JP2016524463A - 特異的結合分子の人工ライブラリー - Google Patents

Abstract

本発明は、下記式（Ｉ）で表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子のライブラリーの作製方法を提供し、（１）板鰓亜綱の種のメンバーからＲＮＡを単離し；（２）得られたＲＮＡからＤＮＡ配列を増幅し；（３）作成されたデータベースからＤＮＡ配列を選択し；（４）ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の２以上の隣接するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅し；（５）２以上の隣接ペプチドドメインをコードする前記増幅されたＤＮＡ配列をライゲーションして、抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成し；（６）得られた前記増幅されたＤＮＡをディスプレイベクターにクローニングし；および（７）前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製することを含む。

Description

本発明は、板鰓亜綱（Elasmobranchii subclass）の種のメンバーに由来する抗原特異的結合分子の人工ライブラリー、これらの製造方法および前記ライブラリーから単離される抗原特異的結合分子に関する。

疾患と闘うための、特異的であり、ますます有効であり、かつ多角的な治療の武器の探索においては、無数の異なる様式が利用されている。それは、従来の低分子から徐々に大きな生物医薬品に至り、例えば、単一結合ドメイン（１０〜１５ｋＤａ）からＩｇＧ全体（〜１５０ｋＤａ）に至る。潜在的な治療薬として現在調査されている単一ドメインは、幅広い種類の異なるタンパク質骨格を有しており、すべて関連した利点および欠点を伴う。

かような単一ドメイン骨格（scaffold）は、異なる種のタンパク質アレイから誘導されうる。免疫グロブリンアイソタイプ新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）は、テンジクザメ（Ginglymostoma cirratum）や他のサメ種およびエイ種の血清において最初に発見されたホモ２量体型重鎖複合体である。ＩｇＮＡＲは軽鎖を有しない。各分子は、１つの可変領域（ＶＮＡＲ）および５つの定常領域（ＣＮＡＲ）からなる。文献における命名は、ＩｇＮＡＲを、免疫グロブリンアイソタイプ新規（novel）抗原受容体または免疫グロブリンアイソタイプ新（new）抗原受容体と称し、これらの語は同義である。

免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様サメ可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）（Ｆｅｎｎｅｌｌ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１０． ４００（２）：ｐ．１５５−７０）に加え、他の例としてラクダ可変重鎖（ＶＨＨ）ドメイン（Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ， Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００９．１９８（３）：ｐ．１５７−７４）、人工ヒト可変重（ＶＨ）ドメイン（Ｃｈｅｎ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００８．３８２（３）：ｐ．７７９−８９）、および定常重（ＣＨ２）（Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｄ．Ｓ．，ＭＡｂｓ，２００９．１（１）：ｐ．２６−８）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）（Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１９９９．３６（２）：ｐ．２１７−２７）ドメイン、ヤツメウナギ可変リンパ球受容体（ＶＬＲ）（Ｔａｓｕｍｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００９．１０６（３１）：ｐ．１２８９１−６）がある。ＶＮＡＲとラクダ可変重鎖（ＶＨＨ）フラグメントとの間における類似性には、ジスルフィド結合の存在やｎＭ範囲の結合親和性が含まれる。

“非免疫グロブリン”ドメインの宿主もあり、例としてＩＩＩ型フィブロネクチン（ＦＮ３）（Ｂｌｏｏｍ，Ｌ． ａｎｄ Ｖ．Ｃａｌａｂｒｏ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２００９．１４（１９−２０）：ｐ．９４９−５５）、人工タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）が含まれる。現在、単一ドメインの生物製剤は、多様な異なる症状に対する治療薬としての成功的応用に向けた集中的な研究対象となっている。

これまで、サメＩｇＮＡＲについては、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型として知られる３つの定義された型がある（図１）。これらは、強い選択圧下にあることによりほとんど置換されることがない、非カノニカルなシステイン残基の位置に基づいて分類される。

３つの型はすべて、３５位および１０７位に古典的な免疫グロブリンカノニカルなシステインを有しており、これらは３６位にある不変なトリプトファンとともに標準的な免疫グロブリンの折り畳み構造を安定化させている。フレームワーク２および３において、定義されたＣＤＲ２自体は無いが、ＴＣＲ ＨＶ２およびＨＶ４とより密接に比較する配列変異領域がそれぞれ定義されている。Ｉ型は、フレームワーク２およびフレームワーク４内に生殖細胞系配列によりコードされたシステイン残基を有し、ＣＤＲ３内にもさらに偶数個のシステインを有する。単離されてリゾチームと複合したＩ型ＩｇＮＡＲの結晶構造研究により、これらのシステイン残基の寄与を決定づけることが可能となった。両フレームワーク２および４のシステインはＣＤＲ３内のシステインとジスルフィド架橋し、ＣＤＲ３ループがＨＶ２領域に向かって強固に引っ張られた、強固にパッキングされた構造を形成する。これまで、Ｉ型ＩｇＮＡＲは、テンジクザメにおいて特定されるのみであり、同位のメンバーを含む他の軟骨魚類はＩＩ型またはこの変異型のみを有する。

ＩＩ型ＩｇＮＡＲは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３内に、これら２つの領域を近接状態で保持する分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を有し、その結果、結合ポケットまたは結合溝をもたらす突き出したＣＤＲ３（図２）として定義される。典型的に、Ｉ型配列はＩＩ型に比べて長いＣＤＲ３を有しており、それぞれ平均して２１残基および１５残基である。これは、フレームワーク２および４の一方と結びつくＩ型ＣＤＲ３における２以上のシステイン残基に対する強い選択圧によると考えられる。体細胞変異の蓄積に関する研究によれば、Ｉ型に比べてＩＩ型のＣＤＲ１では多数の変異がある一方、Ｉ型のＨＶ２領域はＩＩ型に比べて配列変異が見られることが示されている。この証拠は、抗原結合部位におけるこれらの領域の決定づけられた位置とよく関連する。ＩＩＩ型として知られる第三のＩｇＮＡＲ型は、新生児において特定されている。ＩｇＮＡＲファミリーのこのメンバーは、（ＣＤＲ３を形成する）Ｄ１領域およびＤ２領域とＶ遺伝子との生殖細胞系列融合によってＣＤＲ３内の多様性を欠如している。ほぼすべての公知のクローンは、ほとんどあるいは全く配列多様性が無い１５残基長のＣＤＲ３を有する。

潜在的利点だけでなく応用における投資範囲をも強調する単一ドメイン結合分子の臨床試験（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ． ａｎｄ Ｐ．Ｊ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５．２３（９）：ｐ．１１２６−３６）による有望な結果がある。より大きくかつより類似する生物学的対（biologic counterpart）（例えばＩｇＧ全体）とは対照的に、小さな単一ドメイン骨格の選択について、多くの論理的根拠が提起されている。より広く引用された中では、多くの場合、サイズが小さい結果、血液脳関門を通過すること、および組織浸透を通じて固形腫瘍を標的とすることに、より容易に適合しうるという一般的な推定がなされる。一般的に、ラクダ種およびサメ種について報告されている単一ドメインは、構造的に異なる抗原結合部位（paratopes）を形成し、その結果として、酵素活性部位のような割れ目（cleft）のターゲティングを容易にしているのではないかということが考えられている。

しかしながら、多くのこれらの特徴について、依然として情報が相対的に少ないことに留意すべきである。ある単一ドメインは、変性後のリフォールディング傾向に加え、高い固有の熱安定性を示す。このような特徴は、生物製剤を市場に売り出すことが要求される大スケール製造の開発活動において有利であろう。さらに、これらの特徴によって、単一ドメインアプローチはドラッグデリバリーの代替方法を受け入れるであろう。個別の単一ドメインを用いた結果は、複数の異なる選択性を伴う結合したマルチドメイン様式の可能性に導く“ビルディングブロック”合成にも応用されうる手段にアプローチする。

ファージディスプレイによって、高い親和性で標的抗原に結合するこれらの配列のために迅速に選別されるタンパク質変異体の大ライブラリーの作製が可能となる。変異ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列に融合する。抗体または抗原結合ポリペプチドのライブラリーは、ランダムＤＮＡ配列の挿入により、または関連遺伝子のファミリーのクローニングにより、単一遺伝子を変換することを含む、数多くの方法によって作製された。その後、ライブラリーは、所望の特性を有する抗体または抗原結合タンパク質の発現のためにスクリーニングされる。

ファージディスプレイ技術は、所望の特性を有する抗体を調製するための従来のハイブリドーマ法およびリコンビナント法に対していくつかの利点を有する。この技術により、時間が短縮され、かつ動物を使用することなく、多様な配列を有する抗体の大ライブラリーの開発が可能となる。

ライブラリーからの高親和性抗体の単離は、ライブラリーの大きさ、細菌性細胞中の産生効率およびライブラリーの多様性に依存する。ライブラリーのサイズは、抗体または抗原結合タンパク質の不適切なフォールディングおよび終止コドンの存在による産生の非効率さによって減少する。抗体または抗原結合ドメインが適切に折り畳まれていない場合、細菌性細胞における発現は阻害される。可変／定常界面の表面にある残基または選択されるＣＤＲ残基を次々に変異させることにより、発現は改善される。フレームワーク領域の配列は、抗体ファージライブラリーが細菌性細胞内で作製されるときに、適切なフォールディングをもたらす因子である。

抗体または抗原結合タンパク質の多様なライブラリーの作製は、高親和性抗体の単離のためにも重要である（国際公開第０３／１０２１５７号、国際公開第０３／０１４１６１号および国際公開第２００５／１１８６２９号の実施例を参照）。これらはしばしば、抗原結合に関与することがわかっているので、ＣＤＲ３領域は、一部において関心が持たれている。

本発明は、Ｉｇ様新規抗原受容体可変ドメイン（ＶＮＡＲ）に関する。（先祖の分子系統は異なるが）ラクダＶＨＨドメインと多少類似するが、ファージディスプレイライブラリー構築物および特異的な結合選択を記述する文献報告の出現は、ナイーブなサメのレパートリーを用いたものは、比較すると頻繁ではなくまれである（Ｎｕｔｔａｌｌ， Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２００２．５１６（１−３）：ｐ．８０−６；Ｌｉｕ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．４４（７）：ｐ．１７７５−８）。これまで、単離されたＶＮＡＲドメインの大部分は、標的免疫された組織を用いて構築されたファージディスプレイライブラリー（Ｄｏｏｌｅｙ，Ｈ．，Ｍ．Ｆ． Ｆｌａｊｎｉｋ ａｎｄ Ａ．Ｊ． Ｐｏｒｔｅｒ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３．４０（１）：ｐ．２５−３３；Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００４．５５（１）：ｐ．１８７−９７、Ｄｏｏｌｅｙ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００６．１０３（６）：ｐ．１８４６−５１）または、ＰＣＲによって相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の標的とされる人工的多様性と結合した“ナイーブな”非免疫多様性（Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１．３８（４）：ｐ．３１３−２６；Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００３．２７０（１７）：ｐ．３５４３−５４、Ｌｉｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｇ．Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ａｎｄ Ｅ．Ｒ．Ｇｏｌｄｍａｎ，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７．７：ｐ．７８）から得られていると思われる。

サメ免疫ストラテジーは、高親和性、高特異的ＶＮＡＲドメインを単離するための強力な手段であるが、この方法は長い免疫スケジュールが要求される、サメ種またはアイソタイプ認識試薬が一般的に不足している等の技術的な困難が存在する。ゆえに、本発明は、あらゆるターゲットに対するＶＮＡＲ治療薬を効率的に調達することに用いられる人工的なＶＮＡＲライブラリーを提供し、上記の困難を迂回する効果がある。理想としては、調査員が迅速かつ動物を必要とせずに、ヒトまたはマウス抗体の単離のために現在広く利用されている同じ生物学的ドラッグデリバリー方法において、ＶＮＡＲを誘導するディスプレイライブラリー技術を用いることができるようになるべきである。

本発明は、同種内の異なるアイソタイプおよび異なる板鰓亜綱種をまたがる異なるアイソタイプ由来の２以上の天然由来のＶＮＡＲ配列から作製されるライブラリーから単離されるＶＮＡＲの予期できない多様性、アフィニティー、選択性および有効性に基づく。異なるアイソタイプと異種フレームワークとを共に融合させるこの新規なアプローチは、単一フレームワークライブラリーを用いては達成できないであろうライブラリー内における多様性の増加を生み出す利点を有する。利点は以下のものを含むが、これに制限されない：
・異なるアイソタイプの融合を通じた、両ＣＤＲ領域、両ＨＶ領域およびフレームワーク領域において生み出されるさらなる多様性
・異なる板鰓亜綱種に由来する異なるアイソタイプの融合を通じた、両ＣＤＲ領域、両ＨＶ領域およびフレームワーク領域におけるさらなる多様性
・トリヌクレオチド（ＴＲＭ）オリゴを用いた特異的変異および両ＣＤＲ領域内でのＮＮＫオリゴを用いたランダム変異を通じたさらなる多様性
・天然由来のＣＤＲ１領域をＮＮＫオリゴと組み合わせて用いることによる融合したフレームワーク領域を超えるさらなるアイソタイプ多様性（これはＣＤＲ１およびＣＤＲ３の古典的なＩＩ型Ｃｙｓ対形成の潜在的付加につながる）
・多様なＣＤＲ３領域の異なる固定長の使用を通じたさらなる多様性
・９×１０^１０クローン以上へのライブラリーサイズの増加（これは、以前報告された（ナイーブ、免疫または人工の）サメライブラリーに比べて２桁大きい）。

本発明は、一般的に、抗原特異的抗原結合分子のライブラリーに関する。前記ライブラリーは、両ＣＤＲ領域およびフレームワーク領域における多様性を創成することで産生される、発生する複数の異なる抗原特異的抗原結合分子、ドメインおよび／またはその断片を含む。特に、ＣＤＲ領域における多様性は、本発明のＶＮＡＲ配列および抗原特異的抗原結合分子のドメインの構造ゆらぎを最小化させる一方で、多様性を最大化するために設計される。

かようなライブラリーは、例えば、結合親和性（binding affinities and avidities）等の所望の活性を有する人工のＶＮＡＲクローンの選択および／またはスクリーニングに有用なコンビナトリアルライブラリーを提供する。これらのライブラリーは、多種多様な標的抗原のいずれかと相互作用する可能な配列を特定するのに有用である。例えば、ファージ上に提示される本発明の多様なＶＮＡＲポリペプチドを含むライブラリーは、対象の抗原結合分子の選択および／またはスクリーニングにおいて、特に有用であり、かつそのハイスループットで効率的であり自動化可能なシステムを提供する。本発明の方法は、最低限の変化を伴う資源またはテンプレートの分子への抗原を標的とする高親和性バインダーを提供するために、および抗体または抗原結合フラグメントが細胞培養で産生される際の良好な収率を提供するために設計される。

本発明は、選択された抗原に対して高親和性を有する新規のＶＮＡＲまたはそのフラグメントを産生および単離する方法を提供する。資源のテンプレートＶＮＡＲ配列において１以上の選択されるアミノ酸位置を変異させる（多様化させる）ことにより、複数の異なるＶＮＡＲおよびＶＮＡＲドメインが作製され、これらの位置において変異したアミノ酸を有するＶＮＡＲドメインの多様なライブラリーが産生する。アミノ酸の位置は、（例えば、資源のＶＮＡＲの構造分析によって決定づけられるように）溶媒が接近できる、および／または既知のおよび／または天然由来のＶＮＡＲポリペプチドにおいて非常に多様である。

本発明は、１以上の抗原特異的抗原結合分子またはドメイン（またはその一部）と、ウイルスコートタンパク質等の異種タンパク質との融合ポリペプチドにも関する。本発明は、融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含む複製可能な発現ベクター、発現ベクターを含む宿主細胞、ウイルス表面上に融合ポリペプチドを提示するウイルス、ウイルス表面上に複数の異なる融合ポリペプチドを提示するウイルスライブラリー、およびこれらの組成物を用いた方法にも関する。

本発明の方法および組成物は、治療上または試薬として用いられうる新規の抗原特異的抗原結合分子を特定するのに有用である。

本発明では、以下に示す多数の図面が参照される。
図１は、カノニカルな（○）および非カノニカルな（●）システイン残基、ジスルフィド結合（連結線）、保存されたトリプトファン（Ｗ）および超可変（ＣＤＲ／ＨＶ）領域の位置を示す再配列されたＩｇＮＡＲ遺伝子の構造を示す。 図２は、ヒトＶＨドメインと比較したＩ型およびＩＩ型の抗リゾチームＩｇＮＡＲの主鎖構造を示す。 図３は、アブラツノザメ由来のテンプレートＶＮＡＲドメイン２Ｖおよび５Ｖの結晶構造を示す。 図４は、２Ｖおよび５Ｖの両方のテンプレートフレームワークを用いてハイブリッド配列から作製された、ライブラリーの設計図およびフレームワークの多様性を示す。ＳＯＥ ＰＣＲを用いたライブラリーに基づく２Ｖおよび５Ｖフレームワーク融合物に対する設計。プライマーの位置は矢印で示す。 図５は、異なる標的に対するヒットの例のアフィニティーを示す。ＥＬＳＳ１について、異なるクラス範囲の標的（ｈＤＬＬ４、ＨＳＡ、ｈＲＡＧＥ）に対してスクリーニングした。ポジティブヒットを精製し、濃度を決定し、結合キネティクスを算出するために、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ−２０００上のＣＭ５チップ固定化標的に対して通過させた。 図６は、ＥＬＳＳ１ライブラリーヒットの選択性を実証するデータを示す。図６Ａは、ｍＩＣＯＳＬに対して単離されたヒットの選択性を示す。ＥＬＳＳ１についてマウスＩＣＯＳＬに対してスクリーニングし、ポジティブヒットについて細胞表面の発現標的への結合を試験し、ＦＡＣＳベースアッセイを用いて親と比較した。 図６は、ＥＬＳＳ１ライブラリーヒットの選択性を実証するデータを示す。図６Ｂは、ＤＬＬ４に対して単離されたヒットの選択性を示す。ＥＬＳＳ１をヒトおよびマウスＤＬＬ４に対してスクリーニングし、ポジティブヒットについてＦＡＣＳベースアッセイにより細胞表面標的に対する結合を評価した。数が大きいほど、示す細胞型への結合が高い。 図７Ａ〜７Ｄは、異なる標的に対するＥＬＳＳ１ライブラリーヒットのインビトロ有効性を実証するデータを示す。図７Ａは、中和アッセイに基づいた、細胞内のｍＩＣＯＳＬに対して単離されたヒットの選択性を示す。ｍＩＣＯＳＬに対するＥＬＳＳ１ライブラリー由来のポジティブＶＮＡＲヒットについて、リガンド（ＩＣＯＳＬ）の同族受容体（ＩＣＯＳ）への結合阻害能を評価した。ＶＮＡＲヒット、Ｃ４、ＣＣ３、Ａ１、ＡＧ１２およびＡＧ２について、ネガティブＶＮＡＲコントロール２Ｖと比較した。全てのクローンについて、受容体へのリガンド結合阻害の有効性を示すために、発現し、精製し、標識化リガンド存在下で滴定した。測定したＩＣ５０は全て１桁ｎＭであった。 図７Ａ〜７Ｄは、異なる標的に対するＥＬＳＳ１ライブラリーヒットのインビトロ有効性を実証するデータを示す。図７Ｂは、マウスＤ１０アッセイにおいて、Ｔ細胞の増殖を阻害する単離および精製された抗ｍＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲの能力を示す（Ｔ細胞増殖アッセイ）。 図７Ａ〜７Ｄは、異なる標的に対するＥＬＳＳ１ライブラリーヒットのインビトロ有効性を実証するデータを示す。図７Ｃは、ＥＬＳＳ１から単離された抗ｈＤＬＬ４ ＶＮＡＲドメインの細胞表面のＮｏｔｃｈ１受容体に対するＤＬＬ４結合阻害能を示す（中和アッセイ）。データは、中和率（数値が高いほどリガンド結合受容体の阻害が大きい）として算出される。 図７Ａ〜７Ｄは、異なる標的に対するＥＬＳＳ１ライブラリーヒットのインビトロ有効性を実証するデータを示す。図７Ｄは、細胞表面で発現したＤＬＬ４に結合し、取り込まれる抗ＤＬＬ４ ＶＮＡＲの能力を示す。抗ＤＬＬ４ ＶＮＡＲドメインはヒトＦｃに融合し、細胞生存を通じて取り込みを測定し、生存が低いほど取り込み有効性が高い。クローン７２、１０および７８はＶＮＡＲヒットである。２ＶはネガティブＶＮＡＲコントロールであり、ＹＷはｍＡｂポジティブコントロールである。 図８は、ヒト関節リウマチ（ＲＡ）のマウスモデルにおける抗ｍＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲのインビボ有効性を示す。左手のグラフは、ネガティブコントロール２Ｖと比較して、ＲＡのコラーゲン誘導マウスモデルにおける全体の臨床スコアまたは炎症レベルを低減する全てのうち上位５位のＶＮＡＲ（Ａ１、Ｃ４、ＣＣ３、ＡＧ２およびＡＧ１２）の能力を示す。クローンＡ１およびＣＣ３は、ｍＩＣＯＳＬに対するリードｍＡｂに比べて、顕著に炎症を低減した（右手のグラフ）。全ての抗ｍＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲドメインおよびアイソトープコントロールＶＮＡＲ、２Ｖは、ヒトＦｃ融合タンパク質として再フォーマットされている。 図９は、クローン２Ｖおよび５Ｖのアミノ酸配列および核酸配列を示す（配列番号９、１０、１１および１２）。 図１０ａは、ライブラリーの作製に用いられるプライマー配列を示す。 図１０ｂは、ＣＤＲ１の多様性に由来するオリゴヌクレオチドを示す。 図１１は、２Ｖおよび５Ｖのライブラリーフレームワークの組み合わせを示す。フレームワーク：６７／８９＝７５．３％。最大多様性（ＣＤＲ１およびＣＤＲ３）：６７／１１１＝６０％。 図１２は、抗ｍＩＣＯＳＬ抗原特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲ）のアミノ酸配列を示す。 図１３は、抗ｍＤＬＬ４抗原特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲ）のアミノ酸配列を示す。 図１３は、抗ｍＤＬＬ４抗原特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲ）のアミノ酸配列を示す。 図１３は、抗ｍＤＬＬ４抗原特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲ）のアミノ酸配列を示す。 図１３は、抗ｍＤＬＬ４抗原特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲ）のアミノ酸配列を示す。 図１３は、抗ｍＤＬＬ４抗原特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲ）のアミノ酸配列を示す。 図１４は、抗ＨＳＡ抗原特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲ）のアミノ酸配列を示す。 図１５ａは、抗ｈＲＡＧＥ抗原特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲ）のアミノ酸配列を示す。 図１５ｂは、抗ＴＮＦ−α抗原特異的結合分子（ＶＮＡＲ）のアミノ酸配列を示す。 ＥＬＳＳ１のスクリーニングに用いられた３つの標的に対する主要なクローンのアラインメントを示す。陰影のないアミノ酸は、両フレームワーク間で保存されているため、ライブラリーを通じて規格化されている。ハイライト領域は、５Ｖおよび／または２Ｖ配列から、選択されたクローンが寄与を有するか否かに依存して誘導される差異のある箇所である。 図１７は、本発明の抗原特異的抗原結合分子における、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ドメインのアミノ酸配列。 図１７は、本発明の抗原特異的抗原結合分子における、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ドメインのアミノ酸配列。 図１７は、本発明の抗原特異的抗原結合分子における、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ドメインのアミノ酸配列。 図１７は、本発明の抗原特異的抗原結合分子における、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ドメインのアミノ酸配列。 図１７は、本発明の抗原特異的抗原結合分子における、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ドメインのアミノ酸配列。 図１８は、ＩＩＩｂ型アブラツノザメＶＮＡＲ ５Ｖ、ＩＩｂ型アブラツノザメＶＮＡＲ、２ＶおよびＩＩ型コモリザメＶＮＡＲ Ｅ９を用いたＥＬＳＳ２についてのライブラリー設計図を示す。５Ｖおよび２Ｖは、ＥＬＳＳ１に用いられる同一のＶＮＡＲドメインであり、ＶＮＡＲドメインＥ９は、免疫コモリザメライブラリーから単離された。 図１９は、ビオチン化ＩＣＯＳＬに対する選択後にＥＬＳＳ２から単離されたファージポジティブヒットを示す。 図２０は、ＥＬＳＳ２から単離されたＩＣＯＳＬポジティブなＶＮＡＲクローンの配列を示す。ポジティブヒットは、図示するように、全異種間およびアイソタイプフレームワーク融合物間であった。

本発明の第一の側面によれば、
（１）板鰓亜綱（Elasmobranchii subclass）の種のメンバーからＲＮＡを単離し；
（２）抗原特異的抗原結合分子をコードする上記（１）で得られたＲＮＡからＤＮＡ配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列のデータベースを作成し；
（３）上記（２）で作成されたデータベースからＤＮＡ配列を選択し；
（４）上記（３）において選択された配列内のＣＤＲ１またはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の２以上の隣接するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成し、この際前記２以上の隣接するペプチドドメインは、ライゲートされた際に、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、および前記２以上の隣接するペプチドドメインは、上記（３）において選択される少なくとも２つの異種のＤＮＡ配列由来である；
（５）前記２以上の隣接するペプチドドメインをコードする増幅されたＤＮＡ配列をライゲーションして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成し；
（６）上記（３）で得られた増幅されたＤＮＡのディスプレイベクターにクローニングし；および
（７）前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製する、
ことを含む、下記式（Ｉ）で表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子のライブラリーの作製方法が提供される。

本発明の方法において、ＲＮＡは、板鰓亜綱（Elasmobranchii subclass）内の１種または複数種の異なるメンバーから単離されてもよい。ゆえに、「板鰓亜綱のメンバー」との語は、「板鰓亜綱の１種以上の異なるメンバー」との語を含む。ゆえに、本発明の第一側面のステップ（１）は、板鰓亜綱の１種以上のメンバーから単離されたＲＮＡを含む。

板鰓亜綱は、軟骨魚綱のサブクラスであり、軟骨魚類、サメ、エイ、ギンガエイ等を含む。このサブクラスのメンバーは、メジロザメ目、ネコザメ目、カグラザメ目、ネズミザメ目、テンジクザメ目、ノコギリエイ目、エイ目、ツノザメ目、カスザメ目、シビレエイ目の１１目にさらに細分化される。その後、各目は、いくつかの科に細分化されうる。例えば、本発明の方法は、テンジクザメ目テンジクザメ科のコモリザメ（Ginglymostoma cirratum）およびツノザメ目ツノザメ科のアブラツノザメ（Squalus acanthias）の２種に関する。

ゆえに、本発明の方法においては、２、３、４、５、６、７または８ペプチドドメインについて、ライゲートされた際にＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４として表される式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードするのに用いることが可能である。

ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の２以上の隣接するペプチドドメインは、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３ａ、ＨＶ４、ＦＷ３、ＣＤＲ３およびＦＷ４ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択することができる。これらは、２、３、４または５ペプチドドメインでもよい。

ライゲートされた際に式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードするＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の隣接するペプチドドメインについて、可能性のある組み合わせは、式（ＩＩＩ）により定義することができる。

ここで、Ｐ−Ｑ−Ｒは、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４であり、Ｐ、ＱおよびＲはそれぞれ、隣接するペプチドドメインを表しており、ＱおよびＲは非存在であってもよい。一緒にライゲートした際に式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする隣接するペプチドドメインの制限されない例としては、下表の通りである。

一緒にライゲートした際に式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする隣接するペプチドドメインの他のフラグメントは、式（Ｉ）で定義されるペプチドドメイン配列を適宜別の方法で分けることで調製することができる。

各フレームワーク（ＦＷ）領域が別個のフラグメントである場合、４または５未満のペプチドドメインを潜在的に作製してもよい。この場合において、式（ＩＩＩ）は以下の通り示される：

４つの別個のペプチドドメインであり、Ｐ−Ｑ−Ｒ−ＳはＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４であり、各Ｐ、Ｑ、ＲおよびＳは隣接するペプチドドメインである；または

前記は５つの別個のペプチドドメインであり、Ｐ−Ｑ−Ｒ−Ｓ−ＴはＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４であり、各Ｐ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴは隣接するペプチドドメインを表す。

これらの代替的な態様である隣接するペプチドドメインの例を、下表に示す：

本発明のこの側面の一態様において、２以上の隣接するペプチドドメインは、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４およびＦＷ１、ならびにＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂおよびＣＤＲ３−ＦＷ４で表される３つのドメインである。

本発明のこの態様において、ステップ（４）は、（４）上記（３）において選択された配列内のＣＤＲ１またはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、上記（３）で選択された少なくとも２つの異種のＤＮＡ配列由来であるＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４およびＣＤＲ３−ＦＷ４の２以上の隣接するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅して、ＦＷ１、ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成することとして定義してもよい。その結果として、本発明のこの態様に係るステップ（５）は、ペプチドドメインＦＷ１、ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４をコードする前記増幅されたＤＮＡ配列をライゲーションして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成することとして定義してもよい。

本発明の一態様において、テンプレート由来のＨＶ２ループおよびＨＶ４ループは、文脈によっては、テンプレート由来ＨＶ２およびＨＶ４と各由来のＦＷ１ならびにＣＤＲ１およびＣＤＲ３フラグメントとの対形成をコードするＰＣＲフラグメントを代替的にスプライシングすることを通じて得てもよい。

本発明の第一の側面の方法のステップ（３）に係る、ステップ（２）で作製されたデータベースからのＤＮＡ配列の選択は、調製したＤＮＡ配列に対する発現したアミノ酸配列の分析に基づいてなされてもよい。翻訳されたＤＮＡ配列は、ＣＤＲ３の長さ分布に加え、分析集団にわたるアミノ酸（ＡＡ）含量、相対的な位置保存および頻度を単位として試験してもよい。

ライブラリーから発現された配列と比較した天然配列のデータベースにおける発現されたＤＮＡ配列の分析から、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３のいずれかの天然含量の程度（the degree of natural content）ならびにＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３に存在する相対的な多様性に基づいてもＤＮＡを選択することが可能である。

天然配列含量（natural sequence content）は、対応する天然に発現したＶＮＡＲ配列と比較して、少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％、例えば、約８０％〜約９５％、または約８５％〜約９０％の配列同一性として定義される。高度の多様性は、約６０％〜約７５％、好ましくは約６５％〜約７０％の配列同一性として定義され、ここで対応する天然に発現したＶＮＡＲ配列と比較して約６０％〜約６５％である多様性が好ましいであろう。

例えば、ＣＤＲ１の天然バージョンおよびＣＤＲ３についての高度の多様性を有することが望ましい。システイン残基の添加は、ＤＮＡ増幅プロセスにおいてＴＲＭオリゴヌクレオチドを用いることで得ることができる。

ゆえに、本発明の抗原特異的抗原結合分子は、（ここで定義されているように）基本構造によってここで開示されている多様な領域のアミノ酸配列のいずれかによって構築される。

ここで、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３ａ、ＨＶ４、ＦＷ３ｂ、ＣＤＲ３およびＦＷ４はそれぞれペプチド配列を表し、“ＦＷ”は“フレームワーク”領域であり、“ＣＤＲ１”は“相補性決定領域１”であり、“ＨＶ”は“超可変領域”であり、“ＣＤＲ３”は“相補性決定領域３”である。好ましいペプチドドメイン配列の例はここで示されている。

本発明の特異的抗原結合分子は、Ｌｉｕら（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，１７７５−１７８３（２００７）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７（７８）ｄｏｉ：１０．１ １８６／１４７２−６７５０−７−７８（２００７））によるＶＮＡＲの命名法の一般的な構造に従って分類されてもよい。

本発明の一態様において、ステップ（４）におけるＤＮＡの増幅は、システインを除くいずれかのアミノ酸配列をコードするオリゴマーの存在下で実行される。言い換えれば、増幅されたＤＮＡによってコードされる得られるＣＤＲ領域は、システインを含まない。しかしながら、他の実施態様において、システインはＣＤＲ領域内に存在していてもよい。

全てのＶＮＡＲは、ＦＷ１およびＦＷ３において古典的な免疫グロブリン（Ｉｇ）の折り畳みを生む２つのカノニカルなシステイン残基を含む。加えて、ＣＤＲおよびＦＷにおいて余分なシステイン（ｃｙｓ）残基の付加によってこれらは特徴づけられる。

Ｉ型：ＣＤＲ３内の２つの余分なｃｙｓに加えて、ＦＷ２およびＦＷ４における非カノニカルなｃｙｓ残基−ＦＷ−ＣＤＲ３対形成は、強固に拘束されたＣＤＲ３構造を形成する。

ＩＩ型：ＣＤＲ３を突出した位置にもたらすジスルフィド架橋を生むＣＤＲ１およびＣＤＲ３における非カノニカルなｃｙｓ残基。

ＩＩＩ型：ＩＩ型のように非カノニカルなｃｙｓ残基だが、ＣＤＲ１内に保存されたＷを含む。

上記全ては、テンジクザメの命名法に基づく。本発明において、他の新たなアイソタイプは単離されており、以下“ｂ型”変異体として記述される。

ＩＩｂ型：非常にフレキシブルなＣＤＲ３をもたらすＣＤＲ１およびＣＤＲ３における非カノニカルなｃｙｓ残基が無い（２ＶはＩＩｂ型変異体の例である）。

ＩＩＩｂ型：ＣＤＲ１およびＣＤＲ３において非カノニカルなｃｙｓ残基は無いが、ＣＤＲ１内に不変のＷを有する（５ＶはＩＩＩｂ型変異体の例である）。

ＣＤＲ１およびＣＤＲ３内には、よりフレキシブルなＣＤＲ３領域を提供しうる非カノニカルなシステイン（Ｃ）残基が無いようにすることが望ましいであろう。かような構造は“ＩＩｂ型”アイソタイプを意味してもよく、Ｌｉｕら（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，１７７５−１７８３（２００７）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７（７８）ｄｏｉ：１０．１ １８６／１４７２−６７５０−７−７８（２００７））によるＶＮＡＲのテンジクザメ命名法の一般的な構造に倣う。

代わりの態様において、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３において非カノニカルなシステイン（Ｃ）残基が無いようにし、しかしＣＤＲ１内に不変のトリプトファン（Ｗ）を有することが望ましいであろう。

かような構造は、“ＩＩＩｂ型”アイソタイプを意味してもよく、ＶＮＡＲのテンジクザメ命名法の一般的な構造に倣う。

本発明の一態様において、抗原特異的抗原結合分子は、ＩＩｂ型およびＩＩＩｂ型のＶＮＡＲに由来するＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３ａ、ＨＶ４、ＦＷ３ｂ、ＣＤＲ３および／またはＦＷ４の融合物であってもよい。ＶＮＡＲ構造を形成するために、融合したＩＩｂ部分およびＩＩＩｂ部分は、適切なようにどちらの順で連結してもよい。

本発明の一態様において、選択されたＤＮＡ配列は、ドメインＦＷ３ｂにおいてＣＫＡ、ＣＲＡまたはＣＮＡのような最後の３つのアミノ酸残基、ＹまたはＤＩＧまたはＤＩＤまたはＡのようなＦＷ４の最初の３つのアミノ酸残基を有してもよい。他のＦＷ３ｂ配列は、ＣＲＧ、ＣＫＶ、ＣＫＴおよび／またはＣＨＴ変異体を含んでもよい。

他の代替的なアイソタイプの融合物は、本実施例に従って作製してもよい。例えば、Ｉ型ＶＮＡＲ由来の領域はＩＩＩ型ＶＮＡＲと融合してもよく、Ｉ型ＶＮＡＲ由来の領域はＩＩ型ＶＮＡＲと融合してもよい。本発明で記載されているように、Ｉｂ型、ＩＩｂ型およびＩＩＩｂ型のＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型アイソタイプ領域の変化も含まれる。融合物は、ＶＮＡＲファミリーにわたるいかなるアイソタイプ融合物、すなわち、板鰓亜綱のいかなる種から単離されたアイソタイプ領域を含むことができる。例えば、小型ザメ由来のＩＩ型領域と融合したテンジクザメ由来のＩＩ型領域、または小型ザメ由来のＩＩＩｂ型と融合したテンジクザメ由来のＩＩｂ型である。

本発明によれば、ライブラリーは、同一種内の異なるアイソタイプおよび異なる板鰓亜綱種にわたる異なるアイソタイプ由来の２以上の天然由来のＶＮＡＲ配列から作られてもよい。異なるアイソタイプおよび異種フレームワークを一緒に融合させるこのアプローチは、単一のフレームワークのライブラリーを用いては得られないであろう、ライブラリー内の多様性の増加を生み出す利点を有する。

本発明の一態様において、板鰓亜綱の２つの異種（アブラツノザメおよびコモリザメ）に由来するＶＮＡＲドメインの３つの異なるアイソタイプが組み合わされる。フレームワーク融合構築物は、アブラツノザメ由来のＩＩｂ型またはＩＩＩｂ型のＶＮＡＲドメインおよびコモリザメ由来のＩＩ型ＶＮＡＲドメインを合体するために設計された。

本発明のさらなる態様は、古典的なＩＩ型ＶＮＡＲドメインにおいて見られる、ＣＤＲ１からＣＤＲ３へのジスルフィド架橋の可能性を生み出すことにより多様性を増加させる、ＣＤＲ領域へのシステイン（ｃｙｓ）残基の組み込みである。

本発明の他の態様において、ステップ（１）の板鰓亜綱の種のメンバーからのＲＮＡの単離は、以前に免疫されていない対象、すなわちフレームワーク材料のナイーブなまたは天然の資源からＲＮＡを単離してもよい。他の態様において、ＲＮＡは以前に免疫された対象から調達することができる。

本発明の第二の側面によれば、
（１）本発明の第一の側面に従って作製されたライブラリーから所望のクローンを選択し；
（２）前記クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製し；
（３）前記抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし；および
（４）宿主を形質転換して、前記発現ベクターを発現させる、
ことを含む、抗原特異的抗原結合分子の製造方法が提供される。

本発明の第三の側面によれば、
（１）板鰓亜綱（Elasmobranchii subclass）の種メンバーからＲＮＡを単離し；
（２）抗原特異的抗原結合分子をコードする上記（１）で得られたＲＮＡからＤＮＡ配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列のデータベースを作成し；
（３）上記（２）で作成されたデータベースからのＤＮＡ配列を選択し；
（４）上記（３）において選択された配列内のＣＤＲ１またはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の２以上の隣接するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成し、この際前記２以上の隣接するペプチドドメインは、ライゲートされた際に、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、および前記２以上の隣接するペプチドドメインは、上記（３）において選択される少なくとも２つの異種のＤＮＡ配列由来である；
（５）ペプチドドメインＦＷ１、ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４をコードする増幅されたＤＮＡ配列をライゲーションして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成し；
（６）上記（５）で得られた増幅されたＤＮＡのディスプレイベクターにクローニングし；および
（７）前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製し、
（８）前記ライブラリーから所望のクローンを選択し；
（９）前記クローンから抗原特異的抗原結合分子の単離および精製し；
（１０）前記抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし；および
（１１）宿主を形質転換して、前記発現ベクターを発現させる
ことを含む、下記式（Ｉ）で表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子の製造方法が提供される。

本発明の方法において、ＲＮＡは板鰓亜綱の１つのメンバーまたは複数の異なるメンバーから単離されうる。ゆえに、板鰓亜綱の種のメンバーとの語は、板鰓亜綱の１以上の異なるメンバーとの語も含む。ゆえに、本発明の第三の側面のステップ（１）は、板鰓亜綱の種のメンバーからのＲＮＡの単離も含む。

記載のように、ステップ（３）におけるＤＮＡ配列の選択は、本発明の第一の側面に関連する。ゆえに、本発明のこの側面は、複数のかような分子の産生を含む。

記載のように、ステップ（４）におけるＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の隣接するペプチドドメインの組み合わせは、本発明の第一の側面に関連する。本発明のこの側面の一態様によるステップ（４）は、上記（３）において選択された配列におけるＣＤＲ１またはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマー存在下で、（３）で選択された少なくとも２つの異種ＤＮＡ配列由来であるペプチドドメインＦＷ１、ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂおよびＣＤＲ３−ＦＷ４をコードするＤＮＡ配列を増幅して、ペプチドドメインＦＷ１、ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成することとして定義してもよい。本発明のこの態様に係るステップ（５）は、ペプチドドメインＦＷ１、ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４をコードする前記増幅されたＤＮＡ配列を一緒にライゲーションして、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成することとして定義することができる。

本発明の他の態様において、ステップ（１）の板鰓亜綱の種のメンバーからのＲＮＡの単離は、以前に免疫されていない対象、すなわちフレームワーク材料のナイーブまたは天然の資源からＲＮＡを単離してもよい。他の態様において、ＲＮＡは以前免疫された対象から調達することができる。

本発明の一態様において、ステップ（４）におけるＤＮＡの増幅は、システインを除くいずれかのアミノ酸の配列をコードするオリゴマー存在下で実行される。言い換えれば、増幅されたＤＮＡによってコードされる得られるＣＤＲ領域は、システインを含まない。しかしながら、他の態様において、システインはＣＤＲ領域に存在していてもよい。

本発明の第四の側面によれば、複数の抗原特異的抗原結合分子をコードする発現可能なＤＮＡ配列のライブラリーを含む形質転換宿主を用いた抗原特異的抗原結合分子の製造方法が提供される。ここで、ライブラリーは、少なくとも２つの異種のアイソタイプＮＡＲ配列から作製され、抗原特異的抗原結合分子は、板鰓亜綱の種のメンバーにおいて発見される免疫グロブリンアイソタイプＮＡＲの可変領域のドメインを複数有する。

本発明の他の態様において、ステップ（１）の板鰓亜綱の種のメンバーからのＲＮＡの単離は、以前に免疫されていない対象、すなわちフレームワーク材料のナイーブなまたは天然の資源からＲＮＡを単離してもよい。他の態様において、ＲＮＡは以前に免疫されていない対象から調達することができる。

本発明の一態様において、ステップ（４）におけるＤＮＡの増幅は、システインを除くいずれかのアミノ酸の配列をコードするオリゴマー存在下で実行される。言い換えれば、得られる増幅されるＤＮＡによってコードされるＣＤＲ領域は、システインを含まない。しかしながら、他の態様において、システインはＣＤＲ領域において存在してもよい。

本発明の第五の側面によれば、式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列：

上記式（ＩＩ）中、
Ａは、配列番号１、配列番号４または配列番号７であり、
Ｘは、５、６または７アミノ酸残基を有するＣＤＲ１領域であり、
Ｂは、配列番号２、配列番号５または配列番号８であり、
Ｙは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７アミノ酸残基を有するＣＤＲ３領域であり、
Ｃは、配列番号３または配列番号６であり、
または、これと少なくとも５０％相同である配列、
この際、配列番号１は、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴまたはＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＷＴＧＡであり、
配列番号２は、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号３は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号４は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴまたはＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡであり、
配列番号５は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号６は、ＹＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号７は、ＡＲＶＤＱＴＰＱＴＩＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤであり、および
配列番号８は、ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡまたはＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡである、
を有する抗原特異的抗原結合分子が提供される。

Ａ、Ｘ、Ｂ、Ｙおよび／またはＣで表わされるアミノ酸配列は、板鰓亜綱内の同一のまたは異なるメンバーに由来してもよい。Ａ、Ｘ、Ｂ、Ｙおよび／またはＣで表されるアミノ酸配列は、ＶＮＡＲ配列の同一のまたは異なるアイソタイプ、すなわちＩ型、ＩＩ型および／またはＩＩＩ型（Ｉｂ型、ＩＩｂ型およびＩＩＩｂ型を含む）に由来してもよい。資源材料の一般的に好ましい組み合わせのいずれについても可能である。

本発明のある態様において、式（ＩＩ）Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃは、Ａ、ＢおよびＣが（ｉ）配列番号１、２および３；（ｉｉ）配列番号１、２および６；（ｉｉｉ）配列番号１、５および３；（ｉｖ）配列番号１、５および６；（ｖ）配列番号４、５および６；（ｖｉ）配列番号４、５および３；（ｖｉｉ）配列番号４、２および６；（ｖｉｉｉ）配列番号４、２および３；（ｉｘ）配列番号７、８および６；（ｘ）配列番号１、８および６で表される配列で構成されてもよい。

ここで、Ａは配列番号１であり、Ｂは配列番号２であり、Ｃは配列番号３であり、式（Ｉ）の配列の一態様は、図９に示すように、配列番号１０であり、ここでＣＤＲ１領域はＳＹＧＬＹＳであり、ＣＤＲ３領域はＱＳＬＡＩＳＴＲＳＹＷＹである。

ここで、Ａは配列番号４であり、Ｂは配列番号５であり、Ｃは配列番号６であり、式（Ｉ）の配列の一態様は、図９に示すように、配列番号１２であり、ここでＣＤＲ１領域はＳＹＡＷＳＳであり、ＣＤＲ３領域はＹＲＭＥＳＩＡＧＲＧＹＤＶである。

配列番号１０および１２は、図９に示されており、タンパク質配列をコードする対応する核酸配列についても、それぞれ配列番号９および１１として示されている。

ＣＤＲ１領域は、図１７に示されるいずれのＣＤＲ１領域でもよい。ＣＤＲ３領域は、図１８で示されるいずれのＣＤＲ３領域でもよい。

本発明の好ましい抗原特異的抗原結合分子（ペプチド）および本発明のライブラリーの作製に用いられる核酸プライマーの配列は、図９〜１８に示されている。

本発明の一態様において、図面で示される本発明の抗原特異的抗原結合分子の配列で表されるように、フレームワーク領域は、図１１に示される配列とともに、および配列番号９、１０、１１および１２として、フレームワーク領域は２Ｖおよび５Ｖとして設計されるクローンに由来してもよい。（および配列番号１〜８に対して記載されてもよい。）
本発明のこの側面の一態様において、式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列：

上記式（ＩＩ）中、
Ａは、配列番号１、配列番号４または配列番号７であり、
Ｘは、５、６または７アミノ酸残基を有するＣＤＲ１領域であり、
Ｂは、配列番号２、配列番号５または配列番号８であり、
Ｙは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７アミノ酸残基を有するＣＤＲ３領域であり、
Ｃは、配列番号３または配列番号６であり、
または、これと少なくとも５０％相同である配列、
この際、配列番号１は、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴまたはＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＷＴＧＡであり、
配列番号２は、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号３は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号４は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴまたはＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡであり、
配列番号５は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号６は、ＹＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
を有する抗原特異的抗原結合分子が提供される。

Ａ、Ｘ、Ｂ、Ｙおよび／またはＣで表わされるアミノ酸配列は、板鰓亜綱の同一のまたは異なるメンバーに由来してもよい。Ａ、Ｘ、Ｂ、Ｙおよび／またはＣで表されるアミノ酸配列は、ＶＮＡＲ配列の同一のまたは異なるアイソタイプ、すなわちＩ型、ＩＩ型および／またはＩＩＩ型（Ｉｂ型、ＩＩｂ型およびＩＩＩｂ型を含む）に由来してもよい。資源材料の一般的に好ましい組み合わせのいずれも可能である。

本発明のある態様において、式（ＩＩ）Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃは、Ａ、ＢおよびＣが（ｉ）配列番号１、２および３；（ｉｉ）配列番号１、２および６；（ｉｉｉ）配列番号１、５および３；（ｉｖ）配列番号１、５および６；（ｖ）配列番号４、５および６；（ｖｉ）配列番号４、５および３；（ｖｉｉ）配列番号４、２および６；（ｖｉｉｉ）配列番号４、２および３で表される配列で構成されてもよい。

本発明の方法において、以前に免疫されていない板鰓亜綱の種のメンバー、“ナイーブな”対象からＲＮＡは単離される。板鰓亜綱は、サメ、ガンギエイおよびエイを含む軟骨魚綱のサブクラスである。一般的に好ましい例は、アブラツノザメ等のツノザメ目およびコモリザメ等のテンジクザメ目のサメを含む。

ＲＮＡは、全血を含む組織サンプルから、ここで記載するような標準的な分子生物学的技術を用いて単離されうる。

ライブラリーの構築に先立ち、組織サンプルにおける全ての天然の抗原特異的抗原結合分子（免疫グロブリンアイソトープ新規抗原受容体またはＩｇＮＡＲ）転写物を代表するレパートリーを増幅するプライマーの設計を目的として、網羅的なｃＤＮＡ配列データベースが作製されうる。ライブラリーの一例として、ファージディスプレイライブラリーがある。

データベースは、抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列の増幅により作製されうる。好ましくは、この方法は、縮重ＰＣＲに始まり、“ＲＡＣＥ”（Rapid Amplification of cDNA Ends）に用いられる３’ＲＡＣＥプライマーを設計する部分配列を得るまでの一連のステップを含む。縮重ＰＣＲをコードするＩｇＮＡＲを単離することは、公知のコモリザメＩｇＮＡＲ配列または他のサメ種に基づきプライマーを用いて実行されうる。これらより、定常ドメインは単離され、配列決定されうる。その結果、可変領域を通じてリーダーから定常ドメインまでの完全長ＩｇＮＡＲ配列を完成するための５’ＲＡＣＥプライマーの設計につながる。

抽出されたＲＮＡは、ｃＤＮＡを産生するために逆転写されうる。アブラツノザメ組織由来のｃＤＮＡ合成は、定常ドメイン１のプライマーによって産生されうる。

天然の免疫グロブリンアイソトープの新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）は、１つの単一可変ドメイン（ＶＮＡＲ）および５つの定常ドメイン（ＣＮＡＲ）で構成されるホモ２量体重鎖複合体である。上記の縮重ＰＣＲ技術により得られるＩｇＮＡＲ配列を分析し、ＩｇＮＡＲ転写物の３’末端（３’ＲＡＣＥ）の増幅に用いるために多重プライマーを設計してもよい。全ＲＮＡを単離し、３’ＲＡＣＥを実行してもよい。全ＲＮＡを単離し、第１のｃＤＮＡ鎖が適切なプライマーを用いて全ＲＮＡから合成してもよい。第１のｃＤＮＡ鎖は、ＰＣＲ増幅に用いられる。ＰＣＲ産物は、ベクターまたはクローン化したＴＡにクローニングしてもよい。その後、ＰＣＲ産物を含むクローンを配列決定してもよい。

ｃＤＮＡをコードする新規抗原受容体（ＮＡＲ）は、膜貫通型の特異的プライマーを用いて、以下のとおり単離してもよい。上記のようにＲＮＡをアブラツノザメ組織から抽出し、逆転写してもよい。縮重３’ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ、ユニバーサルプライマーおよびアブラツノザメＩｇＮＡＲ特異的プライマーによって、１回目のＰＣＲを実行してもよい。得られるＰＣＲ産物をベクターにクローニングし、配列決定してもよい。

５’非翻訳領域、スプライスリーダー、可変ドメインおよび部分的定常ドメインをコードするＮＡＲ ｃＤＮＡクローンは、以下のとおり得てもよい。保存領域を特定するために、各種について（上記のように３’ＲＡＣＥから単離された）定常ドメインをコードするヌクレオチド配列を分析してもよい。

以下のとおり、プライマーを同一性の高いこれらの領域内で設計し、配列をコードするＮＡＲの５’ＲＡＣＥ増幅のために用いてもよい。５’ＲＡＣＥシステムを用いて、ｃＤＮＡ末端の増幅を得てもよい。組織および遺伝子特異的プライマーを用いて合成した第１鎖ｃＤＮＡから全ＲＮＡを抽出した後、オリゴｄＣテールにライゲーションしてもよい。ｄＣテール化ｃＤＮＡは、遺伝子特異的プライマーと組み合わせてＰＣＲ増幅に用いてもよい。合致するサイズの増幅産物を精製し、ＴＡにクローニングするか、代わりにベクターにクローニングしてもよい。その後、ＰＣＲ産物を含むクローンを配列決定してもよい。

以下のとおり、スプライスリーダー領域、可変ドメインおよび部分的定常ドメイン１をコードするＮＡＲ ｃＤＮＡクローンをＰＣＲ増幅により得てもよい。上記のように、５’ＲＡＣＥで得られる配列を分析し、スプライスリーダー配列を特定してもよい。ヌクレオチド配列を整列し、高ヌクレオチド同一性の領域においてプライマーを設計してもよい（指定のフォワードプライマー）。同様に、３’ＲＡＣＥで得られる配列を分析し、定常ドメインにおける高ヌクレオチド同一性の領域を特定し、プライマーを設計してもよい（指定のリバースプライマー）。以下のように、ＮＡＲ ｃＤＮＡクローンを得るためのＰＣＲ増幅は、これらのフォワードおよびリバースプライマーを用いて実行してもよい。

上記のとおり、ＲＮＡを多重のアブラツノザメ組織から抽出してもよい。第１のｃＤＮＡ鎖は、全ＲＮＡおよびオリゴｄＴプライマーから合成してもよい。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、このｃＤＮＡから用いてＮＡＲ特異的クローンをＰＣＲ増幅するのに用いてもよい。合致するサイズの増幅産物を精製し、ＴＡにクローンするかあるいはベクターにクローニングし、配列決定してもよい。

アブラツノザメＩｇＮＡＲ配列を特定および特徴づけるために、バイオインフォマティック分析を行ってもよい。上記のように、ＮＡＲをコードするクローンの大ライブラリーを構築するために、オープンリーディングフレームの特定および単離されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列分析は、各種のＮＡＲ特異的プライマーの設計を可能にしうる。アブラツノザメ由来のＩｇＮＡＲ配列を定義するために、コモリザメＩｇＮＡＲタンパク質配列はテンプレートとして供してもよい。連続して、多重配列アラインメントを生み出すために、いくつかの種のアブラツノザメ（spiny）ＩｇＮＡＲ配列を選択してもよい。各ＩｇＮＡＲ ｃＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームを特定してアミノ酸配列に翻訳してもよい。その後、ＩｇＮＡＲアミノ酸配列を整理して公知のコモリザメＩｇＮＡＲ遺伝子構造と比較し、ＩｇＮＡＲドメイン（ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３Ａ、ＨＶ４、ＦＷ３Ｂ、ＣＤＲ３およびＦＷ４）を特定してもよい。

本発明の一態様において、クローン２Ｖおよび５Ｖ（図９に示す配列）をディスプレイベクター（例えば、ファージディスプレイベクター）にクローニングし、ライブラリーテンプレートとして用いてもよい。好ましくは、選択されたテンプレートは高水準のバクテリア発現を示す。

ここで記載されるように、ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡを用いて包括的な‘天然の’アブラツノザメＶＮＡＲアミノ酸（ＡＡ）配列データベースを作製してもよく、これは異なるアブラツノザメ動物および組織タイプの範囲に由来する完全長のユニークなｃＤＮＡ ＶＮＡＲクローンを含む。コンパイルされた翻訳されたＶＮＡＲドメインは、ＣＤＲ３の長さ分布に加え、分析集団を通じ、アミノ酸（ＡＡ）含量、相対的な位置保存および頻度について試験されうる。ゆえに、この分析は人工的なライブラリーデザインを導く。

ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループを起点とすることで、これらのループ、隣接するフレームワーク残基ならびにループ長さの範囲および分布を通じて含量を調べるのに便利である。データベース内の配列は、長さ（ｎ＞１００）プールに従って、ユニークなクローンとして分類してもよい。アブラツノザメＣＤＲ３の平均長さ（１３±２アミノ酸）に対応するように、ＣＤＲ３ループの全長が１〜１６アミノ酸の範囲にあるものに焦点を当ててもよい。

本発明の二重テンプレートの設計によれば、ＣＤＲ３のすぐ隣にあるＦＷ２ａポジション−３、−２および−１を調節し、人工ライブラリーにおいてＣＫＡモチーフまたはＣＲＡモチーフのいずれかを表すことが可能である。このアプローチは、データベースにおいて発見される‘天然の’アミノ酸（ＡＡ）配列多様性の７６％に達する表現を許容するであろう。配列データベースにおいてＣＤＲ３のすぐ後にある第１の３つのＦＷ４残基は、少ないＹＧＡでＤＧＡモチーフを含むであろう。

ＣＤＲ３ループ自体において、特異的な連結またはＪ遺伝子セグメントの使用は、Ｃ末端のＣＤＲ３末端における特定の残基（特に、最後から２番目および最後の残基）についてバイアスを誘導しうる。

特異的な変異原性オリゴヌクレオチドを用いたプラスミド由来の２Ｖおよび５Ｖ配列以外の代表的なテンプレート領域のＰＣＲは、ＰＣＲ増幅により行ってもよい。３つの初期ＰＣＲ産物セット（ＦＷ１、ＣＤＲ１−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４でそれぞれ構成されるフラグメント）に由来する各ＰＣＲ産物をマスターミックスとして混合し、続いてスプライスバイオーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲにより連結してもよい。

ＳＯＥ−ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼで切断し、同様に切断したベクターとライゲーションしてもよい。４つのテンプレートが誘導する可変のサブライブラリーをＳＯＥ−ＰＣＲにより構築し、これらの構築に用いられるＣＤＲ１−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４フラグメントの起源に基づいてプール（pool）を定義してもよい。

全てのプールに対し、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループにおける付加されたオリゴヌクレオチド指向の人工多様性とともに、両テンプレートから誘導される等量のＦＷ１フラグメントが含まれてもよい。その後、適切な挿入部を含むライゲーションされたベクターで宿主細胞を形質転換してもよい。サブライブラリーの構築において、３セットの初期ＰＣＲ産物が各オリジナルテンプレートから産生することが好ましく、ここでテンプレートは、フレームワーク１（ＦＷ１）、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３をほぼ含む３つの別個の領域に分けられる。定義されたＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループ領域は、テンプレート特異的なトリヌクレオチド（ＴＲＭ）オリゴマーを用いて変異させてもよい。ＴＲＭオリゴヌクレオチドは、意図的に除外されたシステインを除き、特定の位置においてランダムにいかなる（ＡＡ）を組み込むために設計してもよい。ＴＲＭオリゴに加え、変異を組み込むために、さらなるテンプレート特異的ＣＤＲ１標的オリゴ（例えば、１、２または３）を用いてもよい。

設計された内容について、‘天然の’アブラツノザメ（spiny）ＶＮＡＲドメイン配列の分析を用いて決定し、定義された縮退コドンおよび直接的な相同コドンとともにオリゴヌクレオチドを用いてライブラリーに組み込んでもよい。

上記のように、本発明は、（２つ以上の天然由来のＶＮＡＲ配列から作製される）改良されたＶＮＡＲの人工ライブラリーおよびその製造方法を提供する。アブラツノザメのＶＮＡＲレパートリーの拡張配列分析から、原核細胞系において高い発現水準を示す２つのクローンを結晶化し、これらのライブラリーの標準として用いた。ＥＬＳＳライブラリーは、同じ板鰓亜綱種であるアブラツノザメに由来する２つの異なるＶＮＡＲアイソタイプ（ＩＩｂ型およびＩＩＩｂ型）フレームワークで構成され、これは、図４に示すようなＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４およびＣＤＲ３領域における多様性に加え、フレームワーク（ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂおよびＦＷ４）を通じて多様性を生み出すために結合される。ＥＬＳＳ２は、図１８に示すように板鰓亜綱の第２の種であるコモリザメに由来する第２のＶＮＡＲアイソタイプ（ＩＩ型）のフレームワークを組み込むことにより増加したフレームワーク多様性の創成を築く。

フレームワーク領域における多様性を生み出すためのオーバーラップＰＣＲを用いた新規のアプローチは良好に行われ、２Ｖ／５Ｖまたは２Ｖ／５Ｖ／Ｅ９ハイブリッド配列が得られた。所望のアミノ酸型の添加が組み込まれることを確保するために定義されたＴＲＭオリゴ、またはＮＮＫオリゴを用いて、ＣＤＲ３およびＣＤＲ１両領域においてさらなる多様性を組み込んだ。さらに、板鰓亜綱の天然のレパートリーにおいて見られることを示すためにＥＬＳＳ１におけるＣＤＲ１の多様性を設計し、設計されたＣＤＲ３の長さもこれらの動物に由来する配列データベースにおいて特定される天然由来のＣＤＲ３配列に基づいていた。

この設計を用いて、人工のサメ可変ＮＡＲ（ＶＮＡＲ）ドメインライブラリー（ＥＬＳＳ１およびＥＬＳＳ２）を構築し、最大限のレベルの機能的多様性と、以前の人工／半人工ライブラリーレポートの改良とを組み込んだ。これまで報告されたサメＶＮＡＲライブラリーを構築するための試みにおいては、典型的に、免疫組織に由来するように、単離されたＶＮＡＲフレームワーク（ＦＷ）領域１〜３の天然の多様性を利用していた。その後、ＣＤＲ３領域を標的とした合成多様性にかようなフレームワークを結合させ、実際に半人工ライブラリーを作製した。

ＮｕｔｔａｌｌおよびＬｉｕならびに彼らの代表的な共同研究者による２つのさらなる別個の研究においては、ＣＤＲ１−ＣＤＲ３ジスルフィド結合に特徴づけられる以前観察されたＩＩ型ＶＮＡＲ構造（Ｄｉａｚ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００２．５４（７）：ｐ．５０１−１２）を模倣するための試みにおいて、ＶＮＡＲ非カノニカルなシステイン残基は、特に多様なＣＤＲ領域内に導入された。非カノニカルなシステインへの同様のアプローチもまた、Ｓｈａｏライブラリー設計の中核を成し、ここで彼らは、Ｉ型ＶＮＡＲ構造のＦＷ２およびＦＷ４領域において発見されるオリジナルテンプレートの非カノニカルなシステイン残基を保持しようと試みた。これは、人工ＣＤＲ２における相補的なシステイン残基のバイアス化された誘導を通じて行われた。

これらの各設計アプローチは、最終ライブラリーにおいて高水準の非対システイン残基を導き、最終的な人工ライブラリーにおける機能的な内容および多様性を補償するであろうと考えられる。ゆえに、従来の設計とは対照的に、本発明は、非カノニカルなシステイン残基によってもたらされるさらなる構造の複雑性を回避する。アブラツノザメのレパートリー、特に、非カノニカルなシステイン残基を含まないものについて、本発明の方法において模倣した。しかしながら、このアプローチ型において１つ注目すべき例外は、Ｓｈａｏおよび共同研究者によって示された研究である（Ｓｈａｏ，Ｃ．Ｙ．，Ｃ．Ｊ．ＳｅｃｏｍｂｅｓおよびＡ．Ｊ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．４４（４）：ｐ．６５６−６５）。この報告は、完全に合成され、単一のテンプレートドメインフレームワークから誘導され、Ｉ型コモリザメＶＮＡＲドメイン、クローン５Ａ７のＣＤＲ３に導入される完全に人工的な多様性を含む。このクローンは、免疫ライブラリーから歴史的に単離され、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）に特異的である。Ｓｈａｏらは、オリジナルテンプレート結合パートナーであるＨＥＬに対する本質的に高度な交差反応性をもって、単独（solitary）レプチン結合ＶＮＡＲの特定を報告した。

さらに、本発明の区別するライブラリー設計の特徴は、以下を含む。

ライブラリーのサイズ
最終的なＥＬＳＳ１ライブラリーサイズ（＞９×１０^１０）、これは、以前報告されたいかなる（天然、免疫または人工の）サメライブラリーと比べても２桁大きい。

多様性
本発明の人工ＶＮＡＲライブラリーは、システインを付加することなく、ランダム化された各位置で全てのアミノ酸と同等の表現を供するトリヌクレオチド混合物を用いて作製される。ゆえに、本発明の人工ライブラリーはトリヌクレオチドの多様性を提供する。

本発明の人工ライブラリーにおいて仕立てられた多様性は、特異的な配列データベースに基づき、ＶＮＡＲのＣＤＲ１を標的とするトリヌクレオチドおよび‘相同スキャンの（homologue-scanning）’オリゴヌクレオチドの使用を通じて、ＶＮＡＲのＣＤＲ１に導入される。ＣＤＲ１の詳細な試験から、いくつかの重要な位置において、‘天然の’多様性は比較的保存されていることが記された。（特に、第２位（５７％Ｙまたは３３％Ｃ）および第４位（８３％Ｌまたは１３％Ｗ）（Ｋａｂａｔナンバリングスキームを用いた全長ＶＮＡＲ配列の２９位および３１位））。

ＣＤＲ１について、２つの対照的な突然変異アプローチを選択した。ＣＤＲ１の完全ランダム化は、ＣＤＲ３ループにおいて述べたように、カスタムトリヌクレオチド（ＴＲＭ）、混合されたコドンオリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｅｌｉｎｋ）を用いて行った。対照的に、採用した仕立ての（ＡＡ）含量アプローチは、‘天然の’配列分析によって導かれるように、定義されたＣＤＲ１の位置の精緻な調節に関与した。特に、我々は、特定の縮退したおよび‘相同残基の’スキャンコドン（Ｂｏｓｔｒｏｍ，Ｊ． ａｎｄ Ｇ．Ｆｕｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００９．５６２：ｐ．１７−３５；Ｂｏｓｔｒｏｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００９．５２５：ｐ．３５３−７６，ｘｉｉｉ）を用いて、各ＣＤＲ１ポジションに定義された‘天然の’可変性をできるだけ多く組み込むことを目標としている。

上記の理由により、‘天然の’データベースクローンの３３％において第２位でシステインが発見されたという事実にもかかわらず、ＥＥＬＳ１においてシステインの含有は回避された。（ＡＡ）含有量のさらなる関連する仕立てを有する我々の配列データベースにおいて発見されるように、最大限可能な‘天然の’文脈上の多様性を保持することを導入するため、オリゴを設計した。上記のランダムなおよび仕立てられた両ストラテジーにおいて、トリプトファン残基（Ｗ）を保持するか否かにかかわらず、４位の調節が含まれた。少なくとも２Ｖおよび５Ｖ骨格に関連して観察されるように、このＷ側鎖またはＬ側鎖のいずれかの位置で、中心ドメイン核内において（特にフレームワーク残基Ｆ６６と）疎水的な相互作用を形成するものと考えられる。

天然のアブラツノザメＮＡＲにおいて観察されるように、含まれた選択されるＣＤＲ３の長さの変化、８つのランダム化されたＣＤＲ３の長さの合計は、最大頻度長さの多様性の範囲を網羅するために加えられた。

ライブラリー設計
ライブラリー設計アプローチは、構造的に重要と思われるＣＤＲの側面残基（flanking residues）を保持した。かようなモチーフは、ＦＷ３ｂおよびＣＤＲ３のＣ末端が類似する免疫グロブリン（Ｉｇ）可変ドメインの宿主において発見されるもののアナログである。アブラツノザメＶＮＡＲ配列の結晶構造モデルおよびさらなるバイオインフォマティクス分析を用いて、この論理的根拠を支持する観察を促した。２つのオリジナルテンプレートＶＮＡＲドメインおよび（図３に）示されるこれらの代表的な分子モデルを結束する結晶構造を有することで、配列データベースにおいて観察される保存されたＮ末端およびＣ末端のＣＤＲ側面残基を位置づけた。これらのＣＤＲ３への近接および他の類似する可変Ｉｇドメインにおける重要性のため、最後の３つのＦＷ３ｂ残基および最初の２つのＦＷ４残基について特に重要視した。一般的に、この領域における残基は、より保存されると思われる。

フレームワーク融合骨格設計
第１の人工ＶＮＡＲライブラリーは、配列２Ｖおよび５Ｖ（ＩＩｂ型およびＩＩＩｂ型）に基づいて二重の骨格設計を用いて築き、第１のライブラリーは、２つの別個の板鰓亜綱種に由来する２つを超えるＶＮＡＲアイソタイプフレームワーク（ＩＩ型ＶＮＡＲに加えて２Ｖ、５Ｖ、Ｅ９）を用いて築く。２つのテンプレートを用いることで、重要な別個のフレームワーク（ＦＷ）および超可変（ＨＶ）ループ領域をシャッフルすることにより、さらなる構造多様性の導入が容易となった。ゆえに、事実上、補足的なＣＤＲ１ループおよびＣＤＲ３ループを指向する多様性を含む、野生型および新規のスプライスされたハイブリッド骨格で構成される誘導されるクローンをもたらす。ＥＬＳＳ１における異なる文脈において、ＨＶ２ループおよびＨＶ４ループを誘導するテンプレートは、代わりに、ＨＶ２およびＨＶ４のＦＷ１およびＣＤＲ１およびＣＤＲ３フラグメントとの対形成を誘導するテンプレートをコードするスプライシングＰＣＲフラグメントを通じて得た。実際、これらによって、我々はハイブリッドなテンプレート誘導型の配列置換（sequence permutation）で構成される６つの新規のさらなるハイブリッド骨格を組み込むことが可能となった。

データベース分析から、２Ｖテンプレートで発見された実際のＨＶ２およびＨＶ４アミノ酸（ＡＡ）配列がアブラツノザメ（spiny）ＶＮＡＲデータベースのクローンの最大の比較群において観察され、それぞれ集団の３３％（４５４／１３６４）および３８％（５１８／１３６４）に対応することがわかった。実際のＨＶ２およびＨＶ４配列は、５Ｖほど頻繁には観察されず、データベース集団において、ＨＶ４はおよそ８％（１１１／１３６４）で観察され、ＨＶ２は１％未満で（１０／１３６４）で観察された。しかしながら、両ＨＶループの一アミノ変異体は、データベースのクローンの高い割合で発見された。これは、２Ｖおよび５ＶテンプレートＨＶ領域はほぼ確実に生殖細胞系列をコードし、または配列における生殖細胞系列に近いことを示唆する。実際に、ライブラリー設計においてこの配列スペースをシャッフルすることにより、我々は、同時に、共通して発見される‘天然の’レパートリー（すなわち配列２Ｖに由来する）を保持し、ハイブリッド多様性の創成を通じてさらなる人工的バリエーションを導入した。さらに、両テンプレート由来のＦＷ１領域のシャッフルにより、さらなる配列多様性を組み込んだ。

ＦＷ１アミノ末端の最初の３〜４残基は、ＶＮＡＲに対する結合特性を調節する上で決定的である。当然のことながら、常にＮ末端残基がＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループのきわめて近傍に位置するように（この際、パラトープおよび標的の接触が媒介される）、可能な構造モデルを用いて合理的に説明する際、Ｎ末端のＦＷ１残基は、ＶＮＡＲドメインのこれらの同族の抗原に対する結合特性に対して有効でありうる。ここで、二重テンプレート設計の利点は、別個のテンプレート由来のＦＷ１をコードする領域間のシャッフルを許容した。ゆえに、採用された総合的な設計アプローチにより、さらなるＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループの多様性が付加される８つの別個の骨格を得られる可能性がある。

定義
本発明の抗原特異的抗原結合分子は、本発明の方法に従って作製されたＶＮＡＲ分子の人工ライブラリーから誘導されるアミノ酸配列を有する。ＶＮＡＲ、ＩｇＮＡＲおよびＮＡＲとの語もまた、互換可能なように用いられてもよい。

ここで、アミノ酸は、１文字コードもしくは３文字コドンのいずれかまたは両方として表現される。

“アフィニティー精製”との語は、化学物質に対する分子の特異的引力もしくは結合またはパートナーの結合に基づく分子の精製を意味し、パートナー成分に結合または引きつけられている間に、分子が不純物から分離されることを可能にする結合体もしくは複合体を形成する。

“相補性決定領域”またはＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１およびＣＤＲ３）との語は、この存在が抗原の結合にとって不可欠であるＶＮＡＲドメインのアミノ酸残基を意味する。各ＶＮＡＲは、典型的に、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、“相補性決定領域”由来のアミノ酸残基および／または“超可変ループ”（ＨＶ）由来のアミノ酸残基を有してもよい。例として、相補性決定領域は、両ＣＤＲ領域および超可変ループに由来するアミノ酸残基を有してもよい。ＶＮＡＲ分子に関して一般的に受け入れられる命名法によれば、ＣＤＲ２領域は存在しない。

“フレームワーク”（ＦＷ）は、ＣＤＲ残基以外のＶＮＡＲ残基である。各ＶＮＡＲは、典型的に、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂおよびＦＷ４として特定される５つのフレームワーク領域を有する。

“コドンセット”は、所望の変異アミノ酸をコードする一連の異なるヌクレオチド三連配列を意味する。オリゴヌクレオチドのセットは、コドンセットによって提供される全ての可能なヌクレオチド三連の組み合わせを表現し、所望のアミノ酸グループをコードするであろう配列を含み、例えば固相合成によって合成されうる。コドン指向の標準形式はＩＵＢコードのものであり、技術分野において公知であり、ここで記述される。

コドンセットは、イタリック体の３つの大文字（例えば、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ，ＤＶＫ等）で典型的に表現される。ゆえに、“非ランダムコドンセット”は、ここで示すように、部分的に、好ましくは完全にアミノ酸選択基準を遂行する選択するアミノ酸をコードするコドンセットを意味する。特定の位置で選択されるヌクレオチド“縮退”を伴うオリゴヌクレオチドの合成は技術分野において公知であり、例えばＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９），２９６，５７−８６）；Ｇａｒｒａｒｄ＆Ｈｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅ（１９９３），１２８，１０３）がある。かような特定のコドンセットを有するオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成剤（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能である）を用いて合成してもよいし、あるいは市販で（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤより）得てもよい。合成される特定のコドンセットを有するオリゴヌクレオチドのセットは、通常、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、全体の配列におけるコドンセットによって確立される相違性を含むであろう。本発明によれば、用いられるオリゴヌクレオチドは、ＶＮＡＲ核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、またここで好都合な制限酵素部位を含んでもよい。

“細胞”、“細胞株”および“細胞培養”は、（文脈上他の意味に解すべき場合を除き）互換可能なように用いられ、かような指定は、細胞または細胞株の全ての子孫を含む。ゆえに、例えば、“形質転換細胞”および“形質転換された細胞”は、転換数にかかわらず誘導される最初の対象細胞および培養を含む。意図的または偶発的な変異により、全ての子孫はＤＮＡ量が正確に特定されていなくてよいことも理解されている。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされるような同じ機能または生物活性を有する変異した子孫が含まれる。

発現に言及する際の“コントロール配列”は、特に宿主生物において作動可能にリンクしたコード配列の発現に不可欠なＤＮＡ配列を意味する。原核生物にとって好ましいコントロール配列は、例えば、プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、リボソーム結合部位等を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサー等のコントロール配列を用いる。

“コートタンパク質”との語は、少なくとも一部がウイルス粒子の表面に存在しているタンパク質を意味する。機能的な見方から、コートタンパク質は、宿主細胞におけるウイルス構築プロセスにおいてウイルス粒子に結合し、他の宿主細胞に感染するまで構築されたウイルスに結合したままであるタンパク質である。

特定のアッセイ（検定）における化学物質の“検出限界”とは、そのアッセイにおいてバックグラウンドレベルを超えて検出されうる化学物質の最低濃度である。例えば、ファージＥＬＩＳＡにおいて、特定の抗原結合フラグメントを提示する特定のファージにおける“検出限界”は、特定のファージが、抗原結合フラグメントを提示しないコントロールファージが発するシグナルを上回るＥＬＩＳＡシグナルを発するときのファージ濃度である。

“融合タンパク質”および“融合ポリペプチド”は、互いに共有結合する２つの部分を有するポリペプチドを意味し、各部分は異なる性質を有するポリペプチドである。この性質は、インビトロまたはインビボの活性等の生物学的性質であってもよい。性質は、標的抗原に対する結合、反応の触媒等のような単一の化学的性質または物理的性質であってもよい。２つの部分は、１つのペプチド結合または１つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを通じて直接結合してもよい。一般的に、２つの部分およびリンカーは、互いにリーディングフレーム内にあるであろう。好ましくは、ポリペプチドの２つの部分は、異種のまたは異なるポリペプチドから得られる。

本明細書において“融合タンパク質”との語は、総称として、水素結合もしくは塩橋を含む化学的手段、またはタンパク質合成または両方を通じたペプチド結合によって互いに連結される１つ以上のタンパク質である。

“異種のＤＮＡ（heterologous DNA）”は、宿主細胞に導入されるＤＮＡである。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、人工ＤＮＡおよび融合物またはこれらの組み合わせを含む資源の多様性に由来してもよい。ＤＮＡは、宿主細胞もしくは受容細胞のように同一の細胞または細胞型由来のＤＮＡ、または異なる細胞型（例えば、同種異系もしくは異種の資源）由来のＤＮＡを含んでもよい。必要に応じて、ＤＮＡは、マーカーまたは選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子、温度耐性遺伝子等）を含んでもよい。

“非常に多様な位置（highly diverse position）”は、公知のアミノ酸配列および／または天然由来の抗生物質または抗原結合フラグメントを比較する際、その位置で表現される多数の異なるアミノ酸を有する軽鎖および重鎖の可変領域に位置するアミノ酸の位置を意味する。非常に多様な位置は、ＣＤＲ領域において典型的である。

“同一性”は、配列比較によって決定される、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列における関係を示す。また、同一性は、場合によっては、かような配列のマッチングによって決定されるように、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の配列関連性の程度（相同性）を意味する。２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列の同一性を測定するための方法が多数存在する一方、同一性を決定するための一般的に採用される方法は、コンピュータプログラムで体系化される。２配列間の同一性を決定するための好適なコンピュータプログラムは、特に制限されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，３８７（１９８４），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５，４０３））を含む。

好ましくは、タンパク質のアミノ酸配列は、ＨＧＭＰ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ）によって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５，４０３−４１０）のデフォルトパラメータを用いて、アミノ酸レベルで、ここで記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。

より好ましくは、タンパク質配列は、核酸またはアミノ酸レベルで、ここで示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％およびさらにより好ましくは９５％（さらにより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性である。

また、タンパク質は、ＨＧＭＰより提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを用いて、ここで開示されている配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。

“ライブラリー”は、複数のＶＮＡＲまたはＶＮＡＲフラグメントの配列（例えば、本発明のポリペプチド）、またはこれらの配列をコードする核酸、本発明の方法に従ってこれらの配列に導入される変異アミノ酸の組み合わせが異なる配列を意味する。

“ライゲーション”は、２つの核酸フラグメント間でホスホジエステル結合を形成する方法である。２つのフラグメントのライゲーションにおいて、フラグメントの末端は互いに適合しなければならない。ある場合において、末端は、エンドヌクレアーゼで切断された後、直接適合するであろう。しかしながら、エンドヌクレアーゼで切断した後に、平滑末端をライゲーションに適合させるために、一般的に産生される交互の末端を変換することが、第一に必須である。末端の平滑化については、ＤＮＡを、適切なバッファー中、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントまたはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ１０ユニットとともに、１５℃で少なくとも１５分間処理する。その後、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿またはシリカ精製によりＤＮＡを精製する。互いにライゲーションされるＤＮＡフラグメントを、ほぼ等モル量で溶液中に置く。また、溶液は、ＡＴＰ、ライゲーションバッファー、およびリガーゼ（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等）をＤＮＡ０．５μｇに対して１０ユニットで含有する。ＤＮＡをベクターにライゲーションさせる場合、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いた切断によってベクターをまず直鎖化する。その後、ライゲーション段階におけるセルフライゲーションを防止するため、直鎖化したフラグメントをバクテリアアルカリホスファターゼまたは子ウシ腸ホスファターゼで処理する。

“変異”は、野生型配列等、参照のヌクレオチド配列に対する核酸の除去、挿入または置換である。

“天然の”または“天然由来の（naturally occurring）”ＶＮＡＲは、非人工源（例えば、エクスビボで得られる組織源に由来する、または板鰓亜綱サブクラスの動物の血清に由来する）から特定されるＶＮＡＲを意味する。これらのＶＮＡＲは、天然のまたはさもなくば誘導された、免疫応答型において産生されるＶＮＡＲを含みうる。天然のＶＮＡＲは、これらの抗体を構成するまたはコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を含む。ここで用いられるように、天然のＶＮＡＲは、“人工のＶＮＡＲ”とは異なり、人工のＶＮＡＲは、資源またはテンプレートの配列から変化したＶＮＡＲ配列を意味し、例えば、異なるアミノ酸である特定の位置でのアミノ酸の置換、除去もしくは添加、または１より多くのアミノ酸により、異なるアミノ酸は、資源の抗体配列とは異なる抗体配列を提供する。

“核酸構築物”との語は、通常、クローニングによって得られ、または化学合成によって生成される、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ等のＲＮＡでもよい、いかなる長さの核酸をも意味する。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡは、コードセンス鎖でもよいし、または非コードもしくはアンチセンス鎖でもよい。治療用途としては、核酸構築物は、治療される対象において発現が可能な形態であることが好ましい。

“作動可能に結合した（Operably linked）”とは、核酸が他の核酸配列とともに機能的な関係に置かれた核酸の手段を意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダー用ＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現した場合に、ポリペプチド用ＤＮＡに作動可能に結合し；プロモーターまたはエンハンサーは、これが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に結合し；リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置している場合、コード配列に作動可能に結合している。通常、“作動可能に結合した”とは、結合するＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合、リーディングフレーム内で近接していることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は、便利な制限部位でのライゲーションによって得られる。かような部位が存在しない場合、人工のオリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーは、従来の方法に従って用いられる。

“ファージディスプレイ”は、ファージ（例えば、糸状ファージ、粒子）の表面上にあるコートタンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質として変異ポリペプチドが提示される技術である。ファージディスプレイ技術により、高親和性で標的の抗原に結合するこれらの配列によって迅速かつ効率的に選別されるランダム化したタンパク質変異体の大ライブラリーの作製が可能となる。ファージ上のペプチドおよびタンパク質ライブラリーの提示は、特異的な結合特性を有する百万のポリペプチドのスクリーニングのために用いてもよい。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファージのコートタンパク質ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩまたはｐＩＸをコードする遺伝子への融合を通じて、小さなランダムのペプチドおよび小さいタンパク質の提示に用いられている。

“ファージミド”は、バクテリア複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１）およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドとしては、糸状バクテリオファージおよびラムドイドバクテリオファージを含む、公知のバクテリオファージを用いてもよい。また、一般的に、プラスミドは、選択可能な抗生物質耐性マーカーを含むであろう。これらのベクターにクローンされるＤＮＡセグメントは、プラスミドのように増殖しうる。細胞がかくまう際、これらのベクターは、ファージ粒子の産生に必要な全ての遺伝子とともに提供され、プラスミドの複製モードは、プラスミドＤＮＡの１本鎖のコピーおよびパッケージファージ粒子を産生するためにローリングサークル複製に変化する。ファージミドは、感染性または非感染性のファージ粒子を形成してもよい。この語は、異種のポリペプチドがファージ粒子表面上に提示されるよう、遺伝子融合物として異種のポリペプチド遺伝子に連結するファージコートタンパク質遺伝子またはこれらのフラグメントを有するファージミドを含む。ファージミドディスプレイベクターの一例として、ｐＷＲＩＬ−１がある。

“ファージベクター”との語は、異種の遺伝子を含み複製可能なバクテリオファージの２本鎖型複製形式を意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を許容するファージ複製起点を有する。好ましくは、ファージは、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはこれらの誘導体のような糸状バクテリオファージ、または２１、ｐｈｉ８０，ｐｈｉ８１もしくはこれらの誘導体のようなラムドイドファージである。

“タンパク質”との語は、総称として、ペプチド結合によって互いに連結した複数のアミノ酸残基を意味する。これは、ペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーまたはポリペプチドと互換的に用いられて同じ意味であり、糖タンパク質およびこれらの誘導体を含む。また、“タンパク質”の語は、タンパク質のフラグメント、アナログ、変異体および誘導体を含むことを意味し、この際、タンパク質のフラグメント、アナログ、変異体および誘導体が参照タンパク質と同一の生物活性または機能を保持する。タンパク質アナログおよび誘導体の例は、ペプチド核酸およびＤＡＲＰｉｎｓ（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を含む。

タンパク質のフラグメント、アナログ、変異体または誘導体は、由来する元のタンパク質配列の長さに依存して、少なくとも２５、好ましくは３０もしくは４０、または５０もしくは１００以下、または６０〜１２０アミノ酸長である。９０〜１２０、１００〜１１０アミノ酸は、例によっては好都合でありうる。

タンパク質のフラグメント、誘導体、変異体またはアナログは、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸）で置換されているもので、そのように置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされてもコードされなくてもよい、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）さらなるアミノ酸がポリペプチドの精製に採用される成熟ポリペプチド（リーダーまたは補助配列等）に融合されるものである。かようなフラグメント、誘導体、変異体またはアナログは、ここでの知見から当業者の範囲内にあるとみなされる。

“オリゴヌクレオチド”は、（リン酸トリエステル、亜リン酸またはホスホアミダイト化学等、固相技術を使用する）公知の手段により化学的に合成される、短い、１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。遺伝子の核酸配列全体が公知であるか、またはコード鎖に相補的な核酸配列が入手可能である場合、さらなる手段は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が使用されることを含む。あるいは、標的のアミノ酸配列が公知である場合、各アミノ酸残基について公知かつ好ましいコード残基を用いて可能性のある核酸配列を推定してもよい。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルまたは分子サイズカラムまたは沈殿によって精製されうる。ＤＮＡが（極性、非極性、イオン性等でありうる）非核酸不純物から分離されたとき、ＤＮＡは“精製される”。

ここで用いられるように、“資源”または“テンプレート”ＶＮＡＲは、ここで記載される基準に従う多様性が実行される際に、抗原結合配列がテンプレート配列として機能するＶＮＡＲまたはＶＮＡＲ抗原結合フラグメントを意味する。一般的に、抗原結合配列は、ＶＮＡＲ内に、好ましくは少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくはフレームワーク領域を含む。

“転写制御要素”は、以下の構成要素を１つ以上含んでもよい：エンハンサー要素、プロモーター、オペレーター配列、リプレッサー遺伝子、および転写終結配列。

“形質転換”は、細胞がＤＮＡを取り込んで“変異体”となる方法を意味する。ＤＮＡの取り込みは、永久的または一時的のいずれでもよい。“変異体”は、ＤＮＡと関連するフェノタイプの発現（例えば、ＤＮＡによってコードされるタンパク質によって参照される抗生物質耐性）から明らかなように、ＤＮＡを取り込んで保持している細胞である。

融合タンパク質（ポリペプチド）または異種のポリペプチド（ファージと非相同である）のように、出発のまたは参照のポリペプチド（例えば、資源のＶＮＡＲまたはこれらのＣＤＲ）の“変異体（variant）”または“変異体（mutant）”は、（１）出発のまたは参照のポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有し、かつ（２）天然または人工の変異を通じて出発のまたは参照のポリペプチドに由来したポリペプチドである。かような変異体は、例えば、対象ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の除去、および／または挿入、および／または置換を含む。例えば、（資源のＶＮＡＲまたは抗原結合フラグメント内で対応する位置で発見されるアミノ酸に関して）変異アミノ酸を有する配列をコードする非ランダムコドンセットを有するオリゴヌクレオチドを用いて産生する本発明の融合ポリペプチドは、資源のＶＮＡＲまたは抗原結合フラグメントに関わる変異ポリペプチドでもよい。よって、変異ＣＤＲは、（資源のＶＮＡＲまたは抗原結合フラグメント等の）出発のまたは参照のポリペプチド配列に関して変異配列を有するＣＤＲを意味する。この文脈において、変異アミノ酸は、（資源のＶＮＡＲまたは抗原結合フラグメント等の）出発のまたは参照のポリペプチド配列において対応する位置にあるアミノ酸とは異なるアミノ酸を意味する。最終構築物が所望の機能的特性を所有するという条件において、最終的な変異構築物を得るために、除去、挿入または置換のいかなる組み合わせを行ってもよい。また、アミノ酸の変換により、糖鎖付加位置の数または割合の変更等、ポリペプチドの翻訳後プロセスが変更されてもよい。

“野生型の（wild-type）”もしくは“参照の（reference）”配列または“野生型の”もしくは“参照の”タンパク質／ポリペプチド（コートタンパク質、または資源のＶＮＡＲのＣＤＲ等）は、その配列から変異の導入を通じて変異ポリペプチドに由来する参照配列であってもよい。一般的に、所定タンパク質の“野生型の”配列は、天然において最も一般的な配列である。同様に、“野生型の”遺伝子配列は、天然において最も一般的に発見される遺伝子配列である。変異は、自然作用、人為的手段のいずれかを通じて、“野生型の”遺伝子（およびこれをコードするタンパク質）に導入されてもよい。このようなプロセスの産物は、オリジナルの“野生型の”タンパク質または遺伝子の“変異体（variant）”または“変異体（mutant）”形式である。

ライブラリーの多様性
ＣＤＲ領域ＣＤＲ１およびＣＤＲ３内のアミノ酸の位置は、各位置で天然由来アミノ酸をコードする非ランダムなコドンセットを用いてそれぞれ変異されてもよい。ある態様において、ＣＤＲ領域内の位置が変異される場合、その位置について、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくは全てのアミノ酸をコードするコドンセットが選択される。ある態様において、ＣＤＲ領域内の位置が変異される場合、その位置の全アミノ酸の好ましくは約５０％〜約１００％、好ましくは約６０％〜９５％、好ましくは約７０％〜約９０％、好ましくは約７５％〜約９０％をコードするコドンセットが選択される。

ＶＮＡＲのライブラリーの多様性は、ＶＮＡＲの構造ゆらぎを最小化させる一方、多様性を最大化させるように設計され、高親和性の抗原特異的抗原結合分子を単離する可能性の増加を提供し、細胞培養により高収率で得られるかような分子を提供する。ＶＮＡＲ可変ドメイン内で変異された位置の数を最小化し、各位置における変異アミノ酸がシステインを除いて各々通常発生するアミノ酸を含むように設計し、一方で、好ましくは（可能であれば）通常発生しないアミノ酸およびストップコドンを除外する。

ライブラリーにおける多様性は、非ランダムコドンセットを用いて少なくとも１つのＣＤＲ内でそれらの位置を変異することにより設計される。好ましくは、非ランダムコドンセットは、システインおよびストップコドンのような非標的配列を最小化する一方、少なくともそれらの位置で通常発生するアミノ酸のサブセットをコードする。

好ましくは、各位置における非ランダムなコドンセットは、少なくとも２つのアミノ酸をコードし、システインはコードしない。構造に悪影響を及ぼしうることから、各位置における非標的アミノ酸は最小化され、システインおよびストップコドンは一般的に除外される。

上記のように、変異アミノ酸は、非ランダムなコドンセットによってコードされる。コドンセットは、所望のアミノ酸基をコードするのに用いられうるオリゴヌクレオチドのセットの形成に用いられうる異なるヌクレオチド三連配列のセットである。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば固相合成により合成することができ、コドンセットによって提供される全ての可能なヌクレオチド三連の組み合わせを表現し、かつ、所望のアミノ酸基をコードするであろう配列を含む。特定位置での選択ヌクレオチドの“縮退”を伴うオリゴヌクレオチドの合成は標準的な手順である。

特定のコドンセットを有するかようなヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成剤（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能である）を用いて合成してもよいし、または市販で（例えば、Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ，Ｈａｗｔｈｏｒｎ，ＮＹまたはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤより）得られる。ゆえに、特定のコドンセットを有する合成されたオリゴヌクレオチドのセットは、通常、異なる配列、配列全体内のコドンセットにより確立される相違性を伴った、複数のオリゴヌクレオチドを含む。本発明によって用いられるように、オリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸テンプレートに対するハイブリダイゼーションを可能にし、クローニング目的で制限酵素部位を含みうる配列を有する。

各位置における標的アミノ酸のうち、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくは全てのアミノ酸基をコードする、実例となる非ランダムなコドンセットが、図１０（ａ）においても示されている。

一態様において、変異のＣＤＲ１およびＣＤＲ３またはこれらの混合物を有するポリペプチドが形成され、ここで少なくとも１つの変異ＣＤＲは、少なくとも１つのアミノ酸位置において変異アミノ酸を含み、変異アミノ酸は非ランダムなコドンセットによってコードされ、ここで非ランダムなコドンセットによってコードされるアミノ酸のうち少なくとも７０％は、公知の可変ドメイン配列内の位置における標的アミノ酸である。これらの位置の変異アミノ酸は、図１０（ａ）で例示されているコドンセットによってコードされることが好ましい。

また、ＣＤＲ１に関連したオリゴヌクレオチド由来の多様性の例を図１０（ｂ）に示す。

選択のアミノ酸をテンプレート核酸に置換する方法は、ここで記載される技術分野において十分に確立されている。例えば、ライブラリーは、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７），１５４，３６７−３８２））を用いた、変異アミノ酸へのアミノ酸の置換を目的とする少なくとも１つのＣＤＲ領域におけるアミノ酸位置を標的とすることによって作製してもよい。

コドンセットは、所望の変異アミノ酸をコードするのに用いられる異なるヌクレオチドの三連配列のセットである。コドンセットは、ＩＵＢコードに従って以下に示されるように、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等モル混合物を指すために記号を用いて表現してもよい。通常、コドンセットは、３つの大文字（例えば１０（ａ）のＲＲＫ、ＧＳＴ、ＴＫＧ、ＴＷＣ、ＫＣＣ、ＫＣＴおよびＴＲＭ）で表現される。

ＩＵＢコード
Ｇ：グアニン
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｃ：シトシン
Ｒ：（ＡまたはＧ）
Ｙ：（ＣまたはＴ）
Ｍ：（ＡまたはＣ）
Ｋ：（ＧまたはＴ）
Ｓ：（ＣまたはＧ）
Ｗ：（ＡまたはＴ）
Ｈ：（ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ：（ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ：（ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ：（ＡまたはＧまたはＴ）Ｈ
Ｎ：（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）。

オリゴヌクレオチドまたはプライマーのセットは、標準的な方法を用いて合成してもよい。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば、固相合成により合成してもよく、コドンセットにより提供される全ての可能なヌクレオチド三連の組み合わせを表現し、所望のアミノ酸基をコードするであろう配列を含む。

特定位置において選択されるヌクレオチド“縮退”を伴うオリゴヌクレオチドの合成は、技術分野において公知である。特定のコドンセットを有するかようなヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成剤（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能である）を用いて合成してもよいし、または市販で（例えば、Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ，Ｈａｗｔｈｏｒｎ ＮＹまたはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤより）得てもよい。ゆえに、特定のコドンセットを有する合成されたオリゴヌクレオチドのセットは、通常、異なる配列、配列全体内のコドンセットにより確立される相違性を伴った、複数のオリゴヌクレオチドを含むであろう。本発明によって用いられるように、オリゴヌクレオチドは、可変ドメインの核酸テンプレートに対するハイブリダイゼーションを可能とし、クローニング目的のために制限酵素部位を含みうる配列を有する。

１つの方法において、変異アミノ酸をコードする核酸配列は、ここで開示されるように、ＶＮＡＲ配列２Ｖまたは５Ｖのように、資源またはテンプレートのポリペプチドをコードする核酸配列のオリゴヌクレオチド媒介変異によって作製してもよい。この技術は、Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８７），１０，６４８７−６５０４（１９８７）で記載されているように、技術分野において公知である。簡潔には、ＤＮＡテンプレートに所望のコドンセットをコードするオリゴヌクレオチドセットをハイブリダイズすることによって変異アミノ酸をコードする核酸配列を作製し、この際、テンプレートは可変領域の核酸テンプレート配列を含むプラスミドの１本鎖型である。ハイブリダイゼーション後、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、オリゴヌクレオチドセットによって提供されるように、コドンセットを含むであろうテンプレートの二次相補鎖全体を合成するために、ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。

他の資源またはテンプレートの分子をコードする核酸は公知であり、容易に決定づけられうる。一般的には、長さとして少なくとも２５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが用いられる。最適なオリゴヌクレオチドは、変異体をコードするヌクレオチドのいずれかのサイドでテンプレートと完全に相補的である１２〜１５個のヌクレオチドを有するであろう。このことは、オリゴヌクレオチドが１本鎖ＤＮＡテンプレート分子に対して適切にハイブリダイズすることを確実にする。オリゴヌクレオチドは、Ｃｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８７）７５：５７６５で記載されるように、技術分野において公知の技術を用いて容易に合成されうる。

ＤＮＡテンプレートは、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販で入手可能なＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが好ましい）のいずれかに由来するこれらのベクター、または、Ｖｉｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９８７）１５３，３で記載されるように１本鎖ファージ複製起点を含むこれらのベクターから生成してもよい。よって、変異されるＤＮＡは、１本鎖テンプレートを生成するために、これらのベクターの１つに挿入されてもよい。

ＤＮＡ配列を変更するため、好ましいハイブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドを１本鎖テンプレートにハイブリダイズさせる。その後、合成用プライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いてテンプレートの相補鎖を合成するため、ＤＮＡ伸長酵素（通常、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント）を添加する。よって、ＤＮＡの一方の鎖がコード配列１の変異型をコードし、他方の鎖（オリジナルテンプレート）がコード配列１の野生型で非変換の配列をコードするように、ヘテロ二重分子が形成される。その後、このヘテロ二重分子を好ましい宿主細胞（通常、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１等の原核生物）に形質転換する。細胞が成長した後、これをアガロースプレートに静置し、変異ＤＮＡを含むバクテリアコロニーを特定するため^３２リンで放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングする。

直上に記載される方法は、プラスミドの両方の鎖が変異を含むホモ二重分子が作製されるように変更してもよい。変更は以下のとおりである：上記のように１本鎖オリゴヌクレオチドを１本鎖テンプレートにアニールする。３種類のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）とよばれる修飾チオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍより得られる）と組み合わせる。この混合物を、テンプレート−オリゴヌクレオチド複合体に添加する。この混合物へのＤＮＡポリメラーゼの添加に際し、変異した塩基を除いてテンプレートに一致するＤＮＡ鎖が生成する。さらに、この新規のＤＮＡ鎖は、ｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含むであろうし、これは制限エンドヌクレアーゼの切断からＤＮＡ鎖を守る役割を果たす。２本鎖ヘテロ二重テンプレート鎖に適切な制限酵素で切れ目を入れた後、テンプレート鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは他の適切なヌクレアーゼで切断し、変異化した部位を含む領域をパスする。その後、この反応は、部分的にのみ１本鎖である分子を残すために停止する。その後、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼ存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて完全な２本鎖型のＤＮＡホモ二量鎖を形成する。その後、このホモ二重鎖分子を適切な宿主細胞に形質転換する。

以前示したように、オリゴヌクレオチドセットの配列は、テンプレート核酸に対してハイブリダイズするのに十分な長さを有し、または、必須ではないが、制限部位を有してもよい。ＤＮＡテンプレートは、バクテリオファージＭ１３ベクター、または、Ｖｉｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９８７）１５３，３で記載されるように１本鎖ファージ複製起点を含むこれらのベクターから生成してもよい。よって、変異されるＤＮＡは、１本鎖テンプレートを生成するために、これらのベクターのうち１つに挿入されなければならない。

核酸カセットを作製するためのテンプレートとして、核酸テンプレート配列を用いたポリメラーゼ鎖反応にオリゴヌクレオチドセットを用いてもよい。核酸テンプレート配列は、ＶＮＡＲ分子（すなわち、置換のために標的とされるアミノ酸をコードする核酸配列）のいかなる部分であってもよい。核酸テンプレートは、第１の核酸鎖および相補的な第２の核酸鎖を有する２本鎖ＤＮＡ分子の部分である。核酸テンプレート配列は、少なくともＶＮＡＲドメインの一部を含み、少なくとも１つのＣＤＲを有する。ある場合において、核酸テンプレート配列は、１つより多くのＣＤＲを有する。核酸テンプレート配列の上流部分および下流部分について、上流のオリゴヌクレオチドセットおよび下流のオリゴヌクレオチドセットの要素とともに、ハイブリダイゼーションの標的としてもよい。

上流プライマーセットの第１のオリゴヌクレオチドは、第１の核酸鎖にハイブリダイズすることができ、下流プライマーセットの第２のオリゴヌクレオチドは、第２の核酸鎖にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、１つ以上のコドンセットを含むことができ、核酸テンプレート配列の部分にハイブリダイズするために設計してもよい。これらのオリゴヌクレオチドを使用することで、後述のＰＣＲにより、２つ以上のコドンセットをＰＣＲ産物（すなわち、核酸カセット）に導入することができる。ＶＮＡＲドメインをコードする核酸配列の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、アミノ酸置換の対象とされるＣＤＲ残基をコードする部分を含む。

また、オリゴヌクレオチド配列内の制限部位を含むために、上流および下流のオリゴヌクレオチドセットを合成してもよい。これらの制限部位は、核酸カセット（すなわち、ＰＣＲ反応産物）のさらなるＶＮＡＲ配列を有する発現ベクターへの挿入を容易にすることができる。

タンパク質発現
本発明の抗原特異的抗原結合分子をコードする核酸配列は、核酸構築物内に存在してもよい。かような核酸構築物は、ベクターの形態（例えば、発現ベクター）であってもよく、染色体由来、エピソーム由来およびウイルス由来のベクター（例えば、バクテリアプラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランズポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入要素由来、酵母染色体要素由来、ウイルス由来（バキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス等）、およびこれらの組み合わせ由来のベクター（コスミドおよびファージミドのような、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝的要素由来のベクター等）を含んでもよい。一般的に、宿主においてポリペプチドを発現するために核酸の維持、増殖または発現に適するいかなるベクターも、この点において発現のために用いてもよい。

核酸構築物は、好ましくは、核酸の発現を制御するプロモーターまたは他の制御配列を含む。核酸の発現を制御するプロモーターおよび他の制御配列は、既に特定されており、技術分野において公知である。当業者であれば、全てのプロモーターまたは他の制御配列を利用することは必須でないことに留意するであろう。最小の必須な制御要素のみが要求されてもよく、事実、かような要素をキメラ配列または他のプロモーターを構築するのに用いてもよい。必須要件は、もちろん、組織および／または一時的な特異性を保つことである。プロモーターは、いかなる適切な公知のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、またはレトロウイルスＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター等、マウスメタロチオネイン−１プロモーター等のメタロチオネインプロモーター等）でもよい。プロモーターは、プロモーター活性（ＴＡＴＡ要素等、任意でエンハンサー要素なし）のために含まれる最小値（例えば、ＣＭＶプロモーターの最小配列）を含む。好ましくは、プロモーターは核酸配列に隣接する。

ここで示されるように、核酸構築物は、ベクター形態内にあってもよい。ベクターは、しばしば、異種のＤＮＡを取り込むベクターを含む細胞の選択を可能にするために、これにトランスフェクションされる（または形質転換される）細胞の選択を可能にする発現マーカーを１つ以上含む。通常、適切な開始および終結シグナルが存在するであろう。

ベクターは、ｐＥＴ等、適切な発現ベクターであればいかなるものでもよい。ベクターは、開始および終結配列を含む、かような求められる付加的なコントロール配列、例えば、選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性、蛍光等）、転写制御配列およびプロモーターを含んでもよい。

プロモーターは、本発明の核酸配列によってコードされるタンパク質の発現を引き起こす適切なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーター）であればいかなるものでもよい。

かようなベクターは、宿主細胞内に存在してもよい。本発明の核酸構築物の発現のために適切な宿主細胞の代表例は、ウイルスベクター；細菌細胞（連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトミセスおよび枯草菌等）：単細胞（例えば、酵母細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞等）；昆虫細胞（ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞等）、動物細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＰＨＫ．２９３およびボウズメラノーマ細胞等）および他の適切なヒト細胞；ならびに植物細胞（シロイヌナズナ等）への核酸の封入を許容するウイルスパッケージング細胞を含む。好ましくは、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞等の真核細胞である。

宿主細胞への発現ベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン−リン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質転換、かきとりローディング（scrape loading）、衝撃導入（ballistic introduction）、感染またはその他の方法によって達成することができる。かような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）等、多くの標準的な研究室マニュアルで記載されている。

成熟したタンパク質について、適切なプロモーターの制御下、ＣＨＯ細胞等の哺乳細胞、酵母、バクテリア、または他の細胞を含む、宿主細胞内で発現させてもよい。本発明の第３の側面の核酸構築物に由来するＲＮＡを用いたかようなタンパク質の産生のため、無細胞翻訳システムを採用してもよい。原核および真核の宿主に用いられる適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）で記載されている。

本発明は、ここで記載されている本発明のいかなるポリペプチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞についても提供する。本発明によれば、ここで定義されるように適切な宿主細胞内で前記分子をコードする核酸配列を発現するステップを含む、本発明に係る抗原特異的抗原結合分子の製造方法が提供される。

タンパク質について、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出またはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンおよび／もしくはヘパリンクロマトグラフィー等の標準的な方法により、リコンビナント細胞培養から回収・精製してもよい。治療のため、核酸構築物（例えば、リコンビナントベクターの形態）について、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されるようなカラムクロマトグラフィー等、技術分野において公知の技術により精製してもよい。

ゆえに、本発明のこの側面は、宿主細胞内で組み換えで発現することによる融合タンパク質の産生、およびペプチド結合架橋、水素結合または塩橋または化学的架橋の手段により発現された融合タンパク質の精製を含む、本発明の融合タンパク質の作製方法に拡張する。本発明のこの側面のある態様において、水素結合または塩橋を用いて融合タンパク質を作製してもよく、この際、ペプチドは多量体化（例えば２量体化または３量体化）が可能である。

ライブラリーとしてのタンパク質発現
他の側面において、本発明は、本発明に係る複数のベクターを含むライブラリーを提供し、前記複数のベクターは複数のポリペプチドをコードする。したがって、本発明は、その表面上に本発明のポリペプチドを提示するウイルスまたはウイルス粒子（ファージまたはファージミド粒子等）を提供する。本発明は、本発明の複数のウイルスまたはウイルス粒子を含むライブラリーについても提供し、各ウイルスまたはウイルス粒子は本発明のポリペプチドを提示する。本発明のライブラリーは、任意の数の別個のポリペプチド（配列）、少なくとも約１×１０^８、少なくとも約１×１０^９、少なくとも１×１０^１０の別個の配列、より好ましくは少なくとも約９×１０^１０の配列を含んでもよい。

本発明は、複数のポリペプチドを含むライブラリーをも提供し、この際、ポリペプチドの各型はここで記載される本発明のポリペプチドである。

核酸カセットは、生成する標的アミノ酸の置換を含むＶＮＡＲの一部または全体を発現するいかなる適切なベクターにクローニングされてもよい。核酸カセットは、ウイルスコートタンパク質の全部または一部に融合し（すなわち、融合タンパク質を生成し）、粒子または細胞の表面上に提示されるＶＮＡＲ鎖配列の一部または全体の産生を許容するベクターにクローニングされてもよい。いくつかの型のベクターは入手可能であり、本発明の実行に用いられる一方、比較的容易に構築されるように、ファージミドベクターはここで用いられるための好ましいベクターであり、すぐに増幅されてもよい。一般的に、ファージミドベクターは、プロモーター、シグナル配列、フェノタイプ選択遺伝子、複製起点部位、および他の必須な構成要素を含む構成要素の多様性を含む。

他の態様において、特定の変異アミノ酸の組み合わせは発現されるものであり、核酸カセットは、ＶＮＡＲ配列の全部または一部をコードすることが可能であり、かつ、変異アミノ酸の組み合わせをコードすることが可能な配列を含む。これらの変異アミノ酸または変異アミノ酸の組み合わせを含む抗原特異的抗原結合分子の製造において、ライブラリー内のように、核酸カセットは付加的なＶＮＡＲ配列（例えば、可変ＣＤＲ、フレームワークおよび／または超可変領域の全部または一部）を含む発現ベクターに挿入されてもよい。これらの付加的な配列もまた、ウイルスコートタンパク質コンポーネントをコードする配列等、他の核酸配列に融合することができることで、融合タンパク質の産生を可能にできる。

本発明の一側面は、遺伝子融合物をコードする核酸配列を含む複製可能な発現ベクターを含み、遺伝子融合物はＶＮＡＲ配列および第２のＶＮＡＲ配列を含む融合タンパク質をコードし、ウイルスコートタンパク質の全部または一部と融合する。また、上記のように、多様な配列を有して産生する複数のＶＮＡＲ配列を含む異なる融合タンパク質をコードする複数の遺伝子融合物を含む、多様な複製可能な発現ベクターのライブラリーも含まれる。ベクターは、多様な構成要素を含み、好ましくは、異なるベクター間のＶＮＡＲ配列の動きを許容するために、および／または異なるフォーマットにおける融合タンパク質の提示を提供するために、構築される。

ベクターの例として、ファージベクター等がある。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を許容するファージ複製起点を有する。ファージは、好ましくは、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージまたはこれらの誘導体等の糸状バクテリオファージ、ラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４等、またはこれらの誘導体等のラムドイドファージである。

ウイルスコートタンパク質の例として、（バクテリオファージラムダの）感染性タンパク質ＰＩＮ、主要コートタンパク質ＰＶＩＩＩ、ｐ３、Ｓｏｃ（Ｔ４）、Ｈｏｃ（Ｔ４）、ｇｐＤ、マイナーバクテリオファージコートタンパク質６（ｐＶＩ）（糸状ファージ；Ｈｕｆｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（１９９９），２３１，（１−２）：３９−５１）、Ｍ１３バクテリオファージの主要コートタンパク質（Ｐ８）（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ（２０００）９（４）：６４７−５４）等がある。融合タンパク質はファージ表面上に提示されてもよく、好適なファージシステムとしては、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳおよびＰｈｉ Ｘ １７４、ｐＪｕＦｏファージシステム（Ｐｅｒｅｂｏｅｖ ａｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（２００１）；７５（１５）：７１０７−１３）およびハイパーファージ（Ｒｏｎｄｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）；１９（１）：７５−８）等である。好ましいヘルパーファージはＭ１３Ｋ０７であり、好ましいコートタンパク質はＭ１３ファージＩＩＩコートタンパク質である。好ましい宿主はＥ．ＣｏｌｉおよびＥ．Ｃｏｌｉベクターのプロテアーゼ欠損株である。ｆｔｈｌベクター（Ｅｎｓｈｅｌｌ−Ｓｅｉｊｆｆｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）；２９（１０）：Ｅ５０−０）等のベクターは、融合タンパク質の発現に有用でありうる。

発現ベクターは、各ＶＮＡＲまたはこれらのフラグメントをコードするＤＮＡに融合した分泌シグナル配列も有する。この配列は、通常、融合タンパク質をコードする遺伝子の５’のすぐの位置しているため、融合タンパク質のアミノ末端で転写されるであろう。しかしながら、特定の場合において、シグナル配列は、分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の５’以外の位置に位置することが実証されている。この配列は、細菌細胞の内膜を通じて接着したタンパク質を標的とする。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパク質をコードするいかなる遺伝子由来の制限エンドヌクレアーゼフラグメントとして得られてもよい。好ましい原核シグナル配列は、例えば、ＬａｍＢまたはＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，（１９８３）６８，１９３１）、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡおよび他の遺伝子をコードする遺伝子から得られてもよい。

本発明を実施するための好ましい原核シグナル配列は、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ５５．１８９（１９８７））に記載されるようなＥ．Ｃｏｌｉ熱安定エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列およびｍａｌＥである。

ベクターは、典型的に、融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターも含む。原核ベクターにおいてきわめて一般的に用いられるプロモーターは、ｌａｃＺプロモーターシステム、アルカリホスファターゼｐｈｏＡプロモーター（Ａｐ）、バクテリオファージＸＰＬプロモーター（温度感受性プロモーター）、ｔａｃプロモーター（ｌａｃリプレッサーによって制御されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター）、トリプトファンプロモーター、およびバクテリオファージＴ７プロモーター等である。プロモーターの一般的な記載は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，の１７章を参照する。これらが最も一般的に用いられるプロモーターであるが、他の適切な微生物プロモーターについても同様に用いてもよい。

ベクターは、ファージまたは細胞の表面上で発現する融合タンパク質の検出または精製に有用な他の核酸配列を有してもよく、例としては、ｇＤタグ、ｃ−Ｍｙｃエピトープ、ポリヒスチジンタグ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、またはβガラクトシダーゼタンパク質をコードする配列が挙げられる。

例えば、ｇＤタグをコードする核酸配列は、融合タンパク質を発現する細胞またはウイルスのポジティブまたはネガティブ選択をも提供する。ある態様において、ｇＤタグは、ウイルスコートタンパク質の構成要素に融合していないＶＮＡＲ配列に融合することが好ましい。例えば、ポリヒスチジンタグをコードする核酸配列は、免疫組織化学を用いて特異的な抗原に結合するＶＮＡＲ配列を含む融合タンパク質を特定するのに有用である。抗原結合の検出に有用なタグは、ウイルスコートタンパク質コンポーネントに融合しないＶＮＡＲ配列、ウイルスコートタンパク質コンポーネントに融合するＶＮＡＲ配列のいずれに融合してもよい。

本発明の実施のために用いられる、他の有用なベクターの構成要素は、フェノタイプ選択遺伝子である。典型的なフェノタイプ選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードするものである。実例として、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｌ）およびテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔｒ）は、この目的のために容易に採用される。

ベクターは、ユニークな制限部位および抑制可能なストップコドンを含む核酸配列も有してもよい。ユニークな制限部位は、異なるベクターおよび発現システム間を移動するＶＮＡＲ配列にとって有用である。抑制可能なストップコドンは、融合タンパク質の発現レベルを制御し、可溶なＶＮＡＲフラグメントの精製を容易にするのに有用である。例えば、アンバーストップコドンは、ｓｕｐＥ宿主においてはファージディスプレイを可能にするためにＧｉｎとして読める。一方、非ｓｕｐＥ宿主においては、ファージコートタンパク質と融合せずに可溶なＶＮＡＲフラグメントを産生するために、ストップコドンとして読める。これらの合成配列は、ベクター内で１つ以上のＶＮＡＲ配列と融合してもよい。

ベクターシステムから容易に除去され、他のベクターシステムに置かれるために、核酸が対象配列（例えば、変異アミノ酸を有するＣＤＲ）をコードすることを許容するベクターシステムを用いることは好都合である。例えば、ＶＮＡＲをコードする核酸配列の除去を容易にするために、ベクターシステム内に適切な制限部位を設計してもよい。通常、制限配列は、効率的な切除および新たなベクターへのライゲーションを容易にするために、ベクターにおいてユニークであるよう選択される。その後、ＶＮＡＲ配列は、ウイルスコートタンパク質または他の配列タグ等、外来の融合配列の無いベクターから発現してもよい。

ＶＮＡＲ配列（遺伝子１）およびウイルスコートタンパク質コンポーネント（遺伝子２）をコードする核酸の間に、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）およびＵＧＡ（オペル）（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｐｅｒ＆Ｒｏｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０，ｐｐ．２３７，２４５−４７および３７４）等の終止コドン等、終止コドン（termination or stop codon）をコードするＤＮＡが挿入されてもよい。野生型の宿主細胞で発現する終止コドンは、遺伝子２タンパク質が接続していない遺伝子１タンパク質産物の合成をもたらす。しかしながら、サプレッサー宿主細胞における成長は、検出可能量の融合タンパク質の合成をもたらす。かようなサプレッサー宿主細胞は、Ｅ．Ｃｏｌｉサプレッサー株（Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５：３７６−３７９（１９８７））等、公知であり記載されている。かような終止コドンを融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに配置するために、いかなる許容される方法を用いてもよい。

抑制性コドンは、ＶＮＡＲ配列をコードする第１の遺伝子およびファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の遺伝子の間に挿入されてもよい。あるいは、抑制性終止コドンは、ファージコートタンパク質において第１のアミノ酸のＶＮＡＲ配列の最後のアミノ酸三連を置き換えることにより、融合部位に隣接して挿入されてもよい。抑制可能な終止コドンは、２量化ドメインのＣ末端またはその後に位置してもよい。抑制可能なコドンを含むプラスミドがサプレッサー宿主細胞内で成長する際、ポリペプチドおよびコートタンパク質を含む融合ポリペプチドの検出可能な産生をもたらす。プラスミドが非サプレッサー宿主細胞内で成長する際、挿入された抑制可能な三連のＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡで終止することにより、ファージコートタンパク質に融合せずにＶＮＡＲ配列は実質的に合成される。非サプレッサー宿主細胞において、抗体可変ドメインは、さもなければこれを宿主膜に引き留める融合ファージコートタンパク質が存在しないことにより、宿主細胞から合成され分泌される。

ある態様において、多様化された（ランダム化された）ＣＤＲは、テンプレート配列において設計された終止コドン（ここでは“終止テンプレート”と称する）を有する。この特徴は、対象の変異アミノ酸の配列を含むオリゴヌクレオチドの取り込みにより、テンプレート配列内のストップコドンの良好な修復に基づいて、首尾よく多様化した配列の検出および選択を提供する。

本発明の抗原特異的抗原結合分子
本発明の特定の態様において、抗原特異的抗原結合分子は、図９、１１、１２、１３、１４、１５（ａ）、１５（ｂ）または１６のいずれかで示される群より選択されるアミノ酸配列を有する。

本発明の一態様において、抗原特異的抗原結合分子は、ＨＧＭＰより提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを用いて、５０％の同一性、または少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を有する、図９、１１、１２、１３、１４、１５（ａ）、１５（ｂ）もしくは１６のいずれかで示されるアミノ酸配列、またはこれらの変異体、アナログ、誘導体またはフラグメントである。本発明の一態様において、抗原特異的抗原結合分子はヒト化する。約２０％〜約８５％のヒト化（例えば、約２５％〜約６０％のヒト化）である本発明のヒト化結合分子を提供することは好都合である。

抗原特異的抗原結合分子は、ここに記載される分子の製造方法における精製および／または単離を補助し、使用前に切断される付加的なＮ末端またはＣ末端配列を含んでもよい。例としては、分子のＣ末端にある（Ａｌａ）_３（Ｈｉｓ）_６がある。

本発明内には、任意の組み合わせで、いくつかの（例えば、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０）アミノ酸残基が置換され、除去され、添加されるタンパク質のアミノ酸配列を有する変異体、アナログ、誘導体およびフラグメントも含まれる。中でも、本発明のタンパク質の特性および活性を変化させない、サイレントな置換、添加または除去であることが特に好ましい。また、この点において特に好ましくは、本発明のタンパク質の特性が変異型において原型と比較して保存される保存的置換である。変異体は、本発明に係る抗原特異的抗原結合分子を有する融合タンパク質も含む。

上記のように、本発明の変異体の例は、１つ以上のアミノ酸を１つ以上の他のアミノ酸に置換したものであるタンパク質を含む。当業者にとって、変異アミノ酸が同様の特性を有することは周知である。大抵、かような物質の１つ以上のアミノ酸は、その物質の所望の活性を妨害または消去することなく、１つ以上の他のかようなアミノ酸で置換されてもよい。かような置換は、“非保存的な”アミノ酸置換であってもよい。

よって、アミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、よく互いに（脂肪族側鎖を有するアミノ酸に）置換されうる。これらの可能な置換の中で、グリシンおよびアラニンは、（比較的短い側鎖を有するので）互いに置換に用いられることが好ましく、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、（疎水的である大きな脂肪族側鎖を有するので）互いに置換に用いられることが好ましい。よく互いに置換されうる他のアミノ酸は、以下を含む：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびにシステインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。この性質の置換は、大抵、“保存的な”または“半保存的な”アミノ酸置換を意味する。

アミノ酸の除去または挿入は、上記言及した融合タンパク質のアミノ酸配列に対してなされてもよい。よって、例えばポリペプチドの活性に対して置換の影響をもたらさない、または少なくともかような活性を消去しないアミノ酸は、除去されてもよい。かような除去は、活性を保持したままである一方、ポリペプチドの全体長および分子量が低減されるため、有利である。これにより、特定の目的のために要求されるポリペプチドの量を低減することができ、例えば、投与レベルを低減することができる。

アミノ酸の挿入は、上記の融合タンパク質の配列に対して行ってもよい。これは、本発明の物質の特性を変化させるために（例えば、融合タンパク質について、上記のように特定、精製または発現を補助するために）行ってもよい。

本発明の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸の変化は、いかなる適切な技術を用いて（例えば、部位特異的変異を用いて）行ってもよい。

本発明の範囲内におけるアミノ酸の置換または挿入は、天然由来または非天然由来のアミノ酸を用いて行うことが好ましい。天然、人工いずれのアミノ酸を用いるかに関わらず、Ｌアミノ酸が存在することが好ましい。

本発明に係るタンパク質は、付加的なＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸配列を有してもよい。かような配列は、多様な理由（例えば、糖鎖付加）に提供されてもよい。

融合タンパク質は、融合タンパク質に構造的要素を提供する異種のペプチドまたはタンパク質配列と融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子を有してもよい。他の態様において、融合タンパク質は、生物活性を有する分子と融合する本発明の抗原特異的抗原結合分子、すなわち薬理学的に有用な活性を有する治療タンパク質を含んでもよい。分子は、ペプチドもしくはタンパク質配列、または他の生物学的に活性な分子であってもよい。

例えば、抗原特異的抗原結合分子は、ポリアミノ酸配列（例えば、複数のヒスチジン残基または複数のリジン残基（好ましくは、２、３、４、５もしくは６残基））、または免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）のような異種のペプチド配列に融合してもよい。

異種のペプチド配列は、マウスやヒト等、他の哺乳動物由来の配列、および他のＶＮＡＲドメインを起源とする任意の異種のペプチド配列を含む。

融合タンパク質が生物学的活性を有する分子と融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子を有する際、生物学的に活性な部分は、酵素、免疫グロブリン、サイトカインまたはこれらのフラグメント等、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質であってもよい。あるいは、生物学的に活性な分子は、抗生物質、抗ガン薬、ＮＳＡＩＤ、ステロイド、鎮痛剤、毒素または他の医薬活性剤であってもよい。抗ガン薬は、細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬を含んでもよい。

ある態様において、融合タンパク質は、他の免疫グロブリンの可変もしくは定常領域、他の本発明の抗原特異的抗原結合分子に融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子を含む。言い換えれば、抗原本発明の特異的抗原結合分子の融合物は、可変長（例えば、２量体、３量体、４量体、またはより高次の多量体（すなわち、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体もしくは１０量体、もしくはそれを超える）であってもよい。特定の態様において、これはモノマーＶＮＡＲサブユニットの多量体として表現されてもよい。

例えば、ＶＮＡＲのＣＤＲが付加的なペプチド配列に融合する際、付加的なペプチド配列はウイルス粒子または細胞の表面上の１つ以上の融合ポリペプチドとの相互作用を提供する。ゆえに、これらのペプチド配列は“２量化ドメイン”を意味する。２量化ドメインは、少なくとも１つの２量化配列もしくは少なくとも１つのシステイン残基を含む配列、またはその両方を含む。好ましい２量化配列は、疎水性残基が常に空いており、各タンパク質の疎水性残基の相互作用による２量体の形成を可能とする両親媒性のαへリックスを有するタンパク質配列を含む；かようなタンパク質およびタンパク質の部分は、例えばロイシンジッパー領域を含む。

２量化ドメインは、（例えば、２量化ドメイン内の抗体ヒンジ配列の包含で提供されるように）１つ以上のシステイン残基を有してもよい。システイン残基は、１つ以上のジスルフィド結合の形成による２量化を提供することができる。一態様において、２量化ドメインの後に終止コドンが存在するとき、２量化ドメインは少なくとも１つのシステイン残基を有する。２量化ドメインは、抗体の可変または定常ドメインとウイルスコートタンパク質コンポーネントとの間に位置することが好ましい。

本発明の融合タンパク質において、抗原特異的抗原結合分子は、融合タンパク質の他の要素に対して、リンカー成分を介して直接融合または連結されてもよい。リンカーは、ペプチド、ペプチド核酸、またはポリアミド結合であってもよい。好ましいペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ）_４、（Ｇｌｙ）_５、（Ｇｌｙ）_４Ｓｅｒ、（Ｇｌｙ）_４（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）_４等の、複数のアミノ酸残基（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５アミノ酸）、またはこれらの組み合わせ、またはこれらの多量体（例えば、２量体、３量体、もしくは４量体、またはそれを超える）であってもよい。例えば、好ましいリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_３であってもよい。あるいは、リンカーは、（Ａｌａ）_３（Ｈｉｓ）_６またはこれらの多量体を含む。ＨＧＭＰより提供されるＢＬＡＳＴコンピュータシステムのデフォルトパラメータを用いて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列も含まれる。

場合によっては、ベクターはコートタンパク質と融合した単一のＶＮＡＲファージポリペプチドをコードする。これらの場合において、ベクターは、特定のプロモーター制御下で１つの転写物を発現する“モノシストロン性（monocistronic）”であると思われる。

かようなベクターの実例では、ドメイン間のリンカーペプチドを有し、ＶＮＡＲ領域をコードするモノシストロン性配列の発現を駆動するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはＴａｃプロモーターを利用する。シストロン配列は、５’末端でＥ．Ｃｏｌｉ ｍａｌＥまたは熱安定性エンドトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と、および３’末端でウイルスコートタンパク質（例えば、ピルタンパク質（pill protein））の全部または一部と連結されてもよい。ベクターは、第２の可変ドメインとウイルスコートタンパク質との間に、３’末端で（ロイシンジッパー等の）２量化ドメインをコードする配列をさらに有してもよい。２量化ドメインを含む融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの複合体を形成するために２量化が可能である。

他の場合において、ＶＮＡＲ配列（多重ＶＮＡＲ配列またはフラグメント）は、別個のポリペプチドとして発現してもよく、そのため、“バイシストロン性”ベクターは別個の転写物の発現を可能にする。これらのベクターにおいて、バイシストロン性メッセージの発現を駆動するために、ＰｔａｃまたはＰｈｏＡプロモーター等の好ましいプロモーターを用いてもよい。例えば、第１のＶＮＡＲ配列をコードする第１のシストロンは、５’末端でＥ．Ｃｏｌｉ ｍａｌＥまたは熱安定性エンドトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に連結し、３’末端でウイルスコートタンパク質の全部または一部と連結してもよい。

例のベクターは、５’末端でＥ．Ｃｏｌｉ ｍａｌＥまたは熱安定性エンドトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と、３’末端でｇＤタグをコードする核酸配列と作動可能に連結されるＶＮＡＲ配列をコードする第１のシストロンの発現を駆動する、好適なプロモーター（ＰｔａｃまたはＰｈｏＡ（ＡＰ）等）を有してもよい。第２のシストロンは、例えば、５’末端でＥ．Ｃｏｌｉ ｍａｌＥまたは熱安定性エンドトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と作動可能に連結する他のＶＮＡＲ配列をコードし、少なくともウイルスコートタンパク質の一部によって後続されるＩｇＧヒンジ配列およびロイシンジッパー配列を含む２量化ドメインを３’末端に有する。

ＶＮＡＲ配列の融合ポリペプチドは、多様な形式で細胞、ウイルスまたはファージミド粒子の表面上に提示されてもよい。この形式には、単一鎖のフラグメントおよびこれらのフラグメントの多価的な形態が含まれる。多価的な形態としては、２量体、またはそれより高次の多量体であってもよい。提示の多価的な形態は、選択プロセスにおいて、一般的に低親和性クローンの特定をもたらす抗原結合部位を１つ超有し、希少なクローンをより効率的に選定することを可能にすることから、好都合である。

本発明に対応して記載されるように、構築されるベクターは、増幅および／または発現のために宿主細胞に導入されてもよい。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿等の標準的な形質転換法を用いて、宿主細胞に導入されてもよい。ベクターがウイルス等の感染性粒子である場合、ベクター自身が宿主細胞への進入を提供する。標準的な手順に従って、遺伝子融合物のコードする複製可能な発現ベクターおよびファージ粒子の産生を含む宿主細胞のトランスフェクションは、ファージ粒子の表面上に融合タンパク質が提示されたファージ粒子を提供する。

複製可能な発現ベクターは、多種の方法を用いて宿主細胞に導入される。一態様において、ベクターは用いて細胞に導入されてもよい。細胞は、任意に３７℃で６〜４８時間（またはＯＤ６００＝０．６〜０．８）、培養液中における培養で成長し、その後、培養液を遠心し、上清を除去する（例えば、デカンテーションする）。初期精製は、緩衝液（例えば、１．０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）中で細胞ペレットを再懸濁した後、再遠心および上清の除去によることが好ましい。得られた細胞ペレットを希釈したグリセロール（例えば、５〜２０％ｖ／ｖ）中で再懸濁し、再遠心して細胞ペレットを再度形成し、上清を除去する。最終的な細胞濃度は、水または希釈グリセロール中で細胞ペレットを所望の濃度まで再懸濁することにより得られる。

エレクトロポレーションにおいて、高ＤＮＡ濃度（約１０倍）を使用することで、形質転換効率が向上し、宿主細胞に形質転換されるＤＮＡ量が増加する。高細胞濃度の使用もその効率を高める（約１０倍）。より多量のＤＮＡが形質転換されれば、より多くの多様性を有し、より多数のユニークな要素を有するコンビナトリアルライブラリーを表す。通常、形質転換された細胞は、培地を含む抗生物質上での成長により選択される。

方法の並び替えや変更を伴う、対象の抗原バインダーを特定するファージディスプレイの使用は、技術分野において確立されている。１つのアプローチは、融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合物に作動可能に連結した転写制御要素を含む変異の複製可能なベクターのファミリーを構築し、好ましい宿主に形質転換し、形質転換された細胞を培養してファージ粒子の表面上に融合ポリペプチドを提示するファージ粒子を形成することを含み、その後、リコンビナントファージ粒子を対象の抗原と接触させることにより選択または選別するプロセスを行い、粒子の少なくとも集団の一部を対象物に結合させ、選択プロセスにおいて結合しない対照粒子に対して結合する粒子のサブセットが増えるようにする。選択されたプールについて、同一の対象物を用いた他の選別回で、他の異なるまたは同一の厳密性を伴って、宿主細胞を感染させることによって増幅する。その後、得られた変異体のプールについて、標的抗原に対してスクリーニングし、新規の高親和性結合タンパク質を特定する。

これらの新規の高親和性結合タンパク質は、アンタゴニストまたはアゴニストとして治療薬として、および／または診断および研究試薬として有用である。

変異アミノ酸を含む可変ドメイン等の融合ポリペプチドは、ファージ、ファージミド粒子または細胞の表面上に発現してもよく、その後、通常は標的抗原である目的の抗原に結合する融合ポリペプチド群のメンバーの能力について選択および／またはスクリーニングしてもよい。

かような融合タンパク質は、宿主細胞内または無細胞系での発現によるリコンビナント技術により、化学合成ルートにより等、いかなる好適なルートで作製してもよい。

ライブラリーメンバーの選択
標的に対するバインダーの選択プロセスは、Ｌタンパク質またはファージ上に提示される抗体もしくは抗体フラグメントに結合するタグ特異的抗体等の抗体の可変ドメインに対して親和性を有する一般的な（generic）タンパク質の選別を含んでもよく、正しく折り畳まれた抗体フラグメント（融合ポリペプチド）を提示するライブラリーメンバーを濃縮するのに用いてもよい。

レセプター等の標的タンパク質は、天然資源から単離しても、または公知の手順によりリコンビナント法で作製してもよい。標的の抗原は、治療対象である多くの分子を含んでもよい。

アフィニティーの選択（選別）について、可能な２つの主要なストラテジーは、（ｉ）固体支持体法またはプレートソーティングまたは固定化標的選別、および（ｉｉ）溶液結合法である。

固体支持体法について、標的タンパク質は、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、多様なアクリルコポリマー、ヒドロキシアクリルメタクリレートゲル、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸コポリマー、ナイロン、中性またはイオン性キャリア等、公知の好ましい固体または半固体のマトリックスと結合していてもよい。

標的抗原のマトリックスとの結合後、固定化された目的物は、少なくとも１つのファージ粒子集団と固定化された標的抗原との結合に適した条件下で、融合ポリペプチドを発現するライブラリーと接触する。通常、ｐＨ、イオン強度、温度等の条件は、生理学的条件を模倣するであろう。固定化した対象に結合した粒子（“バインダー”）は、洗浄により対象に結合しない粒子から分離する。洗浄条件は、高親和性バインダーを除く全ての除去をもたらすために調節することができる。バインダーは、多様な方法により固定化対象から解離してもよい。これらの方法は、野生型リガンド（例えば、過剰な標的抗原）を用いた競合解離、ｐＨおよび／またはイオン強度の変更、および公知の方法を含む。バインダーの選択は、典型的に、０．１Ｍ ＨＣｌまたはリガンド等の適切な溶出物質を用いた親和性基質からの溶出を含む。リガンド濃度を増加させて溶出させることで、提示された親和性の高い結合分子を溶出させることができる。

バインダーを単離した後、その細胞をバインダー（および必要であればヘルパーファージ（例えば、ウイルス粒子がファージミド粒子であるとき））であるウイルス粒子で感染させることにより、好ましい宿主細胞内で再増幅し、宿主細胞を所望の融合ポリペプチドを提示する粒子の増幅に適した条件下で培養する。その後、この方法で標的抗原のバインダーが濃縮されるまで、ファージ粒子を収集し、選択プロセスを１回以上繰り返す。選択または選別について、いかなる回数も利用することができる。選択または選別の手順の１つとして、Ｌタンパク質または提示されたポリペプチド内に存在するポリペプチドタグに対する抗体（ｇＤタンパク質またはポリヒスチジンタグに対する抗体等）等の一般的な高親和性タンパク質に結合するバインダーを単離することを含んでもよい。

他の選択法は、従来の液相選別法に比べて効率が改善された液相選別を可能とする“溶液結合法”である。溶液結合法は、ランダムなライブラリーから元のバインダーを発見すること、または特定の結合クローンもしくはクローン群の親和性を改良するために設計されたライブラリーから改良されたバインダーを発見することに用いられる。この方法は、標識化またはタグ分子と融合した標的抗原によって提示されたファージまたはファージミド粒子（ライブラリー）のもの等、複数のポリペプチドの接触を含む。タグは、ビオチンまたは対応する特異的バインダーが入手可能なその他の成分であってもよい。液相の厳格性は、第１の溶液結合相において、標識化標的抗原の濃度低下を利用することにより変えることができる。

厳格性をさらに高めるため、第１の溶液結合相の後に、第１液相において非標識抗原と最初に結合した後の高濃度の非標識の標的抗原を有する第２の液相に続ける。通常、（もし含まれる場合）第２相では、標識抗原に対して１００〜１０００倍の非標識抗原が用いられる。第１液相のインキュベート時間は、平衡に達するまで、数分から１〜２時間以上にまでわたってもよい。この第１相における結合時間を短縮することで、迅速な結合速度（on-rate）を有するバインダーをバイアスまたは選択してもよい。厳格性を増すために、第２相におけるインキュベーションの時間または温度を変更してもよい。これは、標的からの脱離速度（off-rate）が遅いバインダーの選択バイアスを提供する。

（ファージ／ファージミド粒子上に提示された）複数のポリペプチドが標的抗原と接触した後、標識対象に結合するファージまたはファージミド粒子は結合しないファージから分離される。結合溶相由来の粒子標的混合物は、標識対象成分と接触し、短時間（例えば、２〜５分）で標識対象成分と結合する分子への結合させることで単離される。非標識抗原の初期濃度は、約０．１ｎＭ〜約１０００ｎＭの範囲であってもよい。結合した粒子を溶出し、次回の選別のために増殖する。各選別回につき低濃度の標識標的抗原を用いた、多数回の選別が好ましい。

例えば、約１００〜２５０ｎＭの標識標的抗原を用いた初期選別または選択は、広範囲の親和性を捕捉するのに十分であるはずだが、この因子は経験的におよび／または所望の実践者に適合するように決定されうる。２回目の選別において、約２５〜１００ｎＭの標識標的抗原を用いてもよい。３回目の選別において、約０．１〜２５ｎＭの標識標的抗原を用いてもよい。例えば、１００ｎＭのバインダーの親和性を改善するために、２０ｎＭで開始した後、標識対象５ｎＭおよび１ｎＭで行った後、より低濃度（約０．１ｎＭ等）の標識標的抗原で行うことが望ましい。

ここで記載されるように、所望の特性を有するバインダーを単離するために、固体支持体および液体選別法の組み合わせは有利に利用される。数分間で標的抗原を選択／選別した後、通常、選択されたプールから個別のクローンのスクリーニングを行い、所望の性質／特性を有する特異的なバインダーを特定する。好ましくは、スクリーニングのプロセスは、ライブラリー候補のハイスループットスクリーニングを可能にするため、自動化システムにより行われる。

２つの主要なスクリーニング法は以下に記載される。しかしながら、他の方法も用いてもよい。第１のスクリーニング法は、固定化された標的抗原でファージＥＬＩＳＡアッセイを含み、これは非結合クローンからの特異的結合クローンの特定を提供する。標的がコートされたウェル上およびＢＳＡまたは他の非標的タンパク質がコートされたウェル上でのクローンの同時アッセイにより、特異性を決定づけてもよい。このアッセイはハイスループットスクリーニングについて自動化可能である。

一態様は、複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製し；結合に適切な条件下でライブラリーを標的抗原および少なくとも１つの非標的抗原と接触させ；ライブラリーにおいて非バインダーからポリペプチドバインダーを分離し；標的抗原と結合して非標的抗原と結合しないバインダーを特定し；標的抗原からバインダーを溶出させ；および特異的な抗原と結合するポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅することによる、抗体可変ドメインライブラリーからの特異的な標的抗原に結合する抗体可変ドメインの選択方法を提供する。

第２のスクリーニングアッセイは、本願において具現化された発明であり、ハイスループット様式において低親和性のクローンから高親和性のクローンのスクリーニングを提供するアフィニティースクリーニングアッセイである。アッセイでは、各クローンについて、標的コートウェルに短時間（例えば、５〜１５分）適用する前に、一定時間（例えば、３０〜６０分）で特定濃度の標的抗原とともに第１のインキュベーション有りおよび無しでアッセイする。その後、結合したファージについて、通常のファージＥＬＩＳＡ法で（例えば、抗Ｍ１３ ＨＲＰコンジュゲートを用いて）測定する。（一方のウェルは標的とともにプレインキュベートされ、他方のウェルは標的抗原とともにプレインキュベートされていない）２つのウェルの結合シグナルの比は、親和性の目安である。第１インキュベーションにおける標的濃度の選択は、対象の親和性範囲に依存する。例えば、１０ｎＭより高い親和性のバインダーが望まれるのであれば、第１インキュベーションにおいて１０００ｎＭの標的がしばしば用いられる。特定の回の選別（選択）においてバインダーが発見された時点で、これらのクローンについて、より高親和性のバインダーを特定するためにアフィニティースクリーニングアッセイでスクリーニングしてもよい。

上記の選別／選択方法の組み合わせは、スクリーニング方法と組み合わさってもよい。例えば、一態様において、ポリペプチドバインダーは、固定化された標的抗原への結合のために最初に選択される。

その後、固定化された標的抗原に結合するポリペプチドバインダーを増幅し、標的抗原への結合を目的として、および非標的抗原への結合欠如を目的としてスクリーニングしてもよい。標的抗原に特異的に結合するポリペプチドバインダーを増幅する。その後、これらのポリペプチドバインダーを、濃度の標識化標的抗原と接触させて複合体を形成させることにより、より高親和性を目的として選択してもよく、この際、標識化標的抗原の濃度範囲は約０．１ｎＭ〜約１０００ｎＭであり、標的抗原上の標識と結合する剤との接触により複合体は分離する。その後、ポリペプチドバインダーを標識化標的抗原から溶出させ、必要に応じて選択ラウンドを繰り返し、低濃度の標識化標的抗原を毎回用いる。その後、この選択法を用いて単離された高親和性のポリペプチドバインダーについて、例えば、液相ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて高親和性を目的としてスクリーニングしてもよい。

標的抗原への結合によりバインダーを特定した後、核酸を抽出してもよい。その後、抽出されたＤＮＡについてＥ．Ｃｏｌｉ宿主細胞に形質転換するのに直接用いてもよいし、あるいは、コードする配列について例えば適切なプライマーによりＰＣＲを用いて増幅し、典型的なシークエンシング方法によって配列決定してもよい。バインダーの可変ドメインのＤＮＡを制限酵素で切断した後、タンパク質発現のためにベクターに挿入してもよい。

ある態様において、本発明のポリペプチドを含むライブラリーは、複数回の選別にかけられ、この際、各選別ラウンドは、前回から得られるバインダーを前回の標的抗原とは異なる標的抗原と接触させることを含む。

本発明の他の側面において、成長ホルモン、子ウシ成長ホルモン、インシュリン様成長因子、（ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン等の）ヒト成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インシュリン、プロインシュリン、アミリン、リラクシン、プロリラクシン、（卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体（leutinizing）ホルモン（ＬＨ）等の）糖タンパク質ホルモン、造血成長因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ポリペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、ＮＧＦ−β、等の神経成長因子、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ、エリスロポエチン、骨誘導因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、骨形成タンパク質、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３リガンドおよびキットリガンド等の特異的な標的抗原に対する高親和性バインダーの選択方法が提供される。

本発明の方法は、１つ以上の多様なＣＤＲ領域を有するポリペプチド（例えば、抗原特異的抗原結合分子）のライブラリーを提供する。これらのライブラリーについて、選別（選択）および／またはスクリーニングし、標的抗原に対する高親和性バインダーを特定する。一側面において、ライブラリー由来のポリペプチドバインダーは、標的抗原への結合を目的として、および親和性を目的として、選択される。その後、これらの選択ストラテジーの１つ以上を用いて選択されたポリペプチドバインダーについて、親和性および／または特異性（標的抗原のみに結合して非標的抗原には結合しない）を目的としてスクリーニングしてもよい。

方法は、１つ以上の多様なＣＤＲ領域を有する複数のポリペプチドを作製し、結合に適した条件下で標的抗原を有する複数のポリペプチドを接触させることにより、標的抗原に対するバインダーを目的として複数のポリペプチドを選別し；標的抗原に結合しないバインダーから標的抗原に対するバインダーを分離し；バインダーを単離し；および高親和性バインダーを特定することを含む。標的抗原に結合するバインダーの親和性は、ここで記載されるような競合ＥＬＩＳＡを用いて決定してもよい。必要に応じて、ポリペプチドは、標的抗原の選別と組み合わせてバインダーの選別に用いられるｇＤ、ポリヒスチジンまたはＦＬＡＧ等のポリペプチドタグと融合してもよい。

他の態様は、ａ）本発明の複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製し；ｂ）結合に適した条件下でライブラリーを固定化された標的抗原と接触させることによって、ライブラリーから標的抗原に対するポリペプチドバインダーを単離し；ｃ）ライブラリーにおいて、非バインダーからポリペプチドバインダーを分離し、標的抗原からバインダーを溶出させ；ｄ）ポリペプチドバインダーを有する複製可能な発現ベクターを増幅し；およびｅ）必要に応じて、ステップａ〜ｄを少なくとも２回繰り返すことを含む、ＶＮＡＲライブラリーからの標的抗原と結合する抗原特異的抗原結合分子の選択方法を提供する。

前記方法は、低濃度の標識化標的抗原を毎回用いて、ｆ）混合物を形成するための結合に適した条件で、ポリペプチドバインダーと０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度範囲の標識化標的抗原とを含む増幅された複製可能な発現ベクターをインキュベートし；ｇ）混合物を標的抗原上で標識と結合する固定化剤と接触させ；ｈ）標識化標的抗原に結合したポリペプチドバインダーを分離し、標識化標的抗原からポリペプチドバインダーを溶出させ；ｉ）ポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅し；およびｊ）必要に応じて、より低濃度の標的抗原を毎回用いて、ｆ）〜ｉ）を少なくとも２回繰り返すことをさらに含む。必要に応じて、方法は、混合物への過剰な非標識化標的抗原の添加および標識化標的抗原からの低親和性バインダーの溶出に十分な時間のインキュベートを含んでもよい。

他の態様は、最も低い標的抗原濃度で結合するポリペプチドバインダーを単離するために、低濃度の標的抗原を毎回用いて、ａ）本発明の複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターライブラリーを作製し；ｂ）ライブラリーを少なくとも約０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度の標的抗原と接触させて、標的抗原に対するポリペプチドバインダーを単離し；ｃ）標的抗原からポリペプチドバインダーを分離し、ポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅し；ｄ）必要に応じて、ステップａ〜ｃを少なくとも２回繰り返し；ｅ）ポリペプチドバインダーを数種類の異なる標的抗原の希釈とともにインキュベートすることにより、高親和性で最低濃度の標的抗原と結合するポリペプチドバインダーを選択し、ポリペプチドバインダーのＩＣ５０を決定し；およびｆ）標的抗原に対して約０．１ｎＭ〜２００ｎＭの親和性を有するポリペプチドバインダーを特定することを含む、複製可能な発現ベクターのライブラリーからの標的抗原に対する高親和性バインダーの単離方法または選択方法を提供する。

他の態様は、低濃度の標的抗原を毎回用いて、ａ）ポリペプチドバインダーと標識化標的抗原との複合体を形成するための結合に適した条件下で、ライブラリーを０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度範囲の標識化標的抗原と接触させ；ｂ）複合体を単離し、標識化標的抗原からポリペプチドバインダーを分離し；ｃ）ポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅し；ｄ）必要に応じて、ステップａ〜ｃを少なくとも２回繰り返すことを含む、本発明のポリペプチドを複数含む複製可能な発現ベクターのライブラリーからポリペプチドバインダーを選択するためのアッセイを提供する。

前記方法は、必要に応じて、ポリペプチドバインダーと標的抗原との複合体に対する過剰な非標識化標的抗原の添加をさらに含む。好ましい態様において、方法のステップは２回繰り返され、標的濃度は、１回目の選択では約１００ｎＭ〜２５０ｎＭであり、２回目の選択では約２５ｎＭ〜１００ｎＭであり、３回目の選択では約０．１ｎＭ〜２５ｎＭである。

本発明は、ａ）標的抗原に対するポリペプチドの結合に適した条件下で、ライブラリーの第１のサンプルを濃度の標的抗原と共にインキュベートし；ｂ）標的抗原無しでライブラリーの第２のサンプルをインキュベートし；ｃ）固定化された標的抗原に対するポリペプチドの結合に適した条件下で各第１および第２サンプルと固定化された標的抗原とを接触させ；ｄ）各サンプルについて固定化された標的抗原に結合したポリペプチドの量を検出し；ｅ）第２サンプル由来のポリペプチド結合量に対する第１サンプル由来のポリペプチド結合量の比の計算によって標的抗原に対するポリペプチドの親和性を決定することを含む、本発明のポリペプチドを複数含む複製可能な発現ベクターライブラリーのスクリーニング方法も含む。

ここで記載される作製されるライブラリーは、特異的標的に対する結合を目的として、および非標的抗原に対する結合の欠如を目的として、スクリーニングしてもよい。一側面において、他の態様は、ａ）本発明のポリペプチドを複数含む複製可能な発現ベクターライブラリーを作製し；ｂ）結合に適した条件下でライブラリーと標的抗原および少なくとも１つの非標的抗原と接触させ；ｃ）ライブラリーにおいて非バインダーからポリペプチドバインダーを分離し；ｄ）結合するバインダーを特定し；ｅ）標的抗原からバインダーを溶出させ；およびｆ）特異的抗原に結合するポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅することを含む、ＶＮＡＲライブラリーから特異的標的抗原に結合する抗体可変ドメインについてのスクリーニング方法を提供する。

上記のいかなる選別／選択方法の組み合わせも、スクリーニング方法と組み合わさってもよい。例えば、一態様において、ポリペプチドバインダーは、まず、固定化された標的抗原に対する結合のために選択される。

その後、固定化された標的抗原に結合するポリペプチドバインダーを増幅し、標的抗原に対する結合を目的として、および非標的抗原に対する結合の欠如を目的として、スクリーニングしてもよい。標的抗原に対して特異的に結合するポリペプチドバインダーを増幅する。その後、より高い親和性を目的として、これらのポリペプチドバインダーは、複合体を形成するために濃度の標識化標的抗原と接触させることにより選択し、この際、標識化標的抗原の濃度範囲は約０．１ｎＭ〜約１０００ｎＭであり、複合体は標的抗原上の標識と結合する剤と接触させることにより単離される。その後、ポリペプチドバインダーを標識化標的抗原から溶出させ、必要に応じて一連の選択を繰り返し、低濃度の標識化標的抗原を毎回用いる。その後、高親和性を目的として、この選択方法を用いて単離された高親和性のポリペプチドバインダーについて、例えば液相ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングした。

薬剤組成物および使用
本発明によれば、本発明の抗原特異的抗原結合分子を含む薬剤組成物が提供される。かような組成物は、前記抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質を含む。

薬剤組成物は、治療タンパク質またはそのフラグメントと融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子も含む。治療タンパク質は、ホルモン、成長因子（例えば、ＴＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子、胎盤成長因子）；分化因子；血液凝固因子（例えば、Ｖｉｌａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、フォンビルブラント因子もしくはＣタンパク質）または血液凝固カスケード由来の他のタンパク質（例えば、抗トロンビン）；サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２もしくはＩＬ−３３）またはインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ、例えばＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３）；インターロイキン受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ＲＩＩ）；ケモカイン（例えば、ＭＩＰｓ（マクロファージ炎症タンパク質）、例えばＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１β；ＭＣＰｓ（単球走化性タンパク質）、例えばＭＣＰ１、２または３、ＲＡＮＴＥＳ（regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted））；栄養素；サイトカイン阻害剤；サイトカイン受容体；酵素、例えば、フリーラジカル捕捉酵素（例えば、スーパーオキシドジスムターゼまたはカタラーゼ）またはプロドラッグ変換酵素（例えば、アンジオテンシン変換酵素、デアミナーゼ、ジヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、キナーゼおよびホスファターゼ）；ペプチドミメティック；プロテアーゼ阻害剤；メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ、例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３もしくはＴＩＭＰ４）またはセルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）。

本発明の他の態様において、融合タンパク質中の治療タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）_２（化学的に結合したＦ（ａｂ’）_２鎖を含む）、ｓｄＡｂまたはＢｉＴＥ（bi-specific T-cell engager）等の抗体またはこれの改変フラグメント（engineered fragment）であってもよい。抗体フラグメントは、他のＶＮＡＲ型フラグメント（ＩｇＮＡＲ分子）と同様に、可変ドメインおよびそのフラグメントも含む。本発明の抗体特異的結合分子は、単量体または２量体または３量体または多量体でありうる、および、同一の標的上で同一のまたは異なる標的および／または同一のまたは異なるエピトープを結合することが可能な同種または異種であってもよい。言い換えれば、抗原特異的結合分子は、単特異性、二重特異性、三重特異性または多重特異性であってもよい。本発明の非相同的な抗原特異的結合分子の意味は、同一標的上の異なるエピトープへの結合を意味する。改変フラグメントは、本発明の抗原特異的結合分子と抗体のＦｃフラグメントとのＦｃ融合物も含む。

薬剤組成物は、治療タンパク質と融合して、例えば、２量体、３量体またはより高次の多量体、すなわち、２，３、４、５、６、７または８量体のように、多数の本発明の抗原特異的抗原結合分子で構成されてもよい。

治療タンパク質と本発明の抗原特異的抗原結合分子との融合は、タンパク質上のいかなる便利な位置であってもよく、Ｎ、Ｃおよび／またはＮ／Ｃ末端融合物であってもよい。本発明の一態様において、本発明の抗原特異的抗原結合分子は、治療タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方にある。

本発明の薬剤組成物は、いかなる適切かつ薬学的に許容される担体、希釈液、補助剤または緩衝液を含んでもよい。組成物は、医薬活性剤をさらに含んでもよい。かような担体は、これに制限されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、リポソーム、水、グリセロール、エタノールまたはこれらの組み合わせを含んでもよい。

かような組成物は、示したような医薬活性剤をさらに含んでもよい。添加剤は、治療化合物（例えば、抗炎症薬、細胞毒性薬、細胞増殖抑制薬または抗生物質）であってもよい。かような添加剤は、必要とする患者への投与に適した形態で存在していてもよく、かような投与は同時、別々または連続的であってもよい。成分は必要に応じて指示書を含むキットの形態で作製されていてもよい。

薬剤組成物は、中でも、例えば、経口、局所、静脈内、筋肉内、鼻腔内または皮内経路による投与を含む、いかなる患者の疾患の治療に効果的な簡便な方法で投与されてもよい。治療においてまたは予防として、活性剤は注射可能な組成物（例えば、滅菌水分散液、好ましくは等張）として個人に投与されてもよい。

哺乳動物、特にヒトへの投与について、活性剤の１日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ以上または４ｍｇ／ｋｇ以下であろうと思われる。医師であれば、いかなる場合において、年齢、体重、性別および個々の応答を含む因子に依存した、個人にとって最も適切な実際の用量を決定するであろう。上記用量は平均的なケースの典型である。高用量または低用量が有利である例も当然あり、かような例も本発明の範囲内である。

本発明によれば、薬剤に用いられるための、本発明の抗原特異的抗原結合分子が提供される。ゆえに、本発明のこの側面は、これを必要とする患者における疾患治療のための薬剤の製造における、かような本発明の抗原特異的抗原結合分子の使用に拡張する。本発明の抗原特異的抗原結合分子は、本発明の薬剤組成物に関連して、上記定義されるような特異的結合分子を含む融合タンパク質の作製にも用いられる。

かような使用は、治療上有効な量の本発明の抗原特異的抗原結合分子を含むここに記載される薬剤組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、治療を必要とする患者における疾患の治療方法も包含する。

ここで用いられるように、“治療”との語は、ヒトまたは非ヒト動物のために有用なレジームを含む。獣医学における“非ヒト動物”の治療は、ウマ、ペット（例えば、ネコおよびイヌ）および家畜／農業動物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマの仲間の動物を含む）等の家畜の治療に拡張する。治療は、いかなる存在する症状または疾患に関する治療処置でもよく、予防（予防治療）であってもよい。治療は、遺伝性疾患または後天性疾患に役立ってもよい。治療は、急性症状または慢性症状に役立ってもよい。治療は、炎症および／またはガンに関連する症状／疾患に役立ってもよい。本発明の抗原特異的抗原結合分子は、特に制限されないが、変形性関節症、強皮症、腎疾患、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、または炎症性疾患等の疾患の治療に用いられてもよい。

本発明の抗原特異的抗原結合分子は、患者における疾患症状の性質を調べることにも用いられてもよい。抗原特異的抗原結合分子は、Ｘ線、ガンマ線またはＰＥＴスキャニング、またはこれと同様の撮像技術を用いて、患者体内の疾患部位の画像を作成するのに用いられてもよい。ゆえに、本発明は、適切に検出可能に標識された抗原特異的抗原結合分子を患者に投与した後、患者の身体をスキャンすることを含む、疾患部位のイメージング方法に及ぶ。あるいは、前記分子の患者への投与は、分子投与後、患者由来サンプルを分析することによる試験結果を提供してもよい。

あるいは、抗原特異的抗原結合分子は、インビトロサンプル中または患者体内における標的分析物の存在を検定することに用いられてもよい。サンプルは、細胞、組織、血液、血漿、唾液、涙、精液、脳脊髄液（ＣＳＦ）および／または母乳等、身体由来のいかなる生体サンプル物質であってもよい。かような方法は、対象サンプルに対する適切に標識された抗原特異的抗原結合分子の添加を含んでもよい。次に、対象分析物に対する標識された抗原特異的抗原結合分子の結合は、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）および／または放射免疫測定（ＲＩＡ）アッセイに従って、蛍光、放射線等のいかなる適切な手段で検出されてもよい。

かような態様は、本発明の抗原特異的抗原結合分子の患者への投与またはサンプルへの前記抗原特異的抗原結合分子の添加を含む、患者における疾患または病状の診断方法を含んでもよい。

抗原特異的抗原結合分子は、対象分子のイムノアフィニティー精製における使用をさらに見出してもよい。好ましくは、本発明の抗原特異的抗原結合分子は、対象分子が抗原特異的抗原結合分子に対して着脱可能に結合するよう、対象分子を含むサンプルが通過または提示されている基質に結合してもよい。かようなイムノアフィニティー精製の方法は、例えば治療物質のように、他では十分に高純度な形態での作製が困難である生物源由来の物質の生物学的処理または化学反応における使用を見出せる。

抗原特異的抗原結合分子が結合しうる基質は、ビーズまたは粉末、プレート（例えば、マルチウェルプレート）、マイクロ流体系の形態であるポリマーを含むカラムであってもよい。かような基質は、任意の適切な不活性な材料（シリコン、ガラスまたはプラスチック材料等）からなってもよく、必要に応じてチップ状であってもよい。配置によっては、かような基質上に、同一のまたは異なる抗原特異性の多重抗原特異的抗原結合分子を配置することが好都合である。基質を抗原特異的抗原結合分子に結合させてから、未結合材料を除去するために基質を洗浄した後、精製された物質を適切な方法により溶出してもよい。

本発明は、実証のみのために存在する後述の実施例で言及される方法によりさらに記述され、本発明を限定するものとして解釈されない。

使用される略称：ＶＮＡＲ、可変新規抗原受容体；ｓｃＦｖ、１本鎖抗体フラグメント；ＦＷ、フレームワーク：ＨＶ、超可変ループ；ＣＤＲ、相補性決定領域；ＳＯＥ−ＰＣＲ、スプライスバイエクステンションポリメラーゼ鎖反応（splice-by-overlap extension polymerase chain reaction）。

実施例１：アブラツノザメ由来ＶＮＡＲの配列データベース構築
以下に示す複数の分子生物学的技術を用いて、アブラツノザメ組織からＲＮＡを単離した。

組織からのＲＮＡの単離：インビトロジェンのＴＲＩｚｏｌ試薬（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ １５５９６）を用いて、サメ組織から全ＲＮＡを単離した。標準的な粉末ホモジナイザーを用いて、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬中で約５０〜１００ｍｇの組織をホモジナイズした。用いたＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍＬあたりクロロホルム０．２ｍｌを添加した後、ホモジナイズしたサンプルを、核タンパク質複合体が完全に解離するよう、室温で５分間インキュベートした。チューブを手で激しく１５秒間撹拌した後、４℃で１２０００×ｇで１５分間遠心した。遠心後、ＲＮＡを含む水相を新しいチューブに移し、最初の段階でＴＲＩｚｏｌ１ｍｌあたり７５％エタノール１ｍｌあるいはイソプロパノール０．５ｍｌを添加し、サンプルを室温で１０分間インキュベートした。その後、サンプルを、４℃で７５００×ｇで５分間遠心した。上清を除去した後、ＲＮＡペレットを、７０％（ｖ／ｖ）ＲＮａｓｅフリーエタノール１ｍｌで１回洗浄し、空気乾燥させ、適量（得られたＲＮＡペレットのサイズに依存して２０〜３００μｌ）のＲＮａｓｅフリー水で再懸濁した。ＲＮＡサンプルを分光光度法により定量した。

あるいは、以下の方法により、組織からＲＮＡを単離した。組織を採取し、製造元のプロトコールに従って直ちにＲＮＡＩａｔｅｒ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ）に懸濁した。カラム上でのＤＮａｓｅＩ切断を含むＵｌｔｒａＴｕｒａｘ（Ｏｄｄｓ Ｘ１０３０Ｄ，Ｉｎｇ． Ｂｕｒｏ ＣＡＴ，Ｚｉｐｐｅｒｅｒ ＧｍＢＨ）用いて、全ＲＮＡを単離した。

全血からのＲＮＡの単離：製造元のプロトコールに従い、アンビオン製ＲｉｂｏＰｕｒｅ−Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ｃａｔ＃ＡＭ１９２８）を用いて、（凝集を防ぐためクエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ）で処理し、ＲＮＡＩａｔｅｒ緩衝液でストックした）全血サンプルからＲＮＡを単離した。

縮重ＰＣＲ：ファージディスプレイライブラリーの構築に先立ち、全ての天然ＩｇＮＡＲ転写物を代表するレパートリーを増幅させるプライマーを設計するために、網羅的なｃＤＮＡ配列データベースをまとめることが必須である。これを達成するため、３’ＲＡＣＥプライマーを設計する部分配列を得るための縮重ＰＣＲから開始し、段階的な方法でデータベースを作成した。配列をコードするＩｇＮＡＲを単離するために、コモリザメＩｇＮＡＲ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ：Ｕ１８７０１）に基づくプライマーを用いて縮重ＰＣＲを実行した。これらより、定常ドメインを単離して配列決定し、可変領域から定常ドメインまでわたる、リーダーから全長ＩｇＮＡＲ配列を完成させるための５’ＲＡＣＥプライマーの設計を得た。

Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン、Ｃａｔ １８０８０−０４４）またはＭ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（プロメガ、Ｍ１７０Ｂ）およびプロトコールを用いて、抽出したＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを作製した。以下の定常ドメイン１プライマーを用いて、アブラツノザメ（spiny）組織由来のｃＤＮＡ合成を行った。

Ｃ１−ｆｏｒ１：５’ ＡＴＡ ＧＴＡ ＴＣＣ ＧＣＴ ＧＡＴ ＴＡＧ ＡＣＡ ３’および
Ｎａｒ−Ｃ１−ＦｏｒＭ１：５ ＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＡＣＴＡＴＴＧ ３’。

上記の縮重ＰＣＲ技術により得られたＩｇＮＡＲ配列を分析し、ＩｇＮＡＲ転写物の３’末端の増幅（３’ＲＡＣＥ）に使用するために、以下の方法により複数のプライマーを設計した。実施例２において上述のように全ＲＮＡを単離し、インビトロジェン製ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｃａｔ Ｌ１５００−０１ ）またはインビトロジェン製５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ １８３７４−０５８）を用いて、３’ＲＡＣＥを実行した。５０℃の代わりに４２℃でインキュベートしたこと以外は製造元のプロトコールに従い、インビトロジェン製ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒまたはインビトロジェン製５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ３’ ＲＡＣＥ Ａｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（＃８３６： ５’− ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣ （Ｔ） １７−３’）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩもしくはＩＩＩを用いて、全ＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を合成した。第１のｃＤＮＡ鎖は、推奨プロトコールおよび表１に列挙されているプライマーに従い、クロンテック製Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＭｉｘまたはＢＩＯＴＡＱ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（バイオライン、ｃａｔ ＢＩＯ−２１０６０）を用いたＰＣＲ増幅のために用いた。ＰＣＲ産物を標準アガロースゲルで分析し、合致するサイズのバンドをゲル精製し、クローニングキットのプロトコールに従って、プロメガ製ｐＧＥＭ Ｔｅａｓｙベクター（Ｃａｔ Ａ１３６０）またはクローンＴＡにクローニングした。ＰＣＲ産物を含むクローンを配列決定した。

Ｔｍ特異的プライマーを用いたｃＤＮＡをコードするＮＡＲの単離：上記のようにアブラツノザメ組織からＲＮＡを抽出し、製造元のプロトコールに従って、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック）を用いて逆転写した。キット指示書に従い、生成した３’ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ、供給されたユニバーサルプライマーおよびアブラツノザメ（spiny）ＩｇＮＡＲ Ｃ３特異プライマーＣ３＿ｆｏｒ１（５’−ＧＣＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＣＴＣ ＣＡＴ ＣＧＣ ＣＡＧ−３’）とともに、１回目のＰＣＲを再度実行した。得られるＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ）にクローニングし、このベクター内のＴ７およびＳｐ６プライミング部位を用いて配列決定した。配列決定された１２個のうち１つのクローンは膜貫通テールをコードし、残りは以前クローニングされた分泌型であった。このクローンは、ＮＡＲのＶ領域特異プライマーＮＡＲ＿Ｆｒ１ ｆｏｒ１（５’ ＧＧＡ ＧＡＡ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＴＧＣ Ｇ−３’）とともに用いられた他のＴｍ特異的プライマーＮＡＲ＿Ｔｍ ｒｅｖｌ（５’−ＧＡＧ ＡＡＴ ＡＡＡ ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＡＣ ＧＡＧ ＡＧＣ Ｇ−３’）の設計が、脾臓ｃＤＮＡから完全長のＮＡＲ Ｖ−Ｃ３−ＴｍおよびＮＡＲ Ｖ−Ｃ５−Ｔｍバージョンを増幅することを可能にした。

５’ＲＡＣＥを用いたｃＤＮＡをコードするＮＡＲの単離：以下のようにして、５’非翻訳領域、スプライスリーダー、可変ドメインおよび部分定常ドメインをコードするＮＡＲ ｃＤＮＡクローンを得た。保存領域を特定するため、各種について（上記のように３’ＲＡＣＥから単離された）定常ドメインをコードするヌクレオチド配列を分析した。以下のとおり、これらの同一性の高い領域においてプライマーを設計し、ＮＡＲコード配列の５’ＲＡＣＥの増幅のために用いた。

インビトロジェン製５’ＲＡＣＥシステム（インビトロジェン、Ｃａｔ １８３７４−４１；１８３７４−０５８）および標準的なプロトコールを用いて、ｃＤＮＡ末端の増幅を行った。組織から全ＲＮＡを抽出し、推奨のプロトコールに従い、遺伝子特異プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ／ＩＩＩおよびｄＣテールを用いて第１のｃＤＮＡ鎖を合成した。クロンテック製Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＭｉｘまたはＢＩＯＴＡＱ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（バイオライン、ｃａｔ ＢＩＯ−２１０６０）を、（表２に列挙した）遺伝子特異プライマーと組み合わせて用いたＰＣＲ増幅のために、ｄＣテール化ｃＤＮＡを用いた。適した製造元のプロトコールに従い、ＰＣＲ増幅を増幅した。標準的なアガロースゲル電気泳動によって判断される、合致するサイズの増幅産物をゲル精製し、インビトロジェン製ＴＡクローニングキットのプロトコールに従ってＴＡクローニングするか、あるいは、製造元の標準プロトコールを用いてプロメガ製ｐＧＥＭ Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ、Ａ１３６０）にクローニングした。ＰＣＲ産物を含むクローンを配列決定に送った。

ＰＣＲを用いたｃＤＮＡをコードするＮＡＲの単離：以下のように、ＰＣＲ増幅により、スプライスリーダー領域、可変ドメインおよび部分定常ドメイン１をコードするＮＡＲ ｃＤＮＡクローンを得た。上記のように、５’ＲＡＣＥから得られた配列を分析し、スプライスリーダー配列を特定した。ヌクレオチド配列をアラインし、ヌクレオチド同一性の高い領域におけるプライマーを設計した（指定のフォワードプライマー）。同様に、定常ドメインにおいてヌクレオチド同一性の高い領域を特定し、３’ＲＡＣＥにより得られる配列を分析し、プライマー（指定のリバースプライマー）を設計した。以下のとおり、これらのフォワードおよびリバースプライマーを用いて、ＮＡＲ ｃＤＮＡクローンを得るためにＰＣＲ増幅を行った。

上記のように、複数のアブラツノザメ組織からＲＮＡを抽出した。製造元のプロトコールに従い、プロメガ製またはインビトロジェン製のオリゴｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ／ＩＩＩを用いて、全ＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を合成した。フォワードおよびリバースプライマー（表３）を用いて、このｃＤＮＡを用いてＮＡＲ特異クローンをＰＣＲ増幅した。標準的なアガロースゲル電気泳動により判断される、合致するサイズの増幅産物をゲル精製し、インビトロジェン製ＴＡクローニングキットのプロトコールに従ってＴＡクローニングするか、あるいは、製造元の標準プロトコールを用いてプロメガ製ｐＧＥＭ Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ、Ａ１３６０）にクローニングし、配列決定した。

アブラツノザメＩｇＮＡＲプライマークラスター分析：バイオインフォマティクス分析を実施し、アブラツノザメＩｇＮＡＲ配列を特定し、特徴づけた。オープンリーディングフレームの特定、上記のように単離されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列分析は、クローンをコードするＮＡＲの大ライブラリーを構築するのに用いられる各種ＮＡＲ特異プライマーの設計を可能にした。コモリザメＩｇＮＡＲタンパク質配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｕ １８７２１）は、アブラツノザメ由来ＩｇＮＡＲ配列をまず定義するためにテンプレートとして供した。次に、いくつかのシードアブラツノザメＩｇＮＡＲ配列を選択し、ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントプログラムを用いて複数の配列アラインメントを作製した。この複数のアラインメントを用いて、ＨＭＭＥＲＢＵＩＬＤプログラムを用いてアブラツノザメＩｇＮＡＲ特異的なＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ （ＨＭＭ）プロフィールを構築した。次に、このＨＭＭプロフィールを用いて、ＧＥＮＥＷＩＳＥＤＢプログラムを用いてアブラツノザメｃＤＮＡ配列データベース全体を調べた。各ＩｇＮＡＲ ｃＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームを特定し、アミノ酸配列に翻訳した。次に、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムを用いて、全ＩｇＮＡＲアミノ酸配列をアラインし、既知のコモリザメＩｇＮＡＲ遺伝子構造と比較し、ＩｇＮＡＲドメイン（ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＨＶ２、ＦＷ３ａ、ＨＶ４、ＦＷ３ｂ、ＣＤＲ３およびＦＷ４）を特定した。

実施例２：２Ｖおよび５ＶアブラツノザメＩｇＮＡＲドメインの配列、発現および結晶化
クローン２Ｖおよび５Ｖ（図９に示す配列）を、プラスミドディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−１（Ｆｉｎｌａｙ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００９．３８８（３）：ｐ．５４１−５８）にクローニングし、高レベルのバクテリア発現を示した。結晶化試験のため、ＨＥＫ２９３細胞内で両タンパク質を一時的に発現し、ニッケル捕捉、次いでＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を介して精製した。簡潔には、濃縮溶媒を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５に調整して、ベッド量１５ｍｌのニッケル担体にロードし、Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール０〜２０ｍＭで連続的に洗浄した。Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ ＮａＣｌ ２０〜１５０ｍＭイミダゾールのグラジエントによりタンパク質を溶出した。プールされたタンパク質を２５ｍＭ ＭＥＳ、２５Ｍｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．８で希釈し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／２０ ３００ｍｌがベッドされたカラム上に通した。Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ ２０ｍＭ ｐＨ８．０に対する透析の後、２Ｖおよび５Ｖのタンパク質溶液が１０ｍｇ／ｍｌおよび１９ｍｇ／ｍｌとなるまでそれぞれ濃縮した。蒸気拡散法を用いた懸滴試験は、２つの異なる条件からの結晶をもたらした：２Ｖについて２０％ ＰＥＧ３３５０および２００ｍＭ ＭＧ Ｓ０４、ならびに５Ｖについて２５％ ＰＥＧ４Ｋ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５。

実施例３：ＥＬＳＳ１人工ライブラリー設計
上記のようにＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡ、広範な異なるアブラツノザメ動物および組織由来の全長ユニークなｃＤＮＡ ＶＮＡＲクローンからなるデータベースを用いて、網羅的な“天然の”アブラツノザメ（spiny）ＩｇＮＡＲ（ＡＡ）配列データベースを作製した。ＣＤＲ３の長さ分布に加えて、分析集団を通じた（ＡＡ）含量、相対的位置保存および頻度に関して、まとめられた翻訳されたＶＮＡＲドメインを試験した。人工ライブラリー設計を導くために、この分析を用いた。ＣＤＲ１およびＣＤＲループを起点とし、これらのループ、隣接するフレームワークの含量およびループ長さの範囲および分布を調べた。長さ（ｎ＞１００）プールに従って、ユニークなクローンとしてデータベース内の配列は除いた。アブラツノザメＣＤＲ３の平均長さ（１３±２アミノ酸）として定義したものに対応するよう、１１〜１６アミノ酸の範囲である全ＣＤＲ３ループに焦点を当てた。各長さにおける詳細な含量分析において、ＣＤＲ３に隣接するフレームワーク３および４内のプールのハイライトの保存された残基は除いた。具体的に、我々は、ＣＤＲ３の後の最後の３つのＦＷ３ｂおよび最初の３つのＦＷ４残基の位置として、これらを定義した。さらに、我々は、ＣＤＲ３ループ自身内のＮ末端およびＣ末端における特定のアミノ酸の明らかな保存を発見した。ＣＤＲ３ループにすぐに隣接するＦＷ３ａの３位、２位および１位は、ＣＫＡ、ＣＲＡについて、明らかに優位で、かつきわめて低程度なＣＮＡ配列モチーフを示した。あるクローンにおいてさらなる多様性が観察されたことも注目すべきである；しかし、かなり大幅に低い頻度であった。かような隣接残基が三次元スペース内のループの提示に顕著に影響をもたらしうること、およびパラトープのコンフォメーションに影響を発揮しうることは、一般的に理解される。これを踏まえ、これらの残基が機能性ループ提示において重要であると仮定し、テンプレートのドメインモチーフを保持した。我々は、二重テンプレート設計を用いて、これらの特定領域および人工ライブラリーにおける、表現されたＣＫＡまたはＣＲＡモチーフのいずれかを調節した。実際、このアプローチにより、データベースで発見したように、“天然の”（ＡＡ）配列多様性の７６％を表現することが可能となった。配列データベースにおけるＣＤＲ３のすぐ後の最初の３つのＦＷ４残基は、ＤＧＡモチーフのより高い発生頻度かつより低程度のＹＧＡを示した。再び、我々が用いた二重テンプレートドメイン法は、最終的な人工ライブラリークローンへのこれら両モチーフの取り込み、およびこれらの位置における模倣された“天然の”多様性を容易にした。

我々は、ＣＤＲ３ループ自身内において、より早い、特に最後から２番目および１番目の残基を回避するような、Ｃ末端ＣＤＲ３の特定残基に存在するバイアスを明らかに見ることができた。このバイアスは、まだ解明されていないが、特定の連結またはＪ遺伝子セグメントの使用にほぼ導入されているであろう。これは、生物物理学的または機能的理由のために必然的に進化しているのかもしれない。加えて、ＣＤＲ３の長さの拡張のように、かような位置において発見された特定の好ましい残基における変化があると思われる。この具体例としては、最後から２番目および１番目のＣ末端ＣＤＲ３残基について、分析される最短のＣＤＲ３（１１ＡＡ）から最長（１６ＡＡ）まで試験するときである。ここで我々は、ＷＹ残基含量の増加傾向（Ｗ４２％→６６％およびＹ４３％→８３％）と反比例して、ＤＶ残基モチーフの組み合わせ保存が明らかに減少する（Ｄ４６％→１４％およびＶ４５％→１４％）ことを発見した。これは、これらの特定の末端残基の間の潜在的な共分散の関係性を示唆し、ゆえに、拡張したＣＤＲ３の長さとよく相関すると思われる。

実施例４：ＥＬＳＳ１人工ライブラリー構築
製造元の推奨に従い、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ （ＨＦ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて、特異的変異オリゴヌクレオチドを用いたプラスミド由来２Ｖおよび５Ｖ配列の代表的なテンプレート領域のＰＣＲを実施した。簡潔には、３つの初期ＰＣＲ産物セット（ＦＷ１、ＣＤＲ１−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４をそれぞれ構成するフラグメント）由来の各ＰＣＲ産物を、等モル量のマスターミックスと混合した。次に、スプライスバイオーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲにより、これらのフラグメントを連結した。Ｓｆｉｌ制限エンドヌクレアーゼでＳＯＥ−ＰＣＲ産物を切断し、同様に切断したｐＷＲＩＬ−１ファージミドベクターにライゲーションした。ＳＯＥ−ＰＣＲにより変異サブライブラリー由来の４種類のテンプレートを構築し、これらを構築するのに用いられるＣＤＲ１−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４フラグメントの源に基づいて、プールを定義した。全てのプールについて、両テンプレートに由来する等量のＦＷ１フラグメントを、添加したオリゴヌクレオチド指定合成多様性とともに、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループに含めた。電気的に有効なＥ．Ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を、適切な挿入部を含むライゲーションしたｐＷＲＩＬ−１で形質転換した。サブライブラリーの構築において、我々は、各オリジナルテンプレートから初期ＰＣＲ産物を３セット作製し、特に、テンプレートはフレームワーク１（ＦＷ１）、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３をほぼ含む３つの別個の領域に分けた。テンプレート特異的なトリヌクレオチド（ＴＲＭ）オリゴマー（Ｇｅｎｅｌｉｎｋ）（Ｖｉｒｎｅｋａｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９４．２２（２５）：ｐ．５６００−７）を用いて、定義したＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループ領域を変異させた。あえて除外したシステインを除いていかなる（ＡＡ）を特定の位置でランダムに取り込むために、ＴＲＭオリゴヌクレオチドを設計した。ＴＲＭオリゴに加えて、我々は、より根本的な設計アプローチにより定義される変異を取り込むために、３つのさらなるテンプレート特異的ＣＤＲ１標的オリゴも用いた。設計される含量について、“天然の”アブラツノザメＶＮＡＲドメイン配列の分析を用いて決定し、定義された縮退コドンおよび直接的な相同コドンとともにオリゴヌクレオチドを用いてライブラリーに取り込んだ。各プールの形質転換数は以下の通りである：プールＡ（２Ｖ−２Ｖ）１．３８×１０^１０、プールＢ（５Ｖ−２Ｖ）２．７２×１０^１０、プールＣ（２Ｖ−５Ｖ）１．９４×１０^１０およびプールＤ（５Ｖ−５Ｖ）３．２４×１０^１０、よって最大の最終組み合わせライブラリープールサイズは９．２８×１０^１０であった。

実施例５：非選択ＥＬＳＳ１人工ライブラリークローンのＱＣ分析
非選択ＥＬＳＳ１ライブラリークローンをランダムにピックアップし、ＤＮＡを単離して、これらの配列を分析した。この分析の目的は、最終的なライブラリー内に良好に取り込まれた全ての意図される設計の特徴に対する程度を決定することであった。全体として、我々は、例外なく設計に含まれる全ての取り込まれたシャッフルおよびオリゴヌクレオチド指定変異の例を発見した。さらに、いくつかのサンプルクローンをランダムに選択し、ＶＮＡＲタンパク質の発現を誘導し、ペリプラズム分画を単離し、タンパク質が生成してバクテリアのペリプラズム抽出物に局在していることを確認するためにウェスタンブロットにより分析した。我々は、２つのテンプレート設計に由来するハイブリッドクローンにおけるタンパク質の発現についても確認した。さらに、我々は、オリジナルの“天然の”データベースを有する非選択のライブラリークローンのパネルのために、両標的ループ、ＣＤＲ１（ｎ＝２８５）およびＣＤＲ３（ｎ＝２４６）の含量分布を比較した。全体的に見ると、分析は、非選択ＥＬＳＳ１合成クローンが同様の多様性（ＡＡ）含量を付与し、その合成を導くのに用いられた“天然の”アブラツノザメデータベースと類似することを示した。我々は、“天然の”、選択されたおよび非選択のＥＬＬＳ１ライブラリークローンのＣＤＲ３ループの長さ分布を比較した。ここで、我々は、大部分について、非選択人工ライブラリー集団は、９（ＡＡ）長さのループのわずかな表現とともに、８〜１６（ＡＡ）ループ長さで等しく均一に分布していることを発見した。

実施例６：複数の標的に対するＥＬＳＳ１人工ＶＮＡＲライブラリーのバイオパニング（biopanninq）による機能的含量バリデーション
ＥＬＳＳ１の質および機能を立証するために、種々の標的（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒトＲＡＧＥ、ヒトＤＬＬ−４、卵白リゾチーム（ＨＥＬ）、およびマウスＩＣＯＳＬ）に対して、固体およびプレコートビーズの両方に基づく方法を用いた。各ターゲットについてポジティブヒットを得た（図５〜１２）。簡潔には、以下のように固体の選択を行った：イムノチューブを、４ｍｌＰＢＳ中で所望の濃度の標的抗原でコートした。その後、チューブを処理し、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、チューブを２％（ｗ／ｖ）Ｍ−ＰＢＳで１時間かけてブロックした。０．５〜１ｍｌのインプットファージのＭ−ＰＢＳ溶液（最終濃度２％（ｗ／ｖ））でブロックし、１時間回転させた。次に、ブロックファージをチューブに添加し、２％（ｗ／ｖ）Ｍ−ＰＢＳで４ｍｌにし、２０ｒｐｍで１時間回転させながらインキュベートした後、さらに１時間静置インキュベートした。未結合ファージを捨て、チューブをＰＢＳＴで５〜１０回洗浄した後、ＰＢＳで５〜１０回洗浄した。１００ｍＭトリエチルアミン１ｍｌを添加して２０ｒｐｍで１０分に達するまで回転させながらファージを溶出させた。溶出したファージ溶液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５ １ｍｌの添加により中和した。溶出したファージを対数増殖期中期（mid-log）のＥＲ２７３８細胞１０ｍｌに加え、混合し、３７℃で３０分間無撹拌でインキュベートした後、２，５００ｇで１５分間遠心した。ペレットを２×ＴＹ−Ｇ１ｍｌで再懸濁し、ＴＹＥ−ＧＡ寒天培地を含むＢｉｏ−Ａｓｓａｙディッシュ上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。

プレコートビーズアッセイについて、製造元の指示により抗原をビオチン化した。ビオチン化材料を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプトアビジン（インビトロジェン）３０μｌと共に２０ｒｐｍで回転させながら、室温で３０分間インキュベートした。室温で１時間撹拌することにより、インプットファージおよびＤｙｎａｂｅａｄｓを４％（ｗ／ｖ）Ｍ−ＰＢＳでプレブロックした、上記と本質的に同一な方法を用いて、プレコートビーズを用いたライブラリー選択を行った。次に、ブロックビーズを添加して室温で１時間回転させることによりファージを脱選択した後、室温で１時間、２０ｒｐｍで抗原コートビーズを添加した。ＰＢＳＴで５回洗浄後、１００ｍＭ ＴＥＡ４００μｌ中で８分間回転させることにより、結合したファージを溶出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５ ２００μｌを添加して中和した。固相選択で述べたように、溶出したファージのＥ．Ｃｏｌｉ感染を行った。

ヒットの親和性測定（図５）：全てのＢＩＡｃｏｒｅ分析は、Ｔ−１００バイオセンサー、シリーズＳ ＣＭ５チップ、アミンカップリングキット、１０ｍＭ酢酸ナトリウム固定化バッファー（ｐＨ４、４．５、５．０および５．５）、１０×ＰＢＳランニングバッファーおよび５０ｍＭ ＮａＯＨ（ＧＥヘルスケア）を用いて実施した。アッセイ条件は、詳細には以下のように、質量変動、親和性および再結合現象の影響を最小化するよう確立した。リファレンス減算および特異性分析のため、別個のフローセル（Ｆｃ１）についてｈＲＡＧＥタンパク質を用いた固定化を実施した。精製ＶＮＡＲタンパク質をＨＢＳ−Ｐランニングバッファーで最終濃度範囲（グローバルフィット分析を用いた動力学定数の算出のために、６００〜３７．５ｎＭから始まる２倍希釈）に希釈した。各濃度を高流速（３０ｍｌ／分）で３分間インジェクションし、５分間で解離させた後、５０ｍＭ ＮａＯＨで５秒再生パルスさせた。各濃度におけるリファレンスを差し引いたセンサーグラムについて、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェア（１．１．１）を用いて分析した。

精製抗ＨＳＡ ＶＮＡＲタンパク質のＢＩＡｃｏｒｅ分析
以下の例外を伴って上記に従い、本分析を実施した。フローセル３、４それぞれのヒトおよびマウス血清アルブミン（ＨＳＡ／ＭＳＡ）１０００ＲＵ表面に加え、標的固定化表面密度３００ＲＵについて試験した。さらに、ネガティブＦｃ１をＤＬＬ４タンパク質でコートした。精製からより多くのタンパク質を有するほど、我々はより高濃度の範囲（８００〜５０ｎＭに始まり２倍希釈液）を試験した。

精製抗ＲＡＧＥ ＶＮＡＲタンパク質のＢＩＡｃｏｒｅ分析
以下の例外を伴って上記に従い、本分析を実施した。フローセルの標的固定化表面密度は以下のとおりである：Ｆｃ１−１０００ＲＵ ＤＬＬ４ネガティブコントロール表面；Ｆｃ２−１０００ＲＵ ｈＲＡＧＥ（単量体）；Ｆｃ３−１０００ＲＵ ｈＲＡＧＥ（２量体）；Ｆｃ４−１０００ＲＵ ｍＲＡＧＥ（２量体）。

精製抗ＤＬＬ４ ＶＮＡＲタンパク質のＢＩＡｃｏｒｅ分析
上記に従って本分析を実施した。ＥＬＩＳＡベース法（図示せず）およびＦＡＣＳベース法（図６ＡおよびＢ）の両方により、ヒットの選択性を試験した。以下のとおり、ＥＬＩＳＡを実施した：抗原を４℃で一晩コートした。４％ ＭＰＢＳ（Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳ）で９６ウェルプレートを３７℃で１時間ブロックした。（ＰＢＳで適切な濃度に希釈した）検出抗体を室温で１時間インキュベートし、次に、二次ＨＲＰコンジュゲート抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。ＴＭＢ基質の添加により、シグナル検出を得た。

選択されたポジティブ単量体ＶＮＡＲドメインについて、ＨＥＫ２９３懸濁培養において発現タンパク質ポストＰＥＩ媒介連続発現のＡタンパク質のアフィニティー精製を容易にする、所有のＦｃ哺乳類発現ベクターへのクローニングと互換性のある制限部位および隣接残基を導入するプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅した。通常、ＶＮＡＲ Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルは、用いる血清フリー培地１リットルあたり５０〜７０ｍｇの領域内である。本質的には、遠心および０．２μｍろ過により濃縮培地から発現後細胞片を除去した後、詳細には上記のように、アフィニティークロマトグラフィーを行い、タンパク質を、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６０サイズ排除カラムに通すことにより、最後の精製（polishing）段階にかけた。ＳＥＣからの溶出ピークをアミコンウルトラフィルターキットを用いて濃縮し、ＵＶ分光法によりタンパク質濃度を決定した。

ＦＡＣＳアッセイを以下のとおり実施した：ＣＨＯ細胞を発現する親、ｍＩＣＯＳＬおよびｈＩＣＯＳＬリガンドをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳおよび５％ＥＤＴＡを３７℃で１０〜１５分間添加することにより、フラスコから除去した。フラスコ表面で上下にピペッティングすることにより細胞を単分散させ、１２００ｒｐｍでスピンダウンし、５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで再懸濁した。細胞を０．５〜１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに等分した。細胞を、ＨＥＫ２９３ ＶＮＡＲ−ｈＦｃ発現タンパク質で１００μｌ組織培養上清とともに、１６℃で３０分間インキュベートした後、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳで３回洗浄した。次に、細胞を１ｇ／ｍｌ抗ｈＦｃビオチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１００μｌと共に、１６℃で３０分間インキュベートした。２％ＦＣＳ含有ＰＢＳで３回洗浄した後、ストレプトアビジンＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を１ｇ／ｍｌで添加し、１６℃で３０分間。２％ＦＣＳ含有ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ４００μｌに再懸濁し、ＦＡＣ−Ｃａｎｔｏ−２上での分析のためにＦＡＣＳチューブに移した。

実施例７：インビトロおよびインビボでのｍＩＣＯＳＬおよびＤＬＬ４に対するヒットの機能的バリデーション
２種類の細胞に基づくアッセイにより、抗ｍＩＣＯＳＬヒットのインビトロ有効性を測定した。はじめは、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）においてマウスＩＣＯＳ受容体を発現するＣＨＯ細胞が５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中でコンフルエントになるまで成長させたときの、リガンド−受容体中和アッセイである（図７Ａ）。ｍＩＣＯＳＬ−ｈＦｃ（４５０ｎｇ／ｍｌで２０μｌ）を、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、抗ｍＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲ−ｈＦＣ４０μｌとともに１時間インキュベートした後、細胞に添加した。１６℃で１時間インキュベートした後、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で細胞を穏やかに３回洗浄し、同じ培地で１：１００００に希釈したヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ）とともに１６℃で４０分間インキュベートした。その後、細胞を再度２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で３回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＴＭＢ基質とともに成長させた。第二のアッセイは、簡単には以下のとおり実施したＤ１０増殖アッセイである（図７Ｂ）：トシル活性化磁気Ｄｙｎａｌビーズを、製品添付の指示に従って、ｍＩＣＯＳＬ、抗ｍｕＣＤ３ｅおよびｈｌｇＧ１フィラーでコートした（ビーズ１×１０^７個あたり、ＩＣＯＳＬ １μｇ／抗ＣＤ３ ０．５μｇ／ｈｌｇＧ１ ３．５ μｇ）。アッセイ立ち上げに先立ち、およそ８０００〜４００００ＣＰＭの読み取りを与える最適な濃度を決定するため、ビーズを滴定した。５０μｌ／ウェルのビーズを、１００μｌのＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｇ／ｌグルコースおよび５０μＭ ＢＭＥで希釈した滴定抗体を含む９６ウェルプレートに添加した。

Ｄ１０．Ｇ４．１細胞をアッセイ培地で４回洗浄し、８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう、Ｃｏｎ Ａ（ＢＤ ｃａｔ＃３５４１ １５）、２．５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２および１０ｐｇ／ｍｌ ＩＬ−１αとともに１０％ Ｒａｔ Ｔ ｓｔｉｍ因子を含有する上記の培地で再懸濁し、５０μｌ／ウェル＝４００００ｃｅｌｌｓ／ウェルで添加した。全てのウェルの最終量を２００μｌにし、４８時間インキュベートした。１μｃｉ／ウェルの３Ｈチミジンを添加し、５〜７時間インキュベートした。ＣＰＭを採取し、カウントした。

細胞ベース中和アッセイおよび細胞死、内在化アッセイにより、抗ＤＬＬ４ヒットのインビトロ有効性を測定した（図７ＣおよびＤ）。中和アッセイ（図７Ｃ）は以下のとおり実施した。ＭＥＭ、１×（Ｃｅｌｌｇｒｏ ＃１０−０１０−ＣＶ）、１０％ＦＢＳ、１％ ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ、５００ｇ／ｍｌ Ｇ４１８硫酸塩含有１％グルタミン中で、６０〜７５％コンフルエントに達するまでＨＥＫ２９３／ＤＬＬ４および親ＨＥＫ２９３細胞を成長させた。マッコイ５Ａ（ＧＩＢＣＯ，＃１２６０５）、１０％ＦＢＳ、１％ ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ、２５０ｇ／ｍｌ Ｇ４１８硫酸塩含有１％グルタミン、３００ｐｇ／ｍｌハイグロマイシン、１ｐｇ／ｍｌピューロマイシン中で、６０〜７５％コンフルエントに達するまで、Ｕ−２ ＯＳ／Ｎｏｔｃｈ １（ルシフェラーゼレポーター株）およびＵ−２ ＯＳ親細胞を成長させた。アッセイのために、両培地を１：１で混合し、全量１００μｌにおいて約１００００ｃｅｌｌｓ／ウェルのＮｏｔｃｈ １およびＤＬＬ−４を不透明底の９６ウェルプレートにｎ＝３で（in triplicate）播種した。試験抗体サンプルをプレート上で滴定し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。それぞれ、１００μｌのＤｕａｌ−ｇｌｏルシフェラーゼバッファー（プロメガ、＃Ｅ２９８０）を添加し、室温で２０分間振とうした。７００ｎｍでルシフェラーゼシグナルを測定した。ＳｔｏｐおよびＧｌｏ基質バッファーを１／１００に希釈し、１００μｌを各サンプルに添加して室温で２０分間後、約７００ｎｍでルシフェラーゼ測定の第二セットを行った（バックグラウンドレニラ（renilla）蛍光）。両測定の比を取り、出力値とした。

上記のようにＨＥＫ２９３細胞を発現するＤＬＬ４を成長させ、さらに４日間のインキュベートで増殖を確保する細胞密度で、１２０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート内に播種した。接着させるため、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４〜６時間インキュベートした。試験抗体および二次サポリン試薬（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＩＴ−５１）の５×ストック溶液を、培地中で１：２のモル比で混合し、複合体を形成させるため、室温で５分超置いた。次に、この混合物を順次希釈し、３０ｍｌを細胞の各ウェルに添加した。プレートを４日間インキュベートした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを１／５希釈（ＭＴＳ）（プロメガ、＃Ｇ５４３０）で添加した。次に、プレートを３７℃で、色の変化および（バックグラウンドの減算のために）４９０ｎｍおよび６５０ｎｍでの吸光度の読み取り値に依存して１．５〜５時間インキュベートした。

関節リウマチのマウスモデルで、抗ｍＩＣＯＳＬのヒットのインビボ有効性を決定した（図８）。モデルは、ＲＡのコラーゲン誘導マウスモデル（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２：１６９）であり、フロイント完全アジュバントに１０個体の雌ＤＢＡ１マウスのグループにウシコラーゲンを注射し（０日目）、その後２０日目に増加させた。試験抗ｍＩＣＯＳＬ ＶＮＡＲ−ｈＦｃドメイン、ポジティブ（ＨＫ５．３ｍＡｂ）およびネガティブコントロール（２Ｖ−ｈＦｃ）を、２０、２２、２４および２６日目に１５ｍｇ／ｋｇＰＢＳ溶液ｉ．ｐ．臨床スコアで投与し、体重を週２回測定した。臨床スコアは、足蹠および指の炎症（footpad and digit inflammation）のキャリパー試験（caliper measurement）に基づいた：１ｐｔ／指、５ｐｔｓ／むくんだ足蹠（swollen footpad）、５ｐｔｓ／むくんだ足首（awollen ankle）、つまり、１５ｐｔｓ／足および６０ｐｔｓ／動物となる。

実施例８：標的に対するクローンのアラインメント
図１６は、ＥＬＳＳ１のスクリーニングに用いた３種類の標的に対する先頭のクローンのアラインメントを示す。アラインメントは、２Ｖおよび５Ｖフレームワークの組み合わせがこれらのクローンに寄与することを示す。陰影のないアミノ酸は、両フレームワーク間に保存されるため、ライブラリーを通じて規格化される。ハイライトされた領域は、選択されたクローンが５Ｖおよび／または２Ｖ配列から寄与されるのか否かに依存して誘導される差異のある箇所である。全てのこれらのクローンは、種々のインビトロアッセイで有効性を示すリードクローンであり、ｍＩＣＯＳＬもインビボアッセイで有効性を示す。これらのクローンのうち５つは、配列（ＣＣ３、Ｃ４、１Ｄ１２、２Ｄ４、１Ｈ０２）を通じて２Ｖを有する。全ＤＬＬ４クローンを含む他の全てのものは、２Ｖ／５Ｖフレームワーク融合物である。

実施例９：ＥＬＳＳ２人工ライブラリー設計
第二のフレームワークライブラリーを設計し、２種類の異なる板鰓亜綱種（アブラツノザメおよびコモリザメ）に由来するＶＮＡＲドメインの３種類の異なるアイソタイプのフレームワークを取り込むことを構築した。３種類の異なるＶＮＡＲドメインアイソタイプ（免疫されたコモリザメから単離されるＩＩ型アイソタイプドメインＥ９に加え、アブラツノザメ２Ｖ（アイソタイプＩＩｂ）、５Ｖ（アイソタイプＩＩＩｂ）ＶＮＡＲドメイン）の間の配列分析に基づいて、２種類のテンプレートフレームワーク融合構築物を設計した。図１８では、ＥＬＳＳ２ライブラリーを基礎として構築された２つのハイブリッドテンプレートフレームワーク配列（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を実証している。ＣＤＲ３ループの長さ（９、１１、１３、１５および１７アミノ酸）および配列の両方において付加されたオリゴヌクレオチド指向の（ＮＮＫオリゴ）人工的多様性を有するＳＯＥ−ＰＣＲにより、２つのテンプレート由来である変異サブライブラリーを構築した。

実施例１０：ＥＬＳＳ２ライブラリーの構築およびバイオパニング
２Ｖ、５ＶおよびＥ９ ＶＮＡＲドメインに基づき、２種類のフレームワーク融合テンプレートを設計した。融合テンプレートを含むプラスミド構築物を合成し（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、遺伝子挿入部をＫｐｎｌおよびＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼで切断するか、製造元の推奨に従い、Ｐｈｕｓｉｏｎ高フィデリティーポリメラーゼマスターミックス（ＮＥＢ）を用いてＰＣＲ増幅した。固定長（９、１１、１３、１５または１７アミノ酸）のＮＮＫオリゴを取り込むことにより、両フレームワークテンプレート上のＣＤＲ３ループのランダムオリゴヌクレオチド人工的多様性を得た。ＦＷ１−ＦＷ３およびＣＤＲ３−ＦＷ４アンプリコンを用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲにより全長ＶＮＡＲ遺伝子配列を組み立てた。Ｓｆｉｌ制限エンドヌクレアーゼでＰＣＲ産物を切断し、同様に切断したファージミドベクターにライゲーションし、エレクトロコンピテントＥ．Ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換し、およそ２×１０^８クローンの組み合わされたサイズを有する２つのサブライブラリーを得た。

ＥＬＳＳ２ライブラリーの質および機能性をバリデーションするために、図６に記載されるものと同じ方法を用いて、ＩＣＯＳＬに対して用いられるプレコートビーズに基づくバイオパニング法を用いた。２回目のパニング（pan 2）後にポジティブなファージヒットを得た（図１９）。テンプレート１のフレームワーク構築物由来の７つの発生源およびテンプレート２のフレームワーク構造物由来の残りの４つとともに１１個のポジティブクローンを配列決定した。全てのＣＤＲ３配列はユニークであった（図２０）。これらのポジティブクローンの中でも、５つ（テンプレート１から３つおよびテンプレート２から２つ）全てが、ＩＩ型構造に関連するＣＤＲ１およびＣＤＲ３の双方でＣｙｓ残基を有した。

Claims (25)

1. （１）板鰓亜綱（Elasmobranchii subclass）の種のメンバーからＲＮＡを単離し；
   （２）抗原特異的抗原結合分子をコードする上記（１）で得られたＲＮＡからＤＮＡ配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列のデータベースを作成し；
   （３）上記（２）で作成されたデータベースからＤＮＡ配列を選択し；
   （４）上記（３）において選択された配列内のＣＤＲ１またはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の２以上の隣接するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成し、この際前記２以上の隣接するペプチドドメインは、ライゲートされた際に、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、および前記２以上の隣接するペプチドドメインは、上記（３）において選択される少なくとも２つの異種のＤＮＡ配列由来である；
   （５）前記２以上の隣接するペプチドドメインをコードする増幅されたＤＮＡ配列をライゲーションして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成し；
   （６）上記（３）で得られた増幅されたＤＮＡのディスプレイベクターにクローニングし；および
   （７）前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製する、
   ことを含む、下記式（Ｉ）で表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子のライブラリーの作製方法。
   
2. （１）請求項１に記載の方法により作製されたライブラリーから所望のクローンを選択し；
   （２）前記クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製し；
   （３）前記抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし；および
   （４）宿主を形質転換して、前記発現ベクターを発現させる、
   ことを含む、抗原特異的抗原結合分子の製造方法。
3. （１）板鰓亜綱（Elasmobranchii subclass）の種のメンバーからＲＮＡを単離し；
   （２）抗原特異的抗原結合分子をコードする上記（１）で得られたＲＮＡからＤＮＡ配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列のデータベースを作成し；
   （３）上記（２）で作成されたデータベースからのＤＮＡ配列を選択し；
   （４）上記（３）において選択された配列内のＣＤＲ１またはＣＤＲ３ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の２以上の隣接するペプチドドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅して、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたＤＮＡ配列を形成し、この際前記２以上の隣接するペプチドドメインは、ライゲートされた際に、式（Ｉ）の抗原特異的抗原結合分子をコードし、および前記２以上の隣接するペプチドドメインは、上記（３）において選択される少なくとも２つの異種のＤＮＡ配列由来である；
   （５）前記２以上の隣接するペプチドドメインをコードする増幅されたＤＮＡ配列をライゲーションして、式（Ｉ）のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするＤＮＡ配列を形成し；
   （６）上記（３）で得られた増幅されたＤＮＡのディスプレイベクターにクローニングし；および
   （７）前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製し、
   （８）前記ライブラリーから所望のクローンを選択し；
   （９）前記クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製し；
   （１０）前記抗原特異的抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングし；および
   （１１）宿主を形質転換して、前記発現ベクターを発現させる
   ことを含む、下記式（Ｉ）で表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子の製造方法。
   
4. 前記２以上の隣接するペプチドドメインは、ＦＷ１、ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３、およびＣＤＲ３−ＦＷ４である、請求項１または３に記載の方法。
5. 複数の抗原特異的抗原結合分子をコードする発現可能なＤＮＡ配列のライブラリーを含む形質転換宿主を用いた抗原特異的抗原結合分子の製造方法であって、前記ライブラリーは少なくとも２つの異種のアイソタイプＮＡＲ配列から作製され、前記抗原特異的抗原結合分子は、板鰓亜綱（Elasmobranchii subclass）の種のメンバーにおいて発見される免疫グロブリンアイソタイプＮＡＲの可変領域の複数のドメインを有する、方法。
6. 式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列：
   上記式（ＩＩ）中、
   Ａは、配列番号１、配列番号４または配列番号７であり、
   Ｘは、５、６または７アミノ酸残基を有するＣＤＲ１領域であり、
   Ｂは、配列番号２、配列番号５または配列番号８であり、
   Ｙは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７アミノ酸残基を有するＣＤＲ３領域であり、
   Ｃは、配列番号３または配列番号６であり、
   または、これと少なくとも５０％相同である配列、
   この際、配列番号１は、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴまたはＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＷＴＧＡであり、
   配列番号２は、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
   配列番号３は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
   配列番号４は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴまたはＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡであり、
   配列番号５は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
   配列番号６は、ＹＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
   配列番号７は、ＡＲＶＤＱＴＰＱＴＩＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤであり、および
   配列番号８は、ＴＹＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡまたはＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡである、
   を有する抗原特異的抗原結合分子。
7. 前記式（Ｉ）の配列が配列番号１０である、請求項６に記載の抗原特異的抗原結合分子。
8. 前記式（Ｉ）の配列が配列番号１２である、請求項６に記載の抗原特異的抗原結合分子。
9. 前記ＣＤＲ１領域が図１７で示されるＣＤＲ１領域である、請求項６に記載の抗原特異的抗原結合分子。
10. 前記ＣＤＲ３領域が図１７で示されるＣＤＲ３領域である、請求項６に記載の抗原特異的抗原結合分子。
11. 図１１、１２、１３、１４、１５または１６のいずれかに示される配列を有する、請求項６に記載の抗原特異的抗原結合分子。
12. ヒト化された、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の抗原特異的結合分子。
13. 請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗原特異的抗原結合分子を有する融合タンパク質。
14. 前記抗原特異的抗原結合分子が生理活性タンパク質に融合している、請求項１３に記載の融合タンパク質。
15. 請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗原特異的抗原結合分子または請求項１３もしくは１４に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
16. 請求項１５に記載の核酸を含む核酸構築物。
17. 請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
18. 請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗原特異的抗原結合分子または請求項１３もしくは１４に記載の融合タンパク質の製造方法であって、宿主細胞内で前記分子をコードする核酸配列を発現させる段階を含む、方法。
19. 請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗原特異的抗原結合分子または請求項１３もしくは１４に記載の融合タンパク質を含む薬剤組成物。
20. 薬剤に用いられるための、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗原特異的抗原結合分子または請求項１３もしくは１４に記載の融合タンパク質。
21. 疾患の治療を必要とする患者の疾患を治療するための薬剤の製造における、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗原特異的抗原結合分子または請求項１３もしくは１４に記載の融合タンパク質の使用。
22. 治療上有効な量の請求項１９に記載の薬剤組成物を治療を必要とする患者に投与することを含む、治療を必要とする患者における疾患の治療方法。
23. 検出可能に標識化された請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗原特異的抗原結合分子または請求項１３もしくは１４に記載の融合タンパク質をサンプルに添加し、および標的分析物に対する分子の結合を検出することを含む、サンプル中の標的分析物の存在の検定方法。
24. 検出可能に標識化された請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗原特異的抗原結合分子または請求項１３もしくは１４に記載の融合タンパク質を患者に投与することを含む、患者における疾患部位のイメージング方法。
25. 請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗原特異的抗原結合分子または請求項１３もしくは１４に記載の融合タンパク質を患者に投与することを含む、患者における疾患または症状の診断方法。