JP6863897B2 - Ｃｘｃｒ４結合分子 - Google Patents

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本文書は、内容全体が参照により組み込まれるＡＵ２０１５９０００５４による優先権を主張する。
電子様式で提出された配列一覧の全内容は、目的を問わずその全体が参照により組み込まれる。
本開示は、Ｇ共役型タンパク質受容体ＣＸＣＲ４（別称ＦｕｓｉｎまたはＣＤ１８４）と拮抗するポリペプチド（本明細書でＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドとも称する）に関する。本発明はまた、このようなポリペプチドをコードする核酸、このようなポリペプチドの調製方法、このようなポリペプチドを含む組成物、特に医薬組成物、及びこのようなポリペプチドの治療目的または診断目的での使用に関する。
ケモカイン（化学誘引物質サイトカイン）は、細胞（例えば、白血球及び／またはリンパ球及び／または幹細胞及び／またはニューロン）の遊走に加え、他の生物過程、例えば血管形成、形態形成、自己免疫、腫瘍成長及び転移の制御を誘導する構造的及び機能的に関連する小タンパク質のファミリーである。ケモカインは、アミノ末端システイン残基（例えばＣＣ、ＣＸＣ、ＣＸ３Ｃ及びＣケモカイン）の存在及び相対位置に基づいたファミリーに分類される。一般に、ケモカインの生物活性は、細胞表面受容体、特に７回膜貫通ドメインＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）によって媒介される。ケモカイン受容体は、それらが結合するケモカイン（複数可）ファミリーに従って分類し、命名される。
ＣＸＣＲファミリーのメンバーの一つが、主にリンパ球に発現し、走化性を活性化するＣＸＣＲ４である。ｆｕｓｉｎとも呼ばれるＣＸＣＲ４は、リンパ球に強力な走化活性を与える分子である間質由来因子１（ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１２とも称する）に特異的なアルファ−ケモカイン受容体である。
ＣＸＣＲ４は、胚形成、ホメオスタシス、線維症及び炎症に関与する。ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路は、臓器血管新生化、ならびに免疫及び造血系に関係している（Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５９１−５９４）。ＣＸＣＲ４受容体の遮断薬は、造血幹細胞を末梢血幹細胞として血流に「動員」できることが明らかになっている。ＣＸＣＲ４はまた、Ｔリンパ好性ＨＩＶ−１の補助受容体を分離するように機能することがわかっている（Ｇｅｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８７２−８７７）。ＣＸＣＲ４はまた、多種多様な癌細胞型に発現し、様々な腫瘍の転移過程の刺激に関与することもわかっている（Ｍｕｒｐｈｙ ＰＭ（２０００１）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：８３３−８３５）。
Ｇタンパク質共役受容体は、現在最も重要な治療標的のクラスであり、これと拮抗する抗体は治療目的、診断目的及び研究目的としての需要が高い。こうした標的への関心は高いが、膜タンパク質に対する高品質の抗体または結合薬を従来の手段を使用して生成することは難題であった。
Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５９１−５９４ Ｇｅｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８７２−８７７ Ｍｕｒｐｈｙ ＰＭ（２０００１）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：８３３−８３５
ＣＸＣＲ４に対する結合薬は、全抗体（例えばＭｅｄａｒｅｘ）、抗体断片及び単一ドメイン抗体（Ａｂｌｙｎｘ）を含め、既に報告されているが、本結合薬は、例えばＦｃ媒介性の効果、ならびに生産コストの高さ、結合薬の腫瘍浸潤に対する有用性を低減する安定性の低さ及びサイズの大きさなどの、抗体の欠点のいくつかを改善する代替的構築物を提供する。本発明の結合薬は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する患者における小分子薬、例えば末梢血幹細胞の動員に広く適応するプレリキサフォル（モゾビルすなわちＡＭＤ３１００）と、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）との併用に代わる手段を提供する。
本開示は、本明細書に記載する例で「ｉ−ｂｏｄｙ」と称するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドに関する。本ｉ−ｂｏｄｙは、細胞表面に発現した天然のヒトＣＸＣＲ４と結合する。本開示のｉ−ｂｏｄｙは、ＣＸＣＲ４を介したシグナル伝達の調節、特に阻害もしくは防止、ならびに／またはＣＸＣＲ４が関与する生物学的経路の調節、ならびに／またはそのようなシグナル伝達と関連する生物学的機構、応答及び効果の調節に使用することができる。よって本開示のｉ−ｂｏｄｙは、ＣＸＣＲ４関連の疾患及び障害の予防及び治療に使用することができる。
本開示のＣＸＣＲ４結合分子すなわちｉ−ｂｏｄｙは、従来的な抗体などの他の結合薬よりも利点をもたらすことが理解されるであろう。従来的な抗体同様、本開示のｉ−ｂｏｄｙはその標的と高親和的かつ高特異的に結合することが可能であるが、従来の治療抗体、ポリペプチドまたはペプチドと比較した場合にサイズの小ささと安定性が有利である。ｉ−ｂｏｄｙはまた、従来の抗体よりも安定な分子であるため、投与代案となり、剤形の小型化、投与頻度の減少、及び副作用の低減をもたらす。ｉ−ｂｏｄｙはまた、サイズが小さいため、例えば他の巨大タンパク質では浸透が不可能な場合がある骨基質及び微小腫瘍環境などの組織、臓器及び領域に浸透することもできる。ｉ−ｂｏｄｙはまた、従来のモノクローナル抗体とは異なり、溝及びクレフトへの浸透を可能にする長いＣＤＲ３結合ループを有する。本開示のｉ−ｂｏｄｙは、ＣＸＣＲ４ Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ポケットの奥深くに結合することが可能である。
ｉ−ｂｏｄｙは比較的サイズが小さいため、半減期の調整に最適である。このことは、造影剤として使用する場合、またはある一定の期間に必要な用量を送達する際に有利となる。小さいポリペプチドであるｉ−ｂｏｄｙはまた、識別されたポリペプチドとコンジュゲートすることにより標的へのペイロードの送達を実現している。
加えて発明者らは、本開示のポリペプチド／ｉ−ｂｏｄｙのＣＸＣＲ４結合が、当技術分野で既知の他の阻害剤／アンタゴニストＣＸＣＲ４結合分子に優る、際立った特徴を有することを見出した。具体的には本開示のＣＸＣＲ４結合ポリペプチド／ｉ−ｂｏｄｙは幹細胞の動員を引き起こさない。加えて、本開示のＣＸＣＲ４結合ポリペプチド／ｉ−ｂｏｄｙは、カルシウムの流入を阻害しない。
本開示は、足場領域とそこに含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３）を含むポリペプチドを提供する。該足場領域は、配列番号１のアミノ酸１〜２６、３３〜７９及び８８〜９７によって定義される足場領域と少なくとも７５％の同一性を有する配列を含み、配列番号１のアミノ酸２７〜３２及び８０〜８７によって、それぞれが定義される該ＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域は、その領域へのアミノ酸の付加または置換により修飾されており、該ポリペプチドはヒトＣＸＣＲ４と結合する。
一例として、ポリペプチドは、配列番号２に指定された配列（図１Ｂ）、または配列番号２に指定された配列、または１〜５個のアミノ酸の付加または置換をそこに含む配列番号２に指定された配列を含む。
一例として、ＣＤＲ１領域は６個の連続したアミノ酸残基のランダム配列（図１ＢにＸＸＸＸＸＸとして図示）からなり、ＣＤＲ３領域はＹ’ｎで表され（図１Ｂ）、ここでのＹはいずれかのアミノ酸残基であり、ｎは端点を含む１０〜２０個のアミノ酸のいずれかの数である。配列番号２のＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３領域は、配列番号１の対応するＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３領域と比較して、アミノ酸の付加及び／または置換によって修飾されている。
一例では、配列番号２の２３位のアミノ酸Ａ’は、アミノ酸グルタミン（Ｑ）またはリジン（Ｋ）である。
一例では、配列番号２の２４位のアミノ酸Ｂ’は、アミノ酸バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）である。
一例では、配列番号２においてＡ’はＱであり、Ｂ’はＶである。
ポリペプチドは更に、Ｍ、ＥＡＥＡ、ＭＡまたはＭＰからなる群から選択される１〜４個の連続したＮ末端アミノ酸を含んでもよい。
一例では、ポリペプチドはヒトＣＸＣＲ４と結合する。別の例では、ポリペプチドはヒトＣＸＣＲ４のアンタゴニストである。
一例では、ポリペプチドは、５０ｕＭ未満、２０ｕＭ未満、１０ｕＭ未満、１μＭ未満、８５０ｎｍ未満、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満または５ｎＭ未満の親和性でヒトＣＸＣＲ４と結合する。具体例では、ポリペプチドは約７００ｎＭの親和性でヒトＣＸＣＲ４と結合する。具体例では、ポリペプチドは７００ｎＭ未満の親和性でヒトＣＸＣＲ４と結合する。
一例では、足場領域は、配列番号１の１〜２６位、３３〜７９位及び８８〜９７位に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有する配列を含む。
一例では、足場領域は、配列番号１の１〜２６位、３３〜７９位及び８８〜９７位に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性、または１００％の相同性を有する配列を含む。
一例では、配列番号１または配列番号２によるポリペプチドは、１個以上のアミノ酸置換によって修飾されている。
一例では、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域は、１個以上のアミノ酸置換によって修飾されている。別の実施形態では、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３領域は、ランダムなループ配列との置換により修飾されている。
一例では、ＣＤＲ３領域は、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、または配列番号３１に対して、少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
一例では、ＣＤＲ３領域は、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、または配列番号３１に対して、少なくとも７０％の相同性、または少なくとも８０％の相同性、または少なくとも９０％の相同性、または少なくとも９５％の相同性、または少なくとも９７％の相同性、または少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性、または１００％の相同性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
別の例では、ＣＤＲ３領域は、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、または配列番号３１から選択される配列内に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個または６個の置換を有する配列を含むか、またはそれからなる。
別の例では、ＣＤＲ３領域は、配列番号１３を含むか、またはそれからなる。
一例では、ＣＤＲ１領域は、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、または配列番号３０に対して、少なくとも５０％の同一性、または少なくとも６５％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または１００％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
一例では、ＣＤＲ１領域は、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、または配列番号３０に対して、少なくとも５０％の相同性、または少なくとも６５％の相同性、または少なくとも８０％の相同性、または１００％の相同性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
別の例では、ＣＤＲ１領域は、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、または配列番号３０内に、少なくとも１個、２個または３個の置換を有する配列を含むか、またはそれからなる。
別の例では、ＣＤＲ１領域は、配列番号１２を含むか、またはそれからなる。
別の例では、ポリペプチドは以下を含む：
（ｉ）配列番号１２に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号１３に対して少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｉｉ）配列番号１２に対して少なくとも５０％の相同性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号１３に対して少なくとも７０％の相同性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｉｉｉ）配列番号１５に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号１６に対して少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｉｖ）配列番号１５に対して少なくとも５０％の相同性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号１６に対して少なくとも７０％の相同性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｖ）配列番号１８に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号１９に対して少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｖｉ）配列番号１８に対して少なくとも５０％の相同性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号１９に対して少なくとも７０％の相同性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｖｉｉ）配列番号２１に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号２２に対して少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２１に対して少なくとも５０％の相同性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号２２に対して少なくとも７０％の相同性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｉｘ）配列番号２４に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号２５に対して少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｘ）配列番号２４に対して少なくとも５０％の相同性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号２５に対して少なくとも７０％の相同性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｘｉ）配列番号２７に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号２８に対して少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｘｉｉ）配列番号２７に対して少なくとも５０％の相同性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号２８に対して少なくとも７０％の相同性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号３０に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号３１に対して少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３領域配列；
（ｘｉｖ）配列番号３０に対して少なくとも５０％の相同性を有するＣＤＲ１領域配列と、配列番号３１に対して少なくとも７０％の相同性を有するＣＤＲ３領域配列。
一例では、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、または配列番号２９に対して、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
一例では、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、または配列番号２９に対して、少なくとも７０％の相同性、または少なくとも８０％の相同性、または少なくとも９０％の相同性、または少なくとも９５％の相同性、または少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する配列を含む。
一例では、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、または配列番号２９のいずれか１つに指定された配列を含む。
一例では、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６からなる群から選択される配列内に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の置換を含む。
一例では、ポリペプチドは、配列番号１１を含むか、またはそれからなる。
更に別の例では、ポリペプチドは、式ＳＸ１ＳＸ２Ｘ３Ｒで表される配列（式中、
Ｘ１は、Ｇ、Ｋ、ＬもしくはＹであり；
Ｘ２は、Ｄ、Ｈ、Ｇ、もしくはＮであり；及び
Ｘ３は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＱもしくはＹであり；
または、その保存的アミノ酸置換）を含んでいるＣＤＲ１領域を含む。
一例では、このＣＤＲ１領域は、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、または配列番号７７のいずれか１つに指定された配列を含むか、またはそれからなる。
一例では、ポリペプチドは、式Ｙ’１ＲＹ’２ＧＹ’３ＹＲＨＲＹ’４ＬＹ’５ＬＧで表される配列（式中、
Ｙ’１は、ＹもしくはＷであり；
Ｙ’２は、Ｔ、ＶもしくはＩであり；
Ｙ’３は、ＧもしくはＡであり；
Ｙ’４は、ＡもしくはＹであり；及び
Ｙ’５は、Ｖ、ＲもしくはＫであり；
または、その保存的アミノ酸置換）を含んでいるＣＤＲ３領域を含む。
一例では、このＣＤＲ３領域は、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、または配列番号７８のいずれか１つに指定された配列を含むか、またはそれからなる。
別の例では、ポリペプチドは、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６からなる群から選択される配列に対して、少なくとも７０％同一である配列を含む。
別の例では、ポリペプチドは、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６からなる群から選択される配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９３％、９５％、９８％、または９９％同一である配列を含む。
別の例では、ポリペプチドは、配列ＺＬＱＶＤＩＶＰＳＱＧＥＩＳＶＧＥＳＫＦＦＬＣＡ’Ｂ’ＡＧＳＸ１ＳＸ２Ｘ３ＲＩＳＷＦＳＰＮＧＥＫＬＴＰＮＱＱＲＩＳＶＶＷＮＤＤＳＳＳＴＬＴＩＹＮＡＮＩＤＤＡＧＩＹＫＣＶＶＹ’１ＲＹ’２ＧＹ’３ＹＲＨＲＹ’４ＬＹ’５ＬＧＥＡＴＶＮＶＫＩＦＱ（配列番号３９）で表される配列を含み、
式中、
Ａ’は、ＱもしくはＫであり；
Ｂ’は、ＶもしくはＡであり；
Ｘ１は、Ｇ、Ｋ、ＬもしくはＹであり；
Ｘ２は、Ｄ、Ｈ、Ｇ、もしくはＮであり；
Ｘ３は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＱもしくはＹであり；
Ｙ’１は、ＹもしくはＷであり；
Ｙ’２は、Ｔ、ＶもしくはＩであり；
Ｙ’３は、ＧもしくはＡであり；
Ｙ’４は、ＡもしくはＹであり；及び
Ｙ’５は、Ｖ、ＲもしくはＫであり；
または、その保存的アミノ酸置換；ならびに
Ｚは、Ｍ、ＥＡＥＡ、ＭＡまたはＭＰから選択されるアミノ酸（複数可）であるか存在しない。
別の例では、ポリペプチドは、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６のいずれか１つに指定された配列を含むか、またはそれからなる。
別の例では、ポリペプチドは、配列番号４０に指定された配列を含むか、またはそれからなる。
一例では、ヒトＣＸＣＲ４に対するポリペプチドのＫＤは、約０．０１ｎＭ〜約７００ｎＭ、例えば約０．０５ｎＭ〜約５００ｎＭ、例えば約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ、例えば約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５ｎＭ〜約３０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約２０ｎＭ、または約３ｎＭ〜約１６ｎＭである。
別の例では、ポリペプチドは、３ｎＭ〜１０ｎＭの親和性でヒトＣＸＣＲ４と結合する。別の例では、ポリペプチドは、３ｎＭ〜５ｎＭの親和性でヒトＣＸＣＲ４と結合する。
一例では、表面プラズモン共鳴法を用いて、ヒトＣＸＣＲ４を固定化し、その固定化したヒトＣＸＣＲ４に対するポリペプチドの結合性を評価することにより、ＫＤを評価する。一例では、ポリペプチドの結合性評価は、固定化されたＣＸＣＲ４脂質粒子（ｌｉｐｏｐａｒｔｉｃｌｅ）に対するものである。
本開示の例示的なポリペプチドは、ヒトＣＸＣＲ４に対して約５ｎＭ（例えば、＋／−１ｎＭ）のＫＤを有する。
別の例では、会合速度（Ｋａ）は、約１ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１、例えば約５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１〜約８．５ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１、例えば約１ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１〜約６ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１、例えば６ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１〜１ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１である。一例では、表面プラズモン共鳴法を用いて、ヒトＣＸＣＲ４を固定化し、その固定化したヒトＣＸＣＲ４に対する分子の結合性を評価することにより、Ｋａを評価する。
別の例では、解離速度（Ｋｄ）は、約０．００５Ｍ−１ｓ−１〜約０．９Ｍ−１ｓ−１、例えば約０．０２Ｍ−１ｓ−１〜約０．７Ｍ−１ｓ−１、例えば約０．２Ｍ−１ｓ−１〜０．５５Ｍ−１ｓ−１である。
本開示の例示的なポリペプチドは、約１．２９７ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１のＫａを有する。本開示の更に例示的な結合ポリペプチドは、約０．００６２９Ｍ−１ｓ−１のＫｄを有する。一例では、表面プラズモン共鳴法を用いて、ヒトＣＸＣＲ４を発現する脂質粒子を固定化し、その固定化したヒトＣＸＣＲ４を発現する脂質粒子に対するポリペプチドの結合性を評価することにより、Ｋａ及びＫｄを評価する。
本開示のポリペプチドとＣＸＣＲ４との結合に関与する残基は特定されており、それを本明細書に開示する。一例では、本開示は、ヒトＣＸＣＲ４の１つ以上の中央の残基と結合する本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合ポリペプチドを提供し、この残基はＥ３２、Ｙ１８４、Ｆ１８９、Ｗ１９５、Ｄ２６２及びＬ２６６またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。別の例では、残基は、Ｅ３２Ｋ、Ｙ１８４Ｓ、Ｆ１８９Ｌ、Ｗ１９５Ｒ、Ｄ２６２Ｇ及びＬ２６６Ｈまたはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。別の例では、本開示は、Ｃ２８、Ｖ１１２、Ｄ１９３、Ｐ１９１、Ｅ２６８及びＥ２８８またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるＣＸＣＲ４の１つ以上の残基と結合する、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合ポリペプチドを提供する。別の例では、残基は、Ｃ２８Ｗ、Ｖ１１２Ａ、Ｄ１９３Ｇ、Ｐ１９１Ｔ、Ｅ２６８Ｋ及びＥ２８８Ｇまたはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。置換されるアミノ酸残基は、Ｕｎｉｐｒｏｔ配列識別番号Ｐ６１０７３−１（配列番号１０５）を有するヒトＣＸＣＲ４の標準配列に従って番号付けする。
ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドは、ＡＭＤ３１００などの小分子の結合を担うことがわかっている同じ残基と接触する。このことは、ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドが、ＣＸＣＲ４結合ポケットの奥深くまで浸透できることを意味する。具体例では、ポリペプチドはＣＸＣＲ４のＤ２６２位と結合する。
本開示のポリペプチドは一般に、ＣＸＣＲ４を介したシグナル伝達の調節、ならびに／またはＣＸＣＲ４が関与する生物学的経路の調節、ならびに／またはこのようなシグナル伝達もしくは経路と関連する生物学的機構、応答及び効果の調節に使用することができる。
一例では、ポリペプチドを使用して、以下の活性のうちの１つ以上を調節（すなわち阻害、防止、刺激またはブースト）することができる：
（ｉ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞内のカルシウム流入；
（ｉｉ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞のｃＡＭＰ；
（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞のβ−アレスチンシグナル伝達；
（ｉｖ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞のアポトーシス；
（ｖ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞の細胞増殖；
（ｖｉ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞の転移；
（ｖｉｉ）ＣＸＣＲ４誘導性の血管形成；及び
（ｖｉｉｉ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞の遊走。
一例では、このポリペプチドの存在しない同一条件下での腫瘍細胞の分化及び／または増殖と比較して、腫瘍細胞増殖を、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％または少なくとも６０％、すなわち７０％もしくは７５％、または８０％もしくは９０％以上増加または減少させることができる。
一例では、ポリペプチドを使用することで、腫瘍細胞増殖アッセイにおいて６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満または５ｎＭ未満のＩＣ５０で腫瘍細胞増殖を阻害することができる。一例では、腫瘍細胞増殖アッセイは、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン細胞増殖またはＣＴＧ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標））アッセイである。別の例では、腫瘍細胞増殖の阻害はＭＴＴアッセイにより決定される。
一例では、本開示のポリペプチドによりＣＸＣＲ４を発現する細胞のアポトーシスの誘導は、カスパーゼアッセイ、Ｔｕｎｎｅｌ法及びＤＮＡ断片化アッセイ、細胞透過性アッセイ、アネキシンＶアッセイ、タンパク質分解アッセイ、ならびにミトコンドリア及びＡＴＰ／ＡＤＰアッセイによって測定することができる。このようなアッセイは、当業者にはよく知られているであろう。
一例では、本開示のポリペプチドを使用して、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞、例えばＣＸＣＲ４を発現する細胞を有する転移性乳癌モデル、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の転移を阻害することができる。
よって本開示はまた、ＣＸＣＲ４を発現する癌細胞の転移を阻害する方法を提供する。
一例では、本開示のポリペプチドを使用して、ＣＸＣＲ４を発現する細胞、例えばＣＥＭ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＰＣ３、及びＲａｍｏｓ細胞において、ＳＤＦ−１誘導性の遊走を阻害することができる。
一例では、本開示のポリペプチドを使用して、例えばＨＵＶＥＣ細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた毛細管形成アッセイで測定できる、血管形成を阻害することができる。
一例では、本開示のポリペプチドは、対象のＣＸＣＲ４関連疾患または障害の治療または予防に使用される。
ポリペプチドが結合するヒトＣＸＣＲ４は、単量体、二量体、または多量体の形態であってよい。例えば、ヒトＣＸＣＲ４はヘテロ二量体の形態であり得る。記載済みのＣＸＣＲヘテロ二量体の例としては、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７（Ｌｅｖｏｙｅ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ ２００９ １１３；６０８５−６０９３）、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ２（Ｓｏｈｙ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７ ２８２；３００６２−３００６９）、ＣＸＣＲ４／β２ＡＲ（β２アドレナリン受容体）（Ｌａ Ｒｏｃｃａ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０ ５６；５４８−５５９）、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５（Ｓｏｈｙ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９ ２８４；３１２７０−３１２７９）、ＣＸＣＲ４／ＤＯＲ（デルタオピオイド受容体）（Ｐｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ ３８；５３７−５４９）が挙げられる。ＣＸＣＲ４は、Ｔ細胞受容体と相互作用することもわかっている（Ｋｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ １８７；１４４０−１４４７）。これらの二量体はＳＤＦ−１誘導性のシグナル伝達結果を調節することができ、記載されるｉ−ｂｏｄｙアンタゴニストもまた、単量体であるＣＸＣＲ４と比較して、シグナル伝達結果を変化させることができる。
一例では、本開示のポリペプチドは、ＣＸＣＲ４の構造に影響する膜貫通ドメインまたはその他のドメインと結合する。
別の例では、本開示のポリペプチドは、ＣＸＣＲ４のいずれかの適した細胞外部分、領域、ドメイン、ループまたは細胞外エピトープと特異的に結合する。一例では、ポリペプチドは、膜貫通ドメインの細胞外部分の１つ、または膜貫通ドメインを連結する細胞外ループの１つと特異的に結合する。
別の例では、本開示のポリペプチドはＰＥＧ化されている。
本開示はまた、本明細書に記載するポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
一例では、核酸分子は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、または配列番号７９のいずれか１つに対して、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有する配列を含む。
一例では、核酸分子は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、または配列番号７９のいずれか１つに対して、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性、または少なくとも９５％の相同性、または少なくとも９７％の相同性、または少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性、または１００％の相同性を有する配列を含む。
一例では、核酸分子は、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
本開示はまた、本明細書に記載する核酸分子を含んでいる発現構築物を提供する。
本開示はまた、本明細書に記載する核酸分子または発現構築物を含んでいる宿主細胞を提供する。
本開示はまた、ポリペプチドの発現が可能である条件下で宿主細胞を培養することと、ポリペプチドを回収することを含む、本開示のポリペプチドの製造方法を提供する。
本開示はまた、本明細書に記載するポリペプチドと薬剤を含むコンジュゲート（例えば免疫複合体）を提供する。
薬剤は、例えば、治療薬、毒素、検出可能標識またはポリペプチドの半減期を延長する薬剤であり得る。一例では、薬剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。別の例では、薬剤は、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ＰＡＳ）の連続した配列である。
一例では、ポリペプチドの半減期を延長する薬剤は、血清タンパク質（例えばアルブミン）または免疫グロブリンのＦｃ部分と結合する。
別の例では、本発明のポリペプチドを、腫瘍細胞などの細胞へ送達される毒素または細胞毒性薬に結合させることができる。
別の例では、本発明のポリペプチドを、放射性同位体などの標識に結合させることができる。
本開示はまた、本明細書に記載する２種以上のポリペプチドを含んでいる多量体を提供する。ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列は、同一であっても、異なっていてもよい。例えば、その最も単純な形態では、少なくとも２種のポリペプチドが好適なリンカーまたは配列またはスペーサーを介して直接結合される。例えば、リンカーまたはスペーサーは、１〜５０個のアミノ酸であり得る。例えば、好適なリンカーはＧＳ９リンカーまたはＧＳ１５リンカーまたはＧＳ２０リンカーである。
本開示はまた、多価ポリペプチドまたは多特異性ポリペプチド（二重特異性ポリペプチドを含む）を提供する。一例では、本開示は、ＣＸＣＲ４以外の標的を目的とするポリペプチドに結合される本開示のポリペプチドを提供する。ＣＸＣＲ４以外の標的としては、半減期を増加させるためのヒト血清アルブミン、循環Ｔ細胞のいずれかを腫瘍にリダイレクトして活性化するためのＣＤ３、ＣＤ６４、ＣＤ１６またはＣＤ８９が挙げられるが、これらに限定されない。具体例では、多特異性ポリペプチドは、ＣＸＣＲ４及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する二重特異性ポリペプチドであり、このポリペプチドは配列番号８０の配列を含む。
本開示はまた、本明細書に記載するポリペプチドまたはコンジュゲートもしくは多量体、及び許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の治療または予防に使用される、本開示によるポリペプチド、コンジュゲートまたは多量体を提供し、該ポリペプチドは配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６からなる群から選択される配列を含む。
一例では、本開示のポリペプチドはヒトＣＸＣＲ４と特異的に結合する。
本開示はまた、ＣＸＣＲ４関連の疾患もしくは障害、またはＣＸＣＲ４シグナル伝達もしくはＣＸＣＲ４が関与する経路もしくは機構と関連する疾患もしくは障害を予防または治療する方法を提供する。これには、本開示のポリペプチドまたはコンジュゲートもしくは多量体を必要とする対象に投与することを含む。
一例では、このポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６からなる群から選択される配列を含む。
本開示のポリペプチド、核酸分子、コンジュゲートまたは多量体による治療の対象となる疾患または障害としては、癌（例えば、造血性癌：ＣＬＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＭＭ、ＮＨＬ；固形腫瘍：乳癌、肺癌、脳腫瘍；間質における腫瘍の化学療法抵抗性；白血病及び他の癌）、ウイルス感染症（例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ウェストナイルウイルス脳炎）、炎症性疾患（例えば関節リウマチ、喘息、全身性エリテマトーデス；神経炎症性疾患）、線維症、例えば肺（肺線維症）、全身性硬化症、腎臓疾患（糖尿病性腎症、一例としてＦＳＧＳ）、肝臓疾患、眼疾患（ブドウ膜炎、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症）；免疫不全症；多発性硬化症ならびに脳卒中が挙げられる。組織及び創傷治癒には、瘢痕、熱傷または放射線が誘発する熱傷を含む。
一具体例では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害は線維症である。更なる例では、障害は特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。別の具体例では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害は腎臓疾患である。
別の例では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害は多発性硬化症である。
別の例では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害はアテローム性動脈硬化症である。
別の例では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害はＨＩＶである。
本開示のポリペプチドは、幹細胞の動員を引き起こすことも、引き起こさないこともできる。一例では、本開示はまた、本開示のポリペプチド、核酸分子、コンジュゲートまたは多量体を必要とする対象に投与することを含む、末梢血幹細胞の動員方法を提供する。一例では、末梢血幹細胞は、自己由来幹細胞移植のために使用される。一例では、それを必要とする対象は多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、または非ホジキンリンパ腫を有する。更なる例では、幹細胞はＣＤ３４＋細胞である。
一般に、ＣＸＣＲ４を対象とする抗体には、一部の適応症の治療方法にとって望ましくない幹細胞の動員が示されている。本開示のポリペプチドは、実質的に幹細胞の動員を引き起こさない。一例では、本開示のポリペプチドにより、対照のＡＭＤ３１００と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％、幹細胞の動員が減少する。
別の例では、ポリペプチドはカルシウム流入を実質的に阻害しない。
本開示はまた、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合ポリペプチドの機能的断片を提供する。一例では、機能的断片は、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合分子のＣＤＲ３配列を含む。「機能的断片」とは、断片が由来する完全長のポリペプチドと比較して、実質的に類似した、または改善された親和性でヒトＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４を介したシグナル伝達を阻害または防止する断片を意味する。好ましくは、断片は、Ｅ３２、Ｙ１８４、Ｆ１８９、Ｗ１９５、Ｄ２６２及びＬ２６６またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるヒトＣＸＣＲ４の１つ以上の中央残基と結合する。
更なる例では、機能断片は、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、または配列番号７８からなる群から選択される配列を含む。
本開示は更に、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合ポリペプチドまたはその一部、例えば本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合ポリペプチドのＣＤＲ３配列に基づいたペプチド模倣体を提供する。ペプチド模倣体は、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、または配列番号７８からなる群から選択される配列に基づくものであっても、それに由来するものであってもよい。本開示はまた、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害、特に本明細書に記載するＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の治療に使用される１種以上の模倣ペプチドを含む組成物を企図する。
本開示は更に、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の治療または予防に使用するための本開示のポリペプチドまたは核酸または発現構築物、または細胞または組成物を提供する。
本開示は更に、本開示のポリペプチドまたは核酸または発現構築物または細胞または組成物を医薬に使用するために提供する。
本開示はまた、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の治療または予防に、本開示のポリペプチドまたは核酸または発現構築物または細胞または組成物を使用できるようにする。
一具体例では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害は線維症である。別の具体例では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害は肺線維症である。別の例では、それは肝線維症である。別の例では、それは眼の線維症関連の病態である。別の例では、それは皮膚線維症である。更に別の例では、それは腎臓線維症である。
本開示は更に、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の治療または予防のための医薬製造に、本開示のポリペプチドまたは核酸または発現構築物または細胞を使用するために提供する。
本開示のポリペプチドは、診断形式に使用することもできる。
したがって、本開示は更に、対象から得たサンプル中のＣＸＣＲ４を検出する方法を提供し、該方法はＣＸＣＲ４−ポリペプチド複合体を形成するようにサンプルを本開示のポリペプチドに接触させることと、その複合体を検出することを含み、その場合の該複合体の検出はサンプル中のＣＸＣＲ４の指標となる。一例では、サンプルはＣＸＣＲ４関連の疾患または病態を罹患している対象由来である。更なる例では、サンプルは生体サンプルである。
本開示はまた、対象中の、または対象から得たサンプル中のヒトＣＸＣＲ４と結合したＣＸＣＲ４結合ポリペプチドの複合体を検出する方法を提供し、該方法は前記複合体を形成できるようにすることと、形成された複合体を検出することを含む。一例では、ヒトＣＸＣＲ４は二量体であっても、三量体であっても、多量体であってもよい。複合体の形成を検出する方法は、当業者によく知られているものである。例として、ウェスタンブロット解析または表面プラズモン共鳴法（ｂｉａｃｏｒｅ）が挙げられる。あるいは、複合体が形成された結果、蛍光検出可能なシグナル（定量化が可能であるかどうかを問わない）を生じさせるような蛍光による方法を使用することができる。
本開示はまた、ヒトＣＸＣＲ４と結合した本開示のＣＸＣＲ４結合ポリペプチドの複合体を提供する。複合体のヒトＣＸＣＲ４部分は、二量体、三量体または多量体の形態であってよい。
本開示は更に、対象におけるＣＸＣＲ４関連の疾患または障害を診断する方法を提供し、該方法は、対象由来のサンプル中のＣＸＣＲ４を検出するための、本明細書に記載する方法を実施することを含み、その場合のサンプル中のＣＸＣＲ４の検出が疾患または傷害の指標となる。
一例では、本方法はサンプル中のＣＸＣＲ４のレベルを測定することを含み、その場合の対照サンプルと比較したサンプル中のＣＸＣＲ４の増減レベルが疾患または障害の指標となる。
本開示は更に、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の場所を特定する方法及び／または検出する方法及び／または診断する方法及び／または予測する方法を提供し、該方法は、ポリペプチドを検出可能なタグとコンジュゲートしておき、ＣＸＣＲ４と結合した本開示のポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏに存在する場合には、それを検出することを含む。
一例では、本方法は更に、対象にポリペプチドを投与することを含む。
本明細書に記載する治療／予防／診断／予測いずれかの方法の一例では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害は、癌、ウイルス感染症（例えばＨＩＶ）、炎症性疾患、神経炎症性疾患；線維症、免疫不全症；多発性硬化症、顔面潮紅または脳卒中である。更なる例では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害は、線維症、癌または炎症である。
本開示による用語「対象」は、ヒト及びヒト以外の動物を含むことを意図する。ヒト以外の動物としては、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物及び哺乳動物以外）、例えばヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類及び爬虫類が挙げられる。
ヒトＮＣＡＭドメイン１の配列（Ａ）；ｉ−ｂｏｄｙ足場及びＣＤＲ１（ＸＸＸＸＸＸによって表す）及びＣＤＲ３（Ｙｎによって表す）（Ｂ）；特異的ＣＸＣＲ４結合物質ＡＤＣＸ−９９（Ｃ）の配列、ならびにＡＣＤＸ−９９の親和性成熟された結合物質のコンセンサス配列（Ｄ）を示す図式である。Ｘ及びＹはいずれかのアミノ酸であり、ｎは端点を含む１０〜２０の数である。Ａ’、Ｂ’は、いずれかのアミノ酸であり、Ｚは存在しないか、またはアミノ酸Ｍ、ＥＡＥＡ、ＭＡもしくはＭＰである。 図２−１は、（Ａ）ＡＤＣＸ−３０６（２２．５ｕＭ）、（Ｂ）ＡＤＣＸ−２７２（１．６ｕＭ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ）による親和性を示す。 図２−２は、（Ｃ）ＡＤＣＸ−６６８（４２ｕＭ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ）による親和性を示す。 図３−１は、示された種々の濃度でのＡＤＣＸ−９９（ＩＭ７−ＦＨタンパク質標識あり）及びＡＤＣＸ−２７２のβ−アレスチン活性を示す。ｉ−ｂｏｄｙ全てが、ある程度β−アレスチンの阻害を示した。 図３−２は、示された種々の濃度でのＡＤＣＸ−９９（Ｆｌａｇ＋ヒスチジン（ＦＨ）あり）及びＡＤＣＸ−６のβ−アレスチン活性を示す。ｉ−ｂｏｄｙ全てが、ある程度β−アレスチンの阻害を示した。 図３−３は、示された種々の濃度でのＡＤＣＸ−３０６及びＡＤＣＸ−６６８のβ−アレスチン活性を示す。ｉ−ｂｏｄｙ全てが、ある程度β−アレスチンの阻害を示した。 周辺質分画から精製されたｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９タンパク質（ＩＭ７−ＦＨ、すなわちＩＭ７−Ｆｌａｇヒスチジン標識免疫タンパク質をコンジュゲート）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）結果を示す。ＳＥＣはＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムを使用して実施した。 固定化したＣＸＣＲ４陽性脂質粒子（Ａ）とのｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９の結合性を表す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；ＢＩＡｃｏｒｅ）を示す。ＡＤＣＸ−９９は、無効な脂質粒子（Ｂ）に対して、またはＣＣＲ５陽性脂質粒子（Ｃ）に対して結合しなかった。 ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９に由来する親和性成熟された突然変異体ライブラリから得た、９０の個別のｉ−ｂｏｄｙを示す。抗ＦＬＡＧ抗体の結合による発現度について、親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙを試験し、陰性対照ＡＤＣＸ−２７２及びＡＤＲ−３、ならびに同一条件下で成長させた野生型ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９（末尾２列に示す）と比較した。 図７−１は、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９の親和性成熟された突然変異体ライブラリから得た、９０の個別のｉ−ｂｏｄｙを示す。親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙが、ＣＸＣＲ４陽性脂質粒子（Ａ）に対して結合するかどうかを試験した。親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙのＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５陽性脂質粒子との結合性を、野生型ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９（末尾２列）の結合性、及び陽性対照ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−２７２及び陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＲ−３と比較する。 図７−２は、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９の親和性成熟された突然変異体ライブラリから得た、９０の個別のｉ−ｂｏｄｙを示す。親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙが、ＣＣＲ５陽性脂質粒子（Ｂ）に対して結合するかどうかを試験した。親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙのＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５陽性脂質粒子との結合性を、野生型ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９（末尾２列）の結合性、及び陽性対照ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−２７２及び陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＲ−３と比較する。 出発配列ＡＤＣＸ−９９に対する、親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙの配列アライメントを示す。 細胞に発現する多数のケモカイン受容体に対するアンタゴニストとして作用するｉ−ｂｏｄｙ（表４に示す）の特異性を示す。これは、β−アレスチンアッセイで測定される。 ＡＤＣＸ−９９に対する、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ４−６６１（Ａ）、ＡＭ４−２７２（Ｂ）、ならびにＡＭ３−１１４、ＡＭ３−５２３及びＡＭ５−２４５（Ｃ）の個々の配列アライメントを示す。 二重特異性ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−Ｓ２１の、ＣＸＣＲ４及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）両方との結合を表す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；ＢＩＡｃｏｒｅ）を示す。（Ａ）種々の濃度６０ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ及び１．００μＭでの、二重特異性ｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−Ｓ２１のＳＡ２１ペプチドによるＨＳＡへの結合性（ＫＤ ５１８（＋／−２）ｎＭ）、（Ｂ）種々の濃度６０ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ及び１．００μＭでの、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ３−１１４によるＨＳＡへの結合性の欠如、（Ｃ）ＣＸＣＲ４に対するｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ３−１１４の結合性（ＫＤ ９ｎＭ）、及び（Ｄ）ＣＸＣＲ４に対する二重特異性ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−Ｓ２１の結合性（ＫＤ ９ｎＭ）。 定量的質量分析により測定した、マウスの静脈内注射後のｉ−ｂｏｄｙ濃度のプロファイルを示す。ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−７４６）をＩＭ７−ＦＨ、ＩＭ７−ＦＨ−ＳＡ２１またはＰＥＧ（３０Ｋまたは２ｘ２０Ｋ）とコンジュゲートして、非コンジュゲートの対照、ＡＤＣＸ９９−９ｘＨｉｓと比較した。 ｃＡＭＰアッセイにより測定した、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６及びＡＭ４−１１２１、陽性対照ＡＭＤ３１００、ならびに陰性対照ｉ−ｂｏｄｙに対するＣＸＣＲ４の化学発光シグナルの検出を示す。 ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６及びＡＭ４−１１２１、対照Ａｇ（ＳＤＦ−１）、２１Ｈ５陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ、ならびにＡＭＤ３１００陽性対照（有効濃度ＥＣ８０）について、Ｑｕｅｓｔ（商標）Ｆｌｕｏ−８キットで測定したカルシウム流入の阻害率を示す。 （Ａ）２つの陽性対照（小分子ＡＭＤ３１００及びＭＡｂ１２Ｇ５）及び陰性対照ｉ−ｂｏｄｙと比較した、抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４；ならびに（Ｂ）抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６及びＡＭ４−１１２１、陽性対照ＡＭＤ３１００、及びＡＤＣＸ−９９に対するＢＲＥＴ β−アレスチンアッセイの結果を示す。 図１６−１は、フローサイトメトリーにより測定した、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ３−１１４の種々の細胞株に対する結合親和性を示す。細胞株はＣＸＣＲ４を発現しないＴ４７Ｄ（Ａ）、ならびに種々のレベルでＣＸＣＲ４を発現するＮａｍａｌｗａ（Ｂ）、ＭＯＬＰ８（Ｃ）、及びＭＯＬＴ４（Ｄ）である。細胞株は全て、１０、１及び０．００１μＭのｉ−ｂｏｄｙ濃度で試験し、それに加えてＮａｍａｌｗａ細胞（Ｂ）は４．７、２．１、０．４７、０．２１、０．１及び０．０１μＭのｉ−ｂｏｄｙでも試験した。 図１６−２は、フローサイトメトリーにより測定した、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ３−１１４の種々の細胞株に対する結合親和性を示す。細胞株は種々のレベルでＣＸＣＲ４を発現するＪｕｒｋａｔ（Ｅ）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（Ｆ）、Ａ４９８（Ｇ）、及びＲａｍｏｓ（Ｈ）である。細胞株は全て、１０、１及び０．００１μＭのｉ−ｂｏｄｙ濃度で試験し、それに加えてＮａｍａｌｗａ細胞（Ｂ）は４．７、２．１、０．４７、０．２１、０．１及び０．０１μＭのｉ−ｂｏｄｙでも試験した。 図１６−３は、フローサイトメトリーにより測定した、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ３−１１４の種々の細胞株に対する結合親和性を示す。細胞株は種々のレベルでＣＸＣＲ４を発現するＮＣＩ−Ｈ６９（Ｉ）及びＨＬ−６０（Ｊ）である。細胞株は全て、１０、１及び０．００１μＭのｉ−ｂｏｄｙ濃度で試験し、それに加えてＮａｍａｌｗａ細胞（Ｂ）は４．７、２．１、０．４７、０．２１、０．１及び０．０１μＭのｉ−ｂｏｄｙでも試験した。 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；ＢＩＡｃｏｒｅ）により測定した、ＣＸＣＲ４陽性脂質粒子への結合に対するＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙのＳＤＦ−１との競合度を示す。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４（Ａ）及びＡＭ４−２７２（Ｂ）のデータを示す。 種々の分子を加えたときの、Ｒａｍｏｓ細胞に対するＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙの結合競合性を示す。ＡＭ３−１１４（上部パネル）、ＡＭ４−２７２（中央パネル）、ＡＭ３−５２３（下部パネル）のｉ−ｂｏｄｙはＲａｍｏｓ細胞に結合した。ＡＭＤ３１００、ＭＡｂ１２Ｇ５及び天然リガンドＳＤＦ−１を添加すると、程度の差はあるが、この結合性が減少した。 図１９−１は、ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙがＲａｍｏｓ細胞のアポトーシスを誘導したことを示す。ＡＭ３−１１４（ＡＤ−１１４）、ＡＭ４−２７２（ＡＤ−２７２）、ＡＭ３−５２３（ＡＤ−５２３）のｉ−ｂｏｄｙはＲａｍｏｓ細胞と結合し、アポトーシスを誘導した。これをアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムの二重染色により評価した（各フローサイトメトリーによる追跡の左上四分区間）。未処理の細胞は陰性対照の役割を担い、タプシガルギンは定評あるアポトーシス誘導試薬である（１９−１）。 図１９−２は、フローサイトメトリーによる追跡の定量化をグラフィック形式で示す（１９−２）。 陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ及び陽性対照の小分子ＡＭＤ３１００と比較した、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−２７２、ＡＭ３−１１４及びＡＭ１−３２０のＨＩＶ阻害アッセイの結果を示す。 ＦＬＵＯＳｔａｒマイクロプレートリーダーを使用して測定した、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６及びＡＭ４−１１２１、ならびに対照２１Ｈ５のＮＰ２−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞生存性を示す。 陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ、２１Ｈ５と比較した、種々のｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６及びＡＭ４−１１２１によるＨＩＶ株（ＮＬ４．３及び１１０９−Ｆ−３０）の阻害を示す。各ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙは用量依存的にＨＩＶ感染を妨げる。ＶＳＶＧは、無関係な受容体との結合後にエンドサイトーシスを受ける小胞性口内炎ウイルス由来のエンベロープである。 図２３−１は、ＰＥＧ化（３０ＫＤａ及び２ｘ２０ＫＤａのＰＥＧ）及び非ＰＥＧ化ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４及びＡＭ４−７４６によるＨＩＶの阻害を示す。ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙは用量依存的に３種のＨＩＶ株の感染を防止する（Ａ）。ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙは、ＣＣＲ５依存性のＨＩＶ株の感染を防止できない（Ｂ）。 図２３−２は、ＰＥＧ化（３０ＫＤａ及び２ｘ２０ＫＤａのＰＥＧ）及び非ＰＥＧ化ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４及びＡＭ４−７４６によるＨＩＶの阻害を示す。 ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２、ＡＭ４−７４６、ＡＭ４−１１２１、ＡＭ３−１１４、ＡＭ３−５２３、または陰性対照生理食塩水、アイソタイプ対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）または陽性対照ＡＭＤ３１００を注射したマウスの末梢血（ＰＢ）の白血球数（Ａ）を示す。ｉ−ｂｏｄｙによるＬＳＫ細胞の動員の欠如を（Ｂ）に示し、ｉ−ｂｏｄｙによるＬＳＫＳＬＡＭ細胞の動員の欠如を（Ｃ）に示す。 ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４及びＡＭ４−５２３、ならびに陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ、２１Ｈ５は、ヒト化ＮＯＤＳＩＬ２Ｒγ（ＮＳＧ）マウスモデルにおいて、陽性対照ＡＭＤ３１００と比較して幹細胞を動員しないことを示す。ｎｓ＝統計的有意なし。 ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙはヒト幹細胞及び前駆細胞を動員しないことを示す。選別されたヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣでのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合実験。（Ａ）ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣを表すドットプロット。（Ｂ）矢印で示すＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２及びＡＭ３−５２３によるヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣとのｉ−ｂｏｄｙの結合を表すフローサイトメトリーヒストグラム。（Ｃ）対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）と比較した、ｈｕＮＳＧ ＢＭからのヒトＢＭ ＣＤ３４＋ＣＤ３８− ＨＳＣ及びｍｕＣＤ４５−ｈｕＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８− ＨＳＣとのＡＭ３−１１４の結合を表すヒストグラム。 レーザー照射マウスでの線維化促進遺伝子発現に対するｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ３−１１４（Ａ）及びＡＭ４−２７２（Ｂ）の効果を示す。ｉ−ｂｏｄｙ処置したマウスのｍＲＮＡレベルについて、８５個の線維化促進遺伝子のパネルを調べた。 ヒト線維芽細胞とのＡＭ３−１１４ ｉ−ｂｏｄｙの結合性を示す。ヒト線維芽細胞をＣＤ４５への抗体染色によって同定した。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４の結合を、Ｃ末端タグに対する抗ＦＬＡＧ抗体によって同定した。ＤＡＰＩは、細胞核を染色するために使用した。最後のパネルは、全３つの染色をマージした画像である。 ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６及びＡＭ４−１１２１が、陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ（ＣＸＣＲ４と結合しない）、陽性対照ＡＭＤ３１００及びＭＳＸ−１２２、ならびにビヒクルのみの対照と比較して、ＳＤＦ−１を負荷したマウスの空気嚢への白血球の浸潤を阻害することを示す。 陽性対照ＡＭＤ３１００及びピルフェニドンならびに陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）と比較した、ブレオマイシン損傷後の肺内線維芽細胞の動員に対する、異なる用量のｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３）の効果を示す。ブレオマイシン処理したマウスからの肺組織を染色して、線維芽細胞のＣＤ４５＋ＣＸＣＲ４＋Ｃｏｌ１＋細胞を測定した。線維芽細胞である細胞の比率をＹ軸で示す。 図３１−１〜図３１−３は、ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３）、ＣＸＣＲ４小分子アンタゴニストＡＭＤ３１００及び陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ、２１Ｈ５が、ヒトＩＰＦ肺線維芽細胞の浸潤を阻害する効果を示す。ｉ−ｂｏｄｙ存在下での、ＩＰＦ肺線維芽細胞株の相対創傷密度（％）。正常肺から（Ａ）の線維芽細胞。矢印は、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４がＩＰＦ肺線維芽細胞（Ｂ及びＣ）の遊走を特異的に阻害し、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２が急性進行患者の線維芽細胞（Ｃ）を阻害したが、いずれのｉ−ｂｏｄｙも正常な肺線維芽細胞（Ａ）にいかなる影響も及ぼさなかったことを示す。ＡＭＤ３１００及び陰性対照ｉ−ｂｏｄｙの２１Ｈ５は、これらの細胞株のいずれにも影響を及ぼさなかった。 図３１−２は、ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３）、ＣＸＣＲ４小分子アンタゴニストＡＭＤ３１００及び陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ、２１Ｈ５が、ヒトＩＰＦ肺線維芽細胞の浸潤を阻害する効果を示す。ｉ−ｂｏｄｙ存在下での、ＩＰＦ肺線維芽細胞株の相対創傷密度（％）。遅発性ＩＰＦ進行患者から（Ｂ）の線維芽細胞。 図３１−３は、ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３）、ＣＸＣＲ４小分子アンタゴニストＡＭＤ３１００及び陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ、２１Ｈ５が、ヒトＩＰＦ肺線維芽細胞の浸潤を阻害する効果を示す。ｉ−ｂｏｄｙ存在下での、ＩＰＦ肺線維芽細胞株の相対創傷密度（％）。急性ＩＰＦ進行患者から（Ｃ）の線維芽細胞。 ＡＭ３−１１４−６Ｈ ｉ−ｂｏｄｙが、遅発性ＩＰＦ肺線維芽細胞において、ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１及びＦＮ１転写物の発現を著しく減少させたことを示す。遅発性肺線維芽細胞をＢＭＥに播種し、２ｍｇ／ｍｌのＢＭＥ単独（白抜きバー）、及びｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４−６Ｈ（灰色バー）またはＡＭＤ３１００（黒色バー）を含有するＢＭＥで処理した。ＲＮＡを抽出して、線維化促進転写物についてｑＰＣＲ解析を実施した。遅発性肺線維芽細胞（ｎ＝３／群）における、アルファＳＭＡ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１及びＦＮ１の平均転写物発現を図示している。 ｉ−ｂｏｄｙが血小板凝集を防止する能力を示す。ＡＭ４−２７２、ＡＭ４−７４６、ＡＭ４−１１２１、ＡＭ３−１１４、ＡＭ３−５２３及びＭＡｂ１２Ｇ５ならびに陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）及び陰性対照ＭＡＢ（ｍＩｇＧ２ａ）が、ＳＤＦ−１αによって誘導される血小板凝集を防止するかどうかを調べた。この条件下で、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４及びＡＭ４−１１２１は、この凝集を最も効果的に防止した。 ＥＡＥを誘導したマウスの臨床スコア及び体重に対する、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２の効果を示す。各線は、ＭＯＧが誘導した実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有する群及び各種の処理を受けた群のマウスの体重を表す。バーは、種々の群のマウスの臨床スコアを表す。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２は臨床スコアを低減し、ＭＯＧが誘導したＥＡＥ動物に見られる体重損失を防止する。
配列一覧の解説
配列番号１：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＮＣＡＭドメイン１をコードするアミノ酸配列
配列番号２：ｉ−ｂｏｄｙ足場をコードするアミノ酸
配列番号３：Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＮＣＡＭドメイン１をコードするアミノ酸配列
配列番号４：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＮＣＡＭドメイン１をコードするアミノ酸配列
配列番号５：Ｒａｔ ｒａｔｔｕｓ ＮＣＡＭドメイン１をコードするアミノ酸配列
配列番号６：Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＮＣＡＭドメイン１をコードするアミノ酸配列
配列番号７：Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ＮＣＡＭ２ドメイン１をコードするアミノ酸配列
配列番号８：Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ＮＣＡＭ１ドメイン１をコードするアミノ酸配列
配列番号９：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＮＣＡＭ２ドメイン１をコードするアミノ酸配列
配列番号１０：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＮＣＡＭ２ドメイン１をコードするアミノ酸配列
配列番号１１：ＡＤＣＸ−９９をコードするアミノ酸配列
配列番号１２：ＡＤＣＸ−９９ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号１３：ＡＤＣＸ−９９ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号１４：ＡＤＣＸ−２７２をコードするアミノ酸配列
配列番号１５：ＡＤＣＸ−２７２ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号１６：ＡＤＣＸ−２７２ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号１７：ＡＤＣＸ−６をコードするアミノ酸配列
配列番号１８：ＡＤＣＸ−６ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号１９：ＡＤＣＸ−６ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号２０：ＡＤＣＸ−５４をコードするアミノ酸配列
配列番号２１：ＡＤＣＸ−５４ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号２２：ＡＤＣＸ−５４ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号２３：ＡＤＣＸ−ＬＳをコードするアミノ酸配列
配列番号２４：ＡＤＣＸ−ＬＳ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号２５：ＡＤＣＸ−ＬＳ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号２６：ＡＤＣＸ−６６８をコードするアミノ酸配列
配列番号２７：ＡＤＣＸ−６６８ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号２８：ＡＤＣＸ−６６８ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号２９：ＡＤＣＸ−３０６をコードするアミノ酸配列
配列番号３０：ＡＤＣＸ−３０６ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号３１：ＡＤＣＸ−３０６ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号３２：ＡＤＣＸ−９９をコードするヌクレオチド配列
配列番号３３：ＡＤＣＸ−２７２をコードするヌクレオチド配列
配列番号３４：ＡＤＣＸ−６をコードするヌクレオチド配列
配列番号３５：ＡＤＣＸ−５４をコードするヌクレオチド配列
配列番号３６：ＡＤＣＸ−ＬＳをコードするヌクレオチド配列
配列番号３７：ＡＤＣＸ−６６８をコードするヌクレオチド配列
配列番号３８：ＡＤＣＸ−３０６をコードするヌクレオチド配列
配列番号３９：親和性成熟したｉ−ｂｏｄｙのコンセンサスアミノ酸配列
配列番号４０：ＡＭ３−１１４をコードするアミノ酸
配列番号４１：ＡＭ３−１１４ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号４２：ＡＭ３−１１４ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号４３：ＡＭ３−１１４をコードするヌクレオチド配列
配列番号４４：ＡＭ３−９２０をコードするアミノ酸配列
配列番号４５：ＡＭ３−９２０ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号４６：ＡＭ３−９２０ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号４７：ＡＭ３−９２０をコードするヌクレオチド配列
配列番号４８：ＡＭ４−１１２１をコードするアミノ酸配列
配列番号４９：ＡＭ４−１１２１ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号５０：ＡＭ４−１１２１ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号５１：ＡＭ４−１１２１をコードするヌクレオチド配列
配列番号５２：ＡＭ４−６１３をコードするアミノ酸配列
配列番号５３：ＡＭ４−６１３ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号５４：ＡＭ４−６１３ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号５５：ＡＭ４−６１３をコードするヌクレオチド配列
配列番号５６：ＡＭ３−５２３をコードするアミノ酸配列
配列番号５７：ＡＭ３−５２３ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号５８：ＡＭ３−５２３ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号５９：ＡＭ３−５２３をコードするヌクレオチド配列
配列番号６０：ＡＭ４−６６１をコードするアミノ酸配列
配列番号６１：ＡＭ４−６６１ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号６２：ＡＭ４−６６１ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号６３：ＡＭ４−６６１をコードするヌクレオチド配列
配列番号６４：ＡＭ３−４６６をコードするアミノ酸配列
配列番号６５：ＡＭ３−４６６ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号６６：ＡＭ３−４６６ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号６７：ＡＭ３−４６６をコードするヌクレオチド配列
配列番号６８：ＡＭ５−２４５をコードするアミノ酸配列
配列番号６９：ＡＭ５−２４５ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号７０：ＡＭ５−２４５ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号７１：ＡＭ５−２４５をコードするヌクレオチド配列
配列番号７２：ＡＭ４−２７２をコードするアミノ酸配列
配列番号７３：ＡＭ４−２７２ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号７４：ＡＭ４−２７２ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号７５：ＡＭ４−２７２をコードするヌクレオチド配列
配列番号７６：ＡＭ４−７４６をコードするアミノ酸配列
配列番号７７：ＡＭ４−７４６ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号７８：ＡＭ４−７４６ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号７９：ＡＭ４−７４６をコードするヌクレオチド配列
配列番号８０：ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ−ＳＡ２１二重特異性ｉ−ｂｏｄｙをコードするアミノ酸配列
配列番号８１：ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ−ＳＡ２１二重特異性ｉ−ｂｏｄｙをコードするヌクレオチド配列
配列番号８２：２１Ｈ５ ｉ−ｂｏｄｙをコードするアミノ酸配列
配列番号８３：ＡＭ４−７７４ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号８４：ＡＭ４−７７４ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号８５：ＡＭ４−２０８ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号８６：ＡＭ４−２０８ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号８７：ＡＭ４−１０８８ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号８８：ＡＭ４−１０８８ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号８９：ＡＭ４−２３９ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号９０：ＡＭ４−２３９ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号９１：ＡＭ３−３２ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号９２：ＡＭ３−３２ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号９３：ＡＭ４−７５７ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号９４：ＡＭ４−７５７ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号９５：ＡＭ４−３８６ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号９６：ＡＭ４−３８６ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号９７：ＡＭ４−３５２ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号９８：ＡＭ４−３５２ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号９９：ＡＭ３−１８２ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号１００：ＡＭ３−１８２ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号１０１：ＡＭ４−２０３ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号１０２：ＡＭ４−２０３ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号１０３：ＡＭ５−９５ ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
配列番号１０４：ＡＭ５−９５ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
配列番号１０５：ヒトＣＸＣＲ４をコードするアミノ酸配列
一般
用語「及び／または」、例えば「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれをも意味すると理解されるべきであり、両方の意味またはいずれかの意味を明示的に裏付けるものと解釈されるべきである。
本明細書を通じて、特に別段の記載がない限り、または文脈上必要とされない限り、単一の工程、組成物、工程群または組成物群への言及は、これらの工程、組成物、工程群または組成物群の単数及び複数（すなわち１つ以上）を包含すると解釈すべきである。
当業者は、本明細書に記載する本発明が、具体的に記載されたもの以外に変形及び改変の余地があることを理解されるだろう。本発明には、そのような全ての変形及び改変が含まれると理解すべきである。本発明はまた、本明細書で個々にまたは一括して参照または記載された工程、特徴、組成物及び化合物の全て、ならびに前記工程または特徴のあらゆる全ての組み合わせまたは任意の２つ以上を含む。
本開示は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、例示目的のみを意図する。機能的に等価な産物、組成物及び方法は、明らかに、本明細書に記載する本開示の範囲内である。
特に別段の記載のない限り、本明細書のいかなる例も、他のいかなる例に準用されるものと解釈すべきである。
選択定義
本明細書を通じて、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（を含む）」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（を含む）」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」などの変形は、指定された要素、整数もしくは工程、または要素群、整数群もしくは工程群を包含するが、いかなる他の要素、整数もしくは工程、または要素群、整数群もしくは工程群をも排除することを意味しないことが理解されるだろう。
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、単一の分子がそのリガンドと結合する強さを指し、通常は２つの薬剤が可逆的に結合する際の平衡解離定数（ＫＤ）として表される。ＫＤは、本開示のｉ−ｂｏｄｙまたはＣＸＣＲ４結合ポリペプチドとＣＸＣＲ４とのＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比で測定される。ＫＤと親和性は反比例する。ＫＤ値は、ｉ−ｂｏｄｙまたはＣＸＣＲ４結合ポリペプチドの濃度と相関性があるため、ＫＤ値が低下（濃度が低下）すれば、抗体の親和性は高くなる。本開示のｉ−ｂｏｄｙまたはＣＸＣＲ４結合ポリペプチドのＣＸＣＲ４に対する親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭ〜約１フェムトモル（ｆＭ）以上であり得る。
ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの標的との相互作用と関連して本明細書で使用される場合、用語「結合する」は、相互作用が標的上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、一般にタンパク質よりむしろ、特異的タンパク質構造を認識して、それと結合する。
本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、ある種の共通する特性を基準としたアミノ酸の分類を指す。個々のアミノ酸間の共通する特性を定義する機能的な方法は、同種の生物の対応するタンパク質間でのアミノ酸の変化頻度を正規化して分析することである。このような分析により、群内のアミノ酸が互いに優先的に交換され、その結果、全体のタンパク質構造に与える影響が互いにほぼ同じであるアミノ酸群を定義することができる（Ｓｃｈｕｌｚ ＧＥ ａｎｄ ＲＨ Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このように定義されるアミノ酸群の例は、以下を含む：
（ｉ）Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる荷電基、
（ｉｉ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる芳香族基、
（ｉｉｉ）Ｈｉｓ及びＴｒｐからなる窒素環基、
（ｉｖ）Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる微極性基など。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＸＣＲ４関連の疾患または病態」は、ＣＸＣＲ４結合分子もしくはポリペプチドのいずれか、または本開示の組成物及び／もしくはＣＸＣＲ４もしくはＣＸＣＲ４が関与する生物学的経路もしくは機構に対して活性である既知の有効成分の組成物を、それを必要とする（すなわち疾患もしくは障害もしくはその少なくとも一症状を有する、ならびに／または疾患もしくは障害を誘引もしくは発現する危険性がある）対象に好適に投与することにより、それぞれ予防及び／または治療できる疾患及び障害を意味するものと解釈すべきである。用語「ＣＸＣＲ４関連の疾患または病態」はまた、ＣＸＣＲ４を介した疾患または障害を含む。
本明細書で使用される場合、用語「相同性」は、類似した機能またはモチーフを有する遺伝子またはタンパク質を同定するために使用される配列類似性の数値による比較を示す。本開示のポリペプチド配列を「問い合わせ配列」として使用し、公共データベースに対して検索を実行することで、例えば、他のファミリーメンバー、関連配列またはホモログを同定することができる。このような検索は、ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏ． Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を使用して実行することができる。比較目的としてギャップありアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。
本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、配列の一致が最大となるように、すなわちギャップ及び挿入を考慮して配列を整列させたとき、２つ以上の配列の対応部分が一致するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の比率を意味する。同一性は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ ＡＭ ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ Ｇｒｉｆｆｉｎ ＡＭ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ ＨＧ ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ Ｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４）に記載されているものを含むが、これに限定されない既知の方法を使用して容易に算出することができる。同一性を決定する方法は、試験配列間の最大一致が得られるように設計する。更に、同一性の決定方法は、一般に公開されているコンピュータープログラムで体系化されている。２つの配列間の同一性を決定するコンピュータープログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。周知であるＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性の決定に使用することができる。
本明細書で使用される場合、用語「治療すること」、「治療する」または「治療」は、指定した障害の少なくとも１つの症状を軽減または解消するのに十分な治療有効量の本開示のポリペプチド、核酸分子、コンジュゲートまたは多量体を投与することを含む。一例では、治療は、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害を治療または予防するために、治療有効量のポリペプチド、核酸分子、コンジュゲートまたは多量体を投与することを伴う。一例では、治療はまた予防療法を指す。
本明細書で使用される場合、用語「予防すること」、「予防する」または「予防」は、指定した障害の少なくとも１つの症状の発現を停止または防止するのに十分な治療有効量の本開示のポリペプチド、核酸分子、コンジュゲートまたは多量体を投与することを含む。
本明細書で使用される場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドが、代わりの標的または細胞に対して作用するよりも、ＣＸＣＲ４を発現する特定の標的または細胞と、高頻度で、急速に、長い持続時間及び／または高親和性で反応または会合することを意味すると解釈されるものとする。より詳細には、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、他のケモカイン受容体、例えばＣＣＲ５、ＣＸＣＲ７またはＣＣＲ７に対してよりも高い親和性で、ＣＸＣＲ４を発現する標的または細胞と結合する。例えば、標的と特異的に結合するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、それが他のＧＰＣＲ、例えば、構造または配列に類似性がある他のＧＰＣＲと結合するよりも高親和性（例えば２倍、１０倍、２０倍または４０倍または６０倍または８０倍〜１００倍または１５０倍または２００倍高い親和性）、高結合活性で、急速に及び／または長い持続時間で、その標的と結合する。ＣＸＣＲ４と特異的に結合するポリペプチドは、他のケモカイン受容体または親和性と関連する分子と、ある程度の交差反応性を示す場合があるが、このような交差反応性はＣＸＣＲ４結合の生物学的機構応答または効果を実質的に調節しない程度に限定的である。
本明細書で使用される場合、「類似した」結合レベルという表現は、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドが、別の標的と結合するレベルの約３０％または２５％または２０％の範囲内のレベルで、標的と結合することを意味すると理解される。この用語は、ある結合分子またはポリペプチドが、別の結合分子またはポリペプチドが同じ標的と結合するレベルの約３０％または２５％または２０％の範囲内のレベルで標的と結合することを意味することもできる。
結合と関連して本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、ポリペプチドが別の標的と結合するレベルの約１５％、または１０％または５％の範囲内のレベルでＣＸＣＲ４と結合することを指す。この用語は、ある結合分子またはポリペプチドが、別の結合分子またはポリペプチドが同じ標的と結合するレベルの約５％または４％または３％の範囲内のレベルで標的と結合することを意味することもできる。
本明細書で使用される場合、用語「ランダムループ配列」は、βストランドのコンフォメーションまたは中間（Ｉセット）ドメインのβストランドのコンフォメーションから伸長する、あるいはその間に伸長するペプチド配列の一部を指す。ループ領域は通常、伸長したβストランドのコンフォメーションを含まない。ループ領域４は、従来のＣＤＲ１ループに類似している。ループ領域８は、従来のＣＤＲ３ループに類似している。
本明細書で使用される場合、用語「相補性決定領域」（同義語ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、その存在が特異的抗原結合の主要な一因である、免疫グロブリンのスーパーファミリードメイン内のアミノ酸残基を指す。
本明細書で使用される場合、用語「足場」または「ｉ−ｂｏｄｙの足場」は、アミノ酸１〜２６、３３〜７９及び８８〜９７によって定義される、ＩセットヒトＮＣＡＭ１免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン１の足場領域が表す配列（配列番号１）を指すことを意図する。
単離されたポリペプチドまたは単離された結合ポリペプチドと関連して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、タンパク質が、その派生物の起源または出所によって、天然に存在するタンパク質と会合しないか、同じ出所に由来する他のタンパク質を含まないか、異なる種からの細胞によって発現しないか、あるいは天然に存在しないタンパク質または組換えもしくは合成起源またはそのいくつかの組み合わせを指す。
用語「治療有効量」は、単独で、または他の治療薬と併用して細胞、組織または対象に投与したとき、疾患の病態または疾患の進行を予防または改善する効果がある治療薬の量を指す。
用語「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」は、それが構造的にベースとするペプチド基質のモデルとして機能することが可能であるペプチド様の分子を意味する。このようなペプチド模倣薬は化学修飾ペプチド、天然に存在しないアミノ酸を含有するペプチド様分子、及びペプトイドを含み、Ｎ置換グリシンのオリゴマーアセンブリから得られるペプチド様分子である（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｒｏ，Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｉｎ ＢＵＲＧＥＲ’Ｓ ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｖｏｌ．１（ｅｄ．Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９５），ページ８０３−８６１を参照のこと）。
種々のペプチド模倣体が当技術分野で既知であり、これには例えば、拘束されたアミノ酸を含むペプチド様分子、ペプチド二次構造を模倣する非ペプチド成分、またはアミド結合等価体を含む。拘束された、天然に存在しないアミノ酸を含む模倣ペプチドは、例えば、α−メチル化アミノ酸；α，α−ジアルキル−グリシンもしくはα−アミノシクロアルカンカルボン酸；Ｎα−Ｃα環式アミノ酸；Ｎα−メチル化アミノ酸；β−もしくはγ−アミノシクロアルカンカルボン酸；α，β−不飽和アミノ酸；β，β−ジメチルもしくはβ−メチルアミノ酸；β−置換−２，３−メタノアミノ酸；ＮＣδもしくはＣα−Ｃδ環式アミノ酸；または置換プロリンもしくは別のアミノ酸模倣体を含み得る。
加えて、ペプチド二次構造を模倣するペプチド模倣体は、例えば、非ペプチド性のβターン模倣体、γターン模倣体、βシート構造の模倣体、またはヘリカル構造の模倣体を含むことができ、これらはそれぞれ、当技術分野において周知である。ペプチド模倣体はまた、例えば、レトロインベルソ修飾体などのアミド結合等価体；還元アミド結合；メチレンチオエーテルもしくはメチレンスルホキシド結合；メチレンエーテル結合；エチレン結合；チオアミド結合；ｔｒａｎｓ−オレフィンもしくはフルオロオレフィン結合；１，５−二置換テトラゾール環；ケトメチレンもしくはフルオロケトメチレン結合または別のアミド等価体を含むペプチド様分子であり得る。当業者は、上記及びその他のペプチド模倣薬成分が、本明細書で使用される用語「ペプチド模倣体」の意味に包含されることを理解している。別途明示されない限り、用語「ポリペプチド」または「ペプチド」はペプチド模倣薬を含む。
ｉ−ｂｏｄｙの足場及びＣＸＣＲ４結合分子
本開示は、修飾されたＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域を有する足場を含む、結合ポリペプチド（すなわち「ｉ−ｂｏｄｙ」）を提供する。一例では、足場領域は、配列番号１に示すヒトＮＣＡＭ１のドメイン１、または強調表示されたＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域を除いて、配列番号１と少なくとも４５％の同一性または少なくとも７５％の相同性を有する関連したドメイン配列を含む。
ＮＣＡＭ（すなわち神経細胞接着分子）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのＩセットドメインすなわち中間セット（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｓｅｔ）ドメインの糖タンパク質である。ＮＣＡＭの細胞外ドメインは、５つの免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインに続く、２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦＮＩＩＩ）ドメインからなる。
関連するドメイン配列は、それぞれウシ、マウス、ラット、ニワトリ及びカエルのＮＣＡＭ １ドメイン配列を示す配列番号３、４、５、６及び８、ならびにそれぞれカエル、ヒト及びマウスのＮＣＡＭ ２ドメイン配列を示す配列番号７、９及び１０を含む。
これらの関連するドメイン間の配列同一性は、以下の通りである：
Figure 0006863897
これらの関連するドメイン間の配列相同性は、以下の通りである：
Figure 0006863897
ヒトＮＣＡＭのドメイン１は、細菌発現系で組換えポリペプチドとして作製された（Ｆｒｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１８：１７７−１９４）。
本開示は、ドメイン（または「ｉ−ｂｏｄｙ」）の結合特性を変化させることがわかっている、ｉ−ｂｏｄｙ足場に組み込まれるＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３領域の修飾体について記載している。特に、発明者らは、驚いたことに高い親和性及び特異性でＣＸＣＲ４と結合し、ＣＸＣＲ４誘導性の細胞遊走を阻害または低減することが可能である修飾されたｉ−ｂｏｄｙアミノ酸及びポリペプチドを開発した。特に、本開示のＣＸＣＲ４結合ポリペプチドまたはｉ−ｂｏｄｙは、癌転移、抗炎症及び線維症関連疾患の阻害に有用である。
したがって、本開示は、ｉ−ｂｏｄｙ足場のアミノ酸配列を含む、ＣＸＣＲ４と結合する数多くのポリペプチドを提供する。このとき、ｉ−ｂｏｄｙ足場のＣＤＲ１またはＣＤＲ３領域が修飾されており、足場分子は５０ｕＭ未満、４０μＭ未満、２０μＭ未満、１０ｕＭ未満、１ｕＭ未満、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または５ｎＭ未満、または１ｎＭ未満の親和性でヒトＣＸＣＲ４と結合する。
一実施形態では、ポリペプチドのＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３領域全体が、ランダムループ配列で置換される。
例えば、ポリペプチドのＣＤＲ１ループ領域を、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、もしくは配列番号７７に示された配列、またはそれと少なくとも５０％の同一性を有する配列を持つループ領域と置換することができる。
例えば、ポリペプチドのＣＤＲ１ループ領域を、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、もしくは配列番号７７に示された配列、またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を持つループ領域と置換することができる。
別の例では、ポリペプチドのＣＤＲ３ループ領域を、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、もしくは配列番号７８に示された配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を持つループ領域と置換することができる。
別の例では、ポリペプチドのＣＤＲ３ループ領域を、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、もしくは配列番号７８に示された配列、またはそれと少なくとも７０％の相同性を有する配列を持つループ領域と置換することができる。
一例では、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２または配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６に対して、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
一例では、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２または配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６に対して、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性、または少なくとも９５％の相同性、または少なくとも９７％の相同性、または少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する配列を含む。
一例では、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２または配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、または配列番号７６を含むか、またはそれからなる。
一例では、ポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸置換を含む配列番号１１を含むか、またはそれからなる。
一例では、ポリペプチドは、配列番号１１を含むか、またはそれからなる。
本開示はまた、本明細書に記載するポリペプチドをコードする核酸分子を形成する。
一例では、核酸分子は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、または配列番号７９のいずれか１つに対して、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有する配列を含む。
一例では、核酸分子は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、または配列番号７９のいずれか１つに対して、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性、または少なくとも９５％の相同性、または少なくとも９７％の相同性、または少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性、または１００％の相同性を有する配列を含む。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの％同一性は、ギャップ生成ペナルティ＝５及びギャップ伸長ペナルティ＝０．３に設定した、ＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）で測定される。問い合わせ配列は少なくとも５０残基長であり、ＧＡＰ分析により、２つの配列が少なくとも５０残基の領域にわたってアライメントされる。例えば、問い合わせ配列は少なくとも１００残基長であり、ＧＡＰ分析により、２つの配列が少なくとも１００残基の領域にわたってアライメントされる。一例では、２つの配列は、その全長にわたってアライメントされる。
本開示の目的では、配列のアライメント及び相同性スコアの算出は、タンパク質とＤＮＡいずれのアライメントにも有用である、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアライメント（すなわちグローバルアライメント）を使用して行う。タンパク質及びＤＮＡのアライメントに、それぞれデフォルトのスコア行列ＢＬＯＳＵＭ５０及び単位行列を使用する。ギャップ内の最初の残基に対するペナルティは、タンパク質に対して−１２、ＤＮＡに対して−１６であり、一方、ギャップ内の追加残基に対するペナルティは、タンパク質に対して−２、ＤＮＡに対して−４である。アライメントは、ＦＡＳＴＡパッケージ版ｖ２０ｕ６（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＰＮＡＳ ８５：２４４４−２４４８，及びＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９０）“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＦＡＳＴＰ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６３−９８）に基づく。
本開示は、本開示の結合タンパク質の変異体形態を企図する。例えば、このような変異体結合タンパク質は、本明細書で指定される配列と比較して、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの例では、結合タンパク質は、１０個以下、例えば、９個または８個または７個または６個または５個または４個または３個または２個または１個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖及び／またはハイドロパシー性及び／または親水性を有するアミノ酸残基で置換されているものである。
当技術分野では、類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義されており、これには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。ハイドロパシー指標については、例えばＫｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）に記載されており、親水性指標については、例えばＵＳ４５５４１０１に記載されている。
本開示はまた、非保存的アミノ酸変化について考察する。例えば、荷電アミノ酸の別の荷電アミノ酸による、及び中性または正荷電アミノ酸による置換を特に目的とする。いくつかの例では、結合タンパク質は、１０個以下、例えば、９個または８個または７個または６個または５個または４個または３個または２個または１個の非保存的アミノ酸置換を含む。
本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合タンパク質の変異体は、ＣＸＣＲ４と結合する能力を保持する。ＣＸＣＲ４に対する特異的な結合を決定する方法を本明細書で記載する。
親和性成熟
更なる例では、増加した親和性、特異性または活性でＣＸＣＲ４と結合できるｉ−ｂｏｄｙを作製するために、または発現または溶解性を増加させたｉ−ｂｏｄｙを作製するために、本開示のポリペプチドが親和性成熟される。例えば、本開示のポリペプチドをコードする配列を、１個以上のアミノ酸置換を誘導するように変異させる。次に、得られた変異体ポリペプチドを、例えば競合アッセイでスクリーニングして、ＣＸＣＲ４との結合を検出するか、他のケモカイン受容体（例えばＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ１、ＸＣＲ１；図９を参照）に対する特異性の増加をスクリーニングするか、または発現の増加または溶解性の増加をスクリーニングするか（図７を参照）、または以下で説明する親和性アッセイによってＣＸＣＲ４に対する親和性の増加をスクリーニングする。
ポリペプチド及びタンパク質の親和性成熟には、いくつかのプロトコルがある。これには、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１９９４）；９１（２２）：１０７４７−１０７５１）、エラープローンＰＣＲ法（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６；８８９−８９６及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５：１４５２−６６）、及び足場全体を無作為化する細菌突然変異誘発遺伝子細胞（Ｉｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：１２７−４３．３）、ならびにそれ以外の標的化方法、例えばドープによるオリゴヌクレオチド突然変異誘発（Ｈｅｒｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ，８４；１４３−１５１４））が含まれる。親和性成熟シングルドメイン、結合タンパク質及びポリペプチドには、Ｑベータバクテリオファージ由来のエラープローンＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと連結したリボソームディスプレイも使用されている（Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０７ １６３−１６８）。
本開示によるポリペプチドは、可溶性分泌型タンパク質であってもよく、または細胞もしくは粒子表面に融合タンパク質として存在してもよい（例えば、ファージもしくはその他のウイルス、リボソームまたは生殖細胞）。例示的なファージディスプレイ方法は、例えば、ＵＳ５８２１０４７、ＵＳ６２４８５１６及びＵＳ６１９０９０８に記載されている。次に、これらの方法を用いて作製されたファージディスプレイ粒子をスクリーニングして、ＣＸＣＲ４との結合に十分なコンフォメーションを有する提示された結合タンパク質、またはＣＸＣＲ４に対する改善された結合物質を同定する。
見かけの親和性は、例えば、当業者によく知られている酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはその他のいずれかの技術によって測定することができる。結合活性は、例えば、当業者によく知られているスキャッチャード分析またはその他のいずれかの技術によって測定することができる。当業者によく知られている見かけの結合親和性を測定するもう一つの技術が、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００システムで分析される）である（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ．Ｊ．２０００，１７：３２３−３２９）。標準測定値及び従来の結合アッセイについては、Ｈｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｐ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．２００２，２８：２１７−２２９に記載されている。
一例では、本開示の親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙは、親和性成熟されていないｉ−ｂｏｄｙの結合親和性よりも高い結合親和性（例えば、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍以上）でヒトＣＸＣＲ４と特異的に結合する。
タンパク質の生産
一例では、本開示のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載する及び／または当技術分野において既知である、タンパク質生産に十分な条件下で、細胞株（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞株）を培養することにより生産される。
組換え発現
組換えタンパク質の場合、それをコードする核酸を、１つ以上の発現構築物、例えば、発現ベクター（複数可）に導入し、その後、ジスルフィドブリッジまたはジスルフィド結合を生じさせることができる細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞を含む細菌細胞などの宿主細胞にトランスフェクトする。例示的な哺乳動物細胞としては、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそれ以外の免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞が挙げられる。例示的な細菌細胞としては、いずれもＮｏｖａｇｅｎから入手可能である、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＳ、Ｔｕｎｅｒ、Ｔｕｎｅｒ ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＡＤ４９４、ＨＭＳ１７４が挙げられる。
このような目的を達成するための分子クローニング技術は、当技術分野において既知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ Ｍ（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ＮＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ｏｒ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。組換え核酸の構築に適したクローニング及びｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法は多種多様である。
単離に続いて、本開示のタンパク質をコードする核酸を発現構築物または複製可能ベクターに挿入し、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）を行うか、または無細胞系または細胞内で発現させる。例えば、核酸はプロモーターに操作可能に連結される。
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は最も広義に解釈されるものとし、ゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、これには、核酸の発現を変更する付加的な調節エレメント（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）の有無にかかわらず、例えば、発現刺激及び／または外部刺激に応答して、または組織特異的に、正確な転写を開始するのに必要となる、ＴＡＴＡボックスまたは開始エレメントが含まれる。本発明の文脈で、用語「プロモーター」はまた、組換え、合成もしくは融合核酸、またはプロモーターに操作可能に連結される核酸の発現を付与、活性化、または増強する誘導体を記載する際にも使用される。例示的なプロモーターは、発現を更に増強する、ならびに／または前記核酸の空間的発現及び／もしくは一過性発現を改変するために、１つ以上の特異的調節エレメントの追加コピーを含むことができる。
本明細書で使用される場合、用語「に操作可能に連結される」は、核酸の発現がプロモーターによって制御されるように核酸と相対してプロモーターを配置することを意味する。
無細胞発現系もまた、本開示で企図される。例えば、ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドをコードする核酸を、好適なプロモーター、例えば、Ｔ７、Ｔ５またはＳＰ６プロモーターに操作可能に連結して、転写及び翻訳に十分な条件下に置き、発現構築物を生じさせる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現または無細胞発現のための典型的な発現ベクターが記載済みであり、これには限定されないが、ＴＮＴ Ｔ７及びＴＮＴ Ｔ３システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴ及びｐＥＸＰ２−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。
細胞内発現のためのベクターは数多く提供されている。ベクター成分は一般に、シグナル配列、本開示のポリペプチドをコードする配列（例えば、本明細書に記載する情報に由来する）、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これに限定されない。当業者は、タンパク質の発現に適した配列を周知しているはずである。ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えばファージ、またはファージミドであり得る。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現における核酸操作、ならびにタンパク質解析のための数多くの既知の技術及びプロトコルが、例えばＡｕｓｕｂｅｌ Ｆ Ｍ（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ＮＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓに記載されている。多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを本開示のｉ−ｂｏｄｙのＤＮＡ配列の発現に用いることができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。好適なベクターとしては、ＳＶ４０誘導体及び既知の細菌プラスミド（例えばＥ．ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ Ｅｌ、Ｐｅｒｌ、Ｐｂｒ３２２、Ｐｍｂ９及びその誘導体）、プラスミド（例えばＲＰ４）；ファージＤＮＡ（例えば、多数のファージ誘導体（例えばＮＭ９８９））及びその他のファージＤＮＡ（例えばＭ１３及び糸状一本鎖ファージＤＮＡ）；酵母プラスミド（例えば、２ｕプラスミドまたはその誘導体）；真核細胞に有用なベクター（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞に有用なベクター）；プラスミド及びファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター（例えば、ファージＤＮＡまた他の発現制御配列が機能するように改変されたプラスミド）などが挙げられる。
例示的なシグナル配列としては、原核生物の分泌シグナル（例えば、ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ）、酵母の分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸性ホスファターゼリーダー）または哺乳動物の分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。
例示的なリーダーペプチドとしては、原核生物において活性であるもの（例えばＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰＩＩＩ、ＤｓｂＡ、ＴｏｒＴ、ＴｏｌＢ、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモータ系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター）が挙げられる。
好適な細菌性プロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７、Ｔ５プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ及びＰＬプロモーターならびにｔｒｐプロモーターが挙げられる。真核性プロモーターとしては、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期／後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えばラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のもの）、及びメタロチオネインプロモーター（例えばマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）が挙げられる。
哺乳動物細胞で有効である例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウィルス最初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウィルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターを含むハイブリッド調節エレメントまたはその活性断片が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＵＳＴＲＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎系（２９３細胞または懸濁培養による増殖用にサブクローニングした２９３細胞）；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＵＳＴＲＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ ＣＣＬ １０）；またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が挙げられる。
酵母細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅからなる群から選択される酵母細胞などの発現に適した典型的なプロモーターとしては、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーターまたはＴＥＦ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
単離された核酸分子またはそれを含む遺伝子構築物を、発現させる細胞に導入する手段は、当業者に既知である。所与の細胞に使用する技術は、既知の適切な方法によって異なる。組換えＤＮＡを細胞に導入する手段としては特に、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介するトランスフェクション、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）及び／またはｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いるなどのリポソームを介したトランスフェクション、ＰＥＧ化を介したＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、ウイルスによる形質導入（例えば、レンチウイルスを使用）、ならびにＤＮＡをコーティングしたタングステンまたは金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いるなどの微粒子の打ち込みが挙げられる。
場合によって、特に、目的とするポリペプチドが多少短い、通常可溶性である及び／または宿主細胞中のタンパク質分解を受けやすい場合は、不溶性形態のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現させることが有用である。不溶性形態のタンパク質の生産は、容易な回収に役立つとともに、望ましくないタンパク質分解からポリペプチドを保護する。不溶性形態のポリペプチドを得る一手段は、封入体の形成を誘導する少なくとも１つのペプチドタグ（すなわち、封入体タグ）を融合構築物に搭載することにより、不溶性融合タンパク質の一部としてポリペプチドを組換え生産することである。通常、その後に、目的とするポリペプチドを融合タンパクから回収できるように、融合タンパク質は少なくとも１つの切断可能ペプチドリンカーを含むように設計される。融合タンパク質は、複数の封入体タグ、切断可能なペプチドリンカー、目的とするポリペプチドをコードする領域を含むように設計することができる。
不溶性タンパク質の発現を容易にするペプチドタグを含む融合タンパク質は、当技術分野において周知である。通常、キメラタンパク質または融合タンパク質のタグ部分が大きいため、融合タンパク質が不溶性となる可能性が高くなる。通常使用される大型ペプチドタグの例としては、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（Ｄｙｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７４：４１１（１９８８））、ベータ−ガラクトシダーゼ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４１：３２６（１９９３）；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２８１：４６２７（１９８４）；及びＫｅｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３９：２３９（１９８５））、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：６４（１９９３）及びＨａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ９４／０４６８８））、Ｌ−リブロキナーゼのＮ末端（米国特許第５，２０６，１５４号及びＬａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏ．，３７：１６１４（１９９３））、バクテリオファージＴ４ ｇｐ５５タンパク質（Ｇｒａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：１０１７（１９９４））、細菌ケトステロイドイソメラーゼタンパク質（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４５９９（１９９４））、ユビキチン（Ｐｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１３：３７４−７９（１９９７））、ウシプロキモシン（Ｎａｕｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．５７：５５−６１（１９９８））、及び殺菌性／浸透性を増加させるタンパク質（“ＢＰＩ”；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．Ｄ．及びＧａｖｉｔ，Ｐ Ｄ．，米国特許第６，２４２，２１９号）が挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野にはこの技術の具体例が豊富である。例えば、タンパク質性タグと可溶性タンパク質との融合タンパク質、及び細胞可溶化物からのその後の精製について記載している米国特許第６，６１３，５４８号；発現したキメラタンパク質を特異的プロテアーゼから保護するタグを教示している米国特許第６，０３７，１４５号；目的とするタンパク質を容易に精製するためのタグ及び切断可能なリンカーを有する融合タンパク質の合成を教示している米国特許第５，６４８，２４４号；及び米国特許第５，２１５，８９６号；同第５，３０２，５２６号；同第５，３３０，９０２号；ならびにキメラタンパク質またはペプチドの不溶性を増加させるように特異的に設計されたアミノ酸組成物を含有する融合タグについて記載しているＵＳ２００５２２１４４４を参照のこと。
近年、Ｚｅａ ｍａｙｓゼインタンパク質（米国特許出願第１１／６４１，９３６号）、Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａシスタチン（米国特許出願第１１／６４１，２７３号）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ由来のアミロイド様仮想タンパク質（米国特許出願第１１／５１６，３６２号）から、更に短い封入体タグが開発されている（各文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。短い封入体タグの使用は、組換え宿主細胞内に産生される標的ペプチドの収率を増加させる。
本発明ではまた、１種以上のポリヌクレオチド構築物を含む、組換え宿主細胞も提供する。本開示のｉ−ｂｏｄｙをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドからの発現を含むｉ−ｂｏｄｙの生産方法と同様に本明細書に包含される。発現は、例えば、ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより達成され得る。
本開示の結合分子またはポリペプチドの生産に使用する宿主細胞は、使用する細胞型に応じて種々の培地で培養することができる。市販の培地、例えばＨａｍ’ｓ Ｆｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭｌ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコの改良イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が哺乳動物細胞の培養に適している。本明細書で述べる他の細胞型を培養するための培地は、当技術分野において既知である。
尚、必ずしも全てのベクター、発現制御配列及び宿主が、等しく適切にＤＮＡ配列を発現するように機能するとは限らない。同様に、全ての宿主が、同じ発現系で等しく適切に機能するわけではない。しかしながら、当業者は、過度な実験をすることなく、適切なベクター、発現制御配列及び宿主を選択して、本出願の範囲を逸脱せずに目的とする発現を達成できるであろう。例えば、ベクターが宿主で機能しなければならないため、ベクターを選択する際には宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及びベクターによってコードされる他のいかなるタンパク質（例えば抗生物質マーカー）の発現も考慮すべきであろう。
本開示はまた、本明細書で開示する１種以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。本開示はまた、上記のいずれかの好適な技術によって、このような１種以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する方法も提供する。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入した後は、例えば、１種以上のポリヌクレオチドから１種以上のポリペプチドが発現する条件下で宿主細胞を培養することにより、ポリヌクレオチドの発現が行われ得る。
本開示のｉ−ｂｏｄｙをコードするポリヌクレオチドは、クローニングに加えて、またはクローニングの代わりに、組換え／合成により調製することができる。ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドに適したコドンを用いて、ポリヌクレオチドを設計することができる。一般に、配列を発現に使用する場合、意図した宿主に好適なコドンを選択する。完全なポリヌクレオチドは、標準方法によって調製して完全なコード配列にアセンブリした重複オリゴヌクレオチドからアセンブリすることができる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：６３１１（１９８４）を参照のこと。
タンパク質の単離
本開示のＣＸＣＲ４結合分子もしくはポリペプチドまたはｉ−ｂｏｄｙは、単離または精製することができる。
本開示のポリペプチドの精製方法は、当技術分野において既知である、及び／または本明細書に記載されている。
組換え技術を使用する場合、本開示のポリペプチドは、細胞内、すなわち細胞周辺腔内で生産することも、または培地中で直接分泌させることもできる。タンパク質を細胞内で生産する場合、第一段階として、例えば、遠心分離または限外濾過により、宿主細胞または溶解した断片の粒子破片を除去する。タンパク質を培地に分泌させる場合、このような発現系からの上清を、最初に市販のタンパク質濃度フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮することができる。タンパク質分解を阻害するため、前述の段階のいずれかでＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を追加してもよく、また外来不純物の増殖を防止するため、抗生物質を追加してもよい。
細胞から調製されたタンパク質を、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーまたはプロテインＧクロマトグラフィー）、熱または前述のいずれかの組み合わせを使用して精製することができる。これらの方法は、当技術分野において既知であり、例えばＷＯ９９／５７１３４に記載されている。
当業者はまた、本開示のポリペプチドを修飾して、精製または検出を容易にするタグ、例えばヘキサヒスチジンタグなどのポリヒスチジンタグ、またはインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ、またはシミアンウイルス５（Ｖ５）タグ、またはＦＬＡＧタグ、またはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを付加できることを承知している。例えば、タグはヘキサヒスチジン（ｈｉｓ）タグである。次に、得られたタンパク質を、当技術分野で既知の方法、例えばアフィニティ精製を使用して精製する。例えば、固体または半固体支持体に固定化されたヘキサｈｉｓタグへ特異的結合するニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）と、タンパク質を含むサンプルを接触させ、該サンプルを洗浄して非結合タンパク質を除去した後、結合したタンパク質を溶出することにより、ヘキサｈｉｓタグを含むタンパク質を精製することができる。その代わりに、またはそれに加えて、タグへ結合するポリペプチド、リガンドまたは抗体をアフィニティ精製方法に使用する。
コンジュゲート
本開示はまた、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドのコンジュゲートを形成する。本開示のポリペプチドへコンジュゲートできる化合物の例は、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象の体内でのタンパク質半減期を延長する化合物及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
例示的な治療薬としては、抗血管形成薬、抗新生血管薬及び／もしくはその他の血管新生薬、抗増殖薬、プロアポトーシス薬、化学療法剤、抗有糸分裂薬（例えば抗有糸分裂薬アウリスタチン、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４，５３，１−６によるＭＭＡＦ／ＭＭＡＥ）または治療用核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
毒素には、細胞に対して有害である（例えば、殺傷する）いかなる薬剤をも含む。当技術分野において既知である薬物のクラス及びその作用機序の説明については、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）を参照のこと。抗体の免疫毒素コンジュゲートの調製に関連する付加的な技術は、例えばＵＳ５１９４５９４に記載されており、これを本開示に利用してもよい。例示的な毒素としては、ジフテリア毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。例えば、ＷＯ９３／２１２３２を参照のこと。
いくつかの例では、ＣＸＣＲ４結合分子もしくはポリペプチドまたはｉ−ｂｏｄｙを、共有結合または非共有結合により細胞毒または他の細胞増殖阻害化合物と結合させて、腫瘍細胞への該薬剤の送達を局在化することができる。例えば、薬剤は、酵素阻害剤、増殖阻害剤、溶解剤、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成阻害剤、膜透過性調整剤、ＤＮＡ代謝産物、ジクロロエチルスルフィド誘導体、タンパク質生産阻害剤、リボソーム阻害剤、アポトーシス誘導剤及び神経毒からなる薬剤の群から選択することができる。
本開示の免疫複合体の形成に適した化学療法剤としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎ）、５−フルオロウラシル、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン及びカルボプラチンなどのその他の白金誘導体）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（旧名称アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（旧名称ダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））が挙げられる。
一例では、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、本開示の別のＣＸＣＲ４結合分子もしくはポリペプチド、または本明細書に記載するＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３領域を含むタンパク質を含めた、別のタンパク質（例えばヒト血清アルブミンすなわちＨＳＡ）とコンジュゲートまたは連結される。本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドはまた、例えば、腫瘍抗原、または何らかの循環Ｔ細胞を腫瘍にリダイレクトして活性化する可能性がある標的（例えばＣＤ３）、または単球及びマクロファージに顕著に発現し、好中球での活性を上方調節する標的（例えばＣＤ６４）、またはナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単球及びマクロファージの表面に発現する標的を標的化する別の結合分子またはポリペプチドにコンジュゲートすることができる。一例では、結合分子またはポリペプチドは、ＩｇＧ（例えばＣＤ１６）の低親和性結合物質、または主として好中球、単球、マクロファージ及び好酸球に恒常的発現する標的（例えばＣＤ８９）の低親和性結合物質である。それ以外のタンパク質またはコンジュゲートパートナーも包含される。追加のタンパク質は当業者に明らかであり、これには特に、例えば免疫賦活剤、または半減期を延長するタンパク質、または血清アルブミンと結合するペプチドもしくはポリペプチドもしくはその他のタンパク質を含む。
例示的な血清アルブミン結合ペプチドまたはタンパク質は、ＵＳ２００６０２２８３６４またはＵＳ２００８０２６０７５７に記載されている。
一例では、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１８６−１１９２に記載されるＸＴＥＮポリペプチドにコンジュゲートされる。
一例では、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ ｅｔ ａｌ （２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．２６ ｎｏ．８ ｐｐ．４８９−５０１に記載されるポリペプチドにコンジュゲートされる。
一例では、本開示のポリペプチドは、例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ（２０１０），Ｂｌｏｏｄ Ｖｏｌ．１１５ ｎｏ．１０ ２０５７−２０６４、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，（２００９）ＢＭＢ Ｒｅｐ．４２：２１２−２１６、及びＮａｇａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４９：３３７−３４６に記載されるように、免疫グロブリンのＦｃ領域にコンジュゲートされる。
ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドコンジュゲート（二重特異性分子）は、当技術分野で既知の方法を使用して調製することができる。例えば、二重特異性分子の結合特異性をそれぞれ個別に生成した後、互いにコンジュゲートすることができる。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが結合特異性である場合、種々のカップリング剤または架橋剤を使用して、共有結合によりコンジュゲートすることができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈａｘａｎｅ）−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｌ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １６０ １６８６、Ｌｉｕ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ ８６４８を参照）。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ Ｍｉｔｔ Ｎｏ ７８，１ １８−１３２、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９ ８１−８３、及びＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３９ ２３６７−２３７５）に記載されているものが挙げられる。
放射性物質をコンジュゲートしたタンパク質の作製に、種々の放射性核種を利用できる。例としては、（例えば診断目的に適する）低エネルギー放射性原子核、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、放射性核種は、投与からイメージング部位への局在までの経過時間以降も活性または検出が可能である、適した半減期を有するガンマ線、光子またはポジトロン放出放射性核種である。本開示はまた、（例えば治療を目的とする）高エネルギー放射性原子核、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅも包含する。これらの同位体は通常、短飛程を有する高エネルギーのα粒子またはβ粒子を発生する。このような放射性核種は、それが近接する細胞、例えばコンジュゲートが付着した、または侵入した腫瘍性細胞を殺傷する。放射性核種は、局在しない細胞に対しては、ほとんどまたは全く影響を及ぼさず、また本質的に非免疫原性である。あるいは、高エネルギー同位体は、本来は安定である同位体の熱照射、例えばホウ素中性子捕捉療法（Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）によって生成し得る。好適であり得る他の同位体は、Ｃａｒｔｅｒ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １，１１８−１２９、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ２；３９７−４１６、Ｐａｙｎｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３，２０７−２１２、Ｓｃｈｒａｍａ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．５，１４７−１５９、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ６；３４９−３５６に記載されている。
別の例では、タンパク質を細胞のプレターゲティングに用いる「受容体」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲートし、そのコンジュゲートを患者に投与して、その後、結合していないコンジュゲートを除去剤を用いて血流から除去した後、治療薬（例えば、放射性ヌクレオチド）とコンジュゲートされた「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、当技術分野において既知であり、容易に利用できる補助的な非タンパク質成分を含有するように修飾することができる。例えば、タンパク質の誘導体化に適した成分は、生理的に許容されるポリマー、例えば水溶性ポリマーである。このようなポリマーは、本開示のＣＸＣＲ４結合ポリペプチドの安定性の増大、及び／または（例えば腎臓による）クリアランスの低減、及び／または免疫原性の低減に有用である。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、またはプロプロピレングリコール（ＰＰＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一例では、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、検出及び／または単離を容易にする１種以上の検出可能なマーカーを含む。例えば、この化合物は、例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）のような蛍光標識を含む。このような蛍光物質の最大吸収波長及び最大発光波長は、それぞれＦＩＴＣ（４９０ｎｍ、５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ、５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ、５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ、６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ、７０３ｎｍ）、及びＣｙ７（７５５ｎｍ、７７８ｎｍ）である。
ある特定の例では、本開示のｉ−ｂｏｄｙを腫瘍のイメージングに有用な薬剤と連結することができる。このような薬剤としては、金属；金属キレート剤；ランタニド；ランタニドキレート剤；放射性金属；放射性金属キレート剤；ポジトロン放出原子核；マイクロバブル（超音波用）；リポソーム；リポソームまたはナノスフェア中にマイクロカプセル化された分子；単結晶酸化鉄ナノ化合物；磁気共鳴イメージング造影剤；光吸収剤、反射剤及び／または散乱剤；コロイド粒子；近赤外蛍光団などの蛍光団が挙げられる。数多くの例において、このような二次的機能／部分は比較的大きく、例えば、サイズが少なくとも２５ａｍｕであり、多くの場合、サイズが少なくとも５０、１００または２５０ａｍｕであり得る。ある特定の例では、二次的機能は、金属をキレート化するキレート成分、例えば、放射性金属または常磁性イオンのキレート剤である。追加例としては、放射線療法またはイメージング工程に有用な放射性核種のためのキレート剤である。
代わりにまたは加えて、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、例えば蛍光半導体ナノ結晶で標識される（例えば、ＵＳ６３０６６１０に記載）。
代わりにまたは加えて、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、例えば、鉄、鋼、ニッケル、コバルト、希土類、ネオジム−鉄−ホウ素、鉄−クロム−コバルト、ニッケル−鉄、コバルト−プラチナ、またはストロンチウムフェライトなどの磁性または常磁性化合物で標識される。
タンパク質の固定化
一例では、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、固体または半固体マトリックスに固定化される。用語「固定化」は、例えばＷＯ９９／５６１２６またはＷＯ０２／２６２９２に記載されているように、特定のマトリックスにタンパク質を固定化する種々の方法及び技術を含むと理解されるものとする。例えば固定化は、特に保存期間中、または１回分使用量形態において、生物学的、化学的または物理的曝露によってタンパク質の活性が低下または劣化することがないように、タンパク質を安定化する役割を果たす。
タンパク質をマトリックスに固定化する種々の方法が、当該技術分野において既知であり、これには架橋、担体への結合、及び半透過性マトリックス内での保持が含まれる。
例示的なマトリックスとしては、多孔性ゲル、酸化アルミニウム、ベントナイト、アガロース、デンプン、ナイロンまたはポリアクリルアミドが挙げられる。
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの活性試験
結合アッセイ
Ｇタンパク質共役受容体に対して最も特異的かつ強力な抗体は通常、タンパク質の三次構造によって形成される高次構造的に複雑なエピトープを標的としている。ネイティブ構造が完全な脂質二重層に依存する膜貫通タンパク質には、可溶性タンパク質標的に対して使用される方法は効果的ではない。
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、例えば、標準のフローサイトメトリー方法によってＣＸＣＲ４との結合性を試験することができる。本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、ヒトＣＸＣＲ４をそのネイティブコンフォメーションで認識することが好ましいため、ＣＸＣＲ４のネイティブコンフォメーションを発現する試薬を利用したアッセイを用いてＣＸＣＲ４への結合を特定することが好ましい。結合アッセイに使用できるネイティブコンフォメーションのＣＸＣＲ４を発現する試薬の非限定的な例としては、ＣＸＣＲ４を自然発現する細胞、ＣＸＣＲ４を発現するようにトランスフェクトされた細胞（例えばＣＸＣＲ４発現ベクターによってトランスフェクトされたＲ１６１０細胞）が挙げられる。ＣＸＣＲ４を発現する好適な細胞の例としては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−５４９、Ｒａｍｏｓ、Ｎａｍａｌｗａ、ＭＯＬＴ−４、ＤＵ−４４７５、ＤＵ−１４５、ＰＣ３、ＬＮｃａＰ、ＳＷ４８０、ＨＴ２９、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＳＪＳＡ−１−ｍｅｔ−ｌｕｃ及びＨＬ−６０細胞が挙げられる。簡潔には、フローサイトメトリーアッセイでは、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を、試験用ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドとともにインキュベートし、洗浄して、試験用抗体と結合可能な標識二次試薬とともにインキュベートし、再度洗浄して、二次試薬の細胞への結合を検出する分析を行う（例えばＦＡＣＳ装置を使用する）。フローサイトメトリーによって評価したときに、細胞を明瞭に染色しているＣＸＣＲ４分子またはポリペプチドを以降の試験に使用する。本開示による使用に適した結合アッセイの例としては、例えばフィルトレーションアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）もしくはＳＰＡアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒまたはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの放射性リガンド結合アッセイ、または例えばＤＥＬＦＩＡ（商標） ＴＲＦ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、もしくはＴａｇ−ｌｉｔｅ（商標）システム（Ｃｉｓｂｉｏ）などの標識リガンド結合アッセイが挙げられる。
あるいは、ＣＨＯ細胞株のような細胞株を、膜貫通形態のＣＸＣＲ４をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトすることができる。トランスフェクトされたタンパク質は、好ましくはＮ末端に、タグに対する抗体を使用して検出されるｍｙｃタグなどのタグを含んでいてもよい。本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの結合は、トランスフェクトした細胞をＣＸＣＲ４結合ポリペプチドとともにインキュベートし、結合したポリペプチドを検出することにより測定することができる。トランスフェクトしたタンパク質上のタグに結合する抗体を陽性対照として使用することができる。
結合性を評価する更なる方法には、高濃度のネイティブコンフォメーションの標的膜タンパク質を組み込むことができる脂質粒子（例えばＣＸＣＲ４を組み込んだ磁性プロテオリポソームまたはＣＸＣＲ４を組み込んだリポソーム粒子）の使用が必要である。このようなリポタンパク質は、例えばＷＯ２００５／０４２６９５、ＷＯ２０１１／０８３１４１、Ｂａｎｉｋ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２（９）：１４−１７、Ｗｉｌｌｉｓ Ｓ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：６９８８−９０に記載されている。目的の膜タンパク質（例えばＣＸＣＲ４）とともにレトロウイルスの構造的コアポリタンパク質（Ｇａｇ）を同時発現することにより、哺乳動物細胞由来の脂質粒子を作製する。Ｇａｇコアタンパク質は形質膜に自己集合し、そこで標的の膜タンパク質を切断して捕捉する。リポタンパク質は直径約１５０ｎｍであるため、容易に水溶液に懸濁させ接種に使用することができる。脂質粒子内の膜タンパク質は、機械的破壊または洗剤なしで細胞表面から直接抽出されるため、膜タンパク質のネイティブ構造及び配向が保持される。リポタンパク質には、標的外の免疫応答を生じ得る細胞質タンパク質または反転した膜タンパク質が含まれない。標準技術を使用して、本開示によるＣＸＣＲ４分子またはポリペプチドが結合する固体支持体上にリポタンパク質を固定化し、表面プラズモン共鳴法によって分析することができる（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ ＪＡ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ４（１１）：１５４２−１５５８、Ｓｔｅｎｌｕｎｄ Ｐ ｅｔ ａｌ（２００３）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１６（２）：２４３−５０、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９７：１１２１５−１１２２０、ＷＯ２００５／０４２６９５を参照）。
更に脂質粒子は、本開示のＣＸＣＲ４結合ポリペプチドが結合するＣＸＣＲ４残基であると特定された残基によって残基を変異させたものであってもよい。これにより、結合するＣＸＣＲ４結合ポリペプチドとＣＸＣＲ４エピトープ間の相互作用に、その側鎖が最大のエネルギーを寄与するアミノ酸を表す重要な残基が有効になる（Ｂｏｇａｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎ，（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０，１−９；Ｌｏ Ｃｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５， ２１７７−２１９８）。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２及びｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−５２３の結合に重要であると同定された残基は、ＣＸＣＲ４二量体構造で可視化した（ＰＤＢ ＩＤ＃３ＯＤＵから誘導；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０：１０６６−１０７１）。
もう一つのアッセイは、例えばＳｃｏｐｅｓ Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４に記載されているような抗原結合アッセイである。このような方法には、一般にＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを標識し、それを固定化標的またはその断片、例えばヒトＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ４陽性脂質粒子と接触させることを伴う。洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した後、標識の量及びその結果としての結合したタンパク質の量を検出する。無論、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを固定化し、標的を標識化することもできる。また、パニング型アッセイを使用することもできる。
ＣＸＣＲ４活性の阻害剤を決定する例示的方法は、競合結合アッセイである。例えば、標識したＳＤＦ−１をＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドとともに、またはＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの添加後に、ＣＸＣＲ４を発現する細胞または固定化されたＣＸＣＲ４陽性脂質粒子に付加する。結合していないＳＤＦ−１及び／またはＣＸＣＲ４結合分子もしくはポリペプチドを洗浄により除去した後、ＣＸＣＲ４に結合した標識の量を検出する。この量を、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの非存在下で培養した後に結合した量と比較して、ＳＤＦ−１結合（すなわち結合した標識）の量が低減したＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドがＣＸＣＲ４阻害剤と考えられる。
結合アッセイはまた、受容体を介したＧタンパク質活性の検出に使用することもできる（例えば、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｄ．Ｂｅｎｏｖｉｃ ＪＬ ｐｐ１１９−１３２（２０００）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ ＮＹ）。このようなアッセイには、Ｇαサブユニットへの受容体刺激性ＧＴＰ結合を含む。ＧＰＣＲの活性化は、ＧαサブユニットでのＧＤＰ−ＧＴＰ交換を生じさせるため、この交換を定量化して、受容体−Ｇタンパク質の相互作用の直接的な測定値として使用することができる。これには通常、無細胞膜標本または人工脂質膜内の受容体と、放射性標識したグアニンヌクレオチドの使用を伴う。取り込まれた放射性標識の量は、Ｇタンパク質の活性化範囲の測定値として使用される。
抗原結合親和性の試験方法は当技術分野において周知であり、これには最大半数結合試験、競合アッセイ及びスキャッチャード分析も含まれる。
親和性アッセイ
場合により、ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドの解離速度定数（Ｋｄ）、会合速度定数（Ｋａ）または結合定数／平衡解離定数（ＫＤ、すなわちＫｏｆｆ／Ｋｏｎ）を測定する。ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドのこれらの定数は、放射性標識または蛍光標識したＣＸＣＲ４の結合アッセイによって測定することができる。このアッセイでは、ＣＸＣＲ４陽性脂質粒子の濃度でＣＸＣＲ４結合ポリペプチドが平衡化する。結合していないＣＸＣＲ４を洗浄により除去した後、ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドの量を測定する。別の例によれば、定数は、ＣＸＣＲ４陽性脂質粒子を固定化した表面プラズモン共鳴分析、例えばＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して測定する（ＷＯ２００５／０４２６９５）。
結合分子がその標的からどれくらい速く解離するかを算出するために使用される定数である解離速度定数（Ｋｄ）を使用してオフレート（ｋｏｆｆ）を算出する。ＢＩＡｃｏｒｅ ＳＰＲ分析では勾配が平坦に見えるほど、オフレートは低速であり、従って結合は強くなる。下降が急になるほど、オフレートは高速であり、抗体結合は弱くなることを意味する。
結合分子がその標的とどれくらい速く結合するかを特性決定するために使用される定数である会合速度定数（Ｋａ）は、オンレートの算出に使用される反応部分である。
実験で測定されたオフレートとオンレートの比（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を使用して、ＫＤ値を算出する。大部分の結合分子は、低マイクロモル（１０−６）からナノモル（１０−７〜１０−９）の範囲のＫＤ値を有する。高親和性抗体は一般に低ナノモル範囲（１０−９）であり、極めて高親和性の抗体はピコモル（１０−１２）範囲であると考えられる。
機能性アッセイ
アゴニストまたはＳＤＦ−１などのリガンドがＣＸＣＲ４に結合すると、このＧタンパク質共役受容体によるシグナル伝達及びＧタンパク質の活性、ならびに他の細胞内シグナル伝達分子の刺激が生じ得る。本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの抑制性活性または刺激性活性を、リガンドあり、またはなしで、好適なアッセイで測定することができ、ならびにリガンドの存在下または非存在下で活性を阻害または刺激するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの能力を評価することができる。
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドによるＣＸＣＲ４受容体の活性は、例えば、β−アレスチン調節の変化、細胞内Ｃａ２＋濃度の変化、ホスホリパーゼＣの活性化、細胞内イノシトール三リン酸ＱＰ３濃度の変化、細胞内ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）濃度の変化、及び細胞内アデノシン環状３’，５’−モノホスフェート（ｃＡＭＰ）濃度の変化など、多数の方法で測定することができる。
ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解などのＧタンパク質活性、またはその後の細胞内（サイトゾル）遊離カルシウム濃度の急速かつ一過性の増加の開始などの、受容体結合によって誘導されるシグナル伝達イベントは、当技術分野で既知の方法または他の好適な方法によって分析することができる（例えば、Ｎｅｏｔｅ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：４１５−４２５；Ｖａｎ Ｒｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １７７：８５１−８５６）。
ｃＡＭＰアッセイ
本発明のポリペプチドによるＧＰＣＲの活性は、蛍光色素を有する細胞内ｃＡＭＰの増減を測定することによりモニターすることができる。細胞内ｃＡＭＰの測定方法は、当技術分野において既知である。ｃＡＭＰの細胞レベルを測定するアッセイは、ＧαｓまたはＧαｉ／ｏタンパク質へのＧＰＣＲの結合によって調節されるアデニル酸シクラーゼの活性に依存する。アデニル酸シクラーゼは、フォルスコリンによる前刺激を必要とする。加えて、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）酵素による、ｃＡＭＰのＡＭＰへの自然分解を抑制するため、アッセイ中の系の最適化に、ＰＤＥ（例えばＩＢＭＸ）の阻害剤が必要な場合がある。有用な膜透過性色素の例としては、細胞内エステラーゼによって切断されて遊離酸を形成できるアセトキシメチルエステル形態の色素が挙げられる。遊離酸はもはや膜透過性がなく、細胞内に捕捉されたままである。また、ＧＰＣＲによるアデニル酸シクラーゼ活性の調節によって生成されるｃＡＭＰのレベルを直接測定するように設計されたアッセイを用いることもできる。このようなアッセイは、内因性のｃＡＭＰと外因的に添加されたビオチン化ｃＡＭＰとの競合に基づく。ｃＡＭＰの捕捉は、固体材料、例えば捕捉ビーズにコンジュゲートされた特異抗体を用いて行う。
ＳＰＡ ｃＡＭＰアッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの放射測定アッセイ、及びＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製の１２５Ｉ標識化ｃＡＭＰを用いたＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（商標）ｃＡＭＰ分析が広く使用されている。近年、放射能の使用を回避するため、これらのアッセイに代わり、発光または蛍光によるホモジニアスアッセイが用いられている。更に別のアッセイは、ＤｉｓｃｏｖＲｘによる酵素断片相補性アッセイ（ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（商標））である。細胞性ｃＡＭＰは、β−ガラクトシダーゼの小さいペプチド断片で標識されたｃＡＭＰと、抗ｃＡＭＰ抗体への結合を競合する。得られた遊離標識ｃＡＭＰは酵素断片と相補し、蛍光または発光物質を用いて検出される活性β−ガラクトシダーゼを生成する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）は、高感度ビーズによる近傍化学発光アッセイである。ストレプトアビジンドナービーズ、及び抗ｃＡＭＰ抗体をコンジュゲートしたアクセプタービーズによって認識されるビオチン化ｃＡＭＰプローブと、細胞のｃＡＭＰが競合する。抗体からビオチン化ｃＡＭＰが放出されると、ストレプトアビジンドナーはそのアクセプターから解離する。これを化学発光シグナルの減少として測定することができる。
加えて、蛍光偏光法（ＦＰ）に用いるｃＡＭＰキットが、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。更にまた、ＨＴＲＦによるｃＡＭＰの検出法が、Ｃｉｓｂｉｏから提供されている。この方法では、新たなドナー（ユーロピウムクリプテートを標識したｃＡＭＰ抗体）とアクセプター（修飾したアロフィコシアニン色素で標識したｃＡＭＰ）の対が、シグナルの安定性を増幅させ、このアッセイをｃＡＭＰ測定に対して高感度かつ再現可能にするように設計されている。
より最近の商用アッセイ（例えばｃＡＭＰ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ））は、Ｇαタンパク質に連結されるＧＰＣＲを調節して、それによりアデニル酸シクラーゼを調節することが可能である。このアッセイは、ｃＡＭＰを、四量体の不活性ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の強力な活性化因子として用い、ｃＡＭＰが結合した調節サブユニットを解離し、遊離した活性触媒サブユニットを放出させる。ルシフェラーゼ／ルシフェリンによる反応を用いて、キナーゼ反応におけるＡＰＴ消費量を測定することにより、ＰＫＡの活性を測定することができる。ＡＴＰの消費量は、ｃＡＭＰによるＰＫＡの活性を表す。
β−アレスチン動員アッセイ
β−アレスチンは、ＧＰＣＲの活性化後、細胞表面に動員される細胞内タンパク質である。これはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性を調節する（Ｌｕｔｔｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１５：４５５−４６５）。この場合、本発明のポリペプチドにより、内在化する受容体の脱感作と標的化を引き起こす。β−アレスチンは、受容体脱感作、Ｇタンパク質結合シグナル伝達の終結、及び内在化における役割に加え、足場タンパク質として作用し、活性化したＧＰＣＲを付加的な細胞内シグナル伝達経路、例えばｃ−Ｓｒｃ、ＥＲＫ １／２及びＡｋｔなどのＧタンパク質に依存しない活性化に連結する。β−アレスチンの動員を測定するにはいくつかの方法を利用することができる。例えば、ＴｒａｎｓＦｌｕｏｒ（登録商標）アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）では、β−アレスチンをＧＦＰと結合し、受容体が活性化すると、ＧＦＰの変化が細胞質分配を拡散させ、ハイコンテントイメージングシステムによって可視化されるピットまたは小胞を含有するＧＦＰを形成する。
Ｘｕ Ｙ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９６：１５１−６に記載されている生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）技術（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）及びＴａｎｇｏ（商標）アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの複数の非イメージングによるβ−アレスチン動員アッセイを利用できる。ＢＲＥＴアッセイでは、目的とする受容体のＣ末端を蛍光タンパク質タグ（例えばｅＧＦＰ２、ＧＦＰ１０またはＹＦＰ）で標識し、β−アレスチンをレニラルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）で標識するか、またはその逆に標識する。β−アレスチンが動員されると、２つのタグが近接し、ＲＬｕｃ反応による発光がＧＦＰを励起し、次いでそれによって高波長の検出可能なシグナルが放出される。ＢＲＥＴは２つの発光の比（ＧＦＰ／ＲＬｕｃ）で算出する。
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴａｎｇｏ（商標）ＧＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍは、プロテアーゼ活性化レポーター遺伝子に基づくプラットフォームである。β−アレスチンをＴＥＶプロテアーゼと融合し、その一方でＧＰＣＲを、プロテアーゼ切断部位と、それに続く転写因子Ｇａｌ−ＶＰ１６を有するＣ末端に伸長させる。ＧＰＣＲが活性化すると、プロテアーゼ標識されたアレスチンが受容体に動員され、受容体に融合されたＧａｌ−ＶＰ１６が切断されて、核内に侵入し、β−ラクタマーゼレポーター遺伝子の転写を調節する。β−ラクタマーゼが２つの蛍光団で標識された修飾基質の切断を触媒し、この２つの蛍光団間のＦＲＥＴシグナル変化をモニターできるようになる。
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）アッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）は、β−ガラクトシダーゼの酵素断片の補完と、それに続く酵素活性を利用して受容体とβ−アレスチン間の相互作用を測定する。このアッセイでは、触媒に不活性であるβ−ガラクトシダーゼのＮ末端欠失突然変異体にβ−アレスチンを融合し、ＧＰＣＲのＣ末端を、β−ガラクトシダーゼの欠失したＮ末端配列に由来する小さい（４ｋＤａ）断片（ＰｒｏＬｉｎｋ（商標））で標識する。ＧＰＣＲとβ−アレスチン間の相互作用により、β−ガラクトシダーゼの２つの部分が近接し、その結果、酵素の活性化、基質の切断、及び化学発光シグナルの生成がもたらされる。
カルシウムアッセイ
本発明のポリペプチドによるＧＰＣＲ活性は、蛍光色素を用いて細胞内カルシウムの増減を測定することによりモニターすることができる。Ｃａ２＋アッセイは、細胞透過性Ｃａ２＋−感受性蛍光色素（例えばＦｌｕｏ−３及びＦｌｕｏ−４）及び自動化リアルタイム蛍光プレートリーダー、例えばＦＬＩＰＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）が利用可能になったことで、ＧＰＣＲスクリーニングにおいて非常に普及している。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅはまた、独自の消光分子が含まれた蛍光色素キットも提供しており、これは細胞内に色素がロードされた後、過剰な色素を除去するために細胞を洗浄する必要がない。ＦＬＩＰＲ（商標）の統合型注入機能により、アゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレーターの全てを１回のアッセイで検出できる、３８４-ウェルまたは１５３６-ウェル形式の超ハイスループットスクリーニングが可能である。蛍光色素を使用する代わりに、Ｃａ２＋−感受性バイオセンサーを使用することもできる。ＧＰＣＲの機能的スクリーニングに向け、セレンテラジン誘導体の存在下で、高い細胞内Ｃａ２＋に応答して強度の発光シグナルを発生させるクラゲ発光タンパク質エクオリンの組換え発現も開発されている（Ｅｇｌｅｎ ＲＭ ｅｔ ａｌ（２００８）Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ ６：６５９−７１）。
それ以外の市販アッセイとしては、Ｆｌｕｏ−４／Ｆｌｕｏｒ−８カルシウム動員アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＴａｎｇｏ（商標）ＧＰＣＲアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。
走化性アッセイ
走化性アッセイを使用して、本発明のＣＸＣＲ４結合ポリペプチドの、ＣＸＣＲ４に対するリガンドの結合を遮断する能力及び／または受容体へのリガンドの結合と関連した機能を阻害する能力を評価することもできる（Ｆｅｒｎａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：１５７−１６７）。このアッセイは、化合物（化学誘引物質）によって誘導される、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の機能的遊走に基づく。走化性は、任意の好適な手段、例えば、９６ウェル走化性プレートを利用したアッセイ、または走化性を評価する当技術分野で認識された他の方法によって評価することができる。一例では、走化性アッセイを利用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＰＣ３またはＮＣＩ−Ｈ６９細胞の遊走を評価することができる。例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞（２００ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中に５ｘ１０５細胞）を本発明のポリペプチド及びＳＤＦ−１を加えて、及び加えずにプレインキュベートし、０．２５％のＢＳＡを入れた直径６．５ｍｍ、５ｍＭ孔ポリカーボネートのＴｒａｎｓｗｅｌｌ培養インサート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の上部ウェルに添加する。ＳＤＦ−１（固定濃度）を下部ウェルに添加して、細胞を３７℃で４時間インキュベートし、遊走させる。下部チャンバ内の遊走細胞は、ＺＭ Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて計数する。
増殖アッセイ
本開示のＣＸＣＲ４結合ポリペプチドが、腫瘍細胞（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−５４９、Ｒａｍｏｓ、Ｎａｍａｌｗａ、ＭＯＬＴ−４、ＤＵ−４４７５、ＤＵ−１４５、ＰＣ３、ＬＮｃａＰ、ＳＷ４８０、ＨＴ２９、ＮＣＩ−Ｈ６９及びＨＬ６０などの、ＣＸＣＲ４を表面に発現する腫瘍細胞）、またはＣＸＣＲ４を発現するように操作された細胞株において細胞増殖を阻害する能力を評価することができる。また、本開示のＣＸＣＲ４結合ポリペプチドが、ＣＤ３４＋前駆細胞の細胞増殖を阻害する能力を評価することもできる（例えば、Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＸＣＲ４ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４＋ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（（２００４）Ｂｌｏｏｄ．１０３：２９４２−２９４９）。細胞増殖アッセイは当業者に既知であろう。細胞増殖アッセイの例としては、例えばＷＯ０１／０８１６１４及びＵＳ５９７２６３９に記載されている、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（ＡＴＣＣ）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣｙＱＵＡＮＴ Ｄｉｒｅｃｔ細胞増殖アッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。
アポトーシスアッセイ
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドが、アポトーシスを誘導する能力を評価することができる。当業者に既知である種々の形式のアポトーシスアッセイが利用可能である。以下はその例である：
（ｉ）カスパーゼアッセイ、例えばＰｈｉＰｈｉＬｕｘ（登録商標）（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ，Ｉｎｃ）、カスパーゼ３活性アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＣａｓｐＡＣＥ（商標）アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）カスパーゼ−３アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、活性カスパーゼ−３検出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カスパーゼ媒介性アポトーシス製品（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）、ＣａｓＰＡＳＥ（商標）アポトーシスアッセイキット（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；
（ｉｉ）Ｔｕｎｎｅｌ及びＤＮＡ断片アッセイ、例えばＡｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、細胞ＤＮＡ断片ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤｅａｄＥｎｄ（商標）ＴＵＮＥＬシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＰＯ−ＢｒｄＵ（商標）ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＵＮＥＬアポトーシス検出キット（Ｕｐｓｔａｔｅ）、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｍｅｂｓｔａｉｎキット（Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））、核媒介性アポトーシスキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）、アポトティックＤＮＡラダーキット（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；
（ｉｉｉ）細胞透過性アッセイ、例えばＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ（商標）アッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ａｓｓａｙｓ）；
（ｉｖ）アネキシンＶアッセイ、例えばアネキシンＶであるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０、すなわちビス−（Ｌ−アスパラギン酸アミド）、トリフルオロ酢酸塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アネキシンＶアポトーシスキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）；
（ｖ）タンパク質切断アッセイ、例えば抗ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｍ３０ ＣｙｔｏＤＥＡＴＨ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）；
（ｖｉ）ミトコンドリア及びＡＴＰ／ＡＤＰアッセイ、例えばＡｐｏＧｌｏｗ（登録商標）アポトーシススクリーニングキット、ミトコンドリア膜電位検出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びミトコンドリア媒介性アポトーシス製品（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）；ならびに
（ｖｉｉ）本明細書に開示された例に記載される、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムの併用。
血管形成アッセイ
血管形成は、内皮細胞遊走、浸潤及び毛細管への分化を含む多くの細胞事象を特徴とする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ内皮管形成アッセイは、内皮分化と、抗血管形成薬による内皮管形成の調節を試験するためのモデルとして使用される（例えば、Ｓｈａｒｏｎ ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ ａｎｄ Ｖｉｃｔｏｒ Ｓｈｉｆｒｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４１７５５．ｐｈ１２１２ｓ４３、またはＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．Ａｕｇｕｓｔ ３；３５９（３）：７１６−７２２を参照）。典型的な内皮管形成アッセイは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＨＭＶＥＣ及びＨＭＥＣ−１細胞を使用して行う。１％のＦＢＳと２００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１２を加えたＭ１９９培地のマトリゲル層に１ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で細胞を播種する。１８時間後、ウェルを４倍率で撮影し、ウェルの脈管網の数を計数する。
受容体二量体アッセイ
ＣＸＣＲ４は、ＣＸＣＲ７、ＣＣＲ５、β２ＡＲ（β２アドレナリン受容体）、ＣＣＲ２、ＤＯＲ（デルタオピオイド受容体）及びＣＣＲ７と形質膜で相互作用し、ＣＸＣＲ４とのホモ二量体を含む、ヘテロ二量体、オリゴマーまたは更に高次の複合体を形成する。ＧＰＲＣヘテロ二量体を特異的標的とする化合物、または受容体の二量体化に影響を及ぼす化合物は、特異的治療効果を実現する可能性を有し得る（Ｒｏｚｅｎｆｅｌｄ Ｒ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４３３：１１−８）。受容体の二量体化をモニターするために、共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴ）を含む、種々の技術が確立されている。
よく用いられるＦＲＥＴまたはＢＲＥＴによる方法では、ドナー分子及びアクセプター分子をＧＰＣＲのＣ末端に遺伝的融合し、それを細胞中で過剰発現させる。ＧＰＣＲが二量体化された結果、ドナー分子及びアクセプター分子が近接すると、共鳴エネルギー移動が発生する（Ａｃｈｏｕｒ Ｌ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７５６：１８３−２００に概説）。ただし、このような従来のＦＲＥＴ及びＢＲＥＴアッセイの限界の一つは、過剰発現系において、細胞内区画内でも共鳴エネルギー移動が発生し、それによって細胞表面でのタンパク質の直接的な相互作用によってのみ生じる特異的シグナルを証明することが困難なことである。
米国特許８，２８３，１２７号、表題「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」に記載されているＧＰＣＲ二量体化アッセイは、任意の２つのタンパク質のヘテロマーのリガンド依存的同定、モニタリング及びスクリーニングのためのＤｉｍｅｒｉｘのＨｅｔｅｒｏｍｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＨＩＴ）アッセイ構成を対象とする。これはまた、近傍性に基づいたレポーター系全てによるＤｉｍｅｒｉｘの応用アッセイも対象とする。
Ｔａｇ−ｌｉｔｅ（商標）を用いたＧＰＣＲ二量体アッセイは、ＴＲ−ＦＲＥＴとＳＮＡＰ−ｔａｇ（商標）技術（Ｃｉｓｂｉｏ）を組み合わせて、９６ウェルまたは３８４ウェル形式における生細胞表面でのタンパク質−タンパク質相互作用の定量分析を可能にする方法である。このアッセイでは、ＧＰＣＲのＮ末端をＳＮＡＰタグまたはＣＬＩＰタグのいずれかで標識し、その後、適切なＴＲ−ＦＲＥＴ適合性蛍光団（通常はドナーとしてテルビウムクリプテートを、アクセプターとして緑色または赤色蛍光分子を使用する）を担持した、ＧＰＣＲと対応する細胞非透過性物質で標識する。本アッセイには、いくつかの可能な二量体の組み合わせが存在する。二量体の１／４は両方ともドナー標識された受容体を含み、二量体の１／４は両方ともアクセプター標識された受容体を含み、二量体の１／２はドナー標識された受容体１つと、アクセプター標識された受容体１つを含む。最後の１／２のみがＦＲＥＴシグナルを発生する。
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）システム（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）は、ＧＰＣＲヘテロ二量体の分析に使用できる、もう一つのプラットフォームである。前述のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）β−アレスチン動員アッセイに利用した細胞株を出発物質として使用することができる。この細胞株では、β−アレスチンがβ−ガラクトシダーゼ酵素アクセプターの大きい部分に融合され、小さい４２アミノ酸のＰｒｏＬｉｎｋ（商標）タグがＧＰＣＲ標的の１つに結合されている。第２の未標識ＧＰＣＲを細胞に導入することができ、この未標識ＧＰＣＲのＰｒｏＬｉｎｋ（商標）標識したＧＰＣＲに対するトランス活性化効果を、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬を使用して、標識ＧＰＣＲへのβ−アレスチンの動員によって測定することができる。トランス活性化強度は、未標識ＧＰＣＲのアゴニストに対する細胞応答とＰｒｏｌｉｎｋ（商標）−ＧＰＣＲのアゴニストに対する応答との比として評価することができる。このアッセイを使用して、ＧＰＣＲ対間、例えばＣＸＣＲ４とＣＸＣＲ７、ＣＸＣＲ４とＣＣＲ５、またはＣＸＣＲ４とβ２ＡＲ、またはＣＸＣＲ４とＤＯＲ、またはＣＸＣＲ４とＣＣＲ２、またはＣＸＣＲ４とＣＣＲ７の間の相互作用を調べるとともに、３８４ウェル形式でのＧＰＣＲヘテロ二量体化の促進と分離によって、ＧＰＣＰ活性を調節する化合物をスクリーニングすることができる。
競合アッセイ
競合試験を使用して、リガンドＳＤＦ−１またはポリペプチド（ｉ−ｂｏｄｙ）を含むＣＸＣＲ４結合分子がＣＸＣＲ４への結合を競合する能力を決定することができる。通常、一定濃度のＳＤＦ−１またはＦＩＴＣ標識ヒト抗ＣＸＣＲ４抗体（例えば１２Ｇ５）の存在下で、例えば１００ｎｍ〜５ｐＭの濃度範囲になるように、ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙを連続した１：３階段希釈で滴定する。次に、その混合物をＣＸＣＲ４発現細胞に添加し、結合させる。各ｉ−ｂｏｄｙが、ＣＸＣＲ４発現細胞への結合を１２Ｇ５と競合する能力は、蛍光サイトメトリー及びＦＩＴＣの検出によって評価することができる。
競合試験はまた、ＷＯ２００５／０４２６９５に記載のリポタンパク質（ＩｎｔｅｇｒａＭｏｌｅｃｕｌａｒ）を含有するＣＸＣＲ４を利用して行うこともできる。
本開示のｉ−ｂｏｄｙが種々の異なる細胞株と結合する能力は、フローサイトメトリーによってＦＡＣＳ滴定を実施することにより検討することもできる。増加量のｉ−ｂｏｄｙを１００，０００細胞とインキュベートし、結合をフローサイトメトリーによって評価することができる。Ｂｍａｘ値も決定することができ、これは各細胞に存在するＣＸＣＲ４分子の概算の数を示した。結合曲線に基づいて、ｉ−ｂｏｄｙ結合のＥＣ５０を決定することができる。好適な細胞株の例としては、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、Ｎａｍａｌｗａ、Ｌ５４０、ＤＭＳ７９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−５４９、ＭＯＬＴ−４、ＤＵ−４４７５、ＤＵ−１４５、ＰＣ３、ＬＮｃａＰ、ＳＷ４８０、ＨＴ２９、ＮＣＩ−Ｈ６９及びＨＬ６０が挙げられる。
本開示のｉ−ｂｏｄｙが、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なるサブセットと結合する能力も検討することができる。ヒトＰＢＭＣを標準方法によって分離し、更に細胞サブセットをＦＡＣＳによって分離することができる。細胞サブセットの例には、ＣＤ３＋、ＣＤ２０＋、ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１４＋のうちの１つ以上を含む。結合性を、本明細書の実施例に示すような好適な対照と比較して、フローサイトメトリーによって評価することができる。
競合アッセイは、ヨウ素１２５で標識したＳＤＦ−Ｉと、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ４脂質粒子を自然に発現する細胞株を使用して行うことができる。ｉ−ｂｏｄｙのＣＸＣＲ４発現細胞株へのＳＤＦ−Ｉ結合の阻害に関する比較は、標準的な放射性標識リガンド結合アッセイによって行うことができる。ｉ−ｂｏｄｙを１：３に順次希釈し、一定範囲の濃度を得ることができたら、比活性２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅの１２５Ｉ−ＳＤＦ−Ｉの存在下で、ＣＸＣＲ４発現細胞に添加する（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＥＭ３１４−２５ＵＣＩ）。ｉ−ｂｏｄｙの非存在下で１２５Ｉ−ＳＤＦ−ＩをＣＸＣＲ４発現細胞に４０℃で２時間、結合させることにより、結合が可能な放射性標識リガンド総量を決定することができる。１μＭの未標識ＳＤＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３００−２８Ａ）の存在下で、１２５Ｉ−ＳＤＦ−Ｉを結合させることにより、放射性標識リガンドの非特異的結合を決定することができる。次に、細胞と会合した１２５Ｉ−ＳＤＦ−Ｉの量を標準方法で測定する。
あるいは、未標識ＳＤＦ−１を使用して、ＣＸＣＲ４を過剰発現する脂質粒子への結合をｉ−ｂｏｄｙと競合させてもよい。ｉ−ｂｏｄｙのこのような脂質粒子への結合は、Ｈｉｓタグに対する抗体またはＦＬＡＧタグに対する抗体を用いて検出することができる。増加濃度のＳＤＦ−１を添加し、結合が残存しているｉ−ｂｏｄｙの量を測定する。これは、ＣＸＣＲ４脂質粒子がプラスチックに固定化されたＥＬＩＳＡ形式で行うことができる。この情報により、ＣＸＣＲ４上のｉ−ｂｏｄｙの結合部位がリガンドＳＤＦ−１と同一であるか、または近似するか、または異なるかが決定する。
タンパク質検出アッセイ
本開示の一例では、ＣＸＣＲ４またはそれが発現する細胞、または膜内にＣＸＣＲ４を含んでいる脂質粒子の存在を検出する。タンパク質または細胞の量、レベルまたは存在は、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学染色、免疫蛍光法、免疫ブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、質量分析法（タンデム型質量分析法、例えばＬＣ ＭＳ／ＭＳを含む）、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバーオプティックス技術またはタンパク質チップ技術からなる群から選択される技術などの当事者に既知である種々の技術のいずれかを使用して決定される。
一例では、タンパク質の量またはレベルを決定するために使用されるアッセイは、半定量分析である。
別の例では、タンパク質の量またはレベルを決定するために使用されるアッセイは、定量分析である。
例えば、タンパク質は免疫アッセイによって、例えば、免疫組織化学染色、免疫蛍光法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、バイオセンサーアッセイ、タンパク質チップアッセイ及び免疫染色アッセイ（例えば免疫蛍光法）からなる群から選択されるアッセイを使用して検出する。
標準的な固相ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡ形式は、種々のサンプル由来のタンパク質濃度の決定に特に有用である。
一形態では、ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡは、例えばメンブレン、ポリスチレンもしくはポリカーボネートのマイクロウェル、ポリスチレンもしくはポリカーボネートのディップスティック、またはガラス支持体などの固体マトリックス上にＣＸＣＲ４脂質粒子を固定化することを含む。次に、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを含むサンプルを、固定化されたＣＸＣＲ４タンパク質と物理的に相対させ、結合すなわち「捕捉」させる。次いで、結合したＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの末端に位置するタグ配列と結合する第２の標識化合物を使用して検出する。
本明細書に記載するアッセイ形式が、例えばスクリーニング工程の自動化またはマイクロアレイ形式などのハイスループット形式に適していることは当業者にとって明らかであろう。更に上記アッセイの変形、例えば競合ＥＬＩＳＡなどは、当業者にとって明らかであろう。
代替例では、当技術分野で既知の方法、例えば免疫組織化学染色または免疫蛍光法などを用いて、細胞内または細胞上のポリペプチドを検出する。免疫蛍光法を用いた方法は定量的または少なくとも半定量的であるため、典型例となる。染色された細胞の蛍光度を定量化する方法は、当技術分野において既知である。
ＣＸＣＲ４を含有する脂質粒子を使用して、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドのＣＸＣＲ４との結合を評価することができる。脂質粒子に埋め込まれたＣＸＣＲ４タンパク質は、可溶性タンパク質または全細胞を使用できないアッセイ、例えば目的とするタンパク質（例えばＣＸＣＲ４）が支持体または基材に結合されなければならないアッセイ、例えば、バイオセンサーアッセイなどのマイクロ流体デバイスを用いたアッセイなどで使用することができる。いくつかの例では、リポタンパク質を表面に付着させた後、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドと接触させ、バイオセンサーにより本発明のＣＸＣＲ４ポリペプチドの脂質粒子への結合を検出する。検出は、表面プラズモン共鳴、比色分析の回折格子、マイクロカンチレバーの偏向（Ｗｅｅｋｓ ＢＬ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｓｃａｎｎｉｎｇ ２５（６）：２９７−９）、または音波反応（Ｃｏｐｅｒ ＭＡ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，８３３−８３７）による。いくつかの例では、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを、センサーの一部である表面に付着させた後、脂質粒子と接触させ、結合を検出する。検出は、表面プラズモン共鳴、比色分析の回折格子、マイクロカンチレバーの偏向、または音波反応による。いくつかの例では、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドと脂質粒子とを溶液中で接触させる。
バイオセンサー装置は、生体分子間の相互作用を測定するように設計されている。バイオセンサー装置は一般に、電極表面と電流の組み合わせ、またはデバイスに組み込まれたインピーダンス測定素子とアッセイ基質との組み合わせ（ＵＳ５５６７３０１に記載されているものなど）を用いている。通常、バイオセンサーは、目的とするタンパク質とそれに結合できる可能性があるリガンドとの間の直接的な相互作用を測定する。バイオセンサーは通常、非常に高感度であり、微弱なまたは極少量の相互作用でも作動して検出することができる。光学チップ、ファイバーオプティクス、スペクトロメーター検出器、マイクロチャネルチップ、ナノウェル及びマイクロカンチレバー、ならびに音波装置からなるバイオセンサー装置が作製されている。当技術分野において既知のバイオセンサーのうち、一部の形態はまた、表面プラズモン共鳴を利用してタンパク質の相互作用を検出する。このとき表面プラズモン共鳴の反射面の変化が、リガンドまたは抗体へのタンパク質の結合を示す（ＵＳ５４８５２７７及びＵＳ５４９２８４０）。
一例では、脂質粒子をセンサー表面に付着させる。ここでの「センサー表面」とは、表面を分子またはポリペプチドと接触させることによってもたらされる基材の特性変化を検出して、このような接触がない表面と比較することができるあらゆる基材である。ただし、他の例では、脂質粒子はセンサー表面に既に付着されている。センサー表面がバイオセンサーチップであり得る一方、センサー表面はまた、例えばＢｉａｃｏｒｅ Ｃ１チップ、Ｆ１チップ、例えば金のコーティングを含むガラス基材などの、当技術分野で既知であるいかなるバイオセンサーチップをも含む。
バイオセンサーは、このような系をマイクロスケールまたはナノスケールに適応させることが容易であるため、ハイスループット分析において特に有用である。更に、このような系を、複数の検出試薬を組み込むように好都合に適合させ、単一のバイオセンサー単位で診断試薬を多重化することが可能である。これにより、少量の体液で数種類のタンパク質またはペプチドを同時に検出することが可能になる。
本開示はまた、目的とするタンパク質が膜成分（例えばＣＸＣＲ４）であり、かつ結合分子またはポリペプチドとのタンパク質の結合試験が、脂質二重層と関連するタンパク質の提示、及び／または支持体または固体基材へのタンパク質の付着を必要とする、またはそれによって容易になる、あらゆるアッセイも包含する。このようなアッセイとしては、マイクロ流体デバイス、光学バイオセンサー、内部全反射フーリエ変換赤外分光法（１９９９８，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ ９６：６９−８０）を使用する種類のバイオセンサーであるＰＡＴＩＲ−ＦＴＩＲ分光計、ＣＰＲＷバイオセンサー（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ７３：２７９１−２１９７に記載されたような結合プラズモン導波路共鳴（Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＣＰＷＲ）分光計）、Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓに記載されたような多重極結合分光計（ｍｕｌｔｉｐｏｌｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＭＣＳ）、Ｗａｌｔ ｅｔ ａｌ（２００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：４５１−５２及びＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８２：６９７−７００に記載されたような光ファイバーバイオセンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １１：４７−５３に記載されたようなラボオンチップマイクロ流体、マイクロチャネル（コンパクトディスクを基板とするデバイスにエッチングされたＧｙｒｏｓのマイクロチャネル）、Tamayo ｅｔ ａｌ（２００１）Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ８６：１６７−１７３に記載されたようなマイクロカンチレバー、ＷＯ０１／０２５５１に記載されたような共焦点顕微鏡とナノウェルによる検出、及びマイクロウェル結合アッセイを使用するアッセイが挙げられる。一例では、センサー表面は９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルのナノウェル、光ファイバーまたはスライド形式を含む。
イメージング方法
上記から当業者には明らかであるが、本開示はまた、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを使用したイメージング方法も企図する。イメージングでは、一般にＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを検出可能標識とコンジュゲートするが、この標識は、イメージングによって検出可能であるシグナルを発することができる何らかの分子または薬剤であり得る。ただし、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドと特異的に結合する第２の標識化合物もまた使用することができる。例示的な検出可能標識としては、タンパク質、放射性同位体、蛍光団、可視光発光蛍光団、赤外発光蛍光団、金属、強磁性体、電磁放射体、特定の磁気共鳴（ＭＲ）分光学的特徴を有する物質、Ｘ線吸収もしくは反射物質、または音響変化物質が挙げられる。
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチド（及び使用する場合は二次標識化合物）は、全身に、または局所の臓器もしくは組織（もしくは癌の場合は腫瘍）に投与して画像化した後、画像処理することができる。一般にＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、腫瘍、組織または臓器の望ましい光学画像を実現するのに効果的な用量で投与される。そのような用量は、使用される特定のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチド、画像化する病態、イメージング工程を施す組織または臓器、使用されるイメージング装置等に依存して大幅に変化し得る。
本開示のいくつかの例では、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、これに限定されないが、腫瘍のイメージング、臓器の断層撮影、臓器機能の監視、冠動脈造影、蛍光内視鏡検査、レーザー誘導手術、光音響法及び音響蛍光法（ｓｏｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）などの種々の生物医学的応用において組織及び臓器のｉｎ ｖｉｖｏ光学造影剤として使用される。
イメージング方法の例としては、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、ＭＲ分光法、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波、ガンマカメラ平面画像撮影、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、その他の核医学に基づくイメージング、可視光を用いた光学イメージング、ルシフェラーゼを用いた光学イメージング、蛍光団を用いた光学イメージング、その他の光学イメージング、近赤外光を用いたイメージング、または赤外光を用いたイメージングが挙げられる。
いくつかの例において、造影剤は、例えば本明細書に記載するモデルを使用して、ヒトに使用する前にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて試験される。
サンプル
本開示の方法が、ｉｎ ｖｉｖｏに基づくスクリーニングとしてではなく、単離した組織サンプルに対してｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される場合に限り、「サンプル」は、対象由来の生体物質のあらゆるサンプル、例えばこれに限定されないが、体液（例えば、血液または滑液または脳脊髄液）、細胞物質（例えば組織吸引物）、組織生検標本または外科的標本などを意味すると理解すべきである。
本開示の方法に従って使用されるサンプルは、直接使用される場合もあれば、使用前に何らか形で処理を必要とする場合もある。例えば、生検サンプルまたは外科的サンプルは、使用前にホモジナイゼーションまたは他の形態の細胞分散を必要とし得る。更にまた生体サンプルが液状でない場合に限り、（そのような形式が必要とされるまたは望ましい場合）緩衝液などの試薬を添加してサンプルを流動化することが必要となる場合がある。
上記の説明から明らかなように、このようなアッセイには、例えば定量化に適した対照、例えば正常もしくは健常な個体または典型的な集団を使用することが必要となる場合がある。
「健常な対象」は、病態、例えばＣＸＣＲ４関連の疾患または障害に罹患していると診断されていないもの、及び／またはそのような疾患または障害を発現するリスクのないものである。
あるいは、または加えて、好適な対照サンプルとは、病態に罹患していないことがわかっている典型的な対象集団について試験したマーカー測定値を含む対照データセットである。
一例では、基準サンプルはアッセイに含まれない。その代わり、好適な基準サンプルは、典型的な集団から事前に得た確立されたデータセットに由来する。試験用サンプルの処理、分析及び／または試験から得たデータを、更にサンプル集団に関して得たデータと比較する。
医薬組成物
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチド（活性成分と同義）は、非経口、外用、経口、もしくは局所投与、エアロゾル投与、または経皮投与用の医薬組成物、予防的治療用の医薬組成物、または治療的処置用の医薬組成物に製剤化するのに有用である。医薬組成物は、投与方法に応じて種々の単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形として、粉末、錠剤、丸薬、カプセル剤及びトローチ剤が挙げられる。
本開示の医薬組成物は、非経口投与、例えば静脈内投与または皮下投与または臓器もしくは関節の体腔もしくは管腔への投与に有用である。投与用の組成物は一般に、薬学的に許容される担体、例えば水性担体中に溶解した本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの溶液を含む。種々の水性担体、例えば緩衝生理食塩水等を使用することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される担体、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有することができる。こうした製剤中の本開示の結合分子またはポリペプチドの濃度は広範囲に変更可能であり、また選択した特定の投与モードと患者の必要性に従って、主に液量、粘度、体重等に基づいて選択することになる。例示的な担体としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油及びオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルも使用することができる。リポソームを担体として使用することもできる。ビヒクルは、等張性及び化学安定性を増強する少量の添加剤、例えば緩衝液及び保存剤を含有することができる。
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、非経口投与用に製剤化でき、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、またはその他の類する経路を介する注入、例えば腫瘍部位もしくは疾患部位への蠕動投与及び直接的点滴注入（腔内投与）用に製剤化することができる。本開示の化合物を活性成分として含有する水性組成物の調製は、当業者には既知であろう。
本発明による好適な医薬組成物は一般に、使用目的に応じた最終濃度範囲を得るように、許容される薬学的担体、例えば滅菌水溶液と混合された、ある量の本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを含む。調製手法は一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８０に例示されるように、当技術分野において既知である。
製剤化された本開示の化合物は、剤形に適合する方法で、及び治療効果／予防効果がある量で投与される。本発明の化合物の好適な投与量は、具体的な化合物、治療すべき病態及び／または治療を受ける対象に応じて異なるはずである。例えば、最適なまたは有用な投与量を決定するために、最適投与量以下で開始し、投与量を徐々に増加させることにより好適な投与量を決定することは、熟練医の能力の範囲内である。
本明細書の開示に基づけば、投与の例示的な投与量及びタイミングは当業者に明らかであろう。
本開示の組成物は、他の治療成分またはイメージング／診断成分と併用することができる。例えば、本開示の医薬組成物は、ビスホスホネート、活性ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオールなどのホルモン製剤、ＳＥＲＭ（選択的エストロゲン受容体モジュレーター）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）製剤、非ステロイド抗炎症薬、可溶性ＴＮＦ受容体製剤、抗ＴＮＦα結合分子、抗体もしくは当該抗体の機能的断片、抗ＰＴＨｒＰ（副甲状腺ホルモン関連タンパク質）結合分子、抗体もしくは当該抗体の機能的断片、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−６受容体結合分子、抗体もしくは当該抗体の機能的断片、抗ＶＥＧＦ−Ａ結合分子もしくは抗体、抗ＣＤ２０結合分子もしくは抗体、抗ＰＤＬ−１もしくは抗ＰＤ１結合分子もしくは抗体、抗ＣＣＬ２結合分子もしくは抗体、抗ＣＣＲ２結合分子もしくは抗体、抗ＲＡＮＫ−Ｌ結合分子もしくは当該抗体の機能的断片、またはｉ−ｂｏｄｙからなる群から選択される追加の活性薬を含み得る。
本開示の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等）、（２）油溶性抗酸化剤（例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等）、及び（３）金属キレート剤（例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等）が挙げられる。
本開示の医薬組成物はまた、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法には、少なくとも１つの他の抗癌剤、抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを含むことができる。
抗癌剤または化学療法剤の例としては、ミトキサントロン、エトポシド、アザシチジン、レナリドミド、テモゾロミド、デシタビン、ガネテスピブ、クロファラビン、シタラビン、ダウノルビシン、ビノレルビン、アザシチジン、ソラフェニブ、リツキシマブ、ベバシズマブまたはボルテゾミブが挙げられる。
こうした組成物はまた、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤も含み得る。滅菌処理によって、及び種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸を含めることによって、微生物の存在を確実に防止することができる。また、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物に含むことが望ましい場合もある。加えて、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収遅延剤を含めることによって、注射用医薬形態の持続的な吸収をもたらすことができる。
一回用量形態を得るため、薬学的に許容される担体と合剤化できる活性成分の量は、治療される対象及び特定の投与様式に応じて異なる。一回用量形態を得るため、担体物質と合剤化できる活性成分の量は一般に、治療効果を生じさせる組成物の活性成分量である。一般に、この量は１００パーセントのうち、活性成分（すなわちＣＸＣＲ４結合ポリペプチド）が約０．０１パーセント〜約９９パーセントの範囲であり、薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分が、一例では約０．１パーセント〜約７０パーセント、一例では約１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。投与計画は、最適な望ましい反応（例えば治療反応）を実現するように調整される。例えば、単一のボーラスを投与しても、複数に分割した用量を経時的に投与しても、治療状況の緊急性によって必要とされる容量に比例して増減してもよい。投与の容易性及び投与量の均一化のため、非経口組成物を単位剤形で製剤化すると特に有利である。本明細書で使用される場合、用語「単位剤形」は、治療される対象に応じた投与単位として適する物理的な個別単位を指す。各単位には、必要とされる薬学的担体と会合されたとき、望ましい治療効果を生じさせるように計算された活性化合物の所定量を含有する。本開示の単位剤形の規格は、（ａ）活性化合物固有の特徴及び達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性を治療するためのそのような活性化合物を調剤する技術分野に固有の制限により決定され、それに直接依存する。ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの投与では、投与量は、宿主体重当たり約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ及び通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な治療計画は、１日１回、週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、月１回、３か月毎に１回、または３〜６か月毎に１回の投与を必要とする。本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの好ましい投与計画には、（ｉ）６投与量を４週毎、次いで３か月毎、（ｉｉ）３週毎、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、続いて１ｍｇ／ｋｇ体重を３週毎のうち、いずれか１つの投薬スケジュールを用いて、抗体とともに、静脈内投与経由で１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を与えることを含む。
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、対象に対して毒性がなく、特定の患者、組成物、及び投与様式について望ましい治療応答を達成するために有効である活性成分量が得られるように変更してもよい。選択する投与量レベルは、使用する本開示の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排泄速度、治療の持続期間、使用する特定の化合物と併用される他の薬物、化合物及び／または物質、治療対象の患者の年齢、性別、体重、病態、全身健康状態及び以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の因子を含めた、様々な薬物動態因子に依存する。「治療有効投与量」の本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、疾患症状の重症度の軽減、疾患の無症状期間の頻度及び期間の増加、または疾患の苦痛を原因とする損傷または廃疾の予防をもたらすことが好ましい。例えば、ＣＸＣＲ４＋腫瘍の治療の場合、「治療有効投与量」が、無治療対象と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％または少なくとも約８０％、細胞成長または腫瘍成長を阻害することが好ましい。化合物が腫瘍成長を阻害する能力を動物モデル系で評価し、ヒト腫瘍での有効性を予測することができる。あるいは、組成物のこの特性は、化合物が細胞成長を阻害する能力を調べることによって評価することができ、このような阻害は、当業者に既知であるアッセイによってｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。治療有効量の治療化合物は、腫瘍サイズを減少させることができ、あるいは減少しない場合でも対象の症状を改善することができる。当業者であれば、そのような量を対象の大きさ、対象の症状の重症度、及び選択された特定の組成物または投与経路のような要因に基づいて決定することが可能である。
治療組成物は、当技術分野で既知の医療装置によって投与することができる。例えば、本開示の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に開示される装置などの無針皮下注射装置によって投与することができる。本開示に有用である周知のインプラント及びモジュールの例としては、制御速度で薬剤を分注するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚経由で薬剤を投与するための治療装置を開示する米国特許第４，４８６，１９４号、正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、連続した薬物送達のための可変流の移植可能な注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、マルチチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号、及び浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。それ以外にも数多くのそのようなインプラント、送達系及びモジュールが当業者に既知である。
一例では、ヒト患者に投与できるように、組成物はパイロジェンフリーに調製される。
本開示はまた、本開示の障害を治療するための医薬の製造に、本開示のいずれかのＣＸＣＲ結合ポリペプチド／ｉ−ｂｏｄｙ組成物を使用することも企図している。薬剤は、ラベルの表示に従って病院及びクリニックへ配布するため、該当するラベルを付けた適切な医薬パッケージで包装することができる。
ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドの使用
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、ＣＸＣＲ４関連の疾患及び障害の診断及び治療を含む、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの診断及び治療有用性を有する。例えば、この分子を、培養中、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、もしくはｅｘ ｖｉｖｏの細胞に、またはヒト対象（例えばｉｎ ｖｉｖｏ）に投与して、種々の障害を治療、予防及び診断することができる。好適な対象は、ＣＸＣＲ４活性によって媒介される、もしくは調節される障害、またはＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路と関連する障害を有するヒト対象を含む。ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドを他の薬剤とともに投与する場合、２つを順にまたは同時に投与することができる。本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドがＣＸＣＲ４に対して特異的結合する場合、これを用いて、細胞表面でのＣＸＣＲ４発現を特異的に検出することができ、更にこれを用いて免疫アフィニティ精製によりＣＸＣＲ４陽性細胞を精製することができる。
標的特異的エフェクター細胞、例えば本開示の組成物に結合されたエフェクター細胞を治療薬として使用することもできる。標的化のためのエフェクター細胞は、ヒト白血球、例えばマクロファージ、好中球または単球であり得る。他の細胞としては、好酸球、ナチュラルキラー細胞、及びＩｇＧ受容体またはＩｇＡ受容体を持つその他の細胞が挙げられる。必要に応じて、エフェクター細胞を、治療する対象から得ることができる。標的特異的エフェクター細胞は、生理学的に許容される溶液の細胞懸濁液として投与することができる。投与する細胞数は、治療目的に応じて異なる。一般に、その量は、標的細胞、例えばＣＸＣＲ４を発現している腫瘍細胞で局在化するのに十分であり、また例えば貪食作用による細胞殺傷をもたらすのに十分である。
標的特異的エフェクター細胞による治療は、標的細胞を排除する他の技術と併用して行うことができる。例えば、本開示の組成物及び／またはこの組成物によって増強されたエフェクター細胞を用いた抗腫瘍療法を化学療法と併用することができる。加えて、併用免疫療法を用いて、２種類の細胞毒性エフェクター集団を腫瘍細胞の排除へと誘導させてもよい。例えば、抗Ｆｃ−ガンマ受容体または抗ＣＤ３と結合されたＣＸＣＲ４結合ポリペプチドを、ＩｇＧ受容体またはＩｇＡ受容体特異的結合薬と併用してもよい。本開示の二重特異性及び多重特異性分子は、細胞表面の受容体のキャッピング及び排除などによる、エフェクター細胞でのＦｃγＲまたはＦｃγＲレベルの調節に使用することもできる。
ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶがＴ細胞に侵入する際の補助受容体として、ＨＩＶ感染症に関与することが知られている。加えて、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路は炎症性病態への関与が示されている。更にまた、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路は、血管形成または新生血管への関与も示されている。したがって、本開示のＣＸＣＲ４結合ポリペプチドを使用して、以下で詳述するような多くの臨床状況においてＣＸＣＲ４の活性を調節することができる。
本開示はまた、本明細書に記載するＣＸＣＲ４関連の疾患または障害を診断または検出する方法も提供する。ＣＸＣＲ４の検出及び分析に適したあらゆる方法を用いることができる。本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は、ヒト、動物由来のサンプル、または研究用サンプル、例えば細胞、組織、臓器、液体、気体、エアロゾル、スラリー、コロイドまたは凝固物質を指す。サンプルはまた、細胞のタンパク質または膜抽出物、体液（例えば痰、血液、血清、血漿または尿）、または生体サンプル（例えば本明細書に記載する抗体を使用している、ホルマリン固定または冷凍された組織切片）を含むが、これらに限定されない。用語「サンプル」はまた、ヒトもしくは動物から新たに採取された細胞、組織、臓器もしくは体液、または処理もしくは保存された細胞、組織、臓器もしくは体液を指す。例えばサンプルは、ヒトまたは動物から除去せずにｉｎ ｖｉｖｏで試験することも、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することもできる。サンプルは、例えば組織学的方法による処理後に試験することができる。
当技術分野で既知の種々の診断検査技術、例えば、競合結合アッセイ、直接的または間接的なサンドイッチアッセイ、及び不均一相または均一相で行われる免疫沈降アッセイを使用することができる（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）ｐｐ．１４７−１５８）。診断検査法で使用する抗体は、検出可能な成分で標識することができる。検出可能な成分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に発生する。例えば、検出可能な成分は、本明細書に記載するもののいずれか、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、シアニン、フォトシアン、ローダミンもしくはルシフェリンなどの蛍光性もしくは化学発光性化合物、またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であり得る。検出可能な成分に抗体をコンジュゲートするための当技術分野で既知のあらゆる方法、例えばＨｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；及びＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）によって記載された方法を用いることができる。
本明細書では、ＣＸＣＲ４と関連する病態の診断方法を提供する。これには対象サンプル中のＣＸＣＲ４及び／またはＳＤＦ−１のレベルを評価することを含み、このとき、基準サンプルと比較した、サンプル中のＣＸＣＲ４及び／またはＳＤＦ−１レベルの変化が、腫瘍または転移または線維症の存在または増加を示す。一態様では、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１と関連する病態は、腫瘍、転移、血管形成または線維症である。基準サンプルと比較した、サンプル中のＣＸＣＲ４及び／またはＳＤＦ−１レベルの増加は、腫瘍もしくは転移の存在、または腫瘍もしくは転移性増殖もしくは線維症の増加を示し得る。基準サンプルは、早期の時点で対象から採取したサンプル、または別の個体から採取したサンプルであり得る。本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合分子、ポリペプチドまたはそのｉ−ｂｏｄｙとサンプルを接触させることにより、サンプル中のＣＸＣＲ４レベル及び／またはＳＤＦ−１レベルを検出することができる。一実施形態では、ＣＸＣＲ４結合分子、ポリペプチドまたはそのｉ−ｂｏｄｙは、検出可能に標識される。
別の例では、腫瘍を有する対象の癌転移を診断する方法を提供する。これには、腫瘍のＣＸＣＲ４レベルまたは活性を評価することを含み、このとき、基準サンプルと比較した、腫瘍中のＣＸＣＲ４レベルまたは活性の変化が、転移性腫瘍増殖の存在を示す。場合によっては、腫瘍のＣＸＣＲ４レベルまたは活性が、以前に測定したときよりも増加している可能性があり、このことは、その対象が癌転移のリスクが高いこと、癌が転移していること、または癌転移が増加していることを示し得る。基準サンプルは、同じ対象由来のもの、異なる時点の同じ腫瘍から、もしくは身体の他の部位から採取したもの、または別の個体由来のものであり得る。
別の例では、線維症を有する対象の線維症の進行のレベルまたは速度を診断する方法を提供する。これには、組織、血液、血漿または体液のＣＸＣＲ４レベルまたは活性を評価することを含み、このとき、基準サンプルと比較したＣＸＣＲ４レベルの変化が線維症の存在を示す。場合によっては、ＣＸＣＲ４レベルまたは活性が、以前に測定したときよりも増加している可能性があり、このことは、その対象が急速進行性の疾患であることを示す。基準サンプルは、同じ対象由来のもの、異なる時点の同じ組織、血液、血漿もしくは体液から、または身体の他の部位から、または別の個体から採取したものであり得る。
治療方法
本明細書では、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。この方法には、治療有効量のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチド及び別の治療薬を投与することを含む。
ＣＸＣＲ４は様々な癌種によって発現することが示されており、特定の状況においてＣＸＣＲ４の発現と対象の予後または生存との間には、逆の相関が認められた。ＣＸＣＲ４発現と関連した癌種の非限定的な例としては、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、黒色腫、腎細胞癌、リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫）、神経芽細胞腫、膠芽腫、横紋筋肉腫、大腸癌、腎臓癌、骨肉腫、急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄性白血病が挙げられる。
したがって、本開示による一例では、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを、ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の治療に使用することができ、この場合の疾患は癌であり、また、当該癌は、膀胱癌、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、上衣細胞腫、ユーイング肉腫系統の腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外癌、ホジキン病、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、肝癌、髄芽腫、神経芽細胞腫、脳腫瘍全般、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、軟組織肉腫全般、テント上方未分化神経外胚葉性及び松果体部腫瘍、視覚路及び視床下部神経膠腫、ウイルムス腫瘍、急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、食道癌、有毛細胞白血病、腎臓癌、多発性骨髄腫、口腔癌、膵癌、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚癌、骨髄異形成症候群ならびに小細胞肺癌からなる群から選択される癌を含むが、これに限定されない。
本開示による一例では、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、転移性腫瘍細胞成長の阻害に使用することができる。
本開示による一例では、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、線維症の治療に使用することができる。
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは単独で使用することも、手術及び／もしくは放射線などの他の癌治療、ならびに／または上記で述べ、指定した抗腫瘍薬などの他の抗腫瘍薬（ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＩＬ−２、ＰＳＭＡ、Ｃａｍｐａｔｈ−１、ＥＧＦＲ等を結合するものなどの化学療法薬及び他の抗腫瘍抗原抗体を含む）と併用することもできる。
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、単独で使用することも、他の炎症及び線維症治療と併用することもできる。
ＣＸＣＲ４はＨＩＶがＴ細胞に侵入するための補助受容体であることが示されており、加えて、ある特定のマウス抗ＣＸＣＲ４抗体はＴ細胞へのＨＩＶ分離株の侵入を阻害できることが実証されている（Ｈｏｕ，Ｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０ １８０−１８８、Ｃａｒｎｅｃ，Ｘ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９ １９３０−１９３８を参照）。したがって、ＣＸＣＲ４を細胞に侵入するウイルスによる受容体として使用し、抗体または他の遮断薬を、ＣＸＣＲ４を受容体として使用するようなウイルスの細胞侵入を阻害するために使用することができる。よって、一例では、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、細胞へのウイルスの侵入を阻害するために使用することができ、この場合、ウイルスは細胞侵入のための受容体としてＣＸＣＲ４を使用し、それによってウイルス感染が阻害される。一例では、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療または予防において、Ｔ細胞へのＨＩＶの侵入を阻害するために使用される。ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは単独で使用することも、他の抗ウイルス薬、例えば抗レトロウイルス薬（例えばＡＺＴまたはプロテアーゼ阻害剤）と併用することもできる。
ＣＸＣＲ４は、ＣＸＣＲ７とヘテロ二量体を形成することがわかっており、ＣＸＣＬ１２を介するＧタンパク質シグナル伝達を調節した（Ｌｅｖｏｙｅ Ａ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１３（２４）：６０８５−６０９３）。ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７ヘテロ二量体は、ベータ−アレスチンを動員し、細胞遊走を増強することもわかっている（Ｄｅｃａｉｌｌｏｔ ＦＭ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６（３７）：３２１８８−９７）。したがって、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは単独で投与することも、例えば、ＷＯ２００７／１１５２３１、ＷＯ２００７／１１５２３２、ＷＯ２００８／０４８５１９、ＷＯ２００８／１０９１５４、ＷＯ２０１０／０５４００６に記載されているＣＸＣＲ７受容体を標的とする薬剤とともに投与することもできる。ＣＸＣＲ４はまた、ＣＣＲ５（Ｓｏｈｙ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９ ２８４；３１２７０−３１２７９）、β２ＡＲ（Ｌａ Ｒｏｃｃａ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０ ５６；５４８−５５９）、ＣＣＲ２（Ｓｏｈｙ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７ ２８２；３００６２−３００６９）、ＤＯＲ（デルタオピオイド受容体）（Ｐｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ ３８；５３７−５４９）またはＣＣＲ７とヘテロ二量体を形成することもわかっている。したがって、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは単独で投与することも、またはこれらの受容体を標的とする薬剤とともに投与することもできる。
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１経路は、炎症性肝疾患（Ｔｅｒａｄａ，Ｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ ８３：６６５−６７２）、自己免疫関節炎症（Ｍａｔｔｈｙｓ，Ｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７ ４６８６−４６９２）、アレルギー性気道疾患（Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｊ Ａ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５−４９９−５０８）、及び歯周病疾患（Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｙ ｅｔ ａｌ（２００５）ＣＩｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：４６７−４７４）を含むが、これに限定されない種々の炎症病態において役割を担うことが示されている。
したがって、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを使用して、炎症性肝疾患、自己免疫関節炎症、アレルギー性気道疾患、歯周病疾患（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによって誘発される）（Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ２００８ １０５；１３５３２−１３５３７）、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬、扁平苔癬）、皮膚修復及び再生（熱傷、瘢痕）、眼炎症（ＡＭＤ、ブドウ膜炎）、全身性強皮症、放射線誘発線維症、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、肺炎症（例えば、慢性閉塞性肺疾患、肺サルコイドーシス、リンパ性肺胞炎、特発性肺胞線維症）、多発性硬化症（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２００８，１８；５０４−５１６）、敗血症（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００６ ３４；３０１１−３０１７）及び炎症性腎臓疾患（例えば、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎）からなる群から選択される障害を含む、炎症、炎症性障害を阻害することができる。ＣＸＣＲ４結合ポリペプチドは単独で使用することも、他の抗炎症薬、例えば非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド（例えば、プレドニソン、ハイドロコーチゾン）、メトトレキサート、ＣＯＸ−２阻害剤、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ）及び免疫抑制剤（例えば、６−メルカプトプリン、アザチオプリン及びシクロスポリンＡ）と併用することもできる。
したがって、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを使用して、肺線維症（特発性肺胞線維症、真菌嚢胞性線維症（Ｃａｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２０１５ ４６；３９５−４０４）、肺動脈高血圧症（Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ ＰＬｏＳＯＮＥ ２０１４ ９；ｅ８９８１０）、放射線誘発線維症（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ ＰＬｏＳＯＮＥ ２０１３；８；ｅ７９７６８）及び全身性強皮症、喘息（Ｌｕｋａｃｓ ｅｔ ａｌ ＡＪＰ ２０１２ １６０；１３５３−１３６０及びＮａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１６４：５９３５−５９４３）、肝線維症（非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）（Ｂｏｕｊｅｄｉｄｉ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５ １２８；２５７−２６７）、腎臓線維症（高血圧及び慢性腎疾患（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４ ３０８；４５９−４７２）、眼線維症（増殖性硝子体網膜症、糖尿病性網膜症（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００５ １１５；８６−９３）、未熟児網膜症（Ｖｉｌｌａｌｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２ ９１；２６４−２７０）、非伝染性ブドウ膜炎（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９ ８９；５２２−５３１）、及び滲出型ＡＭＤ（ＵＳ＿７９６４１９１）、心臓線維症（高血圧、虚血性心筋症、心内膜心筋線維症、動脈線維症（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ Ｃｉｒｃ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．２０１１ ４；６５１−６５８）、皮膚線維症（肥厚性瘢痕（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐ ａｎｄ Ｒｅｇ ２０１４ ２２；６２２−６３０）、熱傷随伴性瘢痕（Ａｖｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ２００６ １２６；４６８−４７６）、糖尿病外傷、強皮症、または全身性強皮症（Ｔｏｕｒｋｉｎａ ｅｔ ａｌ Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｐａｉｒ ２０１１，４；１０．１１８６／１７５５−１５３６−４−１５）からなる群から選択される障害を含む、線維症障害において線維症を阻害することができる。本発明のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは単独で使用することも、または他の抗線維化薬、例えばピルフェニドンまたはニンテダニブと併用することもできる。
ＳＤＦ−１はＣＸＣＲ４を発現するヘマンジオサイトの動員を経て新生血管を誘導することが示された（Ｊｉｎ，Ｄ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ Ｍｅｄ．１２：５５７−５６７）。ＣＸＣＲ４はまた、胃腸管の血管成長に不可欠であることもわかっている（Ｔａｃｈｉｂａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８５）：５９１−４）。更に、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４経路の遮断は、ＶＥＧＦに依存しない方法で血管形成を阻害することにより、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長を減衰させることができる（Ｇｕｌｅｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：５８６４−５８−７１）。したがって、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを使用して、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４経路を妨げることにより血管形成を阻害することができる。血管形成の阻害は、例えば、腫瘍成長または腫瘍転移（腫瘍がＣＸＣＲ４＋であるかどうかは問わない）を阻害するために使用することができる。ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは単独で使用することも、または他の抗血管形成薬、例えば抗ＶＥＧＦ（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ Ｍ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｃｅｌｌ １２４（１）：１７５−８９）もしくはＰＤＧＦ−Ｄ抗体または抗体の断片と併用することもできる。
本開示のｉ−ｂｏｄｙによる幹細胞の動員欠如−潜在用途
種々のサイトカイン、ケモカイン及び接着分子は、ＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１の相互作用を含む、ＣＤ３４＋幹細胞の動員の調節（Ｇａｚｉｔｔ，Ｙ．（２００１）．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１０：２２９−２３６に概説）に関与している。更に、小分子ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、骨髄から末梢へのＣＤ３４＋幹細胞の迅速な動員を刺激することが示されている（例えば、Ｄｅｖｉｎｅ，Ｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ２２ １０９５−１ １０２；Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ２０１：１３０７−１３１８，Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｇ，Ｎ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６：１８６７−１８７４を参照）。
対称的に、本開示のｉ−ｂｏｄｙの一部は、幹細胞の動員能力を欠くことがわかった。幹細胞を動員しないＣＸＣＲ４阻害剤／アンタゴニスト（例えば本明細書に記載するｉ−ｂｏｄｙ）は、長期研究及び慢性疾患の治療に有用となることを示す研究が複数ある。
ｉ）線維症治療
損傷への反応には、ホメオスタシスを維持するだけでなく、組織修復も誘導するように設計された適応機構の活性化を伴う。この再生修復のための潜在能力は、以下の肝臓切除または急性尿細管壊死などの、ある特定の状況にあるヒトにおいて顕在化する。しかしながら、慢性損傷または反復損傷が認められる場合、反応の大部分が、障害を受けた実質細胞の再生と、関連する大量のＥＣＭの産生との連係を伴い、最終的に結合組織による瘢痕の形成に至る。この結合組織による修復は、例えば、皮膚損傷後の器官完全性の保持を助けることは明らかだが、心臓、腎臓及び肺などの他の臓器でのその存在は不利益である場合が多い（Ｗｙｎｎ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｍｅｄ（２０１２）１８：１０２８−１０４０）。
線維症の治療には未対応の臨床ニーズがある（Ｌｕｐｐｉ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃａｒｅ Ｒｅｐ（２０１２）１：２１６−２２３、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．（２０１３）５：１６７ｓｒ１）。重要なことに、線維症促進性炎症過程を標的とする現行の治療方策はないことから、これが未対応の臨床ニーズであることは明らかであり、新規治療薬の開発が必要である。したがって、炎症誘発性サイトカインの活性化及びＥＣＭの病理的異常蓄積を阻害する方策は、病理学的な臓器線維症の予防にとって潜在的な治療標的となる。
（ａ）肺線維症：特発性肺胞線維症（ＩＰＦ）
特発性肺胞線維症（ＩＰＦ）は、肺の瘢痕及び線維症を特徴とし、最終的には末期呼吸機能不全に至る間質性炎症性疾患である。最近の研究では、ＣＸＣＲ４を発現する循環線維芽細胞が肺線維症の病因に関与するという証拠が提示されている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００４）１１４：４３８−４４６．）。上記及び他の最近の研究は、この線維芽細胞でのＣＸＣＲ４の活性を阻害することが、肺疾患、糖尿病及び心臓血管疾患を伴う線維症を含む、様々な種類の線維症を有する患者の治療に有用な方法であり得ることを示唆している。
ｂ）眼線維症
後眼部の新しい血管の病理的異常成長は、加齢黄斑変性、増殖性糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症を含む多くの疾患の破壊的悪化による結果である。視力を脅かす進行した加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤと呼ばれる）は、８５歳以上の全人口のうち５．７％が罹患している。糖尿病性網膜症は、糖尿病で最も恐れられている合併症であり、ＩＩ型糖尿病を有する患者の約４０％、Ｉ型糖尿病を有する患者の約８６％が罹患している（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７６：１２４−３６）。未熟児網膜症と呼ばれる、もう一つの網膜血管疾患は、早産の破壊的悪化による結果であり、未だに西側諸国の小児失明の主因である。このような病態に共通する特徴は、血管の異常成長と、それに続く瘢痕形成であり、これが失明に至る決定的な事象となる。このような疾患による失明を回避するために、網膜血管の異常成長ならびにそれに続く瘢痕の両方を標的とする治療が必要とされている。
滲出型ＡＭＤは現在、血管形成成長因子である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の作用を妨げるヒト化抗体または抗体断片を毎月または隔月で眼球に注射することにより治療する。これらの新たな治療は、滲出型ＡＭＤ保有者の臨床医療を一変させ、大多数の患者の突然の失明を防止している（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５５：１４１９−３１；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５５：１４３２−４４）。硝子体網膜症、糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症を含む、瘢痕及び線維症関連の眼障害の治療に、本発明のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを使用することができる。
ｉｉ）アテローム性動脈硬化症の治療
Ｚｅｒｎｅｃｋｅら（Ｚｅｒｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０２：０９−２１７）は、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４軸がアテローム性動脈硬化症を防止すること、またこの防止効果が骨髄性細胞ホメオスタシスの制御によるという証拠を示している。この研究は、小分子アンタゴニストＡＭＤ３４６５によるＣＸＣＲ４の長期的阻害が、２種類の異なるマウス株（Ａｐｏｅ−／−マウス及びＬｄｌｒ−／−）の食餌誘発性アテローム硬化性病変の発現を悪化させたことを示している。ＡＭＤ３４６５によるＣＸＣＲ４の拮抗作用は、骨髄からの好中球の放出に対してＡＭＤ３１００よりも１０倍効果的であることが示されている（Ｈａｔｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５；７０：７５２−７６１）。Ｚｅｒｎｅｃｋｅらはまた、ＡＭＤ３４６５による持続的な治療が骨髄性好中球の拡大と、単球のわずかな増加をもたらし、骨髄リンパ球の減少と相関性が見られることを実証した。その結論によると、「ＣＸＣＲ４アンタゴニストは造血細胞を動員することができるが、斑安定化前駆体サブセットの動員を阻害する場合があり、それによってアテローム性動脈硬化症を促進し得るため、治療を試みる場合は注意を要すると思われる」。したがって、造血細胞を動員する能力を欠く薬剤は、アテローム性動脈硬化の治療に有用であり得る。本発明のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、抗アテローム性効果を及ぼすと同時に、幹細胞の動員を増加させない能力を有する。
ｉｉｉ）腎臓疾患
Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｏｃｔ１；３０７（７）：Ｆ７８３−９７による研究は、ＣＸＣＲ４の阻害が、造血幹細胞またはその動員に対する何らかの効果によってではなく、白血球浸潤及び炎症誘発性サイトカインの発現を阻害することによって、急性腎臓損傷を改善するという説得力のある証拠を示している。したがって、本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、腎臓疾患の治療に有用であり得る。
ｉｖ）血管形成
ＳＤＦ−１とその受容体であるＣＸＣＲ４は、血管形成及び瘢痕形成（線維症）に関与している（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２００５；４３８：９６７−７４）。事実、ＳＤＦ−１は、滲出型ＡＭＤ、増殖性糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症を有する患者の硝子体で増加する（Ｓｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ Ｒｅｔｉｎａ ２０１４；３４：１８０２−１０、Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００５；１１５：８６−９３、Ｓｏｎｍｅｚ ｅｔ ａｌ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２００８；１１５：１０６５−１０７０）。その受容体ＣＸＣＲ４は、病理学的に異常な成長をする血管の成長端に局在する。更に、ＣＸＣＲ４の阻害は、脈絡膜新生血管及び未熟児網膜症の齧歯目モデルでの血管の異常成長を防止することが示されている（Ｌｉｍａ ｅ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００７；２１：３２１９−３０）。別の調査は、循環線維芽細胞が増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）膜の筋線維芽細胞の前駆体として機能できることを示している。ＰＶＲ網膜上膜にはＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＲ４を発現する多数の細胞が存在した。このことは、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４ケモカイン軸が優勢であると、ＰＶＲを有する患者の眼に線維芽細胞が動員されることが明らかであることを示唆していた（Ａｂｕ Ｅｌ−Ａｓａｒ ｅｔ ａｌ Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００８；９２：６９９−７０４）。
これらの血管疾患の臨床管理を改善するには、血管形成とそれに続く線維症の両方を標的とする治療が必要である。本開示の新規ポリペプチドまたはｉ−ｂｏｄｙは、そのような治療に有用である。
したがって、本開示のＣＸＣＲ４結合分子、ポリペプチドまたはｉ−ｂｏｄｙは、ＡＭＤ、増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、増殖性硝子体網膜症、ブドウ膜炎、角膜血管形成における後眼部血管疾患モデルにおいて、血管形成とそれに続く瘢痕を低減するのに効果的であり得る。
炎症性モデル
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの炎症阻害能を、炎症性マウスモデルで検討することができる。これらのモデルには、Ｌｉａｎｇ Ｚｈｏｎｇｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（４）：ｅ３４０３８．ｄｏｉ：１０．１３７１に記載されている、マウスの実験的大腸炎モデル、カラギーナン誘発足浮腫モデル、及びブレオマイシン誘発肺線維症モデルが含まれる。
線維症モデル
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの線維症阻害能を、ブレオマイシン齧歯類モデルで検討することができる。特発性肺線維症（ＩＰＦ）の模倣に頻繁に使用される齧歯類のブレオマイシンモデルにおいて、血清及び気管支肺胞洗浄流体中のＳＤＦ−１レベルが増加している。更に、ＣＸＣＲ４及び小分子ＣＸＣＲ４アンタゴニスト（ＡＭＤ３１００）に対する中和抗体は、肺好酸球増多症を低減することが見出された。これは、ＣＸＣＲ４を介したシグナルがアレルギー性気道疾患のマウスモデルの肺炎症に関与することを示している（Ｇｏｎｚａｌｏ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６５：４９９−５０８、Ｌｕｋａｃｓ ｅｔ ａｌ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００２；１６０：１３５３−６０）。このデータは、ＣＸＣＲ４が再上皮形成よりも線維症を促進する上で顕著な役割を有することを明確に示している。本発明のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを、抗線維化薬として使用することができる。
現在まで、複数のＣＸＣＲ４アンタゴニストが開発されている（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２００７；８８：２７９−２８９）。ＴＮ１４００３、ＭＳＸ−１２２またはＡＭＤ３１００などのアンタゴニストを用いたＣＸＣＲ４の遮断は、ブレオマイシン誘発肺線維症を効果的に軽減することが示されている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００７；３７：２９１−２９９）。ＦＤＡ認可の小分子ＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００（プレリキサフォル）は、ブレオマイシン治療マウスでも試験済みである。ＡＭＤ３１００は幹細胞のホーミングを妨げる効果がある一方、幹細胞の動員も増加させるため、自家移植に備えた幹細胞の収率増加に用いられるようになった。１４ｍｅｒのペプチドであるＴＮ１４００３は、ブレオマイシン治療マウスでの肺線維症の発現を妨げるが、対する小分子ＭＳＸ−１２２はまた、ブレオマイシン誘発肺線維症の完全な防止においてＴＮ１４００３及びＡＭＤ３１００よりも優位性を示し（Ｘｕ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００７；３７：２９１−２９９）、更にＭＳＸ−１２２を投与された放射線照射マウスには、肺線維症の発現に有意な低減が見られたが、ＡＭＤ３１００はこの線維症過程を有意に抑制しなかった（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１３；８（１１）：ｅ７９７６８．）。本発明のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドは、幹細胞のホーミングを妨げる一方、幹細胞の動員を増加させない能力を有する。
ＩＰＦの病因に関する新たな標的の役割を明らかにする代替技術は、疾患患者から線維芽細胞を単離し、メディエーターの放出を健常者からの線維芽細胞と比較することを含む。この方法では、細胞を薬理学的アゴニストとアンタゴニストで処理する。線維芽細胞を３次元マトリックスに埋め込んで培養し、他の細胞型とともに共培養することができる。本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの線維症阻害能を、ヒト患者線維芽細胞で検討することができる。
更にもう一つの翻訳モデルは、ＩＰＦ患者由来の線維芽細胞を免疫不全マウスに移植することである。本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの線維症阻害能を、この線維症の動物モデルで検討することができる（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ５０ Ｎｕｍｂｅｒ ５，Ｍａｙ ２０１４）。
癌／転移モデル
本開示のＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドの転移阻害能を、マウスモデルで検討することができる。これらのモデルには、Ｌｉａｎｇ Ｚｈｏｎｇｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（４）：ｅ３４０３８．ｄｏｉ：１０．１３７１に記載されている、乳癌モデル（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の投与による）、頭頸部癌動物モデル（６８６ＬＮ−Ｍｓ細胞の投与による）、及びブドウ膜黒色腫微小転移モデルが含まれる。
ｉｎ ｖｉｖｏ血管形成アッセイ
ＣＸＣＲ４結合分子の血管形成阻害能を、マウスモデルで検討することができる。これらのモデルは、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．Ａｕｇｕｓｔ ３；３５９（３）：７１６−７２２に記載されており、ここではＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をヌードマウスの側腹部に皮下移植する。
キット
いくつかの例では、ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチドを、キットまたは医薬パッケージで提供してもよい。
一例では、本開示は、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合分子の投与を行うためのキットに関する。
医薬パッケージ及びキットは更に、医薬製剤中の賦形剤、担体、緩衝液、保存剤または安定剤を含む。キットの各構成物は個別容器内に封入することができ、また種々の容器全てを単一のパッケージに収めることができる。発明のキットは、室温または冷蔵保存用に設計することができる。加えて、製剤には、キットの貯蔵寿命を延長させる安定剤を含有することができ、これには例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または他の既知である従来の安定剤を含む。組成物が凍結乾燥されている場合、キットは製剤を再構成するための調製溶液を更に含むことができる。許容される溶液は当技術分野において周知であり、例えば薬学的に許容されるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
加えて、本明細書で提供する医薬パッケージまたはキットは、本明細書で提供する他の成分のいずれか、例えば他の箇所で詳細に記載する化学療法剤などを更に含むことができる。
本発明の医薬パッケージ及びキットは、本明細書で提供するアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイなどのための成分などを更に含むことができる。あるいは、キットの製剤は、患者組織の生検切片を試験するための免疫組織化学染色などの免疫アッセイに使用される。
本発明の医薬パッケージ及びキットは更に、例えば、製品の説明、投与様式及び治療の適応を明記している標記を含む。本明細書で提供する医薬パッケージは、本明細書に記載する成分のいずれかを含むことができる。医薬パッケージは更に、本明細書に記載する疾患徴候のいずれかを予防、そのリスクを低減、または治療することについての標記を含むことができる。
本開示のキットは更に、本発明のいずれかの方法にキット成分を使用する上での標記または指示を含むことができる。キットは、本開示の方法で化合物を投与するための指示とともに、パックまたはディスペンサー中の本開示のｉ−ｂｏｄｙ化合物を含むことができる。指示は、治療、検出、モニタリングまたは診断方法を含む、本明細書に記載する本開示の方法のいずれかを実施する上での指示を含むことができる。指示には更に、十分な臨床エンドポイントもしくは発生し得る有害症状を示す徴候、またはヒト対象での使用にあたり食品医薬品局などの規制当局によって要求される追加情報を含んでもよい。
本開示の広い一般的な範囲から逸脱することなく、上述した実施形態に多数の変形及び／または改変を加えてよいことを当業者は理解されるであろう。したがって本実施形態は、あらゆる点で限定ではなく例示と見なすべきである。本開示は以降の非限定的な実施例を含む。
一般的な方法
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
（図２、５、１１、１７）選択したｉ−ｂｏｄｙと固定化されたＣＸＣＲ４脂質粒子との結合の速度論解析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して２５℃で実施した。ストレプトアビジンの固定化は、１ｘＨＢＳ−Ｐ＋ランニングバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％［ｖ／ｖ］のＴｗｅｅｎ−２０）中で実施した。アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とその説明書を利用して、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ；１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５で１００μｇ／ｍＬに希釈）を、センサーチップ面上の４つ全ての経路に同時に付着させ、６，０００ＲＵ未満のストレプトアビジンを結合させた（１ＲＵ＝１ｐｇタンパク質／ｍｍ２）。脂質粒子を伴う結合実験は全て、計測用のランニングバッファーとして１ｘＨＢＳ／ＢＳＡ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）を用いて実施した。ビオチン化ＣＸＣＲ４脂質粒子（ＷＯ２００５／０４２６９５に記載されている、Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、カタログ番号ＬＥＶ−１０１Ｂ；３．６Ｕ／ｍＬ）は通常、ランニングバッファーで２０分の１に希釈し、２，５００ＲＵ超の捕捉反応レベルになるように、１，８００秒間に２μＬ／ｍＬで注入することにより、ストレプトアビジンを含む経路に固定化した。オフターゲット対照として使用するビオチン化ＣＣＲ５及び無効な脂質粒子を同様の方法で固定した。結合速度論を決定するために、１ｘＨＢＳ／ＢＳＡで希釈したｉ−ｂｏｄｙの段階希釈液（３倍）を固定化された脂質粒子上に注入し、会合相と解離相をそれぞれ６０秒及び６００秒間モニターした。二重参照目的で、計測用のランニングバッファー（「ゼロバッファー」ブランク）溶液も含めた。収集した実験データは、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア（ｗｗｗ．ｂｉｏｌｏｇｉｃ．ｃｏｍ．ａｕ）を使用して処理した。速度論パラメーター（ｋａ＝会合速度定数及びｋｄ＝解離速度定数）、及び平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）は、各組の実験データをＬａｎｇｍｕｉｒ１：１結合モデルにフィッティングさせることにより導出した。全ての相互作用測定を３重に実施し、得られた結合パラメーターを平均値±標準偏差として報告した。
β−アレスチン（ＢＲＥＴ）アッセイ
（図３及び１４）本試験ではＢＲＥＴを使用して、以前に検証したＢＲＥＴを利用したＧＰＣＲ／β−アレスチン相互作用のモニタリングに基づいて、結果として生じる何らかの近接の増加から、リアルタイム速度論プロファイルを評価した。ＢＲＥＴは、ドナーである相補的レニラルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）変異体とアクセプターである緑色蛍光タンパク質変異体との間に発生する。セレンテラジン基質（第一世代ＢＲＥＴ（ＢＲＥＴ）用のセレンテラジンｈまたは拡張ＢＲＥＴ（ｅＢＲＥＴ）用のＥｎｄｕＲｅｎなど）のＲｌｕｃ触媒酸化によって、１０ｎｍ以内にある場合、エネルギーがアクセプターへ移動し、その結果アクセプターの発光ピークが特徴的波長となる。ＢＲＥＴ β−アレスチンアッセイを前述のように実施した（Ｈ．Ｂ．，Ｓｅｅｂｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｏｃａｎ，Ｍ．，Ｅｉｄｎｅ，Ｋ．Ａ．ａｎｄ Ｐｆｌｅｇｅｒ，Ｋ．Ｄ．（２０１１）‘Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｈｅｔｅｒｏｍｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｂｅｔａ−ａｒｒｅｓｔｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｔｏ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｓ’，Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ，９（１），２１−３０，１０．１０８９／ａｄｔ．２０１０．０３３６を参照）。ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ８のｃＤＮＡ構築物は、Ａｒｏｎ Ｃｈａｋｅｒａ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から寄贈された、Ｒｌｕｃで標識した対応する受容体ｃＤＮＡを含むプラスミドから生成した。β−アレスチン２／ＶｅｎｕｓのｃＤＮＡ構築物は、Ａｔｓｕｓｈｉ Ｍｉｙａｗａｋｉ（ＲＩＫＥＮ Ｂｒａｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗａｋｏ−ｃｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）から寄贈されたｐＣＳ２−Ｖｅｎｕｓから事前に調製した。１００ｎＭのＳＤＦ−１アゴニストの存在下でＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ８及びβ−アレスチン２／Ｖｅｎｕｓを一過性発現する細胞のＢＲＥＴ技術を、ＣＸＣＲ４アゴニストのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２及びｉ−ｂｏｄｙの存在下で評価した。１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び４００ｍｇ／ｍＬのジェネテシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した完全培地（０．３ｍｇ／ｍＬのグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地；Ｇｉｂｃｏ）中に、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で保持した。製造業者の指示に従ってＧｅｎｅｊｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用し、播種後２４時間、トランスフェクションを実施した。０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を採取した。ＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をトランスフェクトした。ＨＢＳＳ中の５μＭのセレンテラジンｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をルシフェラーゼ基質溶液として使用した。５％のＦＣＳを含有する、ＨＥＰＥＳ緩衝系フェノールレッドを含まない完全培地中に、トランスフェクションの２４時間後に細胞を播種し、ポリ−Ｌ−リジンをコーティングした白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に添加した。ＢＲＥＴを使用して用量反応曲線を生成し、プレート中の培地を５ｍＭのセレンテラジンｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含有するＰＢＳに置き換えて、直ちにアッセイを実施した。このアッセイでは、トランスフェクションの４８時間後、基質平衡に確実に達するようにプレートを３０ｍＭのＥｎｄｕＲｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに３７℃、５％のＣＯ２で２時間インキュベートした。全てのＢＲＥＴ測定は、Ｗａｌｌａｃ １４２０ソフトウェア搭載ＶＩＣＴＯＲ Ｌｉｇｈｔプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、３７℃で取得した。フィルター処理した発光を、４００〜４７５及び５２０〜５４０ｎｍで順次測定した。ビヒクル処理した細胞サンプルの、４００〜４７５ｎｍの発光に対する５２０〜５４０ｎｍの発光の比率を、様々な濃度のアゴニスト（この場合、ＳＤＦ−１またはＣＸＣＬ１２の存在下）及びｉ−ｂｏｄｙ（ＡＤＣＸ−９９、ＡＤＣＸ−２７２、ＡＣＤＸ−６、ＡＣＤＸ−３０６、ＡＤＣＸ−６６８）で処理した同じ細胞の第２のアリコートでの同様の比率から減算することにより、ＢＲＥＴシグナルを算出した。データは、２重に実施された４回の独立実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
（図９）製造業者のプロトコルに従って、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）β−アレスチンアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）を実施した。細胞を白壁の３８４ウェル組職培養処理マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種して、総容積２０μＬ中、５，０００細胞（または、ＣＸＣＲ４の場合１０，０００細胞）で正規化した。３７℃（５％のＣＯ２、相対湿度９５％）で細胞成長させた。ｉ−ｂｏｄｙまたはＡＭＤ３１００（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（０．５〜３．８μＭで５μＬ）を単一検体用ウェルに添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。次に、アゴニストをＥＣ８０濃度で添加し、３７℃で９０分間（または、ＣＣＲ１の場合１８０分間）インキュベートを継続した。１５μＬ（５０％ｖ／ｖ）のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬混合液を単独で添加しアッセイシグナルを生成した後、室温で１時間インキュベートした。マイクロプレートを読み取った後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ装置を用いてシグナルを生成し、相対発光量（ＲＬＵ）の化学発光シグナルを検出した。ＣＢＩＳデータ解析スイート（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ）を使用して化合物活性を解析した。％阻害＝１００％ｘ［１−（試験サンプルの平均ＲＬＵ−ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）／（ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ−ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）］。
Ｉｍ７−ＦＨはＮ末端の溶解タグ及び精製タグに対応し、Ｉｍ７はＥ．ｃｏｌｉタンパク質（Ｈｏｓｓｅ ＲＪ ｅｔ ａｌ（２００９）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １５；３８５（２）：３４６−５７）、ＦＨはＦｌａｇ＋６ヒスチジン残基である。
実施例１−ＣＸＣＲ４を遮断するｉ−ｂｏｄｙの同定
サメＩｇＮＡＲ抗体構造から得た原則は、免疫グロブリンスーパーファミリーのヒトＩセット領域の結合レパートリー生成に問題なく適用することができる。これについてはＷＯ２００５／１１８６２９に詳細に記載されている。サメＩｇＮＡＲ抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＩセットドメイン、例えばＮＣＡＭのドメイン１と構造的に近似する。修飾したＮＣＡＭドメイン１をｉ−ｂｏｄｙ足場と呼ぶ。この足場を用いて、ポリペプチドのライブラリを作成してファージ上に提示させ、特定の標的と対照して、その標的に対する特異的結合物質をスクリーニングする。このようなライブラリは、主にＣＤＲ１及びＣＤＲ３の類似領域に変異性を含むことが予想される。
ＣＤＲ１領域（図１ＢにＸＸＸＸＸＸによって表す）及びＣＤＲ３領域（図１ＢにＹ’ｎによって表す）にランダムなアミノ酸配列を有するｉ−ｂｏｄｙライブラリを作成した。この場合のｎ（ランダムなＣＤＲ３配列内のアミノ酸数）は、配列番号２に従ってアミノ酸の長さと配列が１０〜２０の間でランダムに変化する。本開示のｉ−ｂｏｄｙは、配列番号１のアミノ酸残基１〜２６、３３〜７９及び８８〜９７に対応する足場領域、または少なくともそれと６０％同一である配列を含むか、さもなければ１〜５個のアミノ酸付加または置換を含み得る。一例では、足場領域は、配列番号２に指定された配列、または１〜５個のアミノ酸付加または置換を含む配列番号２に指定された配列を含む。
配列番号２の相補性決定領域（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３）は、それぞれ配列番号１のアミノ酸位２７〜３２及び８０〜８６によって表された配列番号１の対応するＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３領域と比較して、アミノ酸付加及び／または置換によって修飾されている。その結果得られるｉ−ｂｏｄｙポリペプチドは、５０μＭ未満の親和性でヒトＣＸＣＲ４と結合することが可能である。
一例では、配列番号２のＡ’及びＢ’はアミノ酸残基のいずれかである。
一例では、配列番号２のＡ’はアミノ酸ＱまたはＫであり、配列番号２のＢ’はアミノ酸残基ＶまたはＡである。更なる例では、配列番号２においてＡ’はＱであり、Ｂ’はＶまたはＡである。
配列番号２は、Ｍ、ＥＡＥＡ、ＭＡまたはＭＰからなる群から選択される１〜４個の連続したＮ末端アミノ酸残基を更に含むことができる。
脂質粒子に提示されるか、またはＨＥＫ細胞株に発現するヒトＣＸＣＲ４（ｈＣＸＣＲ４）と対照して、ファージ上に提示されたｉ−ｂｏｄｙを選別し、続いてプレートもしくはビーズに捕捉された、または溶液中にＣＸＣＲ４陽性細胞を含む、ｉ−ｂｏｄｙライブラリ及びｈＣＸＣＲ４脂質粒子をインキュベートした。いずれのフォーマットでも、徹底的な洗浄を完了し、非特異的結合物質を除去した。ｈＣＸＣＲ４陽性脂質粒子または細胞の存在量を観察し、単一コロニーを選抜して成長させた。ｉ−ｂｏｄｙ足場の配列は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域の特異的領域を除き同一のままである。ｈＣＸＣＲ４と特異的に結合した単一コロニーのＣＤＲ１及びＣＤＲ３配列を、表１に詳述する。ＣＸＣＲ４に対するｉ−ｂｏｄｙの親和性を表１に、ＡＤＣＸ−９９に対する親和性を図５に、ｉ−ｂｏｄｙのＡＤＣＸ−３０６、ＡＤＣＸ−２７２及びＡＤＣＸ−６６８に対する親和性を図２に記載する。
また、ｉ−ｂｏｄｙ結合物質ＡＤＣＸ−９９、ＡＤＣＸ−２７２、ＡＤＣＸ−６、ＡＤＣＸ−３０６及びＡＤＣＸ−６６８がβ−アレスチンを調節する能力を図３に示す。
Figure 0006863897
加えて、ＣＸＣＲ４と結合しない対照ｉ−ｂｏｄｙを作製し、これを２１Ｈ５と称した。これをアイソタイプ対照として使用した。このｉ−ｂｏｄｙの配列を以下に示す：
ＬＱＶＤＩＶＰＳＱＧＥＩＳＶＧＥＳＫＦＦＬＣＱＶＡＧＤＡＫＤＫＤＩＳＷＦＳＰＮＧＥＫＬＴＰＮＱＱＲＩＳＶＶＷＮＤＤＳＳＳＴＬＴＩＹＮＡＮＩＤＤＡＧＩＹＫＣＶＶＴＧＳＤＡＭＳＮＹＳＹＰＩＳＥＳＥＡＴＶＮＶＫＩＦＱ（配列番号８２）
実施例２−ＣＸＣＲ４を遮断するｉ−ｂｏｄｙの特性決定
２．１ Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｉ−ｂｏｄｙの発現及び精製
Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を使用してｉ−ｂｏｄｙを発現させ、精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ免疫タンパク質（Ｉｍ７）ＦＬＡＧ及び６ｘＨＩＳを含む種々の親和性タグ（図４でＩｍ７−ＦＨと称する）を付けてｉ−ｂｏｄｙを発現させた。それぞれ抗ＦＬＡＧ樹脂またはＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いた各種のタグを利用して、ｉ−ｂｏｄｙを周辺質分画及び細胞質から精製した。サイズ排除クロマトグラフィーの結果を図４に示す。
２．２ Ｐｉｃｈｉａにおけるｉ−ｂｏｄｙの発現及び精製
ｉ−ｂｏｄｙの遺伝子をＰｉｃｈｉａ発現ベクターにクローニングした。クローン選択の一部最適化後のタンパク質力価は、小規模（２ｍｌスケール）で３〜９ｍｇ／Ｌの範囲であった。発酵スケールでは、収率は２６〜１５０ｍｇ／Ｌであった。更なるパラメーター（例えば温度、ｐＨ、供給速度及び供給手法）を発酵レベルで最適化すると、収率を改善することができた。大規模な発現及び精製後、ｉ−ｂｏｄｙをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特性決定した。ｉ−ｂｏｄｙはサイズに応じて移動するとき、本質的に無傷であることが示された（図示せず）。
２．３ ＣＸＣＲ４と結合するｉ−ｂｏｄｙの親和性と特異性
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９は固定化されたＣＸＣＲ４陽性脂質粒子（Ａ）と結合することが示されたが、無効な脂質粒子（Ｂ）に対して、またはＧＰＣＲ ＣＣＲ５（Ｃ）に対して陽性であった脂質粒子に対しては、ごくわずかな結合性しか示さなかった。これは、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９がＣＸＣＲ４に対して特異的であることを示す（図５）。
ＣＸＣＲ４との親和性が同定されたｉ−ｂｏｄｙの１つであるＡＤＣＸ−９９は、図５のＢｉａｃｏｒｅアッセイによる測定では、ＣＸＣＲ４陽性脂質粒子に対して約６００ｎＭ（６２２．８７７ｎＭ）のＫＤであった。
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−２７２は固定化されたＣＸＣＲ４陽性脂質粒子と結合することが示された（図２）が、無効な脂質粒子に対して、またはＥＬＩＳＡによってＧＰＣＲ ＣＣＲ５に対して陽性であった脂質粒子に対しては、ごくわずかな結合性しか示さなかった（図７Ｂ）。これは、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−２７２がＣＸＣＲ４に対して特異的であることを示す。
ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−２７２のＣＸＣＲ４との親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（図２Ｂ）による測定で、ＣＸＣＲ４陽性脂質粒子に対して約１．６ｕＭのＫＤであることが決定された。
実施例３−ｉ−ｂｏｄｙの親和性成熟
ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９を、エラープローンＰＣＲを使用して親和性成熟した。これは２種類の方法、すなわちＣＤＲ１及びＣＤＲ３を対象としたランダムな突然変異のライブラリを作成する方法、または配列内のいずれかの場所に平均２〜３のヌクレオチド突然変異を使用する方法のいずれかで実施した。ライブラリは、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５：１４５２−６６に従ってパンニングした。この手法を用いて、ｉ−ｂｏｄｙ ＡＤＣＸ−９９のＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３領域を修飾し、親和性または発現を改善した突然変異体のライブラリを作成した。
３．１ ｉ−ｂｏｄｙの発現レベル、親和性及び特異性の改善
親和性成熟させたＡＤＣＸ−９９の９０のランダムな突然変異体ｉ−ｂｏｄｙを９６ウェルプレート中で培養した。周辺質分画の分析はタンパク質の発現を示し、親和性レベルは突然変異体クローン間で有意に変化した。ＡＤＣＸ−９９と比較して、いくつかの突然変異体クローンは、野生型ＡＤＣＸ−９９ ｉ−ｂｏｄｙよりも良好な発現因子であった（図６）。
次に、同じ９０のクローンの、ＣＸＣＲ４陽性脂質粒子との結合性について検討すると、大部分のクローンはＣＸＣＲ４陽性脂質粒子に対して低い親和性を有したが、いくつかのクローンは高い親和性を示したことが観察された（図７−１）。突然変異体ｉ−ｂｏｄｙクローン３６及び３９は、野生型ＡＤＣＸ−９９ ｉ−ｂｏｄｙと比較して、このアッセイのＣＸＣＲ４陽性脂質粒子に対して高い結合性を有することが明らかであった。突然変異体ｉ−ｂｏｄｙクローンのＣＣＲ５陽性脂質粒子との結合性についても検討した（図７−２）。ｉ−ｂｏｄｙ突然変異体クローン３６及び３９は、ＣＸＣＲ４に特異性を示す野生型ＡＤＣＸ−９９（図７−２）と同様に、ＣＣＲ５に対して低い結合性を有した。
ＡＤＣＸ−９９の突然変異体クローンに更にもう１周、親和性成熟を施し、１０００の突然変異体クローンにわたって親和性及び発現の改善を調べた。
親和性成熟したｉ−ｂｏｄｙのコンセンサス配列を図１Ｄに示す（配列番号３９）。ＣＤ１及びＣＤＲ３領域はそれぞれ、ＳＸ１ＳＸ２Ｘ３Ｒ及びＹ’１ＲＹ’２ＧＹ’３ＹＲＨＲＹ’４ＬＹ’５ＬＧで表される。
本開示の親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙは、配列番号１のアミノ酸残基１〜２６、３３〜７９及び８８〜９７に対応する足場領域、または少なくともそれと６０％同一である配列を含むか、さもなければ１〜５個のアミノ酸付加または置換を含み得る。一例では、ポリペプチドは、配列番号２に指定された配列、または１〜５個のアミノ酸付加または置換を含む配列番号２に指定された配列を含む。
一例では、配列番号３９のＡ’及びＢ’はアミノ酸残基のいずれかである。
一例では、配列番号３９のＡ’はアミノ酸ＱまたはＫであり、配列番号３９のＢ’はアミノ酸残基ＶまたはＡである。更なる例では、配列番号３９においてＡ’はＱであり、Ｂ’はＶまたはＡである。
一例では、Ｚは存在しないか、Ｍ、ＥＡＥＡ、ＭＡまたはＭＰから選択されるアミノ酸である。改善された親和性成熟配列の一覧を表２に記載する。
Figure 0006863897
ＡＤＣＸ−９９のコンセンサス配列（配列番号２及び３９）と比較して修飾されたアミノ酸位の一覧を図１に示す。図８は、親和性成熟された各ｉ−ｂｏｄｙに対応する特定のアミノ酸残基置換を示す。下線は、各配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域に対応する。
表３は、脂質粒子に発現したＣＸＣＲ４に対する上位２０の親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙのオフレートに関する改善をまとめたものである。
Figure 0006863897
Figure 0006863897
表４は、脂質粒子に発現したＣＸＣＲ４に対する上位２０の親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙの親和性（Ｋａ、Ｋｄ及びＫＤ）をまとめたものである。
Figure 0006863897
表４の親和性成熟された結合物質の特異性を多数のケモカインに対して決定し、これを図９に示す。結果は、標的ＣＸＣＲ４と高特異性を示すが、他のケモカインＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）との結合性は限定的であることを示している。
３．２ 親和性成熟されたｉ−ｂｏｄｙの発現レベル、親和性及び特異性の改善
ＡＤＣＸ−９９のＣＤＲ１内において２８位でＧ＞Ｋへのアミノ酸置換が、３１位でＩ＞Ｆへのアミノ酸置換が行われ（図１ＤにそれぞれＸ１及びＸ３で指定）、ＡＤＣＸ−９９配列のＣＤＲ３内において８９位でＡ＞Ｙへのアミノ酸置換（図１ＤにＹ４で指定）が行われた場合、１０ｍｇ／Ｌから１４ｍｇ／Ｌへの発現の改善が観察された。これをＡＭ４−６６１に対応する配列で表す。ＡＤＸＣ−９９に対するＡＭ４−６６１のアライメントを図１０Ａに示す。
ＡＤＣＸ−９９のＣＤＲ１内において２８位でＧ＞Ｙへの置換（図１ＤにＸ１で指定）が、３１位でＩ＞Ｙへの置換（図１ＤにＸ３で指定）が行われ、ＡＤＣＸ−９９のＣＤＲ３内において８２位でＴ＞Ｉへの置換（図１ＤにＹ２で指定）が、８９位でＡ＞Ｙへの置換（図１ＤにＹ４で指定）が行われた場合、７００ｎＭ超から１ｎＭへのＣＸＣＲ４に対する親和性の改善が見られた。これをＡＭ４−２７２に対応する配列によって明示する。アライメントを図１０Ｂに示す。
ポリペプチドＡＭ３−１１４、ＡＭ５−２４５及びＡＭ３−５２３には、ＣＸＣＲ４に対する特異性の改善が観察された。ＡＤＣＸ−９９では３４％であったＣＣＲ４活性（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ β−アレスチンアッセイで測定）が、ＡＭ３−１１４、ＡＭ５−２４５及びＡＭ３−５２３ではそれぞれ−３％、−５％及び−２％減少した。全３つのポリペプチドは、ＡＤＣＸ−９９のＣＤＲ３内の８０位にＹ＞Ｗへの置換（図１ＤにＹ１で指定）、ＡＤＣＸ−９９のＣＤＲ１内の３０位にＤ＞ＧまたはＨへの置換（図１ＤにＸ２で指定）を有した。アライメントを図１０Ｃに示す。
実施例４−ｉ−ｂｏｄｙの半減期の改善
４．１ ＣＸＣＲ４及びヒト血清アルブミンに対する二重特異性
１８残基のヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）結合ペプチド（Ｎ末端）−ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ−（Ｃ末端）（ＵＳ２０１００１０４５８８；Ｄｅｎｎｉｓ ＭＳ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３５０３５−３５０４３に記載）をＡＭ３−１１４のＣ末端にコンジュゲートしてＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＳＡ２１（配列番号８０）を生成することにより、二重特異性ｉ−ｂｏｄｙを作製した。Ｉｍ７タンパク質は、コンジュゲートの検出を容易にするために使用した。
図１１に示すように、表面プラズモン共鳴法によってＣＸＣＲ４及びＨＳＡに対する親和性を測定した。二重特異性ＣＸＣＲ４及びＨＳＡ結合物質ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＳＡ２１は、ＣＸＣＲ４に対して約５〜１０ｎＭの親和性、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対して約５００ｎＭの親和性を示した（図１１Ａ）。ＣＸＣＲ４に対する親和性は、１８残基のＨＳＡペプチドＳＡ２１を付加してもしなくても変化しなかった（それぞれ図１１Ｃ及びＤ）。ｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ３−１１４は、１８残基のＨＳＡペプチドＳＡ２１を付加しないＨＳＡとは結合しなかった（図１１Ｂ）。したがって、このコンジュゲートはＣＸＣＲ４及びＨＳＡ両方と特異的結合を示している。
４．２ ｉ−ｂｏｄｙのＰＥＧ化
ｉ−ｂｏｄｙ分子の流体力学的半径を増加させ、それによって腎排泄及び肝排泄を低減するため（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２：８６８−８７６０）、ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ及びＡＭ４−７４６−Ｉｍ７−ＦＨ［Ｉｍ７−ＦＨはＮ末端の溶解性精製タグに対応し、Ｉｍ７はＥ．ｃｏｌｉタンパク質（Ｈｏｓｓｅ ＲＪ ｅｔ ａｌ（２００９）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １５；３８５（２）：３４６−５７）、ＦＨはｆｌａｇ＋６Ｈｉｓである］を、部位特異的コンジュゲート手法（ＨｉＰＥＧ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰｏｌｙＴｈｅｒｉｃｓ，ＵＫ）を利用して３０Ｋの直鎖ＰＥＧまたは２ｘ２０Ｋの分岐ＰＥＧにコンジュゲートした。
４．３ ｉ−ｂｏｄｙの半減期延長の評価
マウスの前臨床薬物動態学的試験において、ＰＥＧ化材料（ＡＭ３−１１４−３０Ｋ ＰＥＧ、ＡＭ３−１１４−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧ、ＡＭ４−７４６−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧ）と１つのＨＳＡペプチドのコンジュゲート（ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ−ＳＡ２１）を、対照ｉ−ｂｏｄｙであるＡＤＣＸ９９−９Ｈ（ヒスチジン９個のタグ）及びＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ（Ｉｍ７タンパク質とＦＬＡＧ＋６ Ｈｉｓタグの両方を含む）と比較して評価した。試験品目を、以下の表４に記載するように、マウス群に１回ずつ静脈内注射投与により投与した。
Figure 0006863897
１、２及び５群の動物に投与された用量容積は３ｍＬ／ｋｇであった。３群の動物に投与された用量容積は２ｍＬ／ｋｇであった。４群及び６群の動物に投与された用量容積は１．２５ｍＬ／ｋｇであった。以下の通りの投薬後に、全マウスから一連の血液サンプル（０．３ｍＬ、２つの時点／マウス３／群／時点）を採取した。
Figure 0006863897
この目的のために、各マウス（ＣＤ−１マウス）を伏在静脈経由、または心臓穿刺によるイソフルラン麻酔法下で採血し、サンプルを血液凝固阻止剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する管に採取した。管は処理するまで湿った氷上に配置した。最後の採血後、各動物を頚椎脱臼によって安楽死させ、それ以上検査せずに廃棄した。
採取後、サンプルを遠心分離（約４℃）し、得られた血漿を２つのアリコートに分けて回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄとラベルした１．５ｍＬの管（エッペンドルフ、カタログ番号０２２４３１０８１）中で冷凍保存（６０℃以下）した。ＡＤＣＸ９９−９Ｈ、ＡＭ３−１１４−ＩＭ７−ＦＨ、ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ−ＳＡ２１、ＡＭ４−７４６−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧ、ＡＭ３−１１４−３０Ｋ ＰＥＧ及びＡＭ３−１１４−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧの濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法によって測定した。サンプルの前処理には、ＡＤＣＸ９９−９Ｈ、ＡＭ３−１１４−ＩＭ７−ＦＨ、ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ−ＳＡ２１、ＡＭ４−７４６−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧ、ＡＭ３−１１４−３０Ｋ ＰＥＧ及びＡＭ３−１１４−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧを直接トリプシン消化して、ＣＤ−１マウス血漿由来のシグネチャーペプチド（ｓＰｅｐｔｉｄｅ）を得ることを必要とした。内部標準物質としてＧＥＫＬＴＰＮＱＱＲＩＧを使用した。ＡＤＣＸ９９−９Ｈ、ＡＭ３−１１４−ＩＭ７−ＦＨ、ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ−ＳＡ２１、ＡＭ３−１１４−３０Ｋ ＰＥＧ及びＡＭ３−１１４−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧに関しては理論濃度範囲０．５００μｇ／ｍＬ〜１００．０００μｇ／ｍＬ、及びＡＭ４−７４６−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧに関しては０．０８３μｇ／ｍＬ〜１６．６６７μｇ／ｍＬにわたって化合物を同定して定量化した。ＡＤＣＸ９９−９Ｈ、ＡＭ３−１１４−ＩＭ７−ＦＨ、ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ−ＳＡ２１、ＡＭ４−７４６−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧ、ＡＭ３−１１４−３０Ｋ ＰＥＧ及びＡＭ３−１１４−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧの原液は公称−８０℃で保存し、ＧＥＫＬＴＰＮＱＱＲＩＧ内部標準物質は４℃で保存した。
Ｔｕｒｂｏイオンスプレーを用いたＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ５０００またはＱＴＲＡＰ ５５００四重極質量分析計を、ＡＤＣＸ９９−９Ｈ、ＡＭ３−１１４−ＩＭ７−ＦＨ、ＡＭ３−１１４−Ｉｍ７−ＦＨ−ＳＡ２１、ＡＭ４−７４６−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧ、ＡＭ３−１１４−３０Ｋ ＰＥＧ及びＡＭ３−１１４−２ｘ２０Ｋ ＰＥＧの検出に使用した。
図１２ならびに表６Ａ及び６Ｂに示すように、ＡＭ３−１１４ ｉ−ｂｏｄｙの半減期は、ＳＡ２１ ＨＳＡ結合ペプチドの付加、ＰＥＧ ３０Ｋ及びＰＥＧ ２ｘ２０Ｋの付加いずれによっても延長された。
Figure 0006863897
４．４ ＸＴＥＮタンパク質配列のｉ−ｂｏｄｙとの融合
ＰＥＧ化に代わるものとして、発明者らは、ｉ−ｂｏｄｙのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長するためにｉ−ｂｏｄｙへ約４００残基の擬似反復配列を付加し、それに続いて精製／検出のためのＣ末端Ｈｉｓタグを利用するＸＴＥＮ方法の有用性を検討した。ＸＴＥＮ配列は本質的に非構造的に操作されるため、非免疫原性であり、また高親水性でもあるため、必然的に発現／精製／下流応用時にｉ−ｂｏｄｙの溶解性及び安定性を与える効果がある（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ；２７（１２）：１１８６−１１９０）。
ＡＭ３−１１４を細菌発現ベクター（ｐＥＴ２６）にクローニングして、初期発現試験を実施した。ウェスタンブロッティングは、誘導化されていない対照には存在しない抗Ｈｉｓ抗体と反応性であるバンドを示す。これは、ＡＭ３−１１４−ＸＴＥＮ構築物が確かに発現していることを強く示唆する。ＡＭ３−１１４−ＸＴＥＮ構築物の推定ＭＷは約５０ｋＤａであり、目的とするバンドは見かけの分子量で１００ｋＤａを少し超える程度である（データ示さず）。このことは、以前に他の非構造化タンパク質について観測された現象である、ｉｂｏｄｙの電気泳動移動度の有意な減少を引き起こす高度に非構造的で酸性のＸＴＥＮ群によって推定される移動度シフトと一致する。
この物質をフローサイトメトリーによってＲＡＭＯＳ細胞でのＣＸＣＲ４との結合性について試験し、用量依存的な方法で結合することを示した。結合性はＡＭ３−１１４ ｉ−ｂｏｄｙの場合よりもわずかに減少しただけであった。これは１１４−ＸＴＥＮが有効であったことを示している。ＡＭ３−１１４−ＸＴＥＮをＳＰＲで試験したところ、親和性はわずかに減少したが、脂質粒子上のＣＸＣＲ４との結合性は依然として保持されることがわかった。興味深いことに、オフレートはＸＴＥＮのないｉ−ｂｏｄｙと近似しているため、親和性の低下は主にオンレートによるものであることは明らかである（データ示さず）。
４．５ ｉ−ｂｏｄｙのＰＡＳ化
ｉ−ｂｏｄｙの半減期を延長するもう一つの方法は、ＰＡＳ化技術を使用することである。小アミノ酸のプロリン、アラニン及び／またはセリン（「ＰＡＳ」）の数百個の残基からなるポリペプチド配列とｉ−ｂｏｄｙを遺伝的に融合する。このＰＡＳ配列、特にＰＡＳ（４００）及びＰＡＳ（６００）は水溶液中でランダムコイル構造を採ることにより大きな流体力学的容積を生成し、血中でのタンパク質の半減期の延長を可能にする。この配列と融合されたタンパク質はまた、免疫原性及び毒性が極めて低いことも報告されている（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２０１３）２６：４８９）。この配列を標的タンパク質と融合すると、マウス体内での半減期を延長し、また標的タンパク質のドラッグライク特性を向上させることが示されている。
ｉ−ｂｏｄｙのＣ末端にＰＡＳ配列を融合し、タンパク質をＥ．Ｃｏｌｉ中で発現させる。
実施例５−ｉ−ｂｏｄｙの機能的特徴
５．１ ＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞でのｃＡＭＰの調節
ＤｉｓｃｏｖｅＲｘは、ｃＡＭＰ経由でシグナル伝達する未標識ＧＰＣＲを安定的に発現する細胞株のパネルを開発した。Ｈｉｔ Ｈｕｎｔｅｒ（登録商標）ｃＡＭＰアッセイは、抑制調節性Ｇタンパク質（Ｇｉ）及び刺激調節性Ｇタンパク質（Ｇｓ）の二次メッセンジャーシグナル伝達を介したＧＰＣＲの活性化を、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘが開発したＥｎｚｙｍｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＥＦＣ）と呼ばれる技術と機能的レポーターとしてのβ−ガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ）を使用して均質な非イメージングアッセイ形式でモニターする。酵素は、酵素アクセプターであるＥＡと酵素ドナーであるＥＤという２つの相補的部分に分かれている。ＥＤはｃＡＭＰと融合されており、アッセイにおいてｃＡＭＰ特異抗体との結合を、細胞が産生するｃＡＭＰと競合する。外部からのＥＡと、いずれかの結合していないＥＤ−ｃＡＭＰとの相補性によって活性型β−Ｇａｌが形成される。次いで活性酵素により化学発光基質が変換され、生じた出力シグナルを標準的なマイクロプレートリーダーで検出することができる。
方法
細胞処理
ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒの細胞株を、標準的手順に従って凍結貯蔵株から復元した。次に総容積２０μＬの細胞を、白壁の３８４ウェルマイクロプレートに播種し、試験までの適切な時間、３７℃でインキュベートした。製造業者の指示に従ってＤｉｓｃｏｖｅＲｘ ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ ｃＡＭＰ ＸＳ＋アッセイを使用してｃＡＭＰの変化を測定した。
アンタゴニスト形式
アンタゴニストを決定するため、ＣＸＣＲ４を発現するＨｕｎｔｅｒ細胞をサンプルとともにプレインキュベートし、続いてＥＣ８０濃度のアゴニストを負荷した。（Ｇｉ ｃＡＭＰアッセイの場合、濃度１５μＭのフォルスコリンを使用した）。培地を細胞から吸引し、１０μＬの１：１のＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬と交換した。ＣＸＣＲ４に対する、５μＬの４倍原液のＡＭＤ３１００またはｉ−ｂｏｄｙを細胞に添加し、３７℃または室温にて３０分間インキュベートした。５μＬの４倍ＥＣ８０アゴニストＳＤＦ−１を細胞に添加して、３７℃または室温にて３０または６０分間インキュベートした。ＧｉとＧＰＣＲの結合には、ＥＣ８０フォルスコリンを加えた（濃度１５μＭのフォルスコリンを使用した）。
シグナル検出
適切な化合物をインキュベートした後、２０μＬのｃＡＭＰ ＸＳ＋ＥＤ／ＣＬ細胞溶解混合液を加えて１時間インキュベートした後、２０μＬのｃＡＭＰ ＸＳ＋ＥＡ試薬を加えて室温で３時間インキュベートしてアッセイシグナルを生成した。化学発光シグナルを検出するためのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）装置を用いてシグナルを生成してマイクロプレートを読み取った。
結果
次に、対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）、ＡＭＤ３１００及びｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６、ＡＭ４−１１２１（ＩＣ５０）によるｃＡＭＰの阻害を測定した。データを表７及び図１３に示す。ＣＸＣＲ４のようなケモカイン受容体は主にＧαｉ結合型であり、したがって二次メッセンジャーｃＡＭＰを経由したシグナルである。サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の調節は、ＳＤＦ−１と種々の細胞シグナル伝達間の相互作用にとって重要であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃＡＭＰレベルを調節する能力について、ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙのパネルを調べた。前述のアンタゴニストＡＭＤ３１００は、６１５ｎＭの推定ＩＣ５０でｃＡＭＰを用量依存的に阻害する効果を示した。ｉ−ｂｏｄｙは、各細胞においてＳＤＦ−１誘発性のｃＡＭＰの減少を妨げる上で非常に効果的であった。実際、どのｉ−ｂｏｄｙもＡＭＤ３１００より低いＩＣ５０値を有した。ＩＣ５０の結果に基づくと、ＣＸＣＲ４結合ｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４は、ｃＡＭＰの強力な阻害剤である。
これらのデータは、ｉ−ｂｏｄｙがＣＸＣＲ４と結合できるとともに、Ｇαｉシグナル伝達経路などの主要な機能的シグナル伝達を阻害することができ、カルシウム流入に影響を及ぼすＧｑ経路を遮断せずにｃＡＭＰの調節を制御することを示唆している。このような理由からｉ−ｂｏｄｙは炎症及び線維症を予防できるだけでなく、幹細胞を動員しないため、長期療法に使用する際に利点となり得る。
Figure 0006863897
５．２ ＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞でのカルシウムの調節
ＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞をｉ−ｂｏｄｙまたはＡＭＤ３１００で３０分間処理し、次いで１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１で３０分間刺激した。その後、対照またはｉ−ｂｏｄｙ（ＩＣ５０）によるＣａ２＋流入の阻害を測定した。
材料
細胞
ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定発現する哺乳動物細胞を、Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ，Ｉｎｃ（カタログ番号Ｃ１００４−１）によって内部で作製した。使用する対照アゴニストはＳＤＦ−１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３００−２８Ａ）であった。
化合物
４０ｕＭまたは１０ｍＭの７つの化合物／ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５、ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６、ＡＭ４−１１２１及びＡＭＤ３１００）を液体形態にて試験した。ＡＭＤ３１００（別名プレリキサフォルまたはモゾビル）は、ＣＸＣＲ４の小分子アンタゴニストであり、市販されている。これを陽性対照として使用した。
カルシウムアッセイキット
Ｓｃｒｅｅｎ Ｑｕｅｓｔ（商標）Ｆｌｕｏ−８ Ｎｏ Ｗａｓｈキット（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ、カタログ番号３６３１５）
装置
ＦＬＩＰＲ ３８４（分子デバイス）
方法
カルシウムアッセイ
細胞を適切な濃度で３８４ウェルプレートに播種し、一晩培養した。カルシウムアッセイを製造業者のプロトコルに従って実施した。カルシウム色素を負荷した緩衝液を細胞に添加して、３７℃で１時間インキュベートした。化合物を１９秒間隔でウェルに注入しながら、カルシウム流入を１２０秒間モニターした。アンタゴニストモードでは、担体または化合物を細胞とともに３０分間プレインキュベートした後、用量反応曲線から得たＥＣ８０濃度の対照アゴニストを加えてカルシウム流入を測定した。データを表８及び図１４に示す。カルシウム流入はＧｑ経路によって誘導されるため、この結果は、試験したｉ−ｂｏｄｙの全てがＧｑ経路を有意に調節しないことを示唆している。したがって、ｉ−ｂｏｄｙはカルシウム流入を調節しない。
Figure 0006863897
５．３ ＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞でのβ−アレスチンの調節
例えばＨｅｎｇ Ｂ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ９（１）：２１−３０に記載されているβ−アレスチンＢＲＥＴアッセイで、ＣＸＣＲ４へのｉ−ｂｏｄｙの結合を調べた。ｉ−ｂｏｄｙがＣＸＣＲ４活性のアゴニストであるかアンタゴニストであるかを特性決定するため、「ビヒクル」及び「ＳＤＦ−１＋ビヒクル」対照とともに、１００ｎＭのＳＤＦ−１がある場合とない場合の１０種の濃度でｉ−ｂｏｄｙを調べた。
各結合物質のβ−アレスチンＢＲＥＴアッセイの結果を表９及び図１５に示す。ＡＭＤ３１００は、ＩＣ５０が１８ｎＭであるのに対して、親ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＤＣＸ−９９）はβ−アレスチンの動員に対して極めて弱い効果を有した。おそらくこれは、ＳＰＲによって示されたＣＸＣＲ４に対する低親和性（６４３ｎＭ）によると思われる。ｉ−ｂｏｄｙパネルのＩＣ５０値は、ＡＭ３−１１４及び１２７で１６４ｎＭ、ＡＭ３−５２３で１３ｎＭの範囲であった。こうしたβ−アレスチン動員の変化は、結合領域内の１〜１０個のアミノ酸の変化によって生じるものである。
Figure 0006863897
実施例６−ｉ−ｂｏｄｙの結合特性
表面にヒトＣＸＣＲ４を発現するいずれかの細胞を使用して、本明細書に記載するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチド（ｉ−ｂｏｄｙ）がネイティブ細胞表面のＣＸＣＲ４と結合する能力を調べることができる。そのような細胞株の例としては、ヒトＴ細胞株、ＣＥＭならびに他の細胞株、例えばＲａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、Ｎａｍａｌｗａ、Ｌ５４０、ＤＭＳ７９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−５４９、ＭＯＬＴ−４、ＤＵ−４４７５、ＤＵ−１４５、ＰＣ３、ＬＮｃａＰ、ＳＷ４８０、ＨＴ２９、ＮＣＩ−Ｈ６９及びＨＬ６０が挙げられる。
６．２ フローサイトメトリー分析によるｉ−ｂｏｄｙのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合親和性
細胞をｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６及びＡＭ４−１１２１（１０μＭ、１μＭ及び０．００１μＭ）で処理して、染色強度をフローサイトメトリー分析によって評価した。試験した細胞株は、Ｔ４７Ｄ（ＣＸＣＲ４陰性）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＣＸＣＲ４低発現）、及びＮａｍａｌｗａ、ＮＣＩ−Ｈ６９、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ａ４９８、Ｒａｍｏｓ（ＣＸＣＲ４高発現）であった。
方法
細胞株を採取して、細胞を９６ウェル組職培養プレートに移した（２ｘ１０５細胞／ウェル）。次に、培養プレートを１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。試験抗体を含有する１００ｕＬのＰＢＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、４℃で６０分間インキュベートした。細胞を３００ｕｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回、１０００ｒｐｍで５分間、洗浄して、（ｉ−ｂｏｄｙに対する）抗Ｈｉｓ−ＰＥ抗体を含有する１００ｕｌのＰＢＳ緩衝液で再懸濁し、暗所にて４℃で４０分間インキュベートした。次に、細胞を３００ｕｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回、１０００ｒｐｍで５分間、洗浄して、細胞を３００ｕｌの懸濁緩衝液で再懸濁し、標準方法に従ってＦＡＣＳ分析を施した。
フローサイトメトリー分析によって実証したＣＸＣＲ４に対する結合親和性を図１６−１〜１６−３に示す。これは、代表するｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４のＴ４７Ｄ細胞（Ａ）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（Ｂ）、ＭＯＬＰ８（Ｃ）、ＭＯＬＴ４（Ｄ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｅ）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（Ｆ）、Ａ４９８（Ｇ）、Ｒａｍｏｓ（Ｈ）、ＮＣＩ−Ｈ６９（Ｉ）及びＨＬ−６０（Ｊ）での結果である。細胞株は、３種類のｉ−ｂｏｄｙ濃度（１０μＭ、１μＭ及び０．００１μＭ）で試験した。例外としてＮａｍａｌｗａ細胞は４．７、２．１、０．４７、０．２１、０．１及び０．０１μＭのｉ−ｂｏｄｙでも試験した。
実施例７−ｉ−ｂｏｄｙによるＳＤＦ−１とのＣＸＣＲ４結合の競合
７．１ ｉ−ｂｏｄｙのＣＸＣＲ４への結合競合性のＳＰＲ分析
ＷＯ２００５／０４２６９５に記載されているように、リポタンパク質（ＩｎｔｅｇｒａＭｏｌｅｃｕｌａｒ）を含有するＣＸＣＲ４を利用して、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害するｉ−ｂｏｄｙの能力を決定する競合試験を実施した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙパネルのリガンドＳＤＦ−１との競合能力を試験した。図１７は２つのｉ−ｂｏｄｙの例を示す。１つは用量依存的にＳＤＦ−１と競合し（ＡＭ３−１１４、図１７Ａ）、もう１つはあまり競合しなかった（ＡＭ４−２７２、図１７Ｂ）。ＣＸＣＲ４脂質粒子を、２ｎＭ、５０ｎＭ及び２００ｎＭのｉ−ｂｏｄｙ及びＳＤＦ−１と同時注入した。
表１２は、各ｉ−ｂｏｄｙがＣＸＣＲ４陽性脂質粒子への結合をＳＤＦ−１と競合する程度（＋によって示す）を示す。
Figure 0006863897
７．２ 種々のＣＸＣＲ４結合分子による、ｉ−ｂｏｄｙのＣＸＣＲ４への結合競合性のフローサイトメトリーアッセイ
Ｎ末端配列ＥＡＥＡを含むＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４−６Ｈ、ＡＭ４−２７２−６Ｈ及びＡＭ３−５２３−６Ｈ）の、細胞表面に発現したＣＸＣＲ４への結合性、及びＳＤＦ−１の結合を競合する能力を、フローサイトメトリーを使用して評価した。ｉ−ｂｏｄｙを１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＰＢＳ及び２％のＦＣＳ）中のＲａｍｏｓ細胞とともに４℃で６０分間インキュベートした。２ｍｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞を抗Ｈｉｓ−ＰＥ抗体（ＭＡＣＳ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、注文番号：１３０−０９２−６９１）を含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、暗所にて４℃で４０分間インキュベートした。このアッセイは堅調であり、これを使用して、ｉ−ｂｏｄｙとＳＤＦ−１及び他のアンタゴニストとの競合を検討することができる。この場合、各ｉ−ｂｏｄｙ（０．５μＭ）は単独でまたは過剰なＳＤＦ−１（２μＭ）、ＭＡｂ１２Ｇ５（２μＭ）及びＡＭＤ３１００（２μＭ）の存在下で、細胞とともにインキュベートした。３つ全てのｉ−ｂｏｄｙの結合性が、２μＭのＡＭＤ３１００の添加時に減少した（図１８）。ＳＤＦ−１は、ＡＭ４−２７２と効果的に競合することが可能であったが、ＡＭ３−１１４及びＡＭ３−５２３とは部分的にしか競合しなかった。３つ全てのｉ−ｂｏｄｙがＡＭＤ３１００と競合した。このことは、ｉ−ｂｏｄｙの結合部位と、この小分子との間に類似性があることを示している。抗ＣＸＣＲ４ ＭＡｂ １２Ｇ５は、ほぼ完全に５２３の結合性を減少させ、かつＡＭ３−１１４及びＡＭ４−２７２の結合を部分的に妨げることが可能であった。
実施例８−ｉ−ｂｏｄｙによるＣＸＣＲ４発現細胞の遊走の阻害
本明細書に開示するＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチド（ｉ−ｂｏｄｙ）が、ＳＤＦ−１によって誘導される遊走を阻害する能力を、転移可能性及び転移特性の観点からｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で特徴が顕著である乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及び前立腺癌細胞株ＰＣ３を用いて検討することができる（Ｋａｉｇｈｎ ｅｔ ａｌ １９７９ Ｉｎｖｅｓｔ Ｕｒｏｌ．１７（１）：１６−２３．Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ ２０００ Ｃａｎｃｅｒ ８８：２９７９−８８）。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、ヌードマウスの原発性乳房脂肪体腫瘍から肺へ浸潤して転移する。この方法は、Ｂｙｅｏｎｇ−Ｃｈｅｌ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２；３２７に記載されている。簡潔には、フィブロネクチン（５０μｇ／ｍＬ）でコーティングしたトランスウェルインサート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に細胞を添加する。次に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞及びＰＣ３細胞を無血清培地中で一晩飢餓状態にした後、抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙとともにインキュベートし、８μｍ細孔径のトランスウェルインサートに付着させる。５００μＬのＲＰＭＩ １６４０中に７ｘ１０４／ｍＬの最終濃度で、細胞を上部チャンバに懸濁させる。順次希釈した組換えＳＤＦ−１を下部チャンバに添加する。３〜９時間のインキュベート後、フィルター上面の細胞を綿棒で拭って除去し、下部チャンバの遊走細胞を固定化して、製造業者の指示に従ってＨｅｍａ３キット（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）を使用して染色する。次に、４分割した顕微鏡視野の視野ごとに細胞遊出を計数する（Ｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ １０５（２０１４）１３４３−１３５０；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）１１（１）８６−９４）。
実施例９−ｉ−ｂｏｄｙによる血管形成の阻害
ＨＵＶＥＣ中の表面ＳＤＦ−１またはＣＸＣＲ４の不活化は、マトリゲルでコーティングした表面に管状構造を配列するＨＵＶＥＣの能力を減衰する。ＨＵＶＥＣがマトリゲル依存的な管状構造を形成する能力に対する、本開示のｉ−ｂｏｄｙの効果を、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００７ Ａｕｇｕｓｔ ３；３５９（３）：７１６−７２２に従って試験することができる。毛細管形成アッセイを実行するために、ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙアンタゴニストを、それぞれ１００ｎＭ、５μＭ及び１μｇ／ｍｌ濃度のヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とともに室温で１０分間プレインキュベートした後、播種した。次に、１％のＦＢＳ及び２００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１を加えた濃度１ｘ１０５細胞／ｍｌのＭ１９９培地のマトリゲル層上で細胞を播種する。１８時間後に、ウェルを４倍率でランダムに５視野撮影し、それらの脈管網の数を計数する。
実施例１０−ｉ−ｂｏｄｙによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞増殖の阻害
本明細書に開示するＣＸＣＲ４分子またはポリペプチド（ｉ−ｂｏｄｙ）が、Ｒａｍｏｓ腫瘍細胞、すなわち前述のＣＸＣＲ４を発現するヒトバーキットリンパ腫細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を阻害する能力を、（Ｌａｐｔｅｖａ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２，８４−８９）に記載されているＭＴＴ細胞増殖アッセイで検討した。細胞を９６ウェル組職培養プレートで成長させ、ビヒクルまたは抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙで処理した。次に、ＭＴＴ溶液を加えて細胞を約４時間インキュベートした。このインキュベーション後、非水溶性ホルマザン色素が形成される。可溶化後、走査マルチウェル分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）を使用してホルマザン色素を定量化する。出現した吸光度は、細胞数と直接相関する。
ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４は１０μＭでＲＡＭＯＳ細胞の成長を実質的に阻害できることがわかった。この効果は特に、ｉ−ｂｏｄｙの添加後２４〜４８時間で顕著であったが、ｉ−ｂｏｄｙの添加から７２時間後もまだ細胞の阻害は十分であった。予測した通り、ＡＭＤ３１００もまた、この期間の細胞成長を阻害することが可能であった。２つの対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５及びＡＭ８−７）は、細胞成長にほとんど影響を及ぼさなかった。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２には小さい阻害効果があったが、ＡＭ３−５２３にはこのアッセイで観察可能な効果はなかった。ｉ−ｂｏｄｙは、正常なＨＥＫ細胞に影響を及ぼさなかった。
実施例１１−ｉ−ｂｏｄｙによるアポトーシスの誘導
本発明のｉ−ｂｏｄｙが、Ｒａｍｏｓ腫瘍細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）のアポトーシスを誘導する能力を、Ｍｉｓｈｒａ Ｍ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １５（１１）：２４６２−７７に記載されている方法によるアポトーシスアッセイで検討した。ｉ−ｂｏｄｙをＲａｍｏｓ細胞とともにインキュベートし、２４時間または７２時間後にフローサイトメトリーによって検討した。アポトーシスの従来的な標識であるアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで細胞を染色した。二重陽性であった細胞はアポトーシス化されたと評価した。３種のＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４−６Ｈ、ＡＭ４−２７２−６Ｈ及びＡＭ３−５２３−６Ｈ）は、強いアポトーシス誘導が可能であった（図１９）。未処理の細胞は、細胞が本来は健全であったことを示す陰性対照の役割を担った。タプシガルギンは、定評あるアポトーシス誘導試薬であり、アポトーシスの予測レベルを示す。ＡＭＤ３１００は、Ｒａｍｏｓ細胞において有意なアポトーシスを誘導しない。このことは、ヒト抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂ ＭＤＸ−１３３８が、Ｒａｍｏｓ細胞においてアポトーシスを誘導することが可能であったが、ＡＭＤ３１００は誘導しなかったことを示す先の報告と整合性がある（Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１３）１９（２）：３５７−６６）。
実施例１２−ｉ−ｂｏｄｙのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍との結合
１２．１−ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を静脈内注射したＳＣＩＤ／ｂｇマウスの脾臓及び肝臓内の腫瘍のｉ−ｂｏｄｙによる染色
１３０μｇ／ｍｌの抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４−６Ｈ、ＡＭ４−２７２−６Ｈ及びＡＭ３−５２３−６Ｈ）を使用した免疫組織化学染色を、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を静脈内注射し、２７日後に犠牲死させたＳＣＩＤ／ｂｇマウスの脾臓及び肝臓に実施した。組織を１０％の中性緩衝ホルマリン中で一晩固定化した後、組織カセットに移して７０％のエタノール中に静置した。次に組織をパラフィン包埋した。４μＭの切片を収容したスライドを、キシレンを取り替えて５分ずつ２回、続いて１００％のエタノールを取り替えて３分ずつ２回、７０％のエタノールで２分間、５０％のエタノールで２分間、及び蒸留水で５分間インキュベートすることにより、脱パラフィン及び水和した。１０ｍＭのクエン酸溶液（ｐＨ６．０）中のスライドを８０℃のオーブン内で一晩インキュベートすることにより、抗原回復を実施した。その後、スライドをＰＢＳで洗浄し、０．４％のＨ２Ｏ２を含有する１０％メタノールに３０分間浸漬した。浸漬処理後、ＣＸＣＲ４特異的ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４−６Ｈ、ＡＭ４−２７２−６ＨまたはＡＭ３−５２３−６Ｈ）及び対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５−６Ｈ）を加えて、スライドを４℃で一晩染色した。その後、スライド全てをビオチン化抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で染色し、製造業者の指示（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってＨＲＰ−ＤＡＢ細胞及び組織染色キットを使用して発色させた。
１３０μｇ／ｍｌのＡＭ３−１１４−６Ｈ及びＡＭ４２７２−６Ｈは、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を負荷した免疫不全マウスの脾臓及び肝臓内のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を染色した（図示せず）。
１２．２−固形腫瘍
ＣＸＣＲ４結合分子またはポリペプチド（ｉ−ｂｏｄｙ）が、ｉｎ ｖｉｖｏでの定着固形腫瘍の増殖を阻害する能力を、Ｒａｍｏｓ皮下腫瘍細胞モデル（または、Ｎａｍａｗａｌａ細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＰＣ３細胞）を使用して検討することができる。このアッセイでは、１０ｘ１０６細胞／マウスを各マウスの脇腹領域に移植し、腫瘍の長さｘ幅ｘ高さ／２によって算出される平均サイズを４０ｍｍ３に成長させる。次に、マウスに第１の用量のｉ−ｂｏｄｙ（治療０日目と称する）及び７日目に第２のｉｐ用量の抗体を腹腔内（ｉｐ）注射により投与する。マウス群を（ｉ）ビヒクル（ｉｉ）ｉ−ｂｏｄｙまたは（ｉｉｉ）抗ＣＤ２０陽性対照のいずれかで処理する。腫瘍容積及びマウス体重を０日目から３０日目の投薬後まで定期的に計量する（約２〜３回／週）。
このアッセイモデルはまた、ｉ−ｂｏｄｙがマウスの生存時間を延長する能力を評価する際にも用いることができる。
１２．３−転移
本開示のｉ−ｂｏｄｙの抗転移効果を、動物モデルにおいて試験することができる。乳癌転移では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を静脈内注射して実験的な転移モデルを作成する。６〜８週齢の雌ヌードマウスに尾静脈経由で、ｉ−ｂｏｄｙ（１ｍＭ、プレインキュベーション５分未満）を混合した１．５ｘ１０６のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を注射する（１０匹／群）。翌日から治療群のマウスに毎日４ｍｇ／ｋｇのｉ−ｂｏｄｙをｉ．ｐ．注射により投与する。動物を腫瘍細胞注射の３５日後に犠牲死させる。全肺組織を採取して切片化し、ヒトＣＸＣＲ４のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及びＨ＆Ｅ組織染色を行い、顕微鏡により切片あたり５視野の転移性腫瘍領域を評価する。
頭頚部癌動物モデルでは、６８６ＬＮ−Ｍｓ細胞の転移性サブクローンを、（Ｙｏｏｎ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：７５１８−７５２４）に記載されているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と同様の方法で注射する。
ブドウ膜黒色腫微小転移巣マウスモデルでは、０日目に、ＨＧＦ／ＴＧＦ−ｂ／ＣＸＣＲ４／ＭＭＰ２を発現する１ｘ１０６の野生型ＯＭＭ２．３細胞を各マウスの右眼の後房に接種する。３日目から、マウスを毎日のｉ．ｐ．注射により本発明のｉ−ｂｏｄｙで処理し、その一方で対照マウスには０．１ｍＬの４５％（２−ヒドロキシプロピル）−ベータシクロデキストリンを注射する。７日目に、腫瘍のある眼球を摘出する。腫瘍の成長を組織学的方法によって確認する。２８日目に、肝組織を採取して１０％のホルマリンで固定し、加工してＨ＆Ｅ染色し、顕微鏡により肝微小転移巣の数を計数する。肝臓中心を通る６断面を顕微鏡で観察し、微小転移巣（直径１００ｍｍ）の存在、及び判定する断片当たりの平均微小転移巣数を調べる（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（４）：ｅ３４０３８）。
実施例１３−ｉ−ｂｏｄｙによるＨＩＶ侵入の阻害
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＶ阻害アッセイを使用して、ＣＸＣＲ４を発現するＴ細胞へのＨＩＶの侵入をｉ−ｂｏｄｙが阻害する能力を実証した。図２０に示すように、ＡＭ３−１１４は、ＣＸＣＲ４を発現するＴ細胞へのＨＩＶの侵入をＡＭＤ３１００と類似した有効性で遮断することが可能であった。予測された通り、阻害アッセイにおいてＡＭ３−１１４及びＡＭＤ−３１００は５０ｎＭのＩＣ５０を有したが、陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）は効果を有しなかった。
細胞生存性アッセイ
第２の実験では、ｉ−ｂｏｄｙがＨＩＶ感染に利用された細胞の生存性を損なわないことが実証された。
方法
ＨＩＶ阻害アッセイでは、ｉ−ｂｏｄｙ（陰性対照ｉ−ｂｏｄｙの２１Ｈ５、抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６またはＡＭ４−１１２１）添加の２４時間前に、ＮＰ２−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞（１００μｌ中に１ｘ１０４）を平底９６ウェルプレートに播種した。次に培地を細胞から除去し、５倍希釈したｉ−ｂｏｄｙを加えた１００μｌの新しい培地と交換し、３７℃で１６時間培養した。ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙの濃度範囲は、２５μｇ／ｍｌ〜０．００８ｕｇ／ｍｌであった。未処理ウェル中のＰＢＳは濃度（５．８％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を一定に維持した。時間経過後、培地を除去し、新しい培地と交換した。次の培養期間を通してｉ−ｂｏｄｙ濃度を維持した。ＮＰ２−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞を３７℃で合計７２時間インキュベートした。各ウェルの細胞生存性を、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｒｅ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。ＦＬＵＯＳｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ）を使用して発光を測定した。抗体存在下での細胞生存率を決定するために、抗体で処理した細胞のルシフェラーゼ量を未処理細胞での量との比率で表した。結果を図２１に示す。
ウイルス侵入の阻害
全てのＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙが、２種類のＨＩＶ−１ ＣＸＣＲ４を使用したエンベロープ株ＮＬ４．３及び１１０９−Ｆ−３０の有意な阻害レベルを引き起こすことを明らかにする。ＮＬ４．３はラボ適合性エンベロープであり、対する１１０９−Ｆ−３０は慢性感染した個体由来の亜型Ｃ臨床用エンベロープである。ｉ−ｂｏｄｙは、無関係な受容体との結合後にエンドサイトーシスを受ける小胞性口内炎ウイルスからのエンベロープである無関係なウイルス（ＶＳＶＧ）の侵入を阻害しなかった。結果を図２２に示す。
陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）は、株１１０９−Ｆ−３０にはほとんど影響を与えなかったが、株ＮＬ４．３には若干の侵入効果を示した。比較すると、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−７４６及びＡＭ４−１１２１は全て、約８０ｎＭのＩＣ５０で非常に良好に両方のＨＩＶ株を阻害した。更に、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４及びＡＭ４−７４６をサイズ３０Ｋ（直鎖）及び２ｘ２０Ｋ（分岐）のＰＥＧとコンジュゲートすると、ＩＣ５０は約８０ｎＭのまま維持された。先の実験とも一致するが、ＡＭ４−２７２はＨＩＶ感染を妨げる効果が最少であった。
ＰＥＧ化したｉ−ｂｏｄｙが、宿主細胞へのＨＩＶ感染を妨げる能力を分析した。３種類のウイルス株のＨＩＶ侵入を妨げる能力について、２０ＫのＰＥＧとコンジュゲートしたＡＭ３−１１４、３０ＫのＰＥＧとコンジュゲートしたＡＭ３−１１４及び３０ＫのＰＥＧとコンジュゲートしたＡＭ４−７４６を分析した。これらを非ＰＥＧ化型のｉ−ｂｏｄｙと比較した。ＡＭ３−１１４及びＡＭ４−７４６はいずれも、非ＰＥＧ化ｉ−ｂｏｄｙと比較してＰＥＧ化ｉ−ｂｏｄｙの力価がわずかに減少した以外は、非ＰＥＧ化型と同様にＨＩＶ侵入を妨げることが可能であった（図２３−１）。
ＰＥＧ化ｉ−ｂｏｄｙ及び非ＰＥＧ化ｉｂｏｄｙは、侵入にＣＣＲ５を利用するＨＩＶ株（ＹＵ−２）による宿主細胞へのＨＩＶの侵入を妨げることはできなかった（図２３−２）。これはｉ−ｂｏｄｙの抗ＣＸＣＲ４活性がＨＩＶの侵入を妨げる上で重要であることを示している。
方法
感染の２４時間前に、ＮＰ２−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞（１００μｌ中に１ｘ１０４）を平底９６ウェルプレートに播種した。抗ＣＸＣＲ４抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再懸濁した。感染前に、培地を細胞から除去し、５倍希釈した（２倍濃度の）ｉ−ｂｏｄｙを加えた１００μｌの新しい培地と交換し、３７℃で３０分培養した。ＣＸＣＲ４抗体の濃度範囲は、２５μｇ／ｍｌ〜０．００８ｕｇ／ｍｌであった。未処理ウェル中のＰＢＳは濃度（５．８％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を一定に維持した。ＮＰ２−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞を、３７℃で１２時間、１００μｌ中に２００ ＴＣＩＤ５０のＥｎｖ偽型ルシフェラーゼレポーターウイルスに感染させた。時間経過後、接種源を除去し、新しい培地と交換した。次の培養期間を通してｉ−ｂｏｄｙ濃度を維持した。ＮＰ２−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４を３７℃で合計７２時間インキュベートした。ＨＩＶ−１の侵入レベルを、製造業者プロトコルに従って細胞可溶化物のルシフェラーゼ活性によって測定した（Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＦＬＵＯＳｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ）を使用して発光を測定した。バックグラウンド活性を模擬感染細胞によって評価し、これを全ウェルから減算した。ｉ−ｂｏｄｙ存在下でのＨＩＶ−１侵入率を算出するために、ｉ−ｂｏｄｙで処理した細胞のルシフェラーゼ量を未処理細胞での量との比率で表した。
実施例１４−ｉ−ｂｏｄｙによる幹細胞動員の欠如
プレリキサフォルすなわちＡＭＤ３１００は小分子ビシクラムＣＸＣＲ４阻害剤であり、ＨＳＣを動員するＧ−ＣＳＦとの併用が承認されている。従来技術のＣＸＣＲ４阻害剤は、幹細胞の動員を生じることが知られている。本実施例に示す実験で実証されるように、本開示のｉ−ｂｏｄｙは幹細胞の動員を引き起こす能力を欠く。
１４．１ 種々の造血細胞に対するＣＸＣＲ４抗体の特異性の評価
種々の造血細胞集団へのＣＸＣＲ４抗体（ＦＬＡＧ標識）の直接的な結合を確認するために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスから採取した骨髄細胞を、５種のＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ４−２７２、ＡＭ４−７４６、ＡＭ４−１１２１、ＡＭ３−１１４またはＡＭ３−５２３）の混合薬で染色し、次いで二次的に蛍光性抗ＦＬＡＧ抗体で標識した。これらの細胞を細胞系マーカー、前駆細胞マーカー及びＨＳＣマーカーで染色し、種々の造血細胞集団でＣＸＣＲ４の発現を評価した。この実験の結果は、原発性マウス造血細胞でのＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙの活性を実証している。同様の実験を、ヒト化ＮＳＧマウスから採取した骨髄細胞で実施し、原発性ヒト造血細胞集団でのＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ活性を確認した（データ示さず）。
ｉ−ｂｏｄｙは全て、骨髄細胞及びヒト臍帯血と結合することが可能であり、ＣＤ３４＋及びＣＤ３８−であった。
１４．２ マウスＬＳＫ及びＬＳＫＳＬＡＭ細胞の動員
ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙを使用して造血幹細胞の動員の証拠を得るために、ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ４−２７２、ＡＭ４−７４６、ＡＭ４−１１２１、ＡＭ３−１１４またはＡＭ３−５２３）をｉ．ｖ．注射によりマウスに注入した（５マウス／群）。１時間後及び３時間後に、マウスを安楽死させ、末梢血（ＰＢ）を採取した。脾臓を採取して計量し、脾腫（脾臓の膨張）を評価する。図２４Ａに示すように、ＰＢを計数して白血球含量を評価した。サンプルを溶解して赤血球を除去し、４０００個の細胞を播種して、ＬＰＰ（低増殖能）コロニー及びＣＦＵ−ＨＰＰ（コロニー形成単位−高増殖能）のコロニー（播種後７日のコロニー計数）を得た。抗体混合液で残存細胞を染色して、系統拘束（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞、幹細胞及び前駆細胞の計数を評価した。フローサイトメトリー解析を使用して、系統拘束細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、ならびにＰＢ容積当たりの濃縮ＨＳＣの数を算出した。白血球の動員は、陽性対照ＡＭＤ３１００と比較してｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ４−２７２、ＡＭ４−７４６、ＡＭ４−１１２１、ＡＭ３−１１４またはＡＭ３−５２３、図２４Ａ）のいずれでも検出されなかった。陽性対照ＡＭＤ３１００と対照して、マウスＬｉｎ−、Ｓｃａ−１＋、ｃ−Ｋｉｔ＋（ＬＳＫ細胞）の動員がないことを図２４Ｂに示す。陽性対照ＡＭＤ３１００と比較して、ｉ−ｂｏｄｙによるＬＳＫ細胞の動員は達成されなかった。
図２４Ｃは、ｉ−ｂｏｄｙによるＬｉｎ−、Ｓｃａ−１＋、ｃ−Ｋｉｔ＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、（ＣＤ３４−）ＬＳＫＳＬＡＭ細胞の動員がないことを示す。ここでも、全てのｉ−ｂｏｄｙに動員が観察されなかった。
１４．３ ヒトＣＤ３４＋細胞の動員
ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙを使用したヒトＣＤ３４＋幹細胞及び前駆細胞の動員の証拠を得るために、ヒト化ＮＯＤＳＩＬ２Ｒγ（ＮＳＧ）マウスにおいて上記の動員実験を実施した。ＮＳＧマウスは極度に免疫不全であり、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を欠く、極度に不完全な先天免疫を有しており、術後の拒絶反応がないヒト細胞の移植が可能である。ＮＳＧマウスに、新たに選別されたＣＤ３４＋臍帯血細胞を移植して、陽性ヒトＣＤ４５／ＣＤ３４移植（約４〜５週）を確認次第、ヒト幹細胞動員のマウスモデルとして使用した。
ヒト化ＮＳＧマウスを２１Ｈ５ ｉ−ｂｏｄｙ、ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４及びＡＭ３−５２３）、及びこのモデルにおいて以前にＣＤ３４＋細胞の有意な動員を示した陽性対照ＡＭＤ３１００で処理した。
動員された末梢血を採取し、ＣＤ３４＋（ヒト幹細胞及び前駆細胞）を評価した。
図２５に示すｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４及びＡＭ４−５２３を用いた予備実験は、ヒト化ＮＯＤＳＩＬ２Ｒγ（ＮＳＧ）マウスモデルにおける陽性対照ＡＭＤ３１００と比較して、これらのｉ−ｂｏｄｙが幹細胞を動員しないことを示している。この発見は重要であり、幹細胞の動員を引き起こすことが知られている従来技術のＣＸＣＲ４阻害剤からの転換を意味する。
１４．４ ｉ−ｂｏｄｙの幹細胞への結合の確認
ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙがＨＳＣを結合するかどうかを決定するために、ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合分析を評価した。既述のように（Ｎｉｌｓｓｏｎ ＳＫ ｅｔ ａｌ，２００５ １５；１０６（４）：１２３２−９；Ｇｒａｓｓｉｎｇｅｒ，２００９ ２；１１４（１）：４９−５９）、臍帯血（ＣＢ）及びヒト骨髄（ＢＭ）を採取した。既述のように（Ｇｒａｓｓｉｎｇｅｒ、２００９）、濃縮したヒトＢＭ ＣＤ３４＋細胞及び精製したＣＢ ＣＤ３４＋細胞を単離した。ヒトＣＢ及びＢＭ ＣＤ３４＋細胞及びｈｕＮＳＧ ＢＭを、ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ（１０μｇ／ｍｌ）、抗Ｈｉｓ−ＰＥならびにＣＤ３４−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ＃３４８０５３）及びＣＤ３８−ＢＶ４２１（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ＃５６２４４４）を含有する抗体混合液で順次染色し、ＰＢＳ（０．５％のＢＳＡ）で洗浄して、既述のように（Ｇｒａｓｓｉｎｇｅｒ、２００９）Ｃｙｔｏｐｅｉａ Ｉｎｆｌｕｘ（ＢＤ）でのフローサイトメトリーによって分析した。ヒト及びマウスのＢＭ及びＰＢ分析では、最大５ｘ１０６の細胞を１０〜２０，０００細胞／秒で分析した。データはＦｌｏｗＪｏ １０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して分析した。ｈｕＮＳＧ ＢＭの分析では、ｈｕＣＤ４５−ＰＥＣｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５７７４８）及びｍｕＣＤ４５−ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６４２７９）も抗体混合液に含めた。ヒトＣＢ及びＢＭからのＨＳＣをＣＤ３４＋ＣＤ３８−と定義し、ｈｕＮＳＧマウスからのＨＳＣをｍｕＣＤ４５−ｈｕＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８−と定義した。３個体のドナーからのＣＢ及びＢＭサンプル、ならびに３個体のｈｕＮＳＧマウスからのＢＭを評価した。
ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２及びＡＭ３−５２３は、結合活性を減少させるヒト臍帯血ＨＳＣと効果的に結合した（図２６）。ＡＭ３−１１４はまた、ヒト骨髄ＨＳＣ及びヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−（ｈｕＮＳＧ）マウスから採取した骨髄に効果的に結合した（図２６）。
実施例１５−ｉ−ｂｏｄｙによる線維症の予防
１５．１ 角膜アルカリ熱傷モデル
ｉ−ｂｏｄｙによる線維症誘導（角膜新生血管（ＮＶ））を、Ｃａｉ Ｘ ｅｔ ａｌ（２０１４）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（２）：ｅ８８１７６に記載されている角膜アルカリ熱傷モデルを使用して検討することができる。この方法は、６０ｍｇ／ｋｇのネンブタールの腹腔内注射及び１滴のテトラカインの局所投与によりラット（例えばＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）を麻酔することが必要である。１ＮのｎａＯＨに浸漬した直径１．５ｍｍ円形片の濾紙を、右眼の中心角膜と４０秒間接触させて静置することにより、角膜アルカリ外傷を形成する。アルカリに暴露した直後に、眼球面をＰＢＳで６０秒間すすぐ。ラットを無作為に２群に分けた（ｎ＝１５）。第１群は、正常生理食塩水で処理（１０μｌ、１日に４回）したアルカリ熱傷を施したラットで構成され、第２群は、ＴＭＰで処理（１０ｍｌ容積中１．５ｍｇ／ｍｌ、１日４回）したアルカリ熱傷を施したラットで構成した。その後、２８日目に細隙灯顕微鏡検査法を使用して全眼を観察し、角膜ＮＶを評価した。
１５．２ 角膜のＮＶの評価
Ｚｈａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４６：４０６２−４０７１ ｄｏｉ：１０．１１６７／ｉｏｖｓ．０４−１３３０に記載されているように、角膜ＮＶ（ＮＶ）を定量化することができる。簡潔には、研究状況を盲検された眼科医が、アルカリ熱傷後１、２、５及び８日に細隙灯顕微鏡下で全眼を検査する。角膜画像を４分割する。各区画の血管長（Ｌｉ、ｉ＝１〜４）を、ノギスを使用して測定する。次式を使用して角膜ＮＶ面積（Ａ）を算出する：Ａ＝Σｉ＝１−４ ３．１４１６ｘ｛Ｒ２−（Ｒ−Ｌｉ）２｝（Ｒはラット角膜の半径である。Ｒ＝３．５ｍｍ、１５匹のラットの角膜の測定から算出）。
１５．３ 脈絡膜新生血管
レーザー誘発性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）は、脈絡膜新生血管の特徴が顕著な一般に認められたモデルである（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＥＬ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｇ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ １００：２１１−２８６）。また、血管形成及び線維症を標的とする潜在的治療の有効性を決定するには迅速な方法でもある。簡潔には、持続波の光凝固レーザー（５３２ｎＭダイオード）を使用して、後眼部の最大４箇所にレーザーを照射する。レーザーエネルギーは、ブルック膜の断裂を形成できる程度の強度にする。以降の７〜１４日間で、脈絡膜から網膜への血管の成長が発生する。それを免疫細胞化学的に定量化するか、または蛍光眼底血管造影法の使用により定量化する。
簡潔には、使用前に１０日間以上、周期照明環境（輝度３５０ルクス未満の閉鎖ケージで１２時間点灯、１２時間消灯）の動物実験施設に収容された合計２０匹のＤａｒｋ ａｇｏｕｔｉラットまたはＣ５７ＢＬ／６マウスに麻酔して、５３２ｎｍの持続波熱レーザーを視神経周囲の４箇所に照射して処置する。レーザー照射直後に、最大用量のｉ−ｂｏｄｙ（網膜での濃度が２０ｍｇ／ｍｌである）で動物を処理する。
全てのラットの網膜構造を、齧歯類専用の眼底カメラ／ＯＣＴ（Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｉｎｓｒｕｍｅｎｔｓ）で観察し、蛍光眼底血管造影法を使用して血管の完全性を定量化する。次に、全ての蛍光損傷のサイズ（直径及び面積）を定量化して血管形成の範囲の測定値を得る。
撮影後、動物を深麻酔で殺傷し、後部眼杯を４％のパラホルムアルデヒドで３０分間、固定する。次に網膜全載をＩＢ４標識で処理し、網膜下腔への脈絡膜血管の成長範囲を評価する。損傷の直径及び面積から、新生血管の範囲の評価を得る。
加えて、脈絡膜血管の浸潤の結果として発現する瘢痕のレベルを、神経膠症マーカーＧＦＡＰの免疫標識により定量化する。
網膜収縮に加えて、線維化を評価するため、損傷サイズ、小膠細胞及び神経膠細胞の応答変化、ならびにレーザー照射後の治療網膜の線維化促進遺伝子発現も検討する。
抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４−６Ｈ（更に対照ｉ−ｂｏｄｙ）は、脈絡膜新生血管のマウスモデルにおいて病理学的血管形成または損傷の特徴を低減する。レーザー照射後、眼におけるＣＸＣＲ４のレベルを調べたところ（線維化ＰＣＲアレイ；ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、調節不全であることがわかった。この状況でのＣＸＣＲ４の上方調節は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストｉ−ｂｏｄｙでの治療が有益な効果を有し得ることを示唆している。
マウスは以下のように処理した：
第１群（ｎ＝１０）：両眼にレーザー、片眼にビヒクル、対側眼にｉ−ｂｏｄｙ
第２群（ｎ＝１０）：片眼にレーザー（ｉ−ｂｏｄｙなし）、対側眼はレーザー非照射
容積１μｌ、最大濃度２０ｍｇ／ｍｌのｉ−ｂｏｄｙ薬を硝子体内注射した。
レーザー照射後の治療網膜の網膜収縮、損傷サイズ及び遺伝子発現に対するｉ−ｂｏｄｙの効果のデータを得た。同一の眼のレーザー非照射領域と比較して、レーザー照射後の網膜には、大幅な収縮があった。ＡＭ３−１１４及びＡＭ４−２７２いずれで処理した場合にも、レーザー照射領域の収縮に有意な低減が見られた。１つの交絡要因は、ビヒクル対照も極めて有意に収縮比を低減すると思われる点であった。ビヒクルはＴＢＳの単一注射のみで構成しているため、ビヒクルがこのような効果を有する可能性はない。蓋然性が高い説明は、処理した眼から実際にｉ−ｂｏｄｙが流出して血流に侵入しており、おそらくこれがビヒクル処理された眼への炎症性細胞の浸透を防止したことである。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４の投与時には、損傷サイズの減少も見られた。
血管形成及び線維化を伴う遺伝子の発現を検討した。市販のスピンカラム（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を使用して網膜及びＲＰＥ／脈絡膜サンプルから全ＲＮＡを単離した。ＰＣＲ遺伝子アレイを使用して、血管形成または線維化を伴う８４遺伝子の発現を評価した（Ｑｉａｇｅｎ）。簡潔には、未処理の、レーザー照射眼及び非照射の対側眼（各群ｎ＝９、各々２５ｎｇ）からの全ＲＮＡサンプルを、それぞれの対応する処置群にプールし（３つのプールされたサンプルで構成される３件の独立実験）、逆転写（ＲＴ２ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ、Ｑｉａｇｅｎ）した後、ｃＤＮＡ標的テンプレートの前増幅（ＲＴ２ ｐｒｅ−ＡＭＰ、Ｑｉａｇｅｎ）を実施した。サンプルを市販のマスターミックス（ＲＴ２ ＳＹＢＲ緑色マスターミックス、Ｑｉａｇｅｎ）に添加し、４０サイクル増幅した（ＡＢＩ ７９００ＨＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ）。処置群ごとに３つの独立したアレイを実施した。デルタデルタＣｔ（ΔΔＣｔ）を使用してデータを分析し、独立ｔ検定を使用して評価した倍率変化及び調節を表す。ＡＭ３−１１４及びＡＭ４−２７２で処理した眼の両方から得た、この遺伝子発現データは、Ｃｏｌ１Ａ２、ＴＧＦ−ｂ１、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、及びメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ３）組織阻害因子、トロンボスポンジン２（Ｔｈｂｓ２）、セリンペプチダーゼ阻害因子（ＳｅｒｐｉｎＨ１）、インテグリンβ８サブユニット（ＩＴＧＢ８）、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、β３インテグリン（ＩＴＧＢ３）、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ（Ａｋｔ１）、ＳＭＡＤファミリーメンバー６（ＳＭＡＤ６）、血小板由来成長因子アルファポリペプチド（ＰＤＦＧＡ）、トランスフォーミング増殖因子、ベータ受容体ＩＩ（Ｔｇｆｂｒ２）、骨形成タンパク質７（Ｂｍｐ７）などの、線維化促進遺伝子に広範な下方調節が見られることを示している（図２７）。
実施例１６−ｉ−ｂｏｄｙの線維芽細胞との結合
線維芽細胞に発現する可能性を有し、線維症の病因に重要な役割を果たし得る骨由来間葉系細胞の循環（Ｓｔｒｉｅｔｅｒ ＲＭ，Ｋｅｅｌｅｙ ＥＣ，Ｂｕｒｄｉｃｋ ＭＤ ａｎｄ Ｍｅｈｒａｄ Ｂ．Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ，Ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ，ｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｃｌｉｎ Ｃｌｉｍａｔｏｌ Ａｓｓｏｃ ２００９；１２０；４９−５９）と、ＣＤ４５及びＣＸＣＲ４を発現しているその細胞は、線維芽細胞を循環させ、ブレオマイシン誘発肺線維症マウスモデルにおいて、ＳＤＦ−１に応答した遊走及び肺への輸送を可能にする（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＲＪ，Ｂｕｒｄｉｃｋ ＭＤ，Ｈｏｎｇ Ｋ，Ｌｕｔｚ ＭＡ，Ｍｕｒｒａｙ ＬＡ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ ｔｒａｆｆｉｃ ｔｏ ｔｈｅ ｌｕｎｇｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＣＸＣＬ１２ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００４）１１４： ４３８−４４）。
ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４）及びＣＤ−４５の二重標識を以下の通りに行った。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４を、単離したヒトＰＢＭＣとともに室温で４時間インキュベートした。ＰＢＭＣを顕微鏡スライドに塗布し、４℃で１０分間、アセトンで固定した。３回洗浄してＰＢＳで再水和した後、スライドをマウス抗ＦＬＡＧの１：１００希釈液とともに４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ヤギ抗マウスＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ５６８（抗ＦＬＡＧとの結合によりｉ−ｂｏｄｙを検出する）とともにスライドを室温で１時間インキュベートした。次に、スライドを洗浄して、マウス抗ＣＤ−４５ ＦＩＴＣ標識抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。更に洗浄後、ＤＡＰＩを含有するＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｍｏｕｎｔａｎｔをスライドに載せた。Ｎｉｋｏｎ Ａ１共焦点顕微鏡を使用して画像を取得した。
ヒト線維芽細胞をＣＤ４５への抗体染色によって同定した。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４の結合を、Ｃ末端タグに対する抗ＦＬＡＧ抗体によって同定した。ＤＡＰＩは、細胞核を染色するために使用した。結果を図２８に示す。この結果は、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４がヒト線維芽細胞と結合できたことを示す。
実施例１７−ｉｎ ｖｉｖｏマウス空気嚢モデル
ｉ−ｂｏｄｙの炎症防御能力を、ｉｎ ｖｉｖｏマウス空気嚢モデルにおいて評価した。皮下（ｓ．ｃ．）空気嚢は、急性及び慢性炎症の研究に使用されるｉｎ ｖｉｖｏモデルである（Ｄｕｒａｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ Ａｉｒ Ｐｏｕｃｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５．６．１−５．６．８，Ｍａｒｃｈ ２０１２）。ラットまたはマウスの空気嚢への刺激源の注射により誘発される炎症反応を、生じる滲出液の量、細胞の浸潤及び炎症性メディエーターの放出により定量化することができる。空気嚢はマウスの背中の皮膚下に無菌空気を注入することにより生成する。マウスを、抗炎症化合物または試験物品（ｉ−ｂｏｄｙまたはＡＭＤ３１００）のいずれかで前処理し、炎症誘導物質であるＳＤＦ−１で二次処理する。次に、空気嚢洗浄流体を分析し、細胞輸送及びサイトカイン放出について調べる。
空気嚢アッセイは、７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスで行った。１日目及び３日目に、０．２ｍｌ／ｇ初期体重（ＩＢＷ）の無菌空気を背中の皮膚下に注入し、嚢を作成した。６日目に、マウスを群に分け、ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６もしくはＡＭ４−１１２１）もしくはＡＭＤ３１００（１０ｍｇ／ｋｇ）を含有するまたは含有しない０．５ｍｌのＰＢＳを腹腔内注射した。３０分後、ＳＤＦ−１（６μｇ）を嚢に注入した。４時間後に、マウスをＣＯ２チャンバ内で屠殺し、空気嚢を洗浄した。フローサイトメトリーによって、細胞を採取して計数し、特性決定した。
空気嚢中の全細胞は、試験物品が炎症の空気嚢／部位への細胞の遊走を阻害することを示している。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６及びＡＭ４−１１２１は（ＡＭＤ３１００と同様に）空気嚢への細胞遊走を阻害したが、陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）は細胞遊走を阻害しなかった。炎症性刺激源のないマウスに注入されたｉ−ｂｏｄｙは、空気嚢への細胞遊走に影響を及ぼさなかった（図２９）。
実施例１８−ブレオマイシンマウスモデルにおける特発性肺胞線維症（ＩＰＦ）の防止
肺線維症を阻害するＣＸＣＲ４結合分子（ｉ−ｂｏｄｙ）の能力を、疾患マウスモデルにおいて検討した。抗生物質及び抗腫瘍薬であるブレオマイシンは、ＩＰＦと似たヒト疾患の実験的モデルにおいて広く使用されている。ブレオマイシンは、脂質過酸化を誘導することによりＤＮＡに対する効果とは独立した細胞障害を引き起こすことが可能である。コラーゲン沈着をもたらすブレオマイシンと肺との相互作用の正確な特徴は確認されていない。しかしながら、サイトカイン及び成長因子、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦ及びＴＧＦ−βの過剰活性化は、疾患進行に一貫して関与している。最近の証拠は、ブレオマイシンマウスモデルにおいてＣＸＣＲ４拮抗作用が肺線維症の予防に有効であることを示唆している。
マウスＩＰＦモデルは炎症及び線維症の有効なモデルであり、これによると初期（４８時間以内）の肺損傷は組織学的に、肺胞内出血及び肺胞壁に加え肺腔内に炎症細胞浸潤を伴う血管周囲浮腫、毛管の鬱血及び肺胞壁肥厚を特徴としていた。このモデルにおいて、巣状気管支周囲及び胸膜下のコラーゲン沈着は通常、ブレオマイシンの投与後１週以内に起こる。
ブレオマイシンの至適用量は２Ｕ／マウスであり、線維芽細胞の動員を評価する際の最適な時期は４日目であることが確認された。ＳＤＦ−１濃度を分析するため、４日目に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液体を採取した。肺組織の片半分を使用して、肺の単細胞懸濁液を作成し、この細胞をフローサイトメトリーに使用して、ＣＤ４５＋、ＣＸＣＲ４＋及びコラーゲン１＋（線維芽細胞）を分析した。肺組織のもう片半分をコラーゲン１の存在を検出するＳｉｒｃｏｌで染色し、ＲＮＡのＣｏｌ−１、Ｃｏｌ−３及びＳＤＦ−１を調べる。
２Ｕのブレオマイシン／マウス（群当たり１０）を使用して、ｉ−ｂｏｄｙとともにマウスに投薬した。ｉ−ｂｏｄｙは、３０ｍｇ／ｋｇの陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５１）、１、１０及び３０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２、ＡＭ３−５２３であった。ＳＤＦ−１、線維芽細胞及びコラーゲン沈着を４日目にモニターした。ブレオマイシンの投与直前に、ｉ−ｂｏｄｙを群に投薬した。肺組織の片半分を細かく切り刻み、ＰＢＳで洗浄して、コラゲナーゼＡ及びディスパーゼ処理した肺の単細胞懸濁液を作成した。次に、この細胞をフローサイトメトリーに使用して、ＣＤ４５＋、ＣＸＣＲ４＋及びコラーゲン１＋線維芽細胞を分析した。
３０ｍｇ／ｋｇのｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４の投与は、ブレオマイシン誘発線維症を有するマウスの肺への線維芽細胞の動員を大幅的に減衰させることができた。また、ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２及びＡＭ３−５２３が、これらのマウスの肺への線維芽細胞の動員を有意に減衰できたことも明らかであった。ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２及びＡＭ３−５２３は、１ｍｇ／Ｋｇでも線維芽細胞の動員を妨げることが可能であった。予想されるように、ＡＭＤ３１００及びピルフェニドン（Ｐｅｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）もまた、線維芽細胞の動員を妨げることが可能であった。ビヒクル単独と、陰性対照ｉ−ｂｏｄｙはいずれも、ブレオマイシン誘導性線維症を有するマウスの肺への線維芽細胞の動員に影響を及ぼさなかった（図３０）。
製造業者のプロトコルに従ってＳｉｒｃｏｌ染色アッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｕｒ Ｌｔｄ．Ｃａｒｒｉｃｋｆｅｒｇｕｓ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して肺組織を調べ、細胞外マトリックスタンパク質コラーゲンの存在を判定した。３０ｍｇ／ｋｇのｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ３−１１４、１０ｍｇ／ｋｇのｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ４−２７２及び３０ｍｇ／ｋｇのｉ−ｂｏｄｙ ＡＭ−３５２３は全て、ビヒクル単独または陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）と比較して、肺のコラーゲン量を減少させた。コラーゲンの減少は、ＡＭＤ３１００及びピルフェニドンにも見られた。
ＰＥＧ化ｉ−ｂｏｄｙの効果を評価するため、マウスでのブレオマイシン肺線維症実験を２１日間にわたり実施した。１０ｍｇ／ＫｇのＰＥＧ化ｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ４−２７２の投与は、７日目で、ブレオマイシン誘発線維症を有するマウスの肺への線維芽細胞の動員を減衰させることが可能であった。ＡＭ４−２７２−ＰＥＧは７日目で、ＡＭＤ３１００及びピルフェニドンとほぼ同程度に線維芽細胞を減少させた。
その後、残存する肺組織を使用して、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１４，４３８に従い、ＣＸＣＬ１２、Ｃｏｌ１ａ１及びＣｏｌ３ａ１の遺伝子発現について、各サンプルからのＲＮＡを分析した。
実施例１９：エピトープマッピング
ショットガン突然変異誘発（Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を使用して、野生型及び突然変異型ヒトＣＸＣＲ４と結合する抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２及びＡＭ３−５２３を評価した。ＣＸＣＲ４を発現するＨＥＫ−２９３ Ｔ細胞に対して、ｉ−ｂｏｄｙを試験した。高い値のシグナル対バックグラウンド比を得たｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ３−１１４（１μｇ／ｍｌ）、ＡＭ４−２７２（２μｇ／ｍｌ）及びＡＭ３−５２３（１μｇ／ｍｌ）の免疫検出及びエピトープマッピングに最適なスクリーニング条件を決定した。スクリーニングで同定された全ての重要残基に対するｉ−ｂｏｄｙの平均反応率（及び範囲）を表１３に示す。対照抗体は、市販の抗ｆｌａｇ及び１２Ｇ５であった。
Figure 0006863897
ｉ−ｂｏｄｙの結合にとって重要なＣＸＣＲ４タンパク質の残基（灰色）は、ｉ−ｂｏｄｙの結合に対して陰性（ＡＭ３−１１４及びＡＭ４−２７２では３０％ＷＴ未満；ＡＭ３−５２３では１５％未満）であるが、抗Ｆｌａｇ ｍＡｂに対しては陽性（７０％ＷＴ超）であり、また追加の対照ｍＡｂ １２Ｇ５に対しても陽性（５０％ＷＴ超）である残基と同定された。
３つ全てのｉ−ｂｏｄｙは、ＡＭＤ３１００にも共通して結合する残基Ｄ２６２を有した（Ｈａｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６０：１６４−１７３）。エピトープマッピングによって同定された全ての重要なアミノ酸は、Ｆ１８９を除いてヒトとマウスのＣＸＣＲ４間で保存的である。ＣＸＣＲ４の残基Ｅ３２またはＬ２６６と結合する結合薬は、まだ確認されていない。
それ以外の一連の残基も、一部のｉ−ｂｏｄｙの結合に影響を及ぼした。そのような残基はＣ２８、Ｖ１１２、Ｄ１９３、Ｐ１９１、Ｅ２６８及びＥ２８８である。
実施例２０−特発性肺胞線維症（ＩＰＦ）を有するヒト患者組織におけるｉ−ｂｏｄｙのＣＸＣＲ４への結合
正常肺及びＩＰＦ肺でのＣＸＣＲ４の発現を更に確認するため、陰性対照ｉ−ｂｏｄｙの２１Ｈ５、ＣＸＣＲ４特異的ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２及びＡＭ３−５２３）を免疫組織化学分析（ＩＨＣ）に利用した（図示せず）。正常肺及び遅発性ＩＰＦ肺の生検材料には、ＣＸＣＲ４発現細胞がほとんど検出されなかった。急性ＩＰＦ肺の生検材料には、ＣＸＣＲ４発現細胞が容易に検出された。最後に、ＣＸＣＲ４はｉ−ｂｏｄｙによって、急性ＩＰＦ肺の生検材料の線維性領域に存在する間質細胞内に検出された。本開示のｉ−ｂｏｄｙは、ＩＰＦ患者肺生検材料（急性及び遅発性進行患者の両方）からの線維芽細胞とは結合できたが、正常肺組織からの肺生検材料とは結合しなかった。
実施例２１−特発性肺患者組織からのヒト肺線維芽細胞浸潤の減少
複数のレポートで、ＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＲ４が肺浸潤に果たす役割を示す証拠が明らかにされている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２０１２ ３２２；１６９−１７６ ＆ Ｋｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１４ １２；９５３−９６４）。Ｌｏｖｇｒｅｎ，Ａらは、β−アレスチンが肺線維芽細胞浸潤に重要な役割を果たすことを示している（Ｌｏｖｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１１ ３；７４ｒａ２３）。更に、ＣＸＣＲ４が、ＣＸＣＬ１２をＣＸＣＲ７に分配し、β−アレスチン経路の活性化をもたらすことが複数のレポートで示されている。このことは、ＣＸＣＲ４が肺線維芽細胞の浸潤を促進し得ることを示唆している（Ｃｏｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１４ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９， ｅ９８３２８、Ｄｅｃａｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１１ ２８６；３２１８８ ３２１９７、及びＲａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ２０１０ １０７；６２８−６３２）。
線維芽細胞浸潤におけるＣＸＣＲ４及びＣＸＣＬ１２の役割を決定するために、正常肺及びＩＰＦ肺の線維芽細胞を創傷治癒浸潤アッセイに利用した。ＩｍａｇｅＬｏｃｋ ９６ウェルプレート（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を５０μｇ／ｍｌの基底膜抽出物（ＢＭＥ；Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）で、室温で１時間コーティングした。正常細胞、及び疾患の遅発進行または急性進行を示す特発性肺胞線維症（ＩＰＦ）患者の肺生検試料から生成した線維芽細胞を、ＢＭＥコーティングされたプレートに播種して（ウェル当たり３６，０００細胞）、一晩インキュベートした。翌日、細胞をＷｏｕｎｄｍａｋｅｒ（商標）（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してスクラッチし、ＤＰＢＳで洗浄して、２ｍｇ／ｍｌのＢＭＥ溶液中の、陰性対照ｉ−ｂｏｄｙの２１ｈ５、ＣＸＣＲ４特異的ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４、ＡＭ４−２７２；１３０μｇ／ｍｌ）またはＡＭＤ３１００（１２μＭ）で処理した。３７℃で１５分間、プレートをインキュベートすることによりＢＭＥを重合化させた。次に、プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍイメージングシステムに挿入し、約５０時間、２時間ごとに画像を取得した。ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェア（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して浸潤を定量化した。
ＩＰＦの治療用として現在承認済みの多重受容体チロシンキナーゼ阻害剤である、ＢＩＢＦ−１１２０は、正常線維芽細胞及びＩＰＦ線維芽細胞両方の運動性を効果的に阻害した。ＣＸＣＲ４特異的ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４−６Ｈ及びＡＭ４−２７２−６Ｈは、遅発性ＩＰＦ及び３つのうち２つの急性ＩＰＦの浸潤を阻害したが、正常肺の線維芽細胞は阻害しなかった（図３１−１〜３１−３は、正常、遅発性及び急性ＩＰＦ患者からの線維芽細胞の代表例を示す）。
実施例２２−ｉ−ｂｏｄｙはｉｎ ｖｉｔｒｏで抗線維性特性を示す
肺線維芽細胞の活性化及び細胞外マトリックス生成にＣＸＣＲ４が果たす潜在的役割を特定するため、線維芽細胞を、ＣＸＣＲ４特異的ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４−６Ｈ、ＡＭ４−２７２−６Ｈ、ＡＭ３−５２３−６Ｈ）、陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ（２１Ｈ５）またはＡＭＤ３１００で４８時間処理し、その後ＲＮＡを抽出し、ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１及びＦＮ１転写物に対してｑＰＣＲ解析を実施した。ｑＰＣＲ方法は以下の通りであった。５０μｇ／ｍｌのＢＭＥに線維芽細胞を播種し、１３０μｇ／ｍｌのｉ−ｂｏｄｙまたは１２μＭのＡＭＤ３１００で処理した。４８時間後に、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用してＲＮＡを抽出し、既述のように（Ｔｒｕｊｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０ ２；５７ｒａ８２）Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。続いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をＴａｑｍａｎプレートにロードし、事前設計されたプライマーを使用して、遺伝子発現解析をＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＦＮ１及びαＳＭＡに対して実施した。Ｔａｑｍａｎ解析は全て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓのＶｉｉａ ７装置（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して実施した。その後、結果をエクスポートし、１８ｓのＲＮＡ発現により正規化し、Ｄａｔａ Ａｓｓｉｓｔソフトウェア（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して倍率変化解析を算出した。ＣＸＣＲ４特異的ＡＭ３−１１４−６Ｈは、遅発性ＩＰＦにおいてＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１及びＦＮ１の線維化促進遺伝子転写物の発現を著しく減少させたが、正常肺線維芽細胞では減少させなかった（図３２）。
ｉ−ｂｏｄｙがＩＰＦ肺線維芽細胞の可溶性コラーゲンを調節できるかどうかを検討するために、ＥＬＩＳＡを使用した。コラーゲン１は、直接ＥＬＩＳＡを使用して検出した。簡潔には、精製したコラーゲン１タンパク質及びコンディショニングした上清を、ｍａｘｉ−ｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。翌朝、プレートを洗浄して、１％のＢＳＡで１時間ブロッキングした後、回転シェーカー上でビオチン化抗コラーゲン１抗体（Ａｂｃａｍ）とともに室温で２時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、ＨＲＰをコンジュゲートしたストレプトアビジンを２０分かけてウェルに添加した。２０分後、プレートを洗浄し、２０分かけてＴＭＢ基質で発色させ、その後、停止液を添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して４５０ｎｍの吸光度を取得した。
ＣＸＣＲ４特異的ｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２−６Ｈは、ｉ−ｂｏｄｙによる処理後４８時間の線維芽細胞の、コンディショニングした上清において、可溶性コラーゲンタンパク質を著しく減少させた。
実施例２３−ｉ−ｂｏｄｙは種々のシグナル伝達パートナーを調節する
ＣＸＣＲ４は、ＣＣＲ２を含む他のケモカイン受容体と連係してシグナル伝達することが、様々なレポートで示されている。ＣＸＣＲ４特異的ｉ−ｂｏｄｙが、潜在的ＣＸＣＲ４シグナル伝達パートナーを調節できるかどうかを判定するために、ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ３−１１４−６ＨまたはＡＭ４−２７２−６Ｈ）、ＡＭＤ３１００またはＢＩＢＦ−１１２０による処理後４８時間の正常、遅発性、及び急性ＩＰＦ肺線維芽細胞培養液から、コンディショニングした上清を回収し、製造業者（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が推奨しているように、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して線維芽細胞のコンディショニングした上清中のＣＣＬ２、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１２を検出した。ＣＸＣＲ４を標的とするｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４−６Ｈ及びＡＭ４−２７２−６Ｈ、ＡＭＤ３１００ならびにＢＩＢＦ−１１２０は、ＩＰＦ線維芽細胞のコンディショニングした上清においてＣＣＬ２タンパク質を著しく増加させたが、正常な上清では増加させなかった。この増加は、急性ＩＰＦ肺線維芽細胞のコンディショニングした上清において顕著であった。ＣＸＣＲ４を標的とするｉ−ｂｏｄｙのＡＭ４−２７２−６Ｈは、一部のＩＰＦ肺線維芽細胞のＣＣＬ５レベルを上昇させたが、この効果には一貫性がなく、対照ｉ−ｂｏｄｙの２１Ｈ５−６Ｈで処理した、１つの遅発性ＩＰＦ肺線維芽細胞株において効果が観察された。
実施例２４−ｉ−ｂｏｄｙは血小板凝集を防止する
ｉ−ｂｏｄｙがＳＤＦ−１αによって誘導される血小板凝集を防止できるかどうかを検討するため、実験を実施した。ヒト多血小板血漿懸濁液を、１０または２０ｕｇ／ｍＬのｉ−ｂｏｄｙのＡＭ３−１１４、ＡＭ３−５２３、ＡＭ４−７４６またはＡＭ４−１１２１（または１２Ｇ５の陽性対照抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ）とともに１０分間プレインキュベートし、続いて１００ｎＭのＳＤＦ−１アルファで刺激した。陰性対照ｉ−ｂｏｄｙの２１Ｈ５（または１２Ｇ５のアイソタイプ対照：マウスＩｇＧ２ａ）の存在下で、ＳＤＦ−１は堅調かつ再現可能な凝集（光透過の増加を示す、下降する黒色曲線）を誘発した。これは以前に発表されたことと一致している。全てのｉ−ｂｏｄｙならびに１２Ｇ５は阻害効果を有し、これはＡＭ３−１１４及びＡＭ４−１１２１で最も効果的であった（図３３）。これらのｉ−ｂｏｄｙは、強度の持続した凝集阻害を示した。ＡＭ３−５２３及びＡＭ４−７４６はＭＡｂ１２Ｇ５と同程度に凝集を防げ、ＡＭ４−２７２はごく弱く凝集を防げただけであった。陰性対照ｉ−ｂｏｄｙまたは対照ＭＡｂのいずれも、血小板凝集にいかなる影響も及ぼさなかった。
実施例２５−抗ＣＸＣＲ４ ｉ−ｂｏｄｙは多発性硬化症マウスモデル（実験的な自己免疫脳脊髄炎）において有効である。
Ｈｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ２０１１）が発表した定評ある論文によると、ＣＸＣＬ１２が実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、すなわち多発性硬化症マウスモデルにおいて約８〜１２日の時点で血液脳関門を越えるＣＸＣＲ４陽性細胞の動員を担っていることを実証したことが示唆されている。加えて、最近の研究で、ＣＸＣＲ４アンタゴニストがＥＡＥにおいて有効性を示すことが実証された（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ ＪＢＣ Ｖｏｌ ２９０（３７）：２２３８５−２２３９７（２０１５）、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２００８，１８；５０４−５１６）。発明者らは、０日目にミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）の注射によって少数の動物（群当たりｎ＝３）にＥＡＥを誘導し、この動物に７〜１０日目（４日間、１日１回注射）まで４ｍｇ／Ｋｇのｉ−ｂｏｄｙ、ＡＭ４−２７２を静脈内投与した。このときに血液脳関門を越える炎症細胞の浸潤に重要であることが報告された。ＡＭ４−２７２ ｉ−ｂｏｄｙを注射した３匹のマウスのうち、１匹は疾患が進行したが、もう２匹はほぼ無疾患であった。ｉ−ｂｏｄｙで処理した動物の１５日目の体重は、疾患動物、または陰性対照ｉ−ｂｏｄｙ、２１Ｈ５を注射した動物と有意差がある。加えて臨床スコアは、１４日目及び１５日目の両方で、疾患動物または対照ｉ−ｂｏｄｙを注射した動物と比較してｉ−ｂｏｄｙの注射によって大幅に改善された（図３４）。これらのデータは、本発明のｉ−ｂｏｄｙが炎症細胞のＣＸＣＲ４と結合し、末梢血管系から脳への細胞の遊走を阻害できることを示唆している。この遊走の阻害がＥＡＥの症状を軽減できることは明らかである。
実験的なマウスの脳の免疫組織化学染色を実施した。疾患動物（ＭＯＧのみ）の脳の白質において、及びＡＭ４−２７２ ｉ−ｂｏｄｙを与えた症状のあるマウスにおいて、炎症細胞の染色が多数見られた。その一方で、ビヒクル対照において、またはＡＭ４−２７２ ｉ−ｂｏｄｙを与えた症状のないマウスにおいて、炎症性Ｔ細胞の染色はほとんど存在しなかった。
最初にヘマトキシリン・エオジン染色を、ｉ−ｂｏｄｙ（ＡＭ４−２７２）処理をしたＥＡＥマウス、またはしていないＥＡＥマウスの脳組織に実施し、Ｔ細胞の白質への浸潤をハイライトした。対照ｉ−ｂｏｄｙ、２１Ｈ５で処理したＭＯＧマウスには、Ｔ細胞の大幅な浸潤が観察されたが、ＡＭ４−２７２ ｉ−ｂｏｄｙで処理したマウスには観察されなかった。

Claims (9)

  1. ヒトＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）と結合するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列で表されるヒトＮＣＡＭドメインの修飾体であり、足場領域と結合ループ領域（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３）とを含み、該足場領域が、配列番号１のアミノ酸１〜２６、３３〜７９及び８８〜９７によって定義される足場領域に、これらの足場領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、ならびに、
    配列番号１のアミノ酸２７〜３２及び８０〜８７によってそれぞれ定義されるＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域は、その領域へのアミノ酸の付加または置換により改変されており、ならびに、
    （ｉ）ＣＤＲ１領域配列が、配列番号４１のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号４２のアミノ酸配列からなる、
    （ｉｉ）ＣＤＲ１領域配列が、配列場番号４５のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号４６のアミノ酸配列からなる、
    （ｉｉｉ）ＣＤＲ１領域配列が、配列番号４９のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号５０のアミノ酸配列からなる、
    （ｉｖ）ＣＤＲ１領域配列が、配列番号５３のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号５４のアミノ酸配列からなる、
    （ｖ）ＣＤＲ１領域配列が、配列番号５７のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号５８のアミノ酸配列からなる、
    （ｖｉ）ＣＤＲ１領域配列が、配列番号６１のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号６２のアミノ酸配列からなる、
    （ｖｉｉ）ＣＤＲ１領域配列が、配列番号６５のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号６６のアミノ酸配列からなる、
    （ｖｉｉｉ）ＣＤＲ１領域配列が、配列番号６９のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号７０のアミノ酸配列からなる、
    （ｉｘ）ＣＤＲ１領域配列が、配列番号７３のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号７４のアミノ酸配列からなる、または、
    （ｘ）ＣＤＲ１領域配列が、配列番号７７のアミノ酸配列からなる、及び、ＣＤＲ３領域配列が、配列番号７８のアミノ酸配列からなる、
    ポリペプチド。
  2. 配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、もしくは、配列番号７６のいずれか１つに記載された配列を含むか、もしくは、それからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ヒトＣＸＣＲ４（配列番号１０５）のＣ２８、Ｅ３２、Ｖ１１２、Ｙ１８４、Ｆ１８９、Ｐ１９１、Ｄ１９３、Ｗ１９５、Ｄ２６２、Ｌ２６６、Ｅ２６８及びＥ２８８からなる群から選択されるＣＸＣＲ４の１つ以上の残基と結合する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現構築物。
  5. 請求項１または２に記載のポリペプチドと、治療薬、毒素、検出可能標識、またはポリペプチドの半減期を延長する剤から選択される薬剤とを含むコンジュゲート。
  6. 請求項１または２に記載のポリペプチドと、許容される担体とを含む、医薬組成物。
  7. ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の治療においてまたはその発現の可能性を減少させるために使用される、請求項１または２に記載のポリペプチドであって、前記疾患または障害が、癌、炎症性疾患、及び線維症からなる群から選択される、ポリペプチド。
  8. ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の発現の可能性を減少させるまたは治療するための、請求項６に記載の医薬組成物であって、前記疾患または障害が、癌、炎症性疾患、及び線維症からなる群から選択される、医薬組成物。
  9. ＣＸＣＲ４関連の疾患または障害の場所を特定する、及び／または検出する、及び／または診断するための方法において使用するための、請求項６に記載の医薬組成物であって、前記方法が、ＣＸＣＲ４が存在する場合に該ＣＸＣＲ４に結合した請求項１に記載のポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで検出する工程を含み、前記ポリペプチドが検出可能なタグにコンジュゲートされている、医薬組成物。
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