ES2924394T3 - Moléculas de unión a CXCR4 - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a polipéptidos (también denominados en el presente documento moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4) que se dirigen contra el receptor de proteína acoplada a G CXCR4, también conocido como Fusin o CD184. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos; a métodos para preparar dicho polipéptido; a composiciones, y en particular a composiciones farmacéuticas que comprenden tales polipéptidos ya usos de tales polipéptidos con fines terapéuticos o de diagnóstico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión a CXCR4

Solicitudes relacionadas e incorporadas como referencia

Este documento reclama prioridad de AU 2015900054.

Todo el contenido de la presentación electrónica de la lista de secuencias se incorpora por referencia en su totalidad para todos los efectos.

Campo de la invención

La presente descripción se refiere a polipéptidos (también denominados en el presente documento moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4) que se dirigen contra el receptor de proteína acoplada a G CXCR4, también conocido como Fusina o CD184. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos; a métodos para preparar dicho polipéptido; a composiciones, y en particular a composiciones farmacéuticas que comprenden tales polipéptidos ya usos de tales polipéptidos con fines terapéuticos o de diagnóstico.

Antecedentes de la invención

Las quimiocinas (citocinas quimioatrayentes) son una familia de pequeñas proteínas estructural y funcionalmente relacionadas que dirigen la migración de las células (por ejemplo, leucocitos y/o linfocitos y/o células madre y/o neuronas) además de controlar otros procesos biológicos, como la angiogénesis, morfogénesis, autoinmunidad, crecimiento tumoral y metástasis. Las quimiocinas se agrupan en familias según la presencia y la posición relativa de los residuos de cisteína amino terminales (por ejemplo, CC, c Xc , CX³C y quimiocinas C). Generalmente, la actividad biológica de una quimiocina está mediada por un receptor de superficie celular, en particular un receptor acoplado a proteína G de 7 dominios transmembrana (GPCR, por sus siglas en inglés). Los receptores de quimiocinas se agrupan y nombran de acuerdo con la familia de quimiocinas a las que se unen.

Un miembro de la familia CXCR es CXCR4 que se expresa predominantemente en linfocitos y que activa la quimiotaxis. CXCR4, también llamado fusina, es un receptor de alfa-quimiocina específico para el factor 1 derivado del estroma (SDF-I, por sus siglas en inglés, también llamado CXCL12), una molécula dotada de una potente actividad quimiotáctica para los linfocitos.

CXCR4 desempeña un papel en la embriogénesis, la homeostasis, la fibrosis y la inflamación. La vía CXCR4/SDF-1 se ha implicado en la vascularización de órganos, así como en los sistemas inmunitario y hematopoyético (Tachibana K et al. (1998) Nature 393: 591-594). Los fármacos que bloquean el receptor CXCR4 parecen ser capaces de "movilizar" las células madre hematopoyéticas al torrente sanguíneo como células madre de la sangre periférica. También se ha demostrado que CXCR4 funciona como un coreceptor para aislados de VIH-1 linfóricos T (Geng Y et al. (1996) Science 272: 872-877). También se ha demostrado que CXCR4 se expresa en una amplia variedad de tipos de células cancerosas y que participa en la estimulación del proceso metastásico en muchas neoplasias diferentes (Murphy PM (20001) N. Eng. J. Med. 345:833-835).

Los receptores acoplados a proteína G son actualmente la clase más importante de dianas terapéuticas, y los anticuerpos dirigidos contra ellos son muy buscados con fines terapéuticos, de diagnóstico y de investigación. A pesar del interés sustancial en estos objetivos, los anticuerpos de alta calidad o los agentes de unión contra las proteínas de membrana han sido difíciles de generar utilizando medios convencionales.

Se han descrito previamente agentes de unión a CXCR4, incluidos anticuerpos completos (por ejemplo, Medarex), fragmentos de anticuerpos y anticuerpos de dominio único (Ablynx); sin embargo, los presentes agentes de unión proporcionan una construcción alternativa que alivia algunos de los inconvenientes de los anticuerpos, por ejemplo, efectos mediados por Fc así como altos costes de producción, baja estabilidad y su gran tamaño, que reducen su utilidad para la penetración tumoral. Los agentes aglutinantes de la presente invención proporcionan una alternativa a los agentes de molécula pequeña como Plerixafor (Mozobil o AMD3100) que actualmente está indicado para la movilización de células madre de sangre periférica en combinación con el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en pacientes con linfoma no Hodgkin (NHL, por sus siglas en inglés) y mieloma múltiple (MM).

Los nanocuerpos que se unen a CXCR4 se describen en PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, EE. UU., vol. 107, núm. 47, 23 de noviembre de 2010 (2010-11-23), páginas 20565-20570.

Breve descripción de la invención

La presente descripción se refiere a moléculas o polipéptidos que se unen a CXCR4, denominados "i-cuerpos" en los ejemplos descritos en el presente documento. Estos i-cuerpos se unen al CXCR4 humano nativo expresado en una superficie celular. Los i-cuerpos de la presente divulgación se pueden usar para modular y, en particular, inhibir o prevenir la señalización mediada por CXCR4 y/o para modular las rutas biológicas donde CXCR4 está involucrado y/o para modular los mecanismos biológicos, las respuestas y los efectos asociados con tal señalización. Como tales, los i-cuerpos de la presente descripción se pueden usar para la prevención y el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con CXCR4.

Se apreciará que las moléculas de unión a CXCR4 o los i-cuerpos de la presente divulgación proporcionan ventajas sobre otros agentes de unión tales como los anticuerpos tradicionales. Al igual que los anticuerpos tradicionales, los i-cuerpos de la presente descripción pueden unirse a su objetivo con alta afinidad y alta especificidad, pero su menor tamaño y estabilidad son ventajosos en comparación con los anticuerpos, polipéptidos o péptidos terapéuticos tradicionales. Los icuerpos también son moléculas más estables que los anticuerpos convencionales, lo que conduce a vías alternativas de administración ya una forma de dosis más baja, una dosificación menos frecuente y menos efectos secundarios. Los icuerpos también son más pequeños en tamaño y, por lo tanto, pueden penetrar tejidos, órganos y áreas como la matriz ósea y el entorno microtumoral que otras proteínas grandes no pueden penetrar. Los i-cuerpos también tienen un bucle de unión a CDR3 largo que puede penetrar surcos y hendiduras a diferencia de los anticuerpos monoclonales tradicionales. Los i-cuerpos de la presente divulgación pueden unirse profundamente al bolsillo del receptor acoplado a proteína G (GPCR) CXCR4.

Debido a su tamaño relativamente pequeño, el i-cuerpo es ideal para personalizar la vida media, lo que tendrá ventajas cuando se use como agente de formación de imágenes o en la administración de una dosis requerida durante un período de tiempo determinado. Como un polipéptido pequeño, el i-cuerpo también proporciona la entrega de una carga útil al objetivo a través de la conjugación con el polipéptido identificado.

Además, los inventores han descubierto que los polipéptidos/i-cuerpos que se unen a CXCR4 de la presente descripción tienen características que los distinguen de otras moléculas de unión a CXCR4 inhibidoras/antagonistas conocidas en la técnica. En particular, los polipéptidos/i-cuerpos que se unen a CXCR4 de la presente descripción no provocan la movilización de células madre. Además, los polipéptidos/i-cuerpos de unión a CXCR4 de la presente divulgación no inhiben el flujo de calcio.

La presente descripción proporciona un polipéptido que comprende una región de andamio y regiones determinantes de complementariedad (CDR1 y CDR3) contenidas en el mismo, donde la región de andamio comprende una secuencia que tiene al menos un 75 % de identidad con la región de andamio definida por los aminoácidos 1 a 26, 33 a 79 y 88 a 97 de SEQ ID NO: 1 y donde la región CDR1 y CDR3 definida por los aminoácidos 27 a 32 y 80-87 respectivamente de SEQ ID NO: 1 están modificadas por adición o sustitución de aminoácidos en la misma y donde el polipéptido se une al CXCR4 humano

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un polipéptido que se une al receptor de quimiocinas CXC humano tipo 4 (CXCR4), que comprende una región de andamio y regiones determinantes de complementariedad (CDR1 y CDR3) contenidas en el mismo, comprendiendo la región de andamio una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la región de andamio definida por los aminoácidos 1 a 26, 33 a 79 y 88 a 97 de SEQ ID NO: 1;

y

(A) donde la región CDR1 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 41 y donde la región CDR3 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 42; o

(B) donde la región CDR1 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 49 y donde la región CDR3 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 50; o

(C) donde la región CDR1 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 57 y donde la región CDR3 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 58; o

(D) donde la región CDR1 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 73 y donde la región CDR3 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 74; o

(E) donde la región CDR1 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 77 y donde la región CDR3 consta de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 78; y donde el polipéptido carece de capacidad de movilización de células madre.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un conjugado que comprende un polipéptido de la invención y un agente seleccionado entre un agente terapéutico, una toxina, un marcador detectable o un agente que prolongue la vidamedia del polipéptido.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención y un vehículo aceptable.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido o conjugado de la invención para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4.

También se describe aquí un polipéptido que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2 (Figura 1B) o la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2 o la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2 que comprende entre 1 y 5 adiciones o sustituciones de aminoácidos en los mismos.

En un ejemplo, la región CDR1 consta de una secuencia aleatoria de seis residuos de aminoácidos consecutivos (designados XXXXXX en la Figura 1B) y la región CDR3 está representada por Y'n (en la Figura 1B), donde Y es cualquier residuo de aminoácido y n es cualquier número entre 10 y 20 aminoácidos inclusive. Las regiones CDR1 y/o CDR3 de SEQ ID NO:2 se modifican mediante la adición y/o sustitución de aminoácidos en relación con las regiones CDR1 y/o CDR3 correspondientes en SEQ ID NO:1.

En un ejemplo, el aminoácido A' en la posición 23 de SEQ ID NO:2 es el aminoácido glutamina (Q) o lisina (K).

En un ejemplo, el aminoácido B' en la posición 24 de SEQ ID NO:2 es el aminoácido valina (V) o alanina (A).

En un ejemplo, A' es Q y B' es V en SEQ ID NO:2.

El polipéptido puede comprender además entre 1 y 4 aminoácidos N-terminales consecutivos seleccionados del grupo que consiste en M, EAEA, MA o MP.

En un ejemplo, el polipéptido se une al CXCR4 humano. En otro ejemplo, el polipéptido es un antagonista del CXCR4 humano.

En un ejemplo, el polipéptido se une al CXCR4 humano con una afinidad de menos de 50 uM, menos de 20 uM, menos de 10 uM, menos de 1 |^j M, menos de 850 nM, menos de 700 nM, menos de 600 nM, menos de 500 nM, menos de 300 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 25 nM, menos de 20 nM, menos de 15 nM, menos de 10 nM o menos de 5 nM. En un ejemplo particular, el polipéptido se une al CXCR4 humano con una afinidad de aproximadamente 700 nM. En un ejemplo particular, el polipéptido se une al CXCR4 humano con una afinidad de menos de 700 nM.

En un ejemplo, el polipéptido según SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 se modifica mediante una o más sustituciones de aminoácidos.

En un ejemplo, la región CDR1 y CDR3 se modifica mediante una o más sustituciones de aminoácidos. En otra realización, la región CDR1 y/o CDR3 se modifica reemplazándola con una secuencia de bucle aleatorio.

También se describe aquí una región CDR3 que comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad, o al menos un 80 % de identidad, o al menos un 90 % de identidad, o al menos un 95 % de identidad, o al menos un 97 % de identidad, o al menos 98 % de identidad, o al menos 99 % de identidad, o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, o SEQ ID NO: 31

En un ejemplo, la región CDR3 comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de homología, o al menos 80 % de homología, o al menos 90 % de homología, o al menos 95 % de homología, o al menos 97 % de homología, o al menos 98 % de homología, o al menos 99 % de homología, o 100 % de homología con SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, o SEQ ID NO: 31

En otro ejemplo, la región CDR3 comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones dentro de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, o SEQ ID NO: 31

En otro ejemplo, la región CDR3 comprende o consiste en SEQ ID NO: 13.

En un ejemplo, la región CDR1 comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos un 50 % de identidad, o al menos un 65 % de identidad, o al menos un 80 % de identidad, o un 100 % de identidad con SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, o SEQ ID NO: 30.

En un ejemplo, la región CDR1 comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos un 50 % de homología, o al menos un 65 % de homología, o al menos un 80 % de homología, o un 100 % de homología con SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, o SEQ ID NO: 30.

En otro ejemplo, la región CDR1 comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos una, dos o tres sustituciones dentro de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, o SEQ ID NO: 30.

En otro ejemplo, la región CDR1 comprende o consiste en SEQ ID NO: 12

En otro ejemplo, el polipéptido comprende:

(i) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 12 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 13;

(ii) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de homología con la SEQ ID NO: 12 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de homología con SEQ ID NO: 13;

(iii) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 15 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 16;

(iv) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de homología con la SEQ ID NO: 15 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de homología con SEQ ID NO: 16;

(v) una secuencia de región CDR1 que tiene al menos un 50 % de identidad con SEQ ID NO: 18 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 19;

(vi) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de homología con la SEQ ID NO: 18 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de homología con SEQ ID NO: 19;

(vii) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 21 una secuencia de la región CDR3 que tiene al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 22;

(viii) una secuencia de región CDR1 que tiene al menos un 50 % de homología con SEQ ID NO: 21 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de homología con SEQ ID NO: 22;

(ix) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50% de identidad con SEQ ID NO: 24 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 25;

(x) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de homología con la SEQ ID NO: 24 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de homología con SEQ ID NO: 25;

(xi) una región c DR1 que tiene al menos un 50% de identidad con SEQ ID NO: 27 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 28;

(xii) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de homología con la SEQ ID NO: 27 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de homología con SEQ ID NO: 28;

(xiii) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 31; o

(xiv) una secuencia de la región CDR1 que tiene al menos un 50 % de homología con la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de región CDR3 que tiene al menos un 70 % de homología con SEQ ID NO: 31.

En un ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad, al menos un 90 % de identidad o al menos un 95 % de identidad o al menos un 97 % de identidad o al menos un 98 % de identidad o al menos un 99 % de identidad a SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, o SEQ ID NO: 29.

En un ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos un 70 % de homología, o al menos un 80 % de homología, o al menos un 90 % de homología, o al menos un 95 % de homología, o al menos un 98 % de homología, o al menos un 99 % de homología con SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, o SEQ ID NO: 29.

En un ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia como se establece en cualquiera de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, o SEQ ID NO: 29

En un ejemplo, el polipéptido comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones dentro de la secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 76.

En un ejemplo, el polipéptido comprende o consta de SEQ ID NO: 11

En otro ejemplo, el polipéptido comprende una región CDR1 que comprende una secuencia representada por la fórmula SX¹SX²X³R donde

X¹ es G, K, L o Y;

X² es D, H, G o N; y

X³ es I, V, M, F, Q o Y;

o una sustitución de aminoácido conservativa del mismo.

En un ejemplo, la región CDR1 comprende o consiste en la secuencia como se establece en cualquiera de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, o SEQ ID NO:77.

En un ejemplo, el polipéptido comprende una región CDR3 que comprende una secuencia representada por la fórmula Y'1,RY'2GY'3YRHRY'4LY'5LG en donde.

Y'¹ es Y o W;

Y'² es T, V o I;

Y'³ es G o A;

Y'⁴ es A o Y; y

Y ^’5 es V, R o K;

o una sustitución conservativa de aminoácidos de los mismos.

En un ejemplo, la región CDR3 comprende o consiste en la secuencia como se establece en cualquiera de SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, o SEQ ID NO: 78.

En otro ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia idéntica en al menos un 70 % a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO: 76.

En otro ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia al menos 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 90 %, 93 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO: 76. En otro ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia representada por la secuencia ZLQVDIVPSQGEISVGESKFFLCA’B’AGSXi SX2X3RISWFSPNGEKLTPNQQRISVVWNDDSSS TLTIYNANIDDAGIYKCWY’ⁱ RY^GY’^sYRHRYULY’^sLGEATVNVKIFQ (SEQ ID NO: 39)

donde

A' es Q o K;

B' es V o A;

X ¹ es G, K, L o Y;

X² es D, H, G o N;

Xa es I, V, M, F, Q o Y;

Y ^'1 es Y o W;

Y'2 es T, V o I;

Y'3 es G o A;

Y ^'4 es A o Y; y

Y ^'5 es V, R o K;

o una sustitución de aminoácido conservativa del mismo; y

Z es un aminoácido seleccionado de M, EAEA, MA o MP o está ausente.

En otro ejemplo, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia como se establece en cualquiera de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO: 76.

En otro ejemplo, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 40.

En un ejemplo, el K^d del polipéptido para CXCR4 humano está entre aproximadamente 0,01 nM y aproximadamente 700 nM, tal como entre aproximadamente 0,05 nM y aproximadamente 500 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente 100 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 50 nM, entre aproximadamente 5 nM y aproximadamente 30 nM, entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 20 nM o entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 16 nM,

En otro ejemplo, el polipéptido se une al CXCR4 humano con una afinidad entre 3 nM y 10 nM. En otro ejemplo, el polipéptido se une al CXCR4 humano con una afinidad entre 3 nM y 5 nM.

En un ejemplo, el K^d se evalúa inmovilizando el CXCR4 humano y evaluando la unión del polipéptido al CXCR4 humano inmovilizado usando resonancia de plasmón superficial. En un ejemplo, la evaluación de la unión del polipéptido es a lipopartículas CXCR4 inmovilizadas.

Un polipéptido ejemplar de la divulgación tiene una K^d de aproximadamente 5 nM (por ejemplo, /- 1 nM) para CXCR4 humano.

En otro ejemplo, la tasa de asociación (Ka) está entre aproximadamente 1 x 104 M-1s-1 a aproximadamente 10 x 105 M-1s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 5x104 M-1s-1 a alrededor de 8,5 x 105 M-1s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 1 x 105 M-1s-1 a alrededor de 6 x 105 M-1s-1, por ejemplo, entre 6x105 M-1s-1 a 1x106 M-1s-1. En un ejemplo, la Ka se evalúa inmovilizando el CXCR4 humano y evaluando la unión de la molécula al CXCR4 humano inmovilizado usando resonancia de plasmón superficial.

En otro ejemplo, la tasa de disociación (Kd) está entre alrededor de 0,005M-1s-1 hasta aproximadamente 0,9 M-1s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 0,02 M-1s-1 hasta aproximadamente 0,7 M-1s-1, por ejemplo, entre unos 0,2 M-1s-1 y 0,55 M-1s-1.

Un polipéptido ejemplar de la divulgación tiene una Ka de aproximadamente 1,297 * 106 M-1s-1. Otro polipéptido de unión a modo de ejemplo de la divulgación tiene un Kd de aproximadamente 0,00629M-1s-1. En un ejemplo, Ka y Kd se evalúan inmovilizando una lipopartícula que expresa CXCR4 humano y evaluando la unión del polipéptido a la lipopartícula inmovilizada que expresa CXCR4 humano usando resonancia de plasmón superficial.

Los residuos implicados en la unión de los polipéptidos de la presente descripción a CXCR4 se han determinado y se describen en el presente documento. En un ejemplo, la divulgación proporciona un polipéptido de unión a CXCR4 como se describe en este documento, que se une a uno o más residuos centrales de CXCR4 humano seleccionados del grupo que consiste en E32, Y184, F189, W195, D262 y L266 o combinaciones de cualquiera de estos. En otro ejemplo, el resto se selecciona del grupo que consta de E32K, Y184S, F189L, W195R, D262G y L266H o una combinación de cualquiera de estos. En otro ejemplo, la descripción proporciona un polipéptido de unión a CXCR4 como se describe aquí que se une a uno o más residuos de CXCR4 seleccionados del grupo que consiste en C28, V112, D193, P191, E268 y E288 o combinaciones de estos. En otro ejemplo, el resto se selecciona del grupo que consiste en C28W, V112A, D193G, P191T, E268K y E288G o una combinación de cualquiera de estos. Los residuos de aminoácidos que se sustituyen se numeran de acuerdo con la secuencia canónica del CXCR4 humano que tiene el identificador de secuencia Uniprot número P61073-1 (SEQ ID NO: 105).

Los polipéptidos de unión a CXCR4 entran en contacto con los mismos residuos que se ha demostrado que son responsables de la unión de moléculas pequeñas como AMD3100, lo que indica que los polipéptidos de unión a CXCR4 pueden penetrar profundamente en el bolsillo de unión de CXCR4. En un ejemplo particular, el polipéptido se une a la posición D262 de CXCR4.

El polipéptido de la presente descripción puede usarse generalmente para modular la señalización mediada por CXCR4 y/o para modular las vías biológicas donde está implicado CXCR4 y/o para modular los mecanismos biológicos, las respuestas y los efectos asociados con dicha señalización o estas vías.

En un ejemplo, el polipéptido se puede usar para modular (es decir, inhibir, prevenir, estimular o potenciar) una o más de las siguientes actividades:

(i) flujo de calcio en células que expresan CXCR4;

(ii) AMPc en células que expresan CXCR4;

(iii) señalización de p-arrestina en células que expresan CXCR4;

(iv) apoptosis en células que expresan CXCR4;

(v) proliferación celular de células que expresan CXCR4;

(vi) metástasis de células que expresan CXCR4;

(vii) angiogénesis inducida por CXCR4; y

(viii) migración de células que expresan CXCR4.

En un ejemplo, la proliferación de células tumorales puede aumentar o disminuir en al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 50 % o al menos un 60 %, o un 70 % o un 75 %, o un 80 % o un 90 % o más, en comparación con la diferenciación y/o proliferación de células tumorales en las mismas condiciones sin la presencia del polipéptido.

En un ejemplo, el polipéptido puede usarse para inhibir la proliferación de células tumorales en un ensayo de proliferación de células tumorales con un IC⁵⁰ de menos de 600 nM, menos de 500 nM, menos de 200 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 25 nM, menos de 10 nM o menos de 5 nM. En un ejemplo, el ensayo de proliferación de células tumorales es una proliferación de células de 5-bromo-2'-desoxiuridina o ensayo CTG (CellTiter-Glo®). En otro ejemplo, la inhibición de la proliferación de células tumorales se determina mediante un ensayo MTT.

En un ejemplo, la inducción de apoptosis en células que expresan CXCR4 por el polipéptido de la presente descripción puede medirse mediante ensayo de caspasa, ensayo de fragmentación de ADN y túnel, ensayo de permeabilidad celular, ensayo de anexina V, ensayo de escisión de proteínas y ensayo mitocondrial y a Tp /ADP. Dichos ensayos serán familiares para los expertos en la materia.

En un ejemplo, el polipéptido de la presente descripción se puede usar para inhibir metástasis de células tumorales CXCR4+, por ejemplo, en un modelo de cáncer de mama metastásico con células que expresan CXCR4, por ejemplo, células MDA-MB-231 o MDA-MB-468.

Por consiguiente, la presente descripción también proporciona un método para inhibir la metástasis de una célula cancerosa que expresa CXCR4.

En un ejemplo, el polipéptido de la presente divulgación puede usarse para inhibir la migración inducida por SDF-1 de células que expresan CXCR4, por ejemplo, en células CEM, MDA-MB-231, MDA-MB-468, PC3 y Ramos.

En un ejemplo, el polipéptido de la presente descripción se puede usar para inhibir la angiogénesis, que se puede medir en un ensayo de formación de tubos capilares, por ejemplo, con células HUVEC o células MDA-MB-231.

En un ejemplo, el polipéptido de la presente descripción se usa en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 en un sujeto.

El CXCR4 humano al que se une el polipéptido puede estar en forma monomérica, dimérica o multimérica. Por ejemplo, el CXCR4 humano puede estar en forma de heterodímero. Los ejemplos de heterodímeros CXCR que se han descrito incluyen CXCR4/CXCR7 (Levoye et al Sangre 2009 113; 6085- 6093), CXCR4/CCR2 (Sohy y col. J Biol Chem. 2007282; 30062-30069), CXCR4/ p2AP (receptor adrenérgico p2) (La Rocca et al J Cardiovasc Pharmacol. 2010 56; 548-559), CXCR4/CCR5 (Sohy y col. J Biol Chem. 2009284; 31270-31279), CXCR4/ DOR (receptor opioide delta) (Pello et al Eur. J. Immunol. 2008 38; 537-549). También se ha demostrado que CXCR4 interactúa con el receptor de células T (Kremer y col. J. Immunol. 2011 187; 1440-1447). Estos dímeros pueden modular los resultados de la señalización inducida por SDF-1 y los antagonistas del i-cuerpo descritos también pueden alterar las consecuencias de la señalización en comparación con el CXCR4 como monómero.

En un ejemplo, el polipéptido de la presente descripción se une a una transmembrana u otro dominio que influye en la estructura de CXCR4.

En otro ejemplo, el polipéptido de la presente descripción se une específicamente a cualquier parte, región, dominio, bucle o epítopo extracelular adecuado de CXCR4. En un ejemplo, el polipéptido se une específicamente a una de las partes extracelulares de los dominios transmembrana o a uno de los bucles extracelulares que unen los dominios transmembrana.

En otro ejemplo, el polipéptido de la descripción está PEGilado.

La presente descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en este documento.

En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad, al menos un 90 % de identidad o al menos un 95 % de identidad, o al menos un 97 % de identidad, o al menos un 98 % de identidad, o al menos un 99 % de identidad, o 100% de identidad a cualquiera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, o SEQ ID NO: 79.

En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de homología, al menos un 90 % de homología, o al menos un 95 % de homología, o al menos un 97 % de homología, o al menos un 98 % de homología, o al menos un 99 % de homología, o 100% de homología a cualquiera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, o SEQ ID NO: 79.

En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consta de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 76.

La presente descripción también proporciona una construcción de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento.

La presente divulgación también proporciona una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico o la construcción de expresión descrita en el presente documento.

La presente divulgación también proporciona un método para producir un polipéptido de la presente divulgación que comprende el cultivo de una célula huésped en condiciones que permitan la expresión del polipéptido y la recuperación del polipéptido.

La presente descripción también proporciona un conjugado (por ejemplo, inmunoconjugado) que comprende un polipéptido descrito en este documento y un agente.

El agente puede ser, por ejemplo, un agente terapéutico, una toxina, un marcador detectable o un agente que prolongue la vida media del polipéptido. En un ejemplo, el agente es polietilenglicol (PEG). En otro ejemplo, el agente es una secuencia consecutiva de Pro-Ala-Ser (PAS).

En un ejemplo, el agente que prolonga la semivida del polipéptido se une a una proteína sérica (por ejemplo, albúmina) o a una porción Fc de una inmunoglobulina.

En otro ejemplo, el polipéptido de la invención se puede unir a una toxina o a un fármaco citotóxico para administrarlo a células tales como células tumorales.

En otro ejemplo, el polipéptido de la invención puede unirse a un marcador como un radioisótopo.

La presente divulgación también proporciona un multímero que comprende dos o más polipéptidos descritos en este documento. Los polipéptidos pueden comprender secuencias de aminoácidos iguales o diferentes. Por ejemplo, en su forma más simple, al menos dos polipéptidos están directamente unidos a través de un conector, secuencia o espaciador adecuado. Por ejemplo. el enlazador o espaciador puede tener entre 1 y 50 aminoácidos. Por ejemplo, un enlazador adecuado es un enlazador GS9 o un enlazador GS15 o un enlazador GS20.

La presente divulgación también proporciona polipéptidos multivalentes o multiespecíficos (incluyendo polipéptidos biespecíficos). En un ejemplo, la divulgación proporciona un polipéptido de la presente divulgación unido a un polipéptido dirigido a un objetivo distinto de CXCR4, que incluye, entre otros, albúmina sérica humana para aumentar la semivida, CD3, CD64, CD16 o CD89 para redirigir y activar cualquier célula T circulante contra los tumores. En un ejemplo particular, el polipéptido multiespecífico es un polipéptido biespecífico que se une a CXCR4 y albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés), comprendiendo el polipéptido la secuencia de SEQ ID NO: 80.

La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o un conjugado o un multímero como se describe en este documento y un vehículo aceptable.

La presente divulgación también proporciona un polipéptido, un conjugado o un multímero según la presente divulgación para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4, comprendiendo el polipéptido una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 76.

En un ejemplo, el polipéptido de la presente descripción se une específicamente al CXCR4 humano.

La presente descripción también proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 o una enfermedad o trastorno asociado con la señalización de CXCR4 o una vía o mecanismo donde está involucrado CXCR4, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un polipéptido o un conjugado o un multímero de la presente descripción.

En un ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:

44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 76.

Las enfermedades o trastornos susceptibles de tratamiento con el polipéptido, molécula de ácido nucleico, conjugado o multímero de la presente descripción incluyen cánceres (por ejemplo, cánceres hematopoyéticos: CLL, AML, ALL, MM, NHL; tumores sólidos: cáncer de mama, cáncer de pulmón, tumores cerebrales; quimiorresistencia estromal de tumores; leucemia y otros cánceres), infecciones virales (por ejemplo, VIH/SIDA, encefalitis por el virus del Nilo Occidental), enfermedades inflamatorias (por ejemplo, artritis reumatoide, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedades neuroinflamatorias), fibrosis, por ejemplo, pulmonar (fibrosis pulmonar), esclerosis sistémica, enfermedad renal (nefropatía diabética, FSGS como ejemplos), hígado, ojo (uveítis, a Md , retinopatía diabética); trastornos de inmunodeficiencia; esclerosis múltiple y accidente cerebrovascular. Cicatrización de tejidos y heridas, incluidas cicatrices, quemaduras o quemaduras inducidas por radiación.

En un ejemplo particular, la enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 es la fibrosis. En otro ejemplo, el trastorno es fibrosis pulmonar idiopática (IPF, por sus siglas en inglés). En otro ejemplo particular, la enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 es la enfermedad renal.

En otro ejemplo, la enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 es la esclerosis múltiple.

En otro ejemplo, la enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 es la aterosclerosis.

En otro ejemplo, la enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 es el VIH.

El polipéptido de la presente descripción puede provocar o no la movilización de células madre. En un ejemplo, la presente divulgación también proporciona un método para la movilización de células madre de sangre periférica, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un polipéptido, molécula de ácido nucleico, conjugado o multímero de la presente divulgación. En un ejemplo, las células madre de sangre periférica se utilizan para el trasplante autólogo de células madre.

En un ejemplo, el sujeto que lo necesita tiene mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda o linfoma no Hodgkin. En otro ejemplo, las células madre son células CD34+.

En general, se ha demostrado que los anticuerpos dirigidos contra CXCR4 movilizan células madre, lo que no es deseable para un enfoque terapéutico en algunas indicaciones. Los polipéptidos de la presente descripción no provocan sustancialmente la movilización de células madre. En un ejemplo, un polipéptido de la presente descripción reduce la movilización de células madre en al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % en comparación con el control AMD3100.

En otro ejemplo, el polipéptido no inhibe sustancialmente el flujo de calcio.

La presente divulgación también proporciona un fragmento funcional de un polipéptido de unión a CXCR4 descrito en este documento. En un ejemplo, el fragmento funcional comprende la secuencia CDR3 de una molécula de unión a CXCR4 descrita en el presente documento. Por "fragmento funcional" se entiende un fragmento que se une a CXCR4 humano con una afinidad que es sustancialmente similar o mejorada cuando se compara con el polipéptido de longitud completa del que deriva, y que inhibe o previene la señalización mediada por CXCR4. Preferiblemente, el fragmento se une a uno o más residuos centrales de CXCR4 humano seleccionados del grupo que consiste en E32, Y184, F189, W195, D262 y L266 o combinaciones de cualquiera de estos.

En otro ejemplo, el fragmento funcional comprende una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, o SEQ ID NO: 78.

La presente divulgación proporciona además un péptido mimético basado en un polipéptido de unión a CXCR4 descrito en este documento o una porción del mismo, tal como una secuencia CDR3 de un polipéptido de unión a CXCR4 descrito en este documento. El péptido mimético se puede basar o derivar de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, o SEQ ID NO: 78. La presente descripción también contempla composiciones que comprenden uno o más péptidos miméticos para usar en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4, en particular una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 descrito en el presente documento.

La presente divulgación proporciona adicionalmente el polipéptido o el ácido nucleico o la construcción de expresión, o la célula o la composición de la presente divulgación para su uso en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4.

La presente divulgación proporciona adicionalmente el uso del polipéptido o el ácido nucleico o la construcción de expresión o la célula o la composición de la presente divulgación en medicina.

La presente divulgación también proporciona el uso de un polipéptido o el ácido nucleico o la construcción de expresión o la célula o la composición de la presente divulgación para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4.

En un ejemplo particular, la enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 es la fibrosis. En otro ejemplo particular, la enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 es la fibrosis pulmonar. En otro ejemplo es la fibrosis hepática. En otro ejemplo, es una condición del ojo relacionada con la fibrosis. En otro ejemplo es la fibrosis de la piel. En otro ejemplo más, es la fibrosis renal.

La presente divulgación proporciona adicionalmente el uso del polipéptido o el ácido nucleico o la construcción de expresión o la célula de la presente divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o afección relacionada con CXCR4.

El polipéptido de la presente descripción también puede usarse en un formato de diagnóstico.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona adicionalmente un método para detectar CXCR4 en una muestra obtenida de un sujeto, comprendiendo el método poner en contacto una muestra con el polipéptido de la divulgación de manera que se forme un complejo de CXCR4-polipéptido y detectar el complejo, en donde detectar el complejo es indicativo de CXCR4 en la muestra. En un ejemplo, la muestra es de un sujeto que padece una enfermedad o afección relacionada con CXCR4. En otro ejemplo, la muestra es una muestra biológica.

La presente descripción también proporciona un método para detectar un complejo de polipéptido de unión a CXCR4 unido a CXCR4 humano en un sujeto o en una muestra obtenida de un sujeto, comprendiendo el método permitir que dicho complejo se forme y detectar el complejo formado. En un ejemplo, el CXCR4 humano puede ser un dímero, trímero o multímero. Los métodos para detectar la formación de complejos serán familiares para los expertos en la materia. Los ejemplos incluyen el análisis de transferencia Western o la resonancia de plasmones superficiales (biacore). Alternativamente, pueden usarse métodos basados en fluorescencia donde la formación del complejo da como resultado la producción de una señal detectable por fluorescencia que puede o no cuantificarse.

La presente divulgación también proporciona un complejo de un polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación unido a CXCR4 humano. La porción CXCR4 humana del complejo puede estar en forma de dímero, trímero o multímero.

La presente divulgación proporciona además un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 en un sujeto, comprendiendo el método realizar el método descrito en el presente documento para detectar CXCR4 en una muestra del sujeto, donde la detección de CXCR4 en la muestra es indicativa de la enfermedad o desorden. En un ejemplo, el método comprende determinar el nivel de CXCR4 en la muestra, donde un nivel aumentado o disminuido de CXCR4 en la muestra en comparación con una muestra de control es indicativo de la enfermedad o trastorno.

La presente descripción proporciona además un método para localizar y/o detectar y/o diagnosticar y/o pronosticar una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4, comprendiendo el método detectar in vivo el polipéptido de la presente descripción se une a CXCR4, si está presente, donde el polipéptido se conjuga con una etiqueta detectable.

En un ejemplo, el método comprende además administrar el polipéptido al sujeto.

En un ejemplo de cualquier método de tratamiento/profilaxis/diagnóstico/pronóstico descrito en el presente documento, la enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 es cáncer, infección viral (por ejemplo, VIH), enfermedad inflamatoria, enfermedades neuroinflamatorias; fibrosis, trastorno de inmunodeficiencia; esclerosis múltiple, sofocos o accidente cerebrovascular. En otro ejemplo, la enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 es fibrosis, cáncer o inflamación. El término "sujeto" según la presente descripción pretende incluir animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 es una representación esquemática que muestra la secuencia del dominio NCAM humano 1 (A); el andamio icuerpo y CDR1 (representado por XXXXXX) y CDR3 (representado por Yn) (B); secuencia de un aglutinante específico de CXCR4, ADCX-99 (C) y secuencia de consenso para aglutinantes madurados por afinidad de ACDX-99 (D). X e Y son cualquier aminoácido, n es un número entre 10 y 20 inclusive. A', B' es cualquier aminoácido. Z está ausente o los aminoácidos M, EAEA, MA o MP.

Figura 2-1 y 2-2 muestran afinidades de resonancia de plasmón superficial (SPR; Biacore) para (A) ADCX-306 (22,5 uM), (B) ADCX-272 (1,6 uM) y (C) ADCX-668 (42 uM).

Figura 3-1 a 3-3 muestra actividad de p-arrestina para ADCX-99 (con Flag, histidina (FH) y con etiqueta de proteína IM7-FH), ADCX-6, ADCX-306, ADCX-668 y ADCX-272 en varias concentraciones como se indica. Todos los i-cuerpos demostraron algún grado de inhibición de la p-arrestina.

Figura 4 muestra los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) para la proteína i-cuerpo ADCX-99 (conjugada con IM7-FH (proteína de inmunidad etiquetada con histidina bandera IM7) purificada de la fracción periplásmica. La SEC se realizó utilizando una columna Superdex 75.

Figura 5 muestra resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés; BIAcore) de i-cuerpo ADCX-99 para unirse a lipopartículas positivas para CXCR4 inmovilizadas (A). ADCX-99 no se unió a lipopartículas nulas (B) o a lipopartículas positivas para CCR5 (C).

Figura 6 muestra 90 i-cuerpos individuales de una biblioteca mutante madurada por afinidad derivada de i-cuerpo ADCX-99. Se analizó la expresión de los i-cuerpos madurados por afinidad mediante la unión del anticuerpo anti-FLAG en comparación con los controles negativos ADCX-272 y ADR-3 y el i-cuerpo ADCX-99 de tipo salvaje, que se cultivaron en las mismas condiciones y se proporciona en las dos últimas columnas.

Figura 7-1 y 7-2 muestra 90 i-cuerpos individuales de la biblioteca mutante madurada por afinidad de i-cuerpo ADCX-99. Se analizó la unión de los i-cuerpos madurados por afinidad a lipopartículas positivas para CXCR4 (A) ya lipopartículas positivas para CCR5 (B). La unión de los i-cuerpos madurados por afinidad a las lipopartículas positivas para CXCR4 y CCR5 se compara con la unión del i-cuerpo ADCX-99 de tipo salvaje (las dos últimas columnas) y el control positivo icuerpo ADCX-272, y el control negativo i -cuerpo ADR-3.

Figura 8 muestra el alineamiento de secuencias de los i-cuerpos madurados por afinidad en relación con la secuencia inicial ADCX-99.

Figura 9 muestra la especificidad de los i-cuerpos (de la Tabla 4) que actúan como antagonistas frente a una serie de receptores de quimiocinas expresados en células y medidos mediante ensayo de p-arrestina.

Figura 10 muestra alineaciones de secuencias individuales para i-cuerpos AM4-661 (A), AM4-272 (B) y AM3-114, AM3-523 y AM5-245 en relación con ADCX-99 (C).

Figura 11 muestra resonancia de plasmón superficial (SPR; BIAcore) de la unión biespecífica de AM3-114-lm7-S21 a CXCR4 y albúmina de suero humano (HSA). (A) unión de i-cuerpo biespecífico AM3-114-lm7-S21 a HSA por el péptido SA21 (Kd 518 (+/-2) nM) a varias concentraciones 60 nM, 200 nM, 600 nM y 1,00 |jM, (B) falta de unión de i-cuerpo Am 3-114 a HSA a varias concentraciones 60 nM, 200 nM, 600 nM y 1,00 j M, (C) unión de i-cuerpo AM3-114 a CXCR4 (Kd 9 nM) y (D) unión de AM3-114-lm7-S21 biespecífico a CXCR4 (Kd 9 nM).

Figura 12 muestra el perfil de concentración de i-cuerpo después de la inyección intravenosa de ratones, según lo determinado por espectrometría de masas cuantitativa. Los i-cuerpos (AM3-114, AM4-746) se conjugaron con IM7-FH, IM7-FH-SA21 o PEG (30K o 2x20K) y se compararon con el control no conjugado, ADCX99-9xHis.

Figura 13 muestra la detección de señal quimioluminiscente de CXCR4 para i-cuerpos AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746 y AM4-1121, control positivo AMD3100 y control negativo i-cuerpo medidos por ensayo de AMPc.

Figura 14 muestra el porcentaje de inhibición del flujo de calcio medido con el kit QuestTM Fluo-8 para i-cuerpos AM3-^{1 1 4} , AM4-272, AM3-523, AM4-746 y AM4-1121, control Ag (SDF-1), 21H5 negativo control i-cuerpo y AMD3100 control positivo (concentración efectiva EC⁸⁰).

Figura 15 muestra los resultados del ensayo BRET p-arrestina para (A) anti-CXCR4 i-cuerpo AM3-114 en comparación con dos controles positivos (molécula pequeña AMD3100 y MAb12G5) y un control negativo i-cuerpo; y (B) i-cuerpos anti-CXCR4 AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746 y AM4-1121, control positivo (AMD3100) y ADCX-99.

Figuras 16-1 a 16-3 muestran afinidad de unión determinada por citometría de flujo de i-cuerpo AM3-114 a varias líneas celulares que no expresan CXCR4 T47D (A), y que expresan CXCR4 en varios niveles, que incluyen: Namalwa (B), MOLP8 (C), MOLT4 (D), Jurkat (E), CCRF-CEM (F), A498 (G), Ramos (H), NCI-H69 (I) y HL-60 (J). Todas las líneas celulares se analizaron con concentraciones de i-cuerpos de 10, 1 y 0,001 ^j M y, además, las células Namalwa (B) se analizaron con i-cuerpos a 4,7, 2,1, 0,47, 0,21, 0,1 y 0,01 j M.

Figura 17 muestra la competencia de los i-cuerpos de CXCR4 con SDF-1 por la unión a lipopartículas positivas de CXCR4 medidas por resonancia de plasmón superficial (SPR; BIAcore). Datos mostrados para i-cuerpo AM3-114 (A) y AM4-272 (B).

Figura 18 muestra la competencia de la unión del i-cuerpo CXCR4 a las células Ramos con varias moléculas. I-cuerpos AM3-114 (panel superior), AM4-272 (panel central), AM3-523 (panel inferior) unidos a células Ramos y esta unión se redujo en diversos grados al agregar AMD3100, MAb12G5 y el ligando natural SDF-1.

Figura 19-1 y 19-2 muestran la apoptosis inducida por el i-cuerpo CXCR4 de células Ramos. I-cuerpos AM3-114 (AD-114), AM4-272 (AD-272), AM3-523 (AD-523) unidos a células Ramos e inducida por apoptosis evaluada mediante doble tinción de anexina V y yoduro de propidio (arriba a la izquierda cuadrante en cada una de las trazas de citometría de flujo). Las células no tratadas actuaron como control negativo y la tapsigargina es un inductor de apoptosis bien descrito (19-1). La cuantificación de las trazas de citometría de flujo se muestra en forma gráfica (19-2).

Figura 20 muestra los resultados de un ensayo de inhibición del VIH para los i-cuerpos AM3-272, AM3-114 y AM1-320 en relación con un i-cuerpo de control negativo y la molécula pequeña de control positivo AMD3100.

Figura 21 muestra la viabilidad de las células NP2-CD4/CXCR4 de los i-cuerpos AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746 y AM4-1121 y el control 21H5 medido con un lector de microplacas FLUOStar.

Figura 22 muestra la inhibición de las cepas de VIH (NL4.3 y 1109-F-30) con varios i-cuerpos AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746 y AM4-1121 en relación con un i-cuerpo de control negativo 21H5. Los i-cuerpos de CXCR4 bloquean la infección del del VIH de una manera dependiente de la dosis. VSVG es la envoltura del virus de la estomatitis vesicular que sufre endocitosis después de unirse a un receptor no relacionado.

Figura 23-1 y 23-2 muestran la inhibición del VIH con i-cuerpos AM3-114 y AM4-746 de CXCR4 PEGilados (30 kDa y 2x20 KDa PEG) y no PEGilados. Los i-cuerpos de CXCR4 bloquean la infección de tres cepas de VIH de forma dependiente de la dosis (A). Los i-cuerpos de CXCR4 no pueden bloquear la infección de una cepa de VIH dependiente de CCR5 (B).

Figura 24 muestra el recuento de glóbulos blancos (A) de sangre periférica (PB, por sus siglas en inglés) de ratones inyectados con i-cuerpos AM4-272, AM4-746, AM4-1121, AM3-114, AM3-523 o controles negativos de solución salina, control de i-cuerpo isotipo (21H5) o control positivo AMD3100; la falta de movilización de células LSK por parte de los icuerpos se muestra en (B) y la falta de movilización de células LSKSLAM por parte de i-cuerpos se muestra en (C).

Figura 25 muestra i-cuerpos AM3-114 y AM4-523 y el control negativo i-cuerpo 21H5 no movilizan células madre en comparación con el control positivo AMD3100 en un modelo de ratón humanizado NODSIL2RY (NSG). ns= no estadísticamente significativo.

Figura 26 muestra que los i-cuerpos de CXCR4 no movilizan tallo ni progenitores humanos. Experimentos de unión in vitro en CD34+CD38'HSC clasificados (A) Diagrama de puntos representativo de CD34+CD38'HSChumano. (B) Histograma de citometría de flujo representativo de la unión de i-cuerpo a la sangre del cordón umbilical humano (CB, por sus siglas en inglés) CD34+c D38‘ HSC con AM3-114, AM4-272 y AM3-523 como indican las flechas (C) Histograma representativo de la unión de AM3-114 a BM CD34+CD38' HSC humano y muCD45'huCD45+CD34+CD38‘ H^s C de huNSG ^b M en relación con el control i-cuerpo (21H5).

Figura 27 muestra el efecto de los i-cuerpos AM3-114 (A) y AM4-272 (B) sobre la expresión del gen profibrótico en ratones tratados con láser. Se analizó un panel de 85 genes profibróticos para determinar los niveles de ARNm en ratones tratados con i-cuerpo.

Figura 28 muestra la unión del i-cuerpo AM3-114 a fibrocitos humanos. Los fibrocitos humanos se identificaron mediante tinción con un anticuerpo contra CD45. La unión de i-cuerpo AM3-114 se identificó mediante un anticuerpo anti-FLAG a la etiqueta C-terminal. Se usó DAPI para teñir el núcleo de las células. El panel final es una imagen fusionada de las tres manchas.

Figura 29 muestra los i-cuerpos AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746 y AM4-1121 que inhiben la infiltración de leucocitos en una bolsa de aire murina cargada con SDF-1 en comparación con un i-cuerpo de control negativo (que no se une a CXCR4), controles positivos AMD3100 y MSX-122 y un control solo de vehículo.

Figura 30 muestra el efecto de i-cuerpos (AM3-114, AM4-272, AM3-523) a diferentes dosis sobre el reclutamiento de fibrocitos intrapulmonares después de la lesión por bleomicina en comparación con los controles positivos AMD3100 y Pirfenidona y el control negativo i-cuerpo (21H5). Los fibrocitos se midieron tiñendo el tejido pulmonar de ratones tratados con bleomicina para células CD45+CXCR4+ Col 1+. El porcentaje de células que son fibrocitos se indica en el eje Y.

Figura 31-1 a 31-3 muestran el efecto de i-cuerpos (AM3-114, AM4-272, AM3-523), antagonista de molécula pequeña CXCR4 AMD3100 y control negativo i-cuerpo 21H5 en la inhibición de la invasión de fibroblastos pulmonares IPF humanos. Densidades relativas de heridas (%) de líneas de fibroblastos de pulmón IPF en presencia de i-cuerpos. Fibroblastos de pulmón normal (A), de progresor lento de IPF (B) y de progresor rápido de IPF (C). Las flechas indican i-cuerpo AM3-114 que inhibió específicamente la migración de fibroblastos pulmonares IPF (B y C), i-cuerpo AM4-272 inhibió fibroblastos de progresión rápida (C) pero ninguno de los i-cuerpo tuvo ningún efecto sobre los fibroblastos pulmonares normales (A). AMD3100 y el control negativo i-cuerpo 21H5 no tuvieron efecto en ninguna de estas líneas celulares.

Figura 32 muestra que el i-cuerpo AM3-114-6H redujo notablemente ACTA2, COL1A1, COL3A1 y FN1 expresión de transcripción en fibroblastos de pulmón de IPF lento. Los fibroblastos de pulmón lentos se sembraron en BME y se trataron con 2 mg/ml de BME solo (barras abiertas) y que contenía i-cuerpo AM3-114-6H (barras grises) o AMD3100 (barras negras). Se extrajo el ARN y se realizó un análisis de qPCR para las transcripciones profibróticas. Se representa la expresión de transcripción promedio de SMA alfa, COL1A1, COL3A1, y FN1 en fibroblastos de pulmón lento (n=3/grupo).

Figura 33 muestra la capacidad de los i-cuerpos para bloquear la agregación plaquetaria. AM4-272, AM4-746, AM4-1121, AM3-114, AM3-523 y MAb12G5, así como un i-cuerpo control negativo (21H5) y un control negativo MAB (mlgG2a) se analizaron para bloquear la formación de plaquetas inducida por SDF-1a. En estas condiciones, los i-cuerpos AM3-114 y AM4-1121 fueron los más efectivos para bloquear esta agregación.

Figura 34 muestra el efecto de i-cuerpo AM4-272 en las puntuaciones clínicas y el peso corporal de ratones con EAE inducida. Las líneas representan los pesos corporales de los ratones en los grupos con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, por sus siglas en inglés) inducida por MOG y diversos tratamientos. Las barras representan puntuaciones clínicas de los ratones en los diversos grupos. I-cuerpo AM4-272 reduce las puntuaciones clínicas y previene la pérdida de peso corporal observada en animales con EAE inducida por MOG.

Clave para el listado de secuencias

SEQ ID NO 1: secuencia de aminoácidos que codifica el dominio 1 de NCAM de Homo sapiens

SEQ ID NO: 2 secuencia de aminoácidos que codifica el andamio del i-cuerpo.

SEQ ID NO: 3 secuencia de aminoácidos que codifica el dominio 1 de NCAM de Bos taurus

SEQ ID NO: 4 secuencia de aminoácidos que codifica el dominio 1 de NCAM de Mus musculus

SEQ ID NO: 5 secuencia de aminoácidos que codifica el dominio 1 de NCAM de Rat rattus

SEQ ID NO: 6 secuencia de aminoácidos que codifica el dominio 1 de NCAM de Gallus

SEQ ID NO: 7 secuencia de aminoácidos que codifica el dominio 1 de NCAM2 de Xenopus laevis

SEQ ID NO: 8 secuencia de aminoácidos que codifica el dominio 1 de NCAM1 de Xenopus laevis

SEQ ID NO: 9 secuencia de aminoácidos que codifica el dominio 1 de NCAM2 de Homo sapiens

SEQ ID NO: 10 secuencia de aminoácidos que codifica el dominio 1 de NCAM2 de Mus musculus

SEQ ID NO: 11 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-99

SEQ ID NO: 12 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-99 CDR1

SEQ ID NO: 13 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-99 CDR3

SEQ ID NO: 14 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-272

SEQ ID NO 15 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-272 CDR1

SEQ ID NO 16 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-272 CDR3

SEQ ID NO 17 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-6

SEQ ID NO 18 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-6 CDR1

SEQ ID NO 19 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-6 CDR3

SEQ ID NO 20 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-54

SEQ ID NO 21 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-54 CDR1

SEQ ID NO 22 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-54 CDR3

SEQ ID NO 23 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-LS

SEQ ID NO 24 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-LS CDR1

SEQ ID NO 25 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-LS CDR3

SEQ ID NO 26 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-668

SEQ ID NO 27 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-668 CDR1

SEQ ID NO 28 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-668 CDR3

SEQ ID NO 29 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-306

SEQ ID NO 30 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-306 CDR1

SEQ ID NO 31 Secuencia de aminoácidos que codifica ADCX-306 CDR3

SEQ ID NO 32 Secuencia de nucleótidos que codifica ADCX-99

SEQ ID NO 33 Secuencia de nucleótidos que codifica ADCX-272

SEQ ID NO 34 Secuencia de nucleótidos que codifica ADCX-6

SEQ ID NO 35 Secuencia de nucleótidos que codifica ADCX-54

SEQ ID NO 36 Secuencia de nucleótidos que codifica ADCX-LS

SEQ ID NO 37 Secuencia de nucleótidos que codifica ADCX-668

SEQ ID NO 38 Secuencia de nucleótidos que codifica ADCX-306

SEQ ID NO 39 secuencia de aminoácidos consenso de i-cuerpos madurados por afinidad.

SEQ ID NO 40 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-114

SEQ ID NO 41 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-114 CDR1

SEQ ID NO 42 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-114 CDR3

SEQ ID NO 43 Secuencia de nucleótidos que codifica AM3-114

SEQ ID NO 44 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-920

SEQ ID NO 45 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-920 CDR1

SEQ ID NO 46 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-920 CDR3

SEQ ID NO 47 Secuencia de nucleótidos que codifica AM3-920

SEQ ID NO 48 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-1121

SEQ ID NO 49 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-1121 CDR1

SEQ ID NO 50 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-1121 CDR3

SEQ ID NO 51 Secuencia de nucleótidos que codifica AM4-1121

SEQ ID NO 52 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-613

SEQ ID NO 53 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-613 CDR1

SEQ ID NO 54 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-613 CDR3

SEQ ID NO 55 Secuencia de nucleótidos que codifica AM4-613

SEQ ID NO 56 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-523

SEQ ID NO 57 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-523 CDR1

SEQ ID NO 58 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-523 CDR3

SEQ ID NO 59 Secuencia de nucleótidos que codifica AM3-523

SEQ ID NO 60 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-661

SEQ ID NO 61 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-661 CDR1

SEQ ID NO 62 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-661 CDR3

SEQ ID NO 63 Secuencia de nucleótidos que codifica AM4-661

SEQ ID NO 64 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-466

SEQ ID NO 65 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-466 CDR1

SEQ ID NO 66 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-466 CDR3

SEQ ID NO 67 Secuencia de nucleótidos que codifica AM3-466

SEQ ID NO 68 Secuencia de aminoácidos que codifica AM5-245

SEQ ID NO 69 Secuencia de aminoácidos que codifica AM5-245 CDR1

SEQ ID NO 70 Secuencia de aminoácidos que codifica AM5-245 CDR3

SEQ ID NO 71 Secuencia de nucleótidos que codifica AM5-245

SEQ ID NO 72 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-272

SEQ ID NO 73 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-272 CDR1

SEQ ID NO 74 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-272 CDR3

SEQ ID NO 75 Secuencia de nucleótidos que codifica AM4-272

SEQ ID NO 76 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-746

SEQ ID NO 77 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-746 CDR1

SEQ ID NO 78 Secuencia de aminoácidos que codifica AM4-746 CDR3

SEQ ID NO 79 Secuencia de nucleótidos que codifica AM4-746

SEQ ID NO 80 Secuencia de aminoácidos que codifica AM3-114-lm7-FH-SA21 i-cuerpo de doble especificidad SEQ ID NO:81 secuencia de nucleótidos que codifica AM3-114-lm7-FH-SA21 i-cuerpo de doble especificidad SEQ ID NO:82 secuencia de aminoácidos que codifica el i-cuerpo de 21H5

SEQ ID NO:83 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-774 CDR1

SEQ ID NO:84 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-774 CDR3

SEQ ID NO:85 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-208 CDR1

SEQ ID NO:86 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-208 CDR3

SEQ ID NO:87 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-1088 CDR1

SEQ ID NO:88 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-1088 CDR3

SEQ ID NO:89 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-239 CDR1

SEQ ID NO:90 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-239 CDR3

SEQ ID NO:91 secuencia de aminoácidos que codifica AM3-32 CDR1

SEQ ID NO:92 secuencia de aminoácidos que codifica AM3-32 CDR3

SEQ ID NO:93 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-757 CDR1

SEQ ID NO:94 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-757 CDR3

SEQ ID NO:95 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-386 CDR1

SEQ ID NO:96 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-386 CDR3

SEQ ID NO:97 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-352 CDR1

SEQ ID NO:98 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-352 CDR3

SEQ ID NO:99 secuencia de aminoácidos que codifica AM3-182 CDR1

SEQ ID NO:100 secuencia de aminoácidos que codifica AM3-182 CDR3

SEQ ID NO:101 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-203 CDR1

SEQ ID NO:102 secuencia de aminoácidos que codifica AM4-203 CDR3

SEQ ID NO:103 secuencia de aminoácidos que codifica AM5-95 CDR1

SEQ ID NO:104 secuencia de aminoácidos que codifica AM5-95 CDR3

SEQ ID NO:105 secuencia de aminoácidos que codifica CXCR4 humano

Descripción detallada

General

Se entenderá que el término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" significa "X e Y" o "X o Y" y se considerará que proporciona soporte explícito para ambos significados o para cualquier significado.

A lo largo de esta especificación, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a un solo paso, composición de la materia, grupo de pasos o grupo de composiciones de la materia se considerará para abarcar uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de esos pasos, composiciones de materia, grupos de pasos o grupo de composiciones de materia.

El alcance de la presente divulgación no está limitado por las realizaciones específicas descritas en el presente documento, que están destinadas únicamente a fines de ejemplificación. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la descripción, como se describe en este documento.

Cualquier ejemplo en este documento se tomará para aplicar mutatis mutandis a cualquier otro ejemplo a menos que se indique específicamente lo contrario.

Definiciones seleccionadas

El término "comprende", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un determinado elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o paso, o grupo de elementos, enteros o pasos.

Como se usa aquí, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de unión de una sola molécula a sus ligandos y normalmente se expresa como la constante de disociación en equilibrio (K^d) para la unión reversible de dos agentes. Está determinada por la relación de Kdisociación/Kasociación, entre el i-cuerpo o el polipéptido de unión a CXCR4 de la presente descripción y CXCR4. Kd y la afinidad están inversamente relacionados. El valor Kd se relaciona con la concentración de i-cuerpo o polipéptido de unión a CXCR4 y, por lo tanto, cuanto menor sea el valor de KD (menor concentración), mayor será la afinidad del anticuerpo. La afinidad de un polipéptido de unión a CXCR4 o i-cuerpo de la presente divulgación a CXCR4 puede ser, por ejemplo, de alrededor de 100 nanomolar (nM) a alrededor de 0,1 nM, de alrededor de 100 nM a alrededor de 1 picomolar (pM), o de alrededor de 100 nM a alrededor de 1 femtomolar (fM) o más.

Como se usa en el presente documento, el término "se une" en referencia a la interacción de una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 con un objetivo significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) en el objetivo. Por ejemplo, una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de a las proteínas en general.

Como se usa en el presente documento, el término "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere a la agrupación de aminoácidos sobre la base de ciertas propiedades comunes. Una forma funcional de definir propiedades comunes entre aminoácidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de cambios de aminoácidos entre proteínas correspondientes de organismos homólogos. De acuerdo con dicho análisis, los grupos de aminoácidos pueden definirse donde los aminoácidos dentro de un grupo se intercambian preferentemente entre sí y, por lo tanto, se parecen más entre sí en su impacto en la estructura general de la proteína (Schulz GE y RH Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer -Verlag). Los ejemplos de grupos de aminoácidos definidos de esta manera incluyen:

(i) grupos cargados, que consisten en Glu, Asp, Lys, Arg y His,

(ii) grupos aromáticos compuestos por Phe, Tyr y Trp,

(iii) grupo de anillo de nitrógeno que consta de His y Trp,

(iv) grupo ligeramente polar formado por Met y Cys, etc.

Como se usa en el presente documento, el término "enfermedad o afección relacionada con CXCR4" se entenderá como enfermedad y trastornos que pueden prevenirse y/o tratarse, respectivamente, mediante la administración adecuada a un sujeto que lo necesite (es decir, que tenga la enfermedad o el trastorno o al menos un síntoma del mismo y/o riesgo de atraer o desarrollar la enfermedad o trastorno) de una molécula de unión a CXCR4 o un polipéptido o composición de la presente descripción y/o de un principio activo conocido activo contra CXCR4 o una ruta biológica o mecanismo donde participa CXCR4. El término enfermedad o afección relacionada con CXCR4 también incluye enfermedades o trastornos mediados por CXCR4.

Como se usa en el presente documento, el término "homología" describe una comparación basada matemáticamente de similitudes de secuencia que se usa para identificar genes o proteínas con funciones o motivos similares. Las secuencias polipeptídicas de la presente divulgación pueden usarse como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia, secuencias relacionadas u homólogos. Dichas búsquedas se pueden realizar utilizando programas BLAST (Altschul y otros (1990) J. Mo. Biol.

215:403-10). Para obtener alineaciones con espacios con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul y otros (1997) Nuc Acids Res. 25(17):3389-3402.

Como se usa aquí, el término "identidad" significa el porcentaje de residuos de nucleótidos o aminoácidos idénticos en las porciones correspondientes en dos o más secuencias cuando las secuencias están alineadas para maximizar el emparejamiento de secuencias, es decir, teniendo en cuenta espacios e inserciones. La identidad se puede calcular fácilmente utilizando métodos conocidos, incluidos, entre otros, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk AM ed. Oxford University Press New York, 1988; Computer Analysis of Sequence data, Part I Griffin AM and Griffin HG eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence analysis in molecular biology, von Heinje G, Academic Press, New Jersey, 1994). Los métodos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Además, los métodos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, entre otros, el paquete de programas GCG, BLASTP, BLASTN y FASTA. El bien conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratando", "tratar" o "tratamiento" incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, molécula de ácido nucleico, conjugado o multímero de la presente divulgación suficiente para reducir o eliminar al menos un síntoma de una enfermedad específica. trastorno. En un ejemplo, el tratamiento implica administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, molécula de ácido nucleico, conjugado o multímero para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4. En un ejemplo, el tratamiento también se refiere al tratamiento profiláctico.

Como se usa en el presente documento, los términos "previniendo", "prevenir" o "prevención" incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, molécula de ácido nucleico, conjugado o multímero de la presente descripción suficiente para detener o dificultar el desarrollo de al menos un síntoma de un trastorno especificado.

Como se usa en el presente documento, el término "se une específicamente" o "específicamente se une " significará que una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con un determinado diana o célula que expresa CXCR4 que con dianas o células alternativas. Más particularmente, la molécula o polipéptido que se une a CXCR4 se une con mayor afinidad a una diana o célula que expresa CXCR4 que a otros receptores de quimioquinas, por ejemplo, CCR5, CXCR7 o CCR7. Por ejemplo, una molécula de unión a CXCR4 o polipéptido que se une específicamente a un objetivo se une a ese objetivo con mayor afinidad (por ejemplo, 2 veces, 10 veces, 20 veces o 40 veces o 60 veces o 80 veces a 100 veces o 150 veces o 200 veces mayor afinidad), avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que se une a otros GPCR, por ejemplo, a otros GPCR que son similares en estructura o secuencia. Un polipéptido que se une específicamente a CXCR4 puede mostrar cierta reactividad cruzada con otros receptores de quimiocinas o moléculas relacionadas con la afinidad, pero solo en la medida en que dicha reactividad cruzada no module sustancialmente un mecanismo biológico de respuesta o efecto de unión a CXCR4.

Como se usa en el presente documento, la referencia a un nivel "similar" de unión se entenderá que significa que una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 se une a un objetivo a un nivel dentro de aproximadamente el 30 %, 25 % o 20 % del nivel al que se une a otro objetivo Este término también puede significar que una molécula de unión o polipéptido se une a un objetivo a un nivel dentro de aproximadamente el 30 %, 25 % o 20 % del nivel al que otra molécula de unión o polipéptido se une al mismo objetivo.

El término "sustancialmente", como se usa aquí en el contexto de la unión, se refiere a un polipéptido que se une a CXCR4 a un nivel de aproximadamente el 15 %, 10 % o 5 % del nivel al que se une a otro objetivo. Este término también puede significar que una molécula de unión o polipéptido se une a un objetivo a un nivel dentro de aproximadamente el 5 %, 4 % o 3 % del nivel al que otra molécula de unión o polipéptido se une al mismo objetivo.

El término "secuencia de bucle aleatorio" como se usa en el presente documento se refiere a una porción de una secuencia peptídica que se extiende desde o entre una conformación de cadena p o conformaciones de cadena p de un dominio intermedio (I-SET). Las regiones de bucle normalmente están libres de conformaciones de cadena p extendidas. La región de bucle 4 es análoga a un bucle CDR1 convencional. La región de bucle 8 es análoga a un bucle CDR3 convencional.

Como se usa en este documento, el término "regiones determinantes de complementariedad" (sin. CDR; es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) se refiere a los residuos de aminoácidos dentro de un dominio de la superfamilia de las inmunoglobulinas, cuya presencia contribuye de manera importante a la unión específica del antígeno.

El término "andamio" o "andamio de i-cuerpo" como se usa en el presente documento pretende referirse a la secuencia representada por las regiones de andamio del dominio 1 de inmunoglobulina (Ig) NCAM1 humana i-SET (SEQ ID NO: 1) definida por los aminoácidos 1 a 26, 33 a 79 y 88 a 97.

El término "aislado" como se usa en el contexto de polipéptido aislado o polipéptido de unión aislado se refiere a una proteína de origen recombinante o sintético o alguna combinación de los mismos, que, en virtud de su origen o fuente de derivación, la proteína no está asociada con las proteínas encontradas en la naturaleza, está libre de otras proteínas de la misma fuente, es expresada por una célula de una especie diferente o no ocurre en la naturaleza.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de agente terapéutico que, cuando se administra solo o en combinación con otro agente terapéutico a una célula, tejido o sujeto, es eficaz para prevenir o mejorar la enfermedad o la progresión de la enfermedad.

El término "péptido mimético" o "peptidomimético" significa una molécula similar a un péptido que puede servir como modelo para un sustrato peptídico sobre el que se basa estructuralmente. Dichos peptidomiméticos incluyen péptidos modificados químicamente, moléculas similares a péptidos que contienen aminoácidos no naturales y peptoides, que son moléculas similares a péptidos que resultan del ensamblaje oligomérico de glicinas N-sustituidas (ver, por ejemplo, Goodman y Ro, Peptidomimetics for Drug Design, en BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY, vol. 1 (ed. M. E. Wolff; John Wiley & Sons 1995), páginas 803-861).

Se conocen en la técnica una variedad de miméticos de péptidos que incluyen, por ejemplo, moléculas similares a péptidos que contienen un aminoácido restringido, un componente no peptídico que imita la estructura secundaria del péptido o un isóstero de enlace amida. Un péptido mimético que contiene un aminoácido de origen no natural restringido puede incluir, por ejemplo, un aminoácido a-metilado; un ácido carboxílico a,a-dialquil-glicina o a-aminocicloalcano; un aminoácido ciclado de Na-Ca; un aminoácido Na-metilado; un ácido carboxílico de p- o Y-amino cicloalcano; un aminoácido a,pinsaturado; un aminoácido p,p-dimetilo o p-metilo; un aminoácido 2,3-metano sustituido en p; un aminoácido ciclado ⁿ C^s o Ca-C5; o una prolina sustituida u otro mimético de aminoácidos.

Además, un mimético peptídico que imita la estructura secundaria del péptido puede contener, por ejemplo, un mimético del giro p no peptídico; imitador de giros y; imitación de la estructura de hoja p; o imitación de estructura helicoidal, cada uno de los cuales es bien conocido en la técnica. Un péptido mimético también puede ser una molécula similar a un péptido que contiene, por ejemplo, un isóstero de enlace amida tal como una modificación retro-inversa; enlace amida reducido; enlace metilenotioéter o metilenosulfóxido; enlace de metileno éter; enlace de etileno; enlace tioamida; enlace trans-olefina o fluoroolefina; anillo de tetrazol disustituido en 1,5; enlace cetometileno o fluorocetometileno u otro isóstero de amida. Un experto en la técnica entiende que estos y otros componentes peptidomiméticos están incluidos en el significado del término "péptido mimético" como se usa en el presente documento. El término "polipéptido" o "péptido" incluirá peptidomiméticos a menos que se indique expresamente lo contrario.

Andamio i-cuerpo y moléculas de unión a CXCR4

La presente descripción proporciona un polipéptido de unión (o "i-cuerpo"), que comprende un andamio con regiones CDR1 y CDR3 modificadas. En un ejemplo, la región de andamio comprende el Dominio 1 de NCAM1 humana como se muestra en SEQ ID NO: 1 o una secuencia de dominio relacionada que tiene al menos un 45 % de identidad o al menos un 75 % de homología excluyendo las regiones CDR1 y CDR3 como se destaca.

NCAM (o Molécula de Adhesión de Células Neurales, por sus siglas en inglés) es una glicoproteína de los dominios I-SET o dominios de conjuntos intermedios de la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig). El dominio extracelular de NCAM consta de cinco dominios similares a inmunoglobulina (Ig) seguidos de dos dominios de fibronectina tipo III (FNIII).

Las secuencias de dominio relacionadas incluyen SEQ ID NO 3, 4, 5, 6 y 8 que muestran secuencias de dominio NCAM 1 de vaca, ratón, rata, pollo y rana respectivamente y SEQ ID NO 7, 9 y 10 que muestran NCAM 2 de rana, humano y ratón secuencias de dominio respectivamente.

La identidad de secuencia entre estos dominios relacionados es la si uiente:

La homolo ía de secuencia entre estos dominios relacionados es la si uiente:

El dominio 1 de la NCAM humana se ha producido como un polipéptido recombinante en un sistema de expresión bacteriano (Frey et al. (1992) J. Cell Biol. 118:177-194).

La presente descripción describe modificaciones introducidas en un andamio de i-cuerpo en las regiones CDR1 y/o CDR3, que se ha demostrado que alteran las propiedades de unión del dominio (o "i-cuerpo"). En particular, los inventores han desarrollado polipéptidos y aminoácidos de i-cuerpo modificados que sorprendentemente pueden unirse a CXCR4 con alta afinidad y especificidad e inhibir o reducir la migración celular inducida por CXCR4. En particular, los polipéptidos de unión a CXCR4 o los i-cuerpos de la presente descripción son útiles para inhibir la metástasis del cáncer, las enfermedades relacionadas con la fibrosis y los antiinflamartorios.

En consecuencia, la presente descripción proporciona una serie de polipéptidos que se unen a CXCR4 que comprenden la secuencia ácida de andamio del i-cuerpo, donde la región CDR1 o CDR3 de andamio del i-cuerpo se ha modificado y donde la molécula se une a CXCR4 humano con una afinidad de menos de 50 uM, menos de 40|^j M, menos de 20|^j M, menos de 10 uM, menos de 1 uM, menos de 700 nM, menos de 600 nM, menos de 500 nM, menos de 400 nM, menos de 300 nM, menos de 200 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 10 nM, o menos de 5 nM o menos de 1 nM.

En una realización, las regiones CDR1 y/o CDR3 completas del polipéptido se reemplazan con una secuencia de bucle aleatorio.

Por ejemplo, la región del bucle CDR1 del polipéptido puede estar relacionada con una región del bucle que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73 o SEQ ID NO: 77 o una secuencia que tiene al menos un 50% de identidad con la misma.

Por ejemplo, la región del bucle CDR1 del polipéptido puede estar relacionada con una región del bucle que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, o SEQ ID NO: 77 o una secuencia que tiene al menos un 50% de homología con la misma.

En otro ejemplo, la región del bucle CDR3 del polipéptido se puede reemplazar con una región del bucle que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, o SEQ ID NO: 78, una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.

En otro ejemplo, la región del bucle CDR3 del polipéptido se puede reemplazar con una región del bucle que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, o SEQ ID NO: 78 una secuencia que tiene al menos un 70% de homología con la misma.

En un ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad, al menos un 90 % de identidad o al menos un 95 % de identidad, o al menos un 97 % de identidad, o al menos un 98 % de identidad, o al menos un 99 % de identidad con identidad a SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 76.

En un ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de homología, al menos un 90 % de homología, o al menos un 95 % de homología, o al menos un 97 % de homología, o al menos un 98 % de homología, o al menos un 99 % de homología con SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 76.

En un ejemplo, el polipéptido comprende o consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 76.

En un ejemplo, el polipéptido comprende o consta de SEQ ID NO: 11 que comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos.

En un ejemplo, el polipéptido comprende o consta de SEQ ID NO: 11

La presente descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en este documento.

En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad, al menos un 90 % de identidad o al menos un 95 % de identidad, o al menos un 97 % de identidad, o al menos un 98 % de identidad, o al menos un 99 % de identidad o 100% de identidad a cualquiera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, o SEQ ID NO: 79.

En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de homología, al menos un 90 % de homología, o al menos un 95 % de homología, o al menos un 97 % de homología, o al menos un 98 % de homología, o al menos un 99 % de homología o 100% de homología a cualquiera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, o SEQ ID NO: 79.

El % de identidad de un polipéptido o polinucleótido se determina mediante análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de espacios = 5 y una penalización por extensión de espacios = 0,3. La secuencia de consulta tiene una longitud de al menos 50 residuos y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 50 residuos. Por ejemplo, la secuencia de consulta tiene una longitud de al menos 100 residuos y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 100 residuos. En un ejemplo, las dos secuencias están alineadas en toda su longitud.

Para los fines de la presente descripción, los alineamientos de secuencias y el cálculo de las puntuaciones de homología se realizan utilizando un alineamiento de Needleman-Wunsch (es decir, un alineamiento global), útil tanto para alineamientos de proteínas como de ADN. Las matrices de puntuación predeterminadas BLOSUM50 y la matriz de identidad se utilizan para las alineaciones de proteínas y ADN, respectivamente. La sanción por el primer residuo en un espacio es -12 para proteínas y -16 para ADN, mientras que la sanción por residuos adicionales en un espacio es -2 para proteínas y -4 para ADN. La alineación es del paquete FASTA versión v20u6 (W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASt P and FASTÁ', Methods in Enzymology, 183:63-98).

La presente divulgación contempla formas variantes de la proteína de unión de la divulgación. Por ejemplo, dicha proteína de unión variante comprende una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con una secuencia como se establece en el presente documento. En algunos ejemplos, la proteína de unión comprende 10 o menos, por ejemplo, 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 sustituciones conservativas de aminoácidos. Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es aquella donde el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar y/o hidropaticidad y/o hidrofilia.

En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluidas cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ¡3 ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los índices hidropáticos se describen, por ejemplo, en Kyte y Doolittle (1982) y los índices hidrofílicos se describen, por ejemplo, en US4554101.

La presente descripción también contempla cambios de aminoácidos no conservativos. Por ejemplo, son de particular interés las sustituciones de aminoácidos cargados con otro aminoácido cargado y con aminoácidos neutros o cargados positivamente. En algunos ejemplos, la proteína de unión comprende 10 o menos, por ejemplo, 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 sustituciones de aminoácidos no conservativas.

Una forma variante de una proteína de unión a CXCR4 descrita en este documento conserva la capacidad de unirse a CXCR4. En el presente documento se describen métodos para determinar la unión específica a CXCR4.

Maduración por afinidad

En otro ejemplo, un polipéptido de la divulgación madura por afinidad para producir un i-cuerpo capaz de unirse a CXCR4 con mayor afinidad, especificidad o actividad o para producir un i-cuerpo con mayor expresión o solubilidad. Por ejemplo, la secuencia que codifica el polipéptido de la divulgación está mutada de manera que se introducen una o más sustituciones de aminoácidos. Luego, el polipéptido variante resultante se analiza para determinar su unión a CXCR4, por ejemplo, en un ensayo competitivo, se analiza el aumento de la especificidad para otros receptores de quimiocinas (por ejemplo, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR5, CXCR6, CXCR7, CCR1, XCR1; consulte la Figura 9), o cribado para el aumento de la expresión o el aumento de la solubilidad (consulte la Figura 7) o cribado mediante ensayos de afinidad como se describe a continuación para los aumentos de la afinidad por CXCR4.

Existen varios protocolos para la maduración por afinidad de polipéptidos y proteínas. Estos incluyen la mezcla de ADN (Stemmer Proc Natl Acad Sci US A. (1994); 91(22):10747-10751), PCR propensa a errores (Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226; 889-896 y Henderson et al. (2007) Estructura 15:1452-66) y células mutantes bacterianas (Irving et al. (1996) Inmunotechnology 2:127-43.3) que aleatorizan todo el andamio, así como métodos más específicos como la mutagénesis de oligonucleótidos dopados (Hermes et al. (1989) Gene, 84; 143-1514). La visualización de ribosomas junto con la ARN polimerasa dependiente de ARN propensa a errores del bacteriófago Qbeta también se ha utilizado para madurar por afinidad dominios únicos, proteínas de unión y polipéptidos (Kopsidas et al, (2006) Immunology Letters 107 163-168).

Los polipéptidos según la divulgación pueden ser proteínas secretadas solubles o pueden presentarse como una proteína de fusión en la superficie de una célula o partícula (por ejemplo, un fago u otro virus, un ribosoma o una espora). Se describen ejemplos de métodos de presentación de fagos, por ejemplo, en US5821047; US6248516 y US6190908. A continuación, las partículas de presentación de fagos producidas utilizando estos métodos se analizan para identificar una proteína de unión presentada que tenga una conformación suficiente para unirse a CXCR4 o una unión mejorada a CXCR4.

Las afinidades aparentes pueden determinarse mediante métodos tales como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o cualquier otra técnica familiar para un experto en la materia. Las avideces pueden determinarse mediante métodos tales como un análisis de Scatchard o cualquier otra técnica familiar para un experto en la materia. Otra técnica para medir la afinidad de unión aparente familiar para los expertos en la técnica es una técnica de resonancia de plasmón superficial (analizado en un sistema BIACORE 2000) (Liljeblad y col., Glyco. J. 2000, 17:323-329). Las mediciones estándar y los ensayos de unión tradicionales están descritos por Heeley, R. P, Endocr. Res. 2002, 28:217-229.

En un ejemplo, un i-cuerpo madurado por afinidad de la presente divulgación se une específicamente a CXCR4 humano con una mayor afinidad de unión (por ejemplo, al menos unas 5 veces, al menos unas 10 veces, al menos unas 50 veces, al menos unas 100 veces, al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces mayor) que la afinidad de unión del i-cuerpo madurado sin afinidad.

Producción de proteínas

En un ejemplo, un polipéptido de la divulgación se produce cultivando una línea celular, por ejemplo, una E. coli línea celular en condiciones suficientes para producir la proteína, por ejemplo, como se describe en el presente documento y/o como se conoce en la técnica.

Expresión recombinante

En el caso de una proteína recombinante, el ácido nucleico que la codifica se coloca en una o más construcciones de expresión, por ejemplo, vector(es) de expresión, que luego se transfectan en células huésped, como células que pueden producir un puente o enlace disulfuro, como las células bacterianas, incluidas células E. coli, células de levadura, células de insecto o células de mamífero. Ejemplos de células de mamífero incluyen células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina. Los ejemplos de células bacterianas incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)-pLysS, Tuner, Tuner pLysS, Origami, Origami B, Origami B pLysS, Rosetta, AD494, HMS174, todos disponibles de Novagen.

Las técnicas de clonación molecular para lograr estos fines son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel FM (1987) Current Protocols in Molecular Biology. New York. NY, John Wiley & Sons or Sambrook, Fritsch and Maniatis Molecular Cloning: a laboratory manual Cold Spring Harbor NY. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Una amplia variedad de métodos de clonación y amplificación in vitro son adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes.

Después del aislamiento, el ácido nucleico que codifica una proteína de la descripción se inserta en un constructo de expresión o vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión en un sistema libre de células o en células. Por ejemplo, el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor.

Como se usa en el presente documento, el término "promotor" debe tomarse en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras de la transcripción de un gen genómico, incluida la caja TATA o el elemento iniciador, que se requiere para un inicio de transcripción preciso, con o sin elementos reguladores adicionales (por ejemplo, secuencias de activación cadena arriba, sitios de unión de factores de transcripción, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo, en respuesta a un estímulo externo y/o de desarrollo, o de una manera específica de tejido. En el presente contexto, el término "promotor" también se utiliza para describir un ácido nucleico recombinante, sintético o de fusión, o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de un ácido nucleico al que está operativamente unido. Los promotores ejemplares pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos para mejorar aún más la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de dicho ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, el término "unido operativamente a" significa posicionar un promotor en relación con un ácido nucleico de manera que la expresión del ácido nucleico esté controlada por el promotor.

Los sistemas de expresión libres de células también están contemplados por la presente divulgación. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión a CXCR4 se une operativamente a un promotor adecuado, por ejemplo, un promotor T7, T5 o SP6, y la construcción de expresión resultante se expone a condiciones suficientes para la transcripción y traducción. Se han descrito vectores de expresión típicos para expresión in vitro o expresión libre de células e incluyen, pero no se limitan a, los sistemas TNT T7 y TNT T3 (Promega), los vectores pEXP1-DEST y pEXP2-DEST (Invitrogen).

Están disponibles muchos vectores para la expresión en células. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, una secuencia que codifica un polipéptido de la presente divulgación (por ejemplo, derivada de la información proporcionada en este documento), un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. El experto en la materia conocerá las secuencias adecuadas para la expresión de una proteína. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo, fago o fagémido según corresponda. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, introducción de ADN en células y expresión génica y análisis de proteínas se describen, por ejemplo, en Ausubel FM (1987) Current Protocols in Molecular Biology. New York. NY, John Wiley & Sons. Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de vector de expresión/huésped para expresar las secuencias de ADN del i-cuerpo de la descripción. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, plásmidos de E. coli col El, Perl, Pbr322, Pmb9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; ADN de fago, por ejemplo, los numerosos derivados del fago \ por ejemplo, NM989, y otro ADN de fago, por ejemplo, M13 y ADN de fago monocatenario filamentoso; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2u o derivados del mismo; vectores útiles en células eucariotas, tales como vectores útiles en células de insectos o mamíferos; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, tales como plásmidos que han sido modificados para emplear ADN de fagos u otras secuencias de control de la expresión; y similares.

Ejemplos de secuencias señal incluyen señales de secreción procariótica (por ejemplo, DsbA, pelB, fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina estable al calor II), señales de secreción de levadura (por ejemplo, líder de invertasa, líder de factor a o líder de fosfatasa ácida) o secreción de mamíferos señales (por ejemplo, señal gD de herpes simple).

Ejemplos de péptidos líderes incluyen aquellos activos en procariotas (tales como PelB, OmpA, PIII, DsbA, TorT, TolB, promotor phoA, sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac).

Los promotores bacterianos adecuados incluyen los promotores lacl e lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, T5, el promotor gpt, los promotores lambda PR y PL y el promotor trp. Los promotores eucarióticos incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de timidina quinasa de HSV, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores de LTR retrovirales, como los del virus del sarcoma de Rous (RSV), y los promotores de metalotioneína, como el promotor metalotioneína I de ratón.

Ejemplos de promotores activos en células de mamíferos incluyen promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE), promotor del factor de elongación humano 1-a (EF1), promotores de ARN nuclear pequeño (U1a y U1b), promotor de cadena pesada de a-miosina, promotor del virus simio 40 (SV40), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotor tardío principal de adenovirus, promotor de p-actina; elemento regulador híbrido que comprende un potenciador de CMV/promotor de p-actina o un promotor de inmunoglobulina o un fragmento activo del mismo. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, AUSTRALIAN CELL BANK CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión; células de riñón de cría de hámster (BHK, AUSTRALIAN CELL BANK CCL 10); o células de ovario de hámster chino (CHO).

Promotores típicos adecuados para la expresión en células de levadura como, por ejemplo, una célula de levadura seleccionada del grupo que comprende Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y S. pombe, incluyen, pero no se limitan a, el promotor ADH1, el promotor GAL1, el promotor GAL4, el promotor COPA1, el promotor PH5, el promotor nmt, el promotor RPR1, o el promotor TEF1.

Los medios para introducir la molécula de ácido nucleico aislada o una construcción génica que comprende la misma en una célula para su expresión son conocidos por los expertos en la técnica. La técnica utilizada para una celda dada depende de las técnicas exitosas conocidas. Los medios para introducir ADN recombinante en las células incluyen la microinyección, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transfección mediada por liposomas, como mediante el uso de lipofectamina (Gibco, MD, EE. u U.) y/o cellfectina (Gibco, MD, EE. UU.), captación de ADN mediada por PEG, electroporación, transducción viral (por ejemplo, utilizando un lentivirus) y bombardeo de micropartículas, como mediante el uso de partículas de tungsteno u oro recubiertas de ADN (Agracetus Inc., WI, EE. UU.), entre otros.

En algunos casos es útil expresar una proteína, polipéptido o péptido en forma insoluble, particularmente cuando el polipéptido de interés es bastante corto, normalmente soluble y/o sujeto a degradación proteolítica dentro de la célula huésped. La producción de la proteína en forma insoluble facilita la recuperación simple y protege al polipéptido de la degradación proteolítica indeseable. Un medio para producir el polipéptido en forma insoluble es producir de forma recombinante el polipéptido como parte de una proteína de fusión insoluble incluyendo en la construcción de fusión al menos una etiqueta de péptido (es decir, una etiqueta de cuerpo de inclusión) que induce la formación de cuerpos de inclusión. Normalmente, la proteína de fusión se diseña para incluir al menos un conector peptídico escindible de modo que el polipéptido de interés pueda recuperarse posteriormente de la proteína de fusión. La proteína de fusión puede diseñarse para incluir una pluralidad de etiquetas de cuerpos de inclusión, conectores peptídicos escindibles y regiones que codifican el polipéptido de interés.

Las proteínas de fusión que comprenden una etiqueta peptídica que facilitan la expresión de proteínas insolubles son bien conocidas en la técnica. Típicamente, la porción de etiqueta de la proteína quimérica o de fusión es grande, lo que aumenta la probabilidad de que la proteína de fusión sea insoluble. Los ejemplos de etiquetas de péptidos grandes que se usan normalmente incluyen, entre otros, cloranfenicol acetiltransferasa (Dykes y col., Eur. J. Biochem., 174:411 (1988), .beta.-galactosidasa (Schellenberger y col., Int. J. Peptide Protein Res., 41:326 (1993); Shen y col., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU.

281:4627 (1984); y Kempe y otros, Gene, 39:239 (1985)), glutatión-S-transferasa (Ray et al., Bio/Tecnología, 11:64 (1993) y Hancock et al. (WO94/04688)), el extremo N de la L-ribulocinasa (Patente de EE.UU. No. 5,206,154 y Lai et al., Antimicrob. Agents & Chemo., 37:1614 (1993), bacteriófago T4 gp55 proteína (Gramm et al., Bio/Technology, 12:1017 (1994), proteína isomerasa cetoesteroide bacteriana (Kuliopulos y col., J. Am. Chem. Soc. 116:4599 (1994)), ubiquitina (Pilon y col., Biotechnol. Prog., 13:374-79 (1997), proquimosina bovina (Naught y col., Biotechnol. Bioengineer. 57:55-61 (1998), y proteína bactericida/que aumenta la permeabilidad ("BPI"; Better, ^m D y Gavit, P D., patente de EE.UU. No.

6,242,219). La técnica está repleta de ejemplos específicos de esta tecnología, ver por ejemplo Patente de EE.UU. No.

6,613,548, que describe la proteína de fusión de una etiqueta proteinácea y una proteína soluble y la subsiguiente purificación del lisado celular; Patente de EE.UU. No. 6,037,145, enseñando una etiqueta que protege la proteína quimérica expresada de una proteasa específica; Patente de EE.UU. No. 5,648,244, que enseña la síntesis de una proteína de fusión que tiene una etiqueta y un conector escindible para una fácil purificación de la proteína deseada; y Patente de EE.UU. No. 5,215,896; Patente de EE.UU. No. 5,302,526; Patente de EE.UU. No. 5,330,902; y EE. UU.

2005221444, que describe etiquetas de fusión que contienen composiciones de aminoácidos diseñadas específicamente para aumentar la insolubilidad de la proteína o el péptido quimérico.

Recientemente se han desarrollado etiquetas de cuerpo de inclusión más cortas a partir de la proteína Zea mays zein (Solicitud de patente de EE.UU. No. 11/641,936), la cistatina de Daucus carota (Solicitud de patente de EE.UU. No.

11/641,273), y una proteína hipotética de tipo amiloide de Caenorhabditis elegans (Solicitud de patente de EE.UU. No.

11/516,362) El uso de etiquetas de cuerpos de inclusión cortos aumenta el rendimiento del péptido diana producido dentro de la célula huésped recombinante.

También se proporciona en el presente documento una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones de polinucleótidos. Un polinucleótido que codifica un i-cuerpo de la presente divulgación se incluye en el presente documento como métodos de producción de i-cuerpos, cuyo método comprende la expresión a partir de un polinucleótido. La expresión puede lograrse, por ejemplo, cultivando en condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el polinucleótido.

Las células huésped utilizadas para producir la molécula de unión o el polipéptido de esta descripción pueden cultivarse en una variedad de medios, según el tipo de célula utilizado. Los medios disponibles comercialmente como Ham's FI0 (Sigma), Medio mínimo esencial ((MEM, por sus siglas en inglés), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM, por sus siglas en inglés), Sigma) son adecuados para cultivar células de mamíferos. Los medios para cultivar otros tipos de células discutidos aquí son conocidos en la técnica.

Se entenderá que no todos los vectores, secuencias de control de la expresión y huéspedes funcionarán igual de bien para expresar las secuencias de ADN. Tampoco todos los anfitriones funcionarán igual de bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la técnica podrá seleccionar los vectores, las secuencias de control de la expresión y los huéspedes adecuados sin una experimentación indebida para lograr la expresión deseada sin apartarse del alcance de esta solicitud. Por ejemplo, al seleccionar un vector, se debe considerar el anfitrión porque el vector debe funcionar en él. También se considerarán el número de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, como marcadores de antibióticos.

La presente divulgación también proporciona una célula huésped que contiene uno o más polinucleótidos como se describe en el presente documento. La presente divulgación también proporciona un método para introducir uno o más polinucleótidos en una célula huésped mediante cualquier técnica adecuada como se describe anteriormente.

Una vez que el polinucleótido se ha introducido en la célula huésped, puede ocurrir la expresión del polinucleótido, por ejemplo, cultivando células huésped en condiciones para la expresión de uno o más polipéptidos de uno o más polinucleótidos.

Un polinucleótido que codifica un i-cuerpo de la presente descripción se puede preparar de forma recombinante/sintética, además de, o en lugar de la clonación. El polinucleótido se puede diseñar con los codones apropiados para el polipéptido de unión a CXCR4. En general, se seleccionarán los codones preferidos para un huésped previsto si la secuencia se utilizará para la expresión. El polinucleótido completo puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados mediante métodos estándar y ensamblarse en una secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay y col., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).

Aislamiento de Proteínas

Una molécula de unión a CXCR4 o polipéptido o i-cuerpo de la presente descripción puede aislarse o purificarse.

Los métodos para purificar un polipéptido de la descripción se conocen en la técnica y/o se describen en el presente documento.

Cuando se usan técnicas recombinantes, el polipéptido de la descripción se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico o directamente secretado en el medio. Si la proteína se produce intracelularmente, como primer paso, los restos de partículas ya sean células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cuando la proteína se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se pueden concentrar primero usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes accidentales.

La proteína preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, intercambio iónico, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrofóbica, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad con proteína A o cromatografía con proteína G), calor o cualquier combinación de lo anterior. Estos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en WO99/57134.

El experto en la materia también sabrá que un polipéptido de la divulgación puede modificarse para incluir una etiqueta para facilitar la purificación o detección, por ejemplo, una etiqueta de polihistidina, por ejemplo, una etiqueta de hexahistidina o una hemaglutinina (HA) del virus de la influenza. o una etiqueta de virus simio 5 (V5), o una etiqueta FLAG, o una etiqueta de glutatión S-transferasa (GST). Por ejemplo, la etiqueta es una etiqueta hexa-his. A continuación, la proteína resultante se purifica usando métodos conocidos en la técnica, como la purificación por afinidad. Por ejemplo, una proteína que comprende una etiqueta hexa-his se purifica poniendo en contacto una muestra que comprende la proteína con ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) que se une específicamente a una etiqueta hexa-his inmovilizada en un soporte sólido o semisólido, lavando la muestra para eliminar la proteína no unida y, posteriormente, eluir la proteína unida. Alternativamente, o además, se usa un polipéptido, ligando o anticuerpo que se une a una etiqueta en un método de purificación por afinidad.

Conjugados

La presente descripción también proporciona conjugados de moléculas o polipéptidos que se unen a CXCR4 descritos en este documento. Los ejemplos de compuestos a los que se puede conjugar un polipéptido de la presente descripción se seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un marcador detectable, un compuesto terapéutico, un coloide, una toxina, un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un compuesto que aumenta la vida media de la proteína en un sujeto y sus mezclas.

Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, un agente antiangiogénico, un agente antineovascularización y/u otro agente de vascularización, un agente antiproliferativo, un agente proapoptótico, un agente quimioterapéutico, agentes antimitóticos (por ejemplo, anti -agente mitótico auristatina, (MMAF/MMAE según Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 1 - 6) o un ácido nucleico terapéutico.

Una toxina incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, mate) las células. Para una descripción de estas clases de fármacos, que se conocen en la técnica, y sus mecanismos de acción, véase Goodman et al., (1990). Se proporcionan técnicas adicionales relevantes para la preparación de conjugados de inmunotoxina de anticuerpos en, por ejemplo, en US5194594 y puede utilizarse en la presente descripción. Los ejemplos de toxinas incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no vinculantes de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, las proteínas Aleurites fordii, las proteínas diantina, las proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, WO93/21232.

En algunos ejemplos, las moléculas o polipéptidos o i-cuerpos que se unen a CXCR4 pueden acoplarse de forma covalente o no covalente a una citotoxina u otro compuesto inhibidor de la proliferación celular, para localizar el suministro de ese agente a una célula tumoral. Por ejemplo, el agente puede seleccionarse del grupo que consiste en agentes, inhibidores de enzimas, inhibidores de la proliferación, agentes líticos, inhibidores de la síntesis de ADN o ARN, modificadores de la permeabilidad de la membrana, metabolitos de ADN, derivados de dicloroetilfuro, inhibidores de la producción de proteínas, inhibidores de ribosomas, inductores de apoptosis, y neurotoxinas.

Los agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados de la presente descripción incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D , 1 dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, antimetabolitos (como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6 tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina) , agentes alquilantes (como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados del platino, como carboplatino), antibióticos (como dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), d oxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)).

En un ejemplo, una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 como se describe en el presente documento se conjuga o une a otra proteína (por ejemplo, albúmina de suero humano o HSA), incluida otra molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación o una proteína que comprende una región CDR1 y/o CDR3 como se describe en este documento. Una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 como se describe en el presente documento también se puede conjugar con otra molécula o polipéptido de unión que se dirige, por ejemplo, a un antígeno tumoral, o a un objetivo que tiene el potencial de redirigir y activar cualquier célula T circulante contra tumores (por ejemplo, CD3), o un objetivo que se expresa notablemente en monocitos y macrófagos y se regula al alza tras la activación en neutrófilos (por ejemplo, CD64) o un objetivo que se expresa en la superficie de células asesinas naturales, leucocitos polimorfonucleares de neutrófilos, monocitos y macrófagos. En un ejemplo, la molécula o polipéptido de unión es una unión de baja afinidad de IgG (por ejemplo, CD16) o una diana que se expresa constitutivamente principalmente en neutrófilos, monocitos, macrófagos y eosinófilos (por ejemplo, CD89). No se excluyen otras proteínas o compañeros de conjugación. Las proteínas adicionales serán evidentes para el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, un inmunomodulador o una proteína que prolonga la semivida o un péptido o polipéptido u otra proteína que se une a la albúmina sérica, entre otros.

Ejemplos de péptidos o proteínas de unión a albúmina sérica se describen en US20060228364 o US20080260757.

En un ejemplo, una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente descripción se conjuga con un polipéptido XTEN como se describe en Schellenberger y cols (2009) Nature Biotechnology 27(12):1186-1192.

En un ejemplo, una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente descripción se conjuga con un polipéptido como se describe en Schlapschy et al (2013) Protein Engineering, Design & Selection vol. 26 núm. 8 págs. 489 - 501.

En un ejemplo, un polipéptido de la presente descripción se conjuga con una región Fc de una inmunoglobulina como se describe, por ejemplo, en Peters y otros (2010), Blood vol. 115 núm. 102057-2064, Kim et al, (2009) BMB Rep. 42: 212­ 216 y Nagashima et al (2011) J Biochem. 149: 337-346.

Los conjugados de polipéptido de unión a CXCR4 (moléculas biespecíficas) se pueden preparar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas, polipéptidos o péptidos, se puede usar una variedad de agentes de acoplamiento o de entrecruzamiento para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de entrecruzamiento incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohaxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por ejemplo, Karpovsky el al. (1984) Exp. J. Med 1601686, Liu, MA et al. (1985) Proceso. nacional Academia ciencia Estados Unidos 828648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins Mitt No 78, 1 18-132, Brennan et al. (1985) Science 229 81-83 y Glenny et al. (1987) .J Inmunol 392367-2375).

Se dispone de una variedad de radionúclidos para la producción de proteínas radioconjugadas. Los ejemplos incluyen, entre otros, núcleos radiactivos de baja energía (por ejemplo, adecuados para fines de diagnóstico), como 13C, 15N, 2H, 1251, 1231, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, 111In y similares. Por ejemplo, el radionúclido es un radionúclido emisor de gamma, fotones o positrones con una semivida adecuada para permitir la actividad o detección después del tiempo transcurrido entre la administración y la localización en el sitio de formación de imágenes. La presente descripción también abarca núcleos radiactivos de alta energía (por ejemplo, con fines terapéuticos), como 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re y 188Re. Estos isótopos normalmente producen partículas a o p de alta energía que tienen una longitud de trayectoria corta. Dichos radionúclidos matan las células con las que están muy cerca, por ejemplo, las células neoplásicas a las que se ha adherido o ha entrado el conjugado. Tienen poco o ningún efecto sobre las células no localizadas y son esencialmente no inmunogénicos. Alternativamente, los isótopos de alta energía pueden generarse mediante la irradiación térmica de un isótopo estable, por ejemplo, como en la terapia de captura de neutrones con boro (Guan et al., 1998). Otros isótopos que pueden ser adecuados se describen en Carter. (2001) Nature Reviews Cancer 1, 118-129, Goldmacher et al. (2011) Therapeutic Delivery 2;397-416, Payne (2003) Cancer Cell 3, 207­ 212, Schrama et al, (2006) Nature Rev. Drug Discov. 5, 147-159, Reichert et al. (2007) Nature Reviews Drug Discovery 6; 349-356.

En otro ejemplo, la proteína se conjuga con un "receptor" (como la estreptavidina) para su uso en la preselección celular donde el conjugado se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación usando un agente de limpieza y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente terapéutico (por ejemplo, un radionucleótido).

Las moléculas o polipéptidos que se unen a CXCR4 de la presente descripción se pueden modificar para que contengan restos no proteináceos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Por ejemplo, los restos adecuados para la derivatización de la proteína son polímeros fisiológicamente aceptables, por ejemplo, un polímero soluble en agua. Dichos polímeros son útiles para aumentar la estabilidad y/o reducir la eliminación (por ejemplo, por el riñón) y/o para reducir la inmunogenicidad de un polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA) o propilenglicol (PPG).

En un ejemplo, una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 como se describe en el presente documento comprende uno o más marcadores detectables para facilitar la detección y/o el aislamiento. Por ejemplo, el compuesto comprende un marcador fluorescente como, por ejemplo, fluoresceína (FITC), 5,6-carboximetilfluoresceína, rojo Texas, nitrobenz-2-oxa-I,3-diazol-4-il (NBD), cumarina, cloruro de dansilo, rodamina, 4'-6-diamidino-2-fenilinodol (DAPI) y los colorantes de cianina Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7, fluoresceína (éster de 5-carboxifluoresceína-N-hidroxisuccinimida), rodamina (5,6-tetrametil rodamina). Los máximos de absorción y emisión, respectivamente, para estos flúor son: FITC (490 nm; 520 nm), Cy3 (554 nm; 568 nm), Cy3.5 (581 nm; 588 nm), Cy5 (652 nm: 672 nm), Cy5.5 (682 nm; 703 nm) y Cy7 (755 nm; 778 nm).

En ciertos ejemplos, los i-cuerpos de la presente divulgación pueden acoplarse con un agente útil en la formación de imágenes de tumores. Dichos agentes incluyen: metales; quelantes de metales; lantánidos; quelantes de lantánidos; radiometales; quelantes de radiometales; núcleos emisores de positrones; microburbujas (para ultrasonido); liposomas; moléculas microencapsuladas en liposomas o nanoesferas; nanocompuestos de óxido de hierro monocristalino; agentes de contraste para la formación de imágenes por resonancia magnética; agentes que absorben, reflejan y/o dispersan la luz; partículas coloidales; fluoróforos, tales como fluoróforos del infrarrojo cercano. En muchos ejemplos, dicha funcionalidad/resto secundario será relativamente grande, por ejemplo, de un tamaño de al menos 25 amu, y en muchos casos puede tener un tamaño de al menos 50,100 o 250 amu. En ciertos ejemplos, la funcionalidad secundaria es un resto de quelato para quelar un metal, por ejemplo, un quelante para un radiometal o ion paramagnético. En ejemplos adicionales, es un quelante para un radionúclido útil para radioterapia o procedimientos de formación de imágenes.

Alternativamente, o además, la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 como se describe en el presente documento se marca, por ejemplo, con un nanocristal semiconductor fluorescente (como se describe, por ejemplo, en US6306610).

Alternativamente, o además, la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 se marca con, por ejemplo, un compuesto magnético o paramagnético, como hierro, acero, níquel, cobalto, materiales de tierras raras, neodimio-hierro-boro, ferrosocromo- cobalto, níquel-ferroso, ferrita de cobalto, de platino o de estroncio.

Proteínas inmovilizadas

En un ejemplo, una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la descripción se inmoviliza en una matriz sólida o semisólida. Debe entenderse que el término "inmovilización" implica varios métodos y técnicas para fijar proteínas en matrices específicas, por ejemplo, como se describe en WO99/56126 o WO02/26292. Por ejemplo, la inmovilización puede servir para estabilizar las proteínas de modo que su actividad no se reduzca o modifique negativamente por exposición biológica, química o física, especialmente durante el almacenamiento o en el uso de un solo lote.

En la técnica se conocen varios métodos para inmovilizar una proteína en una matriz e incluyen la reticulación, la unión a un vehículo y la retención dentro de una matriz semipermeable.

Los ejemplos de matrices incluyen geles porosos, óxido de aluminio, bentonita, agarosa, almidón, nailon o poliacrilamida.

Ensayo de la actividad de una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación

Ensayos de unión

Los anticuerpos más específicos y potentes contra los receptores acoplados a proteína G generalmente se dirigen a epítopos conformacionalmente complejos formados por la estructura terciaria de las proteínas. Los enfoques utilizados con respecto a las dianas de proteínas solubles no son efectivos para las proteínas que atraviesan la membrana, cuya estructura nativa depende de una bicapa lipídica intacta.

Las moléculas o polipéptidos que se unen a CXCR4 de la presente descripción se pueden ensayar para determinar la unión a CXCR4, por ejemplo, mediante métodos de citometría de flujo estándar. Dado que las moléculas o polipéptidos que se unen a CXCR4 de la presente divulgación reconocen preferiblemente a CXCR4 humano en su conformación nativa, la unión a CXCR4 se determina preferiblemente usando un ensayo que utiliza un reactivo que expresa la conformación nativa de CXCR4. Los ejemplos no limitantes de reactivos que expresan CXCR4 de conformación nativa que se pueden usar en los ensayos de unión incluyen células que expresan naturalmente CXCR4, células que se han transfectado para expresar CXCR4 (por ejemplo, células R1610 transfectadas con un vector de expresión de CXCR4). Los ejemplos de células adecuadas que expresan CXCR4 incluyen MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-361, MdA-MB-549, Ramos, Namalwa, MOLT-4, DU-4475, DU-145, PC3, Células LNcaP, SW480, HT29, NCI-H69, SJSA-1-met-luc y HL-60. Brevemente, para el ensayo de citometría de flujo, las células que expresan CXCR4 se incuban con la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de prueba, se lavan, se incuban con un reactivo secundario marcado capaz de unirse al anticuerpo de prueba, se lavan nuevamente y se someten a análisis para detectar la unión del reactivo secundario a las células (por ejemplo, usando una máquina FACS). Las moléculas CXCR4 o los polipéptidos que tiñen las células de forma brillante según lo evaluado por citometría de flujo se utilizan para investigaciones adicionales. Los ejemplos de ensayos de unión adecuados para su uso de acuerdo con la presente descripción incluyen ensayos de unión de radioligandos como el ensayo de filtración (PerkinElmer) o el ensayo SPA (PerkinElmer o GE Healthcare), o ensayos de unión de ligandos etiquetados como DELFIA™ TRF (PerkinElmer), LanthaScreen™ (Invitrogen), o Tag-lite™ sistema (Cisbio).

Alternativamente, una línea celular tal como una línea celular CHO puede transfectarse con un vector de expresión que codifica una forma transmembrana de CXCR4. La proteína transfectada puede comprender una etiqueta, tal como una etiqueta myc, preferiblemente en el extremo N-terminal, para la detección usando un anticuerpo contra la etiqueta. La unión de una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de esta divulgación a CXCR4 puede determinarse incubando las células transfectadas con el polipéptido de unión a CXCR4 y detectando el polipéptido unido. La unión de un anticuerpo a la etiqueta en la proteína transfectada puede usarse como control positivo.

Otro enfoque para evaluar la unión requiere el uso de lipopartículas que sean capaces de incorporar altas concentraciones de proteínas de membrana diana en sus conformaciones nativas (por ejemplo, proteoliposomas magnéticos que incorporan CXCR4 o partículas de liposomas que incorporan CXCR4). Tales partículas de lipoproteínas se describen, por ejemplo, en WO 2005/042695, WO 2011/083141, Banik et al (2009) Descubrimiento y desarrollo de fármacos 12(9):14-17; Willis S et al (2008) Bioquímica 47:6988-90. Las lipopartículas se producen a partir de células de mamífero mediante la coexpresión de la poliproteína del núcleo estructural retroviral, Gag, junto con una proteína de membrana deseada (por ejemplo, CXCR4). Las proteínas del núcleo Gag se autoensamblan en la membrana plasmática donde brotan y capturan las proteínas de la membrana diana. Las lipoproteínas tienen un diámetro de aproximadamente 150 nm, por lo que se suspenden fácilmente en soluciones acuosas que se pueden usar para la inoculación. Debido a que las proteínas de membrana dentro de las lipopartículas se derivan directamente de la superficie celular sin alteración mecánica ni detergentes, se conserva la estructura y orientación nativas de las proteínas de membrana. Las lipoproteínas no contienen proteínas citoplasmáticas ni proteínas de membrana invertida que puedan provocar una respuesta inmunitaria desenfocada. Las lipoproteínas se pueden inmovilizar sobre un soporte sólido utilizando técnicas estándar y la unión mediante moléculas o polipéptidos CXCR4 según la presente descripción analizada mediante resonancia de plasmón superficial (véase, por ejemplo, Maynard JA et al (2009) Biotechnol J 4 (11): 1542-1558, Stenlund P et al (2003) Anal Biochem 316 (2): 243-50, Hoffman y otros (2000) Proc Natl Acad Sci 97:11215-11220, WO 2005/042695).

Además, las lipopartículas se pueden mutar residuo a residuo para determinar qué residuos de CXCR4 se unen a los polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente divulgación. Esto valida residuos críticos que representan aminoácidos cuyas cadenas laterales hacen las contribuciones energéticas más altas a la interacción entre el polipéptido de unión a CXCR4 y el epítopo de CXCR4 (Bogan y Thorn, (1998) J. Mol. Biol. 280, 1-9; El Cuento et al., (1999) J. Mol. Biol. 285, 2177-2198. Los residuos críticos identificados para la unión de i-cuerpo AM3-114, i-cuerpo AM4-272 e i-cuerpo AM3-523 se visualizaron en una estructura de dímero CXCR4 (derivada de PDB ID # 3ODU; Wu et al., (2010) Science 330: 1066­ 1071.

Otro ensayo es un ensayo de unión a antígeno, por ejemplo, como se describe en Scopes in: Protein Purification: Principles and Practice, tercera edición, Springer Verlag, 1994. Tal método implica generalmente marcar la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 y ponerlo en contacto con el objetivo inmovilizado o un fragmento del mismo, por ejemplo, lipopartículas positivas para CXCR4 o CXCR4 humanas. Después del lavado para eliminar la proteína unida no específica, se detecta la cantidad de marcador y, como consecuencia, la proteína unida. Por supuesto, la molécula de unión a CXCR4 o el polipéptido se pueden inmovilizar y marcar la diana. También se pueden utilizar ensayos de tipo tamizaje (panning).

Un método ejemplar para determinar un inhibidor de la actividad de CXCR4 es un ensayo de unión competitiva. Por ejemplo, se añade SDF-1 marcado a células que expresan CXCR4 o lipopartículas positivas de CXCR4 inmovilizadas con una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 o después de la adición de la molécula o polipéptido de unión a CXCR4. Después del lavado para eliminar la molécula o polipéptido de unión a SDF-1 y/o CXCR4 no unido, se detecta la cantidad de marcador unido a CXCR4. Esto se compara con la cantidad unida después de la incubación en ausencia de una molécula o polipéptido de unión a CXCR4, y una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 que redujo la cantidad de unión de SDF-1 (es decir, el marcador unido) se considera un agente inhibidor de CXCR4.

Los ensayos de unión también se pueden utilizar para detectar la activación de la proteína G mediada por el receptor (por ejemplo, Regulación de la función y expresión del receptor acoplado a proteína G ed. Benovic JL pp119-132 (2000) Wiley-Liss NY). Dichos ensayos incluyen la unión de GTP estimulada por el receptor a las subunidades Ga. La activación de GPCR da como resultado el intercambio de GDP-GTP en la subunidad Ga y este intercambio puede cuantificarse y usarse como una medida directa de la interacción receptor-proteína G. Esto normalmente implica el uso de nucleótidos de guanina radiomarcados con el receptor en preparaciones de membranas libres de células o membranas lipídicas artificiales. La cantidad de radiomarcador incorporado se usa como una medida del grado de activación de la proteína G.

Los métodos para evaluar la afinidad de unión a antígeno son bien conocidos en la técnica y también incluyen ensayos de unión a la mitad del máximo, ensayos de competición y análisis de Scatchard.

Ensayos de afinidad

Opcionalmente, la constante de velocidad de disociación (Kd), la constante de velocidad de asociación (Ka) o la constante de unión/constante de disociación de equilibrio (Kd, es decir, Kdisociación/Kasociación) de un polipéptido de unión a CXCR4. Estas constantes para un polipéptido de unión a CXCR4 pueden medirse mediante un ensayo de unión a CXCR4 marcado radiactivamente o marcado con fluorescencia. Este ensayo equilibra el polipéptido de unión a CXCR4 con una concentración de lipopartículas positivas para CXCR4. Después del lavado para eliminar el CXCR4 no unido, se determina la cantidad de polipéptido de unión a CXCR4. De acuerdo con otro ejemplo, las constantes se miden usando ensayos de resonancia de plasmones de superficie, por ejemplo, usando resonancia de plasmones de superficie BIAcore (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) con lipopartículas positivas para CXCR4 inmovilizadas (WO 2005/042695).

La constante de velocidad de disociación (Kd) se usa para calcular la velocidad de disociación (kdisociación), una constante que se usa para calcular qué tan rápido se disocia una molécula de unión de su objetivo. Una pendiente más plana en el análisis BIAcore SPR indica una tasa de desconexión más lenta y, por lo tanto, una unión más fuerte. Una desventaja más pronunciada significa una tasa de desactivación más rápida/unión de anticuerpos más débil.

La constante de velocidad de asociación (Ka) es la parte de la reacción utilizada para calcular la velocidad de activación, una constante utilizada para caracterizar la rapidez con la que la molécula de unión se une a su objetivo.

La relación entre las tasas de asociación y disociación medidas experimentalmente (Kdisociación/Kasociación) se usa para calcular el valor Kd. La mayoría de las moléculas de unión tienen valores Kd en el rango micromolar bajo (10-6) a nanomolar (10-7 a 10-9). Generalmente se considera que los anticuerpos de alta afinidad están en el rango nanomolar bajo (10-9) con anticuerpos de muy alta afinidad estando en el rango picomolar (10-12).

Ensayos funcionales

La unión de un ligando, como un agonista o SDF-1 a CXCR4, puede dar como resultado la señalización por parte de este receptor acoplado a proteína G y la actividad de las proteínas G, así como la estimulación de otras moléculas de señalización intracelular. La actividad inhibidora o estimuladora de una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente descripción se puede determinar con o sin un ligando en un ensayo adecuado, así como la evaluación de la capacidad de la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 para inhibir o estimular la actividad en presencia o ausencia del ligando.

La actividad del receptor CXCR4 por la molécula de unión a CXCR4 o el polipéptido de la presente descripción se puede medir de varias formas, por ejemplo, alteración de la modulación de la p-arrestina, alteración de la concentración de Ca2+ intracelular, activación de fosfolipasa C, alteración en la concentración intracelular de inositol trifosfato QP3, alteración en la concentración intracelular de diacilglicerol (DAG) y alteración en la concentración intracelular de adenosin 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc).

La actividad de la proteína G, como la hidrólisis de GTP a GDP, o el evento de señalización posterior desencadenado por la unión del receptor, como la inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre intracelular (citosólico), se puede ensayar mediante métodos conocidos en la técnica u otros. métodos adecuados (por ejemplo, Neote et al (1993) Cell 72: 415-425; Van Riper y otros (1993) J. Exp. Med 177: 851-856).

Ensayos de AMPc

La activación de los GPCR por los polipéptidos de la invención se puede controlar midiendo el aumento o la disminución del AMPc intracelular con tintes fluorescentes. Los métodos para medir el AMPc intracelular son conocidos en la técnica. Los ensayos que miden los niveles celulares de AMPc dependen de la actividad de la adenilato ciclasa, que está regulada por GPCR acoplados a Gas o Gai/o proteína. La adenilato ciclasa requiere estimulación previa con forskolina. Además, para contrarrestar la degradación natural de AMPc a AMP por las enzimas fosfodiesterasas (PDE), es posible que se requiera un inhibidor de PDE (por ejemplo, IBMX) en el sistema durante la optimización del ensayo. Los ejemplos de colorantes permeables a la membrana útiles incluyen formas de colorantes de éster de acetoximetilo que pueden ser escindidos por esterasas intracelulares para formar un ácido libre, que ya no es permeable a la membrana y permanece atrapado dentro de una célula. También se pueden utilizar ensayos diseñados para medir directamente los niveles de AMPc producidos tras la modulación de la actividad de la adenilato ciclasa por los GPCR. Dichos ensayos se basan en la competencia entre el AMPc endógeno y el AMPc biotinilado añadido exógenamente. La captura de AMPc se logra mediante el uso de un anticuerpo específico conjugado con un material sólido, como una perla de captura.

Ensayos radiométricos como el ensayo SPA cAMP (GE Healthcare) y FlashPlate™ Ensayo cAMP de PerkinElmer usando I125 marcado con AMPc se usa ampliamente. Más recientemente, estos ensayos han sido reemplazados por ensayos homogéneos basados en luminiscencia o fluorescencia para evitar el uso de radiactividad. Otro ensayo es el ensayo de Complementación de Fragmentos de Enzimas (HitHunter™) por DiscovRx. El AMPc celular compite con el AMPc marcado con un pequeño fragmento peptídico de p-galactosidasa para unirse a un anticuerpo anti-AMPc. El AMPc marcado libre resultante se complementa con el fragmento de enzima, produciendo p-galactosidasa activa que se detecta con sustratos fluorescentes o luminiscentes. AlfaScreen™ (PerkinElmer) es un ensayo quimioluminiscente de proximidad sensible basado en perlas. El AMPc celular compite con una sonda de AMPc biotinilada reconocida por un donante de estreptavidina y perlas aceptoras conjugadas con anticuerpos anti-AMPc. La liberación del AMPc biotinilado del anticuerpo da como resultado la disociación del donante de estreptavidina de su aceptor, lo que se puede medir como una disminución en la señal quimioluminiscente.

Además, los kits cAMP basados en polarización de fluorescencia (FP, por sus siglas en inglés) están disponibles en PerkinElmer, Molecular Devices y GE Healthcare. Además, la detección de AMPc basada en HTRF está disponible en Cisbio. Con este método, se diseñan nuevos pares de donante (anticuerpo AMPc marcado con criptato de europio) y aceptor (AMPc marcado con un tinte de aloficocianina modificado) para aumentar la estabilidad de la señal y hacer que este ensayo sea altamente sensible y reproducible para la medición de AMPc.

Ensayos comerciales más recientes, como el cAMP-Glo™ (Promega) están disponibles para la modulación de GPCR que están acoplados a proteínas Ga que a su vez modulan la adenilato ciclasa. El ensayo se basa en AMPc como un potente activador de la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) tetrámera e inactiva que da como resultado la disociación de sus subunidades reguladoras unidas a AMPc y la liberación de las subunidades catalíticas activas libres. La activación de PKA se puede monitorear midiendo el uso de APT en una reacción de quinasa con una reacción basada en luciferasa/luciferina. La cantidad de ATP consumida refleja la activación de PKA por AMPc.

Ensayo de reclutamiento de fi-arrestina

Las beta-arrestinas son proteínas intracelulares que se reclutan en la superficie celular después de la activación del GPCR. Regulan la actividad de los receptores acoplados a proteína G (GPCR) (Luttrell et al. (2002) Journal of Cell Science, 115:455-465). En este caso, por los polipéptidos de la invención, lo que da como resultado la desensibilización y el direccionamiento del receptor para la internalización. Además de su papel en la desensibilización del receptor, la terminación de la señalización acoplada a la proteína G y la internalización, la p-arrestina también actúa como una proteína de andamiaje para vincular los GPCR activados a otras vías de señalización intracelular, como la activación de c-Src, ERK 1/2 y Akt de manera independiente de la proteína G. Hay varios métodos disponibles para medir el reclutamiento de p-arrestina, incluido el ensayo TransFluor® (Molecular Devices) donde la p-arrestina se acopla a GFP y tras la activación del receptor, la distribución citoplasmática difusa de GFP cambia a la formación de pozos o vesículas que contienen GFP que se visualizan con un sistema de imágenes de alto contenido.

Varios ensayos de reclutamiento de p-arrestina no basados en imágenes, como la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), como se describe en Xu Y et al (1999) Proc Natl Acad Sci 96: 151-6, la tecnología PathHunterTM (DiscoveRx) y el ensayo TangoTM (Invitrogen) están disponibles. En el ensayo BRET, el receptor de interés se etiqueta en el extremo C-terminal con una etiqueta de proteína fluorescente (como eGFP2, GFP10 o y Fp ) y la p-arrestina se etiqueta con una Renilla luciferasa (RLuc) o viceversa. Tras el reclutamiento de p-arrestina, las dos etiquetas se acercan mucho y la luz emitida por la reacción de RLuc excita la GFP, que luego emite una señal detectable a una longitud de onda más alta. BRET se calcula como el cociente de las dos emisiones (GFP/RLuc).

Tango de Invitrogen™ GPCR Assay System es una plataforma basada en un gen reportero activado por proteasa. La parrestina se fusiona con una proteasa TEV, mientras que el GPCR se extiende en su extremo C con un sitio de escisión de proteasa seguido del factor de transcripción Gal-VP16. Tras la activación de GPCR, la arrestina etiquetada con proteasa se recluta en el receptor y la Gal-VP16 que se fusiona con el receptor se escinde y entra en el núcleo para regular la transcripción de un gen reportero de p-lactamasa. La p-lactamasa cataliza la escisión de un sustrato modificado marcado con dos fluoróforos, y se puede monitorear el cambio en la señal de FRET entre estos dos fluoróforos.

El ensayo PathHunterTM (DiscoveRx) utiliza la complementación de fragmentos enzimáticos de p-galactosidasa y la actividad enzimática posterior para medir las interacciones receptor-p-arrestina. En este ensayo, la p-arrestina se fusiona con un mutante por deleción N-terminal de p-galactosidasa que es catalíticamente inactivo, y el GpCR se etiqueta en el C-terminal con un fragmento pequeño (4 kDa) derivado de la secuencia N-terminal eliminada de p-galactosidasa (ProLink™). Tras la interacción GpCR-p-arrestina, las dos partes de la p-galactosidasa se acercan, lo que da como resultado la activación de la enzima, la escisión del sustrato y la generación de una señal quimioluminiscente.

Ensayos de calcio

La activación de los GPCR por los polipéptidos de la invención se puede controlar midiendo el aumento o la disminución del calcio intracelular con colorantes fluorescentes. El ensayo de Ca2+ es muy popular en la detección de GPCR debido a la disponibilidad de colorantes fluorescentes sensibles a Ca2+- permeables a las células (como Fluo-3 y Fluo-4) y lectores de placas de fluorescencia automatizados en tiempo real, como FLIPR™ (Dispositivo Molecular). El dispositivo Molecular también ofrece kits de colorantes fluorescentes, que contienen moléculas de extinción patentadas que permiten la carga celular del colorante sin necesidad de un lavado celular posterior para eliminar el exceso de colorante. Las capacidades de pipeteo integradas del FLIPR™ permiten la detección de ultra alto rendimiento en formato de 384 o 1536 pocillos con la capacidad de detectar agonistas, antagonistas y moduladores, todo en un solo ensayo. El uso de colorantes fluorescentes también se puede sustituir por el uso de biosensores sensibles a Ca2+". La expresión recombinante de la fotoproteína aequorina de las medusas, que proporciona una señal luminiscente intensa en respuesta al Ca2+ intracelular elevado en presencia de un derivado de coelenterazina, también se ha desarrollado para pantallas funcionales de GPCR (Eglen RM et al (2008) Ensayo de tecnología de desarrollo de fármacos 6: 659-71).

Los ensayos comerciales adicionales incluyen el ensayo de movilización de calcio Fluo-4/Fluor-8 (Invitrogen) y el ensayo Tango™ Gp CR (Life Technologies).

Ensayos de quimiotaxis

Los ensayos de quimiotaxis también se pueden usar para evaluar la capacidad de un polipéptido de unión a CXCR4 de la invención para bloquear la unión de un ligando a CXCR4 y/o inhibir la función asociada con la unión del ligando al receptor (Fernandis et al. (2004) Oncogene 23: 157-167). Estos ensayos se basan en la migración funcional de células in vitro o in vivo inducida por un compuesto (quimioatrayente). La quimiotaxis se puede evaluar por cualquier medio adecuado, por ejemplo, en un ensayo que utiliza una placa de quimiotaxis de 96 pocillos u otro método reconocido en la técnica para evaluar la quimiotaxis. En un ejemplo, se puede evaluar la migración de células Jurkat, MDA-MB-231, MDA-MB-468, PC3 o NCI-H69 utilizando un ensayo de quimiotaxis. Por ejemplo, celdas Jurkat (5 * 105 células en 200 ml de RPMI-1640) se preincuban con y sin los polipéptidos de la invención y ^s DF-1 y se añaden al pocillo superior de un inserto de cultivo Transwell de policarbonato de 6,5 mm de diámetro y poro 5 mM (Costar, Cambridge, MA) con 0,25% de BSA. Se añade SDF-1 (concentración fija) en los pocillos inferiores y las células se incuban para la migración a 37°C durante 4 h. Las células migradas en la cámara inferior se cuentan con un contador ZM Coulter (Coulter Diagnostics, Hialeah, FL).

Ensayos de proliferación

Los polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente divulgación pueden evaluarse por su capacidad para inhibir la proliferación celular de células tumorales (por ejemplo, células tumorales que expresan CXCR4 en la superficie tales como MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-549, Ramos, Namalwa, MOLT-4, DU-4475, DU-145, PC3, LNcaP, SW480, HT29, NCI-H69 y HL60), o en una línea celular que ha sido diseñada para expresar CXCR4. Los polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción también pueden evaluarse por su capacidad para inhibir la proliferación celular de células progenitoras CD34+ (por ejemplo, Khan et al. Overexpression of CXCR4 on human CD34+ progenitors increases their proliferation, migration, and n Od /SCID repopulation ((2004) Blood. 103:2942-2949). Los ensayos de proliferación celular serán conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos de ensayos de proliferación celular incluyen el ensayo de proliferación celular MTT (ATCC), el ensayo de proliferación celular acuosa CellTiter (Promega), el ensayo alamarBlue (Invitrogen), el ensayo de proliferación celular directa CyQUANT (Life Technologies), que se describen, por ejemplo, en WO01/081614, y US5972639.

Ensayos de apoptosis

Las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción pueden evaluarse en cuanto a su capacidad para inducir la apoptosis. Los ensayos de apoptosis están disponibles en una variedad de formatos que serán conocidos por los expertos en la técnica. Éstos incluyen:

(i) ensayos de caspasa, por ejemplo, PhiPhiLux® (Oncolmmunin, Inc), ensayo de actividad de caspasa 3 (Roche Applied Science), caspasa-Glo™ Ensayos (Promega), CaspACE™ Sistema de ensayo (Promega), EnzChek® kit de ensayo Caspasa-3 (Invitrogen), kits de detección Active Caspase-3 (Stratagene), productos de apoptosis mediada por caspasa (BioVision), kit de ensayo de apoptosis CasPASETM (Genentech);

(ii) Ensayos de fragmentación de ADN y túnel, por ejemplo, kit de escalera de ADN apoptótico (Roche Applied Science), ^e LⁱSA de fragmentación de ADN celular (Roche Applied Science), DeadEnd™ Sistema TUNEL (Promega), APO-BrdU™ kit de ensayo TUNEL (Invitrogen), kit de detección de apoptosis TUNEL (Upstate), kit de tinción de apoptosis Mebstain (Bechman Coulter), kits de apoptosis mediada por energía nuclear (BioVision), kit de escalera de ADN apoptótico (Genentech);

(iii) Ensayos de permeabilidad celular, por ejemplo, APOPercentage™ Ensayo (Ensayos Biocolor);

(iv) Ensayos de anexina V, por ejemplo, anexina V, Alexa Fluor® (Invitrogen), rodamina 110, bis-(amida del ácido L-aspártico), sal del ácido trifluoroacético (Invitrogen), kits de apoptosis de anexina V (BioVision);

(v) Ensayos de escisión de proteínas, por ejemplo, anti-poli (ADP-ribosa) polimerasa (Roche Applied Science), M30 CytoDEATH (Roche Applied Science);

(vi) Ensayos mitocondriales y ATP/ADP, por ejemplo, ApoGlow® kit de detección rápida de apoptosis, kit de detección de potencial de membrana mitocondrial (Stratagene) y productos de apoptosis mediada por mitocondrias (BioVision); y (vii) una combinación de anexina V y yoduro de propidio como se describe en los ejemplos descritos en el presente documento.

Ensayos de angiogénesis

La angiogénesis se caracteriza por una serie de eventos celulares que incluyen la migración, invasión y diferenciación de células endoteliales en capilares. in vitro Los ensayos de formación de tubos endoteliales se utilizan como modelo para estudiar la diferenciación endotelial y la modulación de la formación de tubos endoteliales por agentes antiangiogénicos (ver por ejemplo Sharon McGonigle y Victor Shifrin Protocolos actuales en farmacología DOI: 10.1002/0471141755.ph1212s43 o Liang et al, (2007) Biochem Biophys Res Commun. 3 de agosto; 359(3): 716-722.). Normalmente, los ensayos de formación de tubos endoteliales se realizan utilizando células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), HMVEC y células HMEC-1. Las células se sembraron en una capa de Matrigel a una densidad de 1*105 células/ml de medio M199 con 1 % de FBS y 200 ng/ml de CXCL12. Después de 18 horas, los pocillos se fotografiaron con un aumento de 4x y se cuenta el número de sus redes tubulares.

Ensayo de dimerización del receptor

CXCR4 interactúa con CXCR7, CCR5, P²AR (p² receptor adrenérgico), CCR2, DOR (receptor opiáceo Delta) y CCR7 en la membrana plasmática para formar un heterodímero, un oligómero o incluso complejos de orden superior que incluyen homodímeros con CXCR4. Los compuestos que se dirigen específicamente a los heterodímeros GPRC o afectan la dimerización del receptor pueden tener potencial para lograr efectos terapéuticos específicos (Rozenfeld R et al (2011) Biochem J 433: 11-8). Se han establecido varias tecnologías para monitorear la dimerización del receptor, incluidos los enfoques de transferencia de energía de resonancia (FRET o BRET).

En los enfoques basados en FRET o BRET de uso común, las moléculas donadoras y aceptoras se fusionan genéticamente con el extremo C-terminal de los GPCR, que se sobreexpresan en las células. La transferencia de energía de resonancia ocurre cuando las moléculas donadoras y aceptoras se acercan mucho como consecuencia de la dimerización de GPCR (revisado en Achour L et al (2011) Métodos Mol Biol 756:183-200). Sin embargo, una limitación de estos ensayos FRET y BRET tradicionales es que, en el sistema de sobreexpresión, la transferencia de energía de resonancia también puede ocurrir dentro de los compartimentos intracelulares, de modo que es difícil demostrar una señal específica que resulte solo de una interacción directa de proteínas en la superficie celular.

El ensayo de dimerización de GPCR como se describe en Patente estadounidense 8,283,127 titulado 'Detection System and Uses Therefor' cubre la configuración de ensayo de la tecnología de identificación de heterómeros (HIT, por sus siglas en inglés) de Dimerix para la identificación, el control y la detección dependientes de ligandos de heterómeros de dos proteínas cualesquiera. También cubre la aplicación del ensayo de Dimerix en todos los sistemas informadores basados en proximidad.

El ensayo de dimerización de GPCR con Tag-lite™ es un método que combina TR-FRET con la tecnología SNAP-tagTM (Cisbio), lo que permite el análisis cuantitativo de las interacciones proteína-proteína en la superficie de las células vivas en un formato de 96 o 384 pocillos. En este ensayo, los GPCR se etiquetan con una etiqueta SNAP o CLIP en el extremo N, que se puede etiquetar posteriormente con sus correspondientes sustratos impermeables a las células que portan los fluoróforos compatibles con TR-FRET apropiados, normalmente utilizando criptato de terbio como donante y una molécula fluorescente verde o roja como aceptor. Existen varias combinaciones posibles de dímeros en este ensayo: 1/4 de los dímeros contienen ambos receptores marcados con el donante, 1/4 de los dímeros contienen ambos receptores marcados con los aceptores y 1/2 de los dímeros contienen un receptor marcado con el donante y un receptor marcado con el aceptor. Solo la última fracción emitirá la señal FRET.

El sistema PathHunterTM (DiscoveRx) es otra plataforma que se puede utilizar para el análisis de heterodimerización de GPCR. Las líneas celulares utilizadas en el ensayo de reclutamiento de p-arrestina PathHunterTM descrito anteriormente se pueden utilizar como material de partida. En estas líneas celulares, la p-arrestina se fusiona con la porción más grande del aceptor de la enzima p-galactosidasa y la etiqueta ProLink™ de 42 aminoácidos más pequeña está adjunta a uno de los objetivos de GPCR. Se puede introducir un segundo GPCR sin etiquetar en las células y los efectos de transactivación del GPCR sin etiquetar en el GPCR ProLink™ etiquetado se puede medir mediante el reclutamiento de p-arrestina en el GPCR etiquetado usando reactivos de detección PathHunter. La fuerza de transactivación se puede estimar como una relación entre la respuesta celular al agonista del GPCR no etiquetado y la respuesta al agonista de Prolink™-GPCR. El ensayo se puede utilizar para investigar la interacción entre pares de GPCR, así como para detectar compuestos que modulan la actividad de GPCP mejorando o interrumpiendo la heterodimerización de GPCR en un formato de 384 pocillos, por ejemplo, CXCR4 y CXCR7, CXCR4 y CCR5 o CXCR4 y p²AR o CXCR4 y DOR o CXCR4 y CCR2 o CXCR4 y CCR7.

Ensayos competitivos

Los estudios de competencia se pueden utilizar para determinar la capacidad de las moléculas de unión a CXCR4, incluido el ligando SDF-1 o los polipéptidos (i- cuerpos), para competir por la unión a CXCR4. Por lo general, los i-cuerpos de CXCR4 se valoran en una serie de diluciones en serie de 1:3 que dan como resultado un rango de concentración, por ejemplo, de 100 nm a 5 pM en presencia de una concentración constante de anticuerpo anti-CXCR4 humano marcado con SDF-1 o FITC (por ejemplo, 12G5). Luego, la mezcla se agrega a las células que expresan CXCR4 y se permite que se una. La capacidad de cada i-cuerpo para competir con 12G5 por unirse a células que expresan CXCR4 puede evaluarse mediante citometría fluorescente y detección de FITC.

También se pueden realizar estudios de competencia utilizando lipoproteínas que contienen CXCR4 (IntegraMolecular) como se describe en WO 2005/042695.

La capacidad de los i-cuerpos de la presente divulgación para unirse a una variedad de líneas celulares diferentes también puede examinarse mediante citometría de flujo realizando una titulación FACS. Se pueden incubar cantidades crecientes de i-cuerpo con 100.000 células y se puede evaluar la unión mediante citometría de flujo. También se puede determinar el valor Bmáx, que indica aproximadamente cuántas moléculas CXCR4 están presentes en cada célula. Basándose en las curvas de unión, se puede determinar una CE50 para la unión de i-cuerpo. Los ejemplos de líneas celulares adecuadas incluyen Ramos, Raji, Namalwa, L540, DMS79, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-549, MOLT-4, DU-4475, DU-145, PC3, LNcaP, SW480, HT29, NCI-H69 y HL60.

También se puede examinar la capacidad de los i-cuerpos de la presente divulgación para unirse a diferentes subconjuntos de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Las PBMC humanas pueden aislarse mediante métodos estándar y los subconjuntos celulares pueden aislarse adicionalmente mediante FACS. Los ejemplos de subconjuntos celulares incluyen uno o más de los siguientes CD3, CD20, CD11b y CD14. La unión se puede evaluar mediante citometría de flujo en comparación con un control adecuado como se muestra en los ejemplos del presente documento.

El ensayo de competencia se puede realizar utilizando SDF-I marcado con yodo-125 y una línea celular que exprese naturalmente lipopartículas CXCR4 o CXCR4. Se puede realizar una comparación de los i-cuerpos sobre el bloqueo de la unión de SDF-I a la línea celular que expresa CXCR4 mediante un ensayo de unión de ligando radiomarcado estándar. Los i-cuerpos pueden diluirse en serie 1:3 para producir un rango de concentraciones y luego agregarse a las células que expresan CXCR4 en presencia de 125I-SDF-I con una actividad específica de 2000 Ci/mmol (Amersham, catálogo #EM3l4-25UCI). El posible ligando radiomarcado enlazado total se puede determinar permitiendo que el 125I-SDF-I para unirse a células que expresan CXCR4 en ausencia de i-cuerpos durante 2 horas a 40 °C. La unión no específica del ligando radiomarcado se puede determinar permitiendo que el 125I-SDF-I para unirse en presencia de 1 |jM de SDF-I sin marcar (Peprotech, catálogo # 300-28A). A continuación, se determina la cantidad de células asociadas 125I-SDF-I mediante métodos estándar.

Alternativamente, podría usarse SDF-1 sin marcar para competir con la unión del i-cuerpo a las lipopartículas que sobreexpresan CXCR4. La unión del i-cuerpo a estas lipopartículas podría detectarse utilizando un anticuerpo contra la etiqueta His o la etiqueta FLAG. Se agregarán concentraciones crecientes de SDF-1 y se medirá la cantidad de i-cuerpo que queda unido. Esto se puede hacer en un formato ELISA donde las lipopartículas CXCR4 se inmovilizan en plástico. Esta información determinará si el sitio de unión del i-cuerpo en CXCR4 es el mismo, cercano o diferente al ligando SDF-1.

Ensayos de detección de proteínas

Un ejemplo de la divulgación detecta la presencia de CXCR4 o una célula que expresa el mismo o una lipopartícula que contiene CXCR4 dentro de la membrana. La cantidad, el nivel o la presencia de una proteína o célula se determina usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por el experto en la materia como, por ejemplo, una técnica seleccionada del grupo que consiste en citometría de flujo, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, inmunotransferencia, Western blot, dot blot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo enzimático, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF), ionización por electropulverización (ESI), espectrometría de masas (incluida la espectrometría de masas en tándem, por ejemplo, ^lC MS/MS), tecnología de biosensores, tecnología de fibra óptica evanescente o tecnología de chips de proteínas.

En un ejemplo, el ensayo utilizado para determinar la cantidad o el nivel de una proteína es un ensayo semicuantitativo.

En otro ejemplo, el ensayo utilizado para determinar la cantidad o el nivel de una proteína es un ensayo cuantitativo.

Por ejemplo, la proteína se detecta con un inmunoensayo, por ejemplo, utilizando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo inmunoabsorbente ligado a fluorescencia (FLISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), un ensayo de biosensor, un ensayo de chip de proteína y un ensayo de inmunotinción (por ejemplo, inmunofluorescencia).

Los formatos estándar de ELISA o FLISA en fase sólida son particularmente útiles para determinar la concentración de una proteína a partir de una variedad de muestras.

En una forma, un ELISA o FLISA consiste en inmovilizar una lipopartícula CXCR4 sobre una matriz sólida, como, por ejemplo, una membrana, un micropocillo de poliestireno o policarbonato, una tira reactiva de poliestireno o policarbonato o un soporte de vidrio. Una muestra que incluye la molécula de unión a CXCR4 o el polipéptido de la descripción se pone en relación física con la proteína CXCR4 inmovilizada y luego se une o "captura". La molécula o polipéptido de unión a CXCR4 unido se detecta luego usando un segundo compuesto marcado que se une a una secuencia etiqueta situada en el extremo de la molécula o polipéptido de unión a CXCR4.

Será evidente para el experto en la materia que los formatos de ensayo descritos en el presente documento son aptos para formatos de alto rendimiento, como, por ejemplo, la automatización de procesos de selección o un formato de micromatriz. Además, las variaciones del ensayo descrito anteriormente serán evidentes para los expertos en la técnica, como, por ejemplo, un ELISA competitivo.

En un ejemplo alternativo, se detecta un polipéptido dentro o sobre una célula, utilizando métodos conocidos en la técnica, como, por ejemplo, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Los métodos que usan inmunofluorescencia son ejemplares, ya que son cuantitativos o al menos semicuantitativos. Los métodos para cuantificar el grado de fluorescencia de una célula teñida son conocidos en la técnica.

Las lipopartículas que contienen CXCR4 se pueden usar para evaluar la unión de una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente descripción con CXCR4. La proteína CXCR4 incrustada en la lipopartícula se puede utilizar en ensayos donde no se pueden utilizar proteínas solubles o células completas, como ensayos donde la proteína de interés (por ejemplo, CXCR4) debe unirse a un soporte o sustrato, por ejemplo, un ensayo que utilice un dispositivo microfluido por ejemplo un ensayo de biosensor. En algunos ejemplos, una lipoproteína se une a una superficie y luego se pone en contacto con la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación y el biosensor detecta la unión del polipéptido CXCR4 de la invención a la lipopartícula. La detección puede ser por resonancia de plasmón superficial, rejilla de difracción colorimétrica, deflexión de micro voladizos (Weeks BL et al (2003) Scanning 25(6):297-9), o respuesta de onda acústica (Coper MA et al (2001) Nature Biotechnology 19, 833-837). En algunos ejemplos, la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 se une a una superficie que forma parte de un sensor y luego se pone en contacto con una lipopartícula y se detecta la unión. La detección puede ser por resonancia de plasmón superficial, rejilla de difracción colorimétrica, desviación de microvoladizos o respuesta de onda acústica. En algunos ejemplos, la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 y la lipopartícula se ponen en contacto en solución.

Los dispositivos biosensores están diseñados para medir la interacción entre moléculas biológicas. Los dispositivos biosensores generalmente emplean una superficie de electrodo en combinación con elementos de medición de corriente o impedancia para integrarse en un dispositivo en combinación con el sustrato de ensayo (como el que se describe en US5567301). Por lo general, los biosensores miden las interacciones directas entre una proteína de interés y los posibles ligandos que pueden unirse a ella. Los biosensores suelen ser muy sensibles y pueden trabajar y detectar incluso interacciones muy débiles o en cantidades muy pequeñas. Se han construido dispositivos biosensores que consisten en chips ópticos, fibra óptica, detectores espectrómetros, chips de microcanales, nanopozos y microvoladizos, y dispositivos de ondas acústicas. Algunas formas de biosensores conocidos en la técnica también se basan en la resonancia de plasmones de superficie para detectar interacciones de proteínas, por lo que un cambio en la superficie de reflexión de la resonancia de plasmones de superficie es indicativo de una proteína que se une a un ligando o anticuerpo (US5485277 y US5492840).

En un ejemplo, la lipopartícula se une a una superficie sensora, donde una "superficie sensora" es cualquier sustrato donde se detecta un cambio en una propiedad del sustrato mediado por el contacto de la superficie con una molécula o polipéptido y se puede comparar con la superficie en ausencia de tal contacto. Sin embargo, en otros ejemplos, la lipopartícula ya está unida a una superficie sensora. Si bien la superficie del sensor puede ser un chip de biosensor, la superficie del sensor también incluye cualquier chip de biosensor conocido en la técnica, por ejemplo, Chip Biacore C1, un chip F1, un sustrato de vidrio que comprende un revestimiento de, por ejemplo oro.

Los biosensores son especialmente útiles en el análisis de alto rendimiento debido a la facilidad de adaptar dichos sistemas a escalas micro o nanométricas. Además, dichos sistemas están convenientemente adaptados para incorporar varios reactivos de detección, lo que permite la multiplexación de reactivos de diagnóstico en una sola unidad de biosensor. Esto permite la detección simultánea de varias proteínas o péptidos en una pequeña cantidad de fluidos corporales.

La presente descripción también abarca cualquier ensayo donde la proteína de interés sea un componente de la membrana (por ejemplo, CXCR4) y donde el estudio de la unión de la proteína con una molécula o polipéptido de unión requiera, o se facilite presentando la proteína en el contexto de una bicapa lipídica y/o unir la proteína a un soporte o sustrato sólido. Dichos ensayos incluyen ensayos que usan un dispositivo microfluídico, un biosensor óptico, espectroscopía PATIR-FTIR, que es un tipo de biosensor que usa espectroscopía intrarroja de transformada de Fourier de reflexión interna total (19998, Chem. Phys. Lipids 96:69-80), CPRW Biosensor (espectroscopía de resonancia de longitud de onda de plasmón acoplado (CPWR, por sus siglas en inglés) como se describe en Salamon et al (1997) Biophys J 73:2791-2197), espectroscopía de acoplamiento multipolar (MCS, por sus siglas en inglés) como se describe en Signature biosceinces, biosensores de fibra óptica (Illumina) como se describe en Walt et al (200) Science 287: 451­ 52 y Dickinson et al (1996) Nature 382: 697-700, microfluidos laboratorio en un chip como se describe en Sundberg et al Current Opin in Biotech 11: 47-53, microcanales (los microcanales de Gyros grabados en un dispositivo basado en un disco compacto, Microcantilevers como se describe en Tamayo et al (2001) Ultramicroscopy 86:167-173, microscopía confocal y detección de nanopozos como se describe WO 01/02551 y ensayos de unión a micropocillos. En un ejemplo, la superficie del sensor comprende un formato de portaobjetos o fibra óptica de 96 pocillos, 384 pocillos, 1536 pocillos y nanopocillos.

Métodos de imagen

Como será evidente para el experto en la materia a partir de lo anterior, la presente descripción también contempla métodos de obtención de imágenes que usan una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación. Para la obtención de imágenes, una molécula o polipéptido que se une a CXCR4 generalmente se conjuga con un marcador detectable, que puede ser cualquier molécula o agente que pueda emitir una señal que sea detectable mediante imágenes. Sin embargo, también se puede usar un compuesto marcado secundario que se une específicamente a una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación. Ejemplos de etiquetas detectables incluyen una proteína, un radioisótopo, un fluoróforo, un fluoróforo emisor de luz visible, un fluoróforo emisor de luz infrarroja, un metal, una sustancia ferromagnética, una sustancia emisora electromagnética, una sustancia con una firma espectroscópica de resonancia magnética (RM) específica, un X -sustancia que absorbe o refleja los rayos, o una sustancia que altera el sonido.

La molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación (y, si se usa el compuesto secundario marcado) puede administrarse de forma sistémica o local a un órgano o tejido (o tumor, en el caso de un cáncer) para obtener imágenes, antes del procedimiento de imagen. Generalmente, la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 se administra en dosis efectivas para lograr la imagen óptica deseada de un tumor, tejido u órgano. Dichas dosis pueden variar ampliamente, dependiendo de la molécula de unión a CXCR4 particular o el polipéptido empleado, la condición de la que se obtendrán imágenes, el tejido u órgano sometido al procedimiento de formación de imágenes, el equipo de formación de imágenes que se utilice y similares.

En algunos ejemplos de la descripción, la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 se usa como agentes in vivo de formación de imágenes ópticas de tejidos y órganos en diversas aplicaciones biomédicas que incluyen, entre otras, formación de imágenes de tumores, formación de imágenes tomográficas de órganos, monitorización de funciones de órganos, angiografía coronaria, endoscopia de fluorescencia, cirugía guiada por láser, métodos fotoacústicos y de sonofluorescencia, y similares.

Ejemplos de métodos de imagen incluyen imágenes por resonancia magnética (IRM), espectroscopia por RM, radiografía, tomografía computarizada (TC), ultrasonido, imágenes de cámara gamma plana, tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT, por sus siglas en inglés), tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés), otra medicina nuclear basada en imágenes, imágenes ópticas usando luz visible, imágenes ópticas usando luciferasa, imágenes ópticas usando un fluoróforo, otras imágenes ópticas, imágenes usando luz infrarroja cercana o imágenes usando luz infrarroja.

En algunos ejemplos, un agente de formación de imágenes se prueba utilizando un ensayo in vitro o in vivo antes de su uso en seres humanos, por ejemplo, usando un modelo descrito en este documento.

Muestras

En la medida en que se lleve a cabo un método de la presente descripción en vitro, o en una muestra de tejido aislado, en lugar de basado en la pantalla in vivo, la referencia a "muestra" debe entenderse como una referencia a cualquier muestra de material biológico derivado de un sujeto como, entre otros, un fluido corporal (por ejemplo, sangre o líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo), material celular (por ejemplo, aspirado de tejido), especímenes de biopsia de tejido o especímenes quirúrgicos.

La muestra que se usa de acuerdo con un método de la presente descripción puede usarse directamente o puede requerir alguna forma de tratamiento antes de su uso. Por ejemplo, una biopsia o muestra quirúrgica puede requerir homogeneización u otra forma de dispersión celular antes de su uso. Además, en la medida en que la muestra biológica no esté en forma líquida (si tal forma es requerida o deseable) puede requerir la adición de un reactivo, tal como un tampón, para movilizar la muestra.

Como será evidente a partir de la descripción anterior, dicho ensayo puede requerir el uso de un control adecuado, por ejemplo, un individuo normal o sano o una población típica, por ejemplo, para la cuantificación.

Un "sujeto sano" es aquel que no ha sido diagnosticado de padecer una afección, por ejemplo, una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 y/o no tiene riesgo de desarrollar la enfermedad o trastorno.

Alternativamente, o además, una muestra de control adecuada es un conjunto de datos de control que comprende mediciones del marcador que se está analizando para una población típica de sujetos que se sabe que no padecen una afección.

En un ejemplo, no se incluye una muestra de referencia en un ensayo. En su lugar, una muestra de referencia adecuada se deriva de un conjunto de datos establecido generado previamente a partir de una población típica. Los datos derivados del procesamiento, análisis y/o ensayo de una muestra de prueba se comparan luego con los datos obtenidos para la muestra de población.

Composiciones farmacéuticas

Moléculas de unión a CXCR4 o polipéptidos de la descripción (sin. ingredientes activos) son útiles para formulaciones en una composición farmacéutica para administración parenteral, tópica, oral o local, administración en aerosol o administración transdérmica, para tratamiento profiláctico o terapéutico. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación unitaria dependiendo del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral incluyen polvo, tabletas, píldoras, cápsulas y pastillas para chupar.

Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción son útiles para la administración parenteral, como la administración intravenosa o la administración subcutánea o la administración en una cavidad corporal o luz de un órgano o articulación. Las composiciones para administración comprenderán comúnmente una solución de la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la divulgación disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un vehículo acuoso. Se puede utilizar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Las composiciones pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes tamponadores y reguladores del pH, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico y similares. La concentración de moléculas de unión o polipéptidos de la presente descripción en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluidos, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente. Los vehículos ejemplares incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. También pueden usarse vehículos no acuosos tales como aceites mixtos y oleato de etilo. Los liposomas también se pueden usar como vehículos. Los vehículos pueden contener cantidades menores de aditivos que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, tampones y conservantes.

Una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la descripción puede formularse para administración parenteral, por ejemplo, formularse para inyección por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica u otras vías similares, incluida la administración peristáltica y la instilación directa en un tumor o sitio de enfermedad (administración intracavidad). La preparación de una composición acuosa que contiene los compuestos de la presente descripción como ingrediente activo será conocida por los expertos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas de acuerdo con la divulgación generalmente incluirán una cantidad de la molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente divulgación mezclada con un vehículo farmacéutico aceptable, como una solución acuosa estéril, para dar un rango de concentraciones finales, dependiendo del uso pretendido. Las técnicas de preparación son generalmente conocidas en la técnica como se ejemplifica por Ciencias farmacéuticas de Remington, 16a ed. Compañía editorial Mack, 1980.

Tras la formulación, los compuestos de la presente descripción se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéutica/profilácticamente eficaz. Las dosis adecuadas de los compuestos de la presente divulgación variarán dependiendo del compuesto específico, la condición a tratar y/o el sujeto que se trata. Está dentro de la capacidad de un médico experto determinar una dosificación adecuada, por ejemplo, comenzando con una dosificación subóptima y modificando gradualmente la dosificación para determinar una dosificación óptima o útil.

Las dosificaciones y tiempos de administración ejemplares serán evidentes para el experto en la materia en base a la descripción del presente documento.

Las composiciones de la presente descripción se pueden combinar con otras fracciones terapéuticas o fracciones de diagnóstico/imagen. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente divulgación puede comprender un agente activo adicional seleccionado del grupo que consiste en bisfosfonatos, vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de la misma, preparaciones hormonales como estradiol, SERM (moduladores selectivos del receptor de estrógeno), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, preparaciones de PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos, preparaciones de receptores solubles de TNF, moléculas de unión anti-TNF-a, anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, anti-PTHrP (hormona paratiroidea relacionadas con la proteína, por sus siglas en inglés) moléculas de unión, anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, antagonistas del receptor de IL-1, moléculas de unión del receptor anti-IL-⁶ , anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, moléculas de unión anti-VEGF-A o anticuerpos anti-CD20 moléculas de unión o anticuerpos, moléculas o anticuerpos de unión anti-PDL-1 o anti-PD1, moléculas o anticuerpos de unión anti-CCL2, moléculas o anticuerpos que se unen a anti-CCR2, moléculas que se unen a anti-RANK-L o fragmentos funcionales de los anticuerpos o i-cuerpos.

Una composición farmacéutica de la presente divulgación también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen (1) antioxidantes solubles en agua, como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares, (² ) antioxidantes solubles en aceite, como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA, por sus siglas en inglés), hidroxitolueno butilado (BHT, por sus siglas en inglés), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares, y (3) agentes quelantes de metales, como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden administrarse en terapia combinada, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente descripción combinado con al menos otro antineoplásico, agente antiinflamatorio o inmunosupresor.

Los ejemplos de antineoplásicos o quimioterapéuticos pueden incluir mitoxantrona, etopósido, azacitidina, lenalidomida, temozolomida, decitabina, ganetespib, clofarabina, citarabina, daunorrubicina, vinorelbina, azacitidina, sorafenib, rituximab, bevacizumab o bortezomib.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, humectantes, emulsionantes y dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un vehículo farmacéuticamente aceptable para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una única forma de dosificación generalmente será la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, del cien por ciento, esta cantidad variará desde aproximadamente el ^{0 , 01} por ciento hasta aproximadamente el noventa y nueve por ciento del ingrediente activo (es decir, polipéptido de unión a CXCR4), en un ejemplo desde aproximadamente el 0,1 por ciento hasta aproximadamente el 70 por ciento, en un ejemplo desde aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. "Forma de unidad de dosificación", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificación de esta divulgación están dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se logrará, y (b) las limitaciones inherentes en el arte de la preparación de tales compuestos. compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos. Para la administración de la molécula o polipéptido de unión a CXCR4, la dosificación oscila entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 1 - 10 mg/ kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración una vez al día, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a ⁶ meses. Los regímenes de dosificación preferidos para moléculas o polipéptidos que se unen a CXCR4 de esta divulgación incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, administrándose el anticuerpo usando uno de los siguientes programas de dosificación (i) cada cuatro semanas durante seis dosis, luego cada tres meses, (ii) cada tres semanas, (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración en particular, sin ser tóxico para el sujeto. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente descripción empleadas, o el éster, la sal o la amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otras drogas, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y como factores bien conocidos en las artes médicas. Una "dosis terapéuticamente eficaz" de una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de esta divulgación preferiblemente da como resultado una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de CXCR4 tumores, una "dosis terapéuticamente eficaz" inhibe preferentemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos un 20%, al menos un 40%, al menos un 60% o al menos un 80% en relación con los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, tal inhibición se puede medir in vitro mediante ensayos conocidos por el experto en la materia. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o mejorar los síntomas en un sujeto. Un experto normal en la técnica podría determinar dichas cantidades basándose en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición particular o vía de administración seleccionada.

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una composición terapéutica de la presente descripción se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, como los dispositivos descritos en Patentes estadounidenses No. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, o 4,596,556. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente divulgación incluyen Patente de EE. UU. No. 4,487,603, que da a conocer una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicamentos a un ritmo controlado, Patente de EE. UU. No. 4,486,194, que divulga un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel, Patente de EE. UU. No. 4,447,233, que divulga una bomba de infusión de medicamentos para administrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa, Patente de EE. UU. No. 4,447,224, que divulga un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármacos, Patente de Ee . UU. No. 4,439,196, que describe un sistema osmótico de administración de fármacos que tiene compartimentos multicámara, y Patente de EE. UU. No. 4,475,196, que describe un sistema osmótico de suministro de fármacos. Los expertos en la técnica conocen muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo.

En un ejemplo, las composiciones se formulan para que estén libres de pirógenos de modo que puedan administrarse a pacientes humanos.

La presente divulgación también contempla el uso de cualquiera de las composiciones de polipéptido de unión a CXCR4/icuerpo de la presente divulgación para preparar un medicamento para tratar un trastorno de la presente divulgación. Los medicamentos se pueden envasar en un paquete farmacéutico adecuado con etiquetas apropiadas para la distribución a hospitales y clínicas de acuerdo con las indicaciones de la etiqueta.

Usos de los polipéptidos de unión a CXCR4

Las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente divulgación tienen numerosas utilidades in vitro e in vivo diagnósticas y terapéuticas que implican el diagnóstico y tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con CXCR4. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar una variedad de trastornos. Los sujetos preferidos incluyen sujetos humanos que tienen trastornos mediados o modulados por la actividad de CXCR4 o que implican la vía CXCR4/SDF-1. Cuando se administra un polipéptido de unión a CXCR4 junto con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente. Dada la unión específica de las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de esta divulgación para CXCR4, se pueden usar para detectar específicamente la expresión de CXCR4 en la superficie de las células y, además, se pueden usar para purificar células positivas para CXCR4 mediante purificación por inmunoafinidad.

Las células efectoras específicas de la diana, por ejemplo, las células efectoras unidas a las composiciones de esta descripción también se pueden usar como agentes terapéuticos. Las células efectoras para el direccionamiento pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células portadoras de receptores de IgG o IgA. Si se desea, se pueden obtener células efectoras del sujeto a tratar. Las células efectoras específicas de la diana pueden administrarse como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener la localización en la célula diana, por ejemplo, una célula tumoral que exprese CXCR4, y para efectuar la destrucción celular, por ejemplo, fagocitosis.

La terapia con células efectoras específicas de diana se puede realizar junto con otras técnicas para la eliminación de células diana. Por ejemplo, la terapia antitumoral que usa las composiciones de la presente descripción y/o las células efectoras armadas con estas composiciones se pueden usar junto con la quimioterapia. Además, la inmunoterapia combinada se puede usar para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de células tumorales. Por ejemplo, los polipéptidos de unión a CXCR4 unidos al receptor anti-Fc-gamma o anti-CD3 pueden usarse junto con agentes de unión específicos del receptor IgG o IgA. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente descripción también se pueden usar para modular los niveles de FcyR o FcyR en las células efectoras, por ejemplo, mediante la protección y eliminación de los receptores en la superficie celular.

Como coreceptor para la entrada del VIH en las células T, se sabe que CXCR4 está involucrado en la infección por VIH. Además, se ha demostrado que la vía CXCR4/SDF-1 está involucrada en afecciones inflamatorias. Además, se ha demostrado que la vía CXCR4/SDF-1 está implicada en la angiogénesis o la neovascularización. Por consiguiente, los polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción se pueden usar para modular la actividad de CXCR4 en varias situaciones clínicas, como se detalla a continuación.

La presente divulgación también proporciona métodos para diagnosticar o detectar una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4 como se describe en este documento. Puede emplearse cualquier método adecuado para la detección y el análisis de CXCR4. Como se usa en el presente documento, el término "muestra" se refiere a una muestra de un ser humano, un animal o una muestra de investigación, por ejemplo, una célula, tejido, órgano, fluido, gas, aerosol, suspensión, coloide o material coagulado. Las muestras también incluyen, pero no se limitan a, extractos de proteínas o membranas de células, fluidos biológicos como esputo, sangre, suero, plasma u orina, o muestras biológicas como secciones de tejido congeladas o fijadas con formalina que emplean los anticuerpos descritos en este documento. El término "muestra" también puede referirse a una célula, tejido, órgano o fluido que se extrae recientemente de un ser humano o un animal, o a una célula, tejido, órgano o fluido que se procesa o almacena. La muestra se puede probar in vivo, por ejemplo, sin remoción del ser humano o animal, o puede ser probado in vitro. La muestra se puede analizar después del procesamiento, por ejemplo, mediante métodos histológicos.

Se pueden usar varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en la técnica, como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147- 158). Los anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico se pueden marcar con un resto detectable. El resto detectable produce directa o indirectamente una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser cualquiera de los descritos en el presente documento, como, por ejemplo, un radioisótopo, como 3H, 14C, 32P, 35S o 1251, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), Texas rojo, cianina, fotocian, rodamina o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, /3-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo con el resto detectable, incluidos los métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. y Cytochem., 30:407 (1982).

En el presente documento se proporciona un método para diagnosticar una afección asociada con CXCR4 que comprende evaluar un nivel de CXCR4 y/o SDF-1 en una muestra de un sujeto, donde un cambio en el nivel de CXCR4 y/o SDF-1 en la muestra en comparación con una muestra de referencia indica la presencia o aumento de un tumor o metástasis o fibrosis. En un aspecto, la condición asociada con CXCR4 o SDF-1 es un tumor, una metástasis, angiogénesis o fibrosis. Un aumento en los niveles de CXCR4 y/o SDF-1 en la muestra en comparación con una muestra de referencia puede indicar la presencia de un tumor o metástasis o un aumento en el crecimiento tumoral o metastásico o fibrosis. La muestra de referencia puede ser una muestra tomada del sujeto en un momento anterior o una muestra de otro individuo. El nivel de CXCR4 y/o los niveles de SDF-1 en la muestra pueden detectarse poniendo en contacto la muestra con la molécula de unión a CXCR4, el polipéptido o el i-cuerpo del mismo descrito en el presente documento. En una realización, la molécula de unión a CXCR4, el polipéptido o el i-cuerpo del mismo están marcados de forma detectable.

En otro ejemplo, se proporciona un método para diagnosticar la metástasis del cáncer en un sujeto que tiene un tumor, que comprende: evaluar los niveles o la actividad de CXCR4 en el tumor, mediante el cual un cambio en los niveles o la actividad de CXCR4 en el tumor en comparación con una muestra de referencia indica la presencia del crecimiento del tumor metastásico. En algunos casos, los niveles o actividades de CXCR4 en el tumor pueden ser más altos que cuando se midieron antes, lo que puede indicar que el sujeto tiene un mayor riesgo de metástasis de cáncer; que el cáncer ha hecho metástasis; o que la metástasis del cáncer ha aumentado. La muestra de referencia puede proceder del mismo sujeto, tomada del mismo tumor en un momento diferente o de otro sitio del cuerpo, o de otro individuo.

En otro ejemplo, se proporciona un método para diagnosticar el nivel o la tasa de progresión de la fibrosis en un sujeto que tiene fibrosis, que comprende: evaluar los niveles o la actividad de CXCR4 en el tejido, sangre, plasma o fluidos biológicos, por lo que un cambio en los niveles de CXCR4 en comparación con una muestra de referencia indica la presencia de fibrosis. En algunos casos, los niveles o actividades de CXCR4 pueden ser más altos que cuando se midieron antes, lo que puede indicar que el sujeto está en una progresión más rápida de la enfermedad. La muestra de referencia puede derivar del mismo sujeto, tomada del mismo tejido, sangre, plasma o fluidos biológicos en un momento diferente o de otro sitio del cuerpo, o de otro individuo.

Métodos de tratamiento

En el presente documento se proporcionan métodos para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4. Los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula o polipéptido que se une a CXCR4 y otro agente terapéutico.

Se ha demostrado que CXCR4 se expresa en una variedad de tipos de cáncer y, en ciertas situaciones, se ha establecido una correlación inversa entre la expresión de CXCR4 y el pronóstico o la supervivencia del sujeto. Los ejemplos no limitativos de tipos de cáncer asociados con la expresión de CXCR4 incluyen mama, próstata, pulmón de células no pequeñas, páncreas, tiroides, carcinoma nasofaríngeo, melanoma, carcinoma de células renales, linfoma (por ejemplo, linfoma no Hodgkin), neuroblastoma, glioblastoma, rabdomiosarcoma, colorrectal, riñón, osteosarcoma, leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide aguda.

Por lo tanto, en un ejemplo de acuerdo con la presente divulgación, una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente divulgación se puede usar para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4, donde la enfermedad es cáncer, y donde el cáncer incluye, pero no se limita a un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, leucemia, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer gástrico, glioma de tronco encefálico, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, ependimoma, familia de tumores del sarcoma de Ewing, tumor de células germinales, cáncer extracraneal, enfermedad de Hodgkin, leucemia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda , cáncer de hígado, meduloblastoma, neuroblastoma, tumores cerebrales en general, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcomas de tejidos blandos en general, tumores neuroectodérmicos y pineales primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico y de la vía visual, tumor de Wilms, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda en adultos, linfoma no Hodgkin en adultos, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cáncer de esófago, leucemia de células peludas, cáncer de riñón, mieloma múltiple, cáncer oral, cáncer de páncreas, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de piel, síndrome mielodisplásico y cáncer de pulmón de células pequeñas.

En un ejemplo de acuerdo con la presente divulgación, se puede usar una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente divulgación para inhibir el crecimiento de células tumorales metastásicas.

En un ejemplo de acuerdo con la presente divulgación, se puede usar una molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente divulgación para tratar la fibrosis.

La molécula o polipéptido de unión a CXCR4 de la presente descripción se puede usar solo o en combinación con otros tratamientos contra el cáncer, como cirugía y/o radiación, y/o con otros agentes antineoplásicos, como los agentes antineoplásicos discutidos y expuestos anteriormente, incluyendo fármacos quimioterapéuticas y otros anticuerpos antiantígeno tumoral, como los que se unen a CD20, Her2, PD-1, PDL-1, IL-2, PSMA, Campath-1, EGFR y similares.

La molécula de unión a CXCR4 o el polipéptido de la presente descripción se pueden usar solos o en combinación con otros tratamientos inflamatorios y de fibrosis.

Se ha demostrado que CXCR4 es un correceptor para la entrada del VIH en las células T y, además, se ha demostrado que ciertos anticuerpos murinos anti-CXCR4 pueden inhibir la entrada de aislados de VIH en las células T (ver Hou, T et al. (1998) J Immunol 160 180-188, Carnec, X et al. (2005) J Virol 79 1930- 1938). Por lo tanto, los virus pueden usar CXCR4 como receptor para entrar en la célula y se pueden usar anticuerpos u otros agentes bloqueantes para inhibir la entrada en la célula de dichos virus que usan CXCR4 como receptor. Por lo tanto, en un ejemplo, las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción se pueden usar para inhibir la entrada de un virus en una célula, donde el virus usa CXCR4 como receptor para la entrada celular, de modo que se inhibe la infección viral. En un ejemplo, las moléculas o polipéptidos que se unen a CXCR4 se usan para inhibir la entrada del VIH en las células T, por ejemplo, en el tratamiento o la prevención del VIH/SIDA. La molécula o polipéptido de unión a CXCR4 se puede usar solo o en combinación con otros agentes antivirales, como fármacos antirretrovirales como AZT o inhibidores de la proteasa.

Se ha descubierto que CXCR4 forma un heterodímero con CXCR7 y la señalización de proteína G mediada por CXCL12 regulada (Levoye A et al (2009) Blood 113 (24): 6085-6093). También se ha demostrado que el heterodímero CXCR4/CXCR7 recluta beta-arrestina para mejorar la migración celular (Decaillot FM et al (2011) J Biol Chem 286 (37): 32188-97). En consecuencia, las moléculas de unión a CXCR4 o los polipéptidos de la presente descripción se pueden administrar solos o junto con agentes que se dirigen al receptor C^x CR7 como se describe, por ejemplo, en WO 2007/115231, WO 2007/115232, WO 2008/048519, WO 2008/109154, WO 2010/054006. También se ha encontrado que CXCR4 forma un heterodímero con CCR5 (Sohy y col. J Biol Chem. 2009 284; 31270-31279), P²AR (La Rocca et al J Cardiovasc Pharmacol. 2010 56; 548-559) CCR2 (Sohy y col. J Biol Chem. 2007 282; 30062-30069), DOR (receptor opioide delta) (Pello et al Eur. J. Immunol. 200838; 537-549) o CCR7. En consecuencia, las moléculas de unión a CXCR4 0 los polipéptidos de la presente descripción se pueden administrar solos o junto con agentes que se dirigen a estos receptores.

Se ha demostrado que la vía CXCR4/SDF-1 desempeña un papel en una variedad de afecciones inflamatorias, que incluyen, entre otras, la enfermedad hepática inflamatoria (Terada, R et al. (2003) Lab. Invest 83:665-672), inflamación articular autoinmune (Matthys, P et al. (2001) J. Inmunol 1674686-4692), enfermedad alérgica de las vías respiratorias (Gonzalo, JA et al (2000) J. Immunol 165-499-508), y enfermedad periodontal (Hosokawa, Y et al (2005) Clin. Exp. Inmunol 4:467-474).

En consecuencia, las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente divulgación que inhiben la unión de SDF-1 a CXCR4 pueden usarse para inhibir la inflamación, trastornos inflamatorios, incluidos trastornos seleccionados del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria del hígado, inflamación de las articulaciones autoinmunes, enfermedad alérgica de las vías respiratorias, enfermedad periodontal (inducida por Porphyromonas gingivalis) (Hajishengallis et al PNAS 2008 105; 13532-13537), artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso sistémico, diabetes tipo I, trastornos inflamatorios de la piel (por ejemplo, psoriasis, liquen plano), reparación y regeneración de la piel (quemaduras, cicatrices), esclerosis sistémica ocular (AMD, uveítis), esclerosis sistémica inducida por radiación fibrosis, enfermedad tiroidea autoinmune, síndrome de Sjogren, inflamación pulmonar (por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, sarcoidosis pulmonar, alveolitis linfocítica, fibrosis pulmonar idiopática), esclerosis múltiple (Kohler et al Brain Pathology 2008, 18; 504-516), sepsis (Ding et al. Crit Care Med 200634; 3011-3017) y enfermedad renal inflamatoria (por ejemplo, nefropatía por IgA, glomerulonefritis). El polipéptido de unión a CXCR4 se puede usar solo o en combinación con otros agentes antiinflamatorios, como medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID, por sus siglas en inglés), corticosteroides (por ejemplo, prednisona, hidrocortisona), metotrexato, inhibidores de la COX-2, antagonistas del TNF (por ejemplo, etanercept, infliximab, adalimumab) e inmunosupresores (como ⁶ -mercaptopurina, azatioprina y ciclosporina A).

En consecuencia, las moléculas o los polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción que inhiben la unión de SDF-I a CXCR4 pueden usarse para inhibir la fibrosis en trastornos fibróticos, incluidos los trastornos seleccionados del grupo que consiste en fibrosis pulmonar (fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística fúngica).Carevic et al Eur Respir J 2015^{4 6} ; 395-404), hipertensión arterial pulmonar (Farkas et al. PLoSONE 20149; e89810), fibrosis inducida por radiación (Shu y col. PL^osOⁿ E 2013; ⁸ ; e79768.) y esclerosis sistémica, asma (Lukacs et al. AJP 2012 160; 1353- 1360 & Nagase et al J Immunol 2000; 164: 5935-5943)), fibrosis hepática (esteatohepatitis no alcohólica (NASH, por sus siglas en inglés) (Boujedidi et al Clinical Science 2015 128; 257-267)), fibrosis renal (hipertensión y enfermedad renal crónica (Yuan et al Am J Physiol Renal Physiol. 2014308; 459-472)), fibrosis ocular (vitrorretinopatía proliferativa, retinopatía diabética (Butler et al The Journal of Clin Invest 2005 115; 86-93), retinopatía del prematuro (Villalvilla et al Life Sciences 2012 91;264-270), uveítis no infecciosa (Zhang et al Experimental Eye Research 2009 89; 522-531) y AMD húmeda (US_7964191)), fibrosis cardíaca (hipertensión, miocardiopatía isquémica, fibrosis endomiocárdica, fibrosis arterial (Chu y col. Circ Heart Fail. 2011 4; 651-658)), fibrosis de la piel (cicatrización hipertrófica (Ding et al. Wound Rep y Reg 2014 22; 622-630), cicatrices relacionadas con quemaduras (Avniel et al Revista de Dermatología Investigativa 2006 126; 468-476), heridas diabéticas, esclerodermia o esclerosis sistémica (Tourkina et al. Fibrogenesis & Tissue Repair 2011, 4; 10.1186/1755-1536-4-15)). Las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente invención se pueden usar solos o en combinación con otros agentes antifibróticos, por ejemplo, Pirfenidona o Nintedanib.

Se ha demostrado que SDF-1 induce la neovascularización a través del reclutamiento de hemangiocitos que expresan CXCR4 (Jin, DK et al. (2006) Nat Med. 12:557-567). También se ha descubierto que CXCR4 es esencial para la vascularización del tracto gastrointestinal (Tachibana et al. (1998) Nature 393 (6685): 591-4). Además, el bloqueo de la vía SDF-1/CXCR4 puede atenuar in vivo crecimiento tumoral mediante la inhibición de la angiogénesis de una manera independiente de VEGF (Guleng, B. et al. (2005) Cancer Res. 65:5864-58-71). Por consiguiente, las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción que inhiben la unión de SDF-I a CXCR4 pueden usarse para inhibir la angiogénesis interfiriendo con la vía SDF-1/CXCR4. La inhibición de la angiogénesis se puede usar, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral o la metástasis tumoral (independientemente de si el tumor es CXCR4+). La molécula o polipéptido de unión a CXCR4 se puede usar solo o en combinación con otros agentes antiangiogénicos, como anti-^v E^g F (Grunewald M et al (2006) Cell 124 (1): 175-89) o anticuerpos PDGF-D o fragmentos de anticuerpos.

Falta de movilización de células madre por parte de los i-cuerpos del presente potencial de divulgación aplicaciones

Varias citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión se han implicado en la regulación de movilización de células madre CD34+ (revisado en Gazitt, Y. (2001). J Hematother. Stem Cell Res. 10:229-236), incluida la interacción de CXCR4 y SDF-I. Además, se ha demostrado que un antagonista de CXCR4 de molécula pequeña estimula la movilización rápida de células madre CD34+ de la médula ósea a la periferia (ver, por ejemplo, Devine, SM et al. (2004) J. Clin. Oncol 22 1095-1 102; Broxmeyer, HE et al. (2005) J. Exp. Med 201: 1307-1318, Flomenberg, N et al (2005) Blood 106: 1867-1874).

Por el contrario, se encontró que algunos de los i-cuerpos de la presente divulgación carecían de capacidad de movilización de células madre. Hay varios estudios que indican que los inhibidores/antagonistas de CXCR4 que no movilizan células madre, como los i-cuerpos descritos en este documento, serán útiles en estudios a largo plazo y en el tratamiento de enfermedades crónicas.

i) Tratamiento de la fibrosis

La respuesta a la lesión implica la activación de mecanismos adaptativos diseñados no solo para mantener la homeostasis sino también para inducir la reparación tisular. Este potencial para la reparación regenerativa es evidente en humanos en ciertas circunstancias, como después de una resección hepática o necrosis tubular aguda. Sin embargo, en presencia de lesiones crónicas o repetidas, la respuesta consiste principalmente en una combinación de regeneración celular parenquimatosa desordenada junto con la producción de grandes cantidades de ECM, lo que eventualmente conduce a la formación de una cicatriz de tejido conectivo. Si bien esta reparación por parte del tejido conectivo ayuda claramente al mantenimiento de la integridad de los órganos después de, por ejemplo, una herida en la piel, su presencia en otros órganos como el corazón, los riñones y los pulmones suele ser perjudicial (Wynn et al Nat Med (2012) 18: 1028-1040).

Existe una necesidad clínica insatisfecha para el tratamiento de la fibrosis (Luppi etal Curr Respir Care Rep (2012) 1:216-223, Friedman et al. Sci Transl Med. (2013) 5: 167sr1). Es importante destacar que no existen estrategias terapéuticas actuales que se dirijan a los procesos inflamatorios profibróticos y, por lo tanto, indiquen una clara necesidad clínica no satisfecha de desarrollar nuevos agentes terapéuticos. En consecuencia, las estrategias que inhiben la activación de citocinas proinflamatorias y la acumulación patológica de ECM proporcionan un objetivo terapéutico potencial para la prevención de la fibrosis orgánica patológica.

(a) Fibrosis pulmonar: Fibrosis pulmonar idiopática (IPF)

La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es una enfermedad inflamatoria intersticial caracterizada por cicatrización y fibrosis de los pulmones que, en última instancia, provoca una insuficiencia respiratoria terminal. Estudios recientes presentan evidencia de que los fibrocitos circulantes que expresan CXCR4 contribuyen a la patogenia de la fibrosis pulmonar (Phillips et al. J Clin Invest (2004) 114: 438-446.). Este y otros estudios recientes sugieren que el bloqueo de la actividad de CXCR4 en estos fibrocitos podría ser un enfoque útil para la terapia en pacientes con varios tipos de fibrosis, incluida la fibrosis asociada con enfermedad pulmonar, diabetes y enfermedad cardiovascular.

b) Fibrosis ocular

El crecimiento patológico de nuevos vasos sanguíneos en la parte posterior del ojo es una consecuencia devastadora de una serie de enfermedades que incluyen la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética proliferativa y la retinopatía del prematuro. La degeneración macular relacionada con la edad avanzada, que amenaza la visión (conocida como AMD húmeda) afecta al 5,7 % de todas las personas mayores de 85 años. La retinopatía diabética es la complicación más temida de la diabetes y afecta aproximadamente al 40 % de las personas con diabetes tipo II y al ^{8 6} % de las personas con diabetes tipo I (Cheung y otros Lancet 2010; 376: 124-36). Otra enfermedad vascular de la retina, llamada retinopatía del prematuro es una consecuencia devastadora del nacimiento prematuro y sigue siendo la principal causa de ceguera infantil en el mundo occidental. Una característica común de estas condiciones es el crecimiento anormal de los vasos sanguíneos y la subsiguiente formación de cicatrices que es el evento crucial que conduce a la ceguera. Para prevenir la ceguera por estas enfermedades, son necesarios tratamientos que se dirijan tanto al crecimiento anormal de los vasos sanguíneos de la retina como a la cicatrización posterior.

Actualmente, la AMD húmeda se trata con una inyección mensual o bimensual en el ojo de un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo que bloquea la acción del factor de crecimiento angiogénico, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés). Estos nuevos tratamientos han transformado la atención clínica de las personas con AMD húmeda y previenen la pérdida repentina de la visión en la mayoría de los pacientes (Rosenfeld etal N Engl J Med 2006; 355: 1419-31; Brown et al N Engl J Med 2006; 355: 1432-44). La molécula o los polipéptidos que se unen a CXCR4 de la presente invención se pueden usar para el tratamiento de trastornos del ojo relacionados con la cicatrización y fibróticos que incluyen vitreorretinopatía, retinopatía diabética y retinopatía del prematuro.

ii) Tratamiento de la aterosclerosis

Zernecke y colegas (Zernecke et al (2008) Circulation Research 102: 09-217) proporcionan evidencia de que el eje CXCL12/CXCR4 es protector en la aterosclerosis y este efecto protector se debe al control de la homeostasis de las células mieloides. Estos estudios muestran que la inhibición a largo plazo de CXCR4 por el antagonista de molécula pequeña AMD3465 agravó el desarrollo de lesiones ateroscleróticas inducidas por la dieta en dos cepas de ratones diferentes (Apoe^ ratones y LdIr/_). Se ha demostrado que el antagonismo de CXCR4 con AMD3465 es 10 veces más efectivo que AMD3100 para liberar neutrófilos de la médula ósea (Hatse et al. Biochem Pharmacol. 2005;70:752-761). Zernecke et al también demostraron que el tratamiento prolongado con AMD3465 provocó una expansión de los neutrófilos mieloides y un ligero aumento de los monocitos, lo que pareció correlacionarse con una reducción de los linfocitos en la médula ósea. Llegaron a la conclusión de que "parece necesario tener precaución al intentar la terapia con antagonistas de CXCR4, que pueden movilizar células hematopoyéticas, pero pueden inhibir el reclutamiento de subconjuntos de progenitores estabilizadores de placa y, por lo tanto, pueden promover la aterosclerosis". Por tanto, los agentes que carecen de la capacidad de movilizar células hematopoyéticas pueden ser útiles en el tratamiento de la aterosclerosis. La molécula o los polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente invención tienen la capacidad de tener efectos antiaterosceróticos sin aumentar la movilización de células madre.

iii) enfermedad renal

Un estudio de Zuk et al (2014) Am J Physiol Renal Physiol Oct1;307(7):F783-97, proporciona evidencia convincente de que la inhibición de CXCR4 mejora la lesión renal aguda al inhibir la infiltración de leucocitos y la expresión de citocinas proinflamatorias en lugar de cualquier efecto sobre las células madre hematopoyéticas o su movilización. Por lo tanto, las moléculas o polipéptidos que se unen a CXCR4 de la presente descripción pueden ser útiles en el tratamiento de la enfermedad renal.

iv) Angiogénesis

SDF-1 y su receptor, CXCR4, se han implicado en la angiogénesis y la formación de cicatrices (fibrosis) (Ferrara y otros Nature 2005; 438: 967-74). De hecho, el SDF-1 aumenta en el humor vítreo de las personas con AMD húmeda, retinopatía diabética proliferativa y retinopatía del prematuro (Scotti etal Retina 2014; 34: 1802-10, Butler etal J Clin Invest 2005; 115: 86-93, Sonmez etal Oftalmología 2008; 115: 1065-1070). Su receptor, CXCR4, se localiza en las puntas en crecimiento de los vasos sanguíneos en crecimiento patológico. Además, se ha demostrado que la inhibición de CXCR4 previene el crecimiento anormal de vasos en un modelo de roedor con neovascularización coroidea y retinopatía del prematuro (Lima y Silva et al FASEB J 2007; 21: 3219-30). Otro estudio ha demostrado que los fibrocitos circulantes pueden funcionar como precursores de miofibroblastos en las membranas de vitreorretinopatía proliferativa (PVR, por sus siglas en inglés). En las membranas epirretinianas de PVR, hubo un gran número de células que expresaban CXCL12 y CXCR4 y sugirieron que el eje de quimiocinas CXCL12/CXCR4 parece ser predominante para el reclutamiento de fibrocitos en el ojo en pacientes con PVR (Abu El-Asar etal Br J Ophthalmol 2008;92:699-704).

Para mejorar el manejo clínico de estas enfermedades vasculares, se necesita un tratamiento que se dirija tanto a la angiogénesis como a la fibrosis posterior. Los nuevos polipéptidos o i-cuerpos de la presente descripción son útiles para dicho tratamiento.

Por lo tanto, las moléculas de unión a CXCR4, los polipéptidos o los i-cuerpos de la presente descripción podrían ser eficaces para reducir la angiogénesis y la posterior cicatrización en modelos de enfermedad vascular de la parte posterior del ojo en AMD, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía del prematuro, vitreorretinopatía proliferativa, uvetis, angiogénesis corneal.

Modelos inflamatorios

La capacidad de las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción para inhibir la inflamación puede examinarse en modelos de ratones inflamatorios. Estos modelos incluyen el modelo de colitis experimental murina, el modelo de edema de la pata inducido por carragenina y el modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina como se describe en Liang Zhongxing y otros (2012) PLoS ONE 7(4): e34038.doi:10.1371.

Modelos fibróticos

La capacidad de las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción para inhibir la fibrosis puede examinarse en el modelo de roedores con bleomicina. En el modelo de bleomicina en roedores, que se utiliza con frecuencia para simular la fibrosis pulmonar idiopática (IPF), los niveles de SDF-1 aumentan en el suero y en el líquido de lavado alveolar bronquial. Además, se descubrió que los anticuerpos neutralizantes contra CXCR4 y la molécula pequeña antagonista de CXCR4, AMD3100, reducen la eosinofilia pulmonar, lo que indica que las señales mediadas por CXCR4 contribuyen a la inflamación pulmonar en un modelo de ratón con enfermedad alérgica de las vías respiratorias (Gonzalo etal J Immunol. 2000; 165:499-508, Lukacs etal Am J Pathol. 2002; 160:1353-60). Estos datos indican claramente que CXCR4 tiene un papel destacado en la promoción de la fibrosis más que en la reepitelización. La molécula o los polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente invención se pueden utilizar como agente antifibrótico.

Hasta la fecha, se han desarrollado varios antagonistas de CXCR4 (Tsutsumi et al. Biopolímeros. 2007; ^{8 8} : 279-289). Se ha demostrado que el bloqueo de CXCR4 con un antagonista como TN14003, MSX-122 o AMD3100 alivia eficazmente la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina (Xu et al Cell Mol Biol. 2007; 37: 291-299). AMD3100 (Plerixafor), un antagonista de CXCR4 de molécula pequeña aprobado por la FDA, también se probó en ratones tratados con bleomicina. Si bien AMD3100 es eficaz para bloquear la búsqueda de células madre, también aumenta la movilización de células madre, lo que ha llevado a su uso para aumentar la producción de células madre en preparación para el autotrasplante. TN14003, un péptido de 14 unidades, bloquea el desarrollo de fibrosis pulmonar en ratones tratados con bleomicina, mientras que MSX-122, una molécula pequeña, también ha demostrado superioridad sobre TN14003 y AMD3100 para prevenir por completo la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina (Xu y col. Cell Mol Biol. 2007; 37: 291-299) y los ratones irradiados que recibieron MSX-122 tuvieron reducciones significativas en el desarrollo de fibrosis pulmonar, mientras que AMD3100 no suprimió significativamente este proceso fibrótico (Shu etal PLoS ONE 2013; 8(11): e79768.). La molécula o los polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente invención tienen la capacidad de bloquear la localización de células madre sin aumentar la movilización de células madre.

Una técnica alternativa para dilucidar el papel de nuevos objetivos en la patogenia de la IPF implica el aislamiento de fibroblastos de pacientes con la enfermedad y la comparación de la liberación de mediadores con fibroblastos de sujetos sanos. En este proceso, las células se exponen a agonistas y antagonistas farmacológicos. Los fibroblastos pueden incrustarse y cultivarse en matrices tridimensionales y cocultivarse con otros tipos de células. La capacidad de las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción para inhibir la fibrosis puede examinarse con fibroblastos de pacientes humanos.

Otro modelo traslacional más es la implantación de fibroblastos de pacientes con IPF en ratones inmunodeficientes. La capacidad de las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción para inhibir la fibrosis puede examinarse en este modelo animal de fibrosis (Murray et al, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology Volumen 50 Número 5, mayo de 2014).

Modelos de cáncer/metástasis

La capacidad de las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 de la presente descripción para inhibir la metástasis puede examinarse en modelos de ratón. Estos modelos incluyen el modelo de cáncer de mama (mediante la administración de células MDA-MB-231), el modelo animal de cáncer de cabeza y cuello (mediante la administración de células ^{6 8 6} LN-Ms) y el modelo de micrometástasis de melanoma uveal como se describe en Liang Zhongxing et al (2012) PLoS ONE 7(4): e34038.doi:10.1371.

Ensayo de angiogénesis in vivo

La capacidad de las moléculas de unión a CXCR4 para inhibir la angiogénesis se puede examinar en un modelo de ratón. Estos modelos se describen en Liang et al, (2007) Biochem Biophys Res Commun. 3 de agosto; 359(3): 716-722, mediante el cual se implantan subcutáneamente células MDA-MB-231 en los costados de ratones desnudos.

Kits

En algunos ejemplos, la molécula o polipéptidos de unión a CXCR4 pueden proporcionarse en un kit o empaque farmacéutico.

En un ejemplo, la presente descripción se refiere a kits para llevar a cabo la administración de una molécula de unión a CXCR4 descrita en el presente documento.

Los paquetes y kits farmacéuticos pueden incluir además un excipiente, un vehículo, un agente tamponador, un conservante o un agente estabilizante en una formulación farmacéutica. Cada componente del kit puede encerrarse dentro de un contenedor individual y todos los diversos contenedores pueden estar dentro de un solo empaque. Los kits de la divulgación se pueden diseñar para temperatura ambiente o almacenamiento en frío. Además, las preparaciones pueden contener estabilizadores para aumentar la vida útil de los kits e incluir, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) u otros estabilizadores convencionales conocidos. Cuando las composiciones están liofilizadas, el kit puede contener más preparaciones de soluciones para reconstituir las preparaciones. Las soluciones aceptables son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) farmacéuticamente aceptable.

Además, los empaques o kits farmacéuticos proporcionados en este documento pueden incluir además cualquiera de los otros restos proporcionados en este documento, como, por ejemplo, un agente quimioterapéutico como se describe en otra parte con más detalle.

Los empaques y kits farmacéuticos de la presente descripción pueden incluir además los componentes para un ensayo proporcionado en el presente documento, como, por ejemplo, un ensayo ELISA. Alternativamente, las preparaciones de los kits se usan en inmunoensayos, como inmunohistoquímica para analizar secciones de biopsia de tejido del paciente.

Los empaques y kits farmacéuticos de la presente divulgación pueden incluir además una etiqueta que especifique, por ejemplo, una descripción del producto, el modo de administración y la indicación del tratamiento. Los empaques farmacéuticos proporcionados en este documento pueden incluir cualquiera de las composiciones que se describen en este documento. El empaques farmacéutico puede incluir además una etiqueta para prevenir, reducir el riesgo o tratar cualquiera de las indicaciones de enfermedad descritas en el presente documento.

Los kits de la presente divulgación pueden incluir adicionalmente etiquetas o instrucciones para usar los componentes del kit en cualquier método de la divulgación. Un kit puede incluir un compuesto i-cuerpo de la presente divulgación en un paquete o dispensador junto con instrucciones para administrar el compuesto en un método de la divulgación. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para practicar cualquiera de los métodos de la divulgación descrita en este documento, incluidos los métodos de tratamiento, detección, control o diagnóstico. Las instrucciones también pueden incluir indicaciones de un punto final clínico satisfactorio o cualquier síntoma adverso que pueda ocurrir, o información adicional requerida por las agencias reguladoras, como la Administración de Alimentos y Medicamentos, para su uso en un sujeto humano.

Los expertos en la materia apreciarán que se pueden realizar numerosas variaciones y/o modificaciones a las realizaciones descritas anteriormente, sin apartarse del amplio alcance general de la presente divulgación. Las presentes realizaciones, por lo tanto, deben considerarse en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas. La presente descripción incluye los siguientes ejemplos no limitantes.

Métodos generales

Ensayo Biacore

(Figura 2, 5, 11, 17) El análisis de unión cinética de i-cuerpos seleccionados con lipopartículas CXCR4 inmovilizadas se realizó a 25 °C utilizando el instrumento Biacore T200 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La inmovilización con estreptavidina se realizó en tampón de funcionamiento 1^{x h} B^s -P+ (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05 % [v/v]). El kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare) y las instrucciones que contiene se utilizaron para la unión de estreptavidina (Sigma; diluida a 100 |jg/mL en tampón de acetato de sodio 10 mM, pH 4,5) en los cuatro canales en la superficie del chip del sensor simultáneamente, lo que resultó en > Se acoplan 6.000 RU de estreptavidina (1 RU = 1 pg de proteína/mm2). Todos los experimentos de unión que implicaban lipopartículas se realizaron con 1xHBS/BSA (HEPEs 10 mM, NaCl 150 mM, BSA 1 mg/ml) como tampón de funcionamiento del instrumento. Lipopartículas CXCR4 biotiniladas (Integral Molecular, Cat#LEV-101B; 3,6 U/mL como se describe en WO 2005/042695) normalmente se diluyeron 1 en 20 en el tampón de funcionamiento y se inmovilizaron en un canal que contenía estreptavidina mediante la inyección de ² jl/m l durante 1800 segundos, lo que dio como resultado niveles de respuesta capturados superiores a 2500 RU. CCR5 biotinilado y lipopartículas nulas, utilizadas como controles fuera del objetivo, se inmovilizaron de manera similar. Para determinar la cinética de unión, se inyectaron diluciones en serie (tres veces) de i-cuerpos diluidos en 1x HBS/BSA sobre lipopartículas inmovilizadas con las fases de asociación y disociación monitoreadas durante 60 segundos y 600 segundos, respectivamente. También se incluyó una medición de control de la solución de tampón de funcionamiento del instrumento (blanco de "tampón cero") con fines de doble referencia. Los datos experimentales recopilados se procesaron utilizando el software Scrubber (www.biologic.com.au). Los parámetros cinéticos (ka = asociación y kd = constantes de velocidad de disociación) y la constante de disociación de equilibrio (KD = kd/ka) se derivaron ajustando cada conjunto de datos experimentales a un modelo de enlace Langmuir 1:1. Todas las mediciones de interacción se realizaron por triplicado y los parámetros de unión derivados se informaron como valores promedio ± desviación estándar.

Ensayo de beta-arrestina (BRET)

(Figuras 3 y 14) BRET se usó en este estudio para evaluar los perfiles cinéticos en tiempo real resultantes de cualquier aumento consiguiente en la proximidad, basándose en el monitoreo previamente validado de las interacciones GPCR/parrestina utilizando BRET. BRET ocurre entre una variante complementaria de luciferasa de Renilla (Rluc) como donante y una variante de proteína fluorescente verde como aceptor. Tras la oxidación catalizada por Rluc del sustrato de coelenterazina (como coelenterazina h para BRET de primera generación (BRET) o EnduRen para BRET extendido (eBRET), la energía se transfiere al aceptor si está dentro de los 10 nm, lo que da como resultado una emisión de luz del aceptor que alcanza un máximo en una característica longitud de onda. Los ensayos de p-arrestina BRET se llevaron a cabo como se describió anteriormente (Ver, HB, Seeber, RM, Kocan, M., Eidne, KA y Pfleger, KD (2011) 'Application of G protein-coupled receptor-heteromer identificaron technology to monitor beta-arrestin recruitment to G protein-coupled receptor heteromers', Assay Drug Dev Technol, 9(1), 21-30, 10.1089/adt.2010.0336). Las construcciones de ADNc de CXCR4/Rluc8 se generaron a partir de plásmidos que contenían el ADNc del receptor respectivo etiquetado con Rluc proporcionado amablemente por Aron Chakera (Universidad de Oxford, Reino Unido). La construcción de ADNc de parrestina 2/Venus se preparó previamente a partir de pCS2-Venus proporcionada amablemente por Atsushi Miyawaki (RIKEN Brain Science Institute, Wako-city, Japón). La tecnología BRET en células que expresan transitoriamente CXCR4/Rluc8 y p-arrestina2/Venus en presencia de agonista de SDF-1 100 nM se evaluó en presencia del agonista de CXCR4 SDF-1/CXCL12 y los i-cuerpos. Las células HEK293FT se mantuvieron a 37 °C, 5% CO² en medio completo (medio de Eagle modificado por Dulbecco que contiene 0,3 mg/ml de glutamina, 100 Ul/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina; Gibco) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FCS, por sus siglas en inglés) y 400 mg/ml de geneticina (Gibco). Las transfecciones se llevaron a cabo 24 h después de la siembra usando Genejuice (Novagen) según las instrucciones del fabricante. Las células se recogieron con tripsina-EDTA al 0,05 % (Gibco). Las células HEK293FT se transfectaron usando FuGene⁶ (Promega). Se usó coelenterazina h 5 |^jM (Promega) en HBSS como solución de sustrato de luciferasa. Las células se recogieron 24 h después de la transfección en medio completo libre de rojo fenol tamponado con HEPES que contenía FCS al 5 % y se añadieron a una placa blanca de 96 pocillos recubierta con poli-L-lisina (Nunc). Las curvas de respuesta a la dosis se generaron mediante BRET, reemplazando el medio de la placa por PBS que contenía coelenterazina h 5 mM (Molecular Probes) y los ensayos se realizaron de inmediato. Para estos ensayos, 48 h después de la transfección, la placa se incubó a 378 °C, 5 % de CO² durante 2 h con EnduRen 30 mM (Promega) para asegurar que se alcanzó el equilibrio del sustrato. Todas las mediciones BRET se tomaron a 37 °C utilizando el lector de placas VICTOR Light con el software Wallac 1420 (PerkinElmer). Las emisiones de luz filtrada se midieron secuencialmente a 400-475 y 520-540 nm. La señal BRET se calculó restando la proporción de emisión de 520­ 540 nm sobre la emisión de 400-475 nm para una muestra de células tratadas con vehículo de la misma proporción para una segunda alícuota de las mismas células tratadas con agonista (en este caso en presencia de SDF-1 o CXCL12) e icuerpo (ADCX-99, ADCX-272, ACDX-⁶ , ACDX-306, ADCX-^{6 6 8} ) en varias concentraciones. Los datos son la media ± S.E.M. de cuatro experimentos independientes realizados por duplicado.

(Figura 9) El ensayo PathHunter® de p-arrestina (DiscoveRx) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se sembraron en microplacas tratadas con cultivo de tejido de 384 pocillos y paredes blancas (Corning) y se normalizaron a 5.000 células (o 10.000 células para CXCR4) en un volumen total de 20 jl. El crecimiento celular fue a 37 °C (5 % CO² , 95 % de humedad relativa). Se añadieron i-cuerpos o AMD3100 (Tocris Bioscience) (5 j l a 0,5 - 3,8 jM ) a los pocillos singlicados y las placas se incubaron a 37 °C durante 30 min. A continuación, se añadieron agonistas a la concentración EC80 y se continuó la incubación a 37 °C durante 90 min (o 180 min para CCR1). La señal del ensayo se generó mediante una única adición de 15 j l (50 % v/v) del cóctel de reactivos PathHunter Detection, seguido de 1 h de incubación a temperatura ambiente. Las microplacas se leyeron después de la generación de señales con un instrumento PerkinElmer Envision para la detección de señales quimioluminiscentes de unidades relativas de luz (RLU). La actividad del compuesto se analizó usando la suite de análisis de datos CBIS (Chemlnnovation). % de inhibición = 100 % * [1 -(URL media de la muestra de prueba - URL media del control del vehículo)/(URL media del control EC80 - URL media del control del vehículo)].

Im7-FH corresponde a una etiqueta de purificación y solubilidad N-terminal donde Im7 es una proteína de E.coli (Hosse RJ et al (2009) Anal Biochem 15; 385 (2): 346-57 y F^h es la etiqueta ⁶ residuos de histidina.

Ejemplo 1 - Identificación de i-cuerpos que bloquean CXCR4

Los principios aprendidos de las estructuras de anticuerpos IgNAR de tiburón se pueden aplicar con éxito a la generación de repertorios de unión de dominios I-set humanos de la superfamilia de inmunoglobulinas, que se describe con más detalle en WO 2005/118629. Los anticuerpos IgNAR de tiburón están estructuralmente cerca de la superfamilia de inmunoglobulinas de dominios I-set como el Dominio 1 de NCAM. El Dominio 1 modificado de NCAM se denomina andamio de i-cuerpo. Usando este andamio, se crea una biblioteca de polipéptidos y se muestra en el fago para la detección frente a objetivos particulares en busca de aglutinantes específicos para ese objetivo. Se prevé que dichas bibliotecas contengan principalmente variabilidad en las regiones análogas a CDR1 y CDR3.

Se creó una biblioteca i-cuerpo que tenía una secuencia de aminoácidos aleatoria en la región CDR1 (representada por XXXXXX en la Figura 1B) y en la región CDR3 (representada por Y'n en la Figura 1B), donde n (el número de aminoácidos en la secuencia aleatoria de CDR3) varía aleatoriamente entre 10 y 20 aminoácidos en longitud y secuencia según SEQ ID NO:2. Los i-cuerpos de la divulgación comprenden una región de andamio que corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 26, 33 a 79 y ⁸⁸ a 97 de SEQ ID NO: 1 o una secuencia idéntica en al menos un 60 % o, de lo contrario, puede comprender entre uno y cinco adiciones o sustituciones de aminoácidos. En un ejemplo, la región de andamio comprende la secuencia como se establece en SEQ ID NO:2 o la secuencia como se establece en SEQ ID NO:2 que comprende entre 1 y 5 adiciones o sustituciones de aminoácidos.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR1 y CDR3) de SEQ ID NO: 2 se modifican mediante la adición y/o sustitución de aminoácidos en relación con las regiones CDR1 y/o CDR3 correspondientes en SEQ ID NO: 1 representadas por las posiciones de aminoácidos 27 a 32 y 80 a ⁸⁶ en SEQ ID NO:1 respectivamente. Los polipéptidos i-cuerpo resultantes pueden unirse a CXCR4 humano con una afinidad de menos de 50 jM .

En un ejemplo, A' y B' en SEQ ID NO:2 son cualquier residuo de aminoácido.

En un ejemplo, A' en SEQ ID NO:2 es el aminoácido Q o K y B' en SEQ ID NO:2 es el residuo de aminoácido V o A. En otro ejemplo, A' es Q y B' es V o A en SEQ ID NO:2.

La secuencia ID NO: 2 puede comprender además entre 1 y 4 residuos de aminoácidos N-terminales consecutivos seleccionados del grupo que consiste en M, EAEA, MA o MP.

Los i-cuerpos mostrados en el fago se seleccionaron frente a CXCR4 humano (hCXCR4) mostrado en una lipopartícula o expresado en una línea de células HEK, después de la incubación de la biblioteca de i-cuerpos y la lipopartícula hCXCR4 capturada en placas o perlas o con células positivas para CXCR4 en solución. Se completó un lavado extensivo para eliminar los aglutinantes no específicos en cualquiera de los formatos. Se observó un enriquecimiento en las lipopartículas o células positivas para hCXCR4 y se recogieron y cultivaron colonias individuales. La secuencia del andamio de i-cuerpo sigue siendo la misma excepto por las regiones específicas de las regiones CDR1 y CDR3. Las secuencias CDR1 y CDR3 de las colonias individuales que se unieron específicamente a hCXCR4 se detallan en la Tabla 1. Las afinidades de los icuerpos con CXCR4 se describen en la Tabla 1 y la Figura 5 para ADCX-99 y en la Figura 2 para los i-cuerpos ADCX-306, ADCX-272 y ADCX-^{6 6 8}.

La capacidad de los aglutinantes de i-cuerpo ADCX-99, ADCX-272, ADCX-⁶ , ADCX-306 y ADCX^{- 6 6 8} para modular la parrestina también se demuestra en la Figura 3.

T l 1: P n l i- r i nifi r h X R4

Además, se generó un i-cuerpo de control, denominado 21H5, que no se une a CXCR4. Esto se usó como un control de ¡sotipo. La secuencia de este i-cuerpo se muestra a continuación: LQVDIVPSQGEISVGESKFFLCQVAGDAKDKDISWFSPNGEKLTPNQQRISVVWNDDSSSTLTI YNANIDDAGIYKCWTGSDAMSNYSYPISESEATVNVKIFQ (SEQ ID NO:82)

Ejemplo 2 - Caracterización de CXCR4 que bloquean i-cuerpos

2.1 Expresión y purificación del i-cuerpo en E.coli

Los i-cuerpos se expresaron y purificaron utilizando un sistema de expresión DE E. coli . Los i-cuerpos se expresaron con varias etiquetas de afinidad, incluidas E. coli. proteína de inmunidad (Im7) FLAG y ⁶ xHIS (designado Im7-FH en la Figura 4). Los i-cuerpos se purificaron a partir de la fracción periplásmica y el citoplasma usando las diversas etiquetas usando resina anti-FLAG o resina Ni-NTA, respectivamente. Los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño se muestran en la Figura 4.

2.2 Expresión y purificación del i-cuerpo en Pichia

Los genes de los i-cuerpos se clonaron en un vector de expresión de Pichia. Después de alguna optimización de la selección de clones, los títulos de proteína oscilaron entre 3 y 9 mg/l en la escala pequeña (escala de 2 ml). En la escala de fermentación, los rendimientos estuvieron entre 26 y 150 mg/L. Otros parámetros como (temperatura, pH, tasa de alimentación y estrategia de alimentación) podrían optimizarse en el nivel de fermentación para mejorar los rendimientos. Después de la expresión y purificación a gran escala, los i-cuerpos se caracterizaron mediante SDS-PAGE y se ha demostrado que están esencialmente intactos a medida que migran al tamaño apropiado (no se muestra la figura).

2.3 Afinidad y especificidad de la unión de i-cuerpo a CXCR4

En un ensayo BIAcore, se demostró que i-cuerpo ADCX-99 se une a lipopartículas positivas para CXCR4 inmovilizadas (A), pero mostró muy poca unión a lipopartículas nulas (B) o a lipopartículas que eran positivas para GPCR CCR5 (C), lo que demuestra la especificidad del i-cuerpo ADCX-99 para CXCR4 (Figura 5).

La afinidad de un i-cuerpo CXCR4 identificado, ADCX-99 fue aproximadamente Kd de 600 nM (622,877 nM) a las lipopartículas positivas para CXCR4 determinadas por el ensayo Biacore en la Figura 5.

Se demostró que i-cuerpo ADCX-272 en un ensayo BIAcore se unía a lipopartículas positivas para CXCR4 inmovilizadas (Figura 2), pero mostró muy poca unión a lipopartículas nulas o a lipopartículas que eran positivas para GPCR CCR5 por medio de ELISA (Figura 7B), demostrando la especificidad del i-cuerpo ADCX-272 para CXCR4.

Se determinó que la afinidad de CXCR4 i-cuerpo ADCX-272 era aproximadamente Kd 1,6 uM a las lipopartículas positivas para CXCR4 determinadas por Biacore (Figura 2B).

Ejemplo 3 - maduración por afinidad de i-cuerpos

El i-cuerpo ADCX-99 se maduró por afinidad mediante PCR propensa a errores. Esto se llevó a cabo de dos maneras; ya sea creando una biblioteca de mutaciones aleatorias dirigidas a CDR1 y CDR3 o usando un promedio de 2-3 mutaciones de nucleótidos en cualquier parte de la secuencia. La biblioteca se panoramizó de acuerdo con Henderson et al. (2007) Structure 15:1452-66. Usando esta estrategia, el i-cuerpo ADCX-99 se modificó en las regiones CDR1 y/o CDR3 para mejorar la afinidad o la expresión para crear una biblioteca de mutantes.

3.1 Mejora de los niveles de expresión, afinidad y especificidad de i-cuerpos

Noventa i-cuerpos mutantes aleatorios del ADCX-99 madurado por afinidad se cultivaron en una placa de 96 pocillos. El análisis de las fracciones periplásmicas mostró que la expresión de proteínas y los niveles de afinidad variaron significativamente entre los clones mutantes. En comparación con ADCX-99, varios clones mutantes se expresaron mejor que el i-cuerpo de ADCX-99 de tipo salvaje (Figura ⁶ ).

Cuando se examinó la unión de los mismos noventa clones a las lipopartículas positivas para CXCR4, se observó que, aunque la mayoría de los clones tenían una afinidad menor por las lipopartículas positivas para CXCR4, varios clones mostraron una afinidad mayor (Figura 7-1). Los clones mutantes de i-cuerpo 36 y 39 parecían tener una mayor unión a las lipopartículas positivas para CXCR4 en este ensayo en comparación con el i-cuerpo de ADCX-99 de tipo salvaje. También se examinó la unión de los clones i-cuerpo mutantes a lipopartículas positivas para CCR5 (Figura 7-2). Los clones mutantes 36 y 39 del i-cuerpo tenían la misma unión baja para CCR5 que el ADCX-99 de tipo salvaje (Figura 7-2), lo que demuestra especificidad para CXCR4.

Los clones mutantes de ADCX-99 se sometieron a una ronda adicional de maduración por afinidad y se examinaron más de ^{1 000} clones mutantes para mejorar la afinidad y la expresión.

La secuencia consenso de los i-cuerpos madurados por afinidad se muestra en la Figura 1D (SEQ ID NO: 39). Las regiones CD1 y CDR3 están representadas por SX¹SX²X³ R y Y'1RY'2GY'3YRHRY'4LY'5LG respectivamente.

Los i-cuerpos madurados por afinidad de la divulgación comprenden una región de andamio que corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 26, 33 a 79 y ^{8 8} a 97 de SEQ ID NO: 1 o una secuencia idéntica en al menos un 60 % a la misma o, de lo contrario, puede comprender entre adiciones o sustituciones de uno y cinco aminoácidos. En un ejemplo, el polipéptido comprende la secuencia como se establece en SEQ ID NO:2 o la secuencia como se establece en SEQ ID n O ^{: 2} que comprende entre ¹ y 5 adiciones o sustituciones de aminoácidos.

En un ejemplo, A' y B' en SEQ ID NO:39 son cualquier residuo de aminoácido.

En un ejemplo, A' en SEQ ID NO: 39 es el aminoácido Q o K y B' en SEQ ID NO: 39 es el residuo de aminoácido V o A. En otro ejemplo, A' es Q y B' es V o A en SEQ ID NO:39.

En un ejemplo, Z está ausente o es un aminoácido seleccionado de M, EAEA, MA o MP. En la Tabla 2 se describe un resumen de las secuencias maduradas por afinidad con mejoras.

T l 2: R m n n i riv AD X- n r r r n m r i n r fini

Un resumen de las posiciones de aminoácidos modificadas en relación con la secuencia consenso de ADCX-99 (SEQ ID NO: 2 y 39) se muestra en la Figura 1. La figura ⁸ indica las sustituciones de residuos de aminoácidos particulares correspondientes a cada i-cuerpo madurado por afinidad. El subrayado corresponde a las regiones CDR1 y CDR3 en cada secuencia.

La Tabla 3 resume las mejoras en relación con las tasas de eliminación de los veinte principales i-cuerpos madurados por afinidad para CXCR4 expresados en lipopartículas.

Tabla 3 Valores de Kd para veinte i-cuerpos madurados por afinidad

La Tabla 4 resume la afinidad (Ka, Kd y Kd) de los veinte principales i-cuerpos madurados por afinidad para CXCR4 expresados en lipopartículas.

Tabla 4 Afinidad de los oli é tidos de unión a CXCR4 or CXCR4 ex resado en li o artículas

La especificidad de los aglutinantes de afinidad madurada en la Tabla 4 se determinó frente a varias quimiocinas y se muestra en la Figura 9, lo que demuestra una alta especificidad para el CXCR4 diana y una unión limitada a otros receptores acoplados a proteína G de quimiocina (GPCR).

3.2 Mejora de los niveles de expresión, afinidad y especificidad de los i-cuerpos madurados por afinidad

Se observó una mejora en la expresión de 10 mg/L a 14 mg/L cuando se hizo una sustitución de aminoácido G>K en la posición 28 y una sustitución de aminoácido I>F en la posición 31 para (designado X¹ y X³ respectivamente en la Figura 1D) dentro de la CDR1 de ADCX-99 y se realizó una sustitución de aminoácido A>Y en la posición 89 (designada Y⁴ en la Figura 1D) dentro de la CDR3 de la secuencia ADCX-99. Esto está representado por la secuencia correspondiente a AM4-661. La alineación de AM4-661 contra ADXC-99 se muestra en la Figura 10A.

Se observó una mejora en la afinidad por CXCR4 de >700 nM a 1 nM cuando una sustitución G>Y en la posición 28 (designada como X¹ en la Figura 1D), y sustitución I>Y en la posición 31 (designada X³ en la Figura 1D) se hicieron en el CDR1 de ADCX-99, y un T>I (designado Y² en la Figura 1D) en la posición 82 y sustitución A>Y en la posición 89 (designada Y⁴ en la Figura 1D) se realizaron en la CDR3 de ADCX-99, como lo demuestra la secuencia correspondiente a AM4-272. La alineación se muestra en la Figura 10B.

Se observó una mejora en la especificidad por CXCR4 para los polipéptidos AM3-114, AM5-245 y AM3-523. La actividad de CCR4 (determinada por el ensayo de p-arrestina DiscoverX) del 34 % para ADCX-99 se redujo a -3 %, -5 % y -2 % para AM3-114, AM5-245 y AM3-523 respectivamente. Los tres polipéptidos tenían una sustitución Y>W en la posición 80 (designada Y¹ en la Figura 1D) en la CDR3 de ADCX-99 y una sustitución D>G o H en la posición 30 (designada X² en la Figura 1D) en el CDR1 de ADCX-99. La alineación se muestra en la Figura 10C.

Ejemplo 4 - Mejora de la semivida de i-cuerpos

4.1 Doble especificidad para CXCR4 y albúmina sérica humana

Se generó un i-cuerpo de doble especificidad mediante la conjugación de un péptido de unión a albúmina sérica humana (HAS, por sus siglas en inglés) de 18 residuos (N-terminal)-RLIEDICLPRWGCLWEDD-(C-terminal) (descrito en EE. UU.

20100104588; Dennis MS y otros (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043) al extremo C de AM3-114 para generar AM3-114-lm7-SA21 (SEQ ID NO: 80). La proteína Im7 se usó para facilitar la detección del conjugado.

La afinidad por CXCR4 y HSA se midió mediante resonancia de plasmón superficial como se muestra en la Figura 11. El aglutinante biespecífico de CXCR4 y HSA AM3-114-lm7-SA21 demostró una afinidad de aproximadamente 5-10 nM por CXCR4 y una afinidad de aproximadamente 500 nM por la albúmina sérica humana (HSA) (Figura 11A). La afinidad por CXCR4 no cambió con y sin la adición del péptido sA21 de HSA de 18 residuos (Figura 11C y D respectivamente). El icuerpo AM3-114 no se unía a HSA sin la adición del péptido SA21 de HSA de 18 restos (Figura 11B). En consecuencia, el conjugado demuestra unión específica a CXCR4 y h Sa .

4.2 PEGilación de i-cuerpos

AM3-114-lm7-FH y AM4-746-lm7-FH [Im7-FH corresponde a una etiqueta de purificación y solubilidad N-terminal donde Im7 es una proteína de E.coli (Hosse RJ et al (2009) Anal Biochem 15; 385 (2): 346-57 y FH es etiqueta ⁶ His] se conjugaron con PEG lineal de 30K o ramificado de 2x20K utilizando un enfoque de conjugación específico del sitio (HipEG™ tecnología, PolyTherics, Reino Unido) con el fin de aumentar el radio hidrodinámico de las moléculas i-cuerpo y así reducir la eliminación renal y hepática (Konterman et al 2011 Curr Opin Biotech 22: 868-8760).

4.3 Evaluación de i-cuerpos de semivida extendida

El material PEGilado (AM3-114-30K PEG, AM3-114-2x20K PEG, AM4-746-2x20K PEG) y un conjugado peptídico de HSA (AM3-114-lm7-FH-SA21) se evaluaron en un estudio farmacocinético preclínico en ratones. junto con los i-cuerpos de control ADCX99-9H (9 etiquetas de histidina) y AM3-114-lm7-FH (que contienen tanto la proteína Im7 como la etiqueta FLAG ⁶ His). Los artículos de prueba se administraron a grupos de ratones una vez por inyección intravenosa como se describe en la Tabla 4 a continuación:

T l 4 Arí l r mini r r n

El volumen de dosis administrado a los

animales de los grupos 1, 2 y 5 fue de 3 mL/kg.

El volumen de dosis administrado a los

animales del grupo 3 fue de 2 ml/kg.

El volumen de dosis administrado a los

animales de los grupos 4 y ⁶ fue de 1,25 mL/kg.

Se recolectó una serie de muestras de sangre de todos los ratones (0,3 ml, 2 puntos de tiempo/3 ratones/grupo/punto de tiempo) después de la dosificación de la siguiente manera:

Tabla 5 Momento de la toma de muestras de san re de ratones

Para ello, se extrajo sangre de cada ratón (ratón CD-1) a través de la vena safena o bajo anestesia con isoflurano mediante punción cardíaca y se recogieron las muestras en tubos que contenían el anticoagulante K² -EDTA. Los tubos se colocaron en hielo húmedo en espera del procesamiento. Después de su última muestra de sangre, cada animal fue sacrificado por dislocación cervical y descartado sin examen adicional.

Después de la recolección, las muestras se centrifugaron (aproximadamente a 4 °C) y el plasma resultante se recuperó en dos alícuotas separadas y se almacenó congelado (<60 °C) en tubos etiquetados Protein LoBind de 1,5 ml (Eppendorf, n.° de catálogo 022431081). Las concentraciones de ADCX99-9H, AM3-114-IM7-FH, AM3-114-lm7-FH-SA21, AM4-746-2x20K PEG, AM3-114-30K PEG y AM3-114-2*20K PEG se determinaron mediante un método de ensayo LC-MS/MS. El pretratamiento de la muestra involucró la digestión tríptica directa de ADCX99-9H, AM3-114-IM7-FH, AM3-114-Im7-FH-SA21, AM4-746-2x20K PEG, AM3-114-30K PEG y AM3-114- 2x20K PEG a un péptido característico (sPeptido) de plasma de ratón CD-1; GEKLTPNQQRIG se utilizó como estándar interno. Los compuestos fueron identificados y cuantificados en un rango de concentración teórica de 0,500 |jg/mL a 100.000 |jg/mL para ADCX99-9H, AM3-114-IM7-FH, AM3-114-lm7-FH-SA21, AM3-114-30K PEG y AM3-114-2x20K PEG y de 0,083 jg/m L a 16,667 jg/m L para AM4-746-2x20K PEG. Las soluciones madre de ADCX99-9H, AM3-114-IM7-FH, AM3-114-lm7-FH-SA21, AM4-746-2x20K PEG, AM3-114-30K PEG y AM3-114-2x20K PEG se almacenaron a -80°C nominal y el patrón interno GEKLTPNQQRIG se almacenó a 4 °C. Se utilizó un espectrómetro de masas de cuadrupolo API 5000 o QTRAP 5500 de AB Sciex que utiliza un aerosol de iones Turbo para la detección de ADCX99-9H, AM3-114-IM7-FH, AM3-114-lm7-FH-SA21, AM4-746-2x20K PEG, AM3-114-30K PEG y AM3-114-2x20K PEG.

La semivida del i-cuerpo AM3-114 se prolongó mediante la adición del péptido de unión a HSA SA21 y la adición de PEG 30K y PEG 2x20K, como se demuestra en la Figura 12 y las Tablas ⁶ A y ⁶ B.

Tabla ⁶ A Parámetros farmacocinéticos después de la in ección intravenosa en ratones CD-1, AAT-M4-438 1 de 2

Tabla ⁶ B Parámetros farmacocinéticos después de la in ección intravenosa en ratones CD-1, AAT-M4-438 2 de 2

4.4 Fusión de secuencia de proteína XTEN con i-cuerpos

Como alternativa a la PEGilación, los inventores examinaron la utilidad del enfoque XTEN, que utiliza la adición de aproximadamente 400 residuos de secuencia cuasi-repetida al i-cuerpo, para aumentar la semivida del i-cuerpo in vivo, seguido de una etiqueta His C-terminal para purificación/detección. La secuencia XTEN está diseñada para ser intrínsecamente no estructurada y, por lo tanto, no inmunogénica, y también es altamente hidrofílica, lo que debería ayudar con la solubilidad y estabilidad de los i-cuerpos durante la expresión/purificación/aplicaciones posteriores (Schellenberger et al, (2009) Nature Biotech; 27(12): 1186-1190).

AM3-114 se clonó en un vector de expresión bacteriano (pET26) y se realizaron ensayos de expresión iniciales. La transferencia de Western muestra una banda que era reactiva al anticuerpo anti-His, que no está presente en el control no inducido, lo que sugiere claramente que la construcción AM3-114-XTEN se está expresando. El PM predicho de la construcción AM3-114-XTEN es de aproximadamente 50 kDa, mientras que la banda de interés tiene un PM aparente de poco más de 100 kDa (datos no mostrados). Esto es consistente con el cambio de movilidad esperado debido al grupo XTEN altamente desestructurado y ácido que causa una disminución significativa en la movilidad electroforética del icuerpo, un fenómeno que se ha observado previamente para otras proteínas no estructuradas.

Se probó la unión de este material a CXCR4 en células RAMOS mediante citometría de flujo y se demostró que se une de manera dependiente de la dosis. La unión fue solo un poco menor que para el AM3-114 i-cuerpo, lo que indica que el 114-XTEN estaba activo. AM3-114-XTEN se probó en SPR y descubrió que aún conservaba la unión a CXCR4 en las lipopartículas, aunque con una afinidad ligeramente reducida. Curiosamente, la menor afinidad parece deberse principalmente a la tasa de asociación, ya que la tasa de disociación es similar a la del i-cuerpo sin XTEN (datos no mostrados).

4.5 PASilación de i-cuerpos

Otro método para extender la semivida del i-cuerpo es utilizar la tecnología PASylation. El i-cuerpo se fusionará genéticamente con una secuencia polipeptídica que consta de varios cientos de residuos de los pequeños aminoácidos prolina, alanina y/o serina ("PAS"). Estas secuencias PAS, particularmente PAS(400) y PAS(600) adoptan una estructura de espiral aleatoria en solución acuosa generando así un gran volumen hidrodinámico que permite la extensión de la semivida de la proteína en sangre, las proteínas fusionadas con estas secuencias también se han informado que tiene muy baja inmunogenicidad y toxicidad, (Schlapschy et al. Protein Eng Des Sel (2013) 26: 489). Se ha demostrado que estas secuencias, cuando se fusionan con una proteína diana, prolongan la semivida en ratones y mejoran las cualidades similares a las de un fármaco de la proteína diana.

El i-cuerpo se fusionará con la secuencia PAS en el extremo C-terminal y la proteína se expresará en E. coli.

Ejemplo 5 - Características funcionales de los i-cuerpos

5.1 Modulación de AMPc en células transfectadas con CXCR4

DiscoverRx ha desarrollado un panel de líneas celulares que expresan de forma estable GPCR no etiquetados que emiten señales a través de AMPc. Los ensayos cAMP Hit Hunter® monitorean la activación de un GPCR a través de una proteína G reguladora inhibitoria (Gi) y una proteína G reguladora estimuladora (Gs) mensajero secundario de señalización en un formato de ensayo homogéneo, sin imágenes, utilizando una tecnología desarrollada por DiscoverRx llamada Complementación de fragmentos enzimáticos (EFC, por sus siglas en inglés) con p-galactosidasa (p-Gal) como indicador funcional. La enzima se divide en dos porciones complementarias: EA para Aceptor de Enzimas y ED para Donante de Enzimas. ED se fusiona con AMPc y en el ensayo compite con AMPc generado por las células para unirse a un anticuerpo específico de AMPc. La p-Gal activa se forma por complementación de EA exógeno con cualquier ED-AMPc no unido. La enzima activa puede entonces convertir un sustrato quimioluminiscente, generando una señal de salida detectable en un lector de microplacas estándar.

Métodos

Manejo de celdas

Las líneas celulares cAMP Hunter se expandieron a partir de stocks congelados de acuerdo con procedimientos estándar. A continuación, las células se sembraron en un volumen total de 20 |jl en microplacas de 384 pocillos de paredes blancas y se incubaron a 37 °C durante el tiempo adecuado antes de la prueba. La modulación de AMPc se determinó utilizando el ensayo DiscoverRx HitHunter cAMP XS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Formato Antagonista

Para la determinación del antagonista, las células Hunter que expresan CXCR4 se incubaron previamente con una muestra seguida de exposición al agonista a la concentración EC80. (Para los ensayos de Gi cAMP, se usó una concentración de forskolina de 15 jM ). El medio se aspiró de las células y se reemplazó con 10 j l de HBSS/Hepes :cAMP XS 1:1+ reactivo Ab. Se añadieron a las células 5 j l de stock 4X de AMD3100 o i-cuerpos para CXCR4 y se incubaron a 37 °C o a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 5 jL del agonista SDF-1 4X EC80 a las células y se incubaron a 37°C o temperatura ambiente durante 30 o 60 minutos. Para los GPCR acoplados a Gi, se incluyó forskolina EC80 (se usó una concentración de forskolina de 15 jM).

Detección de señal

Después de la incubación apropiada del compuesto, la señal del ensayo se generó a través de la incubación con 20 jL de cóctel de lisis cAMP XS ED/CL durante una hora, seguido de la incubación con 20 jL de cAMP XS reactivo E^a durante tres horas a temperatura ambiente. Las microplacas se leyeron después de la generación de señales con un instrumento PerkinElmer EnvisionTM para la detección de señales quimioluminiscentes.

Resultados

A continuación, se determinó la inhibición de AMPc por el i-cuerpo control (21H5), AMD3100 y i-cuerpos AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746, AM4-1121 (IC50). Los datos se muestran en la Tabla 7 y la Figura 13. Los receptores de quimiocinas como CXCR4 están acoplados principalmente a Gai y, por lo tanto, emiten señales a través del AMPc de segundo mensajero. La regulación del AMP cíclico (AMPc) podría ser importante para las interacciones entre SDF-1 y varias señallizaciones celulares. Se examinó el panel de i-cuerpos de CXCR4 para determinar la capacidad de modular los niveles de AMPc in vitro. El antagonista AMD3100 descrito anteriormente mostró un efecto de inhibición de AMPc dependiente de la dosis con una IC50 esperada de 615 nM. Los i-cuerpos fueron muy efectivos para bloquear la disminución de AMPc inducida por SDF-1 en estas células. De hecho, todos los i-cuerpos tenían valores IC50 inferiores a AMD3100. Según los resultados de IC50, el i-cuerpo AM3-114 que se une a CXCR4 es un potente inhibidor de AMPc.

Estos datos sugieren que los i-cuerpos pueden unirse a CXCR4 e inhibir la señallización funcional clave, como la vía de señalización Gai, que controla la modulación del AMPc sin bloquear la vía Gq que influye en el flujo de calcio. Esta podría ser la razón por la que los i-cuerpos podrían bloquear la inflamación y la fibrosis, pero no movilizar las células madre, lo que sería una ventaja cuando se usaran en una terapia a largo plazo.

T l 7 I m r X R4 rmin r n AMP n m n ni

5.2 Modulación de calcio en células transfectadas con CXCR4

Las células transfectadas con CXCR4 se trataron con i-cuerpos o AMD3100 durante 30 min, luego se estimularon con 100 ng/ml de SDF-1 durante 30 min. Entonces se determinó la inhibición de la entrada de Ca2+ por controles o i-cuerpos (IC⁵⁰).

Materiales

Células

Las células de mamífero que expresan de forma estable el receptor CXCR4 humano fueron producidas internamente por Multispan, Inc (No. de catálogo C1004-1). El agonista de control utilizado fue SDF-1 (Peprotech, Cat# 300-28A).

Compuestos

Se probaron 7 compuestos/i-cuerpos (21H5, AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746, AM4-1121 y AMD3100) en forma líquida a 40 uM o 10 mM. AMD3100 (también conocido como plerixafor o Mozobil) es un antagonista de molécula pequeña de CXCR4 y está disponible comercialmente. Se utilizó como control positivo.

Kit de ensayo de calcio

Screen QuestTM Fluo^{- 8} Kit sin lavado (AAT Bioquest, Cat# 36315)

Instrumentos

FLIPR 384 (Dispositivos Moleculares)

Métodos

Ensayo de calcio

Las células se sembraron en una placa de 384 pocillos a una densidad adecuada y se cultivaron durante la noche. El ensayo de calcio se realizó de acuerdo con los protocolos del fabricante. El tampón de carga de tinte de calcio se añadió a las células y se incubaron durante una hora a 37°C. El flujo de calcio se controló durante 120 segundos con el compuesto inyectado en los pocillos en el segundo 19. En modo antagonista, el vehículo o los compuestos se preincubaron con las células durante 30 minutos antes de la medición del flujo de calcio con el agonista de control a la concentración EC80 obtenida a partir de la curva dosis-respuesta. Los datos se muestran en la Tabla ⁸ y la Figura 14. Dado que el flujo de calcio está dirigido por la vía Gq, éste resultados sugieren que todos los i-cuerpos probados no modulan significativamente la vía Gq. En consecuencia, los i-cuerpos no modulan el flujo de calcio.

Tabla ⁸ Ensa o de inhibición de calcio

5.3 Modulación de fi-arrestina en células transfectadas con CXCR4

La unión de los i-cuerpos a CXCR4 se examinó en un ensayo BRET de p-arrestina como se describe en See, Heng B et al (2011) Assay and Drug Development Technologies 9(1):21-30. Los i-cuerpos se examinaron a diez concentraciones con y sin SDF-1 100 nM con la adición de controles de "vehículo" y "vehículo SDF-1" para caracterizar si los i-cuerpos son agonistas o antagonistas de la actividad de CXCR4.

Los resultados del ensayo BRET de p-arrestina para cada aglutinante se proporcionan en la Tabla 9 y en la Figura 15. AMD3100 tenía una IC50 de 18 nM, mientras que el i-cuerpo original de CXCR4, ADCX-99, tuvo un efecto muy débil en el reclutamiento de p-arrestina, probablemente debido a la baja afinidad (643 nM) por CXCR4, como lo muestra SPR. Los valores IC50 del panel i-cuerpo oscilaron entre 164 nM para AM3-114 y 127, 13 nM para AM3-523. Estos cambios en el reclutamiento de p-arrestina son el resultado del cambio de ¹ a ¹⁰ aminoácidos en las regiones de unión.

Tabla 9 Afinidad de i-cuer os determinada or el ensa o -Arrestina

Ejemplo 6 - Características de unión de los i-cuerpos

Cualquier célula que exprese CXCR4 humano en la superficie se puede usar para examinar la capacidad de las moléculas o polipéptidos (i-cuerpos) que se unen a CXCR4 descritos en el presente documento para unirse a CXCR4 nativo de la superficie celular. Los ejemplos de dichas líneas celulares incluyen la línea de células T humanas, CEM, así como otras líneas celulares como Ramos, Raji, Namalwa, L540, DMS79, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-549, MOLT-4, DU-4475, DU-145, PC3, LNcaP, SW480, HT29, NCI-H69 y HL60.

6.2 Afinidad de unión in vitro de i-cuerpos por análisis de citometría de flujo

Las células se trataron con i-cuerpos AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746 y AM4-1121 (10 ^|j M, 1 ^|j M y 0,001 ^|j M), y las intensidades de tinción se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo. Las líneas celulares analizadas fueron T47D (CXCR4 negativo), MDA-MB-231 (expresión baja de CXCR4) y Namalwa, NCI-H69, Jurkat, CCRF-CEM, A498, Ramos (expresión alta de CXCR4).

Método

Se recolectaron las líneas celulares y se transfirieron las células a placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (2 * 10⁵ células/pozo). A continuación, la placa de cultivo se centrifugó a 1000 rpm, 4 °C durante 5 min. Las células se resuspendieron con 100 ul de tampón PBS que contenía el anticuerpo de prueba y se incubaron a 4 °C durante 60 min. Las células se lavaron dos veces con 300 ul de tampón FACS helado, 1000 rpm, 5 min y se resuspendieron con 100 ul de tampón PBS que contenía anticuerpo anti-His-PE (para i-cuerpos) y se incubaron a 4 °C durante 40 min en la oscuridad. A continuación, las células se lavaron con 300 ul de tampón FACS enfriado con hielo x 2, 1000 rpm, 5 min y las células se resuspendieron con 300 ul de tampón de suspensión y se sometieron a análisis FACS según métodos estándar.

La afinidad de unión por CXCR4 demostrada mediante análisis de citometría de flujo se muestra en las Figuras 16-1 a 16-3 para el i-cuerpo AM3-114 representativo en células T47D (A), células Namalwa (B), MOLP⁸ (C), MOLT4 (D) , células Jurkat (E), CCRF-CEM (F), A498 (G), Ramos (H), NCI-H69 (I) y HL-60 (J). Las líneas celulares se probaron con tres concentraciones de i-cuerpos (10 jiM, 1 jiM y 0,001 jiM) con la excepción de las células Namalwa que también se probaron con i-cuerpos a 4,7, 2,1, 0,47, 0,21, 0,1 y 0,01 ^ji M.

Ejemplo 7 - Competencia con la unión de SDF-1 a CXCR4 por parte de los i-cuerpos

7.1 Ensayo SPR de competencia por i-cuerpos que se unen a CXCR4

Se realizaron estudios de competencia para determinar la capacidad de los i-cuerpos para inhibir la unión de SDF-1 a CXCR4 utilizando lipoproteínas que contienen CXCR4 (IntegraMolecular) como se describe en WO 2005/042695.

Se probó un panel de i-cuerpos de CXCR4 mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) para determinar su capacidad para competir con el ligando SDF-1. La Figura 17 muestra un ejemplo de dos i-cuerpos, uno que compitió con SDF-1 de manera dependiente de la dosis (AM3-114 Figura 17A) y otro que no compitió bien (AM4-272 Figura 17B). Se co-inyectaron lipopartículas CXCR4 con i-cuerpo y SDF-1 a 2 nM, 50 nM y 200 nM.

La Tabla 12 muestra el grado (indicado por ) de cada i-cuerpo para competir con SDF-1 por la unión a lipopartículas positivas para CXCR4.

Tabla 12 Grado de com etencia con SDF-1 ara unirse a li o artículas ositivas ara CXCR4

7.2 Ensayo de citometría de flujo de competencia por la unión de i-cuerpos a CXCR4 por varias moléculas de unión a CXCR4

La unión de i-cuerpos de CXCR4 (AM3-114-6H, AM4-272-6H y AM3-523-6H) que contienen la secuencia N-terminal EAEA a CXCR4 expresado en la superficie de las células y la capacidad de SDF-1 para competir para la unión se evaluó usando citometría de flujo. Los i-cuerpos se incubaron con células Ramos en 100 |jl de tampón FACS (1 x PBS y FCS al 2 %) a 4 °C durante 60 minutos. Después de lavar dos veces con 2 ml de tampón FACS enfriado con hielo, las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos, las células se resuspendieron en 100 j l de tampón FACS que contenía el anticuerpo anti-His-PE (MACS Molecular, número de pedido: 130-092-691) y se incubó a 4 °C durante 40 min en la oscuridad. Este ensayo es robusto y se puede utilizar para examinar la competencia entre los i-cuerpos y SDF-1 y otros antagonistas. En este caso, cada i-cuerpo (0,5 jM ) se incuba con las células solas o en presencia de un exceso de SDF-1 (2 jM ), MAb12G5 (2 jM ) y AMD3100 (2 jM ). La unión de los tres i-cuerpos se redujo con la adición de AMD31002 jM (Figura 18). SDF-1 pudo competir bien con AM4-272 pero solo parcialmente con AM3-114 y AM3-523. Los tres i-cuerpos compitieron con AMD3100, lo que indica que existe una similitud entre el sitio de unión de los i-cuerpos y esta pequeña molécula. El MAb 12G5 anti-CXCR4 fue capaz de reducir la unión de 523 casi por completo y bloquear parcialmente la unión de AM3-114 y AM4-272.

Ejemplo 8 - Inhibición de la migración de células que expresan CXCR4 por los i-cuerpos

La capacidad de las moléculas o polipéptidos de unión a CXCR4 descritos en el presente documento (i-cuerpos) para inhibir la migración inducida por ^s DF-1 se puede examinar usando la línea de células de cáncer de mama MDA-MB-468 y la línea de células de cáncer de próstata PC3 que están bien caracterizadas en términos de su potencial metastásico y sus propiedades in vitro e in vivo (Kaighn et al 1979 Invest Urol. 17(1):16-23. Yoneda et al 2000 Cancer 88:2979-88). Las células MDA-MB-468 son invasivas y hacen metástasis en el pulmón desde los tumores primarios de la almohadilla de grasa mamaria de ratones desnudos. El método se describe en Byeong-Chel Lee y otros (2004) Mol Cancer Res 2;327. Brevemente, las células se añaden a insertos transwell recubiertos con fibronectina (50 jg/m l) (Costar Corp., Cambridge, MA). Las células MDA-MB-468 y las células PC3 se privan de alimento durante la noche en medios sin suero y luego se incuban con el i-cuerpo anti-CXCR4 antes de su aplicación en insertos transwell de ⁸ jm de tamaño de poro. Las células se suspenden en la cámara superior a una concentración final de 7 * 104/mL en 500 jL de RPMI 1640. Se añade SDF-1 recombinante diluido en serie a la cámara inferior. Después de 3 a 9 horas de incubación, las células de la superficie superior de los filtros se eliminan limpiándolas con hisopos de algodón y las células migradas de la cámara inferior se fijan y tiñen con un kit Hema3 (Biochemical Sciences Inc., Swedesboro, NJ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, la transmigración celular se enumera en cuatro campos microscópicos separados por campo (Kashima et al Cancer Sci 105 (2014) 1343-1350; Zhu et al Molecular Cancer Research (2013) 11(1) 86-94).

Ejemplo 9 - Inhibición de la angiogénesis por los i-cuerpos

La inactivación de SDF-1 o CXCR4 de superficie en HUVEC afecta la capacidad de HUVEC para alinearse en estructuras tubulares en superficies recubiertas de Matrigel. Los i-cuerpos de la presente divulgación pueden probarse para determinar sus efectos sobre la capacidad de las HUVEC para formar estructuras tubulares dependientes de Matrigel según Liang y otros, Biochem Biophys Res Commun. 2007 3 de agosto; 359(3): 716-722. Para realizar el ensayo de formación de tubos capilares, el antagonista de CXCR4 i-cuerpo se preincuba con células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) a concentraciones de 100 nM, 5 jM y 1 jg/ml, respectivamente, durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la siembra. Luego, las células se colocan en placas sobre la capa de Matrigel a una densidad de 1 * 10⁵ células/ml de medio M199 con 1 % de FBS y 200 ng/ml de SDF-1. Después de 18 h, los pozos se fotografían con un aumento de 4x en cinco campos aleatorios y se cuenta el número de sus redes tubulares.

Ejemplo 10 - Inhibición de la proliferación in vitro de células tumorales por i-cuerpos

La capacidad de las moléculas o polipéptidos CXCR4 descritos en el presente documento (i-cuerpos) para inhibir la proliferación de células tumorales de Ramos, una línea celular de linfoma de Burkitt humano que expresa CXCR4 mencionada anteriormente, in vitro se examinó en un ensayo de proliferación de células MTT como se describe en (Lapteva (2005) Cáncer Gene Therapy 12, 84-89). Las células se cultivaron en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocilios y se trataron con un vehículo o el i-cuerpo anti-CXCR4. A continuación, las células se incubaron con la solución de MTT durante aproximadamente 4 horas. Después de este período de incubación, se forma un colorante de formazán insoluble en agua. Después de la solubilización, el tinte de formazán se cuantifica utilizando un espectrofotómetro de barrido de pocillos múltiples (lector ELISA). La absorbancia revelada se correlaciona directamente con el número de células.

Se descubrió que i-cuerpo AM3-114 a 10 |jM podía inhibir sustancialmente el crecimiento de las células RAMOS. Este efecto fue particularmente evidente entre 24 y 48 h después de la adición del i-cuerpo, aunque todavía hubo una inhibición sustancial de las células a las 72 h después de la adición del i-cuerpo. Como se esperaba, AMD3100 también pudo inhibir el crecimiento celular en este período de tiempo. Dos i-cuerpos de control (21H5 y AM8-7) tuvieron poco efecto sobre el crecimiento celular. Hubo un pequeño efecto inhibitorio de i-cuerpo AM4-272 pero AM3-523 no tuvo ningún efecto observable en este ensayo. Los i-cuerpos no tuvieron ningún efecto sobre las células HEK normales.

Ejemplo 11 - Inducción de apoptosis por los i-cuerpos

La capacidad de un i-cuerpo de la invención para inducir la apoptosis en células tumorales de Ramos (una línea celular de linfoma de Burkitt humano) se examinó en un ensayo de apoptosis de acuerdo con los métodos que se describen en Mishra M et al (2011) J Cell Mol Med 15 (11): 2462-77. Los i-cuerpos se incubaron con células Ramos y se examinaron mediante citometría de flujo después de 24 o 72 horas. Las células se tiñeron para anexina V y yoduro de propidio, que son marcadores clásicos de apoptosis. Se evaluó que las células que eran doblemente positivas se habían vuelto apoptóticas. Los tres i-cuerpos de CXCR4 (AM3-114-6H, AM4-272-6H y AM3-523-6H) pudieron inducir fuertemente la apoptosis (Figura 19). Las células no tratadas actuaron como un control negativo para mostrar que, por lo demás, las células estaban sanas. La tapsigargina es un inductor de apoptosis bien descrito y muestra el nivel esperado de apoptosis. AMD3100 no induce una apoptosis significativa en las células Ramos. Esto es consistente con un informe anterior que muestra que el mAb MDX-1338 anti-CXCR4 humano fue capaz de inducir la apoptosis en las células Ramos, pero AMD3100 no (Kuhne et al. Clin Cancer Res (2013) 19(2): 357-66).

Ejemplo 12 - Unión de los i-cuerpos a tumores in vivo

12.1 - Tinción de i-cuerpo de tumores en el bazo y el hígado de ratones SCID/ bg que habían sido inyectados por vía intravenosa con células CCRF-CEM

Se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica usando los i-cuerpos anti CXCR4 (AM3-114-6H, AM4-272-6H y AM3-523-⁶ H) a 130 jg/m l en los bazos e hígados de ratones SCID/bg que habían sido inyectados por vía intravenosa con células CCRF-CEM y sacrificados después de 27 días. Los tejidos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante la noche y posteriormente se transfirieron a casetes de tejido y se colocaron en etanol al 70 %. A continuación, los tejidos se incluyeron en parafina. Los portaobjetos que contenían secciones de 4 jm se desparafinizaron e hidrataron incubándolos en dos cambios de xileno durante cinco minutos cada uno, seguidos de dos cambios de etanol al ^{10 0} % durante 3 minutos cada uno, etanol al 70 % durante 2 minutos, etanol al 50 % durante 2 minutos y agua destilada durante 5 min. La recuperación del antígeno se realizó incubando los portaobjetos en solución de ácido cítrico 10 mM (pH 6,0) en un horno a 80 °C durante la noche. Posteriormente, los portaobjetos se lavaron en PBS y se permeabilizaron en metanol al 10 % que contenía 0,4 % de H²O² durante 30 min. Después de la permeabilización, los portaobjetos se tiñeron con icuerpos específicos de CXCR4 (AM3-114-6H, AM4-272-6H o AM3-523-6H) y un i-cuerpo de control (21H5-6H) durante la noche a 4 °C. Todos los portaobjetos se tiñeron posteriormente con anticuerpos anti-His tag biotinilados (Miltenyi Biotech) y se revelaron usando un kit de tinción de células y tejidos HRP-DAB de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems).

130 jg/m l de células CCRF-CEM teñidas con AM3-114-6H y AM4272-6H en el bazo y el hígado de los ratones inmunocomprometidos desafiados con estas células (no se muestra la figura).

^{12 . 2} - tumores sólidos

La capacidad de las moléculas de unión a CXCR4 o polipéptidos (i-cuerpos) para inhibir la proliferación de un tumor sólido establecido in vivo puede examinarse utilizando un modelo de células tumorales subcutáneas de Ramos (o células Namawala o MDA-Mb -231 o MDA-MB-468 o células PC3). En este ensayo, 10 x 106 se implantan células/ratón en la región del flanco de cada ratón y se les permite crecer hasta un tamaño medio de 40 mm3, calculado por largo x ancho x alto/2 de los tumores. Luego, los ratones reciben una inyección intraperitoneal (ip) de una primera dosis de i-cuerpo (designada como día 0 de tratamiento) y una segunda dosis ip de anticuerpo el día 7. Los grupos de ratones se tratan con (i) vehículo (ii) i-cuerpo o (iii) control positivo anti-CD20. El volumen del tumor y el peso corporal del ratón se miden a intervalos regulares (aproximadamente 2-3 veces por semana) entre el día 0 y el día 30 después de la dosificación.

Este modelo de ensayo también se puede utilizar para evaluar la capacidad de los i-cuerpos para aumentar el tiempo de supervivencia de los ratones.

12.3- Metástasis

La eficacia anti-metastásica de los i-cuerpos de la presente descripción puede probarse en modelos animales. Para la metástasis del cáncer de mama, las células MDA-MB-231 se inyectan por vía intravenosa para generar un modelo de metástasis experimental. A ratones desnudos hembra de seis a ocho semanas de edad se les administran inyecciones de células de cáncer de mama MDA-MB-231 1,5 * 106 mezcladas con i-cuerpo (1 mM, menos de 5 min de preincubación) a través de la vena de la cola (10/grupo). A partir del día siguiente, los ratones del grupo tratado reciben 4 mg/kg de icuerpo diariamente por inyección i.p. Los animales se sacrifican 35 días después de la inyección de células tumorales. Los tejidos pulmonares completos se cosechan y se seccionan para RT-PCR en tiempo real para la histotinción humana CXCR4 y H&E para evaluar microscópicamente el área del tumor metastásico en cinco campos por sección.

Para el modelo animal de cáncer de cabeza y cuello, se inyectan subclones metastásicos de células ^{6 8 6} LN-Ms de la misma manera que las células MDA-MB-231 como se describe (Yoon Y et al., (2007) Cancer Res 67:7518-7524).

Para el modelo de ratón con micrometástasis de melanoma uveal, en el día 0, cada ratón se inocula con 1 * 106 células OMM2.3 de tipo salvaje que expresan HGF/TGF-b/CXCR4/MMP2 en la cámara posterior del ojo derecho. En el día 3, los ratones se tratan con el i-cuerpo de la invención diariamente por inyección i.p., mientras que a los ratones de control se les inyectan 0,1 ml de (2-hidroxipropil)-beta ciclodextrina al 45 %. El día 7 se enuclean los ojos con tumor. El crecimiento del tumor se comprueba por métodos histológicos. El día 28, se recogen tejidos hepáticos y se fijan en formalina al 10%, se procesan, se tiñen con H&E y se cuenta el número de micrometástasis hepáticas bajo el microscopio. Se examinan microscópicamente seis secciones a través del centro del hígado para detectar la presencia de micrometástasis ^{( 1 00} mm de diámetro) y se determina el número promedio de micrometástasis por sección (Liang et al. PLoS One. 2012; 7(4): e34038).

Ejemplo 13 - Inhibición de la invasión del VIH por i-cuerpos

Se utilizó un ensayo de inhibición in vitro del VIH para demostrar la capacidad de i-cuerpos para inhibir la entrada del VIH en las células T que expresan CXCR4. AM3-114 pudo bloquear la entrada del VIH en las células T que expresan CXCR4 con una eficacia similar a AMD3100, como se muestra en la Figura 20. AM3-114 y AMD-3100 tenían un IC⁵⁰ de 50 nM, mientras que el control negativo de i-cuerpo (21H5) no tuvo efecto en el ensayo de inhibición como se esperaba.

Viabilidad celular

En un segundo experimento se demostró que los i-cuerpos no provocaban pérdida de viabilidad de las células utilizadas para la infección por VIH.

Método

Para el ensayo de inhibición del VIH, las células NP2-CD4/CXCR4 (1*104 en 100 |jl) se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano 24 h antes de la adición de i-cuerpo (i-cuerpo 21H5 control negativo e i-cuerpos anti-CxCR4 AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746 o AM4-1121). A continuación, se extrajo el medio de las células y se reemplazó con 100 j l de medio fresco con diluciones quíntuples de i-cuerpo durante 16 horas a 37°C. El intervalo de concentración para los i-cuerpos de CXCR4 fue de 25 jg/m l a 0,008 jg/ml. La concentración de PBS (5,8 %, vol/vol) se mantuvo en los pocillos no tratados. Después de esto, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco. Las concentraciones de icuerpo se mantuvieron durante todo el período de cultivo posterior. Las células NP2-CD4/CXCR4 se incubaron a 37 °C durante un total de 72 h. La viabilidad celular en cada pocillo se evaluó utilizando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTitre-Glo (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se midió utilizando un lector de microplacas FLUOStar (BMG). Para determinar el porcentaje de viabilidad celular en presencia de anticuerpo, la cantidad de luciferasa en las células tratadas con el anticuerpo se expresó como porcentaje de la de las células no tratadas. Los resultados se presentan en la Figura 21.

Inhibición de la entrada de virus.

Todos los i-cuerpos de CXCR4 parecen causar niveles significativos de inhibición de dos cepas de envoltura que usan CXCR4 de VIH-1, NL4.3 y 1109-F-30. NL4.3 es una envoltura adaptada al laboratorio, mientras que 1109-F-30 es un sobre clínico de subtipo C de una persona con infección crónica. Los i-cuerpos no inhibieron la entrada de un virus no relacionado, VSVG, que es la envoltura del virus de la estomatitis vesicular que sufre endocitosis después de unirse a un receptor no relacionado. Los resultados se presentan en la Figura 22.

El i-cuerpo de control negativo, 21H5, tuvo poco efecto sobre la cepa 1109-F-30 pero algún efecto de invasión sobre la cepa NL4.3. En comparación, los i-cuerpos AM3-114, AM4-746 y AM4-1121 todos inhibieron muy bien ambas cepas de VIH con un IC⁵⁰ de alrededor de 80 nM. Además, cuando los i-cuerpos AM3-114 y AM4-746 se conjugaron con PEG de tamaño 30K (lineal) y 2x20K (ramificado), el IC⁵⁰ permaneció consistentemente alrededor de 80 nM. También de acuerdo con el experimento anterior, AM4-272 fue el menos efectivo para bloquear la infección por VIH.

Los i-cuerpos PEGilados se evaluaron respecto a su capacidad para bloquear la infección por VIH en las células huésped. AM3-114 conjugado con PEG 20K, AM3-114 conjugado con PEG 30K y AM4-746 conjugado con PEG 30K se analizaron para determinar la capacidad de bloquear la invasión del VIH de tres cepas de virus diferentes. Estos se compararon con las versiones no pegiladas del i-cuerpo. Tanto AM3-114 como AM4-746 pudieron bloquear la invasión del VIH de manera similar a las versiones no PEGiladas, con solo una ligera reducción en la potencia de los i-cuerpos PEGilados en comparación con los i-cuerpos no PEGilados (Figura 23-1)

Los i-cuerpos PEGilados y los cuerpos no PEGilados no pueden bloquear la entrada del VIH en las células huésped por una cepa de VIH (YU-2) que depende de CCR5 para entrar (Figura 23-2). Esto demuestra que la actividad anti-CXCR4 de los i-cuerpos es fundamental para bloquear la entrada del VIH.

Método

Células NP2-CD4/CXCR4 (1 x io ⁴ en 100 |jl) se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano 24 h antes de la infección. Los anticuerpos anti-CXCR4 se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Antes de la infección, se extrajo el medio de las células y se reemplazó con ^{10 0} j l de medio fresco con diluciones quíntuples de icuerpo (a una concentración x2) durante 30 min a 37 °C. El rango de concentración para los anticuerpos CXCR4 fue de 25 jg/m l a 0,008 jg/ml. La concentración de PBS (5,8 %, vol/vol) se mantuvo en los pocillos no tratados. Se infectaron células NP2-CD4/CXCR4 con 200 TCID50 de virus indicadores de luciferasa pseudotipados con Env en 100 j l durante 12 ha 37 °C. Después de esto, se retiró el inóculo y se reemplazó con medio nuevo. Las concentraciones de i-cuerpo se mantuvieron durante todo el período de cultivo posterior. NP2-CD4/CXCR4 se incubaron a 37 °C durante un total de 72 h. El nivel de entrada del VIH-1 se midió mediante la actividad de luciferasa en lisados celulares (Promega) según el protocolo del fabricante. La luminiscencia se midió utilizando un lector de microplacas FLUOStar (BMG). La actividad de fondo se evaluó mediante células infectadas de forma simulada y se sustrajo de todos los pocillos. Para calcular el porcentaje de entrada de VIH-1 en presencia de i-cuerpo, la cantidad de luciferasa en las células tratadas con i-cuerpo se expresó como porcentaje de la de las células no tratadas.

Ejemplo 14 - Falta de movilización de células madre por i-cuerpos

Plerixafor o AMD3100 es un inhibidor de molécula pequeña de biciclam CXCR4, que ha sido aprobado para su uso en combinación con G-CSF para la movilización de HSC. Se sabe que los inhibidores de CXCR4 de la técnica anterior provocan la movilización de células madre. Como se demuestra en los experimentos que se muestran en este ejemplo, los i-cuerpos de la presente divulgación carecen de la capacidad de provocar la movilización de células madre.

14.1 Evaluación de la especificidad de los anticuerpos CXCR4 frente a diversas células hematopoyéticas.

Para confirmar la unión directa de los anticuerpos CXCR4 (marcados con FLAG) a varias poblaciones de células hematopoyéticas, las células de la médula ósea recolectadas de ratones C57/BL6 se tiñeron con un cóctel de cinco cuerpos CXCR4 i (AM4-272, AM4-746, AM4-1121, AM3-114 o AM3-523) y luego se marcaron secundariamente con un anticuerpo fluorescente anti-FLAG. Estas células se tiñeron para marcadores de linaje, progenitores y HSC y se evaluó la expresión de CXCR4 en diversas poblaciones de células hematopoyéticas. Los resultados de este experimento validan la actividad del i-cuerpo CXCR4 en células hematopoyéticas primarias de ratón. El mismo experimento se realizó en células de médula ósea recolectadas de ratones NSG humanizados para validar la actividad del i-cuerpo CXCR4 en poblaciones primarias de células hematopoyéticas humanas (datos no mostrados).

Todos los i-cuerpos pudieron unirse a las células de la médula ósea y a la sangre del cordón umbilical humano, que eran CD34+ y CD38-.

14.2 Movilización de células LSK y LSKSLAM de ratón

Para obtener evidencia de la movilización de células madre hematopoyéticas utilizando i-cuerpos de CXCR4, se inyectó a los ratones un i-cuerpo de CXCR4 (AM4-272, AM4-746, AM4-1121, AM3-114 o AM3-523) mediante inyección iv (5 ratones /grupo). Después de 1 y 3 horas, los ratones fueron sacrificados y se recogió sangre periférica (PB). Los bazos se recolectaron y pesaron para evaluar la esplenomegalia (agrandamiento del bazo). Se contó el PB para evaluar el contenido de glóbulos blancos como se muestra en la Figura 24A. Las muestras se lisaron para eliminar los glóbulos rojos y 4000 células se sembraron en placas para colonias LPP (bajo potencial proliferativo, por sus siglas en inglés) y CFU-HPP (unidad formadora de colonias con alto potencial proliferativo, por sus siglas en inglés) (recuento de colonias 7 días después de la siembra). Las células restantes se tiñeron con un cóctel de anticuerpos para evaluar el contenido de células madre y progenitoras comprometidas con el linaje. Se utilizó el análisis de citometría de flujo para calcular el número de células comprometidas con el linaje, células madre hematopoyéticas y progenitoras, así como HSC enriquecidas por volumen de PB. No se detectó movilización de glóbulos blancos con ninguno de los i-cuerpos (AM4-272, AM4-746, a M4-1121, AM3-114 o AM3-523 Figura 24A) en comparación con el control positivo AMD3100. Falta de movilización de murino Lin-, Sca-1+, c-Kit+ (células LSK) se muestra en la Figura 24B frente a un control positivo AMD3100. Los i-cuerpos no lograron ninguna movilización de células LSK en comparación con el control positivo AMD3100.

La Figura 24C muestra la falta de movilización de células Lin', Sca-1+, c-Kit+, CD150+, CD48', (CD34') LSKSLAM por icuerpos. Nuevamente, no se observó movilización para todos los i-cuerpos.

14.3 Movilización de células CD34+ humanas

Adquirir evidencia de movilización de células madre CD34+ humanas y progenitoras usando i-cuerpos de CXCR4, el experimento de movilización anterior se llevó a cabo en ratones NODSIL2Ry (NSG) humanizados. Los ratones NSG son severamente inmunodeficientes y carecen de células T maduras, células B y células NK y tienen una inmunidad innata severamente defectuosa, lo que permite el injerto de células humanas sin un rechazo posterior. Los ratones NSG fueron trasplantados con células CD34+de la sangre del cordón umbilical recién clasificadas y tras la confirmación del injerto de CD45/CD34 humano positivo (~4-5 semanas) se usaron como modelo de ratón para la movilización de células madre humanas.

Los ratones NSG humanizados se trataron con i-cuerpo 21H5, i-cuerpos de CXCR4 (AM3-114 y AM3-523) y el control positivo AMD3100, que previamente demostró que proporciona una movilización significativa de células CD34+ en este modelo.

La sangre periférica movilizada se recolectó y evaluó para CD34+ (madre humanas y progenitores).

Los experimentos preliminares con i-cuerpos AM3-114 y AM4-523, como se muestra en la Figura 25, demuestran que estos i-cuerpos no movilizan células madre en comparación con el control positivo AMD3100 en un modelo de ratón humanizado NODSIL2R^y (NSG). Este hallazgo es significativo y representa una desviación de los inhibidores de CXCR4 de la técnica anterior que se sabe que provocan la movilización de células madre.

14.4 Confirmación de unión de i-cuerpos a células madre

Para determinar si los i-cuerpos de CXCR4 se unen a HSC, se evaluó el análisis de unión a células humano CD34+CD38' in vitro. La sangre del cordón umbilical (CB) y la médula ósea humana (BM) se recolectaron como se describió previamente (Nilsson SK et al, 2005 15; 106(4):1232-9; Grassinger, 2009 2; 114(1):49-59). Las células BM CD34+ humanas enriquecidas y las células CB CD34+ purificadas se aislaron como se describió previamente (Grassinger, 2009). Células CB y BM CD34+ humanas y huNSG BM se tiñeron secuencialmente con i-cuerpos de CXCR4 (10 |jg/ml), anti-His-PE y un cóctel de anticuerpos que contenía CD34-FITC (BD Biociences #348053) y CD38-BV421 (BD Horizon #562444), se lavó con PBS (BSA al 0,5 %) y se analizó mediante citometría de flujo en un Cytopeia Influx (BD) como se describió anteriormente (Grassinger, 2009). Para el análisis de BM y PB humanos y murinos, hasta 5 * 10⁶ las células se analizaron a 10-20.000 células/s. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo 10 (FlowJo, LLC). Para el análisis de huNSG BM, también se incluyeron en el cóctel de anticuerpos huCD45-PECy7 (BD Biosciences #557748) y muCD45-BUV395 (BD Biosciences #564279). Las HSC de CB y BM humanas se definieron como CD34+CD38- y las h SC de ratones huNSG se definieron como muCD45'huCD45+CD34+CD38\ Se evaluaron muestras de CB y BM de 3 donantes individuales y BM de 3 ratones huNSG individuales.

Los i-cuerpos AM3-114, AM4-272 y AM3-523 se unieron de manera eficaz a las HSC de sangre del cordón umbilical humano con una avidez decreciente (Figura 26). AM3-114 también se unió de manera efectiva a HSC de médula ósea humana y médula ósea extraída de ratones NODSCIDIL2Ry-/' humanizado (huNSG) (Figura 26).

Ejemplo 15 - Prevención de fibrosis por i-cuerpos

15.1 Modelo de quemadura por álcali de la córnea

La inducción de fibrosis (neovascularización (NV) corneal) por los i-cuerpos se puede examinar utilizando el modelo de quemadura por álcali de la córnea como se describe en Cai X et al (2014) PLoS ONE 9(2):e88176. El método consiste en anestesiar ratas (por ejemplo, Sprague Dawley) con una inyección intraperitoneal de 60 mg/kg de Nembutal y la administración tópica de una gota de tetracaína. Se hace una herida alcalina en la córnea colocando un trozo circular de papel de filtro de 1,5 mm de diámetro, empapado en NaOH 1 N, en contacto con la córnea central del ojo derecho durante 40 segundos. Inmediatamente después de la exposición al álcali, la superficie ocular se enjuaga con PBS durante 60 segundos. Las ratas se dividen aleatoriamente en 2 grupos (n=15): Grupo 1 compuesto por ratas sometidas a quemaduras alcalinas con tratamiento salino normal (10 jl, 4 veces al día), y Grupo 2 compuesto por ratas sometidas a quemaduras alcalinas con tratamiento TMP (1,5 mg/ml en un volumen de 10 ml, 4 veces al día). A continuación, se observan todos los ojos el día 28 usando microscopía con lámpara de hendidura para la evaluación de NV corneal.

15.2 Evaluación de NV en la córnea

NV (NV) corneal se puede cuantificar como se describe en Zhang Z et al (2005) Invest Ophthalmol Vis Sci 46:4062-4071 doi:10.1167/iovs.04-1330. Brevemente, un oftalmólogo sin conocimiento de las condiciones del estudio examina todos los ojos bajo un microscopio con lámpara de hendidura los días 1, 2, 5 y ⁸ después de la quemadura alcalina. La imagen corneal se divide en 4 cuartos. La longitud del vaso de cada cuarto (Li, i = 1-4) se mide usando un calibrador Vernier. El área NV corneal (A) se calcula utilizando la siguiente ecuación: A = Zi = 1-4 3,1416*{R2-(R-Li)2} (R es el radio de la córnea de la rata. R = 3,5 mm, calculado a partir de la medición de 15 córneas de rata).

15.3 Neovascularización coroidea

La neovascularización coroidea inducida por láser (NVC) es un modelo bien caracterizado y aceptado de neovascularización coroidea(Fletcher EL et al. (2011) Prog Mol Biol Transl Sci 100: 211-286). También es un método rápido para determinar la eficacia de tratamientos potenciales que se dirigen a la angiogénesis y la fibrosis. Brevemente, se aplican hasta cuatro puntos de láser en la parte posterior del ojo utilizando un láser de fotocoagulación de onda continua (diodo de 532 nM). La energía del láser es lo suficientemente alta como para crear una ruptura en la membrana de Bruch. Durante los siguientes 7 a 14 días, se produce el crecimiento de vasos sanguíneos desde la coroides hacia la retina, y se cuantifica inmunocitoquímicamente o usando angiografía con fluoresceína.

Brevemente, un total de veinte (20) ratas agutí oscuras o ratones C57BL/6 alojados en una instalación biomédica para animales en un entorno de luz cíclica (12 horas encendidas, 12 horas apagadas, con una luminancia en la jaula de <350 lux) durante 10 días o más antes de su uso se anestesian y se tratan con un láser térmico de onda continua de 532 nm aplicado como 4 puntos alrededor del nervio óptico. Inmediatamente después del tratamiento con láser, los animales se tratan con la dosis más alta de i-cuerpo (la concentración en la retina es de ²⁰ mg/ml).

La estructura de la retina de todas las ratas se examina con una cámara de fondo de ojo/OCT de roedores dedicada (Micron III, Phoenix Instruments), y la integridad vascular se cuantifica usando angiografía con fluoresceína. A continuación, se cuantifica el tamaño (diámetro y área) de todas las lesiones fluorescentes para proporcionar una medida del grado de angiogénesis.

Después de la obtención de imágenes, los animales se sacrifican por sobredosis de anestésico y las copas oculares posteriores se fijan en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. A continuación, las muestras completas de la retina se procesan para el marcaje con IB4 a fin de evaluar la extensión del crecimiento de los vasos coroideos en el espacio subretiniano. El diámetro y el área de la lesión proporcionan una evaluación de la extensión de la neovascularización.

Además, el nivel de cicatrización que se desarrolla como consecuencia de la invasión de los vasos sanguíneos coroideos se cuantifica mediante inmunomarcaje para el marcador gliótico GFAP.

Además, también se examina la contracción retiniana, el tamaño de la lesión, la alteración de la microglía y la respuesta glial y la expresión del gen profibrótico en las retinas tratadas después del tratamiento con láser para evaluar la fibrosis.

El i-cuerpo AM3-114-6H anti-CXCR4 (más un i-cuerpo de control) reduce la angiogénesis patológica o las características de la lesión en un modelo de neovascularización coroidea en ratones. Los niveles de CXCR4 se examinaron en el ojo después del tratamiento con láser (arreglo de fibrosis PCR; SABiosciences) y se demostró que estaban desregulados. La regulación al alza de CXCR4 en este entorno sugiere que el tratamiento con i-cuerpos antagonistas de CXCR4 podría tener un efecto beneficioso.

Los ratones fueron tratados de la siguiente manera:

• Grupo 1 (n=10): láser ambos ojos-vehículo en un ojo; i-cuerpo en el otro

• Grupo 2 (n=10): Láser de un ojo (sin i-cuerpo); otro ojo sin láser.

El fármaco i-cuerpo se inyectó por vía intravítrea en un volumen de 1 |jl a una concentración de hasta 20 mg/ml.

Se obtuvieron datos de los efectos de los i-cuerpos sobre la contracción retiniana, el tamaño de la lesión y la expresión génica en las retinas tratadas después del tratamiento con láser. Hubo una contracción dramática de la retina después del tratamiento con láser en comparación con las regiones no tratadas con láser en el mismo ojo. El tratamiento con AM3-114 y AM4-272 dio como resultado una reducción significativa en la contracción de las regiones tratadas con láser. Un factor de confusión fue que los controles del vehículo también parecen tener una reducción muy significativa en la relación de contracción. Dado que el vehículo consta de una sola inyección de TBS, es poco probable que esto tenga tal efecto. La explicación más probable es que i-cuerpo en realidad se escapó del ojo tratado y entró en la circulación, tal vez bloqueando la infiltración de células inflamatorias en el ojo tratado con el vehículo. También hubo una reducción del tamaño de la lesión tras la administración del i-cuerpo AM3-114.

Se examinó la expresión de genes asociados con la angiogénesis y la fibrosis. El ARN total se aisló de las muestras de retina y EPR/coroides utilizando columnas de centrifugación comerciales (RNeasy, Qiagen, Valencia CA). Se utilizó una matriz de genes PCR para evaluar la expresión de 84 genes relacionados con la angiogénesis o la fibrosis (Qiagen). Brevemente, las muestras de ARN total de ojos no tratados, tratados con láser y ojos contralaterales no tratados (n = 9 de cada grupo, cada 25 ng) se agruparon dentro de sus respectivos grupos de tratamiento (3 experimentos independientes que contenían 3 muestras agrupadas), se transcribieron inversamente (RT2 primera hebra, Qiagen) y luego se sometió a una preamplificación de las plantillas diana de DNAc (RT2 pre-AMP, Qiagen). Las muestras se agregaron a una mezcla maestra comercial (RT2 SYBR green mastermix, Qiagen) y se amplificaron durante 40 ciclos (ABI 7900HT, Life Technologies, Grand Island NY). Se realizaron tres matrices independientes para cada grupo de tratamiento. Los datos se analizaron usando delata delta Ct (AACt), expresado como veces de cambio y de regulación evaluados usando una prueba t no pareada. Estos datos de expresión génica de ojos tratados con AM3-114 y AM4-272 indican que existe una extensa regulación a la baja de genes profibróticos como Col1A2, TGF-b1, factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF, por sus siglas en inglés) e inhibidor tisular de metaloproteinasa (TIMP3, por sus siglas en inglés) , trombospondina 2 (Thbs2), inhibidor de la serina peptidasa (SerpinH1), subunidad de la integrina p⁸ (ITGB⁸ ), lisil oxidasa (LOX), eotaxina (CCL11), integrina p3 (ITGB3), serina-treonina proteína quinasa (Akt1), miembro de la familia SMAD ⁶ (SMAD⁶ ), polipéptido alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDFGA), factor de crecimiento transformante, receptor beta II (Tgfbr2), proteína morfogenética ósea 7 (Bmp7), (Figura 27).

Ejemplo 16 - Unión de i-cuerpos a fibrocitos

Las células mesenquimales derivadas de hueso circulantes que tienen el potencial de convertirse en fibrocitos y pueden desempeñar un papel fundamental en la patogenia de la fibrosis (Strieter RM, Keeley EC, Burdick MD y Mehrad B. The Role of Circulating Mesenchymal Progenitor Cells, Fibrocytes, in Promoting Pulmonary Fibrosis. Trans Am Clin Climatol Assoc 2009; 120;49-59) y que las células que expresan CD45 y CXCR4 son fibrocitos circulantes que pueden migrar en respuesta a SDF-1 y viajar a los pulmones en un modelo murino de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina (Phillips RJ, Burdick MD, Hong K, Lutz MA, Murray LA et al. Circulating fibrocytes traffic to the lungs in response to CXCL12 and mediate fibrosis. J Clin Invest (2004) 114: 438-44).

El doble mareaje de i-cuerpo (AM3-114) y CD-45 se realizó de la siguiente manera. El i-cuerpo AM3-114 se incubó con PBMC humanas aisladas a temperatura ambiente durante 4 horas. Las PBMC se untaron en un portaobjetos de microscopio y se fijaron con acetona a 4 °C durante 10 minutos. Después de tres lavados y rehidratación con PBS, los portaobjetos se incubaron con una dilución 1:100 de antiFLAG de ratón durante la noche a 4 °C. Después de lavar, los portaobjetos se incubaron con Alex Fluor 568 cabra anti-ratón (para detectar i-cuerpo mediante la unión de anti-FLAG) a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, los portaobjetos se lavaron y se incubaron con anticuerpo anti-CD-45 de ratón marcado con FITC durante la noche a 4 °C. Después de un lavado adicional, los portaobjetos se montaron con medio de montaje antidecoloración ProLong Gold que contenía DAPI. Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio confocal Nikon A1.

Los fibrocitos humanos se identificaron mediante tinción con un anticuerpo contra CD45. La unión de i-cuerpo AM3-114 se identificó mediante un anticuerpo anti-FLAG a la etiqueta C-terminal. Se usó DAPI para teñir el núcleo de las células. Los resultados se presentan en la Figura 28. Los resultados muestran que i-cuerpo AM3-114 fue capaz de unirse a los fibrocitos humanos.

Ejemplo 17 - Modelo in vivo murino de bolsa de aire­

La capacidad de los i-cuerpos para bloquear la inflamación se evaluó en un modelo murino in vivo de bolsa de aire. La bolsa de aire subcutánea (s.c.) es un modelo in vivo utilizado para estudiar la inflamación aguda y crónica (Durate et al, Models of Inflammation: Carrageenan Air Pouch, Current Protocols in Pharmacology 5.6.1-5.6.8, marzo de 2012). La inyección de irritantes en una bolsa de aire en ratas o ratones induce una respuesta inflamatoria que puede cuantificarse por el volumen de exudado producido, la infiltración de células y la liberación de mediadores inflamatorios. Se genera una bolsa de aire mediante la inyección de aire estéril debajo de la piel del dorso del ratón. El ratón se trata previamente con el compuesto antiinflamatorio o el artículo de prueba (i-cuerpos o AMD3100), y se trata secundariamente con SDF-1, el inductor de la inflamación. Luego se analiza el líquido de lavado de la bolsa de aire para determinar el tráfico de células y la liberación de citocinas.

El ensayo de bolsa de aire se realizó en ratones BALB/c de 7 semanas de edad. Los días 1 y 3, se inyectaron 0,2 ml/g de peso corporal inicial (IBW, por sus siglas en inglés) de aire estéril debajo de la piel de la espalda para crear la bolsa. El día ⁶ , los ratones se dividieron en grupos y recibieron una inyección intraperitoneal de 0,5 ml de PBS con o sin i-cuerpo (AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746 o AM4-1121) o a Md 3100 (10 mg/kg). Treinta minutos más tarde, se inyectó SDF-1 ^{( 6} |jg) en la bolsa. Cuatro horas más tarde, los ratones fueron asesinados en una cámara de CO² y se lavó la bolsa de aire. Las células se recogieron, contaron y caracterizaron por citometría de flujo.

El total de células en la bolsa de aire demuestra que los artículos de prueba inhiben la migración de células hacia la bolsa de aire/sitio de inflamación. Los i-cuerpos AM3-114, AM4-272, AM3-523, AM4-746 y AM4-1121 inhibieron la migración celular a la bolsa de aire (similar a AMD3100), sin embargo, el i-cuerpo de control negativo (21H5) no inhibió la migración celular. Los i-cuerpos inyectados en el ratón sin el estimulante inflamatorio no tuvieron ningún efecto sobre la migración de células a la bolsa de aire (Figura 29).

Ejemplo 18 - Prevención de la fibrosis pulmonar idiopática (IPF) en un modelo de ratón con bleomicina

La capacidad de las moléculas de unión a CXCR4 (i-cuerpos) para inhibir la fibrosis pulmonar se examinó en un modelo de enfermedad en ratones. La bleomicina, un agente antibiótico y antitumoral, se usa ampliamente en modelos experimentales de enfermedades humanas que se asemejan a la IPF. La bleomicina es capaz de causar daño celular independientemente de su efecto sobre el ADN al inducir la peroxidación lipídica. La naturaleza precisa de la interacción entre la bleomicina y el pulmón que conduce a la deposición de colágeno es incierta. Sin embargo, la sobreactivación de citocinas y factores de crecimiento como IL-1, IL-⁶ , TNF-alfa, PDGF y TGF-beta se ha implicado sistemáticamente en la progresión de la enfermedad. La evidencia reciente sugiere que antagonizar CXCR4 es eficaz para prevenir la fibrosis pulmonar en el modelo de ratón con bleomicina.

El modelo de IPF de ratón es un modelo validado de inflamación y fibrosis, con lesión pulmonar inicial (dentro de las 48 horas) caracterizada histológicamente por edema perivascular, congestión capilar y engrosamiento de la pared alveolar asociado con hemorragia intraalveolar e infiltrado de células inflamatorias en las paredes alveolares, así como como en los espacios. La deposición de colágeno peribronquial y subpleural focal generalmente se produce dentro de una semana después de la administración de bleomicina en este modelo.

La dosis óptima de Bleomicina es 2U/ratón y el momento óptimo para evaluar el reclutamiento de fibrocitos se confirmó en el día 4. En los días 4, se recogieron fluidos de lavado broncoalveolar (BAL, por sus siglas en inglés) para el análisis de la concentración de SDF-1. La mitad del tejido pulmonar se usó para hacer suspensiones de células individuales del pulmón y las células se usaron para citometría de flujo y se analizaron para CD45+, CXCR4+ y Colágeno1+ (fibrocitos). La otra mitad del tejido pulmonar se tiñó con Sircol para determinar la presencia de colágeno 1 y se analizará el ARN para Col-1, Col-3 y SDF-1.

Usando 2U de bleomicina/ratón (10 por grupo), los ratones recibieron dosis de i-cuerpos, control negativo i-cuerpo 21H5 a 30 mg/kg y anti-CXCR4 i-cuerpos, AM3-114, AM4-272, AM3-523 a 1, 10 y 30 mg/kg. El SDF-1, los fibrocitos y la deposición de colágeno se controlaron el día 4. A los grupos se les administró i-cuerpo justo antes de la administración de Bleomicina. Se picó la mitad del tejido pulmonar y se lavó en PBS y se usó para preparar suspensiones de células individuales del pulmón con colagenasa A y tratamiento con dispasa. A continuación, las células se usaron para citometría de flujo y se analizaron para detectar fibrocitos CD45+, CXCR4+ y Colágeno1+.

La administración de i-cuerpo AM3-114 a 30 mg/kg pudo atenuar drásticamente el reclutamiento de fibrocitos en los pulmones de ratones con fibrosis inducida por bleomicina. También fue evidente que los i-cuerpos AM4-272 y AM3-523 fueron capaces de atenuar significativamente el reclutamiento de fibrocitos en los pulmones de estos ratones. Los icuerpos AM4-272 y AM3-523 fueron capaces de bloquear el reclutamiento de fibrocitos incluso a 1 mg/kg. Como era de esperar, AMD3100 y Perfenidona también pudieron bloquear el reclutamiento de fibrocitos. Ni el vehículo solo ni el icuerpo de control negativo afectaron el reclutamiento de fibrocitos en los pulmones de ratones con fibrosis inducida por bleomicina (Figura 30).

El tejido pulmonar se examinó utilizando el ensayo de tinción Sircol (Biocolour Ltd., Carrickfergus, Irlanda del Norte) según el protocolo del fabricante, para determinar la presencia de la proteína colágeno de la matriz extracelular. i-cuerpo AM3-114 a 30 mg/kg, i-cuerpo AM4-272 a 10 mg/kg e i-cuerpo AM-3523 a 30 mg/kg redujeron el contenido de colágeno del pulmón en comparación con el vehículo solo o el control negativo i-cuerpo (21H5). También se observó una reducción en el colágeno para AMD3100 y Pirfenidona.

Se realizó un experimento de fibrosis pulmonar con bleomicina en ratones durante 21 días para evaluar el efecto del icuerpo PEGilado. La administración de i-cuerpo AM4-272 PEGilado a 10 mg/kg pudo atenuar el reclutamiento de fibrocitos en los pulmones de ratones con fibrosis inducida por bleomicina en el día 7. AM4-272-PEG disminuyó los fibrocitos en el día 7 aproximadamente en la misma medida que AMD3100 y Pirfenidona.

Posteriormente, el tejido pulmonar restante se usó para analizar el ARN de cada muestra para la expresión génica de CXCL12, Col1a1 y Col3a1 según Phillips et al (2004) J Clin Invest 114, 438.

Ejemplo 19 Mapeo de epítopos

Se usó mutagénesis shotgun (Integral molecular) para evaluar la unión de los i-cuerpos AM3-114, AM4-272 y AM3-523 anti-CXCR4 a CXCR4 humano de tipo salvaje y mutado. Los i-cuerpos se probaron frente a células T HEK-293 que expresan CXCR4. Se determinaron las condiciones de detección óptimas para la inmunodetección y el mapeo de epítopos de i-cuerpos AM3-114 (1 |jg/ml), AM4-272 (2 |jg/ml) y AM3-523 (1 |jg/ml) que dieron un valor alto de señal a fondo. Las reactividades medias de i-cuerpo (y los rangos) se muestran en la Tabla 13 para todos los residuos críticos identificados en la pantalla. Los anticuerpos de control fueron anti-flag y 12G5, que están disponibles comercialmente.

T l 1 R i ríi r ni n i- r AM -114 AM4-272 AM - 2 X R4

Los residuos críticos de la proteína CXCR4 para la unión de i-cuerpo (gris) se identificaron como aquellos que eran negativos para la unión de i-cuerpo (<30 % WT para AM3-114 y AM4-272; <15 % para AM3-523) pero positivos para el mAb anti-Flag (>70 % en peso), y también positivo para un control adicional mAb 12G5 (>50 % en peso).

Los tres i-cuerpos tenían el resto D262 en común al que también se une AMD3100 (Haste et al., (2001) Molecular Pharmacology 60:164-173). Todos los aminoácidos críticos identificados por el mapeo de epítopos se conservan entre CXCR4 humano y de ratón excepto F189. No se han identificado previamente agentes de unión que se unan a los residuos E32 o L266 de CXCR4.

Un conjunto adicional de residuos también tuvo un efecto sobre la unión de algunos i-cuerpos que son; C28, V112, D193, P191, E268y E288

Ejemplo 20 - unión de i-cuerpo a CXCR4 en tejidos de pacientes humanos con fibrosis pulmonar idiopática (IPF) Para confirmar aún más la expresión de CXCR4 en pulmones normales y con IPF, se utilizaron controles negativos icuerpo 21H5, i-cuerpos específicos de CXCR4 (AM3-114, AM4-272 y AM3-523) en el análisis inmunohistoquímico (IHC) (datos no mostrados). Se detectaron pocas células que expresan CXCR4 en biopsias de pulmón normales y de IPF lenta. Las células que expresan CXCR4 se detectaron fácilmente en biopsias de pulmón con IPF rápida. Finalmente, se detectó CXCR4 con los i-cuerpos en células intersticiales presentes en regiones fibróticas de biopsias pulmonares de IPF rápida. Los i-cuerpos de la presente divulgación pudieron unirse a los fibroblastos de biopsias de pulmón de pacientes con IPF (tanto de proceso rápido como lento) pero no se unieron a biopsias de pulmón de tejido pulmonar normal.

Ejemplo 21 - Reducción de la invasión de fibroblastos de pulmón humano a partir de tejido de paciente pulmonar idiopático Varios informes han mostrado evidencia del papel de CXCL12 y CXCR4 en la invasión pulmonar (Li et al Cancer Lett ^{2 0 1 2} 322; 169-176 & Krook etal Mol Cancer Res 2014 ^{1 2} ; 953-964). Lovgren, A et al han demostrado que la p-arrestina juega un papel importante en la invasión de fibroblastos pulmonares (Lovgren et al. Sci Transl Med 2011 3; 74ra23). Además, varios informes han demostrado que CXCR4 entrega CXCL12 a CXCR7, lo que lleva a la activación de la vía de la p-arrestina, lo que sugiere que CXCR4 puede promover la invasión de fibroblastos pulmonares (Coggins et al. 2014 PLoS uno 9, e98328, Decaillot et al. J Biol Chem 2011 286; 3218832197, & Rajagopal et al PNAS 2010 107; 628-632).

Para determinar el papel de CXCR4 y CXCL12 en la invasión de fibroblastos, se utilizaron fibroblastos de pulmón normales e IPF en un ensayo de invasión de cicatrización de heridas. Las placas ImageLock de 96 pocillos (Essen Bioscience) se recubrieron con 50 |jg/ml de extracto de membrana basal (BME; Trevigen) durante una hora a temperatura ambiente. Se sembraron fibroblastos normales y generados a partir de biopsias de pulmón de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (IPF) que mostraban una progresión lenta o una progresión rápida de la enfermedad (36.000 células por pocillo) en placas recubiertas con BME y se incubaron durante la noche. Al día siguiente, las células se rascaron con un Woundmaker™ (Essen Bioscience), lavaron con DPBS tratado con i-cuerpo 21 h5 control negativo, i-cuerpos específicos de CXCR4 (AM3-114, AM4-272;130 jg/m l) o AMD3100 (12 jM ) en una solución de BME de 2 mg/ml. Se permitió que el BME polimerizara incubando la placa a 37 °C durante 15 minutos. A continuación, las placas se insertaron en un sistema de imágenes IncuCyte Zoom y se adquirieron imágenes cada 2 horas durante aproximadamente 50 horas. La invasión se cuantificó utilizando el software IncuCyte (Essen Bioscience).

BIBF-1120, un inhibidor de múltiples receptores tirosina quinasa actualmente aprobado para el tratamiento de la IPF, inhibió eficazmente la motilidad de los fibroblastos tanto normales como de la IPF. Los i-cuerpos AM3-114-6H y AM4-272-⁶ H específicos de CXCR4 inhibieron la invasión en IPF lenta y en dos de tres IPF rápida, pero no en fibroblastos pulmonares normales (las Figuras 31-1 a 31-3 muestran ejemplos representativos de fibroblastos de forma normal, lenta y pacientes con IPF rápida).

Ejemplo 22: los i-cuerpos exhiben propiedades antifibróticas in vitro

Para determinar las funciones potenciales de CXCR4 en la activación de fibroblastos pulmonares y la generación de matriz extracelular, los fibroblastos se trataron con i-cuerpos específicos de CXCR4 (AM3-114-6H, AM4-272-6H, AM3-523-6H), control negativo de i-cuerpo (21H5) o AMD3100 durante 48 horas, después de lo cual se extrajo el ARN y se realizó un análisis qPCR para transcritos ACTA2, COL1A1, COL3A1 y FN1 . El método qPCR fue el siguiente: Los fibroblastos se sembraron en 50 jg/m l de BME y se trataron con 130 jg/m l de i-cuerpos o 12 jM de AMD3100. Después de 48 horas, el ARN se extrajo con el reactivo T rizol y se transcribió inversamente en ADNc utilizando la transcriptasa inversa superíndice II (Life technology) como se describió anteriormente (Trujillo et al Sci Transl Med 20102; 57ra82). El ADN complementario (ADNc) se cargó posteriormente en una placa Taqman y el análisis de expresión génica se realizó utilizando cebadores prediseñados para COL1A1, COL3A1, FN1, y aSMA. Todos los análisis Taqman se realizaron usando un instrumento Viia 7 de Applied Bio system (Life technology). Luego, los resultados se exportaron, se normalizaron a la expresión de ARN de 18 s y se calcularon los análisis de cambio de pliegue utilizando el software Data Assist (Life technology). AM3-114-⁶ H específico de CXCR4 redujo notablemente la expresión del transcrito del gen profibrótico de ACTA2, COL1A1, COL3A1 y FN1 en IPF lenta pero no en fibroblastos pulmonares normales (Figura 32).

Para examinar si los i-cuerpos podían modular el colágeno soluble en fibroblastos de pulmón IPF, se usó un ELISA. El colágeno 1 se detectó usando un ELISA directo. Brevemente, la proteína de colágeno 1 purificada y los sobrenadantes acondicionados se recubrieron en placas ELISA maxi-sorb durante la noche a 4 °C. A la mañana siguiente, las placas se lavaron, se bloquearon con BSA al 1% durante una hora y luego se incubaron con un anticuerpo anti-Colágeno 1 biotinilado (Abcam) durante 2 horas en un agitador rotatorio a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron las placas y se añadió estrepdavidina conjugada con HRP a los pocillos durante 20 minutos. Después de 20 minutos, las placas se lavaron y revelaron con sustrato TMB durante 20 minutos, después de lo cual se añadió una solución de parada y se adquirió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas Synergy H1 (Biotek).

El i-cuerpo específico de CXCR4, AM4-272-6H, redujo notablemente la proteína de colágeno soluble en sobrenadantes acondicionados de fibroblastos 48 horas después del tratamiento con i-cuerpo.

Ejemplo 23 - Los i-cuerpos modulan varios socios de señalización

Varios informes indican que CXCR4 emite señales junto con otros receptores de quimiocinas, incluido CCR2. Para determinar si los i-cuerpos específicos de CXCR4 pueden modular los posibles socios de señalización de CXCR4, se recogieron sobrenadantes acondicionados de cultivos de fibroblastos de pulmón con IPF normal, lenta y rápida 48 horas después de i-cuerpo (AM3-114-6H o AM4-272-6H), AMD3100 o BIBF -1120 y se detectaron CCL2, CCL5 y CXCL12 en sobrenadantes acondicionados con fibroblastos usando kits ELISA comerciales recomendados por el fabricante (R&D Systems). El CXCR4 dirigido a i-cuerpos, AM3-114-6H y AM4-272-6H, AMD3100 y BIBF-1120 aumentó notablemente la proteína CCL2 en IPF, pero no en los sobrenadantes acondicionados con fibroblastos normales, lo que fue evidente en los sobrenadantes acondicionados con fibroblastos pulmonares de rápida-IPF. El CXCR4 dirigido a i-cuerpo, AM4-272-⁶ H, aumentó los niveles de CCL5 en algunos fibroblastos de pulmón IPF; sin embargo, este efecto no fue constante y se observó en una línea de fibroblastos de pulmón de IPF lenta tratada con el control i-cuerpo, 21H5-6H.

Ejemplo 24 - Los i-cuerpos bloquean la agregación plaquetaria

Se llevaron a cabo experimentos para examinar si los i-cuerpos podían bloquear la agregación de plaquetas inducida por SDF-1a. Se preincubaron suspensiones de plasma rico en plaquetas humanas con i-cuerpos AM3-114, AM3-523, ^a M4-746 o AM4-1121 (o 12G5 control positivo anti-CXCR4 Mab) a 10 o 20 ug/mL durante 10 min, seguido de estimulación con SDF-1 alfa 100 nM. En presencia del control negativo i-cuerpo 21H5 (o el control de isotipo para 12G5: IgG2a de ratón). SDF-1 indujo una agregación robusta y reproducible (las curvas negras descendentes, que indican un aumento en la transmisión de luz), que coincide con lo publicado anteriormente. Todos los i-cuerpos así como 12G5 tuvieron un efecto inhibidor, siendo AM3-114 y AM4-1121 los más eficientes (Figura 33). Estos i-cuerpos mostraron un fuerte y sostenido bloqueo de agregación. AM3-523 y AM4-746 bloquearon la agregación en la misma medida que MAb12G5, y AM4-272 bloquearon la agregación solo débilmente. Ni el i-cuerpo de control negativo ni el MAb de control tuvieron ningún efecto sobre la agregación plaquetaria.

Ejemplo 25 - El i-cuerpo anti CXCR4 es activo en un modelo de ratón de esclerosis múltiple (Encefalomielitis autoinmune experimental)

Holman et al (Biochimica et Biophysica Acta 2011) Ha habido algunas publicaciones que sugieren que se demostró que CXCL12 es responsable de reclutar células positivas para CXCR4 a través de la barrera hematoencefálica alrededor de los puntos de tiempo del día 8-12 en Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), modelo de ratón de esclerosis múltiple. Además, estudios recientes demostraron que los antagonistas de CXCR4 mostraron eficacia en la EAE (Hanes etal JBC Vol 290(37):22385-22397 (2015), Kohler et al. Brain Pathology 2008, 18; 504-516). Los inventores indujeron la EAE en un pequeño número de animales (n=3 por grupo) mediante inyección de proteína de oligodendrocitos de mielina (MOG, por sus siglas en inglés) el día 0 y los trataron con i-cuerpo AM4-272 por vía intravenosa a 4 mg/kg entre los días 7 y 10 (una inyección/día durante 4 días). Este es el tiempo que se ha informado que es crítico para la infiltración de células inflamatorias a través de la barrera hematoencefálica. Se observó que de los tres ratones a los que se inyectó el i-cuerpo AM4-272, uno progresó a la enfermedad mientras que los otros 2 estaban casi libres de la enfermedad. Los pesos corporales de los animales tratados con i-cuerpo el día 15 son significativamente diferentes de los animales enfermos o de los animales inyectados con el control negativo i-cuerpo 21H5. Además, las puntuaciones clínicas mejoraron drásticamente con la inyección de i-cuerpo en comparación con los animales enfermos o los inyectados con icuerpo de control tanto en el día 14 como en el día 15 (Figura 34). Estos datos sugieren que los i-cuerpos de la presente invención pueden unirse a CXCR4 en las células inflamatorias e inhibir su migración desde el sistema sanguíneo periférico al cerebro. Parece que bloquear esta migración puede aliviar los síntomas de la EAE.

Se realizó inmunohistoquímica de los cerebros de los ratones experimentales. Se observó una gran cantidad de tinción de células inflamatorias en la sustancia blanca de los cerebros de los animales enfermos (solo MOG) y en el ratón sintomático que recibió el i-cuerpo AM4-272. Mientras que hubo muy poca tinción de células T inflamatorias en el control del vehículo o en los ratones asintomáticos que recibieron el i-cuerpo AM4-272.

La tinción inicial con hematoxilina y eosina se llevó a cabo en el tejido cerebral de ratones con EAE con y sin tratamiento con i-cuerpo (AM4-272) para resaltar la infiltración de células T en la sustancia blanca. Se observó una infiltración drástica de células T en los ratones MOG tratados con el i-cuerpo 21H5 de control, pero no en los ratones tratados con el i-cuerpo AM4-272.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que se une al receptor tipo 4 de quimiocinas C-X-C (CXCR4) humano, que comprende una región de andamio y regiones determinantes de complementariedad (CDR1 y CDR3) contenidas en el mismo, donde la región de andamio comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la región de andamio definida por aminoácidos 1 a 26, 33 a 79 y 88 a 97 de SEQ ID NO: 1;

y

(A) en donde la región CDR1 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 41 y en donde la región CDR3 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 42; o

(B) en donde la región CDR1 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 49 y en donde la región CDR3 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 50; o

(C) en donde la región CDR1 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 57 y en donde la región CDR3 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 58; o

(D) en donde la región CDR1 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 73 y en donde la región CDR3 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 74; o

(E) en donde la región CDR1 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 77 y en donde la región CDR3 consiste en la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 78;

y en donde el polipéptido carece de capacidad de movilización de células madre.

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, en donde la región de andamio comprende la secuencia como se establece en SEQ ID NO:2 o la secuencia como se establece en SEQ ID NO:2 que comprende entre 1 y 5 adiciones o sustituciones de aminoácidos en la misma.

3. Un polipéptido que se une al receptor tipo 4 de quimiocinas C-X-C (CXCR4) humano que comprende o consiste en la secuencia establecida en cualquiera de ^s E^q ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ⁱD NO: 72 o SEQ ID NO: 76.

4. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se une a uno o más residuos de CXCR4 seleccionados del grupo que consiste en C28, E32, V112, Y184, F189, P191, D193, W195, D262, L266, E268 y E288 de CXCR4 humano (SEQ ID NO: 105).

5. Una construcción de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un conjugado que comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un agente seleccionado entre un agente terapéutico, una toxina, un marcador detectable o un agente que prolongue la semivida del polipéptido.

7. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el conjugado de la reivindicación 6 y un vehículo aceptable.

8. Un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el conjugado de la reivindicación 6, para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con CXCR4.