JP6616284B2 - 特異的結合分子の人工ライブラリー - Google Patents
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Description
・異なるアイソタイプの融合を通じた、両CDR領域、両HV領域およびフレームワーク領域において生み出されるさらなる多様性
・異なる板鰓亜綱種に由来する異なるアイソタイプの融合を通じた、両CDR領域、両HV領域およびフレームワーク領域におけるさらなる多様性
・トリヌクレオチド(TRM)オリゴを用いた特異的変異および両CDR領域内でのNNKオリゴを用いたランダム変異を通じたさらなる多様性
・天然由来のCDR1領域をNNKオリゴと組み合わせて用いることによる融合したフレームワーク領域を超えるさらなるアイソタイプ多様性(これはCDR1およびCDR3の古典的なII型Cys対形成の潜在的付加につながる)
・多様なCDR3領域の異なる固定長の使用を通じたさらなる多様性
・9×1010クローン以上へのライブラリーサイズの増加(これは、以前報告された(ナイーブ、免疫または人工の)サメライブラリーに比べて2桁大きい)。
(1)板鰓亜綱(Elasmobranchii subclass)の種のメンバーからRNAを単離し;
(2)抗原特異的抗原結合分子をコードする上記(1)で得られたRNAからDNA配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするDNA配列のデータベースを作成し;
(3)上記(2)で作成されたデータベースからDNA配列を選択し;
(4)上記(3)において選択された配列内のCDR1またはCDR3ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、FW1−CDR1−FW2−HV2−FW3a−HV4−FW3b−CDR3−FW4の2以上の隣接するペプチドドメインをコードするDNA配列を増幅して、式(I)の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたDNA配列を形成し、この際前記2以上の隣接するペプチドドメインは、ライゲートされた際に、式(I)の抗原特異的抗原結合分子をコードし、および前記2以上の隣接するペプチドドメインは、上記(3)において選択される少なくとも2つの異種のDNA配列由来である;
(5)前記2以上の隣接するペプチドドメインをコードする増幅されたDNA配列をライゲーションして、式(I)のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするDNA配列を形成し;
(6)上記(3)で得られた増幅されたDNAのディスプレイベクターにクローニングし;および
(7)前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製する、
ことを含む、下記式(I)で表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子のライブラリーの作製方法が提供される。
(1)本発明の第一の側面に従って作製されたライブラリーから所望のクローンを選択し;
(2)前記クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製し;
(3)前記抗原特異的抗原結合分子をコードするDNA配列を発現ベクターにクローニングし;および
(4)宿主を形質転換して、前記発現ベクターを発現させる、
ことを含む、抗原特異的抗原結合分子の製造方法が提供される。
(1)板鰓亜綱(Elasmobranchii subclass)の種メンバーからRNAを単離し;
(2)抗原特異的抗原結合分子をコードする上記(1)で得られたRNAからDNA配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするDNA配列のデータベースを作成し;
(3)上記(2)で作成されたデータベースからのDNA配列を選択し;
(4)上記(3)において選択された配列内のCDR1またはCDR3ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、FW1−CDR1−FW2−HV2−FW3a−HV4−FW3b−CDR3−FW4の2以上の隣接するペプチドドメインをコードするDNA配列を増幅して、式(I)の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたDNA配列を形成し、この際前記2以上の隣接するペプチドドメインは、ライゲートされた際に、式(I)の抗原特異的抗原結合分子をコードし、および前記2以上の隣接するペプチドドメインは、上記(3)において選択される少なくとも2つの異種のDNA配列由来である;
(5)ペプチドドメインFW1、CDR1−FW2−HV2−FW3a−HV4−FW3およびCDR3−FW4をコードする増幅されたDNA配列をライゲーションして、式(I)のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするDNA配列を形成し;
(6)上記(5)で得られた増幅されたDNAのディスプレイベクターにクローニングし;および
(7)前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製し、
(8)前記ライブラリーから所望のクローンを選択し;
(9)前記クローンから抗原特異的抗原結合分子の単離および精製し;
(10)前記抗原特異的抗原結合分子をコードするDNA配列を発現ベクターにクローニングし;および
(11)宿主を形質転換して、前記発現ベクターを発現させる
ことを含む、下記式(I)で表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子の製造方法が提供される。
Aは、配列番号1、配列番号4または配列番号7であり、
Xは、5、6または7アミノ酸残基を有するCDR1領域であり、
Bは、配列番号2、配列番号5または配列番号8であり、
Yは、8、9、10、11、12、13、14、15、16または17アミノ酸残基を有するCDR3領域であり、
Cは、配列番号3または配列番号6であり、
または、これと少なくとも50%相同である配列、
この際、配列番号1は、TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTまたはTRVDQTPRTATKETGESLTINCWTGAであり、
配列番号2は、TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAまたはTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRAであり、
配列番号3は、DGAGTVLTVNであり、
配列番号4は、ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTまたはASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGAであり、
配列番号5は、TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAまたはTYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRAであり、
配列番号6は、YGAGTVLTVNであり、
配列番号7は、ARVDQTPQTITKETGESLTINCVLRDであり、および
配列番号8は、TYWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRAまたはTYWYRKNPGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRAである、
を有する抗原特異的抗原結合分子が提供される。
本発明のこの側面の一態様において、式(II)で表されるアミノ酸配列:
Aは、配列番号1、配列番号4または配列番号7であり、
Xは、5、6または7アミノ酸残基を有するCDR1領域であり、
Bは、配列番号2、配列番号5または配列番号8であり、
Yは、8、9、10、11、12、13、14、15、16または17アミノ酸残基を有するCDR3領域であり、
Cは、配列番号3または配列番号6であり、
または、これと少なくとも50%相同である配列、
この際、配列番号1は、TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTまたはTRVDQTPRTATKETGESLTINCWTGAであり、
配列番号2は、TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAまたはTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRAであり、
配列番号3は、DGAGTVLTVNであり、
配列番号4は、ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTまたはASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGAであり、
配列番号5は、TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAまたはTYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRAであり、
配列番号6は、YGAGTVLTVNであり、
を有する抗原特異的抗原結合分子が提供される。
最終的なELSS1ライブラリーサイズ(>9×1010)、これは、以前報告されたいかなる(天然、免疫または人工の)サメライブラリーと比べても2桁大きい。
本発明の人工VNARライブラリーは、システインを付加することなく、ランダム化された各位置で全てのアミノ酸と同等の表現を供するトリヌクレオチド混合物を用いて作製される。ゆえに、本発明の人工ライブラリーはトリヌクレオチドの多様性を提供する。
ライブラリー設計アプローチは、構造的に重要と思われるCDRの側面残基(flanking residues)を保持した。かようなモチーフは、FW3bおよびCDR3のC末端が類似する免疫グロブリン(Ig)可変ドメインの宿主において発見されるもののアナログである。アブラツノザメVNAR配列の結晶構造モデルおよびさらなるバイオインフォマティクス分析を用いて、この論理的根拠を支持する観察を促した。2つのオリジナルテンプレートVNARドメインおよび(図3に)示されるこれらの代表的な分子モデルを結束する結晶構造を有することで、配列データベースにおいて観察される保存されたN末端およびC末端のCDR側面残基を位置づけた。これらのCDR3への近接および他の類似する可変Igドメインにおける重要性のため、最後の3つのFW3b残基および最初の2つのFW4残基について特に重要視した。一般的に、この領域における残基は、より保存されると思われる。
第1の人工VNARライブラリーは、配列2Vおよび5V(IIb型およびIIIb型)に基づいて二重の骨格設計を用いて築き、第1のライブラリーは、2つの別個の板鰓亜綱種に由来する2つを超えるVNARアイソタイプフレームワーク(II型VNARに加えて2V、5V、E9)を用いて築く。2つのテンプレートを用いることで、重要な別個のフレームワーク(FW)および超可変(HV)ループ領域をシャッフルすることにより、さらなる構造多様性の導入が容易となった。ゆえに、事実上、補足的なCDR1ループおよびCDR3ループを指向する多様性を含む、野生型および新規のスプライスされたハイブリッド骨格で構成される誘導されるクローンをもたらす。ELSS1における異なる文脈において、HV2ループおよびHV4ループを誘導するテンプレートは、代わりに、HV2およびHV4のFW1およびCDR1およびCDR3フラグメントとの対形成を誘導するテンプレートをコードするスプライシングPCRフラグメントを通じて得た。実際、これらによって、我々はハイブリッドなテンプレート誘導型の配列置換(sequence permutation)で構成される6つの新規のさらなるハイブリッド骨格を組み込むことが可能となった。
本発明の抗原特異的抗原結合分子は、本発明の方法に従って作製されたVNAR分子の人工ライブラリーから誘導されるアミノ酸配列を有する。VNAR、IgNARおよびNARとの語もまた、互換可能なように用いられてもよい。
CDR領域CDR1およびCDR3内のアミノ酸の位置は、各位置で天然由来アミノ酸をコードする非ランダムなコドンセットを用いてそれぞれ変異されてもよい。ある態様において、CDR領域内の位置が変異される場合、その位置について、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは全てのアミノ酸をコードするコドンセットが選択される。ある態様において、CDR領域内の位置が変異される場合、その位置の全アミノ酸の好ましくは約50%〜約100%、好ましくは約60%〜95%、好ましくは約70%〜約90%、好ましくは約75%〜約90%をコードするコドンセットが選択される。
G:グアニン
A:アデニン
T:チミン
C:シトシン
R:(AまたはG)
Y:(CまたはT)
M:(AまたはC)
K:(GまたはT)
S:(CまたはG)
W:(AまたはT)
H:(AまたはCまたはT)
B:(CまたはGまたはT)
V:(AまたはCまたはG)
D:(AまたはGまたはT)H
N:(AまたはCまたはGまたはT)。
本発明の抗原特異的抗原結合分子をコードする核酸配列は、核酸構築物内に存在してもよい。かような核酸構築物は、ベクターの形態(例えば、発現ベクター)であってもよく、染色体由来、エピソーム由来およびウイルス由来のベクター(例えば、バクテリアプラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランズポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入要素由来、酵母染色体要素由来、ウイルス由来(バキュロウイルス、パポバウイルス、SV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス等)、およびこれらの組み合わせ由来のベクター(コスミドおよびファージミドのような、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝的要素由来のベクター等)を含んでもよい。一般的に、宿主においてポリペプチドを発現するために核酸の維持、増殖または発現に適するいかなるベクターも、この点において発現のために用いてもよい。
他の側面において、本発明は、本発明に係る複数のベクターを含むライブラリーを提供し、前記複数のベクターは複数のポリペプチドをコードする。したがって、本発明は、その表面上に本発明のポリペプチドを提示するウイルスまたはウイルス粒子(ファージまたはファージミド粒子等)を提供する。本発明は、本発明の複数のウイルスまたはウイルス粒子を含むライブラリーについても提供し、各ウイルスまたはウイルス粒子は本発明のポリペプチドを提示する。本発明のライブラリーは、任意の数の別個のポリペプチド(配列)、少なくとも約1×108、少なくとも約1×109、少なくとも1×1010の別個の配列、より好ましくは少なくとも約9×1010の配列を含んでもよい。
本発明の特定の態様において、抗原特異的抗原結合分子は、図9、11、12、13、14、15(a)、15(b)または16のいずれかで示される群より選択されるアミノ酸配列を有する。
標的に対するバインダーの選択プロセスは、Lタンパク質またはファージ上に提示される抗体もしくは抗体フラグメントに結合するタグ特異的抗体等の抗体の可変ドメインに対して親和性を有する一般的な(generic)タンパク質の選別を含んでもよく、正しく折り畳まれた抗体フラグメント(融合ポリペプチド)を提示するライブラリーメンバーを濃縮するのに用いてもよい。
本発明によれば、本発明の抗原特異的抗原結合分子を含む薬剤組成物が提供される。かような組成物は、前記抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質を含む。
以下に示す複数の分子生物学的技術を用いて、アブラツノザメ組織からRNAを単離した。
Nar−C1−ForM1:5 AGTGGAGGAGACTGACTATTG 3’。
クローン2Vおよび5V(図9に示す配列)を、プラスミドディスプレイベクターpWRIL−1(Finlay,W.J.et al.,J Mol Biol,2009.388(3):p.541−58)にクローニングし、高レベルのバクテリア発現を示した。結晶化試験のため、HEK293細胞内で両タンパク質を一時的に発現し、ニッケル捕捉、次いでSuperdex200を介して精製した。簡潔には、濃縮溶媒を50mM Tris pH8.5に調整して、ベッド量15mlのニッケル担体にロードし、Tris 20mM NaCl、20mMイミダゾール0〜20mMで連続的に洗浄した。Tris 20mM NaCl 20〜150mMイミダゾールのグラジエントによりタンパク質を溶出した。プールされたタンパク質を25mM MES、25Mm HEPES pH6.8で希釈し、Superdex 200 16/20 300mlがベッドされたカラム上に通した。Tris 20mM、NaCl 20mM pH8.0に対する透析の後、2Vおよび5Vのタンパク質溶液が10mg/mlおよび19mg/mlとなるまでそれぞれ濃縮した。蒸気拡散法を用いた懸滴試験は、2つの異なる条件からの結晶をもたらした:2Vについて20% PEG3350および200mM MG S04、ならびに5Vについて25% PEG4K、0.1M HEPES pH7.5。
上記のようにPCR増幅されたcDNA、広範な異なるアブラツノザメ動物および組織由来の全長ユニークなcDNA VNARクローンからなるデータベースを用いて、網羅的な“天然の”アブラツノザメ(spiny)IgNAR(AA)配列データベースを作製した。CDR3の長さ分布に加えて、分析集団を通じた(AA)含量、相対的位置保存および頻度に関して、まとめられた翻訳されたVNARドメインを試験した。人工ライブラリー設計を導くために、この分析を用いた。CDR1およびCDRループを起点とし、これらのループ、隣接するフレームワークの含量およびループ長さの範囲および分布を調べた。長さ(n>100)プールに従って、ユニークなクローンとしてデータベース内の配列は除いた。アブラツノザメCDR3の平均長さ(13±2アミノ酸)として定義したものに対応するよう、11〜16アミノ酸の範囲である全CDR3ループに焦点を当てた。各長さにおける詳細な含量分析において、CDR3に隣接するフレームワーク3および4内のプールのハイライトの保存された残基は除いた。具体的に、我々は、CDR3の後の最後の3つのFW3bおよび最初の3つのFW4残基の位置として、これらを定義した。さらに、我々は、CDR3ループ自身内のN末端およびC末端における特定のアミノ酸の明らかな保存を発見した。CDR3ループにすぐに隣接するFW3aの3位、2位および1位は、CKA、CRAについて、明らかに優位で、かつきわめて低程度なCNA配列モチーフを示した。あるクローンにおいてさらなる多様性が観察されたことも注目すべきである;しかし、かなり大幅に低い頻度であった。かような隣接残基が三次元スペース内のループの提示に顕著に影響をもたらしうること、およびパラトープのコンフォメーションに影響を発揮しうることは、一般的に理解される。これを踏まえ、これらの残基が機能性ループ提示において重要であると仮定し、テンプレートのドメインモチーフを保持した。我々は、二重テンプレート設計を用いて、これらの特定領域および人工ライブラリーにおける、表現されたCKAまたはCRAモチーフのいずれかを調節した。実際、このアプローチにより、データベースで発見したように、“天然の”(AA)配列多様性の76%を表現することが可能となった。配列データベースにおけるCDR3のすぐ後の最初の3つのFW4残基は、DGAモチーフのより高い発生頻度かつより低程度のYGAを示した。再び、我々が用いた二重テンプレートドメイン法は、最終的な人工ライブラリークローンへのこれら両モチーフの取り込み、およびこれらの位置における模倣された“天然の”多様性を容易にした。
製造元の推奨に従い、Phusion high fidelity (HF) polymerase master mix (Finnzymes)を用いて、特異的変異オリゴヌクレオチドを用いたプラスミド由来2Vおよび5V配列の代表的なテンプレート領域のPCRを実施した。簡潔には、3つの初期PCR産物セット(FW1、CDR1−FW3およびCDR3−FW4をそれぞれ構成するフラグメント)由来の各PCR産物を、等モル量のマスターミックスと混合した。次に、スプライスバイオーバーラップエクステンション(SOE)PCRにより、これらのフラグメントを連結した。Sfil制限エンドヌクレアーゼでSOE−PCR産物を切断し、同様に切断したpWRIL−1ファージミドベクターにライゲーションした。SOE−PCRにより変異サブライブラリー由来の4種類のテンプレートを構築し、これらを構築するのに用いられるCDR1−FW3およびCDR3−FW4フラグメントの源に基づいて、プールを定義した。全てのプールについて、両テンプレートに由来する等量のFW1フラグメントを、添加したオリゴヌクレオチド指定合成多様性とともに、CDR1およびCDR3ループに含めた。電気的に有効なE.Coli TG1細胞(Lucigen)を、適切な挿入部を含むライゲーションしたpWRIL−1で形質転換した。サブライブラリーの構築において、我々は、各オリジナルテンプレートから初期PCR産物を3セット作製し、特に、テンプレートはフレームワーク1(FW1)、CDR1およびCDR3をほぼ含む3つの別個の領域に分けた。テンプレート特異的なトリヌクレオチド(TRM)オリゴマー(Genelink)(Virnekas,B.,et al.,Nucleic Acids Res,1994.22(25):p.5600−7)を用いて、定義したCDR1およびCDR3ループ領域を変異させた。あえて除外したシステインを除いていかなる(AA)を特定の位置でランダムに取り込むために、TRMオリゴヌクレオチドを設計した。TRMオリゴに加えて、我々は、より根本的な設計アプローチにより定義される変異を取り込むために、3つのさらなるテンプレート特異的CDR1標的オリゴも用いた。設計される含量について、“天然の”アブラツノザメVNARドメイン配列の分析を用いて決定し、定義された縮退コドンおよび直接的な相同コドンとともにオリゴヌクレオチドを用いてライブラリーに取り込んだ。各プールの形質転換数は以下の通りである:プールA(2V−2V)1.38×1010、プールB(5V−2V)2.72×1010、プールC(2V−5V)1.94×1010およびプールD(5V−5V)3.24×1010、よって最大の最終組み合わせライブラリープールサイズは9.28×1010であった。
非選択ELSS1ライブラリークローンをランダムにピックアップし、DNAを単離して、これらの配列を分析した。この分析の目的は、最終的なライブラリー内に良好に取り込まれた全ての意図される設計の特徴に対する程度を決定することであった。全体として、我々は、例外なく設計に含まれる全ての取り込まれたシャッフルおよびオリゴヌクレオチド指定変異の例を発見した。さらに、いくつかのサンプルクローンをランダムに選択し、VNARタンパク質の発現を誘導し、ペリプラズム分画を単離し、タンパク質が生成してバクテリアのペリプラズム抽出物に局在していることを確認するためにウェスタンブロットにより分析した。我々は、2つのテンプレート設計に由来するハイブリッドクローンにおけるタンパク質の発現についても確認した。さらに、我々は、オリジナルの“天然の”データベースを有する非選択のライブラリークローンのパネルのために、両標的ループ、CDR1(n=285)およびCDR3(n=246)の含量分布を比較した。全体的に見ると、分析は、非選択ELSS1合成クローンが同様の多様性(AA)含量を付与し、その合成を導くのに用いられた“天然の”アブラツノザメデータベースと類似することを示した。我々は、“天然の”、選択されたおよび非選択のELLS1ライブラリークローンのCDR3ループの長さ分布を比較した。ここで、我々は、大部分について、非選択人工ライブラリー集団は、9(AA)長さのループのわずかな表現とともに、8〜16(AA)ループ長さで等しく均一に分布していることを発見した。
ELSS1の質および機能を立証するために、種々の標的(ヒト血清アルブミン(HSA)、ヒトRAGE、ヒトDLL−4、卵白リゾチーム(HEL)、およびマウスICOSL)に対して、固体およびプレコートビーズの両方に基づく方法を用いた。各ターゲットについてポジティブヒットを得た(図5〜12)。簡潔には、以下のように固体の選択を行った:イムノチューブを、4mlPBS中で所望の濃度の標的抗原でコートした。その後、チューブを処理し、回転させながら4℃で一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄後、チューブを2%(w/v)M−PBSで1時間かけてブロックした。0.5〜1mlのインプットファージのM−PBS溶液(最終濃度2%(w/v))でブロックし、1時間回転させた。次に、ブロックファージをチューブに添加し、2%(w/v)M−PBSで4mlにし、20rpmで1時間回転させながらインキュベートした後、さらに1時間静置インキュベートした。未結合ファージを捨て、チューブをPBSTで5〜10回洗浄した後、PBSで5〜10回洗浄した。100mMトリエチルアミン1mlを添加して20rpmで10分に達するまで回転させながらファージを溶出させた。溶出したファージ溶液を、1M Tris−HCl pH7.5 1mlの添加により中和した。溶出したファージを対数増殖期中期(mid-log)のER2738細胞10mlに加え、混合し、37℃で30分間無撹拌でインキュベートした後、2,500gで15分間遠心した。ペレットを2×TY−G1mlで再懸濁し、TYE−GA寒天培地を含むBio−Assayディッシュ上に広げ、30℃で一晩インキュベートした。
以下の例外を伴って上記に従い、本分析を実施した。フローセル3、4それぞれのヒトおよびマウス血清アルブミン(HSA/MSA)1000RU表面に加え、標的固定化表面密度300RUについて試験した。さらに、ネガティブFc1をDLL4タンパク質でコートした。精製からより多くのタンパク質を有するほど、我々はより高濃度の範囲(800〜50nMに始まり2倍希釈液)を試験した。
以下の例外を伴って上記に従い、本分析を実施した。フローセルの標的固定化表面密度は以下のとおりである:Fc1−1000RU DLL4ネガティブコントロール表面;Fc2−1000RU hRAGE(単量体);Fc3−1000RU hRAGE(2量体);Fc4−1000RU mRAGE(2量体)。
上記に従って本分析を実施した。ELISAベース法(図示せず)およびFACSベース法(図6AおよびB)の両方により、ヒットの選択性を試験した。以下のとおり、ELISAを実施した:抗原を4℃で一晩コートした。4% MPBS(Marvel PBS)で96ウェルプレートを37℃で1時間ブロックした。(PBSで適切な濃度に希釈した)検出抗体を室温で1時間インキュベートし、次に、二次HRPコンジュゲート抗体と共に、室温で1時間インキュベートした。TMB基質の添加により、シグナル検出を得た。
2種類の細胞に基づくアッセイにより、抗mICOSLヒットのインビトロ有効性を測定した。はじめは、96ウェルプレート(Greiner,Bio−One)においてマウスICOS受容体を発現するCHO細胞が5%FBS含有DMEM/F12培地中でコンフルエントになるまで成長させたときの、リガンド−受容体中和アッセイである(図7A)。mICOSL−hFc(450ng/mlで20μl)を、2%FBS含有DMEM/F12中で、抗mICOSL VNAR−hFC40μlとともに1時間インキュベートした後、細胞に添加した。16℃で1時間インキュベートした後、2%FBS含有DMEM/F12で細胞を穏やかに3回洗浄し、同じ培地で1:10000に希釈したヤギ抗ヒトFc−HRP(SIGMA)とともに16℃で40分間インキュベートした。その後、細胞を再度2%FBS含有DMEM/F12で3回洗浄し、PBSで1回洗浄し、TMB基質とともに成長させた。第二のアッセイは、簡単には以下のとおり実施したD10増殖アッセイである(図7B):トシル活性化磁気Dynalビーズを、製品添付の指示に従って、mICOSL、抗muCD3eおよびhlgG1フィラーでコートした(ビーズ1×107個あたり、ICOSL 1μg/抗CD3 0.5μg/hlgG1 3.5 μg)。アッセイ立ち上げに先立ち、およそ8000〜40000CPMの読み取りを与える最適な濃度を決定するため、ビーズを滴定した。50μl/ウェルのビーズを、100μlのRPMI、10%FCS、2mMグルタミン、pen strep、10mM HEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、2g/lグルコースおよび50μM BMEで希釈した滴定抗体を含む96ウェルプレートに添加した。
図16は、ELSS1のスクリーニングに用いた3種類の標的に対する先頭のクローンのアラインメントを示す。アラインメントは、2Vおよび5Vフレームワークの組み合わせがこれらのクローンに寄与することを示す。陰影のないアミノ酸は、両フレームワーク間に保存されるため、ライブラリーを通じて規格化される。ハイライトされた領域は、選択されたクローンが5Vおよび/または2V配列から寄与されるのか否かに依存して誘導される差異のある箇所である。全てのこれらのクローンは、種々のインビトロアッセイで有効性を示すリードクローンであり、mICOSLもインビボアッセイで有効性を示す。これらのクローンのうち5つは、配列(CC3、C4、1D12、2D4、1H02)を通じて2Vを有する。全DLL4クローンを含む他の全てのものは、2V/5Vフレームワーク融合物である。
第二のフレームワークライブラリーを設計し、2種類の異なる板鰓亜綱種(アブラツノザメおよびコモリザメ)に由来するVNARドメインの3種類の異なるアイソタイプのフレームワークを取り込むことを構築した。3種類の異なるVNARドメインアイソタイプ(免疫されたコモリザメから単離されるII型アイソタイプドメインE9に加え、アブラツノザメ2V(アイソタイプIIb)、5V(アイソタイプIIIb)VNARドメイン)の間の配列分析に基づいて、2種類のテンプレートフレームワーク融合構築物を設計した。図18では、ELSS2ライブラリーを基礎として構築された2つのハイブリッドテンプレートフレームワーク配列(Life Technologies)を実証している。CDR3ループの長さ(9、11、13、15および17アミノ酸)および配列の両方において付加されたオリゴヌクレオチド指向の(NNKオリゴ)人工的多様性を有するSOE−PCRにより、2つのテンプレート由来である変異サブライブラリーを構築した。
2V、5VおよびE9 VNARドメインに基づき、2種類のフレームワーク融合テンプレートを設計した。融合テンプレートを含むプラスミド構築物を合成し(Life Technologies)、遺伝子挿入部をKpnlおよびSacI制限エンドヌクレアーゼで切断するか、製造元の推奨に従い、Phusion高フィデリティーポリメラーゼマスターミックス(NEB)を用いてPCR増幅した。固定長(9、11、13、15または17アミノ酸)のNNKオリゴを取り込むことにより、両フレームワークテンプレート上のCDR3ループのランダムオリゴヌクレオチド人工的多様性を得た。FW1−FW3およびCDR3−FW4アンプリコンを用いて、SOE−PCRにより全長VNAR遺伝子配列を組み立てた。Sfil制限エンドヌクレアーゼでPCR産物を切断し、同様に切断したファージミドベクターにライゲーションし、エレクトロコンピテントE.Coli ER2738細胞(Lucigen)に形質転換し、およそ2×108クローンの組み合わされたサイズを有する2つのサブライブラリーを得た。
1.(1)板鰓亜綱(Elasmobranchii subclass)の種のメンバーからRNAを単離し;
(2)抗原特異的抗原結合分子をコードする上記(1)で得られたRNAからDNA配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするDNA配列のデータベースを作成し;
(3)上記(2)で作成されたデータベースからDNA配列を選択し;
(4)上記(3)において選択された配列内のCDR1またはCDR3ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、FW1−CDR1−FW2−HV2−FW3a−HV4−FW3b−CDR3−FW4の2以上の隣接するペプチドドメインをコードするDNA配列を増幅して、式(I)の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたDNA配列を形成し、この際前記2以上の隣接するペプチドドメインは、ライゲートされた際に、式(I)の抗原特異的抗原結合分子をコードし、および前記2以上の隣接するペプチドドメインは、上記(3)において選択される少なくとも2つの異種のDNA配列由来である;
(5)前記2以上の隣接するペプチドドメインをコードする増幅されたDNA配列をライゲーションして、式(I)のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするDNA配列を形成し;
(6)上記(3)で得られた増幅されたDNAのディスプレイベクターにクローニングし;および
(7)前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製する、
ことを含む、下記式(I)で表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子のライブラリーの作製方法。
(2)前記クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製し;
(3)前記抗原特異的抗原結合分子をコードするDNA配列を発現ベクターにクローニングし;および
(4)宿主を形質転換して、前記発現ベクターを発現させる、
ことを含む、抗原特異的抗原結合分子の製造方法。
3.(1)板鰓亜綱(Elasmobranchii subclass)の種のメンバーからRNAを単離し;
(2)抗原特異的抗原結合分子をコードする上記(1)で得られたRNAからDNA配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするDNA配列のデータベースを作成し;
(3)上記(2)で作成されたデータベースからのDNA配列を選択し;
(4)上記(3)において選択された配列内のCDR1またはCDR3ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、FW1−CDR1−FW2−HV2−FW3a−HV4−FW3b−CDR3−FW4の2以上の隣接するペプチドドメインをコードするDNA配列を増幅して、式(I)の抗原特異的抗原結合分子をコードする複数の増幅されたDNA配列を形成し、この際前記2以上の隣接するペプチドドメインは、ライゲートされた際に、式(I)の抗原特異的抗原結合分子をコードし、および前記2以上の隣接するペプチドドメインは、上記(3)において選択される少なくとも2つの異種のDNA配列由来である;
(5)前記2以上の隣接するペプチドドメインをコードする増幅されたDNA配列をライゲーションして、式(I)のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするDNA配列を形成し;
(6)上記(3)で得られた増幅されたDNAのディスプレイベクターにクローニングし;および
(7)前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製し、
(8)前記ライブラリーから所望のクローンを選択し;
(9)前記クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製し;
(10)前記抗原特異的抗原結合分子をコードするDNA配列を発現ベクターにクローニングし;および
(11)宿主を形質転換して、前記発現ベクターを発現させる
ことを含む、下記式(I)で表されるペプチドドメイン構造を有する抗原特異的抗原結合分子の製造方法。
5.複数の抗原特異的抗原結合分子をコードする発現可能なDNA配列のライブラリーを含む形質転換宿主を用いた抗原特異的抗原結合分子の製造方法であって、前記ライブラリーは少なくとも2つの異種のアイソタイプNAR配列から作製され、前記抗原特異的抗原結合分子は、板鰓亜綱(Elasmobranchii subclass)の種のメンバーにおいて発見される免疫グロブリンアイソタイプNARの可変領域の複数のドメインを有する、方法。
6.式(II)で表されるアミノ酸配列:
Aは、配列番号1、配列番号4または配列番号7であり、
Xは、5、6または7アミノ酸残基を有するCDR1領域であり、
Bは、配列番号2、配列番号5または配列番号8であり、
Yは、8、9、10、11、12、13、14、15、16または17アミノ酸残基を有するCDR3領域であり、
Cは、配列番号3または配列番号6であり、
または、これと少なくとも50%相同である配列、
この際、配列番号1は、TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTまたはTRVDQTPRTATKETGESLTINCWTGAであり、
配列番号2は、TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAまたはTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRAであり、
配列番号3は、DGAGTVLTVNであり、
配列番号4は、ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTまたはASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGAであり、
配列番号5は、TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAまたはTYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRAであり、
配列番号6は、YGAGTVLTVNであり、
配列番号7は、ARVDQTPQTITKETGESLTINCVLRDであり、および
配列番号8は、TYWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRAまたはTYWYRKNPGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRIKDLTVADSATYICRAである、
を有する抗原特異的抗原結合分子。
7.前記式(I)の配列が配列番号10である、上記6に記載の抗原特異的抗原結合分子。
8.前記式(I)の配列が配列番号12である、上記6に記載の抗原特異的抗原結合分子。
9.前記CDR1領域が図17で示されるCDR1領域である、上記6に記載の抗原特異的抗原結合分子。
10.前記CDR3領域が図17で示されるCDR3領域である、上記6に記載の抗原特異的抗原結合分子。
11.図11、12、13、14、15または16のいずれかに示される配列を有する、上記6に記載の抗原特異的抗原結合分子。
12.ヒト化された、上記6〜11のいずれか1つに記載の抗原特異的結合分子。
13.上記6〜12のいずれか1つに記載の抗原特異的抗原結合分子を有する融合タンパク質。
14.前記抗原特異的抗原結合分子が生理活性タンパク質に融合している、上記13に記載の融合タンパク質。
15.上記6〜12のいずれか1つに記載の抗原特異的抗原結合分子または上記13もしくは14に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
16.上記15に記載の核酸を含む核酸構築物。
17.上記16に記載のベクターを含む宿主細胞。
18.上記6〜12のいずれか1つに記載の抗原特異的抗原結合分子または上記13もしくは14に記載の融合タンパク質の製造方法であって、宿主細胞内で前記分子をコードする核酸配列を発現させる段階を含む、方法。
19.上記6〜12のいずれか1つに記載の抗原特異的抗原結合分子または上記13もしくは14に記載の融合タンパク質を含む薬剤組成物。
20.薬剤に用いられるための、上記6〜12のいずれか1つに記載の抗原特異的抗原結合分子または上記13もしくは14に記載の融合タンパク質。
21.疾患の治療を必要とする患者の疾患を治療するための薬剤の製造における、上記6〜12のいずれか1つに記載の抗原特異的抗原結合分子または上記13もしくは14に記載の融合タンパク質の使用。
22.治療上有効な量の上記19に記載の薬剤組成物を治療を必要とする患者に投与することを含む、治療を必要とする患者における疾患の治療方法。
23.検出可能に標識化された上記6〜12のいずれか1つに記載の抗原特異的抗原結合分子または上記13もしくは14に記載の融合タンパク質をサンプルに添加し、および標的分析物に対する分子の結合を検出することを含む、サンプル中の標的分析物の存在の検定方法。
24.検出可能に標識化された上記6〜12のいずれか1つに記載の抗原特異的抗原結合分子または上記13もしくは14に記載の融合タンパク質を患者に投与することを含む、患者における疾患部位のイメージング方法。
25.上記6〜12のいずれか1つに記載の抗原特異的抗原結合分子または上記13もしくは14に記載の融合タンパク質を患者に投与することを含む、患者における疾患または症状の診断方法。
Claims (4)
- 複数の抗原特異的抗原結合分子をコードする発現可能なDNA配列のライブラリーを含む形質転換宿主を用いた抗原特異的抗原結合分子の製造方法であって、
前記ライブラリーは少なくとも2つの異種のアイソタイプNAR配列から作製され、
前記抗原特異的抗原結合分子は、板鰓亜綱(Elasmobranchii subclass)の種のメンバーにおいて発見される免疫グロブリンアイソタイプNARの可変領域の複数のドメインを有し、
前記抗原特異的抗原結合分子は、下記式(I)で表されるペプチドドメイン構造を有し、
前記発現可能なDNA配列のライブラリーは、以下:
(1)板鰓亜綱(Elasmobranchii subclass)の種のメンバーからRNAを単離し;
(2)抗原特異的抗原結合分子をコードする上記(1)で得られたRNAからDNA配列を増幅して、抗原特異的結合分子をコードするDNA配列のデータベースを作成し;
(3)上記(2)で作成されたデータベースからDNA配列を選択し;
(4)上記(3)において選択された配列内のCDR1またはCDR3ドメインに相補的な複数の異種オリゴマーの存在下で、FW1−CDR1−FW2−HV2−FW3a−HV4−FW3b−CDR3−FW4の2以上の隣接するペプチドドメインをコードするDNA配列を増幅し、この際前記2以上の隣接するペプチドドメインは、ライゲートされた際に、式(I)の抗原特異的抗原結合分子をコードし、および前記2以上の隣接するペプチドドメインは、上記(3)において選択される少なくとも2つの異種のアイソタイプNARのDNA配列由来である;
(5)前記2以上の隣接するペプチドドメインをコードする増幅されたDNA配列をライゲーションして、式(I)のペプチドドメイン構造を有する抗原特異的結合分子をコードするDNA配列を形成し;
(6)上記(3)で得られた増幅されたDNAのディスプレイベクターにクローニングし;および
(7)前記ディスプレイベクターで宿主を形質転換して、前記抗原特異的抗原結合分子のライブラリーを作製する、
ことを有する方法により製造される、製造方法。 - (1)請求項1に記載の方法により作製されたライブラリーから所望のクローンを選択し;
(2)前記クローンから抗原特異的抗原結合分子を単離および精製し;
(3)前記抗原特異的抗原結合分子をコードするDNA配列を発現ベクターにクローニングし;および
(4)宿主を形質転換して、前記発現ベクターを発現させる、
ことを含む、抗原特異的抗原結合分子の製造方法。 - 前記2以上の隣接するペプチドドメインは、FW1、CDR1−FW2−HV2−FW3a−HV4−FW3、およびCDR3−FW4である、請求項1に記載の製造方法。
- RNAは、板鰓亜綱内の複数種の異なるメンバーから単離されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
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