BR112020012075A2 - inibidores de heterômero gpcr e usos dos mesmos - Google Patents

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BR112020012075A2
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BR
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gpcrx
cxcr4
inhibitor
heteromer
fact
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BR112020012075-8A
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Dong Seung Seen
Hye Ryung Park
Ji Yeong LEE
Eun Hee Kim
Jae Yeon Jeong
Chang Soo Yang
Mi Lim LEE
So Hui Kim
Won Ki Huh
Yong Bhum SONG
Chul O. Park
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Gpcr Therapeutics, Inc.
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Abstract

A invenção refere-se a inibidores de heterômeros de receptor CXC 4 (CXCR4) e receptor de proteína acoplada G (GPCR) (heterômeros CXCR4-GPCR) associados aos cânceres, em que CXCR4 forma um heterômero funcional com outros receptores de proteína acoplada G (GPCRx). Mais especificamente, esta invenção se refere ao GPCRx que forma heterômeros com CXCR4, que, mediante coestimulação com agonistas de CXCR4 e agonistas de GPCRx, resulta na sinalização a jusante aprimorada de CXCR4. Esta invenção também refere-se ao uso de inibidores do parceiro de GPCR de interação do heterômero CXCR4-GPCRx ou inibidores específicos de heterômero CXCR4-GPCRx que incluem inibidores da formação do heterômero CXCR4-GPCRx e anticorpos específicos de heterômero CXCR4-GPCRx, e no diagnóstico e/ou terapia contra câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “INIBIDO- RES DE HETERÔMERO GPCR E USOS DOS MESMOS”.
CAMPO DA TÉCNICA
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório nº U.S. 62/607876, depositado em 19 de dezembro de 2017, e reivindica adicionalmente o benefício de prioridade do Pedido Provi- sório nº U.S. 62/679598, depositado em 1 de junho de 2018 e reivindica adicionalmente o benefício de prioridade do Pedido Provisório nº U.S. 62/732946, depositado em 18 de setembro de 2018. Cada um dos pe- didos relacionados supracitados, em sua totalidade, está incorporado no presente documento a título de referência.
[002] Adicionalmente, cada uma das referências identificadas no presente documento, em sua totalidade, está incorporada no presente documento a título de referência.
TÉCNICA ANTECEDENTE
[003] A invenção divulgada no presente documento se refere, de modo geral, a inibidores de heterômeros de GPCR funcional inovadores e, mais especificamente, a inibidores de heterômeros de receptor CXC 4 (CXCR4) e receptor acoplado à proteína G (GPCR) que exibem sina- lização aprimorada a jusante de CXCR4 como resultado de formação de heterômero funcional e que estão associados a cânceres e outras doenças.
[004] Receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são sete re- ceptores de superfície celular de domínio transmembranar que são aco- plados às proteínas G. GPCRs mediam diversas respostas sensoriais e fisiológicas percebendo-se estímulos que incluem luz, odorantes, hor- mônios, neurotransmissores, quimiocinas, pequenas moléculas de lipí- deo e nucleotídeos. Existem aproximadamente 800 genes de GPCR no genoma humano, e é previsto que mais da metade deles codifiquem receptores sensoriais, tais como receptores olfativos, visuais e gustati- vos (Bjarnadottir, et al., 2006). Os 350 GPCRs restantes têm papeis fi- siologicamente importantes em desenvolvimento embrionário, compor- tamento, humor, cognição, regulação de pressão sanguínea, frequência cardíaca e processos digestivos, regulação de sistema imunológico e inflamação, manutenção de homeostase, e crescimento e metástase de cânceres (Filmore 2004, Overington, et al., 2006). GPCRs estão asso- ciados a diversas doenças e são os alvos de aproximadamente 40% de todos os fármacos de prescrição (Filmore 2004).
[005] Receptor CXC 4 (CXCR4) é um membro da família de re- ceptor de quimiocina GPCR. CXCRA4 é expresso na maioria dos tipos de célula hematopoiética, células-tronco de medula óssea, células pro- genitoras endoteliais, células endoteliais vasculares, neurônios e célu- las-tronco neuronais, micróglia e astrócitos (Klein e Rubin 2004, Griffith, et al., 2014). CXCR4 responde a seu ligante de quimiocina de motivo C- X-C 12 (CXCL12), também conhecido como fator 1 derivado de célula estromal (SDF-1), e tem papeis essenciais no desenvolvimento embrio- nário dos sistemas hematopoiético, cardiovascular e nervoso (Griffith, et al., 2014). CXCRA4 foi constatado como um correceptor para vírus da imunodeficiência humana (HIV), e tem papeis importantes no aloja- mento de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) para a medula óssea, inflamação, vigilância imunológica de tecidos e regeneração de tecido em adultos (Chatterjee, et al. 2014). Mutações na terminação C de CXCRA4 provocam ativação de CXCRA4 persistente, que resulta em uma deficiência imunológica congênita chamada de síndrome de WHIM (Ver- rugas, Hipogamaglobulinemia, Infecções e Mielocatexe) caracterizada pela neutropenia e linfopenia de célula B (Hernandez, et al., 2003; Ka- wai, 2009). CXCR4 também tem papeis essenciais no desenvolvimento de linfócito T e B dentro de órgãos linfoides e o timo durante desenvol- vimento e em adultos (Allen, et al., 2004; Ara, et al., 2003).
[006] CXCRA4 é implicado em várias doenças imunes e autoimu- nes, tais como infecção por HIV, isquemia, cicatrização de ferida, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistemático (SLE), pneumonias interstici- ais, doença vascular, esclerose múltipla, fibrose pulmonar, e doença de via respiratória alérgica (Chu et al., 2017; Debnath, et al., 2013; Do- manska, et al., 2013). O envolvimento de CXCR4 em artrite reumatoide foi demonstrado pelo acúmulo aumentado de células T positivas para CXCR4 em articulações artríticas e uma redução em artrite induzida por colágeno em camundongos deficientes de CXCRA4 (Buckley et al., 2000; Chung et al., 2010). Além disso, antagonista de CXCR4, AMD3100, ali- viou artrite induzida por colágeno significativamente em um modelo de camundongo (De Klerck et al., 2005). CXCR4 também regula fibrose pulmonar recrutando-se fibroblastos circulatórios e células progenitoras derivadas de medula óssea durante lesão pulmonar, e AMD3100 de- monstrou um efeito preventivo em fibrose pulmonar em camundongo induzida por bleomicina (Song et al, 2010). O eixo geométrico CXCR4/CXCL12 também está implicado na patogênese de SLE. Em modelos de camundongo de lúpus e pacientes com SLE, células infla- matórias, tais como monócitos, neutrófilos e células B demonstraram expressão aumentada de CXCRA4 e migraram para a pele e o pulmão que superexpressa CXCL12 predominantemente (Chong e Mohan, 2009; Wang et al., 2009; Wang et al., 2010). Antagonista de CXCRA, CTCE-9908, prolongou a sobrevivência e melhorou muito as condições de doença e nefrite em um modelo de camundongo com lúpus (Wang et al., 2009). Ademais, CXCR4 também está envolvido em doenças ce- rebrais e cardíacas que incluem lesão cerebral, derrame, infarto do mi- ocárdio, aterosclerose e restenose vascular induzida por lesão (Cheng et al., 2017; Domanska, et al., 2013; Doring, et al., 2014).
[007] O envolvimento de CXCR4 em câncer foi noticiado primeiro quando células B de pacientes com leucemia linfocítica crônica (B-CCL)
expressam altos níveis de CXCRA4 funcional na superfície, mostrando mobilização de cálcio aprimorada e polimerização de actina mediante exposição de CXCL12, e migração em direção às células estromais de medula óssea que secretam CXCL12 (Burger, et al., 1999).
[008] CXCRA4 é subsequentemente caracterizado por ser respon- sável pela metástase de câncer de mama em órgãos que expressam níveis superiores de CXCL12, tais como gânglios linfáticos, medula ós- sea, pulmão e fígado (Muller, et al., 2001). Após a constatação inicial, a evidência crescente indica que CXCRA4 está associado a uma variedade de diferentes cânceres e tem múltiplos potenciais papeis em maligni- dade. CXCRA4 é superexpresso em mais de 23 cânceres humanos, in- cluindo câncer de mama, câncer pulmonar, câncer cerebral, câncer de rim (ou carcinoma de célula renal), câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de próstata, melanoma, leucemia, mieloma múltiplo, cânceres gastrointestinais e sarcomas de tecido mole, e considerado um marca- dor de prognóstico fraco (Domanska, et al., 2013; Chatterjee, et al. 2014; Furusato et al., 2010). CXCR4 é o único receptor de quimiocina que é expresso pela maior parte de tipos de câncer (Liang et al., 2015), e estimula o crescimento de célula tumoral, sobrevivência e invasividade em resposta ao CXCL12 secretado pelas células cancerígenas e pelas células associadas a câncer adjacentes (Burger e Kipps, 2006; Chatter- jee et al., 2014; Domanska et al., 2013).
[009] Meta-análises sistemáticas que usam bancos de dados que incluem PubMed, EMBASE e a biblioteca Cochrane indicam associação significativa entre superexpressão de CXCRA4 e sobrevivência isenta de progressão e sobrevivência geral fracas em vários cânceres que in- cluem malignidade hematológica, câncer de mama, câncer colorretal, câncer esofágico, câncer de cabeça e pescoço, câncer renal, câncer pulmonar, câncer ginecológico, câncer de fígado, câncer de próstata e câncer de vesícula biliar (Du et al., 2015; Hu et al., 2015; Li et al., 2017;
Wang et al., 2016; Zhao et al., 2015).
[010] O eixo geométrico CXCR4/CXCL12 tem um papel central em crescimento tumoral, invasão, angiogênese, vasculogênese, metástase, resistência ao fármaco e interação de microambiente de tumor de célula cancerígena (D'Alterio et al., 2012; Domanska et al., 2013; Guo et al., 2016)
[011] O papel fundamental de CXCRA4 em proliferação de célula cancerígena e crescimento tumoral foi demonstrado em vários modelos experimentais in vitro e in vivo, tal como modelos de camundongo orto- tópicos, de xenoenxerto humano subcutâneo e transgênicos que usam antagonistas de CXCR4 (Domanska et al., 2013). As células de medu- loblastoma Daoy e células de glioblastoma U87 mostraram expressão de CXCRA4 e exibiram aumento dependente de dose em proliferação para um gradiente de CXCL12 in vitro, e a administração sistemática de AMD3100 inibiu o crescimento de U87 intracraniana e xenoenxertos de célula Daoy (Rubin et al., 2003).
[012] O envolvimento de CXCR4 na metástase de células cance- rígenas em direção aos órgãos que expressam CXCL12 também foi de- monstrado em modelos de xenoenxerto de câncer pancreático, de tire- oide, melanoma, de próstata e do cólon (Bartolome et al., 2009; De Falco et al., 2007; Taichman et al., 2002; Wang et al., 2008; Zeelenberg et al., 2003).
[013] O principal mecanismo de ação descrito para as pequenas moléculas ou antagonistas de peptídeos de CXCRA4 é centrado em sua habilidade para mobilizar células malignas do BM, desse modo, sensi- bilizando-as em quimioterapia. Estes agentes demonstraram limitações com relação a meias-vidas curtas, o que torna difícil seu controle ade- quado durante períodos de tempo longos (Hendrix et al., 2000). Por ou- tro lado, anticorpos monocilonais terapêuticos têm a vantagem de ter meias-vidas mais prolongadas e são adequados para dosagem menos frequente. Adicionalmente, anticorpos de IgG humana têm a habilidade de induzir a morte celular mediante ligação à sua proteína-alvo em cé- lulas cancerígenas, por meio da interação com receptor de Fc em célu- las efetoras que incluem citotoxicidade/fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC/ADCP) (Jiang et al., 2011). Tal meca- nismo de ação citotóxico não é inerente a pequenas moléculas ou pep- tídeos e demonstra ter um papel principal na atividade clínica de diver- sos anticorpos terapêuticos (Wang et al., 2015).
[014] O alvejamento de CXCR4 com o uso de um anticorpo anti- CXCRA4 de neutralização ou antagonistas específicos de CXCRA4 inibiu crescimento tumoral primário, assim como metástase em órgãos secun- dários em câncer de mama, câncer do cólon, carcinoma hepatocelular, osteossarcoma e melanoma (De Falco et al., 2007; Hassan et al., 2011; Huang et al., 2009; Kim et al., 2008; Muller et al., 2001; Schimanski et al., 2006; Smith et al., 2004; Zeelenberg et al., 2003). Em um modelo de camundongo com câncer de mama transgênico, a inibição de CXCR4 com CTCE-9908 reduziu não só o crescimento de tumor primário, mas também a expressão de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fosforilação de AKT (Hassan et al., 2011).
[015] Células-tronco de câncer (CSCs) são uma população de cé- lulas cancerígenas com propriedades, tais como auto renovação infinita, potencial para se diferenciar em múltiplas linhagens de câncer, habili- dade para adotar um estado quiescente e alta resistência intrínseca à quimioterapia e radioterapia. CSCs são consideradas a principal causa de recaída e recorrência de câncer após terapia antiproliferativa padrão. Portanto, espera-se que o alvejamento de células-tronco cancerígenas forneça intervenções terapêuticas mais eficazes para erradicar o câncer e evitar recaída (Batlle e Clevers, 2017; Reya et al., 2001; Wurth, 2016). De maneira interessante, CSCs também expressam CXCRA4, e CXCR4 direciona o tráfego e a metástase destas células para os microambien- tes ricos em CXCL12, tais como medula óssea e zona subventricular no cérebro que favorecem manutenção, sobrevivência e crescimento de célula tronco cancerígena. Antagonistas de CXCR4 demonstraram mo- bilizar CSCs a partir destes microambientes protetores, e sensibilizam as mesmas para quimioterapia e radioterapia convencionais, e terapia antiangiogênica (Burger e Kipps, 2006; Burger e Peled, 2009; Furusato et al., 2010; Redondo-Munoz et al., 2006; Walenkamp et al., 2017; Wurth, 2016).
[016] Evidências crescentes mostraram que a massa tumoral con- tém vários tipos de célula, tais como fibroblastos estromais, células imu- nológicas, células endoteliais, tecido conjuntivo e matriz extracelular adicionalmente às células cancerígenas que constituem microambiente tumoral (TME) ou nichos de célula cancerígena. O eixo geométrico CXCRA4/CXCL12 tem papeis pivotantes em interação de célula tumoral e microambiente que sustentam a estrutura, crescimento, angiogênese e evasão tumoral de vigilância imunológica em vários cânceres de am- bos sistemas hematopoiético e não hematopoiético (Burger e Kipps, 2006; Burger e Peled, 2009; Walenkamp et al., 2017). CXCL12 pode promover angiogênese tumoral recrutando-se células endoteliais para o TME diretamente, ou indiretamente atraindo-se células inflamatórias po- sitivas para CXCRA4 para a massa tumoral, e forçando-as a secretar fa- tores proangiogênicos (Owen e Mohamadzadeh, 2013; Walenkamp et al., 2017).
[017] Evidências crescentes indicam que o eixo geométrico CXCR4/CXCL12 contribui para a falta de capacidade de resposta tumo- ral aos inibidores de angiogênese. O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi considerado o principal fator proangiogênico em câncer e foi alvejado para terapia antiangiogênica em pacientes com carcinoma retal com o uso de um anticorpo anti-VEGF bevacizumabe
(Genentech). Surpreendentemente, bevacizumabe aumentou a expres- são de CXCL12 e CXCRA4 em células cancerígenas, e níveis plasmáti- cos aumentados de CXCL12 nestes pacientes estavam associados a rápida progressão e metástase de doença (Owen e Mohamadzadeh, 2013; Xu et al., 2009). Portanto, a eficácia de uma terapia de combina- ção que usa bevacizumabe e plerixafor foi avaliada quanto ao glioma recorrente (identificador ClinicalTrials.gov: NCTO1339039). No entanto, o estudo foi encerrado devido a uma baixa taxa de acréscimo (Walen- kamp et al., 2017).
[018] A inibição do eixo geométrico CXCR4/CXCL12 demonstrou prejudicar o microambiente tumoral (TME) e expor as células tumorais ao ataque imunológico diminuindo-se a infiltração de células supresso- ras derivadas de mieloide, aumentando-se a razão de células T citotó- xicas CD8+ para células Treg, ou eliminando-se a revascularização de tumor (Burger et al., 2011; Domanska et al., 2013; Walenkamp et al., 2017). A administração de antagonistas de CXCR4, AMD3100 ou T22 atuou sinergicamente com os inibidores de checkpoint imunológico, tais como anticorpos de antígeno associado ao linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4), proteína de morte celular programada 1 (PD-1) e anticorpos de ligante de morte celular programada 1 (PD-L1), e aumentou muito sua atividade antitumoral em um modelo de adenocarcinoma ductal pancreático, carcinoma hepatocelular avançado (HCC), e melanoma B16 de CXCR4 transduzido (Chen et al., 2015; Feig et al., 2013; Lee et al., 2006; Scala, 2015; Walenkamp et al., 2017). Estes resultados indi- cam que o alvejamento de eixo geométrico CXCR4/CXCL12 oferece be- nefício aos inibidores de checkpoint imunológico convencionais.
[019] Vários fármacos que alvejam CXCRA4 foram desenvolvidos (Peled, et al., 2012; Debnath, et al., 2013; Walenkamp, et al., 2017). Inibidores de CXCR4 podem ser divididos em 5 categorias:
[020] (1) antagonistas de molécula pequena não peptídica, tal como AMD3100 (plerixafor, Mozobil"", Genzyme (MA, E.U.A.); (Cashen et al., 2007; Donzella et al., 1998), AMDO70 (AMD11070; Crawford e Alan Kaller, 2008; Stone et al., 2007), AMD3465 (Genzyme Corp., Bio- chem Pharmacol. 15 de outubro de 2009;78(8):993-1000; Bodart et al., 2009; Ling et al., 2013), GSK812397 (Jenkinson et al., 2010; Planesas et al., 2015), KRH-3955 (Murakami et al., 2009; Nakasone et al., 2013), KRH-1636 (Ichiyama et al., 2003), D-[Lys3] GHRP-6 (Patel et al., 2012), TG-0054 (Burixafor, TaiGen Biotechnology Co., Ltd.; de Nigris et al., 2012; Hsu et al., 2015), WZ811 (Zhan et al., 2007), MSX-122 (Metasta- tix, Inc.; Liang et al., 2012), e S08MCI (Composto 26; Zhu et al., 2010);
[021] (2) antagonistas de peptídeo pequeno, tais como peptídeos anti-HIV T22 (Masuda et al., 1992), T134 e T140 (Tamamura et al., 1998), BKT140 (também conhecido como BL-8040; TF14016; 4F-ben- zoil-TN14003, Biokine Therapeutics Ltd. (Rehovot, Israel); Fahham et al., 2012; Otani et al., 2012), ALX40-4C (empresa canadense Allelix Bi- opharmaceuticals (ON, Canadá); Doranz et al., 2001), GST-NT21MP (Yang et al., 2014), FC131 (Tanaka et al., 2009; Tanaka et al., 2008), FC122 (Inokuchi et al., 2011), POL6326 (de Nigris et al., 2012), e LY 2510924 (Lilly) (Peng et al., 2015);
[022] (3) anticorpos para CXCRA4, tais como ulocuplumabe (MDX1338/BMS-936564; Kuhne et al., 2013), PF-06747143 (Pfizer; Liu et al., 2017), 12G5 (Endres et al., 1996), i-corpos (AD-114, AD-114-6H, AD-114-Im7-FH, e AD-114-PA600-6H; AdAlta; Griffiths et al., 2016; Gri- ffiths et al., 2018), nanocorpos (238D2 e 238D4; Jahnichen et al., 2010; Proc. Nat! Acad. Sci. 2010, E.U.A. 107(47), 20565-20570), e ALX-0651 (Ablynx, nanocorpo biparatópico, identificador ClinicalTrials.gov: NCTO01374503);
[023] (4) análogos de ligante (CXKCL12) com atividade supressora, tal como CTCE-9908 (Chemokine Therapeutics (BC, Canadá); Wong et al., 2014); e
[024] (5) ligantes de CXCR4 radiomarcados, tais como [99mMTc]O2-AMD3100 (Hartimath et al., 2013), [68Ga]pentixafor (Dem- mer et al., 2011; Gourni et al., 2011), [177Lu]pentixather e [90Y]pentixa- ther (Herrmann et al., 2016).
[025] AMD3100 (JM 3100, plerixafor, comercializado como Mozo- bil) é um antagonista de molécula pequena específico de CXCRA4 que inibe mobilização de cálcio mediada por CXCL12 e quimiotaxia em vá- rios tipos de célula (Hatse, Princen et al. 2002), e evita crescimento tu- moral em modelos de xenoenxerto em camundongo (Rubin, Kung et al. 2003, Cho, Yoon et al. 2013, Liao, Fu et al. 2015). AMD3100 foi origi- nalmente desenvolvido para terapia de HIV (como um bloqueador de entrada de HIV que antagoniza especificamente CXCRA, um dos corre- ceptores de entrada de HIV), porém, foi aprovado pela Administração de Fármacos e Alimentos Americana apenas para mobilização de célula tronco em pacientes com linfoma e mieloma múltiplo em 2008 (Keating 2011). Durante o ensaio clínico inicial de AMD3100 para infecção por HIV, notou-se que este composto causa mobilização de célula tronco hematopoiética (HSC, CD34 *) a partir da medula óssea para sangue periférico (Broxmeyer et al., 2005; De Clercq, 2003; Liles et al., 2003).
[026] Desenvolvimento de AMD3100 para terapia de HIV foi sus- penso devido aos efeitos colaterais significativos que incluem tromboci- topenia, contrações ventriculares prematuras e leucocitose depois de inibição a longo prazo do eixo geométrico CXCR4/CXCL12 (Hendrix, et al., 2004; Peled, et al., 2012). Embora a investigação da possibilidade do uso de AMD3100 como um fármaco anticâncer seja iniciada, a falta de disponibilidade oral e alguns efeitos colaterais graves que acompa- nham o uso a longo prazo devem ser superados (Peled, et al., 2012). Em vez disso, AMD3100 subcutâneo foi aprovado em combinação com G-CSF para mobilização de célula tronco autóloga e transplante para pacientes nos Estados Unidos com linfoma de não Hodgkin (NHL) ou mieloma múltiplo por até 4 dias consecutivos, e para pacientes na Eu- ropa com mieloma múltiplo ou linfoma por 2 a 4 dias consecutivos e por até 7 dias consecutivos, respectivamente (DiPersio et al., 2009a; DiPer- sio et al., 2009b; Keating, 2011). Até então, AMD3100 é o único antago- nista de CXCR4 aprovado pela FDA.
[027] AMD3100 demonstrou inibir mobilização de cálcio mediada por CXCL12 e quimiotaxia em vários tipos de célula cancerígena que expressam CXCR4 (Hatse et al., 2002), e demonstraram significativa atividade antitumoral com metástase diminuída e sobrevivência geral aumentada em vários modelos de xenoenxerto em camundongo (Bur- ger et al., 2011; Chatterjee et al., 2014; Cho et al., 2013; Debnath et al., 2013; Domanska et al., 2013; Liao et al., 2015; Rubin et al., 2003; Wal- enkamp et al., 2017).
[028] No entanto, AMD3100 exibe agonismo parcial para CXCR4 in vitro e aumenta a proliferação de células de mieloma (Kim et al., 2010; Zhang et al., 2002). AMD3100 também atua como um modulador alos- térico positivo de CXCR7, um receptor de quimiocina alternativo para CXCL12, e aumenta ligação de CXCL12 ao CXCR7 (Kalatskaya et al., 2009). Como CXCRA4, CXCR7 também é altamente expresso por diver- sos tipos de cânceres e está associado à metástase tumoral (Decaillot et al., 2011; Zabel et al., 2011). Devido às propriedades complexas de AMD3100, o papel exato de AMD3100 em câncer deve ser investigado cuidadosamente.
[029] AMD3100 foi clinicamente avaliado como fármaco anticâncer em combinação com fármacos citotóxicos convencionais, tais como mi- toxantrona, etopósido, citrabina, daunorrubicina, azacitidina, lenalido- mida, decitabina, clofarabina, fludarabina e/ou idarrubicina; inibidores de tirosina quinase de receptor AC220 e sorafenibe; inibidor de HSP90 (Ganetespib); G-CSF; inibidor de proteassoma (bortezomibe); ou anti-
corpo monoclonal (rituximabe) em malignidades hematológicas que in- cluem leucemia mieloide aguda (AML), MM, Síndromes Mielodisplásti- cas (MDS), CLL e linfoma linfocítico pequeno (SLL) (identificador Clini- calTrials.gov:. — NCTOO512252, “NCTOO694590, NCTO0903968, NCTOO0990054, NCTO1065129, NCTO1373229, NCTO1352650, NCTO01236144, NCTO1301963, NCTO1160354, NCTO1027923, NCTOO0943943 e NCTO1435343). AMD3100 foi examinado por interrom- per comunicação de microambiente tumoral linfoide (NOCT01610999) e para quimiosensibilização em combinação com outros fármacos anti- câncer em pacientes com AML, ALL e MDS reincidente ou refratário (identificador ClinicalTrials.gov: NCTOO906945 e NCTO01319864).
[030] AMD3100 foi ou também é avaliado em tumores sólidos que incluem glioma de alto nível, sarcoma de Ewing, neuroblastoma, cânce- res pancreático, ovariano e colorretal sozinho ou em combinação com inibidor de angiogênese bevacizumabe (identificador ClinicalTrials.gov: NCTO01339039, NCTO1977677, NCTO1288573, NCTO2179970 e NCTO03277209).
[031] AMD3100 foi testado ou é atualmente avaliado para a mobi- lização das células-tronco/progenitoras/precursoras hematopoiéticas em pacientes com várias malignidades hematológicas e doenças que incluem AML, MDS, neutropenia, beta-talassemia, anemia falciforme, WHIMS, anemia Fanconi, Síndrome de Wiskott-Aldrich, mastocitose sis- temática ((Domanska et al., 2013), NCTO1058993, NCTO01206075, NCTO03226691, NCTOO0967785, NCTO2678533, NCTO3019809 e NCTOO001756). O mesmo foi ou é atualmente avaliado por recrutar cé- lulas CD34+, células progenitoras endoteliais (EPC) e/ou células proge- nitoras CD117+ em pacientes com diabetes, ferimentos, isquemia crítica dos membros inferiores, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), fibrose cística, fibrose pulmonar (identificador ClinicalTrials.gov: NCTO02056210, NCT02790957, NCTO1916577, NCTO3182426).
[032] Embora a investigação da possibilidade do uso de AMD3100 como um fármaco anticâncer seja iniciada, a falta de disponibilidade oral e alguns efeitos colaterais graves que acompanham o uso a longo prazo devem ser superados (Peled, et al., 2012).
[033] O antagonista de CXCRA4 disponível por via oral, AMDO70 (denominado também no presente documento AMD-070, AMD11070, AMD-11070 ou X4P-001; X4 Pharmaceuticals) demonstrou atividade antitumoral em vários modelos de tumor (Morimoto et al., 2016; O'Boyle et al., 2013; Parameswaran et al., 2011) e foi estudado em um ensaio clínico de fase I/ll em indivíduos infectados com HIV (identificador Clini- calTrials.gov: NCTOOO89466, (Debnath et al., 2013). AMDO70 está, agora, no ensaio clínico de fase II/Ill em pacientes com síndrome de WHIM, melanoma avançado e carcinoma de célula renal sozinho ou jun- tamente com pembrolizumabe, nivolumabe ou axitinibe (identificador ClinicalTrials.gov: NCTO3005327, NCTO02823405, NCTO02923531 e NCTO02667886).
[034] A eficácia de antagonistas de peptídeo pequeno de CXCRA, T140 e seus análogos TN14003, TC14012 e BKT140 (denominados também no presente documento BL-8040, TF14016, 4F-benzoil- TN14003, BioLineRx, Ltd.) para bloquear CXCRA4 foi demonstrada em diversos estudos pré-clínicos que incluem mobilização de célula tronco, câncer pulmonar de célula pequena (SCLC), câncer de mama, mela- noma, AML, leucemia mieloide crônica, MM, câncer pancreático e artrite reumatoide (Burger et al., 2011). Atualmente, BKT 140 está sob desen- volvimento clínico para mobilização de célula tronco e progenitora he- matopoiética em várias malignidades hematopoiéticas (identificador Cli- nicalTrials.g0v: — NCTO2502968, —“NCTO3154827, NCTO2763384, NCTO02639559 e NCTO02462252). Adicionalmente, BKT140 está em en- saios clínicos de fase || para interferir na interação de microambiente tumoral em indivíduos com AML em combinação com citarabina (identi- ficador ClinicalTrials.gov: NCTO2502968). O mesmo também é investi- gado em vários cânceres, tais como AML, câncer gástrico, câncer pul- monar de célula não pequena (NSCLC), e cânceres pancreáticos me- tastáticos juntamente com inibidores de checkpoint imunológico, tais como Pembrolizumabe (Keytruda, Merck) e Atezolizumabe (Tecentria, Genentech/Roche) (identificador ClinicalTrials.gov: NCTO3154827, NCTO03281369, NCTO03337698, NCTO02907099, NCTO3193190 e NCTO02826486).
[035] De maneira similar, CTCE-9908 (Chemokine Therapeutics Corp., Canadá), um inibidor de peptídeo de CXCRA, reduziu metástases em modelos de camundongo de osteossarcoma e melanoma (Kim et al., 2008). Após o estudo de fase | em pacientes com cânceres sólidos avançados, CTCE-9908 foi designado como um fármaco órfão para o tratamento de osteossarcoma pela FDA em 2005. Não existe desenvol- vimento adicional após o ensaio clínico de fase |/Il ter sido concluído em 2008 (Debnath, et al., 2013).
[036] MSX-122 (Altiris Therapeutics), um antagonista de molécula pequena de CXCRA, foi abandonado após ensaio clínico em pacientes com tumores sólidos (identificador ClinicalTrials.gov: NOCTO0591682). Dois contratempos grandes foram relatados em 2017 no campo de de- senvolvimento de antagonistas de CXCR4 como fármacos anticâncer. Bristol-Myers Squibb (BMS) interrompeu um estudo de fase I/Il de ulo- cuplumabe (BMS-936564/MDX1338, (Kuhne et al., 2013), um anticorpo anti-CXCR4 completamente humano, em pacientes com tumores sóli- dos para falta de eficácia (https://seekingalphacom/article/4057548-bris- tol-failure-makes-small-dent-cxcr4-blocking-approach?page=2). Além disso, Eli Lilly decidiu abandonar alguns programas anticâncer que in- cluem LY2510924, que é um antagonista de peptídeo de CXCR4 (http://wwwfiercebiotechcom/biotech/lilly-puts-two-thirds-mid-phase-
cancer-pipeline-up-for-sale-major-shake-up-r-d-priorities) após uma sé- rie de ensaios clínicos em tumores sólidos (identificador ClinicalTri- als.gov: NCTO2737072, NCTO1391130 e NCTO1439568). Estes even- tos indicam que o desenvolvimento de antagonistas de CXCR4 como fármacos anticâncer, especialmente para tumores sólidos, é um desafio contínuo.
[037] Outros antagonistas de molécula pequena que estão atual- mente sob investigação clínica incluem:
[038] USL311 (Upsher-Smith) está sob a fase | e a fase |l em pa- cientes com tumores sólidos e glioblastoma multiforme (GBM), respec- tivamente (identificador ClinicalTrials.gov: NCTO02765165); GMI-1359 (Glycomimetics) está em ensaio de fase | (identificador ClinicalTri- als.gov: NCT02931214).
[039] PF-06747143 (Pfizer), um anticorpo anticCXCR4 humani- zado, está em ensaio clínico de fase | em pacientes com AML seja so- zinho ou combinado com quimioterapia (identificador ClinicalTrials.gov: NCTO02954653, (Liu et al., 2017)).
[040] AD-114 (i-corpo, AdAlta; (Griffiths et al., 2018) é um anti- corpo anti-CXCR4 de tubarão humanizado e recebeu a designação de fármaco órfão da FDA dos Estados Unidos para um candidato a fármaco usado para tratamento de fibrose pulmonar idiopática em 2017 (https://www.reuters.com/article/idUSFWN1F70Y0). O estudo de AD- 114 tem foco principalmente nas condições fibróticas que incluem de- generação macular úmida relacionada à idade e doença do fígado gor- duroso não alcoólico (https://Jungdiseasenews.com/2017/08/23/adalta- present-research-on-investigative-therapy-ad-114-at-ipf-summit/).
[041] POL6326 (balixafortide, Polyphor), um antagonista de CXCRA4 de peptídeo, esteve sob avaliação clínica em indivíduos com câncer de mama (identificador ClinicalTrials.gov: NCTO01837095), ma- lignidades hematológicas (identificador ClinicalTrials.gov:
NCTO01413568), e regeneração e mobilização de célula tronco em paci- entes com infarto do miocárdio agudo (identificador ClinicalTrials.gov: NCTO01905475).
[042] Ligantes de CXCRA4 radiomarcados, tais como [99mTc]O2- AMD3100 e [68Ga]Pentixafor foram usados para imaginologia SPECT ou PET pré-clínico ou clínico de expressão de CXCR4 (Demmer et al., 2011; Gourni et al., 2011; Hartimath et al., 2013; Walenkamp et al., 2017). Imaginologia PET com [E8Ga]Pentixafor demonstrou expressão aumentada de CXCR4 não só em tumores hematológicos e sólidos, tais como leucemia, linfoma, MM, carcinoma adrenocortical e SCLC, mas também em outras afecções patológicas, tais como esplenose, der- rame, aterosclerose e infarto do miocárdio (Walenkamp et al., 2017).
[043] Um ligante de CXCRA4 de peptídeo marcado com a- ou B- emissores ([177Lu]pentixather e [90Y]pentixather) foi testado em mais de 30 terapias como endorradioterapia direcionada ao CXCRA4 junta- mente com quimioterapia padrão em pacientes com malignidades he- matológicas (Walenkamp et al., 2017).
[044] Embora vários fármacos que antagonizam CXCRA4 ou anti- corpo que alveja CXCR4 tenham sido desenvolvidos e estejam sob in- vestigação, sejam sozinhos, em combinação com terapias anticâncer convencionais ou com um inibidor de checkpoint imunológico, o sucesso tem sido limitado até então (Peled, et al., 2012, Debnath, et al., 2013, Walenkamp, et al., 2017). Devido aos papeis pivotantes de CXCR4 em desenvolvimento de linfócito B e T e vigilância imunológica, a inibição a longo prazo ou persistente de CXCR4 com antagonista de CXCRA4 evo- caria, potencialmente, sistema imunológico e disfunções hematopoiéti- cas, e poderia expor pacientes com câncer ao risco de supressão imu- nológica (Burger, 2009). Células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são normalmente protegidas em nichos de medula óssea. Se os antagonis-
tas de CXCRA4 são administrados com fármacos citotóxicos ou radiote- rapia, as HSCs mobilizadas em periferia estariam expostas aos efeitos de tratamento citotóxico que poderia exacerbar as citopenias. Compli- cações cardíacas observadas em pacientes tratados com AMD3100 também levantaram preocupações gerais sobre uso prolongado de an- tagonistas de CXCRA4 como fármacos anticâncer.
[045] Para evitar potenciais efeitos colaterais associados aos an- tagonistas de CXCRA4 convencionais e para desenvolver fármacos anti- câncer mais eficientes que alvejam CXCRA4, um novo paradigma para projetar inibidor de CXCR4 é urgentemente necessário.
[046] Recentemente, heterômeros de GPCR oferecem novas pos- sibilidades para desenvolver terapêutica mais específica e restrita à do- ença. Tradicionalmente, GPCRs foram considerados monoméricos visto que GPCRs monoméricos podem ativar proteínas G induzindo-se alte- rações conformacionais do domínio hepta-helicoidal mediante ligação de ligante (Pin et al., 2008; Okada et al., 2001). No entanto, evidências crescentes demonstram que GPCRs podem formar oligômeros, sejam oligêômeros homogêneos ou heterogêneos, e heterômeros de GPCR po- dem exibir propriedades específicas que claramente os distinguem de monômeros bem definidos existentes, tais como trajetórias de sinaliza- ção, afinidades de ligação de ligante, internalização e reciclagem (De Falco et al., 2007; Ferre et al., 2010; Gomes et al., 2016). Portanto, a oligomerização de GPCR pode fornecer uma maneira de aumentar a diversidade de entidades de GPCR com um número limitado de genes (Park e Palczewski, 2005). Assim, a identificação de heterômeros de GPCR inovadores ofereceria novas possibilidades para se entender os papeis de heterômeros de GPCR em tecidos específicos e em doenças específicas, assim como fornecer novas oportunidades para desenvol- ver terapêutica mais eficiente com menos efeitos colaterais. (Milligan 2008; Rozenfeld e Devi 2010; Gomes et al., 2016; Farran 2017).
[047] CXCR4 também forma heterômeros com diferentes GPCRs. Até então, CXCR4 é conhecido por interagir com GPCRs na família de receptor de quimiocina (CCR2 (Rodriguez-Frade et al., 2004; Sohy et al., 2007; Sohy et al., 2009; Armando et al., 2014), CCR5 (Agrawal et al., 2004; Rodriguez-Frade et al., 2004; Sohy et al., 2007, Sohy et al., 2009; Martinez-Munoz et al., 2014), CXCR3 (Watts et al., 2013), e CXCR7 (Sierro et al., 2007; Levoye et al., 2009; Decaillot et al., 2011)), receptor do tipo quemerina quimiocina 1 (CMKLR1) (de Poorter et al., 2013), receptor de ó-opioide (OPRD) (Pello et al. 2008; Burbassi et al., 2010), e família de receptor adrenérgico (ADRA1A (Tripathi et al., 2015), ADRA1B (Tripathi et al., 2015) e ADRB2 (LaRocca et al. 2010; Nakai et al., 2014)).
[048] A existência de heterômeros CXCR4-CCR2 e CXCR4-CCR5 foi noticiada primeiro através do estudo de infecção por HIV. Rodriguez- Frade et al. mostraram que CCR2-01, um anticorpo monoclional especí- fico de CCR2, não compete com CCL2 para ligação com CCR2 ou si- nalização de CCR2 de disparo, porém bloqueou a replicação de cepas de HIV monotrópicas (R5) e T-trópicas (X4) induzindo-se oligomeriza- ção de CCR2 com CCR5 ou CXCRA4 (Rodriguez-Frade et al., 2004). Agrawal et al. também demonstraram que CCR5D32 inibiu, especifica- mente, a expressão de superfície celular de CCR5 e CXCR4 através de heteromerização com CCR5 e CXCRA, inibindo, desse modo, a ativi- dade de correceptor de HIV de CCR5 e CXCRA4 em células CD4+ (Agra- wal et al., 2004). A coexpressão de CCR5 demonstrou evitar ligação de gp120 de HIV-1 com a superfície celular e reduzir infecciosidade de X4 HIV-1 induzindo-se oligomerização de CCR5-CD4-CXCRA4 e alterações conformacionais em CD4 e CXCRA4 (Martinez-Munoz et al., 2014).
[049] Sohy et al. relataram a existência de cooperação de ligação negativa entre as subunidades de heterômeros CXCR4-CCR2 e
CXCRA4-CCRS5, isto é, os ligantes de um receptor competiram pela liga- ção de um marcador específico do outro, em linhas celulares recombi- nantes e leucócitos primários (Sohy et al., 2007; Sohy et al., 2009). Tam- bém demonstraram que TAK-779, o antagonista de CCR2 e CCRS5, evi- tou mobilização de cálcio e quimiotaxia iniciada pelo agonista de CXCR4 CXCL12 em células que coexpressam CCR2 e CXCR4 ou CCR5 e CXCRA4 (Sohy et al., 2007; Sohy et al., 2009). Armando et al. mostraram que CXCR4 e CCR2 podem formar oligômeros homogêneos e hetero- gêneos, e a coativação de CCR2 e CXCRA4 com a proteína quimiotática de monócito humano 1 (MCP-1) e CXCL12 provocou um aumento si- nérgico em mobilização de cálcio (Armando et al., 2014).
[050] Watts et al. identificaram heterômeros CXCR4-CXCR3 em células HEK293T e mostraram cooperação de ligação negativa para agonistas endógenos e agonista de CXCR3 pequeno VUF10661, porém não para antagonistas de CXCR3 VUF10085 nem antagonista de CXCR4 AMD3100 (Watts et al., 2013).
[051] CXCRA4 também interage com ACKR3, conhecido também como CXCR7, um GPCR da família quimiocina que se liga ao CXCL12 e CXCL11, porém não tem capacidade para se acoplar às proteínas G mediante ligação de agonista. Sierro et al. identificaram heterômeros CXCR4-ACKR3 como heterômeros funcionais que exibiram sinalização de cálcio induzida por CXCL12 aprimorada e sinalização de ERK1/2 al- terada em células HEK293 (Sierro et al., 2007). Lovoye et al. relataram um resultado oposto que mostra que heterômeros CXCR4-ACKR3 exi- biram respostas de Gai e cálcio reduzidas mediante exposição ao CXCL12 em células CHO-K1 (Levoye et al., 2009). Decaillot et al. nota- ram que a coexpressão de CXCR4 e ACKR3 recrutou constitutivamente B-arrestina para heterômeros CXCR4/ACKR3 e potencializou trajetórias de sinalização a jusante dependentes de B-arrestina mediadas por
CXCL12, que incluem ERK1/2, p38 MAPK e migração de célula aprimo- rada mediante exposição ao CXCL12 (Decaillot et al., 2011).
[052] CXCR4 também interage com o receptor do tipo quemerina quimiocina 1 (CMKLR1, também conhecido como ChemR23) (de Poor- ter et al., 2013). Embora heterômeros CXCR4-CMKLR1 exibam coope- ração de ligação de agonista negativa similar a dos heterômeros CXCR4-CCR2 e CXCR4-CCRS5 relatados por Sohy et al. (Sohy et al., 2007; Sohy et al., 2009), AMD3100 não inibiu de forma cruzada a liga- ção de quemerina ou inibiu a mobilização de cálcio induzida por CXCL12 (de Poorter et al., 2013).
[053] CXCRA4 e o receptor de ó-opioide (DOR) são amplamente distribuídos em tecidos cerebrais e células imunológicas. Pello et al. re- lataram que CXCR4 e DOR podem formar heterômeros, e o estímulo simultâneo com ambos agonistas suprimiu a ativação de sinalização de Gai e evitou a migração de célula em direção ao CXCL12, embora o agonista individual elicite a sinalização de Gai robusta (Pello et al., 2008). Burbassi et al. também notaram aumento dos heterômeros CXCRA4-DOR e redução do acoplamento de CXCR4 a proteínas G no tecido cerebral e glia cultivada de camundongos deficientes de receptor de p-opioide (MOR) (Burbassi et al., 2010). A função de CXCRA foi re- cuperada com um antagonista de DOR, indicando que DOR está envol- vido na supressão de CXCR4 em glia formando-se heterômeros CXCRA4-DOR (Burbassi et al., 2010).
[054] CXCR4 também é conhecido por interagir com receptores a- e B-adrenérgicos (a-AR e B-AR). LaRocca et al. relataram que a estimu- lação de CXCR4 com CXCL12 regula negativamente acúmulo de CAMP induzido por B-AR e fosforilação dependente de PKA de fosfolambano em miócitos ventriculares de rato adulto com o uso de agonista de B-AR não seletivo, isoproterenol (LaRocca et al., 2010). Eles demonstraram a coexpressão de CXCR4 e ADRB?2 (B2-AR) nos miócitos cardíacos e a associação física de CXCR4 com ADRB2 com o uso de coimunopreci- pitação e transferência de energia de ressonância de bioluminescência, sugerindo o heterômero CXCR4-ADRB2 como um modulador cardíaco inovador.
[055] Nakai et al. estudaram a função de ADRB2 sobre linfócitos. Estimulação de linfócitos com agonistas seletivos de ADRB2 suprimiu a saída de linfócitos dos gânglios linfáticos e produziu linfopenia em ca- mundongos (Nakai et al., 2014). ADRB2 interagiu fisicamente com CCR7 e CXCRA, e a ativação de ADRB2 aprimorou sinais promotores de retenção através de heterômeros CCR7-ADRB2 e CXCR4-ADRB2 e reduziu subsequentemente a saída de linfócito dos gânglios linfáticos.
[056] Tripathi et al. revelaram a presença de heterômeros CXCR4- ADRA1A (a1A-AR) e CXCR4-ADRA1B (a1B-AR) na superfície de célu- las de músculo liso vasculares (VSMC) (Tripathi et al., 2015). Um peptí- deo derivado da segunda hélice de transmembrana de CXCRA4 interrom- peu a interação entre ADRA1A/B e CXCRA, inibiu a mobilização de cál- cio e contração de VSMC mediante estimulação de a1-AR. A ativação de CXCR4 com CXCL12 aumentou a potência de agonistas de a1-AR em resposta de pressão sanguínea em ratos, sugerindo que heterôme- ros CXCR4-ADRA1A/B poderiam ser um alvo farmacológico inovador para regulação de pressão sanguínea.
[057] Relatou-se que CXCRA4 interage com CNR2 (Receptor Ca- nabinoide 2, também conhecido como CB2) (Coke et al., 2016; Scarlett et al., 2018). A ativação simultânea de CXCR4 e CB2 com ambos ago- nistas resultou na redução de ativação de ERK1/2, mobilização de cálcio e quimiotaxia celular. Estes resultados mostram que o sistema canabi- noide pode modular negativamente a função de CXCRA4 e progressão tumoral.
[058] Conforme descrito acima, GPCRs que formam heterômeros com CXCR4 foram estudados dentro de um número limitado de famílias de GPCR, tais como famílias de quimiocina, adrenérgica e de receptor opioide. Considerando-se o papel principal e a expressão aumentada de CXCR4 em uma variedade de afecções patológicas, há um grande potencial para a existência de diferentes heterômeros CXCR4-GPCRx que conferem recursos únicos a uma doença específica. No entanto, devido ao grande número de genes de GPCR (cerca de 800) e dificul- dades em estabelecer técnicas de exame com base na proximidade de alta produtividade e ensaios funcionais, a identificação de novos hete- rômeros CXCR4-GPCRx foi um grande desafio.
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA
[059] Assim, existe na técnica uma necessidade para identificar heterômeros de GPCR funcional, tal como CXCR4-GPCRx, e desenvol- ver seus inibidores para uso como terapêutica contra câncer que alveja heterômero de GPCR com eficácia superior e efeitos colaterais inferio- res. Esta invenção atende a esta necessidade e fornece vantagens re- lacionadas.
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA
[060] Através do uso de sistema de alta produtividade de adenoví- rus (AdHTS) que permite a geração rápida e eficiente de múltiplos ade- novírus recombinantes simultaneamente (Choi, et al., 2012), e do ensaio de complementação de fluorescência bimolecular com base em adeno- vírus (BIFC) (documento de Patente; Song, 2014), os inventores exami- naram um grande número de GPCRs para sua associação com CXCR4 em células U-2 OS.
[061] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um mé- todo para tratamento, amenização, prevenção ou diagnóstico de um câncer em um indivíduo que tem heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o método compreende: administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de um heterômero CXCR4-
GPCRx, em que: GPCRx se heteromeriza com CXCR4 no indivíduo, a heteromerização de GPCRx com CXCR4 é acompanhada pelo aprimo- ramento da sinalização a jusante de CXCRA4; e o aprimoramento de si- nalização a jusante de CXCR4 é suprimido pelo inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[062] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o método com- preende: administrar ao paciente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx; em que:
[063] i) o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada; e
[064] ii) o inibidor ou combinação de inibidores administrados su- prime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4- GPCRXx no paciente com câncer.
[065] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de supressão de sinalização a jusante aprimorada de um hete- rômero CXCR4-GPCRx em uma célula de um paciente que sofre de câncer, sendo que o método compreende: administrar ao paciente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; em que:
[066] i) o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada; e
[067] ii) o inibidor ou combinação de inibidores administrados su- prime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCRA4- GPCRXx no paciente com câncer.
[068] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um kit farmacêutico para uso no tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o kit farmacêutico compreende: um inibidor ou uma combinação de inibi- dores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx; sendo que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a ju- sante aprimorada.
[069] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer em um pa- ciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRXx, sendo que a composição farmacêutica compreende:
[070] i) um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e
[071] ii) um veículo farmaceuticamente aceitável;
[072] em que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a ju- sante aprimorada.
[073] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada, sendo que o método compreende:
[074] 1) determinar se o paciente tem a célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimorada: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paci- ente; e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determine se:
[075] i) a célula cancerígena de um paciente que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRXx; ou
[076] ii) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: al- tera propriedades específicas de heterômero ou função do dito heterô- mero CXCR4-GPCRx em uma célula (ou células) derivada de paciente; altera propriedades específicas de heterômero de uma célula (ou célu- las) derivada de paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; ou diminui a proliferação celular de uma célula (ou células) derivada de pa- ciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; e
[077] 2) se o paciente tiver uma célula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx ao paciente com câncer.
[078] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o método compreende:
[079] 1) determinar se a célula cancerígena de um paciente con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente e realizando-se, ou ter realizado, um en- saio na amostra biológica para determinar se o dito heterômero CXCR4- GPCRx está presente na célula cancerígena de um paciente; em que:
[080] a) o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORAS3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; e
[081] b) o ensaio realizado na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um en- saio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, micros- copia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação ou um ensaio animal fluorescente; e
[082] 2) se a célula cancerígena de um paciente contém o dito he- terômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que con- siste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRXx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx ao paciente.
[083] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx que tem sina- lização a jusante aprimorada, sendo que o método compreende:
[084] 1) determinar se o paciente tem a célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimorada: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paci- ente; e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determine se:
[085] i) a célula cancerígena de um paciente contém o dito heterô- mero CXCR4-GPCRx; ou
[086] ii) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: al- tera propriedades específicas de heterômero ou função do dito heterô- mero CXCR4-GPCRx em uma célula (ou células) derivada de paciente; altera propriedades específicas de heterômero de uma célula (ou célu- las) derivada de paciente que contém o dito heterômero CXCR4- GPCRx; ou diminui a proliferação celular de uma célula (ou células) de- rivada de paciente que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; e
[087] 2) se o paciente tiver uma célula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer uma combinação de inibidores selecionados den- tre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e
[088] 3) se o paciente não tem uma célula cancerígena que con- tém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer o inibidor de CXCRA4 ou o inibidor de GPCRx como um único inibidor.
[089] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o método compreende:
[090] 1) determinar se a célula cancerígena de um paciente con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente e realizando-se, ou ter realizado, um en- saio na amostra biológica para determinar se o dito heterômero CXCR4- GPCRx está presente na célula cancerígena de um paciente; em que:
[091] a) o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORAS3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; e
[092] b) o ensaio realizado na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um en- saio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, micros- copia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA), citometria de fluxo, RNAseq, qRT-PCR, micromatriz ou um en- saio animal fluorescente; e
[093] 2) se a célula cancerígena de um paciente contém o dito he- terômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e
[094] 3) se a célula cancerígena de um paciente não contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paci- ente com câncer o inibidor de CXCR4 ou o inibidor de GPCRx como um único inibidor.
[095] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a heteromerização de CXCR4 com GPCRx é avaliada através de um ensaio com base em proximidade.
[096] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o ensaio com base em proximidade é selecionado dentre o grupo que consiste em complementação de flu- orescência bimolecular (BiFC), ensaio de ligação de proximidade (PLA), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), trans- ferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET), reticu- lação de cisteína, coimunoprecipitação e uma combinação de TR-FRET e SNAP-tag (Comps-Agrar et al., 2011).
[097] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a heteromerização de CXCR4 com GPCRx é avaliada através de um ensaio de cointernalização.
[098] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o aprimoramento de sinalização a ju- sante de célula de CXCRA4 é avaliado através de um ensaio de Ca2+ intracelular.
[099] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, APLNR, CS5AR1, CALCR, CCR5, CHRM1, GALR1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1, PTGER2, PTGER3, SSTR2 e TACR3.
[0100] Em determinadas modalidades do método de tratamento,
método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1, PTGER2 e TACR3.
[0101] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0102] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0103] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0104] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3.
[0105] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, HRH1, NTSR1 e TACR3.
[0106] Em determinadas modalidades do método de tratamento,
método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3.
[0107] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3.
[0108] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1 e TACR3.
[0109] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, CHRM1, HRH1 e TACR3.
[0110] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, EDNRB, HRH1 e TACR3.
[0111] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, EDNRB e HRH1.
[0112] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, CHRM1 e HRH1.
[0113] Em determinadas modalidades do método de tratamento,
método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, HRH1 e TACR3.
[0114] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2 e HRH1.
[0115] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é, ou compreende, um inibidor do CXCRA.
[0116] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de CXCR4 é selecionado dentre o grupo que consiste em: AD-114, AD-114-6H, AD-114-Im7-FH, AD-114-PA600-6H, ALX-0651, ALX40-4C, AMDO70 (AMD11070, X4P- 001), AMD3100 (plerixafor), AMD3465, ATI 2341, BKT140 (BL-8040; TF14016; 4F-Benzoil-TN14003), CTCE-9908, CX549, D-[Lys3] GHRP- 6, FO122, FC131, GMI-1359, GSK812397, GST-NT21MP, isotioureia- 1a, isotioureia-1t (IT1t) KRH-1636, KRH-3955, LY2510924, LY2624587, MSX-122, N-[C]Meti-AMD3465, PF-06747143, POL6326, dímero SDF-1 1-9[P2G], SDF1 P2G, T134, T140, 122, TC 14012, TG-0054 (Burixafor), USL311, ulocuplumabe (MDX1338/BMS- 936564), proteína inflamatória de macrófago viral-Il (vMIP-II), WZ811, 12G5, 238D2, 238D4, [ºCu]-AMD3100, [ºº*Cu]-AMD3465, [Ga]penti- xafor, [PY]pentixater, [P*"Tc]O 2-AMD3100, ["'Lu]pentixater e 508MCI (Composto 26).
[0117] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor do heterômero CXCR4-
GPCRx é, ou compreende, um antagonista do CXCRA4.
[0118] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o antagonista de CXCRA4 é selecio- nado dentre o grupo que consiste em ALX40-4C, AMDO70 (AMD11070, X4P-001), AMD3100 (plerixafor), AMD3465, ATI 2341, BKT140 (BL- 8040; TF14016; 4F-Benzoil-TN14003), CTCE-9908, CX549, D-[Lys3] GHRP-6, FC122, FC131, GMI-1359, GSK812397, GST-NT21MP, isoti- oureia-1a, isotioureia-1t (IT1t), KRH-1636, KRH-3955, LY2510924, MSX-122, N-[11C]Metil-AMD3465, POL6326, dímero SDF-1 1-9[P2G], SDF1 P2G, T134, T140, T22, TC 14012, TG-0054 (Burixafor), USL311, proteína inflamatória de macrófago viral-Il (vMIP-II), WZ811, [64Cu]- AMD3100, [64Cu]-AMD3465, [68Gal]pentixafor, [90Y]pentixater, [99mTc]O 2-AMD3100, [177Lu]pentixater e S08MCI (Composto 26).
[0119] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é, ou compreende, um anticorpo do CXCRA.
[0120] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o anticorpo de CXCRA4 é selecionado dentre o grupo que consiste em AD-114, AD-114-6H, AD-114-Im7-FH, AD-114-PA600-6H, ALX-O0651, LY2624587, PF-O6747143, ulocuplu- mabe (MDX1338/BMS-936564), 12G5, 238D2 e 238D4.
[0121] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é, ou compreende adicionalmente, um inibidor do GPCRx.
[0122] Em determinadas modalidades do método de tratamento,
método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor do GPCRx é simultânea ou sequencialmente administrado com o inibidor do CXCRA4.
[0123] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é, ou compreende, um antagonista, um agonista inverso, um modulador alostérico, um anticorpo ou porção de ligação do mesmo, um ligante ou quaisquer combinações de GPCRx.
[0124] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1, PTGER2 e TACR3.
[0125] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0126] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1IR1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CHRM1, ED- NRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0127] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0128] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3.
[0129] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, HRH1, NTSR1 e TACR3.
[0130] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3.
[0131] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3.
[0132] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB?2, CHRM1, EDNRB, HRH1 e TACR3.
[0133] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, CHRM1, HRH1 e TACR3.
[0134] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, ED- NRB, HRH1 e TACR3.
[0135] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, ED- NRB, e HRH1.
[0136] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2, CHRM1 e HRH1.
[0137] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB?2, HRH1 e TACR3.
[0138] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de uma molécula selecionado dentre o grupo que consiste em ADRB2 e HRH1.
[0139] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de ADCYAP1IR1 selecionado dentre o grupo que consiste em: M65, Max.d.4, MK-0893, N-estearil-[Nle 7], neurotensina-(6-11)/VIP-(7-28), PACAP-(6-38) e PG 97-269.
[0140] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de ADORAZB selecionado dentre o grupo que consiste em: 3-isobutil-8-pir- rolidinoxantina, aloxazina, AS16, AS70, AS74, AS94, AS95, AS96, AS99, AS100, AS101, ATL8O02, BW-A1433, cafeina, CGS 15943, CPX, CSC, CVT-6883, DAX, DEPX, derenofilina, DPCPX, FK-453, |-ABOPX, istradefilina, KF26777, LASS8096, LUF5981, MRE 2029F20, MRE 3008F20, MRS1191, MRS1220, MRS1523, MRS1706, MRS1754, MSX- 2, OSIP339391, pentoxifilina, preladenant, PSB-10, PSB-11, PSB36, PSB603, PSB-0788, PSB1115, rolofilina, SCH 58261, SCH442416, ST- 1535, teofilina, tonapofilina, vipadenant, composto de xantina e amina, XCC e ZM-241385.
[0141] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de ADORAS3 selecionado dentre o grupo que consiste em: ATL802, BW- A1433, cafeina, CGS 15943, CSC, CVT-6883, derenofilina, dexniguldi- pina, DPCPX, FK-453, flavanona, flavona, galangina, -ABOPX, istrade- filina, KF26777, LASS8096, LUF5981, MRE 2029F20, MRE 3008F20, MRE 3010F20, MRS1041, MRS1042, MRS1067, MRS1088, MRS1093, MRS1097, MRS1177, MRS1186, MRS1191, MRS1191, MRS1220, MRS1476, MRS1486, MRS1505, MRS1523, MRS1754, MRS928, MSX- 2, nicardipina, preladenant, PSB-10, PSB-11, PSB36, PSB603,
PSB1115, rolofilina, sacuranetina, SCH 58261, SCH442416, ST-1535, teofilina, tonapofilina, vipadenant, visnagina, VUF5574, VUF8504, VUF8507, composto de xantina e amina, e ZM-241385.
[0142] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de ADRBZ2 selecionado dentre o grupo que consiste em: Alprenolol, ate- nolol, betaxolol, bupranolol, butoxamina, carazolol, carvedilol, CGP 12177, cicloprolol, ICI 118551, ICYP, labetalol, levobetaxolol, levobu- nolol, LK 204-545, metoprolol, nadolol, NIHP, NIP, propafenona, propra- nolol, sotalol, SR59230A e timolol.
[0143] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de ADRB2 é Carvedilol.
[0144] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de C5AR1, o inibidor é selecionado dentre o grupo que consiste em: A8 9"'- 73, AcPhe-Orn-Pro-D-Cha-Trp-Arg, avacopan, CO89, CHIPS, DF2593A, JPE1375, L-156,602, NDT9520492, N-metil-Phe-Lys-Pro-D-Cha-Trp-D- Arg-CO 2H, PMX205, PMX53, RPR121154 e W54011.
[0145] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de CALCR selecionado dentre o grupo que consiste em a-CGRP-(8-37) (humano), AC187, CT-(8-32) (salmão) e olcegepant.
[0146] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de CALCR é AC187.
[0147] Em determinadas modalidades do método de tratamento,
método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de CHRM1 selecionado dentre o grupo que consiste em benzilato de 3- quinuclidinila (QNB), 4-DAMP, aclidínio, AESC90CB, AFDX384, amitrip- tilina, AQ-RA 741, atropina, benzatropina, biperideno, darifenacina, dici- clomina, dosulepina, etopropazina, glicopirrolato, guanilpirenzepina, hexa-hidrodifenidol, hexa-hidrossiladifenidol, hexocíclio, himbacina, ipratrópio, litocolilcolina, metoctramina, ML381, toxina muscarínica 1, to- xina muscarínica 2, toxina muscarínica 3, escopolamina de N-metila, otenzepade, oxibutinina, p-F-HHSIiD, pirenzepina, propantelina, (R,R)- quinuclidinil-4-fluorometil-benzilato, escopolamina, sila-hexocíclio, soli- fenacina, telenzepina, tiotrópio, tolterodina, tri-hexifenidila, tripitramina, UH-AH 37, umeclidínio e VUO255035.
[0148] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de CHRM1 é oxibutinina, umeclidínio e VUO255035.
[0149] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de EDNRB selecionado dentre o grupo que consiste em A192621, ambri- sentan, atrasentan, bosentan (RO 470203, Tracleer);, BQ788, IRL 2500, K-8794, macitentan, RES7011, Ro 46-8443, SB209670, SB217242 (en- rasentan), TAK 044, e tezosentan (RO610612).
[0150] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de EDNRB é bosentan.
[0151] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de
HRH1 selecionado dentre o grupo que consiste em (-)-clorfeniramina, (+)-clorfeniramina, (-)- trans-H 2-PAT, (+)- cis-H 2-PAT, (+)- trans-H 2- PAT, (+)- cis-H 2-PAT, (+)- trans-H 2-PAT, (R)-cetirizina, (S)-cetirizina, 9- OH-risperidona, A-317920, A-349821, ABT-239, alimemazina, amitripti- lina, aripiprazol, arpromidina, asenapina, astemizol, AZD3778, azelas- tina, BU-E 47, cetirizina, clorfeniramina, clorpromazina, ciproxifano, cle- mastina, clobempropite, clozapina, conessina, ciclizina, cipro-heptadina, desloratadina, difenidramina, dosulepina, doxepina, epinastina, fexofe- nadina, flufenazina, fluspirileno, haloperidol, hidroxizina, impromidina, INCB-38579, JNJ-39758979, cetotifeno, loratadina, loxapina, MK-0249, molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, pipamperona, pitoli- sante, prometazina, pirilamina, quetiapina, risperidona, sertindol, terfe- nadina, tioridazina, tiotixeno, trifluoperazina, tripelenamina, triprolidina, ziprasidona e zotepina.
[0152] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de HRH1 é cetirizina, pirila- mina, hidroxizina ou loratadina.
[0153] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de MLNR selecionado dentre o grupo que consiste em GM-109, MA-2029 e OHM-11526.
[0154] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de MLNR é MA-2029.
[0155] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de NTSR1 selecionado dentre o grupo que consiste em Meclinertant,
SR48527, SR48692 e SR142948A.
[0156] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de NTSR1 é Merclinertant.
[0157] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um inibidor de TACR3 selecionado dentre o grupo que consiste em [Trp ”, B-Ala ?] neu- rocinina A-(4-10), AZD2624, FK 224, GR138676, GSK 172981, GSK 256471, N' 2-difenilquinolina-4-carboidrazida 8m, N' 2-difenilquinolina- 4-carboidrazida, osanetant, PD 154740, PD 161182, PD157672, sare- dutant, SB 218795, SB 222200, SB 235375, SCH 206272, SSR 146977 e talnetant.
[0158] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de TACR3 é SSR146977.
[0159] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é um inibidor de interação de proteína-proteína (PPI).
[0160] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em câncer de mama, câncer pulmonar, câncer de cérebro, câncer de rim, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer da próstata, melanoma, mieloma múltiplo, cânceres gastrointestinais, car- cinoma de célula renal, sarcomas de tecido mole, carcinoma hepatoce- lular, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de esôfago e leu- cemia.
[0161] Em determinadas modalidades do método de tratamento,
método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de heterômero CXCR4- GPCRx é administrado ao indivíduo em uma composição farmacêutica.
[0162] É divulgado, adicionalmente, no presente documento um método para avaliar resposta, ou potencial resposta, de um indivíduo que tem o heterômero CXCR4-GPCRx ao tratamento, amenização ou prevenção de um câncer, sendo que o método compreende: obter uma amostra do indivíduo; detectar a heteromerização de CXCR4 e GPCRx na amostra; e com base, pelo menos em parte, na detecção da hetero- merização de CXCR4 e GPCRXx, avaliar a resposta, ou potencial res- posta, do indivíduo ao tratamento, amenização ou prevenção de um câncer.
[0163] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a heteromerização de CXCR4 e GPCRx é acompanhada pelo aprimoramento de sinalização a jusante de CXCRA4.
[0164] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o aprimoramento de sinalização a ju- sante de célula de CXCRA4 é avaliado através de um ensaio de Ca2+ intracelular.
[0165] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a heteromerização de CXCR4 com GPCRx é avaliada através de um ensaio com base em proximidade.
[0166] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o ensaio com base em proximidade é selecionado dentre o grupo que consiste em complementação de flu- orescência bimolecular (BiFC), ensaio de ligação de proximidade (PLA), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), trans- ferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET), reticu- lação de cisteína e coimunoprecipitação.
[0167] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a heteromerização de CXCR4 com GPCRx é avaliada através de um ensaio de cointernalização.
[0168] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o heterômero CXCR4-GPCRx tem, causa ou produz, a sinalização a jusante aprimorada.
[0169] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a sinalização a jusante aprimorada resulta do heterômero CXCR4-GPCRx, tal como resulta de agonismo do heterômero CXCR4-GPCRx, resulta de agonismo de CXCR4 do he- terômero CXCR4-GPCRx, ou resulta de agonismo de GPCRx do hete- rômero CXCR4-GPCRx.
[0170] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a sinalização a jusante aprimorada é a jusante do CXCRA, do respectivo GPCRx ou do heterômero CXCR4- GPCRx.
[0171] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor ou combinação de inibido- res suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer, tal como suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx nas células cancerígenas de um paciente.
[0172] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é determinada por um ensaio de Ca2+ intracelular.
[0173] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a sinalização a jusante aprimorada é uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio.
[0174] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a quantidade aprimorada de mobili- zação de cálcio é uma quantidade sinérgica de mobilização de cálcio.
[0175] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o heterômero CXCR4-GPCRx tem duas ou mais das seguintes características:
[0176] 1) os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula colocalizam e interagem fisicamente, seja diretamente ou por meio de proteínas intermediárias que atuam como condutos para alos- terismo, conforme determinado por meio de um ou mais dentre os se- guintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hi- bridização in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação ou um ensaio animal fluorescente;
[0177] 2) uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio, de modo que: a) o CXCRA4 ou o respectivo GPCRx, em um contexto de protômero individual em uma célula, mediante coestimulação com
CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo, resulte em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx se- letivo; e b) o heterômero CXCR4-GPCRx exibe uma mobilização de cál- cio aprimorada mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo em relação à soma de quantidades de mo- bilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; conforme de- terminado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio; ou
[0178] 3) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: i) al- tera propriedades específicas de heterômero do heterômero CXCR4- GPCRx em uma célula derivada de um paciente; ii) altera função espe- cífica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula de- rivada de um paciente; iii) altera propriedades específicas de heterô- mero de uma célula derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx; ou iv) diminui proliferação celular de uma célula (ou células) derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4- GPCRx.
[0179] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, os componentes de heterômero CXCR4-GPCRXx na célula colocalizam e interagem fisicamente, seja di- retamente ou por meio de proteínas intermediárias que atuam como condutos para alosterismo, conforme determinado por meio de um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação ou um ensaio animal fluorescente.
[0180] Em determinadas modalidades do método de tratamento,
método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o ensaio com base em proximidade é, ou compreende, transferência de energia de ressonância (RET), RET de bioluminescência (BRET), RET de fluorescência (FRET), RET de flu- orescência de prazo estabelecido (TR-FRET), FRET auxiliada por anti- corpo, FRET auxiliada por ligante, complementação de fluorescência bi- molecular (BIFC) ou um ensaio de ligação de proximidade (PLA).
[0181] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o heterômero CXCR4-GPCRx exibe a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio, de modo que:
[0182] a) o CXCRA4 ou o respectivo GPCRx em um contexto de pro- tômero individual na célula mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo resulta em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; e
[0183] b) o heterômero CXCR4-GPCRx exibe uma mobilização de cálcio aprimorada mediante coestimulação com o CXCL12 e o respec- tivo agonista de GPCRx seletivo com relação à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo;
[0184] conforme determinado por meio de um ensaio de mobiliza- ção de cálcio.
[0185] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: i) altera propriedades específicas de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx na célula derivada de um paciente; ii) altera função específica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx na cé- lula derivada de um paciente; iii) altera propriedades específicas de he- terômero da célula derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; ou iv) diminui proliferação celular da célula derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
[0186] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx é um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx ou um inibidor de heterômero CXCR4-GPCRx.
[0187] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx é um antagonista de CXCR4, um antagonista de GPCRXx, ou um antagonista de heterômero CXCR4-GPCRx.
[0188] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o método administra um inibidor se- lecionado dentre o grupo que consiste em: o inibidor de CXCRA, o inibi- dor de GPCRx ou o inibidor de heterômero CXCR4-GPCRx.
[0189] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor é administrado como uma composição farmacêutica.
[0190] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor administrado é o inibidor de CXCRA4.
[0191] Em determinadas modalidades do método de tratamento,
método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor administrado é o inibidor de GPCRx.
[0192] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor administrado é o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0193] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o método administra a combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: o inibidor de CXCRA, o inibidor de GPCRx e o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx.
[0194] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a combinação de inibidores é admi- nistrada sequencial, concomitante ou simultaneamente.
[0195] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de CXCRA4 é um antago- nista de CXCRA4, um agonista inverso de CXCRA4, um antagonista par- cial de CXCRA4, um modulador alostérico de CXCR4, um anticorpo de CXCRA, um fragmento de anticorpo de CXCRA, um ligante de CXCR4 ou um conjugado de anticorpo e fármaco de CXCRA.
[0196] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor de GPCRx é um antago- nista de GPCRXx, um agonista inverso de GPCRXx, um antagonista par- cial de GPCRx, um modulador alostérico de GPCRx, um anticorpo de GPCRXx, um fragmento de anticorpo de GPCRx, um ligante de GPCRx ou um conjugado de anticorpo e fármaco de GPCRx.
[0197] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é um antagonista do heterômero CXCR4-GPCRXx, um agonista inverso do heterômero CXCR4-GPCRx, um antagonista parcial do he- terômero CXCR4-GPCRx, um modulador alostérico do heterômero CXCR4-GPCRXx, um anticorpo do heterômero CXCR4-GPCRx, um fra- gmento de anticorpo do heterômero CXCR4-GPCRXx, um ligante do he- terômero CXCR4-GPCRx, um inibidor de interação de proteína-proteína (PPI) do heterômero CXCR4-GPCRXx, ou um conjugado de anticorpo e fármaco do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0198] Em determinadas modalidades do método de tratamento ou método de supressão, divulgados no presente documento, o método compreende adicionalmente detectar o heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer.
[0199] Em determinadas modalidades do método de tratamento ou método de supressão, divulgados no presente documento, o método compreende adicionalmente identificar o heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer.
[0200] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o método compreende adicional- mente:
[0201] i) obter, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente com câncer;
[0202] ii) conduzir, ou ter conduzido, um ensaio de diagnóstico para determinar a presença, identidade, ou presença e identidade, de um he- terômero CXCR4-GPCRXx na amostra biológica obtida do paciente com câncer; e
[0203] iii) selecionar o inibidor ou combinação de inibidores para su- primir sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0204] Em determinadas modalidades do método de tratamento ou método de supressão, divulgados no presente documento, a amostra biológica de um paciente é uma amostra de fluido biológico ou uma amostra de tecido biológico.
[0205] Em determinadas modalidades do método de tratamento ou método de supressão, divulgados no presente documento, uma biopsia líquida é realizada na amostra de fluido biológico ou na amostra de te- cido biológico.
[0206] Em determinadas modalidades, a amostra de fluido biológico inclui células tumorais circulantes (CTCs), DNA livre de célula derivada de tumor (cfDNA), pequenos RNAs circulantes e vesículas extracelula- res que incluem exossomas, de fluidos corporais conforme divulgado, por exemplo, em Campos CDM et al., “Molecular Profiling of Liquid Bi- opsy Samples for Precision Medicine,” Cancer J., março/abril de 2018;24(2):93-103, que é incorporado aqui em sua totalidade.
[0207] Em determinadas modalidades do método de tratamento ou método de supressão, divulgados no presente documento, a amostra de fluido biológico é uma amostra sanguínea, uma amostra plasmática, uma amostra de saliva, uma amostra de fluido cerebral, uma amostra de fluido ocular ou uma amostra de urina.
[0208] Em determinadas modalidades do método de tratamento ou método de supressão, divulgados no presente documento, a amostra de tecido biológico é uma amostra de tecido de órgão, uma amostra de tecido ósseo ou uma amostra de tecido de tumor.
[0209] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a célula cancerígena contém o hete- rômero CXCR4-GPCRx.
[0210] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, uma célula não cancerígena normal não contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
[0211] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a progressão do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4- GPCRx é diminuída na faixa de 5 a 100% mais mediante administração da combinação de inibidores, em relação à administração do inibidor de CXCR4 ou inibidor de GPCRx como o inibidor único ao dito paciente.
[0212] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a eficácia de um inibidor de CXCR4 é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combina- ção com o inibidor de GPCRx ao paciente que tem a dita célula cance- rígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de CXCR4 quando administrado como um inibidor único.
[0213] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combina- ção com o inibidor de CXCR4 ao paciente que tem a dita célula cance- rígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx, em relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando administrado como um inibidor único.
[0214] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a progressão do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4- GPCRx é diminuída na faixa de 5 a 100% mais mediante administração da combinação de inibidores, em relação à administração do inibidor de CXCRA4 ou inibidor de GPCRx como o inibidor único ao dito paciente.
[0215] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a eficácia de um inibidor de CXCR4 é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combina- ção com o inibidor de GPCRx ao paciente que tem a dita célula cance- rígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de CXCR4 quando administrado como um inibidor único.
[0216] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combina- ção com o inibidor de CXCR4 ao paciente que tem a dita célula cance- rígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx, em relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando administrado como um inibidor único.
[0217] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o método administra uma combina- ção de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um ini- bidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0218] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o método administra uma combina- ção de um inibidor de CXCR4 e um inibidor de GPCRx.
[0219] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o método administra um inibidor de heterômero CXCR4-GPCRx.
[0220] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a administração da combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterô- mero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 2000 vezes, em relação à administração de inibidor único.
[0221] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a administração da combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterô- mero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 1500 vezes, em relação à administração de inibidor único.
[0222] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a administração da combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterô- mero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 500 e 1500 vezes, em relação à administração de inibidor único.
[0223] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a administração do inibidor ou com- binação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 2000 vezes, em relação à supressão da sinalização a jusante de um protômero de CXCRA4 ou um protômero de GPCRx em seu respectivo contexto de protômero individual.
[0224] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a administração do inibidor ou com- binação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 1500 vezes, em relação à supressão da sinalização a jusante de um protômero de CXCRA4 ou um protômero de GPCRx em seu respectivo contexto de protômero individual.
[0225] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a administração do inibidor ou com- binação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 500 e 1500 vezes, em relação à supressão da sinalização a jusante de um protômero de CXCRA4 ou um protômero de GPCRx em seu respectivo contexto de protômero individual.
[0226] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a célula cancerígena do paciente con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx em uma concentração maior que uma célula não cancerígena normal do dito paciente,
[0227] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a presença do heterômero CXCR4- GPCRXx na célula cancerígena do paciente identifica uma subpopulação de pacientes com câncer mediado por CXCRA4.
[0228] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, a presença do heterômero CXCR4- GPCRx na célula cancerígena do paciente é um biomarcador de uma subpopulação de pacientes com câncer mediado por CXCRA4.
[0229] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o biomarcador da subpopulação de pacientes com câncer mediado por CXCRA4 permite medicina de preci- são, estratificação de paciente ou classificação de paciente.
[0230] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o biomarcador da subpopulação de pacientes com câncer mediado por CXCR4 permite terapêutica de cân- cer de precisão com base em GPCR.
[0231] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor é um anticorpo.
[0232] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx é um anticorpo.
[0233] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o anticorpo é um anticorpo biespecí- fico do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0234] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o anticorpo é um anticorpo de hete- rômero específico do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0235] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o inibidor é um ligante (ou ligantes) biespecífico do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0236] Em determinadas modalidades do método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, di- vulgados no presente documento, o anticorpo é um conjugado de anti- corpo e fármaco (ADC), conforme divulgado, por exemplo, em Beck a et al., “Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates”, Nature Reviews Drug Discovery, 16:315-337, (2017) e Lambert, et al., “Antibody-Drug Conjugates for Cancer Treatment”, An- nual Review of Medicine, 69:191-207 (2018), em que cada um está in- corporado aqui em sua totalidade.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0237] FIGURA 1: Mostra desenho esquemático de ensaio de com- plementação de fluorescência bimolecular (BIFC). GPCR A é fundido com fragmento de terminal N de Vênus (VN) de proteína fluorescente amarela (YFP) e GPCR B é fundido com fragmento de terminal C de Vênus (VC). Quando GPCRs A e B formam heterômero, as VN e VC complementares estão próximas o suficiente para formar Vênus funcio- nal.
[0238] FIGURAS 2a a 2u: Mostram identificação de GPCRs de in- teração com CXCRA4 com o uso de ensaio BiFC. Imagens representati- vas que mostraram sinal de BIFC negativo; CXCR4-VN e HA-VC (Figura 2a) e CXCR4-VN e GCGR-VC (Figura 2c). Imagens representativas de CXCR4 e GPCRx que mostraram sinal de BiFC positivo; CXCR4-VN e CXCRA4-VC (Figura 2b), CXCR4-VN e ADCYAP1IR1-VC (Figura 2d), CXCRA4-VC e ADORA2Z2B-VN (Figura 2e), CXCR4-VN e ADORA3-VC (Figura 2f), CXCR4-VN e ADRB2-VC (Figura 29), CXCR4-VN e APLNR- VC (Figura 2h), CXCR4-VN e C5AR1-VC (Figura 2i), CXCR4-VN e CALCR-VC (Figura 2j), CXCR4-VN e CCR5-VC (Figura 2k), CXCR4-VN e CHRM1-VC (Figura 21), CXCR4-VWN e GALR1I-VC (Figura 2m), CXCRA4-VN e EDNRB-VC (Figura 2n), CXCR4-VN e HRH1-VC (Figura 20), CXCR4-VN e MLNR-VC (Figura 2p), CXCR4-VN e NTSR1-VC (Fi- gura 29), CXCR4-VN e PTGER2-VC (Figura 2r), CXCR4-VC e PTGERS3-VN (Figura 2s), CXCR4-VN e SSTR2-VC (Figura 2t), e CXCRA4-VN e TACR3-VC (Figura 2u).
[0239] FIGURAS 3a a 3b: Mostram o princípio de estudo de coin- ternalização de GPCR. Células que coexpressam CXCR4-GFP e GPCRx são tratadas com agonista de GPCRx específico. (Figura 3a) CXCR4 e GPCRx não interagem fisicamente entre si. Agonista de GPCRx induz internalização de GPCRx, porém, não de CXCR4-GFP. (Figura 3b) CXCR4 e GPCRx interagem fisicamente e formam heterô- mero. Agonista de GPCRx induz internalização de GPCRx, e CXCR4- GFP é cointernalizado com GPCRx.
[0240] FIGURAS 4a a 4q: Mostram cointernalização de CXCR4- EGFP mediante estimulação de GPCRXx com seu agonista correspon- dente (controle: CXCR4-GFP (Figura 4a)). Células U-2 OS foram co- transduzidas com adenovírus que codificam CXCR-EGFP e GPCRx- VC, e os seguintes parceiros de GPCRx foram examinados para formar heterômero com CXCR4-EGFP e para induzir cointernalização do CXCR4-EGFP: GPCRx representa ADCYAP1IR1 (Figura 4b), ADORAZB (Figura 4c), ADORA3 (Figura 4d), ADRB2 (Figura 4e), APLNR (Figura 4f), CSAR1 (Figura 49), CCR5 (Figura 4h), CHRM1 (Fi- gura 4i), GALR1 (Figura 4j)), EDNRB (Figura 4k), HRH1 (Figura 4l), MLNR (Figura 4m), NTSR1 (Figura 4n), PTGER3 (Figura 40), SSTR2 (Figura 4p) e TACR3 (Figura 49).
[0241] FIGURAS 5a a 5d: Mostram aprimoramento da resposta de cálcio em células que coexpressam CXCR4 e ADRB2 mediante coesti- mulação com seus respectivos agonistas seletivos. Células de câncer de mama humano MDA-MB-231 foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCRA4 e HA-VC (Figura 5a), ADRB2 e HA-VC (Figura 5b), ou CXCR4 e ADRB?2 (Figura 5c). Adenovírus que codificam HA-VC foram usados para ajustar a quantidade total de adenovírus transduzi- dos. Permitiu-se que as células expressassem GPCR por 2 dias, incu- badas com Cal-520 AM por 2 h e foram tratadas com 15 nM de CXCL12,
100 nM de salmeterol (agonista de ADRB2 seletivo), ou CXCL12 e sal- meterol juntos. Mobilização de cálcio foi medida com o uso de Leitor de Microplaca FlexStation 3 Multi-Mode. Os resultados foram normalizados para atividade de linha de base. Dados representam três experimentos independentes (média + SEM). (Figura 5d) Mobilização de cálcio foi quantificada calculando-se a área sob a curva (AUC) de cada gráfico em A a C. Dados foram normalizados para resposta de cálcio estimu- lada por CXCL12 em células que expressam CXCRA4 sozinho. Soma representa o efeito aditivo calculado das respostas obtidas após estimu- lação de CXCL12 e salmeterol| individualmente em células que coex- pressam CXCR4 e ADRB2, para permitir a visualização da potenciação. ***P < 0,001; Teste t de Student.
[0242] FIGURAS 6a a 61: Mostra o aprimoramento da resposta de cálcio em células que coexpressam CXCR4 e GPCRx mediante coesti- mulação com seus respectivos agonistas seletivos, conforme mostrado nas Figuras 5a a c. Células MDA-MB-231 foram transduzidas com ade- novírus que codificam CXCR4 e HA-VC, GPCRx e HA-VC, ou CXCR4 e GPCRx. GPCRx representa ADCYAP1R1 (Figura 6a), ADORAZB (Fi- gura 6b), ADORAS (Figura 6c), CSAR1 (Figura 6d), CALCR (Figura 6e), CHRM1 (Figura 6f), EDNRB (Figura 69), HRH1 (Figura 6h), MLNR (Fi- gura 6i), NTSR1 (Figura 6j)), PTGER?2 (Figura 6k) e TACR3 (Figura 61). Células foram incubadas com Cal-520 AM, e foram tratadas com CXCL12, agonista de GPCRx, ou agonista de CXCL12 e GPCRx juntos. Respostas de cálcio foram quantificadas conforme descrito na Figura 5. Dados representam três experimentos independentes (média + SEM). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; Teste t de Student.
[0243] FIGURAS 7a a 7e: Mostram exemplos de heterômero CXCR4-GPCRx que falharam em mostrar sinalização de cálcio aprimo- rada em células que coexpressam CXCR4 e GPCRXx na presença de agonistas para ambos GPCRs. Células MDA-MB-231 foram transduzi- das com adenovírus que codificam CXCR4 e HA-VC, GPCRx e HA-VC ou CXCR4 e GPCRx. GPCRx representa APLNR (Figura 7a), CCR5 (Fi- gura 7b), GALR1 (Figura 7c), PTGER3 (Figura 7d), e SSTR2 (Figura 7e). Células foram incubadas com Cal-520 AM, e foram tratadas com CXCL12, agonista de GPCRx, ou agonista de CXCL12 e GPCRx juntos. Mobilização de cálcio foi quantificada conforme descrito na Figura 5. Dados representam três experimentos independentes (média + SEM). Teste t de Student. ns: não significativo.
[0244] FIGURAS 8a a 81: Mostram cotratamento de ambos antago- nistas que suprimiram de maneira eficiente a resposta de cálcio aprimo- rada quando células que expressam heterômero CXCR4-GPCRx foram estimuladas com agonistas de CXCL12 e GPCRXx, simultaneamente. Células MDA-MB-231 foram cotransduzidas com adenovírus que codi- ficam CXCR4 e GPCRx. GPCRx representa ADRB2 (Figura 8a), CHRM1 (Figuras 8b a 8d), EDNRB (Figura 8e), HRH1(endo) (Figura 8f e Figura 89), HRH1 (Figura 8h e Figura 8i), MLNR (Figura 8j)), NTSR1 (Figura 8k) e TACR3 (Figura 81). Em F&G, células foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCRA, e respostas de HRH1 endóge- nas foram examinadas com 50 nM de histamina. Células foram incuba- das com Cal-520 AM por 2 h, antagonistas ou veículo de GPCR por 30 min e estimuladas com quantidades indicadas de CXCL12, agonista de GPCRXx, ou agonista de CXCL12 e GPCRx. Mobilização de cálcio foi quantificada conforme descrito na Figura 5d. Dados representam três experimentos independentes (média + SEM). *P < 0,05, **P <0,01,***P. < 0,001; Teste t de Student.
[0245] FIGURA 9: Mostra o princípio de estudo de inibição de inter- nalização. Células que coexpressam CXCR4-GFP e GPCRx são trata- das com CXCL12 (SDF-1) e/ou antagonista de GPCRx específico. (ce- nário A) CXCR4 e GPCRx formam heterômero. Agonista de CXCRA,
CXCL12 (SDF-1) induziu internalização de CXCR4-GFP sozinho ou CXCRA4-GFP com GPCRx. (cenário B) Antagonista de GPCRx não in- duz internalização de CXCR4-GFP. (cenário C) Internalização de CXCRA4-GFP estimulado por CXCL12 (SDF-1) é inibida por antagonista de GPCRx específico.
[0246] FIGURAS 10a a 10c: Mostram inibição de internalização por antagonista de GPCRx para heterômeros. (Figura 10a) CXCR4-ADRB2; (Figura 10b) CXCR4-CHRM1; e (Figura 10c) CXCR4-HRH1. (Figura 10a) Células U-2 OS que expressam CXCR4-GFP foram transduzidas com adenovírus que codificam ADRB2. Tratamento por CXCL12 (SDF- 1), um agonista de CXCRA, induziu internalização de CXCR4-ADRB?2. Porém, Carvedilol, um antagonista de ADRB2, não induz internalização. Cotratamento com CXCL12 e Carvedilol inibiu, parcialmente, internali- zação de CXCR4-ADRB2 induzida por CXCL12. (Figura 10b) Células U-2 OS que expressam CXCRA4-GFP foram transduzidas com adenoví- rus que codificam CHRM1. Tratamento por CXCL12 induziu internaliza- ção de CXCR4-CHRM1. Porém, oxibutinina ou umeclidínio, antagonis- tas de CHRM1, não induziram internalização. Cotratamento com CXCL12 e oxibutinina ou umeclidínio inibiu, parcialmente, internalização de CXCR4-CHRM1 induzida por CXCL12. (Figura 10c) Células U-2 OS que expressam CXCRA4-GFP foram transduzidas com adenovírus que codificam HRH1. Tratamento por CXCL12 induziu internalização de CXCR4-HRH1. Porém, prometazina, hidroxizina ou loratadina, antago- nistas de HRH1, não induzem internalização. Cotratamento com CXCL12 e prometazina, hidroxizina ou loratadina inibiu internalização de CXCR4-HRH1 induzida por CXCL12.
[0247] FIGURAS 11a a 11c: Mostram o efeito de antagonista de GPCRx sobre a sobrevivência de células derivadas de paciente (PDCs) de pacientes com câncer. (Figura 11a) Efeito de antagonista de ADRB2
(Carvedilol) sobre a sobrevivência de PDC. Carvedilol induziu sobrevi- vência significativamente diminuída de células. (IC50 = 11,69 uM) (Fi- gura 11b) Efeito de antagonistas de CHRM1 (oxibutinina, umeclidínio) sobre a sobrevivência de PDC. Oxibutinina e umeclidínio, cada um, mostrou sobrevivência significativamente diminuída de células em IC50 = 3,04 uM e 4,03 UM, respectivamente. (Figura 11c) Efeito de antago- nistas de HRH1 (prometazina, hidroxizina e loratadina) sobre a sobrevi- vência de PDC. Prometazina, hidroxizina e loratadina, cada uma, mos- trou sobrevivência diminuída de PDC em IC50 = 18,39 uM, 12,79 uM e 5,29 UM, respectivamente.
[0248] FIGURAS 12a a 12c: Mostram detecção de heterodímero CXCRA4-ADRB2 por PLA e gRT-PCR em células U-2 OS que superex- pressam CXCR4 e ADRB2. Células U-2 OS que expressam CXCR4- GFP foram transduzidas com adenovírus que codificam ADRB2 em di- ferentes MOIs por 2 dias. Então, células U-2 OS que coexpressam CXCRA4-ADRB? realizaram PLA. (Figura 12a) Imagem de detecção de heterômero CXCR4-ADRB2 por PLA. (Figura 12b) Aumento do sinal de PLA proporcional ao nível de expressão de ADRB2 em uma maneira dependente de dose. (Figura 12c) Dados de qRT-PCR que mostram ní- vel de expressão de ADRB2 endógeno de células U-2 OS.
[0249] FIGURAS 13a a 13b: Mostram detecção de heterômero CXCR4-ADRB2 em PDC por PLA. PDCs originadas por GBM (IDs de amostra: 986T, 948T, 783T, 777T, 352T1, 35212, 578T, 559T, 464T, 448T, 096T) foram colocadas em placas em lâmina de câmara e o he- terômero CXCR4-ADRB?2 foi detectado por PLA com anticorpos de CXCR4 e ADRB?2 específicos. (Figura 13a) Imagem de detecção de he- terômero CXCR4-ADRB2. Núcleos foram visualizados com tingimento de DAP! e heterômeros CXCR4-ADRB?2 foram mostrados como peque- nos pontos. (Figura 13b) Razão de heterômero CXCR4-ADRB2 em PDC.
[0250] FIGURAS 14a a 14b: Mostram detecção de heterômero CXCR4-CHRM1 em PDC por PLA. PDCs originadas por GBM (IDs de amostra: 986T, 948T, 783T, 777T, 352T1, 35212, 578T, 559T, 464T, 448T, 096T) foram colocadas em placas em lâmina de câmara e o he- terômero CXCR4-CHRM1 foi detectado por PLA com anticorpos de CXCR4 e CHRM1 específicos. (Figura 14a) Imagem de detecção de he- terômero CXCR4-CHRM1. Núcleos foram visualizados com tingimento de DAP! e heterômeros CXCR4-ADRB?2 foram mostrados como peque- nos pontos. (Figura 14b) Razão de heterômero CXCR4-CHRM1 em PDC.
[0251] FIGURAS 15a a 15b: Mostram resultados de detecção de heterômero CXCR4-GPCRx em PDX. PDXs originadas por GBM (IDs de amostra; 777T, 783T, 948T, 5597) foram heterômero CXCR4- ADRB?2 detectado por PLA com anticorpos de CXCR4 e ADRB?2 espe- cíficos. (Figura 15a) Imagem de detecção de heterômero CXCR4- ADRB?2. Núcleos foram visualizados com tingimento de DAPI e heterô- meros CXCR4-ADRB2 foram mostrados como pequenos pontos. (Fi- gura 15b) Razão de heterômero CXCR4-ADRB2 em PDX.
[0252] FIGURAS 16a a 16b: Mostram o aprimoramento da resposta de cálcio em células que coexpressam CXCR4 e GPCRx mediante co- estimulação com seus respectivos agonistas. Células MDA-MB-231 fo- ram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e ADRB?2 (Fi- gura 16a) ou CXCR4 e HRH1 (Figura 16b). Células foram cultivadas por 3 dias, manchadas com Cal-520 AM, e foram tratadas com CXCL12 (30 nM) sozinho, doses crescentes de histamina ou salmetero! sozinho, ou doses crescentes de histamina ou salmeterol em combinação com 30 nM de CXCL12. Mobilização de cálcio foi medida com o uso de FlexS- tation 3. A soma representa o valor aditivo calculado das respostas evo- cadas por 30 nM de CXCL12 sozinho (quadrado aberto) e ligante de GPCRXx sozinho em doses indicadas (círculo preenchido). O gráfico de soma foi representado como uma linha quebrada com triângulos inver- tidos. Diferenças estatisticamente significativas entre a soma (triângulo invertido) e cotratamento (quadrado preenchido) em cada ponto foram determinadas através de Teste t de Student. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; dados representam média + SD (n = 3).
[0253] FIGURAS 17a a 17c: Não mostram aprimoramento da res- posta de cálcio em células que coexpressam CXCR4 e GPCRx medi- ante coestimulação com seus respectivos agonistas. Células MDA-MB- 231 foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e APLNR (Figura 17a), CXCR4 e PTGER3 (Figura 17b), ou CXCR4 e SSTR2 (Figura 17c). Células foram cultivadas por 3 dias, manchadas com corante Cal 6, e foram tratadas com CXCL12 sozinho (20 nM), do- ses crescentes de apelina-13, PGE2 ou octreotida sozinhos, ou doses crescentes de apelina-13, PGE2 ou octreotida em combinação com 20 nM de CXCL12. Mobilização de cálcio foi medida com o uso de FlexS- tation 3. A soma representa o valor aditivo calculado das respostas evo- cadas por 20 nM de CXCL12 sozinho (quadrado aberto) e ligante de GPCRx sozinho em doses indicadas (círculo preenchido). O gráfico de soma foi representado como uma linha quebrada com triângulos inver- tidos. Diferenças estatisticamente significativas entre a soma (triângulo invertido) e cotratamento (quadrado preenchido) em cada ponto foram determinadas através de Teste t de Student. Nenhuma diferença esta- tística foi observada em nenhum ponto. Dados representam média + SD (n=3).
[0254] FIGURAS 18a a 18b: Mostram o aprimoramento da resposta de cálcio em células MDA-MB-231 de tipo selvagem mediante coesti- mulação com CXCL12 e histamina. (Figura 18a) Células MDA-MB-231 foram estimuladas com CXCL12 (100 nM), histamina (10 nM) ou CXCL12 e histamina juntas, e respostas de Ca2+ elicitadas por CXCR4 e HRH1 endógenos foram medidas. (Figura 18b) Mobilização de cálcio foi quantificada calculando-se a área sob a curva (AUC) de cada gráfico. A soma representa o valor aditivo calculado das respostas evocadas por cada agonista. Os dados representam três experimentos independentes realizados em três exemplares (média + SEM). Diferença estatistica- mente significativa entre a soma e cotratamento foi determinada através de Teste t de Student. *P < 0,05.
[0255] FIGURAS 19a a 19b: Mostram migração aprimorada de cé- lulas MDA-MB-231 em resposta a uma coestimulação com CXCL12 (30 nM) e histamina (50 nM). Células MDA-MB-231 foram transduzidas com 1 MOI de lentivírus que codifica CXCRA4, e migração quimiotática das células em direção ao CXCL12, histamina, CXCL12 e histamina juntos na presença ou ausência de pirilamina (1 UM), um agonista inverso de HRH1 seletivo, foi avaliada. Quimiotaxia foi quantificada contando-se as células migradas na superfície inferior da membrana de 10 campos por câmara. (Figura 19a) Uma imagem representativa de cada grupo. (Fi- gura 19b) Embora a própria histamina não induza a migração das célu- las MDA-MB-231, a mesma aumentou significativamente a migração das células mediante coestimulação com CXCL12. A migração aprimo- rada de células MDA-MB-231 ocorreu devido ao HRH1 endógeno, visto que a adição de pirilamina (1 UM), um agonista inverso de HRH1 sele- tivo, aboliu completamente a resposta aprimorada. Os dados represen- tam média + SEM (n = 3 ou 5). Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas através de Teste t de Student. *P < 0,05.
[0256] FIGURA 20: Mostra supressão eficiente da resposta de cál- cio aprimorada através de cotratamento de anticorpo anti-CXCR4 e an- tagonista de ADRB2 quando células que expressam heterômero CXCRA4-ADRB2 foram simultaneamente estimuladas com agonista de CXCL12 e ADRB2. Células MDA-MB-231 foram cotransduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e ADRB2. Células foram tratadas com antagonista de ADRB2 (Carvedilol), anticorpo anti-CXCR4 (12G5),
ou veículo de concentração indicada e incubadas com Cal 6 por 2 horas. Células foram estimuladas subsequentemente com quantidades indica- das CXCL12, agonista de ADRB2 (Salmeterol) ou agonista de CXCL12 e ADRB2.
[0257] FIGURAS 21a a 21b: Mostram a detecção de heterômero CXCR4-GPCR por PLA em células U-2 OS que superexpressam CXCR4 e GPCRx. Células U-2 OS que expressam CXCR4-GFP foram transduzidas com adenovírus que codificam CHRM1 ou HRH1 em dife- rentes MOIs por 2 dias. Subsequentemente, PLA foi realizado em célu- las U-2 OS que coexpressam CXCR4-GPCRXx com o uso de anticorpos de CXCR4 e GPCRx específicos. O sinal de PLA aumentou, em propor- ção, ao nível de expressão de CHRM1 (Figura 21a) e HRH1(Figura 21b) em uma maneira dependente de dose.
[0258] FIGURAS 22a a 22b: (Figura 22a) Mostra imagens de três camundongos que foram transplantados com uma célula parental A549, AS49-CXCR4 que superexpressa CXCR4 estavelmente e A549- CXCRA4-ADRB2 que superexpressa estavelmente heterômero CXCR4- ADRB?2, respectivamente, em 28 dias após transplante; (Figura 22b) Mostra o gráfico que compara crescimento tumoral entre células trans- plantadas da Figura 22a; crescimento tumoral foi monitorado todo ter- ceiro ou quarto dia medindo-se o comprimento (L) e largura (W) do tu- mor e que calcula o volume tumoral com base na seguinte Fórmula: Vo- lume = 0,5 LW?. Os resultados são apresentados como a média + desvio padrão de 3 indivíduos.
[0259] FIGURAS 23a a 23g: Mostra resposta de cálcio em células MDAMBZ231 que coexpressam CXCR4 e GPCRx mediante coestimula- ção com CXCL12 e ligante endógeno para GPCRx. Células MDAMB231 foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e HA-VC, GPCRx e HA-VC, ou CXCR4 e GPCRx, em que GPCRx representa ADCYAP1R1 (PAC1) (Figura 23a), ADORAZB (Figura 23b), ADORA3
(Figura 23c), CHRM1 (Figura 23d), EDNRB (Figura 23e), MLNR (Figura 23f), e TACR3 (Figura 239).
[0260] FIGURAS 24a a 24b: Mostram resposta de cálcio em células MDAMB231 que coexpressam CXCR4 e ADCYAP1R1 mediante coes- timulação com seus ligantes endógenos seletivos. Células MDA-MB- 231 foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e ADCYAP1R1. (Figura 24a) Células foram tratadas com PACAP38 (1 NM, ligante endógeno seletivo ADCYAP1R1) sozinho, doses crescentes de CXCL12 sozinho ou doses crescentes de CXCL12 em combinação com 1 nM de PACAP38. (Figura 24b) Células foram tratadas com CXCL12 sozinho, doses crescentes de PACAP38 sozinho ou doses crescentes de PACAP38 em combinação com 15 nM de CXCL12.
[0261] FIGURAS 25a a 25b: Mostram resposta de cálcio em células MDA-MB-231 que coexpressam CXCR4 e TACR3 mediante coestimu- lação com seus ligantes endógenos seletivos. Células MDA-MB-231 fo- ram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e TACR3. (Fi- gura 25a) Células foram tratadas com neurocinina B (0,4 NM, ligante endógeno seletivo TACR3) sozinha, doses crescentes de CXCL12 so- zinho ou doses crescentes de CXCL12 em combinação com 0,4 nM de neurocinina B. (Figura 25b) Células foram tratadas com CXCL12 sozi- nho (30 nM), doses crescentes de neurocinina B sozinha ou doses cres- centes de neurocinina B em combinação com 30 nM de CXCL12.
[0262] FIGURAS 26a a 26b: Mostram a validação de edição de gene CXCR4 e HRH1 mediada por CRISPR/Cas9 em células MDA-MB-
231. (Figura 26a) Células MDA ºXCR4+, HRH- foram geradas rompendo-se o gene HRH1 em células MDA-MB-231 que expressam estavelmente CXCRA4 (MDA XCRi*), transduzindo-se lentivírus que codificam Cas9 e RNA-guia que alveja HRH1. A ausência de HRH1 funcional foi confir- mada medindo-se respostas de cálcio mediante exposição à histamina. (Figura 26b) Gene CXCRA4 foi editado em células MDA-MB-231 com o uso de sistema CRISPR/Cas-9 e expressão de CXCRA4 foi detectada com o uso de immunoblotting.
[0263] FIGURAS 27a a 27b: Mostram resposta de cálcio aprimo- rada em células MDA-MB-231 mediante cotratamento com CXCL12 e histamina é anulada na ausência de HRH1. (Figura 27a) Células MDAMB231 que superexpressam estavelmente células de CXCR4 (MDA ºXºR4*) qu MDA ºXºRt* reduzidas com HRH1 com o uso de sistema CRISPR/Cas9 (MDA CXCR4+, HRH1-) foram tratadas com CXCL12 sozinho (50 nM), concentrações crescentes de histamina ou histamina e CXCL12 juntos. (Figura 27b) Células MDA º*ºR** ou células MDA CXCR+, HRH1- foram tratadas com histamina sozinha (15 nM), concentrações crescentes de CXCL12, ou CXCL12 e histamina juntas.
[0264] FIGURAS 28a a 28b: Mostram resposta de cálcio aprimo- rada em células MDA-MB-231 mediante cotratamento com CXCL12 e histamina é anulada na ausência de CXCRA. (Figura 28a) Células MDA- MB-231 (MDA “!) ou células MDA Y' reduzidas com CXCR4 com o uso de sistema CRISPR/Cas9 (MDA ºXCR4-) foram tratadas com histamina sozinha (15 nM), concentrações crescentes de CXCL12, ou histamina e CXCL12 juntos. (Figura 28b) Células MDA-MB-231 ou células MDA CXCR4- foram tratadas com CXCL12 sozinho (100 nM), concentrações crescentes de histamina sozinha ou CXCL12 e histamina juntos, e res- postas de Ca2+ foram medidas.
[0265] FIGURAS 29a a 29b: Mostram efeito antitumoral de inibidor de CXCRA, inibidor de ADRB2, ou inibidor de CXCR4 e ADRB2 em ca- mundongos transplantados com linha celular AS49-CXCR4-ADRB2 que superexpressa estavelmente heterômero CXCR4-ADRB2. A Figura 29a é um gráfico que compara taxas de crescimento tumoral para o efeito antitumoral in vivo de inibidor de CXCRA4, LY2510924, inibidor de ADRB?2, Carvedilol, ou combinação de LY2510924 e Carvedilol. A Fi- gura 29b é um gráfico que compara taxas de crescimento tumoral para o efeito antitumoral de inibidor de CXCRA4, AMDO7O, inibidor de ADRB?2, Carvedilol, ou combinação de AMDO70 e Carvedilol. Crescimento tumo- ral foi monitorado todo terceiro ou quarto dia medindo-se o comprimento (L) e largura (W) do tumor e calculando-se o volume tumoral com base na seguinte Fórmula: Volume = 0,5 LW?. Os resultados são apresenta- dos como a média + desvio padrão de 10 indivíduos.
[0266] A menos que seja indicado de outra forma, o seguinte inclui abreviações para termos divulgados no presente documento: leucemia mieloide aguda (AML), Receptor de Adenosina A3 (ADORA3), Receptor de Adenosina A2b (ADORAZB), sistema de alta produtividade de ade- novírus (AdHTS), Receptor Tipo | (ADCYAP1R1) de Polipeptídeo de Ati- vação de Adenilato Ciclase 1 (Pituitário),), Adrenoceptor Alfa 1A (ADRA1A), Adrenoceptor Beta 2 (ADRB2), Receptor de Apelina (APLNR), Receptor de quimiocina atípico 3 (ACKR3), complementação de fluorescência bimolecular (BIFC), Transferência de energia de resso- nância de bioluminescência (BRET), albumina de soro bovino (BSA), Receptor de Calcitonina (CALCR), células-tronco cancerígenas (CSCs), receptor tipo 2 de C-C quimiocina (CCR2), receptor do tipo quemerina quimiocina 1 (CMKLR1), Receptor Colinérgico Muscarínico 1 (CHRM1), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), do- ença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Receptor de Complemento C5a 1 (CSAR1), fragmento de terminal C de Vênus (VC), ligante de qui- miocina de motivo C-X-C 12 (CXCL12), receptor CXC 4 (CXCRA4), antí- geno associado ao linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4), receptor de 3-opi- oide (OPRD), Receptor Tipo B de Endotelina (EDNRB), ensaio imuno- absorvente ligado a enzimas (ELISA), parafina incorporada de formalina fixa (FFPE), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), receptor acoplado à proteína G (GPCR), Receptor de Galanina 1 (GALR1), glioblastoma multiforme (GBM), Receptor de Glucagon (GCGR), tecnologia de identificação de heterômero GPCR (GPCR-HIT),
fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), células-tronco hematopoiéticas (HSCs), carcinoma hepatocelular (HCC), Receptor de Histamina H1 (HRH1), vírus da imunodeficiência humana (HIV), União Internacional do Comitê de Farmacologia Básica e Clínica sobre No- menclatura de Receptor e Classificação de Fármaco (NC-IUPHAR), re- ceptor de p-opioide (MOR), Receptor de Motilina (MLNR), Mieloma múl- tiplo (MM), multiplicidade de infecção (MOI), Síndromes Mielodisplásti- cas (MDS), Receptor de Neurotensina 1 (NTSR1), linfoma de não Hod- gkin (NHL), câncer pulmonar de célula não pequena (NSCLC), fragmen- tos de terminal N de Vênus (VN), célula derivada de paciente (PDC), Enxerto Derivado de Paciente (PDX), tomografia de emissão de pósitron (PET), Tomografia computadorizada (CT), ligante de morte celular pro- gramada 1 (PD-L1), proteína de morte celular programada 1 (PD-1), Re- ceptor de Prostaglandina E 2 (PTGER2), Receptor de Prostaglandina E 3 (PTGER3), ensaio de ligação de proximidade (PLA), ração em cadeia de polimerase quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR), tomogra- fia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT), linfoma linfo- cítico pequeno (SLL), câncer pulmonar de célula pequena (SCLC), Re- ceptor de Somatostatina 2 (SSTR2), fator derivado de célula estromal 1 (SDF-1), lúpus eritematoso sistemático (SLE), Receptor de Taquicinina 3 (TACR3), ciclos de limite (Ct), FRET de prazo estabelecido (TR- FRET), microambiente tumoral (TME), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), células de músculo liso vasculares (VSMC), síndrome de WHIM (Verrugas, Hipogamaglobulinemia, Infecções, e Mielocatexe), proteína de fluorescência verde (GFP) e proteína de fluorescência ama- rela (YFP).
MODO PARA A INVENÇÃO
[0267] CXCRA4 tem papeis importantes em formação e progressão de tumor, porém, o desenvolvimento de antagonistas de CXCR4 como fármacos anticâncer não tem sido bem-sucedido, possivelmente devido aos efeitos colaterais e falta de eficácia dentro de faixas de dose acei- táveis. Recentemente, vários heterômeros CXCR4-GPCR com proprie- dades fisiológicas e farmacológicas distintas foram relatados, porém, seus papeis em biologia de câncer ou possibilidades para desenvolver terapêutica anticâncer que alveja heterômeros CXCR4-GPCR não fo- ram claramente entendidas.
[0268] Tradicionalmente, acredita-se que GPCRs funcionem como monômeros que interagem com proteínas G hetero-triméricas mediante ligação de ligante, e fármacos foram desenvolvidos com base em GPCRs monoméricos ou homoméricos (Milligan 2008). Esta visão se alterou drasticamente através das constatações de que GPCRs podem formar heterômeros, e heteromerização é obrigatória para alguns GPCRs. A heteromerização de GPCR é conhecida por alterar a matu- ração de GPCR e entrega em superfície celular, afinidade de ligação de ligante, intensidade de sinalização e trajetórias, assim como dessensi- bilização e reciclagem de receptor (Terrillon e Bouvier 2004; Ferre et al., 2010; Rozenfeld e Devi 2010; Gomes et al., 2016; Farran 2017). Dife- rentes heterômeros de GPCR exibem propriedades funcionais e farma- cológicas distintas, e a heteromerização de GPCR pode variar depen- dendo dos tipos de célula, tecidos e doenças ou afecções patológicas (Terrillon e Bouvier 2004; Ferre et al., 2010;Rozenfeld e Devi 2010; Go- mes et al., 2016; Farran 2017). Agora a heteromerização de GPCR é considerada um fenômeno geral, e decifrar a heteromerização de GPCR abre novas vias para entender a função, fisiologia, papeis de receptor em doenças e afecções patológicas. Consequentemente, a identifica- ção de heterômeros de GPCR e suas propriedades funcionais oferece nova oportunidade para desenvolver novos produtos farmacêuticos ou para encontrar novos usos de fármacos velhos com menos efeitos co- laterais, maior eficácia e seletividade de tecido aumentada (Ferre et al., 2010; Rozenfeld e Devi 2010; Farran 2017).
[0269] A identificação de heterômero de GPCR autêntico exige ava- liação intensiva e crítica.
Para distinguir heterômeros de GPCR de sim- ples associação de GPCRs, pesquisadores neste campo e da União In- ternacional do Comitê de Farmacologia Básica e Clínica sobre Nomen- clatura de Receptor e Classificação de Fármaco (NC-IUPHAR) declara- ram heterômero de GPCR como “complexo macromolecular composto por pelo menos duas unidades de receptor (funcionais) [protômeros] com propriedades bioquímicas que são demonstravelmente diferentes daquelas de seus componentes individuais” e estes heterômeros exis- tem no tecido nativo (Ferre et al., 2009; Gomes et al., 2016; Pin et al., 2007). Os pesquisadores propuseram três critérios para demonstrar he- terômeros de GPCR: (1) Heterômeros devem exibir colocalização e in- teração apropriadas para permitir alosterismo com o uso de coimuno- precipitação, hibridização in situ, ou técnicas com base em proximidade que incluem ensaios de ligação de proximidade em células/tecidos que expressam ambos receptores e não em células/tecidos que carecem de um dos receptores; (2) Heterômeros devem exibir propriedades distin- tas, tais como alterações em sinalização, ligação de ligante e/ou diape- dese, apenas em células/tecidos que expressam ambos receptores, po- rém, não em células/tecidos que carecem de um dos receptores; e (3) Reagentes de heterômero seletivo devem alterar propriedades especií- ficas de heterômero.
Reagentes de heterômero seletivo incluem anticor- pos de heterômero seletivo, peptídeos permeáveis em membrana e li- gantes bivalentes/bifuncionais (Gomes et al., 2016; Pin et al., 2007). Embora diversos heterômeros de GPCR tenham sido identificados in vitro com o uso de receptores recombinantes expressos em células he- terólogas, apenas alguns demonstraram propriedades inovadoras e pouquíssimos mostraram evidência para heteromerização de GPCR em tecido nativo devido a problemas da técnica (Gomes et al., 2016). NC- IUPHAR anunciou que deveria ser fornecida evidência que satisfaça pelo menos dois dos três critérios acima para aprovação de novos he- terômeros de GPCR (Pin et al., 2007).
[0270] Conforme divulgado no presente documento, para estabele- cer se o critério 1 de 3 é atendido (com relação a possibilidade de os componentes de heterômero colocalizarem e interagirem fisicamente, seja diretamente ou por meio de proteínas intermediárias que atuam como condutos para alosterismo) na determinação da presença/existên- cia de um heterômero CXCR4-GPCRXx, um ou mais dentre os seguintes métodos podem ser utilizados para, inclusive, porém, sem limitação: en- saios de cointernalização; ensaios de colocalização (que determinam colocalização dos portômeros de receptor dentro de um compartimento celular) tal como hibridização in situ, imuno-histoquímica ou microscopia imunoeletrônica; ensaios com base em proximidade, tais como técnicas biofísicas com base em proximidade, que incluem transferência de ener- gia de ressonância (RET), RET de bioluminescência (BRET), RET de fluorescência (FRET), RET de fluorescência de prazo estabelecido (TR- FRET), FRET auxiliado por anticorpo, FRET auxiliado por ligante, com- plementação de fluorescência bimolecular (BIFC) e ensaios de ligação de proximidade (PLA); ensaios coimunoprecipitação; ou animais fluo- rescentes. Por exemplo, BiFC, ensaio de cointernalização ou PLA, fo- ram utilizados para avaliar se um heterômero CXCR4-GPCRx atendeu o critério 1 de 3.
[0271] Conforme divulgado no presente documento, para estabele- cer se o critério 2 de 3 é atendido (com relação a possibilidade de um heterômero exibir propriedades distintas daquelas dos protômeros indi- viduais), tal como um heterômero CXCR4-GPCRx que resulta em uma sinalização a jusante aprimorada, por exemplo, uma mobilização de cál- cio aprimorada (tal como determinado por um ensaio de mobilização de cálcio), uma abordagem dualista foi utilizada nestes heterômeros CXCR4-GPCRx que atenderam ao critério 1 de 3 abordado acima: (1)
determinar a presença/ausência de uma sinalização a jusante aprimo- rada, por exemplo, uma mobilização de cálcio aprimorada (sinergismo) no contexto de protômero individual - comparando-se a mobilização de cálcio em células que coexpressam HA-VC e um dos protômeros (seja CXCRA4 ou GPCRx) mediante (a) coestimulação com CXCL12 e o res- pectivo agonista seletivo, com relação à (b) estimulação com CXCL12 sozinho ou o respectivo agonista seletivo sozinho; e (2) determinar a presença/ausência de uma sinalização a jusante aprimorada, por exem- plo, uma mobilização de cálcio aprimorada (sinergismo) no contexto de heterômero CXCR4-GPCRx - comparando-se a mobilização de cálcio em células que coexpressam CXCR4 e GPCRx mediante (a) coestimu- lação com CXCL12 e o respectivo agonista seletivo, com relação à (b) soma de estimulação com o CXCL12 sozinho ou o respectivo agonista seletivo sozinho.
Conforme divulgado no presente documento, para atender ao critério 2 de 3 e ser considerado um heterômero CXCR4- GPCRx que resulta em uma sinalização a jusante aprimorada, por exemplo, uma mobilização de cálcio aprimorada, deve haver (1) uma ausência de uma sinalização a jusante aprimorada, por exemplo, uma mobilização de cálcio aprimorada em qualquer contexto de protômero (isto é, o contexto de CXCR4 e HA-VC ou o contexto de GPCRx e HA- VC), e (2) uma presença de uma sinalização a jusante aprimorada, por exemplo uma mobilização de cálcio aprimorada no contexto de heterô- mero CXCR4-GPCRx.
Tanto no contexto de protômero quanto no con- texto de heterômero CXCR4-GPCRXx, a concentração de CXCL12 utili- zada para estimular as células (seja como um único agente ou em com- binação com o respectivo agonista de GPCRx seletivo) e a concentra- ção do agonista de GPCRx seletivo (seja um agonista endógeno ou um agonista seletivo conhecido para o respectivo GPCRx) utilizada para es- timular as células (seja como um único agente ou em combinação com CXCL12) estão independentemente em uma concentração de 100x a concentração de EC50 ou inferior. Por exemplo, a concentração de CXCL12 utilizada para estimular as células (seja como um agente único ou em combinação com o respectivo agonista de GPCRx seletivo) es- tava em uma concentração de 15 nM (que é aproximadamente a con- centração de EC50 contra CXCR4).
[0272] Conforme divulgado no presente documento, para estabele- cer se o critério 3 de 3 é atendido (com relação a possibilidade de que os reagentes de heterômero seletivos devem alterar propriedades es- pecíficas de heterômero) na determinação da presença/existência de um heterômero CXCR4-GPCRx, células derivadas de paciente, que atenderam ao critério 1 de 3 e 2 de 3, são afetadas na presença de um antagonista (um antagonista de CXCRA4, um antagonista de GPCRx ou um antagonista de heterômero CXCR4-GPCRx), tal como afetar a pro- liferação celular das células derivadas de paciente que contêm um he- terômero CXCR4-GPCRx.
[0273] Em algumas modalidades, o método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, conforme divulgados no presente documento, incluem ou dependem de estabele- cer que uma associação de CXCR4 e um GPCRx em uma célula atende pelo menos dois dos seguintes critérios ou características para serem considerados um heterômero CXCR4-GPCRXx, que compreende: 1) os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula colocali- zam e interagem fisicamente, seja diretamente ou por meio de proteínas intermediárias que atuam como condutos para alosterismo, conforme determinado por meio de um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação ou um ensaio ani- mal fluorescente; 2) uma quantidade aprimorada de mobilização de cál- cio, de modo que: a) CXCRA4 ou o respectivo GPCRx em um contexto de protômero individual em uma célula, mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo, resulte em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx se- letivo; e b) o heterômero CXCR4-GPCRx exibe uma mobilização de cál- cio aprimorada mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo em relação à soma de quantidades de mo- bilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; conforme de- terminado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio; ou 3) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: i) altera propriedades específicas de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx em uma cé- lula derivada de um paciente; ii) altera função específica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula derivada de um paciente; ili) altera propriedades específicas de heterômero de uma célula deri- vada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; ou iv) diminui a proliferação celular de uma célula (ou células) derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
Em algumas mo- dalidades, o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera propriedades específicas de heterômero do heterômero CXCRA4- GPCRx em uma célula derivada de paciente, conforme determinado por pelo menos um dos seguintes métodos: PLA, ensaios de ligação de ra- dioligante, ensaios de ligação de [35S]GTP-yS, ensaio de cálcio, ensaio CAMP, ensaio GTPase, ativação de PKA, ensaios de fosforilação de ERK1/2 e/ou AKt/PKB, ensaios de fosforilação de Src e STAT3, ensaio de CRE-repórter, ensaio de NFAT-RE-repórter, ensaio de SRE-repórter, ensaio de repórter SRF-RE, ensaio de repórter NF-kB-RE, ensaio de fosfatase alcalina secretada, ensaio de produção de 1-fosfato de inosi- tol, ensaio de atividade de adenilila ciclase, análise de expressão de gene-alvo através de RT-PCR, RT-qPCR, RNAseg, sequenciamento de próxima geração (NGS) ou micromatriz.
Em algumas modalidades, o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera função especí- fica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula deri- vada de paciente, conforme determinado por pelo menos um dos se- guintes métodos: PLA, ensaios de ligação de radioligante, ensaios de ligação de [35S]GTP-yS, ensaio de cálcio, ensaio cAMP, ensaio GTPase, ativação de PKA, ensaios de fosforilação de ERK1/2 e/ou AKt/PKB, ensaios de fosforilação de Src e STAT3, ensaio de CRE-re- pórter, ensaio de NFAT-RE-repórter, ensaio de SRE-repórter, ensaio de repórter SRF-RE, ensaio de repórter NF-KkB-RE, ensaio de fosfatase al- calina secretada, ensaio de produção de 1-fosfato de inositol, ensaio de atividade de adenilila ciclase, análise de expressão de gene-alvo atra- vés de RT-PCR, RT-9PCR, RNAseq ou micromatriz.
Em algumas mo- dalidades, o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera propriedades específicas de heterômero de uma célula derivada de pa- ciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx, conforme determi- nado por pelo menos um dos seguintes métodos: ensaios sobre prolife- ração, migração, invasão e resistência ao fármaco (sobrevivência) de células cancerígenas, modulação de função de célula imune, angiogê- nese, vasculogênese, metástase, resistência ao fármaco, micromatriz de tecido (TMA) e interação de microambiente de tumor de célula can- cerígena (TME). Por exemplo, em algumas modalidades, o método de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit far- macêutico, conforme divulgados no presente documento, incluem ou dependem de estabelecer que uma associação de CXCR4 e um GPCRx em uma célula atende pelo menos dois dos seguintes critérios ou carac- terísticas para serem considerados um heterômero CXCR4-GPCRXx, que compreende: 1) os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula colocalizam e interagem fisicamente, seja diretamente ou por meio de proteínas intermediárias que atuam como condutos para alosterismo, conforme determinado por meio de um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, complementação de fluores- cência biomolecular (BIFC) ou um ensaio de ligação de proximidade (PLA); 2) uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio, de modo que: a) CXCRA4 ou o respectivo GPCRx em um contexto de pro- tômero individual em uma célula, mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo, resulte em uma quanti- dade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quanti- dades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de ago- nista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; e b) o heterômero CXCR4-GPCRx exibe uma mobilização de cálcio apri- morada mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo em relação à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio; ou 3) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: i) altera propriedades específicas de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula derivada de um paciente; ii) altera função específica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula derivada de um paciente; ili) altera pro- priedades específicas de heterômero de uma célula derivada de um pa- ciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; ou iv) diminui a proli- feração celular de uma célula (ou células) derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
Em algumas modalidades, o mé- todo de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, conforme divulgados no presente documento, incluem ou dependem de estabelecer que uma associação de CXCR4 e um GPCRx em uma célula atende aos critérios 1 e 2 para serem conside-
rados um heterômero CXCR4-GPCRx. Em algumas modalidades, o mé- todo de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, conforme divulgados no presente documento, incluem ou dependem de estabelecer que uma associação de CXCR4 e um GPCRx em uma célula atende aos critérios 1 e 3 para serem conside- rados um heterômero CXCR4-GPCRx. Em algumas modalidades, o mé- todo de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, conforme divulgados no presente documento, incluem ou dependem de estabelecer que uma associação de CXCR4 e um GPCRx em uma célula atende aos critérios 2 e 3 para serem conside- rados um heterômero CXCR4-GPCRx. Em algumas modalidades, o mé- todo de tratamento, método de supressão, composição farmacêutica ou kit farmacêutico, conforme divulgados no presente documento, incluem ou dependem de estabelecer que uma associação de CXCR4 e um GPCRx em uma célula atende aos critérios 1, 2 e 3 para serem consi- derados um heterômero CXCR4-GPCRx.
[0274] Conforme divulgado no presente documento, o heterômero CXCR4-GPCRx que atende pelo menos dois dos três critérios pode ter, causar ou produzir uma sinalização a jusante aprimorada. A sinalização a jusante aprimorada pode ser o resultado do heterômero CXCR4- GPCRx, tal como do agonismo do heterômero CXCR4-GPCRx, do ago- nismo de CXCR4 do heterômero CXCR4-GPCRx, do agonismo de GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx e/ou do agonismo de CXCR4 e agonismo de GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx. Em algumas mo- dalidades, a sinalização a jusante aprimorada pode ser a jusante do CXCRA, do respectivo GPCRx ou do heterômero CXCR4-GPCRx. Em algumas modalidades, a sinalização a jusante aprimorada pode ser do heterômero CXCR4-GPCRXx, com relação à sinalização a jusante de um protômero de CXCRA4 ou um respectivo protômero de GPCRx em seu respectivo contexto de protômero individual. Em algumas modalidades,
a sinalização a jusante aprimorada pode ser do heterômero CXCR4- GPCRx, com relação à sinalização a jusante de um protômero de CXCR4 em um contexto de protômero individual. Em algumas modali- dades, a sinalização a jusante aprimorada pode ser do heterômero CXCR4-GPCRXx, com relação à sinalização a jusante de um respectivo protômero de GPCRx em um contexto de protômero individual. Em al- gumas modalidades, a sinalização a jusante aprimorada pode ser do heterômero CXCR4-GPCRXx, com relação à sinalização a jusante de um protômero de CXCR4 e um respectivo protômero de GPCRx em seu respectivo contexto de protômero individual. A sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRXx, pode, em algumas mo- dalidades, ser suprimida no paciente com câncer, tal como suprimida nas células cancerígenas de um paciente. Em algumas modalidades, a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRXx, pode ser uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio (ou quantidade sinérgica de mobilização de cálcio), que pode ser determi- nada através de um ensaio de Ca2+ intracelular, tal como um ensaio de mobilização de cálcio.
[0275] Conforme divulgado no presente documento, o heterômero CXCR4-GPCRx que atende pelo menos dois dos três critérios pode ter, causar ou produzir uma sinalização a jusante aprimorada, em que a si- nalização a jusante aprimorada é uma quantidade aprimorada de mobi- lização de cálcio. A quantidade aprimorada de mobilização de cálcio do heterômero CXCR4-GPCRXx pode ser uma quantidade de mobilização de cálcio que, mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, é pelo menos 10% maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
Em algumas modalidades, a quantidade aprimo- rada de mobilização de cálcio do heterômero CXCR4-GPCRx pode ser uma quantidade sinérgica de mobilização de cálcio que, mediante coes- timulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, é pelo menos 10% maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
Por exem- plo, a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio (ou quantidade sinérgica de mobilização de cálcio) do heterômero CXCR4-GPCRx pode ser uma quantidade de mobilização de cálcio que, mediante coes- timulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, é pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, pelo menos 90% maior, pelo menos 100% maior, pelo menos 150% maior, ou pelo menos 200% maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
Em algumas modalidades, a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio (ou quantidade sinér- gica de mobilização de cálcio) do heterômero CXCR4-GPCRx pode ser uma quantidade de mobilização de cálcio que, mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, pode ser entre 10 e 100% maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio, por exem- plo, pode ser uma quantidade de mobilização de cálcio que, mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx sele- tivo, pode ser entre 25 e 100% maior, 50 e 100% maior, 75 e 100%
maior, ou 100 e 200% maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas célu- las com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, con- forme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
[0276] Em algumas modalidades, de acordo com o método de tra- tamento, método de supressão, composição farmacêutica, ou kit farma- cêutico, conforme divulgados no presente documento, o heterômero CXCR4-GPCRx atende pelo menos dois dos três critérios, desse modo, se tem, causa ou produz uma sinalização a jusante aprimorada, em que a sinalização a jusante aprimorada é uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio, de modo que: a) o CXCR4 ou o respectivo GPCRx, em um contexto de protômero individual na célula, mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx sele- tivo, resulte em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; e b) o heterômero CXCR4-GPCRx exibe uma mo- bilização de cálcio aprimorada mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo em relação à soma de quan- tidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de ago- nista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio. Por exemplo, em algumas modalidades, a sinalização a jusante aprimo- rada do heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio, de modo que: i) a mobilização de cálcio do pro- tômero CXCR4 ou GPCRXx, no contexto de protômero individual na cé- lula, é não sinérgica, conforme determinado por meio de ensaio de mo- bilização de cálcio; e ii) a mobilização de cálcio do heterômero CXCR4- GPCRXx na célula é sinérgica, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio. Em algumas modalidades, o contexto de protômero individual pode ser: a) o protômero individual CXCR4 na célula, na ausência do respectivo protômero individual GPCRx; ou b) o respectivo protômero individual GPCRx na célula, na ausência do pro- tômero individual CXCRA4; mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo, resultam em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio. Em algu- mas modalidades, o contexto de protômero individual pode ser, inde- pendentemente: a) o protômero individual CXCRA4 na célula, na ausên- cia do respectivo protômero individual GPCRx; e b) o respectivo protô- mero individual GPCRx na célula, na ausência do protômero individual CXCRA4; mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo ago- nista de GPCRx seletivo, resultam em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio. Por exemplo, em algumas modalidades, o heterômero CXCR4-GPCRx, mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, pode resul- tar em uma quantidade de mobilização de cálcio que é maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo ago- nista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
[0277] O termo “CXCR4”, conforme usado no presente documento se refere ao Receptor de quimiocina de motivo C-X-C 4, também iden- tificado pelos identificadores (IDs) de banco de dados único e nomes alternativos, conforme mostrado na Tabela 1 (Chatterjee et al., 2014;
Debnath et al., 2013; Domanska et al., 2013; Guo et al., 2016; Peled et al., 2012; Roccaro et al., 2014; Walenkamp et al., 2017).
[0278] O termo “GPCRX”, conforme usado no presente documento, se refere aos GPCRs que foram usados neste estudo para investigar se estes GPCRs interagem com CXCR4 e mostram propriedades distintas daquelas de protômeros individuais que incluem ADCYAP1R1 (Recep- tor Tipo I ADCYAP), ADORAZB (Receptor de Adenosina A2b), ADORA3 (Receptor de Adenosina A3), ADRB2 (Adrenoceptor Beta 2), APLNR (Receptor de Apelina), CSAR1 (Receptor 1 de Complemento C5a), CALCR (Receptor de Calcitonina), CCR5 (Receptor de quimiocina (mo- tivo C-C) 5), CHRM1 (Receptor Colinérgico Muscarínico 1), GALR1 (Re- ceptor de Galanina 1), EDNRB (Receptor de Endotelina Tipo B), HRH1 (Receptor de Histamina H1), MLNR (Receptor de Motilina), NTSR1 (Re- ceptor de Neurotensina 1), PTGER?2 (Receptor de Prostaglandina E 2), PTGER3 (Receptor de Prostaglandina E 3), SSTR2 (Receptor de So- matostatina 2), e TACR3 (Receptor Taquicinina 3), também identifica- dos pelos identificadores (IDs) de banco de dados único e nomes alter- nativo, conforme mostrado na Tabela 1 e na Tabela 2.
[0279] A Tabela 1 mostrada abaixo fornece a nomenclatura de GPCRx que forma heterômeros com CXCR4 e aprimora sinergicamente a resposta de Ca2+ mediante coestimulação com ambos agonistas, e a Tabela 2 mostrada abaixo fornece a nomenclatura de GPCRx que forma heterômeros com CXCRA, porém, não aprimora sinergicamente a res- posta de Ca2+ mediante coestimulação com ambos agonistas. TABELA 1 ee eee me e - FF Receptor de quimio- membranas Derivado de Leucócito|GCID: GCO2M136114HGNC:| 4 Iídeo 3; Receptor de Fator 1 Derivado/ENSGO0000121966OMIM: de Célula Estromal; Receptor de quif162643UniProtKB: P61073 Imiocina (motivo C-X-C) 4; Receptor del
[Sete Hélices de Transmembrana del Proteína 3 Associada ao LPS; Recep. lor de quimiocina C-X-C Tipo 4; Re. lceptor de Neuropeptídeo Y Y3; Recep. ltor de Neuropeptídeo Y3; Receptor de |Quimiocina; Receptor de Segmento de [Sete Transmembranas, Baço; Recep. or de quimiocina (motivo C-X-C) 4| |Fusina); Receptor SDF-1; Antígeno lCD184; Fusinay LAP-3; LESTR;) NPYRL; FB22; HM89; LCRI) D28201E; HSY3RR; NPYY3R;CXC.
R4; CXCR4; CD184; NPY3R) HIMS; LAP3; NPYR; WHIM Receptor Tipo | de Polipeptídeo de Ati ração de Adenilato Ciclase 1 (Pituitá lio); Receptor de Tipo 1 de Polipeptí deo de Ativação de Adenilato Ciclase Pituitário; Receptor de Tipo 1 de PAÍGCID: — GC07P031058HGNC; Receptor Tipo 1 [CAP; Receptor de PACAP 1; PACAP-242Entrez Gene: 117Ensembi ADCYAPIR1 ADCYAP RR1; Hiphop de Receptor Tipo | de PodENSGO0000078549O0MIM: lipeptídeo de Ativação de Adenilato Ci102981UniProtKB: P41586 lclase 1 Pituitário; Receptor Tipo 1 de Polipeptídeo de Ativação de Adenilato) lCiclase Pituitário; PACAP-R-1; PACA.
PRI;PACAPR; PACIR; PAC1 [6CID: * GC17P015927HGNC: ADORASB Receptor de Adeno- o ao a ensina ab; ADORABÍE ENTSZ Gene: 136Ensembl sina A2b IENSGO0000170425OMIM: 600446UNiProtKB: P29275 [GCID: — GCO1MT111499HGNC: Receptor de Adeno- 68Entrez Gene: 140Ensembl:: ADORA3 Receptor de Adenosina A3; AGAR sina A3 |ENSGO0000282608OMIM: Adrenérgico, Beta-2-, Receptor, Su- berfície; Beta-2 —Adrenorreceptor; Adrenoceptor —Beta-2; —“ADRB2RjGCID: — GCO5P148825HGNC: [B2AR; Adrenoceptor Beta 2, Superfil286Entrez Gene: 154Ensemb! ADRB2 Adrenoceptor Beta 2 lie; Superfície de Adrenoceptor BetalENSGO00000169252OMIM: |2; Receptor Adrenérgico Beta-2; ReJ109690UniProtKB: PO7550 leptor de Catecolamina; BETAZAR; ADRBR; BAR Receptor de Componente 5a de Com lemento 1; Receptor de ComponenteleCID: — GC19P047290HGNC: CSARI Receptor de Comple-|5 de Complemento 1 (ligante C5a)1338Entrez Gene: 728Ensemb! mento C5a 1 — Receptor Quimiotático de Anafilatod=ENSGO0000197405OMIM: lina 1 C5a; Receptor Quimiotático del1 13995UniProtKB: P21730 Anafilatoxina C5a; Receptor de Com ponente 5 de Complemento 1; Recep- ltor de Anafilatoxina C5a; C5a-R;C5R1; |C5AR; Antígeno CD88; Ligante C5a; |CD88; C5a IGCID: GCO07M093424HGNC: Receptor de Calcito- 1440Entrez Gene: 799Ensembl: CALCR |CT-R; CTR1; CRT; CTR nina |IENSGO0000004948OMIM: [1 14131UniProtKB: P30988 IGCID: GC11M062927HGNC: IReceptor de Acetilcolina, Muscarínico| Receptor Colinérgico 1950Entrez Gene: 1128Ensembl!: CHRM1 (1; Receptor de Acetilcolina Muscarí- Muscarínico 1 |IENSGO0000168539OMIM: hico M1; HM1; MIR; M1 [1 18510UniProtKB: P11229 I|Tipo Não Seletivo de Receptor de En- IGCID: GC13M077895HGNC: dotelina; ET-BR; ET-B;ETRB; Subtipo| Receptor de Endote- |3180Entrez Gene: 1910Ensemb!. EDNRB B1 de Receptor de Endotelina; AB- lina Tipo B |IENSGO0000136160OMIM: |CDS; HSCR2; ETB1; ETBR; WS4A;) [131244UniProtKB: P24530 HSCR; ETB IGCID: GCO3PO011113HGNC: YR |HH1R; H1IR; Receptor de Histamina, Receptor de Hista- |5182Entrez Gene: 3269Ensemb!. HRH1 ISubclasse H1; Receptor de Histamina| mina H1 |IENSGO00000196639OMIM: H1; HisH1; H1-R 600167 UniProtKB: P35367 IGCID: GC13P049220HGNC: Receptor Acoplado à Proteína G 38; M495Entrez Gene: 2862Ensembl!: MLNR Receptor de Motilina [GPR38; MTLR1; Receptor Acoplado à| IENSGO0000102539OMIM: Proteína G 38; MTLR 602885UniProtKB: 043193 [Receptor de Neurotensina Insensitivo| de Levocabastina de Alta Afinidade;|GCID: GC20P062708HGNC: NTSR1 Receptor de Neuro- [Receptor de Neurotensina 1 (Alta Afil8039Entrez Gene: 4923Ensembl. tensina 1 idade); NT-R-1; NTR1; NTRH; RejENSGO0000101188OMIM: |ceptor de Neurotensina Tipo 1;NTRR;/162651UniProtKB: P30989
INTR IGCID: GCO4M103586HGNC: [Beta Receptor de Neurocinina; Recep- 11528Entrez —Gene: 6870En Receptor de Taquici- tor de Neurocinina B; Receptor NK-3; TACR3 embl: nina 3 INK-3R; NK3RNKR; Receptor de Neu- IENSGO00000169836OMIM: Iromedina-K; TAC3RL; TAC3R; HH11 162332UniProtKB: P29371 *GCID: Identificação Genecards HGNC: Comitê de Nomenclatura de Gene HUGO TABELA 2 Nome completo | aumostames es |Receptor Acoplado à Proteína| CID: GC11M057233HGNC; IG HG11; Receptor Tipo 1 de ' B39Entrez Gene: 187Ensembl; APLNR Receptor de Apelina|Angiotensina Il; Receptor Tipo| IEENSGO0000134817OMIM: 1 de Angiotensina; Receptor| 600052UniProtKB: P35414 de APJ (Apelina); Receptor
Acoplado à Proteína G APJ; IReceptor Acoplado à Proteína| IG APJ; Receptor Órfão HG11; IReceptor APJ; AGTRL1; APJ; APJR; HG11 IReceptor Tipo 5 de quimiocina| |IC-C; Receptor de quimiocina| |ICCR5; Receptor de quimiocina| ltmotivo C-C) 5 (Gene/Pseudo- Igene); Receptor 5 de quimio- CID: GCO3PO46382HGNC:| . , |ecinade motivo C-C A159A; Re- Receptor de Quimio-| . 1606Entrez Gene: 1234Ensembl; CCR5 lceptor de quimiocina CCRS5| cina (Motivo C-C) 5 IENSGO0000160791OMIM: IDelta32; Antígeno de CD195; 601373UniProtKB: P51681 |Correceptor de Fusão de HIV. 1; CC-CKR-5; ChemRi3; |ICMKBRS5; CCR-5; C-C CKR-5; |CCCKR5; IDDM22; CD195; ICKR-5; CKR5 CID: GC18P077250HGNC; IGALNR1; GAL1-R; GALR-1; Receptor de Gala- 1132Entrez Gene: 2587Ensembl: GALR1 IGALNR; Receptor Tipo 1 de nina 1 IENSGO0000166573OMIM: |Galanina 60037 7UniProtKB: P47211 |Receptor de Prostaglandina E) 2 (Subtipo EP2), 53kDa; Re- |ceptor de Prostaglandina E 2) CID: GC14P052314HGNC; (Subtipo EP2), 53kD; Subtipo| Receptor de Prosta- PS594Entrez Gene: 5732Ensembl; PTGER2 IEP2 de Receptor de PGE?2; glandina E 2 IENSGO0000125384OMIM: ISubtipo EP2 de Receptor de 176804UniProtKB: P43116 |PGE; Receptor de Prostanoide)| |EP2; Subtipo EP2 de Recepto! Ide Prostaglandina E2; EP2 IReceptor de Prostaglandina E| 13 (Subtipo EP3); Subtipo del| IReceptor EP3 de PGE2; Re- lceptor EP3 de Prostanoide;| |PGE2-R; Isoforma de Subtipo/GCID: GCO1MO070852HGNC: PTGERS Receptor de Prosta-|3 de Receptor EP3 de Prosta-P595Entrez Gene: 5733Ensemb:!: glandina E 3 lglandina E; Subtipo de Recep-ENSGO00000050628OMIM: Itor EP3 de Prostaglandina E2;1 76806UniProtKB: P43115 IReceptor de Prostaglandina| (PGE-2); Receptor de PGE, ISubtipo EP3; Subtipo EP3 del IReceptor de PGE; EP3-lII;
oo BRST |EP3e; EP3
EEE EST gsTRa — | Receptor do Somar tostatina Tipo 2: 8s.2.,!1331Entrez Gene: 6752Ensembl] tostatina 2 ss2-R IEENSGO0000180616OMIM: 182452UniProtKB: P30874 *GCID: Identificação Genecards HGNC: Comitê de Nomenclatura de Gene HUGO
[0280] Informações adicionais com relação aos GPCRs avaliados no presente documento como heterômeros com CXCR4 são detalhadas abaixo:
[0281] (1) ADCYAP1R1 -- Receptor de tipo | de polipeptídeo de ati- vação de adenilato ciclase pituitário também conhecido como PAC1, é uma proteína que, em seres humanos, é codificada pelo gene de ADCYAP1R1. Este receptor se liga ao peptídeo de ativação de adenilato ciclase pituitário. ADCYAP1IR1 é uma proteína associada à membrana e compartilha homologia significativa com membros da família de recep- tor de glucagon/secretina de classe B acoplada à proteína G. Este re- ceptor media diversas ações biológicas de polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 e é positivamente acoplado à adenilato ciclase (Vau- dry et al., 2000). Este é um receptor para PACAP-27 e PACAP-38. À atividade deste receptor é mediada por proteínas G que ativam adenilil ciclase. ADCYAP1R1 pode regular a liberação de adrenocorticotropina, hormônio luteinizante, hormônio de crescimento, prolactina, epinefrina e catecolamina. ADCYAP1R1 pode ter um papel em espermatogênese e motilidade de esperma. ADCYAP1R1 causa relaxamento de músculo liso e secreção no trato gastrointestinal (Ogi et al., 1993).
[0282] ADCYAP1R1 é expresso na medula adrenal, ácino pancreá- tico, útero, plexo mientérico e cérebro (Reubi, 2000; Reubi et al., 2000). O mesmo também é expresso nos gânglios trigêmeos, ótico e cervical superior (pré-juncional) e nas artérias cerebrais (pós-juncionais) (Knuts- son e Edvinsson, 2002). Doenças associadas ao ADCYAP1R1 incluem distúrbio de estresse pós-traumático (Lowe et al., 2015) e distúrbio de ansiedade. Dentre suas trajetórias relacionadas estão eventos de sina- lização de G alfa (ou alfas) e sinalização de RET (Cooper et al., 2013).
[0283] (2) ADORAZB -- O receptor de adenosina A2B, também co- nhecido como ADORAZB, é um receptor de adenosina acoplado à pro- teina G, e também denota o gene de receptor de adenosina A2b hu- mano que o codifica o mesmo. Adenosina funciona como uma molécula de sinalização através da ativação de quatro receptores de adenosina distintos - ADORA1, ADORAZA, ADORAZB, e ADORA3, também deno- minados A1, A2A, A2B e A3, respectivamente. Esta proteína de mem- brana integral estimula atividade de adenilato ciclase na presença de adenosina. Esta proteína também interage com netrina-1, que é envol- vida em alongamento de axônio. Estes receptores são amplamente ex- pressos e estiveram implicados em diversas funções biológicas, tanto fisiológica quanto patológica. Ambos receptores ADORA2A e ADORAZB são importantes em imunologia de câncer. O microambiente tumoral é hipóxico, que promove a expressão de CD39 e CD73 através de células imunológicas. CD39 e CD73 são ectonucleotidases que con- vertem ATP em adenosina, que eleva as concentrações de adenosina localmente. Adenosina é um mediador crucial de função imunológica al- terada em câncer conforme se liga aos receptores ADORAZ2A e ADORAZB em linfócitos que silenciam a resposta imunológica antitumo- ral (Chen et al., 2013).
[0284] ADORAZB tem um papel na regulação de expressão de CXCRA in vivo e na proteção contra formação de lesão vascular (Yang et al., 2008) e promove progressão de câncer oral humano (Kasama et al., 2015). Identificação de um eixo geométrico Fra-1/ADORAZB farma- cologicamente tratável que promove metástase de câncer de mama (Desmet et al., 2013). Receptores ADORAZB exibem altos níveis de ex- pressão no ceco, cólon e bexiga, com níveis inferiores no pulmão, vasos sanguíneos e olho (Fagerberg et al., 2014).
[0285] (3) ADORA3 -- O receptor de adenosina A3, também conhe- cido como ADORAS3, é um receptor de adenosina, mas também denota o gene humano que codifica o mesmo. Receptores ADORA3 são recep- tores acoplados à proteína G que se acoplam ao Gi/Gq e estão envolvi- dos em uma variedade de trajetórias de sinalização intracelular e fun- ções fisiológicas. O mesmo media uma função cardioprotetora prolon- gada durante isquemia cardíaca, está envolvido na inibição de desgra- nulação de neutrófilo em lesão de tecido mediada por neutrófilo, esteve implicado em ambos efeitos neuroprotetor e neurodegenerativo, e pode também mediar tanto proliferação celular quanto morte celular (Gao et al., 2008; Miwatashi et al., 2008).
[0286] Cordicepina induz apoptose em células cancerígenas de be- xiga humana por meio de ativação de receptores ADORAS3 (Cao et al, 2017). Jafari et al., mostrou que agonista de receptor ADORA inibiu a sobrevivência de células-tronco de câncer de mama por meio de traje- tória de GLI-1 e ERK1/2 (Jafari et al., 2017). ADORA3 é amplamente expressa em tecidos adrenais (RPKM 4.4), intestino delgado (RPKM
2.9) e 20 outros tecidos que abrangem cérebro, bexiga, gânglio linfático e cólon (Fagerberg et al., 2014).
[0287] (4) ADRB2 -- O receptor adrenérgico beta-2 (adrenorreceptor B2), também conhecido como ADRB2, é um receptor beta-adrenérgico que abrange membrana celular que interage com epinefrina, um hormô- nio e neurotransmissor (sinônimo de ligante, adrenalina) cuja sinaliza- ção, por meio de uma interação de canal de cálcio do tipo L a jusante, media respostas fisiológicas, tais como relaxamento de músculo liso e broncodilatação (Gregorio et al., 2017). ADRB2 funciona no sistema muscular, tal como relaxamento de músculo liso, terminais de nervo mo- tor, glicogenólise e no sistema circulatório, tal como contração de mús-
culo cardíaco, aumento de débito cardíaco. No olho normal, a estimula- ção beta-2 através de salbutamol aumenta pressão intraocular por meio de malha. No sistema digestivo, o ADRB2 induz glicogenólise e gluco- neogênese em fígado e secreção de insulina do pâncreas (Fitzpatrick, 2004).
[0288] Sinalização de ADRB2 no miócito cardíaco é modulada por interações com CXCRA4 (LaRocca et al., 2010). Norepinefrina atenua ex- pressão de CXCRA4 e a invasão correspondente de células MDA-MB- 231 de câncer de mama por meio de ADRB2 (Wang et al., 2015a). ADRB?2 é expresso em diversos cânceres, tais como pancreático, de próstata (Braadland et al., 2014; Xu et al., 2017), renal e de câncer de mama (Choy et al., 2016).
[0289] (5) CSAR1 -- O receptor C5a também conhecido como re- ceptor 1 de componente 5a complementar (CSAR1) ou CD88 (Agrupa- mento de Diferenciação 88) é um receptor acoplado à proteína G para C5a. O mesmo funciona como um receptor complementar. CSAR1 mo- dula respostas inflamatórias, obesidade, desenvolvimento e cânceres. (Gerard e Gerard, 1994).
[0290] O C5AR1 é expresso em granulócitos, monócitos, células dendríticas, linha celular derivada de hepatoma HepG2, astrócitos, mi- cróglia (Klos et al., 2013). CSAR1 é relacionado em diversas doenças, tais como doença intestinal inflamatória, artrite reumatoide, psoríase, encefalomielite alérgica experimental, esclerose múltipla, meningite e trauma cerebral (Lee et al., 2008).
[0291] (6) CALCR -- O receptor de calcitonina (CT) é um receptor acoplado à proteína G que se liga à calcitonina de hormônio peptídico e está envolvido na manutenção de homeostase de cálcio, particular- mente com relação à formação óssea e metabolismo (Dacquin et al., 2004; Davey et al., 2008). CT funciona ativando-se as proteínas G Gs e Gq frequentemente encontradas em osteoclastos, em células no rim e em células em diversas regiões do cérebro. O mesmo também pode afetar os ovários em mulheres e nos testículos em homens. A atividade deste receptor é mediada por proteínas G que ativam adenilil ciclase. Acredita-se que o receptor de calcitonina se acople à proteína de ligação ao trifosfato de guanosina heterotrimérico que é sensível à toxina de cólera. Os efeitos fisiológicos de CT, tais como inibição de reabsorção óssea mediada por osteoclasto ou excreção de Ca2+ aumentada pelo rim são mediados por CTs de alta afinidade (Albrandt et al., 1995).
[0292] A mutação de perda de função em CT identifica glioblastoma altamente agressivos com resultado ruim (Pal et al., 2018). Expressão de CTRs em glândula mamária, cartilagem, nariz e ouvido foi relatada. A regulação de desenvolvimento de expressão de gene CALCR em uma variedade dos tecidos acima sugere um papel para CTRs na morfogê- nese desses tecidos (Pondel, 2000).
[0293] (7) CHRM1 -- Os receptores colinárgicos muscarínicos per- tencem a uma família maior de receptores acoplados à proteína G. À diversidade funcional desses receptores é definida pela ligação de ace- tilcolina e inclui respostas celulares, tais como inibição de adenilato ci- clase, degeneração de fosfoinositida e mediação de canal de potássio. Receptores muscarínicos influenciam diversos efeitos de acetilcolina no sistema nervoso central e periférico (Rang, 2003). O receptor colinárgico muscarínico 1 é envolvido na mediação de broncoconstrição vagal- mente induzida e na secreção ácida do trato gastrointestinal. O mesmo é encontrado, predominantemente, ligado às proteínas G de classe Gq que usam regulação ascendente de fosfolipase C e, portanto, trisfosfato de inosito| e cálcio intracelular como uma trajetória de sinalização (Qin et al., 2011).
[0294] Receptores muscarínicos são amplamente distribuídos ao longo do corpo e controlam funções distintas de acordo com a localiza- ção e subtipo (CHRM1 a CHRMB5). Os mesmos são predominantemente expressos no sistema nervoso parassimpático quando exercem ambos efeitos inibidor e excitatório. Este receptor se encontra mediando o po- tencial pós-sináptico de baixa excitação no gânglio no nervo pós-gangli- ônico, é comum nas glândulas exócrinas e no CNS (Johnson, 2002). Doenças associadas ao CHRM1 incluem asma e bloqueio cardíaco, do- ença congênita e de Pelizaeus-Merzbacher. Ativadores de receptores de acetilcolina muscarínicos CHRM1 (mMAChRs) podem fornecer trata- mentos inovadores para esquizofrenia e mal de Alzheimer (Marlo et al., 2009).
[0295] (8) EDNRB -- Receptor tipo B de endotelina (ETB) foi clonado logo após o receptor de ETA (EDBRA). De maneira similar ao EDNRA, o mesmo pertence à classe A de receptores hepta-helicoidais acoplados à proteína G com uma terminação amino externa e terminação carbóxi interna e sítios de ligação intrínsecos às porções hepta-helicoidais do receptor. Similar ao EDNRA, o agonista endógeno ET-1 tem uma alta afinidade para o EDNRB. A farmacologia do receptor EDNRB é de al- guma forma mais rica que aquela do EDNRA, em que múltiplos agonis- tas do EDNRB são reconhecidos, que incluem sarafotoxina 6c (S6c) e IRL1620. Antagonistas seletivos do EDNRB incluem BQ788, A192621, RES7011, e IRL2500. O EDNRB esteve localizado nos tecidos cardio- vasculares, no sistema pulmonar, neurônios, ossos, pâncreas e rim (Watts, 2010).
[0296] EDNRB é um receptor acoplado à proteína G que ativa um segundo sistema mensageiro de fosfatidilinositol-cálcio. Seu ligante, en- dotelina, consiste em uma família de três peptídeos vasoativos poten- tes: ET1, ET2, e ET3. Em células melanocíticas o gene de EDNRB é regulado pelo fator de transcrição associado à microftalmia. Mutações em qualquer gene são ligações com a síndrome de Waardenburg (Sato- Jin et al., 2008). O distúrbio multigênico, doença de Hirschsprung tipo 2, ocorre devido à mutação em gene de EDNRB (Tanaka et al., 1998).
Doenças associadas ao EDNRB incluem síndrome de Waardenburg, síndrome de Abcd e Tipo 4A. Dentre suas trajetórias relacionadas estão a trajetória de sinalização de cálcio e regulação e síntese de prostaglan- dina da Síndrome de Waardenburg (Sato-Jin et al., 2008).
[0297] (9) HRH1 -- O receptor H1 é um receptor de histamina que pertence à família de receptores acoplados à proteína G como rodop- sina. Este receptor é ativado pela histamina de amina biogênica. O HRH1 é ligado a uma proteína G intracelular (Gq) que ativa fosfolipase C e a trajetória de sinalização de trifosfato de inositol (IP3). Anti-hista- minas, que atuam neste receptor, são usadas como fármacos antialér- gicos. A estrutura de crista do receptor foi determinada e usada para constatar novos ligantes de HRH1 em estudos de exame virtual com base na estrutura (de Graaf et al., 2011). Uma subunidade da proteína G subsequentemente se dissocia e afeta o envio de mensagens intra- celular que inclui sinalização a jusante realizada através de vários inter- mediários, tais como AMP cíclico, GMP cíclico, cálcio e fator nuclear kappa B. A mesma funciona em quimiotaxia de célula imune, produção de citocina pró-inflamatória, expressão de moléculas de adesão de cé- lula e outras afecções alérgicas e inflamatórias (Canonica e Blaiss, 2011).
[0298] Em tecidos periféricos, o HRH1 media a contração de mús- culos lisos, aumento em permeabilidade capilar devido à contração de vênulas terminais e liberação de catecolamina da medula adrenal, as- sim como media neurotransmissão no sistema nervoso central. O mesmo também é conhecido por contribuir para a patofisiologia de do- enças alérgicas, tais como dermatite atópica, asma, anafilaxia e rinite alérgica (Xie e He, 2005). O mesmo é expresso em músculos lisos, em células endoteliais vasculares, no coração e no sistema nervoso central (de Graaf et al., 2011).
[0299] (10) MLNR -- Receptor de motilina é um receptor acoplado à proteína G que se liga à motilina. Motilina, por sua vez, é um peptídeo intestinal que estimula contração de músculo liso intestinal. Além disso, o MLNR media efeitos progastrocinéticos. MLNR é um alvo terapêutico importante para o tratamento de distúrbios de hipomotilidade (Depoor- tere, 2001).
[0300] O mesmo se encontra em suas maiores concentrações nos nervos da parede antral do estômago e também se encontra em níveis significativos ao longo do músculo liso do trato gastrointestinal superior (Kitazawa et al., 1995). Doenças associadas ao MLNR incluem gastro- paresia e neuropatia autonômica diabética (Kitazawa et al., 1997).
[0301] (11) NTSR1 -- Receptor de neurotensina 1 pertence à grande superfamília de receptores acoplados à proteína G. Neurotensina é um peptídeo de 13 aminoácidos originalmente isolado do hipotálamo e de- pois dos intestinos dos bovinos. No cérebro, a neurotensina se encontra, exclusivamente, nas células, fibras e terminais nervosos, enquanto a maior parte da neurotensina periférica se encontra nas células N endó- crinas localizadas no intestino. Injeções centrais ou periféricas de neu- rotensina produzem efeitos farmacológicos completamente diferentes que indicam que o peptídeo não cruza a barreira hematoencefálica. NTSR1 media as múltiplas funções de neurotensina, tal como hipoten- são, hiperglicemia, hipotermia, antinocicepção e regulação de motili- dade e secreção intestinal (Vincent, 1995).
[0302] A sinalização é efetuada através de proteínas G que ativam um segundo sistema mensageiro de fosfatidilinositol-cálcio. A sinaliza- ção resulta na ativação de quinases de MAP a jusante e protege as cé- lulas contra apoptose (Heakal et al., 2011). Swift et al., mostrou que a expressão alterada de receptores de neurotensina é associada ao es- tado de diferenciação de câncer de próstata (Swift et al., 2010).
[0303] (12) PTGER?2 -- Receptor 2 de Prostaglandina E2, também conhecido como EP2, é um receptor de prostaglandina para prostaglan- dina E2 (PGE2) codificado pelo gene humano PTGER2. PTGER?2 é classificado como um tipo relaxante de receptor de prostanoide com base em sua habilidade, mediante ativação, para relaxar determinados tipos de músculo liso. Quando inicialmente ligado ao PGE2 ou qualquer outro de seus agonistas, o mesmo mobiliza proteínas G que contêm o complexo Gas-GBy. Os complexos Gas-GBy se dissociam em suas su- bunidades Gas e GBy que, por sua vez, regulam as trajetórias de sina- lização de célula. Em particular, Gas estimula adenil ciclase a elevar os níveis celulares de CAMP, desse modo, se ativa PKA; PKA ativa vários tipos de moléculas de sinalização, tal como o fator de transcrição CREB, que resultam em diferentes tipos de respostas funcionais dependendo do tipo de célula (Markovic et al., 2017; Woodward et al., 2011). PTGER?2 também ativa a trajetória de GSK-3 que regula as respostas migratória de célula e respostas imunológicas inatas que incluem pro- dução de citocina e interleucina pró-inflamatória e trajetória de beta-ca- tenina que regula não só a adesão de célula em célula, mas também ativa a trajetória de sinalização de Wnt que, por sua vez, estimula a transcrição de genes responsáveis pela regulação de migração e proli- feração de célula (Woodward et al., 2011).
[0304] O receptor PTGER2 pode atuar como um promotor tumoral. Camundongos com knockout de gene PTGER2 têm menos cânceres de pulmão, mama, pele e cólon depois da exposição aos carcinógenos. Knockout deste gene em camundongos com a mutação de polipose coli adenomatosa também causa uma diminuição no tamanho e número de pólipos intestinais pré-cancerígenos que os animais desenvolvem. Es- tes efeitos são normalmente atribuídos à perda de: produção de fator de crescimento endotelial vascular mediada por PTGER?2 e, desse modo, de vascularização tumoral; regulação de motilidade e sobrevivência de célula endotelial; interferência com a atividade anti-proliferação celular do fator de crescimento de transformação-B; e, mais recentemente, re- gulação de respostas imunes antitumorais de hospedeiro (O'Callaghan e Houston, 2015).
[0305] PTGER?2 é amplamente distribuído em seres humanos. Sua proteína é expressa no intestino delgado humano, pulmão, meios de artérias e arteríolas do rim, timo, útero, córtex cerebral, estriado cere- bral, hipocampo cerebral, epitélio córneo, coriocapilares córneos, célu- las de miométrio, eosinófilos, esclera do olho, cartilagem articular, o corpo cavernoso do pênis, e células de músculo liso da via respiratória; seu mRNA é expresso em fibroblastos gengival, células dendríticas de- rivadas de monócito, aorta, corpo cavernoso do pênis, cartilagem arti- cular, músculo liso da via respiratória e células epiteliais da via respira- tória. Em ratos, a proteína receptora e/ou mMRNA se encontrou no pul- mão, baço, intestino, pele, rim, fígado, ossos longos e extensivamente ao longo do cérebro e outras partes do sistema nervoso central (Yagami et al., 2016).
[0306] Estudos pré-clínicos indicam que PTGER?2 pode ser um alvo para tratar e/ou prevenir distúrbios humanos particulares que envolvem: doenças alérgicas, tais como asma (síndromes de asma induzidas por fármaco inflamatório não esteroide e aspirina particular) e rinite (Ma- chado-Carvalho et al., 2014); glaucoma (Doucette e Walter, 2017); vá- rias doenças do sistema nervoso (Yagami et al., 2016); fraturas, osteo- porose e outras anormalidades ósseas (Li et al., 2007); fibrose pulmo- nar; determinadas formas de doença maligna, tal como câncer do cólon que inclui aqueles que surge de mutações de polipose coli adenomatosa (O'Callaghan e Houston, 2015); e formas de hipertensão sensíveis a sal (Yang e Du, 2012); Este receptor também foi sugerido como um alvo para contracepção (Sugimoto et al., 2015).
[0307] (13) TACR3 -- Receptor de taquicinina 3, também conhecido como TACR3, funciona como receptores para taquicininas. As taquici- ninas são uma família de peptídeos que compreendem a substância P (SP), neurocinina A (NKA), neurocinina B (NKB) e as espécies diver- gentes de endocininas que incluem endocinina B (EKB) em seres hu- manos. Estas taquicininas são codificadas em três diferentes genes, pré-protaquicinina 1 (TAC1) que codifica SP e NKA, TAC3 que codifica NKB e TACA4 que codifica EKB. Três receptores de taquicinina foram identificados, que interagem com estas taquicininas: TACR1, TACR2 e TACR3, também chamadas NK1, NK2 e NK3, respectivamente, em que SP e EKB mostram a maior potência para TACR1, NKA para TACR2 e NKB para TACR3. Afinidades de receptor são especificadas por varia- ções na extremidade 5' da sequência. Receptor-3 de taquicinina (TACR3) é o mediador de ações biológicas codificadas pela sequência de terminal C de taquicininas, para a qual neurocinina B é um agonista mais potente que a neurocinina A ou substância P (Page et al., 2003).
[0308] É relatado que quatro pedigrees humanos com grave defici- ência de gonadotropina congênita e falha púbere, em que todos os indi- víduos afetados são homozigotos para mutações de perda de função em TAC3 (que codifica neurocinina B) ou seu receptor TACR3 (que co- difica NK3R) (Topaloglu et al., 2009). NKB, um membro da família de taquicinina relacionada à substância P, é conhecido por ser altamente expresso em neurônios hipotalâmicos que também expressam kisspep- tina (Goodman et al., 2007), um regulador recentemente identificado de secreção de hormônio de liberação de gonadotropina (Gianetti e Semi- nara, 2008).
[0309] (14) APLNR -- O receptor de apelina (também conhecido como o receptor APJ) é um receptor acoplado à proteína G que se liga à apelina e Apela/ELABELA/Toddler (Medhurst et al., 2003). Receptor para hormônios de apelina (APLN) e ligante endógeno precoce de re-
ceptor de apelina (APELA) acoplados às proteínas G que inibem ativi- dade de adenilato ciclase. APLNR tem um papel principal no desenvol- vimento precoce, tal como gastrulação e morfogênese cardíaca, atu- ando-se como um receptor para hormônio de APELA. APLNR também tem um papel em vários processos em adultos, tais como regulação de formação de vaso sanguíneo, pressão sanguínea, contratilidade cardí- aca e falha cardíaca atuando-se como um receptor para o hormônio de APLN. Uma década de investigações mostrou que o sistema apelinér- gico tem uma faixa ampla de funções biológicas, com um papel impor- tante particularmente na manutenção de homeostase do sistema cardi- ovascular e metabolismo de fluido. A ativação de APLNR provoca um espectro amplo de alterações bioquímicas que incluem supressão de cAMP, fosforilação de proteína quinase B (Akt), ERK1/25 e p70S6K, mobilização de cálcio 7 e sintase de óxido nítrico (NOS). No entanto, a especificidade que liga estas atividades bioquímicas a uma determinada função biológica ainda deve ser determinada (Wang et al., 2015c).
[0310] Além disso, a mesma funciona em angiogênese embrionária e tumoral (Wu et al., 2017) e como um correceptor de vírus da imuno- deficiência humana (HIV-1) (Zhou et al., 2003). Tanto APLNR quanto apelina são expressos em diversos tecidos que incluem tecido cardíaco, pulmonar, endotelial, renal e cerebral (Wang et al., 2015c).
[0311] (15) COCR5 -- Receptor de quimiocina C-C tipo 5, também co- nhecido como CCR5 ou CD195, é uma proteína na superfície de glóbu- los brancos que é envolvida no sistema imunológico conforme o mesmo atua como um receptor para quimiocinas. Este é o processo pelo qual as células T são atraídas ao tecido específico e alvos de órgão. Diversas formas de HIV, o vírus que provoca AIDS, usam inicialmente CCR5 para entrar e infectar células hospedeiras. Determinados indivíduos carre- gam uma mutação conhecida como CCR5-432 no gene CCR5, que os protege contra essas cepas de HIV. Determinadas populações herda- ram a mutação Delta 32 que resulta na deleção genética de uma porção do gene CCR5. Veículos homozigotos desta mutação são resistentes às cepas M-trópicas de infecção por HIV-1 (Hutter et al., 2009). Ligantes cognatos de CCR5 incluem CCL3, CCL4 (também conhecidos como MIP 1a e 18, respectivamente), e CCL3L1. CCRB5 interage, adicional- mente, com CCLS5 (Struyf et al., 2001).
[0312] É provável que CCR5 tenha um papel em respostas inflama- tórias para infecção, embora seu papel exato em função imunológica normal não esteja claro. Regiões desta proteína também são cruciais para ligação de ligante de quimiocina, resposta funcional do receptor e atividade de correceptor de HIV (Barmania e Pepper, 2013). CCR5 é predominantemente expresso em células T, macrófagos, células den- dríticas, eosinófilos, micróglia e uma subpopulação de células de câncer de mama ou próstata (Sicoli et al., 2014; Velasco-Velazquez et al. 2012).
[0313] (16) GALR1 -- Receptor de Galanina 1 (GAL1) é um receptor acoplado à proteína G codificado pelo gene GALR1. A galanina de neu- ropeptídeo onipresente controla diversas funções, tais como secreções endócrinas, motilidade intestinal e atividades comportamentais. Estes efeitos reguladores de galanina são mediados através da interação com receptores de membrana específicos e envolvem as proteínas de liga- ção ao nucleotídeo guanina sensíveis à toxina de tosse convulsa Gi/Go como elementos de transdução (Habert-Ortoli et al., 1994).
[0314] GALR1 tem efeitos antiproliferativos em carcinoma de célula escamosa oral. Proteína de GALR1 e expressão de mRNA e secreção de GAL foram detectadas em níveis variáveis em queratinócitos orais humanos imortalizados e linhas celulares de carcinoma de célula esca- mosa orofaríngea humana. Mediante inibição competitiva de GALR1,
proliferação foi regulada de modo crescente em queratinócitos imortali- zados e malignos (Henson et al., 2005)
[0315] Stevenson et al., relata o marcador e regulador de célula tronco, galanina e GALR1 como peças determinantes da resistência ao fármaco e potenciais alvos terapêuticos para combate à resistência ao fármaco. Mecanisticamente, identificam um papel inovador para o eixo geométrico de receptor e ligante de galanina GALR1 como um impor- tante regulador a montante da expressão da proteína antiapoptótica FLIPL. Clinicamente, mMRNA de galanina se mostrou superexpresso em tumores colorretais, e notavelmente, a alta expressão de mRNA de ga- lanina se correlacionou com a fraca sobrevivência isenta de doença na doença em estágio precoce (Stevenson et al., 2012). GALR1 é ampla- mente expresso no cérebro e medula espinhal, assim como em sítios periféricos, tais como o intestino delgado e coração (Fagerberg et al., 2014)
[0316] (17) PTGER3 -- Receptor de prostaglandina EP3 (53 kDa), também conhecido como EP3, é um receptor de prostaglandina para prostaglandina E2 (PGE2) codificada pelo gene humano PTGER3; é um dos quatro receptores de EP identificados, em que os outros são PTGER1, PTGER2 e PTGERA4, também chamados EP1, EP2 e EPA, respectivamente, em que todos estes se ligam com e mediam respostas celulares para PGE2 e também, porém, geralmente com menos afini- dade e capacidade resposta, determinados outros prostanoides. Ativa- ção de PTGER3 promove secreção duodenal em camundongos; esta função é mediada por ativação de PTGER3 em seres humanos. As fun- ções de receptor de EP podem varia com a espécies e a maioria dos estudos funcionais citados aqui não traduziram seus modelos de animal e tecido em seres humanos (Moreno, 2017).
[0317] Estudos dos efeitos diretos de ativação de PTGER3 sobre câncer em modelos de animal e tecido geraram resultados contraditó- rios que sugerem que este receptor não tem um papel importante na carcinogênese. No entanto, alguns estudos sugeriram uma função pró- carcinogênica indireta para o PTGER3: O crescimento e metástase de células de carcinoma pulmonar de Lewis implantadas, uma linha celular de câncer pulmonar em camundongo, é suprimido em camundongos deficientes de PTGER3. Este efeito estava associado a uma redução nos níveis de fator de crescimento endotelial vascular e expressão de metaloproteinase-9 matricial no estroma do tumor; expressão do fator de crescimento pró-linfangiogênico, VEGF-C e seu receptor, VEGFR3; e uma angiogênese e linfangiogênese associada ao tumor (O'Callaghan e Houston, 2015).
[0318] PTGER3 é amplamente distribuído em seres humanos. Sua proteína e/ou mMRNA são expressos no rim (isto é, glomérulos, túbulos convolutos distais tardios negativos de proteína Tamm-Horsfall, seg- mentos de conexão, dutos de coleta cortical e medular, meios e células endoteliais de artérias e arteríolas); estômago (músculo liso vascular e células mucosais de fundo gástrico); tálamo (anterior, ventromedial, la- terodorsal, paraventricular e núcleo medial central); epitélio mucosal in- testinal no ápice de criptas; miométrio (células estromais, células endo- teliais e, na gravidez, placenta, córion e âmnio); fibroblastos gengivais da boca; e olho (endotélio córneo e queratócitos, células trabeculares, epitélio ciliar e células estromais conjuntivas e iridais, e células M Tr| ler retinais) (Norel, 2016).
[0319] (18) SSTR2 -- Receptor de somatostatina tipo 2 é uma pro- teína que, em seres humanos, é codificada pelo gene SSTR2. Soma- tostatina atua em diversos sítios para inibir a liberação de diversos hor- mônios e outras proteínas secretoras. Os efeitos biológicos de soma- tostatina são provavelmente mediados por uma família de receptores acoplados à proteína G que são expressos em uma maneira específica de tecido. SSTR2 mostrou interagir com shank2 (Zitzer et al., 1999).
[0320] SSTR?2 codifica receptor de somatostatina que pode inibir a proliferação celular de tumores sólidos. A hipermetilação de promotor SSTR?2 é associada ao risco e à progressão de carcinoma de célula es- camosa laríngea em machos (Shen et al., 2016). A maioria de adeno- mas de pituitário expressam SSTR2, porém, outros receptores de so- matostatina também são encontrados (Miller et al., 1995). Análogos de somatostatina (isto é, octreotida, lanreotida) são usados para estimular estes receptores e, assim, para inibir adicionalmente a proliferação de tumor (Zatelli et al., 2007). SSTR2 é expresso nos maiores níveis no cérebro e rim (Fagerberg et al., 2014).
[0321] O termo “inibidor”, conforme usado no presente documento, se refere à molécula que inibe ou suprime a função aprimorada de he- terômero CXCR4-GPCRx. Exemplos sem limitação do inibidor da inven- ção que podem ser usados para tratamento, amenização ou prevenção de um câncer ou sintomas relacionados incluem antagonista de GPCRx, agonista de GPCRx inverso, modulador alostérico positivo e negativo de GPCRx, anticorpo de heterômero CXCR4-GPCRx específico ou suas porções de ligação de antígeno que incluem arcabouços como an- ticorpo de domínio único, ligantes bivalentes que têm um farmacóforo seletivo para CXCRA4 unidos por um braço espaçador para um farmacó- foro seletivo para GPCRx, anticorpo biespecífico contra CXCR4 e GPCRx, ligante de CXCRA4 radiomarcado ligado ao ligante de GPCRx e ligantes de molécula pequena que inibem sinalização de heterômero se- letivo. Determinados exemplos de inibidores contra GPCRx que formam heterômeros com CXCRA4 e aprimoram a resposta de Ca2+ mediante coestimulação com ambos agonistas são listados na Tabela 3.
[0322] O termo “antagonista”, conforme usado no presente docu- mento, se refere a um tipo de ligante de receptor ou fármaco que blo-
queia ou reduz uma resposta biológica ligando e bloqueando-se um re- ceptor, também denominados bloqueadores. Antagonistas têm afini- dade, porém, nenhuma eficácia para seus receptores cognatos, e sua ligação interrompe a interação e inibe a função de um agonista ou ago- nista inverso nos receptores cognatos. Determinados exemplos de an- tagonistas contra GPCRx que formam heterômeros com CXCRA4 e apri- moram a resposta de Ca2+ mediante coestimulação com ambos ago- nistas são listados na Tabela 3.
[0323] Tabela 3. Exemplos de inibidores contra GPCRx que formam heterômeros com CXCRA4 e aprimoram a resposta de Ca2+ mediante coestimulação com ambos agonistas. TABELA 3 | romena || imaniantamentare | etc | Antagonistas/Agonistas inversos pos/outros ALX40-4C, AMDO7O (AMD11070, X4P-001), AMD3100] Kplerixafor), AMD3465, ATI 2341, BKT140 (BL-8040; ITF14016; 4F-Benzoil-TN14003), CTCE-9908, CX549, D-[Lys3] GHRP-6, FC122, FC131, GMI-1359) IGSK812397, GST-NT21MP, isotioureia-1a, isotioureia|-AD-114, AD-114-6H, AD-114-Im7- [1t (IT1t), KRH-1636, KRH-3955, LY 2510924, MSX-122FH, AD-114-PA600-6H, ALX-O651) CXCR4 IN-[ C]Metil-AMD3465, POL6326, dímero SDF-1 14LY2624587, PF-O6747143, ulol PIP2G]), SDF1 P2G, T134, T140, T22, TC 14012, TG jcuplumabe (MDX1338/BMS-936564),| 10054 (Burixafor), USL311, proteína inflamatória de ma112G5, 238D2 e 238D4 lrófago viral-ll (vMIP-II), WZ811, [“ºCu]l-AMD3100, |ºCul-AMD3465, — [“ºGa]pentixafor, — [*"Y]pentixater) [º*"Tc]O -AMD3100, ["Lu]pentixater e 508MC! (Com.
posto 26).
IM65, Max.d.4, MK-0893, N-estearil-[Nle *], neuroten- ADCYAP1IR1 Isina-(6-11)/VIP-(7-28), PACAP-(6-38) e PG 97-269.
[B-isobutil-8-pirrolidinoxantina, aloxazina, AS16, ASTO, AS74, AS94, AS95, AS96, ASS99, AS10OO, AS101) ATL802, BW-A1433, cafeina, CGS 15943, CPX, CSC,) |CVT-6883, DAX, DEPX, derenofilina, DPCPX, FK-453, |-ABOPX, istradefilina, KF26777, LAS38096, LUF5S981) ADORAZB IMRE 2029F20, MRE 3008F20, MRS1191, MRS1220,) IMRS1523, MRS1706, MRS1754, MSX-2, OSIP339391, ppentoxifilina, preladenant, PSB-10, PSB-11, PSB36) |PSB603, PSB-0788, PSB1115, rolofilina, SCH 58261) ISCH442416, ST-1535, teofilina, tonapofilina, vipade.
Inant, composto de xantina e amina, XCC e ZM-241385, IO E A RE Rr] o
[6883, derenofilina, dexniguldipina, DPCPX, FK453, fla ranona, flavona, galangina, I-ABOPX, istradefilina,) KF26777, LAS38096, LUF5981, MRE 2029F20, MRE BoogF20, MRE 3010F20, MRS1041, MRS1042)| IMRS1067, MRS1088, MRS1093, MRS1097, MRS1177, IMRS1186, MRS1191, MRS1191, MRS1220, MRS1476, IMRS1486, MRS1505, MRS1523, MRS1754, MRS928, IMSX-2, nicardipina, preladenant, PSB-10, PSB-11) PSB36, PSB603, PSB1115, rolofilina, sacuranetina) ISCH 58261, SCH442416, ST-1535, teofilina, tonapofi lina, vipadenant, visnagina, VUF5574, VUF8S504, NVUF8507, composto de xantina e amina, e ZM-241385. Alprenolol, atenolol, betaxolol, bupranolol, butoxamina) larazolol, carvedilo, CGP 12177, cicloprolol, ICI ADRB2 118551, ICYP, labetalo|, levobetaxolo|, levobunolol, LK| 1204-545, metoprolol, nadolol, NIHP, NIP, propafenona propranotol, sotalol, SR59230A e timolol. ABNT, —AcPhe-Om-Pro-D-Cha-Trp-Arg, avacopan) |co8g9, CHIPS, DF2593A, JPE1375, L-156,602) SAR! INDT9520492, N-metil-Phe-Lys-Pro-D-Cha-Trp-D-Arg |cO 2H, PMX205, PMX53, RPR121154 e W54011. la-CGRP-(8-37) (ser humano), ACT87, CT-(8-32) (sal
CALCR sao benzilato de 3-quinuclidinita (QNB), 4-DAMP, aclidínio) AESC90CB, AFDX384, amitriptilina, AQ-RA 741, atro- pina, benzatropina, biperideno, darifenacina, diciclo. mina, dosulepina, etopropazina, glicopirrolato, guanilpi renzepina, hexa-hidrodifenidol, hexa-hidrossiladifenidol, hexocíclio, himbacina, ipratrópio, litocolilcolina, metoc- CHRM1 lramina, ML381, toxina muscarínica 1, toxina muscarí hica 2, toxina muscarínica 3, escopolamina de N-metila, lotenzepade, oxibutinina, p-F-HHSID, pirenzepina, pro. pantelina, (R,R)-quinuclidinil-4-fluorometil-benzilato, es. |lcopolamina, sila-hexocíclio, solifenacina, telenzepina, ti lotrópio, tolterodina, tri-hexifenidila, tripitramina, UH-AH| [37, umeclidínio e VUO255035. A192621, ambrisentan, atrasentan, bosentan (RO EDNRB 470203, Tracleer), BQO788, IRL 2500, K-8794, maciten. lan, RES7011, Ro 46-8443, SB209670, SB217242 (en. rasentan), TAK 044 e tezosentan (RO610612). |-)-clorfeniramina, (+)-clorfeniramina, (-)- trans-H PAT |(+)- cis-H 2-PAT, (+)- trans-H PAT, (£)- cis-H -PAT, (+) ltrans-H -PAT, (R)-cetirizina, (S)-cetirizina, 9-OH-risperi HR dona, A-317920, A-349821, ABT-239, alimemazina) lamitriptilina, aripiprazol, arpromidina, asenapina, aste. mizol, AZD3778, azelastina, BU-E 47, cetirizina, clorfe hiramina, clorpromazina, ciproxifano, clemastina, clo- bempropite, clozapina, conessina, ciclizina, cipro-hepta dina, desloratadina, difenidramina, dosulepina, doxe- bina, epinastina, fexofenadina, flufenazina, fluspirileno, Ihaloperidol, hidroxizina, impromidina, INCB-38579, JNJ.
39758979, cetotifeno, loratadina, loxapina, MK-0249) IMmolindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, pipam.
berona, pitolisante, prometazina, pirilamina, quetiapina, risperidona, sertindol, terfenadina, tioridazina, tiotixeno, lriluoperazina, tripelenamina, triprolidina, ziprasidona e| Iotepina. [MR erros MAZoS e ORE [ rs ecneian sntasa7 stage same [Trp ”, B-Ala *] neurocinina A-(4-10), AZD2624, FK 224) IGR138676, GSK 172981, GSK 256471, N',2-difenilqui.
Inolina-4-carboidrazida 8m, N',2-difenilquinolina4-car- TACR3 |boidrazida, osanetant, PD 154740, PD 161182) |PD157672, saredutant, SB 218795, SB 222200, SB 1235375, SCH 206272, SSR 146977 e talnetant.
[0324] Em algumas modalidades, o método de tratamento de cân- cer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRXx, ou o método de supressão de sinalização a jusante aprimorada de um heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula de um paciente que sofre de câncer, conforme divulgado no presente docu- mento, pode compreender administrar ao paciente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterô- mero CXCR4-GPCRx; em que: i) o heterômero CXCR4-GPCRx tem si- nalização a jusante aprimorada; e ii) o inibidor ou combinação de inibi- dores administrada suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRXx no paciente com câncer. Em algumas mo- dalidades, o kit farmacêutico ou composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, conforme divulgado no presente docu- mento, pode compreender um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; em que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante apri- morada. Por exemplo, em algumas modalidades, o inibidor de CXCR4 é um antagonista de CXCRA4, um agonista inverso de CXCRA4, um anta- gonista parcial de CXCRA4, um modulador alostérico de CXCRA, um an- ticorpo de CXCRA, um fragmento de anticorpo de CXCRA, um ligante de CXCR4 ou um conjugado de anticorpo e fármaco de CXCRA4. Por exemplo, em algumas modalidades, o inibidor de GPCRx é um antago- nista de GPCRx, um agonista inverso de GPCRx, um antagonista par- cial de GPCRx, um modulador alostérico de GPCRx, um anticorpo de GPCRx, um fragmento de anticorpo de GPCRx, um ligante de GPCRx ou um conjugado de anticorpo e fármaco de GPCRx. Por exemplo, em algumas modalidades, o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx é um antagonista do heterômero CXCR4-GPCRx, um agonista inverso do he- terômero CXCR4-GPCRx, um antagonista parcial do heterômero CXCR4-GPCRx, um modulador alostérico do heterômero CXCR4- GPCRX, um anticorpo do heterômero CXCR4-GPCRx, um fragmento de anticorpo do heterômero CXCR4-GPCRXx, um ligante do heterômero CXCR4-GPCRx, um inibidor de interação de proteína-proteína (PPI) do heterômero CXCR4-GPCRx, ou um conjugado de anticorpo e fármaco do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0325] Em algumas modalidades, o método de tratamento, método de supressão, kit farmacêutico ou composição farmacêutica, conforme divulgados no presente documento, inclui uma combinação de inibido- res selecionados dentre o grupo que consiste em: o inibidor de CXCRA, o inibidor de GPCRx e o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx, em que a combinação pode ser em uma composição farmacêutica única ou uma pluralidade de composições farmacêuticas separadas para cada respectivo inibidor. Em algumas modalidades, a combinação de inibido- res compreende o inibidor de CXCR4 e o inibidor de GPCRx. Em algu- mas modalidades, a combinação de inibidores compreende o inibidor de CXCRA4 e o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx. Em algumas mo- dalidades, a combinação de inibidores compreende o inibidor de GPCRx e o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRXx. Em algumas modalidades, a combinação de inibidores é administrada sequencial, concomitante ou simultaneamente. Em algumas modalidades, a combinação de inibido- res é administrada como uma composição farmacêutica que compre- ende adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algu- mas modalidades, a combinação de inibidores é administrada como composições farmacêuticas separadas, em que as composições farma- cêuticas separadas independentemente compreendem adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o método de tratamento, método de supressão, kit farmacêutico, ou com- posição farmacêutica, conforme divulgados no presente documento, compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quanti- dade sub-terapeuticamente eficaz do inibidor de CXCRA, tal como ad- ministrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor de CXCR4 ao paciente. Em algumas modalidades, o método de tratamento, mé- todo de supressão, kit farmacêutico, ou composição farmacêutica, con- forme divulgados no presente documento, compreendem uma quanti- dade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade sub-terapeuticamente eficaz do inibidor de GPCRx, tal como administrar uma quantidade tera- peuticamente eficaz do inibidor de GPCRx ao paciente. Em algumas modalidades, o método de tratamento, método de supressão, kit farma- cêutico, ou composição farmacêutica, conforme divulgados no presente documento, compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade sub-terapeuticamente eficaz do inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx, tal como administrar uma quantidade terapeutica- mente eficaz do inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx ao paciente.
[0326] Em algumas modalidades, o método de tratamento de cân- cer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRXx, conforme divulgado no presente docu- mento, pode compreender: 1) determinar se o paciente tem a célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinali- zação a jusante aprimorada: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente; e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determinar se: i) a célula cancerígena de um pa- ciente que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; ou ii) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: altera propriedades específicas de heterômero ou função do dito heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula (ou células) derivada de um paciente; altera propriedades espe- cíficas de heterômero de uma célula (ou células) derivada de um paci- ente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; ou diminui a prolifera- ção de célula de uma célula (ou células) derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; e 2) se o paciente tem uma cé- lula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx ao paciente com câncer.
Em algumas modalidades, o método de trata- mento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, conforme divulgado no pre- sente documento, pode compreender: 1) determinar se a célula cance- rígena de um paciente contém o heterômero CXCR4-GPCRx: obtendo- se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determinar se o dito heterômero CXCR4-GPCRx está presente na célula cancerígena de um paciente; em que: a) o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é seleci- onado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1IR1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; e b) o ensaio realizado na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernali-
zação, um ensaio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquíi- mica, microscopia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximi- dade, um ensaio de coimunoprecipitação ou um ensaio animal fluores- cente, tal como por meio de um ensaio de cointernalização, complemen- tação de fluorescência bimolecular (BIFC) ou um ensaio de ligação de proximidade (PLA); e 2) se a célula cancerígena de um paciente contém o dito heterômero CXCR4-GPCRXx, então, administrar internamente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx ao paciente. Em algumas mo- dalidades, a amostra biológica de um paciente é uma amostra de fluido biológico ou é uma amostra de tecido biológico. Em algumas modalida- des, uma biopsia líquida é realizada na amostra de fluido biológico ou realizada na amostra de tecido biológico. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico é uma amostra sanguínea, uma amostra plasmática, uma amostra de saliva, uma amostra de fluido cerebral, uma amostra de fluido ocular ou uma amostra de urina. Em determinadas modalidades, a amostra de fluido biológico inclui células tumorais circu- lantes (CTCs), DNA livre de célula derivada de tumor (cfDNA), peque- nos RNAs circulantes e vesículas extracelulares que incluem exosso- mas, de fluidos corporais conforme divulgado, por exemplo, em Campos CDM et al., “Molecular Profiling of Liquid Biopsy Samples for Precision Medicine”, Cancer J., março/abril de 2018;24(2):93-103, que é incorpo- rado aqui em sua totalidade. Em algumas modalidades, a amostra de tecido biológico é uma amostra de tecido de órgão, uma amostra de tecido ósseo ou uma amostra de tecido de tumor.
[0327] O termo “heterômero”, conforme usado no presente docu- mento, se refere ao complexo macromolecular composto por pelo me- nos duas unidades de GPCR [protômeros com propriedades bioquími-
cas que são demonstravelmente diferentes daquelas de seus compo- nentes individuais]. Heteromerização pode ser avaliada através da hi- bridização in situ, imuno-histoquímica, RNAseq, PCR quantitativa de transcrição reversa (RT-QPCR, PCR em tempo real), micromatriz, en- saio de ligação de proximidade (PLA), FRET de prazo estabelecido (TR- FRET), tomografia computadorizada de emissão de fóton única (SPECT) de corpo inteiro ou Tomografia de Emissão de Pósitron/Tomo- grafia Computadorizada (PET/CT).
[0328] A frase “quantidade eficaz”, conforme usada no presente do- cumento, se refere a uma quantidade suficiente para produzir resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Tal entrega é dependente de um número de variáveis que incluem o período de tempo para o qual a unidade de dosagem individual deve ser usada, a biodisponibilidade do agente, a rota de administração, etc.
[0329] A frase “quantidade terapeuticamente eficaz”, conforme usada no presente documento, se refere à quantidade de um agente terapêutico (por exemplo, um inibidor, um antagonista, ou qualquer ou- tro agente terapêutico fornecido no presente documento) que é sufici- ente para reduzir, amenizar e/ou prevenir a gravidade e/ou duração de um câncer e/ou um sintoma relacionado ao mesmo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico pode ser uma quan- tidade necessária para a redução, amenização ou prevenção do avanço ou progressão de um câncer, redução, amenização ou prevenção da recorrência, desenvolvimento ou início de um câncer, e/ou para melho- rar ou aprimorar o efeito profilático ou terapêutico de outra terapia (por exemplo, uma terapia diferente da administração de um inibidor, um an- tagonista ou qualquer outro agente terapêutico fornecido no presente documento).
[0330] A frase “agente terapêutico” se refere a qualquer agente que possa ser usado no tratamento, amenização, prevenção ou controle de um câncer e/ou um sintoma relacionado ao mesmo. Em determinadas modalidades, um agente terapêutico se refere a um inibidor de heterô- mero CXCR4-GPCRx da invenção. Um agente terapêutico pode ser um agente que é bem conhecido por ser útil para, ou foi ou é atualmente usado para o tratamento, amenização, prevenção ou controle de um câncer e/ou um sintoma relacionado ao mesmo.
[0331] A frase “ensaio de Ca2+ intracelular”, “ensaio de mobilização de cálcio” ou suas variantes, conforme usado no presente documento, se referem ao ensaio com base em célula para medir o fluxo de cálcio associado à ativação ou inibição de GPCR. O método utiliza um corante fluorescente sensível ao cálcio que é absorvido no citoplasma da maio- ria das células. O corante se liga ao cálcio liberado do armazenamento intracelular e sua fluorescência aumenta. A alteração na intensidade de fluorescência está diretamente correlacionada à quantidade de cálcio intracelular que é liberado no citoplasma em resposta à ativação de li- gante do receptor de interesse.
[0332] A frase “ensaio com base em proximidade”, conforme usada no presente documento, se refere às técnicas biofísicas e bioquímicas que têm capacidade para monitorar proximidade e/ou ligação de duas moléculas de proteína in vitro (em lisados de célula) e em células vivas, que incluem transferência de energia de ressonância de bioluminescên- cia (BRET), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), complementação de fluorescência bimolecular (BIFC), ensaio de ligação de proximidade (PLA), reticulação de cisteína e coimunopre- cipitação (Ferre et al., 2009; Gomes et al., 2016).
[0333] Métodos alternativos para detectar formação de heterômero incluem, porém, sem limitação: imunocoloração (Bushlin et al., 2012; Decaillot et al., 2008); microscopia imunoeletrônica (Fernandez-Duenas et al., 2015); BRET (Pfleger e Eidne, 2006); ensaios de FRET de prazo estabelecido (Fernandez-Duenas et al., 2015); hibridização in situ (He et al., 2011); FRET (Lohse et al., 2012); ensaio de recrutamento de B- arrestina com o uso de tecnologia de identificação de heterômero GPCR (GPCR-HIT, Dimerix Bioscience) (Mustafa e Pfleger, 2011) com o uso de BRET, FRET, BiFC, complementação de luminescência bimolecular, ensaio de fragmentação de enzima e sistema de ensaio de GPCR Tango Tango (Thermo Fisher Scientific) (Mustafa, 2010); sistema PRESTO-Tango (Kroeze et al., 2015); tecnologia de secreção/agrega- ção regulada (ARIAD Pharmaceuticals) (Hansen et al., 2009); tecnolo- gia de amplificação e seleção de receptor (ACADIA Pharmaceuticals) (Hansen et al., 2009); DimerScreen (Cara Therapeutics) (Mustafa, 2010); ensaio de translocação de proteína de dímero/interação (Pato- bios) (Mustafa, 2010); coimunoprecipitação (Abd Alla et al., 2009); en- saios de internalização de GPCR com o uso de ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) de superfície (Decaillot et al., 2008) ou cito- metria de fluxo (Law et al., 2005); ensaios de fosforilação de célula in- teira (Pfeiffer et al., 2002); e ensaio de ligação e proximidade (PLA) (Fre- derick et al., 2015).
[0334] Métodos alternativos para detectar alterações em proprieda- des farmacológicas, propriedades de sinalização e/ou propriedades de diapedese, em células que expressam ambos CXCR4 e GPCRx in- cluem, porém, sem limitação: Ensaios de ligação de radioligante (Bushlin et al., 2012; Pfeiffer et al., 2002); biotinilação e immunoblotting de superfície celular (He et al., 2011); imunocoloração (Bushlin et al., 2012; Decaillot et al., 2008); microscopia imunoeletrônica (Fernandez- Duenas et al., 2015); ensaios de ligação de [35S]GTP S (Bushlin et al, 2012); imaginologia ou ensaios de cálcio com o uso de corantes, tais como éster de Fura 2-acetometoxi (Molecular Probes), corante de cálcio Fluo-4 NW (Thermo Fisher Scientific), ou corante FLIPR5 (Molecular Devices); ensaios CAMP que usam kit de radioimunoensaio (Amersham
Biosciences); AlfaScreen (PerkinElmer Life Sciences); ensaio de AMP cíclico de parâmetro (R&D Systems); kit femto CAMP (Cisbio); kit de imunoensaio direto de CAMP (Calbiochem) ou ensaio de cAMP GloSen- sor (Promega); ensaio de GTPase (Pello et al., 2008); ativação de PKA (Stefan et al., 2007); ensaios de fosforilação de ERK1/2 e/ou AKkUPKB (Callen et al., 2012); ensaios de fosforilação de Src e STAT3 (Rios et al., 2006); ensaios de repórter, tal como elemento de resposta de CAMP (CRE); fator nuclear de elemento de resposta de células T ativadas (NFAT-RE); elemento de resposta de soro (SRE); elemento de resposta de fator e resposta de soro (SRF-RE); e ensaios de repórter de lucife- rase de elemento de resposta NF-KB; ensaio de fosfatase alcalina se- cretada (Decaillot et al., 2011); medição de produção de 1-fosfato de inositol com o uso de TR-FRET ou [3H]mio-inositol (Mustafa et al., 2012); RT-QPCR para medir expressão de gene-alvo a jusante (Mustafa et al., 2012); e atividade de adenilil ciclase (George et al., 2000); se- quenciamento de próxima geração (NGS); e qualquer outro ensaio que possa detectar uma alteração em função de receptor como resultado de heterodimerização de receptor.
[0335] A frase “inibidor de interação de proteina-proteína”, “inibidor de PPI” ou suas variantes, conforme usado no presente documento, se referem a quaisquer moléculas que podem interferir com as interações de proteína-proteína. A interação de proteína-proteína, diferente da in- teração de enzima-substrato que envolve bolsos de ligação bem defini- dos, é uma interação transiente ou associação entre proteínas sobre áreas relativamente grandes e é frequentemente conduzida por intera- ções eletrostáticas, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e/ou forças de Van der Waals. Inibidores de PPI podem incluir, porém, sem limitação, peptídeos de membrana permeável ou lipídeo fundido em uma sequência de peptídeos que interrompe a interface heteromérica de GPCR, por exemplo, hélice de transmembrana, laço intracelular ou cauda de terminal C de GPCRx. O inibidor de PPI do heterômero CXCR4-GPCRXx, por exemplo, pode ser um peptídeo de membrana per- meável ou peptídeo de penetração em célula (CPP) conjugado com peptídeo que alveja a interface (ou interfaces) heteromérica de CXCR4- GPCRXx, ou pode ser um peptídeo com lipídeos de penetração em célula que alveja a interface (ou interfaces) heteromérica CXCR4-GPCRx.
[0336] Por exemplo, o peptídeo de membrana permeável ou peptí- deo de penetração em célula inclui: Peptídeos HIV-1 TAT, tais como TAT 48-60 € TAT 40-57; Penetratinas, tais como pAntp(43-58); Poliargininas (Rn, tais como R5 a R12); vetor de peptídeo Diatos 1047 (DPV1047, VectocellO); MPG (gp41 de HIV fundido com sinal de localização nu- clear (NLS) do antígeno T grande SV40); Pep-1 (agrupamento rico em triptofano fundido com o NLS de antígeno T grande SV40); peptídeo PpVEC (caderina endotelial vascular); ARF com base em proteína de quadro de leitura alternativo p14 (ARF) (1 a 22); terminação N da prote- ína de príon bovina não processada BPrPr(1-28); peptídeo anfifático modelo (MAP); Transportans; peptídeo p28 derivado de azurina; peptí- deos de B-folha anfifáticos, tais como VT5; CPPs ricos em prolina, tal como Bac 7 (Bac1-24); CPPs hidrofóbicos, tal como C105Y derivado de al-antitripsina; PFVYLI derivado de C105Y sintético; peptídeo Pep-7 (clone de fago de peptídeo CHL8); e CPPs hidrofóbicos modificados, tais como peptídeos em grampo e peptídeos prenilados (Guidotti et al., 2017; Kristensen et al., 2016). O peptídeo de membrana permeável ou peptídeo de penetração em célula pode incluir, adicionalmente, por exemplo, peptídeos de penetração em célula derivados de TAT, peptí- deos de penetração em célula com base em sequência de sinal (por exemplo, NLS), peptídeos de sequência de translocação de membrana hidrofóbica (MTS) e transportadores moleculares ricos em arginina. O peptídeo lapidado de penetração em célula inclui, por exemplo, pepdu- cinas, tais como ICL1/2/3, peptídeos palmitoilados curtos de cauda C
(Covic et al., 2002; O'Callaghan et al., 2012).
[0337] O peptídeo (ou peptídeos) que alveja a interface heteromé- rica de CXCR4-GPCRx pode ser, por exemplo, um domínio de trans- membrana de CXCRA, domínio de transmembrana de GPCRXx, laço in- tracelular de CXCRA, laço intracelular de GPCRx, domínio de terminal C de CXCRA, ou domínio de terminal C de GPCRXx, laço extracelular de CXCRA, laço extracelular de GPCRx, região de terminal N de CXCRA4, ou região de terminal N de GPCRx.
[0338] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma compo- sição farmacêutica (por vezes denominada no presente documento “for- mulações farmacêuticas”) que tem um inibidor de um heterômero CXCR4-GPCRx da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo farmaceuticamente aceitável que pode ser usado nas com- posições farmacêuticas da invenção incluem qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão conhecidos na técnica, tais como veículos fisiolo- gicamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores, por exemplo, so- lução salina tamponada de fosfato, água e emulsões, tais como uma emulsão de óleo e água, e vários tipos de agentes umectantes. Estas composições farmacêuticas podem ser preparadas em formas de dose unitária líquida ou qualquer outra forma de dosagem que seja suficiente para entrega do inibidor de um heterômero CXCR4-GPCRx da invenção na área-alvo do indivíduo que necessita de tratamento. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser preparadas de qualquer ma- neira apropriada para o modo de administração escolhido, por exemplo, intravascular, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intratecal, etc. Outros componentes opcionais, por exemplo, estabilizadores de grau farmacêutico, tampões, conservantes, excipientes e semelhantes po- dem ser prontamente selecionados por uma pessoa versada na técnica. A preparação de uma composição farmacêutica, com a devida conside- ração ao pH, isotonicidade, estabilidade e semelhantes, está dentro do nível de habilidade na técnica.
[0339] Formulações farmacêuticas que contêm um ou mais inibido- res de um heterômero CXCR4-GPCRx da invenção fornecido no pre- sente documento podem ser preparadas para armazenamento mistu- rando-se os inibidores que têm o grau desejado de pureza com veículos fisiologicamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos aos recebedores nas dosagens e concentrações empregadas, e in- cluem tampões, como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxi- dantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes, como clo- reto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ci- clo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol; polipeptídeos de baixo peso mole- cular menos que cerca de 10 resíduos; proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirroli- dona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, argi- nina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; açúcares, como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons for- madores de sal, como sódio; complexos de metal (por exemplo, com- plexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, como TWEEN'TY ,PLURONICS'Y ou polietileno glicol (PEG).
[0340] Assim, em algumas modalidades, a invenção fornece um método para tratamento, amenização ou prevenção de uma doença em um indivíduo que necessita do mesmo. Os métodos da invenção podem incluir administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica fornecida no presente documento ao indiví- duo. Por exemplo, a composição farmacêutica pode incluir um ou mais inibidores de um heterômero CXCR4-GPCRx fornecido no presente do- cumento. Doenças que podem ser tratadas ou prevenidas com o uso dos métodos da invenção incluem câncer, tumor, metástase e/ou angio- gênese. Em particular, os métodos da invenção são úteis para tratar cânceres ou sintomas relacionados, em que as células de câncer, tumor e/ou microambiente expressam o heterômero CXCR4-GPCRx. Exem- plos sem limitação de cânceres ou tumores que podem ser tratados, amenizados ou prevenidos com o uso dos métodos da invenção incluem tumores do trato gastrointestinal, por exemplo, câncer de mama, câncer pulmonar, carcinoma de célula pequena do pulmão, carcinoma hepato- celular, câncer cerebral, câncer de rim, câncer pancreático ou adeno- carcinoma pancreático, câncer ovariano, câncer de próstata, melanoma, linfoma, leucemia, mieloma múltiplo, carcinoma de célula renal, sar- coma de tecido mole, câncer gastrointestinal, câncer de estômago, cân- cer do cólon, câncer colorretal, adenocarcinoma colorretal, adenocarci- noma de bexiga, câncer esofágico e adenocarcinoma do estômago, esôfago, garganta e trato urogenital.
[0341] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, ou fornece um método de supressão de sinalização a jusante aprimorada de um heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula de um paciente que sofre de câncer, sendo que o método compreende: administrar ao paciente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx; em que: i) o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a ju- sante aprimorada; e ii) o inibidor ou combinação de inibidores adminis- trada suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero
CXCR4-GPCRXx no paciente com câncer.
[0342] Em algumas modalidades, a invenção fornece um kit farma- cêutico para uso no tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o kit far- macêutico compreende: um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; sendo que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante apri- morada. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composi- ção farmacêutica para uso no tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRXx, sendo que a composição farmacêutica compreende: i) um inibidor ou uma combi- nação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e li) um veículo farmaceuticamente aceitável; em que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada.
[0343] Em algumas modalidades, de acordo com o método de tra- tamento, método de supressão, kit farmacêutico, ou composição farma- cêutica, fornecidos no presente documento, a progressão do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx é diminuída na faixa de 5 a 100% mais mediante admi- nistração da combinação de inibidores, com relação à administração do inibidor de CXCRA4 ou inibidor de GPCRX com o inibidor único ao dito paciente, tal como diminuída na faixa de 5 a 100% mais, 10 a 100% mais, 20 a 100% mais, 30 a 100% mais, 40 a 100% mais, 50 a 100% mais, 60 a 100% mais, 75 a 100% mais, 5 a 75% mais, 5 a 50% mais, ou 5 a 25% mais, mediante administração da combinação de inibidores, com relação à administração do inibidor de CXCRA4 ou inibidor de GPCRx como o inibidor único ao dito paciente. Em algumas modalida- des, o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; por exemplo, selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecio- nado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que con- siste em: ADRB2, CHRM1, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB e HRH1; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1 e HRH1; ou selecionado den- tre o grupo que consiste em: ADRB2, HRH1 e TACR3. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de GPCRx é selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de C5AR1, inibidor de CALCR, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; por exemplo, selecio- nado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R!1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB2, inibidor de C5AR1, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, ini- bidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de
ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibi- dor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB?2, inibidor de CHRM1, inibidor de ED- NRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; sele- cionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, ini- bidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADORAZB, ini- bidor de ADORAS, inibidor de ADRB?2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; se- lecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ini- bidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, e inibidor de HRH1; selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADRB?2, inibidor de CHRM1, e inibidor de HRH1; ou selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, ini- bidor de HRH1 e inibidor de TACR3.
[0344] Em algumas modalidades, de acordo com o método de tra- tamento, método de supressão, kit farmacêutico, ou composição farma- cêutica, fornecidos no presente documento, a eficácia de um inibidor de CXCRA4 é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRx ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx, com relação à eficácia do inibidor de CXCR4 quando administrado como um inibidor único, tal como aumentada na faixa de 5 a 1750%, 5 a 1500%, 5 a 1250%, 5 a 1000%, 5 a 900%, 5 a 800%, 5 a 700%, 5 a 500%, 5 a 400%, a 250%, 5 a 200%, 5 a 100%, 5 a 75%, 5 a 50%, 5 a 40%, 5 a 30%, 5 a 25%, 100 a 2000%, 200 a 2000%, 300 a 2000%, 500 a 2000%, 750 a 2000%, 1000 a 2000%, 1250 a 2000%, 1500 a 2000%, 5 a 1500%, 25 a 1500%, 50 a 1500%, 75 a 1500%, 100 a 1500%, 200 a 1500%, 300 a 1500%, 500 a 1500%, 750 a 1500%, 1000 a 1500% ou 1250 a 1500%, quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRx ao pa- ciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx, com relação à eficácia do inibidor de CXCR4 quando administrado como um inibidor único.
Em algumas modalidades, o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; por exem- plo, selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecio- nado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que con- siste em: ADRB2, CHRM1, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB e HRH1; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1 e HRH1; ou selecionado den- tre o grupo que consiste em: ADRB2, HRH1 e TACR3. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de GPCRx é selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de C5AR1, inibidor de CALCR, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; por exemplo, selecio- nado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB?2, inibidor de C5AR1, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, ini- bidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibi- dor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB?2, inibidor de CHRM1, inibidor de ED- NRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; sele- cionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, ini- bidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADORAZB, ini- bidor de ADORAS, inibidor de ADRB?2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; se- lecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1,
e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ini- bidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, e inibidor de HRH1; selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, e inibidor de HRH1; ou selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, ini- bidor de HRH1 e inibidor de TACR3.
[0345] Em algumas modalidades, de acordo com o método de tra- tamento, método de supressão, kit farmacêutico, ou composição farma- cêutica, fornecidos no presente documento, a eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRA4 ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx, com relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando administrado como um inibidor único, tal como aumentada na faixa de 5 a 1750%, 5 a 1500%, 5 a 1250%, 5 a 1000%, 5 a 900%, 5 a 800%, 5 a 700%, 5 a 500%, 5 a 400%, a 250%, 5 a 200%, 5 a 100%, 5 a 75%, 5 a 50%, 5 a 40%, 5 a 30%, 5 a 25%, 100 a 2000%, 200 a 2000%, 300 a 2000%, 500 a 2000%, 750 a 2000%, 1000 a 2000%, 1250 a 2000%, 1500 a 2000%, 5 a 1500%, 25 a 1500%, 50 a 1500%, 75 a 1500%, 100 a 1500%, 200 a 1500%, 300 a 1500%, 500 a 1500%, 750 a 1500%, 1000 a 1500% ou 1250 a 1500%, quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRA4 ao pa- ciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx, com relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando administrado como um inibidor único. Em algumas modalidades, o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1,
CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; por exem- plo, selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1RI1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecio- nado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que con- siste em: ADRB2, CHRM1, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB e HRH1; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1 e HRH1; ou selecionado den- tre o grupo que consiste em: ADRB2, HRH1 e TACR3. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de GPCRx é selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de C5AR1, inibidor de CALCR, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; por exemplo, selecio- nado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB2, inibidor de C5AR1, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, ini- bidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS3, inibidor de ADRB2, inibidor de
CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibi- dor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS3, inibidor de ADRB?2, inibidor de CHRM1, inibidor de ED- NRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; sele- cionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1RI1, ini- bidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADORAZB, ini- bidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; se- lecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ini- bidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB32, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, e inibidor de HRH1; selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, e inibidor de HRH1; ou selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, ini- bidor de HRH1 e inibidor de TACR3.
[0346] Em algumas modalidades, de acordo com o método de tra- tamento, método de supressão, kit farmacêutico, ou composição farma- cêutica, fornecidos no presente documento, o método administra uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterô-
mero CXCR4-GPCRx; ou o kit farmacêutico ou composição farmacêu- tica compreende uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx. Em algumas modalida- des, a combinação de inibidores é uma combinação de dois inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx. Em algumas modalidades, de acordo com o método de tratamento, método de supressão, kit farmacêutico, ou composição farmacêutica, fornecidos no presente documento, o método administra uma combinação de um inibidor de CXCRA4 e um inibidor de GPCRx; ou o kit farmacêutico ou composição farmacêutica compreende uma combinação de um inibidor de CXCR4 e um inibidor de GPCRx. Em algumas modalidades, de acordo com o método de tratamento, método de supressão, kit farma- cêutico, ou composição farmacêutica, fornecidos no presente docu- mento, o método administra um inibidor de heterômero CXCR4-GPCRx; ou o kit farmacêutico ou composição farmacêutica compreende um ini- bidor de heterômero CXCR4-GPCRx.
[0347] Em algumas modalidades, de acordo com o método de tra- tamento ou método de supressão fornecidos no presente documento, ou de acordo com o uso do kit farmacêutico ou composição farmacêu- tica fornecido no presente documento, a administração da combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito hete- rômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 2000 vezes, com relação à administração de inibidor único, tal como suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 1750 vezes, 5 e 1500 vezes, e 1250 vezes, 5 e 1000 vezes, 5 e 900 vezes, 5 e 800 vezes, 5 e 700 vezes, 5 e 500 vezes, 5 e 400 vezes, 5 e 250 vezes, 5 e 200 vezes, 5e 100 vezes, 5 e 75 vezes, 5 e 50 vezes, 5 e 40 vezes, 5 e 30 vezes, 5 e vezes, 100 e 2000 vezes, 200 e 2000 vezes, 300 e 2000 vezes, 500 e 2000 vezes, 750 e 2000 vezes, 1000 e 2000 vezes, 1250 e 2000 ve- zes, 1500 e 2000 vezes, 5 e 1500 vezes, 25 e 1500 vezes, 50 e 1500 vezes, 75 e 1500 vezes, 100 e 1500 vezes, 200 e 1500 vezes, 300 e 1500 vezes, 500 e 1500 vezes, 750 e 1500 vezes, 1000 e 1500 vezes ou 1250 e 1500 vezes, com relação à administração de inibidor único.
Em algumas modalidades, o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; por exemplo, selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CHRM1, ED- NRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1IR1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que con- siste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACRS3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que con- siste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado den- tre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, HRH1 e TACR3; seleci- onado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB, HRH1 e TACRS3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB e HRH1; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1 e HRH1; ou selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, HRH1 e TACR3. Em algumas modalidades, o inibidor de GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de CSAR1,
inibidor de CALCR, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; por exemplo, selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1RI1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA, inibidor de ADRB;2, inibidor de CSAR1, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, ini- bidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1RI1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA, inibidor de ADRB32, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, ini- bidor de MLNR, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB?2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB32, inibidor de EDNRB, e inibidor de HRH1; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, e inibi- dor de HRH1; ou selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de HRH1 e inibidor de TACR3.
[0348] Em algumas modalidades, de acordo com o método de tra- tamento ou método de supressão fornecidos no presente documento, ou de acordo com o uso do kit farmacêutico ou composição farmacêu- tica fornecido no presente documento, a administração do inibidor ou combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e e2000 vezes, com relação à supressão de sinalização a ju- sante de um protômero de CXCRA4 ou um protômero de GPCRx em seu respectivo contexto de protômero individual, tal como suprime a sinali- zação a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRXx no pa- ciente com câncer na faixa entre 5 e 1750 vezes, 5 e 1500 vezes, 5 e 1250 vezes, 5 e 1000 vezes, 5 e 900 vezes, 5 e 800 vezes, 5 e 700 vezes, 5 e 500 vezes, 5 e 400 vezes, 5 e 250 vezes, 5 e 200 vezes, 5 e 100 vezes, 5 e 75 vezes, 5 e 50 vezes, 5 e 40 vezes, 5 e 30 vezes, 5 e vezes, 100 e 2000 vezes, 200 e 2000 vezes, 300 e 2000 vezes, 500 e 2000 vezes, 750 e 2000 vezes, 1000 e 2000 vezes, 1250 e 2000 ve- zes, 1500 e 2000 vezes, 5 e 1500 vezes, 25 e 1500 vezes, 50 e 1500 vezes, 75 e 1500 vezes, 100 e 1500 vezes, 200 e 1500 vezes, 300 e 1500 vezes, 500 e 1500 vezes, 750 e 1500 vezes, 1000 e 1500 vezes, ou 1250 e 1500 vezes, com relação à supressão de sinalização a ju- sante de um protômero de CXCRA4 ou um protômero de GPCRx em seu respectivo contexto de protômero individual. Em algumas modalidades, o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; por exem- plo, selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1I, CHRM1, EDNRB, HRHI1,
MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecio- nado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que con- siste em: ADRB2, CHRM1, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB e HRH1; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1 e HRH1; ou selecionado den- tre o grupo que consiste em: ADRB2, HRH1 e TACR3. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de GPCRx é selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de C5AR1, inibidor de CALCR, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; por exemplo, selecio- nado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R!1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB2, inibidor de C5AR1, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, ini- bidor de MLNR, inibidor de NTSR1 e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibi- dor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB?2, inibidor de CHRM1, inibidor de ED- NRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; sele- cionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, ini- bidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADORAZB, ini- bidor de ADORAS3, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; se- lecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ini- bidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, e inibidor de HRH1; selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, e inibidor de HRH1; ou selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, ini- bidor de HRH1 e inibidor de TACR3.
[0349] Teste e avaliação inicial de um inibidor, ou combinação de inibidores, sobre ser eficaz, ou terapeuticamente eficaz, na supressão de uma sinalização a jusante aprimorada de um heterômero CXCR4- GPCRX, de acordo com os métodos divulgados no presente documento, e/ou na determinação de um valor de IC50 de acordo com os ensaios divulgados no presente documento, podem utilizar uma concentração do inibidor na faixa entre 1 e 10 uM (ou cada um dos inibidores da com- binação em concentrações na faixa entre 1 e 10 uM), tal como em uma concentração de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 UM. Se a supressão do sinal pelo inibidor não for apreciável o suficiente para uma medição de- terminável, então, uma concentração maior do inibidor pode ser usada para avaliar melhor uma medição determinável, tal como um valor de IC50. Se a supressão do sinal pelo inibidor for muito forte, então, uma concentração inferior do inibidor pode ser usada para avaliar melhor uma medição determinável, tal como um valor de IC50.
[0350] Entende-se que as modificações que não afetam substanci- almente a atividade das várias modalidades desta invenção também são fornecidas dentro da definição da invenção fornecida no presente docu- mento. Consequentemente, os seguintes exemplos são destinados a ilustrar, mas não limitar a invenção divulgada no presente documento.
EXEMPLOS EXEMPLO 1. AVALIAÇÃO DE FORMAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX ATRAVÉS DE ENSAIO BIFC.
[0351] Para identificar heterômeros CXCR4-GPCRx inovadores, se produziu adenovírus recombinantes que codificam 143 GPCRs fundidos com fragmentos de terminal N da Vênus de proteína fluorescente ama- rela (VN) e 147 GPCRs fundidos com fragmento de terminal C da Vênus (VC), conforme descrito em Song et al. (Song et al., 2014; Patente SNU; Song, thesis). Heterômeros CXCR4-GPCR foram identificados com o uso de ensaio de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) (Figura 1), em dois fragmentos de VN e VC complementares de Vênus reconstituem um sinal fluorescente apenas quando ambos fragmentos estão próximos o suficiente através da interação entre duas proteínas diferentes das quais estão fundidas (Hu et al., 2002).
[0352] Células U-2 OS foram colocadas em placa em placas de 96 poços, foram cotransduzidas, cada uma, com 30 MO! de adenovírus que codificam CXCR4-VN e GPCRx-VC ou CXCR4-VC e GPCRX-VN, e fo- ram deixadas para expressar GPCRs por 2 dias. Após tingimento das células com Hoechst 33342, BiFC e imagens nucleares foram obtidas a partir de três campos por poço com o uso de analisador de célula IN
1000. Imagens de cerca de 200 células de cada poço foram analisadas com software de análise de múltiplos alvos na caixa de ferramentas IN Cell Developer (GE Healthcare, Waukesha, WI). O limite celular foi mar- cado com base em sinal de Hoechst, e a intensidade de fluorescência por célula foi medida. Células com intensidades de fluorescência maio- res que o nível de fundo foram consideradas como células de BiFC po- sitivas. Células mortas que mostraram intensidades extremamente altas foram excluídas da contagem de células. Células positivas foram deter- minadas, e razão de contagem de célula positiva (“pontuação de BiFC”) foi calculada como (células positivas/total de células) x 100 (consultar a Tabela 4 abaixo).
[0353] Quando CXCRA4-VN foi coexpresso com HA-VC (Figura 2a) ou GCGR-VC, um GPCR que codifica receptor de glucagon (Figura 2c), nenhum sinal de proteína de fluorescência amarela (YFP) (sinal de BiFC) foi observado. Por outro lado, quando CXCRA4-WVN foi coexpresso com CXCRA4-VC (Figura 2b), o sinal de BiFC foi observado na mem- brana plasmática e no citoplasma. O sinal de BiFC forte foi observado na membrana plasmática e no citoplasma quando CXCRA4-VN foi co- transduzido com ADCYAP1R1-VC (Figura 2d), ADORA3-VC (Figura 2f), ADRB2-VC (Figura 2g), APLNR-VC (Figura 2h), CBSAR1-VC (Figura 2i), CALCR-VC (Figura 2j), CCR5-VC (Figura 2k), CHRM1-VC (Figura 21), GALR1-VC (Figura 2m), EDNRB-VC (Figura 2n), HRH1-VC (Figura 20), MLNR-VC (Figura 2p), NTSR1-VC (Figura 29), PTGER2-VC (Figura 2r), SSTR2-VC (Figura 2t), e TACR3-VC (Figura 2u). O sinal de BiFC ro- busto também foi observado quando as células foram cotransduzidas com CXCR4-VC e ADORAZB-WVN (Figura 2e) ou PTGER3-VN (Figura 2s). Células que mostraram sinal de fluorescência de BIFC maior que o nível de fundo foram contadas como células de BiFC positivas, e a pon- tuação de BiFC foi calculada.
[0354] A interação de proteína-proteína pode ser afetada pelas tags de fusão, tais como fragmentos de proteína de fluorescência em BiIFC ou renilla luciferase em BRET através da interferência com a expressão, dobragem ou localização da proteína parceira. A proteína parceira tam- bém pode prejudicar a expressão ou dobragem das tags de fusão, e afetar resultado de ensaio com base em proximidade. Assim, a ausência de sinal entre duas proteínas em combinação específica não necessa- riamente implica na não interação das proteínas, porém, simplesmente que as moléculas doadoras e aceitantes anexas estão em conformação particular que não permite que a interação ocorra (Eidne et al., 2002; Kerppola, 2006).
[0355] Portanto, CXCR4 e GPCRx que geraram sinal de BIFC em combinação de CXCR4-VN e GPCRx-VC ou CXCR4-VC e GPCRX-VN foram considerados proteínas de interação. A pontuação de BiFC de par de CXCRA4-VN e CXCRA4-VC, um homômero bem conhecido, foi 9,9. As- sim, pares de CXCR4-GPCRx que receberam pontuação de BiFC maior ou igual a 10 foram selecionados como candidatos a heterômero CXCR- GPCRx, conforme mostrado na Tabela 4.
[0356] Tabela 4. GPCRs que exibiram pontuação de BiIFC maior ou igual 10 quando coexpressos com CXCRA. TABELA 4 Pontuação de BIFC Pd E e pes To pe 3 *CXCRA4-VC e GPCRx-VN foram usados.
[0357] Dezesseis GPCRs, ADCYAP1IR1I, ADORA3, ADRB;2, APLNR, C5AR1, CALCR, CCR5, CHRM1, GALR1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1, PTGER2, SSTR2 e TACR3, foram identificados como GPCRs de interação com CXCR4 em combinação de CXCR4-VN e GPCRx-VC e dois GPCRs, ADORAZB e PTGER3, receberam pontua- ção de BiFC maior que 10 em combinação de CXCRA4-VC e GPCRXx- VN, conforme mostrado na Tabela 4. Dentre estes, ADRB2 e CCR5 fo- ram relatados para formar heterômeros com CXCR4 (LaRocca 2010, Nakai 2014, (Agrawal et al., 2004; LaRocca et al., 2010; Rodriguez- Frade et al., 2004; Sohy et al., 2007; Sohy et al., 2009; Martinez-Munoz et al., 2014)), e os 16 GPCRs restante se mostraram heterômeros CXCR4-GPCRx inovadores que não foram relatados ao conhecimento dos inventores.
[0358] Dentre GPCRs que foram conhecidos por interagir com CXCRA4, ADRA1IA e CXCR3 também foram incluídos no ensaio BIFC dos inventores. Estes GPCRs foram excluídos de investigação adicio- nal, visto que receberam sinal de BIFC menor que 10 com CXCR4: ADRA1A (CXCR4-VN-ADRA1A-VC: pontuação de BiFC 7,85) e CXCR3 (pontuação de BiFC 1,16).
[0359] Receptor de canabinoide 2 (CB2, por vezes denominado CNR2) foi identificado como um GPCR de interação com CXCRA4 no ensaio BiIFC dos inventores (configuração de CNR2-VN-CXCRA4-VC: pontuação de BiFC 4,25; configuração de CNR2-VC-CXCRA4-VN: pon- tuação de BiFC 38,1), e ensaio de cointernalização, conforme descrito nas Figuras 3a a 3b e 4a a 49. Porém, CNR?2 não foi selecionado como o candidato final, uma vez que falhou em exibir uma sinalização a ju-
sante aprimorada no ensaio de mobilização de cálcio (consultar o Exem- plo 3 abaixo). EXEMPLO 2. AVALIAÇÃO DE FORMAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX ATRAVÉS DE ENSAIO DE COINTERNALIZAÇÃO.
[0360] Alguns dos heterômeros de GPCR são conhecidos por exi- bir, como resultado da heteromerização, propriedades de diapedese al- teradas, tais como maturação do GPCR parceiro (receptor de GABA(B)) (White, 1998), internalização mediada por agonista do GPCR parceiro a partir da superfície celular (DOR-GRPR, A2A-D2R) (Hillion et al., 2002; Liu et al., 2011; Torvinen et al., 2005), e alterações na localização do GPCR parceiro de um compartimento intracelular na superfície celular (DOR-CB1) (Rozenfeld et al., 2012).
[0361] Cointernalização de pares de GPCRs coexpressos em res- posta aos agonistas seletivos para apenas um do par foi usada para confirmar heteromerização de GPCR (Milligan, 2008). Para examinar se GPCRx modula a diapedese de CXCR4 quando coexpresso e forma heterômero CXCR4-GPCRx e também para confirmar a interação física entre CXCR4 e GPCRx identificada com o uso de ensaio BiFC, células foram cotransduzidas com adenovírus que codificam CXCRA4-GFP e GPCRXx, e imagens GFP foram obtidas antes e 30 min após a estimula- ção com agonista de GPCRx. Perda de expressão de GFP na superfície celular ou surgimento de grânulos de GFP dentro das células foram con- siderados como cointernalização de CXCR4-GFP com GPCRx (Figuras 3a a 3b).
[0362] Nas Figuras 4a a 49, as células foram estimuladas com ago- nistas de GPCRx específicos para CXCRA4 (Figura 4a), ADCYAP1IR1 (Figura 4b), ADORAZB (Figura 4c), ADORA3 (Figura 4d), ADRB?2 (Fi- gura 4€), APLNR (Figura 4f), CSAR1 (Figura 49), CCR5 (Figura 4h), CHRM1 (Figura 4i), GALR1 (Figura 4j)), EDNRB (Figura 4k), HRH1 (Fi- gura 41), MLNR (Figura 4m), NTSR1 (Figura 4n), PTGER3 (Figura 40),
SSTR2 (Figura 4p), e TACR3 (Figura 49) como a seguir: 10 nM de CXCL12 (Figura 4a), 1 uM de peptídeo intestinal vasoativo (VIP) (Figura 4b), 1 uM de BAY 60-6583 (Figura 4c), 1 uM de CGS21680 (Figura 4d), 100 nM de formoterol (Figura 4€), 1 UM de apelina-13 (Figura 4f), 100 nM de C5a (Figura 49), 100 nM de CCL?2 (Figura 4h), 1 uM de acetilco- lina (Figura 4i), 100 nM de galanina (Figura 4j), 1 UM de endotelina 1 (Figura 4k), 1 uM de histamina (Figura 41), 100 nM de motilina (Figura 4m), 1 uM de neurotensina (Figura 4n), 1 UM de PGE2 (Figura 40), 1 UM de SRIF-14 (Figura 4p), e 1 UM de senktide (Figura 49), respectiva- mente. Imagens foram obtidas antes e 30 min após a estimulação de agonista, e analisadas com o uso de analisador de célula IN 2000. À seleção da concentração destes agonistas de GPCRx foi definida inici- almente na concentração de EC50 (ou alternativamente, a concentra- ção de Ki ou Kd) para o respectivo GPCRx específico, e se o sinal re- sultante fosse muito intenso, então, a concertação seria diminuída abaixo de EC50, e se o sinal resultante fosse muito fraco, então, a con- certação seria aumentada até não mais que 10000x a concentração de EC50.
[0363] Estimulação de células que expressam CXCR4-GFP com CXCL12 resultou na relocação de GFP a partir da membrana plasmática para grânulos intracelulares distintos, que mostra internalização de CXCRA4-GFP de superfície no citoplasma (Figura 4a). Dentre 18 heterô- meros CXCR4-GPCRx identificados através de ensaio BiFC, 16 heterô- meros que contêm o seguinte GPCRx induziram internalização de CXCRA conforme revelado pelos grânulos de GFP intracelular aumen- tados e sinal de GFP reduzido na membrana plasmática em células que coexpressam CXCRA4-GFP e GPCRXx, que confirma a cointernalização de heterômero: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, APLNR, C5AR1, CCR5, CHRM1, GALR1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1, PTGER3, SSTR2 e TACR3 (Figura 4b a q). Heterômeros CXCR4-
GPCRx que contêm CALCR e PTGER?2, por outro lado, não demons- tram cointernalização do heterômero mediante tratamento de agonista de GPCRx. Esses resultados demonstram que determinados parceiros de GPCRx identificados no ensaio BIFC formam heterômeros CXCR4- GPCRx em células que coexpressam ambos GPCRs, conforme eviden- ciado pelas propriedades de diapedese celular alteradas do heterômero. EXEMPLO 3. AVALIAÇÃO ATRAVÉS DE ENSAIO DE MOBILIZAÇÃO DE CA2+ DE SINALIZAÇÃO A JUSANTE DE CXCR4 APRIMORADA MEDIANTE FORMAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX E INIBI- ÇÃO DA SINALIZAÇÃO APRIMORADA.
[0364] Para examinar adicionalmente se esses heterômeros CXCR4-GPCRx exibem propriedades distintas daquelas dos protôme- ros individuais (em células que carecem de um dos receptores), foi in- vestigada a sinalização de cálcio na presença de qualquer um ou de ambos agonistas em células que expressam GPCR ou ambos GPCRs juntos. Neste exemplo, conforme observado no Exemplo 2, a seleção da concentração destes agonistas de GPCRx foi definida inicialmente na concentração de EC50 (ou alternativamente, a concentração de Ki ou Kd) para o respectivo GPCRx específico, e se o sinal de Ca2+ resul- tante fosse muito intenso, então, a concertação seria diminuída abaixo de EC50, e se o sinal de Ca2+ resultante fosse muito fraco, então, a concertação seria aumentada até não mais que 100x a concentração de EC50.
[0365] Quando as células MDA-MB-231 de câncer de mama hu- mano foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCRA, trata- mento de CXCL12 evocou a mobilização de cálcio intracelular (Figura 5a). Estimulação das células com salmeterol, um agonista de ADRB2 seletivo, não induz resposta de cálcio, o que demonstra que a resposta de cálcio evocada pelo CXCL12 foi mediada por CXCRA4. Cotratamento das células com CXCL12 e salmetero| induziu resposta de cálcio similar em comparação com aquela induzida por CXCL12 sozinho. Em células que superexpressam ADRB2 sozinho, CXCL12 não induziu resposta de cálcio, enquanto salmeterol induziu resposta de cálcio, o que mostra que salmeterol| induz resposta de cálcio através de ADRB?2 (Figura 5b). Co- tratamento de ambos agonistas induziu resposta de cálcio similar àquela estimulada por salmeterol sozinho.
[0366] Em células que superexpressam tanto CXCR4 quanto ADRB2, a estimulação com cada agonista induziu respostas de cálcio similares àquelas mostradas em células que expressam CXCR4 ou ADRB?2 sozinho (Figuras 5c vs 5a e 5b). Por outro lado, cotratamento de ambos agonistas juntos aumentou significativamente a resposta de cálcio em comparação com aquela evocada por agonistas individuais (Figuras 5c e 5d). A sinalização de cálcio aprimorada foi observada ape- nas em células que expressam tanto CXCR4 quanto ADRB2, porém, não em células que expressam CXCR4 ou ADRB?2 sozinho. Esses re- sultados claramente demonstram que o heterômero CXCR4-ADRB2 exibe propriedades distintas daquelas dos GPCRs individuais.
[0367] Para examinar se os outros GPCRs identificados por intera- gir com CXCR4 em ensaio de BiFC e cointernalização também mostram propriedades distintas em sinalização de cálcio, experimentos mostra- dos nas Figuras 5a a 5d foram realizados para outros parceiros de GPCRx identificados. Em células que coexpressam CXCR4 e ADCYAP1R1 (Figura 6a), ADORAZB (Figura 6b), ADORAS3 (Figura 6c), C5AR1 (Figura 6d), CALCR (Figura 6e), CHRM1 (Figura 6f), EDNRB (Figura 69), HRH1 (Figura 6h), MLNR (Figura 6i), NTSR1 (Figura 6j), PTGERZ?2 (Figura 6k), ou TACR3 (Figura 61), o cotratamento de CXCL12 e respectivo agonista de GPCRx aumentou significativamente as res- postas de cálcio em comparação com a soma de respostas de cálcio que foram induzidas por agonistas individuais, conforme mostrado nas Figuras 5c e 5d, e conforme mostrado nas Figuras 6a a 61. As células que coexpressam o CXCR4 e o GPCRx (seja ADCYAP1R1 (Figura 6a), ADORAZB (Figura 6b), ADORA3 (Figura 6c), CSAR1 (Figura 6d), CALCR (Figura 6e), CHRM1 (Figura 6f), EDNRB (Figura 6g), HRH1 (Fi- gura 6h), MLNR (Figura 61), NTSR1 (Figura 6j)), PTGER?2 (Figura 6Kk), ou TACR3 (Figura 61)) exibiram uma mobilização de cálcio aprimorada me- diante coestimulação (ou cotratamento) com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo com relação à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado pelo ensaio de mobilização de cálcio. Notavelmente, em células que coexpressam CXCR4 e CNR2, resposta de cálcio induzida por CXCL12 foi significativamente reduzida, em vez de aprimorada, me- diante adição de CXCL12 sozinho ou juntamente com JWH-133, um agonista de CNR2 seletivo, em comparação com a resposta de cálcio mediada por CXCL12 observada em células que expressam CXCRA4 so- zinho (dados não mostrados).
[0368] Dentro do conjunto acima de sistemas coexpressos, notou- se também que uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio foi observada no contexto de protômero individual em células que en- volvem CXCR4 e PTGER?2 (Figura 6k) (um contexto de protômero indi- vidual, por exemplo, seja CXCRA4 expresso na ausência do respectivo GPCRXx, ou o respectivo GPCRx expresso na ausência do CXCRA4), me- diante coestimulação com CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo. Especificamente, uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio foi observada para PTGER?2 (Figura 6Kk), no contexto de pro- tômero individual, em ambas situações em que CXCRA4 foi expresso na ausência do respectivo GPCRx, e quando o respectivo GPCRx (PTGER2) foi expresso na ausência do CXCRA, mediante coestimula- ção com CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo (5 uM de PGE2), a quantidade de mobilização de cálcio que resulta dos sistemas de contexto de protômero individual foi maior que a soma de quantida- des de mobilização de cálcio que resultam de estimulações de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo (5 uM de PGE2).
[0369] Consequentemente, a partir destas observações, estes sis- temas que coexpressam CXCR4 e o GPCRx selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1 (Figura 6a), ADORAZB (Figura 6b), ADORAS (Figura 6c), CSAR1 (Figura 6d), CALCR (Figura 6e), CHRM1 (Figura 6f), EDNRB (Figura 6g), HRH1 (Figura 6h), MLNR (Figura 6i), NTSR1 (Figura 6j)), e TACR3 (Figura 61), são considerado por ter: (i) exi- bido uma mobilização de cálcio aprimorada mediante coestimulação (ou cotratamento) com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx sele- tivo com relação à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respec- tivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado pelo ensaio de mobilização de cálcio; (ii) exibido uma quantidade de mobilização de cálcio menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo em um contexto de protômero individual; e, assim, (iii) constituído heterômeros CXCR4-GPCRx que exibem propriedades distintas daquelas do GPCR individual. As respos- tas de cálcio aprimoradas não foram observadas em células que expres- sam GPCRs individuais, desse modo, se demonstra que estes heterô- meros CXCR4-GPCRx exibem propriedades distintas daquelas do GPCR individual.
[0370] A sinalização de cálcio aprimorada induzida por pequenas quantidades de agonistas individuais juntos indicou claramente que os heterômeros CXCR4-GPCRx aumentariam a sensibilidade e a faixa di- nâmica destes receptores em concentrações de ligante limites in vivo, e pode estar associada a um prognóstico fraco. A sinalização de cálcio aprimorada pelos heterômeros CXCR4-GPCRx também indica que o di- agnóstico atual com base no nível de expressão de CXCR4 sozinho pre- cisa ser alterado para considerar os níveis de expressão de CXCR4 e GPCRx.
[0371] Por outro lado, GPCRs, tais como APLNR (Figura 7a), CCR5 (Figura 7b), GALR1 (Figura 7c), PTGER3 (Figura 7d), e SSTR2 (Figura 7e) não mostraram respostas de cálcio aprimoradas quando células que expressam ambos receptores foram cotratados com ambos agonistas, embora estes GPCRs fossem mostrados por interagir com CXCR4 em ensaio de BiFC (Tabela 5) e cointernalização de CXCR4-GFP. Estes resultados claramente demonstram que o aumento sinérgico em res- posta de cálcio mostrado nas Figuras 5a a 5d e 6a a 6| é um recurso único de heterômeros CXCR4-GPCRx, que não é compartilhado por ou- tros heterômeros CXCR4-GPCRx, tais como CXCR4-APLNR, CXCRA4- CCOR5, CXCR4-GALR1, CXCR4-PTGER3, e CXCR4-SSTR?2.
[0372] Tabela 5. GPCRs que exibiram pontuação de BiFC maior ou igual 10 quando coexpressos com CXCRA4, porém, não mostraram sina- lização de Ca2+ aprimorada mediante cotratamento de ambos agonis- tas. TABELA 5 mento de ambos agonistas Pontuação de BIFC
LL LL E *CXCRA4-VC e GPCRX-VN foram usados.
[0373] Foi examinado adicionalmente se as respostas de cálcio aprimoradas em células que coexpressam CXCR4 e GPCRx mediante coestimulação com ligantes de CXCL12 e GPCRx são inibidas por an- tagonistas de GPCRx. Em células que coexpressam CXCR4 e ADRB2 (Figura 8a), CHRM1 (Figura 8b e Figura 8c), HRH1 (Figuras 8f a 8i), MLNR (Figura 8j), ou NTSR1 (Figura 8k), tratamento de 10 uM de anta- gonista de ADRB2 carvedilol (Figura 8a), 1 uM de antagonista de CHRM1 seletivo VUO255035 (Figura 8b), 10 UM de antagonista de CHRM1 oxibutinina (Figura 8c), 1 UM de antagonista de HRH1 seletivo cetirizina (Figura 8f), 1 uM de antagonista de HRH1 seletivo pirilamina (Figura 89), 10 uM de antagonista de HRH1 hidroxizina (Figura 8h), 10 UM de antagonista de HRH1 seletivo loratadina (Figura 8i), 1 UM de an- tagonista de MLNR seletivo MA-2029 (Figura 8j) e 1 UM de antagonista de NTSR1 seletivo meclinertant (Figura 8k), respectivamente, suprimi- ram a sinalização de cálcio aprimorada significativamente. E o cotrata- mento de ambos antagonistas, juntos, resultou em uma supressão mais completa (Figuras 8a a 8c, e 8f a 8k). Estes resultados demonstraram que antagonistas de GPCRx poderiam ser usados como uma terapêu- tica eficiente contra heterômeros CXCR4-GPCRx, quando GPCRx re- presenta ADRB2, CHRM1, HRH1, MLNR e NTSR1.
[0374] Em células que coexpressam CXCR4 e CHRM1, 10 uM de antagonista de receptor de acetilcolina muscarínico, umeclidínio, redu- ziram a sinalização de cálcio aprimorada, embora não seja estatistica- mente significativo (Figura 8d). Nestas células, cotratamento de AMD3100 e umeclidínio inibiu quase completamente a resposta de cál- cio induzida por adição simultânea de CXCL12 e betanecol.
[0375] Em células que coexpressam CXCR4 e EDNRB (Figura 8e) ou TACR3 (Figura 81), o tratamento de 1 uM de AMD3100 sozinho (Fi- gura 8e e Figura 81), ou 1 uM de antagonista de receptor de endotelina bosentan (Figura 8e) ou 1 uM de antagonista de TACR3 seletivo SSR
146977 sozinho (Figura 81) falhou em inibir a resposta de cálcio aprimo- rada significativamente. Porém, quando as células foram cotratadas com AMD3100 e bosentan (Figura 8e) ou AMD3100 e SSR 146977 jun- tos (Figura 81), as respostas de cálcio aprimoradas foram significativa- mente inibidas.
[0376] Em células que coexpressam CXCR4 e CHRM1 (Figura 8b), EDNRB (Figura 8e), HRH1 (Figura 8f e 89), ou MLNR (Figura 8j), em- bora 1 uM de AMD3100 sozinho tenha falhado em inibir a sinalização de cálcio aprimorada, o cotratamento de 1 uM de ambos antagonistas juntos suprimiu significativamente a sinalização de cálcio aprimorada.
[0377] Estes resultados demonstram claramente que o cotrata- mento de pequenas doses de antagonistas que alvejam cada protômero fornece ferramentas terapêuticas inovadoras para suprimir de maneira eficiente a resposta de heterômero CXCR4-GPCRx, enquanto evita efeitos colaterais associados às altas doses de antagonistas individuais. EXEMPLO 4. INIBIÇÃO DE INTERNALIZAÇÃO POR ANTAGONIS- TAS DE GPCRX.
[0378] Para estudar adicionalmente se a cointernalização de hete- rodímero de CXCRA4 foi bloqueada pelos antagonistas de GPCRx par- ceiro, o ensaio de inibição de internalização foi realizado. Conforme mostrado nas Figuras 4b a 49, células U-2 OS que expressam CXCR4- GFP foram cointernalizadas por agonista de GPCRx específico parceiro quando CXCR4 e GPCRx foram simultaneamente transduzidos para cé- lulas (controle: CXCR4-GFP (Figura 4a)). Se CXCRA4 formou heterodí- mero com GPCRx e cointernalizou através de GPCRXxX parceiro, o mesmo pode ser bloqueado por antagonista de GPCRx específico.
[0379] Células U-2 OS que expressam estavelmente CXCR4-GFP foram transduzidas com adenovírus que codificam GPCRx (ADRB?2, CHRM1, HRH1). Após 2 dias, imagens foram obtidas antes e 20 minutos após estimular as células com agonista de CXCR4 específico, CXCL12
(SDF-1) (20 nM), e/ou antagonista de GPCRx específico (10 uM). Inter- nalização de CXCRA4-GFP foi observada como grânulos de GFP com o uso de analisador de célula IN 2500. Perda de expressão de GFP na superfície celular ou surgimento de grânulos de GFP dentro das células foram considerados como cointernalização de CXCR4-GFP. Agonista de CXCR4, CXCL12 induziu internalização de CXCR4-GFP com GPCRx (Figuras 10a a c, primeiras colunas). Antagonistas de GPCRx, tratados como a seguir, não tiveram efeito sobre a internalização do he- terômero (Figuras 10a a c, segundas colunas): Carvedilol, um antago- nista de ADRB2 (Figura 10a); oxibutinina e umeclidínio, antagonistas de CHRM1 (Figura 10b); prometazina, hidroxizina e loratadina, antagonis- tas de HRH1 (Figura 10c). Internalização de CXCL12 estimulou CXCR4- GFP com GPCRx foi inibida por antagonistas de GPCRx específicos (Figuras 10a a c, terceiras colunas).
[0380] Estes dados demonstram que cointernalização de CXCR4- GPCRx foi um evento específico de heterômero e CXCR4 e GPCRx for- maram heterodímero. Estes dados demonstram, adicionalmente, que, através da inibição de internalização de heterômero CXCRA, sinal a ju- sante anormal em células superexpostas de heterômero CXCRA4- GPCRXx, tais como cânceres, pode ser bloqueado para fins terapêuticos. EXEMPLO 5. AVALIAÇÃO ATRAVÉS DE ENSAIO DE PROLIFERA- ÇÃO CELULAR DE EFEITOS FENOTÍPICOS DE INIBIDOR DE SINA- LIZAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX SOBRE CRESCI- MENTO TUMORAL.
[0381] Diversos antagonistas de CXCR4 foram desenvolvidos, po- rém, nenhum foi aprovado como fármacos anticâncer até o momento. Para superar a limitação de inibidores de CXCR4 e para desenvolver agente terapêutico com base em heterômero CXCRA, o efeito de anta- gonista de GPCRx sobre proliferação celular foi testado pelos invento- res.
[0382] Foram preparadas suspensões de célula única de tecidos de glioblastoma retirados e dissociados dos pacientes. (fornecidas pelo hospital de Samsung Seoul em Seoul, Coreia) Estas células foram cul- tivadas sob condições ideias para propagação e não diferenciação de célula tronco neuronal normal. Meios foram meios neurobasais isentos de soro compostos complementados com FGF e EGF básicos.
[0383] O efeito de antagonista de GPCRx sobre a sobrevivência de células derivadas de paciente (PDCs) foi avaliado com o uso de ATPIite (PerkinElmer, reagente de número de Cat. 6016739. ATPIite é um sis- tema de monitoramento de trifospato de adenosina com base em lucife- rase vagalume. Este ensaio de luminescência é a alternativa para en- saios colorimétricos, fluorométricos e radioisotópicos para a avaliação quantitativa de proliferação e citotoxicidade de células de mamífero cul- tivadas. Células foram semeadas em placa de 384 poços a 500 célu- las/poço em 40 ul de meio de cultura. Após crescimento de um dia para o outro, as células foram cultivadas por 7 dias na presença de diversas doses de antagonista de GPCRx ou DMSO sozinho. Após a incubação de 7 dias, 15 ul de ATPIite foram adicionados em cada poço e a placa foi agitada por 5 minutos em um agitador orbital a 700 rom. O sinal lu- minescente foi detectado dentro de 30 minutos no instrumento de de- tecção PerkinElmer TopCount. A viabilidade celular foi calculada com o uso da equação: Viabilidade celular (%) = (OD de tratamento de anta- gonista/OD de tratamento de DMSO apenas) x 100%.
[0384] Conforme mostrado nas Figuras 11a a c, quando Carvedilol, antagonista de ADRB2 específico, foi tratado em PDC que expressa CXCR4 e ADRB2, o crescimento de células foi significativamente ini- bido. (IC50 = 11,69 uM, Figura 11a). Oxibutinina e umeclidínio, antago- nistas de CHRM1, também inibidos na sobrevivência de PDc. Oxibuti- nina ou umeclidínio, cada um, mostrou sobrevivência significativamente diminuída de células em IC50 = 3,04 uM e 4,03 UM, respectivamente.
(Figura 11b). Prometazina, hidroxizina e/ou loratadina como um antago- nista de HRH1 mostraram, cada um, sobrevivência diminuída de PDc em IC50 = 18,39 uM, 12,79 uM ou 5,29 UM, respectivamente.(Figura 11c).
[0385] Estes resultados demonstram que a proliferação celular anormal induzida por heterômero CXCRA4 pode ser bloqueada por anta- gonista de GPCRx específico parceiro nas células que expressam he- terômero CXCR4-GPCRXx, o que indica que a inibição de crescimento de célula cancerígena com o uso de antagonista de GPCRx parceiro nos pacientes que carregam heterômero CXCR4-GPCRXx pode superar as limitações de inibidores de CXCRA4 sozinhos como terapêutica contra câncer. EXEMPLO 6. AVALIAÇÃO DE FORMAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX EM CÉLULAS DERIVADAS DE PACIENTE (PDC) COM O USO DE ENSAIO DE LIGAÇÃO DE PROXIMIDADE (PLA).
[0386] Para investigar a existência de complexos de GPCR em te- cidos nativos, várias abordagens, tais como microscopia de força atô- mica (Fotiadis et al., 2006), coimunoprecipitação (Gomes et al., 2004) e ensaios de ligação ou funcionais (Wreggett e Wells, 1995) foram usa- das. Os métodos mais convenientes para monitorar interações são com base na transferência de energia de ressonância realizada com proteí- nas identificadas. A identificação pode ser realizada através de sondas seletivas, tais como anticorpos ou ligantes fluorescentes (Roess et al., 2000; Patel et al., 2002).
[0387] Bazin et al., empregou uma abordagem com base em trans- ferência de energia de ressonância de fluorescência de prazo estabele- cido (TR-FRET) que oferece uma razão de sinal para ruído muito maior (Bazin et al., 2002). FRET é com base na transferência de energia entre dois fluoróforos, um doador e um aceitante, quando em grande proximi- dade. Interações moleculares entre biomoléculas podem ser avaliadas acoplando-se cada parceiro com uma identificação fluorescente e de- tectando-se o nível de transferência de energia. Introduzir um atraso de tempo de aproximadamente 50 a 150 yu segundos entre a excitação de sistema e a medição de fluorescência permite que o sinal seja desobs- truído de todas as emissões de curta duração não específicas.
[0388] O ensaio de ligação de proximidade (PLA) é uma tecnologia que estende as capacidades de imunoensaios tradicionais em incluir a detecção direta de proteínas, interações de proteína e modificações com alta especificidade e sensibilidade (Gullberg et al., 2004). Dois an- ticorpos primários criados em diferentes espécies reconhecem o antí- geno-alvo nas proteínas de interesse. Anticorpos secundários direcio- nados contra as regiões constantes dos diferentes anticorpos primários, chamados de sondas de PLA, se ligam aos anticorpos primários. Cada uma das sondas de PLA tem uma curta fita de DNA única presa à mesma, se as sondas de PLA estão muito próximas (isto é, se as duas proteínas originais de interesse estão muito próximas, ou parte de um complexo de proteína, conforme mostrado nas Figuras), as fitas de DNA podem participar da síntese de DNA de círculo de rolamento quando substratos e enzimas apropriados são adicionados. A reação de síntese de DNA resulta na amplificação de diversas centenas de vezes do cír- culo de DNA. A seguir, sondas de oligonucleotídeo complementares identificadas fluorescentes são adicionadas, e se ligam ao DNA amplifi- cado. A alta concentração resultante de fluorescência é facilmente visí- vel como um ponto claro distinto quando vista com um microscópio de fluorescência (Gustafsdottir et al., 2005).
[0389] Linha celular que superexpressa CXCRA4, U2OS-CXCRA, foi infectada com adenovírus que expressa ADRB2, Ad-ADRB?2, na dose de O, 2,5, 10, 40 MOIs por 2 dias. PLA foi realizado conforme descrito anteriormente (Brueggemann et al., 2014; Tripathi et al., 2014). Para realizar PLA, células infectadas foram fixadas com 4% de paraformal- deído (PFA) em lâminas de cultura de tecido de dezesseis poços. As lâminas foram bloqueadas com solução de bloqueio fornecida pela Du- olink e incubadas com anti-CXCR4 de camundongo (1:200, Santacruz, Sc-53534), anticADRB2 de coelho (1:200, Thermoscientific, PA5- 33333), anti-cCHRM1 de coelho (1:200, Ls bio, Ls-C313301) a 37 ºC por 1h em uma câmara de umidificação. Lâminas foram, então, lavadas e incubadas (1 h a 37 ºC) com anticorpos anti-coelho e anti-camundongo secundários conjugados com sondas de PLA Duolink Il mais e menos. Lâminas foram lavadas novamente e, então, incubadas com solução de ligação-ligase (30 min a 37 ºC) seguido por incubação com solução de amplificação-polimerase (2 h a 37 ºC). Lâminas foram, então, montadas com volume mínimo de meio de montagem Duolink Il com 4',6-diami- dino-2-fenilindol (DAPI) por 15 a 30 min, e sinais de PLA [Reagentes de Detecção /n Situ Duolink Verde (A de excitação/emissão 495/527 nm) ou Vermelho (A de excitação/emissão 575/623 nm) foram identificados como pontos fluorescentes sob um analisador de célula IN 2500.
[0390] Conforme mostrado nas Figuras 12a a 12b, o sinal de PLA aumenta em uma maneira dependente de dose, como o nível de ex- pressão de ADRB2. Figura 12a: Imagens de sinal de PLA de células U20S que expressam heterômero CXCR4-ADRB2 sobre uma série de MOIs (multiplicidade de infecção). Figura 12b: Os pontos de sinal ver- melhos foram contados e calculados por normalização contra controle negativo. O sinal de PLA aumentou proporcionalmente ao nível de ex- pressão de ADRB2 em uma maneira dependente de dose. Figura 12c: Para investigar expressão de ADRB2 endógeno, gqRT-PCR foi realizado com iniciadores de ADRB2 específicos. Como os resultados mostram, nível de expressão de ADRB2 endógeno de célula U2OS foi bastante alto, o que indica que o sinal de PLA é detectado mesmo na seção sem infecção de vírus (em O MOI para ADRB2).
[0391] Tradicionalmente glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral pri- mário mais comum e letal. Biologia de câncer pré-clínico dependeu muito do uso de linhas de célula cancerígena humana in vitro e do pro- cesso de xenoenxerto de estabelecer estas linhas celulares. No entanto, o processo de estabelecer linhas celulares convencionais resulta em perda irreversível de propriedades biológicas importantes e, como re- sultado, os modelos de tumor de xenoenxerto não mantêm característi- cas genômicas e fenotípicas presentes no tumor original.
[0392] A célula derivada de paciente (PDC) derivou diretamente do glioblastoma que porta similaridades extensivas para células-tronco neurais normais e recapitulam o genótipo, padrões de expressão de gene, e biologia in vivo de glioblastomas humanos.
[0393] Para realizar PLA com amostras de PDC, as células deriva- das de paciente foram colocadas em placa e fixadas com 4% de PFA em lâminas de cultura de tecido de dezesseis poços. As lâminas foram bloqueadas com solução de bloqueio fornecida pela Duolink e incuba- das com anti-CXCR4 de camundongo (1:200, Santacruz, Sc-53534), anti-ADRB2 de coelho (1:200, Thermoscientific, PA5-33333), anti- CHRM1 de coelho (1:200, Ls bio, Ls-C313301) a 37 ºC por 1 h em uma câmara de umidificação. Lâminas foram, então, lavadas e incubadas (1 h a 37ºC) com anticorpos anti-coelho e anti-ccamundongo secundários conjugados com sondas de PLA Duolink Il mais e menos. Lâminas fo- ram lavadas novamente e, então, incubadas com solução de ligação- ligase (30 min a 37ºC) seguido por incubação com solução de amplifi- cação-polimerase (2 h a 37ºC). Lâminas foram, então, montadas com volume mínimo de meio de montagem Duolink Il com 4' ,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) por 15 a 30 min, e sinais de PLA [Reagentes de Detec- ção In Situ Duolink Verde (A de excitação/emissão 495/527 nm) ou Ver- melho (A de excitação/emissão 575/623 nm) foram identificados como pontos fluorescentes sob o analisador de célula IN 2500.
[0394] Conforme mostrado nas Figuras 13a a 13b e Figuras14a a 14b, a razão de PLA se refere ao heterômero CXCR4-GPCRXx, e a fre- quência da formação de heterômero varia dependendo do paciente. À razão de PLA foi calculada como: número de pontos fluorescentes em amostra de PDC/número de pontos fluorescentes em controle negativo. O controle negativo (NC) representa sinal de fluorescência de fundo, indicado pelo número de pontos quando apenas o anticorpo secundário conjugado com sondas de PLA Duolink Il mais e menos é tratado sem tratamento de anticorpo primário (anticCXCR4 de camundongo, anti- ADRB?2 de coelho, anti-CHRM1 de coelho) em processamento de PLA. Estes dados demonstram a análise quantitativa de heterodímero CXCRA4-ADRB2 em amostras de paciente com câncer. EXEMPLO 7. AVALIAÇÃO DE FORMAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX IN VIVO COM O USO DE MODELO DE PDX.
[0395] Para realizar PLA com amostras de PDX, as amostras de FFPE derivadas de paciente com glioblastoma foram usadas (forneci- das pelo hospital de Samsung Seoul em Seoul, Coreia). Após a amostra de FFPE ser desparafinizada e ter realizado recuperação de antígeno induzida por calor por 15 minutos a 100 ºC. Lâminas foram bloqueadas com solução de bloqueio fornecida pela Duolink e incubadas com anti- CXCRA4 de coelho (1:200, Thermoscientific, PA3305), anti-ADRB2 de camundongo (1:200, Santacruz, Sc-271322), a 37 ºC por 1 h em uma câmara de umidificação. O outro processo foi igual ao descrito acima (PLA com PDC).
[0396] Na Figura 15a, os núcleos foram visualizados com tingi- mento de DAP], e heterômeros CXCR4-ADRBA4 foram tingidos com PLA como pequenos pontos. Conforme mostrado na Figura 15b, a razão de PLA é diferente de acordo com o paciente e com base neste resultado, o que indica que é possível realizar medicina personalizada pelos diag- nósticos de acompanhamento.
EXEMPLO 8. AVALIAÇÃO ATRAVÉS DE ENSAIO DE MOBILIZAÇÃO DE CA2+ DE SINALIZAÇÃO A JUSANTE DE CXCR4 APRIMORADA MEDIANTE FORMAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX.
[0397] Em células que superexpressam tanto CXCR4 quanto ADRB)2, a estimulação com salmetero| sozinho não elicita dose de mo- bilização de cálcio de maneira dependente (Figura 16a). Porém, quando as células foram coestimuladas com salmeterol na presença de CXCL12, a sinalização de cálcio foi muito aprimorada em uma faixa am- pla de concentrações de salmeterol, tais como concentrações na faixa entre 10 nM e 300 nM.
[0398] De maneira similar, cotratamento com histamina e CXCL12 também aprimorou significativamente as respostas de cálcio em células que superexpressam tanto CXCR4 quanto HRH1 sobre uma faixa am- pla de concentrações de histamina (0,3 nM a 300 nM), mesmo em con- centrações de histamina que não evocaram quaisquer respostas de cál- cio quando tratadas sozinhas (0,3 nM e 1 nM) (Figura 16b). Conside- rando-se que a concentração de histamina em plasma humano e glo- mérulos está abaixo de 10 nM e 2 UM, respectivamente (Sedor e Abboud, 1984), este resultado indica que a sinalização de cálcio apri- morada através de heterômero CXCR4-HRH1 pode ocorrer em níveis fisiológicos de concentração de histamina in vivo.
[0399] Em células que expressam CXCR4-APLNR (Figura 17a), CXCR4-PTGERS3 (Figura 17b), ou CXCR4-SSTR?2 (Figura 17c), estimu- lação com agonista de GPCRx (apelina-13, PGE2, ou octreotida, res- pectivamente) sozinho aumentou a dose de sinal de cálcio de maneira dependente. No entanto, diferente das células que expressam CXCR4- ADRB2 ou CXCR4-HRH1, o sinal de cálcio não foi aprimorado nem um pouco mediante coestimulação com ambos agonistas (agonista de CXCL12 e GPCRx) em quaisquer faixas de dose testadas em células que expressam CXCR4-APLNR, CXCR4-PTGER3 ou CXCR4-SSTR2.
Estes resultados são consistentes com os resultados mostrados nas Fi- guras 7a, 7d, 7e, respectivamente, e mostram que a falta de aprimora- mento de sinal em células que expressam CXCR4-APLNR ou CXCR4- SSTR2 mediante coestimulação não ocorreu devido ao uso de uma dose específica de agonista de GPCRx, mas sim devido à natureza in- trínseca destes heterômeros. Estes resultados também demonstram claramente que as respostas de cálcio aprimoradas mostradas nas Fi- guras 6a a 6| e Figuras 16a a 16b são recursos únicos de heterômeros CXCR4-GPCRx, tais como CXCR4-ADRB2 ou CXCR4-HRH1, con- forme descrito nas Figuras 5c a 5d e Figura 6h, respectivamente. EXEMPLO 9. AVALIAÇÃO DE MOBILIZAÇÃO DE CA2+ APRIMO- RADA MEDIANTE COESTIMULAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4- HRH1 ENDÓGENO EM CÉLULAS MDA-MB-231.
[0400] Com o uso de RT-qgPCR, os níveis de expressão endógena de CXCR4 e HRH1 em células MDA-MB-231 foram medidos. Os ciclos de limite (Ct) de CXCR4 e HRH1 foram 28,5 e 27,7, respectivamente, quando 12,5 ng de RNA total foram analisados. Estimulação de células MDA-MB-231 com CXCL12 (100 nM), ou histamina (10 nM) sozinha, elicitou respostas de cálcio fracas (Figura 18a). Porém, quando as célu- las foram coestimuladas com CXCL12 e histamina juntos, foi observada uma resposta de cálcio muito aprimorada similar ao aprimoramento ob- servado em células que superexpressam CXCR4 e HRH1 juntos (Figu- ras 18a e 18b, em comparação com a Figura 16b). O resultado indica claramente que a resposta de cálcio aprimorada mediante coestimula- ção com ambos agonistas poderia ocorrer em células nativas que ex- pressam tanto CXCRA4 quanto HRH1 juntos. EXEMPLO 10. AVALIAÇÃO DE MIGRAÇÃO APRIMORADA DE CÉ- LULAS CANCERÍGENAS POR HETERÔMERO CXCRA4-HRH1 MEDI- ANTE COESTIMULAÇÃO COM AMBOS LIGANTES.
[0401] Visto que células MDA-MB-231 expressam cerca de duas vezes mais mMRNA de HRH1 em comparação com mMRNA de CXCR4 quando medido por RT-qPCR, as células MDA-MB-231 foram transdu- zidas com pequena quantidade de lentivírus que codifica CXCR4 (1 MOI) e migração quimiotática das células em direção a CXCL12 e HRH1 foi medida (Figuras 19a e 19b). Histamina (50 nM) sozinha, suficiente para produzir sinalização de cálcio conforme mostrado na Figura 27a (consultar abaixo), não induz migração de célula. Por outro lado, quando tratada juntamente com CXCL12, a histamina aprimorou significativa- mente a migração de células MDA-MB-231 em direção ao CXCL12. No entanto, na presença de pirilamina, um agonista inverso de HRH1 sele- tivo, a coestimulação das células com CXCL12 e histamina falhou em aprimorar a migração de célula elicitada por CXCL12. Os resultados de- monstram claramente que o aprimoramento de migração de célula can- cerígena observada foi especificamente induzido por HRH1, e não por outros subtipos de receptor de histamina. EXEMPLO 11. AVALIAÇÃO ATRAVÉS DE ENSAIO DE MOBILIZA- ÇÃO DE CA2+ DE SINALIZAÇÃO A JUSANTE DE CXCR4 APRIMO- RADA MEDIANTE FORMAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX E INIBIÇÃO DA SINALIZAÇÃO APRIMORADA.
[0402] Em células que superexpressam tanto CXCR4 quanto ADRB?2, o cotratamento de ambos agonistas de CXCL12, um agonista de CXCRA4 e salmeterol, um agonista de ADRB2 seletivo aumentou sig- nificativamente a resposta de cálcio em comparação com aquelas evo- cadas por agonistas individuais (Figura 20). Esses resultados clara- mente demonstram que o heterômero CXCR4-ADRB2 exibe proprieda- des distintas daquelas dos GPCRs individuais.
[0403] Foi examinado se as respostas de cálcio aprimoradas em células que coexpressam CXCR4 e ADRB2 mediante coestimulação com ligantes de CXCL12 e ADRB2 são inibidas por anticorpo anti- CXCRA4 como um antagonista de CXCRA4. Em células que coexpressam
CXCR4 e ADRB2, o tratamento de 2 ug de anticorpo anti-CXCRA4, 12G5, suprimiu a sinalização de cálcio aprimorada, conforme mostrado na Fi- gura 20. E o cotratamento de ambos antagonistas (Carvedilol, antago- nista de ADRB2 e 12G5, antagonista de CXCRA4 juntos) resultou em uma supressão mais significativa. Estes resultados demonstraram que o anticorpo anti-CXCR4 e antagonista de ADRB2 poderiam ser usados como uma terapêutica eficiente contra heterômero CXCR4-ADRB?2.
[0404] Com a utilização do ensaio de mobilização de cálcio, as cé- lulas MDA-MB-231 de câncer de mama humano foram semeadas em 20000 células por poço em uma placa de 96 poços de fundo transpa- rente preto (Corning Costar, nº 3340) em 100 ul de RPMI 1640 comple- mentado com 10% de FBS. No dia seguinte, células foram cotransduzi- das com 10 MOI de CXCRA4 e 30 MOI de GPCRx. Após 2 dias, as células foram tratadas com antagonista de ADRB2, Carvedilol(Tocris), anti- corpo anti-CXCR4, 12G5 (Thermo Scientific, 35-8800) com quantidades indicadas e incubadas com Cal 6 (Kit de Ensaio FLIPRO Calcium 6 pela Molecular Devices, número de Cat. R8191) por 2 h. E, então, as células foram estimuladas com quantidades indicadas de CXCL12, agonista de ADRB?2 ou agonista de CXCL12 e ADRB2. Mobilização de cálcio foi me- dida com o uso de Leitor de Microplaca FlexStation 3 Multi-Mode. Os resultados foram normalizados para atividade de linha de base. Mobili- zação de cálcio foi quantificada calculando-se a área sob a curva (AUC) de cada gráfico. Dados foram normalizados para resposta de cálcio es- timulada por CXCL12 em células que expressam CXCRA4 sozinho. Da- dos representam três experimentos independentes (média + SEM). *P < 0,05; Teste t de Student. EXEMPLO 12. AVALIAÇÃO DE FORMAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX EM CÉLULA QUE EXPRESSA CXCR4-GPCRX COM O USO DE PLA.
[0405] Um processo para examinar um heterômero CXCR4-GPCRx é essencial para o tratamento de fármaco anticâncer de CXCR4-GPCRx alvejado. Primeiro, para a detecção quantitativa de heterômero CXCR4 e GPCRx, PLA foi realizado em células que expressam CXCR4-GPCRx. Linha celular que superexpressa CXCR4, U2OS-CXCRA, foi infectada com adenovírus que expressa GPCRx, Ad-GPCRXx, na dose de 0, 2,5, 10, 40 MOIs por 2 dias. E, então, as células transduzidas foram fixadas com 4% de paraformaldeído e o PLA foi realizado. O número de sinais de PLA significa demonstrar quantitativamente a formação de hetero- merização de CXCR4-GPCRx.
[0406] Conforme mostrado nas Figuras 21a a 21b, o sinal de PLA aumentou proporcionalmente ao nível de expressão de CHRM1 (Figura 21a) e HRH1 (Figura 21b) em uma maneira dependente de dose. Estes resultados demonstram a detecção de diferentes tipos de heterômero CXCR-GPCRx e análise quantitativa de heterômero CXCR4-GPCRx nas amostras de paciente com câncer.
[0407] Ao utilizar o PLA em células, linhas celulares de superex- pressão de CXCRA4, a U2OS-CXCRA4 foi infectada com adenovírus que expressa GPCRx, Ad-GPCRx na dose de O, 2,5, 10, 40 MOIs por 2 dias. PLA foi realizado conforme descrito anteriormente (Brueggemann et al., 2014; Tripathi et al., 2014). Para realizar PLA, células infectadas foram fixadas com 4% de PFA em lâminas de cultura de tecido de dezesseis poços. Lâminas foram bloqueadas com solução de bloqueio fornecida pela Duolink e incubadas com anti-CXCR4 de camundongo (Santacruz, Sc-53534), anti-CHRM1 de coelho (LS Bio, LS-C313301) ou anti-HRH1 de coelho (Thermoscientific, PA5-27817) a 37 ºC por 1 h em uma câ- mara de umidificação. Lâminas foram, então, lavadas e incubadas (1 h a 37 ºC) com anticorpos anti-coelho e anti-camundongo secundários conjugados com sondas de PLA Duolink Il mais e menos. Lâminas fo- ram lavadas novamente e, então, incubadas com solução de ligação-
ligase (30 min a 37 ºC) seguido por incubação com solução de amplifi- cação-polimerase (2 h a 37 ºC). Lâminas foram, então, montadas com volume mínimo de meio de montagem Duolink Il com 4' 6-diamidino-2- fenilindo!l (DAPI) por 15 a 30 min, e sinais de PLA [Reagentes de Detec- ção In Situ Duolink Verde (A de excitação/emissão 495/527 nm) ou Ver- melho (A de excitação/emissão 575/623 nm) foram identificados como pontos fluorescentes sob um analisador de célula IN 2500. EXEMPLO 13. INIBIÇÃO DE MOBILIZAÇÃO DE CA2+ DA SINALIZA- ÇÃO A JUSANTE DE CXCR4 APRIMORADA MEDIANTE FORMA- ÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX - COMPARAÇÃO DE TRA-
TAMENTO DE INIBIDOR ÚNICO COM TRATAMENTO DE INIBIDOR DE COMBINAÇÃO.
[0408] Os dados mostrados acima (consultar o Exemplo 3, Figura 8a) demonstraram que um sinal de Ca2+ aumentado devido à formação de heterômero CXCR4-ADRB?2 foi significativamente diminuído quando tratado simultaneamente com um inibidor de CXCRA4 e um inibidor de ADRB?2. O grau de inibição (medido como valores de IC50 para resposta de Ca?*) foi comparado com uma série de inibidores de CXCRA4, avali- ado como tratamento único em células que expressam CXCR4 sozinho (contexto de protômero individual), como tratamento único em células que expressam heterômero CXCR4-ADRB2 e como cotratamento com um inibidor de ADRB2 (Carvedilol; 10 uM) em células que expressam heterômero CXCR4-ADRB2.
[0409] Células MDA-MB-231 foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 apenas, ou CXCR4 e ADRB. As células foram cultivadas por 2 dias e foram tratadas com inibidor de CXCR4 apenas ou cotratadas com um inibidor de CXCR4 e um inibidor de ADRB2 (Car- vedilol; 10 uM). As células foram, então, tingidas com Cal-6 por 2 horas e estimuladas com agonista de CXCR4 (CXCL12; 20 nM) e agonista de ADRB?2 (Salmeterol; 1 uM). A mobilização de cálcio foi medida com o uso de FlexStation3, os resultados da mesma são mostrados na Tabela 6, que mostra IC50 de resposta de Ca2* em: (1) células MDA-MB-231 que expressam CXCR4 sozinho (contexto de protômero individual), tra- tadas com inibidor de CXCR4 apenas (2º coluna); (2) células MDA-MB- 231 que expressam heterômero CXCRA4-ADRB;2, tratadas simultanea- mente com inibidor de CXCRA4 e inibidor de ADRB2, Carvedilol, (3º co- luna); e (3) células MDA-MB-231 que expressam heterômero CXCR4- ADRB32, tratadas apenas com inibidor de CXCRA4 (4º coluna). TABELA 6 | | gg o e Inibidor de CXCR4 dilol) (- Carvedilol) o as | amar amena ee as [es | asse TE | | es ee | eee mes O amam | ameno | sense e se e | mese
[0410] Conforme mostrado na Tabela 6, o valor de IC50 de resposta de Ca?* foi dependente de inibidor de CXCR4 no contexto de tratamento único de células MDA-MB-231 que expressam CXCR4 sozinho, e no contexto de tratamento único e no contexto de cotratamento com um inibidor de ADRB2 de células MDA-MB-231 que expressam heterômero CXCRA4-ADRB2. Dependendo da identidade do inibidor de CXCRA4, o valor de IC50 de resposta de Ca?* no contexto de heterômero CXCR4- ADRB?2 diminuiu em 1400 vezes ou mais quando tratado em combina- ção com um inibidor de ADRB2 (3º coluna), com relação ao tratamento único com o inibidor de CXCRA4 sozinho (4º coluna). Por exemplo, o va- lor de IC50 de resposta de Ca?* no contexto de heterômero CXCR4- ADRB?2 diminuiu cerca de 540 vezes (de 28,65 nM para 0,053 nM), cerca de 1400 vezes (de 1,12 nM para 0,0008 nM), ou cerca de 890 vezes (de 17,78 nM para 0,02 nM), mediante cotratamento de Carvedilol com AMD3100, Ulocuplumabe, ou TZ14011, com relação ao tratamento único com AMD3100, Ulocuplumabe, ou TZ14011, respectivamente. Estes resultados sugerem que o cotratamento com um inibidor de CXCRA4 e inibidor de ADRB?2 inibe de maneira mais eficaz a resposta de Ca?* aumentada do que o tratamento único com um inibidor de CXCR4 sozinho nas células que expressam heterômero CXCR4-ADRB2.
[0411] Para determinar a possibilidade de que a formação de hete- rômero CXCR4-ADRBZ2 induz alteração de conformação e/ou altera a afinidade de ligação para o inibidor de CXCRA, os valores de IC50 de resposta de Ca?* foram comparados entre tratamento único com um ini- bidor de CXCRA4 de células que expressam CXCR4 sozinho e células que expressam heterômero CXCRA4-ADRB2. Os resultados mostraram que tratamento único com um inibidor de CXCRA4 alterou o valor de IC5O0 apenas em cerca de 0,4 a 5 vezes em células que expressam heterô- mero CXCR4-ADRB2 (4º coluna), com relação às células que expres- sam CXCRA4 sozinho (2º coluna). Estes resultados sugerem que cotra- tamento com inibidor de CXCR4 e inibidor de ADRB2 pode aumentar, a um grau dramático para determinados inibidores de CXCRA, a eficácia terapêutica em relação aos pacientes e/ou células/tecidos de paciente que expressam heterômero CXCR4-ADRB2, em comparação com tra- tamento único com inibidor de CXCRA4. EXEMPLO 14. EFEITO DE HETERÔMERO CXCR4-ADRB2 EM CRESCIMENTO TUMORAL.
[0412] Para investigar o efeito de heterômero CXCR4-ADRB2 no crescimento tumoral, linhas celulares que superexpressam estavel- mente CXCRA4 sozinho ou heterômero CXCR4-ADRB?2 foram prepara- das em célula de câncer pulmonar A549, e a mesma quantidade de cé- lulas (1x10” célula/cabeça) foram injetadas por via subcutânea em ca- mundongos nus para comparar taxas de crescimento tumoral. Con- forme mostrado nas Figuras 22a a 22b, o tamanho de tumor em 28 dias após transplante foi de 351,4 + 214,7 mm? para A549, 726,9 + 259,6 mm? para A549-CXCRA4 e 1012,2 + 556,1 mm? para A549-CXCR4- ADRBZ2. A taxa de crescimento tumoral de camundongos transplanta- dos com o A549-CXCR4 que superexpressa CXCR4 foi mais rápida do que aquela de camundongos que carregam apenas A549 parental, e o crescimento tumoral mais rápido foi observado em camundongos trans- plantados com células que superexpressam o heterômero CXCRA4- ADRB2. Estes resultados sugerem que a formação de heterômero CXCR4-ADRB2 aumenta sinergicamente a resposta de Ca?* e, assim, promove crescimento tumoral.
[0413] Imagens de três camundongos que foram transplantados com célula parental A549, AS49-CXCRA4 que superexpressa estavel- mente CXCR4, ou AS49-CXCR4-ADRB2 que superexpressa estavel- mente heterômero CXCR4-ADRB2, em 28 dias após o transplante, são mostradas na Figura 22a. Estas imagens mostram que o tamanho de tumor do camundongo que carrega a célula que expressa heterômero CXCRA4-ADRB2 é o maior (que mais acelerou) dentre eles. As taxas de crescimento tumoral destes três camundongos diferentes ao longo do tempo são ilustradas graficamente na Figura 22b. Crescimento tumoral foi monitorado todo terceiro ou quarto dia medindo-se o comprimento (L) e largura (W) do tumor e calculando-se o volume tumoral com base na seguinte Fórmula: Volume = 0,5 LW?. Os camundongos que carre- gam célula que expressa CXCR4 mostram crescimento tumoral relati- vamente rápido em comparação com os camundongos que carregam célula parental AS49, e o crescimento tumoral é o mais rápido em ca- mundongos transplantados com células que superexpressam o heterô- mero CXCR4-ADRB?2.
EXEMPLO 15. AVALIAÇÃO ATRAVÉS DE ENSAIO DE MOBILIZA- ÇÃO DE CA2+ DE SINALIZAÇÃO A JUSANTE DE CXCR4 APRIMO- RADA MEDIANTE COESTIMULAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-
GPCRX COM LIGANTES ENDÓGENOS.
[0414] O aprimoramento da resposta de cálcio em células MDA-MB- 231 que coexpressam CXCR4 e GPCRx mediante coestimulação com CXCL12 e ligante endógeno para GPCRx, é mostrado nas Figuras 23a a 23g. Células MDA-MB-231 foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e HA-VC, GPCRx e HA-VC, ou CXCR4 e GPCRx, em que GPCRx representa ADCYAP1R1 (Figura 23a), ADORAZB (Figura 23b), ADORAS3 (Figura 23c), CHRM1 (Figura 23d), EDNRB (Figura 23e), MLNR (Figura 23f), e TACR3 (Figura 23g). Células foram tratadas com CXCL12 sozinho, ligante endógeno de GPCRx sozinho ou ligante de CXCL12 e GPCRx juntos. Mobilização de cálcio foi calculada conforme descrito na Figura 5d. A diferença estatisticamente significativa entre a soma (quadrado com pontos) e cotratamento (quadrado preenchido) foi determinada através de Teste t de Student. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; média + SEM (n =3).
[0415] Na Figura 6a, a sinalização de Ca?* aprimorada foi obser- vada em células que expressam CXCR4 e ADCYAP1R1 juntos, porém, não em células que expressam GPCR individual sozinho, mediante co- tratamento com CXCL12 e VIP, um ligante de ADOCYAP1IR1 endógeno não seletivo. Quando as células foram cotratadas com CXCL12 e PA- CAP-38, um ligante endógeno de ADCYAP1R1 seletivo, sinalização de Ca2+ aprimorada também foi observada (Figura 23a). O resultado de- monstra que a sinalização aprimorada de heterômero CXCR4- ADCYAP1R1 mediante coestimulação com CXCL12 não é apenas limi- tada ao VIP, mas também ao ligante natural de ADCYAP1R1 seletivo. O mesmo sugere, adicionalmente, que este aprimoramento poderia acontecer in vivo em células que expressam CXCR4 e ADCYAP1IR1 juntos por seus ligantes naturais.
[0416] A sinalização de Ca?* aprimorada foi observada nas células que expressam CXCR4 e ADORAZB (Figura 6b) ou CXCR4 e ADORA3 juntos (Figura 6c), porém, não em células que expressam GPCR indivi- dual sozinho, mediante cotratamento com CXCL12 e BAY 60-6583 (agonista de ADORAZB seletivo), ou CXCL12 e CI-IB-MECA (agonista de ADORA; seletivo), respectivamente. Quando estas células foram co- tratadas com CXCL12 e adenosina, o ligante endógeno para todos os receptores de adenosina, a sinalização de Ca2+ aprimorada também foi observada (Figuras 23b e 23c). O resultado demonstra que o ligante endógeno natural, não apenas agonistas sintéticos, aprimora a sinaliza- ção a jusante de heterômeros CXCR4-ADORA2Z2B e CXCR4-ADORA3 mediante coestimulação com CXCL12. O mesmo sugere, adicional- mente, que aprimoramento sinérgico de sinalização a jusante poderia acontecer in vivo em células que expressam CXCR4 e ADORAZB ou CXCR4 e ADORA3 juntos por seus ligantes naturais.
[0417] Na Figura 6f, a sinalização de Ca?* aprimorada foi observada em células que expressam CXCR4 e CHRM1 juntos, porém, não em células que expressam GPCR individual sozinho, mediante cotrata- mento com CXCL12 e betanecol, um agonista de CHRM1 sintético. Quando as células foram cotratadas com CXCL12 e acetilcolina, o li- gante endógeno para todos os receptores de acetilcolina, a sinalização de Ca2+ aprimorada também foi observada (Figura 23d). O resultado demonstra que ligante endógeno natural, não apenas agonista sintético, aprimora a sinalização de heterômero CXCR4-CHRM1 mediante coes- timulação com CXCL12. O mesmo sugere, adicionalmente, que aprimo- ramento sinérgico de sinalização a jusante poderia acontecer in vivo em células que expressam CXCR4 e CHRM1 juntos por seus ligantes na- turais.
[0418] Na Figura 6g, a sinalização de Ca?* aprimorada foi obser- vada em células que expressam CXCR4 e EDNRB juntos, porém, não em células que expressam GPCR individual sozinho, mediante cotrata- mento com CXCL12 e BQ3020, um agonista de EDNRB seletivo.
Quando as células foram cotratadas com CXCL12 e endotelina-1, o li- gante endógeno para receptores de endotelina, a sinalização de Ca?* aprimorada também foi observada (Figura 23e). O resultado demonstra que ligante endógeno natural, não apenas agonista sintético, aprimora a sinalização de heterômero CXCR4-EDNRB mediante coestimulação com CXCL12. O mesmo sugere, adicionalmente, que aprimoramento sinérgico de sinalização a jusante poderia acontecer in vivo em células que expressam CXCR4 e EDNRB juntos por seus ligantes naturais.
[0419] Na Figura 6i, a sinalização de Ca?* aprimorada foi observada em células que expressam CXCR4 e MLNR juntos, porém, não em cé- lulas que expressam GPCR individual sozinho, mediante cotratamento com CXCL12 e roxitromiícina, um antibiótico, assim como agonista de MLNR completo. Quando as células foram cotratadas com CXCL12 e motilina, um ligante endógeno seletivo para MLNR, a sinalização de Ca?* aprimorada também foi observada (Figura 23f). O resultado de- monstra que ligante endógeno natural, não apenas agonista sintético, aprimora a sinalização de heterômero CXCR4-MLNR mediante coesti- mulação com CXCL12. O mesmo sugere, adicionalmente, que aprimo- ramento sinérgico de sinalização a jusante poderia acontecer in vivo em células que expressam CXCR4 e MLNR juntos por seus ligantes natu- rais.
[0420] Na Figura 61, a sinalização de Ca?* aprimorada foi observada em células que expressam CXCR4 e TACR3 juntos, porém, não em cé- lulas que expressam GPCR individual sozinho, mediante cotratamento com CXCL12 e senktide, um agonista de TACR3 seletivo. Quando as células foram cotratadas com CXCL12 e neurocinina B, ligante endó- geno seletivo para TACR3, a sinalização de Ca?* aprimorada também foi observada (Figura 23g). O resultado demonstra que ligante endó- geno natural, não apenas agonista sintético, aprimora a sinalização de heterômero CXCR4-TACR3 mediante coestimulação com CXCL12. O mesmo sugere, adicionalmente, que aprimoramento sinérgico de sinali- zação a jusante poderia acontecer in vivo em células que expressam CXCR4 e EDNRB juntos por seus ligantes naturais.
EXEMPLO 16. AVALIAÇÃO ATRAVÉS DE ENSAIO DE MOBILIZA- ÇÃO DE CA2+ DE SINALIZAÇÃO A JUSANTE DE CXCR4 APRIMO- RADA MEDIANTE COESTIMULAÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4- GPCRX.
[0421] Nas células MDA-MB-231 que coexpressam CXCR4 e ADCYAP1R1, a estimulação com ligantes endógenos seletivos CXCL12 sozinho ou PACAP38 sozinho, respectivamente, produziram sinalização de cálcio de maneira dependente de dose (Figuras 24a a 24b). Células MDA-MB-231 foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e ADCYAP1R1. Conforme mostrado na Figura 24a, a adição de pequena quantidade de ligante endógeno seletivo ADCYAP1IR1 (PA- CAP38; 1 nM) aprimorou significativamente a resposta de cálcio em uma faixa ampla de concentrações de CXCL12 em comparação com os valores de soma calculados adicionando-se as respostas obtidas por PACAP38 sozinho e CXCL12 sozinho em doses indicadas (Figura 24a). A resposta de Ca?* máxima evocada por CXCL12 sozinho foi tida como 100%. A soma representa o valor aditivo calculado das respostas evo- cadas por 1 nM de PACAP38 e CXCL12 sozinhos em doses indicadas. De maneira similar, conforme mostrado na Figura 24b, a adição de |i- gante endógeno de CXCRA4 seletivo (CXCL12; 15 nM) aprimorou signi- ficativamente a resposta a jusante em uma faixa ampla de concentra- ções de PACAP38 em comparação com os valores de soma calculados adicionando-se as respostas obtidas por CXCL12 sozinho e PACAP38 sozinho em doses indicadas, mesmo em concentrações que não evo- caram nenhuma resposta quando tratadas sozinhas (0,03 — 0,3 nM) (Fi- gura 24b). A resposta de Ca?* máxima evocada por PACAP38 sozinho foi tida como 100%. A soma representa o valor aditivo calculado das respostas evocadas por 15 nM de CXCL12 sozinho e PACAP38 sozinho em doses indicadas. Diferenças estatisticamente significativas entre a soma e cotratamento em cada ponto foram determinadas através de Teste t de Student. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; média + SD (n = 3). Estes resultados sugerem uma resposta aprimorada em células que coexpressam CXCR4 e ADCYAP1RI1 in vivo na presença de pequenas quantidades de ligantes de CXCL12 e ADCYAP1R1 juntos.
[0422] O aprimoramento de resposta de cálcio em uma faixa ampla de concentrações de ligante em células que coexpressam CXCR4 e TACR3 é mostrado nas Figuras 25a a 25b. Células MDA-MB-231 foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e TACR3. Estimu- lação das células com CXCL12 sozinho ou neurocinina B sozinha pro- duziu, respectivamente, sinalização de cálcio de maneira dependente de dose (Figuras 25a a 25b). Conforme mostrado na Figura 25a, a adi- ção de pequena quantidade de neurocinina B (0,4 NM, ligante endógeno de TACR3 seletivo) aprimorou, significativamente, a resposta de cálcio em uma faixa ampla de concentrações de CXCL12 em comparação com os valores de soma calculados adicionando-se as respostas obtidas através de neurocinina B sozinha e CXCL12 sozinho em doses indica- das. A resposta de cálcio máxima evocada por CXCL12 sozinho foi tida como 100%. A soma representa o valor aditivo calculado das respostas evocadas por 0,4 nM de neurocinina B sozinha e CXCL12 sozinho em doses indicadas. De maneira similar, conforme mostrado na Figura 25b, a adição de CXCL12 aprimorou significativamente a resposta a jusante em uma faixa ampla de concentrações de neurocinina B em compara- ção com os valores de soma calculados adicionando-se as respostas obtidas através de CXCL12 sozinho e neurocinina B sozinha em doses indicadas. Resposta máxima evocada pela neurocinina B sozinha foi tida como 100%. A soma representa o valor aditivo calculado das res-
postas evocadas por 30 nM de CXCL12 sozinho e neurocinina B sozi- nha em doses indicadas. Diferenças estatisticamente significativas en- tre a soma e cotratamento em cada ponto foram determinadas através de Teste t de Student. *P < 0,05; **P < 0,01; média + SD (n = 3). Estes resultados sugerem uma resposta aprimorada em células que coexpres- sam CXCR4 e TACR3 in vivo na presença de pequenas quantidades de ligantes de CXCL12 e neurocinina B juntos. EXEMPLO 17. CONFIRMAÇÃO DE UMA PERDA DE PROPRIEDADE
ESPECÍFICA DE HETERÔMERO MEDIANTE DELEÇÃO DE UM DOS PROTÔMEROS.
[0423] Nas Figuras 8f e 8g, sinalização de cálcio aprimorada foi ob- servada em células MDA-MB-231 que superexpressam CXCR4 sozinho mediante cotratamento com CXCL12 e histamina. Com o uso de RT- qPCR, células MDA-MB-231 demonstraram expressar, anteriormente, HRH1, assim como baixo nível de MRNAs de CXCRA, em que cerca de duas vezes mais MRNA de HRH1 é expresso em comparação com MRNA de CXCRA4 (Exemplo 9). Para confirmar se a sinalização de cál- cio aprimorada mostrada nas Figuras 8f e 89 ocorre devido à presença de expressão de HRH1 endógeno, e não devido à presença de outros receptores de histamina, gene HRH1 em células MDA º“CRt* foi dele- tado com o uso de sistema CRISPR/Cas9. Células MDA-MB-231 que expressa estavelmente CXCR4 (MDA ºXºR4*) foram transduzidas com lentivírus que codificam Cas9 e RNA-guia que alvejam HRH1. A pre- sença de HRH1 funcional foi detectada medindo-se respostas de cálcio mediante exposição à histamina. Embora células MDA º*ºRt* tenham mostrado aumento dependente de dose em sinalização de cálcio medi- ante exposição à histamina, células MDA CXCR4+, HRH1- não mostraram nenhuma resposta de cálcio mesmo em 1 uM de histamina (Figura 26a). O resultado implica na ausência quase completa de HRH1 funcional em células MDA CXCR4+, HRH1-,
[0424] Quando células MDA-MB-231 que superexpressam estavel- mente CXCR4 (células MDA ºXºRé*) foram tratadas com histamina, o aumento dependente de dose em sinalização de cálcio foi observado (Figura 27a). Quando as células foram tratadas com histamina na pre- sença de CXCL12 (50 nM), a resposta de cálcio significativamente apri- morada foi obtida em uma faixa ampla de concentrações de histamina, que resulta em potência e eficácia aumentadas conforme evidenciado pelas alterações em valores de ECs5o e E max. No entanto, em células MDA º*XºRt* reduzidas com HRH1 com o uso de sistema CRISPR/Cas9 (células MDA CXCR4+, HRH1-), nenhuma resposta mediada por histamina foi obtida na ausência ou presença de CXCL12 (50 nM), o que reconfirma a ausência de HRH1 funcional nestas células. Resposta de cálcio má- xima evocada por histamina sozinha em células MDA º“ºRº* foi tida como 100%. A soma representa o valor aditivo calculado das respostas evocadas por 50 nM de CXCL12 sozinho e histamina sozinha em doses indicadas.
[0425] Em células MDA ºXºRt*+, 7 estimulação com CXCL12 produ- ziu resposta de cálcio de maneira dependente de dose (Figura 27b). À adição de concentração de não sinalização de histamina (15 nM) apri- morou significativamente a resposta de cálcio em uma faixa ampla de concentrações de CXCL12, que resulta em potência e eficácia muito aumentadas conforme evidenciado pelas alterações em valores de EC5o Ee E max. A resposta de cálcio mediada por CXCL12 em células MDA CXCR4+, HRH1- foj similar à resposta observada em células MDA ºXºRt* No entanto, a adição de histamina falhou em aumentar a resposta de cálcio mediada por CXCL12 em células MDA CXCR4+, HRH1-, o que demonstra a perda de propriedade específica de heterômero mediante deleção de HRH1. Resposta máxima evocada por CXCL12 sozinho em células MDA CXCR* foj tida como 100%. A soma representa o valor aditivo cal- culado das respostas evocadas por 15 nM de histamina sozinha e
CXCL12 sozinho em doses indicadas. Diferenças estatisticamente sig- nificativas entre a soma e cotratamento em cada ponto foram determi- nadas através de Teste t de Student. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; média + SD (n = 3). Valores de EC5o e E max foram calculados com o uso do software GraphPad Prism.
[0426] Nas Figuras 18a a 18b, o aprimoramento significativo em si- nalização de cálcio também foi observado em células MDA-MB-231 de tipo selvagem na presença de CXCL12 e histamina juntos, embora o ligante individual sozinho tenha produzido apenas sinais fracos. Para confirmar se a resposta aprimorada ocorre devido à expressão endó- gena de CXCRA, o gene de CXCRA4 foi alvejado com o uso de sistema CRISPR/Cas9, e a expressão de CXCRA4 foi detectada com o uso de immunoblotting. A expressão de CXCR4 foi significativamente diminu- ída em células MDA-MB-231 tratadas com RNA-guia que alveja CXCR4 em comparação com a expressão em células tratadas com controle que não alveja RNA-guia (Figura 26b).
[0427] A resposta de cálcio aprimorada em células MDA-MB-231 mediante cotratamento com CXCL12 e histamina é anulada na ausência de CXCRA4. Conforme mostrado na Figura 28a, em células MDA-MB- 231 (células MDA-MB-231 (MDA Y), mas não em células MDA “Y" re- duzidas com CXCR4 com o uso de sistema CRISPR/Cas9 (MDA ºCXºcR4- )), a sinalização aprimorada na presença de pequena quantidade de his- tamina (15 nM) foi evidente em uma faixa ampla de concentrações de CXCL12, embora o aumento dependente de dose mediado por CXCL12 em resposta de cálcio não fosse observado devido à expressão de baixo nível de CXCR. A resposta de cálcio máxima evocada por CXCL12 so- zinho em células MDA Y foi tida como 100%. A soma representa o valor aditivo calculado das respostas evocadas por 15 nM de histamina sozi- nha e CXCL12 sozinho em doses indicadas. A deleção de CXCR4 anu- lou completamente a sinalização aprimorada na presença de histamina,
o que demonstra a perda de propriedade específica de heterômero me- diante deleção de CXCRA4.
[0428] De maneira similar, conforme mostrado na Figura 28b, a adi- ção de CXCL12 aprimorou a resposta mediada por histamina em uma faixa ampla de concentrações de histamina em células MDA-MB-231 em comparação com os valores de soma calculados adicionando-se as respostas obtidas por CXCL12 sozinho e histamina sozinha em doses indicadas. A sinalização aprimorada mostrada em células MDA-MB-231 não foi observada em células MDA ºXºRt-, embora células MDA CXcR4- tenham retido respostas de histamina. A resposta máxima evocada por histamina sozinha em células MDA “7 foi tida como 100%. A soma re- presenta o valor aditivo calculado das respostas evocadas por 100 nM de CXCL12 sozinho e histamina sozinha em doses indicadas. Diferen- ças estatisticamente significativas entre a soma e cotratamento em cada ponto foram determinadas através de Teste t de Student. **P < 0,01; ***P < 0,001; média + SD (n = 3). Valores de EC5o e E max foram calcu- lados com o uso do software GraphPad Prism. Em conjunto, estes re- sultados demonstram que o heterômero CXCR4-HRH1 é responsável pela sinalização aprimorada mediante cotratamento com CXCL12 e his- tamina em células MDA-MB-231 de tipo selvagem. EXEMPLO 18. INIBIÇÃO DE MOBILIZAÇÃO DE CA2+ DA SINALIZA- ÇÃO A JUSANTE DE CXCR4 APRIMORADA MEDIANTE FORMA- ÇÃO DE HETERÔMERO CXCR4-GPCRX - COMPARAÇÃO DE TRA-
TAMENTO DE INIBIDOR ÚNICO COM TRATAMENTO DE INIBIDOR DE COMBINAÇÃO.
[0429] Visão geral: Conforme ilustrado abaixo (consultar as Tabelas 7 a 14), cotratamento através de várias combinações de um inibidor de CXCR4 e um inibidor de GPCRx em uma série de células que expres- sam heterômero CXCR4-GPCRx resulta em uma resposta de cálcio sig- nificativamente reduzida em comparação com o tratamento único por um inibidor de CXCRA4 sozinho. Os protômeros de GPCRx da série de heterômeros CXCR4-GPCRx avaliados nas Tabelas 7 a 14 são: ADRB2, HRH1, ADCYAP1IR1, CS5AR1I, CALCR, EDNRB, MLNR e TACR3, respectivamente. Células MDA-MB-231 foram transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 apenas, ou CXCR4 e o GPCRx especificado. As células foram cultivadas por 2 dias e foram tratadas com antagonista de CXCRA4 sozinho ou cotratamento de antagonista de CXCR4 e o antagonista de GPCRx especificado. E, então, células foram tingidas com Cal-6 por 2 horas e estimuladas com CXCL12 (20 nM)eo agonista de GPCRx especificado. Mobilização de cálcio foi medida com o uso de FlexStation 3. Um valor na coluna identificado como “Nenhum” é o IC50 de resposta de Ca2+ na célula MDA-MB-231 que expressa heterômero CXCR4-GPCRx especificado tratada com inibidor de CXCRA4 apenas (na ausência de um antagonista de GPCRx especifi- cado). Um valor nas colunas restantes é o IC50 de resposta de Ca2+ na célula MDA-MB-231 que expressa heterômero CXCR4-GPCRx especi- ficado a partir do tratamento simultâneo com o antagonista de CXCR4 e o antagonista de GPCRx especificado.
[0430] A eficiência de inibidores de CXCR4 na supressão da sinali- zação aprimorada de heterômero CXCR4-ADRB?2 foi medida na ausên- cia ou presença dos inibidores de ADRB?2 representativos Carazolol ou Propranolol (Tabela 7). Células MDA-MB-231 foram cotransduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e ADRB2, e sinalização de Ca2+ foi medida mediante coestimulação das células com CXCL12 (20 nM) e Salmeterol (1 uM). Inibidores foram tratados 30 min antes da estimula- ção de agonista. A mobilização de Ca2+ foi medida conforme descrito na Figura 5, e valores de IC 5º foram calculados com o uso do software GraphPad Prism.
TABELA 7 CXCR4
[0431] Inibidores de CXCR4 AMD-3100, Ulocuplumabe e BKT140 suprimiram a sinalização de CXCR4-ADRB2 de maneira mais eficiente (maior potência) na presença de 10 uM de Carazolol ou Propranolol, conforme mostrado com os valores de IC 59 reduzidos em comparação com os valores de IC 5º de inibidores de CXCR4 na ausência de inibido- res de ADRB2. Dependendo da identidade do inibidor de CXCRA, o va- lor de IC50 de resposta de Ca no contexto de heterômero CXCR4- ADRB?2 diminuiu em até cerca de 25 vezes ou mais quando tratado em combinação com um inibidor de ADRB2 (Carazolol ou Propranolol), com relação ao tratamento único com o inibidor de CXCRA4 sozinho (coluna “Nenhum”). Estes resultados sugerem que o cotratamento com um ini- bidor de CXCRA4 e inibidor de ADRB?2 inibe de maneira mais eficaz a resposta de Ca aumentada do que o tratamento único com um inibidor de CXCRA4 sozinho nas células que expressam heterômero CXCRA4- ADRB2.
[0432] A eficiência de inibidores de CXCR4 na supressão da sinali- zação aprimorada de heterômero CXCR4-HRH1 foi medida na ausência ou presença dos inibidores de HRH1 representativos Hidroxizina, Pro- metazina ou Cipro-heptadina (Tabela 8). Células MDA-MB-231 foram cotransduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e HRH1, e sina- lização de Ca2+ foi medida mediante coestimulação das células com CXCL12 (20 nM) e Histamina (1 nM). Inibidores foram tratados 30 min antes da estimulação de agonista. A mobilização de Ca2+ foi medida conforme descrito na Figura 5, e valores de IC so foram calculados com o uso do software GraphPad Prism. TABELA 8
[0433] Inibidores de CXCR4 AMD-3100, Ulocuplumabe e BKT140 suprimiram a sinalização de CXCR4-HRH1 de maneira mais eficiente (maior potência) na presença de 10 uM de Hidroxizina, Prometazina ou Cipro-heptadina, conforme mostrado com os valores de IC so reduzidos em comparação com os valores de IC 5º de inibidores de CXCR4 na ausência de inibidores de HRH1. Dependendo da identidade do inibidor de CXCRA, o valor de IC50 de resposta de Ca no contexto de heterô- mero CXCR4-HRH1 diminuiu em até cerca de 5.100 vezes ou mais quando tratado em combinação com um inibidor de HRH1 (Hidroxizina, Prometazina ou Cipro-heptadina), com relação ao tratamento único com o inibidor de CXCRA4 sozinho (coluna “Nenhum”). Estes resultados su- gerem que o cotratamento com um inibidor de CXCRA4 e inibidor de HRH1 inibe de maneira mais eficaz a resposta de Ca aumentada do que o tratamento único com um inibidor de CXCRA4 sozinho nas células que expressam heterômero CXCR4-HRH1.
[0434] A eficiência de inibidores de CXCR4 na supressão da sinali- zação aprimorada de heterômero CXCR4-ADCYAP1R1 foi medida na ausência ou presença dos inibidores de ADCYAP1R1 representativos MG65 ou PACAP-(6-38) (Tabela 9). Células MDA-MB-231 foram cotrans- duzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e ADCYAP1R1, e sina- lização de Ca2+ foi medida mediante coestimulação das células com CXCL12 (20 nM) e PACAP-38 (1 nM). Inibidores foram tratados 30 min antes da estimulação de agonista. A mobilização de Ca2+ foi medida conforme descrito na Figura 5, e valores de IC 5º foram calculados com o uso do software GraphPad Prism. TABELA 9
[0435] Inibidores de CXCR4 AMD-3100 e BKT140 suprimiram a si- nalização de CXCR4-ADCYAP1R1 de maneira mais eficiente (maior po- tência) na presença de 1 uM de M65 ou 1 uM de PACAP-(6-38), con- forme mostrado com os valores de IC 5º reduzidos em comparação com os valores de IC 5º de inibidores de CXCR4 na ausência de inibidores de ADCYAP1R1. Dependendo da identidade do inibidor de CXCRA, o valor de IC50 de resposta de Ca no contexto de heterômero CXCR4- ADCYAP1R1 diminuiu em até cerca de 225 vezes ou mais quando tra- tado em combinação com um inibidor de ADCYAP1R1 (M65 ou PACAP- (6-38)), com relação ao tratamento único com o inibidor de CXCRA4 so- zinho (coluna “Nenhum”). Estes resultados sugerem que o cotratamento com um inibidor de CXCRA4 e inibidor de ADCYAP1R1 inibe de maneira mais eficaz a resposta de Ca aumentada do que o tratamento único com um inibidor de CXCRA4 sozinho nas células que expressam heterômero CXCR4-ADCYAP1R1.
[0436] A eficiência de inibidores de CXCR4 na supressão da sinali- zação aprimorada de heterômero CXCR4-C5AR1 foi medida na ausên- cia ou presença do inibidor de CSAR1 representativo W54011 (Tabela 10). Células MDA-MB-231 foram cotransduzidas com adenovírus que codificam CXCRA4 e C5AR1, e sinalização de Ca2+ foi medida mediante coestimulação das células com CXCL12 (20 nM) e C5a (0,03 nM). Inibi-
dores foram tratados 30 min antes da estimulação de agonista. A mobi- lização de Ca2+ foi medida conforme descrito na Figura 5, e valores de IC 5º foram calculados com o uso do software GraphPad Prism. TABELA 10
[0437] Inibidores de CXCR4 AMD-3100, Ulocuplumabe e BKT140 suprimiram a sinalização de CXCR4-C5AR1 de maneira mais eficiente (maior potência) na presença de 10 uM de W54011, conforme mostrado com os valores de IC 5º reduzidos em comparação com os valores de IC 50 de inibidores de CXCR4 na ausência de inibidores de CSAR1. De- pendendo da identidade do inibidor de CXCRA, o valor de IC50 de res- posta de Ca no contexto de heterômero CXCR4-C5AR1 diminuiu em até cerca de 12 vezes ou mais quando tratado em combinação com um ini- bidor de CSAR1 (WB54011), com relação ao tratamento único com o ini- bidor de CXCRA4 sozinho (coluna “Nenhum”). Estes resultados sugerem que o cotratamento com um inibidor de CXCR4 e inibidor de CSAR1 inibe de maneira mais eficaz a resposta de Ca aumentada do que o tratamento único com um inibidor de CXCRA4 sozinho nas células que expressam heterômero CXCR4-C5AR1.
[0438] A eficiência de inibidores de CXCR4 na supressão da sinali- zação aprimorada de heterômero CXCR4-CALCR foi medida na ausên- cia ou presença do inibidor de CALCR representativo CT-(8-32) (Tabela 11). Células MDA-MB-231 foram cotransduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e CALCR, e sinalização de Ca2+ foi medida mediante coestimulação das células com CXCL12 (20 nM) e calcitonina (100 nM). Inibidores foram tratados 30 min antes da estimulação de agonista. À mobilização de Ca2+ foi medida conforme descrito na Figura 5, e valo- res de IC 5º foram calculados com o uso do software GraphPad Prism. TABELA 11 [| E e
[0439] Inibidores de CXCR4 AMD-3100 e BKT140 suprimiram a si- nalização de CXCR4-CALCR de maneira mais eficiente (maior potên- cia) na presença de 10 uM de CT-(8-32), conforme mostrado com os valores de IC 5º reduzidos em comparação com os valores de IC 5º de inibidores de CXCR4 na ausência de inibidores de CALCR. Depen- dendo da identidade do inibidor de CXCRA, o valor de IC50 de resposta de Ca no contexto de heterômero CXCR4-CALCR diminuiu em até cerca de 210 vezes ou mais quando tratado em combinação com um inibidor de CALCR (CT-(8-32)), com relação ao tratamento único com o inibidor de CXCRA4 sozinho (coluna “Nenhum”). Estes resultados suge- rem que o cotratamento com um inibidor de CXCR4 e inibidor de CALCR inibe de maneira mais eficaz a resposta de Ca aumentada do que o tratamento único com um inibidor de CXCRA4 sozinho nas células que expressam heterômero CXCR4-CALCR.
[0440] A eficiência de inibidores de CXCR4 na supressão da sinali- zação aprimorada de heterômero CXCR4-EDNRB foi medida na ausên- cia ou presença dos inibidores de EDNRB representativos ambrisentan ou bosentan (Tabela 12). Células MDA-MB-231 foram cotransduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e EDNRB, e sinalização de Ca2+ foi medida mediante coestimulação das células com CXCL12 (20 nM) e BQ3020 (0,5 nM). Inibidores foram tratados 30 min antes da estimulação de agonista. A mobilização de Ca2+ foi medida conforme descrito na Figura 5, e valores de IC 5º foram calculados com o uso do software
GraphPad Prism. TABELA 12 Inibidores de EDNRB 1C50 [nM] 1C50 [nM]
[0441] Inibidores de CXCR4 AMD-3100, Ulocuplumabe e BKT140 suprimiram a sinalização de CXCR4-EDNRB de maneira mais eficiente (maior potência) na presença de 10 uM de ambrisentan ou 10 uM de bosentan, conforme mostrado com os valores de IC so reduzidos em comparação com os valores de IC 5º de inibidores de CXCR4 na ausên- cia de inibidores de EDNRB. Dependendo da identidade do inibidor de CXCRA, o valor de IC50 de resposta de Ca no contexto de heterômero CXCRA4-EDNRB diminuiu em até cerca de 315 vezes ou mais quando tratado em combinação com um inibidor de EDNRB (ambrisentan ou bosentan), com relação ao tratamento único com o inibidor de CXCR4 sozinho (coluna “Nenhum”). Estes resultados sugerem que o cotrata- mento com um inibidor de CXCR4 e inibidor de EDNRB inibe de maneira mais eficaz a resposta de Ca aumentada do que o tratamento único com um inibidor de CXCRA4 sozinho nas células que expressam heterômero CXCRA4-EDNRE.
[0442] A eficiência de inibidores de CXCR4 na supressão da sinali- zação aprimorada de heterômero CXCRA4-MLNR foi medida na ausên- cia ou presença do inibidor de MLNR representativo MA-2029(Tabela 13). Células MDA-MB-231 foram cotransduzidas com adenovírus que codificam CXCRA4 e MLNR, e sinalização de Ca2+ foi medida mediante coestimulação das células com CXCL12 (20 nM) e motilina (0,2 nM). Inibidores foram tratados 30 min antes da estimulação de agonista. A mobilização de Ca2+ foi medida conforme descrito na Figura 5, e valo- res de IC 5º foram calculados com o uso do software GraphPad Prism. TABELA 13 [Cm EE
[0443] Inibidores de CXCR4 AMD-3100, Ulocuplumabe e BKT140 suprimiram a sinalização de CXCR4-MLNR de maneira mais eficiente (maior potência) na presença de 10 uM de MA-2029, conforme mos- trado com os valores de IC so reduzidos em comparação com os valores de IC 5o de inibidores de CXCRA4 na ausência de inibidor de MLNR. De- pendendo da identidade do inibidor de CXCRA, o valor de IC50 de res- posta de Ca no contexto de heterômero CXCR4-MLNR diminuiu em até cerca de 11 vezes ou mais quando tratado em combinação com um ini- bidor de MLNR (MA-2029), com relação ao tratamento único com o ini- bidor de CXCR4 sozinho (coluna “Nenhum”). Estes resultados sugerem que o cotratamento com um inibidor de CXCR4 e inibidor de MLNR inibe de maneira mais eficaz a resposta de Ca aumentada do que o trata- mento único com um inibidor de CXCRA4 sozinho nas células que ex- pressam heterômero CXCR4-MLNR.
[0444] A eficiência de inibidores de CXCR4 na supressão da sinali- zação aprimorada de heterômero CXCR4-TACR3 foi medida na ausên- cia ou presença dos inibidores de TACR3 representativos SB 222200, osanetant ou talnetant (Tabela 14). Células MDA-MB-231 foram co- transduzidas com adenovírus que codificam CXCR4 e TACR3, e sinali- zação de Ca2+ foi medida mediante coestimulação das células com CXCL12 (20 nM) e neurocinina B (0,3 nM). Inibidores foram tratados 30 min antes da estimulação de agonista. A mobilização de Ca2+ foi me- dida conforme descrito na Figura 5, e valores de IC 5º foram calculados com o uso do software GraphPad Prism. TABELA 14
[0445] Inibidores de CXCR4 AMD-3100, Ulocuplumabe e BKT140 suprimiram a sinalização de CXCR4-TACR3 de maneira mais eficiente (maior potência) na presença de 10 uM de SB-222200, 10 uM de osa- netant, ou 10 uM de talnetant, conforme mostrado com os valores de IC 50 reduzidos em comparação com os valores de IC 509 de inibidores de CXCRA4 na ausência de inibidores de TACR3. Dependendo da identi- dade do inibidor de CXCRA, o valor de IC50 de resposta de Ca no con- texto de heterômero CXCR4-TACR3 diminuiu em até cerca de 16 vezes ou mais quando tratado em combinação com um inibidor de TACR3 (SB-222200, osanetant, ou talnetant), com relação ao tratamento único com o inibidor de CXCRA4 sozinho (coluna “Nenhum”). Estes resultados sugerem que o cotratamento com um inibidor de CXCRA4 e inibidor de TACRS3 inibe de maneira mais eficaz a resposta de Ca aumentada do que o tratamento único com um inibidor de CXCRA4 sozinho nas células que expressam heterômero CXCR4-TACR3. EXEMPLO 19. EFEITO ANTITUMORAL DE INIBIDORES DE HETE- RÔMERO CXCR4-ADRB2 EM CRESCIMENTO TUMORAL.
[0446] Na Figura 22, foi observado que os camundongos que car- regam células que superexpressam CXCR4 e ADRB2 mostraram um aumento dramático em proliferação tumoral em comparação com os ca- mundongos que carregam célula parente AS549. Isto sugere que o hete- rômero CXCR4-ADRB2 promove proliferação tumoral.
[0447] Para investigar o efeito antitumoral de inibidores de heterô- mero CXCR4-ADRB2 em crescimento tumoral, o AS49-CXCR4-ADRB2 que superexpressa estavelmente o heterômero CXCR4-ADRB2 (1x107 célula/cabeça) foi injetado por via subcutânea em camundongos nus. Quando os tamanhos de tumor alcançaram uma média de 50 a 100 mm3, o inibidor de CXCRA4, o inibidor de ADRB2 sozinho ou uma com- binação de inibidores de CXCR4 e ADRB2 foram tratados.
[0448] A Figura 29a é um gráfico que compara taxas de crescimento tumoral para o efeito antitumoral in vivo de inibidor de CXCRA, LY2510924 (3 mg/kg), inibidor de ADRB2, Carvedilol (30 mg/kg), ou combinação de LY 2510924 (3 mg/kg) e Carvedilo!l (30 mg/kg). A Figura 29b é um gráfico que compara taxas de crescimento tumoral para o efeito antitumoral de inibidor de CXCR4, AMDO70 (10 mg/kg), inibidor de ADRB2, Carvedilo! (80 mg/kg), ou combinação de AMDO70 (10 mg/kg) e Carvedilol (380 mg/kg). O crescimento tumoral foi monitorado todo terceiro ou quarto dia medindo-se o comprimento (L) e largura (W) do tumor e calculando-se o volume tumoral com base na seguinte Fór- mula: Volume = 0,5 LW?.
[0449] Conforme mostrado na Figura 29a, camundongos que supe- rexpressam CXCR4-ADRB?2 foram tiveram crescimento tumoral mais inibido pelo inibidor de CXCRA4, LY 2510924 ou pelo inibidor de ADRB2, Carvedilol do que os camundongos de controle. Adicionalmente, a com- binação de LY 2510924 e Carvedilol demonstrou que o efeito inibidor de crescimento tumoral foi superior ao grupo de administração única. Mais especificamente, camundongos que carregam A549 que superexpres- sam CXCR4-ADRB? tratados com veículo como um controle alcança-
ram um volume tumoral médio de 554,2+152,7 mm? no dia 21 após tra- tamento, em comparação com LY2510924, Carvedilol ou LY2510924 e Carvedilol, que alcançaram um volume tumoral médio de 488,9+135,2 mmº?, e 432,0+206,4 mm?, 356,3+125,4 mm?, respectivamente, no mesmo período de tempo.
[0450] Um modelo similar foi observado no grupo tratado com AMDOT7O, outro inibidor de CXCRA.
[0451] A Figura 29b mostra que linhas celulares que superexpres- sam heterômero CXCR4-ADRB?2 foram transplantadas em camundongo nu e quando o tamanho de tumor alcançou 50 a 100 mm?, o inibidor de CXCRA4, AMDO7O ou o inibidor de ADRB2, Carvedilol foi administrado por via oral sozinho ou em combinação por 23 dias. Conforme mostrado na Figura 29b, o tamanho do tumor nos 23 dias após administração do fármaco foi de 618,5 + 190,9 mm? no grupo de controle, 543,2 + 260,4 mm? ou 510,4 + 139,9 mm? no grupo tratado com AMDO70 ou Carve- dilol, respectivamente. O tamanho de tumor de grupo tratado com fár- maco se mostra menor que aquele do grupo de controle. Adicional- mente, na combinação de AMDO7O e Carvedilol, o tamanho do tumor foi de 418,0 + 238,4 mm?, que indica que o efeito antitumor é superior àquele do grupo de administração única.
[0452] Estes resultados sugerem que o cotratamento de inibidores de CXCR4 e ADRB?2 possa fornecer um efeito terapêutico melhor para pacientes que expressam heterômero CXCR4 e ADRB?2.
[0453] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo estão incorporados no presente documento a título de referência como se cada publicação individual ou pedido de patente específico estivesse individualmente indicado como incorpo- rado a título de referência.
[0454] Embora modalidades preferenciais tenham sido mostradas e descritas no presente documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas a título de exemplo. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da in- venção e que métodos e estruturas inseridos do escopo dessas reivin- dicações e seus equivalentes estejam cobertos desse modo.
MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS
[0455] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um indivíduo que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o método compreende: administrar ao indi- víduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterô- mero CXCR4-GPCRx.
[0456] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um indivíduo que tem heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o mé- todo compreende: administrar ao indivíduo uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um inibidor ou uma combinação de inibidores selecio- nados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um ini- bidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; em que a célula que contém o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada.
[0457] Em uma modalidade, um método para tratamento, ameniza- ção ou prevenção de um câncer em um indivíduo que tem heterômero CXCR4-GPCRXx, sendo que o método compreende: administrar ao indi- víduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de um heterômero CXCR4-GPCRx, em que: GPCRx se heteromeriza com CXCRA4 no indivíduo, a heteromerização de GPCRXx com CXCR4 é acompanhada pelo aprimoramento da sinalização a jusante de CXCRA4; e o aprimoramento de sinalização a jusante de CXCR4 é suprimido pelo inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0458] Em uma modalidade, um método para avaliar resposta, ou potencial resposta, de um indivíduo que tem o heterômero CXCR4- GPCRXx ao tratamento, amenização ou prevenção de um câncer, sendo que o método compreende: obter uma amostra do indivíduo; detectar a heteromerização de CXCR4 e GPCRxX na amostra; e com base, pelo menos em parte, na detecção da heteromerização de CXCR4 e GPCRXx, avaliar a resposta, ou potencial resposta, do indivíduo ao tratamento, amenização ou prevenção de um câncer.
[0459] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o método compreende: administrar ao pa- ciente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados den- tre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRXx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; em que:
[0460] i) o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada; e
[0461] ii) o inibidor ou combinação de inibidores administrados su- prime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4- GPCRXx no paciente com câncer.
[0462] Em uma modalidade, um método de supressão de sinaliza- ção a jusante aprimorada de um heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula de um paciente que sofre de câncer, sendo que o método com- preende: administrar ao paciente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx; em que:
[0463] i) o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada; e
[0464] ii) o inibidor ou combinação de inibidores administrados su- prime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCRA4- GPCRXx no paciente com câncer.
[0465] Em uma modalidade, um kit farmacêutico para uso no trata- mento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que o kit farmacêutico compreende: um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; sendo que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada.
[0466] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx, sendo que a composição far- macêutica compreende:
[0467] i) um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e
[0468] ii) um veículo farmaceuticamente aceitável;
[0469] em que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a ju- sante aprimorada.
[0470] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um hete- rômero CXCR4-GPCRx, sendo que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada, sendo que o método compreende:
[0471] 1) determinar se o paciente tem a célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimorada: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paci- ente; e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determine se:
[0472] i) a célula cancerígena de um paciente contém o dito heterô- mero CXCR4-GPCRx; ou
[0473] ii) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: al-
tera propriedades específicas de heterômero ou função do dito heterô- mero CXCR4-GPCRx em uma célula (ou células) derivada de paciente; altera propriedades específicas de heterômero de uma célula (ou célu- las) derivada de paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; ou diminui a proliferação celular de uma célula (ou células) derivada de pa- ciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; e
[0474] 2) se o paciente tiver uma célula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx ao paciente com câncer.
[0475] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um hete- rômero CXCR4-GPCRx, sendo que o método compreende:
[0476] 1) determinar se a célula cancerígena de um paciente con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente e realizando-se, ou ter realizado, um en- saio na amostra biológica para determinar se o dito heterômero CXCR4- GPCRx está presente na célula cancerígena de um paciente; em que:
[0477] a) o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORAS3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; e
[0478] b) o ensaio realizado na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um en- saio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, micros- copia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação ou um ensaio animal fluorescente; e
[0479] 2) se a célula cancerígena de um paciente contém o dito he- terômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que con- siste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx ao paciente.
[0480] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um hete- rômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimorada, sendo que o método compreende:
[0481] 1) determinar se o paciente tem a célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimorada: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paci- ente; e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determine se:
[0482] i) a célula cancerígena de um paciente contém o dito heterô- mero CXCR4-GPCRx; ou
[0483] ii) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: al- tera propriedades específicas de heterômero ou função do dito heterô- mero CXCR4-GPCRx em uma célula (ou células) derivada de paciente; altera propriedades específicas de heterômero de uma célula (ou célu- las) derivada de paciente que contém o dito heterômero CXCR4- GPCRx; ou diminui a proliferação celular de uma célula (ou células) de- rivada de paciente que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; e
[0484] 2) se o paciente tiver uma célula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer uma combinação de inibidores selecionados den- tre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e
[0485] 3) se o paciente não tem uma célula cancerígena que con- tém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer o inibidor de CXCRA4 ou o inibidor de GPCRx como um único inibidor.
[0486] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um hete- rômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimorada, sendo que o método compreende:
[0487] 1) determinar se o paciente tem a célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimorada: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paci- ente; e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determine se:
[0488] i) a célula cancerígena de um paciente contém o dito heterô- mero CXCR4-GPCRx; ou
[0489] ii) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: al- tera propriedades específicas de heterômero ou função do dito heterô- mero CXCR4-GPCRx em uma célula (ou células) derivada de paciente; altera propriedades específicas de heterômero de uma célula (ou célu- las) derivada de paciente que contém o dito heterômero CXCR4- GPCRx; ou diminui a proliferação celular de uma célula (ou células) de- rivada de paciente que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; e
[0490] 2) se o paciente tiver uma célula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer uma combinação de inibidores selecionados den- tre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e
[0491] 3) se o paciente não tem uma célula cancerígena que con- tém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer o inibidor de CXCRA4 ou o inibidor de GPCRx como um único inibidor;
[0492] em que:
[0493] a) progressão do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx é diminuída na faixa de 5 a 100% mais mediante administração da combinação de ini- bidores, em relação à administração do inibidor de CXCRA4 ou inibidor de GPCRx como o inibidor único ao dito paciente;
[0494] b) eficácia de um inibidor de CXCR4 é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRx ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de CXCRA4 quando administrado como um inibidor único; e/ou
[0495] c) eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de CXCR4 ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando administrado como um inibidor único.
[0496] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um hete- rômero CXCR4-GPCRXx, sendo que o método compreende:
[0497] 1) determinar se a célula cancerígena de um paciente con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente e realizando-se, ou ter realizado, um en- saio na amostra biológica para determinar se o dito heterômero CXCR4- GPCRx está presente na célula cancerígena de um paciente; em que:
[0498] a) o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORAS3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; e
[0499] b) o ensaio realizado na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um en- saio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, micros- copia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas
(ELISA), citometria de fluxo, RNAseq, gRT-PCR, micromatriz ou um en- saio animal fluorescente; e
[0500] 2) se a célula cancerígena de um paciente contém o dito he- terômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e
[0501] 3) se a célula cancerígena de um paciente não contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paci- ente com câncer o inibidor de CXCRA4 ou o inibidor de GPCRX como um único inibidor.
[0502] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula cancerígena que contém um hete- rômero CXCR4-GPCRx, sendo que o método compreende:
[0503] 1) determinar se a célula cancerígena de um paciente con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente e realizando-se, ou ter realizado, um en- saio na amostra biológica para determinar se o dito heterômero CXCR4- GPCRx está presente na célula cancerígena de um paciente; em que:
[0504] a) o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORAS3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; e
[0505] b) o ensaio realizado na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um en- saio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, micros- copia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA), citometria de fluxo, RNAseq, qRT-PCR, micromatriz ou um en- saio animal fluorescente; e
[0506] 2) se a célula cancerígena de um paciente contém o dito he- terômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx, e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e
[0507] 3) se a célula cancerígena de um paciente não contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paci- ente com câncer o inibidor de CXCRA4 ou o inibidor de GPCRX como um único inibidor;
[0508] em que:
[0509] a) progressão do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx é diminuída na faixa de 5 a 100% mais mediante administração da combinação de ini- bidores, em relação à administração do inibidor de CXCRA4 ou inibidor de GPCRx como o inibidor único ao dito paciente;
[0510] b) eficácia de um inibidor de CXCR4 é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRx ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de CXCRA4 quando administrado como um inibidor único; e/ou
[0511] c) eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de CXCRA4 ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando administrado como um inibidor único.
[0512] Em determinadas modalidades, uma ou mais de uma (que inclui, por exemplo, todas) das seguintes modalidades adicionais podem compreender cada uma das outras modalidades ou partes das mesmas.
[0513] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o heterômero CXCR4-GPCRx tem, causa ou produz, a sinalização a ju- sante aprimorada.
[0514] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada resulta do heterômero CXCR4- GPCRx.
[0515] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada resulta do agonismo do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0516] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada resulta do agonismo de CXCR4 do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0517] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada resulta do agonismo de GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRXx.
[0518] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada resulta do agonismo de CXCRA4 e do agonismo de GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0519] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada é a jusante do CXCRA, do respectivo GPCRx ou do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0520] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada é a jusante do CXCRA.
[0521] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada é a jusante do respectivo GPCRx.
[0522] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada é a jusante do heterômero CXCRA4- GPCRx.
[0523] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é com relação à sinalização a jusante de um protômero de CXCRA4 ou um respectivo protômero de GPCRx em seu respectivo contexto de protô- mero individual.
[0524] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é com relação à sinalização a jusante de um protômero de CXCR4 em um contexto de protômero individual.
[0525] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é com relação à sinalização a jusante de um respectivo protômero de GPCRx em um contexto de protômero individual.
[0526] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é com relação à sinalização a jusante de um protômero de CXCR4 e um respectivo protômero de GPCRx em seu respectivo contexto de protô- mero individual.
[0527] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor ou combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com cân- cer.
[0528] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor ou combinação de inibidores administrados suprime a sinali- zação a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx nas cé- lulas cancerígenas de um paciente.
[0529] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método compreende adicionalmente determinar ou diagnosticar a pre- sença de um heterômero CXCR4-GPCRx.
[0530] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método compreende adicionalmente determinar ou diagnosticar a pre- sença de um heterômero CXCR4-GPCRx em um paciente com câncer.
[0531] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método compreende adicionalmente determinar ou diagnosticar a pre- sença de um heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula cancerígena ou tecido de câncer.
[0532] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método compreende adicionalmente determinar ou diagnosticar a pre- sença de um heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula cancerígena ou tecido de câncer obtido de um paciente com câncer.
[0533] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método compreende adicionalmente determinar ou diagnosticar a pre- sença de um heterômero CXCR4-GPCRx; e em que a determinação ou diagnóstico compreende:
[0534] 1) obter ou ter obtido uma amostra biológica (por exemplo, células ou tecido, tais como células ou tecido de um paciente com cân- cer); e
[0535] 2) realizar ou ter realizado um ensaio na amostra biológica, em que o ensaio na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colo- calização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, microscopia imuno- eletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimu- noprecipitação ou um ensaio animal fluorescente.
[0536] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é determinada por um ensaio de Ca2+ intracelular.
[0537] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a sinalização a jusante aprimorada é uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio.
[0538] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio do heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade de mobilização de cálcio que, medi- ante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, é pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, ou pelo menos 90% maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
[0539] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio do heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade de mobilização de cálcio que, medi- ante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, é entre 10 e 100% maior que a soma de quantidades de mobi- lização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx sele- tivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
[0540] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio do heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade de mobilização de cálcio que, medi- ante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, é entre 25 e 100% maior que a soma de quantidades de mobi- lização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx sele- tivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
[0541] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio é determinada por um ensaio de Ca2+ intracelular.
[0542] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o ensaio de Ca2+ intracelular é um ensaio de mobilização de cálcio.
[0543] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio é uma quantidade sinérgica de mobilização de cálcio.
[0544] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a quantidade sinérgica de mobilização de cálcio das células que contêm o heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade de mobilização de cál- cio que, mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, é pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, ou pelo menos 90% maior que a soma de quan- tidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de ago- nista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mo- bilização de cálcio.
[0545] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o heterômero CXCR4-GPCRx tem duas ou mais dentre as seguintes características:
[0546] 1) os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula colocalizam e interagem fisicamente, seja diretamente ou por meio de proteínas intermediárias que atuam como condutos para alos- terismo, conforme determinado por meio de um ou mais dentre os se- guintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hi- bridização in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação ou um ensaio animal fluorescente;
[0547] 2) uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio, de modo que:
[0548] a) o CXCRA4 ou o respectivo GPCRx em um contexto de pro- tômero individual na célula mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo resulte em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; e
[0549] b) o heterômero CXCR4-GPCRx exibe uma mobilização de cálcio aprimorada mediante coestimulação com o CXCL12 e o respec- tivo agonista de GPCRx seletivo com relação à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo;
[0550] conforme determinado por meio de um ensaio de mobiliza- ção de cálcio; ou
[0551] 3) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx:
[0552] i) altera propriedades específicas de heterômero do heterô- mero CXCR4-GPCRx em uma célula derivada de paciente;
[0553] ii) altera função específica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula derivada de paciente;
[0554] iii) altera propriedades específicas de heterômero de uma cé- lula derivada de paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx; ou
[0555] iv) diminui a proliferação celular de uma célula (ou células) derivada de paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
[0556] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera propriedades específicas de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx em uma cé- lula derivada de paciente, conforme determinado por pelo menos um dos seguintes métodos: PLA, ensaios de ligação de radioligante, en- saios de ligação de [35S]GTP-yS, ensaio de cálcio, ensaio cAMP, en- saio GTPase, ativação de PKA, ensaios de fosforilação de ERK1/2 e/ou AKt/PKB, ensaios de fosforilação de Src e STAT3, ensaio de CRE-re- pórter, ensaio de NFAT-RE-repórter, ensaio de SRE-repórter, ensaio de repórter SRF-RE, ensaio de repórter NF-kB-RE, ensaio de fosfatase al- calina secretada, ensaio de produção de 1-fosfato de inositol, ensaio de atividade de adenilila ciclase, análise de expressão de gene-alvo atra- vés de RT-PCR, RT-GPCR, RNAsegq ou micromatriz.
[0557] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera função espe- cífica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx em uma célula de- rivada de paciente, conforme determinado por pelo menos um dos se- guintes métodos: PLA, ensaios de ligação de radioligante, ensaios de ligação de [35S]GTP-yS, ensaio de cálcio, ensaio cAMP, ensaio GTPase, ativação de PKA, ensaios de fosforilação de ERK1/2 e/ou AKt/PKB, ensaios de fosforilação de Src e STAT3, ensaio de CRE-re- pórter, ensaio de NFAT-RE-repórter, ensaio de SRE-repórter, ensaio de repórter SRF-RE, ensaio de repórter NF-kB-RE, ensaio de fosfatase al- calina secretada, ensaio de produção de 1-fosfato de inositol, ensaio de atividade de adenilila ciclase, análise de expressão de gene-alvo atra- vés de RT-PCR, RT-GPCR, RNAsegq, sequenciamento de próxima gera- ção (NGS) ou micromatriz.
[0558] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera propriedades específicas de heterômero de uma célula derivada de paciente que con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx, conforme determinado por pelo me- nos um dos seguintes métodos: ensaios sobre proliferação, migração, invasão e resistência ao fármaco (sobrevivência) de células canceríge- nas, modulação de função de célula imune, angiogênese, vasculogê- nese, metástase, resistência ao fármaco, micromatriz de tecido (TMA) e interação de microambiente de tumor de célula cancerígena (TME).
[0559] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx compreendem protô- meros CXCR4 e GPCRx individuais.
[0560] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a célula que contém o CXCRA4 ou o respectivo GPCRx em um contexto de protômero individual compreende, independentemente:
[0561] i) o protômero CXCRA4 individual na ausência do respectivo protômero GPCRx individual; ou
[0562] ii) o respectivo protômero GPCRx individual na ausência do protômero CXCRA4 individual;
[0563] respectivamente.
[0564] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a célula que contém o CXCR4 em um contexto de protômero individual compreende o dito protômero CXCR4 individual na ausência do respec- tivo protômero GPCRx individual.
[0565] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a célula que contém o respectivo GPCRx em um contexto de protômero individual compreende o dito respectivo protômero GPCRx individual na ausência do protômero CXCRA4 individual.
[0566] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx na célula colocalizam e interagem fisicamente, seja diretamente ou por meio de proteínas in- termediárias que atuam como condutos para alosterismo, conforme de- terminado por meio de um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de coimunoprecipitação ou um ensaio ani- mal fluorescente.
[0567] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o ensaio com base em proximidade é, ou compreende, transferência de energia de ressonância (RET), RET de bioluminescência (BRET), RET de fluorescência (FRET), RET de fluorescência de prazo estabelecido
(TR-FRET), FRET auxiliada por anticorpo, FRET auxiliada por ligante, complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) ou um ensaio de ligação de proximidade (PLA).
[0568] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx na célula colocalizam e interagem fisicamente, seja diretamente ou por meio de proteínas in- termediárias que atuam como condutos para alosterismo, conforme de- terminado por meio de um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) ou um ensaio de ligação de proximidade (PLA).
[0569] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a célula cancerígena de um paciente contém o heterômero CXCR4- GPCRx.
[0570] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o heterômero CXCR4-GPCRx exibe a quantidade aprimorada de mobi- lização de cálcio, de modo que:
[0571] a) o CXCRA4 ou o respectivo GPCRx em um contexto de pro- tômero individual na célula mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRXx seletivo resulta em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; e
[0572] b) o heterômero CXCR4-GPCRx exibe uma mobilização de cálcio aprimorada mediante coestimulação com o CXCL12 e o respec- tivo agonista de GPCRx seletivo com relação à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo;
[0573] conforme determinado por meio de um ensaio de mobiliza- ção de cálcio.
[0574] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que:
[0575] i) a mobilização de cálcio do protômero CXCR4 ou GPCRXx, no contexto de protômero individual na célula, é não sinérgica, conforme determinado por meio de ensaio de mobilização de cálcio; e
[0576] ii) a mobilização de cálcio do heterômero CXCR4-GPCRx na célula é sinérgica, conforme determinado por meio de um ensaio de mo- bilização de cálcio.
[0577] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que, no contexto de protômero individual:
[0578] a) o protômero CXCRA4 individual na célula, na ausência do respectivo individual protômero GPCRx; ou
[0579] b) o respectivo protômero GPCRx individual na célula, na au- sência do protômero CXCR4 individual;
[0580] mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo ago- nista de GPCRx seletivo resulta em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
[0581] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que no contexto de protômero individual, independentemente:
[0582] a) o protômero CXCR4 individual na célula, na ausência do respectivo individual protômero GPCRx; e
[0583] b) o respectivo protômero GPCRx individual na célula, na au- sência do protômero CXCR4 individual;
[0584] mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo ago- nista de GPCRx seletivo resulta em uma quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
[0585] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o heterômero CXCR4-GPCRx, mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, resulta em uma quantidade de mobilização de cálcio que é maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
[0586] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a quantidade de mobilização de cálcio que resulta da coestimulação do heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade aprimorada de mobiliza- ção de cálcio, em relação à soma de mobilizações de cálcio que resul- tam da estimulação de agonista único do dito heterômero CXCR4- GPCRXx, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
[0587] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio é pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, ou pelo menos 90% maior que a soma de mobilizações de cálcio que resultam da esti- mulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRXx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mo- bilização de cálcio.
[0588] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio é uma quantidade sinérgica de mobilização de cálcio.
[0589] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método administra um reagente seletivo de heterômero CXCRA4- GPCRx.
[0590] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx:
[0591] i) altera propriedades específicas de heterômero do heterô- mero CXCR4-GPCRx na célula derivada de paciente;
[0592] ii) altera função específica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx na célula derivada de paciente;
[0593] iji) altera propriedades específicas de heterômero da célula derivada de paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx; ou
[0594] iv) diminui a proliferação celular da célula derivada de paci- ente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
[0595] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera propriedades específicas de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx na célula de- rivada de paciente.
[0596] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera função espe- cífica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx na célula derivada de paciente.
[0597] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera propriedades específicas de heterômero da célula derivada de paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
[0598] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx diminui a prolifera- ção celular da célula derivada de paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
[0599] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx é um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx ou um inibidor de heterômero CXCR4- GPCRx.
[0600] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx é um antagonista de CXCRA, um antagonista de GPCRx ou um antagonista de heterômero CXCR4-GPCRx.
[0601] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx é administrado como uma composição farmacêutica.
[0602] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método administra um inibidor selecionado dentre o grupo que con- siste em: o inibidor de CXCRA, o inibidor de GPCRx ou o inibidor de heterômero CXCR4-GPCRx.
[0603] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor é administrado como uma composição farmacêutica.
[0604] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor administrado é o inibidor de CXCRA4.
[0605] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor administrado é o inibidor de GPCRx.
[0606] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor administrado é o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0607] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método administra a combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: o inibidor de CXCRA, o inibidor de GPCRx e o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0608] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a combinação de inibidores é administrada como uma composição far- macêutica.
[0609] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a combinação de inibidores compreende o inibidor de CXCRA4 e o inibi- dor de GPCRx.
[0610] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a combinação de inibidores compreende o inibidor de CXCRA4 e o inibi- dor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0611] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a combinação de inibidores compreende o inibidor de GPCRx e o inibi- dor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0612] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a combinação de inibidores é administrada sequencial, concomitante ou simultaneamente.
[0613] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a combinação de inibidores é administrada como uma composição far- macêutica que compreende adicionalmente um veículo farmaceutica- mente aceitável.
[0614] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a combinação de inibidores é administrada como composições farma- cêuticas separadas, em que as composições farmacêuticas separadas independentemente compreendem adicionalmente um veículo farma- ceuticamente aceitável.
[0615] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de CXCR4 é um antagonista de CXCRA, um agonista reverso de CXCRA, um antagonista parcial de CXCRA4, um modulador alostérico de CXCRA4, um anticorpo de CXCRA4, um fragmento de anticorpo de
CXCRA4 ou um ligante de CXCRA.
[0616] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de GPCRx é um antagonista de GPCRx, um agonista reverso de GPCRx, um antagonista parcial de GPCRx, um modulador alostérico de GPCRx, um anticorpo de GPCRx, um fragmento de anticorpo de GPCRx ou um ligante de GPCRx.
[0617] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx é um antagonista do heterô- mero CXCR4-GPCRx, um agonista reverso do heterômero CXCR4- GPCRXx, um antagonista parcial do heterômero CXCR4-GPCRXx, um mo- dulador alostérico do heterômero CXCR4-GPCRx, um anticorpo do he- terômero CXCR4-GPCRx, um fragmento de anticorpo do heterômero CXCR4-GPCRXx, um ligante do heterômero CXCR4-GPCRx ou um ini- bidor de interação de proteína-proteína (PPI) do heterômero CXCR4- GPCRx.
[0618] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de CXCRA, o inibidor de GPCRx ou o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRXx, é um conjugado de anticorpo e fármaco.
[0619] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx é administrada ao paciente.
[0620] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que uma quantidade sub-terapeuticamente eficaz do inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx é administrada ao paciente.
[0621] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor de CXCR4 é admi- nistrada ao paciente.
[0622] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que uma quantidade sub-terapeuticamente eficaz do inibidor de CXCRA4 é administrada ao paciente.
[0623] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de CXCR4 é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0624] AD-114, AD-114-6H, AD-114-Im7-FH, AD-114-PA600-6H, ALX-0651, ALX40-4C, AMDO70 (AMD11070, X4P-001), AMD3100 (ple- rixafor), AMD3465, ATI 2341, BKT140 (BL-8040; TF14016; 4F-Benzoil- TN14003), CTCE-9908, CX549, D-[Lys3] GHRP-6, FC122, FC131,
GMI-1359, GSK812397, GST-NT21MP, isotioureia-1a, isotioureia-1t (IT1t), KRH-1636, KRH-3955, LY 2510924, LY2624587, MSX-122, N- [MC]Metil-AMD3465, PF-06747143, POL6326, dímero SDF-1 1-9[P2G], SDF1 P2G, T134, T140, T22, TC 14012, TG-0054 (Burixafor), USL311, ulocuplumabe (MDX1338/BMS-936564), proteína inflamatória de ma- crófago viral-lIl (vMIP-II), WZ811, 12G5, 238D2, 238D4, [“Cu]- AMD3100, [ºCu]-AMD3465, [Ga]pentixafor, [ººY]pentixater, [P*"Tc]O 2-AMD3100, ["”"Lu]pentixater e 508MCI (Composto 26).
[0625] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor de GPCRx é admi- nistrada ao paciente.
[0626] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que uma quantidade sub-terapeuticamente eficaz do inibidor de GPCRx é administrada ao paciente.
[0627] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0628] ADCYAP1IR1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0629] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é ADRB2 ou HRH1.
[0630] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é ADCYAP1R1.
[0631] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de ADCYAP1R1 é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0632] M65, Max.d.4, MK-0893, N-estearil-[Nle *7], neurotensina-(6- 11)/VIP-(7-28), PACAP-(6-38) e PG 97-269.
[0633] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é ADORAZB.
[0634] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de ADORAZB é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0635] 3-isobutil-8-pirrolidinoxantina, aloxazina, AS16, AS70, AS7A4, ASS94, AS95, AS96, AS99, AS100, AS101, ATL8O2, BW-A1433, cafeína, CGS 15943, CPX, CSC, CVT-6883, DAX, DEPX, derenofilina, DPCPX, FK-453, -ABOPX, istradefilina, KF26777, LASS8096, LUF5981, MRE 2029F20, MRE 3008F20, MRS1191, MRS1220, MRS1523, MRS1706,
MRS1754, MSX-2, OSIP339391, pentoxifilina, preladenant, PSB-10, PSB-11, PSB36, PSB603, PSB-0788, PSB1115, rolofilina, SCH 58261, SCH442416, ST-1535, teofilina, tonapofilina, vipadenant, composto de xantina e amina, XCC e ZM-241385.
[0636] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é ADORAS3.
[0637] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de ADORAS3 é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0638] ATL802, BW-A1433, cafeina, CGS 15943, CSC, CVT-6883, derenofilina, dexniguldipina, DPCPX, FK-453, flavanona, flavona, galan- gina, I-ABOPX, istradefilina, KF26777, LASS8096, LUF5981, MRE 2029F20, MRE 3008F20, MRE 3010F20, MRS1041, MRS1042, MRS1067, MRS1088, MRS1093, MRS1097, MRS1177, MRS1186, MRS1191, MRS1191, MRS1220, MRS1476, MRS1486, MRS1505, MRS1523, MRS1754, MRS928, MSX-2, nicardipina, preladenant, PSB- 10, PSB-11, PSB36, PSB603, PSB1115, rolofilina, sacuranetina, SCH 58261, SCH442416, ST-1535, teofilina, tonapofilina, vipadenant, visna- gina, VUF5574, VUF8504, VUF8507, composto de xantina e amina, e ZM-241385.
[0639] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é ADRB2.
[0640] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de ADRB2 é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0641] Alprenolol, atenolol, betaxolol, bupranolol, butoxamina, cara- zolol, carvedilol, CGP 12177, cicloprolol, ICI 118551, ICYP, labetalol, le- vobetaxolol, levobunolol, LK 204-545, metoprolol, nadolol, NIHP, NIP, propafenona, propranolol, sotalol, SR59230A e timolol.
[0642] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é C5AR1.
[0643] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de CSAR1 é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0644] AB 4711-713, AcPhe-Orn-Pro-D-Cha-Trp-Arg, avacopan, CO89, CHIPS, DF2593A, JPE1375, L-156,602, NDT9520492, N-metil-Phe- Lys-Pro-D-Cha-Trp-D-Arg-CO 2H, PMX205, PMX53, RPR121154 e WB54011.
[0645] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é CALCR.
[0646] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de CALCR é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0647] a-CGRP-(8-37) (ser humano), AC187, CT-(8-32) (salmão) e olcegepant.
[0648] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é CHRM1.
[0649] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de CHRM1 é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0650] benzilato de 3-quinuclidinila (QNB), 4-DAMP, aclidínio, AESC90CB, AFDX384, amitriptilina, AQ-RA 741, atropina, benzatro- pina, biperideno, darifenacina, diciclomina, dosulepina, etopropazina, glicopirrolato, guanilpirenzepina, hexa-hidrodifenidol, hexa-hidrossiladi- fenidol, hexocíclio, himbacina, ipratrópio, litocolilcolina, metoctramina, ML381, toxina muscarínica 1, toxina muscarínica 2, toxina muscarínica 3, escopolamina de N-metila, otenzepade, oxibutinina, p-F-HHSiD, pi- renzepina, propantelina, (R,R)-quinuclidinil-4-fluorometil-benzilato, es- copolamina, sila-hexocíclio, solifenacina, telenzepina, tiotrópio, toltero- dina, tri-hexifenidila, tripitramina, UH-AH 37, umeclidínio e VUO255035.
[0651] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é EDNRB.
[0652] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de EDNRB é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0653] A192621, ambrisentan, atrasentan, bosentan (RO 470203, Tracleer), BQO788, IRL 2500, K-8794, macitentan, RES7011, Ro 46- 8443, SB209670, SB217242 (enrasentan), TAK 044 e tezosentan (RO610612).
[0654] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é HRH1.
[0655] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de HRH1 é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0656] (-)-clorfeniramina, (+)-clorfeniramina, (-)- trans-H 2-PAT, (+)- cis-H 2-PAT, (+)- trans-H 2-PAT, (+)- cis-H 2-PAT, (+)- trans-H 2-PAT, (R)- cetirizina, (S)-cetirizina, 9-OH-risperidona, A-317920, A-349821, ABT- 239, alimemazina, amitriptilina, aripiprazol, arpromidina, asenapina, as- temizol, AZD3778, azelastina, BU-E 47, cetirizina, clorfeniramina, clor- promazina, ciproxifano, clemastina, clobempropite, clozapina, cones- sina, ciclizina, cipro-heptadina, desloratadina, difenidramina, dosule- pina, doxepina, epinastina, fexofenadina, flufenazina, fluspirileno, halo- peridol, hidroxizina, impromidina, INCB-38579, JNJ-39758979, cetoti- feno, loratadina, loxapina, MK-0249, molindona, olanzapina, perfena-
zina, pimozida, pipamperona, pitolisante, prometazina, pirilamina, que- tiapina, risperidona, sertindol, terfenadina, tioridazina, tiotixeno, tri- fluoperazina, tripelenamina, triprolidina, ziprasidona e zotepina.
[0657] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é MLNR.
[0658] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de MLNR é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0659] GM-109, MA-2029 e OHM-11526.
[0660] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é NTSR1.
[0661] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de NTSR1 é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0662] Meclinertant, SR48527, SR48692 e SR142948A.
[0663] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx é TACR3.
[0664] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de TACR3 é selecionado dentre o grupo que consiste em:
[0665] [Trp 7, B-Ala %] neurocinina A-(4-10), AZD2624, FK 224, GR138676, GSK 172981, GSK 256471, N',2-difenilquinolina-4-carboi- drazida 8m, Nf 2-difenilquinolina-4-carboidrazida, osanetant, PD 154740, PD 161182, PD157672, saredutant, SB 218795, SB 222200, SB 235375, SCH 206272, SSR 146977 e talnetant.
[0666] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o respectivo agonista de GPCRx seletivo é ligante natural do respectivo GPCRX,., respectivamente.
[0667] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método compreende adicionalmente detectar o heterômero CXCR4- GPCRXx no paciente com câncer.
[0668] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método compreende adicionalmente identificar o heterômero CXCR4- GPCRXx no paciente com câncer.
[0669] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método compreende adicionalmente:
[0670] i) obter, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente com câncer;
[0671] ii) conduzir, ou ter conduzido, um ensaio de diagnóstico para determinar a presença, identidade, ou presença e identidade, de um he- terômero CXCR4-GPCRx na amostra biológica obtida do paciente com câncer; e
[0672] iii) selecionar o inibidor ou combinação de inibidores para su- primir sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0673] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em câncer de mama, câncer pulmonar, câncer de cérebro, câncer de rim, câncer pan- creático, câncer ovariano, câncer da próstata, melanoma, mieloma múl- tiplo, cânceres gastrointestinais, carcinoma de célula renal, sarcomas de tecido mole, carcinoma hepatocelular, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de esôfago e leucemia.
[0674] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a amostra biológica de um paciente é uma amostra de fluido biológico.
[0675] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que uma biopsia líquida é realizada na amostra de fluido biológico. Em algu- mas modalidades, a amostra de fluido biológico inclui células tumorais circulantes (CTCs), DNA livre de célula derivada de tumor (cfDNA), pe- quenos RNAs circulantes e vesículas extracelulares que incluem exos- somas, de fluidos corporais conforme divulgado, por exemplo, em Cam- pos CDM et al., “Molecular Profiling of Liquid Biopsy Samples for Preci- sion Medicine,” Cancer J., março/abril de 2018;24(2):93-103, que é in- corporado aqui em sua totalidade.
[0676] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a amostra de fluido biológico é uma amostra sanguínea, uma amostra plasmática, uma amostra de saliva, uma amostra de fluido cerebral, uma amostra de fluido ocular ou uma amostra de urina.
[0677] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a amostra biológica de um paciente é uma amostra de tecido biológico.
[0678] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que uma biopsia líquida é realizada na amostra de tecido biológico.
[0679] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a amostra de tecido biológico é uma amostra de tecido de órgão, uma amostra de tecido ósseo ou uma amostra de tecido de tumor.
[0680] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a célula cancerígena contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
[0681] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que uma célula não cancerígena normal não contém o heterômero CXCR4- GPCRx.
[0682] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a célula cancerígena do paciente contém o heterômero CXCR4-GPCRx em uma concentração maior que uma célula não cancerígena normal do dito paciente, por exemplo, 10% concentração maior que uma célula não cancerígena normal do dito paciente, tal como 25% maior, 50% maior, 100% maior, 200% maior, ou 300% maior, que uma célula não cancerígena normal do dito paciente.
[0683] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o heterômero CXCR4-GPCRx contido na célula cancerígena do paci- ente está em uma concentração maior que uma célula não cancerígena normal do dito paciente, por exemplo, concentração 10% maior que uma célula não cancerígena normal do dito paciente, tal como 25% maior,
50% maior, 100% maior, 200% maior, ou 300% maior, que uma célula não cancerígena normal do dito paciente; e em que o GPCRx do hete- rômero CXCR4-GPCRx contido na célula cancerígena do paciente é se- lecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0684] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a presença do heterômero CXCR4-GPCRx na célula cancerígena do paciente identifica uma subpopulação de pacientes com câncer medi- ado por CXCRA.
[0685] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a presença do heterômero CXCR4-GPCRx na célula cancerígena do paciente é um biomarcador de uma subpopulação de pacientes com câncer mediado por CXCRA.
[0686] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o biomarcador da subpopulação de pacientes com câncer mediado por CXCRA4 permite medicina de precisão, estratificação de paciente ou classificação de paciente.
[0687] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o biomarcador da subpopulação de pacientes com câncer mediado por CXCRA4 permite a terapêutica de câncer de precisão com base em GPCR.
[0688] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a presença do heterômero CXCR4-GPCRXx na célula cancerígena do paciente identifica uma subpopulação de pacientes com câncer medi- ado por CXCRA4; e em que o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx presente na célula cancerígena do paciente é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CS5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0689] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a presença do heterômero CXCR4-GPCRx na célula cancerígena do paciente é um biomarcador de uma subpopulação de pacientes com câncer mediado por CXCRA4; e em que o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx presente na célula cancerígena do paciente é selecio- nado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1IR1, ADORAZBE, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
[0690] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor é um anticorpo.
[0691] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx é um anticorpo.
[0692] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0693] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o anticorpo é um anticorpo de heterômero específico do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0694] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor é um ligante (ou ligantes) biespecífico do heterômero CXCR4- GPCRx.
[0695] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o anticorpo é um conjugado de anticorpo e fármaco (ADC), conforme divulgado, por exemplo, em Beck a et al., “Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates”, Nature Reviews Drug
Discovery, 16:315-337, (2017) e Lambert, et al., “Antibody-Drug Conju- gates for Cancer Treatment”, Annual Review of Medicine, 69:191-207 (2018), em que cada um está incorporado aqui em sua totalidade.
[0696] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método compreende: administrar ao paciente um inibidor ou uma com- binação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; em que: |) o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinaliza- ção a jusante aprimorada; e ii) o inibidor ou combinação de inibidores administrada suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito hete- rômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer.
[0697] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o kit farmacêutico ou composição farmacêutica, tal como para uso no tratamento de câncer em um paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRXx, compreende: um inibidor ou uma com- binação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; em que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada.
[0698] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a progressão do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx é diminuída na faixa de 5a 100% mais, 10 a 100% mais, 20 a 100% mais, 30 a 100% mais, 40 a 100% mais, 50 a 100% mais, 60 a 100% mais, 75 a 100% mais, 5 a 75% mais, 5 a 50% mais, ou 5 a 25% mais, mediante administração da com- binação de inibidores, com relação à administração do inibidor de CXCR4 ou inibidor de GPCRx como o inibidor único ao dito paciente.
[0699] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a eficácia de um inibidor de CXCRA4 é aumentada na faixa de 5 a 2000%, a 1750%, 5 a 1500%, 5 a 1250%, 5 a 1000%, 5 a 900%, 5 a 800%, 5 a 700%, 5 a 500%, 5 a 400%, 5 a 250%, 5 a 200%, 5 a 100%, 5 a 75%, 5 a 50%, 5 a 40%, 5 a 30%, 5 a 25%, 100 a 2000%, 200 a 2000%, 300 a 2000%, 500 a 2000%, 750 a 2000%, 1000 a 2000%, 1250 a 2000%, 1500 a 2000%, 5 a 1500%, 25 a 1500%, 50 a 1500%, 75 a 1500%, 100 a 1500%, 200 a 1500%, 300 a 1500%, 500 a 1500%, 750 a 1500%, 1000 a 1500%, ou 1250 a 1500%, quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRx ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx, com relação à eficácia do inibidor de CXCRA4 quando administrado como um inibidor único.
[0700] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000%, 5 a 1750%, 5 a 1500%, 5 a 1250%, 5 a 1000%, 5 a 900%, 5 a 800%, 5 a 700%, 5 a 500%, 5 a 400%, 5 a 250%, 5 a 200%, 5 a 100%, 5 a 75%, 5 a 50%, 5 a 40%, 5 a 30%, 5 a 25%, 100 a 2000%, 200 a 2000%, 300 a 2000%, 500 a 2000%, 750 a 2000%, 1000 a 2000%, 1250 a 2000%,
1500 a 2000%, 5 a 1500%, 25 a 1500%, 50 a 1500%, 75 a 1500%, 100 a 1500%, 200 a 1500%, 300 a 1500%, 500 a 1500%, 750 a 1500%, 1000 a 1500%, ou 1250 a 1500%, quando administrado em combinação com o inibidor de CXCRA4 ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx, com relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando administrado como um inibidor único.
[0701] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método administra uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; ou o kit farmacêutico ou composição farmacêutica compreende uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0702] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a combinação de inibidores é uma combinação de dois inibidores sele- cionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
[0703] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método administra uma combinação de um inibidor de CXCR4 e um inibidor de GPCRx; ou o kit farmacêutico ou composição farmacêutica compreende uma combinação de um inibidor de CXCR4 e um inibidor de GPCRx.
[0704] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o método administra um inibidor de heterômero CXCR4-GPCRx; ou o kit farmacêutico ou composição farmacêutica compreende um inibidor de heterômero CXCR4-GPCRx.
[0705] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a administração da combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 2000 vezes, 5 e 1750 vezes, 5 e 1500 vezes, 5 e 1250 vezes, 5 e 1000 vezes, 5 e 900 vezes, 5 e 800 vezes, e 700 vezes, 5 e 500 vezes, 5 e 400 vezes, 5 e 250 vezes, 5 e 200 vezes, 5 e 100 vezes, 5 e 75 vezes, 5 e 50 vezes, 5 e 40 vezes, 5e 30 vezes, 5 e 25 vezes, 100 e 2000 vezes, 200 e 2000 vezes, 300 e 2000 vezes, 500 e 2000 vezes, 750 e 2000 vezes, 1000 e 2000 vezes, 1250 e 2000 vezes, 1500 e 2000 vezes, 5 e 1500 vezes, 25 e 1500 vezes, 50 e 1500 vezes, 75 e 1500 vezes, 100 e 1500 vezes, 200 e 1500 vezes, 300 e 1500 vezes, 500 e 1500 vezes, 750 e 1500 vezes, 1000 e 1500 vezes ou 1250 e 1500 vezes, com relação à administração de inibidor único.
[0706] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a administração do inibidor ou combinação de inibidores suprime a si- nalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 2000 vezes, 5 e 1750 vezes, 5 e 1500 vezes, 5 e 1250 vezes, 5 e 1000 vezes, 5 e 900 vezes, 5 e 800 vezes, 5 e 700 vezes, 5 e 500 vezes, 5 e 400 vezes, 5 e 250 vezes, 5 e 200 vezes, 5 e 100 vezes, 5 e 75 vezes, 5 e 50 vezes, 5 e 40 vezes, 5 e 30 vezes, 5 e 25 vezes, 100 e 2000 vezes, 200 e 2000 vezes, 300 e 2000 vezes, 500 e 2000 vezes, 750 e 2000 vezes, 1000 e 2000 vezes, 1250 e 2000 vezes, 1500 e 2000 vezes, 5 e 1500 vezes, 25 e 1500 vezes, 50 e 1500 vezes, 75 e 1500 vezes, 100 e 1500 vezes, 200 e 1500 vezes, 300 e 1500 vezes, 500 e 1500 vezes, 750 e 1500 vezes, 1000 e 1500 vezes ou 1250 e 1500 vezes com relação à supressão de sinali- zação a jusante de um protômero CXCRA4 ou um protômero GPCRx em seu respectivo contexto de protômero individual.
[0707] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; por exem- plo, selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, CHRM1, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADORAZB,
ADORA3, ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecio- nado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1, NTSR1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que con- siste em: ADRB2, CHRM1, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB, HRH1 e TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, EDNRB e HRH1; selecionado dentre o grupo que consiste em: ADRB2, CHRM1 e HRH1; ou selecionado den- tre o grupo que consiste em: ADRB2, HRH1 e TACR3.
[0708] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que o inibidor de GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA3, inibidor de ADRB2, inibidor de CSAR1, inibidor de CALCR, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibi- dor de NTSR1 e inibidor de TACR3; por exemplo, selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS3, inibidor de ADRB2, inibidor de CSAR1, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibi- dor de NTSR1 e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS, inibidor de ADRB?2, inibidor de CHRM1, inibidor de ED- NRB, inibidor de HRH1, inibidor de MLNR, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1RI1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA, inibidor de ADRB32, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, ini- bidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADCYAP1R1, inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORA, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADORAZB, inibidor de ADORAS3, inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, inibidor de NTSR1, e inibidor de TACR3; se- lecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de EDNRB, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, inibidor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, inibi- dor de HRH1, e inibidor de TACR3; selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADRB2, inibidor de EDNRB, e inibidor de HRH1; selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de ADRB2, inibidor de CHRM1, e inibidor de HRH1; ou selecionado dentre o grupo que con- siste em: inibidor de ADRB?2, inibidor de HRH1 e inibidor de TACR3.
[0709] Em uma modalidade adicional, o método de tratamento, mé- todo de supressão, composição farmacêutica, ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das modalidades acima e qualquer uma ou mais dentre as modalidades adicionais no presente documento, em que a concentração inicial do inibidor está na faixa entre 1 e 10 uM (ou cada um dos inibidores da combinação em concentrações na faixa entre 1 e uM), tal como em uma concentração de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 90u 10 UM, no teste e/ou avaliação do dito inibidor, ou combinação de inibido- res, sobre ser eficaz, ou terapeuticamente eficaz, na supressão de uma sinalização a jusante aprimorada de um heterômero CXCR4-GPCRx.
MATERIAIS E MÉTODOS REAGENTES
[0710] BAY 60-6583, CGS 21680, C5a, acetilcolina, motilina, neu- rotensina, senktide, salmeterol, CI-IB-MECA, calcitonina de salmão, BQ- 3020, octreotida, VUO255035, cetirizina, pirilamina, MA-2029, mecliner- tant e SSR 146977 foram adquiridos junto à Tocris Bioscience (Ellisville, MO, E.U.A.). Galanina, endotelina-1, histamina, Prostaglandina E2 (PGE2), SRIF-14 (somatostatina) e betanecol foram adquiridos junto à Sigma-Aldrich (St Louis, Mo., E.U.A.). CXCL12, peptídeo intestinal va- soativo (VIP) e CCL2 foram adquiridos junto à R&D systems (Minnea- polis, Minnesota, E.U.A.). Formoterol, carvedilol, oxibutinina, bosentan, hidroxizina e loratadina foram adquiridos junto à Prestwick Chemical (lllkirch, França). Apelina-13, roxitromicina, AMD3100, umeclidínio fo- ram obtidos junto à Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, E.U.A.), Selleckchem (Houston, TX, E.U.A.), Medchem express (Prince- ton, NJ, E.U.A.), e Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, E.U.A.), respectivamente.
CONSTRUÇÃO DE VETORES ADENOVIRAIS QUE CONTÊM cDNAs de GPCR.
[0711] Vetores que contêm fragmentos de BiFC, pCS2+VNm10 e PBIFC-VC155, foram obtidos junto à Chang-Deng Hu (Hu et al., 2002) e James Smith (Saka et al., 2007), respectivamente. O VÊNm10 é uma va- riante de Vênus VN154 que contém mutações de L46F e L64F. Para construir vetores de pAdBIFC-VN e pAdBiFC-VC, DNAs que contêm VNMm10 e VC155 foram amplificados por PCR e clonados em pShuttle- CMV. Vetores de pAdBiIFC-VN e pAdBiFC-VC foram obtidos através de recombinação homóloga entre pAdEasy-1 e pShuttle-CMV-VNm10 ou pShuttle-CMV-VC155 com o uso do sistema de vetor AdEasy de acordo com as instruções do fabricante (Qbiogene, Carlsbad, CA). Clones de cCDNA de GPCR humano foram obtidos junto ao Missouri SeT cDNA Re- source Center (Rolla, MO, E.U.A.). cDNAs de GPCR foram amplificados através de PCR e clonados em vetor de PDONR201. Adenovírus que codificam GPCR, GPCR-VN, GPCR-VC e GPCR-EGFP foram obtidos através de recombinação de LR in vitro entre clones de entrada que contêm GPCR e vetores de pAdHTS, pAdBiFC-VN, pAdBiFC-VC, ou pAdDdHTS-GFPC, e a transfecção subsequente para células 293A com o uso do sistema AdHTS, conforme descrito anteriormente (Choi et al, 2012; Song et al., 2014).
CULTURA CELULAR
[0712] Células U-2 OS e células MDA-MB-231 foram adquiridas junto à American Type Culture Collection (Manassas, VA, E.U.A.), e cé- lulas 293A foram adquiridas junto à Invitrogen (Carlsbad, CA, E.U.A). Células U-2 OS, células MDA-MB-231 e células 293A foram cultivadas em meio McCoy's 5A, RPMI 1640, e meio de Eagle Modificado, respec- tivamente, na presença de 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 unida- des/ml de penicilina e 100 pug/ml de estreptomicina. Células foram culti- vadas com 5% de CO?2 a 37ºC.
ENSAIO BIFC
[0713] Células U-2 OS foram semeadas em uma densidade de 3000 células por poço em uma placa de fundo transparente de 96 poços preta em 100 ul de meio McCoy's 5A complementado com 10% de FBS. No dia seguinte, as células foram transduzidas, cada uma, com 30 MOI de adenovírus que codificam GPCR-VN e GPCR-VC. Três dias após transdução, células foram fixadas com 2% de formaldeído e núcleos fo- ram tingidos com Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlisbad, CA). Imagens foram adquiridas com o uso de analisador de célula IN 1000 e analisa- das com caixa de ferramentas IN Cell Developer (GE Healthcare, Wau- Kesha, WI). Imagens nucleares e BiFC foram visualizadas com o uso de um lente objetiva de x20 e filtros de excitação de 360 nm (Hoechst) e 480 nm, e monitoradas através de filtros de emissão de 460 e 535 nm, respectivamente, com um espelho tricroico 61002.
ENSAIO DE COINTERNALIZAÇÃO
[0714] Células U-2 OS foram semeadas em uma densidade de 3000 células por poço em uma placa de fundo transparente de 96 poços preta em 100 ul de meio McCoy's 5A complementado com 10% de FBS. No dia seguinte, as células foram cotransduzidas com adenovírus que codificam CXCR4-EGFP (10 MOI) e GPCR-VC ou GPCR-VN (30 MOI). Dois dias após transdução, células foram estimuladas com agonistas de GPCRx por 30 min e fixadas com 2% de formaldeído. Imagens foram obtidas com o uso de analisador de célula IN 2000 que usa um compri- mento de onda de excitação de 480 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm.
ENSAIO DE MOBILIZAÇÃO DE CÁLCIO
[0715] As células MDA-MB-231 de câncer de mama humano foram semeadas em 20000 células por poço em uma placa de 96 poços de fundo transparente preto (Corning Costar, nº 3340) em 100 ul de RPMI 1640 complementado com 10% de FBS. No dia seguinte, células foram cotransduzidas com 10 MOI de CXCR4 e 30 MOI de HA-VC, 10 MOI de HA-VC e 30 MOI de GPCRXx, ou 10 MOI de CXCR4 e 30 MOI de GPCRx. Adenovírus que codificam HA-VC foram usados para ajustar a quanti- dade total de adenovírus transduzidos. Após 2 dias, as células foram lavadas duas vezes com tampão de ensaio (solução de sal equilibrada de Hank sem vermelho de fenol, complementada com 0,1% de BSA e mM de HEPES, pH 7 4), e tingidas com 5 pg/ml de Cal-520 AM (AAT Bioquest, Sunnyvale, CA, E.U.A.) diluído em tampão de ensaio por 2 h. Células foram lavadas com tampão de ensaio três vezes, e incubadas a 37 "C por mais 30 min. A placa foi carregada em um Leitor de Microplaca FlexStation 3 Multi-Mode (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, E.U.A.) e agonistas de GPCRx foram adicionados. A mobilização de Ca2+ intra- celular foi medida a 37 “C com o uso de um comprimento de onda de excitação de 490 nm e um comprimento de onda de emissão de 525 nm. Antagonistas ou veículos foram adicionados 30 min antes do trata- mento de agonista.
ENSAIO DE INIBIÇÃO DE INTERNALIZAÇÃO
[0716] Células U-2 OS de CXCR4-GFP expresso foram semeadas em uma densidade de 5000 células por poço em uma placa de fundo transparente de 96 poços preta em 100 ul de meio McCoy's 5A comple- mentado com 10% de FBS. No dia seguinte, as células foram transdu- zidas com adenovírus que codificam GPCRx (30 MOI). Dois dias após transdução, células foram estimuladas com agonistas de SDF-1 e/ou GPCRx por 20 min e fixadas com 4% de paraformaldeído. Imagens fo- ram obtidas com o uso de analisador de célula IN 2500 que usa um comprimento de onda de excitação de 480 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm.
ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO
[0717] PDCs foram semeadas em placa de 384 poços a 500 ea/poço em 40 ul de meio de cultura. Após crescimento de um dia para o outro, as células foram cultivadas por 7 dias na presença de diversas doses de antagonista de GPCRx ou DMSO sozinho. Após a incubação de 7 dias, 15 ul de ATPIite (PerkinElmer, número de Cat. 6016739) fo- ram adicionados em cada poço e as placas foram agitadas por 5 minu- tos em um agitador orbital a 700 rpm. O sinal luminescente foi detectado dentro de 30 minutos no instrumento de detecção PerkinElmer To- pCount. A viabilidade celular foi calculada com o uso da equação: Via- bilidade celular (%) = (OD de tratamento de antagonista/OD de trata- mento de DMSO apenas) x 100%.
ENSAIO DE LIGAÇÃO DE PROXIMIDADE EM CÉLULA
[0718] Linhas celulares de superexpressão de CXCRA4, a U2O0S- CXCRA, foi infectada com adenovírus que expressa ADRB2, Ad- ADRB2, na dose de O, 2,5, 10, 40 MOIs por 2 dias. Ensaios de ligação de proximidade (PLA) foram realizados conforme descrito anteriormente
(Brueggemann et al., 2014; Tripathi et al., 2014). Para realizar PLA, cé- lulas infectadas foram fixadas com 4% de paraformaldeído (PFA) em lâminas de cultura de tecido de dezesseis poços. As lâminas foram blo- queadas com solução de bloqueio fornecida pela Duolink e incubadas com anti-CXCR4 de camundongo (1:200, Santacruz, Sc-53534), anti- ADRB?2 de coelho (1:200, Thermoscientific, PA5-33333) a 37 ºC por 1 h em uma câmara de umidificação. Lâminas foram, então, lavadas e incu- badas (1 h a 37 ºC) com anticorpos anti-coelho e anti-camundongo se- cundários conjugados com sondas de PLA Duolink Il mais e menos. Lâ- minas foram lavadas novamente e, então, incubadas com solução de ligação-ligase (30 min a 37 ºC) seguido por incubação com solução de amplificação-polimerase (2 h a 37 ºC). Lâminas foram, então, montadas com volume mínimo de meio de montagem Duolink Il com 4' ,6-diami- dino-2-fenilindol (DAPI) por 15 a 30 min, e sinais de PLA [Reagentes de Detecção /n Situ Duolink Verde (A de excitação/emissão 495/527 nm) ou Vermelho (A de excitação/emissão 575/623 nm) foram identificados como pontos fluorescentes sob um analisador de célula IN 2500.
ENSAIO DE LIGAÇÃO DE PROXIMIDADE EM PDC
[0719] PDCs foram semeadas em lâmina de 96 câmaras em 100000 ea/poço em 100 ul de meio de cultura. Para realizar PLA, PDCs foram fixadas com 4% de paraformaldeído (PFA) e foram bloqueadas com solução de bloqueio fornecida pela Duolink e incubadas com anti- CXCRA4 de camundongo (1:200, Santacruz, Sc-53534), anti-ADRB2 de coelho (1:200, Thermoscientific, PA5-33333), anti-cCHRM1 de coelho (1:200, Ls bio, Ls-C313301) a 37 ºC por 1 h em uma câmara de umidifi- cação. Lâminas foram, então, lavadas e incubadas (1 h a 37 ºC) com anticorpos anti-coelho e anti-camundongo secundários conjugados com sondas de PLA Duolink Il mais e menos. Lâminas foram lavadas nova- mente e, então, incubadas com solução de ligação-ligase (30 min a 37 ºC) seguido por incubação com solução de amplificação-polimerase (2 h a 37 ºC). Lâminas foram, então, montadas com volume mínimo de meio de montagem Duolink Il com 4' ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por a 30 min, e sinais de PLA [Reagentes de Detecção /n Situ Duolink Verde (A de excitação/emissão 495/527 nm) ou Vermelho (A de excita- ção/emissão 575/623 nm) foram identificados como pontos fluorescen- tes sob um analisador de célula IN 2500.
ENSAIO DE LIGAÇÃO DE PROXIMIDADE EM PDX
[0720] Para realizar PLA com amostras de PDX, as amostras de FFPE derivadas de paciente com glioblastoma foram usadas (forneci- das pelo hospital de Samsung Seoul em Seoul, Coreia). Após a amostra de FFPE ser desparafinizada e ter realizado recuperação de antígeno induzida por calor por 15 minutos a 100 ºC. Lâminas foram bloqueadas com solução de bloqueio fornecida pela Duolink e incubadas com anti- CXCRA4 de coelho (1:200, Thermoscientific, PA3305), anti-ADRB2 de camundongo (1:200, Santacruz, Sc-271322), a 37 ºC por 1 h em uma câmara de umidificação. O outro processo foi igual ao descrito acima (PLA com PDC).
ENSAIO DE MIGRAÇÃO QUIMIOTÁTICA
[0721] Placas transpoço (membrana de policarbonato de tamanho de poro de 8 um, 6,5 mm de diâmetro) foram revestidas com 50 ug/ml de colágeno por 2 h a 37 ºC (Corning Inc.). Células MDA-MB-231 foram privadas de soro por 24 h e, então, colocadas em placa em meio isento de soro que contém 0,5% de BSA na câmara superior (20000 célu- las/100 ul). Antagonistas ou agonistas inversos foram adicionados às células 30 min antes da colocação em placa das células nas placas de transpoço. Atrativos foram adicionados na câmara inferior. Antagonistas ou agonistas inversos também foram incluídos na câmara inferior. Após 3 h a 37 ºC, células na membrana transpoço superior foram removidas com o uso de uma haste flexível com algodão, fixadas e tingidas com 0,1% de violeta de genciana. Quimiotaxia foi quantificada contando-se as células migradas na superfície inferior da membrana de 10 campos por câmara em lente objetiva de 10x.
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE QUANTITATIVA DE TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT-qPCR)
[0722] RNA total foi extraído com o uso de TRlizol (Invitrogen) e cCDNA foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total após tratamento com DNase | (Sigma). RT-qPCR foi conduzido com o uso de kit SensiFAST SYBR (Bioline). Sequências iniciadoras são como a seguir:
[0723] ADRB2-F: 5-CTCTTCCATCGTGTCCTTCTAC-3' (SEQ ID NO:1),
[0724] ADRB2-R: 5-AATCTTCTGGAGCTGCCTTT-3' (SEQ ID NO:2);
[0725] HRH1-F: 5- COCETCETGCTGGATCCCTTATTTC-3' (SEQ ID NO:3),
[0726] HRH1-R: 5-GGTTCAGTGTGGAGTTGATGTA-3' (SEQ ID NO:4);
[0727] CXCRA4-F: 5:- CCACCATCTACTCCATCATCTTC-3' (SEQ ID NO:5),
[0728] CXCRA4-R: 58-ACTTGTCCGTCATGCTTCTC-3' (SEQ ID NO:6);
[0729] B-actina-F: -GGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3' (SEQ ID NO:7),
[0730] B-actina-R: 58-AGCTCGTAGCTCTTCTCCA-3' (SEQ ID NO:8); GAPDH-F:
[0731] 5-ATGACATCAAGAAGGTGGTGAA-3' (SEQ ID NO:9), GA- PDH-R:
[0732] 5-GCTGTTGAAGTCAGAGGAGAC-3' (SEQ ID NO:10).
[0733] Os ciclos de limite (Ct) foram calculados através de sistema PCR em tempo real QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific).
PRODUÇÃO DE LENTIVÍRUS
[0734] pLenti CMV Hygro DEST (w117-1) foi um presente de Eric Campeau e Paul Kaufman (plasmídeo Addgene nº 17454) (Campeau et al., 2009). cDNA de CXCRA4 foi inserido no vetor lentiviral com o uso de recombinação de LR. Lentivírus que codificam CXCR4 foram produzi- dos com o uso de sistemas de expressão lentiviral ViraPower (Invirto- gen). CONSTRUÇÃO DE LINHAS CELULARES ESTÁVEIS QUE EXPRES- SAM CXCR4 SOZINHO OU HETERÔMERO CXCR4 E ADRB2
[0735] Para estabelecer linhas celulares que expressam CXCR4 es- tável, a reserva lentiviral (que contém o construto de expressão de pLenti6-CXCR4 embalado que foi inserido com gene CXCR4 em pLenti- CMV Hygro DEST (Addgene, nº 17454)), foi produzida cotransfectando- se a mistura de embalagem lentiviral ViraPower (Invitrogen, K497500) e construto de expressão de pLenti6-CXCR4 na linha celular produtora 293FT. Transdução desta reserva lentiviral em linha celular A549 foi re- alizada e seguida por seleção com higromicina (100 pg/ml) e blasticitina (5 ug/ml). Para estabelecer linhas celulares que expressam heterômero CXCRA4-ADRB? estável, a reserva lentiviral (que contém o construto de expressão de pLenti6/V5-ADRB2 embalado que foi inserido com gene ADRB?2 em vetor pLenti6/V5-DEST Gateway '!"Y (Invitrogen, V49610)), foi produzida cotransfectando-se a mistura de embalagem ViraPower e construto de expressão pLenti6/V5-ADRB2 em linha celular produtora 293FT. Transdução desta reserva lentiviral em linha celular A549- CXCRA foi realizada e seguida por seleção com higromicina (100 pg/ml) e blasticitina (5 ug/ml). Então, clones resistentes aos antibióticos foram selecionados e realizaram RT-9PCR e imunofluorescência para confir- mar a expressão do gene inserido, CXCR4 e ADRB?2.
MODELO DE XENOENXERTO DE CAMUNDONGO
[0736] Camundongos de cinco anos de idade fêmeas Balb/c-nu/nu foram obtidos junto à Envigo (França) e mantidos em uma instalação para animal isenta de patógeno específica. Todos os protocolos para uso animal e eutanásia foram aprovados pelo Comitê de Ética de Expe- rimento Animal Qubest Bio (Coreia do Sul) com base na Lei de Proteção Animal. As 1x10” células de AS49, AS49-CXCR4 ou AS49-CXCR4- ADRB?2 foram suspensas em 100 ul de solução salina tamponada de fosfato (PBS) e foram implantadas por via subcutânea na região axilar entre a parede clavicular e torácica no lado direito do camundongo. O crescimento tumoral foi monitorado todo terceiro ou quarto dia medindo- se o comprimento (L) e largura (W) do tumor com um compasso eletrô- nico e calculando-se o volume tumoral com base na seguinte Fórmula: Volume = 0,5 LW?. GERAÇÃO DE CXCR4 OU CÉLULAS DE KNOCKOUT DE HRH1 COM O USO DE SISTEMA CRISPR/CAS9
[0737] RNAs-guia de CRISPR que alvejam CXCR4 e HRH1, e RNA- guia de não alvejamento clonado em vetor lentiCRISPR v2 foram adqui- ridos junto à GenScript (Piscataway, NJ) (Sanjana et al., 2014). As se- quências de RNA-guia são como a seguir:
[0738] TGTTGGCTGCCTTACTACAT (gRNA de CXCRA4 nº 1; (SEQ ID NO:11)),
[0739] CGATCAAGTCCGCCACCGAG (gRNA de HRH nº 3; (SEQ ID NO:12)) e
[0740] ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA (gRNA de não alvejamento; (SEQ ID NO:13)). Lentivírus foram produzidos com o uso de sistemas de expressão lentiviral ViraPower (Invirtogen). Células MDA-MB-231 e células MDA-MB-231 que superexpressam CXCR4 (MDA ºXºRt+) foram transduzidas com lentivírus que codificam gRNA de não alvejamento, gRNA de CXCRA4 ou gRNAs de HRH1. Células foram selecionadas com puromicina (3 uM) por 2 semanas e perda de CXCR4 e HRH1 foi esti- mada com immunoblotting e respostas de cálcio, respectivamente. Para detectar CXCRA, anticorpo monoclonal de coelho anti-CXCR4 (Abcam,
nº ab124824) foi usado.
FONTE DE INIBIDORES DE GPCRX
[0741] Ulocuplumabe foi adquirido junto à Creative Biolabs (Shirley, NY, EU.A.). BKT140 foi adquirido junto à Chem Scene (Monmouth Junction, NJ, E.U.A.). Carazolol foi adquirido junto à Santacruz Biotech (Dallas, TX, E.U.A.). Osanetant foi adquirido junto à Axon Medchem, (Groningen, Holanda). M65 e CT-(8-32) (salmão) foram adquiridos junto à Bachem (San Diego, CA, E.U.A.). PACAP-(6-38), W54011, PMX205, PMX53, AC187, SB 222200 e Talnetant foram adquiridos junto à Tocris Bioscience (Ellisvile, MO, E.U.A.). Propranolol, Prometazina, Cipro- heptadina, Hidroxizina, Ambrisentan e macitentan foram adquiridos junto à Prestwick Chemical (Illkirch, França), e Selleckchem (Huston, TX, E.U.A.), respectivamente. ESTUDOS /N VIVO
[0742] Para o teste de eficácia antitumoral que usa inibidor de CXCR4 e ADRB2, a linha celular AS49-CXCR4-ADRB2 que superex- pressa CXCR4 e ADRB2 em AB549, a linha de célula de câncer pulmonar foi administrada por via subcutânea (1x10” célula em 100 ul de PBS/ca- beça) para BALB/c-nu. Quando o tamanho de tumor alcançou 50 a 100 mm?, grupos de dez camundongos foram administrados com veículo (1% de dimetilcelulose em PBS), inibidor de CXCR4 (3 mg/kg de LY 2510924 formulado em PBS, 10 mg/kg de AMDO70 formulado em DMSO), inibidor de ADRB2 (30 mg/kg de Carvedilol formulado em 1% de dimetilcelulose em PBS) ou combinação de inibidor de CXCR4 e ADRB2, AMDO70 e Carvedilol, ou LY2510924 e Carvedilo! uma vez ao dia por 21 a 23 dias. LY2510924 foi injetado por via subcutânea e AMDO7O ou Carvedilol foi administrado por via oral. O crescimento tu- moral foi monitorado todo terceiro ou quarto dia medindo-se o compri- mento (L) e largura (W) do tumor: Volume = 0,5 LW?.
REFERÊNCIAS
Cada uma das seguintes referências, em sua totalidade, está incorpo- rada no presente documento a título de referência: Abd Alla, J., Reeck, K., Langer, A., Streichert, T. e Quitterer, U. (2009). Calreticulin enhances B2 bradykinin receptor maturation and heterodi- merization.
Biochem Biophys Res Commun 387, 186-190; Agrawal, L., Lu, X., Qingwen, J., VanHorn-Ali, Z., Nicolescu, |.V., McDer- mott, D.H., Murphy, P.M. e Alkhatib, G. (2004). Role for CCR5Delta32 protein in resistance to R5, R5X4, and X4 human immunodeficiency vi- rus type 1 in primary CD4+ cells.
J Virol 78, 2277-2287; Albrandt, K., Brady, E.M., Moore, C.X., Mull, E., Sierzega, M.E. e Beau- mont, K. (1995). Molecular cloning and functional expression of a third isoform of the human calcitonin receptor and partial characterization of the calcitonin receptor gene.
Endocrinology 136, 5377-5384; Allen, C.D., Ansel, K.M., Low, C., Lesley, R., Tamamura, H., Fuji, N. e Cyster, J.G. (2004). Germinal center dark and light zone organization is mediated by CXCR4 and CXCR5. Nat Immunol 5, 943-952; Ara, T., Itoi, M., Kawabata, K., Egawa, T., Tokoyoda, K., Sugiyama, T., Fujii, N., Amagai, T. e Nagasawa, T. (2003). A role of CXC chemokine ligand 12/stromal cell-derived factor-1/pre-B cell growth stimulating fac- tor and its receptor CXCRA in fetal and adult T cell development in vivo.
J Immunol 170, 4649-4655; Armando, S., Quoyer, J., Lukashova, V., Maiga, A., Percherancier, Y., Heveker, N., Pin, J.P., Prezeau, L. e Bouvier, M. (2014). The chemokine CXC4 and CC? receptors form homo- and heterooligomers that can en- gage their signaling G-protein effectors and betaarrestin.
FASEB J 28, 4509-4523; Barmania, F. e Pepper, M.S. (2013). C-C chemokine receptor type five (CCR5): An emerging target for the control of HIV infection.
Appl Trans! Genom 2, 3-16; Bartolome, R.A., Ferreiro, S., Miquilena-Colina, M.E., Martinez-Prats, L.,
Soto-Montenegro, M.L., Garcia-Bernal, D., Vaquero, J.J., Agami, R., Delgado, R., Desco, M., et al. (2009). The chemokine receptor CXCR4 and the metalloproteinase MT1-MMP are mutually required during mel- anoma metastasis to lungs.
Am J Pathol 174, 602-612; Batlle, E. e Clevers, H. (2017). Cancer stem cells revisited.
Nat Med 23, 1124-1134; Bazin, H., Trinquet, E. e Mathis, G. (2002). Time resolved amplification of cryptate emission: a versatile technology to trace biomolecular inter- actions.
J Biotechnol 82, 233-250; Beck a et al., “Strategies and challenges for the next generation of anti- body-drug conjugates”, Nature Reviews Drug Discovery, 16:315-337, (2017); Bjarnadottir, T.K., Gloriam, D.E., Hellstrand, S.H., Kristiansson, H., Fred- riksson, R. e Schioth, H.B. (2006). Comprehensive repertoire and phy- logenetic analysis of the G protein-coupled receptors in human and mouse.
Genomics 88, 263-273; Bodart, V., Anastassov, V., Darkes, M.C., Idzan, S.R., Labrecque, J., Lau, G., Mosi, R.M., Neff, K.S., Nelson, K.L., Ruzek, M.C,, et al. (2009). Pharmacology of AMD3465: a small molecule antagonist of the chemo- kine receptor CXCRA4. Biochem Pharmacol 78, 993-1000; Braadland, P.R., Ramberg, H., Grytli, H.H. e Tasken, K.A. (2014). beta- Adrenergic Receptor Signaling in Prostate Cancer.
Front Oncol 4, 375; Broxmeyer, H.E., Orschell, C.M., Clapp, D.W., Hangoc, G., Cooper, S., Plett, P.A., Liles, W.C., Li, X., Graham-Evans, B., Campbell, T.B., et al. (2005). Rapid mobilization of murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with AMD3100, a CXCRA4 antagonist.
J Exp Med 201, 1307-1318; Brueggemann, L.I., Mackie, A.R., Cribbs, L.L., Freda, J., Tripathi, A., Majetschak, M. e Byron, K.L. (2014). Differential protein kinase C-de-
pendent modulation of Kv7.4 and Kv7.5 subunits of vascular Kv7 chan- nels.
J Biol Chem 289, 2099-2111; Buckley, C.D., Amft, N., Bradfield, P.F., Pilling, D., Ross, E., Arenzana- Seisdedos, F., Amara, A., Curnow, S.J., Lord, J.M., Scheel-Toellner, D., et al. (2000). Persistent induction of the chemokine receptor CXCR4 by TGF-beta 1 on synovial T cells contributes to their accumulation within the rneumatoid synovium.
J Immunol 165, 3423-3429; Burbassi, S., Sengupta, R. e Meucci, O. (2010). Alterations of CXCR4 function in mu-opioid receptor-deficient glia.
Eur J Neurosci 32, 1278- 1288; Burger, J.A., Burger, M. e Kipps, T.J. (1999). Chronic Iymphocytic leu- kemia B cells express functional CXCR4 chemokine receptors that me- diate spontaneous migration beneath bone marrow stromal cells.
Blood 94, 3658-3667; Burger, J.A. e Kipps, T.J. (2006). CXCR4: a key receptor in the crosstalk between tumor cells and their microenvironment.
Blood 107, 1761-1767; Burger, J.A. e Peled, A. (2009). CXCRA4 antagonists: targeting the mi- croenvironment in leukemia and other cancers.
Leukemia 23, 43-52; Burger, J.A., Stewart, D.J., Wald, O. e Peled, A. (2011). Potential of CXCR4 antagonists for the treatment of metastatic lung cancer.
Expert Rev Anticancer Ther 11, 621-630; Busthlin, |., Gupta, A., Stockton, S.D., Jr., Miller, L.K. e Devi, L.A. (2012). Dimerization with cannabinoid receptors allosterically modulates delta opioid receptor activity during neuropathic pain.
PLoS One 7, e49789; Callen, L., Moreno, E., Barroso-Chinea, P., Moreno-Delgado, D., Cortes, A., Mallol, J., Casado, V., Lanciego, J.L., Franco, R., Lluis, C., et al. (2012). Cannabinoid receptors CB1 and CB2 form functional heteromers in brain.
J Biol Chem 287, 20851-20865; Campeau, E., Ruhl, V.E., Rodier, F., Smith, C.L., Rahmberg, B.L., Fuss, J.O., Campisi, J., Yaswen, P., Cooper, P.K. e Kaufman, P.D. (2009). À versatile viral system for expression and depletion of proteins in mam- malian cells.
PLoS One 4, e6529; Canonica, G.W. e Blaiss, M. (2011). Antihistaminic, anti-inflammatory, and antiallergic properties of the nonsedating second-generation antihis- tamine desloratadine: a review of the evidence.
World Allergy Organ J 4, 47-53; Cao, H.L., Liu, Z.J. e Chang, Z. (2017). Cordycepin induces apoptosis in human bladder cancer cells via activation of A3 adenosine receptors.
Tumour Biol 39, 1010428317706915; Cashen, A.F., Nervi, B. e DiPersio, J. (2007). AMD3100: CXCR4 antag- onist and rapid stem cell-mobilizing agent.
Future Oncol 3, 19-27; Chatterjee, S., Behnam Azad, B. e Nimmagadda, S. (2014). The intricate role of CXCRA4 in cancer.
Adv Cancer Res 124, 31-82; Chen, J.F., Eltzschig, H.K. e Fredholm, B.B. (2013). Adenosine recep- tors as drug targets--what are the challenges? Nat Rev Drug Discov 12, 265-286; Chen, Y., Ramjiawan, R.R., Reiberger, T., Ng, M.R., Hato, T., Huang, Y., Ochiai, H., Kitahara, S., Unan, E.C., Reddy, T.P., et al. (2015). CXCRA4 inhibition in tumor microenvironment facilitates anti-pro- grammed death receptor-1 immunotherapy in sorafenib-treated hepato- cellular carcinoma in mice.
Hepatology 61, 1591-1602; Cheng, X., Wang, H., Zhang, X., Zhao, S., Zhou, Z., Mu, X., Zhao, C. e Teng, W. (2017). The Role of SDF-1/CXCR4/CXCR7 in Neuronal Re- generation after Cerebral Ischemia.
Front Neurosci 11, 590; Cho, K.S., Yoon, S.J., Lee, J.Y., Cho, N.H., Choi, Y.D., Song, Y-S. e Hong, S.J. (2013). Inhibition of tumor growth and histopathological changes following treatment with a chemokine receptor CXCR4 antago- nist in a prostate cancer xenograft model.
Oncol Lett 6, 933-938; Choi, E.W., Seen, D.S., Song, Y.B., Son, H.S., Jung, N.C., Huh, W.K., Hahn, J.S., Kim, K., Jeong, J.Y. e Lee, T.G. (2012). AdHTS: a high-
throughput system for generating recombinant adenoviruses.
J Biotech- nol 162, 246-252; Chong, B.F. e Mohan, C. (2009). Targeting the CXCR4/CXCL12 axis in systemic lupus erythematosus.
Expert Opin Ther Targets 13, 1147- 1153; Choy, C., Raytis, J.-L., Smith, D.D., Duenas, M., Neman, J., Jandial, R. e Lew, M.W. (2016). Inhibition of beta2-adrenergic receptor reduces tri- ple-negative breast cancer brain metastases: The potential benefit of perioperative beta-blockade.
Oncol Rep 35, 3135-3142; Chu, T., Shields, L.B.E., Zhang, Y.P., Feng, S.Q., Shields, C.B. e Cai, J. (2017). CXCL12/CXCR4/CXCR7 Chemokine Axis in the Central Nerv- ous System: Therapeutic Targets for Remyelination in Demyelinating Diseases.
Neuroscientist 23, 627-648; Chung, S.H,., Seki, K., Choi, B.1., Kimura, K.B,., Ito, A., Fujikado, N., Saijo, S. e lwakura, Y. (2010). CXC chemokine receptor 4 expressed in T cells plays an important role in the development of collagen-induced arthritis.
Arthritis Res Ther 12, R188; Comps-Agrar, L., Maurel, D., Rondard, P., Pin, J.P., Trinquet, E. e Prezeau, L. (2011). Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to G protein- coupled receptor oligomerization.
Methods Mol Biol 756, 201-214; Cooper, A.J., Narasimhan, S., Rickels, K. e Lohoff, F.W. (2013). Genetic polymorphisms in the PACAP and PAC1 receptor genes and treatment response to venlafaxine XR in generalized anxiety disorder.
Psychiatry Res 210, 1299-1300; Covic, L., Gresser, A.L., Talavera, J., Swift, S. e Kuliopulos, A. (2002). Activation and inhibition of G protein-coupled receptors by cell-penetrat- ing membrane-tethered peptides.
Proc Natl Acad Sci, E.U.A., 99, 643- 648; Crawford, J.B., Chen, G., Gauthier, D., Wilson, T., Carpenter, B., Baird,
LR., McEachern, E. e Alan Kaller, C.H., Bem Atsma, Renato T.
Skerlj e Gary J.
Bridger (2008). AMDO70, a CXCR4 Chemokine Receptor Antag- onist: Practical Large-Scale Laboratory Synthesis.
Organic Process Re- search & Development 12, 823-830; D'Alterio, C., Barbieri, A., Portella, L., Palma, G., Polimeno, M., Riccio, A., lerano, C., Franco, R., Scognamiglio, G., Bryce, J., et al. (2012). In- hibition of stromal CXCRA4 impairs development of lung metastases.
Cancer Immunol Immunother 61, 1713-1720; Dacquin, R., Davey, R.A., Laplace, C., Levasseur, R., Morris, H.A., Goldring, S.R., Gebre-Medhin, S., Galson, D.L., Zajac, J.D. e Karsenty, G. (2004). Amylin inhibits bone resorption while the calcitonin receptor controls bone formation in vivo.
J Cell Biol 164, 509-514; Davey, R.A., Turner, A.G., McManus, J.F., Chiu, W.S., Tjahyono, F., Moore, A.J., Atkins, G.J., Anderson, P.H., Ma, C., Glatt, V., et al. (2008). Calcitonin receptor plays a physiological role to protect against hyper- calcemia in mice.
J Bone Miner Res 23, 1182-1193; De Clerca, E. (2003). The bicyclam AMD3100 story.
Nat Rev Drug Dis- cov 2, 581-587; De Falco, V., Guarino, V., Avilla, E., Castellone, M.D., Salerno, P., Sal- vatore, G., Faviana, P., Basolo, F., Santoro, M. e Melillo, R.M. (2007). Biological role and potential therapeutic targeting of the chemokine re- ceptor CXCRA4 in undifferentiated thyroid cancer.
Cancer Res 67, 11821- 11829; de Graaf, C., Kooistra, A.J., Vischer, H.F., Katritch, V., Kuijer, M., Shiroi- shi, M., lwata, S., Shimamura, T., Stevens, R.C., de Esch, |.J., et al. (2011). Crystal structure-based virtual screening for fragment-like lig- ands of the human histamine H(1) receptor. ] Med Chem 54, 8195-8206; De Klerck, B., Geboes, L., Hatse, S., Kelchtermans, H., Meyvis, Y., Ver- meire, K., Bridger, G., Billiau, A., Schols, D. e Matthys, P. (2005). Pro-
inflammatory properties of stromal cell-derived factor-1 (CXCL12) in col- lagen-induced arthritis.
Arthritis Res Ther 7, R1208-1220; de Nigris, F., Schiano, C., Infante, T. e Napoli, C. (2012). CXCRA4 inhib- itors: tumor vasculature and therapeutic challenges.
Recent Pat Anti- cancer Drug Discov 7, 251-264; de Poorter, C., Baertsoen, K., Lannoy, V., Parmentier, M. e Springael, J.Y. (2013). Consequences of ChemR23 heteromerization with the chemokine receptors CXCR4 and CCR7. PLoS One 8, e58075; Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A. e Neamati, N. (2013). Small molecule inhibitors of CXCRA4. Theranostics 3, 47-75; Decaillot, F.M., Kazmi, M.A., Lin, Y., Ray-Saha, S., Sakmar, T.P. e Sachdev, P. (2011). CXCR7/CXCRA4 heterodimer constitutively recruits beta-arrestin to enhance cell migration.
J Biol Chem 286, 32188-32197; Decaillot, F.M., Rozenfeld, R., Gupta, A. e Devi, L.A. (2008). Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 16045-16050; Demmer, O., Gourni, E., Schumacher, U., Kessler, H. e Wester, H.J. (2011). PET imaging of CXCRA4 receptors in cancer by a new optimized ligand.
ChemMedChem 6, 1789-1791; Depoortere, |. (2001). Motilin and motilin receptors: characterization and functional significance.
Verh K Acad Geneeskd Belg 63, 511-529; Desmet, C.J., Gallenne, T., Prieur, A., Reyal, F., Visser, N.L., Wittner, B.S., Smit, M.A., Geiger, T.R., Laoukili, J., Iskit, S., et al. (2013). Identi- fication of a pharmacologically tractable Fra-1/ADORAZB axis promoting breast cancer metastasis.
Proc Natl Acad Sci U S A 110, 5139-5144; DiPersio, J.F., Micallef, I.N., Stiff, P.J., Bolwell, B.J., Maziarz, R.T., Ja- cobsen, E., Nademanee, A., McCarty, J., Bridger, G., Calandra, G., et al. (2009a). Phase Ill prospective randomized double-blind placebo-con- trolled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor com-
pared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autolo- gous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non- Hodgkin's lIyémphoma.
J Clin Oncol 27, 4767-4773; DiPersio, J.F., Stadtmauer, E.A., Nademanee, A., Micallef, I.N., Stiff, P.J., Kaufman, J.L., Maziarz, R.T., Hosing, C., Fruehauf, S., Horwitz, M., et al. (2009b). Plerixafor and G-CSF versus placebo and G-CSF to mo- bilize hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation in patients with multiple myeloma.
Blood 113, 5720-5726; Domanska, U.M., Kruizinga, R.C., Nagengast, W.B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E.G. e Walenkamp, A.M. (2013). A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: no place to hide.
Eur J Cancer 49, 219-230; Donzella, G.A., Schols, D., Lin, S.W,., Este, J.A., Nagashima, K.A., Mad- don, P.J., Allaway, G.P., Sakmar, T.P., Henson, G., De Clercg, E., et al. (1998). AMD3100, a small molecule inhibitor of HIV-1 entry via the CXCRA4 co-receptor.
Nat Med 4, 72-77; Doranz, B.J., Filion, L.G., Diaz-Mitoma, F., Sitar, D.S., Sahai, J., Bari- baud, F., Orsini, M.J., Benovic, J.L., Cameron, W. e Doms, R.W. (2001). Safe use of the CXCR4 inhibitor ALX40-4C in humans.
AIDS Res Hum Retroviruses 17, 475-486; Doring, Y., Pawig, L., Weber, C. e Noels, H. (2014). The CXCL12/CXCRA4 chemokine ligand/receptor axis in cardiovascular dis- ease.
Front Physiol 5, 212; Doucette, L.P. e Walter, M.A. (2017). Prostaglandins in the eye: Func- tion, expression, and roles in glaucoma.
Ophthalmic Genet 38, 108-116; Du, Y., Long, Q., Guan, B. e Mu, L. (2015). Prognostic Value of High CXCRA4 Expression in Renal Cell Carcinoma: A System Review and Meta-Analysis.
Dis Markers 2015, 568980; Eidne, K.A., Kroeger, K.M. e Hanyaloglu, A.C. (2002). Applications of novel resonance energy transfer techniques to study dynamic hormone receptor interactions in living cells.
Trends Endocrinol Metab 13, 415- 421; Endres, M.J., Clapham, P.R., Marsh, M., Ahuja, M., Turner, J.D., MckKnight, A., Thomas, J.F., Stoebenau-Haggarty, B., Choe, S., Vance, P.J., et al. (1996). CD4-independent infection by HIV-2 is mediated by fusin/CXCRA4. Cell 87, 745-756; Fagerberg, L., Hallstrom, B.M., Oksvold, P., Kampf, C., Djureinovic, D., Odeberg, J., Habuka, M., Tahmasebpoor, S., Danielsson, A., Edlund, K., et al. (2014). Analysis of the human tissue-specific expression by ge- nome-wide integration of transcriptomics and antibody-based prote- omics.
Mol Cell Proteomics 13, 397-406; Fahham, D., Weiss, 1.D., Abraham, M., Beider, K., Hanna, W., Shlomai, Z., Eizenberg, O., Zamir, G., Izhar, U., Shapira, O.M,., et al. (2012). In vitro and in vivo therapeutic efficacy of CXCR4 antagonist BKT140 against human non-small cell lung cancer.
J Thorac Cardiovasc Surg 144, 1167-1175 e1161; Farran, B. (2017). An update on the physiological and therapeutic rele- vance of GPCR oligomers.
Pharmacol Res 117, 303-327; Feig, C., Jones, J.O., Kraman, M., Wells, R.J., Deonarine, A., Chan, D.S., Connell, C.M., Roberts, E.W., Zhao, Q., Caballero, O.L., et al. (2013). Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic can- cer.
Proc Natl Acad Sci U S A 110, 20212-20217; Fernandez-Duenas, V., Taura, J.J., Cottet, M., Gomez-Soler, M., Lopez- Cano, M., Ledent, C., Watanabe, M., Trinquet, E., Pin, J.P., Lujan, R., et al. (2015). Untangling dopamine-adenosine receptor-receptor assembly in experimental parkinsonism in rats.
Dis Model Mech 8, 57-63; Ferre, S., Baler, R., Bouvier, M., Caron, M.G., Devi, L.A., Durroux, T., Fuxe, K., George, S.R., Javitch, J.A., Lohse, M.J., et al. (2009). Building a new conceptual framework for receptor heteromers.
Nat Chem Biol 5,
131-134; Ferre, S., Navarro, G., Casado, V., Cortes, A., Mallol, J., Canela, E.l., Lluis, C. e Franco, R. (2010). G protein-coupled receptor heteromers as new targets for drug development.
Prog Mol Biol Transl Sci 91, 41-52; Filmore, D. (2004). It's a GPCR world.
Modern Drug Discovery American Chemical Society 2004 (novembro), 24-28; Fitzpatrick, D., Purves, D., Augustine, G. (2004). “Table 20:2" (Mass: Sunderland); Fotiadis, D., Jastrzebska, B., Philippsen, A., Muller, D.J., Palczewski, K. e Engel, A. (2006). Structure of the rhodopsin dimer: a working model for G-protein-coupled receptors.
Curr Opin Struct Biol 16, 252-259; Frederick, A.L., Yano, H., Trifilieff, P., Vishwasrao, H.D., Biezonski, D., Meszaros, J., Urizar, E., Sibley, D.R., Kellendonk, C., Sonntag, K.C., et al. (2015). Evidence against dopamine D1/D2 receptor heteromers.
Mol Psychiatry 20, 1373-1385; Furusato, B., Mohamed, A., Uhlen, M. e Rhim, J.S. (2010). CXCR4 and cancer.
Pathol Int 60, 497-505; Gao, Z.G., Ye, K., Goblyos, A., lizerman, A.P. e Jacobson, K.A. (2008). Flexible modulation of agonist efficacy at the human A3 adenosine re- ceptor by the imidazoquinoline allosteric enhancer LUF6000. BMC Phar- macol 8, 20; George, S.R., Fan, T., Xie, Z., Tse, R., Tam, V., Varghese, G. e O'Dowd, B.F. (2000). Oligomerization of mu- and delta-opioid receptors.
Genera- tion of novel functional properties.
J Biol Chem 275, 26128-26135; Gerard, C. e Gerard, N.P. (1994). CSA anaphylatoxin and its seven transmembrane-segment receptor.
Annu Rev Immunol 12, 775-808; Gianetti, E. e Seminara, S. (2008). Kisspeptin and KISS1R: a critical pathway in the reproductive system.
Reproduction 136, 295-301; Gomes, |., Ayoub, M.A., Fujita, W., Jaeger, W.C., Pfleger, K.D. e Devi,
L.A. (2016). G Protein-Coupled Receptor Heteromers.
Annu Rev Phar- macol Toxicol 56, 403-425; Gomes, |., Gupta, A., Filipovska, J., Szeto, H.H., Pintar, J.E. e Devi, L.A. (2004). A role for heterodimerization of mu and delta opiate receptors in enhancing morphine analgesia.
Proc Natl Acad Sci U S A 101, 5135- 5139; Goodman, R.L., Lehman, M.N., Smith, J.T., Coolen, L.M., de Oliveira, C.V., Jafarzadehshirazi, M.R., Pereira, A., Igbal, J., Caraty, A., Ciofi, P., et al. (2007). Kisspeptin neurons in the arcuate nucleus of the ewe ex- press both dynorphin A and neurokinin B.
Endocrinology 148, 5752- 5760; Gourni, E., Demmer, O., Schottelius, M., D'Alessandria, C., Schulz, S.., Dijkgraaf, |., Schumacher, U., Schwaiger, M., Kessler, H. e Wester, H.J. (2011). PET of CXCRA4 expression by a (68)Ga-labeled highly specific targeted contrast agent.
J Nucl Med 52, 1803-1810; Gregorio, G.G., Masureel, M., Hilger, D., Terry, D.S., Juette, M., Zhao, H., Zhou, Z., Perez-Aguilar, J.M., Hauge, M., Mathiasen, S., et al. (2017). Single-molecule analysis of ligand efficacy in beta2AR-G-protein activa- tion.
Nature 547, 68-73; Griffith, J.W., Sokol, C.L. e Luster, A.D. (2014). Chemokines and chem- okine receptors: positioning cells for host defense and immunity.
Annu Rev Immunol 32, 659-702; Griffiths, K., Dolezal, O., Cao, B., Nilsson, S.K., See, H.B., Pfleger, K.D., Roche, M., Gorry, P.R., Pow, A., Viduka, K,., et al. (2016). i-bodies, Hu- man Single Domain Antibodies That Antagonize Chemokine Receptor CXCRA.
J Biol Chem 291, 12641-12657; Griffiths, K., Habiel, D.M., Jaffar, J., Binder, U., Darby, W.G., Hosking, C.G., Skerra, A., Westall, G.P., Hogaboam, C.M. e Foley, M. (2018). Anti-fibrotic Effects of CXCR4-Targeting i-body AD-114 in Preclinical Models of Pulmonary Fibrosis.
Sci Rep 8, 3212;
Guidotti, G., Brambilla, L. e Rossi, D. (2017). Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics.
Trends Pharmacol Sci 38, 406-424; Gullberg, M., Gustafsdottir, S.M., Schallmeiner, E., Jarvius, J., Bjarne- gard, M., Betsholtz, C., Landegren, U. e Fredriksson, S. (2004). Cytokine detection by antibody-based proximity ligation.
Proc Natl Acad Sci US A 101, 8420-8424; Guo, F., Wang, Y., Liu, J., Mok, S.C., Xue, F. e Zhang, W. (2016). CXCL12/CXCR4: a symbiotic bridge linking cancer cells and their stro- mal neighbors in oncogenic communication networks.
Oncogene 35, 816-826; Gustafsdottir, S.M., Schallmeiner, E., Fredriksson, S., Gullberg, M., Soderberg, O., Jarvius, M., Jarvius, J., Howell, M. e Landegren, U. (2005). Proximity ligation assays for sensitive and specific protein anal- yses.
Anal Biochem 345, 2-9; Habert-Ortoli, E., Amiranoff, B., Loquet, |., Laburthe, M. e Mayaux, J.F. (1994). Molecular cloning of a functional human galanin receptor.
Proc Natl Acad Sci U S A 91, 9780-9783; Hansen, J.L., Hansen, J.T., Speerschneider, T., Lyngso, C., Erikstrup, N., Burstein, E.S., Weiner, D.M., Walther, T., Makita, N,, liri, T. et al. (2009). Lack of evidence for ATIR/B2R heterodimerization in COS-7, HEK293, and NIH3T3 cells: how common is the ATIR/B2R heterodi- mer? J Biol Chem 284, 1831-1839; Hartimath, S.V., Domanska, U.M., Walenkamp, A.M., Rudi, A.J.O.D. e de Vries, E.F. (2013). [(9)(9)MTc]JO(2)-AMD3100 as a SPECT tracer for CXCRA4 receptor imaging.
Nucl Med Biol 40, 507-517; Hassan, S., Buchanan, M., Jahan, K., Aguilar-Mahecha, A., Gaboury, L., Muller, W.J., Alsawafi, Y., Mourskaia, A.A,, Siegel, P.M., Salvucci, O., et al. (2011). CXCRA4 peptide antagonist inhibits primary breast tumor growth, metastasis and enhances the efficacy of anti- VEGF treatment or docetaxel in a transgenic mouse model.
Int J Cancer 129, 225-232;
Hatse, S., Princen, K., Bridger, G., De Clercg, E. e Schols, D. (2002). Chemokine receptor inhibition by AMD3100 is strictly confined to CXCRA4. FEBS Lett 527, 255-262; He, S.Q., Zhang, Z.N., Guan, J.S., Liu, H.R., Zhao, B., Wang, H.B., Li, Q., Yang, H., Luo, J., Li, Z.Y., et al. (2011). Facilitation of mu-opioid re- ceptor activity by preventing delta-opioid receptor-mediated codegrada- tion.
Neuron 69, 120-131; Heakal, Y., Woll, M.P., Fox, T., Seaton, K., Levenson, R. e Kester, M. (2011). Neurotensin receptor-1 inducible palmitoylation is required for efficient receptor-mediated mitogenic-signaling within structured mem- brane microdomains.
Cancer Biol Ther 12, 427-435; Hendrix, C.W., Collier, A.C., Lederman, M.M., Schols, D., Pollard, R.B., Brown, S., Jackson, J.B., Coombs, R.W., Glesby, M.J., Flexner, C.W,, et al. (2004). Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCRA4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection.
J Ac- quir Immune Defic Syndr 37, 1253-1262; Hendrix, C.W., Flexner, C., MacFarland, R.T., Giandomenico, C., Fuchs, E.J., Redpath, E., Bridger, G. e Henson, G.W. (2000). Pharmacokinetics and safety of AMD-3100, a novel antagonist of the CXCR-4 chemokine receptor, in human volunteers.
Antimicrob Agents Chemother 44, 1667- 1673; Henson, B.S., Neubig, R.R., Jang, |., Ogawa, T., Zhang, Z., Carey, T.E. e D'Silva, N.J. (2005). Galanin receptor 1 has anti-proliferative effects in oral squamous cell carcinoma.
J Biol Chem 280, 22564-22571; Hernandez, P.A., Gorlin, R.J., Lukens, J.N., Taniuchi, S., Bohinjec, J., Francois, F., Klotman, M.E. e Diaz, G.A. (2003). Mutations in the chem- okine receptor gene CXCRA4 are associated with WHIM syndrome, a combined immunodeficiency disease.
Nat Genet 34, 70-74; Herrmann, K,., Schottelius, M., Lapa, C., Osl, T., Poschenrieder, A., Han- scheid, H., Luckerath, K., Schreder, M., Bluemel, C., Knott, M., et al.
(2016). First-in-Human Experience of CXCR4-Directed Endoradiother- apy with 177LuU- and 90Y-Labeled Pentixather in Advanced-Stage Multi- ple Myeloma with Extensive Intra- and Extramedullary Disease.
J Nucl Med 57, 248-251; Hillion, J., Canals, M., Torvinen, M., Casado, V., Scott, R., Terasmaa, A., Hansson, A., Watson, S., Olah, M.E., Mallol, J., et al. (2002). Coag- gregation, cointernalization, and codesensitization of adenosine A2A re- ceptors and dopamine D2 receptors.
J Biol Chem 277, 18091-18097; Hsu, W.T., Jui, H.Y., Huang, Y.H., Su, M.Y., Wu, Y.W., Tseng, W.Y., Hsu, M.C., Chiang, B.L., Wu, K.K. e Lee, C.M. (2015). CXCR4 Antago- nist TG-0054 Mobilizes Mesenchymal Stem Cells, Attenuates Inflamma- tion, and Preserves Cardiac Systolic Function in a Porcine Model of My- ocardial Infarction.
Cell Transplant 24, 1313-1328; Hu, C.D., Chinenov, Y. e Kerppola, T.K. (2002). Visualization of interac- tions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.
Mol Cell 9, 789-798; Hu, F., Miao, L., Zhao, Y., Xiao, Y.Y. e Xu, Q. (2015). A meta-analysis for C-X-C chemokine receptor type 4 as a prognostic marker and poten- tial drug target in hepatocellular carcinoma.
Drug Des Devel Ther 9, 3625-3633; Huang, E.H., Singh, B., Cristofanilli, M., Gelovani, J., Wei, C., Vincent, L., Cook, K.R. e Lucci, A. (2009). A CXCRA4 antagonist CTCE-9908 in- hibits primary tumor growth and metastasis of breast cancer.
J Surg Res 155, 231-236; Hutter, G., Nowak, D., Mossner, M., Ganepola, S., Mussig, A,, Allers, K., Schneider, T., Hofmann, J., Kucherer, C., Blau, O., et al. (2009). Long- term control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell transplantation.
N Engl J Med 360, 692-698; Ichiyama, K., Yokoyama-Kumakura, S., Tanaka, Y., Tanaka, R., Hirose, K., Bannai, K., Edamatsu, T., Yanaka, M,., Niitani, Y., Miyano-Kurosaki,
N,, et al. (2003). A duodenally absorbable CXC chemokine receptor 4 antagonist, KRH-1636, exhibits a potent and selective anti-HIV-1 activ- ity.
Proc Natl Acad Sci U S A 100, 4185-4190; Inokuchi, E., Oishi, S., Kubo, T., Ohno, H., Shimura, K., Matsuoka, M. e Fujii, N. (2011). Potent CXCRA4 antagonists containing amidine type Pep- tide bond isosteres.
ACS Med Chem Lett 2, 477-480; Jafari, S.M., Panjehpour, M., Aghaei, M., Joshaghani, H.R. e Enderami, S.E. (2017). A3 Adenosine Receptor Agonist Inhibited Survival of Breast Cancer Stem Cells via GLI-1 and ERK1/2 Pathway.
J Cell Biochem 118, 2909-2920; Jahnichen, S., Blanchetot, C., Maussang, D., Gonzalez-Pajuelo, M., Chow, K.Y., Bosch, L., De Vrieze, S., Serruys, B., Ulrichts, H., Vandevelde, W., et al. (2010). CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.
Proc Natl Acad Sci U S A 107, 20565-20570; Jenkinson, S., Thomson, M., McCoy, D., Edelstein, M., Danehower, S., Lawrence, W., Wheelan, P., Spaltenstein, A. e Gudmundsson, K. (2010). Blockade of X4-tropic HIV-1 cellular entry by GSK812397, a potent non- competitive CXCR4 receptor antagonist.
Antimicrob Agents Chemother 54, 817-824; Jiang, X.R., Song, A., Bergelson, S., Arroll, T., Parekh, B., May, K., Chung, S., Strouse, R., Mire-Sluis, A. e Schenerman, M. (2011). Ad- vances in the assessment and control of the effector functions of thera- peutic antibodies.
Nat Rev Drug Discov 10, 101-111; Johnson, G. (2002). PDQ Pharmacology (2º ed.) (Hamilton, Ontario: BC Decker Inc.); Kalatskaya, |., Berchiche, Y.A., Gravel, S., Limberg, B.J., Rosenbaum, J.S. e Heveker, N. (2009). AMD3100 is a CXCR7 ligand with allosteric agonist properties.
Mol Pharmacol 75, 1240-1247; Kasama, H., Sakamoto, Y., Kasamatsu, A., Okamoto, A., Koyama, T.,
Minakawa, Y., Ogawara, K., Yokoe, H., Shiiba, M., Tanzawa, H,, et al. (2015). Adenosine A2b receptor promotes progression of human oral cancer.
BMC Cancer 15, 563; Kawai, T. e Malech, H.L. (2009). WHIM syndrome: congenital immune deficiency disease.
Curr Opin Hematol 16, 20-26; Keating, G.M. (2011). Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobili- zation in patients with lIymphoma or multiple myeloma.
Drugs 71, 1623- 1647; Kerppola, T.K. (2006). Design and implementation of bimolecular fluo- rescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.
Nat Protoc 1, 1278-1286; Kim, H.Y., Hwang, J.Y., Kim, S.W., Lee, H.J., Yun, H.J., Kim, S. e Jo, D.Y. (2010). The CXCR4 Antagonist AMD3100 Has Dual Effects on Sur- vival and Proliferation of Myeloma Cells In vitro.
Cancer Res Treat 42, 225-234; Kim, S.Y., Lee, C.H., Midura, B.V., Yeung, C., Mendoza, A., Hong, S.H., Ren, L., Wong, D., Korz, W., Merzouk, A,, et al. (2008). Inhibition of the CXCR4/CXCL12 chemokine pathway reduces the development of mu- rine pulmonary metastases.
Clin Exp Metastasis 25, 201-211; Kitazawa, T., Taneike, T. e Ohga, A. (1995). Excitatory action of [Leu13]motilin on the gastrointestinal smooth muscle isolated from the chicken.
Peptides 16, 1243-1252; Kitazawa, T., Taneike, T. e Ohga, A. (1997). Functional characterization of neural and smooth muscle motilin receptors in the chicken proventric- ulus and ileum.
Regul Pept 71, 87-95; Klein, R.S. e Rubin, J.B. (2004). Immune and nervous system CXCL12 and CXCRA: parallel roles in patterning and plasticity.
Trends Immunol 25, 306-314; Klos, A., Wende, E., Wareham, K.J. e Monk, P.N. (2013). International
Union of Basic and Clinical Pharmacology. [corrigido]. LXXXVII.
Com- plement peptide C5a, C4a, and C3a receptors.
Pharmacol Rev 65, 500- 543; Knutsson, M. e Edvinsson, L. (2002). Distribution of MRNA for VIP and PACAP receptors in human cerebral arteries and cranial ganglia.
Neu- roreport 13, 507-509; Kristensen, M., Birch, D. e Morck Nielsen, H. (2016). Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos.
Int J Mol Sci 17; Kroeze, W.K., Sassano, M.F., Huang, X.P., Lansu, K., McCorvy, J.D., Giguere, P.M., Sciaky, N. e Roth, B.L. (2015). PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.
Nat Struct Mol Biol 22, 362-369; Kuhne, M.R., Mulvey, T., Belanger, B., Chen, S., Pan, C., Chong, C., Cao, F., Niekro, W., Kempe, T., Henning, K.A,, et al. (2013). BMS- 936564/MDX-1338: a fully human anti-CXCR4 antibody induces apop- tosis in vitro and shows antitumor activity in vivo in hematologic malig- nancies.
Clin Cancer Res 19, 357-366; Lambert, et al., “Antibody-Drug Conjugates for Cancer Treatment”, An- nual Review of Medicine, 69:191-207 (2018); LaRocca, T.J., Schwarzkopf, M., Altman, P., Zhang, S., Gupta, A., Gomes, |., Alvin, Z., Champion, H.C., Haddad, G., Hajjar, R.J., et al. (2010). beta2-Adrenergic receptor signaling in the cardiac myocyte is modulated by interactions with CXCRA4. J Cardiovasc Pharmacol 56, 548-559; Law, P.Y., Erickson-Herbrandson, L.J., Zha, Q.Q., Solberg, J., Chu, J., Sarre, A. e Loh, H.H. (2005). Heterodimerization of mu- and delta-opioid receptors occurs at the cell surface only and requires receptor-G protein interactions.
J Biol Chem 280, 11152-11164; Lee, C.H., Kakinuma, T., Wang, J., Zhang, H., Palmer, D.C., Restifo,
N.P. e Hwang, S.T. (2006). Sensitization of B16 tumor cells with a CXCRA4 antagonist increases the efficacy of immunotherapy for estab- lished lung metastases.
Mol Cancer Ther 5, 2592-2599; Lee, H., Whitfeld, P.L. e Mackay, C.R. (2008). Receptors for complement C5a.
The importance of C5aR and the enigmatic role of C5L2. Immunol Cell Biol 86, 153-160; Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F. e Lagane, B. (2009). CXCR7 heterodimerizes with CXCRA4 and regulates CXCL12- mediated G protein signaling.
Blood 113, 6085-6093; Li, M., Thompson, D.D. e Paralkar, V.M. (2007). Prostaglandin E(2) re- ceptors in bone formation.
Int Orthop 31, 767-772; Li, Y.P., Pang, J., Gao, S., Bai, P.Y., Wang, W.D., Kong, P. e Cui, Y. (2017). Role of CXCR4 and SDF1 as prognostic factors for survival and the association with clinicopathology in colorectal cancer: A systematic meta-analysis.
Tumour Biol 39, 1010428317706206; Liang, J.X., Gao, W,, Liang, Y. e Zhou, X.M. (2015). Chemokine receptor CXCRA4 expression and lung cancer prognosis: a meta-analysis.
Int J Clin Exp Med 8, 5163-5174; Liang, Z., Zhan, W., Zhu, A., Yoon, Y., Lin, S., Sasaki, M., Klapproth, J.M., Yang, H., Grossniklaus, H.E., Xu, J., et al. (2012). Development of a unique small molecule modulator of CXCRA4. PLoS One 7, e34038; Liao, Y.X., Fu, Z.Z., Zhou, C.H., Shan, L.C., Wang, Z.Y, Yin, F., Zheng, L.P., Hua, Y.Q. e Cai, Z.D. (2015). AMD3100 reduces CXCR4-mediated survival and metastasis of osteosarcoma by inhibiting JNK and Akt, but not p38 or Erk1/2, pathways in in vitro and mouse experiments.
Oncol Rep 34, 33-42; Liles, W.C., Broxmeyer, H.E., Rodger, E., Wood, B., Hubel, K., Cooper, S., Hangoc, G., Bridger, G.J., Henson, G.W., Calandra, G., et al. (2003). Mobilization of hematopoietic progenitor cells in healthy volunteers by AMD3100, a CXCRA4 antagonist.
Blood 102, 2728-2730;
Ling, X., Spaeth, E., Chen, Y.., Shi, Y., Zhang, W., Schober, W,, Hail, N., Jr., Konopleva, M. e Andreeff, M. (2013). The CXCRA4 antagonist AMD3465 regulates oncogenic signaling and invasiveness in vitro and prevents breast cancer growth and metastasis in vivo.
PLoS One 8, e58426; Liu, S.H., Gu, Y., Pascual, B., Yan, Z., Hallin, M., Zhang, C., Fan, C,, Wang, W., Lam, J., Spilker, M.E., et al. (2017). A novel CXCR4 antago- nist I9G1 antibody (PF-06747 143) for the treatment of hematologic ma- lignancies.
Blood Adv 1, 1088-1100; Liu, X.Y., Liu, Z.C., Sun, Y.G., Ross, M., Kim, S., Tsai, F.F., Li, Q.F., Jeffíry, J., Kim, J.Y., Loh, H.H., et al. (2011). Unidirectional cross-activa- tion of GRPR by MOR1D uncouples itch and analgesia induced by opi- oids.
Cell 147, 447-458; Lohse, M.J., Nuber, S. e Hoffmann, C. (2012). Fluorescence/biolumines- cence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling.
Pharmacol Rev 64, 299-336; Lowe, S.R., Pothen, J., Quinn, J.W., Rundle, A., Bradley, B., Galea, S., Ressler, K.J. e Koenen, K.C. (2015). Gene-by-social-environment inter- action (GxSE) between ADCYAP1R1 genotype and neighborhood crime predicts major depression symptoms in trauma-exposed women.
J Af- fect Disord 187, 147-150; Machado-Carvalho, L., Roca-Ferrer, J. e Picado, C. (2014). Prostaglan- din E2 receptors in asthma and in chronic rhinosinusitis/nasal polyps with and without aspirin hypersensitivity.
Respir Res 15, 100; Markovic, T., Jakopin, Z., Dolenc, M.S. e Mlinaric-Rascan, |. (2017). Structural features of subtype-selective EP receptor modulators.
Drug Discov Today 22, 57-71; Marlo, J.E., Niswender, C.M., Days, E.L., Bridges, T.M., Xiang, Y., Ro- driguez, A.L., Shirey, J.K., Brady, A.E., Nalywajko, T., Luo, Q., et al. (2009). Discovery and characterization of novel allosteric potentiators of
M1 muscarinic receptors reveals multiple modes of activity.
Mol Phar- macol 75, 577-588; Martinez-Munoz, L., Barroso, R., Dyrhaug, S.Y., Navarro, G., Lucas, P., Soriano, S.F., Vega, B., Costas, C., Munoz-Fernandez, M.A., Santiago, C., et al. (2014). CCR5/CD4/CXCRA4 oligomerization prevents HIV-1 gp120!!IB binding to the cell surface.
Proc Natl Acad Sci U S A 111, E1960-1969; uda, M., Nakashima, H., Ueda, T., Naba, H., Ikoma, R., Otaka, A., Tera- kawa, Y., Tamamura, H., Ibuka, T., Murakami, T., et al. (1992). A novel anti-HIV synthetic peptide, T-22 ([Tyr5,12,Lys7]-polyphemusin 11). Bio- chem Biophys Res Commun 189, 845-850; Medhurst, A.D., Jennings, C.A., Robbins, M.J., Davis, R.P., Ellis, C., Winborn, K.Y., Lawrie, K.W., Hervieu, G., Riley, G., Bolaky, J.E., et al. (2003). Pharmacological and immunohistochemical characterization of the APJ receptor and its endogenous ligand apelin.
J Neurochem 84, 1162-1172; Miller, G.M., Alexander, J.M., Bikkal, H.A., Katznelson, L., Zervas, N.T. e Klibanski, A. (1995). Somatostatin receptor subtype gene expression in pituitary adenomas.
J Clin Endocrinol Metab 80, 1386-1392; Milligan, G. (2008). A day in the life of a G protein-coupled receptor: the contribution to function of G protein-coupled receptor dimerization.
Br J Pharmacol 153 Suppl 1, S216-229; Miwatashi, S., Arikawa, Y., Matsumoto, T., Uga, K., Kanzaki, N., Imai, Y.N. e Ohkawa, S. (2008). Synthesis and biological activities of 4-phe- nyl-5-pyridyl-1,3-thiazole derivatives as selective adenosine A3 antago- nists.
Chem Pharm Bull (Tokyo) 56, 1126-1137; Moreno, J.J. (2017). Eicosanoid receptors: Targets for the treatment of disrupted intestinal epithelial homeostasis.
Eur J Pharmacol 796, 7-19; imoto, M., Matsuo, Y., Koide, S., Tsuboi, K., Shamoto, T.., Sato, T., Saito, K., Takahashi, H. e Takeyama, H. (2016). Enhancement of the
CXCL12/CXCRA4 axis due to acquisition of gemcitabine resistance in pancreatic cancer: effect of CXCRA4 antagonists.
BMC Cancer 16, 305; Muller, A., Homey, B., Soto, H., Ge, N., Catron, D., Buchanan, M.E., McClanahan, T., Murphy, E., Yuan, W., Wagner, S.N,, et al. (2001). In- volvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis.
Nature 410, 50-56; Murakami, T., Kumakura, S., Yamazaki, T., Tanaka, R., Hamatake, M., Okuma, K., Huang, W., Toma, J., Komano, J., Yanaka, M,, et al. (2009). The novel CXCRA4 antagonist KRH-3955 is an orally bioavailable and extremely potent inhibitor of human immunodeficiency virus type 1 infec- tion: comparative studies with AMD3100. Antimicrob Agents Chemother 53, 2940-2948; Mustafa, S., Ayoub, M.A., Pfleger, K.D.G. (2010). Uncovering GPCR heteromer-biased ligands.
Drug Discov Today Techno! 7, e1-e94; Mustafa, S. e Pfleger, K.D. (2011). G protein-coupled receptor heter- omer identification technology: identification and profiling of GPCR het- eromers.
J Lab Autom 16, 285-291; Mustafa, S., See, H.B., Seeber, R.M., Armstrong, S.P., White, C.W., Ventura, S., Ayoub, M.A. e Pfleger, K.D. (2012). Identification and profil- ing of novel alpha1A-adrenoceptor-CXC chemokine receptor 2 heter- omer.
J Biol Chem 287, 12952-12965; Nakai, A., Hayano, Y., Furuta, F., Noda, M. e Suzuki, K. (2014). Control of Iymphocyte egress from Iymph nodes through beta2-adrenergic re- ceptors.
J Exp Med 211, 2583-2598; Nakasone, T., Kumakura, S., Yamamoto, M., Murakami, T. e Yamamoto, N. (2013). Single oral administration of the novel CXCRA4 antagonist, KRH-3955, induces an efficient and long-lasting increase of white blood cell count in normal macaques, and prevents CD4 depletion in SHIV- infected macaques: a preliminary study.
Med Microbiol Immunol 202, 175-182;
Norel, X., Jones, R.L., Giembycz, M., Narumiya, S., Woodward, D.F., Coleman, R.A., Abramovitz, M., Breyer, R.M., Hills, R. (2016). Pros- tanoid receptors: EP3 receptor.
IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology; O'Boyle, G., Swidenbank, |., Marshall, H., Barker, C.E., Armstrong, J., White, S.A., Fricker, S.P., Plummer, R., Wright, M. e Lovat, P.E. (2013). Inhibition of CXCR4-CXCL12 chemotaxis in melanoma by AMD11070. Br J Cancer 108, 1634-1640; O'Callaghan, K., Kuliopulos, A. e Covic, L. (2012). Turning receptors on and off with intracellular pepducins: new insights into G-protein-coupled receptor drug development.
J Biol Chem 287, 12787-12796; O'Callaghan, G. e Houston, A. (2015). Prostaglandin E2 and the EP re- ceptors in malignancy: possible therapeutic targets? Br J Pharmacol 172, 5239-5250; Ogi, K., Miyamoto, Y., Masuda, Y., Habata, Y., Hosoya, M., Ohtaki, T., Masuo, Y., Onda, H. e Fujino, M. (1993). Molecular cloning and func- tional expression of a cDNA encoding a human pituitary adenylate cyclase activating polypeptide receptor.
Biochem Biophys Res Commun 196, 1511-1521; Okada, T., Ernst, O.P., Palczewski, K. e Hofmann, K.P. (2001). Activa- tion of rhnodopsin: new insights from structural and biochemical studies.
Trends Biochem Sci 26, 318-324; Otani, Y., Kijima, T., Kohmo, S., Oishi, S., Minami, T., Nagatomo, |., Takahashi, R., Hirata, H., Suzuki, M., Inoue, K,., et al. (2012). Suppres- sion of metastases of small cell lung cancer cells in mice by a peptidic CXCR4 inhibitor TF14016. FEBS Lett 586, 3639-3644; Overington, J.P., Al-Lazikani, B. e Hopkins, A.L. (2006). How many drug targets are there? Nat Rev Drug Discov 5, 993-996; Owen, J.L. e Mohamadzadeh, M. (2013). Macrophages and chemokines as mediators of angiogenesis.
Front Physiol 4, 159; Page, N.M., Bell, N.J., Gardiner, S.M., Manyonda, 1.T., Brayley, K.J.,
Strange, P.G. e Lowry, P.J. (2003). Characterization of the endokinins: human tachykinins with cardiovascular activity.
Proc Natl Acad Sci US A 100, 6245-6250; Pal, J., Patil, V., Kumar, A., Kaur, K., Sarkar, C. e Somasundaram, K. (2018). Loss-of-Function Mutations in Calcitonin Receptor (CALCR) Identify Highly Aggressive Glioblastoma with Poor Outcome.
Clin Cancer Res 24, 1448-1458; Parameswaran, R., Yu, M., Lim, M., Groffen, J. e Heisterkamp, N. (2011). Combination of drug therapy in acute Iymphoblastic leukemia with a CXCR4 antagonist.
Leukemia 25, 1314-1323; Park, P.S. e Palczewski, K. (2005). Diversifying the repertoire of G pro- tein-coupled receptors through oligomerization.
Proc Natl Acad Sci US A 102, 8793-8794; Patel, K., Dixit, V.D., Lee, J.H., Kim, J.W., Schaffer, E.M., Nguyen, D. e Taub, D.D. (2012). Identification of ghrelin receptor blocker, D-[Lys3] GHRP-6 as a CXCR4 receptor antagonist.
Int J Biol Sci 8, 108-117; Patel, R.C., Kumar, U., Lamb, D.C., Eid, J.S., Rocheville, M., Grant, M., Rani, A., Hazlett, T., Patel, S.C., Gratton, E., et al. (2002). Ligand binding to somatostatin receptors induces receptor-specific oligomer formation in live cells.
Proc Natl Acad Sci US A 99, 3294-3299; Peled, A., Wald, O. e Burger, J. (2012). Development of novel CXCR4- based therapeutics.
Expert Opin Investig Drugs 21, 341-353; Pello, O.M., Martinez-Munoz, L., Parrillas, V., Serrano, A., Rodriguez- Frade, J.M., Toro, M.J., Lucas, P., Monterrubio, M., Martinez, A.C. e Mellado, M. (2008). Ligand stabilization of CXCR4/delta-opioid receptor heterodimers reveals a mechanism for immune response regulation.
Eur J Immuno!l 38, 537-549; Peng, S.B., Zhang, X., Paul, D., Kays, L.M., Gough, W,, Stewart, J., Uh- lik, M.T., Chen, Q., Hui, Y.H., Zamek-Gliszczynski, M.J., et al. (2015). Identification of LY2510924, a novel cyclic peptide CXCRA4 antagonist that exhibits antitumor activities in solid tumor and breast cancer meta- static models.
Mol Cancer Ther 14, 480-490; Pfeiffer, M., Koch, T., Schroder, H., Laugsch, M., Hollt, V. e Schulz, S. (2002). Heterodimerization of somatostatin and opioid receptors cross- modulates phosphorylation, internalization, and desensitization.
J Biol Chem 277, 19762-19772; Pfleger, K.D. e Eidne, K.A. (2006). Illuminating insights into protein-pro- tein interactions using bioluminescence resonance energy transfer (BRET). Nat Methods 3, 165-174; Pin, J.P., Neubig, R., Bouvier, M., Devi, L., Filizola, M., Javitch, J.A., Lohse, M.J., Milligan, G., Palczewski, K., Parmentier, M., et al. (2007). International Union of Basic and Clinical Pharmacology.
LXVII.
Recom- mendations for the recognition and nomencliature of G protein-coupled receptor heteromultimers.
Pharmacol Rev 59, 5-13; Planesas, J.M., Perez-Nueno, V.1., Borrell, J.l. e Teixido, J. (2015). Stud- ying the binding interactions of allosteric agonists and antagonists of the CXCR4 receptor.
J Mol Graph Model 60, 1-14; Pondel, M. (2000). Calcitonin and calcitonin receptors: bone and be- yond.
Int J Exp Pathol 81, 405-422; Qin, K., Dong, C., Wu, G. e Lambert, N.A. (2011). Inactive-state preas- sembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers.
Nat Chem Biol 7, T40-747; Rang, H.P., Dale, M.M,, Ritter, J.M., Moore, P.K. (2003). “Ch. 10”, Phar- macology (5º ed.). (Elsevier Churchill Livingstone); Redondo-Munoz, J., Escobar-Diaz, E., Samaniego, R., Terol, M.J., Gar- cia-Marco, J.A. e Garcia-Pardo, A. (2006). MMP-9 in B-cell chronic lym- phocytic leukemia is up-regulated by alpha4beta1 integrin or CXCRA4 en- gagement via distinct signaling pathways, localizes to podosomes, and is involved in cell invasion and migration.
Blood 108, 3143-3151; Reubi, J.C. (2000). In vitro evaluation of VIP/PACAP receptors in healthy and diseased human tissues.
Clinical implications.
Ann N Y Acad Sci 921, 1-25; Reubi, J.C., Laderach, U., Waser, B., Gebbers, J.O., Robberecht, P. e Laissue, J.A. (2000). Vasoactive intestinal peptide/pituitary adenylate cyclase-activating peptide receptor subtypes in human tumors and their tissues of origin.
Cancer Res 60, 3105-3112; Reya, T., Morrison, S.J., Clarke, M.F. e Weissman, I.L. (2001). Stem cells, cancer, and cancer stem cells.
Nature 414, 105-111; Rios, C., Gomes, |. e Devi, L.A. (2006). mu opioid and CB1 cannabinoid receptor interactions: reciprocal inhibition of receptor signaling and neu- ritogenesis.
Br J Pharmacol 148, 387-395; Roccaro, A.M., Sacco, A., Purschke, W.G., Moschetta, M., Buchner, K., Maasch, C., Zboralski, D., Zollner, S., Vonhoff, S., Mishima, Y., et al. (2014). SDF-1 inhibition targets the bone marrow niche for cancer ther- apy.
Cell Rep 9, 118-128; Rodriguez-Frade, J.M., del Real, G., Serrano, A., Hernanz-Falcon, P., Soriano, S.F., Vila-Coro, A.J., de Ana, A.M., Lucas, P., Prieto, |., Mar- tinez, A.C., et al. (2004). Blocking HIV-1 infection via CCOR5 and CXCR4 receptors by acting in trans on the CCR2 chemokine receptor.
EMBO J 23, 66-76; Roess, D.A., Horvat, R.D., Munnelly, H. e Barisas, B.G. (2000). Lutein- izing hormone receptors are self-associated in the plasma membrane.
Endocrinology 141, 4518-4523; Rozenfeld, R., Bushlin, |., Gomes, |., Tzavaras, N., Gupta, A., Neves, S., Battini, L., Gusella, G.L., Lachmann, A., Ma'ayan, A,., et al. (2012). Re- ceptor heteromerization expands the repertoire of cannabinoid signaling in rodent neurons.
PLoS One 7, e29239; Rozenfeld, R. e Devi, L.A. (2010). Receptor heteromerization and drug discovery.
Trends Pharmacol Sci 31, 124-130; Rubin, J.B., Kung, A.L., Klein, R.S., Chan, J.A., Sun, Y., Schmidt, K,,
Kieran, M.W,, Luster, A.D. e Segal, R.A. (2003). A small-molecule an- tagonist of CXCRA4 inhibits intracranial growth of primary brain tumors.
Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13513-13518; Saka, Y., Hagemann, A.l., Piepenburg, O. e Smith, J.C. (2007). Nuclear accumulation of Smad complexes occurs only after the midblastula tran- sition in Xenopus.
Development 134, 4209-4218; Sanjana, N.E., Shalem, O. e Zhang, F. (2014). Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.
Nat Methods 11, 783-784; Sato-Jin, K., Nishimura, E.K., Akasaka, E., Huber, W., Nakano, H., Mil- ler, A., Du, J., Wu, M., Hanada, K., Sawamura, D., et al. (2008). Epistatic connections between microphthalmia-associated transcription factor and endothelin signaling in Waardenburg syndrome and other pigmen- tary disorders.
FASEB J 22, 1155-1168; Scala, S. (2015). Molecular Pathways: Targeting the CXCR4-CXCL12 Axis--Untapped Potential in the Tumor Microenvironment.
Clin Cancer Res 21, 4278-4285; Schimanski, C.C., Bahre, R., Gockel, 1., Muller, A., Frerichs, K., Horner, V., Teufel, A., Simiantonaki, N., Biesterfeld, S., Wehler, T., et al. (2006). Dissemination of hepatocellular carcinoma is mediated via chemokine receptor CXCRA4. Br J Cancer 95, 210-217; Sedor, J.R. e Abboud, H.E. (1984). Actions and metabolism of histamine in glomeruli and tubules of the human kidney.
Kidney Int 26, 144-152; Shen, Z., Chen, X,, Li, Q., Zhou, C., Li, J., Ye, H. e Duan, S. (2016). SSTR2 promoter hypermethylation is associated with the risk and pro- gression of laryngeal squamous cell carcinoma in males.
Diagn Pathol 11,10; Sicoli, D., Jiao, X., Ju, X., Velasco-Velazquez, M,, Ertel, A., Addya, S., Li, Z., Ando, S., Fatatis, A., Paudyal, B., et al. (2014). CCR5 receptor antagonists block metastasis to bone of v-Src oncogene-transformed metastatic prostate cancer cell lines.
Cancer Res 74, 7103-7114;
Sierro, F., Biben, C., Martinez-Munoz, L., Mellado, M., Ransohoff, R.M., Li, M., Woehl, B., Leung, H., Groom, J., Batten, M., et al. (2007). Dis- rupted cardiac development but normal hematopoiesis in mice deficient in the second CXCL12/SDF-1 receptor, CXCR7. Proc Natl Acad Sci US A 104, 14759-14764; Smith, M.C., Luker, K.E., Garbow, J.R., Prior, J.L., Jackson, E., Piwnica- Worms, D. e Luker, G.D. (2004). CXCRA4 regulates growth of both pri- mary and metastatic breast cancer.
Cancer Res 64, 8604-8612; Sohy, D., Parmentier, M. e Springael, J.Y. (2007). Allosteric transinhibi- tion by specific antagonists in CCR2/CXCR4 heterodimers.
J Biol Chem 282, 30062-30069; Sohy, D., Yano, H., de Nadai, P., Urizar, E., Guillabert, A., Javitch, J.A., Parmentier, M. e Springael, J.Y. (2009). Hetero-oligomerization of CCR2, CCR5, and CXCRA4 and the protean effects of “selective” antag- onists.
J Biol Chem 284, 31270-31279; Song, J.S., Kang, C.M., Kang, H.H., Yoon, H.K., Kim, Y.K., Kim, K.H., Moon, H.S. e Park, S.H. (2010). Inhibitory effect of CXC chemokine re- ceptor 4 antagonist AMD3100 on bleomycin induced murine pulmonary fibrosis.
Exp Mol Med 42, 465-472; Song, Y.B., Park, C.O., Jeong, J.Y. e Huh, W.K. (2014). Monitoring G protein-coupled receptor activation using an adenovirus-based beta-ar- restin bimolecular fluorescence complementation assay.
Anal Biochem 449, 32-41; Stefan, E., Aquin, S., Berger, N., Landry, C.R., Nyfeler, B., Bouvier, M. e Michnick, S.W. (2007). Quantification of dynamic protein complexes using Renilla luciferase fragment complementation applied to protein ki- nase A activities in vivo.
Proc Natl Acad Sci U S A 104, 16916-16921; Stevenson, L., Allen, W.L., Turkington, R., Jithesh, P.V., Proutski, |., Stewart, G., Lenz, H.J., Van Schaeybroeck, S., Longley, D.B. e John- ston, P.G. (2012). Identification of galanin and its receptor GalR1 as novel determinants of resistance to chemotherapy and potential bi- omarkers in colorectal cancer.
Clin Cancer Res 18, 5412-5426; Stone, N.D., Dunaway, S.B., Flexner, C., Tierney, C., Calandra, G.B., Becker, S., Cao, Y.J., Wiggins, |.P., Conley, J., MacFarland, R.T., et al. (2007). Multiple-dose escalation study of the safety, pharmacokinetics, and biologic activity of oral AMDO70, a selective CXCR4 receptor inhib- itor, in human subjects.
Antimicrob Agents Chemother 51, 2351-2358; Struyf, S., Menten, P., Lenaerts, J.P., Put, W., D'Haese, A., De Clerca, E., Schols, D., Proost, P. e Van Damme, J. (2001). Diverging binding capacities of natural LD78beta isoforms of macrophage inflammatory protein-1alpha to the CC chemokine receptors 1, 3 and 5 affect their anti- HIV-1 activity and chemotactic potencies for neutrophils and eosinophils.
Eur J Immunol 31, 2170-2178; Sugimoto, Y., Inazumi, T. e Tsuchiya, S. (2015). Roles of prostaglandin receptors in female reproduction.
J Biochem 157, 73-80; Swift, S.L., Burns, J.E. e Maitland, N.J. (2010). Altered expression of neurotensin receptors is associated with the differentiation state of pros- tate cancer.
Cancer Res 70, 347-356; Taichman, R.S., Cooper, C., Keller, E.T., Pienta, K.J., Taichman, NS. e McCauley, L.K. (2002). Use of the stromal cell-derived factor-1/CXCR4 pathway in prostate cancer metastasis to bone.
Cancer Res 62, 1832- 1837; Tamamura, H., Xu, Y., Hattori, T., Zhang, X., Arakaki, R., Kanbara, K,., Omagari, A., Otaka, A., Ilbuka, T., Yamamoto, N,, et al. (1998). A low- molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun 253, 877- 882; Tanaka, H., Moroi, K., Iwai, J., Takahashi, H., Ohnuma, N., Hori, S., Takimoto, M., Nishiyama, M., Masaki, T., Yanagisawa, M., et al. (1998). Novel mutations of the endothelin B receptor gene in patients with
Hirschsprung's disease and their characterization.
J Biol Chem 273, 11378-11383; Tanaka, T., Nomura, W., Narumi, T., Esaka, A., Oishi, S., Ohashi, N., Itotani, K., Evans, B.J., Wang, Z.X., Peiper, S.C., et al. (2009). Structure- activity relationship study on artificial CXCR4 ligands possessing the cy- clic pentapeptide scaffold: the exploration of amino acid residues of pen- tapeptides by substitutions of several aromatic amino acids.
Org Biomol Chem 7, 3805-3809; Tanaka, T., Tsutsumi, H., Nomura, W., Tanabe, Y., Ohashi, N., Esaka, A., Ochiai, C., Sato, J., Itotani, K., Murakami, T., et al. (2008). Structure- activity relationship study of CXCRA4 antagonists bearing the cyclic pen- tapeptide scaffold: identification of the new pharmacophore.
Org Biomol Chem 6, 4374-4377; Terrillon, S. e Bouvier, M. (2004). Roles of G-protein-coupled receptor dimerization.
EMBO Rep 5, 30-34; Topaloglu, A.K., Reimann, F., Guclu, M., Yalin, A.S., Kotan, L.D., Porter, K.M,, Serin, A., Mungan, N.O., Cook, J.R., Imamoglu, S., et al. (2009). TAC3 and TACR3 mutations in familial hypogonadotropic hypogonad- ism reveal a key role for Neurokinin B in the central control of reproduc- tion.
Nat Genet 41, 354-358; Torvinen, M., Torri, C., Tombesi, A., Marcellino, D., Watson, S., Lluis, C., Franco, R., Fuxe, K. e Agnati, L.F. (2005). Trafficking of adenosine A2A and dopamine D2 receptors.
J Mol Neurosci 25, 191-200; Tripathi, A., Davis, J.D., Staren, D.M., Volkman, B.F. e Majetschak, M. (2014). CXC chemokine receptor 4 signaling upon co-activation with stromal cell-derived factor-1alpha and ubiquitin.
Cytokine 65, 121-125; Tripathi, A., Vana, P.G., Chavan, T.S., Brueggemann, L.I., Byron, K.L., Tarasova, N.I., Volkman, B.F., Gaponenko, V. e Majetschak, M. (2015). Heteromerization of chemokine (C-X-C motif) receptor 4 with alpha1A/B- adrenergic receptors controls alpha1-adrenergic receptor function.
Proc
Natl Acad Sci U S A 112, E1659-1668; Vaudry, D., Gonzalez, B.J., Basille, M., Yon, L., Fournier, A. e Vaudry, H. (2000). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its re- ceptors: from structure to functions.
Pharmacol Rev 52, 269-324; Velasco-Velazquez, M., Jiao, X., De La Fuente, M., Pestell, T.G., Ertel, A., Lisanti, M.P. e Pestell, R.G. (2012). CCR5 antagonist blocks metas- tasis of basal breast cancer cells.
Cancer Res 72, 3839-3850; Vincent, J.P. (1995). Neurotensin receptors: binding properties, trans- duction pathways, and structure.
Cell Mol Neurobio!l 15, 501-512; Walenkamp, A.M.E., Lapa, C., Herrmann, K. e Wester, H.J. (2017). CXCR4 Ligands: The Next Big Hit? J Nucl Med 58, 77S-82S; Wang, A., Fairhurst, A.M., Tus, K., Subramanian, S., Liu, Y., Lin, F., Iga- rashi, P., Zhou, X.J., Batteux, F., Wong, D., et al. (2009). CXCR4/CXCL12 hyperexpression plays a pivotal role in the pathogene- sis of lupus.
J Immunol 182, 4448-4458; Wang, A., Guilpain, P., Chong, B.F., Chouzenoux, S., Guillevin, L., Du, Y., Zhou, X.J., Lin, F., Fairhurst, A.M., Boudreaux, C., et al. (2010). Dysregulated expression of CXCR4/CXCL12 in subsets of patients with systemic lupus erythematosus.
Arthritis Rheum 62, 3436-3446; Wang, F., Li, S., Zhao, Y., Yang, K., Chen, M., Niu, H., Yang, J., Luo, Y., Tang, W. e Sheng, M. (2016). Predictive role of the overexpression for CXCRA4, C-Met, and VEGF-C among breast cancer patients: A meta- analysis.
Breast 28, 45-53; Wang, L.P., Jin, J., Lv, F.F., Cao, J., Zhang, J., Wang, B.Y., Shao, Z.M,, Hu, X.C. e Wang, Z.H. (2015a). Norepinephrine attenuates CXCRA4 ex- pression and the corresponding invasion of MDA-MB-231 breast cancer cells via beta2-adrenergic receptors.
Eur Rev Med Pharmaco!l Sci 19, 1170-1181; Wang, W., Erbe, A.K., Hank, J.A., Morris, Z.S. e Sondel, P.M. (2015b). NK Cell-Mediated Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in Cancer
Immunotherapy.
Front Immunol 6, 368; Wang, Z., Ma, Q., Liu, Q., Yu, H., Zhao, L., Shen, S. e Yao, J. (2008). Blockade of SDF-1/CXCR4 signalling inhibits pancreatic cancer progres- sion in vitro via inactivation of canonical Wnt pathway.
Br J Cancer 99, 1695-1703; Wang, Z., Yu, D., Wang, M., Wang, Q., Kouznetsova, J., Yang, R., Qian, K., Wu, W., Shuldiner, A., Sztalryd, C., et al. (2015c). Elabela-apelin re- ceptor signaling pathway is functional in mammalian systems.
Sci Rep 5, 8170; Watts, A.O., van Lipzig, M.M., Jaeger, W.C., Seeber, R.M., van Zwam, M,, Vinet, J., van der Lee, M.M., Siderius, M., Zaman, G.J., Boddeke, H.W.,, et al. (2013). Identification and profiling of CXCR3-CXCRA4 chem- okine receptor heteromer complexes.
Br J Pharmacol 168, 1662-1674; Watts, S.W. (2010). Endothelin receptors: what's new and what do we need to know? Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 298, R254-260; White, J.H., Wise, A., Main, M.J., Green, A., Fraser, N.J., Disney, G.H,, Barnes, A.A., Emson, P., Foord, S.M., Marshall, F.H. (1998). Heterodi- merization is required for the formation of a functional GABA(B) receptor.
Nature 396, 679-682; Wong, D., Kandagatla, P., Korz, W. e Chinni, S.R. (2014). Targeting CXCR4 with CTCE-9908 inhibits prostate tumor metastasis.
BMC Urol 14,12; Woodward, D.F., Jones, R.L. e Narumiya, S. (2011). International Union of Basic and Clinical Pharmacology.
LXXXIII: classification of prostanoid receptors, updating 15 years of progress.
Pharmacol Rev 63, 471-538; Wreggett, K.A. e Wells, J.W. (1995). Cooperativity manifest in the bind- ing properties of purified cardiac muscarinic receptors.
J Biol Chem 270, 22488-22499; Wu, L., Chen, L. e Li, L. (2017). Apelin/APJ system: A novel promising therapy target for pathological angiogenesis.
Clin Chim Acta 466, 78-84;
Wurth, R,, Florio, T. (2016). Subventricular zone microenvironment pro- tects glioblastoma cells from radiotherapy cytotoxicity: role of the chem- okine CXCL12. Translational Cancer Research 5(Suppl 6):, S1098- 81101; Xie, H. e He, S.H. (2005). Roles of histamine and its receptors in allergic and inflammatory bowel diseases.
World J Gastroenterol| 11, 2851-2857; Xu, H., Fu, S., Chen, Q., Gu, M., Zhou, J., Liu, C., Chen, Y. e Wang, Z. (2017). The function of oxytocin: a potential biomarker for prostate cancer diagnosis and promoter of prostate cancer.
Oncotarget 8, 31215-31226; Xu, L., Duda, D.G., di Tomaso, E., Ancukiewicz, M., Chung, D.C., Lau- wers, G.Y., Samuel, R., Shellito, P., Czito, B.G., Lin, P.C., et al. (2009). Direct evidence that bevacizumab, an anti-VEGF antibody, up-regulates SDF1alpha, CXCR4, CXCL6, and neuropilin 1 in tumors from patients with rectal cancer.
Cancer Res 69, 7905-7910; Yagami, T., Koma, H. e Yamamoto, Y. (2016). Pathophysiological Roles of Cyclooxygenases and Prostaglandins in the Central Nervous System.
Mol Neurobiol 53, 4754-4771; Yang, D., Koupenova, M., McCrann, D.J., Kopeikina, K.J., Kagan, H.M., Schreiber, B.M. e Ravid, K. (2008). The A2b adenosine receptor protects against vascular injury.
Proc Natl Acad Sci U S A 105, 792-796; Yang, Q., Zhang, F., Ding, Y., Huang, J., Chen, S., Wu, Q., Wang, Z., Wang, Z. e Chen, C. (2014). Antitumour activity of the recombination polypeptide GST-NT21MP is mediated by inhibition of CXCRA4 pathway in breast cancer.
Br J Cancer 110, 1288-1297; Yang, T. e Du, Y. (2012). Distinct roles of central and peripheral prosta- glandin E2 and EP subtypes in blood pressure regulation.
Am J Hyper- tens 25, 1042-1049; Zabel, B.A., Lewen, S., Berahovich, R.D., Jaen, J.C. e Schall, T.J. (2011). The novel chemokine receptor CXCR7 regulates trans-endothe- lial migration of cancer cells.
Mol Cancer 10, 73;
Zatelli, M.C., Ambrosio, M.R., Bondanelli, M. e Uberti, E.C. (2007). Con- trol of pituitary adenoma cell proliferation by somatostatin analogs, do- pamine agonists and novel chimeric compounds.
Eur J Endocrinol 156 Suppl 1, S29-35; Zeelenberg, 1.S., Ruuls-Van Stalle, L. e Roos, E. (2003). The chemokine receptor CXCRA is required for outgrowth of colon carcinoma microme- tastases.
Cancer Res 63, 3833-3839; Zhan, W., Liang, Z., Zhu, A., Kurtkaya, S., Shim, H., Snyder, J.P. e Liotta, D.C. (2007). Discovery of small molecule CXCR4 antagonists.
J Med Chem 50, 5655-5664; Zhang, W.B., Navenot, J.M,, Haribabu, B., Tamamura, H,, Hiramatu, K,, Omagari, A., Pei, G., Manfredi, J.P., Fuji, N., Broach, J.R., et al. (2002). A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists.
J Biol Chem 277, 24515-24521; Zhao, H., Guo, L., Zhao, H., Zhao, J., Weng, H. e Zhao, B. (2015). CXCRA4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis.
Oncotarget 6, 5022-5040; Zhou, N., Fan, X., Mukhtar, M., Fang, J., Patel, C.A., DuBois, G.C. e Pomerantz, R.J. (2003). Cell-cell fusion and internalization of the CNS- based, HIV-1 co-receptor, APJ.
Virology 307, 22-36; Zhu, A., Zhan, W., Liang, Z., Yoon, Y., Yang, H., Grossniklaus, H.E., Xu, J., Rojas, M., Lockwood, M., Snyder, J.P., et al. (2010). Dipyrimidine amines: a novel class of chemokine receptor type 4 antagonists with high specificity. ] Med Chem 53, 8556-8568; e Zitzer, H., Honck, H.H., Bachner, D., Richter, D. e Kreienkamp, H.J. (1999). Somatostatin receptor interacting protein defines a novel family of multidomain proteins present in human and rodent brain.
J Biol Chem 274, 32997-33001.

Claims (173)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratamento, amenização ou prevenção de um câncer num indivíduo que tem heterômero CXCR4-GPCRx caracteri- zado pelo fato de que o método compreende: administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de um heterô- mero CXCR4-GPCRx, em que: GPCRx se heteromeriza com CXCR4 no indivíduo, a heteromerização de GPCRX com CXCR4 é acompa- nhada pelo aprimoramento da sinalização a jusante de CXCRA; e o apri- moramento de sinalização a jusante de CXCR4 é suprimido pelo inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a heteromerização de CXCR4 com GPCRx é avaliada através de um ensaio com base em proximidade.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ensaio com base em proximidade é selecionado den- tre o grupo que consiste em complementação de fluorescência bimole- cular (BIFC), ensaio de ligação de proximidade (PLA), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), transferência de ener- gia de ressonância de bioluminescência (BRET), reticulação de cisteína e co-imunoprecipitação.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a heteromerização de CXCR4 com GPCRx é avaliada por um ensaio de cointernalização.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o aprimoramento de sinalização celular a jusante de CXCR4 é avaliado por um ensaio de Ca2+ intrace- lular.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a, caracterizado pelo fato de que GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2,
APLNR, C5AR1, CALCR, CCR5, CHRM1, GALR1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1, PTGER2, PTGER3, SSTR2 e TACR3.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a6, caracterizado pelo fato de que o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é um inibidor do CXCRA4.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CXCR4 é selecionado dentre o grupo que consiste em AD-114, AD-114-6H, AD-114-Im7-FH, AD-114-PA600-6H, ALX-0651, ALX40-4C, AMDO70 (AMD11070, X4P-001), AMD3100 (ple- rixafor), AMD3465, ATI 2341, BKT140 (BL-8040; TF14016; 4F-Benzoil- TN14003), CTCE-9908, CX549, D-[Lys3] GHRP-6, FC 122, FC131, GMI- 1359, GSK812397, GST-NT21MP, isotioureia-1a, isotioureia-1t (IT1t), KRH-1636, KRH-3955, LY2510924, LY2624587, MSX-122, N-[C]Me- ti-AMD3465, PF-06747143, POL6326, dímero SDF-1 1-9[P2G], SDF1 P2G, T134, T140, T22, TC 14012, TG-0054 (Burixafor), USL311, ulocu- plumabe (MDX1338/BMS-936564), proteína inflamatória de macrófago viral-Il (vMIP-II), WZ811, 12G5, 238D2, 238D4, [ººCu]-AMD3100, [*Cu]- AMD3465, [Gal]pentixafor, [ººY]pentixater, [º**TcC]O 2-AMD3100, ['"TLu]pentixater e 5S08MCI (Composto 26).
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx é um antago- nista do CXCRA4.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o antagonista de CXCR4 é selecionado dentre o grupo que consiste em ALX40-4C, AMDO70 (AMD11070, X4P-001), AMD3100 (plerixafor), AMD3465, ATI 2341, BKT140 (BL-8040; TF14016; 4F-Ben- zoil-TN14003), CTCE-9908, CX549, D-[Lys3] GHRP-6, FC122, FC131, GMI-1359, GSK812397, GST-NT21MP, isotioureia-1a, isotioureia-1t (ITIt), KRH-1636, KRH-3955, LY2510924, MSX-122, N-["C]Metil- AMD3465, POL6326, dímero SDF-1 1-9[P2G], SDF1 P2G, T134, T140,
T22, TC 14012, TG-0054 (Burixafor), USL311, proteína inflamatória de macrófago viral-Il (vMIP-II), WZ811, [º*Cu]-AMD3100, [Cu]-AMD3465, [ººGa]pentixafor, [PY]pentixater, [P*"Tc]O 2-AMD3100, [Lu]pentixater e 508MCI (Composto 26).
11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx compreende adicionalmente um inibidor do GPCRx.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteri- zado pelo fato de que o inibidor de GPCRx é concomitante ou sequen- cialmente administrado com o inibidor de CXCRA.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a12, caracterizado pelo fato de que o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é, ou compreende uma combinação de um antagonista, um agonista reverso, um modulador alostérico, um anticorpo ou porção de ligação do mesmo, ou um ligante, de GPCRx.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GPCRx é um antagonista de uma molé- cula selecionada dentre o grupo que consiste em ADCYAP1RI1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1, PTGER2 e TACR3.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de GPCRx é um antagonista de ADRB?2 selecionado dentre o grupo que consiste em Alprenolol, ate- nolol, betaxolol, bupranolol, butoxamina, carazolol, carvedilol, CGP 12177, cicloprolol, ICI 118551, ICYP, labetalol, levobetaxolol, levobu- nolol, LK 204-545, metoprolol, nadolol, NIHP, NIP, propafenona, propra- nolol, sotalol, SR59230A e timolol.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de ADRB2 é Carvedilol.
17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de GPCRx é um antagonista de CALCR selecionado dentre o grupo que consiste em a-CGRP-(8-37) (humano), AC187, CT-(8-32) (salmão) e olcegepant.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de CALCR é AC187.
19. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de GPCRx é um antagonista de CHRM1 selecionado dentre o grupo que consiste em benzilato de 3- quinuclidinila (QNB), 4-DAMP, aclidínio, AESC90CB, AFDX384, amitrip- tilina, AQ-RA 741, atropina, benzatropina, biperideno, darifenacina, dici- clomina, dosulepina, etopropazina, glicopirrolato, guanilpirenzepina, hexa-hidrodifenidol, hexa-hidrossiladifenidol, hexocíclio, himbacina, ipratrópio, litocolilcolina, metoctramina, ML381, toxina muscarínica 1, to- xina muscarínica 2, toxina muscarínica 3, escopolamina de N-metila, otenzepade, oxibutinina, p-F-HHSiD, pirenzepina, propantelina, (R,R)- quinuclidinil-4-fluorometil-benzilato, escopolamina, sila-hexocíclio, soli- fenacina, telenzepina, tiotrópio, tolterodina, tri-hexifenidila, tripitramina, UH-AH 37, umeclidínio e VUO255035.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de CHRM1 é selecionado dentre o grupo que consiste em oxibutinina, umeclidínio e VUO255035.
21. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GPCRx é um antagonista de EDNRB selecionado dentre o grupo que consiste em A192621, ambrisentan, atra- sentan, bosentan (RO 470203, Tracleer), BQ788, IRL 2500, K-8794, ma- citentan, RES7011, Ro 46-8443, SB209670, SB217242 (enrasentan), TAK 044 e tezosentan (RO610612).
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de EDNRB é bosentan.
23. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de GPCRx é um antagonista de HRH1 selecionado dentre o grupo que consiste em (-)-clorfeniramina, (+)-clorfeniramina, (-)- trans-H 2-PAT, (+)- cis-H 2-PAT, (+)- trans-H 2- PAT, (+)- cis-H 2-PAT, (+)- trans-H 2-PAT, (R)-cetirizina, (S)-cetirizina, 9- OH-risperidona, A-317920, A-349821, ABT-239, alimemazina, amitripti- lina, aripiprazol, arpromidina, asenapina, astemizol, AZD3778, azelas- tina, BU-E 47, cetirizina, clorfeniramina, clorpromazina, ciproxifano, cle- mastina, clobempropite, clozapina, conessina, ciclizina, cipro-heptadina, desloratadina, difenidramina, dosulepina, doxepina, epinastina, fexofe- nadina, flufenazina, fluspirileno, haloperidol, hidroxizina, impromidina, INCB-38579, JNJ-39758979, cetotifeno, loratadina, loxapina, MK-0249, molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, pipamperona, pitoli- sante, prometazina, pirilamina, quetiapina, risperidona, sertindol, terfe- nadina, tioridazina, tiotixeno, trifluoperazina, tripelenamina, triprolidina, ziprasidona e zotepina.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de HRH1 é cetirizina, pirilamina, hidroxizina ou loratadina.
25. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de GPCRx é um antagonista de MLNR selecionado dentre o grupo que consiste em GM-109, MA-2029 e OHM-11526.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de MLNR é MA-2029.
27. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de GPCRx é um antagonista de NTSR1 selecionado dentre o grupo que consiste em Meclinertant, SR48527, SR48692 e SR142948A.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de NTSR1 é Merclinertant.
29. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de GPCRx é um antagonista de TACR3 selecionado dentre o grupo que consiste em [Trp 7, B-Ala ?] neu- rocinina A-(4-10), AZD2624, FK 224, GR138676, GSK 172981, GSK 256471, N',2-difenilquinolina-4-carboidrazida 8m, N',2-difenilquinolina- 4-carboidrazida, osanetant, PD 154740, PD 161182, PD157672, sare- dutant, SB 218795, SB 222200, SB 235375, SCH 206272, SSR 146977 e talnetant.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteri- zado pelo fato de que o antagonista de TACR3 é SSR146977.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 30, caracterizado pelo fato de que o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é um inibidor de interação de proteína-proteína (PPI).
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em câncer de mama, câncer pulmonar, câncer de cérebro, câncer de rim, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer da próstata, melanoma, mieloma múltiplo, cânceres gastrointestinais, car- cinoma de célula renal, sarcomas de tecido mole, carcinoma hepatoce- lular, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de esôfago e leu- cemia.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 32, caracterizado pelo fato de que o inibidor de heterômero CXCR4- GCPRx é administrado ao indivíduo numa composição farmacêutica.
34. Método para avaliar resposta, ou potencial resposta, de um indivíduo que tem o heterômero CXCR4-GPCRx ao tratamento, amenização ou prevenção de um câncer caracterizado pelo fato de que o método compreende: obter uma amostra do indivíduo; detectar a he- teromerização de CXCR4 e GPCRx na amostra; e com base, pelo me- nos em parte, na detecção da heteromerização de CXCR4 e GPCRXx, avaliar a resposta, ou potencial resposta, do indivíduo ao tratamento, amenização ou prevenção de um câncer.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracteri- zado pelo fato de que a heteromerização de CXCR4 e GPCRx é acom- panhada pelo aprimoramento de sinalização a jusante de CXCRA4.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracteri- zado pelo fato de que o aprimoramento de sinalização celular a jusante de CXCRA4 é avaliado por um ensaio de Ca2+ intracelular.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que a heteromerização de CXCR4 com GPCRx é avaliada por um ensaio com base em proximidade.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteri- zado pelo fato de que o ensaio com base em proximidade é selecionado dentre o grupo que consiste em complementação de fluorescência bi- molecular (BIFC), ensaio de ligação de proximidade (PLA), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET), reticulação de cis- teína e co-imunoprecipitação.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 38, caracterizado pelo fato de que a heteromerização de CXCR4 com GPCRx é avaliada por um ensaio de cointernalização.
40. Método de tratamento de câncer num paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx caracterizado pelo fato de que o método compreende: administrar ao paciente um ini- bidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; em que: i) o heterômero CXCR4-
GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada; e ii) o inibidor ou combi- nação de inibidores administrada suprime a sinalização a jusante apri- morada do dito heterômero CXCR4-GPCRXx no paciente com câncer.
41. Método para suprimir sinalização a jusante aprimorada de um heterômero CXCR4-GPCRx numa célula de um paciente que so- fre de câncer caracterizado pelo fato de que o método compreende: administrar ao paciente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; em que: i) o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimo- rada; e li) o inibidor ou combinação de inibidores administrada suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer.
42. Kit farmacêutico para uso no tratamento de câncer num paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4- GPCRx caracterizado pelo fato de que o kit farmacêutico compreende: um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; sendo que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada.
43. Composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer num paciente que tem uma célula que contém um heterômero CXCR4-GPCRx caracterizada pelo fato de que a composição farma- cêutica compreende: i) um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e il) um veículo farmaceuticamente aceitável; em que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante aprimorada.
44. Método de tratamento de câncer num paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRX,
sendo que o heterômero CXCR4-GPCRx tem sinalização a jusante apri- morada, em que o método é caracterizado pelo fato de que compre- ende: 1) determinar se o paciente tem a célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimo- rada: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente; e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determinar se: i) a célula cancerígena de um paciente contém o dito he- terômero CXCR4-GPCRx; ou ii) um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx: altera propriedades específicas de heterômero ou fun- ção do dito heterômero CXCR4-GPCRx numa célula (ou células) deri- vada de um paciente; altera propriedades específicas de heterômero de uma célula (ou células) derivada de um paciente que contém o heterô- mero CXCR4-GPCRx; ou diminui a proliferação de célula de uma célula (ou células) derivada de um paciente que contém o heterômero CXCRA4- GPCRx; e 2) se o paciente tem uma célula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx ao paciente com câncer.
45. Método de tratamento de câncer num paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx caracterizado pelo fato de que o método compreende: 1) determinar se a célula cancerígena de um paciente contém o heterômero CXCR4- GPCRx: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determinar se o dito heterômero CXCR4-GPCRx está presente na cé- lula cancerígena de um paciente; em que: a) o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; e b) o ensaio realizado na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hibridiza- ção in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um en- saio com base em proximidade, um ensaio de co-imunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA), citometria de fluxo, RNAsegq, gRT-PCR, microarranjo, ou um ensaio animal fluorescente; e 2) se a célula cancerígena de um paciente contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente um inibidor ou uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterô- mero CXCR4-GPCRx ao paciente.
46. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizado pelo fato de que o heterô- mero CXCR4-GPCRx tem, causa ou produz a sinalização a jusante apri- morada.
47. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada resulta do heterômero CXCR4-GPCRx.
48. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada resulta do agonismo do heterômero CXCRA4- GPCRx.
49. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada resulta do agonismo de CXCRA4 do heterômero CXCR4-GPCRx.
50. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada resulta do agonismo de GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx.
51. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada resulta do agonismo de CXCR4 do agonismo de GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx.
52. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 51, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada é a jusante do CXCRA, do respectivo GPCRx ou do heterômero CXCR4-GPCRx.
53. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 51, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada é a jusante do CXCRA.
54. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 51, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada é a jusante do respectivo GPCRx.
55. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 51, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada é a jusante do heterômero CXCR4-GPCRx.
56. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 51, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é relativa à sinali- zação a jusante de um promotor de CXCRA4 ou um respectivo promotor de GPCRx em seu respectivo contexto de promotor individual.
57. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 51, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é relativa à sinali- zação a jusante de um promotor de CXCRA4 num contexto de promotor individual.
58. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 51, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é relativa à sinali- zação a jusante de um respectivo promotor de GPCRx num contexto de promotor individual.
59. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 51, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é relativa à sinali- zação a jusante de um promotor de CXCRA4 e um respectivo promotor de GPCRx em seu respectivo contexto de promotor individual.
60. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 59, caracterizado pelo fato de que o inibidor ou combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRXx no paciente com câncer.
61. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 59, caracterizado pelo fato de que o inibidor ou combinação de inibidores administrados suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRx nas células canceríge- nas de um paciente.
62. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 61, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada do heterômero CXCR4-GPCRx é determinada por um ensaio de Ca2+ intracelular.
63. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o ensaio de Ca2+ intracelular é um en- saio de mobilização de cálcio.
64. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 63, caracterizado pelo fato de que a sinalização a jusante aprimorada é uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio.
65. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a quantidade aprimorada de mobiliza- ção de cálcio do heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade de mo- bilização de cálcio que, mediante coestimulação com o CXCL12 e o res- pectivo agonista de GPCRx seletivo, é maior que a soma de quantida- des de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRXx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mo- bilização de cálcio.
66. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a quantidade aprimorada de mobiliza-
ção de cálcio do heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade de mo- bilização de cálcio que, mediante coestimulação com o CXCL12 e o res- pectivo agonista de GPCRx seletivo, é pelo menos 10% maior, pelo me- nos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, ou pelo menos 90% maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
67. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a quantidade aprimorada de mobiliza- ção de cálcio do heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade de mo- bilização de cálcio que, mediante coestimulação com o CXCL12 e o res- pectivo agonista de GPCRx seletivo, é pelo menos 100% maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimu- lação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um en- saio de mobilização de cálcio.
68. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 67, caracterizado pelo fato de que a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio é determinada por um ensaio de Ca2+ intracelular.
69. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o ensaio de Ca2+ intracelular é um en- saio de mobilização de cálcio.
70. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 67, caracterizado pelo fato de que a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio é uma quantidade sinérgica de mo- bilização de cálcio.
71. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a quantidade sinérgica de mobilização de cálcio das células que contêm o heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade de mobilização de cálcio que, mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo, é pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, ou pelo menos 90% maior que a soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme deter- minado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
72. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 70, caracterizado pelo fato de que o heterômero CXCR4-GPCRx tem duas ou mais dentre as seguintes características: 1) os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx numa célula coloca- lizam e interagem fisicamente, seja diretamente ou por meio de proteí- nas intermediárias que atuam como condutos para alosterismo, con- forme determinado por meio de um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de co-imunoprecipitação, ensaio imu- noabsorvente ligado a enzimas (ELISA), citometria de fluxo, RNAsega, qgRT-PCR, microarranjo ou um ensaio animal fluorescente; 2) uma quan- tidade aprimorada de mobilização de cálcio, de modo que: a) CXCR4 ou o respectivo GPCRx num contexto de promotor individual numa cé- lula, mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo, resulte numa quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respec- tivo agonista de GPCRx seletivo; e b) o heterômero CXCR4-GPCRXx exibe uma mobilização de cálcio aprimorada mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo em relação à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da esti- mulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRXx seletivo; conforme determinado por meio de um ensaio de mo- bilização de cálcio; ou 3) um reagente seletivo de heterômero CXCR4- GPCRx: i) altera propriedades específicas de heterômero do heterô- mero CXCR4-GPCRx numa célula derivada de um paciente; ii) altera função específica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx numa célula derivada de um paciente; iii) altera propriedades específicas de heterômero de uma célula derivada de um paciente que contém o hete- rômero CXCR4-GPCRx; ou iv) diminui a proliferação celular de uma cé- lula (ou células) derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
73. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 72, caracterizado pelo fato de que os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx compreendem protômeros CXCR4 e GPCRx individuais.
74. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 72 ou 73, caracterizado pelo fato de que a célula que contém o CXCRA4 ou o respectivo GPCRXx, num contexto de promotor individual, compreende,
independentemente: i) o promotor individual CXCR4 na ausência do res- pectivo promotor individual GPCRx; ou ii) o respectivo promotor indivi- dual GPCRx na ausência do promotor individual CXCRA; respectiva- mente.
75. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 74, caracterizado pelo fato de que a célula que contém o CXCRA, num contexto de promotor individual, compreende o dito promotor individual CXCRA4 na ausência do respectivo promotor in- dividual GPCRx.
76. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 74, caracterizado pelo fato de que a célula que contém o respectivo GPCRx, num contexto de promotor individual, com- preende o dito respectivo promotor individual GPCRx na ausência do promotor individual CXCRA.
77. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 76, caracterizado pelo fato de que os componentes de heterômero CXCR4-GPCRx na célula colocalizam e interagem fisi- camente, seja diretamente ou por meio de proteínas intermediárias que atuam como condutos para alosterismo, conforme determinado por meio de um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hibridização in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um ensaio com base em proximidade, um ensaio de co-imunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzi- mas (ELISA), citometria de fluxo, RNAseg, gRT-PCR, microarranjo ou um ensaio animal fluorescente.
78. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 77,
caracterizado pelo fato de que o ensaio com base em proximidade é, ou compreende, transferência de energia de ressonância (RET), RET de bioluminescência (BRET), RET de fluorescência (FRET), RET de flu- orescência de prazo estabelecido (TR-FRET), FRET auxiliada por anti- corpo, FRET auxiliada por ligante, complementação de fluorescência bi- molecular (BiFC) ou um ensaio de ligação de proximidade (PLA).
79. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 76, caracterizado pelo fato de que os compo- nentes de heterômero CXCR4-GPCRXx na célula colocalizam e intera- gem fisicamente, seja diretamente ou por meio de proteínas intermedi- árias que atuam como condutos para alosterismo, conforme determi- nado por meio de um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de coin- ternalização, complementação de fluorescência bimolecular (BiIFC) ou um ensaio de ligação de proximidade (PLA).
80. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 79, caracterizado pelo fato de que a célula can- cerígena de um paciente contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
81. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 80, caracterizado pelo fato de que o heterô- mero CXCR4-GPCRx exibe a quantidade aprimorada de mobilização de cálcio, de modo que: a) o CXCRA4 ou o respectivo GPCRx, num contexto de promotor individual na célula, mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo, resulte numa quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resulta da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; e b) o he- terômero CXCR4-GPCRx exibe uma mobilização de cálcio aprimorada mediante coestimulação com o CXCL12 e o respectivo agonista de GPCRx seletivo em relação à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo; conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
82. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 80, caracterizado pelo fato de que: i) a mobili- zação de cálcio do promotor CXCR4 ou GPCRXx, no contexto de promo- tor individual na célula, é não sinérgica, conforme determinado por meio de ensaio de mobilização de cálcio; e ii) a mobilização de cálcio do he- terômero CXCR4-GPCRx na célula é sinérgica, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
83. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 82, caracterizado pelo fato de que, no contexto de promotor individual: a) o promotor individual CXCR4 na célula, na ausência do respectivo promotor individual GPCRx; ou b) o respectivo promotor individual GPCRx na célula, na ausência do promotor indivi- dual CXCRA4; mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo, resultam numa quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
84. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 82, caracterizado pelo fato de que, no contexto de promotor individual, independentemente: a) o promotor individual CXCRA4 na célula, na ausência do respectivo promotor individual
GPCRx; e b) o respectivo promotor individual GPCRx na célula, na au- sência do promotor individual CXCR4; mediante coestimulação com CXCL12 e um respectivo agonista de GPCRx seletivo, resultam numa quantidade de mobilização de cálcio que é menor ou igual à soma de quantidades de mobilização de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx se- letivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
85. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 84, caracterizado pelo fato de que o heterô- mero CXCR4-GPCRx, mediante coestimulação com o CXCL12 e o res- pectivo agonista de GPCRx seletivo, resulta numa quantidade de mobi- lização de cálcio que é maior que a soma de quantidades de mobiliza- ção de cálcio que resultam da estimulação de agonista único das ditas células com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
86. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a quantidade de mobilização de cálcio que resulta da coestimulação do heterômero CXCR4-GPCRx é uma quantidade aprimorada de mobilização de cálcio, em relação à soma de mobilizações de cálcio que resultam da estimulação de agonista único do dito heterômero CXCR4-GPCRx, conforme determinado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
87. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a quantidade aprimorada de mobiliza- ção de cálcio é pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, ou pelo menos 90% maior que a soma de mobiliza- ções de cálcio que resultam da estimulação de agonista único com o CXCL12 ou o respectivo agonista de GPCRx seletivo, conforme deter- minado por meio de um ensaio de mobilização de cálcio.
88. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 86 ou 87, caracterizado pelo fato de que a quantidade aprimorada de mo- bilização de cálcio é uma quantidade sinérgica de mobilização de cálcio.
89. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 71, caracterizado pelo fato de que o método administra um reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx.
90. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 89, caracterizado pelo fato de que o reagente se- letivo de heterômero CXCR4-GPCRx: i) altera propriedades específicas de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx na célula derivada de um paciente; ii) altera função específica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx na célula derivada de um paciente; iii) altera proprieda- des específicas de heterômero da célula derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx,; ou iv) diminui proliferação celular da célula derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4- GPCRx.
91. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera propriedades específicas de heterômero do he- terômero CXCR4-GPCRx na célula derivada de um paciente.
92. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 90,
caracterizado pelo fato de que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera função específica de heterômero do heterômero CXCR4-GPCRx na célula derivada de um paciente.
93. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx altera propriedades específicas de heterômero da cé- lula derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
94. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o reagente seletivo de heterômero CXCR4-GPCRx diminui a proliferação celular da célula derivada de um paciente que contém o heterômero CXCR4-GPCRx.
95. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 94, caracterizado pelo fato de que o reagente se- letivo de heterômero CXCR4-GPCRx é um inibidor de CXCRA, um ini- bidor de GPCRx ou um inibidor de heterômero CXCR4-GPCRx.
96. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 94, caracterizado pelo fato de que o reagente se- letivo de heterômero CXCR4-GPCRx é um antagonista de CXCRA, um antagonista de GPCRx ou um antagonista de heterômero CXCRA4- GPCRx.
97. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 96, caracterizado pelo fato de que o reagente se- letivo de heterômero CXCR4-GPCRx é administrado como uma compo- sição farmacêutica.
98. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 88, caracterizado pelo fato de que o método admi- nistra um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em: inibidor de CXCRA, inibidor de GPCRx ou inibidor heterômero CXCR4-GPCRx.
99. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o inibidor é administrado como uma composição farmacêutica.
100. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que o inibidor administrado é o inibidor de CXCRA4.
101. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que o inibidor administrado é o inibidor de GPCRx.
102. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que o inibidor administrado é o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
103. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 88, caracterizado pelo fato de que o método administra a combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: inibidor de CXCRA, inibidor de GPCRxe inibidor do heterô- mero CXCR4-GPCRx.
104. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação
103, caracterizado pelo fato de que a combinação de inibidores é ad- ministrada como uma composição farmacêutica.
105. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a combinação de inibidores com- preende o inibidor de CXCRA4 e o inibidor de GPCRx.
106. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a combinação de inibidores com- preende o inibidor de CXCRA4 e o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx.
107. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a combinação de inibidores com- preende o inibidor de GPCRx e o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx.
108. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 103 a 107, caracterizado pelo fato de que a combinação de inibidores é administrada sequencial, concomitante ou simultanea- mente.
109. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 103 a 108, caracterizado pelo fato de que a combinação de inibidores é administrada como uma composição farmacêutica que compreende adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.
110. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 103 a 109, caracterizado pelo fato de que a combinação de inibidores é administrada como composições farmacêuticas separa- das, sendo que as composições farmacêuticas separadas compreen- dem, independentemente, um veículo farmaceuticamente aceitável.
111. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 110, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CXCR4 é um antagonista de CXCR4, um agonista reverso de CXCRA, um antagonista parcial de CXCRA4, um modulador alostérico de CXCRA4, um anticorpo de CXCR4, um fragmento de anticorpo de CXCRA4 ou um ligante de CXCRA4.
112. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 111, caracterizado pelo fato de que o inibidor de GPCRx é um antagonista de GPCRx, um agonista reverso de GPCRXx, um antagonista parcial de GPCRx, um modulador alostérico de GPCRXx, um anticorpo de GPCRx, um fragmento de anticorpo de GPCRx ou um ligante de GPCRx.
113. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 112, caracterizado pelo fato de que o inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx é um antagonista do heterômero CXCR4-GPCRXx, um agonista reverso do heterômero CXCR4-GPCRx, um antagonista parcial do heterômero CXCR4-GPCRx, um modulador alostérico do heterômero CXCR4-GPCRXx, um anticorpo do heterômero CXCR4-GPCRXx, um fragmento de anticorpo do heterômero CXCR4- GPCRX, um ligante do heterômero CXCR4-GPCRx ou um inibidor de interação de proteína-proteína (PPI) do heterômero CXCR4-GPCRx.
114. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 110, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CXCRA, o inibidor de GPCRx ou o inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx, é um conjugado de anticorpo e fármaco.
115. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 114, caracterizado pelo fato de que uma quan- tidade terapeuticamente eficaz do inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é administrada ao paciente.
116. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 114, caracterizado pelo fato de que uma quan- tidade subterapeuticamente eficaz do inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx é administrada ao paciente.
117. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 116, caracterizado pelo fato de que uma quan- tidade terapeuticamente eficaz do inibidor de CXCR4 é administrada ao paciente.
118. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 116, caracterizado pelo fato de que uma quan- tidade subterapeuticamente eficaz do inibidor de CXCR4 é administrada ao paciente.
119. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 118, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CXCRA4 é selecionado dentre o grupo que consiste em: AD-114, AD- 114-6H, AD-114-Im7-FH, AD-114-PA600-6H, ALX-0651, ALX40-4C, AMDO7O (AMD11070, X4P-001), AMD3100 (plerixafor), AMD3465, ATI 2341, BKT140 (BL-8040; TF14016; 4F-Benzoil-TN14003), CTCE-9908, CX549, D-[ILys3] GHRP-6, FC122, FC131, GMI-1359, GSK812397,
GST-NT21MP, isotioureia-1a, isotioureia-1t (IT1t), KRH-1636, KRH- 3955, LY2510924, LY2624587, MSX-122, N-[ C]Metil-AMD3465, PF- 06747143, POL6326, dímero SDF-1 1-9[P2G], SDF1 P2G, T134, T140, T22, TC 14012, TG-0054 (Burixafor)) USL311, ulocuplumabe (MDX1338/BMS-936564), proteína inflamatória de macrófago viral-ll (VMIP-II), WZ811, 12G5, 238D2, 238D4, [ºCu]-AMD3100, [*“Cu]- AMD3465, [Ga]pentixafor, [*ºY]pentixater, [P*"TC]O 2-AMD3100, ["”"Lu]pentixater e 508MCI (Composto 26).
120. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 119, caracterizado pelo fato de que uma quan- tidade terapeuticamente eficaz do inibidor de GPCRx é administrada ao paciente.
121. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 119, caracterizado pelo fato de que uma quan- tidade subterapeuticamente eficaz do inibidor de GPCRx é administrada ao paciente.
122. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 121, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1RI1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3.
123. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é ADRB2 ou HRH1.
124. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é ADCYAP1R1.
125. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ADCYAP1R1 é sele- cionado dentre o grupo que consiste em: M65, Max.d.4, MK-0893, N- estearil-[Nle *7], neurotensina-(6-11)/VIP-(7-28), PACAP-(6-38) e PG 97-269.
126. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é ADORAZB.
127. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ADORAZB é selecio- nado dentre o grupo que consiste em: 3-isobutil-8-pirrolidinoxantina, aloxazina, AS16, AS7O0, AS74, AS94, AS95, AS96, AS99, AS100, AS101, ATL8O2, BW-A1433, cafeina, CGS 15943, CPX, CSC, CVT- 6883, DAX, DEPX, derenofilina, DPCPX, FK453, -ABOPX, istradefi- lina, KF26777, LASS8096, LUF5S981, MRE 2029F20, MRE 3008F20, MRS1191, MRS1220, MRS1523, MRS1706, MRS1754, MSX-2, OSIP339391, pentoxifilina, preladenant, PSB-10, PSB-11, PSB36, PSB603, PSB-0788, PSB1115, rolofilina, SCH 58261, SCH442416, ST- 1535, teofilina, tonapofilina, vipadenant, composto de xantina e amina, XCC e ZM-241385.
128. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é ADORAS3.
129. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ADORAS3 é selecio- nado dentre o grupo que consiste em: ATL802, BW-A1433, cafeína, CGS 15943, CSC, CVT-6883, derenofilina, dexniguldipina, DPCPX, FK- 453, flavanona, flavona, galangina, I-ABOPX, istradefilina, KF26777, LAS38096, LUF5981, MRE 2029F20, MRE 3008F20, MRE 3010F20, MRS1041, MRS1042, MRS1067, MRS1088, MRS1093, MRS1097, MRS1177, MRS1186, MRS1191, MRS1191, MRS1220, MRS1476, MRS1486, MRS1505, MRS1523, MRS1754, MRS928, MSX-2, nicardi- pina, preladenant, PSB-10, PSB-11, PSB36, PSB603, PSB1115, rolofi- lina, sacuranetina, SCH 58261, SCH442416, ST-1535, teofilina, tonapo- filina, vipadenant, visnagina, VUF5574, VUF8504, VUF8507, composto de xantina e amina, e ZM-241385.
130. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é ADRB2.
131. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ADRB?2 é selecionado dentre o grupo que consiste em: Alprenolol, atenolol, betaxolol, bupra- nolol, butoxamina, carazolol, carvedilol, CGP 12177, cicloprolol, ICI 118551, ICYP, labetalol, levobetaxolol, levobunolol, LK 204-545, meto- prolol, nadolol, NIHP, NIP, propafenona, propranolol, sotalol, SR59230A e timolol.
132. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é C5AR1.
133. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CBAR1 é selecionado dentre o grupo que consiste em: A8 971-1?, AcPhe-Orn-Pro-D-Cha-Trp- Arg, avacopan, CO089, CHIPS, DF2593A, JPE1375, L-156,602, NDT9520492, N-metil-Phe-Lys-Pro-D-Cha-Trp-D-Arg-CO 2H, PMX205, PMX53, RPR121154 e W54011.
134. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é CALCR.
135. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CALCR é selecionado dentre o grupo que consiste em: a-CGRP-(8-37) (humano), AC187, CT- (8-32) (salmão) e olcegepant.
136. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é CHRM1.
137. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CHRM1 é selecionado dentre o grupo que consiste em: benzilato de 3-quinuclidinila (QNB), 4- DAMP, aclidínio, AESC90CB, AFDX384, amitriptilina, AQ-RA 741, atro- pina, benzatropina, biperideno, darifenacina, diciclomina, dosulepina, etopropazina, glicopirrolato, guanilpirenzepina, hexa-hidrodifenidol, hexa-hidrossiladifenidol, hexocíclio, himbacina, ipratrópio, litocolilcolina, metoctramina, ML381, toxina muscarínica 1, toxina muscarínica 2, to- xina muscarínica 3, escopolamina de N-metila, otenzepade, oxibutinina,
p-F-HHSIiD, pirenzepina, propantelina, (R,R)-quinuclidinil-4-fluorometil- benzilato, escopolamina, sila-hexocíclio, solifenacina, telenzepina, tio- trópio, tolterodina, tri-hexifenidila, tripitramina, UH-AH 37, umeclidínio e VUO0255035.
138. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é EDNRB.
139. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 138, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EDNRB é selecionado dentre o grupo que consiste em: A192621, ambrisentan, atrasentan, bo- sentan (RO 470203, Tracleer), BQ788, IRL 2500, K-8794, macitentan, RES7011, Ro 46-8443, SB209670, SB217242 (enrasentan), TAK 044 e tezosentan (RO610612).
140. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é HRH1.
141. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 140, caracterizado pelo fato de que o inibidor de HRH1 é selecionado dentre o grupo que consiste em: (-)-clorfeniramina, (+)-clorfeniramina, (- )- trans-H 2-PAT, (+)- cis-H 2-PAT, (+)- trans-H 2-PAT, (+)- cis-H 2-PAT, (+)- trans-H 2-PAT, (R)-cetirizina, (S)-cetirizina, 9-OH-risperidona, A- 317920, A-349821, ABT-239, alimemazina, amitriptilina, aripiprazol, ar- promidina, asenapina, astemizol, AZD3778, azelastina, BU-E 47, cetiri- zina, clorfeniramina, clorpromazina, ciproxifano, clemastina, clobempro- pite, clozapina, conessina, ciclizina, cipro-heptadina, desloratadina, di-
fenidramina, dosulepina, doxepina, epinastina, fexofenadina, flufena- zina, fluspirileno, haloperidol, hidroxizina, impromidina, INCB-38579, JNJ-39758979, cetotifeno, loratadina, loxapina, MK-0249, molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, pipamperona, pitolisante, prometa- zina, pirilamina, quetiapina, risperidona, sertindol, terfenadina, tiorida- zina, tiotixeno, trifluoperazina, tripelenamina, triprolidina, Zziprasidona e zotepina.
142. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é MLNR.
143. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 142, caracterizado pelo fato de que o inibidor de MLNR é selecionado dentre o grupo que consiste em: GM-109, MA-2029 e OHM-11526.
144. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é NTSR1.
145. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o inibidor de NTSR1 é selecionado dentre o grupo que consiste em: Meclinertant, SR48527, SR48692 e SR142948A.
146. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 122, caracterizado pelo fato de que o GPCRx é TACR3.
147. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação
146, caracterizado pelo fato de que o inibidor de TACR3 é selecionado dentre o grupo que consiste em: [Trp 7, B-Ala *] neurocinina A-(4-10), AZD2624, FK 224, GR138676, GSK 172981, GSK 256471, N',2-dife- nilquinolina-4-carboidrazida 8m, N',2-difenilquinolina-4-carboidrazida, osanetant, PD 154740, PD 161182, PD157672, saredutant, SB 218795, SB 222200, SB 235375, SCH 206272, SSR 146977 e talnetant.
148. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 147, caracterizado pelo fato de que o respec- tivo agonista de GPCRx seletivo é ligante natural do respectivo GPCRx, respectivamente.
149. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 148, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente detectar o heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer.
150. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 149, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente identificar o heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer.
151. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 150, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente: i) obter, ou ter obtido, uma amostra bioló- gica do paciente com câncer; ii) conduzir, ou ter conduzido, um ensaio de diagnóstico para determinar a presença, identidade, ou presença e identidade, de um heterômero CXCR4-GPCRXx na amostra biológica ob- tida do paciente com câncer; e iii) selecionar o inibidor ou combinação de inibidores para suprimir sinalização a jusante aprimorada do heterô- mero CXCR4-GPCRx.
152. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 151, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em câncer de mama, câncer pulmonar, câncer de cérebro, câncer de rim, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer da próstata, melanoma, mieloma múltiplo, cânceres gastrointestinais, carcinoma de célula renal, sarcomas de tecido mole, carcinoma hepatocelular, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de esôfago e leucemia.
153. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 152, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica de um paciente é uma amostra de fluido biológico.
154. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 153, caracterizado pelo fato de que uma biopsia líquida é realizada na amostra de fluido biológico.
155. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 153 ou 154, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido bioló- gico é uma amostra sanguínea, uma amostra de plasma, uma amostra de saliva, uma amostra de fluido cerebral, uma amostra de fluido ocular ou uma amostra de urina.
156. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 152, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica de um paciente é uma amostra de tecido biológico.
157. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 156, caracterizado pelo fato de que uma biopsia líquida é realizada na amostra de tecido biológico.
158. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 156 ou 157, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido bioló- gico é uma amostra de tecido de órgão, uma amostra de tecido ósseo ou uma amostra de tecido tumoral.
159. Método de tratamento de câncer num paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimorada caracterizado pelo fato de que o método compreende: 1) determinar se o paciente tem a célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinali- zação a jusante aprimorada: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente; e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determinar se: i) a célula cancerígena de um pa- ciente contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; ou ii) um reagente se- letivo de heterômero CXCR4-GPCRx: altera propriedades específicas de heterômero ou função do dito heterômero CXCR4-GPCRxX numa cé- lula (ou células) derivada de um paciente; altera propriedades especiífi- cas de heterômero de uma célula (ou células) derivada de um paciente que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; ou diminui a proliferação de célula de uma célula (ou células) derivada de um paciente que con- tém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; e 2) se o paciente tem uma cé- lula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx; e 3) se o paciente não tem uma célula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer o inibidor de CXCRA4 ou o inibidor de GPCRx como um inibidor único.
160. Método de tratamento de câncer num paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinalização a jusante aprimorada caracterizado pelo fato de que o método compreende: 1) determinar se o paciente tem a célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx que tem sinali- zação a jusante aprimorada: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente; e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determinar se: i) a célula cancerígena de um pa- ciente contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; ou li) um reagente se- letivo de heterômero CXCR4-GPCRx: altera propriedades específicas de heterômero ou função do dito heterômero CXCR4-GPCRxX numa cé- lula (ou células) derivada de um paciente; altera propriedades especiífi- cas de heterômero de uma célula (ou células) derivada de um paciente que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; ou diminui a proliferação de célula de uma célula (ou células) derivada de um paciente que con- tém o dito heterômero CXCR4-GPCRx; e 2) se o paciente tem uma cé- lula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4- GPCRx; e 3) se o paciente não tem uma célula cancerígena que contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com câncer o inibidor de CXCRA4 ou o inibidor de GPCRx como um inibidor único; em que: a) a progressão do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRx é diminuída na faixa de 5 a 100% mais mediante administração da com- binação de inibidores, em relação à administração do inibidor de CXCR4 ou inibidor de GPCRx como o inibidor único ao dito paciente; b) a eficá- cia de um inibidor de CXCR4 é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRx ao pa- ciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-GPCRXx, em relação à eficácia do inibidor de CXCR4 quando administrado como um inibidor único; e/ou c) a eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de CXCR4 ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém heterômero CXCR4-GPCRx, em rela- ção à eficácia do inibidor de GPCRx quando administrado como um ini- bidor único.
161. Método de tratamento de câncer num paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx caracterizado pelo fato de que o método compreende: 1) determinar se a célula cancerígena de um paciente contém o heterômero CXCRA4- GPCRx: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determinar se o dito heterômero CXCR4-GPCRx está presente na cé- lula cancerígena de um paciente; em que: a) o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; e b) o ensaio realizado na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hibridiza- ção in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um en- saio com base em proximidade, um ensaio de co-imunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA), citometria de fluxo, RNAsegq, gRT-PCR, microarranjo, ou um ensaio animal fluorescente; e 2) se a célula cancerígena de um paciente contém o dito heterômero
CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com cân- cer uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que con- siste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx; e 3) se a célula cancerígena de um pa- ciente não contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, adminis- trar internamente ao paciente com câncer o inibidor de CXCRA4 ou o ini- bidor de GPCRx como um inibidor único.
162. Método de tratamento de câncer num paciente que tem uma célula cancerígena que contém um heterômero CXCR4-GPCRx caracterizado pelo fato de que o método compreende: 1) determinar se a célula cancerígena de um paciente contém o heterômero CXCRA4- GPCRx: obtendo-se, ou ter obtido, uma amostra biológica do paciente e realizando-se, ou ter realizado, um ensaio na amostra biológica para determinar se o dito heterômero CXCR4-GPCRx está presente na cé- lula cancerígena de um paciente; em que: a) o GPCRx do heterômero CXCR4-GPCRx é selecionado dentre o grupo que consiste em: ADCYAP1R1, ADORAZB, ADORA3, ADRB2, C5AR1, CALCR, CHRM1, EDNRB, HRH1, MLNR, NTSR1 e TACR3; e b) o ensaio realizado na amostra biológica é ou compreende um ou mais dentre os seguintes: um ensaio de cointernalização, um ensaio de colocalização, hibridiza- ção in situ, imuno-histoquímica, microscopia imunoeletrônica, um en- saio com base em proximidade, um ensaio de co-imunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA), citometria de fluxo, RNAseq, gRT-PCR, microarranjo ou um ensaio animal fluorescente; e 2) se a célula cancerígena de um paciente contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, administrar internamente ao paciente com cân- cer uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que con- siste em: um inibidor de CXCRA, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx,; e 3) se a célula cancerígena de um pa-
ciente não contém o dito heterômero CXCR4-GPCRx, então, adminis- trar internamente ao paciente com câncer o inibidor de CXCRA ou o ini- bidor de GPCRX como um inibidor único; em que: a) a progressão do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o he- terômero CXCR4-GPCRx é diminuída na faixa de 5 a 100% mais medi- ante administração da combinação de inibidores, em relação à adminis- tração do inibidor de CXCRA4 ou inibidor de GPCRx como o inibidor único ao dito paciente; b) a eficácia de um inibidor de CXCR4 é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o ini- bidor de GPCRx ao paciente que tem a dita célula cancerígena que con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de CXCRA4 quando administrado como um inibidor único; e/ou c) a eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de CXCRA4 ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém heterômero CXCR4-GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando administrado como um inibidor único.
163. Método de tratamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 159 a 162, caracterizado pelo fato de que a progres- são do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx é diminuída na faixa de 5 a 100% mais mediante administração da combinação de inibidores, em relação à administração do inibidor de CXCR4 ou inibidor de GPCRx como o inibidor único ao dito paciente.
164. Método de tratamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 159 a 163, caracterizado pelo fato de que a eficácia de um inibidor de CXCRA4 é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRXx ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4-
GPCRXx, em relação à eficácia do inibidor de CXCR4 quando adminis- trado como um inibidor único.
165. Método de tratamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 159 a 164, caracterizado pelo fato de que a eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de CXCRA4 ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4- GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando adminis- trado como um inibidor único.
166. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 165, caracterizado pelo fato de que a progres- são do câncer no paciente que tem a dita célula cancerígena que con- tém o heterômero CXCR4-GPCRx é diminuída na faixa de 5 a 100% mais mediante administração da combinação de inibidores, em relação à administração do inibidor de CXCRA4 ou inibidor de GPCRX como o inibidor único ao dito paciente.
167. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 166, caracterizado pelo fato de que a eficácia de um inibidor de CXCRA4 é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de GPCRx ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4- GPCRXx, em relação à eficácia do inibidor de CXCR4 quando adminis- trado como um inibidor único.
168. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 167, caracterizado pelo fato de que a eficácia de um inibidor de GPCRx é aumentada na faixa de 5 a 2000% quando administrado em combinação com o inibidor de CXCRA4 ao paciente que tem a dita célula cancerígena que contém o heterômero CXCR4- GPCRx, em relação à eficácia do inibidor de GPCRx quando adminis- trado como um inibidor único.
169. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 168, caracterizado pelo fato de que o método administra uma combinação de inibidores selecionados dentre o grupo que consiste em: um inibidor de CXCRA4, um inibidor de GPCRx e um inibidor do heterômero CXCR4-GPCRx.
170. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 169, caracterizado pelo fato de que o método administra uma combinação de um inibidor de CXCR4 e um inibidor de GPCRx.
171. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 170, caracterizado pelo fato de que a adminis- tração da combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante apri- morada do dito heterômero CXCR4-GPCRx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 2000 vezes, em relação à administração de inibidor único.
172. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 171, caracterizado pelo fato de que o método administra um inibidor de heterômero CXCR4-GPCRx.
173. Método de tratamento, método de supressão, composi- ção farmacêutica ou kit farmacêutico, como definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 172, caracterizado pelo fato de que a adminis- tração do inibidor ou combinação de inibidores suprime a sinalização a jusante aprimorada do dito heterômero CXCR4-GPCRXx no paciente com câncer na faixa entre 5 e 2000 vezes, em relação à supressão da sinalização a jusante de um promotor de CXCRA4 ou um promotor de GPCRx em seu respectivo contexto de promotor individual.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112020012075A2 (pt) 2017-12-19 2020-12-01 Gpcr Therapeutics, Inc. inibidores de heterômero gpcr e usos dos mesmos
JP2021517164A (ja) 2018-03-05 2021-07-15 テオン セラピューティクス，インク． アデノシン受容体アンタゴニストおよびその使用
SG11202109724QA (en) * 2019-03-06 2021-10-28 Inmed Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for biosynthesis of terpenoids or cannabinoids in a heterologous system
KR20210156849A (ko) * 2019-05-17 2021-12-27 주식회사 지피씨알 Gpcr 헤테로머 저해제들 및 이의 용도
CN110755431B (zh) * 2019-11-08 2023-02-28 暨南大学 地氯雷他定在制备抗肝癌药物中的应用
JPWO2022025168A1 (pt) * 2020-07-30 2022-02-03
KR20230051519A (ko) 2020-08-15 2023-04-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 칼시토닌 수용체 (calcr)를 인코딩하는 변이체 핵산 분자를 갖는 대상체에서 비만의 치료
CN112807425A (zh) * 2021-01-14 2021-05-18 南方医科大学深圳医院 一种tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用
US20240158856A1 (en) * 2021-08-04 2024-05-16 Hangzhou Zheda Dixun Biological Gene Engineering Co., Ltd Primer probe set for human histamine receptor hrh1 mrna detection, kit and detection method
CN114574580B (zh) * 2022-02-14 2022-11-29 山东大学 靶向a2br联合化疗在三阴性乳腺癌治疗中的应用
WO2023211779A1 (en) * 2022-04-25 2023-11-02 Kallyope, Inc. Treatment of headache disorders with nk3 modulators
WO2023239937A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 Gpcr Therapeutics, Inc. Gpcr inhibitors and uses thereof
CN114891742B (zh) * 2022-06-23 2024-06-04 杭州中赢生物医疗科技有限公司 一种强杀伤性nk细胞的培养基及体外扩增方法
CN116298305B (zh) * 2023-01-03 2024-05-28 郑州大学 一种抗nt5c1a自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998000538A2 (en) 1996-07-01 1998-01-08 Biosignal Inc. Peptides and peptidomimetic compounds affecting the activity of g-protein-coupled receptors by altering receptor oligomerization
WO1998000715A2 (en) 1996-07-01 1998-01-08 Biosignal Inc. Method of assaying compounds which affect the activity of g protein-coupled receptors based on measurement of receptor oligomerization
US6855807B1 (en) 1999-06-16 2005-02-15 New York University Heterodimeric opioid G-protein coupled receptors
US20010053848A1 (en) 2000-03-10 2001-12-20 Patel Yogesh C. Hetero-oligomeric G protein-coupled receptors as novel drug targets
SI1411918T1 (sl) * 2001-07-31 2012-04-30 Genzyme Global S A R L Postopki za mobilizacijo progenitorskih/matičnih celic
AU2004241193B2 (en) 2003-05-20 2011-03-10 The University Court Of The University Of Glasgow Materials and methods relating to G-protein coupled receptor oligomers
WO2005103721A1 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with cxc chemokine receptor 4 (cxcr4)
CA2640087A1 (en) * 2006-01-25 2007-08-02 Mount Sinai School Of Medicine Methods and compositions for modulating the mobilization of stem cells
US20090028832A1 (en) * 2006-08-10 2009-01-29 Chung Leland F Compositions and methods for targeted tumor therapy
MX2010012518A (es) 2008-05-16 2010-12-06 Ablynx Nv Secuencias de aminoacidos dirigidas contra cxcr4 y otros receptores acoplados a proteina g y compuestos que comprenden los mismos.
US20110160081A1 (en) 2008-07-01 2011-06-30 Javitch Jonathan A functional complementation assay for defined gpcr oligomers
FR2949156B1 (fr) 2009-08-13 2016-04-15 Cis-Bio Int Methode de determination de la liaison d'un compose donne a un recepteur membranaire
WO2011091435A2 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Mount Sinai School Of Medicine Methods of treating liver disease
JP2011168567A (ja) * 2010-02-22 2011-09-01 Kyoto Univ 再発癌の予防または治療用医薬
KR101029972B1 (ko) 2010-06-18 2011-04-20 서울대학교산학협력단 바이러스 벡터를 이용하여 단백질의 상호작용을 측정하는 방법
WO2012047339A2 (en) * 2010-06-28 2012-04-12 The General Hospital Corporation Anti-cxcr4 as a sensitizer to cancer therapeutics
WO2012058241A2 (en) * 2010-10-26 2012-05-03 University Of South Alabama Methods and compositions for ameliorating pancreatic cancer
KR102048718B1 (ko) * 2013-08-02 2019-11-26 화이자 인코포레이티드 항-cxcr4 항체 및 항체-약물 접합체
WO2015019284A2 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 Cambridge Enterprise Limited Inhibition of cxcr4 signaling in cancer immunotherapy
CN103536594A (zh) * 2013-10-21 2014-01-29 江苏亚虹医药科技有限公司 G蛋白偶联受体拮抗剂在用于制备治疗谷氨酸受体高表达肿瘤药物中的用途
WO2015095973A1 (en) 2013-12-23 2015-07-02 Université de Montréal Systems and methods for the monitoring of protein complex formation in cells
ES2924394T3 (es) * 2015-01-09 2022-10-06 Adalta Ltd Moléculas de unión a CXCR4
WO2017020128A1 (en) * 2015-08-03 2017-02-09 Université de Montréal Markers for acute myeloid leukemias with core binding factor rearrangements and other genetic subtypes and uses thereof
BR112020012075A2 (pt) 2017-12-19 2020-12-01 Gpcr Therapeutics, Inc. inibidores de heterômero gpcr e usos dos mesmos

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