ES2828368T3 - Anticuerpos anti-receptor CCR7 humanizados - Google Patents

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Abstract

Anticuerpo anti-CCR7 humanizado que comprende las regiones hipervariables HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, donde: HVR-H1 comprende la SEQ ID NO: 6; HVR-H2 H1 comprende la SEQ ID NO: 13; HVR-H3 H1 comprende la SEQ ID NO: 19; HVR-L1 H1 comprende la SEQ ID NO: 27; HVR-L2 H1 comprende la SEQ ID NO: 31; y HVR-L3 H1 comprende la SEQ ID NO: 36, y donde el anticuerpo tiene al menos una de entre: a) una afinidad minima por un antigeno sintetico con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 76, definida por una Kd que no es mas de un factor 10 superior a la Kd de un anticuerpo anti-CCR7 de raton del cual la secuencia de aminoacidos del dominio variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1 y del cual la secuencia de aminoacidos del dominio variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2; y, b) una IC50 de no mas de 100 nM para inhibir al menos una de entre la senalizacion intracelular dependiente de CCR7 y la internalizacion del receptor CCR7, por al menos un ligando de CCR7 seleccionado de entre CCL19 y CCL21.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-receptor CCR7 humanizados
Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere en general a los campos de la medicina y la farmacia, en particular al campo de los biofármacos para usar en oncología. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos anti­ receptor CCR7 que son útiles en el tratamiento de los cánceres donde las células tumorales expresan un receptor CCR7.
Antecedentes de la invención
[0002] El receptor de motivos CC 7 humano (de ahora en adelante denominado "CCR7") es un receptor acoplado a proteína G (GPCR) con siete dominios transmembranarios que se descubrió originalmente expresado de una manera selectiva de linfocitos por una infección de EBV (Birkenbach et al., 1993, J.Virol. 67: 2209-2220). Después, se descubrió que el CCR7 era un receptor de quimiocinas selectivo para la CCL19 y la CCL21. En condiciones fisiológicas, la expresión de CCR7 está restringida a linfocitos T y B vírgenes y células dendríticas maduras y juega un papel en la regulación de su migración, organización y activación.
[0003] La actividad del CCR7 ha sido implicada en una diversa variedad de estados patológicos, incluidas las afecciones inflamatorias crónicas (Moschovakis et al., 2012, Eur J Immunol. 42:1949-55), aterosclerosis (Luchtefeld et al., 2010, Circulation 122:1621-28), infección por VIH (Evans et al., 2012, Cytokine Growth Factor Rev. 23:151-57) y cáncer (Ben-Baruch, 2009, Cell Adhesion Migration 3:328-33).
[0004] Varios estudios han revelado que el CCR7 se expresa en una amplia variedad de células tumorales, incluidas, por ejemplo, linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular, linfoma de células B grandes, linfoma asociado al SIDA, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de Burkitt, leucemia linfoblástica aguda de células B, enfermedad de Hodgkin, leucemia/linfoma de células T adultas, micosis fungoides, crisis blástica de síndromes mieloproliferativos crónicos, crisis blástica de síndromes mielodisplásicos, cánceres tales como cáncer de mama, cáncer pulmonar de células no pequeñas, melanoma, cáncer gástrico o carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello y carcinoma de colon como leucemia linfocítica crónica de células B, linfoma no hodgkiniano, célula de cáncer de mama y tumor mamario maligno (WO 2007/003426). Además, está volviéndose claro que el CCR7 juega un papel en la metástasis de los ganglios linfáticos de varios cánceres (Viola y Luster, 2008, Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48:171-97).
[0005] Un anticuerpo monoclonal de ratón de referencia contra el CCR7 humano (MAB197, Clon n.° 150503) está disponible comercialmente de R&D Systems (www. RnDSystems.com).
[0006] La WO 2007/003426 divulga el uso de un anticuerpo que se une a un CCR7 para tratar un cáncer, por el cual las células tumorales expresan CCR7. Se divulga que la unión del anticuerpo a las células tumorales que expresan el CCR7 inhibe la migración de células tumorales y/o mata células tumorales por una o más de entre la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y la inducción de apoptosis.
[0007] La WO 2012/043533 divulga 8 anticuerpos monoclonales de ratón diferentes contra el CCR7 humano que son útiles para tratar la fibrosis o el cáncer. Sin embargo, ninguno de estos anticuerpos tiene una IC50 inferior a 7,4 nM para inhibir la transducción de señales de Ca2+ intracelular.
[0008] La WO 2014/151834 divulga tres anticuerpos humanos anti-CCR7 diferentes generados en un Xenomous™ inmunizado con células que expresan CCR7 humano, así como un anticuerpo anti-CCR7 humano de ratón y la quimerización y la humanización de los mismos. Los anticuerpos humanos anti-CCR7 se unen a un epítopo diferente en el CCR7 humano que el anticuerpo monoclonal de ratón de referencia MAB197. Los anticuerpos se describen por ser útiles para tratar afecciones inflamatorias, afecciones cancerosas, así como afecciones y complicaciones que surgen del trasplante de tejidos u órganos. La WO 2014/151834 divulga además el aislamiento de anticuerpos anti-CCR7 humano de ratón, entre ellos el anticuerpo bloqueante MAb 22, que se quimerizó sustituyendo sus regiones constantes de la cadena pesada por sus equivalentes humanos. Este anticuerpo quimerizado retuvo su capacidad para unirse al CCR7 humano. La cadena ligera de este anticuerpo quimerizado se alteró además para generar una serie de variantes de MAb 22 con cadenas pesadas quimerizadas y cadenas ligeras humanizadas. La WO 2014/151834 no revela cuál, si la hay, de estas variantes de MAb 22 con cadenas ligeras humanizadas ha retenido la capacidad para unirse al CCR7 humano. Hay sin embargo todavía una necesidad en la técnica de anticuerpos anti-CCR7 adicionales y mejorados que sean útiles en la terapia humana.
Resumen de la invención
[0009] En un primer aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti-CCR7 humanizado que comprende las regiones hipervariables HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, donde: HVR-H1 comprende la secuencia: G-F/L-T/A/P-F-S/T/R-N/D/S-Y/F-A; HVR-H2 H1 comprende la secuencia: I-S-S/D-G/R-G-S/T/F-Y/H/F-T/P; HVR-H3 H1 comprende la secuencia: A/T/V/G-R-R/A-A/E/T-Y/G/T-R/V-Y/V-D/*-GTG/*-E/V/D/A/G/*-N/S/D/T-A/S/D-M/L/F-Y/S; HVR-L1 H1 comprende la secuencia: Q/S-D/S-I/L/V-G/S/L-D/S/P/G/N-S/N-7Y/DGKTY; HVR-L2 H1 comprende la secuencia: A/S/T-T/I/V-S; y HVR-L3 H1 comprende la secuencia: L/W/Q-Q-Y/F/G/W-A/T/S-S/N/H-S/F/N-P-L/P/Q-T, donde "*" indica que puede no haber ningún aminoácido en esa posición. El anticuerpo de la invención tiene preferiblemente al menos una de entre: a) una afinidad mínima por el antígeno sintético SYM1899 con la SEQ ID NO: 76 definida por una Kd que sea no más de un factor 10 mayor que la Kd de un anticuerpo anti-CCR7 de ratón del que la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1 y del que la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2; y b) una IC50 de no más de 100 nM para la inhibición de al menos una de entre la señalización intracelular dependiente de CCR7 y la internalización del receptor CCR7, por al menos un ligando de CCR7 seleccionado de entre CCL19 y CCL21.
[0010] En una forma de realización preferida, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo anti-CCR7 humanizado, donde HVR-H1 comprende una de las SEQ ID NOs 3-10; HVR-H2 comprende una de las SEQ ID NOs 11-16; HVR-H3 comprende una de las SEQ ID NOs 17-23; HVR-L1 comprende una de las SEQ ID NOs 24-30; HVR-L2 comprende una de las SEQ ID NOs 31-33; y HVR-L3 comprende una de las SEQ ID NOs 34-39. Más preferiblemente el anticuerpo anti-CCR7 humanizado de la invención comprende HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, donde cada uno, en orden, comprende: (i) las SEQ ID NOs 3, 11, 17, 24, 32 y 34; (ii) las SEQ ID NOs 4, 12, 18, 25, 31 y 35; (iii) las SEQ ID NOs 5, 12, 18, 26, 31 y 35; (iv) las SEQ ID NOs 6, 13, 19, 27, 31 y 36; (v) las SEQ ID NOs 7, 14, 20, 24, 31 y 35; (vi) las SEQ ID NOs 8, 15, 21,28, 31 y 37; (VII) las SEQ ID NOs 9, 16, 22, 29, 33 y 38; o (VIII) las SEQ ID NOs 10, 14, 23, 30, 31 y 39.
[0011] En otra forma de realización preferida, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo anti-CCR7 humanizado, donde el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende 4 regiones marco de la cadena pesada, HFR1 a HFR4, y 3 regiones hipervariables HVR-H1 a HVR-H3 que están operativamente enlazadas en el orden HFR1, HVR-H1, HFR2, HVR-H2, HFR3, HVR-H3 y HFR4, donde el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende 4 regiones marco de la cadena ligera, LFR1 a LFR4, y 3 regiones hipervariables HVR-L1 a HVR-L3 que están operativamente enlazadas en el orden LFR1, HVR-L1, LFR2, HVR-L2, LFR3, HVR-L3 y LFR4, donde las regiones marco de la cadena pesada HFR1 a HFR4 tienen las secuencias de aminoácidos de: i) las SEQ ID NOs: 40, 43, 45 y 48, respectivamente (= las FR de VH1); ii) las SEQ ID NOs: 41,44, 46 y 49, respectivamente (= las FR de VH2); o, iii) las SEQ ID NOs: 42, 44, 47 y 49, respectivamente (= las FR de VH3), y donde las regiones marco de la cadena ligera LFR1 a LFR4 tienen las secuencias de aminoácidos de: iv) las SEQ ID NOs: 50, 52, 55 y 58, respectivamente (= las FR de VL1); o, v) las SEQ ID NOs: 51,53, 56 y 59, respectivamente (= las FR de VL2).
[0012] De nuevo en una forma de realización preferida adicional, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo anti-CCR7 humanizado, donde el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs: 61, 62 y 63 (VH1, 2 o 3), y donde el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs: 64 y 65 (VK1 o 2), donde preferiblemente el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61 y preferiblemente el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64.
[0013] Un anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las formas de realización anteriores de la invención comprende preferiblemente una región constante de la cadena pesada que es una región IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4.
[0014] Un anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las formas de realización anteriores de la invención comprende preferiblemente una región Fc funcional que posee al menos una función efectora seleccionada del grupo consistente en: unión de C1q, citotoxicidad dependiente del complemento; unión de receptor de Fc, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y fagocitosis.
[0015] En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las formas de realización anteriores de la invención.
[0016] En un tercer aspecto, la invención se refiere a: a) un anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las formas de realización anteriores de la invención; o b) una composición farmacéutica que comprende tal anticuerpo; para usar como un medicamento.
[0017] En un cuarto aspecto, la invención se refiere a a) un anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las formas de realización anteriores de la invención; o b) una composición farmacéutica que comprende tal anticuerpo; para usar en el tratamiento de un cáncer, una afección inflamatoria, una afección o complicación que surge del trasplante de tejidos u órganos, o una afección o complicación que surge de la fibrosis o está asociada a la misma. Preferiblemente, en el tratamiento, el cáncer es un cáncer cuyas células tumorales expresan un receptor CCR7, preferiblemente el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular, linfoma de células B grandes, linfoma asociado al SIDA, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de Burkitt, leucemia linfoblástica aguda de células B, enfermedad de Hodgkin, leucemia/linfoma de células T adultas, micosis fungoides, crisis blástica de síndromes mieloproliferativos crónicos, crisis blástica de síndromes mielodisplásicos, cáncer de mama, cáncer pulmonar de células no pequeñas, melanoma, cáncer gástrico, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello y carcinoma de colon. Preferiblemente, en el tratamiento, la afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad inflamatoria intestinal, la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, asma, inflamación alérgica de las vías respiratorias, hiperplasia del músculo liso de las vías respiratorias, enfermedades pulmonares fibróticas, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, aterosclerosis, infección por VIH y SIDA, o donde el trasplante de tejidos u órganos es uno o más de entre trasplante de riñón, de corazón, de piel y de pulmón. Preferiblemente, en el tratamiento, la fibrosis se selecciona del grupo que consiste en fibrosis hepática y cirrosis, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis de la piel, fibrosis cardiovascular, fibrosis gastrointestinal.
[0018] En un quinto aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las formas de realización anteriores de la invención, donde preferiblemente la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de entre el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo, y donde preferiblemente la secuencia de nucleótidos codificante está operativamente enlazada a secuencias reguladoras para la expresión de la secuencia de nucleótidos codificante en una célula huésped.
[0019] En un sexto aspecto, la invención se refiere a una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico según el quinto aspecto.
Descripción de la invención
Definiciones
[0020] El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CCR7 únicos, incluidos anticuerpos neutralizantes, antagonistas, anticuerpos monoclonales en toda su longitud o intactos, composiciones de anticuerpos anti-CCR7 con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos anti-CCR7 monocatenarios y fragmentos de anticuerpos anti-CCR7 (véase a continuación), incluidos fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos de dominio único (sdAbs), siempre que muestren la actividad biológica y/o inmunológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa en la presente de forma intercambiable con anticuerpo. Un anticuerpo puede ser humano y/o humanizado.
[0021] El término "anticuerpo anti-CCR7" o "un anticuerpo que se une a CCR7" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a CCR7 con una afinidad suficiente, de manera que el anticuerpo es útil como un agente diagnóstico y/o terapéutico dirigido contra CCR7. Preferiblemente, la extensión de unión de un anticuerpo anti-CCR7 a una proteína no CCR7 no relacionada es inferior a aproximadamente un 10% de la unión del anticuerpo a CCR7 según se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA) o un ELISA. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que se une a CCR7 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 mM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. En determinadas formas de realización, un anticuerpo anti-CCR7 se une a un epítopo de CCR7 que está conservado entre los CCR7 de diferentes especies.
[0022] Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En formas de realización preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry y, más preferiblemente, más de un 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminales o internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria o (3) hasta la homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos un paso de purificación.
[0023] La unidad de anticuerpo básica de 4 cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional llamado cadena J y, por lo tanto, contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizar para formar agrupaciones polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J). En el caso de las IgG, la unidad de 4 cadenas tiene generalmente aproximadamente 150.000 daltons. Cada cadena L está enlazada a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se enlazan entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L tiene también puentes disulfuro intracatenarios regularmente separados. Cada cadena H tiene en el extremo N-terminal, un dominio variable (Vh) seguido de tres dominios constantes (Ch) para cada una de las cadenas a y y y cuatro dominios Ch para los isotipos |j y £. Cada cadena L tiene en el extremo N-terminal, un dominio variable (Vl) seguido de un dominio constante (Cl) en su otro extremo. La Vl está alineada con la Vh y la Cl está alineada con el primer dominio constante de la cadena pesada (Ch1). Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. El emparejamiento de una Vh y una Vl forma un único sitio de unión a antígeno. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6.
[0024] La cadena L de cualquier especie de vertebrado se puede asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (Ch), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, 5, £, y y j , respectivamente. Las clases y y a están divididas además en subclases basándose en diferencias relativamente menores en la secuencia Ch y la función, por ejemplo, los seres humanos expresan las subclases siguientes: IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
[0025] La "región variable" o el "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena ligera o pesada del anticuerpo. Se puede hacer referencia al dominio variable de la cadena pesada como "Vh". Se puede hacer referencia al dominio variable de la cadena ligera como "Vl". Estos dominios son generalmente las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.
[0026] El término "variable" se refiere al hecho de que determinados segmentos de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre anticuerpos. El dominio V media la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye equitativamente a través de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. En lugar de eso, las regiones V consisten en extensiones relativamente invariables llamadas regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema llamadas "regiones hipervariables" (HVR) que tienen cada una 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas nativas comprende cada uno cuatro FR, adoptando en gran medida una configuración de hoja p, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas muy próximas entre sí por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que presentan varias funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
[0027] Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de unión a antígeno, así como un dominio CL y al menos los dominios constantes de la cadena pesada, Ch1, Ch2 y Ch3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa humana) o una variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.
[0028] Un "anticuerpo desnudo" para los fines de la presente es un anticuerpo que no está conjugado a una fracción citotóxica o radiomarcador.
[0029] Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión a antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véase la patente de EE.UU. n.° 5,641,870, ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. En una forma de realización, un fragmento de un anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, así, retiene la capacidad para unirse al antígeno.
[0030] La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad para cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L entera junto con el dominio de región variable de la cadena H (Vh) y el primer dominio constante de una cadena pesada (Ch1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un único fragmento F(ab')2 grande que corresponde a aproximadamente dos fragmentos Fab enlazados con disulfuro que tienen una actividad de unión a antígeno bivalente y sigue siendo capaz de reticularse con el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab porque tienen unos pocos residuos adicionales en el extremo carboxilo del dominio Ch1, incluidas una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para un Fab' donde el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente fueron producidos como pares de los fragmentos Fab', que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
[0031] El fragmento Fc comprende las partes de carboxilo terminal de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos están determinadas por las secuencias de la región Fc, región que es también la parte reconocida por los receptores de Fc (FcR) hallados en determinados tipos de células.
[0032] "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie Fv monocatenaria (scFv), un dominio de región variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera se pueden enlazar de manera covalente mediante un conector peptídico flexible de manera que las cadenas ligeras y pesadas puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie Fv bicatenaria. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de las cadenas H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácidos para la unión a antígeno y confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad inferior que el sitio de unión entero.
[0033] "Fv monocatenario", también abreviado como "sFv" o "scFv", son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo Vh y Vl conectados en una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido sFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs.
269-315 (1994).
[0034] El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se pueden sintetizar sin contaminar con otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como que se requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención se pueden preparar por la metodología de hibridoma descrita por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden producirse usando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, eucariotas animales o vegetales (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
[0035] Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen anticuerpos "quiméricos" donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada (véase la patente de EE.UU. n.° 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominios variables derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.), y secuencias de regiones constantes humanas.
[0036] Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano con la especificidad, la afinidad y la capacidad del anticuerpo deseadas. En algunos casos, unos pocos residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá típicamente dos dominios variables, donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994).
[0037] El término "región hipervariable", "HVR", cuando se usa en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable de un anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos que son responsables de la unión a antígeno. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en la VH (HI, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). Están en uso y se abarcan en la presente una serie de delineaciones de regiones hipervariables. Los regiones hipervariables generalmente comprenden residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50- 56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL, y alrededor de aproximadamente 31-35 (HI), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la VH cuando se numeran conforme al sistema de numeración de Kabat; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL, y 26-32 (HI), 52-56 (H2) y 95-101 (H3) en la VH cuando se numeran conforme al sistema de numeración de Chothia; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable"/CDR (por ejemplo, los residuos 27-38 (L1), 56-65 (L2) y 105-120 (l3) en la VL, y 27-38 (H1), 56-65 (H2) y 105-120 (H3) en la VH cuando se numeran conforme al sistema de numeración IMGT; Lefranc, M. P. et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M. et al. Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000)). Opcionalmente el anticuerpo tiene inserciones simétricas en uno o más de los siguientes puntos 28, 36 (L1), 63, 74-75 (L2) y 123 (L3) en la VL, y 28, 36 (H1), 63, 74-75 (H2) y 123 (H3) en la VH cuando se numeran conforme a Honneger, A. y Plunkthun, A. J. (Mol. Biol. 309:657-670 (2001)). Las regiones hipervariables/CDR de los anticuerpos de la invención se definen y se numeran preferiblemente conforme al sistema de numeración IMGT.
[0038] Los residuos "marco" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos a los residuos de la región hipervariable definidos en la presente.
[0039] Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben sustancial 0 completamente la actividad biológica del antígeno.
[0040] Un "anticuerpo agonista", como se utiliza en la presente, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.
[0041] Un "anticuerpo dependiente de la especie", por ejemplo, un anticuerpo anti-IgE humana de mamíferos, es un anticuerpo que tiene una afinidad de unión más fuerte por un antígeno de una primera especie de mamífero que la que tiene por un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie "se une específicamente" a un antígeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10-7 M, preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-8 M y más preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-9 M), pero tiene una afinidad de unión por un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humano que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser de cualquiera de los varios tipos de anticuerpos definidos anteriormente, pero es preferiblemente un anticuerpo humanizado o humano.
[0042] La "afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza del total de la suma de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se utiliza en la presente, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y puede generalmente representarse por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir por métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad de unión se conoce en la técnica, cualquiera de los cuales se puede usar para los fines de la presente invención. Formas de realización ilustrativas específicas se describen a continuación.
[0043] Una "Kd" o un "valor Kd" se puede medir usando ensayos de resonancia de plasmón de superficie usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado con -10-50 unidades de respuesta (RU). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, a 5 jg/m l (-0 ,2 j M) antes de la inyección con una velocidad de flujo de 5 jl/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta 1M de etanolamina para bloquear grupos que no han reaccionado. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie dobles del anticuerpo o Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05%
Tween 20 (PBST) a 25°C con una velocidad de flujo de aproximadamente 25 jl/m in. Las velocidades de asociación
(kon) y las velocidades de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (versión 3.2 del BIAcore Evaluation Software) ajustando simultáneamente el sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kf/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la constante de asociación excede 106 M-1 S-1 por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la constante de asociación se puede determinar usando una técnica de extinción de fluorescencia que mide el aumento o la reducción de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja de agitación.
[0044] Una "constante de asociación" o "velocidad de asociación" o "kon" según esta invención puede también determinarse con la misma técnica de resonancia de plasmón de superficie anteriormente descrita usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) como se ha descrito anteriormente.
[0045] Un anticuerpo "que se une a" un antígeno de interés, por ejemplo una diana antigénica de CCR7 polipeptídica asociada a tumores, es uno que se une al antígeno con afinidad suficiente, de manera que el anticuerpo es útil como un agente terapéutico que se dirige contra una célula o un tejido que expresa el antígeno, y no tiene reactividad cruzada significativa con otras proteínas. En tales formas de realización, la extensión de la unión del anticuerpo a una proteína "no diana" será menos de aproximadamente un 10% de la unión del anticuerpo a su proteína diana particular determinada por análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA). Con respecto a la unión de un anticuerpo a una molécula diana, el término "unión específica" o "se une específicamente" o es "específica para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular significa una unión que es sensiblemente diferente de una interacción no específica. Una unión específica se puede medir, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, que es generalmente una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, una unión específica se puede determinar por competencia con una molécula de control que sea similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, se indica una unión específica si la unión de la diana marcada a una sonda es inhibida competitivamente por la diana no marcada en exceso. El término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específica para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular como se utiliza en la presente puede ser mostrado, por ejemplo, por una molécula con una Kd para la diana (que se puede determinar como se ha descrito anteriormente) de al menos aproximadamente 10-4 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-5 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-6 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-7 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-8 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-9 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-10 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-11 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-12 M o superior. En una forma de realización, el término "unión específica" se refiere a una unión donde una molécula se une a un polipéptido particular o epítopo en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo polipeptídico.
[0046] El término "epítopo" es la porción de una molécula a la que se une una proteína de unión a antígeno, por ejemplo un anticuerpo. El término incluye cualquier determinante capaz de unirse específicamente a una proteína
de unión a antígeno, tal como un anticuerpo o a un receptor de células T. Un epítopo puede ser contiguo o no contiguo (por ejemplo, en un polipéptido, los residuos de aminoácidos que no son contiguos entre sí en la secuencia polipeptídica pero a los que, en el contexto de la molécula, se une la proteína de unión a antígeno). En determinadas formas de realización, los epítopos pueden ser miméticos en cuanto a que comprenden una estructura tridimensional que es similar a un epítopo usado para generar la proteína de unión a antígeno, pero no comprenden ninguno o comprenden solo algunos de los residuos de aminoácidos en ese epítopo usado para generar la proteína de unión a antígeno. La mayoría de las veces, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otros tipos de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes de epítopos pueden incluir grupos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo, sulfonilo o sulfato, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
[0047] Las "funciones efectoras" de los anticuerpos se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de las funciones efectoras de los anticuerpos incluyen: unión de C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión de receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B.
[0048] El término "región Fc" en la presente se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluidas las regiones Fc de secuencia nativa y las regiones Fc variantes. Aunque los bordes de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina puede variar, la región Fc de una cadena pesada de una IgG humana se define normalmente como que se extiende desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta su extremo carboxilo. La lisina C-terminal (residuo 447 según el sistema de numeración EU) de la región Fc puede ser eliminada, por ejemplo, durante la producción o la purificación del anticuerpo, o por ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin ningún residuo K447 eliminado y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.
[0049] Una "región Fc funcional" posee una "función efectora" de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen unión de C1q; CDC; unión de receptor de Fc; ADCC; fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras requieren generalmente que la región Fc esté combinada con un dominio de unión (por ejemplo un dominio variable de un anticuerpo) y se puede evaluar usando varios ensayos como se describe, por ejemplo, en las definiciones en la presente.
[0050] Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc hallada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de IgG 1 humana de secuencia nativa (alotipos A y no A); región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa, así como variantes de origen natural de las mismas.
[0051] Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, preferiblemente una o más sustitución/sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o a la región Fc de un polipéptido precursor, por ejemplo de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido precursor. La región Fc variante en la presente poseerá preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido precursor, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de homología con la misma, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de homología con la misma.
[0052] La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad donde las Ig secretadas unidas a receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que lleva un antígeno y maten posteriormente a la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son absolutamente requeridos para tal muerte. Las principales células para la mediación de la ADCC, las células NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para valorar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de EE.UU. n.° 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al. (EE.UU.) 95:652-656 (1998).
[0053] "Receptor de Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa de FcR humano. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluidas las variantes alélicas y las formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los FcyRII receptores incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión M. en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluidos los que se identificarán en el futuro, están abarcados por el término "FcR" en la presente. El término incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
[0054] La unión a un FcRn humano in vivo y la vida media en suero de polipéptidos de unión de alta afinidad a FcRn humano se pueden evaluar, por ejemplo, en ratones transgénicos o en líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se les administran los polipéptidos con una región Fc variante. La WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos con una unión mejorada o disminuida a los FcR. Véase también, por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
[0055] Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos FcyRIII y realizan una función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de la sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (Nk ), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, de las que se prefieren las PBMC y las células NK. Las células efectoras se pueden aislar a partir de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre.
[0056] La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia de complemento. La activación de la vía del complemento tradicional se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antígeno cognado. Para valorar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Variantes de anticuerpos con secuencias de aminoácidos de la región Fc alteradas (anticuerpos con una región Fc variante) y la capacidad de unión de C1q aumentada o disminuida se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6,194,551 B1 y la WO 1999/51642. Véase también, por ejemplo, Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). Una tal sustitución que aumenta la unión de C1q, y, así, aumenta la actividad CDC, es la sustitución E333A, que puede aplicarse ventajosamente en los anticuerpos de la invención.
[0057] El término "anticuerpo que comprende una región Fc" se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fc. La lisina C-terminal (residuo 447 según el sistema de numeración EU) de la región Fc puede ser eliminada, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o por ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Por consiguiente, una composición que comprende un anticuerpo con una región Fc según esta invención puede comprender un anticuerpo con K447, con todos los K447 eliminados o una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.
[0058] La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" se puede determinar por alineamiento de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos usando algoritmos de alineamiento global o local, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineamiento global (por ejemplo, Needleman y Wunsch), que alinea las secuencias óptimamente a lo largo de toda la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineamiento local (por ejemplo, Smith Waterman). Se puede entonces hacer referencia a las secuencias como "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando ellas (cuando se alinean óptimamente mediante, por ejemplo, los programas GAP o BESTFIT usando los parámetros por defecto) comparten al menos un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define a continuación). GAP usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias a lo largo de toda su longitud (longitud total), maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de espacios. Un alineamiento global se usa adecuadamente para determinar la identidad de secuencia cuando las dos secuencias tienen longitudes similares. Generalmente, se utilizan los parámetros por defecto de GAP, con una penalización de creación de espacios = 50 (nucleótidos)/8 (proteínas) y una penalización por extensión de espacios = 3 (nucleótidos)/2 (proteínas). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación por defecto es nwsgapdna y, para las proteínas, la matriz de puntuación por defecto es Blosum62 (Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Los alineamientos de secuencias y las puntuaciones para el porcentaje de identidad de secuencia se pueden determinar usando programas de ordenador, tales como el GCG Wisconsin Package, versión 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 EE.UU., o usando software de código abierto, como el programa "needle" (usando el algoritmo global de Needleman Wunsch) o "water" (usando el algoritmo local de Smith Waterman) en EmbossWIN versión 2.10.0, usando los mismos parámetros que se han dado anteriormente para GAP o usando los ajustes por defecto (tanto para 'needle' como para 'water' y tanto para alineamientos de ADN como para los de proteínas, la penalización por apertura de espacios por defecto es 10,0 y la penalización por extensión de espacios por defecto es 0,5; las matrices de puntuación por defecto son Blossum62 para las proteínas y DNAFull para el ADN). Cuando las secuencias tienen longitudes en general sustancialmente diferentes, se prefieren los alineamientos locales, tales como los que se usan con el algoritmo de Smith Waterman. Alternativamente, la similitud o identidad en porcentaje se puede determinar buscando contra las bases de datos públicas, usando algoritmos tales como FASTA, BLAST, etc.
[0059] Una vez que dos secuencias de aminoácidos se alinean usando cualquiera de los programas de alineamiento anteriores, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (lo que puede alternativamente expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de residuos de aminoácidos marcados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias en el alineamiento de ese programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A.
[0060] Un "constructo de ácido nucleico" o "vector de ácido nucleico" se entiende en la presente con el significado de una molécula de ácido nucleico artificial resultante del uso de la tecnología del ADN recombinante. El término "constructo de ácido nucleico" por lo tanto no incluye moléculas de ácido nucleico de origen natural, aunque un constructo de ácido nucleico puede comprender (partes de) moléculas de ácido nucleico de origen natural. Los términos "vector de expresión" o "constructo de expresión" se refieren a secuencias de nucleótidos que son capaces de efectuar la expresión de un gen en células huésped u organismos huésped compatible con tales secuencias. Estos vectores de expresión típicamente incluyen por lo menos secuencias reguladoras de transcripción adecuadas y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción 3'. También pueden estar presentes factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, tal como elementos potenciadores de la expresión. El vector de expresión se introducirá en una célula huésped adecuada y será capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificante en un cultivo celular in vitro de la célula huésped. El vector de expresión será adecuado para la replicación en la célula huésped u organismo de la invención.
[0061] Como se utiliza en la presente, el término "promotor" o "secuencia reguladora de la transcripción" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de una o más secuencias codificantes, y está localizado aguas arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia codificante, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para una ARN-polimerasa dependiente del ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluidos, pero de forma no limitativa, sitios de unión de factores de transcripción, sitios de unión de proteínas represoras y activadoras y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por una persona experta en la técnica porque actúa directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de tejidos bajo la mayoría de condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado fisiológicamente o mediante el desarrollo, por ejemplo por la aplicación de un inductor químico.
[0062] Como se utiliza en la presente, el término "operativamente enlazado" se refiere a un enlace de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia reguladora de transcripción está operativamente enlazada a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Operativamente enlazado significa que las secuencias de ADN que se enlazan son típicamente contiguas y, cuando sea necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en marco de lectura.
Descripción detallada de la invención
Anticuerpos anti-CCR7 de la invención
[0063] En un primer aspecto, la invención proporciona proteínas de unión a antígeno que se unen a CCR7. Una proteína de unión a antígeno de la invención que se une a CCR7 es preferiblemente un anticuerpo anti-CCR7 en el sentido más amplio tal y como se ha definido en la presente anteriormente, incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-CCR7, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos, muteínas de anticuerpos y variantes de anticuerpos. Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención es preferiblemente un anticuerpo aislado. Preferiblemente, un anticuerpo anti-CCR7 de la invención se une a un CCR7 de primate, más preferiblemente a un CCR7 humano. Una secuencia de aminoácidos de CCR7 humano está disponible en GenBank: EAW60669.1 (SEQ ID NO: 75). Los aminoácidos 1 a 24 de esta secuencia comprenden el péptido señal de translocación de membrana, que se escinde durante la expresión. Los aminoácidos 25 a 59 del CCR7 humano componen el dominio extracelular N-terminal, este dominio comprende residuos de tirosina sulfatada en las posiciones Y32 e Y41. Se conocen varias variantes alélicas para el CCR7 humano con una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia en GenBank: EAW60669.1. "CCR7 humano" en la presente invención incluye estas variantes alélicas, al menos en la medida en que las variantes tienen un dominio extracelular y la función de CCR7.
[0064] Preferiblemente, un anticuerpo anti-CCR7 de la invención se une específicamente al dominio extracelular N-terminal de un CCR7, preferiblemente un CCR7 humano. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención se une específicamente a un epítopo que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos "ZxLFE", donde Z es una tirosina sulfatada y x puede ser cualquier aminoácido y F se puede sustituir por un aminoácido hidrofóbico. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención se une así específicamente a un epítopo que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos "ZTLFE" en las posiciones 41 a 45 en el dominio extracelular N-terminal del CCR7 humano. El anticuerpo es preferiblemente específico para CCR7 humano.
[0065] Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención tiene preferiblemente una afinidad mínima por un CCR7 humano o por un antígeno sintético que comprende el epítopo "ZTLFE", preferiblemente por el antígeno sintético SYM1899 como se describe en los ejemplos en la presente. Preferiblemente, por lo tanto, el anticuerpo anti-CCR7 de la invención tiene una Kd de 1 x 10-8 M, 5 x 10-9 M, 2 x 10-9 M, 1,8 x 10-9 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M o 1 x 10-11 M o menos. Alternativamente, la afinidad mínima del anticuerpo se define por referencia a la Kd de un anticuerpo anti-CCR7 de referencia cuando se evalúa en el mismo ensayo. Así, preferiblemente un anticuerpo anti-CCR7 de la invención tiene una Kd para un CCR7 humano o para un antígeno sintético que comprende el epítopo "ZTLFE" (preferiblemente el antígeno sintético SYM1899 como se describe en los ejemplos en la presente) que no es más de un factor 10, 5, 2, 1,5, 1,2, 1,1 o 1,05 superior a la Kd de un anticuerpo anti-CCR7 de referencia para el antígeno, por lo cual el anticuerpo anti-CCR7 de referencia es un anticuerpo anti-CCR7 de ratón del cual la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1 y del cual la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2. Se entiende en la presente que un anticuerpo con una Kd que sea no más de un factor 10 veces mayor que la Kd de una referencia es un anticuerpo que tiene una afinidad que no es menor que un factor 10 inferior a la afinidad del anticuerpo de referencia. Así, si el anticuerpo de referencia tiene una Kd de 1 x 10-9 M, el anticuerpo en cuestión tiene una Kd de 1 x 10-8 M o menos.
[0066] Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención se une preferiblemente a un CCR7 humano o a un antígeno sintético que comprende el epítopo “ZTLFE” (preferiblemente el antígeno sintético SYM1899 como se describe en los ejemplos en la presente; SEQ ID NO: 76) con una constante de velocidad koff máxima. Preferiblemente, por lo tanto, el anticuerpo anti-CCR7 de la invención tiene una constante de velocidad koff que es 1 x 10-3, 1 x 10-4 o 1 x10-5 s-1 o menos. Alternativamente, la constante de velocidad koff máxima del anticuerpo se define por referencia a la constante de velocidad koff de un anticuerpo anti-CCR7 de referencia cuando se evalúa en el mismo ensayo. Así, preferiblemente un anticuerpo anti-CCR7 de la invención se une a un CCR7 humano o a un antígeno sintético que comprende el epítopo “ZTLFE” (preferiblemente el antígeno sintético SYM1899 como se describe en los ejemplos en la presente) que no es más de un factor 10, 5, 2, 1,5, 1,2, 1,1 o 1,05 superior a la constante de velocidad koff de un anticuerpo anti-CCR7 de referencia para el antígeno, por lo cual el anticuerpo anti-CCR7 de referencia es un anticuerpo anti-CCR7 de ratón del cual la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1 y del cual la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2.
[0067] Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención es preferiblemente un anticuerpo neutralizante que inhibe la señalización intracelular dependiente de CCR7 y/o la internalización del receptor CCR7 por al menos un ligando de CCR7 seleccionado de CCL19 y CCL21. Un anticuerpo anti-CCR7 tiene preferiblemente una IC50 que no es superior a 150, 100, 80, 50, 30, 25, 20, 15, 10, 5 o 3 nM para inhibir la señalización intracelular dependiente de CCR7 y/o la internalización del receptor CCR7 por al menos un ligando de CCR7 seleccionado de CCL19 y CCL21, como puede determinarse, por ejemplo, en un ensayo como se describe en los ejemplos en la presente. Alternativamente, la IC50 máxima del anticuerpo se define por referencia a la IC50 de un anticuerpo anti-CCR7 de referencia cuando se evalúa en el mismo ensayo. Así, preferiblemente un anticuerpo anti-CCR7 de la invención tiene una IC50 que no es más de un factor 10, 5, 2, 1,5, 1,2, 1,1 o 1,05 superior a la IC50 de un anticuerpo anti-CCR7 de referencia, por lo cual el anticuerpo anti-CCR7 de referencia es un anticuerpo anti-CCR7 de ratón del cual la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1 y del cual la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2.
[0068] Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención inhibe preferiblemente la señalización intracelular dependiente de CCR7 como se ha descrito anteriormente, sin efectos agonistas sustanciales, más preferiblemente sin efectos agonistas detectables, como pueden, por ejemplo, determinarse en un ensayo como se describe en los ejemplos en la presente.
[0069] Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención comprende preferiblemente las regiones hipervariables HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, donde:
HVR-H1 comprende la secuencia: G-F/L-T/A/P-F-S/T/R-N/D/S-Y/F-A;
HVR-H2 H1 comprende la secuencia: I-S-S/D-G/R-G-S/T/F-Y/H/F-T/P;
HVR-H3 H1 comprende la secuencia: A/T/V/G-R-R/A-A/E/T-Y/G/T-R/V-Y/V-D/*-GTG/*-E/V/D/A/G/*-N/S/D/T-A/S/D-M/L/F-Y/S;
HVR-L1 H1 comprende la secuencia: Q/S-D/S-I/L/V-G/S/L-D/S/P/G/N-S/N-7Y/DGKTY;
HVR-L2 H1 comprende la secuencia: A/S/T-T/I/V-S; y
HVR-L3 H1 comprende la secuencia: L/W/Q-Q-Y/F/G/W-A/T/S-S/N/H-S/F/N-P-L/P/Q-T, donde "*" indica que puede no haber ningún aminoácido en esa posición.
[0070] Más preferiblemente, un anticuerpo anti-CCR7 de la invención es un anticuerpo donde:
HVR-H1 comprende una de las SEQ ID NOs 3-10; HVR-H2 comprende una de las SEQ ID NOs 11-16; HVR-H3 comprende una de las SEQ ID NOs 17-23; HVR-L1 comprende una de las SEQ ID NOs 24-30; HVR-L2 comprende una de las SEQ ID NOs 31-33; y HVR-L3 comprende una de las SEQ ID NOs 34-39.
[0071] Más preferiblemente, un anticuerpo anti-CCR7 de la invención comprende HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, donde cada una, en orden, comprende: (i) las SEQ ID NOs 3, 11, 17, 24, 32 y 34; (ii) las SEQ ID NOs 4, 12, 18, 25, 31 y 35; (iii) las SEQ ID NOs 5, 12, 18, 26, 31 y 35; (iv) las SEQ ID NOs 6, 13, 19, 27, 31 y 36; (v) las SEQ ID NOs 7, 14, 20, 24, 31 y 35; (vi) las SEQ ID NOs 8, 15, 21,28, 31 y 37; (VII) las SEQ ID NOs 9, 16, 22, 29, 33 y 38; o (VIII) las SEQ ID NOs 10, 14, 23, 30, 31 y 39.
[0072] Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención puede ser un anticuerpo de ratón o un anticuerpo quimérico, por ejemplo, ratón-humano. Sin embargo, preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo humanizado según la invención provoca preferiblemente de poca a ninguna respuesta inmunogénica contra el anticuerpo en un sujeto al que se le administra el anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado según la invención provoca y/o se espera que provoque una respuesta de anticuerpo humano anti-ratón (HAMA) con un nivel sustancialmente reducido en comparación con el anticuerpo de ratón original, por ejemplo, que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y la 2 en un sujeto huésped. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado provoca y/o se espera que provoque una respuesta mínima o ninguna respuesta de anticuerpo humano anti-ratón (HAMA). Más preferiblemente, un anticuerpo de la invención provoca una respuesta de anticuerpo anti-ratón que está en un nivel aceptable clínicamente o es menor que dicho nivel.
[0073] Se conocen en la técnica varios métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es humana. A menudo se hace referencia a estos residuos de aminoácidos no humanos como residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y sus compañeros (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), sustituyendo secuencias de regiones hipervariables por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. n.° 4,816,567), donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos típicamente humanos donde algunos residuos de las regiones hipervariables y posiblemente algunos residuos de las FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
[0074] La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se van a usar para hacer los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que está más próxima a la del roedor se acepta entonces como el marco humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., 1993, J. Immunol.
151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol. 196:901). Otro método usa un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas pesadas o ligeras. El mismo marco se puede usar para diferentes anticuerpos humanizados (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623).
[0075] Es importante además que los anticuerpos se humanicen con retención de una alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un método, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias precursoras y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para las personas expertas en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas representaciones permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de la FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación de modo que se consiga la característica de anticuerpo deseada, tal como una afinidad aumentada por lo(s) antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región hipervariable están implicados directamente y más sustancialmente en la influencia sobre la unión a antígeno.
[0076] Para la elección de las regiones marco de dominio variable humanas preferidas, tanto ligeras como pesadas, usadas para producir los anticuerpos humanizados preferidos de la invención, se buscaron bases de datos en línea de secuencias de IgG humanas para la comparación con los dominios VH murinos del anticuerpo 729 usando algoritmos de búsqueda de BLAST. Se seleccionaron dominios variables humanos candidatos de los 200 mejores resultados de BLAST. Estos se redujeron a tres candidatos basándose en una combinación de homología de marco, manteniendo los residuos de marco claves y la estructura de bucles canónica.
[0077] Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención es preferiblemente un anticuerpo donde el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende 4 regiones marco de la cadena pesada, HFR1 a HFR4, y 3 regiones hipervariables HVR-H1 a HVR-H3 que están operativamente enlazadas en el orden HFR1, HVR-H1, HFR2, HVR-H2, HFR3, HVR-H3 y HFR4, y donde el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende 4 regiones marco de la cadena ligera, LFR1 a LFR4, y 3 regiones hipervariables HVR-L1 a HVR-L3 que están operativamente enlazadas en el orden LFR1, HVR-L1, Lf R2, HVR-L2, l Fr 3, HVR-L3 y LFR4. Preferiblemente, las regiones marco de la cadena pesada HFR1 a HFR4 en un anticuerpo de la invención tienen las secuencias de aminoácidos de: i) las SEQ ID NOs: 40, 43, 45 y 48, respectivamente (es decir, las FR de VH1); ii) las SEQ ID NOs: 41, 44, 46 y 49, respectivamente (es decir, las FR de VH2); o iii) las SEQ ID NOs: 42, 44, 47 y 49, respectivamente (es decir, las FR de VH3). Preferiblemente, las regiones marco de la cadena ligera LFR1 a LFR4 en un anticuerpo de la invención tienen las secuencias de aminoácidos de: iv) las SEQ ID NOs: 50, 52, 55 y 58, respectivamente (es decir, las FR de VL1); o v) las SEQ ID NOs: 51, 53, 56 y 59, respectivamente (es decir, las FR de VL2).
[0078] Preferiblemente en un anticuerpo anti-CCR7 de la invención, donde el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs: 61, 62 y 63 (VH1, 2 o 3), más preferiblemente el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 61.
[0079] Preferiblemente, en un anticuerpo anti-CCR7 de la invención, el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs: 64 y 65 (VK1 o 2), más preferiblemente el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 64.
[0080] Un anticuerpo anti-CCR7 particularmente preferido de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61 (es decir, el dominio variable VH1), y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64 (es decir, el dominio variable VK1).
[0081] Se contempla(n) una modificación/modificaciones de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CCR7 de la invención. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan por introducción de los cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico que codifica el anticuerpo o por síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos del antagonista. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace para conseguir el constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales del antagonista, tal como el cambio del número o la posición de los sitios de glicosilación.
[0082] Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos con cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un antagonista con un residuo metionilo N-terminal o el antagonista fusionado con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula antagonista incluyen la fusión al extremo N o C del antagonista de una enzima o un polipéptido que aumente la vida media en suero del antagonista.
[0083] Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. En estas variantes se sustituye al menos un residuo de aminoácido en la molécula antagonista por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución de antagonistas de anticuerpos incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de las FR.
[0084] Otro tipo de variante de aminoácidos del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del antagonista. Por alterar se entiende eliminar una o más fracciones de carbohidrato halladas en el antagonista y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el antagonista. La glicosilación de polipéptidos es típicamente o con enlace N o con enlace O. Con enlace N se refiere a la fijación de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación con enlace O se refiere a la fijación de uno de los monosacáridos o derivados de monosacáridos N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más frecuentemente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación con enlace N). La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación con enlace O). Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero de forma no limitativa, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis de "casete" de una variante preparada antes o una versión no variante del antagonista.
[0085] En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-CCR7 de la invención comprende una región constante de anticuerpo de la cadena ligera y/o una de la cadena pesada. Se puede usar cualquier región constante de un anticuerpo conocida en la técnica. La región constante de la cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de la cadena ligera de tipo kappa o lambda, por ejemplo, una región constante de la cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de la cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu humana. Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención puede tener así regiones constantes de cualquier isotipo, es decir, incluidas regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, así como regiones constantes de IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una forma de realización, la región constante de la cadena pesada o ligera es un fragmento, derivado, variante o muteína de una región constante de origen natural. Se conocen técnicas para derivar un anticuerpo de una subclase o un isotipo diferente a partir de un anticuerpo de interés, es decir, un cambio de subclase. Así, anticuerpos IgG se pueden derivar de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo precursor), pero también presentan propiedades biológicas asociadas al isotipo o la subclase de un anticuerpo diferente del anticuerpo precursor. Se pueden emplear técnicas de ADN recombinante. Se puede emplear ADN clonado codificante de polipéptidos de anticuerpo particulares en tales procedimientos, por ejemplo, ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase también Lantto et al. (2002, Methods Mol. Biol.178:303-16). Por consiguiente, los anticuerpos anti-CCR7 de la invención incluyen aquellos que comprenden, por ejemplo, una o más de las secuencias de dominio variable descritas en la presente y que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE e IgD), así como fragmentos Fab o F(ab')2 de los mismos. Además, si se desea una IgG4, también se puede desear introducir una mutación puntual (CPSCP -> CPPCP) en la región bisagra como se describe en Bloom et al. (1997, Protein Science 6:407) para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro intra-cadena H que puede conducir a la heterogeneidad en los anticuerpos IgG4.
[0086] Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención comprende preferiblemente una región Fc funcional que posee al menos una función efectora seleccionada del grupo que consiste en: unión de C1q, citotoxicidad dependiente del complemento; unión de receptor de Fc, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y fagocitosis.
[0087] Un anticuerpo anti-CCR7 de la invención se puede modificar para mejorar la función efectora, por ejemplo para mejorar la ADCC y/o la CDC del anticuerpo. Esto se puede conseguir mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc de un anticuerpo. Una sustitución preferida en la región Fc de un anticuerpo de la invención es una sustitución que aumenta la unión de C1q, y, así, aumenta la actividad CDC, tal como se describe, por ejemplo, en Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). Una sustitución preferida en la región Fc que aumenta la unión de C1q es la sustitución E333A.
[0088] Los grupos glicosilo añadidos al esqueleto de aminoácidos de las glicoproteínas, por ejemplo los anticuerpos, están formados por varios monosacáridos o derivados de monosacáridos que dan como resultado una composición que puede ser diferente en el mismo anticuerpo producido en células de diferentes mamíferos o tejidos. Además, se ha demostrado que la diferente composición de los grupos glicosilo puede afectar a la potencia en la mediación de la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Por lo tanto, es posible mejorar esas propiedades por medio del estudio del patrón de glicosilación de anticuerpos de diferentes fuentes. Un ejemplo de tal método es Niwa et al. (2004, Cancer Res, 64(6):2127-33).
[0089] Alternativa o adicionalmente, se puede(n) introducir residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una muerte celular mediada por el complemento y una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) aumentadas. Véanse Caron et al. (1992, J. Exp Med.
176:1191-1195) y Shopes (1992, Immunol. 148:2918-2922). También se pueden preparar anticuerpos homodiméricos con una actividad antitumoral mejorada usando agentes reticulantes heterobifuncionales como se describe en Wolff et al. (1993, Cancer Research 53:2560-2565). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y, así, puedan tener una lisis de complemento y capacidades de ADCC mejoradas. Véase Stevenson et al. (1989, Anti-Cancer Drug Design 3:2 19-230). Para aumentar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de un anticuerpo) como se describe en la US 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG.
[0090] Un anticuerpo anti-CCR7 preferido de la invención comprende una región constante de la cadena pesada del alotipo humano G1m17,1 (véase Jefferis y Lefranc (2009) MAbs Vol. 1 Número 4, págs 1-7), esta región constante de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO.: 79. Más preferiblemente, la región constante de la cadena pesada del alotipo humano G1m17,1 en el anticuerpo de la invención comprende una sustitución E333A, esta región constante de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 80.
[0091] La radioterapia o quimioterapia citotóxica del cáncer está limitada por efectos secundarios graves, a veces con peligro de muerte, que surgen de toxicidades para las células normales sensibles porque las terapias no son selectivas para las células malignas. Una estrategia para evitar estos problemas es acoplar el agente terapéutico a anticuerpos tales como los anticuerpos anti-CCR7 de la invención. Esto aumenta la exposición de las células malignas, y reduce la exposición de las células normales, a los tratamientos dirigidos a ligandos. Véase Allen, Nature, 2: 750-763 (2002). El agente terapéutico puede ser un agente inmunosupresor, es decir, una sustancia que actúa para suprimir o enmascarar el sistema inmunitario del mamífero que está siendo tratado en este caso. Esto incluiría sustancias que suprimen la producción de citocinas, reducen o suprimen la expresión de autoantígenos o enmascaran los antígenos del MHC. El agente terapéutico también puede ser un agente citotóxico, es decir, una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. El término se destina a incluir isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos, es decir, compuestos químicos útiles en el tratamiento del cáncer, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos. El agente terapéutico también puede ser una citocina, una hormona, un factor de crecimiento, un factor de necrosis, es decir, una proteína o un péptido liberados por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares o incluso en la misma población celular. Como se utiliza en la presente, el término citocina incluye proteínas y péptidos de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa. El agente terapéutico también puede ser un profármaco que se refiere a una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco primario y es capaz de ser activada o convertida enzimáticamente en la forma primaria más activa. Conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña.
[0092] En una forma de realización preferida de la invención, el anticuerpo anti-CCR7 de la invención se conjuga con una o más moléculas de toxina. Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, la cadena A de una exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, sarcina alfa, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAP1, PAP11 y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
[0093] La presente invención contempla además un anticuerpo conjugado con un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa; DNasa) u otro compuesto capaz de dañar una estructura celular u orgánulo y, por lo tanto, matar o disminuir la vitalidad de la célula.
[0094] Los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar con un agente de activación de profármaco que convierte un profármaco en un fármaco anticanceroso activo. El componente agente de tales conjugados incluye cualquier agente capaz de actuar sobre un profármaco de manera que lo convierta en su forma más activa y citotóxica.
[0095] Alternativamente, se pueden construir proteínas de fusión que comprendan al menos la región de unión a antígeno de un anticuerpo anti-CCR7 de la invención enlazado a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608).
[0096] Se pueden preparar conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales o conectores. El conector puede ser un "conector escindible" que facilite la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se pueden usar un conector lábil al ácido, un conector sensible a peptidasas, un conector de dimetilo o un conector que contiene bisulfuro. Alternativamente, se puede producir una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y el agente citotóxico, por ejemplo por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos.
Producción y purificación de los anticuerpos de la invención
[0097] Se pueden preparar anticuerpos anti-CCR7 de la invención por cualquier número de técnicas convencionales. Usualmente se producirán en sistemas de expresión recombinante, usando cualquier técnica conocida en la técnica. Véanse, por ejemplo, Shukla y Thommes (2010, "Recent advances in large-scale production of monoclonal antibodies and related proteins", Trends in Biotechnol. 28(5):253-261), Harlow y Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, y Sambrook y Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Cualquier sistema de expresión conocido en la técnica se puede usar para producir los polipéptidos recombinantes de la invención. En general, las células huésped son transformadas con un vector de expresión recombinante que comprende ADN que codifica un polipéptido deseado.
[0098] En un aspecto, por lo tanto, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-CCR7 de la invención. Una secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que comprende al menos el dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CCR7 de la invención, otra secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que comprende al menos el dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR7 de la invención. Una molécula de ácido nucleico preferida es un vector de expresión donde las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de anticuerpos de la invención están operativamente enlazados a secuencias reguladoras de la expresión, tales como, por ejemplo, un promotor y una secuencia señal. Las secuencias señal preferidas para la expresión de los polipéptidos de anticuerpos anti-CCR7 de la invención incluyen, por ejemplo, el péptido señal de la cadena pesada:
MGWTLVFLFLLSVTAGVHS (SEQ ID NO: 77) y el péptido señal de la cadena ligera: MVSSAQFLGLLLLCFQGTRC (SEQ ID NO: 78).
[0099] En otro aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende una molécula de ácido nucleico tal como se ha definido anteriormente en esta sección. La célula es preferiblemente una célula aislada o una célula cultivada. Entre las células huésped que se pueden emplear hay procariotas, levadura o células eucarióticas superiores. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo E. coli o bacilos. Las células eucarióticas superiores incluyen células de insecto y líneas celulares establecidas de origen de mamífero.
Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea celular de riñón de mono COS-7 (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células 293, células C127, células 3T3, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, líneas celulares BHK y la línea celular CVI/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CVI como describen McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821. Los vectores de clonación y expresión apropiados para el uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamíferos son descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985).
[0100] Las células transformadas se pueden cultivar en condiciones que promueven la expresión del polipéptido. Así, en un aspecto, la invención se refiere a un método para la producción de un anticuerpo anti-CCR7 de la invención, donde el método comprende el paso de cultivo de una célula que comprende al menos un vector de expresión tal y como se define en la presente, en condiciones propicias para la expresión del polipéptido y, opcionalmente, la recuperación del polipéptido.
[0101] Se puede recuperar un anticuerpo anti-CCR7 de la invención por procedimientos convencionales de purificación de proteínas, incluidos, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, proteína A-Sefarosa, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad (véanse por ejemplo Low et al., 2007, J. Chromatography B, 848:48-63; Shukla et al., 2007, J. Chromatography B, 848:28-39), incluidas, por ejemplo, la cromatografía de afinidad usando ligandos de CaptureSelect™ que ofrecen una solución única de purificación por afinidad basada en fragmentos de anticuerpos derivados de camélidos de dominio único (VHH) (véase, por ejemplo, Eifler et al., 2014. Biotechnology Progress DOI:10.1002/btpr.1958). Los polipéptidos contemplados para el uso en la presente incluyen polipéptidos de anticuerpo anti-CCR7 recombinantes sustancialmente homogéneos sustancialmente libres de materiales endógenos contaminantes.
Composiciones que comprenden los anticuerpos de la invención
[0102] En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CCR7 de la invención, es decir, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un receptor CCR7, o un derivado farmacéuticamente o profármaco del mismo, junto con un adyuvante, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable, para la administración a un sujeto. Dicha composición farmacéutica se puede usar en los métodos de tratamiento descritos en la presente a continuación por administración de una cantidad eficaz de la composición a un sujeto que la necesita. El término "sujeto", como se utiliza en la presente, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no está restringido a, primates y seres humanos. El sujeto es preferiblemente un ser humano macho o hembra de cualquier edad o raza.
[0103] El término "portador farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en la presente, se destina a incluir cualquier y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica (véase, por ejemplo, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", Rowe et al eds. 7a edición, 2012, www.farmpress.com). El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y las concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluidos ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como octadecildimetilbencil cloruro de amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; parabenos de alquilo tal como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (p Eg ).
[0104] Los anticuerpos de la invención pueden estar en la misma formulación o se pueden administrar en formulaciones diferentes. La administración puede ser concurrente o secuencial, y puede ser eficaz en cualquier orden.
[0105] Compuestos activos suplementarios también pueden incorporarse en la composición farmacéutica de la invención. Así, en una forma de realización particular, la composición farmacéutica de la invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se vean negativamente afectados entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente quimioterapéutico, una citocina, un agente analgésico o un agente inmunomodulador, por ejemplo un agente inmunosupresor o un agente inmunoestimulante.
La cantidad eficaz de tales otros agentes activos depende, entre otras cosas, de la cantidad de anticuerpo de la invención presente en la composición farmacéutica, el tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, etc.
[0106] En una forma de realización, el anticuerpo de la invención se prepara con portadores que protegerán dicho compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluidos implantes y sistemas de administración microencapsulados, por ejemplo liposomas. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tal como etilvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para las personas expertas en la técnica. Las suspensiones liposómicas, incluidos los liposomas dirigidos, también pueden usarse como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos por las personas expertas en la técnica, por ejemplo, como se describe en la U.S. 4,522,811, WO2010/095940.
[0107] La vía de administración del anticuerpo (o fragmento del mismo) de la invención puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término "parenteral" como se utiliza en la presente incluye la administración intravenosa, intraarterial, intralinfática, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Se prefieren las formas intravenosas de administración parenteral. Por "administración sistémica" se entiende administración oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. La cantidad de un anticuerpo requerida para el efecto terapéutico o profiláctico variará, por supuesto, con el anticuerpo elegido, la naturaleza y la gravedad de la afección que se esté tratando y el paciente. Además, el anticuerpo puede administrarse adecuadamente mediante infusión por pulsos, por ejemplo, con dosis descendentes del anticuerpo. Preferiblemente, la dosificación se da mediante inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.
[0108] Así, en una forma de realización particular, la composición farmacéutica de la invención puede estar en una forma adecuada para la administración parenteral, tal como soluciones, suspensiones o productos liofilizados estériles en la forma de dosificación unitaria apropiada. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones acuosas (si son hidrosolubles) o dispersiones estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, CremophorEM (BASF, Parsippany, N.J.) o suero salino tamponado con fosfato (PBS). En cualquier caso, la composición debe ser estéril y debería ser fluida en la medida en que existe una inyectabilidad fácil. Debe ser estable en las condiciones de producción y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, un poliol farmacéuticamente aceptable como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y mezclas derivadas adecuadas. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. Se puede conseguir la prevención de la acción de los microorganismos mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición.
[0109] La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
[0110] Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (por ejemplo, un polipéptido o anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con un ingrediente o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de una esterilización con filtro. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que produce un polvo de la sustancia activa más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución del mismo previamente sometida a filtración esterilizante.
[0111] En una forma de realización particular, dicha composición farmacéutica se administra por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC). Se pueden usar excipientes adecuados, tales como agentes de carga, agentes tampón o surfactantes. Las formulaciones mencionadas se prepararán usando métodos estándar para preparar composiciones administrables parentalmente como es bien conocido en la técnica y descritos con más detalle en varias fuentes, incluida, por ejemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (Ed. Allen, L. V. 22a edición, 2012, www.pharmpress.com).
[0112] Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas, es decir, las composiciones parenterales, en una forma unitaria de dosificación para que sea más fácil su administración y uniforme su dosificación. La forma unitaria de dosificación como se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a ser tratado; cada unidad con una cantidad predeterminada de compuesto activo (anticuerpo de la invención) calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada por, y depende directamente de, las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se quieren conseguir y las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de los individuos.
[0113] Generalmente una cantidad administrada eficaz de un anticuerpo de la invención dependerá de la eficacia relativa del compuesto elegido, la gravedad del trastorno que está siendo tratado y el peso del enfermo. Sin embargo, los compuestos activos se administrarán típicamente una vez o más veces al día, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 veces al día, con dosis totales típicas diarias en el rango de 0,001 a 1.000 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/día, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 a 10 mg/kg de peso corporal/día.
[0114] Aparte de la administración de anticuerpos al paciente, la presente solicitud contempla la administración de anticuerpos por terapia génica. La WO96/07321 se refiere al uso de terapia génica para generar anticuerpos intracelulares.
[0115] Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un contenedor, paquete o dispensador junto con instrucciones para la administración.
[0116] Los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden usar con otros fármacos para proporcionar una terapia combinatoria. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o proporcionarse como una composición separada para la administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
Uso de los anticuerpos de la invención
[0117] Los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la invención serán útiles en el tratamiento de un amplio rango de enfermedades, afecciones e indicaciones. Los ejemplos de tipos de enfermedades que se pueden tratar incluyen afecciones cancerosas, afecciones inflamatorias, afecciones y complicaciones que surgen del trasplante de tejidos u órganos, así como afecciones y complicaciones que surgen de la fibrosis o están asociadas a la misma.
[0118] Los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse adecuadamente para tratar trastornos o enfermedades asociados a cánceres, especialmente, para tratar cánceres, donde dichos cánceres están caracterizados por células tumorales que expresan un receptor CCR7, más específicamente, para matar o inducir la apoptosis de las células tumorales que expresan un receptor CCR7. Los cánceres ilustrativos, no limitativos, cuyas células tumorales expresan un receptor CCR7 susceptibles de ser tratados según la invención incluyen leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular, linfoma de células B grandes, linfoma asociado al SIDA, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de Burkitt, leucemia linfoblástica aguda de células B, enfermedad de Hodgkin, leucemia/linfoma de células T adultas, micosis fungoides, crisis blástica de síndromes mieloproliferativos crónicos, crisis blástica de síndromes mielodisplásicos, cáncer de mama, cáncer pulmonar de células no pequeñas, melanoma, cáncer gástrico o carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello y carcinoma de colon. En una forma de realización preferida, los cánceres susceptibles de ser tratados según la invención incluyen cáncer de mama, cáncer pulmonar de células no pequeñas, melanoma, cáncer gástrico o carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello y carcinoma de colon. En una forma de realización más preferida, los cánceres susceptibles de ser tratados según la invención incluyen linfoma folicular, leucemia/linfoma de células T adultas, linfoma de Burkitt, crisis blástica de síndromes mieloproliferativos crónicos y crisis blástica de síndromes mielodisplásicos. En una forma de realización todavía más preferida, los cánceres que van a ser tratados según la invención incluyen CLL y MCL.
[0119] En una forma de realización particular, el anticuerpo de la invención se puede combinar con otros tratamientos de las afecciones médicas descritas en la presente, por ejemplo, quimioterapia, terapia de radiación, inmunoterapia o método quirúrgico, incluidos agentes alquilantes, antimetabolitos, antihormonas, tratamientos para varios síntomas, por ejemplo, analgésicos, diuréticos, antidiuréticos, antivirales, antibióticos, citocinas, suplementos nutricionales, tratamientos para la anemia, tratamientos para la coagulación de la sangre, tratamientos para los huesos, tratamientos psiquiátricos y psicológicos, y similares.
[0120] Se puede cosechar médula ósea o células madre de la sangre periférica de dicho paciente después del tratamiento con anticuerpo anti-CCR7 para efectuar un trasplante autólogo de médula ósea o células madre.
[0121] También puede ser útil tratar a los pacientes con citocinas para aumentar la expresión de CCR7 u otra proteína diana en la superficie de células B cancerosas antes de la administración de un anticuerpo de la invención. Las citocinas también se pueden administrar simultáneamente con la administración del anticuerpo que se está agotando o el anticuerpo radiomarcado para estimular las funciones inmunitarias efectoras o antes o después de la misma.
[0122] En una forma de realización, se pueden usar regímenes quimioterapéuticos para complementar las terapias descritas en la presente, y se pueden administrar simultánea o consecutivamente en cualquier orden con la administración de dicho anticuerpo radiomarcado. El régimen de quimioterapia se puede seleccionar del grupo que consiste en CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina (también llamada hidroxil daunorrubicina), vincristina (también llamada oncovin) y prednisona), ICE (idarrubicina, citarabina y etopósido), mitozantrona, citarabina, DVP (daunorrubicina, vincristina y prednisona), ATRA (ácido todo-trans-retinoico), idarrubicina, régimen de quimioterapia de Hoelzer, régimen de quimioterapia La, ABVD (bleomicina, dacarbazina, doxorrubicina y vincristina), CEOP (ciclofosfamida, epirrubicina, vincristina y prednisolona), 2-CdA (2-clorodesoxiadenosina), FLAG e IDA (fludarabina, citarabina, filgrastim e idarrubicina), (con o sin posterior tratamiento con G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos)), VAD (vincristina, doxorrubicina y dexametasona), M y P (melfalán y prednisona), C (ciclofosfamida)-semanalmente, ABCM (adriamicina, bleomicina, ciclofosfamida y mitomicina C), MOPP (mecloretamina, vincristina, prednisona y procarbazina) y DHAP (dexametasona, citarabina y cisplatina). Un régimen quimioterapéutico preferido es CHOP.
[0123] Así, en otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para tratar un cáncer, específicamente un cáncer cuyas células tumorales expresan un receptor CCR7, y dicho método comprende la administración a un sujeto que necesita dicho tratamiento de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención, es decir, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al receptor CCR7, o una composición farmacéutica de la invención. En una forma de realización particular, dicho cáncer es un cáncer caracterizado por células tumorales que expresan un receptor CCR7. Los cánceres ilustrativos, no limitativos, que van a ser tratados según la invención incluyen CLL, MCL, linfoma folicular, linfoma de células B grandes, linfoma asociado al SIDA, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de Burkitt, leucemia linfoblástica aguda de células B, enfermedad de Hodgkin, leucemia/linfoma de células T adultas, micosis fungoides, crisis blástica de síndromes mieloproliferativos crónicos, crisis blástica de síndromes mielodisplásicos, cáncer de mama, cáncer pulmonar de células no pequeñas, melanoma, cáncer gástrico o carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello y carcinoma de colon. En una forma de realización preferida, los cánceres que van a ser tratados según la invención incluyen cáncer de mama, cáncer pulmonar de células no pequeñas, melanoma, cáncer gástrico o carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello y carcinoma de colon. En una forma de realización más preferida, los cánceres que van a ser tratados según la invención incluyen linfoma folicular, leucemia/linfoma de células T adultas, linfoma de Burkitt, crisis blástica de síndromes mieloproliferativos crónicos y crisis blástica de síndromes mielodisplásicos. En una forma de realización todavía más preferida, los cánceres que van a ser tratados según la invención incluyen CLL y MCL.
[0124] En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para matar o para inducir la apoptosis de células tumorales que expresan un receptor CCR7 que comprende poner en contacto dichas células con un anticuerpo de la invención, es decir, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un receptor CCR7. En una forma de realización particular, dichas células tumorales son células tumorales que expresan un receptor CCR7, tal como células de CLL y MCL.
[0125] Un anticuerpo que "inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan un polipéptido de CCR7" o un anticuerpo "inhibitorio del crecimiento" es uno que da lugar a una inhibición del crecimiento medible de las células cancerosas que expresan o sobreexpresan el polipéptido apropiado. El polipéptido de CCR7 es un polipéptido transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa. Los anticuerpos anti-CCR7 inhibitorios del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de las células tumorales que expresan CCR7 en más de un 20%, preferiblemente de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 50%, e incluso más preferiblemente, en más de un 50% (por ejemplo, de aproximadamente un 50% a aproximadamente el 100%) en comparación con el control apropiado, donde el control consiste típicamente en células tumorales no tratadas con el anticuerpo que se está evaluando. En una forma de realización, la inhibición del crecimiento se puede medir con una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,1 a 30 mg/ml o aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en cultivo celular, donde la inhibición del crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. La inhibición del crecimiento de las células tumorales in vivo se puede determinar de varias maneras, tal como se describe en la EP2474557B1 para células tumorales que expresan CCR7. El anticuerpo es inhibitorio del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-CCR7 a aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da lugar a la reducción del tamaño tumoral o de la proliferación de células tumorales dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, preferiblemente dentro de aproximadamente 5 a 30 días.
[0126] Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es uno que induce la muerte celular programada determinada por la unión de la anexina V, la fragmentación del ADN, la contracción celular, la dilatación del retículo endoplásmico, la fragmentación celular y/o la formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos apoptóticos). La célula es normalmente una que sobreexpresa un polipéptido de CCR7. Preferiblemente la célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula hematopoyética, tal como una célula B, una célula T, un basófilo, un eosinófilo, un neutrófilo, un monocito, una plaqueta o un eritrocito. Varios métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados a la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidilserina (PS) se puede medir por unión de anexina; la fragmentación del ADN se puede evaluar a través de la fragmentación en escalera (laddering) del ADN; y la condensación nuclear/de la cromatina junto con la fragmentación del ADN se pueden evaluar por cualquier aumento en las células hipodiploides. Preferiblemente, el anticuerpo que induce la apoptosis es uno que da lugar a aproximadamente 2 a 50 veces, preferiblemente aproximadamente 5 a 50 veces, y más preferiblemente aproximadamente 10 a 50 veces, la inducción de la unión de la anexina con respecto a células no tratadas en un ensayo de unión de anexina.
[0127] Un anticuerpo que "induce la muerte celular" es uno que hace que una célula viable se vuelva no viable. La célula es una que expresa un polipéptido de CCR7 y es de un tipo celular que específicamente expresa o sobreexpresa un polipéptido de CCR7. La célula puede consistir en células cancerosas o normales del tipo celular particular. El polipéptido de CCR7 puede ser un polipéptido transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido que es producido y segregado por una célula cancerosa. La célula puede ser una célula cancerosa, por ejemplo, una célula B o una célula T. La muerte celular in vitro se puede determinar en ausencia de complemento y células efectoras inmunitarias para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad dependiente del complemento (ADCC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CDC). Así, el ensayo para la muerte celular se puede realizar usando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunitarias. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular, se puede evaluar la pérdida de integridad de la membrana evaluada por absorción de yoduro de propidio (PI), azul de tripán (véase Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) o 7AAD respecto a células no tratadas. Los anticuerpos inductores de la muerte celular preferidos son aquellos que inducen la absorción de PI en el ensayo de absorción de PI en las células BT474.
[0128] Se ha mencionado previamente información sobre células tumorales que expresan un receptor CCR7 susceptibles de ser tratadas con los métodos, anticuerpos, regímenes de administración y dosificaciones de la invención. En una forma de realización particular, las células tumorales que expresan un receptor CCR7 susceptibles de ser tratadas con los métodos mencionados anteriormente son células de CLL o MCL.
[0129] En todos los casos, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad eficaz en el tratamiento del cáncer, como se ha definido previamente; dicha cantidad puede ser una cantidad suficiente para efectuar una respuesta deseada, o para mejorar un síntoma o signo, por ejemplo, de la metástasis o de la progresión, el tamaño o el crecimiento del tumor primario. Una cantidad terapéuticamente eficaz para un sujeto particular puede variar dependiendo de factores como la afección que está siendo tratada, la salud general del sujeto, el método, la vía y la dosificación de administración y la gravedad de los efectos secundarios. Preferiblemente, el efecto dará lugar a un cambio en la cuantificación de al menos aproximadamente un 10%, preferiblemente al menos un 20%, 30%, 50%, 70% o incluso un 90% o más. Cuando se da en combinación, una cantidad terapéuticamente eficaz está en proporción con una combinación de componentes y el efecto no se limita a los componentes individuales solos. Una cantidad terapéuticamente eficaz modulará los síntomas típicamente en al menos aproximadamente un 10%; normalmente en al menos aproximadamente un 20%; preferiblemente al menos aproximadamente un 30%; o más preferiblemente al menos aproximadamente un 50%. Alternativamente, la modulación de la migración significará que se ve afectada la migración o el tráfico de varios tipos celulares. Eso dará lugar a, por ejemplo, cambios estadísticamente significativos y cuantificables en los números de células que se ven afectadas. Esto puede ser una reducción en los números de células diana que son atraídas dentro de un periodo de tiempo o área diana. La velocidad de progresión, el tamaño, la diseminación o el crecimiento del tumor primario también pueden examinarse.
[0130] Los anticuerpos anti-CCR7 y las composiciones de la invención que comprenden tales anticuerpos también pueden usarse para tratar afecciones inflamatorias y afecciones y complicaciones que surgen del trasplante de tejidos u órganos.
[0131] La actividad del CCR7 está implicada en enfermedades intestinales inflamatorias (EII) tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La enfermedad de Crohn es una enfermedad intestinal inflamatoria crónica debilitante que se piensa que refleja una respuesta inmunitaria mediada por Th1 demasiado activa a la flora del intestino. Las lesiones de la enfermedad de Crohn pueden aparecer en cualquier sitio del intestino y ocasionalmente en otros lugares del tracto gastrointestinal. Las lesiones de la colitis ulcerosa, por otro lado, aparecen normalmente en el colon. La naturaleza de las lesiones es también diferente, pero las enfermedades son lo suficientemente similares para que sea a veces difícil distinguirlas clínicamente. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 6,558,661. Los anticuerpos y las composiciones descritos en la presente se pueden usar para tratar pacientes con EII y/o reducir, prevenir o eliminar uno o más síntomas o complicaciones de una EII.
[0132] La inhibición de la actividad del CCR7 ha sido implicada en el rechazo de los trasplantes de tejido u órganos (Lo et al.,25 2011, Transplantation 91:70-77; Liu et al., 2011, Eur J Immunol 41:611-23; Yuling et al., Am J Transplant 8:1401-12). Los anticuerpos y las composiciones descritos en la presente se pueden usar para tratar a los receptores de trasplantes de tejidos u órganos, por ejemplo, receptores de trasplantes de riñón, de corazón, de piel o de pulmón, y/o reducir, prevenir o eliminar una o más complicaciones de la cirugía de un trasplante.
[0133] La actividad del CCR7 ha sido implicada en el asma, la inflamación alérgica de las vías respiratorias, la hiperplasia del músculo liso de las vías respiratorias y las enfermedades pulmonares fibróticas (Gomperts et al., 2007, J Leukoc Biol. 82:449-56; Kawakami et al., 2012, Cell Immunol 2575:24-32; Saunders et al., 2009, Clin Exp Allergy 39:1684-92). Los anticuerpos y las composiciones descritos en la presente se pueden usar para tratar pacientes con asma, inflamación alérgica de las vías respiratorias, hiperplasia del músculo liso de las vías respiratorias o enfermedades pulmonares fibróticas, y/o para reducir, prevenir o eliminar uno o más síntomas o complicaciones de estas enfermedades.
[0134] La actividad del CCR7 ha sido implicada en la artritis reumatoide (Moschovakis et al., 2012, Eur J Immunol.
42:1949-55). Los anticuerpos y las composiciones descritos en la presente se pueden usar para tratar pacientes con artritis reumatoide, y/o para reducir, prevenir o eliminar uno o más síntomas o complicaciones de la artritis reumatoide.
[0135] La actividad del CCR7 ha sido implicada en la esclerosis múltiple (Aung et al., 2010, J Neuroimmunol.
226:158-64). Los anticuerpos y las composiciones descritos en la presente se pueden usar para tratar pacientes con esclerosis múltiple, y/o para reducir, prevenir o eliminar uno o más síntomas o complicaciones de la esclerosis múltiple.
[0136] La actividad del CCR7 ha sido implicada en la psoriasis (Fan et al., 2008, Indian J Dermatol Venereol Leprol.
74(5):550; Bosé et al., 2013, Am J Pathol, 183(2):413-421). Los anticuerpos y las composiciones descritos en la presente se pueden usar para tratar pacientes con psoriasis, y/o para reducir, prevenir o eliminar uno o más síntomas o complicaciones de la psoriasis.
[0137] La actividad del CCR7 ha sido implicada en la aterosclerosis (Luchtefeld et al., 2010, Circulation 10 122:1621-28). Los anticuerpos y las composiciones descritos en la presente se pueden usar para tratar pacientes con aterosclerosis, y/o para reducir, prevenir o eliminar uno o más síntomas o complicaciones de la aterosclerosis.
[0138] La actividad del CCR7 ha sido implicada en la infección por VIH (Evans et al., 2012, Cytokine Growth Factor Rev. 23:151-57). Los anticuerpos y las composiciones descritos en la presente se pueden usar para tratar pacientes infectados con VIH, incluidos los pacientes que tienen SIDA, o los pacientes con riesgo de contraer el VIH o de desarrollar SIDA, y/o para reducir, prevenir o eliminar uno o más síntomas o complicaciones del VIH o el SIDA.
[0139] Los anticuerpos anti-CCR7 de la invención y las composiciones que comprenden tales anticuerpos pueden usarse además para la terapia de la fibrosis, preferiblemente la fibrosis de tejido. Un ejemplo de la fibrosis de tejido incluye una fibrosis seleccionada del grupo que consiste en fibrosis hepática, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis de la piel, fibrosis cardiovascular, fibrosis gastrointestinal y otras enfermedades fibrosas. Un ejemplo de la fibrosis hepática incluye una fibrosis hepática seleccionada del grupo que consiste en cirrosis hepática, reperfusión isquémica, trastorno postrasplante hepático, hepatitis necrótica, hepatitis B, hepatitis C, cirrosis biliar primaria y colangitis esclerosante primaria. En cuanto a la cirrosis hepática, se menciona una causada por al menos una seleccionada del grupo consistente en inducción por alcohol, inducción por un fármaco e inducción química. Un ejemplo de la fibrosis renal incluye una fibrosis renal seleccionada del grupo que consiste en glomerulonefritis proliferativa, glomerulonefritis esclerótica, dermopatía fibrosante nefrogénica, nefropatía diabética, fibrosis intersticial del túbulo renal y glomeruloesclerosis segmentaria focal. Un ejemplo de la fibrosis pulmonar incluye una fibrosis pulmonar seleccionada del grupo que consiste en fibrosis intersticial pulmonar, sarcoidosis inducida por fármacos, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de lesión alveolar pulmonar difusa, hipertensión pulmonar y displasia broncopulmonar neonatal. Un ejemplo de la fibrosis de la piel incluye una fibrosis de la piel seleccionada del grupo que consiste en esclerodermia, cicatrización queloide, psoriasis, cicatrización hipertrófica y pseudoesclerodermia. Un ejemplo de la fibrosis cardiovascular incluye una fibrosis cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en aterosclerosis, reestenosis coronaria, miocardiopatía congestiva, insuficiencia cardíaca, trasplante cardíaco y fibrosis de miocardio. Un ejemplo de la fibrosis gastrointestinal incluye una fibrosis gastrointestinal seleccionada del grupo que consiste en colitis colagenosa, atrofia vellosa, hiperplasia de las criptas, formación de pólipos, fibrosis de la enfermedad de Crohn, curación de úlceras gástricas y cicatriz posterior a una cirugía de adhesión abdominal. La fibrosis puede tener una afección que surge de una enfermedad fibrosante relativa al hueso y puede ser la formación de pannus reumatoide.
[0140] Cualquiera de los métodos terapéuticos mencionados antes descritos anteriormente se pueden aplicar a cualquier sujeto que necesite tal terapia, incluidos, por ejemplo, mamíferos, preferiblemente primates, y más preferiblemente, seres humanos.
[0141] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para referirse a que se incluyen los artículos que siguen a la palabra, pero los artículos no específicamente mencionados no se excluyen. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "una" o "un" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno del elemento, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "una" o "un" significa por tanto normalmente "al menos uno/a".
[0142] Los ejemplos siguientes se ofrecen solo para uso ilustrativo y no se destinan a limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.
Descripción de las figuras
[0143]
Figura 1. Mapeo del epítopo de (a) mAbs murino 729 y (b) mAb humanizado 650 (la versión humanizada del mAb 729). Ambos anticuerpos reconocen el mismo epítopo lineal situado en el extremo N-terminal del CCR7 humano (Z = Tyr sulfatada).
Figura 2. El efecto agonista de la unión de ligandos (a: CCL19; b: CCL21) sobre la migración de células T humanas de linfoma es inhibido por el mAb anti-CCR7 murino 730 (IC50: 15 nM y 6 nM respectivamente).
Figura 3. Evaluado en un ensayo de CDC, a las células T humanas vírgenes normales no las mata el tratamiento con mAb anti-CCR7 humano 729-2A (triángulo), ni el Rituxan (RTX; cuadrado), ni el Campath (CAMP; círculo). Se incluyó IgG2A (diamante) como control negativo.
Figura 4. Ensayo de CDC. A las células tumorales de pacientes con CLL refractaria a CD20 las mata el mAb anti-CCR7 humano murino 729-2A (729-2A; triángulo), pero no el control negativo IgG2A (diamante).
Figura 5. Los mAbs anti-CCR7 humanizados (1*1 = HC1 LC1, 2*1 = HC2 LC1 y 3.1 = HC3 LC1) y el mAb anti-CCR7 humano quimérico (Fab de ratón/Fc humano, 0*0 = HC0 LC0) indujeron la lisis de los linfocitos leucémicos. Controles positivos: mAbs Alemtuzumab (ALEM) y Rituxan (RTX) y control negativo: IGG1. El ensayo de ADCC (n=2) fue ejecutado con una proporción de células efectoras/células diana (células de CLL) 5:1 (barras gris claro) y 10:1 (barras gris oscuro).
Figura 6. Inhibición de la internalización del receptor CCR7 inducida por CCL19 por el mAb anti-CCR7 humanizado 650 determinada por un ensayo de internalización activa (PathHunterTM, DiscoverX, Fremont, CA, EE.UU.). La concentración de mAb 650 (pg/ml) se representa en el eje x frente a la inhibición de la internalización del CCR7 inducida por CCL19 (% de inhibición) en el eje y.
Figura 7. Inhibición de la señalización intracelular dependiente de CCR7 inducida por CCL19 de la vía de la P-arrestina por el mAb anti-CCR7 humanizado 650 determinada por un ensayo de reclutamiento de P-arrestina establecido (PathHunterTM, DiscoverX, Fremont, CA, EE.UU.). La concentración de mAb 650 (pg/ml) se representa en el eje x frente a la inhibición del reclutamiento de P-arrestina inducido por CCL19 (% de inhibición) en el eje y.
Figura 8. Inhibición de la señalización de cAMP intracelular dependiente de CCR7 inducida por CCL19 por mAb anti-CCR7 humanizado 650 determinada por un ensayo de la vía del mensajero secundario cAMP establecido (PathHunterTM, DiscoverX, Fremont, CA, EE.UU.). La concentración de mAb 650 (pg/ml) se representa en el eje x frente a la inhibición de la vía del mensajero secundario cAMP de CCR7 inducida por CCL19 (% de inhibición) en el eje y.
Ejemplos
1. Generación de mAbs anti-CCR7 de ratón
[0144] Ratones normales (es decir, ratones con un sistema inmunitario murino) fueron inmunizados con antígenos que comprenden o expresan secuencias de aminoácidos del dominio extracelular N-terminal del CCR7 humano. Los anticuerpos monoclonales de ratón se obtuvieron usando tecnología de hibridoma estándar.
[0145] Los intentos iniciales usando antígenos carentes de sulfatación en la Y41 del dominio N-terminal del CCR7 produjeron anticuerpos que no consiguieron neutralizar la señalización de CCR7 dependiente de CCL19 o CCL21. La inmunización con antígenos que comprenden sulfatación en la Y41 produjo una serie de anticuerpos monoclonales de ratón que fueron capaces de neutralizar la señalización de CCR7 dependiente de CCL19 o CCL21. Se determinaron las secuencias para ocho anticuerpos monoclonales anti-CCR7 humano de ratón seleccionados. Las secuencias de aminoácidos de las regiones hipervariables de estos ocho anticuerpos monoclonales se enumeran en la tabla 1.
[0146] La secuencia de aminoácidos de los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo de ratón 729 se dan en las SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente.
Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de las regiones hipervariables de ocho anticuerpos monoclonales anti-CCR7 humano de ratón seleccionados.
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2. Evaluación de mAbs anti-CCR7 de ratón
2.1 Mapeo de epítopo
[0147] El mapeo de epítopos de anticuerpos monoclonales (figura 1) se realizó según protocolos previamente publicados (Slootstra et al., 1996 Mol Divers, 1:87-96; Timmerman et al., 2007, J Mol Recognit, 20:283-99). De forma breve: la unión del anticuerpo a cada péptido se evalúa en un PEPSCAN basado en un ELISA. Las matrices de péptidos se incuban con una solución de anticuerpo primario, por ejemplo consistente en 1 mg/ml diluido en solución de bloqueo (4% de suero de caballo, 5% (p/v) de ovoalbúmina en PBS/1% Tween). Después de lavar, los péptidos se incuban con una dilución de factor 1000 de conjugado de peroxidasa y anticuerpo durante una hora a 25° C. Después de lavar, se añadió la solución de sustrato de peroxidasa (0,5 mg/ml de sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 0,006% de H2O2 en 0,05 M de tampón de citrato a pH 4). Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente, se midió el desarrollo de color. El desarrollo de color se cuantificó con una cámara de dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) y un sistema de procesamiento de imagen.
2.2 Los mAbs Anti-CCR7 inhiben la señalización intracelular dependiente de CCR7
[0148] Los anticuerpos monoclonales anti-CCR7 obtenidos (tabla 2) inhiben la señalización intracelular mediada por CCL19 y CCL21 en las células de ovario de hámster chino (CHO) que sobreexpresan CCR7 humano, según se determina por un ensayo de reclutamiento de p-arrestina estándar establecido (PathHunter™, DiscoverX, Fremont, CA, Ee .UU.; Southern et al., 2013, J Biomol Screen. 18(5):599-609).
Tabla 2: Inhibición de la señalización intracelular mediada por CCL19 y CCL21 en células de ovario de hámster chino (CHO) que sobreexpresan CCR7 humano determinada por un ensayo de reclutamiento de p-arrestina.
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2.3 El mAb anti-CCR7 inhibe la migración celular
[0149] El mAb murino 730 inhibe la migración (quimiotaxis) de células T humanas de linfoma, que expresan endógenamente el receptor CCR7 humano, inducida por los ligandos CCL19 y CCL21, con una IC50 de 15 nM y 6 nM, respectivamente (figura 2).
[0150] Se realizaron ensayos de migración celular usando cámaras dobles Transwell con insertos de 8 |_im de tamaño de los poros (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.). La cámara inferior contenía el ligando (CCL19 o CCL21) diluido en medio HamF12 complementado con BSA al 0,5%. Las células con expresión endógena de CCR7 (células T de linfoma (HuT-78), preincubadas con anticuerpos monoclonales anti-CCR7, se colocaron en el inserto y el ensamblaje de cámara se incubó a 37°C. La cantidad de células migradas por la transmembrana a la cámara inferior se determinó, después de la lisis celular, por tinción de ADN (solución de tinción CyQuant GR, Life Technologies Ltd, Reino Unido).
2.4 El mAb anti-CCR7 bloquea la señalización de CCR7 sin efectos agonistas
[0151] Evaluados a altas concentraciones (267 nM), ninguno de los anticuerpos monoclonales de unión anti-CCR7 humano murinos enumerados en la tabla 2 anterior, incluidos los mAb 729 y 730, indujeron efectos agonistas intracelulares detectables en células de ovario de hámster chino (CHO), que sobreexpresan CCR7 humano, según se determina por un ensayo de reclutamiento de p-arrestina estándar establecido (PathHunter™, DiscoverX, Fremont, CA, Ee .UU.; Southern et al., 2013, J Biomol Screen. 18(5):599-609) (datos no mostrados). Se usó IgG2a como control negativo, y CCL21, un ligando natural para CCR7, se usó como control positivo.
2.5 Mediciones de afinidad
2.5.1 Medición de afinidad de Biacore
[0152] Las afinidades de los anticuerpos monoclonales identificados se determinaron por mediciones de Biacore en condiciones estándar. El anticuerpo monoclonal fue inmovilizado en una superficie sensora apropiada y la solución del antígeno sulfatado SYM1899 ((piroGlu)DEVTDDZIGDNTTVDZTLFESLCSKKDVRNK; SEQ ID NO: 76); donde Z denota una tirosina sulfatada) que comprende los residuos 19-49 derivados del extremo N-terminal del CCR7 humano, se hizo pasar sobre la superficie sensora. El valor de afinidad obtenido (Kd) del mAb murino 729 para SYM1899 fue 0,7 nM.
2.5.2 Medición de afinidad por citometría de flujo
[0153] Células CHO que expresan CCR7 humano (106 células/ml) se preincubaron a 4°C durante 24 horas con los mAbs murinos 726-735 en una serie de dilución de factor 3 (rango 20 nM-0,11 pM). La cantidad de anticuerpo unido se determinó tiñendo con anticuerpo específico de ratón secundario marcado con ficoeritrina (PE) y la detección posterior, por citometría de flujo. Los valores EC50 (tabla 3) se determinaron a partir de las curvas de unión sigmoideas al 50% de los valores mínimos y máximos de la meseta.
Tabla 3: Valores de afinidad (EC50) de los mAbs murinos anti-CCR7 humano para las células CHO que expresan hCCR7, determinados por citometría de flujo.
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2.6 El mAb anti-CCR7 es seguro en células normales
[0154] En ensayos de CDC, las células T humanas vírgenes normales (figura 3) son seguras para el tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-CCR7 mAb 729-2A, en concentraciones eficaces (rango 33-0,5 nM). Los ensayos de CDC se realizaron como se describe en Cuesta-Mateos et al. (2015, Cancer Immunol Immunother. DOI: 10.1007/s00262-015-1670-z).
2.7 El mAb anti-CCR7 mata las células tumorales de pacientes de CLL refractaria a CD20
[0155] A las células B de tumores de CLL refractaria a CD20, a partir de un paciente que no responde a la terapia con citostáticos y anticuerpos monoclonales anti-CD-20 y que se considera que es resistente a la terapia anti-CD20, las mata eficazmente en el ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) el mAb729-2A (IC500,15 nM) (figura 4). Los ensayos de CDC se realizaron como se describe en Cuesta-Mateos et al. (2015, supra).
3. Humanización
3.1 Diseño y construcción de Ab humanizados
[0156] El anticuerpo monoclonal murino anti-CCR7 humano MAb 729 se seleccionó para la humanización. Usando sistemas de numeración de anticuerpos de IMGT y Kabat, las CDR fueron identificadas en el mAb 729 (véase la tabla 1 anterior). Estos dos sistemas de numeración identifican diferentes residuos del anticuerpo murino como pertenecientes a las CDR, y se usó una secuencia de CDR combinada IMGT/Kabat para la retención óptima de la conformación de bucles de la CDR. El código para las variantes humanizadas del mAb murino 729 utilizadas en la presente es mAb 650.
[0157] Para la cadena pesada murina, la región V de los genes de la línea germinal humana más próxima es Homo sapiens IGHV3-21 (SEQ ID NO: 73). Para la cadena ligera murina, la región V de los genes de la línea germinal humana más próxima es Homo sapiens IGKV1-39 (SEQ ID NO: 74).
[0158] Para la humanización de la cadena pesada, se buscó en bases de datos en línea de secuencias de IgG humanas para comparar con el dominio v H murino usando algoritmos de búsqueda de BLAST, y los dominios variables humanos candidatos se seleccionaron de los mejores 200 resultados de BLAST. Estos se redujeron a tres candidatos basándose en una combinación de homología de marco, manteniendo los residuos de marco claves y la estructura de bucles canónica, respectivamente CAG17616 (SEQ ID NO: 67), AAL67510 (SEQ ID NO: 68) y ACS96226 (SEQ ID NO: 69). Con las CDR de la VH del MAb 729 anti-CCR7 humano murino injertadas en estos marcos aceptores se convierten en las variantes humanizadas VH1, VH2 y VH3, con secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada humanizado como se representa en las SEQ ID NOs: 61, 62 y 63, respectivamente. La tabla 4 enumera las secuencias de aminoácidos de regiones marco en los tres dominios variables de la cadena pesada humanizados según la numeración IMGT.
Tabla 4: Secuencias de aminoácidos de las regiones marco de la cadena pesada en los tres dominios variables de la cadena pesada humanizados según la numeración IMGT
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[0159] Para la humanización de la cadena ligera, se buscó en las bases de datos en línea de secuencias de IgG humanas para comparar con el dominio VL murino usando algoritmos de búsqueda de BLAST, y los dominios variables humanos se seleccionaron de los mejores 200 resultados de BLAST. Estos se redujeron a tres candidatos basándose en una combinación de homología de marco, manteniendo los residuos de marco claves y la estructura de bucles canónica, respectivamente ABI74066 (SEQ ID NO: 70), ABA26122 (SEQ ID NO: 71) y ABU90653 (SEQ ID NO: 72). Con las CDR de la VH del MAb 729 anti-CCR7 humano murino injertadas en estos marcos aceptores se convierten en las variantes humanizadas VK1, VK2 y VK3, con secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada humanizado de las SEQ ID NO: 64, 65 y 66, respectivamente. La tabla 5 enumera las secuencias de aminoácidos de regiones marco en los tres dominios variables de la cadena ligera humanizados según la numeración IMGT.
Tabla 5: Secuencias de aminoácidos de las regiones marco de la cadena ligera en los tres dominios variables de la cadena ligera humanizados según la numeración IMGT
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[0160] La variante VK3 original contenía un motivo de glicosilación con enlace N (NXS/T, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina). Este motivo de glicosilación con enlace N se eliminó cambiando el residuo de asparagina en la posición 72 a un residuo de serina. La asparagina mutó a una serina, que era el residuo en esta posición de la VL murina. Algunos anticuerpos humanos contienen también una serina en esta posición. Aparte de este motivo de glicosilación con enlace N en la variante VK3, no se hallaron más motivos de glicosilación con enlace N en las secuencias de las otras variantes humanizadas.
4. Evaluación de los mAbs anti-CCR7 humanizados
4.1 Unión al inmunógeno SYM1899
[0161] ELISA para evaluar la unión de variantes del anticuerpo 650 al inmunógeno SYM1899, un péptido sulfatado derivado del extremo N-terminal del CCR7 humano, (residuos 19-49). SEQ ID NO: 76). Se inmovilizaron 100 ng/pocillo de SYM1899 sobre placas de 96 pocillos Maxisorp en tampón de recubrimiento. Se eliminó el tampón de recubrimiento y se añadió 200 pl/pocillo de solución de bloqueo (leche semidesnatada en polvo al 3% p/v, PBS) y se agitó 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó seis veces con PBS-T (0,001% v/v Tween 20). Se diluyeron variantes del anticuerpo 650 a 1 ug/ml en PBS y se realizó una dilución en serie 1:1 en PBS a una concentración de 0,0078 pg/ml. Se añadieron 100 pl por pocillo por triplicado de cada dilución de anticuerpo a la placa además de un control negativo de PBS y se incubó 2 horas a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó seis veces con PBS-T. Se añadieron 100 pl/pocillo de cabra anti humano HRP (específico para Fc) (1:60.000 en PBS) y las placas se incubaron durante una hora agitadas a temperatura ambiente. La placa se lavó seis veces con PBS-T y una vez en PBS. Se añadieron 100 pl/pocillo de solución de sustrato TMB y se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se añadieron 50 pl de HCl 1M por pocillo y la placa se leyó inmediatamente a 450 nm en un lector de placas Biolise.
Tabla 6: determinación de Kd para variantes del anticuerpo 650 calculada usando un ajuste de la curva logístico de 4 parámetros.
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[0162] La humanización del mAb 650 fue exitosa con una serie de potenciales variantes candidatas identificadas. Las tres variantes del anticuerpo 650 que comprenden la variante de la cadena ligera LC3 no se unieron bien a SYM1899 y dieron Kd superiores a 100.
[0163] HC1 LC1 produjo la mejor Kd de 1,78 y fue el único constructo que sorprendentemente se unió a SYM1899 aún mejor que el HC0 LC0 quimérico con una Kd de 2,14.
4.2 Las variantes del anticuerpo 650 1-1,2-1 y 3-1 median la ADCC en células de CLL
[0164] Tres mAbs de IgG1 anti-CCR7 humano humanizados que comprendían la misma variante de la cadena ligera (LC1, es decir, CadenaPesada*CadenaLigera: 1*1 = HC1 LC1, 2*1 = HC2 LC1; y 3.1 = HC3 LC1) y el mAb anti-CCR7 humano quimérico (Fab de ratón/Fc humano: 0*0 = HC0 LC0) mataron al 50-60% de las células T malignas de pacientes con leucemia linfocítica crónica según se determinó mediante un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (n=2) (figura 5). Alemtuzumab (ALEM) y Rituxan (RTX) se usaron como controles positivos y el mAb IGGl se usó como control negativo. El ensayo ADCC se realizó como se describe en Somovilla-Crespo et al. (2013, J. of Hematol. & Oncol. 6:89).
4.3 El mAb anti-CCR7 humanizado 650 inhibe la internalización del receptor CCR7
[0165] La actividad antagonista del mAb anti-CCR7650-H1L1 se demuestra por inhibición de la internalización del receptor CCR7 inducida por CCL19 (IC500,4155 pg/ml = 2,8 nM; rango evaluado: 267-0,014 nM) (figura 6) según se determina por un ensayo de internalización activa establecido (PathHunter™, DiscoverX, Fremont, CA, EE.UU.), esencialmente como se describe a continuación.
Diseño del ensayo de internalización activa: endocitosis de GPCR
[0166] Usando la tecnología EFC, DiscoveRx ha desarrollado varios métodos para estudiar la internalización de receptores. Los ensayos de internalización de GPCR activada de PathHunter® proporcionan una medición cuantitativa de la internalización de GPCR mediada por arrestinas, que permite examinar el movimiento de GPCR no marcados unidos a arrestina desde la membrana plasmática en células vivas.
[0167] Para la determinación de antagonistas, las células se preincubaron con antagonista seguido de la exposición a agonista a la concentración EC80. Se realizó una dilución intermedia de los stocks de muestra para generar muestra 5X en el tampón de ensayo. Se añadieron 5 pL de muestra 5X a las células y se incubaron a 37°C o temperatura ambiente durante 30 minutos. La concentración de vehículo fue de un 1%. Se añadieron 5 pL de agonista EC806X en el tampón de ensayo a las células y se incubaron a 37°C o temperatura ambiente durante 90 o 180 minutos (EA-Arrestina / EA-Endosoma) o 37°C durante 16 horas (EA-Membrana).
Detección de señal
[0168] La señal de ensayo fue generada a través de una única adición de 12,5 o 15 pL (50% v/v) de cóctel de reactivos de detección PathHunter, seguido de una incubación de una hora a temperatura ambiente. Las microplacas se leyeron tras la generación de señal con un instrumento PerkinElmer EnvisionTM para la detección de señal quimioluminiscente.
Análisis de datos
[0169] La actividad del compuesto se analizó utilizando el paquete de análisis de datos CBIS (ChemInnovation, CA). Para el ensayo de modo antagonista, el porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula siguiente: % de inhibición = 100% x (1 -(RLU media de muestra de prueba - RLU media de control de vehículo) / (RLU media de control EC80 - RLU media de control de vehículo)).
4.3 El mAb anti-CCR7 humanizado 650 inhibe la señalización intracelular dependiente de CCR7 de la vía de B-arrestina
[0170] La señalización intracelular inducida por CCL19 de CCR7 es inhibida eficazmente por el mAb 650-H1L1, una versión humanizada del mAb murino 729, (IC509,5622 pg/ml = 63,7 nM; rango evaluado 267-0,014 nM) (figura 7) según se determina por un ensayo de reclutamiento de B-arrestina establecido (PathHunterTM, DiscoverX, Fremont, CA, EE.UU.), esencialmente como se describe a continuación.
Vía de arrestina
[0171] El ensayo de p-arrestina PathHunter® examina la activación de un GPCR en un formato de ensayo homogéneo sin imágenes usando una tecnología desarrollada por DiscoveRx llamada complementación de fragmentos enzimáticos (EFC) con p-galactosidasa (P-Gal) como el indicador funcional.
Diseño del ensayo
[0172] Formato de modulación de antagonistas: para la determinación de antagonistas, las células se preincubaron con antagonista seguido de la exposición a agonista a la concentración EC80. Se realizó una dilución intermedia de stocks de muestra para generar muestra 5X en el tampón de ensayo. Se añadieron 5 pL de muestra 5X a las células y se incubaron a 37°C o temperatura ambiente durante 30 minutos. La concentración de vehículo fue de un 1%. Se añadieron 5 pL de agonista EC80 6X en el tampón de ensayo a las células y se incubaron a 37°C o temperatura ambiente durante 90 o 180 minutos.
Detección de señal
[0173] La señal de ensayo fue generada a través de una única adición de 12,5 o 15 pL (50% v/v) de cóctel de reactivos de detección PathHunter, seguido de una incubación de una hora a temperatura ambiente. Las microplacas se leyeron tras la generación de señal con un instrumento PerkinElmer EnvisionTM para la detección de señal quimioluminiscente.
Análisis de datos
[0174] La actividad del compuesto se analizó utilizando el paquete de análisis de datos CBIS (Chemlnnovation, CA). Para el ensayo del modo de antagonista, el porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula siguiente: % de inhibición = 100% x (1 -(RLU media de muestra de prueba - RLU media de control de vehículo) / (RLU media de control EC80 - RLU media de control de vehículo)).
4.4 El mAb anti-CCR7 humanizado 650 inhibe la señalización de cAMP intracelular dependiente de CCR7
[0175] El mAb 650-H1L1 inhibe la señalización de cAMP intracelular dependiente de CCR7 inducida por CCL19, (IC501,609 pg/ml = 10,7 nM; rango evaluado 267-0,014 nM) (figura 8) según se determina por un ensayo de la vía del mensajero secundario cAMP establecido (PathHunter™, DiscoverX, Fremont, CA, EE.UU.), esencialmente como se describe a continuación.
Vía del mensajero secundario cAMP
[0176] DiscoveRx ha desarrollado un panel de líneas celulares que expresan de forma estable GPCR no marcados que señalan endógenamente a través de cAMP. Los ensayos de cAMP de Hit Hunter® examinan la activación de un GPCR a través de la señalización de los mensajeros secundarios Gi y Gs en un formato de ensayo homogéneo sin imágenes usando una tecnología desarrollada por DiscoveRx llamada complementación de fragmentos enzimáticos (EFC) con p-galactosidasa (P-Gal) como el punto final funcional.
Diseño del ensayo: modulación por cAMP de GPCR
Formato de agonista inverso
[0177] Para la determinación de agonista inverso, las células se preincubaron con muestra en presencia de forskolina EC20. El medio se aspiró de las células y se sustituyó con 15 pL de 2:1 HBSS/10 mM HEPES:reactivo cAMP XS+ Ab. Se realizó una dilución intermedia de stocks de muestra para generar muestra 4X en el tampón de ensayo con forskolina EC20 4X. Se añadieron 4,5 pL de muestra 4X a las células y se incubaron a 37°C o temperatura ambiente durante 30 o 60 minutos. La concentración final de vehículo de ensayo fue de un 1%.
Detección de señal
[0178] Después de una incubación de compuesto apropiada, la señal de ensayo fue generada a través de la incubación con 20 pL de cóctel de lisis cAMP XS+ ED/CL durante una hora seguido de la incubación con 20 pL de reactivo EA cAMP XS+ durante tres horas a temperatura ambiente. Las microplacas se leyeron tras la generación de señal con un instrumento PerkinElmer EnvisionTM para la detección de señal quimioluminiscente.
Análisis de datos
[0179] La actividad del compuesto se analizó utilizando el paquete de análisis de datos CBIS (Chemlnnovation, CA). Para los ensayos del modo de agonista inverso de Gi, el porcentaje de actividad se calcula usando la fórmula siguiente:
% de actividad de agonista inverso = 100% x ((RLU media de muestra de prueba - R LU media de
forskolina) / (RLU media de control positivo de forskolina - R LU media de control EC20))
5. Cambio de alotipo y mutantes de Fc con CDC mejorada de los anticuerpos anti-CCR7 humanizados
5.1 Diseño de mutantes con alotipo cambiado y con CDC mejorada
[0180] El alotipo original de las variantes del mAb anti-CCR7 humanizado 650 1-1, 2-1 y 3-1 (véase 4.2. anterior para el código) no produjo una función efectora de CDC suficientemente fuerte. El alotipo de las tres variantes 1­ 1, 2-1 y 3-1 se cambió por lo tanto al alotipo humano G1m17,1 para dar las variantes 11-17, 21-17, 31-17, cada una con una región constante de la cadena pesada como se representa en la SEQ ID NO: 79. Para mejorar adicionalmente la función efectora de CDC, las regiones constantes de las cadenas pesadas de estas tres variantes se modificaron además introduciendo la sustitución E333A (como se describe en Idusogie et al., 2000, J. Immunol. 164: 4178-4184), para dar las variantes 11-AE, 21-AE, 31-AE cada una con una región constante de la cadena pesada como se representa en la SEQ ID NO: 80. Además, se construyó un anticuerpo de control "11-x" cambiando la secuencia de aminoácidos de HVR-H3 (CDR3) en la cadena pesada del anticuerpo 11-17 a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 81, que completamente abolió su capacidad para reconocer y unirse al CCR7. Los anticuerpos fueron expresados transitoriamente en células CHO en volúmenes de cultivo de 500 ml, se purificaron y se usaron para hacer pruebas adicionales como se describe a continuación, con el anticuerpo HC0 LC0 quimérico (véase arriba), al que también se hace referencia como "0-0".
5.2 Rendimiento de los anticuerpos anti-CCR7 humanizados mutantes con alotipo cambiado y con CDC mejorada
[0181] El rendimiento de los anticuerpos 11-17, 21-17, 31-17, 11-AE, 21-AE, 31-AE, 11-x y Ab 0-0 quimérico se evaluaron a continuación en una variedad de ensayos.
1. La unión de anticuerpos a CCR7 expresado en la membrana se determinó por selección de células activada por fluorescencia (FACS) por citometría de flujo en tres muestras de leucemia linfocítica crónica (CLL) diferentes y en tres muestras de leucemia prolinfocítica de células T (TPLL) diferentes (datos no mostrados). Se incluyeron controles apropiados (controles de isotipo humano) para calcular fácilmente el porcentaje de células positivas y/o la intensidad de fluorescencia media relativa (RMFI), obtenido de la proporción MFI (muestra)/MFI (control). En las muestras de CLL los anticuerpos 11-AE, 11-17, 31-17, 31-Ae funcionaron mejor e incluso superaron al anticuerpo 0-0 quimérico. En las muestras de TPLL, los anticuerpos 11-AE y 11­ 17 funcionaron mejor. Los anticuerpos 11-a E, 11-17, 31-17, 31-AE mostraron perfiles de FACS similares en células T obtenidas de dos donantes sanos (HD), mientras que no se unieron a neutrófilos, monocitos o células NK (datos no mostrados).
2. Los anticuerpos fueron evaluados por su capacidad para mediar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en tres muestras de CLL diferentes y una muestra de TPLL (datos no mostrados). Los ensayos CDC se realizaron esencialmente como se describe en Cuesta-Mateos et al. (2015, supra). Los anticuerpos 11-17, 11-AE y 31-AE mostraron la mejor respuesta de mediación de CDC en células de CLL recién aisladas de las muestras n.° 1 y n.° 3. Los anticuerpos 11-17 y 11-AE mostraron una respuesta de mediación de CDC en células de CLL de la muestra n.° 2. Los anticuerpos 11-17, 11-AE, 21-a E y 31-AE mostraron una respuesta de mediación de CDC en células de TPLL de la muestra n.° 1.
Basándose en los resultados anteriores sobre el rendimiento de los anticuerpos en el perfil de FACS y la mediación de CDC se seleccionaron los anticuerpos 11-AE, 11-17, 31-17 y 31-AE para hacer pruebas adicionales.
3. De los cuatro anticuerpos seleccionados, 11-AE y 11-17 mostraron el mejor perfil de CDC en una cuarta muestra de CLL (datos no mostrados).
4. Los cuatro anticuerpos seleccionados se evaluaron adicionalmente por su capacidad para mediar la ADCC. Los ensayos de ADCC se realizaron de la siguiente manera:
A) Células diana: células PBMC aisladas o malignas derivadas de pacientes se incubaron a 37°C durante 30 min con medio solo (RPMI 0,1% BSA) o con medio en presencia de los anticuerpos evaluados con una concentración final de 10 pg/ml. Dependiendo de la muestra usada, se evaluaron un control de isotipo (IC) y/o anticuerpos anti-CD52 (alemtuzumab) y/o anti-CD20 (rituximab) y/o anti-CCR7. El anticuerpo no unido se lavó dos veces añadiendo 2 ml de RPMI 0,1% BSA y centrifugando las células a 1800 rpm durante 2 minutos.
B) Células efectoras: se obtuvieron PBL humanos o de ratón por centrifugación de gradiente de densidad en Ficoll. La proporción de células NK y monocitos se determinó por FACS como se ha descrito anteriormente usando anticuerpos dirigidos contra CD16-PE y CD14-APC.
C) Para discriminar las células diana y las células efectoras, los PBL fueron marcados con Cell Tracker calceína-UV (Invivogen) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadió 1 pL de solución de Cell Tracker 5 mM a cada ml de suspensión celular en PBS (1x106 células/ml) para una concentración final de trabajo de 5 pM. La muestra fue incubada durante 20 minutos a 37°C, protegida de la luz. Entonces, se añadió cinco veces el volumen de tinción original de medio de cultivo a las células y se incubó durante 5 minutos (este paso elimina cualquier tinte liberado restante en la solución) y las células se sedimentaron por centrifugación a 1800 rpm durante 2 minutos.
D) Las células diana se sembraron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo con 104 células/pocillo en RPMI 10% FBS. Entonces los PBL marcados con calceína-UV se usaron como células efectoras (como efectoras de la lisis celular) en diferentes proporciones efector respecto a diana (E:T). Después de 4 h de incubación, las células diana fueron teñidas con varios marcadores específicos y la viabilidad celular se determinó por tinción de 7AAD. Cada muestra fue analizada por citometría de flujo. El porcentaje de células diana muertas por ADCC se determinó mediante: % de lisis = 100 x (ER-SR) / (MR-SR). ER, SR y MR representan muerte celular experimental, espontánea y máxima. Los datos fueron normalizados respecto al control de medio.
Los cuatro anticuerpos seleccionados superaron a alemtuzumab y rituximab en la mediación de ADCC utilizando PBL aislados en 2 muestras diferentes de CLL (datos no mostrados).
5. Los cuatro anticuerpos seleccionados fueron capaces de mediar la ADCC usando PBL aislados en una muestra de CLL refractaria a alemtuzumab (datos no mostrados).
6. Los perfiles de afinidad de citometría de flujo (FCAP) mostraron que los cuatro anticuerpos seleccionados tienen perfiles similares de unión en células de CLL y TPLL, aunque los anticuerpos con la combinación de la cadena pesada 11 tienen afinidades ligeramente más altas que los anticuerpos con la combinación de la cadena pesada 31 (datos no mostrados).
7. Tanto en las muestras de CLL como en las de TPLL, los cuatro anticuerpos seleccionados bloquean la migración hacia CCL19, sin embargo, el anticuerpo 31-AE es ligeramente menos eficaz en el bloqueo de la migración hacia CCL21 (datos no mostrados).
[0182] La tabla 7 presenta una visión de conjunto de los resultados anteriores, donde las variantes de anticuerpo anti-CCR7 humanizado de mutantes individuales con alotipo cambiado y con CDC mejorada se clasifican según su rendimiento relativo en los ensayos anteriores. El 11-x no mostró ninguna unión a CCR7 expresado en la membrana según se analiza por FACS, ni medió la CDC o la ADCC.
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^ oo o - g g -
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado que comprende las regiones hipervariables HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, donde:
HVR-H1 comprende la SEQ ID NO: 6;
HVR-H2 H1 comprende la SEQ ID NO: 13;
HVR-H3 H1 comprende la SEQ ID NO: 19;
HVR-L1 H1 comprende la SEQ ID NO: 27;
HVR-L2 H1 comprende la SEQ ID NO: 31; y
HVR-L3 H1 comprende la SEQ ID NO: 36,
y donde el anticuerpo tiene al menos una de entre:
a) una afinidad mínima por un antígeno sintético con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76, definida por una Kd que no es más de un factor 10 superior a la Kd de un anticuerpo anti-CCR7 de ratón del cual la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 1 y del cual la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 2; y,
b) una IC50 de no más de 100 nM para inhibir al menos una de entre la señalización intracelular dependiente de CCR7 y la internalización del receptor CCR7, por al menos un ligando de CCR7 seleccionado de entre CCL19 y CCL21.
2. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según la reivindicación 1, donde el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende 4 regiones marco de la cadena pesada, HFR1 a HFR4, y 3 regiones hipervariables HVR-H1 a HVR-H3 que están operativamente enlazadas en el orden HFR1, HVR-H1, HFR2, HVR-H2, HFR3, HVR-H3 y HFR4, donde el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende 4 regiones marco de la cadena ligera, LFR1 a LFR4, y 3 regiones hipervariables HVR-L1 a HVR-L3 que están operativamente enlazadas en el orden LFR1, HVR-L1, LFR2, HVR-L2, LFR3, HVR-L3 y LFR4, donde las regiones marco de la cadena pesada HFR1 a HFR4 tienen las secuencias de aminoácidos de:
i) las SEQ ID NOs: 40, 43, 45 y 48, respectivamente;
ii) las SEQ ID NOs: 41, 44, 46 y 49, respectivamente; o,
iii) las SEQ ID NOs: 42, 44, 47 y 49, respectivamente,
y donde las regiones marco de la cadena ligera LFR1 a LFR4 tienen las secuencias de aminoácidos de:
iv) las SEQ ID NOs: 50, 52, 55 y 58, respectivamente; o,
v) las SEQ ID NOs: 51, 53, 56 y 59, respectivamente.
3. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según las reivindicaciones 1 o 2, donde el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs: 61, 62 y 63, y donde el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs: 64 y 65, donde preferiblemente el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61 y preferiblemente el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64.
4. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según la reivindicación 3, donde el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61 y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64.
5. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el anticuerpo comprende una región constante de la cadena pesada que es una región de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
6. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el anticuerpo comprende una región Fc funcional que posee al menos una función efectora seleccionada del grupo que consiste en: unión de Clq, citotoxicidad dependiente del complemento; unión de receptor de Fc, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y fagocitosis.
7. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el anticuerpo comprende una región constante de la cadena pesada del alotipo G1m17,1, donde preferiblemente la región constante de la cadena pesada comprende una sustitución E333A.
8. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o composición farmacéutica según la reivindicación 8 para el uso como un medicamento.
10. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o composición farmacéutica según la reivindicación 8 para usar en el tratamiento de un cáncer, una afección inflamatoria, una afección o complicación que surge de un trasplante de tejidos u órganos, o una afección o complicación que surge de la fibrosis o está asociada a la misma.
11. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o composición farmacéutica según la reivindicación 8 para un uso según la reivindicación 10, donde el cáncer es un cáncer cuyas células tumorales expresan un receptor CCR7, preferiblemente el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular, linfoma de células B grandes, linfoma asociado al SIDA, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de Burkitt, leucemia linfoblástica aguda de células B, enfermedad de Hodgkin, leucemia/linfoma de células T adultas, micosis fungoides, crisis blástica de síndromes mieloproliferativos crónicos, crisis blástica de síndromes mielodisplásicos, cáncer de mama, cáncer pulmonar de células no pequeñas, melanoma, cáncer gástrico, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello y carcinoma de colon.
12. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o composición farmacéutica según la reivindicación 8 para un uso según la reivindicación 10, donde la afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad inflamatoria intestinal, la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, asma, inflamación alérgica de las vías respiratorias, hiperplasia del músculo liso de las vías respiratorias, enfermedades pulmonares fibróticas, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, aterosclerosis, infección por VIH y SIDA, o donde el trasplante de tejidos u órganos es uno o más de entre trasplante de riñón, de corazón, de piel y de pulmón.
13. Anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o composición farmacéutica según la reivindicación 8 para un uso según la reivindicación 10, donde la fibrosis se selecciona del grupo que consiste en fibrosis hepática y cirrosis, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis de la piel, fibrosis cardiovascular, fibrosis gastrointestinal.
14. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-CCR7 humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
15. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de entre el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo.
16. Molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 14 o 15, donde la secuencia de nucleótidos codificante está operativamente enlazada a secuencias reguladoras para la expresión de la secuencia de nucleótidos codificante en una célula huésped.
17. Célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 14-16.
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