CN117295769A - 一种具有抗癌活性的双功能融合蛋白 - Google Patents

一种具有抗癌活性的双功能融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种具有抗癌活性的双功能融合蛋白及其制备方法和用途。本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗PD‑L1单域抗体片段、拮抗VEGF片段。本发明所提供的具有抗癌活性的双功能融合蛋白，能够在一个抗体融合蛋白分子中，将抗PD‑L1单抗阻断PD‑L1/PD‑1相互作用、抗VEGF单抗减少微血管生长和抑制转移性疾病的功能有机地结合在一起，从而可以用于治疗肿瘤，具有良好的产业化前景。

Description

一种具有抗癌活性的双功能融合蛋白 技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种具有抗癌活性的双功能融合蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤细胞和正常细胞不同的地方之一，在其生长的高代谢需求。肿瘤细胞依赖血管提供营养物质和氧气，处理代谢产物，并在现有血管上，促进新生血管的生成。在肿瘤分泌的促血管生成因子中，人血管内皮生长因子(VEGF)，特别是VEGF-A是导致肿瘤血管生成的一个重要因素(Josep Garcia等,2020，Cancer Treatment Reviews 86：1-2)。因此,对VEGF信号通路的抑制可限制多种肿瘤的进展。比如贝伐珠单抗(Bevacizumab,商品名 )，一种人源化抗-VEGF单克隆抗体，可与VEGF结合，阻止VEGF与内皮细胞表面VEGF受体(Flt-1和KDR)相互作用。目前贝伐珠单抗被FDA批准用于转移性结直肠癌，晚期、转移性或复发性非小细胞肺癌和复发性胶质母细胞瘤等的治疗。
然而，靶向治疗经常伴随着癌细胞的突变，导致治疗无效。而免疫治疗则着重于激活免疫系统，真正改变肿瘤微环境的免疫状况。例如靶点为CTLA-4的第一个免疫检查点抑制剂，其在2011年被FDA批准上市。在那之后，三年之间有五个针对PD-1/PD-L1靶点的抗体药物上市，将免疫检查点的研究推向了热点。然而抗PD-1/PD-L1单抗药物虽然在肿瘤治疗中有高效性和广谱性，但是也有很明显的不足，比如有效率有限(<30％)、耐药性、毒副作用等。
鉴于一些靶点的信号通路在生物学机制上的协同作用，联合用药往往能够起到单药达不到的效果。例如Roche采用抗PD-L1单抗(Atezolizumab)和Bevacizumab治疗肝细胞癌(HCC)，在三期临床(IMbrave 150)达到双终点(OS和PFS显著延长)，2020年已经得到FDA批准上市；另外，三联疗法Atezolizumab+Bevacizumab+化疗(紫杉醇+卡铂)在非小细胞肺癌(NSCLC)三期临床(IMpower 150)无进展生存期(PFS)显著延长，2018年获得FDA批准上市。然而，大量数据也表明，联合治疗在提高疗效的同时往往伴随着毒性的增加，因此寻找高疗效低毒性的治疗方法仍然是临床上免疫治疗需要解决的核心问题，例如开发单分子双特异性抗体。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种具有抗癌活性的双功能融合蛋白及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗PD-L1单域抗体片段、拮抗VEGF片段。
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码上述的融合蛋白。
本发明另一方面提供一种构建体，所述构建体含有上述的分离的多核苷酸。
本发明另一方面提供一种表达系统，所述表达系统含有上述的构建体或基因组中整合有外源的上述的多核苷酸。
本发明另一方面提供上述的融合蛋白的制备方法，包括：在合适的条件下培养上述的表达系统，使之表达所述融合蛋白，分离、纯化以提供所述融合蛋白。
本发明另一方面提供上述的融合蛋白、或上述的表达系统的培养物在制备药物中的用途。
本发明另一方面提供一种药物组合物，包括上述的融合蛋白、或上述的表达系统的培养物。
附图说明
图1显示为本发明实施例4中双功能融合蛋白在M-NSG小鼠中的抑瘤效果示意图。
具体实施方式
本发明发明人经过大量探索研究，意外地发现了一种融合蛋白分子，该融合蛋白分子可以通过阻断PD-L1/PD-1相互作用、阻断VEGF信号通路来减少肿瘤的新生血管生成及解除免疫抑制，具有优良的肿瘤抑制效果，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗PD-L1单域抗体片段、拮抗VEGF片段。上述融合蛋白中，抗PD-L1单域抗体片段通常可以用于阻断PD-L1/PD-1相互作用，提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达，从而抑制肿瘤生长。拮抗VEGF片段的可变区部分可以与VEGF结合，从而可以阻断肿瘤新生血管的生成，“饿死”癌细胞。拮抗VEGF片段通常还可以包括Fc部分，可以与FcRn受体结合，从而可以延长体内半衰期，同时也可与表达Fc受体的效应细胞结合起到杀伤癌细胞的作用。
本发明所提供的融合蛋白中，可以包括抗PD-L1单域抗体片段。上述抗PD-L1单域抗体片段通常可以是能够特异性与PD-L1结合的多肽或蛋白片段。抗PD-L1单域抗体片段中，通 常缺失对应的抗体轻链，而只有重链可变区对应的片段。抗PD-L1单域抗体片段的结合特性通常可以由其包括的3个互补决定区(CDR，complementarity determining region)来决定，CDR区可以与框架区(FR，framework region)有序排列，FR区通常不直接参与结合反应。这些CDR可以形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，构成了抗体的抗原结合位点。例如，上述抗PD-L1单域抗体片段的互补决定区(CDR)可以包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～5其中之一所示的CDR1，SEQ ID NO.6～9其中之一所示的CDR2，SEQ ID NO.10～15其中之一所示的CDR3。
在本发明一具体实施例中，抗PD-L1单域抗体片段的互补决定区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CDR1，SEQ ID NO.6所示的CDR2，SEQ ID NO.10所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-L1单域抗体片段的互补决定区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR1，SEQ ID NO.7所示的CDR2，SEQ ID NO.11所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-L1单域抗体片段的互补决定区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CDR1，SEQ ID NO.7所示的CDR2，SEQ ID NO.12所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-L1单域抗体片段的互补决定区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR1，SEQ ID NO.8所示的CDR2，SEQ ID NO.13所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-L1单域抗体片段的互补决定区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR1，SEQ ID NO.7所示的CDR2，SEQ ID NO.14所示的CDR3。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-L1单域抗体片段的互补决定区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1，SEQ ID NO.9所示的CDR2，SEQ ID NO.15所示的CDR3。
上述抗PD-L1单域抗体片段中，还可以包括框架区(FR，framework region)。如上所述，CDR区可以与FR区有序排列，例如，抗PD-L1单域抗体片段自N端至C端可以依次包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。再例如，框架区FR可以包括氨基酸序列如SEQ ID No.38所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.39～41其中之一所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.42～44其中之一所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.45所示的FR4。
在本发明一具体实施例中，框架区FR包括：
氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的FR1，SEQ ID NO.39所示的FR2，SEQ ID NO.42所示的FR3；SEQ ID NO.45所示的FR4，或
氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的FR1，SEQ ID NO.40所示的FR2，SEQ ID NO.43所示的FR3；SEQ ID NO.45所示的FR4，或
氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的FR1，SEQ ID NO.41所示的FR2，SEQ ID NO.43所示的FR3；SEQ ID NO.45所示的FR4，或
氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的FR1，SEQ ID NO.41所示的FR2，SEQ ID NO.44所示的FR3；SEQ ID NO.45所示的FR4。
在本发明另一具体实施例中，抗PD-L1单域抗体片段可以包括：a)氨基酸序列如SEQ ID No.16～21其中之一所示的多肽片段；或，b)氨基酸序列与SEQ ID No.16～21其中之一具有80％以上序列一致性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，上述b)中的多肽片段具体指：氨基酸序列如SEQ ID No.16～21其中之一所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID No.16～21其中之一所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，可以是与PD-L1特异性结合的能力，也可以是对PD-L1/PD-1相互作用的阻断，从而可以阻断PD-L1/PD1通路，也可以是提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的功能，还可以是抑制肿瘤生长的功能。上述b)中的抗PD-L1单域抗体片段的氨基酸序列可以与SEQ ID No.16～21其中之一具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性。上述抗PD-L1单域抗体片段通常可以来源于羊驼(Vicugna pacos)，例如，其CDR区可以来源于羊驼。上述抗PD-L1单域抗体片段通常可以是人源化的，例如，其框架区可以来源于人。
本文中，序列一致性(sequence identity)指参与对比的序列中相同残基的百分比。可采用本领域周知的计算软件计算两条或多条目的序列的序列一致性，这些软件可获自如NCBI。
本发明所提供的融合蛋白中，可以包括拮抗VEGF片段。上述拮抗VEGF片段通常可以是能够拮抗VEGF的多肽或蛋白片段。例如，上述拮抗VEGF片段可以是单克隆抗体等。再例如，上述拮抗VEGF片段可以是贝伐珠单抗等。
在本发明一具体实施例中，拮抗VEGF片段可以包括：
c)氨基酸序列如SEQ ID No.22～23其中之一所示的多肽片段；
d)氨基酸序列与SEQ ID No.22～23其中之一具有80％以上序列一致性且具有c)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，上述d)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.22～23其中之一所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30 个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID No.22～23其中之一所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，可以是特异性拮抗VEGF的功能，还可以是与FcRn受体结合的Fc部分的功能，从而可以延长体内半衰期，同时也可与表达Fc受体的效应细胞结合起到杀伤癌细胞的作用。所述d)中的氨基酸序列可以与SEQ ID No.22～23其中之一具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性。上述拮抗VEGF片段通常可以来源于小鼠(Mus musculus)，例如，其CDR区可以来源于小鼠。上述拮抗VEGF片段通常可以是人源化的，例如，其框架区可以来源于人。
本发明所提供的融合蛋白中，还可以包括连接肽片段。所述融合蛋白中，通常可以包括多个连接肽片段，至少部分的结构域或各结构域之间均可以设有连接肽片段。例如，抗PD-L1单域抗体片段、拮抗VEGF片段之间可以设有连接肽。上述连接肽片段通常可以为一段长度合适的富含G、S和/或A(主要由甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和/或丙氨酸(A)构成)的柔性多肽，从而使相邻的蛋白质结构域可相对于彼此自由移动。例如，所述连接肽片段的氨基酸序列可以包括如(GS)n、(GGS)n、(GGSG)n、(GGGS)nA、(GGGGS)nA、(GGGGS)nG、(GGGGA)nA、(GGGGG)nA等序列，其中，n选自1-10之间的整数。在本发明一具体实施例中，所述连接肽片段的氨基酸序列的长度可以为3-30、3-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-22、22-24、24-26、26-28、或28-30。
本发明所提供的融合蛋白中，融合蛋白可以是线性的，例如，融合蛋白可以自N端至C端可以依次包括抗PD-L1单域抗体片段、拮抗VEGF片段。融合蛋白也可以具有类似于单克隆抗体的结构，例如，抗PD-L1单域抗体片段可以位于拮抗VEGF片段的重链的N端，或者抗PD-L1单域抗体片段可以位于拮抗VEGF片段的轻链的N端。在本发明一具体实施例中，所述融合蛋白的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO.22-29其中之一所示的序列，例如，所述融合蛋白的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.24所示的序列、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.25所示的序列、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.26所示的序列、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.23所示的序列、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.23所示的序列、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.23所示的序列。
本发明第二方面提供一种分离的多核苷酸，编码本发明第一方面所提供的融合蛋白。上述多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供所述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，可以通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等方法制备获 得，也可以从适合的天然来源加以分离。
本发明第三方面提供一种构建体，上述构建体含有本发明第二方面所提供的分离的多核苷酸。合适的构建上述构建体的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，所述构建体可以通过体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，可以由上述的分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。通常来说，合适的载体可以包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，这些启动子可以是包括但不限于大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，例如，可以是包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。当所述的多核苷酸被表达时，表达载体中还可以包括增强子序列，如果在载体中插入增强子序列，则将会使转录得到增强，增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本发明第四方面提供一种表达系统，所述表达系统含有本发明第三方面所提供的构建体或基因组中整合有外源的本发明第二方面所提供的多核苷酸，从而可表达上述的融合蛋白。上述表达系统可以是宿主细胞，任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性的例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。将构建体导入宿主细胞的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等方法。
本发明第五方面提供本发明第一方面所提供的融合蛋白的制备方法，本领域技术人员可选择合适的方法以制备所述融合蛋白，例如，所述制备方法可以包括：在合适的条件下培养本发明第四方面所提供的表达系统，使之表达所述融合蛋白，收集含有所述融合蛋白的培养物，而后分离及纯化以提供所述融合蛋白。
本发明第六方面提供本发明第一方面所提供的融合蛋白、本发明第四方面所提供的表达系统的培养物在制备药物中的用途。上述药物可以是用于治疗肿瘤的药物，例如，可以是癌症或实体肿瘤，具体可以是肺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、经典霍奇金淋巴瘤、血液恶性肿瘤、头颈癌和鼻咽癌等，这些癌症可以为早期、中期或晚期，例如转移癌等。
本发明第七方面提供一种药物组合物，包括本发明第一方面所提供的融合蛋白或本发明第四方面所提供的表达系统的培养物。上述药物组合物中，融合蛋白或培养物的含量通常为治疗有效量的。本发明中，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的融合蛋白、药物组合物通常能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状。本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的治疗有效量，例如，可以是对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。治疗的处方(例如，对剂量的决定等)可以是由医生确定的，通常考虑的因素包括但不限于所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及其它因素等。
本发明所提供的药物组合物中，还可以包括药学上可接受的载体。上述载体可以包括各种赋形剂和稀释剂，这些载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体对于本领域技术人员来说应该是熟知的，例如，在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.，1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分讨论。
本发明第八方面提供一种治疗方法，包括：向个体施用治疗有效量的本发明第一方面所提供的融合蛋白、本发明第四方面所提供的表达系统的培养物、或本发明第七方面所提供的药物组合物。
本发明中，“治疗”一词包括可导致欲求的药学和/或生理效果的预防性、治愈性或缓和性处置。该效果较佳是指医疗上可减少疾病的一种或多种症状或者完全消除疾病，或阻滞、延迟疾病的发生和/或降低疾病发展或恶化的风险。
本发明中，“个体”通常包括人类、非人类的灵长类，或其他哺乳动物(如狗、猫、马、羊、猪、牛等)，其可因利用所述制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。
本发明中，上述融合蛋白、表达系统的培养物、或药物组合物可以作为是单一有效成分，也可以与其他药剂联用，从而在联合治疗中施用。例如，可以将上述具有抗癌活性的双 功能融合蛋白、表达系统的培养物、或药物组合物联合其他至少一种抗肿瘤药物。再例如，可以将上述具有抗癌活性的双功能融合蛋白、表达系统的培养物、或药物组合物与靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体联合使用。
本发明所提供的具有抗癌活性的双功能融合蛋白，能够在一个抗体融合蛋白分子中，将抗PD-L1单抗阻断PD-L1/PD-1相互作用、抗VEGF单抗减少微血管生长和抑制转移性疾病的功能有机地结合在一起，从而可以用于治疗肿瘤，具有良好的产业化前景。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999 等。
实施例1
融合蛋白的构建和重组表达制备
根据CHO细胞密码子偏好性将表1中双功能融合蛋白氨基酸序列转换成碱基序列，并分别在重链和轻链编码序列的5’端引入HindIII酶切位点和Kozak序列(GCCACC)，在3’端引入终止密码子及EcoRI酶切位点通过基因合成(通用生物系统(安徽)有限公司)获得全长DNA。将合成的重链和轻链编码基因分别进行HindIII-HF(购自NEB，R3104V)和EcoRI-HF(购自NEB，R3101V)双酶切，并用琼脂糖凝胶DNA/PCR产物小量回收试剂盒(购自Biomiga)进行切胶回收，与同样进行HindIII和EcoRI双酶切的pCDNA3.1(+)载体用T4连接酶(购自NEB，M0202V)进行连接，转化Top10感受态，涂布在LB氨苄青霉素抗性平板上培养。挑取克隆进行鉴定，并测序确认，分别构建了基于pCDNA3.1(+)的重链和轻链表达质粒。用去内毒素质粒大抽试剂盒(购自Biomiga，BW-PD3511-02)分别提取重链和轻链表达质粒，并将两者1:1混合。取1.0mg混合质粒，使用Wayne293表达培养基(购自中山康晟，A21501)稀释至25mL；取3.0mg PEI(线性，25KD，Polysciences，Inc.)，使用Wayne293表达培养基稀释至25mL后加入到质粒溶液中，混匀，室温孵育30分钟。取对数期生长的Hek293F细胞(活率>95％)，计数；1100rpm，离心10分钟，弃上清，用450mL Wayne293表达培养基重悬细胞。将上述质粒-PEI混合物，加入到细胞悬液中，37℃，5％CO 2摇床培养箱中培养7天后，离心取上清，用于后续蛋白纯化。
表1双功能融合蛋白氨基酸序列和编码序列
实施例2
双功能融合蛋白的纯化
2.1抗PD-L1单域抗体位于抗VEGF单抗的重链N端
将细胞发酵上清调至pH7.0后上样到Protein A亲和层析柱(博格隆生物技术有限公司)，平衡液为20mM PB,0.15M NaCl(pH＝7.0)，100％0.1M Gly-HCl(pH＝3.0)洗脱；洗脱液预先加入10％1M Tris-HCl(pH＝8.5)。100％洗脱液稀释至电导<3ms/cm，上清液调pH7.0上样至DSP层析柱(博格隆生物技术有限公司)，分别15％和100％洗脱(20mM PB，0.5M NaCl，pH7.0)。得到15％洗脱组分，即为目的蛋白。采用UV280法测定蛋白浓度。
2.2抗PD-L1单域抗体位于抗VEGF单抗的轻链N端
将细胞发酵上清调至pH7.0后上样到Protein A亲和层析柱(博格隆生物技术有限公司)，平衡液为20mM PB,0.15M NaCl(pH＝7.0)，100％0.1M Gly-HCl(pH＝3.0)洗脱；洗脱液预先加入10％1M Tris-HCl(pH＝8.5)。100％洗脱液稀释至电导4ms/cm，上样于Super Q(TOSOH)层析柱，平衡液为20mM Tris,pH8.0，洗脱液为500mM NaCl+20mM Tris(pH＝8.0)，分别35％和100％洗脱，通过流穿去除过量轻链，得到35％洗脱组分，即为目的蛋白。采用UV280法测定蛋白浓度。
纯度检测使用SEC-HPLC-UV分析。检测器：Agilent 1100 LC；检测波长：214nm；流动相：150mM pH7.0 PB+5％异丙醇；色谱柱：Superdex 200 Increase 5/150 GL；运行时间：15分钟；柱温25℃。检测结果显示纯度都大于95％。
实施例3
鉴定双功能融合蛋白在体外的功能
3.1抗PD-L1体外活性检测：
合成CD5L-OKT3scFv-CD14(GenBank:ADN42857.1)，并用HindIII-EcoRI(Takara)酶切，插入载体pCDNA3.1，构建pCDNA3.1-antiCD3TM。以人PD-L1(GenBank:NM_014143.2)为模板，高保真扩增得到PD-L1片段，并通过重叠PCR在序列5’端引入CMV启动子序列，重组连接插入pCDNA3.1-antiCD3TM，构建pCDNA3.1-antiCD3TM-PDL1。转染CHO细胞(Thermo)，然后用G418选择10-14d来产生稳定细胞系CHO-antiCD3TM-PDL1。
以人PD1(GenBank:NP_005009.2)为模板扩增所得片段，与经HindIII-BamHI(Takara)酶切的PB513B1-dual-puro载体(优宝生物)重组连接，构建质粒pB-PD1。以pGL4.30(优宝生物)为模板进行高保真扩增，回收所得片段，与经SfiI-XbaI(Takara)酶切的pB-PD1载体重组连接，构建pB-NFAT-Luc2p-PD1质粒。质粒成功 构建后用去内毒素质粒大抽试剂盒(Biomiga)提取质粒用于转染Jurkat细胞(中国科学院干细胞库)。参考专利CN 107022571A中的方法，通过使用0.1mg/ml的多聚-D-赖氨酸将Jurkat细胞处理成相对贴壁的状态，然后根据脂质体转染试剂盒(Lipofectamine 3000；invitrogen)中的转染说明对Jurkat细胞进行转染；第三天用含有10％FBS和2.5μg/ml嘌呤霉素的RPMI1640培养基(Thermo)进行加压筛选；此后每隔一段时间补加培养基，待细胞活率恢复后逐渐增加嘌呤霉素的含量至4μg/ml。最终获得单克隆Jurkat-NFAT-Luc2p-PD1细胞株。
取CHO-antiCD3TM-PDL1、Jurkat-NFAT-Luc2p-PD1细胞并计数，调整细胞密度为4×10 6/ml，96孔板中每孔每个细胞各加入25μl；分别用1％BSA梯度稀释实施例2中制备的融合蛋白样品，并加入50μl至细胞中；37℃、5％CO 2共培养6h后，每孔加入10μl荧光素酶底物(Promega,E2620)，振荡器上震荡2min，读数。操作如试剂盒说明。
3.2拮抗VEGF片段的体外活性检测：
HEK293细胞铺6孔细胞培养板，每孔1.0×10 6细胞，37℃，5％CO 2培养箱中过夜培养。按照 转染试剂说明书配制转染体系，其中pcDNA-KDR质粒1.0μg、pGL4.30质粒4μg。转染48小时后，细胞放大到10cm细胞培养皿，添加G418 200μg/ml、Hygromycin 100μg/ml。每3天更换一次新鲜加压培养基，至有明显的克隆团长出。消化细胞，铺96孔细胞培养板，待单克隆长出后，使用0.1μg/ml VEGF刺激6小时后检测化学发光情况，挑选信号响应明显的克隆继续放大培养。最终获得单克隆HEK293-NFAT-KDR。HEK293-NFAT-KDR细胞按照4万个/每孔密度铺板，使用Accutase进行消化；收集消化后的细胞，1000rpm离心5分钟；弃上清，加入分析培养液(DMEM+5％FBS)重悬细胞；细胞计数，调整细胞密度至1.6×10 6/ml；铺96孔细胞培养板，每孔25ul；使用分析培养液配制VEGF溶液，浓度为60ng/ml；加入到细胞培养板中，每孔25ul；使用分析培养液配制实施例2中制备获得的融合蛋白，加入到细胞培养板中，每孔25ul；37℃，5％CO 2孵育培养6h；每孔加入10ul Bright-Glo荧光素酶检测试剂(Promega，E2620)，震荡2分钟转移80ul裂解液至酶标白板中，酶标仪读数。
各双功能融合蛋白的抗PD-L1活性、抗VEGF活性的测量结果如表2所示。由表2可知，各双功能融合蛋白的活性并没有明显差异，均呈现出良好的体外细胞活性。
表2双功能融合蛋白的体外细胞活性
实施例4
双功能融合蛋白在人源化小鼠体内的肿瘤抑制活性
利用MDA-MB-231(人乳腺癌)细胞在huPBMC免疫系统人源化小鼠(M-NSG小鼠)体内建模来测定本发明的双功能融合蛋白体内药效。筛选6-8周龄雌性M-NSG小鼠，小鼠接种MDA-MB-231细胞(10*10E6+基质胶25％)，于第7天尾静脉注射PBMC(5*10E6/0.2ml)，后观察瘤体积及体重，选择肿瘤体积均在140-260mm 3之间的小鼠，依据其肿瘤体积和体重随机分为6组，每组7只，分组当天开始给药。荷瘤小鼠肿瘤体积过大/过小淘汰。每周2次腹腔注射：PBS、同型对照IgG1、阳性对照Avelumab(Merck)、DAF-5a、DAF-6a及联合给药(方案详见表3)，共给药3周左右。在分组前以及实验结束前，从眼眶采血。实验过程中动物体重(每周两次测量)，肿瘤体积(每周两次测量)。结果如图1所示。
表3
组别 给药样品 剂量
组1 同型对照IgG1 15mg/kg
组2 阳性对照Avelumab 15mg/kg
组3 DAF-5a 15mg/kg
组4 DAF-6a 15mg/kg
组5 PBS 5ul/kg
组6 联合给药：Avelumab+Bevacizumab 各15mg/kg
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (16)

  1. 一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗PD-L1单域抗体片段和拮抗VEGF片段，所述抗PD-L1单域抗体片段的互补决定区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1～5其中之一所示的CDR1，SEQ ID NO.6～9其中之一所示的CDR2，SEQ ID NO.10～15其中之一所示的CDR3。
  2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1单域抗体片段的互补决定区包括：
    氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CDR1，SEQ ID NO.6所示的CDR2，SEQ ID NO.10所示的CDR3；或
    氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR1，SEQ ID NO.7所示的CDR2，SEQ ID NO.11所示的CDR3；或
    氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CDR1，SEQ ID NO.7所示的CDR2，SEQ ID NO.12所示的CDR3；或
    氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR1，SEQ ID NO.8所示的CDR2，SEQ ID NO.13所示的CDR3；或
    氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR1，SEQ ID NO.7所示的CDR2，SEQ ID NO.14所示的CDR3；或
    氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1，SEQ ID NO.9所示的CDR2，SEQ ID NO.15所示的CDR3。
  3. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1单域抗体片段还包括框架区，所述框架区FR包括氨基酸序列如SEQ ID No.38所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID No.39～41其中之一所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID No.42～44其中之一所示的FR3、和氨基酸序列如SEQ ID No.45所示的FR4。
  4. 如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：
    氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的FR1，SEQ ID NO.39所示的FR2，SEQ ID NO.42所示的FR3；SEQ ID NO.45所示的FR4，或
    氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的FR1，SEQ ID NO.40所示的FR2，SEQ ID NO.43所示的FR3；SEQ ID NO.45所示的FR4，或
    氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的FR1，SEQ ID NO.41所示的FR2，SEQ ID NO.43所示的FR3；SEQ ID NO.45所示的FR4，或
    氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示的FR1，SEQ ID NO.41所示的FR2，SEQ ID NO.44所示的FR3；SEQ ID NO.45所示的FR4。
  5. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1单域抗体片段包括：
    a)氨基酸序列如SEQ ID No.16～21其中之一所示的多肽片段；
    或，b)氨基酸序列与SEQ ID No.16～21其中之一具有90％以上序列一致性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段；
    和/或，所述抗PD-L1单域抗体片段来源于羊驼；
    和/或，所述抗PD-L1单域抗体片段是人源化的。
  6. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述拮抗VEGF片段包括：
    c)氨基酸序列如SEQ ID No.22～23其中之一所示的多肽片段；或，
    d)氨基酸序列与SEQ ID No.22～23其中之一具有90％以上序列一致性且具有c)限定的多肽片段的功能的多肽片段；
    和/或，所述拮抗VEGF片段来源于鼠；
    和/或，所述拮抗VEGF片段是人源化的；
    和/或，所述拮抗VEGF片段为贝伐珠单抗。
  7. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括连接肽片段，优选的，所述连接肽片段富含G、S和/或A，更优选的，所述连接肽选自由G甘氨酸和/或S丝氨酸和/或A丙氨酸组成的柔性多肽链，所述连接肽的长度为3～30个氨基酸。
  8. 如权利要求1～7任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白自N端至C端依次包括抗PD-L1单域抗体片段、拮抗VEGF片段；
    和/或，所述抗PD-L1单域抗体片段位于拮抗VEGF片段的重链的N端；
    和/或，所述抗PD-L1单域抗体片段位于拮抗VEGF片段的轻链的N端。
  9. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.22-29其中之一所示的序列；
    或，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.24所示的序列、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.25所示的序列、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.26所示的序列、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.23所示的序列、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.23所示的序列、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.23所示的序列。
  10. 一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1～9任一权利要求所述的融合蛋白。
  11. 一种构建体，所述构建体含有如权利要求10所述的分离的多核苷酸。
  12. 一种表达系统，所述表达系统含有如权利要求11所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求10所述的多核苷酸。
  13. 如权利要求1-9任一权利要求所述的融合蛋白的制备方法，包括：在合适的条件下培养如权利要求12所述的表达系统，使之表达所述融合蛋白，分离、纯化以提供所述融合蛋白。
  14. 如权利要求1-9任一权利要求所述的融合蛋白、或如权利要求12所述的表达系统的培养物在制备药物中的用途。
  15. 如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述药物选自用于治疗肿瘤的药物。
  16. 一种药物组合物，包括如权利要求1-9之任一权利要求所述的融合蛋白、或如权利要求12所述的表达系统的培养物。
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