JP7212009B2 - Cxcr4結合分子 - Google Patents
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Description
本明細書で引用または参照された全ての文献、ならびに本明細書の引用文献で引用または参照された全ての文献は、本明細書で言及したあらゆる製品用の、または参照により本明細書に組み込まれたあらゆる文献のあらゆる製造業者の指示書、説明書、製品仕様書及び製品シートとともに、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(i)配列番号12に対して少なくとも50%の同一性を有するCDR1領域配列と、配列番号13に対して少なくとも70%の同一性を有するCDR3領域配列;
(ii)配列番号12に対して少なくとも50%の相同性を有するCDR1領域配列と、配列番号13に対して少なくとも70%の相同性を有するCDR3領域配列;
(iii)配列番号15に対して少なくとも50%の同一性を有するCDR1領域配列と、配列番号16に対して少なくとも70%の同一性を有するCDR3領域配列;
(iv)配列番号15に対して少なくとも50%の相同性を有するCDR1領域配列と、配列番号16に対して少なくとも70%の相同性を有するCDR3領域配列;
(v)配列番号18に対して少なくとも50%の同一性を有するCDR1領域配列と、配列番号19に対して少なくとも70%の同一性を有するCDR3領域配列;
(vi)配列番号18に対して少なくとも50%の相同性を有するCDR1領域配列と、配列番号19に対して少なくとも70%の相同性を有するCDR3領域配列;
(vii)配列番号21に対して少なくとも50%の同一性を有するCDR1領域配列と、配列番号22に対して少なくとも70%の同一性を有するCDR3領域配列;
(viii)配列番号21に対して少なくとも50%の相同性を有するCDR1領域配列と、配列番号22に対して少なくとも70%の相同性を有するCDR3領域配列;
(ix)配列番号24に対して少なくとも50%の同一性を有するCDR1領域配列と、配列番号25に対して少なくとも70%の同一性を有するCDR3領域配列;
(x)配列番号24に対して少なくとも50%の相同性を有するCDR1領域配列と、配列番号25に対して少なくとも70%の相同性を有するCDR3領域配列;
(xi)配列番号27に対して少なくとも50%の同一性を有するCDR1領域配列と、配列番号28に対して少なくとも70%の同一性を有するCDR3領域配列;
(xii)配列番号27に対して少なくとも50%の相同性を有するCDR1領域配列と、配列番号28に対して少なくとも70%の相同性を有するCDR3領域配列;
(xiii)配列番号30に対して少なくとも50%の同一性を有するCDR1領域配列と、配列番号31に対して少なくとも70%の同一性を有するCDR3領域配列;
(xiv)配列番号30に対して少なくとも50%の相同性を有するCDR1領域配列と、配列番号31に対して少なくとも70%の相同性を有するCDR3領域配列。
X1は、G、K、LもしくはYであり;
X2は、D、H、G、もしくはNであり;及び
X3は、I、V、M、F、QもしくはYであり;
または、その保存的アミノ酸置換)を含んでいるCDR1領域を含む。
Y’1は、YもしくはWであり;
Y’2は、T、VもしくはIであり;
Y’3は、GもしくはAであり;
Y’4は、AもしくはYであり;及び
Y’5は、V、RもしくはKであり;
または、その保存的アミノ酸置換)を含んでいるCDR3領域を含む。
式中、
A’は、QもしくはKであり;
B’は、VもしくはAであり;
X1は、G、K、LもしくはYであり;
X2は、D、H、G、もしくはNであり;
X3は、I、V、M、F、QもしくはYであり;
Y’1は、YもしくはWであり;
Y’2は、T、VもしくはIであり;
Y’3は、GもしくはAであり;
Y’4は、AもしくはYであり;及び
Y’5は、V、RもしくはKであり;
または、その保存的アミノ酸置換;ならびに
Zは、M、EAEA、MAまたはMPから選択されるアミノ酸(複数可)であるか存在しない。
(i)CXCR4を発現する細胞内のカルシウム流入;
(ii)CXCR4を発現する細胞のcAMP;
(iii)CXCR4を発現する細胞のβ-アレスチンシグナル伝達;
(iv)CXCR4を発現する細胞のアポトーシス;
(v)CXCR4を発現する細胞の細胞増殖;
(vi)CXCR4を発現する細胞の転移;
(vii)CXCR4誘導性の血管形成;及び
(viii)CXCR4を発現する細胞の遊走。
配列番号1:Homo sapiens NCAMドメイン1をコードするアミノ酸配列
配列番号2:i-body足場をコードするアミノ酸
配列番号3:Bos taurus NCAMドメイン1をコードするアミノ酸配列
配列番号4:Mus musculus NCAMドメイン1をコードするアミノ酸配列
配列番号5:Rat rattus NCAMドメイン1をコードするアミノ酸配列
配列番号6:Gallus gallus NCAMドメイン1をコードするアミノ酸配列
配列番号7:Xenopus laevis NCAM2ドメイン1をコードするアミノ酸配列
配列番号8:Xenopus laevis NCAM1ドメイン1をコードするアミノ酸配列
配列番号9:Homo sapiens NCAM2ドメイン1をコードするアミノ酸配列
配列番号10:Mus musculus NCAM2ドメイン1をコードするアミノ酸配列
配列番号11:ADCX-99をコードするアミノ酸配列
配列番号12:ADCX-99 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号13:ADCX-99 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号14:ADCX-272をコードするアミノ酸配列
配列番号15:ADCX-272 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号16:ADCX-272 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号17:ADCX-6をコードするアミノ酸配列
配列番号18:ADCX-6 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号19:ADCX-6 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号20:ADCX-54をコードするアミノ酸配列
配列番号21:ADCX-54 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号22:ADCX-54 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号23:ADCX-LSをコードするアミノ酸配列
配列番号24:ADCX-LS CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号25:ADCX-LS CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号26:ADCX-668をコードするアミノ酸配列
配列番号27:ADCX-668 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号28:ADCX-668 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号29:ADCX-306をコードするアミノ酸配列
配列番号30:ADCX-306 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号31:ADCX-306 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号32:ADCX-99をコードするヌクレオチド配列
配列番号33:ADCX-272をコードするヌクレオチド配列
配列番号34:ADCX-6をコードするヌクレオチド配列
配列番号35:ADCX-54をコードするヌクレオチド配列
配列番号36:ADCX-LSをコードするヌクレオチド配列
配列番号37:ADCX-668をコードするヌクレオチド配列
配列番号38:ADCX-306をコードするヌクレオチド配列
配列番号39:親和性成熟したi-bodyのコンセンサスアミノ酸配列
配列番号40:AM3-114をコードするアミノ酸
配列番号41:AM3-114 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号42:AM3-114 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号43:AM3-114をコードするヌクレオチド配列
配列番号44:AM3-920をコードするアミノ酸配列
配列番号45:AM3-920 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号46:AM3-920 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号47:AM3-920をコードするヌクレオチド配列
配列番号48:AM4-1121をコードするアミノ酸配列
配列番号49:AM4-1121 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号50:AM4-1121 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号51:AM4-1121をコードするヌクレオチド配列
配列番号52:AM4-613をコードするアミノ酸配列
配列番号53:AM4-613 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号54:AM4-613 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号55:AM4-613をコードするヌクレオチド配列
配列番号56:AM3-523をコードするアミノ酸配列
配列番号57:AM3-523 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号58:AM3-523 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号59:AM3-523をコードするヌクレオチド配列
配列番号60:AM4-661をコードするアミノ酸配列
配列番号61:AM4-661 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号62:AM4-661 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号63:AM4-661をコードするヌクレオチド配列
配列番号64:AM3-466をコードするアミノ酸配列
配列番号65:AM3-466 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号66:AM3-466 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号67:AM3-466をコードするヌクレオチド配列
配列番号68:AM5-245をコードするアミノ酸配列
配列番号69:AM5-245 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号70:AM5-245 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号71:AM5-245をコードするヌクレオチド配列
配列番号72:AM4-272をコードするアミノ酸配列
配列番号73:AM4-272 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号74:AM4-272 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号75:AM4-272をコードするヌクレオチド配列
配列番号76:AM4-746をコードするアミノ酸配列
配列番号77:AM4-746 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号78:AM4-746 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号79:AM4-746をコードするヌクレオチド配列
配列番号80:AM3-114-Im7-FH-SA21二重特異性i-bodyをコードするアミノ酸配列
配列番号81:AM3-114-Im7-FH-SA21二重特異性i-bodyをコードするヌクレオチド配列
配列番号82:21H5 i-bodyをコードするアミノ酸配列
配列番号83:AM4-774 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号84:AM4-774 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号85:AM4-208 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号86:AM4-208 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号87:AM4-1088 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号88:AM4-1088 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号89:AM4-239 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号90:AM4-239 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号91:AM3-32 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号92:AM3-32 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号93:AM4-757 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号94:AM4-757 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号95:AM4-386 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号96:AM4-386 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号97:AM4-352 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号98:AM4-352 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号99:AM3-182 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号100:AM3-182 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号101:AM4-203 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号102:AM4-203 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号103:AM5-95 CDR1をコードするアミノ酸配列
配列番号104:AM5-95 CDR3をコードするアミノ酸配列
配列番号105:ヒトCXCR4をコードするアミノ酸配列
用語「及び/または」、例えば「X及び/またはY」は、「X及びY」または「XまたはY」のいずれをも意味すると理解されるべきであり、両方の意味またはいずれかの意味を明示的に裏付けるものと解釈されるべきである。
本明細書を通じて、用語「comprise(を含む)」、または「comprises(を含む)」もしくは「comprising(含んでいる)」などの変形は、指定された要素、整数もしくは工程、または要素群、整数群もしくは工程群を包含するが、いかなる他の要素、整数もしくは工程、または要素群、整数群もしくは工程群をも排除することを意味しないことが理解されるだろう。
(i)Glu、Asp、Lys、Arg及びHisからなる荷電基、
(ii)Phe、Tyr及びTrpからなる芳香族基、
(iii)His及びTrpからなる窒素環基、
(iv)Met及びCysからなる微極性基など。
本開示は、修飾されたCDR1及びCDR3領域を有する足場を含む、結合ポリペプチド(すなわち「i-body」)を提供する。一例では、足場領域は、配列番号1に示すヒトNCAM1のドメイン1、または強調表示されたCDR1及びCDR3領域を除いて、配列番号1と少なくとも45%の同一性または少なくとも75%の相同性を有する関連したドメイン配列を含む。
更なる例では、増加した親和性、特異性または活性でCXCR4と結合できるi-bodyを作製するために、または発現または溶解性を増加させたi-bodyを作製するために、本開示のポリペプチドが親和性成熟される。例えば、本開示のポリペプチドをコードする配列を、1個以上のアミノ酸置換を誘導するように変異させる。次に、得られた変異体ポリペプチドを、例えば競合アッセイでスクリーニングして、CXCR4との結合を検出するか、他のケモカイン受容体(例えばCCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCR1、XCR1;図9を参照)に対する特異性の増加をスクリーニングするか、または発現の増加または溶解性の増加をスクリーニングするか(図7を参照)、または以下で説明する親和性アッセイによってCXCR4に対する親和性の増加をスクリーニングする。
一例では、本開示のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載する及び/または当技術分野において既知である、タンパク質生産に十分な条件下で、細胞株(例えば、E.Coli細胞株)を培養することにより生産される。
組換えタンパク質の場合、それをコードする核酸を、1つ以上の発現構築物、例えば、発現ベクター(複数可)に導入し、その後、ジスルフィドブリッジまたはジスルフィド結合を生じさせることができる細胞、例えばE.coli細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞を含む細菌細胞などの宿主細胞にトランスフェクトする。例示的な哺乳動物細胞としては、サルのCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはそれ以外の免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞が挙げられる。例示的な細菌細胞としては、いずれもNovagenから入手可能である、BL21(DE3)、BL21(DE3)-pLysS、Tuner、Tuner pLysS、Origami、Origami B、Origami B pLysS、Rosetta、AD494、HMS174が挙げられる。
本開示のCXCR4結合分子もしくはポリペプチドまたはi-bodyは、単離または精製することができる。
本開示はまた、本明細書に記載するCXCR4結合分子またはポリペプチドのコンジュゲートを形成する。本開示のポリペプチドへコンジュゲートできる化合物の例は、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象の体内でのタンパク質半減期を延長する化合物及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一例では、本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドは、固体または半固体マトリックスに固定化される。用語「固定化」は、例えばWO99/56126またはWO02/26292に記載されているように、特定のマトリックスにタンパク質を固定化する種々の方法及び技術を含むと理解されるものとする。例えば固定化は、特に保存期間中、または1回分使用量形態において、生物学的、化学的または物理的曝露によってタンパク質の活性が低下または劣化することがないように、タンパク質を安定化する役割を果たす。
結合アッセイ
Gタンパク質共役受容体に対して最も特異的かつ強力な抗体は通常、タンパク質の三次構造によって形成される高次構造的に複雑なエピトープを標的としている。ネイティブ構造が完全な脂質二重層に依存する膜貫通タンパク質には、可溶性タンパク質標的に対して使用される方法は効果的ではない。
場合により、CXCR4結合ポリペプチドの解離速度定数(Kd)、会合速度定数(Ka)または結合定数/平衡解離定数(KD、すなわちKoff/Kon)を測定する。CXCR4結合ポリペプチドのこれらの定数は、放射性標識または蛍光標識したCXCR4の結合アッセイによって測定することができる。このアッセイでは、CXCR4陽性脂質粒子の濃度でCXCR4結合ポリペプチドが平衡化する。結合していないCXCR4を洗浄により除去した後、CXCR4結合ポリペプチドの量を測定する。別の例によれば、定数は、CXCR4陽性脂質粒子を固定化した表面プラズモン共鳴分析、例えばBIAcore表面プラズモン共鳴(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)を使用して測定する(WO2005/042695)。
アゴニストまたはSDF-1などのリガンドがCXCR4に結合すると、このGタンパク質共役受容体によるシグナル伝達及びGタンパク質の活性、ならびに他の細胞内シグナル伝達分子の刺激が生じ得る。本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドの抑制性活性または刺激性活性を、リガンドあり、またはなしで、好適なアッセイで測定することができ、ならびにリガンドの存在下または非存在下で活性を阻害または刺激するCXCR4結合分子またはポリペプチドの能力を評価することができる。
本発明のポリペプチドによるGPCRの活性は、蛍光色素を有する細胞内cAMPの増減を測定することによりモニターすることができる。細胞内cAMPの測定方法は、当技術分野において既知である。cAMPの細胞レベルを測定するアッセイは、GαsまたはGαi/oタンパク質へのGPCRの結合によって調節されるアデニル酸シクラーゼの活性に依存する。アデニル酸シクラーゼは、フォルスコリンによる前刺激を必要とする。加えて、ホスホジエステラーゼ(PDE)酵素による、cAMPのAMPへの自然分解を抑制するため、アッセイ中の系の最適化に、PDE(例えばIBMX)の阻害剤が必要な場合がある。有用な膜透過性色素の例としては、細胞内エステラーゼによって切断されて遊離酸を形成できるアセトキシメチルエステル形態の色素が挙げられる。遊離酸はもはや膜透過性がなく、細胞内に捕捉されたままである。また、GPCRによるアデニル酸シクラーゼ活性の調節によって生成されるcAMPのレベルを直接測定するように設計されたアッセイを用いることもできる。このようなアッセイは、内因性のcAMPと外因的に添加されたビオチン化cAMPとの競合に基づく。cAMPの捕捉は、固体材料、例えば捕捉ビーズにコンジュゲートされた特異抗体を用いて行う。
β-アレスチンは、GPCRの活性化後、細胞表面に動員される細胞内タンパク質である。これはGタンパク質共役受容体(GPCR)の活性を調節する(Luttrell et al.(2002)Journal of Cell Science,115:455-465)。この場合、本発明のポリペプチドにより、内在化する受容体の脱感作と標的化を引き起こす。β-アレスチンは、受容体脱感作、Gタンパク質結合シグナル伝達の終結、及び内在化における役割に加え、足場タンパク質として作用し、活性化したGPCRを付加的な細胞内シグナル伝達経路、例えばc-Src、ERK 1/2及びAktなどのGタンパク質に依存しない活性化に連結する。β-アレスチンの動員を測定するにはいくつかの方法を利用することができる。例えば、TransFluor(登録商標)アッセイ(Molecular Devices)では、β-アレスチンをGFPと結合し、受容体が活性化すると、GFPの変化が細胞質分配を拡散させ、ハイコンテントイメージングシステムによって可視化されるピットまたは小胞を含有するGFPを形成する。
本発明のポリペプチドによるGPCR活性は、蛍光色素を用いて細胞内カルシウムの増減を測定することによりモニターすることができる。Ca2+アッセイは、細胞透過性Ca2+-感受性蛍光色素(例えばFluo-3及びFluo-4)及び自動化リアルタイム蛍光プレートリーダー、例えばFLIPR(商標)(Molecular Device)が利用可能になったことで、GPCRスクリーニングにおいて非常に普及している。Molecular Deviceはまた、独自の消光分子が含まれた蛍光色素キットも提供しており、これは細胞内に色素がロードされた後、過剰な色素を除去するために細胞を洗浄する必要がない。FLIPR(商標)の統合型注入機能により、アゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレーターの全てを1回のアッセイで検出できる、384-ウェルまたは1536-ウェル形式の超ハイスループットスクリーニングが可能である。蛍光色素を使用する代わりに、Ca2+-感受性バイオセンサーを使用することもできる。GPCRの機能的スクリーニングに向け、セレンテラジン誘導体の存在下で、高い細胞内Ca2+に応答して強度の発光シグナルを発生させるクラゲ発光タンパク質エクオリンの組換え発現も開発されている(Eglen RM et al(2008)Assay Drug Dev Technol 6:659-71)。
走化性アッセイを使用して、本発明のCXCR4結合ポリペプチドの、CXCR4に対するリガンドの結合を遮断する能力及び/または受容体へのリガンドの結合と関連した機能を阻害する能力を評価することもできる(Fernandis et al.(2004)Oncogene 23:157-167)。このアッセイは、化合物(化学誘引物質)によって誘導される、in vitroまたはin vivoでの細胞の機能的遊走に基づく。走化性は、任意の好適な手段、例えば、96ウェル走化性プレートを利用したアッセイ、または走化性を評価する当技術分野で認識された他の方法によって評価することができる。一例では、走化性アッセイを利用して、Jurkat細胞、MDA-MB-231、MDA-MB-468、PC3またはNCI-H69細胞の遊走を評価することができる。例えば、Jurkat細胞(200mlのRPMI-1640中に5x105細胞)を本発明のポリペプチド及びSDF-1を加えて、及び加えずにプレインキュベートし、0.25%のBSAを入れた直径6.5mm、5mM孔ポリカーボネートのTranswell培養インサート(Costar、Cambridge,MA)の上部ウェルに添加する。SDF-1(固定濃度)を下部ウェルに添加して、細胞を37℃で4時間インキュベートし、遊走させる。下部チャンバ内の遊走細胞は、ZM Coulterカウンター(Coulter Diagnostics、Hialeah,FL)を用いて計数する。
本開示のCXCR4結合ポリペプチドが、腫瘍細胞(例えば、MDA-MB-231、MDA-MB-361、MDA-MB-549、Ramos、Namalwa、MOLT-4、DU-4475、DU-145、PC3、LNcaP、SW480、HT29、NCI-H69及びHL60などの、CXCR4を表面に発現する腫瘍細胞)、またはCXCR4を発現するように操作された細胞株において細胞増殖を阻害する能力を評価することができる。また、本開示のCXCR4結合ポリペプチドが、CD34+前駆細胞の細胞増殖を阻害する能力を評価することもできる(例えば、Kahn et al.Overexpression of CXCR4 on human CD34+ progenitors increases their proliferation,migration,and NOD/SCID repopulation((2004)Blood.103:2942-2949)。細胞増殖アッセイは当業者に既知であろう。細胞増殖アッセイの例としては、例えばWO01/081614及びUS5972639に記載されている、MTT細胞増殖アッセイ(ATCC)、CellTiter Aqueous細胞増殖アッセイ(Promega)、alamarBlueアッセイ(Invitrogen)、CyQUANT Direct細胞増殖アッセイ(Life Technologies)が挙げられる。
本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドが、アポトーシスを誘導する能力を評価することができる。当業者に既知である種々の形式のアポトーシスアッセイが利用可能である。以下はその例である:
(i)カスパーゼアッセイ、例えばPhiPhiLux(登録商標)(OncoImmunin,Inc)、カスパーゼ3活性アッセイ(Roche Applied Science)、caspase-Glo(商標)アッセイ(Promega)、CaspACE(商標)アッセイシステム(Promega)、EnzChek(登録商標)カスパーゼ-3アッセイキット(Invitrogen)、活性カスパーゼ-3検出キット(Stratagene)、カスパーゼ媒介性アポトーシス製品(BioVision)、CasPASE(商標)アポトーシスアッセイキット(Genentech);
(ii)Tunnel及びDNA断片アッセイ、例えばApoptotic DNA Ladder Kit(Roche Applied Science)、細胞DNA断片ELISA(Roche Applied Science)、DeadEnd(商標)TUNELシステム(Promega)、APO-BrdU(商標)TUNELアッセイキット(Invitrogen)、TUNELアポトーシス検出キット(Upstate)、Apoptosis Mebstainキット(Bechman Coulter))、核媒介性アポトーシスキット(BioVision)、アポトティックDNAラダーキット(Genentech);
(iii)細胞透過性アッセイ、例えばAPOPercentage(商標)アッセイ(Biocolor Assays);
(iv)アネキシンVアッセイ、例えばアネキシンVであるAlexa Fluor(登録商標)(Invitrogen)、Rhodamine 110、すなわちビス-(L-アスパラギン酸アミド)、トリフルオロ酢酸塩(Invitrogen)、アネキシンVアポトーシスキット(BioVision);
(v)タンパク質切断アッセイ、例えば抗ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ(Roche Applied Science)、M30 CytoDEATH(Roche Applied Science);
(vi)ミトコンドリア及びATP/ADPアッセイ、例えばApoGlow(登録商標)アポトーシススクリーニングキット、ミトコンドリア膜電位検出キット(Stratagene)及びミトコンドリア媒介性アポトーシス製品(BioVision);ならびに
(vii)本明細書に開示された例に記載される、アネキシンVとヨウ化プロピジウムの併用。
血管形成は、内皮細胞遊走、浸潤及び毛細管への分化を含む多くの細胞事象を特徴とする。in vitro内皮管形成アッセイは、内皮分化と、抗血管形成薬による内皮管形成の調節を試験するためのモデルとして使用される(例えば、Sharon McGonigle and Victor Shifrin Current Protocols in Pharmacology DOI:10.1002/0471141755.ph1212s43、またはLiang et al,(2007)Biochem Biophys Res Commun.August 3;359(3):716-722を参照)。典型的な内皮管形成アッセイは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、HMVEC及びHMEC-1細胞を使用して行う。1%のFBSと200ng/mlのCXCL12を加えたM199培地のマトリゲル層に1x105細胞/mlの密度で細胞を播種する。18時間後、ウェルを4倍率で撮影し、ウェルの脈管網の数を計数する。
CXCR4は、CXCR7、CCR5、β2AR(β2アドレナリン受容体)、CCR2、DOR(デルタオピオイド受容体)及びCCR7と形質膜で相互作用し、CXCR4とのホモ二量体を含む、ヘテロ二量体、オリゴマーまたは更に高次の複合体を形成する。GPRCヘテロ二量体を特異的標的とする化合物、または受容体の二量体化に影響を及ぼす化合物は、特異的治療効果を実現する可能性を有し得る(Rozenfeld R et al(2011)Biochem J 433:11-8)。受容体の二量体化をモニターするために、共鳴エネルギー移動法(FRETまたはBRET)を含む、種々の技術が確立されている。
競合試験を使用して、リガンドSDF-1またはポリペプチド(i-body)を含むCXCR4結合分子がCXCR4への結合を競合する能力を決定することができる。通常、一定濃度のSDF-1またはFITC標識ヒト抗CXCR4抗体(例えば12G5)の存在下で、例えば100nm~5pMの濃度範囲になるように、CXCR4 i-bodyを連続した1:3階段希釈で滴定する。次に、その混合物をCXCR4発現細胞に添加し、結合させる。各i-bodyが、CXCR4発現細胞への結合を12G5と競合する能力は、蛍光サイトメトリー及びFITCの検出によって評価することができる。
本開示の一例では、CXCR4またはそれが発現する細胞、または膜内にCXCR4を含んでいる脂質粒子の存在を検出する。タンパク質または細胞の量、レベルまたは存在は、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学染色、免疫蛍光法、免疫ブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射性免疫アッセイ(RIA)、酵素免疫アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動法(FRET)、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型法(MALDI-TOF)、エレクトロスプレーイオン化法(ESI)、質量分析法(タンデム型質量分析法、例えばLC MS/MSを含む)、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバーオプティックス技術またはタンパク質チップ技術からなる群から選択される技術などの当事者に既知である種々の技術のいずれかを使用して決定される。
上記から当業者には明らかであるが、本開示はまた、本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドを使用したイメージング方法も企図する。イメージングでは、一般にCXCR4結合分子またはポリペプチドを検出可能標識とコンジュゲートするが、この標識は、イメージングによって検出可能であるシグナルを発することができる何らかの分子または薬剤であり得る。ただし、本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドと特異的に結合する第2の標識化合物もまた使用することができる。例示的な検出可能標識としては、タンパク質、放射性同位体、蛍光団、可視光発光蛍光団、赤外発光蛍光団、金属、強磁性体、電磁放射体、特定の磁気共鳴(MR)分光学的特徴を有する物質、X線吸収もしくは反射物質、または音響変化物質が挙げられる。
本開示の方法が、in vivoに基づくスクリーニングとしてではなく、単離した組織サンプルに対してin vitroで実施される場合に限り、「サンプル」は、対象由来の生体物質のあらゆるサンプル、例えばこれに限定されないが、体液(例えば、血液または滑液または脳脊髄液)、細胞物質(例えば組織吸引物)、組織生検標本または外科的標本などを意味すると理解すべきである。
本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチド(活性成分と同義)は、非経口、外用、経口、もしくは局所投与、エアロゾル投与、または経皮投与用の医薬組成物、予防的治療用の医薬組成物、または治療的処置用の医薬組成物に製剤化するのに有用である。医薬組成物は、投与方法に応じて種々の単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形として、粉末、錠剤、丸薬、カプセル剤及びトローチ剤が挙げられる。
本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドは、CXCR4関連の疾患及び障害の診断及び治療を含む、多数のin vitro及びin vivoの診断及び治療有用性を有する。例えば、この分子を、培養中、in vitro、もしくはex vivoの細胞に、またはヒト対象(例えばin vivo)に投与して、種々の障害を治療、予防及び診断することができる。好適な対象は、CXCR4活性によって媒介される、もしくは調節される障害、またはCXCR4/SDF-1経路と関連する障害を有するヒト対象を含む。CXCR4結合ポリペプチドを他の薬剤とともに投与する場合、2つを順にまたは同時に投与することができる。本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドがCXCR4に対して特異的結合する場合、これを用いて、細胞表面でのCXCR4発現を特異的に検出することができ、更にこれを用いて免疫アフィニティ精製によりCXCR4陽性細胞を精製することができる。
本明細書では、CXCR4関連の疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。この方法には、治療有効量のCXCR4結合分子またはポリペプチド及び別の治療薬を投与することを含む。
種々のサイトカイン、ケモカイン及び接着分子は、CXCR4とSDF-1の相互作用を含む、CD34+幹細胞の動員の調節(Gazitt,Y.(2001).J Hematother.Stem Cell Res.10:229-236に概説)に関与している。更に、小分子CXCR4アンタゴニストは、骨髄から末梢へのCD34+幹細胞の迅速な動員を刺激することが示されている(例えば、Devine,S M et al.(2004)J.Clin.Oncol 22 1095-1 102;Broxmeyer,H E et al.(2005) J.Exp.Med 201:1307-1318,Flomenberg,N et al(2005)Blood 106:1867-1874を参照)。
損傷への反応には、ホメオスタシスを維持するだけでなく、組織修復も誘導するように設計された適応機構の活性化を伴う。この再生修復のための潜在能力は、以下の肝臓切除または急性尿細管壊死などの、ある特定の状況にあるヒトにおいて顕在化する。しかしながら、慢性損傷または反復損傷が認められる場合、反応の大部分が、障害を受けた実質細胞の再生と、関連する大量のECMの産生との連係を伴い、最終的に結合組織による瘢痕の形成に至る。この結合組織による修復は、例えば、皮膚損傷後の器官完全性の保持を助けることは明らかだが、心臓、腎臓及び肺などの他の臓器でのその存在は不利益である場合が多い(Wynn et al Nat Med(2012)18:1028-1040)。
特発性肺胞線維症(IPF)は、肺の瘢痕及び線維症を特徴とし、最終的には末期呼吸機能不全に至る間質性炎症性疾患である。最近の研究では、CXCR4を発現する循環線維芽細胞が肺線維症の病因に関与するという証拠が提示されている(Phillips et al J Clin Invest(2004)114:438-446.)。上記及び他の最近の研究は、この線維芽細胞でのCXCR4の活性を阻害することが、肺疾患、糖尿病及び心臓血管疾患を伴う線維症を含む、様々な種類の線維症を有する患者の治療に有用な方法であり得ることを示唆している。
後眼部の新しい血管の病理的異常成長は、加齢黄斑変性、増殖性糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症を含む多くの疾患の破壊的悪化による結果である。視力を脅かす進行した加齢黄斑変性(滲出型AMDと呼ばれる)は、85歳以上の全人口のうち5.7%が罹患している。糖尿病性網膜症は、糖尿病で最も恐れられている合併症であり、II型糖尿病を有する患者の約40%、I型糖尿病を有する患者の約86%が罹患している(Cheung et al Lancet 2010;376:124-36)。未熟児網膜症と呼ばれる、もう一つの網膜血管疾患は、早産の破壊的悪化による結果であり、未だに西側諸国の小児失明の主因である。このような病態に共通する特徴は、血管の異常成長と、それに続く瘢痕形成であり、これが失明に至る決定的な事象となる。このような疾患による失明を回避するために、網膜血管の異常成長ならびにそれに続く瘢痕の両方を標的とする治療が必要とされている。
Zerneckeら(Zernecke et al(2008)Circulation Research 102:09-217)は、CXCL12/CXCR4軸がアテローム性動脈硬化症を防止すること、またこの防止効果が骨髄性細胞ホメオスタシスの制御によるという証拠を示している。この研究は、小分子アンタゴニストAMD3465によるCXCR4の長期的阻害が、2種類の異なるマウス株(Apoe-/-マウス及びLdlr-/-)の食餌誘発性アテローム硬化性病変の発現を悪化させたことを示している。AMD3465によるCXCR4の拮抗作用は、骨髄からの好中球の放出に対してAMD3100よりも10倍効果的であることが示されている(Hatse et al.Biochem Pharmacol.2005;70:752-761)。Zerneckeらはまた、AMD3465による持続的な治療が骨髄性好中球の拡大と、単球のわずかな増加をもたらし、骨髄リンパ球の減少と相関性が見られることを実証した。その結論によると、「CXCR4アンタゴニストは造血細胞を動員することができるが、斑安定化前駆体サブセットの動員を阻害する場合があり、それによってアテローム性動脈硬化症を促進し得るため、治療を試みる場合は注意を要すると思われる」。したがって、造血細胞を動員する能力を欠く薬剤は、アテローム性動脈硬化の治療に有用であり得る。本発明のCXCR4結合分子またはポリペプチドは、抗アテローム性効果を及ぼすと同時に、幹細胞の動員を増加させない能力を有する。
Zuk et al(2014)Am J Physiol Renal Physiol Oct1;307(7):F783-97による研究は、CXCR4の阻害が、造血幹細胞またはその動員に対する何らかの効果によってではなく、白血球浸潤及び炎症誘発性サイトカインの発現を阻害することによって、急性腎臓損傷を改善するという説得力のある証拠を示している。したがって、本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドは、腎臓疾患の治療に有用であり得る。
SDF-1とその受容体であるCXCR4は、血管形成及び瘢痕形成(線維症)に関与している(Ferrara et al Nature 2005;438:967-74)。事実、SDF-1は、滲出型AMD、増殖性糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症を有する患者の硝子体で増加する(Scotti et al Retina 2014;34:1802-10、Butler et al J Clin Invest 2005;115:86-93、Sonmez et al Ophthalmology 2008;115:1065-1070)。その受容体CXCR4は、病理学的に異常な成長をする血管の成長端に局在する。更に、CXCR4の阻害は、脈絡膜新生血管及び未熟児網膜症の齧歯目モデルでの血管の異常成長を防止することが示されている(Lima e Silva et al FASEB J 2007;21:3219-30)。別の調査は、循環線維芽細胞が増殖性硝子体網膜症(PVR)膜の筋線維芽細胞の前駆体として機能できることを示している。PVR網膜上膜にはCXCL12及びCXCR4を発現する多数の細胞が存在した。このことは、CXCL12/CXCR4ケモカイン軸が優勢であると、PVRを有する患者の眼に線維芽細胞が動員されることが明らかであることを示唆していた(Abu El-Asar et al Br J Ophthalmol 2008;92:699-704)。
本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドの炎症阻害能を、炎症性マウスモデルで検討することができる。これらのモデルには、Liang Zhongxing et al(2012)PLoS ONE 7(4):e34038.doi:10.1371に記載されている、マウスの実験的大腸炎モデル、カラギーナン誘発足浮腫モデル、及びブレオマイシン誘発肺線維症モデルが含まれる。
本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドの線維症阻害能を、ブレオマイシン齧歯類モデルで検討することができる。特発性肺線維症(IPF)の模倣に頻繁に使用される齧歯類のブレオマイシンモデルにおいて、血清及び気管支肺胞洗浄流体中のSDF-1レベルが増加している。更に、CXCR4及び小分子CXCR4アンタゴニスト(AMD3100)に対する中和抗体は、肺好酸球増多症を低減することが見出された。これは、CXCR4を介したシグナルがアレルギー性気道疾患のマウスモデルの肺炎症に関与することを示している(Gonzalo et al J Immunol.2000;165:499-508、Lukacs et al Am J Pathol.2002;160:1353-60)。このデータは、CXCR4が再上皮形成よりも線維症を促進する上で顕著な役割を有することを明確に示している。本発明のCXCR4結合分子またはポリペプチドを、抗線維化薬として使用することができる。
本開示のCXCR4結合分子またはポリペプチドの転移阻害能を、マウスモデルで検討することができる。これらのモデルには、Liang Zhongxing et al(2012)PLoS ONE 7(4):e34038.doi:10.1371に記載されている、乳癌モデル(MDA-MB-231細胞の投与による)、頭頸部癌動物モデル(686LN-Ms細胞の投与による)、及びブドウ膜黒色腫微小転移モデルが含まれる。
CXCR4結合分子の血管形成阻害能を、マウスモデルで検討することができる。これらのモデルは、Liang et al,(2007)Biochem Biophys Res Commun.August 3;359(3):716-722に記載されており、ここではMDA-MB-231細胞をヌードマウスの側腹部に皮下移植する。
いくつかの例では、CXCR4結合分子またはポリペプチドを、キットまたは医薬パッケージで提供してもよい。
Biacoreアッセイ
(図2、5、11、17)選択したi-bodyと固定化されたCXCR4脂質粒子との結合の速度論解析を、Biacore T200装置(GE Healthcare、Uppsala,Sweden)を使用して25℃で実施した。ストレプトアビジンの固定化は、1xHBS-P+ランニングバッファー(10mMのHEPES、150mMのNaCl、0.05%[v/v]のTween-20)中で実施した。アミンカップリングキット(GE Healthcare)とその説明書を利用して、ストレプトアビジン(Sigma;10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5で100μg/mLに希釈)を、センサーチップ面上の4つ全ての経路に同時に付着させ、6,000RU未満のストレプトアビジンを結合させた(1RU=1pgタンパク質/mm2)。脂質粒子を伴う結合実験は全て、計測用のランニングバッファーとして1xHBS/BSA(10mMのHEPES、150mMのNaCl、1mg/mLのBSA)を用いて実施した。ビオチン化CXCR4脂質粒子(WO2005/042695に記載されている、Integral Molecular、カタログ番号LEV-101B;3.6U/mL)は通常、ランニングバッファーで20分の1に希釈し、2,500RU超の捕捉反応レベルになるように、1,800秒間に2μL/mLで注入することにより、ストレプトアビジンを含む経路に固定化した。オフターゲット対照として使用するビオチン化CCR5及び無効な脂質粒子を同様の方法で固定した。結合速度論を決定するために、1xHBS/BSAで希釈したi-bodyの段階希釈液(3倍)を固定化された脂質粒子上に注入し、会合相と解離相をそれぞれ60秒及び600秒間モニターした。二重参照目的で、計測用のランニングバッファー(「ゼロバッファー」ブランク)溶液も含めた。収集した実験データは、Scrubberソフトウェア(www.biologic.com.au)を使用して処理した。速度論パラメーター(ka=会合速度定数及びkd=解離速度定数)、及び平衡解離定数(KD=kd/ka)は、各組の実験データをLangmuir1:1結合モデルにフィッティングさせることにより導出した。全ての相互作用測定を3重に実施し、得られた結合パラメーターを平均値±標準偏差として報告した。
(図3及び14)本試験ではBRETを使用して、以前に検証したBRETを利用したGPCR/β-アレスチン相互作用のモニタリングに基づいて、結果として生じる何らかの近接の増加から、リアルタイム速度論プロファイルを評価した。BRETは、ドナーである相補的レニラルシフェラーゼ(Rluc)変異体とアクセプターである緑色蛍光タンパク質変異体との間に発生する。セレンテラジン基質(第一世代BRET(BRET)用のセレンテラジンhまたは拡張BRET(eBRET)用のEnduRenなど)のRluc触媒酸化によって、10nm以内にある場合、エネルギーがアクセプターへ移動し、その結果アクセプターの発光ピークが特徴的波長となる。BRET β-アレスチンアッセイを前述のように実施した(H.B.,Seeber,R.M.,Kocan,M.,Eidne,K.A.and Pfleger,K.D.(2011)‘Application of G protein-coupled receptor-heteromer identification technology to monitor beta-arrestin recruitment to G protein-coupled receptor heteromers’,Assay Drug Dev Technol,9(1),21-30,10.1089/adt.2010.0336を参照)。CXCR4/Rluc8のcDNA構築物は、Aron Chakera(Oxford University,United Kingdom)から寄贈された、Rlucで標識した対応する受容体cDNAを含むプラスミドから生成した。β-アレスチン2/VenusのcDNA構築物は、Atsushi Miyawaki(RIKEN Brain Science Institute,Wako-city,Japan)から寄贈されたpCS2-Venusから事前に調製した。100nMのSDF-1アゴニストの存在下でCXCR4/Rluc8及びβ-アレスチン2/Venusを一過性発現する細胞のBRET技術を、CXCR4アゴニストのSDF-1/CXCL12及びi-bodyの存在下で評価した。10%のウシ胎仔血清(FCS)及び400mg/mLのジェネテシン(Gibco)を補充した完全培地(0.3mg/mLのグルタミン、100IU/mLのペニシリン及び100mg/mLのストレプトマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地;Gibco)中に、HEK293FT細胞を、37℃、5%のCO2で保持した。製造業者の指示に従ってGenejuice(Novagen)を使用し、播種後24時間、トランスフェクションを実施した。0.05%のトリプシン-EDTA(Gibco)を用いて細胞を採取した。FuGene6(Promega)を使用してHEK293FT細胞をトランスフェクトした。HBSS中の5μMのセレンテラジンh(Promega)をルシフェラーゼ基質溶液として使用した。5%のFCSを含有する、HEPES緩衝系フェノールレッドを含まない完全培地中に、トランスフェクションの24時間後に細胞を播種し、ポリ-L-リジンをコーティングした白色96ウェルプレート(Nunc)に添加した。BRETを使用して用量反応曲線を生成し、プレート中の培地を5mMのセレンテラジンh(Molecular Probes)を含有するPBSに置き換えて、直ちにアッセイを実施した。このアッセイでは、トランスフェクションの48時間後、基質平衡に確実に達するようにプレートを30mMのEnduRen(Promega)とともに37℃、5%のCO2で2時間インキュベートした。全てのBRET測定は、Wallac 1420ソフトウェア搭載VICTOR Lightプレートリーダー(PerkinElmer)を使用して、37℃で取得した。フィルター処理した発光を、400~475及び520~540nmで順次測定した。ビヒクル処理した細胞サンプルの、400~475nmの発光に対する520~540nmの発光の比率を、様々な濃度のアゴニスト(この場合、SDF-1またはCXCL12の存在下)及びi-body(ADCX-99、ADCX-272、ACDX-6、ACDX-306、ADCX-668)で処理した同じ細胞の第2のアリコートでの同様の比率から減算することにより、BRETシグナルを算出した。データは、2重に実施された4回の独立実験の平均±S.E.M.である。
サメIgNAR抗体構造から得た原則は、免疫グロブリンスーパーファミリーのヒトIセット領域の結合レパートリー生成に問題なく適用することができる。これについてはWO2005/118629に詳細に記載されている。サメIgNAR抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリーのIセットドメイン、例えばNCAMのドメイン1と構造的に近似する。修飾したNCAMドメイン1をi-body足場と呼ぶ。この足場を用いて、ポリペプチドのライブラリを作成してファージ上に提示させ、特定の標的と対照して、その標的に対する特異的結合物質をスクリーニングする。このようなライブラリは、主にCDR1及びCDR3の類似領域に変異性を含むことが予想される。
LQVDIVPSQGEISVGESKFFLCQVAGDAKDKDISWFSPNGEKLTPNQQRISVVWNDDSSSTLTIYNANIDDAGIYKCVVTGSDAMSNYSYPISESEATVNVKIFQ(配列番号82)
2.1 E.coliにおけるi-bodyの発現及び精製
E.coli発現系を使用してi-bodyを発現させ、精製した。E.coli免疫タンパク質(Im7)FLAG及び6xHISを含む種々の親和性タグ(図4でIm7-FHと称する)を付けてi-bodyを発現させた。それぞれ抗FLAG樹脂またはNi-NTA樹脂を用いた各種のタグを利用して、i-bodyを周辺質分画及び細胞質から精製した。サイズ排除クロマトグラフィーの結果を図4に示す。
i-bodyの遺伝子をPichia発現ベクターにクローニングした。クローン選択の一部最適化後のタンパク質力価は、小規模(2mlスケール)で3~9mg/Lの範囲であった。発酵スケールでは、収率は26~150mg/Lであった。更なるパラメーター(例えば温度、pH、供給速度及び供給手法)を発酵レベルで最適化すると、収率を改善することができた。大規模な発現及び精製後、i-bodyをSDS-PAGEによって特性決定した。i-bodyはサイズに応じて移動するとき、本質的に無傷であることが示された(図示せず)。
BIAcoreアッセイにおいて、i-body ADCX-99は固定化されたCXCR4陽性脂質粒子(A)と結合することが示されたが、無効な脂質粒子(B)に対して、またはGPCR CCR5(C)に対して陽性であった脂質粒子に対しては、ごくわずかな結合性しか示さなかった。これは、i-body ADCX-99がCXCR4に対して特異的であることを示す(図5)。
i-body ADCX-99を、エラープローンPCRを使用して親和性成熟した。これは2種類の方法、すなわちCDR1及びCDR3を対象としたランダムな突然変異のライブラリを作成する方法、または配列内のいずれかの場所に平均2~3のヌクレオチド突然変異を使用する方法のいずれかで実施した。ライブラリは、Henderson et al.(2007)Structure 15:1452-66に従ってパンニングした。この手法を用いて、i-body ADCX-99のCDR1及び/またはCDR3領域を修飾し、親和性または発現を改善した突然変異体のライブラリを作成した。
親和性成熟させたADCX-99の90のランダムな突然変異体i-bodyを96ウェルプレート中で培養した。周辺質分画の分析はタンパク質の発現を示し、親和性レベルは突然変異体クローン間で有意に変化した。ADCX-99と比較して、いくつかの突然変異体クローンは、野生型ADCX-99 i-bodyよりも良好な発現因子であった(図6)。
ADCX-99のCDR1内において28位でG>Kへのアミノ酸置換が、31位でI>Fへのアミノ酸置換が行われ(図1DにそれぞれX1及びX3で指定)、ADCX-99配列のCDR3内において89位でA>Yへのアミノ酸置換(図1DにY4で指定)が行われた場合、10mg/Lから14mg/Lへの発現の改善が観察された。これをAM4-661に対応する配列で表す。ADXC-99に対するAM4-661のアライメントを図10Aに示す。
4.1 CXCR4及びヒト血清アルブミンに対する二重特異性
18残基のヒト血清アルブミン(HAS)結合ペプチド(N末端)-RLIEDICLPRWGCLWEDD-(C末端)(US20100104588;Dennis MS et al(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043に記載)をAM3-114のC末端にコンジュゲートしてAM3-114-Im7-SA21(配列番号80)を生成することにより、二重特異性i-bodyを作製した。Im7タンパク質は、コンジュゲートの検出を容易にするために使用した。
i-body分子の流体力学的半径を増加させ、それによって腎排泄及び肝排泄を低減するため(Konterman et al 2011 Curr Opin Biotech 22:868-8760)、AM3-114-Im7-FH及びAM4-746-Im7-FH[Im7-FHはN末端の溶解性精製タグに対応し、Im7はE.coliタンパク質(Hosse RJ et al(2009)Anal Biochem 15;385(2):346-57)、FHはflag+6Hisである]を、部位特異的コンジュゲート手法(HiPEG(商標)technology,PolyTherics,UK)を利用して30Kの直鎖PEGまたは2x20Kの分岐PEGにコンジュゲートした。
マウスの前臨床薬物動態学的試験において、PEG化材料(AM3-114-30K PEG、AM3-114-2x20K PEG、AM4-746-2x20K PEG)と1つのHSAペプチドのコンジュゲート(AM3-114-Im7-FH-SA21)を、対照i-bodyであるADCX99-9H(ヒスチジン9個のタグ)及びAM3-114-Im7-FH(Im7タンパク質とFLAG+6 Hisタグの両方を含む)と比較して評価した。試験品目を、以下の表4に記載するように、マウス群に1回ずつ静脈内注射投与により投与した。
PEG化に代わるものとして、発明者らは、i-bodyのin vivo半減期を延長するためにi-bodyへ約400残基の擬似反復配列を付加し、それに続いて精製/検出のためのC末端Hisタグを利用するXTEN方法の有用性を検討した。XTEN配列は本質的に非構造的に操作されるため、非免疫原性であり、また高親水性でもあるため、必然的に発現/精製/下流応用時にi-bodyの溶解性及び安定性を与える効果がある(Schellenberger et al,(2009)Nature Biotech;27(12):1186-1190)。
i-bodyの半減期を延長するもう一つの方法は、PAS化技術を使用することである。小アミノ酸のプロリン、アラニン及び/またはセリン(「PAS」)の数百個の残基からなるポリペプチド配列とi-bodyを遺伝的に融合する。このPAS配列、特にPAS(400)及びPAS(600)は水溶液中でランダムコイル構造を採ることにより大きな流体力学的容積を生成し、血中でのタンパク質の半減期の延長を可能にする。この配列と融合されたタンパク質はまた、免疫原性及び毒性が極めて低いことも報告されている(Schlapschy et al.Protein Eng Des Sel(2013)26:489)。この配列を標的タンパク質と融合すると、マウス体内での半減期を延長し、また標的タンパク質のドラッグライク特性を向上させることが示されている。
5.1 CXCR4トランスフェクト細胞でのcAMPの調節
DiscoveRxは、cAMP経由でシグナル伝達する未標識GPCRを安定的に発現する細胞株のパネルを開発した。Hit Hunter(登録商標)cAMPアッセイは、抑制調節性Gタンパク質(Gi)及び刺激調節性Gタンパク質(Gs)の二次メッセンジャーシグナル伝達を介したGPCRの活性化を、DiscoveRxが開発したEnzyme Fragment Complementation(EFC)と呼ばれる技術と機能的レポーターとしてのβ-ガラクトシターゼ(β-Gal)を使用して均質な非イメージングアッセイ形式でモニターする。酵素は、酵素アクセプターであるEAと酵素ドナーであるEDという2つの相補的部分に分かれている。EDはcAMPと融合されており、アッセイにおいてcAMP特異抗体との結合を、細胞が産生するcAMPと競合する。外部からのEAと、いずれかの結合していないED-cAMPとの相補性によって活性型β-Galが形成される。次いで活性酵素により化学発光基質が変換され、生じた出力シグナルを標準的なマイクロプレートリーダーで検出することができる。
細胞処理
cAMP Hunterの細胞株を、標準的手順に従って凍結貯蔵株から復元した。次に総容積20μLの細胞を、白壁の384ウェルマイクロプレートに播種し、試験までの適切な時間、37℃でインキュベートした。製造業者の指示に従ってDiscoveRx HitHunter cAMP XS+アッセイを使用してcAMPの変化を測定した。
アンタゴニストを決定するため、CXCR4を発現するHunter細胞をサンプルとともにプレインキュベートし、続いてEC80濃度のアゴニストを負荷した。(Gi cAMPアッセイの場合、濃度15μMのフォルスコリンを使用した)。培地を細胞から吸引し、10μLの1:1のHBSS/Hepes:cAMP XS+Ab試薬と交換した。CXCR4に対する、5μLの4倍原液のAMD3100またはi-bodyを細胞に添加し、37℃または室温にて30分間インキュベートした。5μLの4倍EC80アゴニストSDF-1を細胞に添加して、37℃または室温にて30または60分間インキュベートした。GiとGPCRの結合には、EC80フォルスコリンを加えた(濃度15μMのフォルスコリンを使用した)。
適切な化合物をインキュベートした後、20μLのcAMP XS+ED/CL細胞溶解混合液を加えて1時間インキュベートした後、20μLのcAMP XS+EA試薬を加えて室温で3時間インキュベートしてアッセイシグナルを生成した。化学発光シグナルを検出するためのPerkinElmer Envision(商標)装置を用いてシグナルを生成してマイクロプレートを読み取った。
次に、対照i-body(21H5)、AMD3100及びi-bodyのAM3-114、AM4-272、AM3-523、AM4-746、AM4-1121(IC50)によるcAMPの阻害を測定した。データを表7及び図13に示す。CXCR4のようなケモカイン受容体は主にGαi結合型であり、したがって二次メッセンジャーcAMPを経由したシグナルである。サイクリックAMP(cAMP)の調節は、SDF-1と種々の細胞シグナル伝達間の相互作用にとって重要であり得る。in vitroでcAMPレベルを調節する能力について、CXCR4 i-bodyのパネルを調べた。前述のアンタゴニストAMD3100は、615nMの推定IC50でcAMPを用量依存的に阻害する効果を示した。i-bodyは、各細胞においてSDF-1誘発性のcAMPの減少を妨げる上で非常に効果的であった。実際、どのi-bodyもAMD3100より低いIC50値を有した。IC50の結果に基づくと、CXCR4結合i-body、AM3-114は、cAMPの強力な阻害剤である。
CXCR4トランスフェクト細胞をi-bodyまたはAMD3100で30分間処理し、次いで100ng/mlのSDF-1で30分間刺激した。その後、対照またはi-body(IC50)によるCa2+流入の阻害を測定した。
細胞
ヒトCXCR4受容体を安定発現する哺乳動物細胞を、Multispan,Inc(カタログ番号C1004-1)によって内部で作製した。使用する対照アゴニストはSDF-1(Peprotech、カタログ番号300-28A)であった。
40uMまたは10mMの7つの化合物/i-body(21H5、AM3-114、AM4-272、AM3-523、AM4-746、AM4-1121及びAMD3100)を液体形態にて試験した。AMD3100(別名プレリキサフォルまたはモゾビル)は、CXCR4の小分子アンタゴニストであり、市販されている。これを陽性対照として使用した。
Screen Quest(商標)Fluo-8 No Washキット(AAT Bioquest、カタログ番号36315)
FLIPR 384(分子デバイス)
カルシウムアッセイ
細胞を適切な濃度で384ウェルプレートに播種し、一晩培養した。カルシウムアッセイを製造業者のプロトコルに従って実施した。カルシウム色素を負荷した緩衝液を細胞に添加して、37℃で1時間インキュベートした。化合物を19秒間隔でウェルに注入しながら、カルシウム流入を120秒間モニターした。アンタゴニストモードでは、担体または化合物を細胞とともに30分間プレインキュベートした後、用量反応曲線から得たEC80濃度の対照アゴニストを加えてカルシウム流入を測定した。データを表8及び図14に示す。カルシウム流入はGq経路によって誘導されるため、この結果は、試験したi-bodyの全てがGq経路を有意に調節しないことを示唆している。したがって、i-bodyはカルシウム流入を調節しない。
例えばHeng B et al(2011)Assay and Drug Development Technologies 9(1):21-30に記載されているβ-アレスチンBRETアッセイで、CXCR4へのi-bodyの結合を調べた。i-bodyがCXCR4活性のアゴニストであるかアンタゴニストであるかを特性決定するため、「ビヒクル」及び「SDF-1+ビヒクル」対照とともに、100nMのSDF-1がある場合とない場合の10種の濃度でi-bodyを調べた。
表面にヒトCXCR4を発現するいずれかの細胞を使用して、本明細書に記載するCXCR4結合分子またはポリペプチド(i-body)がネイティブ細胞表面のCXCR4と結合する能力を調べることができる。そのような細胞株の例としては、ヒトT細胞株、CEMならびに他の細胞株、例えばRamos、Raji、Namalwa、L540、DMS79、MDA-MB-231、MDA-MB-361、MDA-MB-549、MOLT-4、DU-4475、DU-145、PC3、LNcaP、SW480、HT29、NCI-H69及びHL60が挙げられる。
細胞をi-bodyのAM3-114、AM4-272、AM3-523、AM4-746及びAM4-1121(10μM、1μM及び0.001μM)で処理して、染色強度をフローサイトメトリー分析によって評価した。試験した細胞株は、T47D(CXCR4陰性)、MDA-MB-231(CXCR4低発現)、及びNamalwa、NCI-H69、Jurkat、CCRF-CEM、A498、Ramos(CXCR4高発現)であった。
細胞株を採取して、細胞を96ウェル組職培養プレートに移した(2x105細胞/ウェル)。次に、培養プレートを1000rpm、4℃で5分間遠心分離した。試験抗体を含有する100uLのPBS緩衝液で細胞を再懸濁し、4℃で60分間インキュベートした。細胞を300ulの氷冷FACS緩衝液で2回、1000rpmで5分間、洗浄して、(i-bodyに対する)抗His-PE抗体を含有する100ulのPBS緩衝液で再懸濁し、暗所にて4℃で40分間インキュベートした。次に、細胞を300ulの氷冷FACS緩衝液で2回、1000rpmで5分間、洗浄して、細胞を300ulの懸濁緩衝液で再懸濁し、標準方法に従ってFACS分析を施した。
7.1 i-bodyのCXCR4への結合競合性のSPR分析
WO2005/042695に記載されているように、リポタンパク質(IntegraMolecular)を含有するCXCR4を利用して、SDF-1のCXCR4への結合を阻害するi-bodyの能力を決定する競合試験を実施した。
N末端配列EAEAを含むCXCR4 i-body(AM3-114-6H、AM4-272-6H及びAM3-523-6H)の、細胞表面に発現したCXCR4への結合性、及びSDF-1の結合を競合する能力を、フローサイトメトリーを使用して評価した。i-bodyを100μlのFACS緩衝液(1xPBS及び2%のFCS)中のRamos細胞とともに4℃で60分間インキュベートした。2mlの氷冷FACS緩衝液で2回洗浄した後、細胞を1,500rpmで5分間遠心分離して、細胞を抗His-PE抗体(MACS Molecular、注文番号:130-092-691)を含有する100μlのFACS緩衝液で再懸濁し、暗所にて4℃で40分間インキュベートした。このアッセイは堅調であり、これを使用して、i-bodyとSDF-1及び他のアンタゴニストとの競合を検討することができる。この場合、各i-body(0.5μM)は単独でまたは過剰なSDF-1(2μM)、MAb12G5(2μM)及びAMD3100(2μM)の存在下で、細胞とともにインキュベートした。3つ全てのi-bodyの結合性が、2μMのAMD3100の添加時に減少した(図18)。SDF-1は、AM4-272と効果的に競合することが可能であったが、AM3-114及びAM3-523とは部分的にしか競合しなかった。3つ全てのi-bodyがAMD3100と競合した。このことは、i-bodyの結合部位と、この小分子との間に類似性があることを示している。抗CXCR4 MAb 12G5は、ほぼ完全に523の結合性を減少させ、かつAM3-114及びAM4-272の結合を部分的に妨げることが可能であった。
本明細書に開示するCXCR4結合分子またはポリペプチド(i-body)が、SDF-1によって誘導される遊走を阻害する能力を、転移可能性及び転移特性の観点からin vitro及びin vivoの両方で特徴が顕著である乳癌細胞株MDA-MB-468及び前立腺癌細胞株PC3を用いて検討することができる(Kaighn et al 1979 Invest Urol.17(1):16-23.Yoneda et al 2000 Cancer 88:2979-88)。MDA-MB-468細胞は、ヌードマウスの原発性乳房脂肪体腫瘍から肺へ浸潤して転移する。この方法は、Byeong-Chel Lee et al(2004)Mol Cancer Res 2;327に記載されている。簡潔には、フィブロネクチン(50μg/mL)でコーティングしたトランスウェルインサート(Costar Corp.,Cambridge,MA)に細胞を添加する。次に、MDA-MB-468細胞及びPC3細胞を無血清培地中で一晩飢餓状態にした後、抗CXCR4 i-bodyとともにインキュベートし、8μm細孔径のトランスウェルインサートに付着させる。500μLのRPMI 1640中に7x104/mLの最終濃度で、細胞を上部チャンバに懸濁させる。順次希釈した組換えSDF-1を下部チャンバに添加する。3~9時間のインキュベート後、フィルター上面の細胞を綿棒で拭って除去し、下部チャンバの遊走細胞を固定化して、製造業者の指示に従ってHema3キット(Biochemical Sciences Inc.,Swedesboro,NJ)を使用して染色する。次に、4分割した顕微鏡視野の視野ごとに細胞遊出を計数する(Kashima et al Cancer Sci 105(2014)1343-1350;Zhu et al Molecular Cancer Research(2013)11(1)86-94)。
HUVEC中の表面SDF-1またはCXCR4の不活化は、マトリゲルでコーティングした表面に管状構造を配列するHUVECの能力を減衰する。HUVECがマトリゲル依存的な管状構造を形成する能力に対する、本開示のi-bodyの効果を、Liang et al,Biochem Biophys Res Commun.2007 August 3;359(3):716-722に従って試験することができる。毛細管形成アッセイを実行するために、CXCR4 i-bodyアンタゴニストを、それぞれ100nM、5μM及び1μg/ml濃度のヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)とともに室温で10分間プレインキュベートした後、播種した。次に、1%のFBS及び200ng/mlのSDF-1を加えた濃度1x105細胞/mlのM199培地のマトリゲル層上で細胞を播種する。18時間後に、ウェルを4倍率でランダムに5視野撮影し、それらの脈管網の数を計数する。
本明細書に開示するCXCR4分子またはポリペプチド(i-body)が、Ramos腫瘍細胞、すなわち前述のCXCR4を発現するヒトバーキットリンパ腫細胞株のin vitroでの増殖を阻害する能力を、(Lapteva(2005)Cancer Gene Therapy 12,84-89)に記載されているMTT細胞増殖アッセイで検討した。細胞を96ウェル組職培養プレートで成長させ、ビヒクルまたは抗CXCR4 i-bodyで処理した。次に、MTT溶液を加えて細胞を約4時間インキュベートした。このインキュベーション後、非水溶性ホルマザン色素が形成される。可溶化後、走査マルチウェル分光光度計(ELISAリーダー)を使用してホルマザン色素を定量化する。出現した吸光度は、細胞数と直接相関する。
本発明のi-bodyが、Ramos腫瘍細胞(ヒトバーキットリンパ腫細胞株)のアポトーシスを誘導する能力を、Mishra M et al(2011)J Cell Mol Med 15(11):2462-77に記載されている方法によるアポトーシスアッセイで検討した。i-bodyをRamos細胞とともにインキュベートし、24時間または72時間後にフローサイトメトリーによって検討した。アポトーシスの従来的な標識であるアネキシンV及びヨウ化プロピジウムで細胞を染色した。二重陽性であった細胞はアポトーシス化されたと評価した。3種のCXCR4 i-body(AM3-114-6H、AM4-272-6H及びAM3-523-6H)は、強いアポトーシス誘導が可能であった(図19)。未処理の細胞は、細胞が本来は健全であったことを示す陰性対照の役割を担った。タプシガルギンは、定評あるアポトーシス誘導試薬であり、アポトーシスの予測レベルを示す。AMD3100は、Ramos細胞において有意なアポトーシスを誘導しない。このことは、ヒト抗CXCR4 mAb MDX-1338が、Ramos細胞においてアポトーシスを誘導することが可能であったが、AMD3100は誘導しなかったことを示す先の報告と整合性がある(Kuhne et al Clin Cancer Res(2013)19(2):357-66)。
12.1-CCRF-CEM細胞を静脈内注射したSCID/bgマウスの脾臓及び肝臓内の腫瘍のi-bodyによる染色
130μg/mlの抗CXCR4 i-body(AM3-114-6H、AM4-272-6H及びAM3-523-6H)を使用した免疫組織化学染色を、CCRF-CEM細胞を静脈内注射し、27日後に犠牲死させたSCID/bgマウスの脾臓及び肝臓に実施した。組織を10%の中性緩衝ホルマリン中で一晩固定化した後、組織カセットに移して70%のエタノール中に静置した。次に組織をパラフィン包埋した。4μMの切片を収容したスライドを、キシレンを取り替えて5分ずつ2回、続いて100%のエタノールを取り替えて3分ずつ2回、70%のエタノールで2分間、50%のエタノールで2分間、及び蒸留水で5分間インキュベートすることにより、脱パラフィン及び水和した。10mMのクエン酸溶液(pH6.0)中のスライドを80℃のオーブン内で一晩インキュベートすることにより、抗原回復を実施した。その後、スライドをPBSで洗浄し、0.4%のH2O2を含有する10%メタノールに30分間浸漬した。浸漬処理後、CXCR4特異的i-body(AM3-114-6H、AM4-272-6HまたはAM3-523-6H)及び対照i-body(21H5-6H)を加えて、スライドを4℃で一晩染色した。その後、スライド全てをビオチン化抗Hisタグ抗体(Miltenyi Biotech)で染色し、製造業者の指示(R&D systems)に従ってHRP-DAB細胞及び組織染色キットを使用して発色させた。
CXCR4結合分子またはポリペプチド(i-body)が、in vivoでの定着固形腫瘍の増殖を阻害する能力を、Ramos皮下腫瘍細胞モデル(または、Namawala細胞またはMDA-MB-231またはMDA-MB-468またはPC3細胞)を使用して検討することができる。このアッセイでは、10x106細胞/マウスを各マウスの脇腹領域に移植し、腫瘍の長さx幅x高さ/2によって算出される平均サイズを40mm3に成長させる。次に、マウスに第1の用量のi-body(治療0日目と称する)及び7日目に第2のip用量の抗体を腹腔内(ip)注射により投与する。マウス群を(i)ビヒクル(ii)i-bodyまたは(iii)抗CD20陽性対照のいずれかで処理する。腫瘍容積及びマウス体重を0日目から30日目の投薬後まで定期的に計量する(約2~3回/週)。
本開示のi-bodyの抗転移効果を、動物モデルにおいて試験することができる。乳癌転移では、MDA-MB-231細胞を静脈内注射して実験的な転移モデルを作成する。6~8週齢の雌ヌードマウスに尾静脈経由で、i-body(1mM、プレインキュベーション5分未満)を混合した1.5x106のMDA-MB-231乳癌細胞を注射する(10匹/群)。翌日から治療群のマウスに毎日4mg/kgのi-bodyをi.p.注射により投与する。動物を腫瘍細胞注射の35日後に犠牲死させる。全肺組織を採取して切片化し、ヒトCXCR4のリアルタイムRT-PCR及びH&E組織染色を行い、顕微鏡により切片あたり5視野の転移性腫瘍領域を評価する。
in vitroのHIV阻害アッセイを使用して、CXCR4を発現するT細胞へのHIVの侵入をi-bodyが阻害する能力を実証した。図20に示すように、AM3-114は、CXCR4を発現するT細胞へのHIVの侵入をAMD3100と類似した有効性で遮断することが可能であった。予測された通り、阻害アッセイにおいてAM3-114及びAMD-3100は50nMのIC50を有したが、陰性対照i-body(21H5)は効果を有しなかった。
第2の実験では、i-bodyがHIV感染に利用された細胞の生存性を損なわないことが実証された。
HIV阻害アッセイでは、i-body(陰性対照i-bodyの21H5、抗CXCR4 i-bodyのAM3-114、AM4-272、AM3-523、AM4-746またはAM4-1121)添加の24時間前に、NP2-CD4/CXCR4細胞(100μl中に1x104)を平底96ウェルプレートに播種した。次に培地を細胞から除去し、5倍希釈したi-bodyを加えた100μlの新しい培地と交換し、37℃で16時間培養した。CXCR4 i-bodyの濃度範囲は、25μg/ml~0.008ug/mlであった。未処理ウェル中のPBSは濃度(5.8%、vol/vol)を一定に維持した。時間経過後、培地を除去し、新しい培地と交換した。次の培養期間を通してi-body濃度を維持した。NP2-CD4/CXCR4細胞を37℃で合計72時間インキュベートした。各ウェルの細胞生存性を、製造業者のプロトコルに従ってCellTitre-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を使用して評価した。FLUOStarマイクロプレートリーダー(BMG)を使用して発光を測定した。抗体存在下での細胞生存率を決定するために、抗体で処理した細胞のルシフェラーゼ量を未処理細胞での量との比率で表した。結果を図21に示す。
全てのCXCR4 i-bodyが、2種類のHIV-1 CXCR4を使用したエンベロープ株NL4.3及び1109-F-30の有意な阻害レベルを引き起こすことを明らかにする。NL4.3はラボ適合性エンベロープであり、対する1109-F-30は慢性感染した個体由来の亜型C臨床用エンベロープである。i-bodyは、無関係な受容体との結合後にエンドサイトーシスを受ける小胞性口内炎ウイルスからのエンベロープである無関係なウイルス(VSVG)の侵入を阻害しなかった。結果を図22に示す。
感染の24時間前に、NP2-CD4/CXCR4細胞(100μl中に1x104)を平底96ウェルプレートに播種した。抗CXCR4抗体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再懸濁した。感染前に、培地を細胞から除去し、5倍希釈した(2倍濃度の)i-bodyを加えた100μlの新しい培地と交換し、37℃で30分培養した。CXCR4抗体の濃度範囲は、25μg/ml~0.008ug/mlであった。未処理ウェル中のPBSは濃度(5.8%、vol/vol)を一定に維持した。NP2-CD4/CXCR4細胞を、37℃で12時間、100μl中に200 TCID50のEnv偽型ルシフェラーゼレポーターウイルスに感染させた。時間経過後、接種源を除去し、新しい培地と交換した。次の培養期間を通してi-body濃度を維持した。NP2-CD4/CXCR4を37℃で合計72時間インキュベートした。HIV-1の侵入レベルを、製造業者プロトコルに従って細胞可溶化物のルシフェラーゼ活性によって測定した(Promega)。FLUOStarマイクロプレートリーダー(BMG)を使用して発光を測定した。バックグラウンド活性を模擬感染細胞によって評価し、これを全ウェルから減算した。i-body存在下でのHIV-1侵入率を算出するために、i-bodyで処理した細胞のルシフェラーゼ量を未処理細胞での量との比率で表した。
プレリキサフォルすなわちAMD3100は小分子ビシクラムCXCR4阻害剤であり、HSCを動員するG-CSFとの併用が承認されている。従来技術のCXCR4阻害剤は、幹細胞の動員を生じることが知られている。本実施例に示す実験で実証されるように、本開示のi-bodyは幹細胞の動員を引き起こす能力を欠く。
種々の造血細胞集団へのCXCR4抗体(FLAG標識)の直接的な結合を確認するために、C57/BL6マウスから採取した骨髄細胞を、5種のCXCR4 i-body(AM4-272、AM4-746、AM4-1121、AM3-114またはAM3-523)の混合薬で染色し、次いで二次的に蛍光性抗FLAG抗体で標識した。これらの細胞を細胞系マーカー、前駆細胞マーカー及びHSCマーカーで染色し、種々の造血細胞集団でCXCR4の発現を評価した。この実験の結果は、原発性マウス造血細胞でのCXCR4 i-bodyの活性を実証している。同様の実験を、ヒト化NSGマウスから採取した骨髄細胞で実施し、原発性ヒト造血細胞集団でのCXCR4 i-body活性を確認した(データ示さず)。
CXCR4 i-bodyを使用して造血幹細胞の動員の証拠を得るために、CXCR4 i-body(AM4-272、AM4-746、AM4-1121、AM3-114またはAM3-523)をi.v.注射によりマウスに注入した(5マウス/群)。1時間後及び3時間後に、マウスを安楽死させ、末梢血(PB)を採取した。脾臓を採取して計量し、脾腫(脾臓の膨張)を評価する。図24Aに示すように、PBを計数して白血球含量を評価した。サンプルを溶解して赤血球を除去し、4000個の細胞を播種して、LPP(低増殖能)コロニー及びCFU-HPP(コロニー形成単位-高増殖能)のコロニー(播種後7日のコロニー計数)を得た。抗体混合液で残存細胞を染色して、系統拘束(lineage-committed)細胞、幹細胞及び前駆細胞の計数を評価した。フローサイトメトリー解析を使用して、系統拘束細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、ならびにPB容積当たりの濃縮HSCの数を算出した。白血球の動員は、陽性対照AMD3100と比較してi-body(AM4-272、AM4-746、AM4-1121、AM3-114またはAM3-523、図24A)のいずれでも検出されなかった。陽性対照AMD3100と対照して、マウスLin-、Sca-1+、c-Kit+(LSK細胞)の動員がないことを図24Bに示す。陽性対照AMD3100と比較して、i-bodyによるLSK細胞の動員は達成されなかった。
CXCR4 i-bodyを使用したヒトCD34+幹細胞及び前駆細胞の動員の証拠を得るために、ヒト化NODSIL2Rγ(NSG)マウスにおいて上記の動員実験を実施した。NSGマウスは極度に免疫不全であり、成熟T細胞、B細胞及びNK細胞を欠く、極度に不完全な先天免疫を有しており、術後の拒絶反応がないヒト細胞の移植が可能である。NSGマウスに、新たに選別されたCD34+臍帯血細胞を移植して、陽性ヒトCD45/CD34移植(約4~5週)を確認次第、ヒト幹細胞動員のマウスモデルとして使用した。
CXCR4 i-bodyがHSCを結合するかどうかを決定するために、ヒトCD34+CD38-細胞に対するin vitro結合分析を評価した。既述のように(Nilsson SK et al,2005 15;106(4):1232-9;Grassinger,2009 2;114(1):49-59)、臍帯血(CB)及びヒト骨髄(BM)を採取した。既述のように(Grassinger、2009)、濃縮したヒトBM CD34+細胞及び精製したCB CD34+細胞を単離した。ヒトCB及びBM CD34+細胞及びhuNSG BMを、CXCR4 i-body(10μg/ml)、抗His-PEならびにCD34-FITC(BD Biociences#348053)及びCD38-BV421(BD Horizon#562444)を含有する抗体混合液で順次染色し、PBS(0.5%のBSA)で洗浄して、既述のように(Grassinger、2009)Cytopeia Influx(BD)でのフローサイトメトリーによって分析した。ヒト及びマウスのBM及びPB分析では、最大5x106の細胞を10~20,000細胞/秒で分析した。データはFlowJo 10ソフトウェア(FlowJo,LLC)を使用して分析した。huNSG BMの分析では、huCD45-PECy7(BD Biosciences #557748)及びmuCD45-BUV395(BD Biosciences #564279)も抗体混合液に含めた。ヒトCB及びBMからのHSCをCD34+CD38-と定義し、huNSGマウスからのHSCをmuCD45-huCD45+CD34+CD38-と定義した。3個体のドナーからのCB及びBMサンプル、ならびに3個体のhuNSGマウスからのBMを評価した。
15.1 角膜アルカリ熱傷モデル
i-bodyによる線維症誘導(角膜新生血管(NV))を、Cai X et al(2014)PLoS ONE 9(2):e88176に記載されている角膜アルカリ熱傷モデルを使用して検討することができる。この方法は、60mg/kgのネンブタールの腹腔内注射及び1滴のテトラカインの局所投与によりラット(例えばSprague Dawley)を麻酔することが必要である。1NのnaOHに浸漬した直径1.5mm円形片の濾紙を、右眼の中心角膜と40秒間接触させて静置することにより、角膜アルカリ外傷を形成する。アルカリに暴露した直後に、眼球面をPBSで60秒間すすぐ。ラットを無作為に2群に分けた(n=15)。第1群は、正常生理食塩水で処理(10μl、1日に4回)したアルカリ熱傷を施したラットで構成され、第2群は、TMPで処理(10ml容積中1.5mg/ml、1日4回)したアルカリ熱傷を施したラットで構成した。その後、28日目に細隙灯顕微鏡検査法を使用して全眼を観察し、角膜NVを評価した。
Zhang Z et al(2005)Invest Ophthalmol Vis Sci 46:4062-4071 doi:10.1167/iovs.04-1330に記載されているように、角膜NV(NV)を定量化することができる。簡潔には、研究状況を盲検された眼科医が、アルカリ熱傷後1、2、5及び8日に細隙灯顕微鏡下で全眼を検査する。角膜画像を4分割する。各区画の血管長(Li、i=1~4)を、ノギスを使用して測定する。次式を使用して角膜NV面積(A)を算出する:A=Σi=1-4 3.1416x{R2-(R-Li)2}(Rはラット角膜の半径である。R=3.5mm、15匹のラットの角膜の測定から算出)。
レーザー誘発性脈絡膜新生血管(CNV)は、脈絡膜新生血管の特徴が顕著な一般に認められたモデルである(Fletcher EL et al.(2011)Prog Mol Biol Transl Sci 100:211-286)。また、血管形成及び線維症を標的とする潜在的治療の有効性を決定するには迅速な方法でもある。簡潔には、持続波の光凝固レーザー(532nMダイオード)を使用して、後眼部の最大4箇所にレーザーを照射する。レーザーエネルギーは、ブルック膜の断裂を形成できる程度の強度にする。以降の7~14日間で、脈絡膜から網膜への血管の成長が発生する。それを免疫細胞化学的に定量化するか、または蛍光眼底血管造影法の使用により定量化する。
第1群(n=10):両眼にレーザー、片眼にビヒクル、対側眼にi-body
第2群(n=10):片眼にレーザー(i-bodyなし)、対側眼はレーザー非照射
容積1μl、最大濃度20mg/mlのi-body薬を硝子体内注射した。
線維芽細胞に発現する可能性を有し、線維症の病因に重要な役割を果たし得る骨由来間葉系細胞の循環(Strieter RM,Keeley EC,Burdick MD and Mehrad B.The Role of Circulating Mesenchymal Progenitor Cells,Fibrocytes,in Promoting Pulmonary Fibrosis.Trans Am Clin Climatol Assoc 2009;120;49-59)と、CD45及びCXCR4を発現しているその細胞は、線維芽細胞を循環させ、ブレオマイシン誘発肺線維症マウスモデルにおいて、SDF-1に応答した遊走及び肺への輸送を可能にする(Phillips RJ,Burdick MD,Hong K,Lutz MA,Murray LA et al.Circulating fibrocytes traffic to the lungs in response to CXCL12 and mediate fibrosis.J Clin Invest(2004)114: 438-44)。
i-bodyの炎症防御能力を、in vivoマウス空気嚢モデルにおいて評価した。皮下(s.c.)空気嚢は、急性及び慢性炎症の研究に使用されるin vivoモデルである(Durate et al,Models of Inflammation:Carrageenan Air Pouch,Current Protocols in Pharmacology 5.6.1-5.6.8,March 2012)。ラットまたはマウスの空気嚢への刺激源の注射により誘発される炎症反応を、生じる滲出液の量、細胞の浸潤及び炎症性メディエーターの放出により定量化することができる。空気嚢はマウスの背中の皮膚下に無菌空気を注入することにより生成する。マウスを、抗炎症化合物または試験物品(i-bodyまたはAMD3100)のいずれかで前処理し、炎症誘導物質であるSDF-1で二次処理する。次に、空気嚢洗浄流体を分析し、細胞輸送及びサイトカイン放出について調べる。
肺線維症を阻害するCXCR4結合分子(i-body)の能力を、疾患マウスモデルにおいて検討した。抗生物質及び抗腫瘍薬であるブレオマイシンは、IPFと似たヒト疾患の実験的モデルにおいて広く使用されている。ブレオマイシンは、脂質過酸化を誘導することによりDNAに対する効果とは独立した細胞障害を引き起こすことが可能である。コラーゲン沈着をもたらすブレオマイシンと肺との相互作用の正確な特徴は確認されていない。しかしながら、サイトカイン及び成長因子、例えばIL-1、IL-6、TNF-α、PDGF及びTGF-βの過剰活性化は、疾患進行に一貫して関与している。最近の証拠は、ブレオマイシンマウスモデルにおいてCXCR4拮抗作用が肺線維症の予防に有効であることを示唆している。
ショットガン突然変異誘発(Integral Molecular)を使用して、野生型及び突然変異型ヒトCXCR4と結合する抗CXCR4 i-body、AM3-114、AM4-272及びAM3-523を評価した。CXCR4を発現するHEK-293 T細胞に対して、i-bodyを試験した。高い値のシグナル対バックグラウンド比を得たi-body、AM3-114(1μg/ml)、AM4-272(2μg/ml)及びAM3-523(1μg/ml)の免疫検出及びエピトープマッピングに最適なスクリーニング条件を決定した。スクリーニングで同定された全ての重要残基に対するi-bodyの平均反応率(及び範囲)を表13に示す。対照抗体は、市販の抗flag及び12G5であった。
正常肺及びIPF肺でのCXCR4の発現を更に確認するため、陰性対照i-bodyの21H5、CXCR4特異的i-body(AM3-114、AM4-272及びAM3-523)を免疫組織化学分析(IHC)に利用した(図示せず)。正常肺及び遅発性IPF肺の生検材料には、CXCR4発現細胞がほとんど検出されなかった。急性IPF肺の生検材料には、CXCR4発現細胞が容易に検出された。最後に、CXCR4はi-bodyによって、急性IPF肺の生検材料の線維性領域に存在する間質細胞内に検出された。本開示のi-bodyは、IPF患者肺生検材料(急性及び遅発性進行患者の両方)からの線維芽細胞とは結合できたが、正常肺組織からの肺生検材料とは結合しなかった。
複数のレポートで、CXCL12及びCXCR4が肺浸潤に果たす役割を示す証拠が明らかにされている(Li et al Cancer Lett 2012 322;169-176 & Krook et al Mol Cancer Res 2014 12;953-964)。Lovgren,Aらは、β-アレスチンが肺線維芽細胞浸潤に重要な役割を果たすことを示している(Lovgren et al Sci Transl Med 2011 3;74ra23)。更に、CXCR4が、CXCL12をCXCR7に分配し、β-アレスチン経路の活性化をもたらすことが複数のレポートで示されている。このことは、CXCR4が肺線維芽細胞の浸潤を促進し得ることを示唆している(Coggins et al.2014 PLoS One 9, e98328、Decaillot et al.J Biol Chem 2011 286;32188 32197、及びRajagopal et al PNAS 2010 107;628-632)。
肺線維芽細胞の活性化及び細胞外マトリックス生成にCXCR4が果たす潜在的役割を特定するため、線維芽細胞を、CXCR4特異的i-body(AM3-114-6H、AM4-272-6H、AM3-523-6H)、陰性対照i-body(21H5)またはAMD3100で48時間処理し、その後RNAを抽出し、ACTA2、COL1A1、COL3A1及びFN1転写物に対してqPCR解析を実施した。qPCR方法は以下の通りであった。50μg/mlのBMEに線維芽細胞を播種し、130μg/mlのi-bodyまたは12μMのAMD3100で処理した。48時間後に、Trizol試薬を使用してRNAを抽出し、既述のように(Trujillo et al Sci Transl Med 2010 2;57ra82)Superscript II逆転写酵素(Life technology)を使用してcDNAに逆転写した。続いて相補的DNA(cDNA)をTaqmanプレートにロードし、事前設計されたプライマーを使用して、遺伝子発現解析をCOL1A1、COL3A1、FN1及びαSMAに対して実施した。Taqman解析は全て、Applied Bio systemsのViia 7装置(Life technology)を使用して実施した。その後、結果をエクスポートし、18sのRNA発現により正規化し、Data Assistソフトウェア(Life technologies)を使用して倍率変化解析を算出した。CXCR4特異的AM3-114-6Hは、遅発性IPFにおいてACTA2、COL1A1、COL3A1及びFN1の線維化促進遺伝子転写物の発現を著しく減少させたが、正常肺線維芽細胞では減少させなかった(図32)。
CXCR4は、CCR2を含む他のケモカイン受容体と連係してシグナル伝達することが、様々なレポートで示されている。CXCR4特異的i-bodyが、潜在的CXCR4シグナル伝達パートナーを調節できるかどうかを判定するために、i-body(AM3-114-6HまたはAM4-272-6H)、AMD3100またはBIBF-1120による処理後48時間の正常、遅発性、及び急性IPF肺線維芽細胞培養液から、コンディショニングした上清を回収し、製造業者(R&D Systems)が推奨しているように、市販のELISAキットを使用して線維芽細胞のコンディショニングした上清中のCCL2、CCL5及びCXCL12を検出した。CXCR4を標的とするi-bodyのAM3-114-6H及びAM4-272-6H、AMD3100ならびにBIBF-1120は、IPF線維芽細胞のコンディショニングした上清においてCCL2タンパク質を著しく増加させたが、正常な上清では増加させなかった。この増加は、急性IPF肺線維芽細胞のコンディショニングした上清において顕著であった。CXCR4を標的とするi-bodyのAM4-272-6Hは、一部のIPF肺線維芽細胞のCCL5レベルを上昇させたが、この効果には一貫性がなく、対照i-bodyの21H5-6Hで処理した、1つの遅発性IPF肺線維芽細胞株において効果が観察された。
i-bodyがSDF-1αによって誘導される血小板凝集を防止できるかどうかを検討するため、実験を実施した。ヒト多血小板血漿懸濁液を、10または20ug/mLのi-bodyのAM3-114、AM3-523、AM4-746またはAM4-1121(または12G5の陽性対照抗CXCR4 Mab)とともに10分間プレインキュベートし、続いて100nMのSDF-1アルファで刺激した。陰性対照i-bodyの21H5(または12G5のアイソタイプ対照:マウスIgG2a)の存在下で、SDF-1は堅調かつ再現可能な凝集(光透過の増加を示す、下降する黒色曲線)を誘発した。これは以前に発表されたことと一致している。全てのi-bodyならびに12G5は阻害効果を有し、これはAM3-114及びAM4-1121で最も効果的であった(図33)。これらのi-bodyは、強度の持続した凝集阻害を示した。AM3-523及びAM4-746はMAb12G5と同程度に凝集を防げ、AM4-272はごく弱く凝集を防げただけであった。陰性対照i-bodyまたは対照MAbのいずれも、血小板凝集にいかなる影響も及ぼさなかった。
Holman et al(Biochimica et Biophysica Acta 2011)が発表した定評ある論文によると、CXCL12が実験的な自己免疫脳脊髄炎(EAE)、すなわち多発性硬化症マウスモデルにおいて約8~12日の時点で血液脳関門を越えるCXCR4陽性細胞の動員を担っていることを実証したことが示唆されている。加えて、最近の研究で、CXCR4アンタゴニストがEAEにおいて有効性を示すことが実証された(Hanes et al JBC Vol 290(37):22385-22397(2015)、Kohler et al Brain Pathology 2008,18;504-516)。発明者らは、0日目にミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質(MOG)の注射によって少数の動物(群当たりn=3)にEAEを誘導し、この動物に7~10日目(4日間、1日1回注射)まで4mg/Kgのi-body、AM4-272を静脈内投与した。このときに血液脳関門を越える炎症細胞の浸潤に重要であることが報告された。AM4-272 i-bodyを注射した3匹のマウスのうち、1匹は疾患が進行したが、もう2匹はほぼ無疾患であった。i-bodyで処理した動物の15日目の体重は、疾患動物、または陰性対照i-body、21H5を注射した動物と有意差がある。加えて臨床スコアは、14日目及び15日目の両方で、疾患動物または対照i-bodyを注射した動物と比較してi-bodyの注射によって大幅に改善された(図34)。これらのデータは、本発明のi-bodyが炎症細胞のCXCR4と結合し、末梢血管系から脳への細胞の遊走を阻害できることを示唆している。この遊走の阻害がEAEの症状を軽減できることは明らかである。
Claims (15)
- 配列番号40の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、ヒトCXCR4と結合するポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが配列番号41の配列からなるCDR1領域、および、配列番号42の配列からなるCDR3領域を含み、
ただし、前記ポリペプチドが、配列番号40に記載される配列を含まない、または、配列番号40に記載される配列からならない、ヒトCXCR4と結合するポリペプチド。 - 単量体、二量体、または多量体の形態にある、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号43の配列を含む核酸、または、請求項2に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現構築物。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドと、薬剤とを含むコンジュゲート。
- 前記薬剤が、治療剤、毒素、コロイド、検出可能標識、放射性同位体、核酸、ペプチド、タンパク質、ポリペプチドの半減期を延長する剤、または、それらの混合物から選択される、請求項4に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリペプチドの半減期を延長する剤が、免疫グロブリンのFc部分である、請求項5に記載のコンジュゲート。
- 請求項1または2に記載のポリペプチド、または、請求項4から6のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
- 以下の1つ以上の活性を調節することができる、請求項1または2に記載のポリペプチド:
(i)CXCR4を発現する細胞内のカルシウム流入;
(ii)CXCR4を発現する細胞のcAMP;
(iii)CXCR4を発現する細胞のβ-アレスチンシグナル伝達;
(iv)CXCR4を発現する細胞のアポトーシス;
(v)CXCR4を発現する細胞の細胞増殖;
(vi)CXCR4を発現する細胞の転移;
(vii)CXCR4誘導性の血管形成;および
(viii)CXCR4を発現する細胞の遊走。 - 請求項1または2に記載のポリペプチド、または、請求項4から6のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、線維症を治療または予防するための医薬組成物。
- 線維症が、特発性肺線維症である、請求項9に記載の組成物。
- CXCR4関連の疾患もしくは障害、または、CXCR4シグナル伝達もしくはCXCR4が関与する経路もしくは機構と関連する疾患もしくは障害を治療または予防するための、請求項1または2に記載のポリペプチド、または、請求項4から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または、請求項9もしくは10に記載の組成物を含む、医薬組成物。
- 前記疾患または障害が、癌、ウイルス感染症、炎症性疾患、全身性硬化症、腎臓疾患、眼疾患、免疫不全症、および、創傷からなる群から選択される、請求項11に記載の組成物。
- 幹細胞の動員を引き起こさない、請求項1または2に記載のポリペプチド、または、請求項4から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または、請求項9もしくは10に記載の組成物。
- 足場領域とそこに含まれる相補性決定領域(CDR1およびCDR3)を含むポリペプチドであって、足場領域は、配列番号1のアミノ酸1~26、33~79および88~97によって定義される足場領域と少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、配列番号1のアミノ酸27~32および80~87によって、それぞれが定義される該CDR1およびCDR3領域は、その領域へのアミノ酸の付加または置換により配列番号1の配列に関して修飾されており、該ポリペプチドはヒトCXCR4と結合し、
前記ポリペプチドが、
(i)配列番号12からなるCDR1領域配列および配列番号13からなるCDR3領域配列;
(ii)配列番号15からなるCDR1領域配列および配列番号16からなるCDR3領域配列;
(iii)配列番号18からなるCDR1領域配列および配列番号19からなるCDR3領域配列;
(iv)配列番号21からなるCDR1領域配列および配列番号22からなるCDR3領域配列;
(v)配列番号24からなるCDR1領域配列および配列番号25からなるCDR3領域配列;
(vi)配列番号27からなるCDR1領域配列および配列番号28からなるCDR3領域配列;または
(vii)配列番号30からなるCDR1領域配列および配列番号31からなるCDR3領域配列;
を含む、
ポリペプチド。 - 配列番号11、配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号23、配列番号26、または、配列番号29のいずれかひとつに記載の配列と少なくとも90%同一である配列を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
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