JP2008511286A - サメ類のIgNARドメインに基づく結合成分 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つがIgNAR可変ドメインである少なくとも2つのIgNARドメイン、
(ii)同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるIセットドメインである少なくとも2つのIセットドメイン、または
(iii)同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるVセットドメインである少なくとも2つのVセットドメインを含む、マルチマーを含む結合成分を提供する。
結晶構造の分析は、例えば治療、診断およびバイオアレイ試薬としてのVNARタンパク質の可能性を明らかにしている。例えばVNARタンパク質は、その中でβヘアピン構造が延長して他の場合隠れている抗原部位に貫通することができるパラトープを形成する、裂け目に結合する抗体として作用する可能性を有する。さらに、これらのタンパク質は高度の安定性を有しており、それらの操作および実用用途の点で有意な利点を与える。
本明細書に示す結果は、これらのドメインの抗原結合または可溶性/安定性に重要であるIgNAR可変ドメインの構造特徴も確認する。これらの特徴をIgSFの他のメンバーのドメイン(例えば、IセットまたはVセットドメイン)に導入して結合性を変える、あるいは可溶性および/または安定性を改善することができる。
本発明は、
(i)同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つがIgNAR可変ドメインである少なくとも2つのIgNARドメイン、
(ii)同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるIセットドメインである少なくとも2つのIセットドメイン、または
(iii)同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるVセットドメインである少なくとも2つのVセットドメインを含む、マルチマーを含む結合成分も提供する。
2つのドメインは、同じ供給源または異なる供給源に由来してよい。
IgNAR可変ドメインを含む本発明の結合成分に関して、このような結合成分は、IgNAR可変ドメインの少なくとも1つの性質が変わるように修飾されているIgNAR可変ドメインを含む。このような結合成分は、適切なIgNAR可変ドメインが由来し得る完全長、野生型タンパク質を含まず、これらとは関係がないことは理解されよう。そうではなくて、このような結合成分は、それらの本来の環境から除去または単離されている可変ドメインを含むIgNARの一部分を含み、これらと関係がある。
本発明は、本発明によるIgNAR可変ドメインまたはマルチマー試薬をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明による結合成分は、IgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメイン中に異なる配列を有する複数の結合成分を含むライブラリーとして与えることができる。違いは1つまたは複数のループに存在することが好ましい。これらのライブラリーは、典型的にはスクリーニング法において使用して、当該の特定の標的分子に対する親和性などの、当該の活性を有する結合試薬を同定することができる。
本発明のスクリーニング法において同定した結合成分を含めた本発明の結合成分は、当該の標的分子に対するそれらの特異的な結合性のために診断/治療の方法において使用することができる。このような使用は、抗体およびその断片に関して既に知られている多数の診断/治療用途と類似していると思われる。例えば本発明の結合成分を使用して、生物サンプル中の当該の分子の存在または不在を検出することができる。
他の態様では本発明は、本発明によるIgNAR可変ドメインまたはマルチマー試薬、ならびに薬剤として許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
(実施例1)
VNAR12Y-1および12Y-2タンパク質の発現
記載されたのと同様に(Nuttall2004)、組換えタンパク質12Y-1(配列番号1および2)および12Y-2(配列番号3および4)を、21残基のC末端デュアルオクタペプチドFLAGエピトープおよびリンカー領域(N-AAADYKDDDDKAADYKDDDDK-C)とインフレームで大腸菌周辺質中に発現させた。簡単に言うと、大腸菌TG1開始培養物を2YT培地/アンピシリン(100μg/mL)/グルコース(2.0%w/v.)中で一晩増殖させ、新たな2YT/100μg/mLのアンピシリン/グルコース(0.1%w/v)中に1/100に希釈し、次いでOD550nm=0.2〜0.4まで37℃/200rpmで増殖させた。培養物は次いでIPTG(1mM最終)を用いて誘導し、28℃でさらに16時間増殖させ、遠心分離(Beckman JA-14/6K/10分/4℃)によって採取した。周辺質分画はMinsky(Minsky1994)の方法によって単離し、組換えタンパク質は抗FLAG抗体-セファロースカラム(10×1cm)を介した親和性クロマトグラフィーによって精製した。親和性カラムはTBS、pH7.4中で平衡状態にし、結合タンパク質はImmunoPure(商標)適度な溶出バッファー(Pierce)で溶出させた。溶出したタンパク質は0.02MのトリスpH7.5の2つの変形で透析し、3000Daのカットオフ膜(YM3、Diaflo)での限外濾過によって濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィー、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびバイオセンサーによって純度および活性を分析した。
VNAR1A-7および12A-9タンパク質の発現
組換えタンパク質1A-7(配列番号5および6)および12A-9(配列番号9および10)を、前の実施例1に記載したのと全く同様に大腸菌周辺質中に発現させ、精製し分析した。
VNAR12Y-1および12Y-2タンパク質の結晶化
組換えタンパク質12Y-2(14mg/ml)を、Hampton Researchの散在マトリクス結晶化スクリーニングキットを使用して2μlの懸滴中に設定した。プレートは25℃でインキュベートした。最終的な結晶化条件は、0.1Mクエン酸ナトリウムpH4.6/20%v/vイソ-プロパノール/20%PEG4000であった。回析良質の結晶を48時間後に得た。
VNAR12A-9および1A-7タンパク質の結晶化
組換えタンパク質12A-9(7mg/ml)を、Cartesian Honey Beeロボットを使用して0.2μlの懸滴として設定した。プレートは25℃でインキュベートした。成功条件を2μlの懸滴に拡大した。最終的な結晶化条件は、0.1MCHESpH9.5/50%PEG200であった。回析良質の結晶(空間群P21212)を40日後に得た。
12Y-1および12Y-2に関するデータ収集および構造決定
全結晶からのX線回析データの収集は、単管集束光学装置(AXCO)を備えるRigakuHR3HBX線発生装置に取り付けた、Rigaku RAXIS IV(Rigaku-MSC)およびMar180(MarResearch)画像プレート検出器を使用して内部で実施した。データは-160℃で収集し、結晶は他の凍結防止剤を必要としなかった。全てのデータ処理はDENZO/SCALEPACKスイート(Otwinoski1997)を使用して実施した。回析データの統計は表2中に要約する。
12A-9および1A-7に関するデータ収集および構造決定
1A-7結晶に関するX線回析データの収集は、単管集束光学装置(AXCO)を備えるRigakuHR3HBX線発生装置に取り付けた、Mar180(MarResearch)画像プレート検出器を使用して内部で実施した。12A-9結晶に関するX線回析データは、日本国においてPhoton FactoryシンクロトロンBL5ビームラインで収集した。両方の結晶に関するデータは-160℃で収集し、結晶は他の凍結防止剤を必要としなかった。全てのデータ処理はDENZO/SCALEPACKスイート(Otwinoski1997)を使用して実施した。回析データの統計は表2中に要約する。
結晶学上のダイマーの構造
ダイマー間のモノマーの相対配置は、6.9°の旋回および-0.43Åの回転移動として記載することができる。これは以下のように計算した。1個のモノマーのみから選択される対応するCα原子の最小二乗法の重ね合わせを使用して、12Y-2ダイマーに12Y-1ダイマーを重ね、したがって(質量中心付近の)旋回の程度、および第一結晶形由来の残りのモノマーを第二結晶形由来のモノマーに重ね合わせるのにしたがって必要とされる移動を計算した。
12Y-1および12Y-2に関する配位
12Y-1および12Y-2に関する配位は、それぞれ付録I(a)およびI(b)として添付する。
12A-9および1A-7に関する配位
12A-9および1A-7に関する配位は、それぞれ付録I(c)およびI(d)として添付する。
12Y-2のループ領域に対する修飾
12Y-2のループ領域8は、その長さの相当な部分が延長し主鎖の水素結合によって安定化するβ鎖を有するβヘアピン鎖立体配座をとる。このβヘアピン鎖立体配座は、例えばTyr87(O)-Phe100(N); Leu89(N)-Leu98(O); Leu89(O)-Leu98(N)の間で主鎖の水素結合によって保たれる。延長ループは免疫グロブリンフレームワークから外側および上側に延長し、例えば酵素活性部位、寄生虫コートタンパク質中の埋もれた裂け目および腔、あるいはウイルス中の裂け目に貫通するのに理想的な構造を作製する。以下の表は、12Y-2のループ領域8の長さと、b12Ig(HIVgp120を標的化する;Saphire2001);ラクダ科VHH1MEL(リゾチームを標的化する、Desmyter1994);およびT細胞受容体1QRNなどの裂け目に結合する抗体由来の長鎖CDR3ループの長さの比較である。
例えば、配列RVGPYSWDDSPQDNYYMをループ領域8近辺の12Y-2骨格に接合させて、抗HIV抗体b12(1HZH)に対応する延長ループを形成することができ、これによってHIVgp120と結合することができるIgNAR骨格を有する新規の結合成分を与えることができる。接合は例えば、12Y-2のアミノ酸残基86〜103(またはこれらの残基の一部分)とRVGPYSWDDSPQDNYYMの置換を含むことができる。
例えば、抗HIV抗体b12(1HZH)の配列GYRFSNFVIを、ループ領域4近辺の12Y-2骨格に接合させることができ、前の(1)に記載した抗HIV抗体b12のCDR3ループ接合部と組合せると、gpl20との結合親和性を増大させると思われる。接合は例えば、12Y-2のアミノ酸残基28〜33(またはこれらの残基の一部分)と配列GYRFSNFVIの置換を含むことができる。
例えば、残基Pro90および/またはPhe100の突然変異によってループ領域8の柔軟性を増大させることができ、それによって改善された抗原結合性をもたらすことができる。
これは実質的に、以下のさまざまな実施例中に記載する新しいサメ類ライブラリーの作製である。
VNARライブラリーを、12または13残基のループ長およびGly84+Glul03、またはGln84+Glyl02のいずれかのフレームワーク残基の組合せを有するCDR3(ループ領域8)用の、新たな縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって拡大した。これらおよび他のCDR3組合せを使用して、2×108を超える要素の他のVNARライブラリーを構築した。
ループ領域8の残基Leu98、Leu99修飾は同様の方法で行うことができる。
例えば:
セット1(短いループ8の残基)
7個の無作為化残基によって置換されたLeu89〜Ser97;式:(NNK)7+(SNK)1をコードする核酸による修飾をLeu98に施した。
セット2(無作為化したループ10の残基)
9個の無作為化残基によって置換されたLeu89〜Ser97;式:(NNK)9+(SNK)1をコードする核酸による修飾をLeu98に施した。
セット3(長いループのLeu98〜99)
チロシン/環状アミノ酸傾向を有する8個の無作為化残基によって置換されたLeu89〜Ser97およびLeu99に、式:(NNK)1(YMC)1(NNK)1(YMC)1(NNK)2(YMC)1(NNK)1(SNK)1(SNK)1をコードする核酸による修飾を施した。
セット4(長いループの11残基)
主なチロシン/環状アミノ酸傾向を有する10個の無作為化残基によって置換されたLeu89〜Ser97およびLeu98に、式:(NNK)3(YMC)4(NNK)3(SNK)1をコードする核酸による修飾を施した。
セット5(長いループの12残基)
芳香族傾向を有しLeu98を有さない12個の無作為化残基によって置換されたLeu89〜Ser97に、式:(NNK)3(WDB)1(NNB)2(WDB)1(NNK)2(WDS)1(NNB)2をコードする核酸による修飾を施す。
セット6(長いループの12残基)
芳香族傾向を有しLeu98を有さない12個の無作為化残基によって置換されたLeu89〜Ser97に、式:(WDB)1(NNK)2(WDS)1(NNB)2(WDB)1(NNK)2(WDB)1(NNB)2をコードする核酸による修飾を施す。
VNARの結合面を広げるために示す修飾
本明細書に示す結果は、VNARの「CDR2」ループは存在せず、分子の底部で短いβターンによって置換されていることを示す。これは図12中に図式的に示し、この場合VNARの「CDR2」は典型的なヒト抗体のそれと一直線に並んでいる。このループの「底部」位置は、低い配列変異性と組合せて、この領域は抗原との相互作用に対してほとんど影響がないことを強く示唆する。しかしながら、従来のC"およびD鎖の消失は、従来のCDR2の不在下で開いた状態の大きな凹状ポケットと延長12Y-2ループ領域8が組合わさった、抗原結合の考えられる他のモデルを示唆する。この凹状ポケットは、考えられる抗原結合面である。このポケットは、残基のループ領域8、ループ領域5およびCおよびDβ鎖を含む。(12Y-2に関する)これらの残基にはAsp33、Tyr37、Glu46、Ser48、Ser50、Ile51、Val59、Lys61、Phe86、Tyr94、Asn95、Tyr96、Leu98、Leu99およびArg101がある。この抗原結合表面は任意の抗体パラトープ(抗体の抗原結合表面)とは異なる、何故ならループ領域が互いに離れており(接触していない)、抗原接触残基がループ領域間にフレームワーク残基を含むことができるからである。
サメ類からヒトドメインへのループ接合による治療物質または診断物質の作製
IgNARおよびヒト免疫グロブリンスーパーファミリーのIセットドメインの構造は、フレームワーク/ループ領域接合部、鎖の射出角、およびループの配向の予測を可能にするほど充分相同性がある。VNARに関して発見した結合ループは、NCAM、ICAM、およびTelokinだけには限られないが、これらなどのヒトIセットの骨格に接合させることができる。これは、非ヒト供給源に由来する可変ループ領域のみを有する、ヒト結合ドメインIg様試薬を形成すると思われる。これらは裂け目に結合する「ヒトIg様」試薬として非常に有用である可能性がある、何故ならこれらは、任意の知られている天然に存在する抗体と異なる抗原結合表面を有するからである。
1.12Y-2由来の抗AMA1ループ領域8のIセット骨格への接合。
2.12Y-2由来の抗AMA1ループ領域4および8のIセット骨格への接合。
3.12Y-1由来の抗AMA1ループ領域8のIセット骨格への接合。
4.12Y-1由来の抗AMA1ループ領域4および8のIセット骨格への接合。
5.他のVNARループ領域8のIセット骨格への接合。
6.他のVNARループ領域4のIセット骨格への接合。
7.VNAR由来のループ領域4および8のIセット骨格への接合(この場合これらのループはジスルフィド架橋によって連結する)。
8.Iセット骨格と接合したループへのループ領域4〜8のジスルフィド架橋の取り込み。
9.等しいループ、ループ領域4および8の無作為化によるIセット骨格のライブラリーの作製。
10.ループ領域4および8と等しいループの無作為化によるIセット骨格のライブラリーの作製、および細胞接着分子を標的化するウイルスを同定するための一組の可変性「ウイルストラップ」としての使用。
神経細胞接着分子1(NCAM;CD56)は、神経細胞の接着を仲介する哺乳動物細胞表面の糖タンパク質である。細胞外ドメインは、5Igスーパーファミリードメイン次に2フィブロネクチンのタイプ3ドメインからなる(図23(a)参照)。NCAMのドメイン1はIgスーパーファミリーのIセット内で分類され、グリコシル化または他の翻訳後修飾によって修飾されない。
非ヒト供給源に由来する可変ループ領域のみを有するヒト結合ドメインIg様試薬、すなわちサメ類のIgNAR抗体を生成するために、VNAR1A-7由来のCDR3ループをNCAMのドメイン1およびTelokinのIセットドメインとのループ接合用にモデル化した。サメ類のVNAR、NCAMのドメイン1およびTelokinは、可変「VNARCDR3」ループの接合地点を評価するために、どの骨格構造相同性が最大であったかを決定するために調整した最小二乗値であった。これらのループは長さと配列の両方が異なり、NCAMのドメイン1およびTelokin骨格上のキメラとしてモデル化して、ヒト結合ドメインIg様試薬を生成した。
最適なNCAM/サメ類1A-7のCDR3ループ接合(モデル5)は、オリゴヌクレオチドプライマーA0989(配列番号81)を使用して重複PCRによって構築した。23B-2で示す生成したクローンはDNA塩基配列決定によって確認した(配列番号40)。
最適なTelokin/サメ類1A-7のCDR3ループ接合(モデル3および5)は、オリゴヌクレオチドプライマーA1022(一次延長プライマー)(配列番号90)およびA1023(二次延長プライマー)(配列番号91)(モデル3)、ならびにプライマーA1024(一次延長プライマー)(配列番号92)およびA1025(二次延長プライマー)(配列番号93)(モデル5)を使用して重複PCRによって構築した。生成したクローンは24F-4(配列番号43および44)(モデル3)ならびに23C-7(配列番号45および46)(モデル5)で示し、DNA塩基配列決定によって確認した。
ヒトドメインからサメ類VNARへのループ接合による治療物質または診断物質の作製
IgNARヒト免疫グロブリンスーパーファミリーのIセットドメインの構造は、フレームワーク/ループ領域接合部、鎖の射出角、およびループの配向の予測を可能にするほど充分相同性がある。ICAM-1などのIセットドメインは、ライノウイルスなどのウイルスの受容体として示されてきている。ライノウイルス結合に特異的なICAM-1上の結合ループはVNAR骨格と接合させることができ、新規な結合成分を生成することができる。これはIセットドメインに基づく他のウイルス診断物質にさらに拡大することができる。
1.ライノウイルス結合ICAM-1VLRループの12Y-2骨格への接合。
2.ライノウイルス結合ICAM-1VLRループの12Y-1骨格への接合。
3.ライノウイルス結合ICAM-1VLRループのVNAR骨格への接合。
4.ライノウイルス結合ICAM-1VLRループのダイマーまたはマルチマーVNAR骨格への接合。
5.狂犬病ウイルス結合NCAMVLRループの12Y-2骨格への接合。
6.狂犬病ウイルス結合NCAMVLRループの12Y-1骨格への接合。
7.狂犬病ウイルス結合NCAMVLRループのVNAR骨格への接合。
8.狂犬病ウイルス結合NCAMVLRループのダイマーまたはマルチマーVNAR骨格への接合。
9.ウイルス結合IセットVLRループのVNAR骨格への接合。
10.ウイルス結合IセットVLRループのダイマーまたはマルチマーVNAR骨格への接合。
「サメ化」による可溶性ヒト可変ドメイン:CDR2領域の作製
Vセット免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質のC'およびC"鎖によって作製されるCDR2ループは、免疫グロブリンの抗原結合および溶媒可溶性の維持において重要である。「底部」位置において等しいサメ類のドメインCDR2ループに関しては、ループ領域4のC末端およびCおよびDβ鎖中に溶媒露出群の残基がここで存在し、これは他の免疫グロブリンドメイン中ではCDR2ループによって覆われている。この溶媒露出面は主に12Y-2の残基Lys32、Asp33、Thr34、Gly35、Tyr55、Glu57、Thr58からなる。残基Asp33-Thr34-Glu57によって形成される荷電および極性群は、特に重要であるようである。
「サメ化」による可溶性ヒトTCR:VH/VL界面の作製
単鎖ヒトTCRドメインを生成するための過去の試みは、低い可溶性および発現における難点のために最適状態でも問題があった。12Y-1および12Y-2のVNARとTCRα(およびβ)ドメインの比較は、サメ類の構造を参照することによってヒトTCRが修飾され得る幾つかの態様を示す。「サメ化」によって我々は、TCRVαまたはVβドメインを別々に生成し指定突然変異によってその可溶性を増大させる機会を得る。
1.TCR界面中の残基Ser31はほとんど常にセリンまたはチロシン:したがって極性残基である。VNAR中では、それは荷電(Asp)残基、あるいは50%までの場合セリンである可能性がある。TCRドメインの残基31をAspに突然変異させることは、したがって可溶性を増大させることができる。
2.TCRドメイン界面中の重要な残基はPro43/Leu89/Phe106(および相当物)である。これはTCRVαおよびVβドメイン中の延長型疎水性群である。12Y-2の残基Glu46、Lys82、Lys104により形成される荷電ポケットと類似した、荷電ポケットを形成するためのこれらの残基の突然変異は、したがって可溶性を増大させることができる。
「サメ化」による可溶性抗体可変ドメイン:VH/VL界面の作製
単鎖抗体の可変ドメインを生成するための過去の試みは、可溶性および発現の問題と遭遇している。12Y-1および12Y-2のVNARと抗体VHおよびVLドメインの比較は、これらの個々のドメインをサメ類の構造を参照することにより修飾して、可溶性および発現レベルを改善することができる幾つかの態様を示す。例えば:
1.前の実施例11中に記載した残基を使用する、単離した単鎖ドメインの可溶性を増大させるためのVHまたはVL界面の修飾。12Y-2の残基Glu46、Lys82、Lys104により形成される荷電ポケットと類似した、荷電ポケットを形成するためのこれらの残基の突然変異は、したがって可溶性を増大させることができる。
VNARダイマーの修飾
12Y-1および12Y-2ダイマー形は、ループ領域下の連続的な8本鎖のβシートである(1760Å2までの界面の埋もれた表面積)。2重モノマー間の相互作用は、D鎖間およびループ領域8間の主鎖βシートの相互作用、ならびに側鎖相互作用および水仲介の接触を含む。これは、ダイマーの相互作用に関する有意な性向、および複合体形成におけるループ領域の非標準的な関与を示唆する。
1.VNARのD鎖中の位置Lys61およびGlu57におけるシステイン残基の導入による組換えダイマーの安定化。あるいは安定化は、D鎖中の位置Ile51およびLys61またはGly62のいずれかにおけるシステイン残基の導入によって実施することができる。
2.VNARのループ領域4中の位置Lys32およびAsp33におけるシステイン残基の導入による組換えダイマーの安定化。
3.位置Val59におけるシステイン残基の導入による組換えダイマーの安定化。
4.VNAR領域のループ領域8中の位置Leu98および/またはLeu99における、システイン残基の導入による組換えダイマーの安定化。
5.結合表面を形成するための12Y-2のループ領域8およびβシート残基の無作為化。例えば、12Y-2残基Asp26-Glu30および(27は疎水性でなければならない);Tyr87-Glul03は、埋もれた残基であるが疎水性でなければならない。この場合残基Asp93-Tyr96は、対称関連分子に由来する。
6.結合表面を形成するためのVNARおよびβシート残基のループ領域4および8の無作為化。ループ領域の配列がそれぞれの例に関して異なるであろうことは理解されよう。
7.同じ結合特異性の2つのコピーを表すための、ダイマーを使用することによるマルチマー化。
8.2つの異なる結合特異性を表すための、ダイマーを使用することによるマルチマー化。
結晶ダイマーが天然形であり、連続的な8本鎖のβシートが生理的条件下において形成される場合、したがってさまざまな残基がダイマーの界面で対になる。したがって結晶構造中では、Leu99残基の側鎖は正しい方向、および適切な距離(3Å)で隣接して、ジスルフィド架橋を形成する。
サメ類IgNARの原理に基づくヒトIセットドメインの設計、構築、およびスクリーニング。
サメ類IgNAR抗体は構造上、TelokinおよびNCAMのドメイン1などのIセットドメイン免疫グロブリンに近い。詳細には、他の場合CDR2ループであるものは分子の「底部」に存在する。前述の構造、タンパク質工学処理、およびライブラリー選択の実験は、サメ類IgNAR抗体の構造から学習した原理は、ヒトIセット免疫グロブリンの結合レパートリーの作製に首尾良く適合させることができることを示唆する。このようなライブラリーは、CDR1およびCDR3類似領域中に可変性を主に含むと予想される。前述の実験は、NCAMおよびTelokinドメインのフレームワーク領域(およびループ領域)を標的化する下流工程の親和性成熟の戦略は、改変され増大した結合親和性および特異性をもたらす可能性があることも示した。
12Y-2IgNARタンパク質の安定性。
サメ類の血液は尿素が豊富である。したがってIgNARドメインは、このような刺激の強い化学物質を用いた処理に異常に耐性があるように進化してきていると仮定することができる。組換えIgNAR14M-15(12Y-2Pro90Leu変異体)(配列番号11)を、8M尿素中での変性後にリフォールディングするその能力に関して試験した。固有の蛍光強度によって再生を測定した(図32参照)。尿素を除去した後に、IgNARドメインはその原型立体配座にリフォールディングした。
完全IgNARコード配列、およびバイオセンサーによる分析用の可変および定常ドメイン試薬の生成。
完全なオオセザメ(Orectolobus maculatus)のIgNARコード配列を、サメ類cDNAからクローニングした(18H-2で示すクローン(配列番号31および32))。完全なDNAおよびアミノ酸配列は図33に与える。DNA配列は、1つのIgNARIセットドメインおよび5Cドメインを含む1本のポリペプチド鎖をコードしている(図34(a)参照)。成熟IgNAR抗体中では、これらの鎖は位置Cys430およびCys660において半分システイン残基によって仲介されダイマーを形成する。生成する2つのジスルフィド架橋は(1)定常ドメイン3に対するC末端および定常ドメイン4に対するN末端、および(2)定常ドメイン5に対するC末端に位置する。採用した番号はタンパク質18H-2に関するものであり;可変ドメイン中での大きさの違いのために、残基番号はそれぞれのIgNARにおいて異なる。
タイプ3のIgNARのモデル化。
タイプ2のIgNAR可変ドメインの解明された構造体の1つは12A-9である。この構造体は、ループ領域4と8の間(すなわち、CDR1類似領域とCDR3類似領域の間)にジスルフィド結合を有する。この特定のIgNARは、サメ類の胚中に見られるタイプ3のIgNARと、CDR3の長さおよびジスルフィド結合の位置が類似している。GenbankのAAM77190(配列番号29)およびAAM77191(配列番号30)(テンジクザメのタイプ3のIgNAR)を参照。
(参考文献)
Claims (81)
- 図2に記載のA、A'、B、C、D、E、FおよびGで示す8個のβ鎖領域、および図2に記載の1〜9で示す9個のループ領域を含むIgNAR可変ドメインの性質を変える方法であって、β鎖領域またはループ領域の少なくとも1つの領域内のIgNAR可変ドメインを修飾することを含む方法。
- 修飾がIgNAR可変ドメインの結合特性を変える、請求項1に記載の方法。
- 修飾がIgNAR可変ドメインの可溶性を改善する、請求項1に記載の方法。
- 修飾がIgNAR可変ドメインの安定性を改善する、請求項1に記載の方法。
- 修飾がIgNAR可変ドメインの性向を増大または低下させてホモダイマーを形成する、請求項1に記載の方法。
- 非修飾β鎖領域およびループ領域が、表3に記載のアミノ酸残基番号を有する、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 非修飾ループ領域5が、図3に記載のC'およびD'で示す2個のβ鎖領域、および図3に記載の5a、5bおよび5cで示す3個のループ領域を含む、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 非修飾β鎖領域C、C'およびD'が、表3Aに記載のアミノ酸残基番号を有する、請求項7に記載の方法。
- 非修飾IgNAR可変ドメイン中のループ領域5bのCα痕跡が、表1中で定義する残基22、83および36のCα痕跡によって形成される平面より5Åしか大きくない、請求項7または請求項8に記載の方法。
- 非修飾β鎖領域A、A'、B、C、D、E、FおよびG、ならびにループ領域1、2、3、6、7および9のアミノ酸配列が、図1および/または表1に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 非修飾IgNARがタイプ2またはタイプ3のIgNARである、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 非修飾IgNARがサメ類に由来する、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 非修飾IgNAR可変ドメインのアミノ酸配列が、図1に示す配列である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 非修飾IgNAR可変ドメインが12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 修飾が置換、挿入、欠失またはこれらの組合せである、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
- 修飾が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個以上のアミノ酸の置換を含む、請求項1から15のいずれかに記載の方法。
- 修飾が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項1から16のいずれかに記載の方法。
- 修飾が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項1から17のいずれかに記載の方法。
- IgNARの1つまたは複数のループ領域を修飾する、請求項1から18のいずれかに記載の方法。
- ループ領域4、またはその一部分、および/またはループ領域8、またはその一部分を修飾する、請求項1から19のいずれかに記載の方法。
- ループ領域8を点突然変異によって修飾する、請求項20に記載の方法。
- ループ領域8を無作為化によって修飾する、請求項20に記載の方法。
- ループ領域8を修飾してCおよび/またはN末端でβ鎖立体配座をとることを容易にする、請求項20に記載の方法。
- ループ領域のCおよび/またはN末端における1つまたは複数のアミノ酸残基の付加または置換によってループ領域8を修飾する、請求項23に記載の方法。
- ループ領域のCおよび/またはN末端において2〜10個のアミノ酸残基を付加または置換する、請求項24に記載の方法。
- VセットまたはIセットドメイン由来のCDRループまたはその一部分をIgNAR可変ドメインのループ領域に接合させることによってIgNAR可変ドメインを修飾する、請求項1から20および23から25のいずれか一項に記載の方法。
- CDRループまたはその一部分をIgNAR可変ドメインのループ領域4および/または8に接合させる、請求項26に記載の方法。
- ループ領域8由来のアミノ酸をVセットまたはIセットドメイン由来のCDR3ループまたはその一部分によって置換する、請求項27に記載の方法。
- 表1中に定義するアミノ酸86〜103またはその一部分を置換する、請求項28のいずれか一項に記載の方法。
- ループ領域4由来のアミノ酸をVセットまたはIセットドメイン由来のCDR1ループまたはその一部分によって置換する、請求項27に記載の方法。
- 表1中に定義するアミノ酸28〜33またはその一部分を置換する、請求項30に記載の方法。
- 表1中に示す残基33、37、46、48、50、51、59、61、86、94、95、96、98、99および101よって定義される群中の1つまたは複数のアミノ酸残基を修飾する、請求項1から31のいずれかに記載の方法。
- IgNARのループ領域4および/またはループ領域8を修飾するとき、β鎖領域またはループ領域1〜3、5〜7または9の少なくとも1つを修飾する、請求項1から32のいずれかに記載の方法。
- β鎖領域C、D、EまたはFまたはループ領域5、6または7の少なくとも1つを修飾する、請求項33に記載の方法。
- β鎖領域CまたはDまたはループ領域5の少なくとも1つを修飾する、請求項34に記載の方法。
- ループ領域5を修飾する、請求項35に記載の方法。
- IgNARがタイプ2またはタイプ3である、請求項1から36のいずれかに記載の方法。
- IgNARがサメ類に由来する、請求項1から37のいずれかに記載の方法または結合成分。
- 請求項1から38のいずれか一項に記載の方法によって生成される修飾IgNAR可変ドメインを含む結合成分。
- 図2に記載のA、A'、B、C、D、E、FおよびGで示す8個のβ鎖領域、および図2に記載の1〜9で示す9個のループ領域を含むIgNAR可変ドメインを含む結合成分であって、β鎖領域またはループ領域の少なくとも1つの領域内でIgNAR可変ドメインが修飾されている結合成分。
- IまたはVセットドメインを修飾する方法であって、IgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴をIまたはVセットドメインに挿入および/または置換することを含む方法。
- 構造特徴が、図2に記載のIgNAR可変ドメイン由来のループ領域である、請求項41に記載の方法。
- ループ領域がIgNAR可変ドメイン由来のループ領域4または8である、請求項42に記載の方法。
- ループ領域8および/またはループ領域4をIセットまたはVセットドメインに接合させる、請求項43に記載の方法。
- IまたはVセットドメインの適切に予め決定したアミノ酸を、表1によって定義するIgNAR可変ドメイン由来のアミノ酸86〜103を含む挿入体で置換する、請求項44に記載の方法。
- IセットまたはVセットドメインのCDR2ループの全体または一部分を除去する、請求項41から45のいずれか一項に記載の方法。
- 構造特徴が、ループ領域4のC末端ならびに図2に記載のIgNAR可変ドメイン由来のCおよびDβ鎖における溶媒露出面である、請求項41に記載の方法。
- 表1中に定義するアミノ酸32、33、34、35、55、57および58またはその一部分と等しいIまたはVセットドメインのアミノ酸を修飾する、請求項41から47のいずれか一項に記載の方法。
- 修飾が荷電または極性アミノ酸をこれらの位置に導入する、請求項48に記載の方法。
- 修飾がIまたはVセットドメインの可溶性を改善する、請求項41から49のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項41から50のいずれか一項に記載のIセットドメインを修飾する方法。
- IセットドメインがNCAM、VCAM、ICAM、Telokin、MADCAM-1、TwitchinおよびTitinから選択される、請求項51に記載の方法。
- 請求項41から50のいずれか一項に記載のVセットドメインを修飾する方法。
- Vセットドメインが抗体、T細胞受容体(TCR)、CTLA-4、CD28、ICOS、CD2、CD4、Cd7、CD22、CD33、CD80、CD86、CD48およびCD58から選択される、請求項53に記載の方法。
- VセットドメインがTCRVαまたはVβドメインであり、IgNAR可変ドメインの溶媒露出表面と等しいアミノ酸がGly30、Ser31、Phe32、Phe33、Phe62、Thr63、Ala64およびGln65である、請求項53または請求項54に記載の方法。
- VセットドメインがTCRVαまたはVβドメインであり、VαドメインとVβドメインの間の界面に位置する1つまたは複数の残基を修飾する、請求項53または請求項54に記載の方法。
- 1つまたは複数のアミノ酸残基がSer31、Pro43、Leu89およびPhe106ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項56に記載の方法。
- 請求項41から57のいずれか一項に記載の方法によって生成される修飾IまたはVセットドメインを含む結合ドメイン。
- IまたはVセットドメインを含む結合成分であって、IまたはVセットドメインがIgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴をIまたはVセットドメインに置換または挿入することによって修飾されている結合成分。
- IまたはVセットドメインを含む結合成分であって、IまたはVセットドメインがIgNAR可変ドメインのループ領域4またはループ領域8と等しい領域に修飾を導入することによって修飾されている結合成分。
- (i)同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つがIgNAR可変ドメインである少なくとも2つのIgNARドメイン、
(ii)同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるIセットドメインである少なくとも2つのIセットドメイン、または
(iii)同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるVセットドメインである少なくとも2つのVセットドメインを含む、マルチマーを含む結合成分。 - 診断試薬と結合した本発明による結合成分。
- 固形支持体に固定されているかあるいはバイオセンサー表面と結合している、本発明による結合成分。
- 本発明による結合成分をコードするポリヌクレオチド。
- 本発明によるポリヌクレオチドを含むベクター。
- 本発明によるベクターを含む宿主細胞。
- 本発明による結合成分を生成する方法であって、本発明による結合成分の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、および場合によっては結合成分を回収することを含む方法。
- 本発明による結合成分および薬剤として許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物。
- 被験体の病状を治療する方法であって、本発明による結合成分を被験体に投与することを含む方法。
- 標的分子に対する親和性を有する本発明による結合成分を選択する方法であって、標的分子に対する親和性を有する本発明による結合成分の発現に関して、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
- 本発明による結合成分をコードする複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、ポリヌクレオチドがIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインにおいて1つまたは複数の修飾を含むポリヌクレオチドライブラリー。
- 4.0Åより良い分解能までIgNARの可変ドメインの原子座標を決定するための、X線を効果的に回析するタイプ2のIgNARの可変ドメインの結晶であって、タイプ2のIgNARの可変ドメインが105〜125のアミノ酸残基からなり、表1および/または図1に記載のアミノ酸配列を含む結晶。
- 付録I(a)、(b)、(c)または(d)の配位の全体または一部分±0.5Å未満のCα原子由来の二乗平均平方根偏差によって定義される構造を含む、タイプ2のIgNARの可変ドメインの結晶。
- 相同性モデル化の方法であって、
(a)IgSFドメインのアミノ酸配列図と図1に示す12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7のアミノ酸配列を一直線に並べて、アミノ酸配列の相同領域を適合させるステップ、
(b)付録I(a)、(b)、(c)または(d)によって定義される12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7構造の対応する領域上の前記IgSFドメインの適合相同領域の構造をモデル化するステップ、および
(c)(例えば好ましい相互作用部分がIgSFドメイン内で形成され、および/または低エネルギー立体配座が形成されるように)、前記適合相同領域の構造を実質的に保つ前記IgSFドメインの立体配座を決定するステップを含む方法。 - タンパク質の構造を決定する方法であって、付録I(a)、(b)、(c)または(d)の配位を与えること、および
(a)前記タンパク質の結晶単位セル中の配位を特定して、前記タンパク質の構造を与えること、または
(b)付録I(a)、(b)、(c)または(d)の配位を処理することによって前記タンパク質のNMRスペクトルピークを割り当てることのいずれかを含む方法。 - 以下の:
(a)付録Iに従う原子座標データであって、前記データが12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7あるいは少なくとも選択したその配位の三次元構造を定義するデータ、
(b)付録Iの原子座標データから誘導可能な12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7に関する構造要因データ(構造要因は回析波の振幅および相を含む)、
(c)付録Iのデータに基づくIgSFドメインの相同性モデル化によって作成したIgSFドメインの原子座標データ、
(d)付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成したIgSFドメインの原子座標データ、および
(e)(c)または(d)の原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むシステム。 - コンピュータ可読データをエンコードするデータ記憶材料を含み、12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7、あるいは12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7の異型の構造配位の全体または一部分によりデータが定義され、前記異型が、付録IのCαまたは骨格原子(窒素-炭素α-炭素)からの二乗平均平方根偏差が2Å未満である骨格原子を含む、コンピュータ可読記憶媒体。
- 付録IのCαまたは骨格原子からの二乗平均平方根偏差が1.5Åを超えず、好ましくは1.5Å未満であり、より好ましくは1.0Å未満であり、さらにより好ましくは0.74Å未満であり、さらにより好ましくは0.72Å未満であり、および最も好ましくは0.5Å未満である、請求項77に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
- 付録Iに従う12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7の構造配位の少なくとも一部分(例えば、本明細書で定義する選択配位)のフーリエ変換を含む第一組のコンピュータ可読データであって、未知の構造の分子または分子複合体のX線回析パターンを含む第二組の機械可読データと組合せ、前記第一組のデータおよび前記第二組のデータの使用に関する命令でプログラムされた機械を使用すると、第二組の機械可読データに対応する構造配位の少なくとも一部分を決定することができる、第一組のコンピュータ可読データをエンコードするデータ記憶材料を含む、コンピュータ可読データ記憶媒体。
- (a)付録Iに従い付録Iに記録される原子座標データであって、前記データが12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7あるいは少なくとも選択したその配位の三次元構造を定義するデータ、
(b)付録Iの原子座標データから誘導可能な付録Iに記録される12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7に関する構造要因データ、
(c)付録1のデータに基づくIgSFドメインの相同性モデル化によって作成した標的IgSFドメインの原子座標データ、
(d)付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成した修飾IgSFドメインの原子座標データ、および
(e)(c)または(d)の原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むコンピュータ可読媒体。 - IgSFドメインに関する構造を作製するためおよび/または合理的な薬剤設計を実施するためのデータを与える方法であって、
(i)以下の:
(a)付録Iに従う原子座標データであって、前記データが12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7の三次元構造、12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7の三次元構造の少なくとも1つのサブドメイン、または12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7の複数の原子の配位を定義するデータ、
(b)付録Iの原子座標データから誘導可能な12Y-1、12Y-2、12A-9または1A-7に関する構造要因データ、
(c)付録Iのデータに基づくドメインの相同性モデル化によって作成した修飾IgSFドメインの原子座標データ、
(d)付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成したタンパク質の原子座標データ、および
(e)(c)または(d)の原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むコンピュータ可読データを含むリモートデバイスとの連絡を確立させること、および
(ii)前記リモートデバイスから前記コンピュータ可読データを受信することを含む方法。
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