CN116829584A - 一种抗pd-1的单域抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗PD‑1的单域抗体。本发明提供一种抗PD‑1的单域抗体，所述抗PD‑1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5～6其中之一所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.9～12其中之一所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.17～21其中之一所示的CDR3。本发明所提供的抗PD‑1的单域抗体具有对于PD‑1的特异性结合能力，且可以用于进一步构建融合蛋白等，构建获得的融合蛋白还可以提高T淋巴细胞中IFN‑γ和/或IL‑2表达，并可以有效抑制肿瘤的生长，具有良好的产业化前景。

Description

一种抗PD-1的单域抗体 技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗PD-1的单域抗体。
背景技术
程序性死亡受体-1(programmed death receptor-1，PD-1)，是一种重要的免疫抑制分子，与其配体结合，起到抑制T细胞活化的作用。PD-1主要在激活的CD4+、CD8+T细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、巨噬细胞、B细胞表面及部分肿瘤细胞表面广泛表达。
PD-1的配体包括程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)和程序性死亡配体2(programmed death ligand 2，PD-L2)，其中PD-L1是主要配体。
肿瘤发展过程中，癌细胞会通过上调PD-L1表达，诱导T细胞的凋亡，避免免疫系统对其的清除，从而导致疾病的进展。近年来，利用靶向PD-1/PD-L1蛋白的单克隆抗体药物，通过阻断PD-1/PD-L1的结合，进而促进体内T细胞的活化和增殖，达到杀伤肿瘤细胞的目的，已在多种肿瘤，如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌等治疗应用，取得显著的疗效。因此，PD1/PD-L1通路已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点。目前，抑制PD1/PD-L1通路的抗体药物，已经在临床上获得巨大成功，其中，百时美施贵宝的Nivolumab，默沙东的Pemrolizumab，罗氏的Atezolizumab，默克的Avelumab，阿斯利康的Durvalumab以及再生元的Cemiplimab先后上市。针对PD1/PD-L1通路的抗体药物，已经成为肿瘤治疗市场中最具潜力的领域。
与大分子单克隆抗体相比，单域抗体(VHH)，尤其是来源于羊驼的单域抗体，正逐渐成为肿瘤治疗领域的后起之秀。这得益于羊驼来源单域抗体自身独特的性质：1)序列与人VH家族3和4同源性高，使得它免疫原性弱；2)分子量小，仅15kDa左右，结构简单，很容易在微生物中大量表达，易于纯化。单域抗体的独特性质和低成本使其应用范围大为拓展，显示出其在疾病的治疗和诊断中具有的价值。但是，现有技术中，获得高亲和力、高特异性且具有产业化前景的单域抗体仍不是一件容易的事，因为仅以三个互补决定区(CDR)发挥结合抗原作用的抗体的筛选要远远难于以6个CDR区来发挥结合抗原作用的抗体，这也使得目前真正商品化或临床前在研的主流抗体仍然是分子量较大的单克隆抗体。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗PD-1的单域抗体，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种抗PD-1的单域抗体，所述抗PD-1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5～6其中之一所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.9～12其中之一所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.17～21其中之一所示的CDR3。
本发明另一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括上述的抗PD-1的单域抗体，所述第二结构域包括具有延长体内半衰期作用的结构域和/或对效应细胞具有结合作用的结构域。
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码上述的抗PD-1的单域抗体、或上述的融合蛋白。
本发明另一方面提供一种构建体，含有上述的分离的多核苷酸。
本发明另一方面提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有上述的构建体或基因组中整合有外源的上述的多核苷酸。
本发明另一方面提供上述的抗PD-1的单域抗体、或上述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体、或融合蛋白的条件下，培养上述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体、或融合蛋白，纯化分离出所述的抗体、或融合蛋白。
本发明另一方面提供上述的抗PD-1的单域抗体、或上述的融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。
本发明另一方面提供一种药物组合物，包括上述的抗PD-1的单域抗体、或上述的融合蛋白。
附图说明
图1显示为本发明实施例6中Anti-PD1-Fc融合蛋白对PD-L1/PD-1相互作用的阻断曲线示意图。
图2显示为本发明实施例7中报告基因法检测Anti-PD1-Fc融合蛋白体外细胞活性的示意图。
图3显示为本发明实施例8中Anti-PD1-Fc融合蛋白对混合淋巴细胞的IL-2分泌的影响示意图。
图4显示为本发明实施例9中Anti-PD1-Fc融合蛋白对肿瘤生长的抑制作用示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本发明发明人经过大量探索性研究，意外发现了一种抗PD-1的单域抗体，该抗PD-1的单域抗体具有良好的特异性，可以有效地特异性阻断PD-L1/PD-1相互作用，在此基础上完成了本发明。
本发明中，术语“程序性死亡受体1”、“PD-受体1”、“PD-1”、“PD1”、“CD279”可以互换使用，包括变体、同种型、不同物种同源物等。
本发明中，术语“单克隆抗体”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结合特异性和亲和力。
本发明中，术语(多肽或蛋白的)“结构域”通常是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在大多数情况下添加或移除特定结构域不影响该多肽或蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
本发明中，术语“单(结构)域抗体(VHH)”通常是指包含本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，单域抗体(VHH)的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。单域抗体(VHH)因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
本发明中，术语“单结构域抗体”、“单域抗体”、“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH抗体片段”以及“VHH抗体”可互换使用。
本发明中，术语“IMGT编号系统”通常是一种专门针对人和其它脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合物(MHC)的集成信息系统，即THE INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION (Lafranc等，2003，Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77)。登录IMGT (http://www.imgt.org/IMGT_vquest)，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区(framework regions，FR)和互补决定区(complementarity determining regions，CDR)。CDR在免疫球蛋白可变结构域的结构内的“位置”在物种之间是保守的，并且存在于称为“环”的结构中，所以通过使用根据结构特征来使可变结构域序列对齐的编号系统，易于鉴定CDR和框架残基。这个信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和替换至通常来自人抗体的接受体框架中。除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，抗PD-1的单域抗体遵循IMGT编号系统方法进行编号，用以确定CDR区和FR区。
本发明中，术语“人源化抗体”通常指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列(例如含有来自羊驼的全部三个CDR的人源化单域抗体)。其他形式具有一个或多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。
本发明中，两个多肽序列之间的“序列一致性(sequence identity)”通常指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列一致性”指示相同氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列一致性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列一致性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。
本发明中，药剂的“有效量”通常指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化所必需的量。药剂(例如，药物组合物)的“治疗有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。例如，消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良效果。
本发明中，“个体”或“受试者”通常是哺乳动物。哺乳动物可以是驯养的动物(例如母牛、羊、猫、犬和马等)、灵长类(例如，人和非人灵长类，例如，猴等)、家兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)等。
本发明中，术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的其他成分的制剂。
本发明中，“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成 分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本发明第一方面提供一种抗PD-1的单域抗体，单域抗体通常是指缺失抗体轻链，而只有重链可变区的一类抗体分子。抗体的抗原结合特性通常由3个互补决定区(CDR，complementarity determining region)来决定，CDR区可以与FR区有序排列，FR区不直接参与结合反应。这些CDR可以形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，构成了抗体的抗原结合位点。上述抗PD-1的单域抗体的互补决定区(CDR)可以包括氨基酸序列如SEQ ID No.5～6其中之一所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.9～12其中之一所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.17～21其中之一所示的CDR3。
在本发明一具体实施例中，抗PD-1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.17所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.18所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.11所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.19所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.18所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.12所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.20所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.21所示的CDR3。
本发明所提供的抗PD-1的单域抗体中，还可以包括框架区(FR，framework region)，框架区FR可以包括氨基酸序列如SEQ ID No.1～3其中之一所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.13～15、SEQ ID No.28～29其中之一所示的 FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31～32其中之一所示的FR4。
在本发明一具体实施例中，框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.13所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4。
在本发明另一具体实施例中，框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.14所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.32所示的FR4。
在本发明另一具体实施例中，框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.15所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4。
在本发明另一具体实施例中，框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.28所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4。
在本发明另一具体实施例中，框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.28所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4。
在本发明另一具体实施例中，框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.29所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4。
本发明所提供的抗PD-1的单域抗体，可以选自：a)氨基酸序列包括SEQ ID No.34～39其中之一所示的氨基酸序列的单域抗体；或，b)氨基酸序列与SEQ ID No.34～39其中之一所示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性、且具有a)所限定的单域抗体功能的单域抗体。具体的，上述b)中的单域抗体具体指：氨基酸序列如SEQ ID No.34～39其中之一所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID No.34～39其中之一所示的单域抗体的功能的单域抗体，例如，可以是与PD-1的特异性结合能力，从而可以与表达PD-1的细胞特异性结合，也可以是对PD-L1/PD-1相互作用的阻断，从而可以阻断PD-L1/PD1通路(例如，阻断效应细胞和靶细胞表面PD-1/PD-L1的结合)，也可以是提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达，还可以是 抑制肿瘤生长。所述b)中的单域抗体的氨基酸序列可以与SEQ ID No.42～49其中之一具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性。
本发明所提供的抗PD-1的单域抗体可以来源于羊驼(Vicugna pacos)，其整体分子量可以是单链抗体(scFv)的二分之一左右，因此可以有效降低整体结构的分子量，从而增强其组织穿透性，更有效的到达靶组织和器官，提高治疗效果，且这种结构比起具有两个scFv串联的结构更便于制备。
本发明所提供的抗PD-1的单域抗体，通常可以是人源化抗体。人源化的抗体可以由上述单域抗体进行了人源化改造获得，从而进一步提高其药物安全性，有效降低抗体的免疫原性。完全人源化的重链抗体常常面临溶解性差导致蛋白聚集的问题，从而无法用于实际临床。单域抗体人源化改造导致的溶解度下降，可能是由于VHH结构域缺乏天然Ig类单克隆抗体配对的轻链所致(Front Immunol.2017 Nov 22；8:1603)。而本发明所提供的经过框架区改造的人源化抗体，仍保持了很高的溶解度，使得用于实际临床应用成为可能。经过人源化的抗PD-1的单域抗体的框架区FR可以包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7～8其中之一所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.16所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.33所示的FR4。
在本发明一具体实施例中，框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.16所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.33所示的FR4。
在本发明另一具体实施例中，框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.16所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.33所示的FR4。
本发明所提供的抗PD-1的单域抗体，可以是人源化抗PD-1的单域抗体，可以选自：c)氨基酸序列包括SEQ ID No.40～51其中之一所示的氨基酸序列的单域抗体；或，d)氨基酸序列与SEQ ID No.40～51其中之一所示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性、且具有c)所限定的单域抗体功能的单域抗体。具体的，上述d)中的单域抗体具体指：氨基酸序列如SEQ ID No.40～51其中之一所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID No.40～51其中之一所示的单域抗体 的功能的单域抗体，例如，可以是与PD-1的特异性结合能力，从而可以与表达PD-1的细胞特异性结合，也可以是对PD-L1/PD-1相互作用的阻断，从而可以阻断PD-L1/PD1通路(例如，阻断效应细胞和靶细胞表面PD-1/PD-L1的结合)，也可以是提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达，还可以是抑制肿瘤生长。所述d)中的单域抗体的氨基酸序列可以与SEQ ID No.40～51其中之一具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性。
本发明第二方面提供一种融合蛋白，包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括本发明第一方面所提供的抗PD-1的单域抗体，第二结构域包括具有延长体内半衰期作用的结构域和/或对效应细胞具有结合作用的结构域。上述融合蛋白可以是一种结合分子，从而能够与表达PD-1的细胞特异性结合。
本发明所提供的融合蛋白中，具有延长体内半衰期作用的结构域可以包括血清白蛋白(例如，人源的HSA等)或其片段、结合血清白蛋白的结构域(例如，抗血清白蛋白抗体，包括单域抗体)、聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体中的一种或多种的组合，所述免疫球蛋白Fc区优选为人免疫球蛋白Fc区。对效应细胞具有结合作用的结构域可以包括免疫球蛋白Fc区等，免疫球蛋白Fc区优选可以为人免疫球蛋白Fc区。人免疫球蛋白Fc区中还可以包括用于消除、减弱或增强Fc介导的效应功能的突变，这些效应功能可以包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性等中的一种或多种的组合。上述免疫球蛋白具体可以是IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM等中的一种或多种的组合，IgG具体可以是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚型等中的一种或多种的组合。单域抗体融合蛋白中包含的免疫球蛋白Fc区可以使所述融合蛋白形成二聚体，同时延长所述融合蛋白的体内半衰期和增加Fc介导的相关活性。免疫球蛋白Fc区可以是人IgG1的Fc区，更具体可以是野生型IgG1 Fc序列，上述序列可以被引入用于消除、减弱或增强Fc介导的效应功能的突变，例如，i)消除、减弱或增强Fc介导的CDC活性的突变；或，ii)消除、减弱或增强Fc介导的ADCC活性的突变；或，iii)消除、减弱或增强Fc介导的ADCP活性的突变。此类突变描述于下列文献中：Leonard G Presta，Current Opinion in Immunology 2008，20:460-470；Esohe E.Idusogie et al.，J Immunol 2000，164:4178-4184；RAPHAEL A.CLYNES et al.，Nature Medicine，2000，Volume 6，Number 4:443-446；Paul R.Hinton et al.，J Immunol，2006，176:346-356。在本发明一具体实施例中，免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列包括SEQ ID No.52～53、SEQ ID No.74～79其中之一所示的序列。
本发明所提供的融合蛋白中，第一结构域和第二结构域之间还可以设有连接肽。连接肽通常可以为一段长度合适的由甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或丙氨酸(A)和/或苏氨酸(T)构成的柔性多肽，能够保持双特异抗体分子各结构域的正确折叠，以及相互的柔韧性，连接肽的长度通常可以为3～30个、3～6个、6～9个、9～12个、12～16个、16～20个、20～25个、25～30个、8个、或15个氨基酸。例如，连接肽片段的氨基酸序列可以包括如(GS)n、(GGS)n、(GGSG)n、(GGGS)nA、(GGGGS)nA、(GGGGA)nA、(GGGGG)nA等序列，其中，n选自0-10之间的整数，例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
本发明所提供的融合蛋白中，从N端至C端可以依次包括第一结构域和第二结构域。在本发明一具体实施例中，融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID No.58～69其中之一所示的氨基酸序列。
本发明第三方面提供一种分离的多核苷酸，编码本发明第一方面所提供的抗PD-1的单域抗体、或本发明第二方面所提供的融合蛋白。上述多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供上述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。
本发明第四方面提供一种构建体，含有本发明第三方面所提供的分离的多核苷酸。上述构建体的构建方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，上述构建体可以通过体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，上述构建体通常可以通过将上述分离的多核苷酸插入合适的载体(例如，载体的多克隆位点)中构建获得。本领域技术人员可选择合适的载体用于构建上述构建体。例如，载体的类型可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体等。再例如，载体可以是表达载体，也可以是克隆载体。载体还可以包括与上述多核苷酸序列操作性连接的一个或多个调控序列，调控序列通常可以包括合适的启动子序列、转录终止子序列、增强子序列等，还可以包括复制起点、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记等。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。例如，这些启动子可以是大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶 启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。调控序列还可以包括合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。标记基因可以用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，例如，可以是包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。当上述的多核苷酸被表达时，表达载体中还可以包括增强子序列，如果在载体中插入增强子序列，则将会使转录得到增强，增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本发明第五方面提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有本发明第四方面所提供的构建体或基因组中整合有外源的本发明第三方面所提供的多核苷酸，从而可表达上述的抗PD-1的单域抗体、或融合蛋白。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞。例如，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。更具体可以是例如，大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。构建所述表达系统的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等方法。
本发明第六方面提供本发明第一方面所提供的抗PD-1的单域抗体、或本发明第二方面所提供的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体、或融合蛋白的条件下，培养如权利要求16所述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体、或融合蛋白，纯化分离出所述的抗体、或融合蛋白。
本发明第七方面提供本发明第一方面所提供的单域抗体、或本发明第二方面所提供的融合蛋白在制备药物和/或药剂中的用途，所述药物和/或药物用于诊断、治疗与表达PD-1的细胞相关的疾病的用途。本发明所提供的单域抗体可以与PD-1的特异性结合，从而可以与表达PD-1的细胞特异性结合、并能够阻断PD-L1/PD-1相互作用，还可以是提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达，从而可以被用于制备药物和/或制剂。
本发明所提供的用途中，与表达或不表达PD-1的细胞相关的疾病具体可以是癌症、肿瘤实体等，具体可以是例如肺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、 肾癌、膀胱癌、乳腺癌、经典霍奇金淋巴瘤、血液恶性肿瘤、头颈癌和鼻咽癌等，这些癌症可以为早期、中期或晚期，例如转移癌。
本发明第九方面提供一种药物组合物，包括本发明第一方面所提供的抗PD-1的单域抗体、本发明第二方面所提供的融合蛋白、或本发明第五方面所提供的表达系统的培养物。上述药物组合物中，所述抗PD-1的单域抗体、融合蛋白、或培养物的含量通常为治疗有效量的。上述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。这些药学上可接受的载体可以包括各种赋形剂和稀释剂，这些载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体对于本领域技术人员来说应该是熟知的，例如，在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.，1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分讨论。在本发明一优选具体实施例中，所述药物组合物可以通过注射途径来给药，因此所述药物组合物优选是粉针剂(如冻干粉针剂)和液体制剂。
上述的药物、或药物组合物等中，上述物质(例如，单域抗体、融合蛋白、培养物等)可以是单一药效成分，也可以与其他活性组分进行组合。
本发明第十方面提供一种治疗方法，包括向个体施用治疗有效量的第一方面所提供的抗PD-1的单域抗体、本发明第二方面所提供的融合蛋白、本发明第五方面所提供的抗体的表达系统的培养物、或本发明第九方面所提供的药物组合物。本发明所提供的治疗方法可以用于治疗肿瘤等、或其他的适应症。优选的治疗有效量的选择通常可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)，例如，当上述物质用于被施用的个体时，肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移可以被抑制，更具体的，肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
本发明所提供的抗PD-1的单域抗体具有对于PD-1的特异性结合能力，且可以用于进一步构建融合蛋白等，构建获得的融合蛋白还可以提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达，并可以有效抑制肿瘤的生长，具有良好的产业化前景。
下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
抗PD1的单域抗体文库构建
将PD1胞外域序列和人血清白蛋白序列构成的融合蛋白hPD1-HSA(SEQ ID NO:54)1mg和1ml的弗氏完全佐剂(Sigma)混合、乳化，免疫健康羊驼(Vicugna pacos)，相隔21天后再次免疫，共免疫3次，刺激B细胞表达抗原特异性的单域抗体。3次免疫后一周，用真空采血管采取30ml羊驼血，经淋巴细胞分离液(天津市灏洋华科生物科技有限公司)分离淋巴细胞，用Trizol法提取总RNA。用反转录试剂盒(Invitrogen)按照说明书将3μg的总RNA反转录成cDNA，并利用巢氏PCR扩增VHH。回收目标VHH核酸片段，利用限制性内切酶SfiI(NEB)进行酶切，插入同样酶切的噬菌体展示载体pcomb3xss(Addgene plasmid#63890；RRID:Addgene_63890)中，通过T4连接酶(Takara)连接。将连接产物转化至电转感受态细胞ER2738中，构建抗PD1的单域抗体文库。通过梯度稀释铺板，测定库容大小为1.5×10 8。与此同时，随机挑取25个克隆进行菌落PCR检测，结果表明所建文库的插入率为100％。
实施例2
抗PD1的单域抗体的筛选和鉴定
2.1抗PD1的单域抗体的筛选
将构建的抗PD1的单域抗体文库采用辅助噬菌体M13KO7(NEB)对其进行包装，并测定展示文库重组噬菌体滴度为8.5×10 12PFU/ml。将hPD1-HSA用100mM NaHCO 3(pH 8.2)的包被液稀释至2μg/ml，按100μL/孔加至酶标板，4℃放置过夜。第二天，PBST(PBS中含有0.1％吐温20)洗5遍，加入200μL 3％BSA在37℃封闭1h后，加入100μL重组噬菌体(约1.5×10 11PFU/孔，来自实施例1构建的文库)，室温作用1h。之后用PBST洗5遍，去除非特异结合的噬菌体。将清洗好的酶标板孔，用1ml的 0.1M gly-HCl+1mg/ml BSA(pH2.2)缓冲液孵育10分钟洗脱，并用1M pH 8.0的Tris-HCl中和。测定噬菌体滴度为4.45×10 6PFU/ml。将上述噬菌体洗脱液进行扩增，并测定滴度为1.6×10 13PFU/ml。使用PD-1胞外域序列和人IgG1 FC构成的融合蛋白hPD1-Fc(SEQ ID NO:56)作为包被蛋白，3％卵清蛋白(OVA)进行封闭，相同筛选过程进行第二轮筛选，第二轮淘洗的噬菌体滴度测定结果为1.96×10 8PFU/ml。
2.2酶联免疫方法(ELISA)和TEPITOPE双筛选
从第二轮淘洗洗脱的噬菌体滴度测定板上挑取400个单克隆在96孔板进行培养，并用M13KO7辅助噬菌体进行侵染、包装，以获得重组噬菌体在上清的积累。
将hPD1-Fc以200ng/孔包板，并用脱脂奶粉室温封闭1小时，将单克隆重组噬菌体上清用PBS稀释一倍后100ul/孔加入，37℃孵育1小时。PBST清洗3次后，每孔加入1:10000稀释的100μl Anti-M13 Antibody(HRP)(义翘神州)，37℃孵育1小时。PBST清洗3次后加入TMB显色工作液(北京康为世纪生物科技有限公司)，室温孵育5分钟显色后，加1M硫酸终止反应，OD450nm读数,大部分OD450nm大于3，显示结合阳性。
将单克隆重组噬菌体上清在96孔板分别和4μg/mL的Bio-hPDL1-HSA(生物素标记，自制)进行等比例混合后，取100μl/孔孵育于预先包被100ng hPD1-Fc的96孔板；以不含重组噬菌体上清的Bio-hPDL1-HSA(PBS稀释成2μg/mL)孔作为对照，37℃孵育1小时。PBST清洗3次后，每孔加入1:50000稀释的100μl Streptavidin-HRP(Jackson ImmunoResearch Inc)，37℃孵育1小时。PBS清洗3次后加入TMB显色工作液(北京康为世纪生物科技有限公司)，室温孵育5分钟显色后，加1M硫酸终止反应，OD450nm读数。其中，对照孔显色明显(OD450nm值为1.16)，噬菌体竞争阳性克隆孔显色较弱或基本不显色(OD450nm数值低于0.2)。挑选竞争阳性克隆测序，去除重复序列。
对获得的高亲和力阳性序列的CDR3序列进一步进行免疫原性分析，通过基于QAM方法的预测工具TEPITOPE(Sturniolo T等，Nat.Biotechnol.17:555-561)计算跟人体免疫原性密切相关的DRB1*03:01、DRB1*07:01、DRB1*15:01、DRB3*01:01、DRB3*02:02、DRB4*01:01和DRB5*01:01等位基因的得分，排除CDR3 TEPITOPE总得分高于4的序列，进一步筛选获得了高人源化程度的抗PD-1的单域抗体序列。本发明最终获得的抗PD-1的单域抗体的CDR3 TEPITOPE总得分大部分都<-2.0，明显低于同类抗PD-1的单域 抗体，意味着本发明抗PD-1的单域抗体具有更低的潜在免疫原性风险。
经过多轮筛选，本发明人最终挑取其中6个竞争强阳性克隆并且TEPITOPE得分较低的抗PD1的单域抗体序列。其全长序列如表1a，其中下划线所示为以IMGT法标示的CDR区。
表1a
各个抗体的框架区(FR)以及互补决定区(CDR区)如表1b。
表1b
CDR3 TEPITOPE得分见表1c。
表1c
注：对照1来源于US2019/0322747A1(SEQ ID No.14)所示的抗PD-1的单域抗体。对照2来源于CN110256562A(SEQ ID No.9)所示的抗PD-1的单域抗体。对照3来源于CN110003336A(SEQ ID No.6)所示的抗PD-1的单域抗体。
实施例3
抗PD-1的单域抗体的初步评价鉴定
3.1单域抗体在宿主大肠杆菌中表达和纯化
以筛选获得的特异性阳性序列质粒为模板，用高保真酶GVP8(通用生物系统(安徽)有限公司)进行PCR扩增，在序列3’端引入组氨酸标签编码序列，PCR产物电泳并切胶回收约600bp左右的条带，将回收的PCR产物与内切酶NdeI(NEB公司)和EcoRI(NEB公司)酶切的pET32a+载体(Novagen)用重组试剂盒(近岸蛋白质科技有限公司)进行重组连接，构建大肠杆菌表达质粒，转化大肠杆菌感受态Top10F’，涂布氨苄抗性平板，培养箱37℃培养过夜。分别挑取氨苄抗性平板上的克隆，提质粒测序，确定序列在pET32a+载体上的正确插入。将测序确定的大肠杆菌表达质粒，转化大肠杆菌表达宿主Rosetta(DE3)，构建大肠杆菌表达菌株。在氨苄抗性平板上挑取重组克隆、培养，并用1mM的IPTG 30℃诱导表达过夜。将诱导表达过夜的菌液进行超声破碎，12000g 4℃离心10分钟后，取上清，用Ni柱(博格隆生物技术有限公司)进行纯化，最终蛋白纯度达到90％以上。
3.2纯化的抗PD-1的单域抗体重组蛋白对人和小鼠PD-1的特异性结合确认
将人hPD1-HSA、小鼠mPD1-HSA(SEQ ID NO:57)或HSA(购于Sigma)200ng/孔4℃包板过夜，并用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将纯化的组氨酸标签融合的抗PD-1的单域抗体稀释至1μg/mL，100μL每孔、37℃孵育1小时。PBST洗涤3次之后按100μl/孔加入1:5000稀释的mouse anti-his tag抗体(R&D Systems，Inc)，室温孵育1小时。PBST洗涤后加入1:10000稀释的HRP-Goat anti-mouse IgG抗体(Thermo Scientific)，每孔100μl加入，室温孵育1小时。PBST洗涤之后加TMB显色工作液(北京康为世纪生物科技有限公司)显色，450nm下检测OD值。
检测结果见表2，结果显示，前述筛选到的6个克隆特异性结合人PD-1均与人PD-1具有良好的结合作用。当用小鼠mPD1-HSA融合蛋白包被时，抗PD-1的单域抗体对应的OD值与不加抗PD-1的单域抗体的空白对照组没有明显差异，说明筛选获取的6个克隆对小鼠PD-1均不结合(结果未显示)。
表2
3.3纯化的抗PD-1的单域抗体重组蛋白对猴PD-1的特异性结合确认
将猴RhPD1-HSA融合蛋白(SEQ ID No.30)以200ng/孔4℃包板过夜，并用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将纯化的组氨酸标签融合的抗PD1的单域抗体稀释至1μg/mL，100μL每孔、37℃孵育1小时。PBST洗涤3次之后加入100μl/孔1:5000稀释的mouse anti-his tag抗体(R&D Systems，Inc)，室温孵育1小时。PBST洗涤后加入1:10000稀释的HRP-Goat anti mouse IgG抗体(Thermo Scientific)，每孔100μl加入，室温孵育1小时。PBST洗涤之后加TMB显色，450nm下检测OD值。
结果显示，抗PD1的单域抗体对应的OD值与不加抗PD1的单域抗体的空白对照组差异明显，说明筛选获取的6个克隆对猴PD-1均结合。
表3
实施例4
抗PD-1的单域抗体的人源化
人源化方法采用VHH人源化框架移植法来进行(Vincke C，Loris R，Saerens D，Martinez-Rodriguez S，Muyldermans S，Conrath K.J Biol Chem.2009；284(5):3273-3284)。根据序列同源性设计完成的通用性人源化VHH框架h-NbBcII10FGLA(PDB编号：3EAK)，将对应的CDR区替换为抗PD-1的单域抗体的CDR区，并对FR2区的个别氨基酸根据人源化抗体DP-47(SEQ ID NO:73)的序列进行进一步的人源化，每个抗PD-1的单域抗体分别获取多种人源化变体，在尽可能引入更多人源氨基酸的同时，从中选择溶解度高，聚体形成量少的人源化方案。对人源化的单域抗体按实施例3.1进行表达纯化。
优选的人源化后的VHH氨基酸序列为SEQ ID NO:40～51，如表4a所示，其中下划线所标示为CDR区。
表4a
各个人源化变体的框架区(FR)及互补决定区(CDR区)如表4b所示。
表4b
各个人源化单域抗体的人源化程度(通过与最接近的人类基因和等位基因进行序列相同性的比较)，通过IMGT/3Dstructure-DB(网站http://www.imgt.org)进行分析，可参考文献：Use of Databases and Tools for Antibody Engineering and Humanization，Marie-PauleLefranc等，Methods Mol Biol，907:3-37，2012。结果如表4c所示。
表4c
注：1)对照1来源于US2019/0322747A1(SEQ ID No.14)所示的抗PD-1的单域抗体。对照2来源于CN110256562A(SEQ ID No.9)所示的抗PD-1的单域抗体。对照3来源于CN110003336A(SEQ ID No.6)所示的抗PD-1的单域抗体。
2)Bevacizumab HCDR3为上市单抗Bevacizumab的重链CDR3序列，Adalimumab HCDR3为上市单抗Adalimumab的重链CDR3序列。3)抗PD-1的单域抗体代号中，V1和V3代表两种不同的人源化序列。
实施例5
用哺乳动物细胞制备Anti-PD1-Fc融合蛋白
5.1抗PD-1的单域抗体与Fc融合蛋白(Anti-PD1-Fc)的表达和纯化
将筛选获得的特异性阳性序列(SEQ ID NO:34-39)和经人源化的序列(SEQ ID NO:40-51)根据CHO细胞密码子偏好性分别将氨基酸序列转换成各碱基序列，通过基因合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)获得全长DNA。以各个DNA为模板，用高保真酶GVP8(安徽通用生物技术有限公司)进行PCR扩增，PCR产物电泳并切胶回收约600bp左右的条带，将回收的PCR产物与含有信号肽和人IgG Fc序列(SEQ ID NO:53)的pCDNA3.1载体进行重组连接，构建表达抗PD-1的单域抗体与人IgG4 Fc融合蛋白(Anti-PD1-Fc)的细胞表达质粒，用去内毒素质粒大抽试剂盒(Biomiga)提取Anti-PD1-Fc的细胞表达质粒，将质粒与转染试剂PEI(Polysciences，Inc.)1:3混合均匀后静置30min，然后加入到HEK293F细胞中，37℃，5％CO 2摇床培养箱中培养7天后，离心取上清。将上清调至pH7.0后上样Protein A亲和层析柱(博格隆生物技术有限公司)，100％0.1M Gly-HCl(pH3.0)洗脱；洗脱液预先加入10％1M Tris-HCl(pH8.5)。100％洗脱液稀释至电导4ms/cm，调pH5.5后，离心(8000rpm，4℃，10min)，上清液调pH5.0上样至DSP层析柱(博格隆生物技术有限公司)，0～60％洗脱液(20mM NaAc，0.5M NaCl，pH5.0)线性洗脱，2ml/min，15min。纯度检测使用SEC-HPLC-UV分析。检测器：Agilent 1100LC；检测波长：214nm；流动相：150mM pH7.0PB+5％异丙醇；色谱柱：Superdex 200Increase 5/150 GL；运行时间：15分钟；柱温25℃。检测结果显示纯度都大于95％。
实施例6
鉴定Anti-PD1-Fc融合蛋白在体外的功能
6.1 Anti-PD1-Fc融合蛋白对人PD-1结合能力鉴定
将hPD1-HSA以200ng/孔4℃包板过夜，并用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将Anti-PD1-Fc融合蛋白分别用1％BSA进行梯度稀释，37℃孵育1小时。PBST清洗3次后，每孔加入1:20000稀释的100μl HRP-Goat anti-Human IgG Fc(Novex)，室温孵育1小时。PBST清洗3次后加入TMB底物，37℃孵育。孵育5分钟显色后，加1M硫酸终止反应，OD450nm读数。结果见表5。
表5
注：Keytruda为上市的抗PD1单抗(Merck)。
6.2鉴定Anti-PD1-Fc融合蛋白对hPD-L1/PD-1相互作用的阻断效果(竞争ELISA法)
将hPD1-HSA以200ng/孔4℃包板过夜，并用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将Anti-PD1-Fc融合蛋白分别用1％BSA从4μg/mL的起始浓度进行5倍梯度稀释后，分别和等体积的生物素标记的4μg/mL的bio-hPDL1-FC(SEQ ID NO.55)等体积混合，分别取100μL混合液至96孔板37℃孵育1小时。PBST清洗3次后，每孔加入1:50000稀释的100μL HRP-Streptavidin(Jackson ImmunoResearch Inc.)，室温孵育1小时。PBST清洗3次后加入TMB底物，37℃孵育。孵育5分钟显色后，加1M硫酸终止反应，OD450nm读数，结果见表6和图1。
表6
样品代号 IC50(nM) 样品名 IC50(nM)
Anti-PD1-1A4-Fc 1.454 Anti-PD1-hu2C4V1-Fc 1.212
Anti-PD1-1A9-Fc 1.554 Anti-PD1-hu2D9V1-Fc 1.032
Anti-PD1-1H1-Fc 1.535 Anti-PD1-hu1A4V3-Fc 2.43
Anti-PD1-1D3-Fc 1.486 Anti-PD1-hu1A9V3-Fc 2.842
Anti-PD1-2C4-Fc 1.549 Anti-PD1-hu1H1V3-Fc 1.121
Anti-PD1-2D9-Fc 1.437 Anti-PD1-hu1D3V3-Fc 0.8777
Anti-PD1-hu1A4V1-Fc 0.965 Anti-PD1-hu2C4V3-Fc 1.193
Anti-PD1-hu1A9V1-Fc 0.955 Anti-PD1-hu2D9V3-Fc 1.146
Anti-PD1-hu1H1V1-Fc 1.125 Keytruda 1.721
Anti-PD1-hu1D3V1-Fc 1.101
注：Keytruda为上市的抗PD1单抗(Merck)。
上述结果说明，本发明的Anti-PD1-Fc融合蛋白对hPDL-1/PD-1相互作用的阻断效果非常显著。
实施例7
鉴定Anti-PD1-Fc融合蛋白在人类T淋巴细胞系中的功能活性
7.1细胞检测株的构建
合成CD5L-OKT3scFv-CD14(GenBank：ADN42857.1)，并用HindIII-EcoRI(Takara)酶切，插入载体pCDNA3.1，构建pCDNA3.1-antiCD3TM。以人PD-L1(GenBank：NM_014143.2)为模板，高保真扩增得到PD-L1片段重组连接插入pCDNA3.1-antiCD3TM，构建pCDNA3.1-antiCD3TM-PDL1。转染CHO细胞(Thermo)，然后用G418选择10-14d来产生稳定细胞系CHO-antiCD3TM-PDL1。
以人PD1(GenBank：NP_005009.2)为模板扩增所得片段，与经HindIII-BamHI(Takara)酶切的PB513B1-dual-puro载体(优宝生物)重组连接，构建质粒pB-PD1。以pGL4.30(优宝生物)为模板进行高保真扩增，回收所得片段，与经SfiI-XbaI(Takara)酶切的pB-PD1载体重组连接，构建pB-NFAT-Luc2p-PD1质粒。质粒成功构建后用去内毒素质粒大抽试剂盒(Biomiga)提取质粒用于转染Jurkat细胞(中国科学院干细胞库)。参考专利CN 107022571A中的方法，通过使用0.1mg/ml的多聚-D-赖氨酸将Jurkat细胞处理成相对贴壁的状态，然后根据脂质体转染试剂盒(Lipofectamine 3000；invitrogen)中的转染说明对Jurkat细胞进行转染；第三天用含 有10％FBS和2.5μg/ml嘌呤霉素的RPMI1640培养基(Thermo)进行加压筛选；此后每隔一段时间补加培养基，待细胞活率恢复后逐渐增加嘌呤霉素的含量至4μg/ml。最终获得单克隆Jurkat-NFAT-Luc2p-PD1细胞株。
7.2 Anti-PD1-FC融合蛋白阻断hPD-L1/PD1通路的功能鉴定
取CHO-CD3TM-PD-L1、Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1细胞并计数，调整细胞密度为4×10 6/ml，96孔板中每孔每个细胞各加入25μl；本实验将Anti-PD1-Fc融合蛋白、阳性对照组Keytruda(Merck)、阴性同型对照组分别用1％BSA进行梯度稀释，加入50μl上述抗体至细胞中，使得抗体的终浓度为280、93.3、31.1、10.4、3.5、1.2、0.4、0.1nM；37℃、5％CO 2共培养6h后，每孔加入10μl荧光素酶底物(Promega,E2620)，振荡器上震荡2min，读数。操作如试剂盒说明。
图2结果显示，加入Anti-PD1-Fc融合蛋白后可以阻断效应细胞和靶细胞表面hPD-1/PD-L1的结合，并呈现出特征性剂量反应曲线；同时具有特异性，阴性同型对照不能阻断hPD-L1和PD1通路结合。
由图2也可见，本发明优化获得的Anti-PD1-Fc融合蛋白的阻断效靶细胞表面hPD-1/PD-L1结合的能力与阳性对照Keytruda相当。
实施例8
鉴定Anti-PD1-Fc融合蛋白对PBMC的激活作用
将5μg/ml的重组抗CD3单抗(近岸蛋白质科技有限公司，货号GMP-A018)以50μl/孔在4℃包板过夜。使用淋巴细胞分离液(Sigma)从健康人外周血中分离PBMC，并用含2μg/ml的重组CD28单抗(近岸蛋白质科技有限公司，货号GMP-A063)稀释细胞至2×10 6/ml。包被重组抗CD3单抗的酶标板弃去上清，用200μl/孔的PBS清洗两遍，每孔中加入200μl细胞，细胞活化24h后，加入5nM Keytruda和5nM Anti-PD1-Fc融合蛋白进行刺激，刺激3天后，1500rpm、5min后收集上清，取上清根据试剂盒(购自达科为公司)说明书进行细胞因子IL2的检测。
结果见图3，Anti-PD1-Fc融合蛋白能增强PBMC分泌IL2，且其分泌的IL2显著高于阳性对照Keytruda。
实施例9
Anti-PD1-Fc融合蛋白的肿瘤抑制活性研究
通过对人源化PD-1 C57小鼠皮下移植表达人PD-L1的MC38细胞(MC38-hPDL1)建立结肠癌肿瘤模型来研究Anti-PD1-Fc融合蛋白的肿瘤抑制活性。
实验设计如下：在6-8周人源化PD-1 C57小鼠右前腿背部皮下接种1×10 6个MC38-hPDL1细胞。接种后根据瘤积筛选肿瘤大小50-70mm 3的小鼠随机分为6组，每组6只小鼠。分组后，分别腹腔注射Keytruda(2mg/kg)，anti-PD1-hu1A4V3-Fc,anti-PD1-hu1A9V3-Fc,anti-PD1-hu2D9V3-Fc(各1mg/kg)及人IgG1同型对照(2mg/kg)，每周给药两次，共给药8次，在平行组中注射PBS作为阴性对照。每周测量两次肿瘤体积。
肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W 2/2。
实验结果如图4所示，随着时间的推移，给予anti-PD1-hu1A4V3-Fc、anti-PD1-hu1A9V3-Fc、anti-PD1-hu2D9V3-Fc的小鼠，其肿瘤体积相对于对照组得到了很好的控制，并没有出现显著增加的情况，说明Anti-PD1-Fc融合蛋白有明显的肿瘤抑制作用。
实施例10
Anti-PD1-Fc融合蛋白的溶解度研究
将经纯化的100mg单域抗体用超滤管(Merck Millipore Ltd.)超滤，置换溶液为5mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)或5mM醋酸-钠(pH5.5)，25℃3500g超滤浓缩，并置换溶液2次，浓缩至不能再浓缩(离心20分钟体积无明显改变)，浓缩液8000g离心10min后测定蛋白含量，该浓度即为该条件下的溶解度。
表7
代号 SEQ ID No. 溶解度(mg/ml)
Anti-PD1-hu1A4V3-Fc 64 154.1
Anti-PD1-hu1A9V3-Fc 65 204.6
Anti-PD1-hu1H1V3-Fc 66 187.2
Anti-PD1-hu1D3V3-Fc 67 173.6
Anti-PD1-hu2C4V3-Fc 68 227.8
Anti-PD1-hu2D9V3-Fc 69 100.4
根据表7，本发明优化获得的人源化Anti-PD1-Fc融合蛋白具有良好的溶解度。 本实施例中的抗PD-1的单域抗体是将原FR2区44位和45位的亲水性氨基酸人源化成普通人抗体的相当保守的疏水性残基G和L(表4a)，但并未影响其溶解度。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (22)

  1. 一种抗PD-1的单域抗体，所述抗PD-1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5～6其中之一所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.9～12其中之一所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.17～21其中之一所示的CDR3。
  2. 如权利要求1所述的抗PD-1的单域抗体，其特征在于，所述抗PD-1的单域抗体的互补决定区包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：
    (1)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.17所示的CDR3；或，
    (2)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.18所示的CDR3；或，
    (3)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.11所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.19所示的CDR3；或，
    (4)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.18所示的CDR3；或，
    (5)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.12所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.20所示的CDR3；或，
    (6)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的CDR2、和氨基酸序列如SEQ ID No.21所示的CDR3。
  3. 如权利要求1所述的抗PD-1的单域抗体，其特征在于，所述抗PD-1的单域抗体还包括框架区，所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1～3其中之一所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.13～15、SEQ ID No.28～29其中之一所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31～32其中之一所示的FR4。
  4. 如权利要求3所述的抗PD-1的单域抗体，其特征在于，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：
    (1’)所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.13所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4；或，
    (2’)所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.14所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.32所示的FR4；或，
    (3’)所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.15所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4；或，
    (4’)所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.28所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4；或，
    (5’)所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.28所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4；或，
    (6’)所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.29所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.31所示的FR4。
  5. 如权利要求3所述的抗PD-1的单域抗体，其特征在于，所述抗PD-1的单域抗体选自：
    a)氨基酸序列包括SEQ ID No.34～39其中之一所示的氨基酸序列的单域抗体；或，
    b)氨基酸序列与SEQ ID No.34～39其中之一所示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性、且具有a)所限定的单域抗体功能的单域抗体。
  6. 如权利要求1所述的抗PD-1的单域抗体，其特征在于，所述抗PD-1的单域抗体为人源化抗体；
    和/或，所述抗PD-1的单域抗体来源于羊驼。
  7. 如权利要求6所述的抗PD-1的单域抗体，其特征在于，所述抗PD-1的单域抗体还包括框架区，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.7～8其中之一所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.16所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.33所示的FR4。
  8. 如权利要求7所述的抗PD-1的单域抗体，其特征在于，所述抗PD-1的单域抗体选自：
    c)氨基酸序列包括SEQ ID No.40～51其中之一所示的氨基酸序列的单域抗体；或，
    d)氨基酸序列与SEQ ID No.40～51其中之一所示的氨基酸序列具有80％以上序列一致性、且具有c)所限定的单域抗体功能的单域抗体。
  9. 一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括如权利要求1～8任一权利要求所述的抗PD-1的单域抗体，所述第二结构域包括具有延长体内半衰期作用的结构域和/或对效应细胞具有结合作用的结构域。
  10. 如权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二结构域包括免疫球蛋白Fc区、血清白蛋白或其片段、结合血清白蛋白的结构域、聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体中的一种或多种的组合，所述免疫球蛋白Fc区优选为人免疫球蛋白Fc区。
  11. 如权利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于消除、减弱或增强Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合。
  12. 如权利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM中的一种或多种的组合，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的一种或多种的组合。
  13. 如权利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列包括SEQ ID No.52～53、SEQ ID No.74～79其中之一所示的序列。
  14. 如权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一结构域和第二结构域之间还设有连接肽，所述连接肽优选选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的柔性多肽链，所述连接肽的长度优选为3～30个氨基酸。
  15. 如权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID No.58～69其中之一所示的氨基酸序列。
  16. 一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1-8任一权利要求所述的抗PD-1的单域抗体、或如权利要求9～15任一权利要求所述的融合蛋白。
  17. 一种构建体，含有如权利要求16所述的分离的多核苷酸。
  18. 一种抗体的表达系统，所述表达系统含有如权利要求17所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求16所述的多核苷酸。
  19. 如权利要求1-8任一权利要求所述的抗PD-1的单域抗体、或如权利要求9～15任一权利要求所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体、或融合蛋白的条件下，培养如权利要求18所述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体、或融合蛋白，纯化分离出所述的抗体、或融合蛋白。
  20. 如权利要求1-8任一权利要求所述的抗PD-1的单域抗体、或如权利要求9～15任一权利要求所述的融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。
  21. 如权利要求20所示的用途，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、经典霍奇金淋巴瘤、血液 恶性肿瘤、头颈癌或鼻咽癌。
  22. 一种药物组合物，包括如权利要求1～8任一权利要求所述的抗PD-1的单域抗体、或如权利要求9～15任一权利要求所述的融合蛋白。
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