 것이고, 이는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다.
코돈 세트는 이탤릭체의 3개 대문자, 예를 들면, NNK, NNS, XYZ, DVK 등에 의해 통상 나타내어진다. 따라서, "비-랜덤 코돈 세트"는 부분적으로, 바람직하게는 완전히 본원에 기재된 아미노산 선택에 대한 기준을 충족하는 선택 아미노산을 코딩하는 코돈 세트를 지칭한다. 특정한 위치에서 선택된 뉴클레오티드 "축퇴"를 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당해 기술분야, 예를 들면, TRIM 접근법[참조: Knappek et al.; J. Mol. Biol. (1999), 296, 57-86); Garrard & Henner, Gene (1993), 128, 103]에 공지되어 있다. 특정한 코돈 세트를 갖는 이러한 세트의 올리고뉴클레오티드는 상업적 핵산 합성기(예를 들면, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems, Foster City, CA)로부터 이용가능)를 사용하여 합성할 수 있거나, 상업적으로 수득할 수 있다(예를 들면, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, Rockville, MD)로부터). 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드의 세트는 통상 상이한 서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이고, 차이는 전체 서열 내의 코돈 세트에 의해 확립될 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드는 VNAR 핵산 주형과의 하이브리드화를 가능하게 하는 서열을 갖고, 편리한 경우, 제한 효소 부위를 또한 포함할 수도 있다.
"세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 상호 교환적으로 사용되고(본 문맥이 달리 지시하지 않는 한), 이러한 명칭은 세포 또는 세포주의 모든 자손을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "형질전환체" 및 "형질전환도니 세포"와 같은 용어는 전이의 수와 무관하게 일차 대상 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 고의 또는 우연의 돌연변이에 기인하여 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.
발현을 지칭할 때 "조절 서열"은 특정 숙주 생물에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열은, 예를 들면, 프로모터, 임의로 작동인자 서열, 리보솜 결합 부위 등을 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 등의 조절 서열을 사용한다.
용어 "코트 단백질"은 단백질, 적어도 일부가 바이러스 입자의 표면 상에 존재하는 단백질을 의미한다. 기능적 관점에서, 코트 단백질은, 숙주 세포에서 바이러스 조립 프로세스 동안 바이러스 입자와 회합하고 또 다른 숙주 세포를 감염시킬 때까지 조립된 바이러스와 회합 상태를 유지하는 임의의 단백질이다.
특정 검정에서 화학 물질에 대한 "검출 한계"는 당해 검정을 위한 배경 수준을 초과하여 검출할 수 있는 당해 물질의 최소 농도이다. 예를 들면, 파지 ELISA에서, 특정 항원 결합 단편을 표시하는 특정 파지에 대한 "검출 한계"는 항원 결합 단편을 표시하지 않는 대조군 파지에 의해 생성된 것을 초과하여 특정 파지가 ELSA 신호를 생성하는 파지 농도이다.
"융합 단백질" 및 "융합 폴리펩티드"는 함께 공유 결합된 2개 부분을 갖는 폴리펩티드를 지칭하고, 여기서 각각의 부분은 상이한 특성을 갖는 폴리펩티드이다. 상기 특성은 생물학적 특성, 예를 들면, 시험관내 또는 생체내 활성일 수 있다. 상기 특성은 또한 단순한 화학적 또는 물리적 특성, 예를 들면, 표적 항원에 대한 결합, 반응의 촉매 등일 수 있다. 2개 부분은 단일 펩티드 결합에 의해 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 통해 직접 결합할 수 있다. 일반적으로, 2개 부분 및 링커는 서로 판독 프레임 내에 존재할 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드의 2개 부분은 이종성 또는 상이한 폴리펩티드로부터 수득된다.
본 명세서에서 용어 "융합 단백질"은, 일반적 용어로서, 수소 결합 또는 염 브릿지를 포함하는 화학적 수단에 의해 또는 단백질 합성을 통한 펩티드 결합에 의해 또는 이들 둘 모두에 의해 함께 결합된 하나 이상의 단백질을 의미한다.
"이종성 DNA"는 숙주 세포 내로 도입되는 임의의 DNA이다. DNA는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 이들의 융합물 또는 조합물을 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. DNA는 숙주 또는 수용체 세포와 동일한 세포 또는 세포 유형으로부터의 DNA, 또는 상이한 세포 유형, 예를 들면, 동종이계 또는 외래 공급원으로부터의 DNA를 포함할 수 있다. DNA는, 임의로, 마커 또는 선택 유전자, 예를 들면, 항생물질 내성 유전자, 온도 내성 유전자 등을 포함할 수 있다.
"고도로 다양한 위치"는, 공지된 및/또는 천연 발생 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산을 비교하는 경우, 위치로 나타내어진 상이한 아미노산의 수를 갖는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 위치된 아미노산의 위치를 지칭한다. 고도로 다양한 위치는 전형적으로 CDR 영역에 존재한다.
"동일성"은, 서열을 비교하여 측정한 바와 같이, 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계를 기재한다. 동일성은 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성(상동성)의 정도를 의미하고, 이 경우 이러한 서열의 스트링 사이의 정합에 의해 측정된 바와 같을 수 있다. 2개 폴리펩티드 또는 2개 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재하지만, 동일성을 측정하기 위해 통상 사용되는 방법은 컴퓨터 프로그램에서 체계화되어 있다. 2개 서열 사이의 동일성을 측정하기 위해 바람직한 컴퓨터 프로그램은, 이로써 한정되지 않지만, GCG 프로그램 팩키지[참조: Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12, 387 (1984)], BLASTP, BLASTN 및 FASTA[참조: Atschul et al., J. Molec. Biol. (1990) 215, 403]를 포함한다.
바람직하게는, 단백질의 아미노산 서열은 HGMP(Human Genome Mapping Project)에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램[참조: Atschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-410]의 디펄트 파라미터를 사용하여 아미노산 수준에서 본원에 개시된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는다.
보다 바람직하게는, 단백질 서열은 핵산 또는 아미노산 수준에서 본원에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 및 보다 바람직하게는 95%(보다 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 가질 수 있다.
단백질은, HGMP에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램의 디펄트 파라미터를 사용하여 본원에 개시된 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
"라이브러리"는 복수의 VNAR 또는 VNAR 단편 서열(예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드) 또는 이들 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하고, 서열은 본 발명의 방법에 따라 이들 서열 내로 도입되는 변이체 아미노산의 조합에서 상이하다.
"연결"은 2개 핵산 단편 사이에서 포스포디에스테르 결합을 형성하는 프로세스이다. 2개 단편의 연결을 위해, 단편의 말단은 서로 적합성이 있어야 한다. 일부 경우, 말단은 엔도뉴클레아제 소화 후에 직접 적합성일 수 있다. 그러나, 이들을 연결에 적합하게 하도록 엔도뉴클레아제 소화 후에 통상 생성된 부착 말단을 블런트 말단으로 먼저 전환시키는 것이 필요할 수 있다. 말단의 블런트화를 위해, DNA는 4개 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에 DNA 폴리머라제 I 또는 T4 DNA 폴리머라제의 클레노브 단편의 약 10개 단위로 15℃에서 적어도 15분 동안 적합한 완충제에서 처리한다. 이어서, DNA는 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 또는 실리카 정제에 의해 정제한다. 함께 연결되는 DNA 단편은 대략 등몰량으로 용액에 넣는다. 용액은 또한 ATP, 리가제 완충제, 리가제, 예를 들면, DNA 0.5㎍당 약 10단위의 T4 DNA 리가제를 함유할 수 있다. DNA가 벡터 내로 연결되어야 하는 경우, 벡터는 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)로 소화시켜 먼저 선형화시킨다. 이어서, 선형화된 단편을 세균 알칼리 포스파타제 또는 송아지 장 포스파타제로 처리하여 연결 단계 동안 자가-연결을 방지한다.
"돌연변이"는 참조 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 야생형 서열에 대한 뉴클레오티드(들)의 결실, 삽입 또는 치환이다.
"천연" 또는 "천연 발생" VNAR은 비-합성 공급원, 예를 들면, 생체외에서 수득된 조직 공급원 또는 판새아강 아부류의 동물 형청으로부터 동정된 VNAR을 지칭한다. 이들 VNAR은 천연 또는 달리 유도된 임의 유형의 면역 반응으로 생성된 VNAR을 포함할 수 있다. 천연 VNAR은 아미노산 서열, 및 이들 항체를 구성하거나 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 천연 VNAR은 "합성 VNAR"과는 상이하고, 합성 VNAR은, 예를 들면, 특정 위치에서 아미노산 또는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체, 결실 또는 부가에 의해 공급원 또는 주형 서열로부터 변경된 VNAR 서열을 지칭하고, 상이한 아미노산은 공급원 항체 서열과 상이한 항체 서열을 제공한다.
용어 "핵산 작제물"은 일반적으로 DNA, cDNA 또는 RNA, 예를 들면, 클로닝에 의해 수득되거나 화학적 합성에 의해 생성된 mRNA일 수 있는 임의 길이의 핵산을 지칭한다. DNA는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 DNA는 코딩 센스 가닥일 수 있거나, 비-코딩 또는 항-센스 가닥일 수 있다. 치료학적 용도를 위해, 핵산 작제물은 바람직하게는 치료되는 대상체에서 발현될 수 있는 형태로 존재한다.
핵산을 지칭할 때 "작동적으로 연결된"은 핵산이 또 다른 핵산 서열과의 기능적 관계에 위치하는 것을 의미한다. 예를 들면, 프리서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는, 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는, 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동적으로 연결되거나; 리보솜 결합 부위는, 번역을 촉진하도록 위치되는 경우에 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에, 우발적이고 판독 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 연결에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 관행에 따라 사용된다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드가 파지, 예를 들면, 사상 파지 입자의 표면 상에서 코트 단백질의 적어도 일부에 대한 융합 단백질로서 표시되는 기술이다. 파지 디스플레이 기술은 표적 항원에 고도의 친화성으로 결합하는 서열을 신속하고 효율적으로 선별할 수 있는 랜덤화 단백질 변이체의 거대 라이브러리의 제조를 가능하게 한다. 파지 상에서 펩티드 및 단백질 라이브러리의 표시는 특이적 결합 특성을 갖는 것에 대해 수백만 폴리펩티드를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 다가 파지 디스플레이 방법은 사상 파지의 유전자 코딩 코트 단백질 pIII, pVIII, pVI, pVII 또는 pIX에 대한 융합을 통해 작은 랜덤 펩티드 및 작은 단백질을 표시하기 위해 사용되어 왔다.
"파지미드"는 세균 복제 기원(예: ColE1) 및 박테리오파지의 유전자간 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 사상 박테리오파지 및 람다 박테리오파지를 포함하는 임의의 공지된 박테리오파지 상에서 사용할 수 있다. 플라스미드는 또한 일반적으로 항생물질 내성을 위해 선택가능한 마커를 함유할 것이다. 이들 벡터 내로 클로닝된 DNA의 세그먼트는 플라스미드로서 증식될 수 있다. 이들 벡터를 포함하는 세포에 파지 입자의 생산에 필요한 모든 유전자가 제공되는 경우, 플라스미드의 복제 방식은 플라스미드 DNA 및 팩키지 파지 입자의 하나의 가닥의 카피를 생성하기 위해 롤링 원형 복제로 변화한다. 파지미드는 감염성 또는 비-감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 이 용어는, 이종성 폴리펩티드가 파지 입자의 표면 상에서 표시되도록 유전자 융합으로 이종성 폴리펩티드 유전자에 연결된 파지 코트 단백질 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 파지미드를 포함한다. 파지미드 표시 벡터의 예는 pWRIL-1이다.
용어 "파지 벡터"는 이종성 유전자를 함유하고 복제가 가능한 박테리오파지의 이중 가닥 복제 형태를 의미한다. 파지 벡터는 파지 복제 및 파지 입자 형성을 가능하게 하는 파지 복제 기원을 갖는다. 파지는 바람직하게는 사상 박테리오파지, 예를 들면, M13, fl, fd, Pf3 파지 또는 이의 유도체, 또는 람다 파지, 예를 들면, 람다, 21, phi80, phi81 또는 이의 유도체이다.
용어 "단백질"은, 일반 용어로서, 펩티드 결합에 의해 함께 결합된 복수의 아미노산 잔기를 의미한다. 이는 펩티드, 올리고펩티드, 올리고머 또는 폴리펩티드와 상호 교환적으로 사용되고 동일한 것을 의미하며, 당단백질 및 이의 유도체를 포함한다. 용어 "단백질"은 또한 단백질의 단편, 동족체, 변이체 및 유도체를 포함하는 것으로 의도되고, 여기서 단편, 동족체, 변이체 또는 유도체는 필수적으로 기준 단백질과 동일한 생물학적 활성 또는 기능을 보유한다. 단백질 동족체 및 유도체의 예는 펩티드 핵산 및 DARPin(Designed Ankyrin Repeat Proteins)을 포함한다.
단백질의 단편, 동족체, 변이체 또는 유도체는 이것이 유래되는 본래 단백질 서열의 길이에 따라 적어도 25개, 바람직하게는 30 또는 40개, 또는 최대 50 또는 100개, 또는 60 내지 120개 아미노산 길이일 수 있다. 90 내지 120개, 100 내지 110개 아미노산의 길이가 일부 예에서 편리할 수 있다.
단백질의 단편, 유도체, 변이체 또는 동족체는 (i) 아미노산 잔기의 하나 이상이 보존되거나 비보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩된 것이거나 코딩되지 않은 것일 수 있는 것, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, 또는 (iii) 추가의 아미노산이 성숙 폴리펩티드, 예를 들면, 폴리펩티드의 정제에 사용되는 리더 또는 보조 서열에 융합되어 있는 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체, 변이체 및 동족체는 본원의 교시로부터 당해 기술분야의 숙련가의 범위 내인 것으로 간주된다.
"올리고뉴클레오티드"는 공지된 방법(예: 고체-상 기술을 사용하는 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포르아미다이트 화학)에 의해 화학적으로 합성되는 짧은 길이의 단일 가닥 또는 이중 가닥의 폴리데옥시뉴클레오티드이다. 추가의 방법은, 유전자의 전체 핵산 서열이 공지되어 있거나 코딩 가닥에 상보성인 핵산의 서열이 이용가능한 경우, 사용된 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함한다. 대안적으로, 표적 아미노산 서열이 공지되어 있는 경우, 각각의 아미노산 잔기에 대해 공지된 및 바람직한 코딩 잔기를 사용하여 잠재적 핵산 서열을 추측할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 폴리아크릴아미드 겔 또는 분자 크기 컬럼 상에서 또는 침전에 의해 정제할 수 있다. DNA는, 당해 DNA가 비-핵산 불순물(이는 극성, 비극성, 이온성 등일 수 있다)로부터 분리되는 경우에 "정제"된 것이다.
"공급원" 또는 "주형 VNAR"은, 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 기준에 따라 분화가 수행될 때에 항원 결합 서열이 주형 서열로서 사용되는 VNAR 또는 VNAR 항원 결합 단편을 지칭한다. 항원 결합 서열은 일반적으로 VNAR 내에 바람직하게는 프레임워크 영역을 포함하여 바람직하게는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.
"전사 조절 요소"는 하나 이상의 하기 성분: 인핸서 요소, 프로모터, 작동인자 서열, 억제인자 유전자 및 전사 종결 서열 중의 하나 이상을 함유할 것이다.
"형질전환"은 세포가 DNA를 흡수하여 "형질전환체"로 되는 프로세스를 의미한다. DNA 흡수는 영구적 또는 일시적일 수 있다. "형질전환체"는 DNA와 연관된 표현형(예를 들면, DNA에 의해 코딩된 단백질에 의헤 제공된 항생물질 내성)의 발현에 의해 입증된 바와 같이 흡수 및 유지된 DNA를 갖는 세포이다.
융합 단백질(폴리펩티드) 또는 이종성 폴리펩티드(파지에 대해 이종성) 등의 출발 또는 참조 폴리펩티드(예를 들면, 공급원 VNAR 또는 이의 CDR)의 "변이체" 또는 "돌연변이체"는, (1) 참조 폴리펩티드의 것과 상이한 아미노산 서열을 갖고 (2) 천연 또는 인공 돌연변이유발을 통해 출발 또는 참조 폴리펩티드로부터 유래되는 폴리펩티드이다. 이러한 변이체는, 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 예를 들면, 변이체 아미노산(공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편 중의 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산과 관련하여)과 함께 서열을 코딩하는 비랜덤 코돈을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 생성한 본 발명의 융합 폴리펩티드는 공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편과 관련하여 변이체 폴리펩티드일 것이다. 따라서, 변이체 CDR은 출발 또는 참조 폴리펩티드 서열(예: 공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편의 서열)과 관련하여 변이체 서열을 포함하는 CDR을 지칭한다. 본 명세서에서, 변이체 아미노산은 출발 VNAR 또는 참조 폴리펩티드 서열(예: 공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편의 서열)에서 상응하는 위치의 아미노산과 상이한 아미노산을 지칭한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 변이체 또는 돌연변이체 작제물에 도달하기 위해 이루어질 수 있고, 단 최종 작제물은 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 아미노산 변화는 또한 폴리펩티드의 번역후 프로세스를 변경할 수 있고, 예를 들면, 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.
"야생형" 또는 "참조" 서열 또는 "야생형" 또는 "참조" 단백질/폴리펩티드, 예를 들면, 코트 단백질의 서열, 또는 공급원 VNAR의 CDR은 변이체 폴리펩티드가 돌연변이체의 도입에 의해 유래되는 참조 서열일 수 있다. 일반적으로, 소정 단백질의 "야생형" 서열은 자연에서 가장 통상적인 서열이다. 유사하게는, "야생형" 유전자 서열은 자연에서 가장 통상적으로 발견되는 유전자에 대한 서열이다. 돌연변이체는 자연 프로세스 또는 인간 유도된 수단을 통해 "야생형" 유전자(및 따라서 이것이 코딩하는 단백질) 내로 도입될 수 있다. 이러한 프로세스의 생성물은 본래 "야생형) 단백질 또는 유전자의 "변이체" 또는 "돌연변이체" 형태이다.
라이브러리 다양성
CDR 영역 CDR1 및 CDR3에서 아미노산 위치는 각각의 위치에서 통상 발생하는 아미노산을 코딩하는 비-랜덤 세트를 사용하여 각각 돌연변이시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR 영역 중의 위치가 돌연변이되는 경우, 당해 위치에 대해 모든 아미노산의 바람직하게는 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 바람직하게는 모든 아미노산을 코딩하는 코돈 세트가 선택된다. 일부 실시형태에서, CDR 영역 중의 위치가 돌연변이되는 경우, 당해 위치에 대해 모든 아미노산의 바람직하게는 약 50 내지 약 100%, 바람직하게는 약 60% 내지 약 95%, 바람직하게는 적어도 약 70% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 75% 내지 약 90%를 코딩하는 코돈 세트가 선택된다.
VNAR의 라이브러리의 다양성은 고친화성 항원 특이적 항원 결합 분자를 단리하는 증가된 능력을 제공하고 세포 배양물에서 고수율로 생산될 수 있는 이러한 분자를 제공하기 위해 VNAR의 구조적 섭동을 최소화하면서 다양성을 최대화하도록 설계된다. VNAR 가변 도메인에서 돌연변이된 위치의 수는 최소화되고, 각 위치에서 변이체 아미노산은, 극도로 발생하는 아미노산 및 정지 코돈을 적합하게(가능한 경우) 배제하면서, 시스테인을 제외한 각 위치에서 통상 발생하는 아미노산을 포함하도록 설계된다.
라이브러리에서의 다양성은 비랜덤 코돈 세트를 사용하여 적어도 하나의 CDR에서 이들 위치를 돌연변이시킴으로써 설계된다. 비랜덤 코돈 세트는 바람직하게는 시스테인 및 정지 코돈 등의 비-표적 서열을 최소화하면서 이들 위치에서 통상 발생하는 아미노산의 서브세트를 적어도 코딩한다.
각각의 위치에서 비랜덤 코돈 세트는 바람직하게는 적어도 2개의 아미노산을 코딩하고, 시스테인을 코딩하지 않는다. 각각의 위치에서 비-표적 아미노산을 최소화하고, 시스테인 및 정지 코돈은 일반적으로 바람직하게는 배제되는데, 이는 이들이 구조에 유해하게 영향을 미치기 때문이다.
상기 논의한 바와 같이, 변이체 아미노산은 랜덤 코돈 세트에 의해 코딩된다. 코돈 세트는 아미노산의 목적하는 그룹을 코딩하는데 사용된 올리고뉴클레오티드의 세트를 형성하기 위해 사용될 수 있는 상이한 뉴클레오티드 트리플릿 서열의 세트이다. 올리고뉴크레오티드의 세트는, 예를 들면, 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오티드 트리플릿의 모든 가능한 조합을 포함하고 아미노산의 목적하는 그룹을 코딩하는 서열을 함유하는 고체 상 합성에 의해 합성할 수 있다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오티드 "축중"을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 표준 공정이다.
특정 코돈 세트를 갖는 이러한 세트의 뉴클레오티드는 상업적 핵산 합성기(예를 들면, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems, Foster City, CA))를 사용하여 합성할 수 있거나, 상업적으로 수득할 수 있다(예를 들면, 진 링크 인코포레이티드(Gene Link Inc, Hawthorn)로부터, NY, 또는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터, Rockville, MD). 따라서,특정 코돈 세트를 갖는 합성된 오릴고뉴클레오티드의 세트는 통상 상이한 서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이고, 그 차이는 전체 서열 내의 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형과의 하이브리드화를 가능하게 하는 서열을 갖고, 또한 클로닝 목적을 위한 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
각각의 위치에 대해 표적 아미노산의 바람직하게는 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 바람직하게는 모두를 포함하는 아미노산의 그룹을 코딩하는 예시적 랜덤 코돈 세트는 도 10a에 또한 제시되어 있다.
한 가지 실시형태에서, 변이체 CDR1 및 CDR3 또는 이의 혼합물을 갖는 폴리펩티드가 형성되고, 여기서 적어도 하나의 변이체 CDR은 적어도 하나의 아미노산 위치에 변이체 아미노산을 포함하고, 변이체 아미노산은 비랜덤 코돈 세트에 의해 코딩되며, 비랜덤 코돈 세트에 의해 코딩된 아미노산의 적어도 70%는 공지된 가변 도메인 서열 중의 당해 위치에 대한 표적 아미노산 서열이다. 이들 위치에서 변이체 아미노산은 도 10a에서 예시된 코돈 세트에 의해 바람직하게 코딩된다.
CDR1과 관련하여 올리고뉴클레오티드 유도된 다양성의 예는 또한 도 10b에 제시되어 있다.
선택 아미노산을 주형 핵산 내로 치환하는 방법은 당해 기술분야에 잘 확립되어 있고, 이중 일부는 본원에 기재되어 있다. 예를 들면, 라이브러리는 쿤켈 방법[참조: Kunkel et al., Methods Enzymol. (1987), 154, 367-382]을 사용하여 변이체 아미노산으로 아미노산 치환을 위해 적어도 하나의 CDR 영역에서 아미노산 위치를 표적화함으로써 생성할 수 있다.
코돈 세트는 목적하는 변이체 아미노산을 코딩하기 위해 사용된 상이한 뉴클레오티드 트리플릿 서열의 세트이다. 코돈 세트는 IUB 코드에 따라 하기 제시된 바와 같이 특정 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 등몰량 혼합물을 지정하기 위해 심볼을 사용하여 나타낼 수 있다. 전형적으로, 코돈 세트는 도 10a에서 3개의 대문자, 예를 들면, RRK, GST, TKG, TWC, KCC, KCT 및 TRM으로 나타내어진다.
IUB 코드
G 구아닌
A 아데닌
T 티민
C 시토신
R (A 또는 G)
Y (C 또는 T)
M (A 또는 C)
K (G 또는 T)
S (C 또는 G)
W (A 또는 T)
H (A 또는 C 또는 T)
B (C 또는 G 또는 T)
V (A 또는 C 또는 G)
D (A 또는 G 또는 T) H
N (A 또는 C 또는 G 또는 T)
올리고뉴클레오티드 또는 프라이머 세트는 표준 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 세트는, 예를 들면, 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오티드 트리플릿의 모든 가능한 조합을 나타내고 아미노산의 목적하는 그룹을 코딩하는 서열을 함유하는 고체 상 합성에 의해 합성할 수 있다.
특정한 위치에서 선택된 뉴클레오티드 "축중"을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 특정한 코돈 세트를 갖는 이러한 세트의 뉴클레오티드는 상업적 핵산 합성기를 사용하여 합성할 수 있거나(예를 들면, 어플라이드 바이오시스템스사(Applied Biosystems, Foster City, CA)로부터 입수가능), 상업적으로 수득할 수 있다(예를 들면, 진 링크 인코포레이티드(Gene Link Inc, Hawthorn NY, or Life Technologies, Rockville, MD). 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드 세트는 전형적으로 상이한 서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이고, 상기 차이는 전체 서열 내의 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형과의 하이브리드화를 가능하게 하는 서열을 갖고, 또한 클로닝 목적을 위한 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
한 가지 방법에서, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열은 본원에 개시된 VNAR 서열 2V 또는 5V 등의 공급원 또는 주형 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[참조: Zoller et al. Nucleic Acids Res. (1987), 10, 6487-6504 (1987)]ㅇ[ 기재된 바와 같이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 요약하면, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산은 목적하는 코돈 세트를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 세트를 DNA 주형과 하이브리드화함으로써 생성되고, 여기서 주형은 가변 영역 핵산 주형 서열을 함유하는 플라슴드의 단일-가닥 형태이다. 하이브리드화 후, DNA 폴리머라제는 주형의 전체 제2 상보성 가닥을 합성하기 위해 사용되고, 따라서 이는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입할 것이고 올리고뉴클레오티드 세트에 의해 제공된 코돈 세트를 함유할 것이다.
기타 공급원 또는 주형 분자를 코딩하는 핵산은 공지되어 있거나, 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 적어도 25개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적 올리고뉴클레오티드는 돌연변이(들)를 코딩하는 뉴클레오티드(들)의 양측에 주형에 완전히 상보성인 12 내지 25개 뉴클레오티드를 가질 것이다. 이는 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA 주형 분자에 적절하게 하이브리드화하는 것을 보장한다. 올리고뉴클레오티드는 문헌[참조: Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1987) 75: 5765]에 기재된 것과 같이 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 용이하게 합성할 수 있다.
DNA 주형은 박테리오파지 M13 벡터(상업적으로 입수가능한 M12mp18 및 M13mp19 벡터가 적합하다)로부터 유래되거나, 문헌[참조: Viera et al., Methods Enzymol., (1987) 153, 3]의 의해 기재된 단일-가닥 파지 복제 기원을 함유하는 벡터로부터 유래되는 벡터에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 돌연변이되는 DNA는 단일 가닥 주형을 생성하기 위해 이들 벡터 중의 하나 내로 삽입될 수 있다.
천연 DNA 서열을 변경하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 적합한 하이브리드화 조건하에 단일 가닥 주형과 하이브리드화한다. 이어서, DNA 중합 효소, 통상 T7 DNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제 I의 클레오브 단편을 부가하여, 합성 프라이머로서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형의 상보성 가닥을 합성한다. 헤테로이중가닥 분자는 DNA의 하나의 가닥이 코딩 서열 1의 돌연변이된 형태를 코딩하고 다른 가닥(본래 주형)이 코딩 서열의 천연 비변화된 서열을 코딩하도록 이렇게 형성된다. 이어서, 이러한 헤테로이중가닥 분자를 적합한 숙주 세포, 통상 이. 콜라이 JM101 등의 원핵생물에 형질전환시킨다. 세포를 성장시킨 후, 이들을 아가로즈 플레이트 상에 플레이팅하고, 돌연변이된 DNA를 함유하는 세균 콜로니를 동정하기 위해 32-포스페이트로 방사표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 스크리닝한다.
바로 위에 기재된 방법은 호모이중가닥 분자가 생성되도록 변형시킬 수 있고, 여기서 플라스미드의 두 가닥은 돌연변이(들)를 함유한다. 변형은 다음과 같다: 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 상기한 바와 같이 단일 가닥 주형에 어닐링시킨다. 3개 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보아데노신(dATP), 데옥시리보구아노신(dGTP) 및 데옥시리보티미딘(dTT)의 혼합물을 dCTP-(aS)로 불리우는 변형된 티오데옥시리보시토신(이는 아머샴(Amersham)으로부터 수득할 수 있다)과 조합한다. 이 혼합물을 주형-올리고뉴클레오티드 복합체에 부가한다. 이 혼합물에 DNA 폴리머라제를 부가하면, 돌연변이된 염기를 제외한 주형과 동일한 DNA의 가닥이 생성된다. 또한, DNA의 이러한 새로운 가닥은 dCTP 대신에 dCTP-(aS)를 함유할 것이고, 이는 제한 엔도뉴클레아제 소화로부터 이를 보호하는 역할을 한다. 이중 가닥 헤테로이중가닥의 주형 가닥을 적절한 제한 효소로 닉(nkck)시킨 후, 주형 가닥은 돌연변이되는 부위(들)를 함유하는 영역을 통해 ExoIII 뉴클레아제 또는 또 다른 적절한 뉴클레아제로 소화시킬 수 있다. 이어서, 반응을 중지시켜, 단지 부분적으로 단일 가닥인 분자를 잔류시킨다. 이어서, 완전한 이중-가닥 DNA 호모이중가닥은 모든 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP 및 DNA 리가제의 존재하에 DNA 폴리머라제를 사용하여 형성한다. 이어서, 이러한 호모이중가닥 분자를 적합한 숙주 세포에 형질전환시킬 수 있다.
이전에 제시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 세트의 서열은 주형 핵산과 하이브리드화하기에 충분한 길이를 갖고, 반드시 그렇지는 않지만, 제한 부위를 또한 함유할 수 있다. DNA 주형은 박테리오파지 M13 벡터 또는 문헌[참조: Viera et al. (Meth. Enzymol. (1987), 153, 3]에 의해 기재된 단일-가닥 파지 복제 기원을 함유하는 벡터로부터 유래되는 벡터에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 돌연변이되는 DNA는 단일-가닥 주형을 생성하기 위해 이들 벡터 중의 하나에 삽입되어야 한다.
올리고뉴클레오티드 세트는 핵산 카세트를 생성하기 위해 주형으로서 핵산 주형 서열을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 사용할 수 있다. 핵산 주형 서열은 VNAR 분자의 임의의 부분(치환을 위해 표적화된 아미노산을 코딩하는 핵산 서열)일 수 있다. 핵산 주형 서열은 제1 핵산 가닥 및 상보성 제2 핵산 가닥을 갖는 이중 가닥 DNA 분자의 부분이다. 핵산 주형 서열은 VNAR 도메인의 적어도 일부를 함유하고, 적어도 하나의 CDR을 갖는다. 일부 경우에, 핵산 주형 서열은 하나 이상의 CDR을 함유한다. 핵산 주형 서열의 상류 부분 및 하류 부분은 상류 올리고뉴클레오티드 세트 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트의 구성원과의 하이브리드화를 위해 표적화시킬 수 있다.
상류 프라이머 세트의 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 핵산 가닥과 하이브리드화할 수 있고, 하류 프라이머 세트의 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 핵산 가닥과 하이브리드화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하나 이상의 코돈 세트를 포함할 수 있고, 핵산 주형 서열의 일부와 하이브리드화하도록 설계될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드의 사용은 2개 이상의 코돈 세트를 PCR 후의 PCR 생성물(즉, 핵산 카세트)로 도입할 수 있다. VNAR 도메인을 코딩하는 핵산 서열의 영역과 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 아미노산 치환을 위해 표적화되는 CDR 잔기를 코딩하는 부분을 포함한다.
상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트는 또한 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제한 부위를 포함하도록 합성할 수 있다. 이들 제한 부위는 핵산 카세트(즉, PCR 반응 생성물)가 추가의 VNAR 서열을 갖는 발현 벡터로 삽입되는 것을 촉진시킬 수 있다.
단백질 발현
본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산 서열은 핵산 작제물에 존재할 수 있다. 이러한 핵산 작제물은 벡터의 형태, 예를 들면, 박현 벡터의 형태일 수 있고, 그 중에서도 염색체, 에피좀 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들면, 세균 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포손, 효모 에피좀, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스, 예를 들면, 바쿨로-바이러스, 파포바-바이러스, 예를 들면, SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성 광견병 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터, 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들면, 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 요소, 예를 들면, 코스미드 및 파지미드로부터 유래된 벡터의 형태일 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리펩티드를 발현사키기 위해 핵산을 유지, 증식 또는 발현시키기에 적합한 임의의 벡터가 이와 관련하여 발현을 위해 사용될 수 있다.
핵산 작제물은 적합하게는 핵산의 발현을 조절하는 프로모터 또는 기타 조절 서열을 포함할 수 있다. 핵산의 발현을 조절하는 프로모터 및 기타 조절 서열은 동정되어 있고, 당해 기술분야에 공지되어 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 전체 프로모터 또는 기타 조절 서열을 사용할 필요가 없는 경우가 있음에 유의한다. 단지 최소 필수 조절 요소가 요구될 수 있고, 실제로 이러한 요소는 키메라 서열 또는 기타 프로모터를 작제하기 위해 사용될 수 있다. 물론, 필수 요건은 조직 및/또는 일시적 특이성을 보유하는 것이다. 프로모터는 임의의 적합한 공지된 프로모터, 예를 들면, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40 프로모터 또는 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예를 들면, 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 메탈로티오닌 프로모터, 예를 들면, 마우스 메탈로티오닌-I 프로모터일 수 있다. 프로모터는 프로모터 활성을 위해 구성된 최소(예를 들면, TATA 요소, 임의로 인핸서 요소 부재), 예를 들면, CMV 프로모터의 최소 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 핵산 서열에 인접한다.
본원에서 서술한 바와 같이, 핵산 작제물은 벡터의 형태일 수 있다. 벡터는 빈번히, 이들로 형질감염(또는 형질전환)된 세포의 선택을 가능하게 하고 바람직하게는 이종성 DNA를 도입한 벡터를 함유하는 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 발현 마커를 포함한다. 적합한 개시 및 정지 신호가 일반적으로 존재할 것이다.
벡터는 임의의 적합한 발현 벡터, 예를 들면, pET일 수 있다. 벡터는 필요에 따라 이러한 추가의 조절 서열, 예를 들면, 선택가능한 마커(예: 항생물질 내성, 형광 등), 개시 및 종결 서열을 포함하는 전사 조절 서열 및 프로모터를 포함할 수 있다.
프로모터는 본 발명의 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질의 발현을 유발하는 임의의 적합한 프로모터, 예를 들면, CMV 프로모터, 인간 포스파글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터일 수 있다.
이러한 벡터는 숙주 세포에 존재할 수 있다. 본 발명의 핵산 작제물의 발현을 위한 적절한 숙주 세포의 대표적 예는 바이러스 벡터 내로 핵산의 캡슐화를 가능하게 하는 바이러스 팩키징 세포; 세균 세포, 예를 들면, 스트렙토콕시(Streptococci, Staphylococci), 이. 콜라이(E. coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 단세포, 예를 들면, 효모 세포, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 아스퍼길루스(Aspergillus) 세포; 곤충 세포, 예를 들면, 드로소필라 S2(Drosophila S2) 및 스포도프테라 Sf9(Spodoptera Sf9) 세포, 동물 세포, 예를 들면, CHO, COS, C127, 3T3, PHK.293 및 보우(Bowes) 흑색종 세포 및 기타 적합한 인간 세포; 식물 세포, 예를 들면, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를 포함한다. 적합하게는, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들면, CHO 세포 또는 HEK293 세포이다.
숙주 세포 내로 발현 벡터의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 마이크로주입, 양이온 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크랩 부하, 탄도 도입, 감염 또는 기타 방법에 의해 달성할 수 있다. 이러한 방법은 다수의 표준 실험실 매뉴얼, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재되어 있다.
성숙 단백질은 포유동물 세포, 예를 들면, CHO 세포, 효모, 세균 및 기타 세포를 포함하는 숙주 세포에서 적절한 프로모터의 조절하에 발현될 수 있다. 세포-비함유 번역 시스템은 본 발명의 제3 측면의 핵산 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 이러한 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주에서 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[참조: Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명의 임의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 따르면, 상기 분자를 코딩하는 핵산 서열을 본원에서 정의된 적합한 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하여, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 생산 방법이 제공된다.
단백질은 회수하고, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교화 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 및/또는 헤파린 크로마토그래피를 포함하는 표준 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 정제할 수 있다. 치료를 위해, 예를 들면, 재조합 벡터 형태의 핵산 작제물은 당해 기술분야에 공지된 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재된 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
따라서, 본 발명의 이러한 측면은 숙주 세포에서 발현에 의해 재조합으로 융합 단백질의 생성, 펩티드 결합 연결, 수소 또는 염 결합 또는 화학적 가교 결합에 의해 발현된 융합 단백질의 정제를 포함하여 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법으로 연장한다. 본 발명의 이러한 측면의 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 펩티드가 가능하게 하는 수소 또는 염 결합 또는 다량체화, 예를 들면, 이량체화 또는 삼량체화를 사용하여 제조할 수 있다.
라이브러리로서 단백질 발현
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 복수의 벡터를 포함하는 라이브러리를 제공하고, 여기서 복수의 벡터는 복수의 폴리펩티드를 코딩한다. 따라서, 본 발명은 이의 표면 상에서 본 발명의 폴리펩티드를 표시하는 바이러스 또는 바이러스 입자(예를 들면, 파지 또는 파지미드 입자)를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 복수의 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 라이브러리를 제공하고, 각각의 바이러스 또는 바이러스 입자는 본 발명의 폴리펩티드를 표시한다. 본 발명의 라이브러리는 임의 수의 상이한 폴리펩티드(서열), 적어도 약 1×108, 적어도 약 1×109, 적어도 약 1×1010 상이한 서열, 보다 적합하게는 적어도 약 9×1010 서ㅕㄹ을 포함할 수도 있다.
본 발명은 복수의 폴리펩티드를 함유하는 라이브러리를 또한 제공하고, 여기서 각 유형의 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드이다.
핵산 카세트는 생성된 표적화된 아미노산 치환체를 함유하는 단백질 또는 전체 VNAR의 발현을 위해 임의의 적합한 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 핵산 카세트는 바이러스 코트 단백질의 전부 또는 일부와 융합된 일부 또는 전체 VNAR 쇄 서열의 생성(즉, 융합 단백질 생성)을 가능하게 하는 벡터 내로 클로닝시킬 수 있고, 입자 또는 세포의 표면 상에 표시할 수 있다. 몇몇 형태의 벡터가 이용가능하고 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있지만, 파지미드 벡터가 본원에서 사용하기에 바람직한 벡터인데, 이는 이들이 비교적 용이하게 작제될 수 있고 용이하게 증폭시킬 수 있기 때문이다. 파지미드 벡터는 일반적으로 프로모터, 신호 서열, 표현형 선택 유전자, 복제 기원 부위 및 기타 필수 성분을 포함하는 다양한 성분을 함유한다.
특정 변이체 아미노산 조합물이 발현되는 또 다른 실시형태에서, 핵산 카세트는 VNAR 서열의 전부 또는 일부를 코딩할 수 있고 변이체 아미노산 조합물을 코딩할 수 있는 서열을 함유한다. 라이브러리에서와 같이 이들 변이체 아미노산 또는 변이체 아미노산의 조합물을 함유하는 항원 특이적 항원 결합 분자의 생성을 위해, 핵산 카세트는 추가의 VNAR 서열, 예를 들면, 다양한 CDR의 전부 또는 일부, 프레임워크 및/또는 초가변 영역을 함유하는 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 이들 추가 서열은 또한 다른 핵산 서열, 예를 들면, 바이러스 코트 단백질 성분을 코딩하고 따라서 융합 단백질의 생성을 가능하게 하는 서열에 융합시킬 수 있다.
본 발명의 한 가지 측면은 유전자 융합을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제가능한 발현 벡터를 포함하고, 여기서 유전자 융합은 바이러스 코트 단백질의 전부 또는 일부에 융합된 VNAR 서열 및 제2 VNAR 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다. 또한, 상기 기재된 바와 같은 다양한 서열로 생성된 복수의 VNAR 서열을 포함하는 복수의 상이한 융합 단백질을 코딩하는 복수의 유전자 융합체를 포함하는 다양한 복제가능한 발현 벡터의 라이브러리가 포함된다. 벡터는 다양한 성분들을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상이한 벡터 사이의 VNAR 서열의 이동을 가능하게 하고/하거나 상이한 포맷으로 융합 단백질의 표시를 제공하도록 작제된다.
벡터의 예는 파지 벡터를 포함한다. 파지 벡터는 파지 복제 및 파지 입자 형성을 가능하게 하는 파지 복제 기원을 갖는다. 파지는 바람직하게는 사상 박테리오파지, 예를 들면, M13, fl, fd, Pf3 파지 또는 이의 유도체, 또는 람다 파지, 예를 들면, 람다, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, 등, 또는 이의 유도체이다.
바이러스 코트 단백질의 예는 감염성 단백질 PIII, 주요 코트 단백질 PVIII, p3, Soc (T4), Hoc (T4), gpD(박테리오파지 람다의), 마이너 박테리오파지 코트 단백질 6 (pVI)(사상 파지; Hufton et al, J Immunol Methods. (1999), 231, (1-2): 39-51), M13 박테리오파지 주요 코트 단백질(P8)의 변이체(Weiss et al, Protein Sci (2000) 9 (4): 647-54)이다. 융합 단백질은 파지의 표면 상에 표시될 수 있고, 적합한 파지 시스템은 M13K07 헬퍼 파지, M13R408, M13-VCS 및 Phi X 174, pJuFo 파지 시스템(Pereboev et al J Virol. (2001); 75(15): 7107-13), 및 하이퍼파지(Rondot et al Nat Biotechnol. (2001); 19(1): 75-8)를 포함한다. 바람직한 헬퍼 파지는 M13K07이고, 바람직한 코트 단백질은 M13 파지 유전자 III 코트 단백질이다. 바람직한 숙주는 이. 콜라이(E. coli) 및 이. 콜라이의 프로테아제 결손 균주이다. 벡터, 예를 들면, fthl 벡터(Enshell-Seijffers et al., Nucleic Acids Res. (2001); 29(10): E50-0)가 융합 단백질의 발현을 위해 유용할 수 있다.
발현 벡터는 또한 각각의 VNAR 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA에 융합된 분비 신호 서열을 가질 수 있다. 이 서열은 전형적으로 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 바로 5' 측에 위치하고, 따라서 융합 단백질의 아미노 말단에서 전사될 것이다. 그러나, 특정한 경우에, 신호 서열은 분비되는 단백질을 코딩하는 유전자의 5' 측 이외의 위치에 위치하는 것으로 입증되었다. 이러한 서열은 세균 세포의 내막을 통해 부착되어 있는 단백질을 표적화한다. 신호 서열을 코딩하는 DNA는 신호 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 임의의 유전자로부터 제한 엔도뉴클레아제 단편으로서 수득할 수 있다. 적합한 원핵생물 신호 서열은, 예를 들면, LamB 또는 OmpF[참조: Wong et al, Gene, (1983) 68, 1931], MalE, PhoA 및 기타 유전자를 코딩하는 유전자로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 실시하기 위한 바람직한 원핵생물 신호 서열은 문헌[참조: Chang et al (Gene 55. 189 (1987)]에 기재된 이. 콜라이 열-안정한 내독소 II(STII) 신호 서열 및 malE이다.
벡터는 또한 전형적으로 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해 프로모터를 포함한다. 원핵생물 벡터에서 가장 통상적으로 사용되는 프로모터는 lac Z 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타제 pho A 프로모터(Ap), 박테리오파지 XPL 프로모터(온도 감수성 프로모터), tac 프로모터(lac 억제인자에 의해 조절되는 하이브리드 trp-lac 프로모터), 트립토판 프로모터 및 박테리오파지 T7 프로모터를 포함한다. 프로모터의 일반적 기재에 대해서는 문헌[참조: section 17 of Sambrook et al. supra]을 참조한다. 이들은 가장 통상적으로 사용되는 프로모터이지만, 기타 적합한 미생물 프로모터도 또한 사용될 수 있다.
벡터는 또한 기타 핵산 서열, 예를 들면, gD 태그, c-Myc 에피토프, 폴리-히스티딘 태그, 형광 단백질(예: GFP), 또는 파지 또는 세포의 표면 상에서 발현된 융합 단백질의 검출 또는 정제에 유용할 수 있는 베타-갈라토시다제 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, gD 태그를 코딩하는 핵산 서열은 또한 융합 단백질을 발현하는 세포 또는 바이러스의 양성 또는 음성 선택을 제공한다. 일부 실시형태에서, gD 태그는 바람직하게는 바이러스 코트 단백질 성분과 융합되지 않은 VNAR 서열과 융합된다. 예를 들면, 폴리히스티딘 태그를 코딩하는 핵산 서열은 면역조직화학을 사용하여 특정의 항원에 결합하는 VNAR 서열을 포함하는 융합 단백질을 동정하는데 유용하다. 항원 결합의 검출에 유용한 태그는 바이러스 코트 단백질 성분에 융합되지 않는 VNAR 서열 또는 바이러스 코트 단백질 성분에 융합된 VNAR 서열에 융합될 수 있다.
본 발명을 실시하기 위해 사용된 벡터의 또 다른 유용한 성분은 표현형 선택 유전자이다. 전형적인 표현형 선택 유전자는 숙주 세포에 대해 항생물질 내성을 제공하는 단백질을 코딩하는 것들이다. 예를 들면, 암피실린 내성 유전자(Ampr) 및 테트라사이클린 내성 유전자(Tetr)는 이러한 목적을 위해 용이하게 사용된다.
벡터는 또한 독특한 제한 부위 및 억제가능한 정지 코돈을 함유하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 독특한 제한 부위는 상이한 벡터와 발현 시스템 사이의 VNAR 서열을 이동시키는데 유용하다. 억제가능한 정지 코돈은 융합 단백질의 발현 수준을 조절하고 가용성 VNAR 단편의 정제를 용이하게 하는데 유용하다. 예를 들면, 앰버 정지 코돈은 파지 디스플레이를 가능하게 하기 위해 supE 숙주에서 Gln으로 판독될 수 있고, 비-supE 숙주에서는 파지 코트 단백질에 대한 융합 없이 가용성 VNAR 단편을 생성하기 위해 정지 코돈으로 판독된다. 이들 합성 서열은 벡터에서 하나 이상의 VNAR 서열과 융합될 수 있다.
목적하는 서열을 코딩하는 핵산, 예를 들면, 변이체 아미노산을 갖는 CDR이 벡터 시스템으로부터 용이하게 제거되고 또 다른 벡터 시스템에 위치되는 것을 가능하게 하는 벡터 시스템을 사용하는 것이 편리할 수 있다. 예를 들면, 적절한 제한 부위는 VNAR을 코딩하는 핵산 서열의 제거를 용이하게 하기 위해 벡터 시스템에서 조작될 수 있다. 제한 서열은 통상적으로 새로운 벡터로의 효율적 절제 및 연결을 용이하게 하기 위해 벡터에서 독특하도록 선택된다. 이어서, VNAR 서열은 외래 융합 서열, 예를 들면, 바이러스 코트 단백질 또는 기타 서열 태그의 부재하에 벡터로부터 발현될 수 있다.
VNAR 서열을 코딩하는 핵산(유전자 1) 및 바이러스 코트 단백질 성분(유전자 2) 사이에, 종결 또는 정지 코돈을 코딩하는 DNA가 삽입될 수 있고, 이러한 종결 코돈은 UAG(amber), UAA(ocher) 및 UGA(opel)을 포함한다[참조: Microbiology, Davis et al., Harper & Row, New York, 1980, pp.237, 245-47 and 374]. 야생형 숙주 세포에서 발현된 종결 또는 정지 코돈은 부착된 유전자 2 단백질의 부재하에 유전자 1 단백질 생성물의 합성을 가져 온다. 그러나, 억제인자 숙주 세포에서의 성장은 융합된 단백질의 검출가능한 양의 합성을 가져 온다. 이러한 억제인자 숙주 세포는 공지되어 있고, 예들 들면, 이. 콜라이 억제인자 균주[참조: Bullock et al., BioTechniques 5: 376-379 (1987)]가 기재되어 있다. 임의의 허용되는 방법은 융합 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 내로 이러한 종결 코돈을 위치시키기 위해 사용될 수 있다.
억제가능한 코돈은 VNAR 서열을 코딩하는 제1 유전자, 및 파지 코트 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 제2 유전자 사이에 삽입될 수 있다. 대안적으로, 억제가능한 종결 코돈은 최종 아미노산 트리플릿을 VNAR 서열에 위치시키거나 제1 아미노산을 파지 코트 단백질에 위치시킴으로써 융합 부위에 인접하게 삽입할 수 있다. 억제가능한 종결 코돈은 이량체화 도메인의 C-말단에 또는 C-말단 이후에 위치될 수 있다. 억제가능한 코돈을 함유하는 플라스미드가 억제인자 숙주 세포에서 성장되는 경우, 이는 폴리펩티드 및 코트 단백질을 함유하는 융합 폴리펩티드의 검출가능한 생성을 가져 온다. 플라스미드가 비-억제인자 숙주 세포에서 성장되는 경우, VNAR 서열은 삽입된 억제가능한 트리플릿 UAG, UAA 또는 UGA에서의 종결에 기인하여 파지 코트 단백질에 대한 융합 없이 실질적으로 합성된다. 비-억제인자 세포에서, 항체 가변 도메인은 달리는 이를 숙주 막에 고정시키는 융합된 파지 코트 단백질의 부재에 기인하여 숙주 세포로부터 합성 및 분비된다.
일부 실시형태에서, 다양화(랜덤화)되는 CDR은 주형 서열(본원에서 "정지 코돈"으로 지칭됨)에서 조작된 정지 코돈을 가질 수 있다. 이러한 특징은 목적하는 변이체 아미노산에 대한 서열(들)을 포함하는 올리고뉴클레오티드(들)의 도입에 기인하여 주형 서열에서 정지 코돈(들)의 성공적 수복에 기반하여 성공적으로 다양화된 서열의 검출 및 선택을 제공한다.
본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자
본 발명의 특정 실시형태에서, 항원 특이적 항원 결합 분자는 도 9, 11, 12, 13, 14, 15a, 15b 또는 16 중의 어느 하나에 제시된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 항원 특이적 항원 결합 분자는 도 9, 11, 12, 13, 14, 15a, 15b 또는 16 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 HGMP에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램의 디펄트 파라미터를 사용하여 이와 50% 동일성, 또는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 이의 임의의 변이체, 동족체, 유도체 또는 단편이다. 본 발명의 한 가지 실시형태에서, 항원 특이적 항원 결합 분자는 인간화된 것이다. 약 20% 내지 약 85% 인간화, 예를 들면, 약 20% 내지 60% 인간화를 갖는 본 발명의 인간화된 결합 분자를 제공하는 것이 편리할 수 있다.
항원 특이적 항원 결합 분자는 본원에 기재된 분자의 생성을 위해 프로세스 동안 정제 및/또는 단리를 보조할 수 있는 사용 전에 절단되는 추가의 N-말단 또는 C-말단 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 분자의 C-말단에서 (Ala)3(His)6.
또한, 본 발명에는 단백질의 아미노산 서열을 갖는 변이체, 동족체, 유도체 및 단편이 포함되고, 여기서 몇몇, 예를 들면, 5 내지 10, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 3, 2, 1개의 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 부가되거나, 어떠한 아미노산 잔기도 치환, 결실 또는 부가되지 않는다. 이들 중에서 침묵 치환, 부가 및 결실이 특히 바람직하고, 이는 본 발명의 단백질의 특성 및 활성을 변경하지 않는다. 또한, 이와 관련하여, 본 발명의 단백질의 특성이 본래 형태와 비교하여 변이체 형태에서 보존되는 보존적 치환이 특히 바람직하다. 또한, 변이체는 본 발명에 따르는 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 변이체의 예는 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 다른 아미노산으로의 치환이 존재하는 단백질을 포함한다. 당해 기술분야의 숙련가는 다양한 아미노산이 유사한 특성을 갖는 것을 인지한다. 물질의 하나 이상의 이러한 아미노산은 종종 당해 물질의 목적하는 활성을 간섭하거나 제거하지 않고서 하나 이상의 다른 이러한 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 이러한 치환은 "비-보존적" 아미노산 치환으로 지칭될 수 있다.
따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 이소로이신은 종종 서로 치환될 수 있다(지방족 측쇄를 갖는 아미노산). 이들 가능한 치환 중에서, 글리신 및 알라닌을 사용하여 서로 치환하고(이들은 비교적 짧은 측쇄이기 때문에) 발린, 로이신 및 이소로이신을 사용하여 서로 치환하는 것(이들은 소수성인 보다 큰 지방족 측쇄를 갖기 때문에)이 바람직하다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 다음을 포함한다: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산). 이러한 성질의 치환은 종종 "보존적" 또는 "반-보존적" 아미노산 치환으로 지칭된다.
아미노산 결실 또는 삽입은 또한 상기 지칭된 융합 단백질을 위해 아미노산 서열에 대해 이루어질 수 있다. 따라서, 예를 들면, 폴리펩티드의 활성에 실질적 효과를 갖지 않거나 적어도 이러한 활성을 제거하지 않는 아미노산이 결실될 수 있다. 이러한 결실은 활성을 여전히 유지하면서 폴리펩티드의 전체 길이 및 분자량을 감소시킬 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 이는 특정 목적에 요구되는 폴리펩티드의 양을 감소시킬 수 있고, 예를 들면, 용량 수준을 감소시킬 수 있다.
상기 융합 단백질의 서열에 대하여 아미노산 삽입이 또한 이루어질 수 있다. 이는 본 발명의 물질의 특성을 변경하기 위해 수행할 수 있다(예를 들면, 융합 단백질과 관련하여 상기 설명된 바와 같이 동정, 정제 또는 발현을 보조하기 위해).
본 발명의 융합 단백질을 위해 서열에 대한 아미노산 변화는 임의의 적합한 기술을 사용하여, 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 아미노산 치환 또는 삽입은 천연 발생 또는 비-천연 발생 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 천연 또는 합성 아미노산이 사용되든지 사용되지 않든지, L-아미노산만이 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 단백질은 추가의 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 서열은 다양한 이유, 예를 들면, 글리코실화를 제공할 수 있다.
융합 단백질은 융합 단백질에 구조적 요소를 제공하는 이종성 펩티드 또는 단백질 서열에 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 생물학적 활성을 갖는 분자, 즉 약리학적으로 유용한 활성을 갖는 치료 단백질과 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 분자는 펩티드 또는 단백질 서열, 또는 또 다른 생물학적 활성 분자일 수 있다.
예를 들면, 항원 특이적 항원 결합 분자는 폴리-아미노산 서열일 수 있는 이종성 펩티드 서열, 예를 들면, 복수의 히스티딘 잔기 또는 복수의 리산 잔기(적합하게는 2, 3, 4, 5 또는 6개 잔기) 또는 면역글로불린 도메인(예: Fc 도메인)에 융합될 수 있다.
이종성 펩티드 서열에 대한 참조는 다른 포유동물 종, 예를 들면, 마우스 및 인간으로부터의 서열, 및 다른 VNAR 도메인으로부터 기원하는 임의의 이종성 펩티드 서열을 포함한다.
융합 단백질이 생물학적 활성을 갖는 분자와 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 경우, 생물학적 활성 잔기는 생물학적 활성을 갖는 펩티드 또는 단백질, 예를 들면, 효소, 면역글로불린, 사이토킨 또는 이의 단편일 수 있다. 대안적으로, 생물학적 활성 분자는 항생물질, 항암 약물, NSAID, 스테로이드, 진통제, 독소 또는 기타 약제학적 활성제일 수 있다. 항암 약물은 세포독성 또는 세포증식억제 약물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 또 다른 면역글로불린 가변 또는 불변 영역에 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 또 다른 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 달리 말하면, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 융합은 가변 길이, 예를 들면, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 고차 다량체(오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체 또는 십량체 또는 그 이상)일 수 있다. 구체적 실시형태에서, 이는 단량체 VNAR 아단위의 다량체로서 나타낼 수 있다.
예를 들면, VNAR CDR이 추가의 펩티드 서열에 융합되는 경우, 추가의 펩티드 서열은 바이러스 입자 또는 세포의 표면 상에서 하나 이상의 융합 폴리펩티드의 상호작용을 제공할 수 있다. 따라서, 이들 펩티드 서열은 "이량체화 도메인"으로 지칭될 수 있다. 이량체화 도메인은 적어도 하나 이상의 이량체화 서열, 또는 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 하나의 서열 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. 적합한 이량체화 서열은 소수성 잔기가 규칙적으로 이격되어 있고 각 단백질의 소수성 잔기의 상호작용에 의해 이량체의 형성을 가능하게 하는 양쪽성 알파 헬릭스를 갖는 단백질의 것들을 포함하고; 이러한 단백질 및 단백질 부분은, 예를 들면, 로이신 지퍼 영역을 포함한다.
이량체화 도메인은 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함할 수 있다(예를 들면, 이량체화 도메인 내에 항체 힌지 서열의 포함에 의해 제공됨). 시스테인 잔기는 하나 이상의 디설파이드 결합의 형성에 의해 이량체화를 제공할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 정지 코돈이 이량체화 도메인 후에 존재하는 경우, 이량체화 도메인은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 이량체화 도메인은 바람직하게는 항체 가변 또는 불변 도메인 및 바이러스 코트 단백질 성분 사이에 위치되어 있다.
본 발명의 융합 단백질에서, 항원 특이적 항원 결합 분자는 융합 단백질의 다른 요소에 링커 잔기를 통해 직접 융합 또는 연결될 수 있다. 링커는 펩티드, 펩티드 핵산 또는 폴리아미드 연결일 수 있다. 적합한 펩티드 링커는 복수의 아미노산 잔기, 예를 들면, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개 아미노산, 예를 들면, (Gly)4, (Gly)5, (Gly)4Ser, (Gly)4(Ser)(Gly)4 또는 이들의 조합 또는 이들의 다량체(예를 들면, 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 그 이상)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 링커는 (GGGGS)3일 수 있다. 대안적 링커는 (Ala)3(His)6 또는 이의 다량체일 수 있다. 또한, HGMP에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램의 디펄트 파라미터를 사용하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열이 포함된다.
일부 경우에, 벡터는 코트 단백질에 융합된 단일 VNAR-파지 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 경우에, 벡터는 특정한 프로모터의 조절하에 하나의 전사체를 발현하는 "모노시스트론성"인 것으로 간주된다.
이러한 벡터의 예시적 예는, 도메인 사이의 링커 펩티드와 함께, VNAR 영역을 코딩하는 모노시트론성 서열의 발현을 유도하기 위해 알칼리 포스파타제(AP) 또는 Tac 프로모터를 사용한다. 시스트론성 서열은 5'-말단에서 이. 콜라이 malE 또는 열-안정한 내독소 II(STII) 신호 서열 및 이의 3' 말단에서 바이러스 코트 단백질(예: pIII 단백질)의 전부 또는 일부에 연결될 수 있다. 벡터는, 제2 가변 도메인 서열 및 바이러스 코트 단백질 서열 사이에서, 이의 3'-말단에 이량체화 도메인을 코딩하는 서열(예: 로이신 지퍼)를 추가로 포함할 수 있다. 이량체화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드는 2개 폴리펩티드의 복합체를 형성하기 위해 이량체화할 수 있다.
다른 경우에, VNAR 서열(복수의 VNAR 서열 또는 단편)은 별개의 폴리펩티드로서 발현될 수 있고, 따라서 벡터는 "바이시스트론성"이며, 별개의 전사체의 발현을 가능하게 한다. 이들 벡터에서, 적합한 프로모터, 예를 들면, Ptac 또는 PhoA 프로모터를 사용하여 바이시스트론성 메시지의 발현을 유도할 수 있다. 예를 들면, 제1 VNAR 서열을 코딩하는 제1 시스트론은 5'-말단에서 이. 콜라이 malE 또는 열-안정한 내독소 II(STII) 신호 서열에 연결될 수 있고, 3'-말단에서 gD 태그를 코딩하는 핵산 서열에 연결될 수 있다. 예를 들면, 제2 VNAR 서열을 코딩하는 제2 시스트론은 이의 5'-말단에서 이. 콜라이 malE 또는 열-안정한 내독소 II(STII) 신호 서열에 연결될 수 있고, 3'-말단에서 바이러스 코트 단백질의 전부 또는 일부에 연결될 수 있다.
예시적 벡터는 적합한 프로모터, 예를 들면, 5'-말단에서 이. 콜라이 malE 또는 열 안정한 내독소 II(STII) 신호 서열에 및 3'-말단에서 gD 태그를 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 VNAR 서열을 코딩하는 제1 시스트론의 발현을 유도하는 Ptac 또는 PhoA(AP) 프로모터를 포함할 수 있다. 제2 시스트론은, 예를 들면, 5'-말단에서 이. 콜라이 malE 또는 열 안정한 내독소 II(STII) 신호 서열에 작동적으로 연결된 또 다른 VNAR 서열을 코딩하고, 3'-말단에는 IgG 힌지 서열 및 로이신 지퍼 서열, 이어서 바이러스 코트 단백질의 적어도 일부를 포함하는 이량체화 도메인을 갖는다.
VNAR 서열의 융합 폴리펩티드는 다양한 포맷으로 세포, 바이러스 또는 파지미드 입자의 표면에서 표시될 수 있다. 이들 포맷은 단일쇄 단편 및 이들 단편의 다가 형태를 포함한다. 다가 형태는 이량체 또는 보다 고차 다량체일 수 있다. 다가 형태의 표시는 이들이 보다 낮은 친화성 클론의 동정을 일반적으로 가져 오고 또한 선택 프로세스 동안 희귀 클론의 보다 효율적 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 갖기 때문에 편리할 수 있다.
본 발명에 따라 기재된 바와 같이 작제된 벡터는 증폭 및/또는 발현을 위해 숙주 세포에 도입된다. 벡터는 전기천공, 인산칼슘 침전 등을 포함하는 표준 형질전환 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 벡터가 감염성 입자, 예를 들면, 바이러스인 경우, 벡터 자체는 숙주 세포 내로의 도입을 제공한다. 표준 공정에 따라 파지 입자의 유전자 융합 및 생성을 코딩하는 복제가능한 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 형질감염은 융합 단백질이 파지 입자의 표면 상에 표시되는 파지 입자를 제공한다.
복제가능한 발현 벡터는 다양한 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입된다. 한 가지 실시형태에서, 벡터는 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 세포는 표준 배양 브로쓰에서의 배양으로 임의로 약 6 내지 48시간(또는 OD600 = 0.6-0.8) 동안 약 37℃에서 성장시키고, 이어서 브로쓰를 원심분리하고, 상청액을 제거한다(예: 경사분리). 초기 정제는 바람직하게는 세포 펠렛을 완충액(예: 1.0mM HEPES, pH 7.4)에서 현탁시키고, 이어서 재원심분리 및 상청액의 제거에 의해 수행한다. 수득되는 세포 펠렛을 희석 글리세롤(예: 5-20% v/v)에 재현탁시키고, 다시 원심분리하여 세포 펠렛을 형성하고, 상청액을 제거한다. 최종 세포 농도는 세포 펠렛을 물 또는 희석 글리세롤에 목적하는 농도로 재현탁시킴으로써 수득한다.
전기천공 동안 보다 높은 DNA 농도(약 10x)의 사용은 형질전환 효율을 증가시키고, 숙주 세포 내로 형질전환된 DNA의 양을 증가시킨다. 높은 세포 농도의 사용은 또한 효율(약 10x)을 증가시킨다. 보다 다량의 도입된 DNA는 보다 큰 다양성을 갖고 보다 큰 수의 조합 라이브러리의 독특한 구성원을 나타내는 보다 큰 라이브러리를 생성한다. 형질전환된 세포는 일반적으로 항생물질 함유 배지 상에서의 성장에 의해 선택된다.
방법에 있어서 이의 다양한 치환 및 변화를 갖는, 표적 항원 결합제를 동정하기 위한 파지 디스플레이의 사용은 당해 기술분야에 잘 확립되어 있다. 한 가지 접근법은, 융합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 융합에 작동적으로 연결된 전사 조절 요소를 함유하는 변이체 복제가능한 벡터의 계열을 작제하고, 적합한 숙주 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 배양하여, 파지 입자의 표면 상에서 융합 폴리펩티드를 표시하는 파지 입자를 형성한 다음, 선택 프로세스에서 결합하지 않는 입자에 대해 입자로부터 결합하는 입자의 서브세트를 증가 및 농후화시킬 목적으로 입자 모집단의 적어도 일부가 표적에 결합하도록 재조합 파지 입자를 표적 항원과 접촉시킴으로써 선택 또는 선별을 수반하는 프로세스를 포함한다. 선택된 풀은 동일한 표적에 대한 또 다른 라운드의 선별을 위해 숙주 세포를 상이하거나 동일한 엄격함으로 감염시킴으로써 증폭시킬 수 있다. 이어서, 수득되는 변이체 풀은 새로운 고친화성 결합 단백질을 동정하기 위해 표적 항원에 대해 스크리닝한다.
이들 신규한 고친화성 결합 단백질은 길항제 또는 효능제로서의 치료제로서 및/또는 진단 및 연구 시약으로서 유용할 수 있다.
변이체 아미노산을 포함하는 항체 가변 도메인 등의 융합 폴리펩티드는 파지, 파지미드 입자 또는 세포의 표면 상에서 발현시킬 수 있고, 이어서 전형적으로 목적하는 항원인 표적 항원에 결합하는 융합 폴리펩티드 그룹의 구성원의 능력에 대해 선택 및/또는 스크리닝한다.
이러한 융합 단백질은 화학적 합성 경로 뿐만 아니라 숙주 세포 또는 세포-비함유 시스템에서의 발현에 의해 재조합 기술을 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 제조할 수 있다.
라이브러리 구성원의 선택
표적에 대한 결합제를 위한 선택 프로세스는 또한 파지 상에 표시된 항체 또는 항체 단편에 결합하는 단백질 L 또는 태그 특이적 항체 등의 항체 가변 도메인에 대해 친화성을 갖는 일반 단백질에 대한 선별을 포함할 수 있고, 이는 정확하게 중첩된 항체 단편(융합 폴리펩티드)를 표시하는 라이브러리 구성원을 농후화하기 위해 사용할 수 있다.
수용체 등의 표적 단백질은 천연 공급원으로부터 단리되거나, 당해 기술분야에 공지된 공정으로 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다. 표적 항원은 치료학적 모겆ㄱ의 다수의 분자를 포함할 수 있다.
가능한 친화성을 위한 2개의 주요 선택(선별) 전략은 (i) 고체-지지체 방법 또는 플레이트 선별 또는 고정된 표적 선별; 및 (ii) 용액-결합 방법이다.
고체 지지체 방법의 경우, 표적 단백질을 당해 기술분야에 공지된 적합한 고체 또는 반고체 매트릭스, 예를 들면, 아가로즈 비드, 아크릴아미드 비드, 유리 비드, 셀룰로즈, 다양한 아크릴 공중합체, 하이드록시알킬 메타크릴레이트 겔, 폴리아크릴 및 폴리메타크릴 공중합체, 나일론, 천연 및 이온성 담체 등에 부착시킬 수 있다.
매트릭스에 대한 표적 항원의 부착 후, 고정된 표적은 파지 입자 모집단의 서브세트를 고정된 표적 항원과 적어도 결합시키기에 적합한 조건하에 융합 폴리펩티드를 발현하는 라이브러리와 접촉시킨다. 통상적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건과 유사할 것이다. 고정된 표적에 결합된 입자("결합제")는 세척에 의해 표적에 결합하지 않은 입자로부터 분리한다. 세척 조건은 고친화성 결합제의 전부를 제거를 제공하도록 조정할 수 있다. 결합제는 다양한 방법에 의해 고정된 표적으로부터 해리시킬 수 있다. 이들 방법은 야생형 리간드(예: 과량의 표적 항원), pH 및/또는 이온 강도의 변경 및 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하는 경쟁 해리를 포함한다. 결합제의 선택은 통상적으로 0.1M HCl과 같은 산 또는 리간드 등의 적합한 용출 물질을 사용한 친화성 매트릭스로부터의 용출을 수반한다. 증가하는 농도의 리간드를 사용한 용출은 증가하는 친화성의 표시된 결합 분자를 용출시킬 수 있다.
결합제를 단리하고, 이어서 세포를 결합제인 바이러스 입자(및 필요한 경우 헬퍼 파지, 예를 들면, 바이러스 입자가 파지미드 입자인 경우)로 감염시켜 적합한 숙주 세포에서 재증폭시키고, 숙주 세포는 목적하는 융합 폴리펩티드를 표시하는 입자의 증폭에 적합한 조건하에 배양한다. 이어서, 파지 입자를 수집하고, 선택 프로세스는 표적 항원의 결합제가 어느 정도 농후화될 때까지 1회 이상 반복한다. 임의 수의 선택 또는 선별 라운드가 사용될 수 있다. 선택 또는 선별 공정 중의 하나는 gD 단백질 또는 폴리히스티딘 태그에 대한 항체 등의 표시된 폴리펩티드에 존재하는 단백질 L 또는 폴리펩티드 태그에 대한 항체 등의 일반 친화성 단백질에 결합하는 결합제를 단리하는 것을 수반할 수 있다.
또 다른 선택 방법은 종래의 용액 선별 방법에 비해 개선된 효율로 용액 상 선별을 가능하게 하는 "용액-결합 방법"이다. 용액 결합 방법은 랜덤 라이브러리로부터 본래 결합제를 발견하거나, 특정 결합 클론 또는 클론 그룹의 친화성을 개선시키기 위해 지정된 라이브러리로부터 개선된 결합제를 발견하기 위해 사용되어 왔다. 이 방법은 복수의 폴리펩티드, 예를 들면, 파지 또는 파지미드 입자(라이브러리) 상에 표시된 것들을 태그 분자로 표지되거나 융합된 표적 항원과 접촉시키는 것을 포함한다. 태그는 비오틴, 또는 특정한 결합제가 이용가능한 다른 잔기일 수 있다. 용액 상의 엄격성은 제1 용액 결합 상 중의 표지된 표적 항원의 농도 감소를 사용함으로써 달라질 수 있다.
엄격성을 추가로 증가시키기 위해, 제1 용액 결합 상은 제1 용액 상에서 표지된 표적과의 초기 결합 후에 고농도의 비표지된 표적 항원을 갖는 제2 용액 상이 계속될 수 있다. 통상적으로, 표직된 표적에 비해 100 내지 1000배의 비표지된 표적이 제2 상(포함되는 경우)에 사용된다. 제1 용액 상의 배양 시간의 길이는 평형에 도달하기 위해 수분 내지 1 내지 2시간 또는 그 이상으로 달라질 수 있다. 이러한 제1 상에서 보다 짧은 결합 시간을 사용하는 것은 신속한 속도를 갖는 결합제를 바이어스 또는 선택할 수 있다. 제2 상에서 시간 길이 및 배양 온도는 엄격성을 증가시키기 위해 달라질 수 있다. 이는 표적의 느린 오프 속도(오프-속도)를 갖는 결합제를 위한 선택 바이어스를 제공한다.
복수의 폴리펩티드(파지/파지미드 입자 상에 표시된)를 표적 항원과 접촉시킨 후, 표지된 표적에 결합되는 파지 또는 파지미드 입자는 결합하지 않은 파지로부터 분리한다. 결합의 용액 상으로부터 입자-표적 혼합물은 이를 표지된 표적 잔기와 접촉시키고 짧은 시간(약 2 내지 5분) 동안 표지된 표적 잔기에 결합하는 분자에 대한 이의 결합을 가능하게 함으로써 단리한다. 표지된 표적 항원의 초기 농도는 약 0.1nM 내지 약 1000nM 범위일 수 있다. 결합된 입자를 용출시키고, 후속 선별 라운드를 위해 증식시킬 수 있다. 각각의 선별 라운드에서 표지된 표적 항원의 보다 낮은 농도를 사용하는 복수의 선별 라운드가 바람직하다.
예를 들면, 약 100 내지 250nM 표지된 항원을 사용하는 초기 선별 또는 선택은 광범위한 친화성을 포획하기에 충분해야 하지만, 이러한 인자는 경험적으로 결정되고/되거나 실시자의 요망에 부합하도록 결정될 수 있다. 제2 라운드의 선택에서, 약 25 내지 100nM의 표지된 표적 항원이 사용될 수 있다. 제3 라운드의 선택에서, 약 0.1 내지 25nM의 표지된 표적 항원이 사용될 수 있다. 예를 들면, 100nM 결합제의 친화성을 개선시키기 위해, 20nM로 출발한 다음 5 및 1nM 표지된 표적으로 진행시키고, 이어서 약 0.1nM 표지된 표적 항원 등의 보다 낮은 농도로 계속하는 것이 바람직할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 고체 지지체 및 용액 선별 방법의 조합은 유리하게는 목적하는 특성을 갖는 결합제를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 몇 라운드 동안 표적 항원에 대한 선택/선별 후, 선택된 풀로부터 개개 클론의 스크리닝을 일반적으로 수행하여, 목적하는 특성/특징을 갖는 특정의 결합제를 동정한다. 바람직하게는, 스크리닝 프로세스는 라이브러리 후보의 고처리량 스크리닝을 가능하게 하기 위해 자동화 시스템에 의해 수행된다.
2개의 주요 스크리닝 방법은 하기에 기재되어 있다. 그러나, 다른 방법도 또한 사용될 수 있다. 첫번째 스크리닝 방법은 고정된 표적 항원을 사용한 파지 ELISA 검정을 포함하고, 이는 비-결합 클론으로부터 특정의 결합 클론의 동정을 제공한다. 특이성은 표적 코팅된 웰 및 BSA 또는 기타 비-표적 단백질 코팅된 웰 상에서 클론의 동시 검정에 의해 측정할 수 있다. 이 검정은 고처리량 스크리닝을 위해 자동화할 수 있다.
한 가지 실시형태는, 복수의 폴리펩티드를 포함하는 복제가능한 발현 벡터의 라이브러리를 생성하고; 라이브러리를 결합에 적합한 조건하에 표적 항원 및 적어도 하나의 비표적 항원과 접촉시키고; 비결합제로부터 라이브러리 중의 폴리펩티드 결합제를 분리하고; 표적에 결합하고 비표적 항원에 결합하지 않는 결합제를 동정하고; 결합제를 표적 항원으로부터 용출시키고; 특이적 항원에 결합하는 폴리펩티드 결합제를 포함하는 복제가능한 발현 벡터를 증촉시킴으로써 항체 가변 도메인의 라이브러리로부터 특이적 표적 항원에 결합하는 항체 가변 도메인을 선택하는 방법을 포함한다.
제2 스크리닝 검정은 낮은 친화성을 고처리량 방식으로 갖는 클론으로부터 높은 친화성을 갖는 클론을 스크리닝하는 것을 제공하는 친화성 스크리닝 검정인 본원에서 실시된 발명이다. 이 검정에서, 각각의 클론은 표적 코팅된 웰에 단시간(예: 5 내지 15분) 적용하기 전에 소정 기간(예: 30 내지 60분) 동안 특정 농도의 표적 항원과 함께 1차 배양의 존재 및 부재하에 검정된다. 이어서, 결합된 파지는 항-M13 HRP 접합체를 사용하는 통상의 파지 ELISA 방법에 의해 측정한다. 하나의 웰은 표적과 함께 예비-배양하고 다른 웰은 표적 항원과 함께 예비 배양하지 않은 2개 웰의 결합 신호의 비는 친화성의 지표이다. 1차 배양을 위한 표적 농도의 선택은 목적하는 친화성 범위에 의존한다. 예를 들면, 10nM 초과의 친화성을 갖는 결합제가 요구되는 경우, 1차 배양에서 1000nM의 표적이 종종 사용된다. 결합제가 특정 라운드의 선별(선택)로부터 발견되는 경우, 이들 클론은 고친화성으로 결합제를 동정하기 위해 친화성 스크리닝 검정으로 스크리닝할 수 있다.
상기 기재된 임의의 선별/선택 방법의 조합을 스크리닝 방법과 조합할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 실시형태에서, 폴리펩티드 결합제는 고정된 표적 항원에 대한 결합에 대해 먼저 선택된다.
이어서, 고정된 표적 항원에 결합하는 폴리펩티드 결합제를 증폭시키고, 표적 항원에 대한 결합 및 비표적 항원에 대한 결합의 결여에 대해 스크리닝한다. 표적 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 결합제를 증폭시킨다. 이어서, 이들 폴리펩티드 결합제는 복합체를 형성하기 위해 소정 농도의 표지된 표적 항원과 접촉시켜 보다 높은 친화성에 대해 선택할 수 있고, 여기서 농도는 약 0.1nM 내지 약 1000nM의 표지된 표적 항원 범위이고, 복합체는 표적 항원 상의 표지와 결합하는 제제와의 접촉에 의해 단리한다. 이어서, 폴리펩티드 결합제를 표지된 표적 항원으로부터 용출시키고, 임의로 선택 라운드를 반복하고, 매회 보다 낮은 농도의 표지된 표적 항원을 사용한다. 이어서, 이러한 선택 방법을 사용하여 단리한 고친화성 폴리펩티드 결합제는, 예를 들면, 용액 상 ELISA 검정 또는 스팟 경쟁 ELISA 검정을 ㅅ용하여 고친화성에 대해 스크리닝할 수 있다.
결합제가 표적 항원에 대한 결합에 의해 동정된 후, 핵산을 추출할 수 있다. 이어서, 추출된 DNA를 직접 사용하여 이. 콜라이 숙주 세포를 형질전환시키거나, 대안적으로, 예를 들면, 적합한 프라이머로 PCR을 사용하여 코딩 서열을 증폭시키고, 통상의 서열분석 방법에 의해 서열분석할 수 있다. 결합제의 가변 도메인 DNA는 제한 효소 소화될 수 있고, 이어서 단백질 발현을 위해 벡터 내로 삽입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 라이브러리는 복수의 선별 라운드에 제공되며, 여기서 각각의 선별 라운드는 이전 라운드(들)의 표적 항원(들)과 상이한 표적 항원과 이전 라운드로부터 수득된 결합제를 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 특이적 표적 항원, 예를 들면, 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, 인슐린양 성장 인자, n-메티오닐 인간 성장 인자를 포함하는 인간 성장 인자, 파라티로이드 호르몬, 티록신, 인슐린, 프로인슐린, 아밀린, 레락신, 프로레락신, 당단백질 호르몬, 예를 들면, 모낭 자극 호르몬(FSH), 류틴화 호르몬(LH), 조혈 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 프로락틴, 췌장 락토겐, 종양 괴사 인자, 뮬러식 억제 물질, 마우스 고나도트로핀-연관 폴리펩티드, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자, 인테그린, 신경 성장 인자, 예를 들면, NGF-베타, 인슐린양 성장 인자-I 및 II, 에리트로포이에틴, 골유도 인자, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 인터류킨, 골 형태형성 단백질, LIF, SCF, FLT-3 리간드 및 키트-리간드에 대한 고친화성 결합제를 선택하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 하나 이상의 다양화된 CDR 영역을 갖는 폴리펩티드(예: 항원 특이적 항원 결합 분자)의 라이브러리를 제공한다. 이들 라이브러리는 표적 항원에 대한 고친화성 결합제를 동정하기 위해 선별(선택) 및/또는 스크리닝된다. 한 가지 측면에서, 라이브러리로부터의 폴리펩티드 결합제는 표적 항원에 대한 결합 및 친화성에 대해 선택된다. 폴리펩티드 결합제는 하나 이상의 이들 선택 전략을 사용하여 선택하고, 이어서 친화성 및/또는 특이성(표적 항원에 대해서만 결합하고 비-표적 항원에 대해서는 결합하지 않음)에 대해 스크리닝할 수 있다.
방법은 복수의 폴리펩티드를 하나 이상의 다양화된 CDR 영역으로 생성하고; 복수의 폴리펩티드를 결합에 적합한 조건하에 표적 항원과 접촉시킴으로써 표적 항원에 대한 결합제에 대해 복수의 폴리펩티드를 선별하고; 표적 항원에 대한 결합제를 결합하지 않은 것들로부터 분리하고; 결합제를 단리하고; 고친화성 결합제를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 표적 항원에 결합하지 않은 결합제의 친화성은 본원에 기재된 바와 같은 경쟁 ELISA를 사용하여 측정할 수 있다. 임의로, 폴리펩티드는 gD, 폴리-his 또는 FLAG 등의 폴리펩티드 태그에 융합될 수 있고, 이는 표적 항원에 대한 선별과 조합하여 결합제를 선별하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 양태는 VNAR의 라이브러리로부터 표적 항원에 결합하는 항원 특이적 항원 결합 분자를 선택하는 방법을 제공하고, 이는 a) 본 발명의 복수의 폴리펩티드를 포함하는 복제가능한 발현 벡터의 라이브러리를 생성하고; b) 라이브러리를 결합에 적합한 조건하에 고정된 표적 항원과 접촉시켜 라이브러리로부터 표적 항원에 대한 폴리펩티드 결합제를 단리하고; c) 비결합제로부터 라이브러리 중의 폴리펩티드 결합제를 분리하고 결합제를 표적 항원으로부터 용출시키고; d) 폴리펩티드 결합제를 갖는 복제가능한 발현 벡터를 증폭시키고, e) 임의로 단계 a 내지 d를 적어도 2회 반복하는 것을 포함한다.
상기 방법은 f) 0.1nM 내지 1000nM 범위의 표지된 표적 항원의 농도로 폴리펩티드 결합제를 포함하는 증폭된 복제가능한 발현 벡터를 결합에 적합한 조건하에 배양하여 혼합물을 형성하고; g) 혼합물을 표적 항원 상의 표지에 결합하는 고정된 제제와 접촉시키고; h) 표지된 표적 항원에 결합된 폴리펩티드 결합제를 분리하고 표지된 표적 항원으로부터 폴리펩티드 결합제를 용출시키고; i) 폴리펩티드 결합제를 포함하는 복제가능한 발현 벡터를 증폭시키고; j) 임의로, 매회 보다 낮은 농도의 표지된 표적 항원을 사용하여 단계 f) 내지 i)를 적어도 2회 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 상기 방법은 과량의 비표지된 표적 항원을 혼합물에 첨가하고, 표지된 표적 항원으로부터 저친화성 결합제를 용출시키기에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 양태는 복제가능한 발현 벡터의 라이브러리로부터 표적 항원에 대한 고친화성 결합제를 단리 또는 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 본 발명의 복수의 폴리펩티드를 포함하는 복제가능한 발현 벡터의 라이브러리를 생성하고; b) 라이브러리를 적어도 약 0.1nM 내지 1000nM의 농도로 표적 항원과 접촉시켜 표적 항원에 대한 폴리펩티드 결합제를 단리하고; c) 표적 항원으로부터 폴리펩티드 결합제를 분리하고 폴리펩티드 결합제를 포함하는 복제가능한 발현 벡터를 증폭시키고; d) 임의로, 매회 보다 낮은 농도의 표적 항원으로 단계 a 내지 c를 적어도 2회 반복하여, 최저 농도의 표적 항원에 결합하는 폴리펩티드 결합제를 단리하고; e) 폴리펩티드 결합제를 표적 항원의 몇몇 상이한 희석물과 함께 배양하여 고친화성을 위해 최저 농도의 표적 항원에 결합하는 폴리펩티드 결합제를 선택하고 폴리펩티드 결합제의 IC50을 측정하고; f) 약 0.1nM 내지 200nM의 표적 항원에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드 결합제를 동정하는 것을 포함한다.
또 다른 양태는 본 발명의 복수의 폴리펩티드를 포함하는 복제가능한 발현 벡터의 라이브러리로부터 폴리펩티드 결합제를 선택하는 검정을 제공하고, 상기 검정은 a) 라이브러리를 결합에 적합한 조건하에 0.1nM 내지 1000nM의 농도 범위로 소정 농도의 표지된 표적 항원과 접촉시켜 폴리펩티드 결합제와 표지된 표적 항원의 복합체를 형성하고; b) 복합체를 단리하고 표지된 표적 항원으로부터 폴리펩티드 결합제를 분리하고; c) 폴리펩티드 결합제를 포함하는 복제가능한 발현 벡터를 증폭시키고; d) 임의로, 매회 보다 저농도의 표적 항원을 사용하여 단계 a 내지 c를 적어도 2회 반복하는 것을 포함한다.
임의로, 상기 방법은 과량의 비표지된 표적 항원을 폴리펩티드 결합제와 표적 항원의 복합체에 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 방법의 단계는 2회 반복하고, 1차 선택 라운드에서 표적의 농도는 약 100nM 내지 250nM이고, 2차 선택 라운드에서는 약 25nM 내지 100nM이고, 3차 선택 라운드에서는 약 0.1nM 내지 25nM이다.
본 발명은 또한 본 발명의 복수의 폴리펩티드를 포함하는 복제가능한 발현 벡터의 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 a) 라이브러리의 샘플을 표적 항원에 대한 폴리펩티드의 결합에 적합한 조건하에 소정 농도의 표적 항원과 함께 먼저 배양하고; b) 라이브러리의 제2 샘플을 표적 항원 부재하에 배양하고; c) 각각의 제1 및 제2 샘플을 고정된 표적 항원에 대한 폴리펩티드의 결합에 적합한 조건하에 고정된 표적 항원과 접촉시키고; d) 각각의 샘플에 대해 고정된 표적 항원에 결합된 폴리펩티드의 양을 검출하고; e) 제2 샘플로부터 결합된 폴리펩티드의 양에 대해 제1 샘플로부터 결합된 폴리펩티드의 양의 비를 계산함으로써 표적 항원에 대한 폴리펩티드의 친화성을 측정하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 생성된 라이브러리는 또한 특이적 표적에 대한 결합 및 비표적 항원에 대한 결합의 결여에 대해 스크리닝할 수 있다. 한 가지 측면에서, 또 다른 실시형태는 VNAR의 라이브러리로부터 특이적 표적 항원에 결합하는 항체 가변 도메인에 대해 스크리닝하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 본 발명의 복수의 폴리펩티드를 포함하는 복제가능한 발현 벡터의 라이브러리를 생성하고; b) 라이브러리를 결합에 적합한 조건하에 표적 항원 및 적어도 하나의 비표적 항원과 접촉시키고; c) 비결합제로부터 라이브러리 중의 폴리펩티드 결합제를 분리하고; d) 표적 항원에 결합하고 비표적 항원에 결합하지 않는 결합제를 동정하고; e) 표적 항원으로부터 결합제를 용출시키고; f) 특이적 항원에 결합하는 폴리펩티드 결합제를 포함하는 복제가능한 발현 벡터를 증폭시키는 것을 포함한다.
상기 기재된 임의의 선별/선택 방법의 조합은 스크리닝 방법과 조합될 수 있다. 예를 들면, 한 가지 실시형태에서, 폴리펩티드 결합제는 고정된 표적 항원에 대해 결합에 대해 먼저 선택된다.
이어서, 고정된 표적 항원에 결합하는 폴리펩티드 결합제는 증폭시키고, 표적 항원에 대한 결합 및 비표적 항원에 대한 결합의 결여에 대해 스크리닝할 수 있다. 표적 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 결합제를 증폭시킨다. 이어서, 이들 폴리펩티드 결합제는 소정 농도의 표지된 표적 항원과 접촉시켜 복합체를 형성함으로써 보다 고친화성에 대해 선택하고, 여기서 표지된 표적 항원의 농도 범위는 약 0.1nM 내지 약 1000nM이고, 복합체는 표적 항원 상의 표지에 결합하는 제제와의 접촉에 의해 단리된다. 이어서, 폴리펩티드 결합제를 표지된 표적 항원으로부터 용출시키고, 임의로 선택 라운드를 반복하고, 매회 보다 낮은 농도의 표지된 표적 항원이 사용된다. 이어서, 이러한 선택 방법을 사용하여 단리된 고친화성 폴리펩티드 결합제는, 예를 들면, 용액 상 ELISA 검정 또는 스팟 경쟁 ELISA 검정을 사용하여 고친화성에 대해 스크리닝할 수 있다.
약제학적 조성물 및 용도
본 발명에 따르면, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 상기 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
약제학적 조성물은 치료학적 단백질 또는 이의 단편에 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 또한 포함할 수 있다. 치료학적 단백질은 호르몬, 성장 인자(예: TGFβ, 상피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 신경 성장 인자(NGF), 콜로니 자극 인자(CSF), 간세포 성장 인자, 인슐린-양 성장 인자, 태반 성장 인자); 분화 인자; 혈액 응고 인자(예: 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 폰 빌레브란트(Von Willebrand) 인자 또는 단백질 C) 또는 혈액 응고 캐스케이드로부터의 또 다른 단백질(예: 항트롬빈); 사이토킨, 예를 들면, 인터류킨(예: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 또는 IL-33) 또는 인터페론(예: IFN-α, IFN-β 및 IFN-η), 종양 괴사 인자(TNF), IFN-η 유도 인자(IGIF), 골 형성 단백질(BMP, 예를 들면, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP10, BMP-11, BMP-12, BMP-13); 인터류킨 수용체 길항제(예: IL-1ra, IL-1RII); 케모킨(예: MIP(마크로파지 염증 단백질), 예를 들면, MIP1α 및 MIP1β; MCPs(단구 주화성 단백질), 예를 들면, MCP1, 2 또는 3; RANTES(활성화시에 조절됨, 발현 및 분비된 정상 T-세포)); 영양 인자; 사이토킨 억제제; 사이토킨 수용체; 효소, 예를 들면, 유리-라디칼 포집 효소, 예를 들면, 수퍼옥사이드 디스무타제 또는 카탈라제 또는 프로-약물 전환 효소(예: 안지오텐신 전환 효소, 데아미나제, 데하이드로게나제, 리덕타제, 키나제 및 포스파타제); 펩티드 모방체; 프로테아제 억제제; 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(TIMP, 예를 들면, TIMP1, TIMP2, TIMP3 또는 TIMP4) 또는 세르핀(세린 프로테아제의 억제제)일 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 융합 단백질에서 치료학적 단백질은 항체, 또는 Fab, Fc, F(ab')2(화학적으로 연결된 F(ab')2 쇄를 포함), Fab', scFc(이의 다량체 형태, 예를 들면, di-scFv 또는 트리-scFv 포함), sdAb 또는 BiTE(이중 특이적 T-세포 인게이저)를 포함하는 이의 조작된 단편일 수 있다. 항체 단편은 또한 가변 도메인 및 이의 단편, 또한 기타 VNAR 유형 단편(IgNAR 분자)를 포함한다. 본 발명의 항원 특이적 결합 분자는 단량체 또는 이량체 또는 삼량체 또는 다량체일 수 있고, 동일한 표적 상의 동일하거나 상이한 표적 및/또는 동일한 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 동종성 또는 이종성일 수 있다. 달리 말하면, 항원 특이적 결합 분자는 일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 본 발명의 이종성 항원 특이적 결합 분자에 대한 참조는 동일한 표적 상의 상이한 에피토프에 대한 결합을 지칭한다. 조작된 단편은 또한 본 발명의 항원 특이적 결합 분자 및 항체의 Fc 분자의 Fc-융합체를 포함한다.
약제학적 조성물은 치료학적 단백질에 융합된 본 발명의 다수의 항원 특이적 항원 결합 분자, 예를 들면, 이량체, 삼량체, 또는 보다 고차의 다량체, 즉 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8량체로 구성될 수 있다.
치료학적 단백질에 대한 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 융합은 단백질 상의 임의의 편리한 부위에서 이루어질 수 있고, N-, C- 및/또는 N-/C-말단 융합(들)일 수 있다. 본 발명의 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 융합은 치료학적 단백질의 N- 및 C-말단 둘 다에 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 적합한 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보조제 또는 완충액을 포함할 수 있다. 조성물은 추가의 약제학적 활성제를 포함할 수 있다. 이러한 담체는, 이로써 한정되지 않지만, 식염수, 완충된 식염수, 덱스트로즈, 리포좀, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
이러한 조성물은 지시된 바와 같은 추가의 약제학적 활성제를 포함할 수 있다. 추가의 제제는 치료학적 화합물, 예를 들면, 항-염증 약물, 세포독성제, 세포증식 억제제 또는 항생물질일 수 있다. 이러한 추가의 제제는 이를 필요로 하는 환자에게 투여하기에 적합한 형태로 존재할 수 있고, 이러한 투여는 동시, 별개 또는 순차로 이루어질 수 있다. 성분들은 필요에 따라 지침을 포함할 수 있는 키트의 형태로 제조할 수 있다.
약제학적 조성물은, 예를 들면, 그 중에서도 경구, 국소, 정맥내, 근육내, 비내 또는 피내 경로에 의한 투여를 포함하는 환자의 질환을 치료하기에 효과적인 임의의 유효한 편리한 방식으로 투여할 수 있다. 치료에서 또는 예방적으로, 활성제는 주사가능한 조성물, 예를 들면, 멸균 수성 분산액, 바람직하게는 등장성 분산액으로서 개체에게 투여할 수 있다.
포유동물 및 특히 인간에게 투여하기 위해, 활성제의 1일 용량은 0.01mg/체중 kg, 전형적으로 대략 1mg/kg, 2mg/kg 또는 최대 4mg/kg일 것이다. 임의의 사례에서 의사는 개체의 연령, 체중, 성별 및 반응을 포함하는 요인에 의존하는 개체에 가장 적합한 실제 용량을 결정할 것이다. 물론, 보다 높거나 낮은 용량이 유리한 경우가 있을 수 있고, 이는 본 발명의 범위 내이다.
본 발명에 따르면, 의약에서 사용하기 위한 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 따라서, 본 발명의 이러한 측면은 이를 필요로 하는 환자에서 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 이러한 항원 특이적 항원 결합 분자의 사용으로 연장한다. 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자는 또한 본 발명의 약제학적 조성물과 관련하여 상기 정의된 이러한 특이적 결합 분자를 포함하는 융합 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 용도는 또한 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 본원에 정의된 바와 같은 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 치료를 필요로 하는 환자에서 질환의 치료 방법을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 인간 또는 비-인간 동물에게 유익할 수 있는 임의의 섭생을 포함한다. 수의학에서 "비-인간 동물"의 치료는 말 및 반려 동물(예: 고양이 및 개)을 포함하는 가축 동물 및 양, 염소, 돼지, 소 및 말 계열의 구성원을 포함하는 농장/농업 동물의 치료로 연장한다. 치료는 임의의 기존의 상태 또는 질환과 고나련하여 치료학적 치료일 수 있거나, 예방학적일 수 있다(예방적 치료). 치료는 유전성 또는 후천성 질환의 것일 수 있다. 치료는 급성 또는 만성 상태의 것일 수 있다. 치료는 염증 및/또는 암과 연관된 상태/질환의 것일 수 있다. 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자는, 이로써 한정되지 않지만, 관절염, 피부 경화증, 신장 질환, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 아테롬성 동맥경화증 또는 임의의 염증성 질환을 포함하는 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자는 또한 환자에서 질환 상태의 성질을 조사하기 위해 사용될 수 있다. 항원 특이적 항원 결합 분자는 X-선, 감마-선 또는 PET 스캐닝 등의 화상 기술을 사용하여 대상체의 신체에서 질환 부위의 화상을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 적합하게 검출가능하게 표지된 항원 특이적 항원 결합 분자를 대상체에게 투여하고 대상체의 신체를 후속적으로 스캐닝하는 것을 포함하여 대상체에서 질환의 부위를 화상화(imaging)하는 방법으로 연장한다. 대안적으로, 대상체에게 상기 분자의 투여는 분자의 투여 후에 대상체로부터 샘플을 분석함으로써 시험 결과를 제공할 수 있다.
대안적으로, 항원 특이적 항원 결합 분자는 시험관 샘플 또는 환자의 신체에서 표적 분석물의 존재를 검정하기 위해 사용될 수 있다. 샘플은 세포, 조직, 혈액, 혈장, 타액, 눈물, 정액, 뇌척수액(CSF) 및/또는 밀크 등의 신체로부터의 임의의 생물학적 샘플 물질일 수 있다. 이러한 방법은 목적하는 샘플에 적합하게 표지된 항원 특이적 항원 결합 분자의 첨가를 포함할 수 있다. 이어서, 표적 분석물에 대한 표지된 항원 특이적 항원 결합 분자의 결합은 표준 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 및/또는 방사선-면역검정(RIA) 검정에 따라 임의의 적합한 수단, 예를 들면, 형광, 방사활성 등에 의해 검출할 수 있다.
이러한 양태는 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 대상체에게 투여하거나 샘플에 상기 항원 특이적 항원 결합 분자를 첨가하는 것을 포함하여 대상체에서 질환 또는 의학적 상태의 진단 방법을 포함할 수 있다.
항원 특이적 항원 결합 분자는 목적하는 분자의 면역친화성 정제에서 추가의 용도를 발견할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자는, 목적하는 분자가 항원 특이적 항원 결합 분자에 방출가능한 방식으로 결합하도록, 목적하는 분자를 함유하는 샘플이 통과하거나 도입되는 기질에 결합할 수 있다. 이러한 면역친화성 정제 방법은, 예를 들면, 치료학적 물질 등과 같이 충분하게 순수한 형태로 제조하기가 어려울 수 있는 생물학적 공급원 또는 화학적 반응물로부터 물질의 생물처리에서 용도를 찾을 수 있다.
항원 특이적 항원 결합 분자가 결합할 수 있는 기질은 비드 또는 분말, 플레이트(예: 복수-웰 플레이트), 마이크유체 시스템의 형태로 중합체를 포함하는 컬럼일 수 있다. 이러한 기질은, 임의로 칩 형태로, 임의의 적합한 불활성 물질, 예를 들면, 규소, 유리 또는 플라스틱 물질로 구성될 수 있다. 일부 구성에서, 이러한 기질 상의 특정한 동일하거나 상이한 항원의 복수의 항원 특이적 항원 결합 분자를 위치시키는 것이 편리할 수 있다. 항원 특이적 항원 결합 분자에 대한 물질의 결합 후, 상기 물질을 세척하여 결합하지 않은 물질을 제거한 다음, 정제된 물질을 적합한 수단으로 용출시킬 수 있다.
본원에서, 참조는 다음 도면의 번호로 수행된다:
도 1은 정규(○) 및 비정규(●) 시스테인 잔기, 디설파이드 결합(연결 라인), 보존된 트립토판(W) 및 초-가변 (CDR/HV) 영역의 위치를 나타내는 재배열된 IgNAR 유전자의 구조를 나타낸다.
도 2는 인간 VH 도메인과 비교하여 유형 I 및 유형 II 항-리소자임 IgNAR의 골격 구조를 나타낸다.
도 3은 스쿠알루스 아칸티아스(Squalus acanthias)로부터 유래하는 주형 VNAR 도메인 2V 및 5V의 결정 구조를 나타낸다.
도 4는 2V 및 5V 주형 프레임워크 둘 다를 사용하여 하이브리드 서열로부터 생성된 라이브러리 설계 및 프레임워크 다양성을 나타낸다. SOE PCR을 사용하여 2V 및 5V 프레임워크 융합 기반 라이브러리에 대한 설계. 프라이머 위치는 화살표로 제시되어 있다.
도 5는 상이한 표적에 대한 히트의 예시적 친화성을 나타낸다. ELSS1은 상이한 부류의 표적(hDLL4, HSA, hRAGE)의 범위에 대해 스크리닝했다. 양성 히트를 정제하고, 농도를 측정하고, 결합의 반응속도를 계산하기 위해 BIAcore T-2000 상에서 CM5-칩 고정된 표적 위를 통과시켰다.
도 6은 ELSS1 라이브러리 히트의 선택성을 예시하는 데이터를 나타낸다. 도 6a는 mICOSL에 대해 단리된 히트의 선택성을 나타낸다. ELSS1은 마우스 ICOSL에 대해 스크리닝하고, 양성 히트는 FACS 기반 검정을 사용하여 부모와 비교하여 세포 표면 발현된 표적에 대한 결합에 대해 시험했다. 도 6b는 DLL4에 대해 단리된 히트의 선택성을 나타낸다. ELSS1은 인간 및 마우스 DLL4에 대해 스크리닝하고, 양성 히트는 FACS 기반 검정에 의해 세포 표면 표적에 대한 결합의 선택성에 대해 평가했다. 수가 보다 클수록, 표에 지시된 세포 유형에 대한 결합은 보다 크다.
도 7a 내지 7d는 상이한 표적에 대한 ELSS1 라이브러리 히트의 시험관내 유효성을 예시하는 데이터를 나타낸다. 도 7a는 세포 기반 중화 검정에서 mICOSL에 대해 단리된 히트의 선택성을 나타낸다. mICOSL에 대한 ELSS1 라이브러리로부터 양성 VNAR 히트는 동족 수용체(ICOS)에 대한 결합으로부터 리간드(ICOSL)를 억제하는 이들의 능력에 대해 평가했다. VNAR 히트, C4, CC3, A1, AG12 및 AG2는 음성 VNAR 대조군 2V와 비교했다. 모든 클론을 발현시키고, 정제하고, 수용체에 대한 리간드 결합을 억제하는 유효성을 나타내기 위해 표지된 리간드의 존재하에 적정했다. 측정된 모든 IC50은 한자리 나노몰이었다.
도 7b는 뮤린 D10 검정(T-세포 증식 검정)에서 T 세포의 증식을 억제하는 단리된 및 정제된 항-mICOSL VNAR의 능력을 나타낸다. 도 7c는 세포 표면 Notch1 수용체(중화 검정)에 대한 DLL4의 결합을 억제하는 DLSS1로부터 단리된 항-hDLL4 VNAR 도메인의 능력을 나타낸다. 데이터는 중화 퍼센트로서 계산되고, 보다 큰 값은 리간드 결합 수용체의 보다 큰 억제를 나타낸다. 도 7d는 세포 표면 발현된 DLL4에 결합하고 이에 의해 내재화되는 항-DLL4 VNAR의 능력을 나타낸다. 항-DLL4 VNAR 도메인은 인간 Fc와 융합되고, 내재화는 세포 생존율을 통해 측정하고, 생존율이 보다 낮으면 내재화의 유효성은 보다 크다. 클론 72, 10 및 78은 VNAR 히트이다. 2V는 음성 VNAR 대조군이고, YW는 mAb 양성 대조군이다.
도 8은 인간 류마티스성 관절염(RA)의 마우스 모델에서 항-mICOSL VNAR의 생체내 유효성을 나타낸다. 좌측 그래프는 음성 대조군 2V와 비교하여 RA의 콜라겐 유도된 마우스 모델에서 염증의 전체 임상 스코어 또는 수준을 감소시키는 모든 5개 리드 VNAR(A1, C4, CC3, AG2 및 AG12)의 능력을 나타낸다. 클론 A1 및 CC3은 mICOSL(좌측 그래프)에 대해 야기된 리드 mAb와 비교하여 염증을 현저히 감소시켰다. 모든 항-mICOSL VNAR 도메인 및 이소형 대조군 VNAR(2V)는 인간 Fc 융합 단백질로서 재-포맷시켰다.
도 9는 클론 2V 및 5V(서열번호 9, 10, 11 및 12)의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 10a은 라이브러리의 제조에서 프라이머 서열 사용을 나타낸다.
도 10b는 CDR1에 대한 올리고뉴클레오티드 유래 다양성을 나타낸다.
도 11은 2V 및 5V 서열에 대한 라이브러리 프레임워크 조합을 나타낸다. 프레임워크: 67/89=75.3%. 최대 다양성(CDR1 및 CDR3): 67/111=60%.
도 12는 항-mICOSL 항원 특이적 항원 결합 분자(VNAR)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 13은 항-mDLL4 항원 특이적 항원 결합 분자(VNAR)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 14는 항-HSA 항원 특이적 항원 결합 분자(VNAR)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 15a는 는 항-hRAGE 항원 특이적 항원 결합 분자(VNAR)의 아미노산 서열을 나타내고, 도 15b는 항-TNF-알파 항원 특이적 결합 분자(VNAR)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 16은 ELSS1의 스크리닝에 사용된 3개 표적에 대한 리드 클론의 정렬을 나타낸다. 임의의 비음영 아미노산은 양 프레임워크 사이에 보존되어 라이브러리 전체에 걸쳐 표준화되어 있다. 강조된 영역은 선택된 클론이 5V 및/또는 2V 서열로부터 기여를 갖는지에 상응하게 도입된 차이가 있는 경우이다.
도 17은 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자에서 CDR1 및 CDR3 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 18은 돔발 상어 유형 IIIb VNAR 5V, 돔발 상어 유형 IIb VNAR, 2V 및 수염 상어 유형 II VNAR E9를 사용한 ELSS2의 라이브러리 설계를 나타낸다. 2V 및 5V는 ELSS1에 사용된 것과 동일한 VNAR 도메인이고, VNAR 도메인 E9는 면역화된 수염 상어 라이브러리로부터 단리되었다.
도 19는 비오티닐화 ICOSL에 대한 선택 후에 ELSS2로부터 단리된 파지 양성 히트를 나타낸다.
도 20은 ELSS2로부터 단리된 ICOSL 양성 VNAR 클론의 서열을 나타낸다. 양성 히트는 설명된 바와 같이 모두 종간 및 이소형간 프레임워크 융합체이다.
본 발명은 또한 단지 예시 목적으로 제공되고 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 다음 실시예를 참조하여 추가로 기재된다.
사용된 약어: VNAR, 가변 신규 항원 수용체; scFv, 단일쇄 항체 단편; FW, 프레임워크; HV, 초가변 루프; CDR, 상보성 결정 영역; SOE-PCR, 스플라이스-바이-오버랩 연장 폴리머라제 연쇄 반응.
실시예 1: 스쿠알루스 아칸티아스( Squalus acanthias )(돔발 상어)로부터 VNAR의 서열 데이터베이스 작제
RNA는 하기 상세된 다중 분자 생물학 기술을 사용하여 돔발 상어 조직으로부터 단리했다.
조직으로부터 RNA 단리: 전체 RNA는 인비트로겐 TRIzol 시약(Sigma Aldrich, Cat 15596)을 사용하여 상어 조직으로부터 단리했다. 대략 50 내지 100mg의 조직은 1ml의 TRIzol 시약 중의 표준 파원 균질화기로 균질화시켰다. 균질화된 샘플을 실온에서 5분 동안 배양하여 핵단백질 복합체의 완전한 해리를 가능하게 하고, 이어서 0.2ml의 클로로포름을 사용된 TRIzol ml당 첨가했다. 튜브를 15초 동안 수동으로 격렬하게 진탕시킨 다음, 4℃에서 15분 동안 12000×g으로 원심분리했다. 원심분리 후, RNA를 함유하는 수성 상을 새로운 튜브로 옮기고, 초기 단계에서 TRIzol ml당 1ml의 75% 에탄올 또는 대안적으로 0.5ml 이소프로판올을 첨가하고, 샘플을 실온에서 10분 동안 배양했다. 이어서, 샘플을 4℃에서 5분 동안 7500×g으로 다시 원심분리했다. 상청액의 제거 후, RNA 펠렛을 1ml의 70%(v/v) RNase-비함유 에탄올에서 1회 세척하고, 공기 건조시키고, 적절한 용적의 RNase-비함유 물(수득되는 RNA 펠렛의 크기에 따라 20 내지 300㎕)에서 재현탁시켰다. RNA 샘플은 분광광도계에 의해 정량화했다.
대안적으로, RNA는 다음과 같이 조직으로부터 단리했다. 조직을 수거하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 RNAlater 완충제(QIAGEN)에 즉시 현탁시켰다. 전체 RNA는 제조업자의 매뉴얼에 따라 조직을 위해 RNeasy Midi 키트(QIAGEN)을 사용하여 단리했다(컬럼 상에서 DNaseI 소화를 포함하여 UltraTurax(Odds X1030D, Ing. Buro CAT, Zipperer GmBH) 사용).
전혈로부터 RNA 단리: RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 암비온(Cat#AM1928)으로부터 리보푸어-블러드 공정(RiboPure-Blood Procedure)을 사용하여 전혈 샘플(응고를 방지하기 위해 나트륨 시트레이트(NaCitrate)로 처리하고 RNAlater 완충제에 저장함)로부터 단리했다.
축중 PCR: 파지 디스플레이 라이브러리를 구성하기 전에, 모든 천연 IgNAR 전사체를 나타내는 레퍼토리를 증폭시키기 위해 프라이머의 설계 목적으로 포괄적 cDNA 서열 데이터베이스를 수집하는 것이 필수적이다. 이를 달성하기 위해 데이터베이스는 3' RACE 프라이머를 설계하는 부분 서열을 수득하기 위해 축중 PCR로 개시하는 계단식 방식으로 생성했다. IgNAR 코딩 서열을 단리하기 위해, 축중 PCR은 수염 상어 IgNAR 서열에 기반한 프라이머를 사용하여 수행했다(예를 들면, GenBank 수탁 번호: U18701). 이들로부터, 불변 도메인을 단리하고, 서열분석하여 5' RACE 프라이머의 설계를 제공함으로써 리더로부터 가변 영역을 통해 불변 도메인가지 전장 IgNAR 서열을 완성시켰다.
추출된 RNA는 수퍼스크립트(SuperScript) III 역전사효소(Invitrogen Cat 18080-044) 또는 M-MLV 역전사효소(Promega M170B) 및 프로토콜을 사용하여 역전사시켜 cDNA를 생성했다. 가시 조직으로부터의 cDNA 합성은 불변 도메인 1 프라이머로 생성했다:
C1-for1: 5' ATA GTA TCC GCT GAT TAG ACA 3', 및
Nar-C1-ForM1: 5'GAGTGGAGGAGACTGACTATTG 3'.
상기 기재된 축중 PCR 기술에 의해 수득된 IgNAR 서열을 분석하고, 다음과 같이 IgNAR 전사체의 3' 말단(3' RACE)의 증폭에 사용하기 위해 다중 프라이머를 설계했다. 전체 RNA는 실시예 2에 기재된 바와 같이 단리하고, 3' RACE는 인비트로겐의 진레이서(GeneRacer) 키트(Cat L1500-01) 또는 인비트로겐의 5'RACE 시스템(Cat 18374-058)을 사용하여 수행했다. 제1 가닥 cDNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 인비트로겐의 진레이서 올리고 dT 프라이머 또는 인비트로겐의 5' RACE 시스템 3' RACE 어댑터 프라이머(#836: 5'- GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC (T)17 -3') 및 수퍼스크립트 II 또는 III을 사용하여 전체 RNA로부터 합성했지만, 50℃ 대신에 42℃에서 배양했다. 제1 가닥 cDNA는 표 1에 하기 수록된 권장된 프로토콜 및 프라이머에 따라 클론테크(Clontech) 어드밴티지 cDNA PCR 폴리머라제 혼합물 또는 BIOTAQ DNA 폴리머라제(Bioline cat BIO-21060)를 사용하여 PCR 증폭을 위해 사용했다. PCR 생성물은 표준 아가로즈 겔 상에서 분석하고, 정확한 크기 밴드를 겔 정제하고, 프로메가(Promega) pGEM Teasy 벡터(Cat A1360) 내로 클로닝시키거나, 클로닝 키트의 프로토콜에 따라 TA 클로닝시켰다. PCR 생성물을 함유하는 클론을 서열분석했다.
돔발 상어 3' RACE 프라이머
spiny_3R_Fm1_f34 CGGCAACGAAAGAGACAGGAG
spiny_3R_Fm1_f47 GACAGGAGAATCCCTGACCATCA
spiny_3R_Fm1_f54 GAATCCCTGACCATCAATTGCGTCC
spiny_3R_Fm2_f113 CTGGTACCGGAAAAATCCGGG
spiny_3R_Fm3_f202 CATTTTCTCTGCGAATCAAGGACC
spiny_3R_Fm3_r226 GGTCCTTGATTCGCAGAGAAAATG
spiny_3R_Fm3_r250 TACGTGGCACTGTCTGCAACTG
Tm 특이적 프라이머를 사용한 cDNA를 코딩하는 NAR의 단리: RNA는 상기 기재된 바와 같이 돔발 상어 조직으로부터 추출하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clonetech)를 사용하여 역전사시켰다. 제1 라운드 PCR은 생성된 3' RACE cDNA, 공급된 범용 프라이머 및 가시 IgNAR C3 특이적 프라이머 C3_for1(5'-GCC TCC TGC CTC CAT CGC CAG-3')를 사용하여 키트 지침에 따라 다시 수행했다. 수득되는 PCR 생성물을 pGEM-Teasy 벡터(Promega) 내로 클로닝시키고, 이 벡터 중의 T7 및 Sp6 프라이밍 부위를 사용하여 서열분석했다. 서열분석된 12개 중의 1개의 클론은 막관통 테일을 코딩했고, 나머지는 이전에 클로닝된 분비체 형태로 존재한다. 이 클론은 또 다른 Tm-특이적 프라이머, NAR_Tm rev1(5'-GAG AAT AAA CAG GAT CAC GAG AGC G-3')의 설계를 가능하게 했고, 이는 비장 cDNA로부터 전장 NAR V-C3-Tm 및 NAR V-C5-Tm 버젼을 증폭시키기 위해 NAR V 영역 특이적 프라이머NAR_Fr1 for1(5' GGA GAA TCC CTG ACC ATC AAC TGC G-3')와 함께 사용되었다.
5' RACE를 사용하여 cDNA를 코딩하는 NAR의 단리: 5' 비번역된 영역, 스플라이스 리더, 가변 도메인 및 부분 불변 도메인을 코딩하는 NAR cDNA 클론은 다음과 같이 수득했다. 각각의 종에 대해 불변 도메인(상기 기재된 바와 같이 3' RACE에 의해 단리됨)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 보존된 영역을 동정하기 위해 분석했다. 프라이머는 높은 동일성의 이들 영역에서 설계했고, 다음과 같은 NAR 코딩 서열의 5' RACE 증폭에 사용했다:
cDNA 말단의 증폭은 인비트로겐의 5' RACE 시스템(Invitrogen, Cat 18374-41; 18374-058) 및 표준 프로토콜을 사용하여 달성했다. 전체 RNA는 조직으로부터 추출하고, 제1 가닥 cDNA는 권장된 프로토콜에 따라 유전자 특이적 프라이머 및 수퍼스크립트 II/III 및 dC-테일을 사용하여 합성했다. dC-테일 cDNA는 유전자 특이적 프라이머(표 2에 수록됨)과 조합하여 클론테크 어드밴티지 cDNA PCR 폴리머라제 혼합물 또는 BIOTAQ DNA 폴리머라제(Bioline cat BIO-21060)를 사용하여 PCR 증폭에 사용했다. PCR 증폭은 적절한 제조업자의 프로토콜에 따라 수행했다. 표준 아가로즈 겔 전기영동에 의해 판단한 바와 같이, 정확한 크기의 증폭된 생성물을 겔 정제하고, 인비트로겐의 TA 클로닝 키트의 프로토콜에 따라 TA 클로닝하거나, 대안적으로 제조업자의 표준 프로토콜을 사용하여 프로메가의 pGEM Teasy 벡터(Promega A1360) 내로 클로닝했다. PCR 생성물을 함유하는 클론은 서열분석을 위해 전송했다.
돔발 상어 5'RACE 프라이머
shark_C1_f395 CACCAATCATCAGTCTCCTCTAC
shark_C1_f411 CTACTCTGCAACTGACGAACTG
shark_C1_r505 CTCACTCCAATGCTTTCTGGCTGG
shark_C1_r549 GTGGTAAAGCCAGACTGTATGG
shark_C1_r594 GGTGGAGCTAAAGTCTCCGTTCG
shark_C1_r655 CACTTGGCAGCTGTACATTGAAC
shark_C1_r697 CTAATTTCTTTCCGTTGGTTACTG
spiny_c_r869 CTTCCACGCTGCTGGTCAAG
spiny_c_r1011 GAATCTCCTCTGGCGATGGAG
spiny_c_r1050 CTCTTATCAAACAGGTGAGAGTAG
spiny_c_f1224 CACATCCACCTTCACAATCCAC
spiny_c_r1246 GTGGATTGTGAAGGTGGATGTG
spiny_c_r1560 GGCAATGCACTGTCTTCTAC
spiny_c_r1745 CAAAAGGGTGTCATTGGCCATCC
spiny_c_r1867 CCCACTAAACAGGAGTAAGTGG
PCR을 사용하여 cDNA를 코딩하는 NAR의 단리: 스플라이스 리더 영역, 가변 도메인 및 부분 불변 도메인 1을 코딩하는 NAR cDNA 클론은 다음과 같이 PCR 증폭에 의해 수득했다: 상기 기재된 바와 같이 5' RACE에 의해 수득된 서열은 스플라이스 리더 서열을 동정하기 위해 분석했다. 뉴클레오티드 서열을 정렬시키고, 프라이머는 높은 뉴클레오티드 동일성의 영역에서 설계했다(전방 프라이머로서 지정됨). 유사하게는, 3' RACE에 의해 수득된 서열은 프라이머(역방향 프라이머로서 지정됨)을 설계하기 위해 불변 도메인 중의 높은 뉴클레오티드 동일성의 영역을 동정하기 위해 분석했다. NAR cDNA 클론을 수득하기 위한 PCR 증폭은 다음과 같이 이들 전방 및 역방 프라이머를 사용하여 수행했다.
RNA는 상기 기재된 바와 같이 다중 돔발 상어 조직으로부터 추출했다. 제1 가닥 cDNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 프로메가 또는 인비트로겐의 올리고 dT 프라이머 및 수파스크립트 II/III을 사용하여 전체 RNA로부터 합성했다. 전방 및 역방 프라이머(표 3)은 이로부터 cDNA를 사용하여 NAR 특이적 클론을 PCR 증폭시키기 위해 사용했다. 표준 아가로즈 겔 전기영동에 의해 판단한 바와 같이, 정확한 크기의 증폭된 생성물을 겔 정제하고, 인비트로겐의 TA 클로닝 키트의 프로토콜에 따라 TA 클로닝하거나, 대안적으로 제조업자의 표준 프로토콜을 사용하여 프로메가의 pGEM Teasy 벡터(Promega A1360) 내로 클로닝시켰다.
가변 PCR에 사용된 돔발 상어 프라이머
전방 997-spiny_utrPAGEETM_f113 GCCTGCTGGTGAAGAAACAATGC
전방 994-spiny_sigMHIFWV_f132 ATGCATATTTTCTGGGTTTCGGTC
역방 879-shark_C1_r655 CACTTGGCAGCTGTACATTGAAC
전방 1005-spiny_utrPAGEETM_f113a CCCTGCTGGTGAAGAAACAATG
전방 1006-spiny_utrPAGEETM_f113b CTTTGCTGGTGAAGAAACAATG
역방 879-shark_C1_r655 CACTTGGCAGCTGTACATTGAAC
돔발 상어 IgNAR 프라이머 클러스터 분석: 생물정보 분석은 돔발 상어 IgNAR 서열을 동정하고 특성화하기 위해 수행했다. 개방 판독 프레임의 동정, 및 기재된 바와 같이 단리된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 분석은 NAR 코딩 클론의 거대 라이브러리를 작제하기 위해 사용될 수 있는 각 종에 대한 NAR-특이적 프라이머의 설계를 가능하게 했다. 수염 상어 IgNAR 단백질 서열(Genbank 수탁번호 #U18721)은 돔발 상어로부터 IgNAR 서열을 최초로 정의하기 위해 주형으로 사용했다. 후속적으로, 몇몇 씨드 가시 IgNAR 서열은 CLUSTALW 정렬 프로그램을 사용하여 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 선택했다. 이러한 다중 정렬은 HMMERBUILD 프로그램을 사용하여 가시 IgNAR에 특이적인 Hidden Markov 모델(HMM) 프로파일을 작성하기 위해 사용했다. 이어서, 이러한 HMM 프로파일은 GENEWISEDB 프로그램을 사용하여 전체 가시 cDNA 서열 데이터베이스를 탐색하기 위해 사용했다. 각각의 IgNAR cDNA 서열을 위한 개방 판독 프레임을 동정하고, 아미노산 서열로 번역했다. 이어서, 모든 IgNAR 아미노산 서열은 CLUSTALW 프로그램을 사용하여 정렬하고, IgNAR 도메인(FW1, CDR1, FW2, HV2, FW3a, HV4, FW3b, CDR3 및 FW4)을 동정하기 위해 공지된 수염 상어 IgNAR 유전자 구조와 비교했다.
실시예 2: 2V 및 5V 가시 VNAR 도메인의 서열, 발현 및 결정화
클론 2V 및 5V(서열은 도 9에 제시됨)를 파지미드 디스플레이 벡터 pWRIL-1[참조: Finlay, W.J., et al., J Mol Biol, 2009. 388(3): p. 541-58] 내로 클로닝시키고, 고도의 세균 발현을 나타냈다. 결정화 시험을 위해, 양 단백질을 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시키고, 니켈 포획, 이어서 수퍼덱스(Superdex) 200을 통해 정제했다. 요약하면, 조절된 배지는 15ml 베드 니켈 수지 상에 부하하기 전에 50mM 트리스 pH 8.5로 조정한 다음, 트리스 20mM NaCl, 20mM 이미다졸 0 내지 20mM로 연속 세척했다. 단백질은 트리스 20mM NaCl, 20 내지 150mM 이미다졸에서 구배에 의해 용출시켰다. 풀링된 단백질은 25mM MES, 25mM HEPES(pH 6.8)로 희석시키고, 수퍼덱스 200 16/20 300ml 베드 컬럼 상에 통과시켰다. 트리스 20mM, NaCl 20mM(pH 8.0)에 대해 투석한 후, 2V 및 5V의 단백질 용액을 각각 10mg/ml 및 19mg/ml로 농축시켰다. 증기-확산 방법을 사용하는 현적 실험은 2개의 상이한 조건으로부터 결정을 제공했다: 2V에 대해 20% PEG3350 및 200 mM MG SO4 및 5V에 대해 25% PEG4K, 0.1M HEPES pH 7.5.
실시예 3: ELSS1 합성 라이브러리 설계
포괄적 "천연" 돔발 상어 VNAR (AA) 서열 데이터베이스는 상기 기재된 바와 같은 PCR 증폭된 cDNA를 사용하여 제조하고, 데이터베이스는 상이한 돔발 상어 동물 및 조직 유형의 범위로부터 전장 특유의 cDNA VNAR 클론으로 구성되었다. 수집 번역된 VNAR 도메인은 CDR3 길이 분포에 추가하여 분석된 모집단에 대해 (AA) 함량, 상대적 위치 보존 및 빈도의 관점에서 검사했다. 이 분석은 합성 라이브러리 설계를 유도하기 위해 사용했다. CDR1 및 CDR3 루프에서 개시하여, 본 발명자들은 이들 루프, 인접한 프레임워크 잔기 및 루프 길이 범위 및 분포를 조사했다. 데이터베이스 내의 서열은 길이(n≥100) 풀에 따라 특유의 클론으로서 비닝(binned)했다. 11 내지 16개 아미노산 범위의 전체 CDR3 루프 길이는 이들이 13±2개 아미노산의 평균 돔발 상어 CDR3 길이로서 정의한 것에 상응하기 때문에 집중되었다. 각각의 길이 비닝된 풀에 대한 상세한 함량 분석은 CDR3에 인접하는 프레임워크 3 및 4 내에 보존된 잔기를 강조했다. 구체적으로, 본 발명자들은 CDR3 후에 이들을 최종 3개 FW3b 및 최초 3개 FW4 잔기 위치로서 정의했다. 또한, 본 발명자들은 CDR3 루프 자체 내의 N- 및 C-말단에서 특정 아미노산의 명백한 보존을 밝혀냈다. CDR3 루프에 바로 인접하는 FW3a 위치 -3, -2 및 -1은 CKA, CRA 및 보다 적은 정도로 CNA 서열 모티브에 대해 명백한 선호를 나타냈다. 추가의 다양성은 일부 클론에서 관찰되었지만, 상당히 보다 낮은 빈도로 존재했음에 유의해야 한다. 이러한 인접한 잔기는 3차원 공간에서 루프 제시에 대해 현저한 영향을 가질 수 있고 따라서 파라토프 형태에 대해 영향을 발휘할 수 있는 것이 일반적으로 이해된다. 이를 염두에 두고, 본 발명자들은 이들 잔기가 기능적 루프 제시에 중요한 것으로 상정했고, 따라서 본 발명자들이 가진 주형 도메인 모티프를 유지했다. 본 발명자들의 이중 주형 설계와 함께, 본 발명자들은 이들 특정 영역을 조절했고, 따라서 합성 라이브러리에서 CKA 또는 CRA 모티프를 나타냈다. 실제로, 이러한 접근법은 데이터베이스에 밝혀진 "천연" (AA) 서열 다양성의 76%를 나타내도록 했다. 서열 데이터베이스에서 CDR3 직후의 최초 3개 FW4 잔기는 DGA 모티브 및 보다 적은 정도로 YAG의 보다 높은 발생을 나타냈다. 또한, 본 발명자들이 사용한 이중 주형 도메인 방법은 최종 합성 라이브러리 클론 내로 이들 두 모티브의 도입을 촉진시켰고, 따라서 이들 위치에서 "천연" 다양성을 모방했다.
CDR3 루프 자체 내에서, 본 발명자들은 초기에 도피한 C-말단 CDR3 말단의 특정 잔기, 특히 최후로부터 2번째 및 최후 잔기에 대한 기존의 바이어스를 명확하게 볼 수 있다. 이러한 바이어스는, 아직 해명되어야 하는 바와 같이, 특정 결합 또는 J-유전자 세그먼트의 사용에 의해 대부분 도입될 수 있다. 이는 생물물리학 또는 기능적 이유를 위해 자연적으로 진화될 수 있다. 또한, CDR3의 길이 연장과 같은 이러한 위치에서 발견된 특히 바람직한 잔기가 변화되는 것으로 생각된다. 이의 구체적 예는 본 발명자들이 최후로부터 2번째 및 최후 C-말단 CDR3 잔기를 분석된 최단 CDR3로부터(11개 AA) 내지 최장(16개 AA)으로 개시하여 검사하는 경우이다. 여기서, 본 발명자들은 특정 WY 잔기에 대한 상호간 증가된 경향(W 42%→66% 및 Y 43%→83%)과 함께 DV 잔기 모티브에 대한 조합된 보존의 명백한 감소(D 46% → 14% 및 V 45% →14%)를 밝혀냈다. 이는 이들 특정 말단 잔기 사이에 잠재적 공분산 관계를 시사할 수 있고, 이는 따라서 연장하는 CDR3 길이와 양호하게 상관하는 것으로 생각된다.
실시예 4: ELSS1 합성 라이브러리 구성
특정의 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 사용하여 각각의 주형 영역 오프 플라스미드-함유 2V 및 5V 서열의 PCR은 제조업자의 권장사항에 따라 푸젼(Phusion) 고충실도(HF) 폴리머라제 마스터 혼합물(Finnzymes)을 사용하여 수행했다. 요약하면, 3개의 일차 PCR 생성물 세트(각각 FW1, CDR1-FW3 및 CDR3-FW3로 이루어진 단편)로부터 등몰량의 각각의 PCR 생성물을 마스터 혼합물로서 혼합했다. 이들 단편은 스플라이스-바이-오버랩 신장(SOE) PCR에 의해 후속적으로 결합시켰다. SOE-PCR 생성물은 sfil 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, 유사하게 소화된 pWRIL-1 파지미드 벡터 내로 연결시켰다. 4개의 주형 유래 변이체 서브-라이브러리는 SOE-PCR에 의해 작제하고, 풀은 이들의 작제에 사용된 CDR1-FW3 및 CDR3-FW4 단편의 기원에 기반하여 정의했다. 모든 풀에 있어서, 양 주형으로부터 유래된 동일한 양의 FW1 단편은 CDR1 및 CDR3 루프 둘 다에서 부가된 올리고뉴클레오티드-지시된 합성 다양성으로 포함되었다. 전기경쟁 이. 콜라이 TG1 세포(Lucigen)는 적절한 삽입체를 함유하는 연결된 pWRIL-1로 형질전환시켰다. 서브-라이브러리의 작제에 있어서, 본 발명자들은 각각의 본래 주형으로부터 일차 PCR 생성물의 3개 세트를 생성했고, 본질적으로 상기 주형은 프레임워크 1(FW1), CDR1 및 CDR3을 대부분 포함하는 3개의 상이한 영역으로 분할했다. 정의된 CDR1 및 CDR3 루프 영역은 주형-특이적 트리뉴클레오티드(TRM) 올리고머(Genelink)[참조: Virnekas, B., et al., Nucleic Acids Res, 1994. 22(25): p. 5600-7]를 사용하여 돌연변이시켰다. TRM 올리고뉴클레오티드는 의도적으로 생략된 시스테인의 배제와 함께 랜덤으로 특정 위치에 임의의 (AA)를 도입하도록 설계했다. TRM 올리고에 추가하여, 본 발명자들은 또한 보다 합리적 설계 접근법에 의해 정의된 돌연변이를 도입하기 위해 3개의 추가의 주형-특이적 CDR1-표적화된 올리고를 사용했다. 설계된 내용물은 "천연" 가시 VNAR 도메인 서열의 분석을 사용하여 결정했고, 정의된 축중 코돈 및 직접 상동성 코돈을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 라이브러리 내로 도입했다. 각각의 풀에 대한 형질전환체의 수는 다음과 같다: 풀 A(2V-2V) 1.38 × 1010, 풀 B(5V-2V) 2.72 × 1010, 풀 C(2V-5V) 1.94 × 1010 및 풀 D(5V-5V) 3.24 × 1010, 따라서 최대 최종 조합된 라이브러리 풀 크기는 9.28 × 1010였다.
실시예 5: 비선택된 ELSS1 합성 라이브러리 클론의 QC 분석
비선택된 ELSS1 라이브러리 클론을 랜덤으로 채취하고, DNA를 단리하고, 이들의 서열을 분석했다. 이러한 분석의 목적은 모든 의도된 설계 특징이 최종 라이브러리에 성공적으로 도입되어 있는 정도를 측정하기 위한 것이었다. 전체적으로, 본 발명자들은 예외 없이 설계에 포함된 모든 도입된 셔플링 및 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발의 예를 발견했다. 또한, 몇몇 샘플 클론을 랜덤으로 선택하고, VNAR 단백질을 발현시키기 위해 유도했고, 주변세포질 분획을 단리하고, 단백질이 생성되었는지를 확인하기 위해 웨스턴 블롯에 의해 분석하고, 세균 주변세포질 추출물로 국지화했다. 본 발명자들은 또한 2개의 주형 설계로부터 유래된 하이브리드 클론에서 단백질 발현을 확인했다. 또한, 본 발명자들은 비선택된 라이브러리 클론의 패널에 대해 표적화된 루프, CDR1(n=285) 및 CDR3(n=246) 둘 다의 함량 분포를 본래 "천연" 데이터베이스와 비교했다. 전체적으로, 분석은 비선택된 ELSS1 합성 클론이 유사하게 다양한 (AA) 함량을 제공했고, 이는 이의 합성을 유도하기 위해 사용된 "천연" 돔발 상어 데이터베이스와 유사했음을 나타냈다. 본 발명자들은 "천연", 비선택된 및 선택된 ELSS1 라이브러리 클론의 CDR3 루프 길이 분포를 비교했다. 여기서, 본 발명자들은, 대부분의 경우, 비선택된 합성 라이브러리 모집단이 9개 (AA) 길이에서 루프의 표현을 약간 초과하여 8 내지 16개 (AA) 루프 길이에 상당히 균일하게 분포되었음을 밝혀냈다.
실시예 6: 다중 표적에 대한 ELSS1 합성 VNAR 라이브러리의 생물신장에 의한 기능적 함량 검증
ELSS1 라이브러리의 품질 및 기능을 검증하기 위해, 고체 상태 및 예비-코팅된 비드 기반 방법을 다양한 표적: 인간 혈청 알부민(HSA), 인간 RAGE, 인간 DLL-4, 계란 리소자임(HEL) 및 마우스 ICOSL에 대해 사용했다. 양성 히트는 각각의 표적에 대해 수득했다(도 5 내지 12). 간단하게 말하면, 고체 상태 선택은 다음과 같이 수행했다: 면역튜브를 4ml PBS 중의 목적하는 농도로 표적 항원으로 코팅시켰다. 이어서, 튜브를 밀봉하고, 회전시키면서 4℃에서 O/N 배양시켰다. PBS로 3회 세척 후, 튜브를 1시간 동안 2% (w/v) M-PBS로 차단했다. 1시간 동안 회전시키면서 0.5 내지 1ml 유입 파지를 M-PBS (2% (w/v) 최종 농도) 중에서 차단한다. 이어서, 차단된 파지를 튜브에 첨가하고, 2% (w/v) M-PBS를 사용하여 4ml로 구성하고, 20rpm에서 1시간 동안 회전하면서 배양한 후 추가로 1시간 동안 정적 배양한다. 결합되지 않은 파지를 제거하고, 튜브를 PBST로 5 내지 10회 세척한 다음, PBS로 5 내지 10회 세척한다. 파지를 20rpm에서 최대 10분 동안 회전하면서 1ml의 100mM 트리에틸아민을 첨가하여 용출시켰다. 유출 파지 용액은 0.5ml 1M Tris-HCl pH 7.5를 첨가하여 중화시킨다. 용출된 파지를 10ml의 미드-로그 ER2738 세포에 첨가하고, 혼합하고 37℃에서 30분 동안 진탕시키지 않고 배양한 다음, 2,500 x g에서 15분 동안 원심분리시켰다. 펠렛을 1ml 2 x TY-G에 재현탁시키고, TYE-GA 한천을 함유하는 생물-검정 접시에 확산시키고, 30℃ O/N에서 O/N 배양했다.
예비-코팅된 비드 검정을 위해, 항원은 제조업자의 지시에 따라 비오티닐화했다. 비오티닐화 재료는 20rpm에서 R/T 회전시 30분 동안 30㎕의 다이나비즈(Dynabeads) M-280 스트렙타비딘(Invitrogen)으로 배양했다. 예비-장식된 비드에 의한 라이브러리 선택은 유입 파지 및 다이나비즈가 R/T에서 1시간 회전 동안 4% (w/v) M-PBS로 예비-차단시킨 상기 기재된 본질적으로 동일한 방법을 사용하여 수행했다. 이어서, 파지는 R/T에서 1시간 동안 회전하면서 차단된 비드를 첨가한 후, 20rpm에서 R/T에서 1시간 동안 항원 코팅된 비드를 첨가하여 선택 해제했다. PBST로 5회 세척 후, 결합된 파지를 400㎕의 100mM TEA 중에서 8분 동안 회전시켜 용출시키고, 200㎕의 1M Tris-HCl pH 7.5를 첨가하여 중화시켰다. 용출된 파지의 이. 콜라이 감염은 고체 상태 선택에 대해 기재된 바와 같이 수행했다.
히트의 친화성 측정(도 5): 모든 BIAcore 분석은 T-100 바이오센서, 시리즈 S CM5 칩, 아민-커플링 키트, pH 4, 4.5, 5.0 및 5.5에서 10mM 나트륨 아세테이트 고정화 완충제, 10×HBS-P 작동 완충제 및 50mM NaOH(GE Healthcare)를 사용하여 수행했다. 검정 조건은 하기에 상세된 질량 이동, 결합활성 및 재결합 이벤트의 영향을 최소화하도록 확립했다. hRAGE 단백질을 사용한 고정화는 기준 감산 및 특이성 분석을 위해 별개의 유동 세포(Fc1) 상에서 수행했다. 정제된 VNAR 단백질을 최종 농도의 범위까지 HBS-P 작동 완충제에서 희석시켰다(범용 적합 분석을 사용하여 반응속도 상수의 계산을 위해 600 내지 37.5nM로부터 개시하여 2배 희석). 각 농도는 30ml/분의 빠른 유속에서 3분 동안 주입하고, 5분 동안 해리시킨 다음, 50mM NaOH로 5초 재생 펄스로 계속했다. 각 농도에 대해 기준 감산 센소그램은 BIAcore T100 평가 소프트웨어(1.1.1)를 사용하여 분석했다.
정제된 항-HSA VNAR 단백질의 BIAcore 분석
이 분석은 하기 예외와 함께 상기 기재된 바와 같이 수행했다. 300RU의 표적화 고정화된 표면 밀도는 각각 유동 세포 3 및 4 상에서 인간 및 마우스 혈청 알부민(HSA/MSA)에 대해 1000RU 표면에 추가하여 시험했다. 또한, 음성 Fc 1은 D114 단백질 상에 코팅했다. 정제로부터 보다 많은 단백질을 갖는 경우, 본 발명자들은 보다 농축된 범위, 800-50nM로부터 개시하여 2배 희석을 시험했다.
정제된 항-RAGE VNAR 단백질의 BIAcore 분석
이 분석은 하기 예외와 함께 상기 기재된 바와 같이 수행했다. 유동 세포의 표적화 고정화된 표면 밀도는 다음과 같았다: Fc 1-1000RU DLL4 음성 대조군 표면; Fc 2-1000RU hRAGE(단량체); Fc 3-1000RU hRAGE(이량체); Fc 4-1000RU mRAGE(이량체).
정제된 항-DLL4 VNAR 단백질의 BIAcore 분석
이 분석은 상기 기재된 바와 같이 수행했다. 히트의 선택성은 ELISA 기반(데이터는 제시하지 않음) 및 FACS 기반 방법(도 6a 및 6b) 둘 다에 의해 수행했다. ELISA는 다음과 같이 수행했다: 항원은 4℃에서 O/N 코팅했다. 96-웰 플레이트는 1시간 동안 37℃에서 4% MPBS(Marvel PBS)로 차단시켰다. 검출 항체(PBS에서 적절한 농도로 희석시킴)는 1시간 동안 R/T에서 배양했다. 1시간 동안 R/T에서 2차 HRP-접합된 항체로 계속했다. 신호 생성은 추가 TMB 기질에 의해 달성했다.
선택된 양성 단량체성 VNAR 도메인은 제한 부위를 도입한 프라이머 및 HEK 293 현탁 배양물에서 PEI-매개된 일시적 발현 후 발현된 단백질의 단백질 A 친화성 정제를 촉진시키는 특유의 Fc 포유동물 발현 벡터로 클로닝에 적합한 인접 서열을 사용하여 PCR 증폭시켰다. VNAR Fc 융합 단백질의 발현 수준은 일반적으로 혈청 비함유 배지를 사용하여 50 내지 70mg/l의 범위내였다. 본질적으로, 후발현 세포 파편은 원심분리 및 0.2㎛ 여과에 이어 상기 상세화된 바와 같은 후속 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 배지로부터 제거하고, 단백질을 PBS로 평형화된 수퍼덱스(Superdex) 200 26/60 크기-배제 컬럼을 통과시켜 최종 연마 단계를 실시했다. SEC로부터 용출된 피크는 암피콘(Amicon) 한외여과 장치 및 UV 분광법에 의해 결정된 단백질 농도를 사용하여 농축시켰다.
FACS 검정은 다음과 같이 수행했다: 부모, mICOSL 및 hICOSL 리간드 발현 CHO 세포를 PBS로 세척하고, 37℃에서 10 내지 15분 동안 PBS 및 5% EDTA를 첨가하여 플라스크로부터 제거했다. 세포를 플라스크의 표면에 대해 상하로 피펫팅하여 단분산시키고, 1200rpm에서 스핀다운시키고, DMEM + 5% FCS에 재현탁시켰다. 세포를 96-웰 U-기반 플레이트에서 0.5 내지 1 x 106 세포/웰의 밀도로 분액화했다. 세포를 16℃에서 30분 동안 HEK293 VNAR-hFc 발현 단백질을 함유하는 100㎕의 조직 배양물 상청액으로 배양한 다음, PBS + 2% FCS로 3회 세척했다. 이어서, 세포를 16℃에서 30분 동안 1㎍/ml에서 100㎕의 항-hFc-비오틴(eBioscience)으로 배양했다. PBS + 2% FCS로 3회 세척 후, 스트렙타비딘-APC(eBioscience)를 16℃에서 30분 동안 1㎍/ml로 첨가했다. PBS + 2% FCS로 1회 세척 후, 세포를 400㎕의 PBS + 2% FCS에 재현탁시키고, FACS-Canto-2 상에서의 분석을 위해 FACS 튜브로 옮겼다.
실시예 7: mICOSL 및 DLL4에 대한 히트의 시험관내 및 생체내 관능성 검증
항-mICOSL 히트의 시험관내 유효성은 두 개의 세포계 검정에 의해 측정했다. 첫 째는 뮤린 ICOS 수용체를 발현시키는 CHO 세포가 96-웰 세포 배양 플레이트(Greiner, Bio-One) 중의 DMEM/F12 + 5% FBS 배지에서 컨플루엔시로 증식되는 리간드-수용체 중화 검정(도 7a)이었다. mICOSL-hFc(450ng/ml에서 20㎕)를 1시간 동안 DMEM/F12 + 2% FBS 중의 40㎕의 항-mICOSL-VNAR-hFC로 예비배양한 다음 세포에 첨가했다. 16℃에서 1시간 배양 후, 세포를 DMEM/F12 + 2% FBS로 완만하게 3회 세척하고, 추가로 40분 동안 16℃에서 동일 배지로 1:10,000로 희석된 염소 항-인간Fc-HRP(SIGMA)로 배양시켰다. 이후, 세포를 다시 DMEM/F12 + 2% FBS 배지 및 PBS를 갖는 것들로 3회 세척하고, TMB 기질로 발달시켰다. 두 번째 검정은 다음과 같이 간단하게 수행된 D10 증식 검정(도 7b)이었다: 토실 활성화 자기 다이날 비드를 생성물 삽입 지침에 따라 mICOSL, 항-mu CD3e 및 hIgG1 충전제(1x107 비드당 1㎍ ICOSL/0.5㎍ 항-CD3/3.5㎍ hIgG1)로 코팅시켰다. 검정 셋업 전에 비드를 적정하여 약 8000-40,000CPM의 판독치를 제공하기 위한 최적 농도를 결정했다. 50㎕/웰의 비드를 100㎕의 RPMI, 10%FCS, 2mM 글루타민, 펜 스트렙, 10mM Hepes, 1mM NaPyruvate, 2g/l 글루코즈 및 50μM BME 중에서 희석된 적정 항체를 함유하는 96-웰에 첨가한다.
D10.G4.1 세포를 검정 배지로 4회 세척하고, 상기 배지 + Con A(BD cat#354115), 2.5ng/ml IL-2 및 10pg/ml IL-1 알파를 포함하는 10% 래트 T 자극 인자 중에 8x105 세포/ml로 재현탁시키고, 50㎕/웰= 40,000 세포/웰로 첨가했다. 모든 웰을 200㎕의 최적 용적이 되게 하고, 48시간 동안 배양했다. 1μci/웰 3H 티미딘을 첨가하고, 5 내지 7시간 동안 배양했다. 수거하고, CPM을 계수했다.
항-DLL4 히트의 시험관내 유효성은 세포계 중화 검정 및 세포사 내재화 검정에 의해 측정했다(도 7c 및 7d). 중화 검정(도 7c)은 다음과 같이 수행했다: HEK293/DLL4 및 부모 HEK293 세포를 MEM, 1x (Cellgro # 10-010-CV), 10% FBS, 1% 펜 스트렙, 1% 글루타민 + 500㎍/ml G418 설페이트에서 60-75% 컨플루언트까지 증식시켰다. U-2 OS/Notch1(루시퍼라제 수용체 균주) 및 U-2 OS 부모 세포를 McCoy's 5A(GIBCO, #12605), 10% FBS, 1% 펜 스트렙, 1% 글루타민 + 250㎍/ml G418 설페이트, 300㎍/ml 하이그로마이신, 1㎍/ml 푸로마신에서 60-75% 컨플루언트까지 증식시켰다. 검정을 위해, 두 배지를 1:1 혼합했다. 총 용적 100㎕의 약 10,000 Notch1 및 DLL4 세포/웰을 백색 불투명 기저 96-웰 플레이트에서 3중으로 접종했다. 시험 항체 샘플은 플레이트를 교차하여 적정하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양했다. 각각에 100㎕ Dual-glo 루시퍼라제 완충제(Promega, #E2980)를 첨가하고, R/T에서 20분 동안 진탕시켰다. 발광 신호는 @700nm에서 측정했다. 정지하고, Glo 기질 완충제를 1/100로 희석하고, 실온에서 20분 동안 각 샘플에 100㎕를 첨가한 다음, 약 700nm에서 제2 세트의 발광 측정을 했다(배경 레닐라 발광). 두 측정치의 비는 출력으로서 취했다.
HEK293 세포를 과발현시키는 DLL4를 상기한 바와 같이 증식시키고, 추가의 4일 배양 동안 증식을 보장하는 세포 밀도에서 96웰 플레이트에서 120㎕/웰로 접종했다. 세포를 4 내지 6시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하여 부착을 가능하게 했다. 배지 중의 1:2 몰 비로 시험 항체 및 제2 사포린 시약(Advanced Targeting Systems #IT-51)의 5배 스톡 용액을 혼합하고, R/T에서 5분 초과로 정치시켜 복합체 형성을 가능하게 했다. 이어서, 이 혼합물을 연속 희석시키고, 세포의 각 웰에 30ml 첨가했다. 플레이트를 4일 동안 배양한 후, 1/5 희석(MTS)(Promega #G5430)으로 세포 역가 96 수성 비방사성 세포 증식 검정이 따른다. 이어서, 플레이트를 발색에 따라 37℃에서 1.5 내지 5시간 동안 배양한 다음, 490nm 및 650nm의 흡광도(배경 공제를 위해)에서 판독했다.
항-mICOSL 히트의 생체내 유효성은 류마티스 관절 마우스 모델(도 8)에서 결정했다. 모델은 RA의 콜라겐 유도된 마우스 모델(참조: Iwai et al, Journal of Immunology, 2002:169)이고, 여기서 10마리 암컷 DBA1 마우스 그룹에 프로인트 완전 아쥬반트 중의 소 콜라겐을 주사한(0일)다음, 20일째에 부스트가 이어졌다. 시험 항-mICOSL VNAR-hFc 도메인, 양성(HK5.3 mAb) 및 음성 대조군(2V-hFc)에 20일, 22일, 24일 및 26일째에 PBS i.p.로 15mg/kg으로 투여했다. 임상 스코어 및 체중을 1주일에 2회 측정했다. 임상 스코어는 발바닥 및 발가락 염증의 캘리퍼 측정에 기초했다: 1pt/발가락, 5pts/팽윤된 발바닥, 5pts/팽윤된 발목은 따라서 15 pts/발 및 60pts/동물을 수득한다.
실시예 8: 목적에 대한 클론의 정렬
도 16은 ELSS1을 스크리닝하는데 사용된 3개의 표적에 대해 리드 클론의 정렬을 나타낸다. 정렬은 2V 및 5V 프레임워크의 조합이 이러한 클론에 기여한다는 것을 나타낸다. 임의의 비음영화 아미노산은 두 프레임워크 사이에 보존시키고, 따라서 라이브러리 전반에 걸쳐 표준화한다. 강조된 영역은 선택된 클론이 5V 및/또는 2V 서열로부터 기여가 존재하였는지의 여부에 따라 도입된 차이가 존재하는 경우이다. 모든 이러한 클론은 가양한 시험관내 검정에서 유효성을 나타내는 리드 클론이고, mICOSL도 또한 생체내 검정에서 유효성을 나타낸다. 이러한 클론 중 5개는 서열을 교차하여 2V를 갖는다(CC3, C4, 1D12, 2D4, 1H02). DLL4 클론을 모도 포함하는 나머지 모두는 2V/5V 프레임워크 융합이다.
실시예 9: ELSS2 합성 라이브러리 설계
제2 프레임워크 라이브러리를 설계하고, 두 개의 상이한 종의 판새아강(Elasmobranchii): 스쿠알루스 아칸티아스(Squalus acanthias) 및 징글리모스토마 시라툼(Ginglymostoma cirratum)으로부터 VNAR 도메인의 3개의 상이한 이소형의 프레임워크를 도입하여 작제했다. 두 개의 주형 프레임워크 융합 작제물은 면역화된 수염 상어로부터 단리된 타입 II 이소형 도메인 E9 이외에 3개의 상이한 VNAR 도메인 이소형: 돔발 상어 2V(이소형 IIb) 및 5V(이소형 IIIb) VNAR 도메인 사이의 서열 분석에 기초하여 설계했다. 도 18은 ELSS2 라이브러리의 기준으로서 작제된(Life Technologies) 두 개의 하이브리드 주형 프레임워크 서열을 예시한다. 2개의 주형 유도된 변이형 서브라이브러리는 CDR3 루프의 길이(9, 11, 13, 15 및 17 아미노산) 및 서열 둘 다에서 첨가된 올리고뉴클레이티드-지시된(NNK 올리고) 합성 다양성으로 SOE-PCR로 작제했다.
실시예 10: ELSS2 라이브러리 작제 및 바이오패닝
2개의 프레임워크 융합 주형은 2V, 5V 및 E9 VNAR 도메인에 기초하여 설계했다. 융합 주형을 함유하는 플라스미드 작제물을 합성하고(Life Technologies), 유전자 삽입물은 제조업자의 권장에 따라서 퓨전(Phusion) 고충실도 폴리머라제 마스터 혼합물(NEB)로 PCR 증폭시키거나 KpnI 및 Sac I 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. 두 프레임워크 주형 상의 CDR3 루프를 교차하는 랜덤 올리고뉴클레오티드 합성 다양성은 고정된 길이의 NNK 올리고(9, 11, 13, 15 또는 17 아미노산)를 도입하여 달성했다. 전장 VNAR 유전자 서열은 FW1-FW3 및 CDR3-FW4 앰플리콘을 사용하는 SOE-PCR로 어셈블리했다. PCR 생성물은 SfiI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, 유사하게 소화된 파지미드 벡터로 연결시키고, 전자경쟁 이. 콜라이 ER2738 세포(Lucigen)로 형질전환시켜 조합된 크기 약 2 x 108 클론을 갖는 두 개의 서브라이브러리를 유도했다.
ELSS2 라이브러리의 품질 및 기능을 검증하기 위해, 예비-코팅된 비드 기반 생물신장 방법은 실시예 6에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 ICOSL에 대해 사용했다. 양성 파지 히트는 팬 2 후에 수득했다(도 19). 11개 양성 클론은 주형 1 프레임워크 작제물로부터 기원하는 7개로 서열분석하고, 나머지는 주형 2 프레임워크 작제물로부터 기원하는 4개로 서열분석했다. 모든 CDR3 서열은 특유했다(도 20). 이들 양성 클론 중에서, 전체 5개(주형 1로부터 3개 및 주형 2로부터 2개)는 유형 II 구성과 상관하는 CDR1 및 CDR3 둘 다에 Cys 잔기를 가졌다.

Claims (25)

  1. (1) 판새아강 아부류(Elasmobranchii subclass) 내 종(species)의 구성원으로부터 RNA를 단리하는 단계;
    (2) 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열의 데이터베이스를 작성하기 위해 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 단계(1)에서 수득한 RNA로부터 DNA 서열을 증폭시키는 단계;
    (3) 단계(2)에서 제조한 데이터베이스로부터 DNA 서열을 선택하는 단계;
    (4) FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 2개 이상의 연속 펩티드 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키는 단계로서, 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인이, 연결되는 경우, 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하고, 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인이, 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 복수의 증폭된 DNA 서열을 형성하기 위해 단계(3)에서 선택된 서열에서 CDR1 또는 CDR3 도메인과 상보성인 복수의 이종성 올리고머의 존재하에 단계(3)에서 선택된 적어도 2개의 이종성 DNA 서열로부터 유래하는, 단계;
    (5) 서열식 I의 펩티드 도메인을 갖는 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 형성하기 위해 2개 이상의 연속 펩티드 도메인을 코딩하는 상기 증폭된 DNA 서열을 함께 연결시키는 단계;
    (6) 단계(3)에서 수득된 증폭된 DNA를 디스플레이 벡터에 클로닝하는 단계; 및
    (7) 숙주를 상기 디스플레이 벡터로 형질전환시켜 상기 항원 특이적 항원 결합 분자의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는, 하기 서열식 I로 나타내어지는 펩티드 도메인 구조를 갖는 항원 특이적 항원 결합 분자의 라이브러리를 제조하는 방법.
    [서열식 I]
    FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4.
  2. (1) 제1항의 방법에 따라 제조한 라이브러리로부터 목적하는 클론을 선택하는 단계;
    (2) 이들 클론으로부터 항원 특이적 항원 결합 분자를 단리 및 정제하는 단계;
    (3) 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계; 및
    (4) 숙주를 형질전환시켜 발현 벡터의 발현을 가능하게 하는 단계를 포함하는, 항원 특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법.
  3. (1) 판새아강 아부류(Elasmobranchii subclass) 내 종의 구성원으로부터 RNA를 단리하는 단계;
    (2) 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열의 데이터베이스를 작성하기 위해 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 단계(1)에서 수득한 RNA로부터 DNA 서열을 증폭시키는 단계;
    (3) 단계(2)에서 제조한 데이터베이스로부터 DNA 서열을 선택하는 단계;
    (4) FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 2개 이상의 연속 펩티드 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키는 단계로서, 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인이, 연결되는 경우, 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하고, 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인이 서열식 I의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 복수의 증폭된 DNA 서열을 형성하기 위해 단계(3)에서 선택된 서열에서 CDR1 또는 CDR3 도메인과 상보성인 복수의 이종성 올리고머의 존재하에 단계(3)에서 선택된 적어도 2개의 이종성 DNA 서열로부터 유래하는, 단계;
    (5) 서열식 I의 펩티드 도메인을 갖는 항원 특이적 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 형성하기 위해 2개 이상의 연속 펩티드 도메인을 코딩하는 상기 증폭된 DNA 서열을 함께 연결시키는 단계;
    (6) 단계(5)에서 수득된 증폭된 DNA를 디스플레이 벡터에 클로닝하는 단계;
    (7) 숙주를 상기 디스플레이 벡터로 형질전환시켜 상기 항원 특이적 항원 결합 분자의 라이브러리를 생성하는 단계;
    (8) 목적하는 클론을 상기 라이브러리로부터 선택하는 단계;
    (9) 상기 클론으로부터 항원 특이적 항원 결합 분자를 단리 및 정제하는 단계;
    (10) 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계 및
    (11) 숙주를 형질전환시켜 발현 벡터의 발현을 가능하게 하는 단계를 포함하는, 하기 서열식 I로 나타내어지는 펩티드 도메인 구조를 갖는 항원 특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법:
    [서열식 I]
    FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 2개 이상의 연속 펩티드 도메인이 FW1, CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3 및 CDR3-FW4인, 방법.
  5. 복수의 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 발현가능한 DNA 서열의 라이브러리를 함유하는 형질전환된 숙주를 사용하여 항원 특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서,
    상기 라이브러리는 적어도 2개의 이종성 이소형(heterologous isotype) NAR 서열로부터 작성되고, 상기 항원 특이적 항원 결합 분자는 판새아강 아부류 내 종의 구성원에서 발견된 면역글로불린 이소형 NAR의 가변 영역의 복수의 도메인을 포함하는, 방법.
  6. 하기 서열식 II로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 50% 상동성인 서열을 포함하는 항원 특이적 항원 결합 분자:
    [서열식 II]
    A-X-B-Y-C
    상기 서열식 II에서,
    A는 서열번호 1, 서열번호 4 또는 서열번호 7이고,
    X는 5, 6 또는 7개 아미노산 잔기의 CDR1 영역이고,
    B는 서열번호 2, 서열번호 5 또는 서열번호 8이고,
    Y는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 아미노산 잔기의 CDR3 영역이고,
    C는 서열번호 3 또는 서열번호 6이고, 여기서
    서열번호 1은 TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDT 또는 TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGA이고,
    서열번호 2는 TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKA 또는 TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRA이고,
    서열번호 3은 DGAGTVLTVN이고,
    서열번호 4는 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDT 또는 ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGA이고,
    서열번호 5는 TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKA 또는 TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRA이고,
    서열번호 6은 YGAGTVLTVN이고,
    서열번호 7은 ARVDQTPQTITKETGESLTINCVLRD이고, 및
    서열번호 8은 TYWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRA 또는 TYWYRKNPGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRA이다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 서열식 I의 서열이 서열번호 10인, 항원 특이적 항원 결합 분자.
  8. 제6항에 있어서, 상기 서열식 I의 서열이 서열번호 12인, 항원 특이적 항원 결합 분자.
  9. 제6항에 있어서, 상기 CDR1 영역이 도 17에 제시된 CDR1 영역인, 항원 특이적 항원 결합 분자.
  10. 제6항에 있어서, 상기 CDR3 영역이 도 17에 제시된 CDR3 영역인, 항원 특이적 항원 결합 분자.
  11. 제6항에 있어서, 상기 항원 특이적 항원 결합 분자가 도 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 중의 어느 하나에 제시된 서열을 갖는, 항원 특이적 항원 결합 분자.
  12. 제6항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간화되어 있는, 항원 특이적 결합 분자.
  13. 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항의 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항원 특이적 항원 결합 분자가 생물학적 활성 단백질에 융합되어 있는, 융합 단백질.
  15. 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항의 항원 특이적 항원 결합 분자, 또는 제13항 또는 제14항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
  16. 제15항에 따르는 핵산을 포함하는 핵산 작제물.
  17. 제16항에 따르는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 항원 특이적 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 제13항 또는 제14항의 융합 단백질의 제조 방법.
  19. 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 정의된 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 제13항 또는 제14항의 융합 단백질의 약제학적 조성물.
  20. 의약에서 사용하기 위한, 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 정의된 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 제13항 또는 제14항의 융합 단백질.
  21. 이를 필요로 하는 환자에서 질환 치료를 위한 약제의 제조에서 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 제13항 또는 제14항의 융합 단백질의 용도.
  22. 제19항의 약제학적 조성물의 치료학적 유효 용량을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 치료를 필요로 하는 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  23. 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항의 검출가능하게 표지된 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 제13항 또는 제14항의 융합 단백질을 샘플에 첨가하고, 표적 분석물에 대한 상기 분자의 결합을 검출하는 것을 포함하여, 샘플에서 표적 분석물의 존재를 검정하는 방법.
  24. 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 검출가능하게 표지된 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 제13항 또는 제14항의 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 질환 부위를 화상화(imaging)하는 방법.
  25. 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 제13항 또는 제14항의 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 질환 또는 의학적 상태를 진단하는 방법.
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