CN105492610B - 特异性结合分子的合成文库 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了生产具有下式(I)所示的肽结构域结构的抗原特异性抗原结合分子的方法：FW1‑CDR1‑FW2‑HV2‑FW3a‑HV4‑FW3b‑CDR3‑FW4，包括(1)从板鳃亚纲的物种成员中分离RNA；(2)从获得的RNA扩增DNA序列；(3)从制备的数据库中选择DNA序列；(4)扩增编码FW1‑CDR1‑FW2‑HV2‑FW3a‑HV4‑FW3b‑CDR3‑FW4的两个或多个连续的肽结构域的DNA序列；(5)将所述扩增的DNA序列连接在一起以形成编码抗原特异性结合分子的DNA序列；(6)将扩增的DNA克隆入展示载体；以及(7)使用所述展示载体转化宿主以产生所述抗原特异性抗原结合分子的文库。本发明还提供了用于生产所定义的抗原特异性抗原结合分子的方法，含有该分子的药物组合物及它们的医药用途。

Description

特异性结合分子的合成文库
技术领域
本发明涉及衍生自板鳃亚纲物种成员的抗原特异性结合分子的合成文库，其生产方法和从所述文库分离的特异性抗原特异性结合分子的方法。
背景技术
已经利用大量不同的方式(modalities)研究特异的、越来越有效的且多样化的治疗武器以挑战疾病。从传统的小分子至逐渐增大的生物药，例如单结合域(10-15kDa)至全IgG(～150kDa)。目前，正在研究的作为潜在疗法的单域包括各种各样的不同蛋白支架，它们均有其各自相关的优缺点。
这种单域支架可以衍生自一系列来源于不同物种的蛋白质。免疫球蛋白同种型(isotope)新型抗原受体(IgNAR)是同型二聚体重链复合物，其最初发现于护士鲨(Ginglymostoma cirratum)和其它鲨鱼以及鳐鱼物种的血清中。IgNARs不含有轻链。每个分子由单可变域(VNAR)和五个恒定域(CNAR)组成。文献中术语IgNARs指的是免疫球蛋白同种型新型抗原受体或免疫球蛋白同种型新抗原受体，并且这中用语是同义的。
除了免疫球蛋白或免疫球蛋白样鲨鱼可变新型抗原受体(VNAR)(Fennell,B.J.,et al.,J Mol Biol,2010.400(2):p.155-70)，其它示例为骆驼科动物可变重链(heavy)(VHH)结构域(Wesolowski,J.,et al.,Med Microbiol Immunol,2009.198(3):p.157-74)、改造的人可变重链(VH)结构域(Chen,W.,et al.,J Mol Biol,2008.382(3):p.779-89)和恒定重链(CH2)(Dimitrov,D.S.,MAbs,2009.1(1):p.26-8)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)(Nuttall,S.D.,et al.,Proteins,1999.36(2):p.217-27)结构域、七鳃鳗可变淋巴细胞受体(VLR)(Tasumi,S.,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,2009.106(31):p.12891-6)。VNAR与骆驼科动物可变重链(VHH)片段之间的相似点包括存在二硫键以及纳摩数量级范围内结合亲和力。
还有多种“非免疫球蛋白”结构域，包括，例如，纤连蛋白型III(FN3)(Bloom,L.andV.Calabro,Drug Discov Today,2009.14(19-20):p.949-55)、DARPins、Anticalins和亲合体(Affibodies)(Gebauer,M.and A.Skerra,Curr Opin Chem Biol,2009.13(3):p.245-55)。目前，深入研究的客体是单域生物制剂，以将它们成功作为治疗剂应用于对多种不同适应症。
迄今为止，已经有三种确定的鲨鱼IgNAR类型，已知为I、II和III型(图1)。这些类型的分类是以非典型的半胱氨酸残基的位置为基础，这些半胱氨酸残基处于强选择性压力下，所以很少被取代。
所有这三种类型在35位和107位具有经典的免疫球蛋白典型半胱氨酸，这两个位置连同36位的不变色氨酸稳定标准免疫球蛋白折叠。CDR2没有进行如此定义，但是相比更接近于TCR HV2和HV4的序列变异区已经分别被定义在框架2和3中。I型在框架2和框架4中具有种属(germline)编码的半胱氨酸残基，并且在CDR3内具有偶数个额外的半胱氨酸。分离的抗溶菌酶且与溶菌酶复合的(against and in complex with lysozyme)I型IgNAR的晶体结构研究使得这些半胱氨酸残基的贡献被确定。框架2和框架4的半胱氨酸均形成二硫桥，与CDR3中的半胱氨酸形成紧密包装结构，在其中，CDR3环被紧紧向下拉至HV2区。迄今为止，仅在护士鲨中鉴定出了I型IgNARs-所有其他软骨鱼类，包括相同级别的成员均仅具有II型或该类型的变异体。
II型IgNAR被定义为在CDR1和CDR3中具有半胱氨酸残基，它们形成分子内二硫键，将这两个区域保持在极为接近的状态，导致有益于与口袋或凹槽区结合的突出的CDR3(图2)。I型序列通常比II型序列具有更长的CDR3，二者分别具有平均21和15个残基。这被认为是由于I型CDR3中的两个或多个半胱氨酸残基连接至它们的框架2和框架4对应物(counterparts)的强选择性压力。关于体细胞突变累积的研究表明II型的CDR1中突变的数量多于I型，但是，I型的HV2区显示了比II型更多的序列变异。该证据与抗原结合位点内的这些区域的已确定的位置紧密相关。已经在新生儿中鉴定出了被称为III型的第三种IgNAR类型。该IgNAR家族成员在CDR3内缺少多样性，这是由于D1和D2区(它们形成CDR3)与V基因的种属融合。几乎所有的已知克隆具有15个残基长度的CDR3，其几何没有或者没有序列多样性。
从单域结合分子的临床试验获得了令人鼓舞的结果(Holliger,P.andP.J.Hudson,Nat Biotechnol,2005.23(9):p.1126-36)，不仅突出了其潜在的优势而且还突出了在其应用中的投资范围。已经提出多种用于选择小型单域支架的原理，而反对较大的且更熟悉的生物对应物，例如全IgG’s。其中引用较为广泛的通常为常规的推定，即由于它们的小尺寸，它们可以更容易适合于通过血脑屏障，并且通过提高组织穿透性靶向实体瘤。通常报道的骆驼科和鲨鱼物种的单域也被怀疑可形成结构上不同的互补位(paratope)，因此，它们可以促进分裂物(clefts)如酶活性位点的靶向作用。
然而，应该注意的是，关于多种这些特性仍然相对缺少信息。一些单域已经表现出高度固有的热稳定性，除了变性后的重折叠倾向以外。这些特性将有益于通常需要将生物治疗剂引入市场的大规模工艺开发活动。此外，这些特性可以使单域方法(approache)更适合用于(amenable to)药物输送的替代模式。使用单一单元结构域方法的结果意味着其还可以被用于“构造块(building-block)”合成，提供了将多域形式与多种不同的特异性相结合的潜能。
噬菌体展示允许生成蛋白变异体大文库，其可以被用于快速分拣那些以高亲和力结合至靶抗原上的序列。将编码变异多肽的核酸融合至编码病毒衣壳蛋白的核酸序列上。已经通过多种方式制备了抗体或抗原结合多肽的文库，包括通过插入随机DNA序列或者通过克隆相关基因家族改变单一基因。然后，将该文库用于预期特性的抗体或抗原结合蛋白的表达的筛选。
噬菌体展示技术相对于传统的用于制备具有预期特性抗体的杂交瘤和重组方法具有多种优势。该技术可以在较短的时间内且不使用动物的情况下产生具有不同序列的大文库。
从文库中分离高亲和力抗体依赖于文库的大小、细菌细胞的生产效果以及文库的多样性。生产效果低导致文库的大小降低，这是由于抗体或抗原结合蛋白的不正确折叠以及终止密码子的存在。如果抗体或抗原结合域被不正确地折叠，细菌细胞中的表达可以被抑制。通过依次突变可变/恒定界面表面的残基，或者已选择的CDR残基来改善表达。当在细菌细胞中产生抗体噬菌体文库时，框架区的序列是提供正确折叠的因素。
生成不同的抗体或抗原结合蛋白文库对于高亲和力抗体的分离很重要(例如，请参见WO 03/102157、WO 03/014161和WO 2005/118629)。CDR3区是感兴趣的部分，因为经常发现它们参与抗原结合。
本发明涉及Ig样新抗原受体可变域(VNAR)。与骆驼科VHH结构域有些类似(但是祖先分子谱系不同)，然而，相比之下，描述使用天然鲨鱼谱系进行噬菌体展示文库构建和特异性结合体选择的文献报道的频率较低且很少(Nuttall,S.D.,et al.,FEBS Lett,2002.516(1-3):p.80-6；Liu,J.L.,et al.,Mol Immunol,2007.44(7):p.1775-8)。迄今为止，大部分分离的VNAR结构域似乎是从使用靶向免疫来源的组织构建的噬菌体展示文库(Dooley,H.,M.F.Flajnik,and A.J.Porter,Mol Immunol,2003.40(1):p.25-33；Nuttall,S.D.,et al.,Proteins,2004.55(1):p.187-97；and Dooley,H.,et al.,Proc Natl AcadSci U S A,2006.103(6):p.1846-51)获得的，或者从通过PCR得到的与靶向互补决定区3(CDR3)的合成多样性结合的“天然的”非免疫的多样性(Nuttall,S.D.,et al.,MolImmunol,2001.38(4):p.313-26；Nuttall,S.D.,et al.,Eur J Biochem,2003.270(17):p.3543-54；and Liu,J.L.,G.P.Anderson,and E.R.Goldman,BMC Biotechnol,2007.7:p.78)获得的。
鲨鱼免疫接种策略是分离具有高亲和力、高特异性VNAR结构域的强有力的方式，然而，该方法存在一些技术挑战，例如需要长期免疫计划并且通常缺少鲨鱼物种或同种型识别试剂。因此，本发明提供了一种合成VNAR文库，其可以被用于用于任意既定靶标的潜在VNAR治疗剂的有效来源，有效避开了上述挑战。理想的情况下，研究者应该能够使用展示文库技术以快速获得VNAR，而不需要使用动物，在相同的生物药开发过程中该技术当前被广泛应用于人和小鼠抗体的分离。
发明内容
本发明是基于从两个或多个天然存在的VNAR序列构建的文库分离得到的VNARs的非预期多样性、亲和力、特异性和效果，所述VNAR序列来自于同样物种的不同的同种型以及跨越不同板鳃亚纲物种的不同的同种型。这种将不同的同种型与不同的物种框架融合在一起的新型方法具有在该文库内产生增加的多样性的优势，而该优势是使用单一框架文库所无法达到的。所述优势包括但不限于：
●在两个CDR区，HV区和框架区内通过不同同种型的融合构建额外的多样性
●在两个CDR区，HV区和框架区内通过不同板鳃亚纲物种来源的不同同种型的融合构建额外的多样性
●在两个CDR区内，通过使用三核苷酸(TRM)低聚物的定向突变以及使用的NNK低聚物的随机突变构建额外的多样性。
●通过使用天然存在的CDR1区结合NNK低聚物在融合的框架区之外构建额外的多样性，如此将导致经典的II型半胱氨酸穿过CDR1和CDR3进行配对。
●通过使用不同固定长度的不同CDR3区构建额外的多样性
●增加文库大小>9×1010个克隆，其比之前报道的任意鲨鱼文库(天然的，免疫或合成的)高两个数量级
本发明通常涉及抗原特异性抗原结合分子文库。所述文库包括多种不同的抗原特异性结合分子，包含其结构域和/或片段，其是通过在CDR区和片段区构建多样性生成的。特别地，CDR区的多样性旨在使多样性最大化，而最小化本发明的VNAR序列和抗原特异性抗原结合分子的结构域的结构性扰动。
这种文库提供了例如用于选择和/或筛选具有预期活性如结合亲和力(affinities)和活动性(avidities)的合成VNAR克隆。这些文库有益于识别能够与任意广泛靶抗原相互作用的序列。例如，含有在噬菌体表面展示的本发明的多样化的VNAR多肽的文库特别有益于并提供了用于选择和/或筛选目的抗原结合分子的高通量的、有效的且自动的系统。本发明的方法旨在提供与靶抗原具有高亲和力的结合体，其与来源或模板分子相比改变最小并且当在细胞培养物中产生抗体或抗原结合片段时提供良好的产率。
本发明提供了用于生成和分离优选对所选抗原具有高亲和力的新型VNARs或其片段的方法。通过突变(多样化)源模板VNAR序列中一个或多个所选氨基酸位点生成在上述位点具有变异氨基酸的VNAR结构域多样化文库而制备了多种不同的VNARs或VNAR结构域。所述氨基酸位点是那些溶剂可及的位点，例如，通过分析源VNAR的结构确定，和/或在已知的和/或天然发生的VNAR多肽中是高度多样化的。
本发明还涉及一种或多种抗原特异性抗原结合分子或结构域(或其部分)与异源蛋白如病毒的衣壳蛋白形成的融合多肽。本发明还涉及可复制的表达载体，其包括编码融合多肽的基因，含有表达载体的宿主细胞，在病毒表面上展示融合多肽的病毒，在病毒表面上展示多种不同融合多肽的病毒文库，以及这些组合物的使用方法。
本发明的方法和组合物有益于识别可以被用于治疗使用或用作试剂使用的新型抗原特异性抗原结合分子。
根据本发明的第一方面，提供了一种生产具有肽结构域结构的抗原特异性抗原结合分子文库的方法，所述肽结构域结构如下式(I)所示：
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4
该方法包括以下步骤：
(1)从板鳃亚纲物种的一个成员中分离RNA；
(2)从步骤(1)中获得的编码抗原特异性抗原结合分子的RNA扩增DNA序列，以构建编码抗原特异性结合分子的DNA序列数据库；
(3)从步骤(2)中制备的数据库选择DNA序列；
(4)在多个与步骤(3)选择的序列中的CDR1或CDR3互补的异源低聚物存在的情况下，扩增编码FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4的两个或多个连续的肽结构域的DNA序列，以形成多个编码式(I)的抗原特异性抗原结合分子的扩增的DNA序列，其中，所述两个或多个连续的肽结构域在连接的时候编码式(I)的抗原特异性抗原结合分子，并且其中所述的两个或多个连续的肽结构域来自于在选自步骤(3)的序列；
(5)将编码两个或多个连续的肽结构域的所述扩增的DNA序列连接在一起以形成编码具有式(I)的肽结构域结构的抗原特异性结合分子的DNA序列；
(6)将步骤(3)中获得的扩增的DNA克隆入展示载体中；以及
(7)转化具有所述展示载体的宿主以产生所述抗原特异性抗原结合分子的文库。
在本发明提供的方法中，RNA可以从板鳃亚纲物种的一个成员或数个不同成员中分离。因此，涉及板鳃亚纲物种的成员也包括涉及板鳃亚纲物种的一个或多个不同成员。因此，本发明的第一方面的步骤(1)可以包括从板鳃亚纲物种的一个成员或数个不同成员中分离RNA。
板鳃亚纲是软骨鱼纲分类的一个亚纲，包括软骨鱼、鲨鱼、鳐鱼和魟鱼。该亚纲的成员可以进一步细分成十一目；真鲨目(Carchariniformes)；虎鲨目(Heterodontiformes)；六鳃鲨目(Hexanchiformes)；鼠鲨目(Lamniformes)；须鲨目(Orectolobiformes)；锯鲨目(Pristiformes)；鳐形目(Rajiformes)；角鲨目(Squaliformes)；扁鲨目(Squatiniformes)；电鳐目(Torpediniformes)。然后，将每个目细分成多个科。例如，本发明的方法涉及两个种；来自须鲨目的铰口鲨科的铰口鲨(Ginglymostoma cirratum)以及角鲨目的角鲨科的白斑角鲨(Squalus acanthias)。
因此，在本发明的方法中，使用两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个肽结构域是可能的，当它们连接时编码如FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4所示的式(I)的抗原特异性抗原结合分子。
所述FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4的两个或多个连续的肽结构域可以选自由FW1、CDR1、FW2、HV2、FW3a、HV4、FW3、CDR3和FW4及它们的组合所组成的组中。可能有两个、三个、四个或五个该肽结构域。
当将FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4的连续的肽结构域的可能组合连接时编码式(I)所示的抗原特异性抗原结合分子，其可以被定义为式(III)所示结构：
P-Q-R，
其中，P-Q-R为FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4，并且其中每个P、Q和R表示连续的肽结构域，并且可选地，其中不含有Q或R。当连接在一起时编码式(I)所示的抗原特异性抗原结合分子的一些连续的肽结构域的非限制性实例如下表所示：
Figure BDA0000887558850000091
连续的肽结构域的其它片段当连接在一起时编码式(I)所示的抗原特异性抗原结合分子，所述片段可以通过合适的替代方式拆分式(I)所定义的肽结构域序列进行制备。
如果每个框架(FW)区均在单独的片段中，那么可能可以制备4或5个肽结构域。在这种情况下，式(III)表示为：
P-Q-R-S
其中有4个单独的肽结构域，其中，P-Q-R-S为FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4并且其中每个P、Q、R和S表示连续的肽结构域；或者
P-Q-R-S-T
其中有5个单独的肽结构域，其中，P-Q-R-S-T为FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4，并且其中每个P、Q、R、S和T表示连续的肽结构域。
根据这些可选实施方式的连续的肽结构域的实例显示在下表中：
编号 P Q R S
11 FW1 CDR1-FW2-HV2- FW3a- HV4-FW3b-CDR3-FW4
12 FW1 CDR1-FW2- HV2-FW3a-HV4 FW3b-CDR3-FW4
13 FW1-CDR1 FW2-HV2-FW3a-HV4- FW3b-CDR3 -FW4
Figure BDA0000887558850000101
在本发明的该方面的一种实施方式中，所述两个或多个连续的肽结构域为FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4所示的三个结构域，即FW1、CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b和CDR3-FW4。
在本发明的该实施方式中，步骤(4)可以被定义为(4)在与CDR1或CDR3互补的基于步骤(3)中选择的序列中的多个异源低聚物存在的情况下，扩增编码肽结构域FW1、CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b和CDR3-FW4的DNA序列(来自从步骤(3)中选择的至少两个异源DNA序列)以形成编码肽结构域FW1、CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b和CDR3-FW4的多个扩增的DNA序列。因此，根据本发明的该实施方式的步骤(5)可以被定义为将编码肽结构域FW1、CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b和CDR3-FW4的所述扩增的DNA序列连接在一起以形成编码具有式(I)所示的肽结构域结构的抗原特异性结合分子。
在本发明的一种实施方式中，不同环境下由模板衍生的HV2和HV4环可以通过选择性剪切编码分别与衍生的FW1，以及CDR1和CDR3片段配对的模板衍生的HV2和HV4的PCR片段实现。
根据本发明的第一方面的方法的步骤(3)，从步骤(2)制备的数据库中选择DNA序列可以按照对表达的氨基酸序列(用于制备DNA序列)进行分析实现。除了CDR3长度分布以外，跨越分析的种群，可以按照氨基酸(AA)含量，相对位点保护和频率对翻译的DNA序列进行检查。
从天然序列的数据库中表达的DNA序列与文库中表达的序列的对比分析中，可能以CDR1和/或CDR3中的天然含量的程度以及CDR1和/或CDR3中表现出的相对多样性为基础选择DNA序列。
天然序列的含量被定义为与相应的天然表达的VNAR序列相比，具有至少约80％、85％、90％或95％的序列同一性，例如约80％至约95％，或者约85％至约90％。高水平多样性被定义为约60％至约75％的序列同一性，适当地，为约65％至约70％，其中，与相应的天然表达的VNAR序列相比，约60％至约65％的多样性是合适的。
例如，具有天然版CDR1以及高水平多样性CDR3是所期望的。半胱氨酸残基的添加可以通过在DNA扩增过程中使用TRM寡核苷酸实现。
因此，本发明的抗原特异性抗原结合分子可以按照基本结构(如本文所定义的)被构建成本文描述的不同区的任意氨基酸序列：
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4
其中，每个FW1、CDR1、FW2、HV2、FW3a、HV4、FW3b、CDR3和FW4表示肽序列，其中，“FW”为“框架”区，“CDR1”为“互补决定区1”，“HV”为“高变”区，以及“CDR3”为“互补决定区3”。合适的肽结构域序列的实例如本文所描述。
本发明的特异性抗原结合分子可以根据Liu等(Liu et al Mol.Immunol.44,1775-1783(2007)and Liu et al BMC Biotechnology,7(78)doi:10.1186/1472-6750-7-78(2007))报道的用于VNARs的术语的常规结构进行分类。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(4)中DNA的扩增在编码除了半胱氨酸以外的任意氨基酸序列的低聚物的存在下进行。换句话说，由扩增的DNA编码得到的CDR区将不包括半胱氨酸。然而，在其它的实施方式中半胱氨酸可以存在于CDR区中。
所有VNARs在FW1和FW3中都包括典型的半胱氨酸残基，其可以构建经典的免疫球蛋白(Ig)折叠。另外，它们通过在CDRs和FWs中添加额外的半胱氨酸(cys)残基进行表征。
I型：除了两个额外的半胱氨酸以外，FW2和FW4中含有非典型的半胱氨酸残基在FW-CDR3配对中形成严格限制的CDR3结构。
II型：CDR1和CDR3中的非典型的半胱氨酸残基，其可以构建二硫键，这导致CDR3形成突出位置。
III型：作为II型的非典型的半胱氨酸残基，但是，其在CDR1区含有保守的W。
所有上述内容均基于护士鲨术语。在本发明中，已经分离出其它新的同种型，他们被描述为“b型”变异体，如下所示：
IIb型：CDR1和CDR3中无非典型的半胱氨酸残基-导致非常灵活的CDR3(2V是IIb型变异体的实例)。
IIIb型：CDR1和CDR3中无非典型的半胱氨酸残基，但是CDR1中具有不可变的W(5V是IIIb型变异体的实例)。
保证CDR1和CDR3中无非典型的半胱氨酸(C)残基是所期望的，这可以提供更灵活的CDR3区。这种结构可以被称为“IIb型”同种型，按照根据Liu等(Liu et alMol.Immunol.44,1775-1783(2007)and Liu et al BMC Biotechnology,7(78)doi:10.1186/1472-6750-7-78(2007))报道的用于VNARs的护士鲨术语的常规结构(generalstructure)。
在可选的实施方式中，保证CDR1和CDR3中无非典型的半胱氨酸(C)残基，但是CDR1中还具有不可变的色氨酸(W)也是所期望的。这种结构可以被称为“IIIb型”同种型，按照Liu等(引用如上)报道的用于VNARs的护士鲨术语的常规结构。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原特异性抗原结合分子可以为来自IIb型和IIIb型VNAR的FW1、CDR1、FW2、HV2、FW3a、HV4、FW3b、CDR3和/或FW4区的融合体。融合的IIb和IIIb部分可以以任意合适的顺序进行连接以形成VNAR结构。
在本发明的一种实施方式中，所选的DNA序列可以具有结构域FW3b中最后三个氨基酸残基作为CKA、CRA或CAN以及FW4的头三个氨基酸残基作为Y或D/G或D/D或A。其它FW3b序列可以包括变异体，例如CRG、CKV、CKT和/或CHT。
其它可选的同种型的融合体也可以根据本发明进行制备。例如，来自I型VNAR的区域可以与III型VNAR融合，或者来自I型的区域可以与II型VNAR融合。还包括I型、II型和III型同种型区域的变异体，例如本发明中描述的，Ib型、IIb型和IIIb型的变异体。融合体还可以包括跨越VNAR家族的任意同种型融合体，即从板鳃亚纲的任意物种中分离得到的同种型区域。例如，来自护士鲨的II型区域与来自角鲨(dogfish)的II型区域融合，或者来自须鲨的IIb型与来自角鲨的IIIb型融合。
根据本发明，所述文库可以通过来自相同物种中的不同同种型以及跨越不同板鳃亚纲物种的不同同种型的两个或多个天然存在的VNAR序列进行构建。这种将不同同种型和不同物种的框架融合在一起的方式具有创造文库内增加的多样性的优势，该优势是使用单一框架文库所无法获得的。
在本发明的一种实施方式中，将来自两个不同的板鳃亚纲物种：白斑角鲨(Squalus acanthias)和铰口鲨(Ginglymostoma cirratum)的VNAR结构域的三种不同同种型进行了结合。框架融合构建体旨在并入来自白斑角鲨的IIb型和IIIb型VNAR结构域以及来自护士鲨的II型VNAR结构域。
本发明的另一种实施方式为将半胱氨酸(cys)残基并入了CDR区，其通过形成如在经典的II型VNAR结构域中可见的CDR1至CDR的二硫键以增加多样性。
在本发明的另一种实施方式中，步骤(1)中从板鳃亚纲物种的成员中分离RNA可以为从之前尚未被免疫的受试体分离RNA，即从框架材料的天然的
Figure BDA0000887558850000141
或自然的(natural)来源。在其它的实施方式中，RNA可以来源于之前已经被免疫的受试体。
根据本发明的第二方面，提供了用于生产抗原特异性抗原结合分子的方法，该方法包括：
(1)从根据本发明的第一方面制备的文库中选择预期的克隆；
(2)从这些克隆中分离和纯化抗原特异性抗原结合分子；
(3)将编码抗原特异性抗原结合分子的DNA序列克隆入表达载体；以及
(4)转化宿主以允许表达载体的表达。
根据本发明的第三方面，提供了具有如下式(I)所示的肽结构域结构的抗原特异性抗原结合分子的生产方法：
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4
该方法包括：
(1)从板鳃亚纲的物种成员中分离RNA；
(2)从步骤(1)获得的编码抗原特异性抗原结合分子的RNA扩增DNA序列，以创建编码抗原特异性结合分子的DNA序列数据库；
(3)从步骤(2)制备的数据库中选择DNA序列；
(4)在多个与步骤(3)选择的序列中的CDR1或CDR3互补的异源低聚物存在的情况下，扩增编码FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4的两个或多个连续的肽结构域的DNA序列，以形成多个编码式(I)的抗原特异性抗原结合分子的扩增的DNA序列，其中，所述两个或多个连续的肽结构域当被连接时编码式(I)的抗原特异性抗原结合分子，并且其中所述两个或多个连续的肽结构域来自于在步骤(3)中选择的至少两个异源DNA序列；
(5)将编码肽结构域FW1、CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3和CDR3-FW4的所述扩增的DNA序列连接在一起以形成编码具有式(I)的肽结构域结构的抗原特异性结合分子的DNA序列；
(6)将步骤(5)获得的扩增的DNA克隆入展示载体；
(7)使用所述展示载体转化宿主以产生所述抗原特异性抗原结合分子的文库；
(8)从文库中选择预期克隆；
(9)从所述克隆中分离并纯化抗原特异性抗原结合分子；
(10将编码抗原特异性抗原结合分子的DNA序列克隆入表达载体中；
(11)转化宿主以允许表达载体表达。
在本发明的方法中，RNA可以从板鳃亚纲物种的一个成员或数个不同成员中分离。因此，涉及板鳃亚纲物种的成员的也包括涉及板鳃亚纲物种的一个或多个不同成员。因此，本发明的第一方面的步骤(1)可以包括从板鳃亚纲物种的一个成员或数个不同成员中分离RNA。
步骤(3)中DNA序列的选择如本发明的第一方面相关的描述。因此，本发明的该方面包括多种这种分子的生产。
步骤(4)中FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4的连续肽结构域的结合如本发明的第一方面相关的描述。根据本发明的该方面的一种实施方式，步骤(4)可以被定义为：在与CDR1或CDR3互补的基于步骤(3)中选择的序列中的多个异源低聚物存在的情况下，扩增编码肽结构域FW1、CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b和CDR3-FW4的DNA序列，其中，所述肽结构域来自于步骤(3)中选择的至少两个异源DNA序列，，以形成编码肽结构域FW1、CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b和CDR3-FW4的多种扩增的DNA序列。根据本发明的该实施方式，步骤(5)可以被定义为将编码肽结构域FW1、CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b和CDR3-FW4的所述扩增的DNA序列连接在一起以形成编码具有式(I)所示的肽结构域结构的抗原特异性结合分子；
在本发明的另一种实施方式中，步骤(1)中从板鳃亚纲物种的成员中分离RNA可以为从之前尚未被免疫的受试体分离RNA，即从框架材料的天然的或自然的来源。在其它的实施方式中，RNA可以来源于之前已经被免疫的受试体。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(4)中DNA的扩增在编码除了半胱氨酸以外的任意氨基酸的序列的低聚物的存在下进行。换句话说，通过扩增的DNA编码得到的CDR区将不包括半胱氨酸。然而，在其它的实施方式中半胱氨酸可以存在于CDR区中。
根据本发明的第四方面，提供了一种抗原特异性抗原结合分子的生产方法，该方法使用含有编码多种抗原特异性抗原结合分子的可表达的DNA序列的文库的转化宿主，其中，从至少两个异源同种型NAR序列构建文库，其中，所述抗原特异性抗原结合分子包括在板鳃亚纲物种的成员中发现的免疫球蛋白同种型NAR的可变区的多个结构域。
在本发明的另一种实施方式中，步骤(1)中从板鳃亚纲物种的一个成员中分离RNA可以为从之前尚未被免疫的受试体分离RNA，即从框架材料的天然的或自然的来源。在其它的实施方式中，RNA可以来源于之前已经被免疫的受试体。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(4)中DNA的扩增在编码除了半胱氨酸以外的任意氨基酸的序列的低聚物的存在下进行。换句话说，通过扩增的DNA编码得到的CDR区将不包括半胱氨酸。然而，在其它的实施方式中半胱氨酸可以存在于CDR区中。
根据本发明的第五方面，提供了一种含有式(II)所示的氨基酸序列的抗原特异性抗原结合分子
A-X-B-Y-C (II)
其中，
A–为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7
X为5、6或7个氨基酸残基的CDR1区
B–为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8
Y为8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸残基的
CDR3区
C–为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6
或与它们至少具有50％同源性的序列，
其中，SEQ ID NO:1为TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDT，TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGA
SEQ ID NO:2为TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKA
或TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQ ID NO:3为DGAGTVLTVN
SEQ ID NO:4为ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDT或ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGA
SEQ ID NO:5为TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKA
或TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQ ID NO:6为YGAGTVLTVN
SEQ ID NO:7为ARVDQTPQTITKETGESLTINCVLRD，以及
SEQ ID NO:8为TYWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRA或TYWYRKNPGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRA。
由A、X、B、Y和/或C表示的氨基酸序列可以衍生自相同的或者不同的板鳃亚纲成员。由A、X、B、Y和/或C表示的氨基酸序列也可以衍生自相同的或者不同的VNAR序列的同种型，例如I型、II型和/或III型(包括Ib型、IIb型和IIIb型)。因此，源材料的任何常规的适当组合都是可能的。
在本发明的一些实施方式中，式(II)A-X-B-Y-C可以由序列组成，其中，元件A、B和C被表示为(i)SEQ ID NO.s 1、2和3；(ii)SEQ ID NO.s1、2和6；(iii)SEQ ID NO.s 1、5和3；(iv)SEQ ID NO:s 1、5和6；(v)SEQ ID NO.s 4、5和6；(vi)SEQ ID NO:s 4、5和3；(vii)SEQID NO:s 4、2和6；(viii)SEQ ID NO.s 4、2和3；(ix)SEQ ID NOs 7、8和6；(x)SEQ ID NOs1、8和6。
其中，A为SEQ ID NO:1，B为SEQ ID NO:2且C为SEQ ID NO:3，式(I)所示序列的一种实施方式为SEQ ID NO:10，其中，CDR1区为SYGLYS且CDR3区为QSLAISTRSYWY，如图9所示。
其中，A为SEQ ID NO:4，B为SEQ ID NO:5且C为SEQ ID NO:6，式(I)所示序列的一种实施方式为SEQ ID NO:12，其中，CDR1区为SYWASS且CDR3区为YRMESIAGRGYDV，如图9所示。
SEQ ID NO:s,10和12如图9所示，其中，编码蛋白序列的相应核酸序列也分别如SEQ ID No.s 9和11所示。
CDR1区可以为图17中所示的任意CDR1区。CDR3区可以为图18所示的任意CDR3区。
图9至18显示的是本发明的优选的抗原特异性抗原结合分子(肽)以及被用于制备本发明的文库的核酸引物序列。
在本发明的一种实施方式中，由如图所示的本发明的抗原特异性抗原结合分子的序列所表示的，框架区可以衍生自指定的2V和5V克隆，序列如图11所示并且如SEQ ID No:s9、10、11和12所示(并且以上描述参考SEQ ID No；s 1至8)。
在本发明该方面的一种实施方式中，提供了一种含有式(II)所示的氨基酸序列的抗原特异性抗原结合分子
A-X-B-Y-C (II)
其中，
A–为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4
X为5、6或7个氨基酸残基的CDR1区
B–为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5
Y为8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸残基的
CDR3区
C–为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6
或与它们至少具有50％同源性的序列，
其中，
SEQ ID NO:1为TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDT，TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGA
SEQ ID NO:2为TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKA
或TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQ ID NO:3为DGAGTVLTVN
SEQ ID NO:4为ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDT或ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGA
SEQ ID NO:5为TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKA
或TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQ ID NO:6为YGAGTVLTVN。
由A、X、B、Y和/或C表示的氨基酸序列可以衍生自相同的或者不同的板鳃亚纲成员。由A、X、B、Y和/或C表示的氨基酸序列也可以衍生自相同的或者不同的VNAR序列的同种型，例如I型、II型和/或III型(包括Ib型、IIb型和IIIb型)。因此，源材料的任意常规的组合都是可能的。
在本发明的一些实施方式中，式(II)A-X-B-Y-C可以由序列组成，在其中，元件A、B和C表示为(i)SEQ ID NO.s 1、2和3；(ii)SEQ ID NO.s1、2和6；(iii)SEQ ID NO.s 1、5和3；(iv)SEQ ID NO:s 1、5和6；(v)SEQ ID NO.s 4、5和6；(vi)SEQ ID NO:s 4、5和3；(vii)SEQID NO:s 4、2和6；(viii)SEQ ID NO.s 4、2和3。
在本发明的方法中，RNA从之前尚未被免疫的板鳃亚纲物种的成员，即“天然的”受试体中分离。板鳃亚纲是软骨鱼纲的一个亚纲，包括鲨鱼、魟鱼(skate)和鳐鱼。通常情况下，合适的实例包括角鲨目的鲨鱼，如白斑角鲨(Squalus acanthias)，以及须鲨目，如护士鲨(Ginglymostoma cirratum)。
RNA可以从组织样本中分离，包括全血，使用如本文描述的标准分子生物学技术。
在构建文库之前，制备全面的cDNA序列数据库，其目的在于设计用于扩增代表组织样本中表示全部天然抗原特异性抗原结合分子(免疫球蛋白同种型新型抗原受体或IgNAR)转录本的谱系的引物。
可以通过扩增编码抗原特异性抗原结合分子的DNA序列构建数据库。适当地，该方法包括一系列步骤，开始于简并PCR以获得部分序列，从其中设计3’RACE引物用于“RACE”(cDNA末端的快速扩增)。为了分离编码序列的IgNAR，可以使用基于已知的护士鲨IgNAR序列或其它鲨鱼物种的引物实施简并PCR。由此，恒定区可以被分离和测序，从而导致5’RACE引物的设计以完成从前导区通过可变区至恒定区的全长IgNAR序列。
提取的RNA可以经逆转录生成cDNA。可以使用恒定区1引物生成从白斑角鲨组织合成的cDNA。
天然免疫球蛋白同种型(isotope)新型抗原受体(IgNAR)是由单可变区(VNAR)和五个恒定区(CNAR)组成的同型二聚体重链复合物。通过如上描述的简并PCR技术获得的IgNAR序列可以被分析，并且设计多个用于IgNAR转录本(3’RACE)的3’末端扩增的引物。分离总RNA并进行3’RACE。使用合适的引物可以从总RNA合成第一链cDNA。该第一链cDNA被用于PCR扩增。PCR产物可以被克隆入载体或克隆的TA。然后，对含有PCR产物的克隆进行测序。
使用跨膜特异性引物的编码新型抗原受体(NAR)的cDNAs可以按照下述方式分离。如上所述，可以从白斑角鲨组织提取RNA且进行逆转录。使用生成的3’RACE cDNA、通用引物和白斑角鲨IgNAR特异性引物进行第一轮PCRs。产生的PCR产物可以被克隆入载体并进行测序。
编码5’非翻译区、接合前导(splice leader)、可变区和部分恒定区的NAR cDNA可以按如下方式获得。对编码每个物种的恒定区(通过如上描述的3’RACE分离)的核苷酸序列进行分析以鉴定保守区。
如下所述的，可以在具有高度同一性的这些区域设计引物并且用于NAR编码序列的5’RACE扩增。使用5’RACE系统实现cDNA末端的扩增。从组织中提取总RNA，并且使用基因特异性引物合成第一链cDNA，随后将其连接至寡-dC尾。结合基因特异性引物，具有dC尾的cDNA可以用于PCR扩增。对大小正确的扩增产物进行纯化和TA克隆或者可选地克隆入载体。然后，对含有PCR产物的克隆进行测序。
通过如下所述的PCR扩增法可以获得编码接合前导区、可变区和部分恒定区1的NAR cDNA克隆。可以分析如上描述的通过5’RACE获得的序列以鉴定接合前导序列。比对核苷酸序列并在具有高度核苷酸同一性的区域设计引物(指定的正向引物)。类似的，分析通过3’RACE获得的序列以鉴定恒定区中具有高度核苷酸同一性的区域以用于设计引物(指定的反向引物)。使用这些正向和反向引物按照如下所述方式进行PCR扩增以获得NAR cDNA。
可以从如前所述的多种白斑角鲨组织提取RNA。从总RNA寡-dT引物合成第一链cDNA。正向和反向引物可以被用于PCR扩增从该cDNA获得的NAR特异性克隆。对大小正确的扩增产物进行纯化和TA克隆或者可选地克隆入载体并测序。
可以进行生物信息学分析以识别和表征白斑角鲨IgNAR序列。开放阅读框的识别，所述分离的cDNA克隆的核苷酸序列分析，可以允许设计用于每个物种的NAR特异性引物，以构建NAR编码克隆的大文库。护士鲨IgNAR蛋白序列可以用作模板以定义从白斑角鲨得到的IgNAR序列。接下来，选择数个种子白斑角鲨(several seed)IgNAR序列以形成多重序列比对。每个IgNAR cDNA序列的开放阅读框可以被识别并且被翻译成氨基酸序列。然后，该IgNAR氨基酸序列可以被比对并且与已知的护士鲨IgNAR基因结构进行比较以识别IgNAR结构域(FW1、CDR1、FW2、HV2、FW3A、HV4、FW3B、CDR3和FW4)。
在本发明的一种实施方式中，克隆2V和5V(如图9所示的序列)可以被克隆入展示载体(例如噬菌粒展示载体)并且被用作文库模板。适当地，所选模板表现出高水平的细菌表达。
使用如本文描述的PCR扩增的cDNA制备全面的“天然”白斑角鲨VNAR氨基酸(AA)序列数据库，其包括来自于一系列不同白斑角鲨动物和组织类型的全长独特的cDNA VNAR克隆。编译的被翻译的VNAR结构域可以根据氨基酸(AA)含量、保守区的相对位置(relativepositional conservation)以及横跨分析群的频率进行检测，除了CDR3长度分布以外。因此，该分析可以指导合成文库的设计。
起始于CDR1和CDR3环，可以便于观察横跨这些环的含量、相邻框架残基以及环长度范围和分布。根据长度(n≥100)池可以将数据库内的序列分类成独特的克隆。可以关注整体CDR3环长度在11至16个氨基酸的范围，因为它们相当于13±2个氨基酸的平均白斑角鲨CDR3长度。
根据本发明的双模板设计，很可能调节与CDR3紧密相邻的FW3a位点-3、-2、&-1，从而代表了合成文库中的CKA或CRA基序。该方式可以允许在数据库中发现的高达76％的“天然”氨基酸(AA)序列的多样性得以表现。在序列数据库中，接在CDR3之后的前三个FW4残基可以包括DGA基序，以及较低程度的YGA。
在CDR3环本身内，特异性结合(joining)或J基因片段的使用可以在CDR3末端的C-端引入用于特定残基的偏性(bias)，特别是倒数第二个和最后的残基。
使用特异性突变寡核苷酸进行的脱离质粒携带的2V和5V序列的各自模板区的PCR可进行PCR扩增。来自于三个初级PCR产品集(分别含有FW1、CDR1-FW3和CDR3-FW4的片段)的每个PCR产品均可以被混合作为预混物(master mixes)，并且随后通过重叠延伸剪切(Splice-by-Overlap Extension)(SOE)PCR法进行结合。
SOE-PCR产物可以经限制性内切酶消化并且被连接至相似的消化载体中。四种模板衍生的变异体亚文库可以通过SOE-PCR进行构建，并且使用根据CDR1-FW3和CDR3-FW4片段的起点为基础进定义的池去构建它们。
对于所有的池，可以包括等量的衍生自这两个模板的FW1片段，以及在CDR1和CDR3环中添加的寡核苷酸介导的(oligonucleotide-directed)合成的多样性。然后，使用含有合适插入片段的连接载体转化宿主细胞。在构建亚文库的过程中，可以从每个初始模板产生合适的三组初级PCR产物，其中，所述模板可以被分成三个不同的区域，其主要含有框架1(FW1)、CDR1和CDR3。定义的CDR1和CDR3环区可以使用模板特异性三核苷酸(TRM)低聚物进行突变。TRM寡核苷酸可以被设计为在随机的特定位点并入任意(AA)，除了被有意忽略的半胱氨酸以外。除了TRM寡核苷酸，额外的模板特异性CDR1靶向寡核苷酸(例如，一个、两个或三个)可以被用于引入(incorporating)突变。
设计内容的决定可以基于使用“天然”白斑角鲨VNAR结构域序列的分析并且可以通过使用具有已定义的简并密码子和直接同源密码子的寡核苷酸被合并入文库。
如上所讨论的，本发明提供了改进的VNARs文库(构建于两个或多个天然存在的VNAR序列)及其生产方法。从白斑角鲨(Squalus acanthias)的VNAR谱系的广泛测序分析可知，将原核系统中表现出高水平表达的两个克隆进行结晶并且用作这些文库的基础。ELSS1文库由两种不同的VNAR同种型(IIb型和IIIb型)框架组成，所述两种不同的VNAR同种型(IIb型和IIIb型框架来自于相同的板鳃亚纲物种，白斑角鲨(Squalus acanthias)，其已经被结合以产生除了CDR1、HV2、HV4和CDR3区内多样性以外的横跨框架(FW1、FW2、FW3a、FW3b和FW4)的多样性，如图4所示。通过合并来自于板鳃亚纲，护士鲨(Ginglymostomacirratum)的第二种物种的第三VNAR同种型(II型)框架创建增多的框架多样性以构建ELSS2，如图18所示。
使用重叠PCR以在框架区内创建多样性的新方法成功地实现了产生2V/5V或2V/5V/E9杂交序列。使用定义的TRM寡核苷酸将额外的多样性并入CDR1和CDR3区，以保证添加的预期的氨基酸类型或NNK寡核苷酸被并入。另外，设计ELSS1中的CDR1多样性以表示白斑角鲨的天然谱系中所见结果，并且设计的CDR3长度也基于在衍生自这些动物的序列数据库内被识别的天然存在的CDR3序列。
使用该设计，构建合成的鲨鱼可变NAR(VNAR)结构域文库(ELSS1和ELSS2)，并入了最高水平的功能多样性以及对之前合成/半合成文库报道的改进。之前的报道通常利用分离的VNAR框架(FW)区1至3的天然多样性，如衍生自免疫组织，尝试构建鲨鱼VNAR文库。然后，这种框架将被偶联至靶向CDR3区的合成多样性，有效创建半合成文库。
在由Nuttall和Liu及它们各自的同事进行的两项额外的不同研究中，VNAR非典型半胱氨酸残基被特异性引入多样性的CDR区，以尝试模拟之前观察到的由CDR1-CDR3二硫键表征的II型VNAR结构(Diaz,M.,et al.,Immunogenetics,2002.54(7):p.501-12)。关于非典型半胱氨酸的类似方式还集中在Shao文库设计，在这里，他们打算保留原始模板的在I型VNAR结构的FW2和FW4区中发现的非典型半胱氨酸残基。这通过合成CDR3中互补(complimentary)半胱氨酸残基的偏倚引入而实现。
这些设计方式中的每一种都被认为很可能导致最终文库中高水平未配对的半胱氨酸残基，从而损害最终合成谱系中的官能团含量(functional content)和多样性。因此，与之前的设计相比，本发明避免了由非典型半胱氨酸残基导致的额外的结构复杂性。在本发明的方法中，模拟了白斑角鲨的谱系，特别是不含有非典型半胱氨酸残基的那些。然而，这种方式的一个著名的例外为Shao及其同事(Shao,C.Y.,C.J.Secombes,and A.J.Porter,Mol Immunol,2007.44(4):p.656-65)所描述的工作。该报道描述了全合成的且衍生自单一模板结构域的框架，以及包括引入至I型护士鲨VNAR结构域的CDR3中的完全人工多样性，克隆5A7。历史上，该克隆是从免疫文库分离的，并且对于鸡蛋白溶菌酶(HEL)是特异性的。Shao等报道了单独(solitary)瘦素结合VNAR的识别，所述单独瘦素结合VNAR与起始模板结合伴侣HEL具有内源性高度交叉反应性。
本发明进一步区别的文库设计特征包括：
文库大小
之前报道了最终ELSS1文库的大小(＞9×1010)，其比任意鲨鱼文库(天然的、免疫的或合成的)大两个数量级。
多样性
使用三核苷酸混合物生成本发明的合成VNAR文库，该混合物在每个随机位点等同代表全部氨基酸，而未添加半胱氨酸。因此，本发明的合成文库提供三核苷酸多样性。
基于特异性序列数据库，已经将本发明的合成数据库中的定制多样性引入VNARCDR1，这通过使用三核苷酸和“同源物-扫描”寡核苷酸，靶向作用于该区域实现。从CDR1的详细检查可以注意到“天然”多样性在几个关键位点相对保守，特别是在第二(57％Y或33％C)和第四(83％L或13％W)位点(根据Kabat编码制，在全VNAR序列中的29位和31位)。
采用了两种截然不同的CDR1诱变方式。使用通常的(custom)三核苷酸TM)混合的密码子寡核苷酸(Genelink)，如描述的CDR3环，进行全CDR1随机化。与此相反，应用的定制(tailored)(AA)含量的方式涉及按照“天然”序列分析的指导对已定义的CDR1位点进行精确地调节。特别地，我们的目的在于通过使用特异性简并和“同源残基”扫描密码子(Bostrom,J.and G.Fuh,Methods Mol Biol,2009.562:p.17-35；Bostrom,J.,et al.,Methods Mol Biol,2009.525:p.353-76,xiii)在每个CDR1位点并入尽可能多的已定义的“天然”可变性。
出于之前讨论的原因，ELSS1避免了半胱氨酸，而不考虑在33％的“天然”数据库克隆中的第二位点发现半胱氨酸的事实。寡核苷酸被设计引入以保持在我们的序列数据库中发现最大可能的“天然”环境下的多样性，并且具有额外的相关定制(AA)含量。在上述随机的和定制的策略中，通过保持、或不保持色氨酸残基(W)以包括位点4的调节。据推测，在该位点，W或L侧链，至少如2V&5V支架背景下观察到的，在中央结构域核心内形成疏水相互作用，特别是与框架残基F66。
包括已选的CDR3长度变异性，共8个随机的CDR3长度被加入以覆盖在天然白斑角鲨NARs中观察到的最高频率的长度多样性范围。
文库设计
文库设计方式保留了被怀疑具有结构重要性的CDR侧翼残基。这种基序类似于在FW3b和CDR3的C-末端具有相似的免疫球蛋白(Ig)可变区的宿主中发现的基序。使用晶体结构模型和白斑角鲨VNAR序列的额外生物信息学分析推动了支持该原理的观察。具有用于解决两个起始模板VNAR结构域及其各自分子模型的晶体结构，如图3所示，绘制了在序列数据库中观察到的保守N-和C-末端CDR侧翼残基。由于它们邻近CDR3并且它们在其它类似的可变Ig结构域中的重要性，特别强调了放置于最后三个FW3b残基和前两个FW4残基上。发现该区域内的残基通常更保守。
框架融合支架设计
基于序列2V和5V(IIb型和IIIb型)使用双重支架设计构建第一合成VNAR文库，并且使用两个以上来源于两种不同的板鳃亚纲物种的VNAR同种型框架(除了II型VNAR，E9以外的2V、5V)构建第一文库。使用两个模板通过混排(shuffling)关键不同框架(FW)和高变(HV)环区促进额外的结构多样性的引入。因此，实际上产生的衍生克隆由指导多样性的互补的(supplementary)CDR1和CDR3环的野生型和新型接合的(spliced hybrid scaffold)杂交支架组成。在ELSS1中不同背景下的模板衍生的HV2和HV4环通过选择性地接合(splicing)编码与各自衍生的FW1，以及CDR1和CDR3片段配对的模板衍生的HV2和HV4的PCR片段获得。实际上，这允许我们并入由杂交模板衍生的序列置换(permutation)组成的六个新型额外的杂交支架。
数据库分析表明在白斑角鲨VNAR数据库中克隆的最大的比较分组(comparativegrouping)中观察到了在2V模板上发现的准确HV2和HV4氨基酸(AA)序列，分别占群体的33％(454/1364)和38％(518/1364)。在5V上发现的准确HV2和HV4序列不像在约8％(111/1364)的数据库群中观察到准确的HV4，且在＜1％(10/1364)的数据库群中观察到HV2那么频繁。然而，在数据库的更高比例的克隆中发现了这两种HV环的单一氨基变异体。这意味着2V和5V模板HV区最可能是编码种系的，或者在序列上接近于种系。实际上，在文库设计中通过混排该序列空间，我们通过形成杂交多样性同时保持了通常发现的“天然”谱系(即衍生自序列2V的)和引入了额外的合成变异体。通过混排这两个模板衍生的FW1区并入了进一步的序列多样性。
FW1氨基末端的前3-4个残基对调节VNAR的结合特性是关键的。N-末端FW1残基可以对VNAR结构域与其同源抗原的结合特性有影响，并且当使用可用的结构模型进行说明时并不令人意外，因为早期N-末端残基的基因图谱(map)比对总是非常接近于VDR1和CDR3环，在该处，互补位和靶标接触区被调节。在本文中，双模板设计的优势在于允许不同模板衍生的FW1编码区之间的混排。因此，采用的整体设计方式很可能产生八种不同的支架，在此基础上增加额外的CDR1和CDR3环的多样性。
定义
本发明的抗原特异性抗原结合分子含有源自根据本发明的方法制备的VNAR分子的合成文库。术语VNAR、IgNAR和NAR也可以互换使用。
本文所示的氨基酸或者为单字母代码或者为三字母代码或者二者均可。
术语“亲和纯化”指的是分子的纯化，这基于所述分子与化学物质或结合伴侣之间的特异性吸附或结合以形成结合物或复合体，所述结合物或复合体允许该分子从杂质中分离，而保留结合或吸附至伴侣部分。
术语“互补决定区”或CDRs(即，CDR1和CDR3)指的是VNAR结构域的氨基酸残基，它的存在为抗原结合所必需的。每个VNAR通常具有三个CDR区域，被定义为CDR1和CDR3。每个互补决定区可以含有来自于“互补决定区”的氨基酸残基和/或来自于“高变区环”(HV)的那些残基。在某些情况下，互补决定区可以含有来自于CDR区和高变区环的氨基酸。根据VNAR分子通常可接受的命名法，不存在CDR2区。
“框架区”(Fw)为除了CDR残基以外的VNAR残基。每个VNAR通常具有五个框架区，被定义为FW1、FW2、FW3a、FW3b和FW4。
“密码子组”指的是用于编码预期可变氨基酸的不同核苷酸三联体序列组。一组寡核苷酸可以被合成，例如，通过固相合成法，包括代表由密码子组提供的核苷酸三联体的所有可能组合并且将编码预期氨基酸组的序列。密码子命名的标准形式为IUB密码子，其为本领域所公知的并且会在本文中进行描述。
密码子组通常被表示为三个斜体的大写字母，如NNK、NNS、XYZ、DVK等。因此，“非随机密码子组”指的是编码部分满足，优选为完全满足本文描述的氨基酸选择标准的所选氨基酸的密码子组。在特定位点具有所选核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域所公知的，例如，TRIM法(Knappek et al.；J.Mol.Biol.(1999),296,57-86)；Garrard&Henner,Gene(1993),128,103)。这种具有特定密码子组的寡核苷酸组可以通过使用商够的核酸合成产品(购自，例如，Applied Biosystems，Foster城，CA)进行合成，或者可以通过商够获得(例如，购自Life Technologies，Rockville，MD)。具有特定密码子组的合成的寡核苷酸组通常包括多种具有不同序列的寡核苷酸，不同之处是由整体序列中的密码子组导致的。根据本发明使用的寡核苷酸具有允许与VNAR核酸模板杂交的序列，并且在合适之处包括限制性酶切位点。
“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用(除非上下文另有说明)，并且这种命名包括细胞或细胞系的全部传代细胞。因此，例如，如“转化子”和“转化细胞”的术语包括原代受试细胞及其产生的培养物，而不考虑转化的数量。还应该理解的是所有传代细胞的DNA含量不可能精确地相同，因为存在特意的或偶然的突变。包括在初始的转化细胞中筛选出的具有相同功能或生物学活性的突变传代细胞。
当涉及表达时，“控制序列”指的是在特定宿主有机体中对于可操作连接的编码序列的表达所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选地包括操纵子序列、核糖体结合位点等。真核细胞使用的控制序列，例如，启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
术语“衣壳蛋白”指的是一种蛋白质，其至少一部分存在于病毒颗粒的表面。从功能的角度来看，衣壳蛋白为在宿主细胞中病毒组装过程中与病毒颗粒相关的任意蛋白，并且保持与组装病毒相关直至其感染其它的宿主细胞。
在特定的试验中用于化学实体的“检测限”为对于该试验该实体超出背景水平的可以被检测到的最低浓度。例如，在噬菌体ELISA中，展示特定抗原结合片段的特定噬菌体的“检测限”为该特定噬菌体产生的ELISA信号超出由不展示该抗原结合片段的对照噬菌体产生的ELISA信号的噬菌体浓度。
“融合蛋白”和“融合多肽”指的是具有共价连接在一起的两个部分的多肽，其中，每个部分为具有不同特性的多肽。所述特性可以为生物学特性，例如体外或体内活性。所述特性还可以为简单的化学或物理特性，例如与靶抗原的结合、反应的催化作用等。这两部分可以通过单一肽键或含有一个或多个氨基酸残基的连接肽直接连接。一般情况下，这两部分和连接肽将彼此存在于阅读框中。优选地，多肽的这两部分从异源的或不同的多肽中获得。
一般而言，本文中的术语“融合蛋白”指的是通过化学方式(包括氢键或盐桥)或者通过肽键进行蛋白合成或者二者均可的方式结合在一起的一种或多种蛋白。
“异源DNA”为被导入宿主细胞的任意DNA。所述DNA可以源自多种来源，包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和这些的融合体或者组合。所述DNA可以包括来自于作为宿主细胞或受体细胞的相同细胞或细胞类型的DNA，或者来自于不同细胞类型的DNA，例如，来自于同种异体或异种来源。可选地，所述DNA可以包括标记物或选择基因，例如，抗生素抗性基因、耐热基因等。
“高度多样化位置”指的是位于轻链和重链的可变区的氨基酸的位置，当对已知的氨基酸序列和/或天然出现的抗体或抗原结合片段进行比较时，轻链和重链的可变区具有在该位置存在的多种不同氨基酸。高度多样化位置通常位于CDR区。
“同一性”描述了通过序列对比确定的两个或多个多肽序列或者两个或多个多核酸序列之间的关系。同一性还表示多肽或多核酸序列之间序列相关性(同源性)的程度，根据具体情况而定，通过这些序列的字符串(string)之间的匹配进行确定。虽然存在多种确定两种多肽或两种多核酸序列之间的同一性的方法，但是将通常采用的用于确定同一性的方法编成了计算机程序。优选的用于确定两种序列之间的同一性的计算机程序包括，但不限于，GCG程序包(Devereux,et al.,Nucleic acids Research,12,387(1984)、B LASTP、BLASTN和FASTA(Atschul et al.,J.Molec.Biol.(1990)215,403)。
优选地，使用由HGMP(人类基因组图谱制作计划)提供的BLAST计算机程序(Atschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215,403-410)的默认参数确定的蛋白的氨基酸序列与本文公开的氨基酸序列在氨基酸水平上具有至少50％的同一性。
更有选地，该蛋白序列在核酸或氨基酸水平上与本文所示的氨基酸序列具有至少55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％以及进一步优选95％以上(还更优选至少96％、97％、98％或99％)的同一性。
所述蛋白也可以含有与本文公开的序列具有至少50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，使用由HGMP提供的BLAST计算机程序的默认参数。
“文库”指的是多个VNARs或VNAR(例如，本发明的多肽)片段序列或编码这些序列的核酸。根据本发明的方法，将在变异氨基酸组合物中不相同的序列引入至这些序列中。
“连接(Ligation)”为两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。为了两个片段的连接，这两个片段的末端必须彼此兼容。在某些情况下，所述末端经核酸内切酶消化后将直接兼容。然而，可能有必要首先将经核酸内切酶消化后通常产生的粘端(staggered end)转变成平末端以使它们对于连接是兼容的。对于使末端平端化，在存在四种脱氧核苷三磷酸的情况下使用约10单位的DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶的Klenow片段，将DNA在合适的缓冲液中于15℃下处理至少15分钟。然后，该DNA通过苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀或者通过二氧化硅纯化进行纯化。将待连接在一起的DNA片段放入约等摩尔量的溶液中。该溶液也含有ATP、连接酶缓冲液和连接酶，如约10单位/0.5μg DNA的T4DNA连接酶。如果该DNA将被连接至载体中，该载体首先经合适的限制性内切核酸酶消化以线性化。然后，使用细菌碱性磷酸酶或牛小肠磷酸酶对该线性化片段进行处理以防止连接过程中发生自连接。
“突变”为相对于参照核酸序列如野生型序列，核苷酸的缺失、插入、或取代。
“天然的”或“天然发生的”VNARs，指的是从非合成来源确定的VN ARs，例如，体外获得的组织来源，或者板鳃亚纲的动物血清。这些VNAR s可以包括任何免疫应答的类型(或者天然的或其它诱导产生的)中生成的VNARs。天然的VNARs包括氨基酸序列，以及构建或编码这些抗体的核酸序列。如本文所用的，天然的VNARs不同于“合成的VNARs”，合成的V NARs指的是对来源或模板序列进行改变得到的VNAR序列，例如，使用不同的氨基酸在特定位置上进行一个氨基酸，或一个以上氨基酸的取代、缺失或添加，所述不同的氨基酸提供与源抗体序列不同的抗体序列。
术语“核酸构建体”通常指的是任意长度的核酸，其可以是通过克隆获得的或由化学合成产生的DNA、cDNA或RNA(如mRNA)。所述DNA可以是单链的或双链的。单链DNA可以是编码正义链，或者其可以是非编码链或反义链。对于治疗用途，所述核酸构建体优选为在待治疗的受试者中能够被表达的形式。
当涉及核酸时，“可操作地连接”指的是将所述核酸置入功能相关的另一核酸序列中。例如，将用于前序列或分泌性先导物的DNA可操作地连接至用于多肽的DNA，如果其被表达为参与多肽分泌的前蛋白；将启动子或增强子可操作地连接至编码序列，如果其影响该序列的转录；或者将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，如果将其置入有利于转录。通常情况下，“可操作地连接”指的是被连接的DNA序列是连续的，并且对于分泌性先导物应视情况而定且在阅读框中。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在合适的限制性位点上连接而实现的。如果这种位点不存在，合成的寡核苷酸接头或连接子按照常规用法使用。
“噬菌体展示”是一种技术，通过该技术多肽变异体以融合蛋白的形式被展示至至少噬菌体表面上的衣壳蛋白部分，如丝状噬菌体，颗粒。噬菌体展示技术允许制备随机蛋白变异体的大文库，其可以快速且有效的分选出与靶抗原以高亲和力进行结合的序列。噬菌体上的肽和蛋白质文库的展示可以被用于在数百万种多肽中筛选出一种具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示方法已经被用于展示小随机肽以及小蛋白，这通过将它们融合至编码丝状噬菌体的衣壳蛋白pIII、pVIII、pVI、pVII或pIX的基因中。
“噬菌粒”是一种具有细菌复制起点，如ColEl，以及细菌噬菌体的基因间隔区拷贝的质粒载体。该噬菌粒可以被用在任意已知的细菌噬菌体上，包括丝状细菌噬菌体和人字形细菌噬菌体。通常情况下，该质粒还将含有用于抗生素抗性的选择性标记物。克隆至这些载体的DNA片段可以作为质粒增殖。当携带这些载体的细胞被提供有用于产生噬菌体颗粒所需的所有基因时，质粒的复制模式转变为滚环复制，以生成质粒DNA一条链的拷贝并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可以生成感染性或非感染性噬菌体颗粒。该术语包括的噬菌粒含有连接至作为基因融合的异源多肽基因上的噬菌体衣壳蛋白基因或其片段，这样所述异源多肽被展示在噬菌体颗粒的表面。噬菌粒展示载体的实例为pWRIL-1。
术语“噬菌体载体”含有异源性基因并且能够复制的细菌噬菌体的双链复制形式。噬菌体载体具有允许噬菌体复制及噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。所述噬菌体优选为丝状细菌噬菌体，例如M13、fl、fd、Pf3噬菌体或者它们的衍生物，或人字形噬菌体，例如lambda21、phi80、phi81或它们的衍生物。
术语“蛋白质”在通用术语中指的是通过肽键连接在一起的多个氨基酸残基。它可以互换使用并且与肽、寡肽、寡聚物或多肽的意思相同，并包括糖蛋白及其衍生物。术语“蛋白质”还旨在包括蛋白质的片段、类似物、变异体及衍生物，其中，所述片段、类似物、变异体或衍生物保留了与参比蛋白质基本上相同的生物学活性。蛋白质类似物和衍生物的实例包括肽核酸和DARPins(设计的锚蛋白重复序列蛋白质(Designed Ankyrin Repeat Proteins))。“本发明的多肽”为如本文所定义的ICOSL特异性抗原结合分子。
蛋白质的片段、类似物、变异体或衍生物可以至少具有25优选为30或40，或者高达50或100，或60至120个氨基酸的长度，这依赖于其衍生自的起始蛋白序列的长度。在某些情况下，90至120，100至100的氨基酸的长度比较合适。
蛋白质的片段、衍生物、变异体或类似物可以为(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选为保守的氨基酸残基)取代并且该取代的氨基酸残基可以为或可以不为由遗传密码子编码的残基，或者(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团，或者(iii)其中额外的氨基酸被融合至成熟的多肽，如被用于多肽纯化的前导序列或辅助序列。该片段、衍生物、变异体和类似物被认为在本文所教导的本领域技术人员的范围内。
“寡核苷酸”为通过已知的方法(如使用固相技术的磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酸胺化学法)经化学合成的长度较短的单链或双链多聚脱氧核苷酸。进一步的方法包括聚合酶链反应(PCR)，如果该基因的完整的核苷酸序列是已知的，或者与编码链互补的核酸的序列是可用的。可选地，如果靶氨基酸序列是已知的，使用用于每个氨基酸残基的已知的且优选的编码残基可以推测出可能的核酸序列。寡核苷酸可以在聚丙烯酰胺凝胶或分子尺寸柱(molecular sizing columns)上进行纯化或者通过沉淀进行纯化。当DNA与非核酸杂质(其可以为极性的、非极性的、离子型的，等)分离时DNA被“纯化”了。
本文所用的“来源”或“模板”VNAR指的是VNAR或VNAR抗原结合片段，其抗原结合序列作为模板序列，在该模板序列的基础上根据本文所述的标准实现多样性。抗原结合序列通常包括在VNAR内，优选为至少一个CDR，优选地包括框架区。
“转录调控元件”将包括以下一个或多个组件：增强子元件、启动子、操纵子序列、阻遏基因和转录终止序列。
“转化”指的是细胞摄取DNA并转变为“转化体”的过程。该DNA摄取过程可以是永久的或是瞬时的。“转化体”是已经摄取并保留DNA的细胞，其可以通过与所述DNA相关的表型的表达得到证明(例如由所述DNA编码的蛋白质提供的抗生素抗性)。
起始或参比多肽(如源VNAR或其CDR)的“变异体”或“突变体”，如融合蛋白(多肽)或异源多肽(与噬菌体异源)，是一种多肽，该多肽(1)具有不同于起始或参比多肽的氨基酸序列和(2)通过自然或人工诱变从起始或参比多肽衍生的。所述变异体包括，例如，目标多肽的氨基酸序列中残基的缺失，和/或插入和/或取代。例如，使用含有编码变异氨基酸(相对于在源VNAR或抗原结合片段中相应位置发现的氨基酸)的非随机密码子组的寡核苷酸生成的本发明的融合多肽将为相对于源VNAR或抗原结合片段的变异多肽。因此，变异CDR指的是含有相对于起始或参比多肽序列(例如源VNAR或抗原结合片段)的变异序列的CDR。变异氨基酸，在本文中，指的是在起始或参比多肽序列中相应位置(例如源VNAR或抗原结合片段的相应位置)上的氨基酸不同的氨基酸。缺失、插入和取代的任意组合均可以导致最终的变异或突变构建体，只要最终的构建体具有预期的功能特性。氨基酸的变化也可以改变多肽的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量或位置。
“野生型”或“参比”序列，或者“野生型”或“参比”蛋白/多肽(如衣壳蛋白)，或源VNAR的CDR的序列，可以为参比序列，通过引入突变从所述参比序列衍生变异多肽。通常情况下，特定蛋白的“野生型”序列为自然界中最常见的序列。相似地，“野生型”基因序列为自然界中最常见的基因的序列。通过自然进程或者通过人工诱变的方式可以在“野生型”基因(及其编码的蛋白)中引入突变。这种加工过程的产物为起始“野生型”蛋白或基因的“变异体”或“突变体”形式。
文库多样性
CDR区CDR1和CDR3中的氨基酸位点可以均可以使用编码每个位点的通常发生的氨基酸的非随机密码子组被突变。在一些实施方式中，当CDR区中的位点将要被突变时，选择编码用于该位点的优选至少约50％，优选至少约60％，优选至少约70％，优选至少约80％，优选至少约90％，优选所有氨基酸的密码子组。在一些实施方式中，当CDR区中的位点将要被突变时，选择编码该位点的所有氨基酸的优选约50％至约100％，优选约60％至95％，优选至少约70％至约90％，优选约75％至约90％的密码子组。
VNARs文库多样性的设计旨在使多样性最大化，而最小化VNAR的结构性扰动，以提供增加分离高亲和力抗原特异性抗原结合分子的能力以及提供可以在细胞培养中高产上述分子。VNAR可变域中的突变位点数被最小化并且每个位点的可变氨基酸被设计包括在每个位点上通常存在的氨基酸，除了半胱氨酸以外，然而合适地(在可能的情况下)排除不常见的氨基酸和终止密码子。
通过使用非随机密码子组突变至少一个CDR中的那些位点设计文库的多样性。所述非随机密码子组优选编码在那些位点上通常存在的氨基酸的至少一个亚组，而最小化非靶标序列，例如半胱氨酸和终止密码子。
每个位点的非随机密码子组优选编码至少两个氨基酸并且不编码半胱氨酸。每个位点上的非靶标氨基酸被最小化，并且通常且优选地排除了半胱氨酸和终止密码子，因为它们可以对结构产生不利影响。
如上所讨论的，变异的氨基酸由非随机密码子组编码。密码子组为不同的核苷酸三联体序列组，其可以被用于形成被用于编码预期氨基酸组的寡核苷酸组。一组寡核苷酸可以被合成，例如，通过固相合成法，包括代表由密码子组提供的核苷酸三联体的所有可能组合并且将编码预期氨基酸组的序列。在某些位点具有已选核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是标准流程。
这种具有某些密码子组的核苷酸组可以使用商够的核酸合成产品(购自，例如，Applied Biosystems，Foster城，CA)进行合成，或者可以商够获得(例如，购自Gene Link公司，Hawthorn，NY，或Life Technologies，Rockville，MD)。因此，具有特定密码子组的合成的寡核苷酸组通常将包括多种具有不同序列的寡核苷酸，这种差异是由整体序列内的密码子组导致的。寡核苷酸，如本发明所使用的，具有允许与可变域核酸模板杂交的序列，并且还可以包括用于克隆目的的限制性酶切位点。
编码氨基酸组的示例性非随机密码子组包括用于每个位点的优选至少约50％，优选至少约60％，优选至少约70％，优选至少约80％，优选至少约90％，优选全部的靶氨基酸，如图10(a)所示。
在一种实施方式中，形成了具有可变CDR1和CDR3，或它们的混合物的多肽，其中，至少一个可变CDR在至少一个氨基酸位点上包括可变氨基酸，其中，所述可变氨基酸由非随机密码子组编码，并且，其中，至少70％的由非随机密码子组编码的氨基酸为在已知的可变结构域序列中用于该位点的靶氨基酸。这些位点上的可变氨基酸优选由图10(a)所示的密码子组编码。
与CDR1相关的由寡核苷酸衍生的多样性的实例也如图10(b)所示。
将选择的氨基酸替换进模板核酸的方法已在本领域充分建立，其中的一些在本文中进行了描述。例如，使用Kunkel法(Kunkel et al.,Methods Enzymol.(1987),154,367-382)通过靶向用于和变异氨基酸进行氨基酸替换的至少一个CDR区中的氨基酸位置进行构建文库。
密码子组为被用于编码预期的变异氨基酸的不同核苷酸三联体序列组。密码子组可以使用符号来表示以指定下述根据IUB代码所示的特定核苷酸或核苷酸的等摩尔混合物。通常，密码子组由图10(a)中的三个大写字母RRK、GST、TKG、TWC、KCC、KCT和TRM所表示。
IUB 代码
G 鸟嘌呤
A 腺嘌呤
T 胸腺嘧啶
C 胞嘧啶
R (A或G)
Y (C或T)
M (A或C)
K (G或T)
S (C或G)
W (A或T)
H (A或C或T)
B (C或G或T)
V (A或C或G)
D (A或G或T)H
N (A或C或G或T)
寡核苷酸或引物组可以使用标准方法进行合成。例如，通过固相合成，可以合成寡核苷酸组，其含有代表由密码子组提供的核苷酸三联体的所有可能组合的序列以及将编码预期氨基酸组的序列。
在特定位置具有选择的核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域所公知的。这种具有特定密码子组的核苷酸组可以使用商业化的核酸合成产品(例如，购自AppliedBiosystems，福斯特城，CA)进行合成，或者可通过商购获得(例如，购自Gene Link公司，Hawthorn NY，或Life Technologi es，洛克维尔，MD)。因此，合成的具有特定密码子组的寡核苷酸组通常包括多个具有不同序列的寡核苷酸，该差异是通过在整体序列中的密码子组建立的。根据本发明所用的寡核苷酸具有允许杂交至可变结构域核酸模板的序列，并且还可以包括用于克隆目的的限制酶位点。
在一种方法中，编码可变氨基酸的核酸序列可以通过编码源多肽或模板多肽如本文所公开的VNAR序列2V或5V的核酸序列的寡核苷酸介导的突变进行构建。该技术为本领域所公知的，如Zoller等(Zoller et al.Nucleic Acids Res.(1987),10,6487-6504(1987))所描述的。简单地说，编码可变氨基酸的核酸序列通过将编码预期密码子组的寡核苷酸组与DNA模板的杂交进行构建，其中，所述模板为含有可变区核酸模板序列的质粒的单链形式。杂交以后，DNA聚合酶被用于合成模板的完整第二互补链，因此，其中将引入寡核苷酸引物，并且将含有由寡核苷酸组提供的密码子组。
编码其它来源或模板分子的核酸是已知的或者可以被轻易地确定。通常情况下，使用长度至少为25个核苷酸的寡核苷酸。理想的寡核苷酸将具有与编码突变的核苷酸的任意一侧的模板完全互补的12至15个核苷酸。这保证了寡核苷酸将正确地杂交至单链DNA模板分子上。使用本领域技术人员公知的技术(如Crea et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,(1987)75:5765)能够轻易地合成所述寡核苷酸。
通过衍生自细菌噬菌体M13载体(商购的M13mpl8和M13mpl9载体是合适的)的载体，或者如Viera et al.,Methods Enzymol.,(1987)153,3)描述的含有单链噬菌体复制起点的那些载体可以形成DNA模板。因此，待突变的DNA可以被插入这些载体中的一个以产生单链模板。
为了改变天然的DNA序列，将寡核苷酸在合适的杂交条件下杂交至单链模板。然后，加入DNA聚合酶，通常为T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段以合成作为合成引物的寡核苷酸模板的互补链。因此，形成了异源双链分子，使得DNA的一条链编码编码序列1的突变形式，并且另一条链(起始模板)编码编码序列1的天然的、未改变的序列。然后，将该异源双链分子转化入合适的宿主细胞，通常为原核生物，如大肠杆菌JM101。细胞生长后，将其接种在琼脂糖平板上并使用带有32-磷酸盐放射性同位素标记的寡核苷酸引物进行筛选以鉴定含有突变DNA的细菌克隆。
可以对上述方法进行修改以构建同源双链分子，其中该质粒的两条链均含有突变。修改如下：将单链寡核苷酸退火至如上所述的单链模板。将三种脱氧核苷酸，即脱氧核糖腺苷(dATP)、脱氧核糖鸟苷(dGTP)和脱氧核糖胸苷(deoxyribothymidine，dTT)的混合物与经修饰的被称为dCTP-(aS)的硫代脱氧核糖胞嘧啶(thiodeoxyribocytosine)(其可以从Amersham获得)相结合。将该混合物加入至模板寡核苷酸复合物中。一旦将DNA酶加入至该混合物，便生成了与模板相同的DNA链，除了突变碱基以外。另外，该DNA新链将含有dCTP-(aS)而不是dCTP，其作用是保护该DNA链免被限制性核酸内切酶消化。双链异源双链核酸分子的模板链经合适的限制内切酶切口后，该模板链可以被ExoIII核酸酶或其它合适的核酸酶消化，而越过含有诱变处理的位点的区域。然后，终止该反应以保留仅为部分单链的分子。然后，在全部四种脱氧核苷三磷酸、ATP和DNA连接酶存在的情况下，使用DNA聚合酶生成完整的双链DNA同源双链。然后，将该同源双链分子转化至合适的宿主细胞内。
如前所示的寡核苷酸组的序列具有杂交至模板核酸的足够长度，还可以，但不是必须的，含有限制性位点。通过衍生自细菌噬菌体M13载体的那些载体或者含有如Viera等(Meth.Enzymol.(1987),153,3)描述的单链噬菌体复制起点的载体可以生成DNA模板。因此，待突变的DNA必须被插入这些载体之一以生成单链模板。
寡核苷酸组可以被用在聚合酶链反应中，使用核酸模板序列作为构建核酸表达盒(cassettes)的模板。该核酸模板序列可以为VNAR分子的任意部分(即，编码以取代为目标的氨基酸的核酸序列)。该核酸模板序列为具有第一核酸链和互补的第二核酸链的双链DNA分子的一部分。核酸模板序列含有VNAR结构域的至少一部分并且具有至少一个CDR。在有些情况下，核酸模板序列含有一个以上的CDR。核酸模板序列的上游部分和下游部分可以被靶向用于与上游寡核苷酸组和下游寡核苷酸组的成员杂交。
上游引物组的第一寡核苷酸可以杂交至第一核酸链并且下游引物组的第二寡核苷酸可以杂交至第二核酸链。该寡核苷酸引物可以包括一个或多个密码子组并且被设计为与核酸模板序列的一部分进行杂交。这些寡核苷酸的使用可以引入两个或多个密码子组至PCR后的PCR产物中(即，核酸表达盒)。杂交至编码VNAR结构域的核酸序列区的寡核苷酸引物包括编码CDR残基的部分，CDR残基用于氨基酸取代。
还可以合成上游和下游寡核苷酸组以在寡核苷酸序列中包括限制性位点。这些限制性位点可以促进核酸表达盒(即，PCR反应产物)插入进具有额外VNAR序列的表达载体中。
蛋白表达
编码本发明的抗原特异性抗原结合分子的核酸序列可以存在于核苷酸构建体中。这种核酸构建体可以为载体的形式，例如，表达载体，并且也可以包括染色体、附加体(episomal)和病毒来源的载体，例如，来自细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒(papova-viruses)，如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒(fowl pox viruses)、假性狂犬病病毒和逆转录病毒)的载体，以及来自它们的组合的载体，如衍生自质粒和细菌噬菌体基因元件，例如粘粒和噬菌粒的那些载体。通常情况下，适用于维持、增殖或表达核酸以在宿主中表达多肽的任何载体均可以被用于该方面的表达。
核酸构建体可以适当地包括启动子或其它控制核酸表达的调控序列。启动子和其它控制核酸表达的调控序列已经被识别并且为本领域所公知的。本领域技术人员将注意到可能没有必要利用全部启动子或其它调控序列。仅需要最基本的调控元件，并且，实际上，这种元件可以被用于构建嵌合序列或其它启动子。当然，基本要求是保留组织和/或时间(temporal)特异性。所述启动子可以为任意合适的已知启动子，例如，人巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV即早启动子(immediate early promoter)、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40启动子或逆转录病毒LTRs的启动子，例如劳斯氏肉瘤病毒的启动子和金属硫因启动子，如小鼠金属硫因I启动子。启动子可以包括用于启动子活性的最基本组成(例如TATA元件，可选地，无增强子元件)，例如，CMV启动子的最基本序列。优选地，所述启动子为连续的核酸序列。
如本文所述的，核酸构建体可以为载体的形式。载体通常包括一种或多种表达标志物，所述表达标志物使得选择经其转染(或转化)的细胞成为可能，并且优选地，使得选择含有引入异源DNA载体的细胞成为可能。通常存在合适的起始和终止信号。
所述载体可以为任意合适的表达载体，例如pET。所述载体可以包括预期的额外的这种控制序列，例如选择性标志物(例如，抗生素抗性、荧光性等)，转录控制序列和启动子，包括起始和终止序列。
启动子可以为用于诱导由本发明的核酸序列编码的蛋白的表达的任意合适的启动子，例如CMV启动子、人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子。
所述载体可以存在于宿主细胞中。用于本发明的核酸构建体表达的合适的宿主细胞的代表性实例包括病毒包装细胞，其允许将核酸包封入病毒载体，细菌细胞，如链球菌(Streptococci)、葡萄球菌(Staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；单细胞，如酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和曲霉细胞(Aspergillus)；昆虫细胞，例如果蝇S2(Drosophila S2)和草地夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)细胞；动物细胞，如CHO、COS、C127、3T3、PHK.293，和Bowes黑色素瘤细胞以及其它合适的人细胞；以及植物细胞，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)。适当地，宿主细胞为真核细胞，如CHO细胞或HEK293细胞。
将表达载体导入至宿主细胞可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、阳离子-脂质介导的转染、电穿孔、转导、刮痕(scrape loading)、弹道导入、感染或其他方法来实现。这些方法在许多标准实验室手册有描述，如Sambrook et al,MolecularCloning,a Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。
在合适的启动子的控制下，在宿主细胞中可以被表达的成熟蛋白包括哺乳动物细胞，如CHO细胞、酵母、细菌、或其它细胞。可以使用非细胞翻译系统以产生如使用源自本发明第三方面的所述核酸构建体的RNAs产生的该类蛋白质。用于原核宿主和真核宿主的合适的克隆和表达载体由Sambroo k et al,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Second Edition,Cold Sp ring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)进行了描述。
本发明还提供了含有本文描述的本发明的任意多聚核苷酸和/或载体的宿主细胞。根据本发明，提供了用于生产本发明的抗原特异性抗原结合分子的方法，包括在本文所定义的合适的宿主细胞中表达编码所述分子的核酸序列的步骤。
通过标准方法可以从重组细胞培养物中回收和纯化蛋白质，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析(chromatography)、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、凝集素和/或肝素层析。对于治疗，例如以重组载体的形式的核酸构建体可以通过本领域公知的技术进行纯化，如通过柱层析的方式，在Sambrooket al,Molecular C loning,a Laboratory Manual,Second Edition,Cold SpringHarbor Laborato ry Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中进行了描述。
因此，本发明的这一方面扩展至制备本发明的融合蛋白的方法，包括在宿主细胞中表达生产重组融合蛋白，通过肽键连接、氢键或盐键或化学交联的方式对表达的融合蛋白进行纯化。在本发明的该方面的某些实施方式中，可以使用氢键或盐键制备融合蛋白，其中肽能够多聚化，例如二聚或三聚。
作为文库的蛋白表达
另一方面，本发明提供了含有多种本发明的载体的文库，其中，多种载体编码多种多肽。因此，本发明提供了在其表面展示本发明的多肽的病毒或病毒颗粒(例如噬菌体或噬菌粒颗粒)。本发明还提供了含有多种本发明的病毒或病毒颗粒的文库，每个病毒或病毒颗粒均展示本发明的多肽。本发明的文库可以包括任意数量的不同多肽(序列)，至少约l×l08个，至少约l×l09个，至少约l×1010个不同的序列，更合适的为至少约9×1010个序列。
本发明还提供了含有多种多肽的文库，其中，每种多肽类型均为如本文描述的本发明的多肽。
可以将核酸表达盒克隆入任何合适的载体中，以表达含有生成的靶氨基酸取代物的部分或整个VNAR的载体。可以将所述核酸表达盒可以克隆入载体，允许产生被融合至全部或部分病毒衣壳蛋白的部分或全部VNAR链序列(如构建融合蛋白)并在颗粒或细胞表面展示。虽然几种类型的载体可用并且可以用于本发明，但是噬菌粒载体为本文使用的优选载体，因为它们的构建相对容易，并且可以容易地扩增。噬菌粒载体通常包括多种组分，包括启动子、信号序列、表型选择基因、复制位点的起点以及其它必需组分。
在另一种实施方式中，其中，特定的变异氨基酸组合物被表达，核酸表达盒含有能够编码全部或部分VNAR序列，并且能够编码变异氨基酸组合物的序列。对于含有这些变异氨基酸或变异氨基酸的组合物的抗原特异性抗原结合分子的生产，如在文库中，核酸表达盒可以被插入含有额外VNAR序列的表达载体中，例如，多种CDR、框架区和/或高变区的全部或部分。这些额外的序列还可以被融合至其它的核酸序列，例如编码病毒衣壳蛋白组分的序列，因此，允许产生融合蛋白。
本发明的一方面包括含有编码基因融合的核酸序列的可复制的表达载体，其中，所述基因融合编码含有VNAR序列和第二VNAR序列的融合蛋白，被融合至全部或部分病毒衣壳蛋白。还包括含有编码多种不同的融合蛋白的多种基因融合体的不同可复制表达载体的文库，其中该融合蛋白包括使用按照如上描述的不同序列生成的多种VNAR序列。所述载体可以包括多种组件并且优选地被构建成允许在不同的载体之间运动的VNAR序列和/或以提供不同形式的融合蛋白的展示。
载体的实例包括噬菌体载体。所述噬菌体载体具有允许噬菌体复制及噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。优选地，所述噬菌体为丝状细菌噬菌体，例如，M13、fl、fd、Pf3噬菌体或它们的衍生物，或者人字形噬菌体，如lambda、21、phi80、phi81、82、424、434等，或它们的衍生物。
病毒衣壳蛋白的实例包括感染性蛋白PIII、主要衣壳蛋白PVIII、p3、Soc(T4)、Hoc(T4)、gpD(细菌噬菌体lambda的)、小细菌噬菌体衣壳蛋白6(pVI)(丝状噬菌体；Hufton etal,J Immunol Methods.(1999),231,(1-2):39-51)、M13细菌噬菌体主要衣壳蛋白(P8)的变异体(Weiss et al,Protein Sci(2000)9(4):647-54)。所述融合蛋白可以在噬菌体的表面展示，并且合适的噬菌体系统包括M13K07辅助噬菌体、M13R408、M13-VCS和Phi X174、pJuFo噬菌体系统(Pereboev et al J Virol.(2001)；75(15):7107-13)，以及超级噬菌体(Rondot et al Nat Biotechnol.(2001)；19(1):75-8)。优选的辅助噬菌体为M13K07，并且优选的衣壳蛋白为M13噬菌体基因III衣壳蛋白。优选的宿主为大肠杆菌以及并且大肠杆菌的蛋白酶缺陷菌株。载体，如fthl载体(Enshell-Seijffers et al.,Nucleic Acids Res.(2001)；29(10):E50-0)可以有助于融合蛋白的表达。
表达载体还可以具有融合至编码每个VNAR或其片段的DNA上的分泌信号序列。该序列通常直接位于编码融合蛋白的基因的5’端，因此，将在融合蛋白的氨基末端被转录。然而，在某些情况下，已经证明所述信号序列位于编码被分泌蛋白的基因的5’端以外的位置。该序列靶向跨细菌细胞内膜附着(attache)的蛋白质。编码信号序列的DNA可以作为来自编码具有信号序列的蛋白的任意基因的限制性内切核酸酶片段而获得。合适的原核信号序列可以从编码基因，例如，LamB或OmpF(Wong et al,Gene,(1983)68,1931)、MalE、PhoA和其它基因获得。
用于实施本发明的优选的原核信号序列为如Chang et al(Gene 55.189(1987))描述的大肠杆菌热稳定肠毒素II(STII)信号序列和malE。
所述载体通常也包括用于促进融合蛋白表达的启动子。在原核载体中最常用的启动子包括lac Z启动子系统、碱性磷酸酶pho启动子(AP)，细菌噬菌体XPL启动子(温敏启动子)，tac启动子(受lac阻遏子调节的杂合trp-lac启动子)、色氨酸启动子和噬菌体T7启动子。对于启动子的常规描述，请参见Sambrook et al第17章。虽然这些是最常用的启动子，但是也可以使用其它合适的微生物启动子。
所述载体还可以包括其它核酸序列，例如，编码gD标签、c-Myc表位、聚-组氨酸标签、荧光蛋白(如GFP)、或β-半乳糖苷蛋白的序列，它们对噬菌体或细胞表面上表达的融合蛋白的检测或纯化是有用的。
编码如gD标签的核酸序列还提供了表达融合蛋白的细胞或病毒的阳性或阴性选择。在一些实施方式中，所述gD标签优选地被融合至未与病毒衣壳蛋白组分融合的VNAR序列上。编码如多组氨酸的核酸序列有利于通过使用免疫组织化学方法鉴定包括结合至特异抗原的VNAR序列的融合蛋白。有利于抗原结合检测的标签可以被融合至未与病毒衣壳蛋白组分融合的VNAR序列或者与病毒衣壳蛋白组分融合的VNAR序列上。
用于实施本发明的另一种有用的载体组分为表型选择基因。典型的表型选择基因为那些编码赋予宿主细胞抗生素抗性的编码蛋白的基因。举例来说，氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)很容易被用于该目的。
所述载体还可以包括含有特殊限制性位点和可抑制的终止密码子的核酸序列。该特殊限制性位点有利于VNAR序列在不同载体和表达系统之间移动。所述可抑制的终止密码子有利于控制融合蛋白的表达水平以及促进可溶性VNAR片段的纯化。例如，琥珀终止密码子(amber stop codon)可以被读为supE宿主中的Gln以使噬菌体展示成为可能，虽然在非supE宿主中其被读为终止密码子以产生未融合至噬菌体衣壳蛋白的可溶性VNAR片段。这些合成序列可以被融合至载体中的一个或多个VNAR序列上。
可以方便地使用载体系统，其允许编码兴趣序列如具有变异氨基酸的CDR的核酸轻易地从载体系统中移除并置入另一载体系统中。例如，可以在载体系统中设计合适的限制性位点以促进编码VNAR的核酸序列的移除。所述限制性序列通常选择为在载体中是特殊的，以促进有效地切除和连接入新载体中。然后，可以从无外源融合序列(例如病毒衣壳蛋白或其它序列标签)的载体表达VNAR序列。
在编码VNAR序列(基因1)与病毒衣壳蛋白组分(基因2)的核酸之间，可以插入编码终止(termination)或停止(stop)密码子的DNA，例如所述终止密码子包括UAG(琥珀，(amber))、UAA(赭石(ocher))和UGA(蛋白石(opel))(Microbiology,Davis et al.,Harper&Row,New York,1980,pp.237,245-47 and 374)。在野生型宿主细胞中表达的终止或停止密码子引起基因1蛋白产物的合成，而未附带基因2蛋白。然而，在抑制性宿主细胞中生长可以引起可检测量的融合蛋白的合成。所述抑制性宿主细胞是公知的且已有描述，例如大肠杆菌抑制性菌株(Bullock et al.,BioTechniques 5:376-379(1987))。任意可接受的方法均可以被用于将这种终止密码子置入编码融合多肽的mRNA中。
可以在编码VNAR序列的第一基因与编码至少部分噬菌体衣壳蛋白的第二基因之间插入抑制性密码子。可选地，通过替换VNAR序列中的最后一个氨基酸三联体或噬菌体衣壳蛋白中第一个氨基酸，将所述抑制性终止密码子可以插入融合位点附近。所述抑制性终止密码子可以位于二聚化结构域的C-末端上或者之后。当含有抑制性密码子的质粒在抑制性宿主细胞中生长时，其导致产生可检测量的含有多肽和衣壳蛋白的融合多肽。当所述质粒在非抑制性宿主细胞中生长时，VNAR序列被大量合成，而未融合至噬菌体衣壳蛋白上，这是由于在插入的抑制性三联体UAG、UAA或UGA处的终止。在非抑制性细胞中抗体可变结构域被合成并且从宿主细胞分泌，这是由于缺少融合的噬菌体衣壳蛋白，否则其可以将抗体可变结构域锚定至宿主细胞膜上。
在一些实施方式中，被多样化(随机化)的CDR可以设计在模板序列(本文被称作“终止模板”)中的终止密码子。基于终止密码子在模板序列中的成功修复，该特征提供了成功多样化的序列的检测和选择，这是由于含有用于目的可变氨基酸的序列的寡核苷酸的并入。
本发明的抗原特异性抗原结合分子
在本发明的某些实施方式中，所述抗原特异性抗原结合分子具有选自如图9、11、12、13、14、15(a)、15(b)或16所示的组中的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原特异性抗原结合分子为如图9、11、12、13、14、15(a)、15(b)或16所示的氨基酸序列，或其任意变异体、类似物、衍生物或片段，包括使用由HGMP提供的BLAST计算机程序的默认参数的与它们具有50％同一性的序列，或者具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性。在本发明的一种实施方式中，所述抗原特异性抗原结合分子是人源化的。它可以方便地提供本发明的约20％至约85％人源化(例如约25％至约60％人源化)的人源化结合分子。
所述抗原特异性抗原结合分子可以包括使用前被剪切的额外的N-末端或C-末端序列，这有助于如本文描述分子的生产过程中的纯化和/或分离。例如，在分子C-末端的(Ala)3(His)6。
本发明还包括具有蛋白质的氨基酸序列的变异体、类似物、衍生物和片段，其中任意组合的数个如5至10个、或1至5个、或1至3个、2个、1个或无氨基酸残基被取代、缺失或添加。其中，特别优选的是沉默取代、添加和缺失，其不改变本发明的蛋白的特性和活性。另外，在这方面特别优选的是保守性取代，其中，相对于原始形式，本发明的蛋白的特性以变异形式被保留。变异体还包括含有根据本发明的抗原特异性抗原结合分子的融合蛋白。
如上述所讨论的，本发明的变异体的实例包括一个或多个氨基酸被其它一个或多个氨基酸替换的蛋白质。本领域技术人员意识到多种氨基酸具有类似的特性。物质的一个或多个这种氨基酸通常可以被一个或多个其它这种氨基酸替换而不影响或消除该物质的预期活性。这种替换可以被称为“非保守的”氨基酸替换。
因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常可以相互替换(具有脂肪族侧链的氨基酸)。在这些可能的替换中，优选甘氨酸和丙氨酸用于相互替换(因为它们具有相对短的侧链)以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸用于相互替换(因为它们具有较大的疏水性脂肪族侧链)。其它通常可相互替换的氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(氨基酸具有酰胺侧链)；以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。这种性质的替换通常被称为“保守的”或“半保守的”氨基酸替换。
相对于如上所述的融合蛋白的氨基酸序列，也可以进行氨基酸缺失或插入。因此，例如，可以缺失对多肽的活性没有实质影响，或者至少不会消除该活性的氨基酸。所述缺失可能是有益的，因为可以减少多肽的整体长度和分子量而仍然保留其活性。这可以使得用于特定目的所需的多肽的量被减少-例如，剂量水平可以被降低。
相对于如上融合蛋白序列，也可以进行氨基酸插入。这可以改变本发明的物质的性质(例如，有助于鉴定、纯化或表达，如上关于融合蛋白的解释)。
相对于本发明的融合蛋白的序列，可以使用任意合适的技术，例如通过使用定点诱变来进行氨基酸的变化。
应该理解的是，在本发明范围内的氨基酸取代或插入可以通过使用天然存在的或非天然存在的氨基酸进行。无论使用的是否为天然的或合成的氨基酸，优选为仅存在L-氨基酸。
根据本发明的蛋白质可以具有额外的N-末端和/或C-末端氨基酸序列。这种序列可以因为多种原因被提供，例如，糖基化。
融合蛋白可以包括本发明的抗原特异性抗原结合分子，其被融合至为融合蛋白提供结构元件的异源肽或蛋白序列上。在其它的实施方式中，所述融合蛋白可以包括本发明所述的抗原特异性抗原结合分子，其与具有生物学活性的分子相融合，即，具有药理学上有用的活性的治疗蛋白。所述分子可以为肽或蛋白序列，或者其它生物学活性分子。
例如，抗原特异性抗原结合分子可以被融合至异源肽序列上，该序列可以为聚氨基酸序列，例如，多个组氨酸残基或多个赖氨酸残基(适当情况下为2、3、4、5或6个残基)，或免疫球蛋白结构域(例如Fc结构域)。
异源肽序列的参照包括来源于其它哺乳动物物种的序列，例如小鼠和人以及来源于其它VNAR结构域的任意异源肽序列。
其中，融合蛋白包含本发明的与具有生物学活性的分子相融合的抗原特异性抗原结合分子，生物学活性部分可以为具有生物学活性的肽或蛋白质，例如酶、免疫球蛋白、细胞因子或其片段。可选地，所述生物学活性分子可以为抗生素、抗癌药、NSAID、类固醇、镇痛剂、毒素或其它药学活性剂。抗癌药可以包括细胞毒性药物或细胞生长抑制剂。
在一些实施方式中，所述融合蛋白可以包括本发明的抗原特异性抗原结合分子，该分子被融合至另一种免疫球蛋白的可变区或恒定区，或本发明的另一种抗原特异性抗原结合分子。换句话说，本发明所述的抗原特异性抗原结合分子的融合体的长度可以是可变的，例如，二聚体、三聚体、四聚体或更多聚体(即，五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体，或更多)。在特定的实施方式中，这可以表示为单体VNAR亚基的多聚体。
例如，其中，将VNAR CDRs融合至额外的肽序列，该额外的肽序列可以提供病毒颗粒或细胞表面的一种或多种融合多肽的相互作用。因此，这些肽序列可以被称为“二聚化结构域”。二聚化结构域可以包括至少一种或多种二聚化序列，或者至少一种含有半胱氨酸残基的序列或者包括这二者。合适的二聚化序列包括那些具有两亲性α螺旋的蛋白质，其中，疏水性残基被有规律地间隔开，并且通过每种蛋白质的疏水性残基的相互作用允许二聚体的形成；所述蛋白质及部分蛋白质包括，例如，亮氨酸拉链区。
二聚化结构域还可以包括一个或多个半胱氨酸残基(例如，通过在二聚化结构域内包括抗体铰链序列提供)。该半胱氨酸残基通过形成一个或多个二硫键提供二聚化。在一种实施方式中，其中，在二聚化结构域的后面存在停止密码子，该二聚化结构域包含至少一个半胱氨酸残基。该二聚化结构域优选位于抗体可变区或恒定区与病毒衣壳蛋白组分之间。
在本发明的融合蛋白中，抗原特异性抗原结合分子可以通过结合体部分直接融合至或连接至该融合蛋白的其它元件上。所述结合体可以为肽、肽核苷酸或聚酰胺结合体。合适的肽结合体可以包含多个氨基酸残基，例如，4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个氨基酸，如(Gly)4、(Gly)5、(Gly)4Ser、(Gly)4(Ser)(Gly)4或其组合或其多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体或更多)。例如，合适的结合体可以为(GGGGS)3。可选的结合体包括(Ala)3(His)6或其多聚体。还包括使用由HGMP提供的BLAST计算机程序的默认参数的至少具有50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在某些情况下，载体编码融合至衣壳蛋白的单一VNAR噬菌体多肽。在这些情况下，该载体被认为是“单顺反子”，在确定的启动子的控制下表达一种转录物。
这种载体的示例性实例使用了碱性磷酸酶(AP)或Tac启动子以促进编码VNAR区的单顺反子序列的表达，在两个结构域之间具有连接肽。该顺反子序列可以在5’-端被连接至大肠杆菌malE或热稳定性肠毒素II(STII)信号序列上并且在其3’端被连接至全部或部分病毒衣壳蛋白(例如，pIII蛋白)上。该载体可以进一步包括在其3’-末端，第二可变结构域序列与病毒衣壳蛋白序列之间编码二聚化结构域(如亮氨酸拉链)的序列。含有二聚化结构域的融合多肽能够发生二聚化以形成两个多肽的复合体。
在其它情况下，VNAR序列(多个VNAR序列或片段)可以被表达为单独的多肽，因此，该载体为“双顺反子”，其允许单独的转录本的表达。在这些载体中，合适的启动子，如Ptac或PhoA启动子，可以被用于促进双顺反子信息的表达。例如，编码第一VNAR序列的第一顺反子可以在5’-端可以被连接至大肠杆菌malE或热稳定的肠毒素II(STII)信号序列上以及在3’-端被连接至编码gD标签的核酸序列上。例如，编码第二VNAR序列的第二顺反子可以在5’-端被连接至大肠杆菌malE或热稳定的肠毒素II(S TII)信号序列上以及在3’-末端被连接至全部或部分病毒衣壳蛋白上。
示例性载体可以包括合适的启动子，例如Ptac或PhoA(AP)启动子，它们可以促进编码在5’-端被可操作地连接至大肠杆菌malE或热稳定肠毒素II(STII)信号序列上且在3’-端被连接至编码gD标签的核酸序列上的VNAR序列的第一顺反子的表达。例如，第二顺反子编码另一VNAR序列，该序列在5’-端被可操作地连接至大肠杆菌malE或热稳定肠毒素II(STII)信号序列上且在3’-端具有含有IgG铰链序列和亮氨酸拉链序列以及跟随的至少部分病毒衣壳蛋白的二聚化结构域。
VNAR序列的融合多肽可以在细胞、病毒、或噬菌粒颗粒的表面以多种形式被展示。这些形式包括单链片段和这些片段的多价形式。所述多价形式可以为二聚体，或更高的多聚体。展示的所述多价形式是方便的，因为它们具有一个以上的抗原结合位点，这通常导致较低亲和力克隆的识别，还允许在筛选过程中稀有克隆的更有效分类。
将根据本发明的描述构建的载体导入宿主细胞进行扩增和/或表达。使用标准转化方法可以将载体导入宿主细胞，所述方法包括电穿孔、磷酸钙沉淀和类似方法。如果载体为感染性颗粒如病毒，那么该载体本身提供对宿主细胞的进入。含有编码基因融合体的可复制表达载体宿主细胞的转染以及根据标准操作流程生产噬菌体颗粒可以提供噬菌体颗粒，在其中，在噬菌体颗粒表面展示融合蛋白。
通过使用多种方法将可复制表达载体导入宿主细胞。在一种实施方式中，可以通过使用将载体导入细胞。细胞在标准培养液的培养中生长，可选地，在约37℃下生长约6-48小时(或者生长至OD600＝0.6-0.8)，然后将培养液进行离心并移除上清液(如轻轻倒出)。优选地，通过将细胞沉淀在缓冲液(如1.0mM HEPES pH 7.4)中重悬，之后再离心并移除上清液进行初步纯化。将得到的细胞沉淀重悬于被稀释的甘油中(如5-20％v/v)，再次离心以形成细胞沉淀并移除上清液。通过将上述细胞沉淀重悬于水中或稀释的甘油中至预期浓度以获得最终的细胞浓度。
在电穿孔(约10x)期间较高的DNA浓度的使用可以提高转化效率并增加转化入宿主细胞的DNA的量。使用高细胞浓度还可以提高效果(约10x)。较大量的转化的DNA可以产生更大的文库，该文库具有更大的多样性并且呈现出组合文库更大数量的特殊成员。通常通过在含有抗生素的培养基中生长以选择转化细胞。
噬菌体展示在识别靶抗原结合体中的应用已经在本领域建立，其具有多种置换(permutations)和变异(variations)的方法。一种方法包括构建含有被可操作地连接至编码融合多肽的基因融合体上的转录调控元件的多种(va riant)可复制载体家族，转化合适的宿主细胞，培养转化的细胞以形成在噬菌体颗粒表面展示融合多肽的噬菌体颗粒，之后需要通过将重组噬菌体颗粒与靶抗原接触以进行选择或分选，使得至少部分颗粒群与靶标结合，其目的是为了提高并丰富在选择过程中结合颗粒相对于未结合颗粒的颗粒子集。选择池可以通过感染宿主细胞进行扩大，以为了另一轮在不同或相同严格度下在同一靶标上进行分选。然后，将得到的变异体池进行抗靶抗原的筛选以识别新型具有高亲和力的结合蛋白。
这些新型具有高亲和力的结合蛋白作为治疗剂、作为拮抗剂或激动剂，和/或诊断和研究试剂是有用的。
融合多肽如含有变异氨基酸的抗体可变域可以在噬菌体、噬菌粒颗粒或细胞的表面上表达，然后，选择和/或筛选出具有结合至通常为目标抗原的靶抗原的融合多肽组的成员的能力。
这种融合蛋白可以通过任意合适的途径进行制备，包括通过在宿主细胞或非细胞系统中表达的重组技术，以及通过化学合成途径。
文库成员的选择
靶标的结合体的选择方法也可以包括在通用蛋白上进行分选，该通用蛋白对抗体可变区如蛋白L或结合至抗体的标签特异性抗体或在噬菌体上展示的抗体片段具有亲和力，该方法可以被用于丰富展示正确折叠抗体片段(融合多肽)的文库成员。
靶蛋白，如受体，可以从天然来源进行分离或者通过本领域公知的重组方法制备。靶抗原可以包括多种治疗目的分子。
用于亲和力选择(分选)的两个主要策略可以为(i)固体支持法或平板分选或固定靶标分选法；和(ii)溶液结合方法。
对于固体载体法，靶蛋白可以被吸附于合适的本领域所公知的固体或半固体基质上，例如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸羟烷基凝胶、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子载体等。
将靶抗原吸附至基质上以后，固定的靶标与表达融合多肽的文库在适合将噬菌体颗粒群的至少一个子集与固定的靶抗原结合的条件下进行接触。正常情况下，所述包括pH值、离子强度、温度等的条件将模拟生理条件。结合至固定的靶标上的颗粒(“结合体”)通过洗涤从未结合至靶标上的颗粒中分离出来。可以调整洗涤条件以导致脱除全部但除了高亲和力的结合体。结合体可以通过多种方法从固定的靶标分离。这些方法包括使用野生型配体(如过量的靶抗原)的竞争性分离，改变pH值和/或离子强度，以及本领域所公知的方法。结合体的选择通常包括从具有合适洗脱材料如0.1M HCl等的酸或配体的亲和基质中洗脱。伴有提高配体浓度的洗脱可以洗脱显示出亲和力升高的分子。
结合体可以被分离并且之后通过使用作为结合体(以及如果必要的话为辅助噬菌粒，例如当病毒颗粒为噬菌粒颗粒时)的病毒颗粒感染细胞以在合适的宿主细胞中进行再扩增，并且在适用于展示预期融合多肽的颗粒的扩增条件下培养宿主细胞。然后，收集噬菌体颗粒并且重复一次或更多次该选择过程，直至靶抗原的结合体在某种程度上被富集。可以使用任意数量的选择或分选轮数。一种选择或分选过程可以包括分离结合至通用亲和蛋白如蛋白L的结合体或结合至存在于展示多肽中的多肽标签的抗体，例如结合至gD蛋白或聚组氨酸标签的抗体。
另一种选择方法为“溶液-结合方法”，该方法允许溶液相分选，且具有超过常规的溶液分选方法的提高的效率。该溶液结合方法已经被用于从随机文库中发现起始结合体或者从指定改善特定结合克隆或克隆组的亲和力的文库中发现改善的结合体。该方法包括与多个多肽接触，例如在具有标记的或与标签分子融合的靶抗原的噬菌体或噬菌粒颗粒(文库)上展示的多肽。所述标签可以为生物素或其它可用的特异性结合体的基团。溶液相的严格度可以通过使用降低浓度的第一溶液结合相中带有标记的靶抗原进行变化。
为了进一步提高严格度，第一溶液结合相之后可以为第二溶液相，该第二溶液相在第一溶液相中与带有标记的的靶标发生初始结合后具有高浓度的未标记的靶抗原。通常情况下，在第二相中(如果包括)使用的未带有标记的靶标超过带有标记的靶标100至1000倍。第一溶液相的孵育时间长度可以从几分钟变化为一到两个小时或者更长时间以达到平衡。在该第一相中使用较短的结合时间可能偏向于(bias)或选择出具有快结合速率的结合体。可以改变在第二相中孵育的时间长度和温度以增加严格度。这提供了选择具有低速率脱离靶点(脱离速率)的结合体的偏向。
多个多肽(在噬菌体/噬菌粒颗粒上展示的)与靶抗原接触后，将结合至标记的靶标的噬菌体或噬菌粒颗粒与未结合的噬菌体相分离。从结合的溶液相中分离颗粒靶标混合物，这通过将其与标记的靶标部分相接触并允许其与结合有标记的靶标部分的分子结合一段较短的时间(如2-5分钟)。标记的靶抗原的初始浓度的范围为约0.1nM至约1000nM。结合的颗粒被洗脱并且可以进行增殖以用于下一轮分选。多轮分选优选每轮分选使用较低浓度的标记的靶抗原。
例如，使用约100至250nM标记的靶抗原进行初始分选或选择应该足够获得大范围的亲和力，虽然该因素可凭经验确定和/或符合工作者的预期。在第二轮选择中，可以使用约25至100nM的标记的靶抗原。在第三轮选择中，可以使用约0.1至25nM的标记的靶抗原。例如，为了改善100nM结合体的亲和力，预期开始于20nM，然后逐步变为5和1nM的标记的靶点，然后，甚至为更低浓度例如约0.1nM的标记的靶抗原。
如本文所述的，固体载体法语溶液分选法的结合在用于分离具有预期特性的结合体方面是有利的。对靶抗原选择/分选数轮以后，通常从已选的池中筛选单克隆以识别具有预期性能/特性的特异性结合体。优选地，筛选过程通过自动系统进行以允许文库候选者的高通量筛选。
以下描述了两种主要的筛选方法。然而，也可以使用其它方法。第一种筛选方法包括使用固定靶抗原进行的噬菌体ELISA试验，该方法提供了从非结合克隆中对特异性结合克隆的识别。通过对靶包被孔和BSA或其它非靶蛋白包被孔上的克隆的同时测定确定特异性。该测定法是自动的，可用于高通量筛选。
一个实施方式提供了通过生成含有大量多肽的可复制表达载体文库以选择抗体可变区的方法，所述抗体可变区结合来自抗体可变区的库的特异性靶抗原，该方法包括；在适用于结合的条件下将该文库与靶抗原和至少一种非靶抗原进行接触；在该文库中将多肽结合体与非结合体相分离；识别结合至靶抗原和未结合至非靶抗原的结合体；从靶抗原上洗脱所述结合体；并扩增含有结合至特异性抗原的多肽结合体的可复制表达载体。
第二种筛选试验为本申请中发明点的体现，其为亲和力筛选试验，该试验提供了以高通量的方法从具有低亲和力的克隆中筛选出具有高亲和力的克隆。在该试验中，应用于靶包被孔之前较短时间内(如5-15分钟)，在与特定浓度的靶抗原进行和未进行一段时间(如30-60分钟)的第一次孵育的情况下对每个克隆进行试验。然后，通过常规的噬菌体ELISA法检测结合的噬菌体，例如，使用抗-M13HRP结合物(conjugates)。两个孔的结合信号的比率表明亲和力，其中一个孔已经与靶标预孵育，另一个孔未与靶抗原预孵育。用于第一次孵育的靶标的浓度的选择依赖于目的亲和力的范围。例如，如果预期结合体的亲和力高于10nM，在第一次孵育中通常使用1000n M的靶标。一旦从特定一轮分选(选择)中发现结合体，可以使用亲和力筛选试验对这些克隆进行筛选以识别出具有高亲和力的结合体。
任意上述分选/选择方法的组合均可以与所述筛选方法相结合。例如，在一种实施方式中，首先选择结合至固定靶抗原的多肽结合体。
然后，将结合至固定靶抗原的多肽结合体进行扩增并且筛选出结合至靶抗原和未结合至非靶抗原的结合体。扩增特异性结合至靶抗原的多肽结合体。然后，通过将这些多肽结合体与一定浓度的标记的靶抗原接触以形成复合物，从而对这些多肽结合体进行较高亲和力的筛选，其中标记的靶抗原的浓度范围为从约0.1nM至约1000nM，所述复合物通过与结合至靶抗原上的标记的制剂相接触而被分离。然后，将多肽结合体从标记的靶抗原洗脱下来，可选地，重复进行数轮选择，每次使用更低浓度的标记的靶抗原。然后，使用该筛选方法分离出的具有高亲和力的多肽结合体可以使用例如，使用溶液相ELISA试验或点竞争ELISA试验以用于高亲和力筛选。
通过结合至靶抗原识别出结合体之后，可以提取核酸。然后，提取的DNA可以被直接用于转化入大肠杆菌宿主细胞或者，可选地，扩增编码序列，例如使用具有合适引物的PCR，并且通过常规的测序法进行测序。结合体的DNA可变域可以经限制性内切酶消化，然后被插入用于蛋白表达的载体中。
在一些实施方式中，含有本发明的多肽的文库经过多轮分选，其中，每轮分选包括将从前一轮获得的结合体与区别于前一轮或前几轮的靶蛋白的靶抗原相接触。
本发明的另一方面提供了与特异性靶抗原具有高亲和力的结合体的选择方法，所述特异性靶抗原例如可以为生长激素、牛生长激素、胰岛素样生长因子、人生长激素包括n-甲硫酰胺人生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、胰淀素(amylin)、松弛素、松弛素原(prorelaxin)、糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)、促黄体激素(leutinizinghormone)(LH)、造血生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳激素(prolactin)、胎盘催乳素(placenta lactogen)、肿瘤坏死因子、苗勒氏管抑制物、小鼠促性腺激素相关多肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整合素、神经生长因子如NGF-β、胰岛素样生长因子-I和II、促红细胞生成素、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、骨形态发生蛋白、LIF、SCF、FLT-3配体和试剂盒配体。
本发明的方法提供了具有一个或多个多样性CDR区的多肽(如抗原特异性抗原结合分子)文库。这些文库被分类(选择)和/或筛选以鉴定出与靶抗原具有高亲和力的结合体。一方面，从文库中选择与靶抗原结合的以及具有亲和力的多肽结合体。然后，使用一种或多种这些选择策略选择的多肽结合体可以被用于亲和力和/或特异性的筛选(仅结合至靶抗原且未与非靶抗原结合)。
一种方法包括生成多个具有一个或多个多样化CDR区的多肽，通过在适用于结合的条件下将多个多肽与靶抗原相接触分选出对于靶抗原为结合体的多个多肽；从那些未结合的结合体中分离出与靶抗原结合的结合体；分离上述结合体；并且鉴定具有高亲和力的结合体。结合至靶抗原的结合体的亲和力可以使用如本文描述的竞争ELISA法进行确定。可选地，所述多肽可以被融合至多肽标签如gD、poly-his或FLAG，其可以被用于分选与分选用靶抗原相结合的结合体。
另一实施方式提供了从VNARs文库中选择结合至靶抗原的抗原特异性抗原结合分子的方法，其包括：a)生成含有本发明的多个多肽的可复制表达载体的文库；b)通过在适用于结合的条件下将所述文库与固定靶抗原相接触，从该文库中分离相对于靶抗原的多肽结合体；c)将文库中的多肽结合体与非结合体相分离并且从靶抗原洗脱结合体；d)扩增具有多肽结合体的可复制表达载体；以及e)可选地，至少重复两次步骤a-d。
所述方法可以进一步包括：f)将经扩增的含有多肽结合体的可重复表达载体与浓度在0.1nM至1000nM范围内的带有标记的靶抗原在适用于结合的条件下进行孵育以形成混合物；g)将上述混合物与结合至靶抗原上标签的固定剂相接触；h)分离结合至带有标记的靶抗原上的多肽结合体并且将该多肽结合体从带有标记的靶抗原上洗脱下来；i)扩增含有多肽结合体的可复制的表达载体；以及j)可选地，至少重复两次步骤f)至i)，每次使用更低浓度的带有标记的靶抗原。可选地，所述方法可以包括添加过量的不带标签的靶抗原至混合物中并且孵育一定时间以足够使得具有低亲和力的结合体从带有标记的靶抗原洗脱下来。
另一实施方式提供了从可复制的表达载体文库中分离或选择出对靶抗原具有高亲和力的结合体的方法，其包括：a)生成含有本发明的多个多肽的可复制的表达载体文库；b)将上述文库与浓度至少为约0.1nM至1000n M的靶抗原相接触以分离靶抗原的多肽结合体；c)从靶抗原中分离多肽结合体并且扩增含有该多肽结合体的可重复的表达载体；d)可选地，至少重复两次步骤a-c，每次使用更低浓度的靶抗原以分离出结合至最低浓度靶抗原的多肽结合体；e)通过将上述多肽结合体与数种不同的靶抗原稀释液共孵育并确定该多肽结合体的IC50值，选择出具有高亲和力的结合至最低浓度靶抗原的多肽结合体；以及f)鉴定出与浓度为约0.1nM至200nM的靶抗原具有亲和力的多肽结合体。
另一实施方式提供了从含有本发明的多个多肽的可复制的表达载体文库中选择多肽结合体的试验，其包括：a)将上述文库与浓度在0.1nM至1000nM范围内的带有标记的靶抗原在适用于结合的条件下相接触以形成多肽结合体与带有标记的靶抗原的复合物；b)分离该复合物并从带有标记的靶抗原中分离出多肽结合体；c)扩增含有多肽结合体的可复制的表达载体；d)可选地，至少重复两次步骤a-c，每次使用更低浓度的靶抗原。
可选地，该方法可以进一步包括添加过量的不带标签的靶抗原至多肽结合体与靶抗原的复合物中。在一种优选的实施方式中，重复两次该方法的上述步骤并且在第一轮选择中靶标的浓度约为100nM至250nM，并且在第二轮选择中靶标的浓度约为25nM至100nM，并且在第三轮选择中靶标的浓度约为0.1nM至25nM。
本发明还提供了对含有本发明的多个多肽的可复制的表达载体文库进行筛选的方法，其包括：a)将第一文库样本与一定浓度的靶抗原在适用于多肽结合至靶抗原的条件下进行孵育；b)将第二文库样本在无靶抗原的条件下孵育；c)将每第一样本和第二样本均与固定靶抗原在适用于多肽结合至固定靶抗原的条件下进行接触；d)检测每个样本对固定靶抗原的结合多肽的量；e)通过计算第一样本中结合多肽的量超出第二样本中结合多肽的量的比率，以确定多肽对靶抗原的亲和力。
按照本文的描述构建的所述文库也可以被用于与特异靶标结合和不与非靶抗原结合的筛选。一方法，另一种实施方式提供了用于从VNARs文库中筛选结合至特异靶抗原的抗体可变域的方法，其包括：a)生成含有本发明的多个多肽的可复制的表达载体文库；b)将上述文库与靶抗原和至少一种非靶抗原在适用于结合的条件下相接触；c)将文库中的多肽结合体与非结合体相分离；d)鉴定结合至靶抗原和未结合至非靶抗原的结合体；e)从靶抗原上洗脱结合体；f)扩增含有结合至特异抗原的多肽结合体的可复制的表达载体。
上述任意分选/选择方法的组合可以与筛选方法相结合。例如，在一种实施方式中，首先选择出结合至固定靶抗原的多肽结合体。
然后，扩增结合至固定靶抗原上的多肽结合体，并且进行与靶抗原结合和不与非靶抗原结合的筛选。扩增特异性结合至靶抗原的多肽结合体。然后，通过将这些多肽结合体与一定浓度的带有标记的靶抗原相接触以形成复合物选择出具有较高亲和力的多肽结合体，其中，所述带有标记的抗原的浓度范围为从约0.1nM至约1000nM。通过将上述复合物与结合至靶抗原上的标签的制剂相接触分离所述复合物。然后，将上述多肽结合体从带有标记的抗原上洗脱下来，可选地，重复进行选择数轮，每次使用更低浓度的带有标记的靶抗原。然后，使用该选择方法分离得到的具有高亲和力的多肽结合体可以使用例如，溶液相ELISA试验或点竞争ELISA试验进行高亲和力筛选。
药物组合物及用途
根据本发明，提供了本发明的抗原特异性抗原结合分子的药物组合物。这种组合物包括含有所述抗原特异性抗原结合分子的融合蛋白。
该药物组合物还可以含有融合至治疗性蛋白的本发明的抗原特异性抗原结合分子，或其片段。所述治疗性蛋白可以是激素、生长因子(如TGFβ、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、集落刺激因子(CSF)、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、胎盘生长因子)；分化因子；凝血因子(例如，因子VIIa、因子VIII、因子IX、von Willebrand因子或蛋白C)，或者来自凝血级联系统的的其它蛋白(例如，抗凝血酶)；细胞因子如白介素(例如，IL1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32或IL-33)或干扰素(例如，IFN-α、IFN-β和IFN-γ)，肿瘤坏死因子(TNF)，IFN-γ诱导因子(IGIF)，骨形态发生蛋白(BMP，例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP10、BMP-11、BMP-12、BMP-13)；白细胞介素受体拮抗剂(例如，IL-1ra，IL-1RII)；趋化因子(例如MIPs(巨噬细胞炎性蛋白)，例如，MIP1α和MIP1β；MCPs(单核细胞趋化蛋白)例如，MCP1、2或3；RANTES(正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白))；营养因子；细胞因子抑制剂；细胞因子受体；酶，例如自由基清除酶，例如超氧化物歧化酶或过氧化氢酶或前药转化酶(例如，血管紧张素转换酶、脱氨酶、脱氢酶、还原酶、激酶和磷酸酶)；肽模拟物；蛋白酶抑制剂；金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs，例如TIMP1、TIMP2、TIMP3或TIMP4)或丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶的抑制剂)。
在本发明的其它实施方式中，融合蛋白中的治疗性蛋白可以为抗体，或其改造的片段，包括Fab、Fc、F(ab’)2(包括化学连接的F(ab’)2链)、Fab’、scFv(包括其多聚体形式，即，二聚scFv或三聚scFv)、sdAb或BiTE(二聚特异性T细胞衔接子(bi-specific T-cellengager))。抗体片段还包括可变区及其片段，以及其它VNAR型片段(IgNAR分子)。本发明的抗原特异性结合分子可以是单体、二聚体或三聚体或多聚体，并且可以是能够结合相同或不同靶标和/或相同靶标上相同或不同表位的同源的或异源的。换句话说，所述抗原特异性结合分子可以是单一特异性的、双特异性的、三特异性的或多特异性的。本发明涉及的异源抗原特异性结合分子指的是与相同靶标上的不同表位相结合。改造的片段还包括本发明的抗原特异性结合分子的Fc融合体以及抗体的Fc片段。
所述药物组合物可以由多种本发明的抗原特异性抗原结合分子组成，例如，被融合至治疗性蛋白上的二聚体、三聚体或更高数量级的多聚体，即2、3、4、5、6、7或8聚体(mers)。
将本发明的抗原特异性抗原结合分子融合至治疗性蛋白可以在该蛋白上的任意合适的位点，可以为N-、C-和/或N-/C-末端融合。在本发明的一种实施方式中，本发所述的抗原特异性抗原结合分子的融合在治疗性蛋白的N-和C-端。
本发明的药物组合物可以含有任意合适的且药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或缓冲液。该组合物可以进一步含有药学上的活性制剂。这种载体可以包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖(dextrose)、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合物。
这种组合物可以进一步含有如本文所述的药学上的活性制剂。额外的制剂可以为治疗性化合物，例如，抗炎药、细胞毒剂、细胞生长抑制剂或抗生素。这种额外的制剂可以以适用于给药至有需要的患者的形式存在，并且所述给药可以是同时的、单独的或顺序的。所述组分可以被制备成试剂盒的形式，该试剂盒可以适当地包括说明书。
所述药物组合物可以以任意有效的、方便的方式给药以有效治疗患者的疾病，包括例如，口服给药、局部给药、静脉注射给药、肌内注射给药、鼻腔给药、或皮下注射途径给药。在治疗或作为预防给药中，活性剂可以作为可注射的组合物给药至个体，例如，作为无菌水分散体的形式，优选为等渗的。
对于给药至哺乳动物，特别是人，预期活性剂的日剂量将至少(from)为0.01mg/kg体重，通常为约1mg/kg、2mg/kg或高达4mg/kg。无论如何，医师将决定最适合于个体的实际剂量，这将依赖于以下因素，包括个体的年龄、体重、性别以及反应。上述剂量为平均情况的示例。当然，可以有更高或更低剂量的示例，这均在本发明的范围内。
根据本发明，提供了本发明的抗原特异性抗原结合分子在医药中的用途。因此，本发明的该方面扩展至本发明的抗原特异性抗原结合分子在制备用于治疗需要其的患者的疾病药物中的用途。本发明的抗原特异性抗原结合分子还可以被用于制备含有如上定义的涉及本发明的药物组合物的特异性结合分子的融合蛋白。
所述用途还包括有需要的患者中疾病的治疗方法，其包括给药至患者含有本发明的抗原特异性抗原结合分子的如本文所定义的治疗有效剂量的药物组合物。
如本文所用的，术语“治疗”包括有益于人或非人的动物的任意方案。在兽药中“非人动物”的治疗可以扩展至家畜的治疗，包括马和宠物(如猫和狗)和农场/农业动物，包括绵羊、山羊、猪、牛和马家族中的成员。所述治疗可以为关于任意当前病症或病情的治疗性治疗，或者可以为预防性的(预防性治疗)。所述治疗可以为对遗传性疾病或后天获得性疾病的治疗。所述治疗可以是对急性或慢性病症的治疗。所述治疗可以是对和炎症和/或癌症相关的病症/病情的治疗。本发明的抗原特异性抗原结合分子可以被用于病情的治疗，包括，但不限于骨关节炎、硬皮病、肾疾病、类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化、动脉粥样硬化、或任意炎性疾病。
本发明的抗原特异性抗原结合分子还可以被用于研究患者疾病病症的性质。该抗原特异性抗原结合分子可以被用于通过使用成像技术，例如X射线、伽玛射线、或PET扫描、或类似技术以制备受试者体内发病部位的成像。因此，本发明可以扩展至受试者发病部位成像的方法，包括将合适的可检测的带有标记的抗原特异性抗原结合分子给药至受试者，随后扫描受试者的身体。可选地，将所述分子给药至受试者可以通过分析来自所述分子给药后受试者的样本以提供测试结果。
可选地，所述抗原特异性抗原结合分子可以被用于测定体外样本中或患者体内靶分析物的存在情况。该样本可以为来自身体的任意生物学样本材料，例如，细胞、组织、血液、血浆、唾液、泪液、精液、脑脊髓液(CSF)和/或乳汁。该方法可以包括添加合适的带有标记的抗原特异性抗原结合分子至目的样本中。然后，可以通过任意合适的方法检测该带有标记的抗原特异性抗原结合分子与靶分析物的结合，例如按照标准的酶联免疫吸附试验(ELISA)和/或放射免疫疗法(RIA)试验检测荧光性、放射性等。
这种实施方式可以包括诊断受试者的疾病或病情的方法，其包括将本发明的抗原特异性抗原结合分子给药至受试者，或者将所述抗原特异性抗原结合分子加入至样本中。
进一步发现该抗原特异性抗原结合分子可以用在目的分子的免疫亲和纯化中。适当的，本发明的抗原特异性抗原结合分子可以与底物结合，在该底物的上方通过或引入含有含有目的分子的样本，使得目的分子以可释放的方式结合至抗原特异性抗原结合分子上。发现所述免疫亲和纯化方法可以用在生物来源或化学反应得到的物质的生物加工中，否则很难制备出具有足够纯度的形式，例如治疗物质。
抗原特异性抗原结合分子可以结合的底物可以为柱状物，其包括珠状或粉末状形式的聚合物、平板(如多孔板)、微流体系统。所述底物可以以任意合适的惰性材料组成，例如，硅、玻璃或塑料材料，可选地，以薄片(chip)的形式。在一些情况下，这可以便于将具有相同或不同抗原特异性的多个抗原特异性抗原结合分子定位于该底物上。底物与抗原特异性抗原结合分子结合后，清洗该底物以去除未结合的材料，然后通过合适的方法洗脱已被纯化的物质。
说明书附图
在本申请中提供了数个附图以供参考，其中：
图1显示了重新排列的IgNAR基因的结构，显示了典型(O)和非典型(●)半胱氨酸残基、二硫键(连接键)、保守色氨酸(W)和高变(CDR/HV)区的位置。
图2显示了与人VH结构域相比的I型和II型抗溶菌酶IgNAR的主体结构。
图3显示了衍生自白斑角鲨的模板VNAR结构域2V和5V的晶体结构。
图4显示了使用2V和5V模板框架从杂交序列构建的文库设计和框架多样性。2V和5V框架融合体的设计是以使用SOE PCR的文库为基础的。引物位置如箭头所示。
图5显示了对不同靶标的亲和力。对ELSS1进行抗一系列不同类型靶标(hDLL4、HAS、hRAGE)的筛选。纯化阳性命中(hit)，确定其浓度，并在BIAcore T-2000上使其通过CM5-芯片固定的靶标以计算结合的动力学。
图6显示的数据举例说明了ELSS1文库靶标的选择性。图6A显示了分离的抗mICOSL的靶标的选择性。对ELSS1进行抗小鼠ICOSL筛选并且使用基于FACS的试验检测阳性靶标与细胞表面表达的靶标的结合(与亲本相比)。图6B显示了分离的抗DLL4的靶标的选择性。对ELSS1进行抗人和小鼠DLL4的筛选，并且使用基于FACS的试验评价阳性命中与细胞表面靶标(target)结合的选择性。数值越大，与表中所示的细胞类型的结合越强。
图7A至7D显示的数据举例说明了ELSS1文库命中抗不同靶标的体外效果。图7A显示了基于中和反应试验在细胞中分离的抗mICOSL命中的选择性。评价来自ELSS1文库的抗mICOSL的阳性VNAR命中抑制配体(ICOSL)与同源受体(ICOS)结合的能力。将VNAR命中、C4、CC3、A1、AG12和AG2与阴性VNAR对照2V进行比较。所有克隆均被表达和纯化并且在带有标记的配体存在的情况下进行滴定以显示抑制配体结合至受体的效果。测定的所有IC50均为个位数(single digit)的纳摩尔。图7B显示了在小鼠D10试验(T细胞增殖测定)中分离和纯化的抗mICOSL VNARs对T细胞增殖的抑制能力。图7C显示了从ELSS1分离的抗hDLL4VNAR结构域对DLL4与细胞表面Notch1受体(中和反应试验)结合的抑制能力。数据以中和百分数计算，其数值越大表明对配体结合受体的抑制作用越强。图7D显示了抗DLL4VNARs的结合细胞表面表达的DLL4的能力以及被细胞表面表达的DLL4内化。抗DLL4VNAR结构域被融合至人Fc并且通过细胞存活检测内化，存活率越低，内化的效率越高。克隆72、10和78为VNAR命中结果。2V为阴性VNAR对照，YW为mAb阳性对照。
图8显示了抗mICOSL VNARs在人风湿性关节炎(RA)的小鼠模型中的体内效果。左图显示了与阴性对照2V相比，所有5个前导VNARs(A1、C4、CC3、AG2和AG12)降低胶原蛋白诱导的RA小鼠模型中整体临床评分或炎症反应的能力。与抗mICOSL而升高的前导mAb相比(右图)，克隆A1和CC3明显降低了炎症反应。所有抗mICOSL VNAR结构域和同种型对照VNAR，2V均重构为人Fc融合蛋白。
图9显示了克隆2V和5V(SEQ ID NO:9、10、11和12)的氨基酸和核苷酸序列。
图10(a)显示了在文库制备过程中使用的引物序列。
图10(b)显示了对于CDR1，寡核苷酸衍生的多样性。
图11显示了2V和5V序列的文库框架组合。框架：67/89＝75.3％。最大多样性(CDR1和CDR3)：67/111＝60％。
图12显示了抗mICOSL抗原特异性抗原结合分子(VNAR)的氨基酸序列。
图13显示了抗mDLL4抗原特异性抗原结合分子(VNAR)的氨基酸序列。
图14显示了抗HSA抗原特异性抗原结合分子(VNAR)的氨基酸序列。
图15(a)显示了抗HRAGE抗原特异性抗原结合分子(VNAR)的氨基酸序列；(b)显示了抗TNF-α抗原特异性抗原结合分子(VNAR)的氨基酸序列。
图16显示了被用于筛选ELSS1的针对三个靶标的前导克隆的比对。两个框架之间的任意无阴影氨基酸(unshaded amino acids)是保守的，所以在整个文库内进行标准化。加亮的区域为存在差异之处，该差异是依赖于所选克隆是否具有来自5V和/或2V序列的贡献。
图17显示了本发明的抗原特异性抗原结合分子中CDR1和CDR3结构域的氨基酸序列。
图18显示了使用白斑角鲨IIIb型VNAR 5V、白斑角鲨IIb型VNAR、2V和护士鲨II型VNAR E9对ELSS2进行的文库设计。5V和2V是被用于ELSS1的相同VNAR结构域，并且VNAR结构域E9从免疫的护士鲨文库中分离。
图19显示了针对生物素化ICOSL的选择后从ELSS2分离的噬菌体阳性命中结果。
图20显示了从ELSS2分离的ICOSL阳性VNAR克隆的序列。阳性命中结果为如图所示的所有交叉物种和交叉同种型的框架融合体。
具体实施方式
还将通过参考以下实施例的方式进一步对本发明进行描述，其示出仅为了解释说明的目的并不用于构成对本发明的限制。
使用的缩略语：VNAR，可变新抗原受体；scFv，单链抗体片段；FW，框架；HV，高变环(Hypervariable loop)；CDR，互补决定区；SOE-PCR，重叠延伸剪接聚合酶链反应(splice-by-overlap extension polymerase chain reaction)。
实施例1：从Squalus acanthias(白斑角鲨)的VNAR构建序列数据库
使用多种分子生物技术从白斑角鲨组织分离RNA，详情如下。
从组织分离RNA：使用Invitrogen的TRIzol试剂(Sigma Aldrich，货号15596)从鲨鱼组织中分离总RNA。约50-100mg组织在1ml的TRIzol试剂中使用标准功率的均质机进行匀浆。均质的样本在室温下孵育5分钟以允许核蛋白复合物的完全分离，之后每ml使用的TRIzol加入0.2ml氯仿。用手剧烈摇动试管15秒，然后于4℃下以12000×g转速离心15分钟。离心后，将含有RNA的水相转移至新的试管中并且相对于开始的步骤中的每ml的TRIzol添加1ml 75％乙醇或可选地添加0.5ml异丙醇，并将样本在室温下孵育10分钟。然后，样本于4℃下以7500×g转速再次离心5分钟。去除上清液后，RNA沉淀在1ml 70％(v/v)无RNA酶的乙醇中清洗一次，使其在空气中干燥并重悬于合适体积的无RNA酶的水中(20-300μl，依赖于得到的RNA沉淀的大小)。RNA样本通过分光光度法进行定量。
可选地，RNA按如下方法从组织分离。根据操作手册上的方案获取组织并将其立即悬浮于RNAlater缓冲液(QIAGEN)中。使用用于组织的RNeasy Midi试剂盒(QIAGEN)按照操作手册分离总RNA，使用UltraTurax(Odds X1030D,Ing.Büro CAT,Zipperer GmBH)，包括在柱上进行DNaseI消化)。
从全血中分离RNA：使用Ambion(货号AM1928)的RiboPure-血液程序根据操作手册从全血样本(经柠檬酸钠(NaCitrate)处理以防止凝血并保存在RNAlater缓冲液中)中分离RNA。
简并PCR：构建噬菌体展示文库之前，有必要编辑全面的cDNA序列数据库用于引物设计目的，以扩增代表全部天然IgNAR转录子的谱库(repertoire)。为了实现该目的，以步进式的方式创建数据库，以简并PCR开始以从获得部分序列，根据这些序列设计3’RACE引物。为了分离编码序列的IgNAR，使用基于护士鲨IgNAR序列(例如，GenBank登录号：U18701)的引物进行简并PCR。由此，分离恒定域并对其进行测序，从而进行5’RACE引物的设计以完成从前导区，通过可变区直至恒定区的全长IgNAR序列。
使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen货号18080-044)或M-MLV逆转录酶(Promega M170B)和方案将提取的RNA经逆转录以生成cDNA。使用恒定域1引物生成从白斑角鲨(spiny)组织合成的cDNA。
C1-for1：5’ATA GTA TCC GCT GAT TAG ACA3’，和
Nar-C1-ForM1：5’GAGTGGAGGAGACTGACTATTG3’。
分析通过如上描述的简并PCR技术获得的IgNAR序列，并且设计多个用于扩增IgNAR转录子(3’RACE)3’末端的引物，如下所述。按照实施例2描述的方法分离总RNA并且使用Invitrogen的GeneRacer试剂盒(货号L1500-01)或Invitrogen的5’RACE系统(货号18374-058)进行3’RACE。使用Invitrogen的GeneRacer Oligo引物或Invitrogen的5’RACE系统3'RACE适配引物(#836:5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC(T)17-3')和SuperScriptII或III按照操作手册的方案但是在42℃下进行孵育而不是50℃，从总RNA合成第一链cDNA。第一链cDNA被用于PCR扩增，使用Clontech的高级cDNA PCR聚合酶Mix或BIOTAQ DNA聚合酶(Bioline货号BIO-21060)按照推荐的方案以及下表1列出的引物进行。在标准琼脂糖胶上分析PCR产物，并且大小正确的条带被切胶纯化并被克隆入Promega的pGEM Teasy载体(货号A1360)或按照克隆试剂盒的方案克隆的TA。含有PCR产物的克隆被测序。
表1：白斑角鲨3’RACE引物
spiny_3R_Fm1_f34 CGGCAACGAAAGAGACAGGAG
spiny_3R_Fm1_f47 GACAGGAGAATCCCTGACCATCA
spiny_3R_Fm1_f54 GAATCCCTGACCATCAATTGCGTCC
spiny_3R_Fm2_f113 CTGGTACCGGAAAAATCCGGG
spiny_3R_Fm3_f202 CATTTTCTCTGCGAATCAAGGACC
spiny_3R_Fm3_r226 GGTCCTTGATTCGCAGAGAAAATG
spiny_3R_Fm3_r250 TACGTGGCACTGTCTGCAACTG
使用Tm特异性引物分离编码cDNA的NAR：按照如上描述的方法从白斑角鲨中提取RNA并使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clonetech)按照操作手册的方案将其逆转录。使用生成的3’RACE cDNA、供应的通用引物和白斑角鲨IgNAR C3特异性引物C3_for1(5’-GCCTCC TGC CTC CAT CGC CAG-3’)，根据试剂盒说明书再次进行第一轮PCR。获得的PCR产物被克隆入pGEM-Teasy载体(Promega)并且使用该载体中的T7和Sp6引发位点(priming sites)进行测序。12个被测序的克隆中有一个克隆编码跨膜尾(transmembrane tail)，其余的为之前克隆的分泌形式。该克隆允许另一种Tm特异性引物NAR_Tm rev1(5’-GAG AAT AAA CAGGAT CAC GAG AGC G-3’)的设计，该引物与NAR V区域特异性引物NAR_Fr1for1(5’GGA GAATCC CTG ACC ATC AAC TGC G-3’)合用以扩增从脾脏cDNA获得的全长NAR V-C3-Tm和NARV-C5-Tm版本。
使用5’RACE分离编码cDNA的NAR：编码5’非翻译区克隆、接合前导子(spliceleader)、可变域和部分恒定域的NAR cDNA按如下方式获得。分析编码每个物种恒定域(通过如上所述进行3’RACE分离)的核苷酸序列以鉴定保守区。在具有高度同一性的这些区域中设计引物并用于编码如下序列的NAR的5’RACE扩增：
使用Invitrogen的5’RACE系统(Invitrogen，货号18374-41；18374-058)和标准方案实现cDNA末端的扩增。从组织中提取总RNA，并使用基因特异性引物以及SuperScriptII/III和dC尾(dC-tailed)按照推荐的方案合成第一链cDNA。dC尾cDNA被用于PCR扩增，使用Clontech的高级cDNA PCR聚合酶Mix或BIOTAQ DNA聚合酶(Bioline货号BIO-21060)并结合基因特异性引物(如表2列出的)。根据合适的操作手册方案进行PCR扩增。将根据标准琼脂糖凝胶电泳判断的大小正确的扩增产物进行切胶纯化，并按照Invitrogen的TA克隆试剂盒的方案进行TA克隆，或者可选地，使用操作手册的标准方案克隆入Promega的pGEM Teasy载体(Promega A1360)。含有PCR产物的克隆被送至测序。
表2：白斑角鲨5’RACE引物
shark_C1_f395 CACCAATCATCAGTCTCCTCTAC
shark_C1_f411 CTACTCTGCAACTGACGAACTG
shark_C1_r505 CTCACTCCAATGCTTTCTGGCTGG
shark_C1_r549 GTGGTAAAGCCAGACTGTATGG
shark_C1_r594 GGTGGAGCTAAAGTCTCCGTTCG
shark_C1_r655 CACTTGGCAGCTGTACATTGAAC
shark_C1_r697 CTAATTTCTTTCCGTTGGTTACTG
spiny_c_r869 CTTCCACGCTGCTGGTCAAG
spiny_c_r1011 GAATCTCCTCTGGCGATGGAG
spiny_c_r1050 CTCTTATCAAACAGGTGAGAGTAG
spiny_c_f1224 CACATCCACCTTCACAATCCAC
spiny_c_r1246 GTGGATTGTGAAGGTGGATGTG
spiny_c_r1560 GGCAATGCACTGTCTTCTAC
spiny_c_r1745 CAAAAGGGTGTCATTGGCCATCC
spiny_c_r1867 CCCACTAAACAGGAGTAAGTGG
使用PCR分离编码cDNA的NAR：通过如下的PCR扩增获得编码接合前导区、可变域和部分恒定域1的NAR cDNA克隆：分析按照如上描述的由5’RACE获得的序列以鉴定接合前导序列。比对核苷酸序列并在具有高度核苷酸同一性的区域设计引物(指定的正向引物)。类似地，分析由3’RACE获得的序列以鉴定在恒定域中具有高度核苷酸同一性的区域以设计引物(指定的反相引物)。使用这些正向和反向引物按如下方式进行PCR扩增以获得NAR cDNA克隆。
如前所描述的，从多个白斑角鲨组织中提取RNA。使用Promega的或Invitrogen的寡核苷酸dT引物和SuperScript II/III按照操作手册的方案从总RNA合成第一链cDNA。正向和反向引物(表3)被用于从使用该cDNA的NAR特异性克隆进行PCR扩增。根据标准琼脂糖凝胶电泳判断的大小正确的扩增产物进行切胶纯化，按照Invitrogen的TA克隆试剂盒的方案进行TA克隆，或者可选的，使用操作手册的标准方案被克隆入Promega的pGEM Teasy载体(Promega A1360)并进行测序。
表3用于可变PCR的白斑角鲨引物
正向 997-spiny_utrPAGEETM_f113 GCCTGCTGGTGAAGAAACAATGC
正向 994-spiny_sigMHIFWV_f132 ATGCATATTTTCTGGGTTTCGGTC
反向 879-shark_C1_r655 CACTTGGCAGCTGTACATTGAAC
正向 1005-spiny_utrPAGEETM_f113a CCCTGCTGGTGAAGAAACAATG
正向 1006-spiny_utrPAGEETM_f113b CTTTGCTGGTGAAGAAACAATG
反向 879-shark_C1_r655 CACTTGGCAGCTGTACATTGAAC
白斑角鲨IgNAR引物类分析：进行生物信息学分析以鉴定和表征白斑角鲨IgNAR序列。开放阅读框的识别，以及按照描述分离的cDNA克隆的核苷酸序列分析，允许对每个物种进行NAR特异性引物的设计，其可以被用于构建编码NAR的克隆的大文库。护士鲨IgNAR蛋白序列(Genbank登录号U18721)用作模板以首次定义了来自白斑角鲨的IgNAR序列。继而，选择数个后代(seed)白斑角鲨IgNAR序列使用CLUSTALW比对程序生成多重序列比对。该多重比对被用于使用HMMERBUILD程序构建特异性用于白斑角鲨IgNAR的Hidden Markov模型(HMM)轮廓(profile)。然后，该HMM轮廓被用于通过使用GENEWISEDB程序搜索完整的白斑角鲨cDNA序列数据库。识别每个IgNAR cDNA序列的开放阅读框并将其翻译成氨基酸序列。接下来，使用CLUSTALW程序比对所有的IgNAR氨基酸序列，并且将其与已知的护士鲨IgNAR基因结构相比较以鉴定IgNAR结构域(FW1、CDR1、FW2、HV2、FW3a、HV4、FW3b、CDR3和FW4)。
实施例2：2V和5V白斑角鲨VNAR结构域的序列(Sequence)、表达和结晶
将克隆2V和5V(图9所示的序列)克隆入噬菌粒展示载体pWRIL-1(Finlay,W.J.,etal.,J Mol Biol,2009.388(3):p.541-58)并且表现出高水平的细菌表达。对于结晶试验，在HEK293细胞中瞬时表达这两种蛋白并且通过Nickel捕获然后Superdex 200进行纯化。简单地说，条件培养基在被装载至15ml床(bed)Nickel树脂之前，被调节至50mMTris pH8.5，然后使用Tris 20mM NaCl、20mM咪唑0-20mM进行连续清洗。在Tris 20mM NaCl20-150mM咪唑中梯度洗脱蛋白。使用25mM MES、25Mm HEPES pH6.8稀释合并的蛋白，并且使其通过Superdex 20016/20300ml床柱。Tris 20mM，NaCl 20mM pH 8.0进行透析后，2V和5V的蛋白溶液分别被浓缩至10mg/ml和19mg/ml。使用蒸气扩散法进行的悬滴实验导致了来自两种不同的条件的晶体：用于2V的20％PEG3350和200mM MG SO4以及用于5V25％PEG4K，0.1MHEPES pH 7.5。
实施例3：ELSS1合成文库设计
使用如上所述的经PCR扩增的cDNA制备全面的“天然”白斑角鲨VNAR(AA)序列数据库，该数据库由来自于一系列不同白斑角鲨动物和组织类型的全长特定cDNA VNAR克隆组成。检测经编译的被翻译的VNAR结构域的(AA)含量、相对位点的保守性和跨越除CDR3长度分布以外的分析群的频率。该分析被用于指导合成文库设计。于CDR1和CDR3环开始，我们考察了跨越这些环的含量、邻近的框架残基以及环长度范围和分布。根据长度(n≥100)池(pool)将数据库内的序列转换(binned)为特定的克隆。关注了长度在11至16个氨基酸范围的整体CDR3环，因为它们相当于我们已经定义的13±2个氨基酸的平均白斑角鲨CDR3长度。每个长度转换池(ength binned pool)的具体的含量分析强调了邻近CDR3的框架3&4内的保守残基。特别地，我们将这些定义为CDR3之后的最后三个FW3b和前三个FW4残基位点。另外，我们发现在CDR3环本身内的N-和C-末端上某些氨基酸的明显保守性。FW3a位点-3、-2、&-1，紧邻CDR3环表现出对CKA、CRA以及较低程度的CAN序列基序的明显的优选。应该注意的是在一些克隆中观察到额外的多样性；然而，其发生频率相当低。通常可以理解的是这种侧翼残基在呈现的三维空间上对环具有明显的影响，因此发挥了对互补位构象的影响。出于这种考虑，我们假设这些残基功能环展示是重要的，因此，保持我们所具有的模板结构域基序。通过使用我们的双模板设计，我们对这些特定的区域进行调整，因此，在合成文库中表示为CKA或CRA基序。实际上，这种方式允许我们展现出76％的在数据库中发现的“天然”(AA)序列多样性。紧接在序列数据库中CDR3之后的前三个FW4残基表现出DGA基序的更高发生率，以及较低程度的YGA。另外，我们使用的双模板结构域方法促进了这两种模体并入最终的合成文库克隆中，从而模拟这些位点的“天然”多样性。
在CDR3环本身中，我们可以清晰地看到在C-端CDR3末端存在特定残基的偏倚，而之前没有(as eluded to earlier)，特别是倒数第二个和最后一个残基。该偏倚很可能是通过使用特异性连接的或J基因片段而引入的，还有待阐明。其可能由于生物物理学或功能的原因而已经发生自然进化。另外，随着CDR3长度的延伸，在该位点中似乎发现了特定的优选残基发生变化。这种情况的具体实例为当我们检测倒数第二个和最后一个C-端末端CDR3残基以及从最短的CDR3(11AA)开始分析至最长(16AA)时。其中，我们发现DV残基基序结合的保守性明显降低(D 46％→14％，V 45％→14％)且以对等(reciprocal)增加的趋势含有WY残基呈(W 42％→66％，Y 43％→83％)。这可以提示这些特定的末端残基之间具有潜在的协方差关系，因此，目前看来其似乎表现出与延伸的CDR3长度具有良好的相关性。
实施例4：ELSS1合成文库的构建
使用Phusion高保真(HF)聚合酶预混物(master mix)(Finnzymes)按照操作手册的推荐进行模板区的PCR反应，所述模板区为通过使用特异性突变的寡核苷酸从质粒携带的2V和5V序列脱离的各自的模板区。简单地说，将等摩尔量的三种初级PCR产物组(分别含有FW1、CDR1-FW3和CDR3-FW4片段)的每个PCR产物混合作为预混物。随后，通过接合重叠延伸(SOE)PCR将这些片段连接。SOE-PCR产物使用Sfil限制性内切酶消化并被连接至相同的经消化的pWRIL-1噬菌粒载体上。通过SOE-PCR构建了衍生自变异亚文库的四种模板，基于用于构建这些模板的CDR1-FW3和CDR3-FW4片段的起点定义池(pool)。对于所有的池，包括等量的衍生自这两种模板的FW1片段，并且具有在CDR1和CDR3环中添加的寡核苷酸指导的合成多样性。使用含有合适插入子的连接的pWRIL-1转化电感受态(Electrocompetant)大肠杆菌TG1细胞(Licigen)。在构建亚文库过程中，我们从每个起始模板生产了三组初级PCR产物，基本上模板被分为三个不同的区域，主要包括框架1(FW1)、CDR1和CDR3。使用模板特异性三核苷酸(TRM)寡聚物(Genelink)突变已定义的CDR1和CDR3环区(Virnekas,B.,etal.,Nucleic Acids Res,1994.22(25):p.5600-7)。TRM寡核苷酸被设计为于特定位点随机并入任意(AA)，除了有意去除半管氨酸以外。除了TRM寡聚物，我们还使用三种额外的模板特异性CDR1靶向的寡聚物用于并入由更合理的设计方式定义的突变体。基于使用“天然”白斑角鲨VNAR结构域序列的分析决定设计的内容，并且使用具有已定义的简并密码子和直接的(direct)同源密码子的寡核苷酸将其并入文库。每个池的转化子数量如下所示：池A(2V-2V)1.38×1010，池B(5V-2V)2.72×1010，池C(2V-5V)1.94×1010和池D(5V-5V)3.24×1010，因此，最大的最终结合的文库的大小为9.28×1010。
实施例5：未选择的ELSS1合成文库克隆的QC分析
未选择的ELSS1文库克隆被随机挑选出，分离DNA并对其序列进行分析。该分析的目的是为了确定所有预期的设计特征被成功并入最终文库的程度。总的来说，我们发现了所有被包括在设计中而无例外的被并入的混排以及寡核苷酸指导的突变的实例。另外，随机选择数个样本克隆并将其诱导至表达VNAR蛋白，分离周质部分并且通过Western blot法进行分析以确定蛋白被产生并且位于细菌周质提取物中，我们还确认了衍生自两种模板设计的杂交克隆中蛋白的表达。另外，我们比较了这两种靶环(具有起始“天然”数据库的一系列未选择的文库克隆的CDR1(n＝285)和CDR3(n＝246))的含量分布。总的来说，分析表明未选择的ELSS1合成克隆提供了相似的不同(diverse)(AA)含量并且其与被用于指导其合成的“天然”白斑角鲨数据库相似。我们比较了“天然的”、未选择的与已选择的ELSS1文库克隆的CDR3环长度分布。在此我们发现了对于大部分而言，未选择的合成文库群相当均匀地分布在8-16(AA)环长度，其中少量出现在环9(AA)长度。
实施例6：通过抗多靶标的ELSS1合成VNAR文库的生物筛选进行功能含量 (Functional Content)验证
为了验证ELSS1文库的质量和功能性，基于固态和预包被磁珠的方法均被用于抗多种靶标：人血清白蛋白(HSA)、人RAGE、人DLL-4，鸡蛋溶菌酶(HEL)、和小鼠ICOSL。获得抗每个靶标的阳性命中结果(图5-12)。简单来说，固态选择的实施如下所示：使用含有预期浓度靶抗原的4ml PBS包被免疫管。然后，将该管密封并于4℃下旋转孵育O/N。使用PBS清洗3x之后，使用2％(w/v)M-PBS封闭该管1h。在M-PBS(2％(w/v)终浓度)中旋转封闭0.5-1ml投入的噬菌体1h。然后，将已封闭的噬菌体加入至该管中，使用2％(w/v)M-PBS补充至4ml，并且在20rpm的条件下旋转孵育1h，之后进一步静止孵育1h。丢弃未结合的噬菌体，并且使用PBST清洗该管5-10x，之后使用PBS清洗5-10x。通过添加1ml的100mM三乙胺在20rpm下旋转达10min以洗脱噬菌体。产出的噬菌体溶液通过加入0.5ml 1M的pH值为7.5的Tris-HCl进行中和。洗脱的噬菌体被加入至10ml mid-log ER2738细胞，在37℃不搅拌的条件下混合并孵育30min，之后以2,500×g离心15min。将沉淀重悬于1ml的2×TY-G中并且涂布在含有TYE-GA琼脂的Bio-assay盘中，并于30℃O/N下孵育O/N。
对于预包被磁珠试验，按照每个操作说明将抗原生物素化。生物素化材料与30μlDynabeads M-280 Streptavidin(Invitrogen)在R/T 20rpm下孵育30分钟。使用如上描述的基本相同的方法实施使用预修饰珠进行文库选择，其中，使用4％(w/v)M-PBS在R/T旋转条件下将产出的噬菌体和Dynabe ads预封闭1小时。然后，通过加入封闭的磁珠在R/T旋转条件下1h，之后加入抗原包被的磁珠在R/T 20rpm下1小时对噬菌体进行去选择。经PBST清洗5x后，通过在400μl 100mM的TEA中旋转8分钟洗脱结合的噬菌体，并且通过加入200μl 1M的pH为7.5的Tris-HCl进行中和。按照固态选择描述的方法实施洗脱的噬菌体的大肠杆菌感染。
阳性命中结果的亲和检测(图5)：所有的BIAcore分析均使用T-100生物传感器SCM5系列芯片，胺偶联试剂盒，pH值为4、4.5、5.0和5.5的10mM醋酸钠固定缓冲液，10×HBS-P电泳缓冲液以及50mM NaOH(GE Healthcare)进行。确定试验条件，以最小化质量传递、亲和力(avidity)和重新结合事件的影响。使用HRAGE蛋白进行的免疫固定化在单独的流动细胞(Fc1)上实施以用于减除参照和特异性分析。纯化的VNAR蛋白经HBS-P电泳缓冲液稀释至终浓度范围(从600-37.5nM开始以2倍稀释，使用整体拟合分析计算动力学常数)。每个浓度以30ml/min的快速流速注射3分钟，并且允许解离5min，之后再生5sec，脉冲50mM NaOH。使用BIAcore T100评价软件(1.1.1)分析每个浓度减去参照的传感图。
纯化的抗HSAVNAR蛋白的BIAcore分析
该分析按照如上所述进行，除了以下例外。测试300RU的靶向固定的表面密度，除了流动细胞3&4上各自的人和小鼠血清白蛋白(HAS/MSA)的1000RU。另外，阴性Fc 1被包被DII 4蛋白。由于从纯化中获得了更多的蛋白，我们测试了更大的浓度范围，从800-50nM以2倍稀释。
纯化的抗RAGE VNAR蛋白的BIAcore分析
该分析按照如上所述进行，除了以下例外。流动细胞的靶向固定的表面密度如下所示：Fc 1- 1000 RU DLL4阴性对照表面；Fc 2- 1000 RU hRAGE(单体)；Fc 3- 1000 RUhRAGE(二聚体)；Fc 4- 1000 RU mRAGE(二聚体)。
纯化的抗DLL4VNAR蛋白的BIAcore分析
该分析按照如上所述进行。通过基于ELSA(数据未给出)和基于FACS的方法(图6A和B)进行阳性命中的选择。ELISA按照如下实施：于4℃O/N包被抗原。使用4％MPBS(MarvelPBS)在37℃下封闭96孔板1小时。检测抗体(在PBS中稀释至合适的浓度)在R/T下孵育1小时。随后是次级HRP酶标抗体在R/T下孵育1小时。通过加入TMB底物实现信号生成。
使用引物对已选择的阳性单体VNAR结构域进行PCR扩增，引入限制性位点和侧翼序列，其对于克隆入所有(proprietary)Fc哺乳动物表达载体是相兼容的，这有利于在HEK293悬浮培养物中PEI介导的瞬时表达后表达的蛋白的蛋白质A的亲和纯化。使用无血清培养基，VNAR Fc融合蛋白的表达水平通常在50-70mg/L的范围内。基本上，通过离心和0.2μm过滤从条件培养基中去除后表达细胞碎片，然后按照如上所述的亲和色谱法，通过经过经PBS平衡的Superdex 200 26/60尺寸排阻柱对蛋白质进行最终的纯化(polishing)步骤。使用Amicon超滤单元浓缩SEC洗脱峰，并使用紫外光谱法确定蛋白浓度。
FACS试验其按照下述方式实施：通过加入PBS和5％EDTA，在37℃下于PBS中清洗亲本CHO细胞、表达mICOSL和hICOSL配体的CHO细胞10-15min，并从烧瓶中移出。通过上下抽吸烧瓶的表面分散细胞，旋转减慢至1200rpm并重悬于DMEM加5％FCS中。将细胞以0.5–1x106个细胞/孔的密度分份至96孔U-底部板中。细胞在含有HEK293 VNAR-hFc表达蛋白的100μl组织培养上清液中于16℃下孵育30分钟，之后使用PBS加2％FCS清洗3x。然后，细胞与100μl的1μg/ml抗hFc-生物素(eBioscience)于16℃下孵育30分钟。经PBS加2％FCS清洗3x以后，加入1μg/ml的链霉亲合素-APC(eBioscience)于16℃下保持30分钟。经PBS加2％FCS清洗1x以后，细胞重悬于400μl的PBS加2％FCS中并将其转移至FACS管以用于FACS-Canto-2分析。
实施例7：抗mICOSL和DLL4的阳性命中结果的体外和体内功能验证
通过两种基于细胞的试验测量抗mICOSL阳性命中结果的体外效果。第一种方法为配体-受体中和试验(图7A)，其中表达小鼠ICOS受体的CHO细胞在96孔细胞培养板(Greiner，Bio-One)中的DMEM/F12+5％FBS培养基中生长至汇合。mICOSL-hFc(20μl，450ng/ml)与40μl的抗mICOSL-VNAR-hFC在DMEM/F12+2％FBS中预孵育1小时，然后将其加入至细胞中。16℃下孵育1小时后，使用DMEM/F12+2％FBS轻柔地清洗细胞3次并且在16℃下与使用相同培养基以1:10000稀释的山羊抗人Fc-HRP(SIGMA)一起另外再孵育40分钟。之后，使用DMEM/F12+2％FBS培养基再清洗细胞3次和使用PBS清洗一次，并与TMB底物共作用(developed)。第二种试验为D10增殖测定(图7B)，其按照如下所述方法进行：按照产品插入说明将Tosyl激活的Dynal磁珠包被mICOSL、抗mu CD3e和hIgG1填充物(每1x107个磁珠1μgICOSL/0.5μg抗CD3/3.5μg hIgG1)。试验设置前，磁珠被滴定以确定最佳浓度，以提供约8000-40,000CPM的读数(reading)。添加50μl/孔的磁珠至含有已滴定的抗体的96孔板中，该抗体被稀释在100μl的RPMI、10％FCS、2mM谷氨酰胺、青链霉素(pen strep)、10mM Hepes、1mM丙酮酸钠、2g/l葡萄糖和50μM BME中。
D10.G4.1细胞经测定培养基清洗4×并重悬于添加了10％大鼠T stim因子以及Con A(BD货号354115)、2.5ng/ml IL-2和10pg/ml IL-1α的上述培养基中至8x105细胞/ml并以50μl/孔至40,000细胞/孔添加。所有孔的终体积为200μl并且孵育48小时。加入1μci/孔3H胸苷并孵育5-7小时。收集并计数CPM。
通过基于细胞的中和试验和细胞死亡、内化试验和测量抗DLL4阳性命中结果的体外效果。中和试验(图7C)按照如下所述进行：HEK293/DLL4和亲本HEK293细胞在MEM、1x(Cellgro#10-010-CV)、10％FBS、1％青链霉素、1％谷氨酰胺加500μg/ml G418硫酸盐中生长至60-75％汇合。U-2OS/Notch1(荧光素酶报告菌株)和U-2OS亲本细胞在McCoy’s 5A(GIBCO,#12605)、10％FBS、1％青链霉素、1％谷氨酰胺加250μg/ml G418硫酸盐、300μg/ml潮霉素、1μg/ml嘌呤霉素中生长至60-75％汇合。对于试验，两种培养基按照1:1进行混合。将总体积为100μl的约10,000 Notch1和DLL4细胞/孔接种至白色不透明的96孔板中，一式三份。对不同板之间(across the plate)的测试抗体样本进行滴定并且在37℃，5％CO2条件下孵育24小时。对于每个样本(To each)，加入100μl Dual-glo荧光素酶缓冲液(Promega,#E2980)，之后在R/T下振摇20分钟。@700nm下检测荧光信号。以1/100稀释终止和Glo底物缓冲液，并添加100μl至每个样本中于R/T下保持20分钟，之后在约700nm(背景renilla发光)下进行发光检测1秒。收集两种测量值的比例作为输出。
DLL4过表达的HEK293细胞的生长如上所述并且以120μl/孔的细胞密度接种至96孔板中，以在进一步孵育四天的过程中保证细胞增殖。细胞在37℃，5％CO2条件下孵育以允许其贴壁。5×测试抗体储液和次级皂草素试剂(Advanced Targeting Systems#IT-51)以1:2摩尔比在培养基中进行混合并且在R/T下额外静置5分钟以允许复合物形成。然后，将该混合物进行连续稀释并且添加30ml至每孔的细胞中。培养板孵育四天，之后加入经1/5稀释的细胞滴定量96含水非放射性细胞增殖试验(Cell Titer 96 Aqueous Non-radioactiveCell Proliferation Assay)(Promega#G5430)(MTS)。然后，培养板在37℃下孵育1.5-5小时，孵育时间依赖于490nm和650nm(用于背景减除)吸光度下的颜色进展和读数。
抗mICOSL阳性命中结果的体内效果在小鼠风湿性关节炎模型(图8)中进行确定。该模型为胶原蛋白诱导的小鼠RA模型(Iwai et al,Journal of Immunology,2002:169)，其中，由10只雌性DBA1小鼠组成的组被注射给予溶于弗氏完全佐剂的牛胶原蛋白(第0天)，之后于第20天进行加强。于第20、22、24和26天腹腔注射给予溶于PBS的测试抗mICOSLVNAR-hFc结构域、阳性对照(HK5.3mAb)和阴性对照(2V-hFc)。每周测量两次临床评分和体重。临床评分基于足垫和足趾炎症的卡尺测量：1pt/足趾，5pts/肿胀足垫，5pts/肿胀脚踝，因此，得出15pts/足和60pts/动物。
实施例8：抗靶标克隆的比对
图16显示了抗被用于筛选ELSS1的三种靶标的前导克隆的比对。比对结果表明2V和5V框架的结合有助于这些克隆。任意无阴影的氨基酸在这两个框架之间均是保守的，所以在整个文库中被标准化。凸显的区域是差异被引入的位置，这依赖于所选克隆是否具有来自5V和/或2V序列的贡献。所有这些克隆均为在体外试验中表现出多种效果的前导克隆，并且mICOSL也在体内试验中表现出效果。这些克隆中的五个克隆具有跨却序列(CC3、C4、1D12、2D4、1H02)的2V。包括所有DLL4克隆在内的所有其它克隆为2V/5V框架融合体。
实施例9：ELSS2合成文库设计
设计并构建第二框架文库，并入来自于两个不同板鳃亚纲物种：白斑角鲨和铰口鲨的VNAR结构域的三种不同同种型的框架。基于三种不同VNAR结构域同种型(白斑角鲨2V(同种型IIb)和5V(同种型IIIb)VNAR结构域，除了从已免疫的护士鲨中分离的II型同种型结构域E9以外)之间的序列分析以设计两种模板框架融合构建体。图18阐明基于ELSS2文库构建(Life Technologies)的两种杂交模板框架序列。两种模板衍生的变异亚文库通过SOE-PCR构建，具有加入的寡核苷酸指导的(NNK低聚物)在两种长度(9、11、13、15和17个氨基酸)上的合成多样性以及CDR3环的序列。
实施例10：ELSS2文库构建和生物筛选
基于2V、5V和E9VNAR结构域设计两种框架融合模板。含有融合模板的质粒构建体被合成(Life Technology)并且基因插入子或者经KpnI和Sac I限制性内切酶消化或者使用Phusion高保真聚合酶预混物(NEB)根据操作手册的推荐进行PCR扩增。通过并入固定长度的(9、11、13、15或17个氨基酸)NNK低聚物获得跨越两种框架模板上的CDR3环的随机寡核苷酸合成多样性。全长VNAR基因序列通过SOE-PCR使用FW1-FW3和CDR3-FW4扩增子组装。PCR产物经SfiI限制性内切酶消化，连接至相同的经消化的噬菌粒载体并被转化入电感受态大肠杆菌ER2738细胞(Lucigen)，结果产生两个亚文库，合计大小约为2×108个克隆。
为了验证ELSS2文库的质量和功能性，基于预包被磁珠的生物筛选方法被用于抗ICOSL，使用如实施例6描述的相同方法。2次筛选后获得阳性噬菌体命中结果(图19)。十一个阳性克隆被测序，其中七个来自于模板1框架构建体，剩余的四个来自于模板2框架构建体。所有CDR3序列均是唯一的(图20)。在这些阳性克隆中，共计五个(三个来自于模板1，两个来自于模板2)在CDR1和CDR3均具有半胱氨酸残基，这与II型构象相关。
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Claims (4)

1.一种使用含有编码多个抗原特异性抗原结合分子的可表达DNA序列的文库的转化宿主生产抗原特异性抗原结合分子的方法，其中，该文库从至少两种异源同种型NAR序列创建，其中，所述抗原特异性抗原结合分子含有多个在板鳃亚纲物种成员中发现的免疫球蛋白同种型NAR的可变区的结构域；
其中，所述抗原特异性抗原结合分子具有如下式（I）所示的肽结构域结构：
FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4
并且其中，可表达的DNA序列的文库由包括以下步骤的方法生产：
（1）从板鳃亚纲的物种成员中分离RNA；
（2）从步骤（1）获得的编码抗原特异性抗原结合分子的RNA扩增DNA序列，以创建编码抗原特异性结合分子的DNA序列数据库；
（3）从步骤（2）制备的数据库中选择DNA序列；
（4）在多个与步骤（3）选择的序列中的CDR1或CDR3互补的异源低聚物存在的情况下，扩增编码FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4的两个或多个连续的肽结构域的DNA序列，以形成多个编码式（I）的抗原特异性抗原结合分子的扩增的DNA序列，其中，所述两个或多个连续的肽结构域当被连接时编码式（I）的抗原特异性抗原结合分子，并且其中所述两个或多个连续的肽结构域来自于在步骤（3）中选择的至少两个异源DNA序列；
（5）将编码两个或多个连续的肽结构域的所述扩增的DNA序列连接在一起以形成编码具有式（I）的肽结构域结构的抗原特异性结合分子的DNA序列；
（6）将步骤（3）获得的扩增的DNA克隆入展示载体；以及
（7）使用所述展示载体转化宿主以产生所述抗原特异性抗原结合分子的文库。
2.一种抗原特异性抗原结合分子的生产方法，该方法包括：
（1）从根据权利要求1中所述的方法制备的文库中选择预期克隆；
（2）从这些克隆中分离并纯化抗原特异性抗原结合分子；
（3）将编码抗原特异性抗原结合分子的DNA序列克隆入表达载体中；以及
（4）转化宿主以允许表达载体的表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述两个或多个连续的肽结构域为FW1、CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b和CDR3-FW4。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述RNA分离自板鳃亚纲物种的多个不同成员。
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