CN114574580B - 靶向a2br联合化疗在三阴性乳腺癌治疗中的应用 - Google Patents

靶向a2br联合化疗在三阴性乳腺癌治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供靶向A2BR联合化疗在三阴性乳腺癌治疗中的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明通过研究发现，在三阴性乳腺癌患者中，A2BR与不良的临床结果相关，而化疗诱导的A2BR表达介导了细胞多能因子的表观遗传激活，并促进了乳腺癌细胞的干性，靶向A2BR联合化疗可阻断BCSC的富集，进而改善TNBC的预后。本发明公开了化疗诱导的腺苷A2B受体表达介导细胞多能因子的表观遗传调控并促进乳腺癌细胞干性的新机制，并为乳腺癌特别是三阴性乳腺癌患者提供了有前景的治疗策略，从而提高TNBC妇女的存活率，因此具有良好的潜在实际应用之价值。

Description

靶向A2BR联合化疗在三阴性乳腺癌治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及靶向A2BR联合化疗在三阴性乳腺癌治疗中的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
三阴性乳腺癌(TNBC)是一种雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达缺失的乳腺癌亚型。TNBC的侵袭性很强：大约46％的TNBC患者发生远处转移，这是患者死亡的主要原因，而转移性TNBCs患者的中位生存期仅为13.3个月。TNBC预后很差，部分原因是缺乏针对性治疗。作为TNBC的主要治疗手段，细胞毒性化疗最初减少了肿瘤体积，但大多数患者有残留疾病或复发。因此，迫切需要更好地了解化疗耐药的机制，以提高TNBC治疗的疗效。
乳腺癌干细胞(BCSCs)是乳腺癌细胞中一个小而动态的亚群，在癌症转移中起着关键作用。BCSCs具有无限的增殖潜能和致瘤特性，并且对化疗耐药。以往的研究表明，在杀死50％癌细胞的药物浓度(IC50)下，不同的化疗药物治疗后，BCSC的数量平均增加了4倍，这表明BCSCs和非干细胞之间对化疗的不同生存期不能解释化疗前后BCSCs百分比的观察到的差异。对这一悖论的解释是，化疗诱导了乳腺癌非干细胞向乳腺癌干细胞的活跃转化。
化疗诱导BCSC富集的一个主要机制是化疗后细胞多能因子NANOG、SOX2、OCT4和KLF4表达增加。细胞多能因子是胚胎干细胞(ESCs)自我更新和多能性的主要调节因子，也是维持和规范BCSCs所必需的。在ESCs中，细胞多能因子的调节和作用已经被很好的阐明，它们协调激活多能相关因子的表达，并形成一个前馈环来调节彼此和自身的表达。然而，在肿瘤干细胞中，调节细胞多能因子表达的分子机制仍尚不清楚。
据报道，肿瘤干细胞中多能因子的表达除了受到STAT3、HIF-1、GLI1、AR和FOXO3等转录因子的调控外，还受到不同转录因子在转录水平上的调控。染色质结构的表观遗传调控通过控制转录因子对基因组DNA的可及性，在激活或抑制多能性因子基因转录方面起着关键作用。DNA可及性是通过两类酶复合物动态改变染色质结构，即染色质重塑来调节的：一类是ATP依赖的染色质重塑复合物，其作用是将核小体沿DNA重新定位并将组蛋白逐出DNA；另一类是组蛋白修饰酶，它共价修饰组蛋白尾部。有研究表明，组蛋白去甲基化酶KDM6A/UTX在乳腺癌化疗反应中多能因子基因转录的调节中发挥重要作用。但是依赖ATP的染色质重塑复合物是如何参与这一过程的还很大程度上是未知的。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供靶向A2BR联合化疗在三阴性乳腺癌治疗中的应用。本发明通过研究发现，在TNBC患者中，A2BR与不良的临床结果相关，而化疗诱导的A2BR表达介导了细胞多能因子的表观遗传激活，并促进了乳腺癌细胞的干性。靶向A2BR联合化疗可阻断BCSC的富集，进而改善TNBC的预后。基于上述研究成果，从而完成本发明。
本发明的第一个方面，提供A2BR编码基因及其表达产物在制备用于诊断、检测、监测或预测三阴性乳腺癌的进展的产品中的应用。
所述产品能够通过检测A2BR编码基因(ADORA2B)和/或A2BR编码基因表达产物的表达水平来诊断、检测、监测或预测三阴性乳腺癌的进展；试验证明，A2BR在TNBC中的表达明显高于ER/PR+和HER2+乳腺癌，同时通过分析A2BR表达与TNBC患者生存的相关性，结果表明中位数以上的A2BR水平与TNBC患者队列中无复发生存率的降低显著相关，而当分析接受化疗的TNBC患者时，生存率差异更大，进一步的，研究发现在1、3或5年内发生转移的乳腺癌患者的14个原发肿瘤中A2BR的表达高于在同一时间点没有转移的患者。上述研究结果表明A2BR的(高)表达与TNBC患者的BCSC表型、肿瘤转移和不良预后紧密相关；其中，所述TNBC患者包括接受化疗的TNBC患者；所述预后包括无复发生存率。
其中，所述A2BR编码基因及其表达产物均可为人源；A2BR编码基因(ADORA2B)的表达产物显然可以为A2BR蛋白，其为腺苷受体中的一种。
本发明的第二个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测三阴性乳腺癌的进展的产品，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样品中ADORA2B的转录；或基于免疫检测方法检测样品中A2BR表达情况的物质。
本发明的又一具体实施方式中，可以采用包括但不限于液相杂交、Northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交检测样品中ADORA2B的转录；采用包括但不限于ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片检测样品中A2BR表达情况。
所述样品可以为受试者乳腺相关样品，如乳腺细胞、组织及血液、淋巴液等。
所述产品可以为试剂盒。
本发明的第三个方面，提供抑制A2BR编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下a1)-a6)至少一种中的应用：
a1)抑制化疗诱导的BCSC富集或制备抑制化疗诱导的BCSC富集的产品；
a2)延缓化疗后肿瘤复发或制备延缓化疗后肿瘤复发的产品；
a3)相互调节H3K27me3和H3K27ac染色质标记，抑制FOXO3与细胞多能因子基因的结合或制备相互调节H3K27me3和H3K27ac染色质标记，抑制FOXO3与细胞多能因子基因的结合的产品；
a4)抑制p38MAPK的激活，进而抑制FOXO3结合和多能性因子基因的表达或制备抑制p38MAPK的激活，进而抑制FOXO3结合和多能性因子基因的表达的产品；
a5)抑制p38MAPK的激活，进而抑制SMARCD3核转位和FOXO3向细胞多能因子基因募集或制备抑制p38MAPK的激活，进而抑制SMARCD3核转位和FOXO3向细胞多能因子基因募集的产品；
a6)治疗肿瘤或制备治疗肿瘤的产品。
抑制A2BR编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对A2BR的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对A2BR本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗A2BR抗体。
其中，所述细胞多能因子包括但不限于NANOG、SOX2、OCT4和KLF4，进一步优选为NANOG、SOX2和KLF4。
所述肿瘤可以为乳腺癌，进一步为三阴性乳腺癌。
所述化疗过程中使用的化疗药物不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，所述化疗药物包括紫杉醇和卡铂；
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
本发明的第四个方面，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括抑制A2BR编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质和化疗药物。
其中，所述抑制A2BR编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对A2BR的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂(如四氧嘧啶)、shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对A2BR本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗A2BR抗体；
所述化疗药物不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，所述化疗药物包括紫杉醇和卡铂。
在本发明的一个具体实施方式中，所述组合物其活性成分为四氧嘧啶和紫杉醇，二者质量比为1～2:1，优选为2:1。
本发明的第五个方面，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
b1)抑制化疗诱导的BCSC富集或制备抑制化疗诱导的BCSC富集的产品；
b2)延缓化疗后肿瘤复发或制备延缓化疗后肿瘤复发的产品；
b3)治疗肿瘤或制备治疗肿瘤的产品。
所述肿瘤可以为乳腺癌，进一步为三阴性乳腺癌；
所述化疗过程中使用的化疗药物不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，所述化疗药物为紫杉醇；
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
优选的，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
优选的，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
优选的，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次报道化疗增加A2BR的蛋白水平，这有助于化疗诱导的细胞多能因子表达和TNBC中BCSC的富集。A2BR介导了p38MAPK的激活、染色质重塑因子SMARCD3的核移位以及组蛋白去甲基化酶KDM6A和组蛋白乙酰转移酶p300与细胞多能因子基因NANOG、SOX2和KLF4特异性的相互作用和募集——KDM6A和p300的募集减少了组蛋白H3K27me3，增加了H3K27ac标记，增加了转录因子FOXO3与NANOG、SOX2和KLF4基因的结合，导致这些基因的转录激活和BCSC的规范。A2BR的基因或药物抑制阻断了化疗介导的多能因子基因的表观激活和体内外BCSC的富集，并延缓了化疗停止后的肿瘤复发。
综上，上述技术方案公开了化疗诱导的腺苷A2B受体表达介导细胞多能因子的表观遗传调控并促进乳腺癌细胞干性的新机制，并为乳腺癌特别是三阴性乳腺癌患者提供了有前景的治疗策略，从而提高TNBC妇女的存活率，因此具有良好的潜在实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中化疗诱导的A2BR表达促进了多能性因子的表达和BCSC的表型。A、用赋形剂(V)、紫杉醇(P)、卡铂(C)的IC50浓度处理乳腺癌细胞72h，免疫印迹法检测A2BR蛋白表达。B-C、MDA-MB-231细胞植入雌性SCID小鼠乳房脂肪垫(MFP)。当肿瘤体积达到200mm3(第0天)时，随机分为V、P(第0、5、10天10mg/kg)或C(第0、5、10天20mg/kg)治疗组。第13天取肿瘤标本进行免疫印迹分析。免疫印迹(B)密度计量学分析结果(C)为平均值±标准差(n＝4)，**p<0.01，*p<0.001 vs.V。D，MDA-MB-231和SUM159细胞在标准聚苯乙烯组织培养板(粘附板)或超低粘附板(球体)上培养7d，收获A2BR蛋白表达。用载体(V)或10nM紫杉醇(P)处理稳定转染非靶向对照shRNA(NTC)载体或靶向A2BR的两种不同shRNA(#1和#2)。E-G、MDA-MB-231亚克隆细胞培养72h，观察A2BR蛋白28(E)的表达、ALDH+细胞百分率(F；均值±SEM；n＝3)和每千个接种细胞的mammosphere数量(G；均值±标准差；n＝4)**p<0.01，***p<0.001 vs.NTC-V；##p<0.01,###p<0.001 vs.NTC-P；ns,not significant。H-I、用10nM紫杉醇、10μM四氧嘧啶和/或10nM四氧嘧啶处理72h，测定每千个细胞中ALDH+细胞百分率(H；均值±扫描电镜；n＝3)和mammosphere数量(I；均值±标准差；n＝4)；*p<0.001，*p<0.001 vsV；##p<0.01 vs.P；ns,not significant。J-K、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆用V或10nM P处理72h，进行RT-qPCR(J；Mean±SEM；n＝3)和免疫印迹(K)检测。在(J)中，*p<0.05，*p<0.001 vs NTC-V；##p<0.01，##p<0.001 vs NTC-P；ns，无显著差异。
图2为本发明实施例中抑制A2BR可阻断紫杉醇诱导的BCSC富集，并延缓体内肿瘤复发。A-D，2×106MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除(A2BRKD)亚克隆细胞植入SCID小鼠的MFP内。当肿瘤体积达到200mm3(第0天)时，随机分组给予赋形剂(V)或紫杉醇(P：10mg/kg，第0、5、10天)，每隔2～3天测量肿瘤体积29。第13天取肿瘤进行ALDH(B)、mammosphere(C)和RT-qPCR(D)检测。数据表现为均值±标准差(n＝5)；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 vs.NTC-V；#p<0.05,##p<0.01 vs.NTC-P；ns,not significant。E-H、MMTV-PyMT转基因小鼠接受赋形剂(V)、紫杉醇(P；5mg/kg，第0、5和10天)、四氧嘧啶(Allo；10mg/kg，第0-13天)或P+Allo治疗。每隔2～3d测量肿瘤体积(E)。第13天取肿瘤进行ALDH(F)、mammosphere(G)和RT-qPCR(H)检测。数据表现为均值±标准差(n＝5)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 vs.V；#p<0.05,##p<0.01 vs.P；ns,not significant。I、将2×106的MDA-MB-231NTC或A2BRKD亚克隆细胞植入SCID小鼠的MFP内。当肿瘤可触及时，每隔5天用10nM紫杉醇治疗一次，直到肿瘤不再可触到为止。绘制无瘤(左)、有瘤(中)、无复发(右)的Kaplan-Meier生存曲线，经对数秩和检验p值(n＝6)。
图3为本发明实施例中化疗诱导的A2BR表达通过减少H3K27me3和增加H3K27ac染色质标记促进FOXO3与多能因子基因的结合。A-B、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆分别转染pLX304(空载体，EV)或编码A2BR基因的pLX304。用赋形剂(V)或10nM紫杉醇(P)处理细胞72h，用FOXO3抗体进行染色质免疫沉淀(CHIP)。用NANOG、SOX2和KLF4基因(A)FOXO3结合位点两侧的引物进行qPCR(B；均值±标准差；n＝3)；**p<0.01,***p<0.001vs.NTC/EV-V；#p<0.05,##p<0.01 vs.NTC/EV-P；^^p<0.01,^^^p<0.0001 vs.A2BR shRNA/EV-P；ns,notsignificant.。C-E、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆经V或P处理72h后进行免疫印迹分析。D、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆用V或P处理72h，制备胞浆和胞核裂解物，并进行免疫印迹分析。F-H、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆用V或10nM P处理72h，用抗H3K27me3(F)、H3K27ac(G)或组蛋白H3(H)的抗体进行芯片，然后在NANOG、SOX2和KLF4基因FOXO3结合位点两侧用引物进行qPCR(Mean±SEM；n＝3)；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs.NTC-V；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001 vs.NTC-P；ns,not significant。
图4为本发明实施例中A2BR通过在多能因子基因的FOXO3结合位点募集KDM6A和p300，减少H3K27me3，增加H3K27ac标记。A-B、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆分别转染pLX304(空载体，EV)或编码A2BR基因的pLX304。用抗KDM6A(A)或p300(B)的抗体进行芯片，然后在NANOG、SOX2和KLF4基因的FOXO_3结合位点两侧用引物进行定量PCR(Mean±SEM；n＝3)；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 vs.NTC-V；##p<0.01,###p<0.001 vs.NTC-P；^^p<0.01,^^^p<0.0001 vs.A2BR shRNA/EV-P；ns,not significant。C、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆经V或P处理72h后进行免疫印迹分析。D、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆用V或P处理72h，制备核裂解产物。用FOXO3抗体或对照IgG进行免疫沉淀(IP)，然后用免疫印迹法检测。NL，核蛋白裂解物。
图5为本发明实施例中A2BR通过激活p38MAPK促进FOXO3结合和多能性因子基因的表达。用10nM紫杉醇(P)单独或与10μM四氧嘧啶(A2BRi)、2.5μM H 89(PKAI)、1μM
Figure GDA0003818443800000071
(PKCαI)、1μM rotlerin(PKCδI)、1μM MK 2 206(AkTI)或5μM SB2 0 35 80(P38i)联合作用72h。B、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆分别用赋形剂(V)或10nM紫杉醇(P)处理72h，进行免疫印迹分析。C、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆在不加(-)或(+)5μM腺苷处理72h后进行免疫印迹分析。分别用10nM紫杉醇、5μM SB203580和5nM紫杉醇处理细胞72h，用FOXO3抗体进行芯片扩增，然后在NANOG、SOX2和KLF4基因的FOX_3结合位点两侧加引物进行定量PCR(Mean±SEM；n＝4)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 vs.V；##p<0.01,###p<0.001vs.P。E-H、当肿瘤累积体积达到150mm3时，用V、P(5mg/kg，第0、5、10天)、LY2228820(LY；10mg/kg，第0-13天)或P+LY治疗MMTV-PyMT转基因小鼠。每隔2～3d测量肿瘤体积(E)。第13天取肿瘤进行ALDH(F)、乳房mammosphere(G)和RT-qPCR(H)检测。数据表现为均值±标准差(n＝5)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 vs.V；#p<0.05,##p<0.01 vs.P；ns,notsignificant。
图6为本发明实施例中化疗诱导的A2BR表达和p38激活促进SMARCD3核转位和与多能性因子基因的结合。A、MDA-MB-231细胞分别用赋形剂(V)或10nM紫杉醇(P)处理72h，不加SB203580(-)或不加SB203580(+)，制备胞浆和胞核裂解物，免疫印迹法检测SMARCD3亚细胞定位。B、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆用V或10nM P处理72h，制备胞浆和胞核裂解物，免疫印迹法检测SMARCD3亚细胞定位。C、MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆用V或10nM P处理72h，制备核裂解产物。用SMARCD3抗体或对照IgG进行免疫沉淀(IP)，然后用免疫印迹法检测。NL，核蛋白裂解物。D、mda-MB-231细胞分别用10nM P、5μM SB203580和5nMSB203580处理72h，34个细胞用SMARCD3抗体进行芯片扩增，然后在NANOG、SOX2和KLF4基因的FOXO3结合位点两侧加引物进行定量PCR(Mean±SEM；n＝4)，*p<0.05，**p<0.01 vs.v；#p<0.05，##p<0.01 vs P.E，MDA-MB-2 31NTC或A2Br基因敲除亚克隆用V或10nM P处理72h，芯片用SMARCD3抗体，然后在NANOG，SOX2和KLF4基因FOXO 3结合位点两侧加引物进行定量PCR(Mean±SEM；n＝4)；*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001 vs.NTC-V，*p<0.01，*p<0.01，*p<0.05，*p<0.01，*p<0.01 vs NTC-V；#p<0.001，##p<0.01，#p<0.01 vs.NTC-P。
图7为本发明实施例中SMARCD3基因敲除阻断紫杉醇诱导的FOXO3与多能性因子基因的结合并抑制BCSC富集。A、将编码NTC的载体或两个针对SMARCD3的shRNA(#1和#2)分别转染MDA-MB-231细胞，进行免疫印迹实验。B-D、MDA-MB-231NTC或SMARCD3基因敲除亚克隆分别用赋形剂(V)或10nM紫杉醇(P)处理72h，分别进行ALDH+(B；Mean±SEM；n＝3)、mammosphere(C；Mean±SEM；n＝4)和qPCR(D；Mean±SEM；n＝3)检测：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 vs.NTC-V；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001 vs.NTC-P；ns,notsignificant。E、MDA-MB-231NTC或SMARCD3基因敲除株使用赋型剂(V)或紫杉醇(P)处理72h后。用抗FoxO3(E)、H3K27me3(F)、H3K27ac(G)、KDM6A(H)或p300(I)的抗体进行芯片扩增，然后在NANOG、SOX2和KLF4基因的FOXO3结合位点两侧加引物进行qPCR(均值±标准差；n＝4)；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 vs.NTC-V；##p<0.01,###p<0.001 vs.NTC-P；ns,notsignificant。
图8为本发明实施例中在TNBC患者中，A2BR与不良的临床结果相关。比较TCGA数据库中1,215例乳腺癌标本中不同亚型乳腺癌(TNBC，n＝123；ER/PR+，n＝615；HER2+，n＝124)中A，A2BRmRNA的表达；*p<0.001与TNBC组比较。B-C、Kaplan-Meier对198例TNBC患者(B)或89例接受化疗的TNBC患者(C)的临床和分子资料进行了无复发生存(RFS)分析。根据原发肿瘤中A2BR mRNA水平(高于(红色)或低于(黑色)中值水平)对患者进行分层。给出了危险比(HR)和P值(对数秩检验)。D-E、从TCGA数据库中检索到36个OSNK信号(多能因子基因NANOG、SOX2、OCT4和KLF4的mRNA)、A2BR mRNA水平、BCSC信号(由20个基因的转录本组成的BCSC信号)和OSNK信号(多能因子基因NANOG、SOX2、OCT4和KLF4的mRNA)。用Pearson‘s检验分析A2BR mRNA与BCSC信号(D)、OSNK信号(E)的相关性。F、来自GEO的2个数据集的临床和分子数据。比较1、3、5年有转移者(有)和无转移者(无转移者)的A2BRmRNA水平；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。G、提出了A2BR在多能性因子基因表达和BCSC对化疗反应的表观遗传调控中的模型。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
三阴性乳腺癌具有独特的分子生物学特性——侵袭性强并缺乏靶向治疗。化疗可以诱导细胞多能因子的表达，进而介导乳腺癌干细胞在三阴性乳腺癌中的干性增加，最终增加肿瘤复发和转移的风险以及患者的死亡率。研究表明，腺苷A2B受体(A2BR)的表达及其下游信号通路的激活可能促进乳腺癌转移。本发明进一步研究了A2BR在调节化疗诱导的乳腺癌干细胞富集中的作用。
首先，本发明在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系中构建了shRNA介导的A2BR基因敲除亚克隆，并通过Aldefluor and mammosphere体外实验评价了其对乳腺癌干细胞(BCSC)表型的影响。随后，用染色质免疫沉淀(ChIP)法检测转录因子FOXO3和组蛋白修饰酶KDM6A和P300在细胞多能因子调控区域的募集，以及这些区域上组蛋白修饰标记H3K27ac和H3K27me3的水平。最后，采用异种移植模型和基因工程的自体乳腺癌模型来评价A2BR对化疗诱导的BCSC体内富集的影响。
实验结果证明化疗增加了A2BR的蛋白水平，这有助于化疗诱导的细胞多能因子表达和TNBC中BCSC的富集。A2BR介导了p38MAPK的激活、染色质重塑因子SMARCD3的核移位以及组蛋白去甲基化酶KDM6A和组蛋白乙酰转移酶p300与细胞多能因子基因NANOG、SOX2和KLF4特异性的相互作用和募集——KDM6A和p300的募集减少了组蛋白H3K27me3，增加了H3K27ac标记，增加了转录因子FOXO3与NANOG、SOX2和KLF4基因的结合，导致这些基因的转录激活和BCSC的规范。A2BR的基因或药物抑制阻断了化疗介导的多能因子基因的表观激活和体内外BCSC的富集，并延缓了化疗停止后的肿瘤复发。
综上，化疗诱导的A2BR表达介导了细胞多能因子的表观遗传激活，并促进了乳腺癌细胞的干性。靶向A2BR联合化疗可能会阻断BCSC的富集，进而改善TNBC的预后。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.方法与材料
细胞培养和试剂
MDA-MB-231细胞在DMEM中维持，SUM159和SUM149细胞在DMEM/F12(50：50)中维持，均添加10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素。细胞在5％CO2、95％空气孵化器(20％O2)中保持在37℃。
慢病毒转染
编码针对A2BR和SMARCD3的shRNA的pLKO.1-puro慢病毒载体从Sigma-Aldrich购买，具体信息见表1。空载体pLx304购自Addgene，编码A2BR的pLx304载体购自DNASU。将慢病毒包装在293T细胞中，转染48h后收集病毒上清。用病毒上清加8μg/mL聚凝胺(MilliporeSigma)转染MDA-MB-231和SUM159细胞。24h后，用含0.5μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养液(MilliporeSigma)补充细胞，并保存在含嘌呤霉素的培养基中，筛选稳定转染的克隆。
表1
shRNA Clone ID
ADORA2B#1 NM_000676.2-926s21c1
ADORA2B#2 NM_000676.2-1478s21c1
SMARCD3#1 NM_003078.3-1190s21c1
SMARCD3#2 NM_003078.3-1052s21c1
免疫印迹实验
培养的细胞裂解在RIPA缓冲液(EMD微孔)中，而肿瘤组织裂解在RIPA缓冲液中，并用电动匀浆机匀浆。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白(50μg)，免疫印迹于硝酸纤维素膜上，并用一抗进行检测(表2)。用辣根过氧化物酶标记的二抗(GEHealthcare)探测膜，用ECL plus(GE Healthcare)检测化学发光信号。
表2
Figure GDA0003818443800000101
Figure GDA0003818443800000111
逆转录和定量PCR
总RNA用TRIzol(Invitrogen)提取，异丙醇沉淀，DNase(无DNA，Invitrogen)处理。以1μg总RNA为模板，应用cDNA逆转录试剂盒(Application Biossystems)合成cDNA，用SYBRGreen和CFX96Touch实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行定量聚合酶链反应(QPCR)分析。根据周期阈值(Ct)计算各靶基因相对18S rRNA的表达量为2-Δ(ΔCt)，其中ΔCt＝Ct(靶)-Ct(18S rRNA)，Δ(ΔCt＝ΔCt(测试样本)-ΔCt(对照样本)。
核质分离
培养细胞在低渗缓冲液(Roche)(10mM HEPES，1.5mM MgCl2，10mM KCl，0.5mMDTT，0.05％NP40，pH 7.9)中冰冻10min，4℃，3000rpm离心10min。取上清液保存为细胞质部分。再悬浮于含有蛋白酶抑制剂混合物的高盐细胞提取缓冲液(5mM HEPES，1.5mM MgCl2，0.2mM EDTA，0.5mM DTT，26％甘油，300mM NaCl，pH 7.9)中，在Dounce匀浆机中匀浆30次，冰上孵育30min，4℃，15000rpm离心30min，上清液保存为细胞核碎片。
Co-IP
将等量的核蛋白裂解产物(500μg)与对照免疫球蛋白或抗FOXO3(NOVUS，NBP2-16521)或SMARCD3(Santa Cruz，sc-101163)的抗体在4℃的蛋白GSepharose beads(Amersham Biosciences)存在下孵育一夜，然后对所得免疫沉淀物进行免疫印迹分析。
ALDH实验
ALDH测定是根据制造商的说明(AldeFluor，Stem Cell Technologies)进行的。培养细胞胰酶消化，肿瘤组织切碎，用1mg/mL的1型胶原酶(Sigma-Aldrich)37℃消化30min，通过70-μm细胞过滤器过滤。5×105细胞悬浮于含0.5μM BODIPY-氨基乙醛的测定缓冲液中，37℃孵育45min。每个样本的等量细胞用50mM的二乙氨基苯甲醛(一种ALDH抑制剂)处理，作为门控的阴性对照。用FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞仪对样品进行分析。
Mammosphere实验
培养细胞胰酶消化，肿瘤组织切碎，用1mg/mL的1型胶原酶(Sigma-Aldrich)37℃消化30min，通过70-μm细胞过滤器过滤。用台盼蓝染色测定活细胞数，将单细胞悬液接种于6孔超低贴壁平板(Corning)中，密度为5000个/mL，接种于完全MammoCult培养基(StemCell Technologies)中。7天后用相差显微镜(OLYPUS)拍摄mammosphere培养物，用ImageJ软件计数直径为50μm的mammosphere。
ChIP实验
培养细胞或切碎的肿瘤组织在3.7％甲醛中交联15min，在0.125mol/L甘氨酸中淬灭5min，用十二烷基硫酸钠裂解缓冲液裂解。染色质用超声波剪切，超声裂解产物用salmonsperm DNA/protein A agarose slurry(EMD Millipore)预清1小时，并在琼脂糖磁珠存在下与抗体孵育过夜。琼脂糖磁珠连续洗涤后，DNA在1％SDS/0.1mol/L NaHCO3中洗脱，0.2mol/L NaCl反转交联。通过酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化DNA，并用qPCR分析候选结合位点。
动物实验
动物规程经四川大学华西医院机构动物保护与利用委员会批准。在对SCID小鼠的检测中，将2×106个MDA-MB-231亲本或敲除亚克隆细胞按1：1的比例注射到5～7周龄雌性小鼠的MFP中，以1：1的比例将Matrigel(BD Biosciences)悬液注入PBS中。小鼠按指示用药治疗。对于MMTV-PyMT转基因小鼠的检测，当每只小鼠的乳腺肿瘤累积体积达到150mm3时，对小鼠进行治疗。测量原发肿瘤的长度(L)和宽度(W)，计算肿瘤体积(V)，计算公式为V＝L×W2×0.524。紫杉醇、卡铂、四氧嘧啶腹腔注射；LY2228820口服。
数据库分析
A2BR、NANOG、SOX2、OCT4、KLF4和BCSC特征基因mRNA在不同亚型原发性乳腺癌中的表达数据来自癌症基因组图谱(TCGA)浸润性癌基因表达数据集(ancergenome.nih.gov)。采用Pearson检验分析123例TNBC患者A2BR表达与BCSC信号和OSNK信号的相关性。Kaplan-Meier曲线来自一个包含3951名乳腺癌患者的基因表达和生存数据的数据集，并进行对数秩检验。A2BR在原发性乳腺癌患者数据集GSE25066和GSE2603中的表达可从GeneExpression Omnibus(ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取。
统计分析
所有数据均以均值±标准差表示。两组间的差异用双尾Student’s t检验进行分析，多组间的差异用单因素方差分析和后设检验进行分析。在所有分析中，p<0.05的值被认为是显著的。
2.结果
化疗诱导的A2BR表达促进多能性因子表达和BCSC表型
为了探讨化疗对A2BR表达的影响，我们将FDA批准的化疗药物紫杉醇和卡铂作用于TNBC细胞系MDA-MB-231(具有BRAF、CDKN2A、KRAS和TP53突变的侵袭性导管癌细胞)、SUM149(具有BRCA1突变的炎性导管癌细胞)和SUM159(具有PIK3CA和TP53突变的间变性癌细胞)，在药物的IC50作用72小时后，我们发现每种化疗药物都增加了所有这些细胞系中A2BR蛋白的水平(图1A)。随后我们将MDA-MB-231细胞移植到雌性严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的乳房脂肪垫(MFP)中，每隔5天给予紫杉醇10mg/kg或卡铂20mg/kg治疗一次，发现两种化疗药物均可提高体内A2BR蛋白水平(图1B-C)。
A2BR的表达已被报道促进乳腺癌的肿瘤转移。由于BCSC是能够形成临床相关转移肿瘤的癌细胞亚群，我们调查了A2BR在BCSC表型调控中的作用。我们将MDA-MB-231和SUM159细胞培养为乳腺细胞，丰富了BCSC群体，发现在非贴壁的乳腺细胞培养中，A2BR蛋白水平明显高于单层贴壁培养(图1D)，提示A2BR的表达与BCSC表型有关。
为了探讨A2BR在化疗诱导的BCSC富集中的作用，我们制备了MDA-MB-231(图1E)和SUM159细胞的shRNA介导的非靶向对照(NTC)或A2BR基因敲除亚克隆，用紫杉醇处理72h，并进行Aldefluor和mammosphere实验来测量BCSC的数量。紫杉醇处理NTC亚克隆后，具有乙醛脱氢酶活性的细胞百分比(ALDH+)显著增加(图1F)，并增加了mammosphere的数量(图1G)。A2BR基因敲除可阻断紫杉醇诱导的ALDH+细胞和mammosphere在两种细胞系中的富集(图1F-G)。通过联合应用A2BR特异性拮抗剂四氧嘧啶，A2BR的药理抑制作用也显著减弱紫杉醇诱导的ALDH+细胞和mammosphere在两种细胞系中的富集(图1H-I)，表明A2BR的表达和活性是化疗诱导的BCSCs富集所必需的(图1H-I)。在MDA-MB-231和SUM159细胞系中，A2BR基因敲除也阻断了紫杉醇诱导的细胞多能因子NANOG，SOX2和KLF4(但不是OCT4，它们的表达不被紫杉醇诱导)，这是维持和规范BCSCs所必需的，结果显示细胞多能因子诱导升高在mRNA(图1J)和蛋白质(图1K)水平上都是必需的。综上所述，这些数据表明化疗药物诱导A2BR蛋白表达，而A2BR蛋白是化疗诱导的细胞多能因子表达和BCSC富集所必需的。
抑制A2BR可阻断紫杉醇诱导的BCSC富集，并延缓体内肿瘤复发
接下来，我们研究了A2BR在体内对化疗诱导的BCSC富集的调节作用。将2×106个MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除的亚克隆细胞注入SCID小鼠的MFP中，当肿瘤体积达到200mm3时，每5天腹腔注射紫杉醇10mg/kg，共3次。最后一次给药3天后，取肿瘤标本进行ALDH、mammosphere和qPCR检测。结果显示，A2BR基因敲除不影响肿瘤生长速度或对紫杉醇的敏感性(图2A)，但减弱了紫杉醇介导的ALDH+细胞百分比(图2B)、mammosphere数量(图2C)以及多能因子NANOG、SOX2和KLF4 mRNA表达的增加(图2D)。
为探讨A2BR的药理抑制作用对紫杉醇诱导的BCSC体内富集的影响，我们采用基因工程的自体乳腺癌模型，对MMTV-PyMT转基因小鼠进行5mg/kg紫杉醇治疗，每5天一次，单独或联合每天10mg/kg四氧嘧啶治疗MMTV-PyMT转基因小鼠。紫杉醇治疗增加了MMTV-PyMT转基因小鼠中ALDH+细胞的百分比(图2F)、mammosphere的数量(图2G)以及NANOG、SOX2和KLF4的mRNA水平(图2H)。但是联合应用A2BR特异性拮抗剂四氧嘧啶可显著阻断紫杉醇诱导的乳腺癌干细胞的富集和多能因子的表达(图2F-H)，而不影响原发肿瘤的生长速度(图2E)。
我们还将2×106个MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除的亚克隆细胞植入MFP，当肿瘤可触及时，每隔5天给予紫杉醇10mg/kg治疗一次，当肿瘤不再可触及时终止治疗，并监测肿瘤复发。A2BR基因敲除没有改变肿瘤形成时间(图2I，左)或肿瘤根除时间(图2I，中间)，但显著增加了肿瘤复发时间(图2I，右)，表明A2BR基因敲除抑制了肿瘤复发，这一过程主要归因于BCSCs的存在。综上所述，这些数据证明了A2BR在紫杉醇诱导的BCSC富集和体内肿瘤复发中的关键作用。
A2BR通过相互调节H3K27me3和H3K27ac染色质标记促进FOXO3与细胞多能因子基因的结合
接下来，我们研究了A2BR调节细胞多能因子表达的机制，这对BCSC表型的确定至关重要。为了探讨FOXO3在A2BR诱导的多能性因子化疗反应中的作用，我们搜索基因组DNA序列，寻找与FOXO3结合位点序列5‘T(A/G)TTTAC-3’匹配的序列，并通过染色质免疫沉淀(ChIP)检测FOXO3与MDA-MB-231和SUM159 NTC和A2BR基因敲除亚克隆细胞的多能因子基因的结合。紫杉醇治疗诱导FOXO3与多能性因子NANOG、SOX2和KLF4基因结合(图3A-B)。A2BR基因敲除阻断了紫杉醇诱导的FOXO3与多能性因子基因的结合，通过转染抗shRNA的A2BR表达载体挽救了这一结合(图3B)。这些数据表明，A2BR通过调节转录因子FOXO3结合在NANOG、SOX2和KLF4基因的调节区来促进这些基因的表达。
然后，我们研究了A2BR如何调节FOXO3与多能因子基因的结合。紫杉醇处理降低了S294处FOXO3的磷酸化(图3C)，促进了其核转位，但不影响FOXO3的总表达(图3D)。然而，A2BR基因敲除并不影响紫杉醇介导的FOXO3去磷酸化和核定位(图3C-D)，这表明A2BR调控FOXO3的转录活性不依赖于其亚细胞定位。接下来，我们探讨了NANOG、SOX2和KLF4基因FOXO3结合位点的染色质可及性是否受A2BR的调节。我们用紫杉醇处理MDA-MB-231和SUM159的NTC或A2BR基因敲除亚克隆，并用针对表观抑制基因的标记H3K27me3和表观激活基因的标记H3K27ac的抗体进行芯片，然后用位于NANOG、SOX2和KLF4基因FOXO3结合位点两侧的引物进行qPCR。紫杉醇处理显著降低了H3K27me3，增加了NANOG、SOX2和KLF4基因FOXO3结合位点的H3K27ac标记；相反，A2BR基因敲除增加了H3K27me3，减少了这些基因FOXO3结合位点的H3K27ac标记(图3F-G)。组蛋白H3在这些位点的总占有率既不受紫杉醇治疗的影响，也不受A2BR基因敲除的影响(图3H)。紫杉醇治疗或A2BR基因敲除仅影响NANOG、SOX2和KLF4基因FOXO3结合位点的H3K27me3和H3K27ac修饰，但不影响总H3K27me3和H3K27ac水平(图3E)。这些数据表明，A2BR介导了NANOG、SOX2和10个KLF4基因的特定FOXO3结合位点上H3K27me3的减少和H3K27ac的修饰，并促进了染色质的可及性和FOXO3与这些区域的结合。
接下来，我们研究了调控H3K27me3和H3K27ac的酶在NANOG、SOX2和KLF4基因的FOXO3结合位点上的占有率。紫杉醇治疗增加了KDM6A的募集(图4A)，增加了降低H3K27me3标记的组蛋白去甲基化酶，并增加了p300(图4B)的募集，组蛋白乙酰转移酶增加了这些基因的FOXO3结合位点的H3K27ac标记，而不影响KDM6A或p300的整体表达(图4C)。紫杉醇诱导的KDM6A和p300募集到FOXO3结合位点的多能因子基因可被A2BR基因敲除，并通过转染抗shRNA的A2BR表达载体来挽救(图4A-B)。用MDA-MB-231细胞的核蛋白裂解物与FOXO3抗体共IP，进一步证实KDM6A和p300向FOXO3结合位点募集。紫杉醇处理增加了FOXO3与KDM6A和p300的相互作用，这在A2BR基因敲除亚克隆中被完全取消(图4D)。这些数据表明，A2BR促进KDM6A和p300募集到NANOG、SOX2和KLF4基因的FOXO3结合位点，导致H3K27me3和H3K27ac标记的相互修饰。
我们在体内进一步证实了A2BR在NANOG、SOX2和KLF4基因的特定FOXO3结合位点对组蛋白H3修饰的调节作用。接种MDA-MB-231NTC或A2BR基因敲除亚克隆细胞的小鼠，每隔5天给予紫杉醇10mg/kg，共3次，采集肿瘤标本进行定量PCR，引物位于NANOG、SOX2和KLF4基因的FOXO3结合位点两侧。紫杉醇治疗增加了FOXO3、KDM6A和p300与这些基因的结合，这些作用被A2BR基因敲除。紫杉醇减少H3K27me3，增加H3K27ac标记，而A2BR基因敲除增加了H3K27me3，减少了这些基因FOXO3结合位点的H3K27ac标记。组蛋白H3的总占有率不受紫杉醇治疗或A2BR基因敲除的影响。综上所述，这些数据表明，A2BR促进KDM6A和p300募集到FOXO3结合的NANOG，SOX2和KLF4基因的位点，减少了H3K27me3，增加了这些位点的H3K27ac标记，导致染色质可及性增加，转录因子FOXO3结合，最终激活了细胞多能因子基因表达。
A2BR通过激活p38MAPK促进FOXO3结合和多能性因子基因的表达
接下来，我们描述了调控多能因子基因表观遗传调控的A2BR下游信号通路。我们用紫杉醇联合A2BR抑制剂四氧嘧啶或共同的A2BR下游蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C-α(PKCα)、蛋白激酶Cδ、AKT和p38MAPK通路的抑制剂处理MDA-MB-231和SUM159细胞。抑制p38MAPK，而不是其他A2BR下游信号通路，与四氧嘧啶阻断紫杉醇诱导的NANOG、SOX2和KLF4表达的效果相似(图5A)，提示A2BR对多能因子表达的调节作用可能是通过激活p38MAPK来实现的。紫杉醇和腺苷均激活A2BR，增加了MDA-MB-231细胞的NTC中p38MAPK的磷酸化，但对A2BR基因敲除亚克隆中的p38MAPK磷酸化无影响(图5B-C)，证实p38MAPK以A2BR依赖的方式被激活。用其特异性抑制剂SB203580抑制p38MAPK可阻断紫杉醇诱导的FOXO3与MDA-MB-231(图5D)和SUM159中的NANOG、SOX2和KLF4基因的结合，这明显复制了A2BR基因下调的效应(图3B)。
为了探讨p38MAPK在A2BR介导的多能性因子表达和体内化疗后BCSC富集中的作用，我们用5mg/kg紫杉醇单独或与10mg/kg p38MAPK特异性抑制剂LY2228820联合处理MMTV-PyMT转基因小鼠。虽然LY2228820仅轻微抑制肿瘤生长速度(图5E)，但它显著抑制紫杉醇诱导的ALDH+(图5F)和mammosphere(图5G)细胞数量以及NANOG、SOX2和KLF4的表达(图5H)。综上所述，这些数据表明p38MAPK的激活参与了A2BR介导的多能因子的表达和BCSC对化疗的反应。
A2BR介导的p38MAPK激活促进SMARCD3核转位和FOXO3向细胞多能因子基因募集
接下来，我们研究了A2BR介导的p38MAPK激活如何调节多能性因子基因的表观遗传调控。染色质重塑因子SMARCD3是p38MAPK的已知底物，被p38MAPK磷酸化后移位到细胞核，在那里它起着调节染色质结构的作用。我们发现在MDA-MB-231细胞中，紫杉醇处理诱导了SMARCD3核转位，这一转位可被p38抑制剂SB203580共同给予阻断(图6A)。A2BR基因敲除也取消了紫杉醇诱导的SMARCD3核转位(图6B)，证实在MDA-MB-231细胞中，SMARCD3的核转位受A2BR-p38MAPK调控。
接下来，我们研究了核SMARCD3的功能。我们用抗SMARCD3的抗体在MDA-MB-231核裂解物中进行了co-IP分析，证明SMARCD3与KDM6A和p300相互作用(图6C)。紫杉醇治疗进一步增加了与KDM6A和p300相互作用的SMARCD3，而不改变细胞核中KDM6A或p300的蛋白水平(图6C)。敲除A2BR可阻断紫杉醇诱导的SMARCD3与KDM6A和p300的相互作用(图6C)。ChIP-qPCR分析进一步表明SMARCD3蛋白占据了NANOG、SOX2和KLF4基因的FOXO3结合位点，紫杉醇诱导MDA-MB-231(图6D-E)和SUM159细胞中SMARCD3以p38MAPK和A2BR依赖的方式与这些位点结合。
为了确定SMARCD3在A2BR介导的多能因子表达和化疗反应中BCSC富集中的作用，我们在MDA-MB-231(图7A)和SUM159细胞中产生了两个独立的SMARCD3敲除亚克隆。SMARCD3基因敲除阻断了紫杉醇诱导的ALDH+(图7B)和mammosphere(图7C)细胞的富集，并抑制了紫杉醇诱导的NANOG，SOX2和KLF4 mRNA的表达(图7D)。从机制上讲，SMARCD3基因敲除阻断了紫杉醇诱导的FOXO3(图7E)、KDM6A(图7H)和p300(图7I)与NANOG、SOX2和KLF4基因的结合，增加了H3K27me3(图7F)，减少了H3K27ac(图7G)的FOXO3结合位点上的标记。综上所述，这些数据表明，化疗诱导SMARCD3核移位，并以A2BR和p38MAPK依赖的方式募集到NANOG、SOX2和KLF4基因的FOXO3结合位点，导致这些基因的表观遗传调节和转录激活。
在TNBC患者中，A2BR与不良的临床结果相关
我们分析了癌症基因组图谱(TCGA)数据库中1247例原发人类乳腺癌的基因表达数据，并比较了A2BR在不同亚型乳腺癌中的表达模式。A2BR在TNBC中的表达明显高于ER/PR+和HER2+乳腺癌(图8A)，突出了其在TNBC中的重要作用。为了确定A2BR表达与TNBC治疗结果的临床相关性，我们询问了198例TNBC样本的微阵列数据，并分析了A2BR表达与TNBC患者生存的相关性。中位数以上的A2BR水平与TNBC患者队列中无复发生存率的降低显著相关(图8B)，而当分析接受化疗的TNBC患者时，生存率差异更大(图8C)。为了研究A2BR在原发性乳腺癌BCSCs调控中的作用，我们从TCGA数据库中的人TNBC样本中分析了A2BR的表达与20个基因组成的BCSC标记以及由细胞多能因子OCT4、SOX2、NANOG和KLF4的表达组成的OSNK标记的相关性，发现A2BR的表达与BCSC(图8D)和OSNK强烈相关。由于BCSCs在临床相关转移的形成中起着关键作用，我们还分析了基因表达总表(GEO)数据集，发现在1、3或5年内发生转移的乳腺癌患者的14个原发肿瘤中A2BR的表达高于在同一时间点没有转移的患者(图8F)。综上所述，这些数据表明A2BR的表达与TNBC患者的BCSC表型、肿瘤转移和不良预后相关。
综上所述，本发明提供了A2BR下游的一条信号通路，该通路通过多能因子基因的表观遗传调控促进化疗诱导的BCSC的富集。由于A2BR的细胞膜定位和靶向可行性，A2BR是一个有吸引力的治疗靶点。目前的研究提供了令人信服的证据，表明遗传或药物抑制A2BR有效地阻断了免疫缺陷和免疫活性小鼠中化疗诱导的BCSC的富集。有必要进行临床试验来评估药理A2BR抑制剂的疗效，特别是与化疗联合应用于TNBC的疗效。我们目前的研究提供了令人信服的证据，支持这样一种假设，即A2BR抑制剂与化疗联合应用可能有效地抑制BCSC的富集，从而提高TNBC妇女的存活率。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.检测A2BR编码基因及其表达产物的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测三阴性乳腺癌的进展的产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，三阴性乳腺癌患者包括接受化疗的三阴性乳腺癌患者。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述A2BR编码基因及其表达产物均为人源。
4.抑制A2BR编码基因及其表达产物的物质在如下a1)-a2)至少一种中的应用：
a1)制备延缓化疗后三阴性乳腺癌复发的产品；
a2)制备治疗三阴性乳腺癌的产品。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述抑制A2BR编码基因及其表达产物的物质包括针对A2BR的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂，实施基因敲除的物质以及针对A2BR的特异性抗体；
化疗过程中使用的化疗药物包括紫杉醇。
6.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述产品为药物或者实验试剂，所述实验试剂供基础研究使用。
7.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述产品为一种组合物，所述组合物其活性成分为四氧嘧啶和紫杉醇，二者质量比为1～2:1。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述组合物其活性成分为四氧嘧啶和紫杉醇，二者质量比为2:1。
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