CN111424090B - Sgce基因作为三阴性乳腺癌标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及SGCE基因作为三阴性乳腺的标志物的应用。本发明通过生物信息数据处理、体内外实验结果证实SGCE在三阴性乳腺癌组织或细胞中高表达，且生存分析表明SGCE基因的表达与三阴性乳腺癌的预后密切相关，说明SGCE基因可作为三阴性乳腺癌诊断或预后评估的标志物。本发明提供一种三阴性乳腺癌早期筛查、早期诊断、早期治疗、预后评估的试剂或试剂盒中的应用，为三阴性乳腺癌患者脱离病痛提供极有前景的策略，为乳腺癌及其他癌症的基础研究和临床研究提供了良好的工具。

Description

SGCE基因作为三阴性乳腺癌标志物的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及SGCE基因的应用，具体地说，涉及SGCE基因作为三阴性乳腺癌标志物的应用，以及其在制备三阴性乳腺癌诊断及预后评估试剂或试剂盒中的应用。

背景技术

乳腺癌是全球最常见的癌症，而且也是导致女性死亡的主要原因之一。美国癌症协会统计发现：2019年有26.86万例浸润性乳腺癌新增病患和48100例导管原位乳腺癌新增病患，并且新增41760位女性死于乳腺癌。截止到2019年1月，美国累计有超过3800万例乳腺癌患者，其中有超过15万例转移性乳腺癌患者。

根据免疫组化染色结果和高通量测序结果，乳腺癌可以分成不同类型。该分类方法主要依据肿瘤细胞表达的雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕酮受体(progesterone receptor,PR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growthfactor receptor,HER2)和Ki67(marker ofproliferation Ki-67)将乳腺癌分为：LuminalA型(ER和/或PR阳性、HER2阴性、Ki67低表达)、Luminal B型(ER和/或PR阳性、HER2阴性、Ki67高表达)、Her 2(ER和/或PR阳性、HER2阳性；ER和PR阴性、HER2阳性)和三阴性乳腺癌(ER阴性/PR阴性/HER2阴性，triple-negative breast cancer,TNBC)。

三阴性乳腺癌(TNBC)是雌激素受体(ER)、黄体酮受体(PR)、人表皮生长因子受体(HER2)表达阴性的乳腺癌，是侵袭性最强的乳腺癌，其转移风险高于任何其他乳腺癌亚型。三阴性乳腺癌是一种浸润性乳腺癌，有易转移、易复发、难治愈的特点，而且这类型乳腺癌的临床预后比其它类型乳腺癌差，乳腺癌干细胞在转移和复发中扮演了重要角色。尽管多聚(adp-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂和抗程序性死亡配体1(PD-L1)单克隆抗体(mAb)已被批准用于TNBC患者，但是由于缺乏上述受体，TNBC对激素或抗Her 2治疗没有反应，治疗通常基于传统化疗，效果特别差。乳腺癌干细胞(BCSCs)是一个小的自我更新的癌细胞亚群，负责耐药性、癌症的发生和癌症的进展。化疗虽然可以杀死TNBC的肿瘤细胞，但不能消除BCSCs，这可能是导致乳腺癌复发和耐药的原因。

SGCE是肌糖蛋白家族成员之一，目前SGCE的研究主要集中在突变与肌张力障碍综合症和遗传性运动障碍方面。虽然相关研究表明，SGCE的表达水平与结直肠癌和胃癌相关，但SGCE和肿瘤的关系还不清楚。本研究发现SGCE在乳腺癌干细胞(BCSC)和乳腺癌形成中发挥重要作用。SGCE在BCSCs中高度表达，与BCSC的自我更新、肿瘤发生、耐药密切相关。

目前，世界上尚未有将SGCE基因作为三阴性乳腺癌的生物标志物的报道。

发明内容

本发明保护SGCE基因的应用，特别涉及SGCE基因作为三阴性乳腺癌标志物的应用，以及其在制备治疗三阴性乳腺癌诊断及预后评估试剂或试剂盒中的应用。

本发明保护SGCE基因作为三阴性乳腺癌标志物的应用。

进一步地，所述的标志物在三阴性乳腺癌肿瘤诊断、筛查的试剂或试剂盒中的应用。

进一步地，所述的标志物在三阴性乳腺癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。

优选地，所述的试剂盒中含有定量SGCE基因表达量的试剂。

进一步地，所述乳腺癌诊断试剂盒是通过Western或定量PCR技术来检测疑似三阴性乳腺癌患者的手术切除组织中SGCE基因的水平进行检测的，所述的SGCE基因癌内表达的程度与三阴性乳腺癌发生率呈正相关。

进一步地，所述三阴性乳腺癌预后评估试剂盒是通过Western或定量PCR技术检测三阴性乳腺癌患者的手术切除组织中SGCE基因的表达情况，所述的SGCE基因癌内表达的程度与三阴性乳腺癌患者的预后生存期呈负相关。

本发明的有益效果：

1)本发明利用生物信息学的方法和体外实验(荧光定量PCR、Western)表明SGCE在三阴性乳腺癌和乳腺癌干细胞中高表达，且生存分析表明SGCE的表达水平与预后密切相关。因此，本发明可以能通过检测SGCE基因的表达水平，及时检测到SGCE基因的表达异常，提供一种三阴性乳腺癌早期筛查、早期诊断、早期治疗的方法和应用，为乳腺癌患者脱离病痛提供极有前景的策略。本发明的临床意义是跟踪检测三阴性乳腺癌变的发生和病理演变过程中SGCE表达变化，预警乳腺癌发生发展趋势，还对判断乳腺癌患者预后、是否会复发以及生存状况作出评估，具有重要作用和指导意义。本发明中提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点。

2)本发明中的SGCE序列检测试剂盒为乳腺癌及其他癌症的基础研究和临床研究提供了良好的工具。例如采用基因治疗的方法，以质粒或病毒为表达载体使其在肿瘤沉默SGCE的表达。

附图及附图说明

图1为SGCE在乳腺癌干细胞中富集表达，其中，图1(A)TNBC单细胞测序中上皮细胞群聚类分析，其中三个BCSC相关的群：Group 1(CD24^lowCD44^high)、Group 2(CD24^lowCD44^high)、Group 3(ALDH1A3)；图1(B)与非BCSC群相比在三个BCSC群中高表达的基因的维恩图分析；图1(C)根据SGCE的的表达水平将人群分为SGCE^high和SGCE^low进行GSEA分析；图1(D-E)分别为SGCE在流式分选出的CD24^lowCD44^high BCSC群和CD24^highCD44^low非BCSC群的表达水平，其中，BCSC表示乳腺癌干细胞。

图2为SGCE在三阴性乳腺癌中高表达，其中图2(A)利用TCGA数据库分析SGCE在不同类型乳腺中的表达水平，图2(B)SGCE在正常永生化乳腺上皮细胞和TNBC细胞系中的蛋白表达水平，MC：人乳腺上皮细胞；

图3SGCE高表达与病人预后不良有关；图3(A)不同类型乳腺癌中SGCE的表达水平与病人无复发生存率的预后分析；图3(B)不同类型乳腺癌中SGCE的表达水平与病人无病生存的预后分析；

图4为敲低SGCE抑制BCSC自我更新，图4(A)qRT-PCR检测SGCE在HCC1806、HCC1937和MDA-MB-231细胞中的敲低效率，图4(B-C)分别为HCC1806和MDA-MB-231细胞中敲低SGCE后进行ALDH实验；图4(D-E)分别为HCC1806和HCC1937细胞中敲低SGCE后检测CD24^lowCD44^highBCSC群；图4(F-G)分别为HCC1806和MDA-MB-231细胞中敲低SGCE后的乳腺癌微球实验；图4(H-I)分别为HCC1806和MDA-MB-231细胞中敲低SGCE后克隆形成实验，其中*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001；BCSC为乳腺癌干细胞。

图5为SGCE敲低进行梯度稀释成瘤实验，图5(A)为HCC1806敲低SGCE后进行梯度稀释的成瘤实验；图5(B)为HCC1806敲低SGCE后进行梯度稀释的成瘤实验的统计结果；图5(C)为HCC1806分选出CD24^lowCD44^highBCSC后敲低SGCE进行梯度稀释的成瘤实验；图5(D)为HCC1806分选出CD24^lowCD44^highBCSC后敲低SGCE进行梯度稀释的成瘤实验的统计结果。

图6为SGCE低表达对化疗药物敏感性影响，图6(A)放化疗及内分泌治疗后SGCE表达与乳腺癌患者RFS的Kaplan-Meier生存分析；图6(B)HCC1806和MDA-MB-231敲低SGCE并用阿霉素处理后细胞活性检测；图6(C-D)HCC1806和MDA-MB-231敲低SGCE后并用顺铂处理后细胞活性检测；图6(E)敲低SGCE同时进行阿霉素腹腔注射后小鼠肿瘤生长曲线的变化；图6(F)阿霉素注射后检测小鼠肿瘤内CD24^lowCD44^high细胞群的变化。

图7为SGCE敲低抑制肿瘤细胞转移，图7(A)敲低SGCE在HCC1806和MDA-MB-231细胞中进行细胞迁移和侵袭实验，图7(B)敲低SGCE在HCC1806和MDA-MB-231细胞中进行细胞迁移和侵袭实验的统计结果，图7(C)敲低SGCE进行裸鼠肺转移实验。

具体实施方式

实施例1SGCE在乳腺癌干细胞中高表达

(1)从单细胞测序中筛选并发现SGCE在乳腺癌干细胞群中高表达

从https://github.com/Michorlab/tnbc_scrnaseq网站下载已经发表的TNBC病人的scRNA-Seq原始数据。利用Scatter软件包对单细胞样本数据进行质控，去除测序深度低于1000读段的样本，去除检测基因数低于500以及大于10000的样本，去除线粒体来源读段比例超过20％的样本。考虑单个样本经过质控操作后保留的高质量上皮细胞数目，我们最终选择PT039、PT089和PT081这三个肿瘤病人来源的肿瘤上皮细胞进行下游分析，根据原始文献的分类结果对细胞群进行分组。将上述3个病人的样本进行合并，并利用Monocle-3软件进行单细胞转录组降维、聚类分析。使用CD24、CD44以及ALDH1A3的表达情况分析可能的BCSC群。其中CD24^lowCD44^high和ALDH1A3⁺细胞群为两种不同的干细胞群。使用scran软件包中的pairwiseWilcox脚本对两种BCSC和非BCSC之间的差异表达基因进行显著性检验，其中FDR值低于0.05的基因视为显著差异表达基因。

使用msigdb网站的GSEA软件包进行GSEA富集分析。使用R软件包将基因表达矩阵转换为GSEA软件识别格式。若样本量较少，则GSEA软件参数“Metric for ranking genes”改为t-Test，否则均使用默认参数。基因富集分析所使用的基因集合下载自GSEA网站，包括C2.KEGG以及C5.BP(v6.2)。

(2)细胞流式实验分选出低分化的乳腺癌干细胞群和高分化的非乳腺癌干细胞群

1)HCC1806细胞接种到6cm的培养皿，待汇合度生长到90％，用胰酶消化细胞。

2)终止细胞消化后进行细胞计数，按照每1×10⁶细胞加入20μl CD24-PE,CD44-FITC的比例向细胞中加入适量的抗体。避光条件下加入抗体后，在冰上避光孵育30-40min。

3)用PBS清洗多余的抗体，4℃，500g，离心5min。

4)重复步骤4)三次。

5)用400μl PBS重新悬浮细胞，将重悬的细胞加入高速分析流式专用管分析CD24^lowCD44^high的变化或者加入细胞分选流式管分选出CD24^lowCD44^high和CD24^highCD44^low细胞群在RNA和蛋白水平检测SGCE的变化。

(3)抽提乳腺癌干细胞群和高分化的非乳腺癌干细胞群RNA

本部分实验采用微量RNA抽提试剂盒

Plus Micro Kit(QIAGEN,74034)来提取CD24^lowCD44^high和CD24^highCD44^low细胞群的RNA。主要操作步骤如下：

1)流式分选获得的细胞离心，小心去除上层液体保留管底的细胞沉淀。

准备Buffer RLT，按照10μlβ-巯基乙醇/1ml Buffer RLT的比例向Buffer RLT中加入β-巯基乙醇，现用现加。

2)向细胞沉淀中加入350μl Buffer RLT，涡旋振荡器涡旋1min。

3)将上一步操作中的液体转移至gDNA Eliminator spin column中进行离心10000rpm，30s。

4)离心后将离心柱丢弃保留液体，向液体中加入等体积(约350μl)的70％乙醇，混匀后转移至RNeasy MinElute spin column，10000rpm，15s。

5)去掉液体，向该离心柱中加入700μl Buffer RW1后再次进行离心10000rpm，15s。

6)离心后去掉液体，加入500μl Buffer RPE，10000rpm，离心15s。

7)离心后去掉液体，加入500μl 80％乙醇，10000rpm，离心2min。

8)离心柱移至2ml离心管，10000rpm，离心5min，再次将离心柱移至新1.5ml离心管加入14μl RNase-free水，离心1min洗脱RNA。

9)取7μl RNA进行反转录。

(4)定量PCR检测SGCE在乳腺癌干细胞群和高分化的非乳腺癌干细胞群表达

反转录后的cDNA样品用双蒸水稀释数倍后作为模板用于SYBR Green SelectMaster Mix(ABI,4472908WEI)进行qRT-PCR检测

1)qRT-PCR反应体系：

cDNA模板 2μl

ABI SYBR Green Select Master Mix 10μl

Forward Primer(10μM) 1μl

Reverse Primer(10μM) 1μl

双蒸水 6μl

2)qRT-PCR反应程序：

2)数据处理：

每个引物的每个cDNA样本都设置3个平行复孔，以GAPDH为内参。计算GAPDH复孔Ct值平均值，每个样本的每个复孔的Ct值减去GAPDH Ct值的平均值，得到ΔCt值；计算对照组样本的Ct值的平均值，再用实验组每个复孔的Ct值减去对照组Ct值的平均值得到ΔΔCt值，利用公式2-ΔΔCt计算出基因的相对表达量，独立重复3次实验后进行t检验。

(5)Western检测SGCE在乳腺癌干细胞群和高分化的非乳腺癌干细胞群表达

具体方法同实施例1。

结果如图：BCSC是TNBC恶性程度高的一个重要因素，依据细胞表面标记，CD24^lowCD44^high和ALDH⁺细胞群都属于BCSC，为了筛选出与BCSC相关的基因，发明人对已经发表的TNBC单细胞测序进行分析。根据基因的表达特征，将单细胞分为不同的类群，其中有三个可认为是BCSC群(图1(A))：Group 1(CD24^lowCD44^high)、Group 2(CD24^lowCD44^high)、Group 3(ALDH1A3)。考虑到CD24^lowCD44^highALDH1A3⁺细胞群有更强的成瘤能力，分析了这三个BCSC群中高表达的基因并且发现了19个基因在这三个群中都呈现高表达(图1(B))。考虑到膜蛋白不仅在信号转导、细胞功能中发挥作用而且更容易成为治疗靶标，我们在19个基因中找到了4个膜蛋白，选择SGCE作为后续研究对象。

接下来检测了SGCE在BCSC中的表达水平。首先根据SGCE的转录水平的高低将TCGA数据库中乳腺癌病人分为SGCE^high和SGCE^low人群并进行GSEA分析，发现干细胞增殖相关的基因在SGCE^high的人群富集表达而在SGCE^low的人群呈现低表达的模式(图1(C))。选取TNBC细胞系HCC1806，通过流式细胞术和细胞流式抗体CD24和CD44分选出CD24^lowCD44^high BCSC群和高分化CD24^highCD44^low的细胞群，定量PCR和Western blotting实验表明SGCE在转录水平和蛋白水平都在BCSC中呈现高表达(图1(D-E))。

实施例2SGCE在三阴性乳腺癌中高表达

(1)利用TCGA数据库分析SGCE在不同类型乳腺癌的表达水平

结果如图2(A)所示：在TCGA数据库中下载包括Luminal A型、Luminal B型、Her2和三阴性乳腺癌在内的不同类型乳腺癌病人的样本，分析SGCE在这些乳腺癌病人的表达情况发现SGCE在三阴性乳腺癌中的表达水平高于其它类型乳腺癌，而三阴性乳腺癌的恶性程度高于其它三类乳腺癌，该结果说明SGCE在恶性程度高的乳腺癌中高表达，在恶性程度低的乳腺癌中低表达，SGCE的表达水平跟乳腺癌恶性程度正相关。

(2)分析正常乳腺上皮细胞和三阴性乳腺癌细胞系中SGCE在蛋白水平的表达。

1)蛋白样品的收集

细胞密度生长至90％时，吸出培养基，用PBS冲洗细胞两遍，加入含有蛋白抑制剂的蛋白裂解液(碧云天,P10013)，冰上裂解30min，4℃，12000g，离心15min，将上层的蛋白样品转移到新的1.5ml EP管中。

2)蛋白浓度的测定

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce,23225)进行蛋白浓度的测定。根据说明书将BSA母液稀释至不同浓度梯度的蛋白标准品，并按照比例配置A+B混合液，混合液现用现配。蛋白标准品和需要测定蛋白浓度的样品均吸取10μl于96孔酶标板的比色皿中，加入100μl A+B混合液，37℃反应30min，在酶标仪(Epoch BioTak)上测定561nm的吸光值，按照标准蛋白样品的浓度和吸光值计算出不同蛋白样品的浓度，根据测定的样品的浓度用蛋白裂解液对不同的样品进行浓度的归一化，使得所有样品蛋白浓度一致，加入5×SDS LoadingBuffer，100度10min金属浴使蛋白变性。

3)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳

根据待检测的目标蛋白的分子量选择配制合适浓度的分离胶，灌胶后用异丙醇缓慢加入进行封胶，水平静置至分离胶完全凝固后，将异丙醇慢慢倒出并用双蒸水冲洗两次，吸干多余的水分，配制浓缩胶迅速插入需要的梳子，待上层胶凝固后拔出梳子，组装好电泳槽，加入1×电泳缓冲液，加入等量的蛋白样品，先用恒压80V电泳30min，再用100V电泳1-2h。

4)转膜

预先裁剪PVDF膜浸泡在甲醇中，电泳后用起胶板将凝胶取出，在装有1×转膜缓冲液的容器中按照夹板黑面、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵、夹板透明面的顺序组装夹板，按照夹板黑面朝向转膜槽负极，夹板透明面朝向转膜槽正极的位置放入转膜槽，转膜槽中注满1×转膜缓冲液，在低温条件下恒压100V转膜1-2h。

5)封闭

用PBST配制5％脱脂奶粉作为封闭液。转膜结束后，根据蛋白分子量的对PVDF膜进行适当裁剪后放入抗体孵育盒，加入封闭液在室温封闭1h。

6)一抗孵育

根据抗体说明书，用含0.01％NaN₃的3％的BSA按照合适比例稀释一抗。封闭结束后用PBST洗膜，每次5min，洗三次，加入一抗稀释液4℃过夜孵育。

7)二抗孵育

将一抗进行回收，PBST洗膜10min，洗三次，加入相应的二抗室温孵育1h。二抗用含有3％脱脂奶粉的PBST按照说明书进行稀释。

8)显影

吸出二抗用PBST洗膜10min，洗三次，将膜浸入新鲜配制的Pierce ECL显影液孵育1min，进行显影。

结果如图2(B)所示：选择人正常乳腺上皮细胞系184B5和多种三阴性乳腺癌细胞系如HCC1937、HCC1806、SUM149pt、MDA-MB-231、MDA-MB-458、Hs578T通过Western检测了SGCE的表达水平，发现SGCE在三阴性乳腺癌细胞系的表达显著高于正常乳腺细胞，因此SGCE的高表达可作为三阴性乳腺癌的标志物。

实施例3SGCE高表达对应TNBC病人预后差

使用kmplot网站(http://kmplot.com/analysis/)分析了SGCE的表达与乳腺癌患者预后生存率的关系(图3)。SGCE的高表达预示乳腺癌病人生存期较短(Luminal A型除外)，尤其是TNBC中SGCE低表达病人的无复发生存(RFS)和无病生存(DMFS)预后良好，同时在实施例2中实验结果也证明与其它类型乳腺癌相比，SGCE在三阴性乳腺癌患者的表达水平最高，这些数据揭示SGCE的表达水平与乳腺癌恶性进程和预后密切相关，SGCE的高表达与乳腺癌恶性程度正相关，与病人生存预后负相关。

实施例4SGCE基因的shRNA稳定沉默SGCE能抑制乳腺癌(体外实验)

(1)构建shSGCE载体

1)设计靶向SGCE的shRNA序列，序列如下：

2)通过公司合成正反链寡核苷酸序列(oligos)

3)合成的正反向oligos稀释成20μM的工作液进行退火

4)退火体系如下：

100℃煮4min，然后自然冷却至室温。

5)PLKO.1载体的酶切回收

酶切体系如下：

双蒸水补足至50μl。

6)连接体系如下

连接程序：16℃，2h；25℃，1h；37℃，30min。

7)连接产物进行转化、挑克隆、摇菌、抽质粒。

8)获得的质粒用EcoRI-HF和NcoI-HF进行双酶切鉴定并测序。

9)选择测序正确的质粒扩增后进行后续实验。

(2)慢病毒包装

1)复苏293T细胞，传代培养至汇合度为80％。

2)将293T细胞的培养基更换为不加FBS的基础培养基饥饿2h。

3)配制A液：

1ml Opti-MEM培养基(Gibico)+56μl PEI。

配制B液：

1ml Opti-MEM培养基+PMD 3.46μg+PSPAX26.36μg+PLKO.14.18μg。

A液、B液分别静置5min，然后将B液加到A液中，混匀，室温静置20min后A+B的混合液轻轻的加到293T细胞中。

4)转染细胞4-6h后更换含5％FBS的DMEM培养基，48h后第一次收病毒液，72h后第二次收集病毒液，两次收集的病毒混合到同一离心管中，4℃，500g，离心5min去除可能残余的细胞，用0.45μm细胞滤膜过滤病毒液，病毒可于-80℃暂时保存。

(3)慢病毒感染

HCC1806或MDA-MB-231进行慢病毒感染，细胞消化后向6孔板中铺适量的细胞加入病毒液和polybrene，病毒过夜感染12h后更换为正常培养基，三天后加入嘌呤霉素筛选稳定细胞株(HCC1806嘌呤霉素筛选浓度为2.5mM，MDA-MB-231嘌呤霉素筛选浓度为10mM，)进行后续实验。

(4)RNA抽提

1)样品裂解：

细胞裂解，细胞铺到6孔板培养至汇合度为90％，直接加入1ml Trizol(Takara,9109)裂解或者用胰酶消化细胞后加入1ml Trizol，冰上裂解3-5min。

组织裂解，小鼠乳腺癌肿瘤组织放置1.5ml EP管并加入200μl Trizol，在冰上用电动研磨器研磨后再加入800μl Trizol继续裂解10min。

2)裂解好的样品加入200μl氯仿，剧烈震荡30s，冰上静置3min。

3)将样品进行离心，4℃，12000g，离心15min。

4)离心后将上层无色透明水相吸出约500μl转移至新的1.5ml EP管，再加入相同体积的异丙醇并混匀，冰上静置10min。

5)将样品进行离心，4℃，12000g，离心15min。

6)在1.5ml EP管底看到少量白色RNA沉淀，轻轻将上清移去。

7)用1ml 75％乙醇清洗沉淀，4℃，12000g，离心5min。

8)重复用75％乙醇清洗一次。

9)小心将上清去掉，在紫外超净台风干RNA沉淀，加入RNase-free水使沉淀充分溶解。

10)电泳检测RNA质量：

称适量琼脂糖加入适量TAE缓冲液放入微波炉中溶解并按照1:10000的稀释比例加入核酸染料GelRed配制1％琼脂糖，每个RNA样本取500ng RNA进行电泳检测，120V，20min跑胶，观察26S，18S和5S rRNA有无降解，若RNA无降解，用Nanodrop 2000测定RNA的浓度准备用于下一步实验。

注意：在整个RNA提取过程中所用到的试剂和耗材均为RNase-free。

(5)RNA反转录

本部分实验采用的是TaKaRa的PrimeScript^TM反转录试剂盒(Takara,RR047A)，该实验需要在冰上进行，主要步骤如下：

1)去除RNA样品中存在的基因组

反应体系：

2)反转录反应

反应体系：

反转录条件为：

37℃ 15min

85℃ 5s

4℃ forever

反转录后的cDNA若长期保存需要放于-80℃度冰箱。

(6)荧光实时定量PCR

反转录后的cDNA样品用双蒸水稀释数倍后作为模板用于SYBR Green SelectMaster Mix(ABI,4472908WEI)进行qRT-PCR检测

1)qRT-PCR反应体系：

2)qRT-PCR反应程序：

2)数据处理：

每个引物的每个cDNA样本都设置3个平行复孔，以GAPDH为内参。计算GAPDH复孔Ct值平均值，每个样本的每个复孔的Ct值减去GAPDH Ct值的平均值，得到ΔCt值；计算对照组样本的Ct值的平均值，再用实验组每个复孔的Ct值减去对照组Ct值的平均值得到ΔΔCt值，利用公式2^-ΔΔCt计算出基因的相对表达量，独立重复3次实验后进行t检验。

(7)CD24^lowCD44^high流式实验

具体方法同实施例1。

(8)ALDH实验

该实验通过ALDH试剂盒(Promega,18J95349)，进行检测。

1)HCC1806或MDA-MB-231感染病毒三天后，消化细胞，计数1×10⁶细胞进行下面的操作。

2)4℃，500g，离心5min，弃掉上清，用1mlALDEFLUOR^TMAssay Buffer悬浮细胞。

3)准备一个新的1.5ml EP管标记为control，在control的EP管中加5μlALDEFLUOR^TM DEAB Reagent，迅速盖好盖子。

4)向1ml ALDEFLUOR^TM Assay Buffer的细胞悬液中加入5μl activatedALDEFLUOR^TM Reagent快速混匀，吸出500μl加至对应的标记为control的已经加有5μlALDEFLUOR^TMDEAB Reagent的EP管中混匀。

5)样品组和control组37℃避光孵育30min-60min。

6)4℃，500g，离心5min，弃上清，用300μlALDEFLUOR^TMAssay Buffer

重浮细胞进行流式分析。

(9)乳腺癌微球实验(tummorsphere)

该实验需要将细胞铺在超低吸附96孔板中，1000-3000个细胞/孔(不同的细胞系所铺的细胞不同)，每组实验设置6-8组平行重复，tummorsphere培养基中培养10-14天，统计直径>200nm的微球体的数量并进行t-检验。Tummorsphere培养基配方：9ml humanmammcultbasal培养基+1ml supplement+20μl heparin+4.8μl氢化可的松(1mg/ml)。

(10)克隆形成实验

胰酶将细胞消化成单个细胞后计数，用胰酶将细胞消化成单个细胞后，按照500细胞/孔的数量重新铺回6孔板，培养10-14天后，用4％多聚甲醛固定30min，倒掉固定液，用0.1％结晶紫染色15-30min，用清水轻轻浸泡冲洗，晾干后拍照。

结果如图4所示：为了进一步研究SGCE在TNBC中的作用，我们选取TNBC细胞系作为研究对象。首先我们设计多条shRNA使用慢病毒载体PLKO.1敲低SGCE，并选取了两条敲低效果最好shRNA，进行后续实验，图4A显示在不同的细胞系SGCE-sh#1和SGCE-sh#2两条shRNA与对照组sh-Control相比都能抑制SGCE的表达。乳腺癌干细胞在三阴性乳腺癌形成、发展、转移和复发中发挥重要作用。为了探讨SGCE是否能够调控乳腺癌干细胞，我们进行了一系列相关的实验，其中ALDH和CD24、CD44流式分析以及乳腺癌微球实验和克隆形成都是检测BCSC自我更新能力的常用方法。实验结果：首先我们通过细胞流式实验检测ALDH⁺群在敲低SGCE后的变化，结果显示在HCC1806和MDA-MB-231细胞中敲低SGCE后ALDH⁺BCSC细胞群都明显减少(图4(A-B))；接下来我们进行了CD24、CD44干细胞表面标记的流式分析实验，其中MDA-MB-231细胞系的细胞基本都表达CD44，不适合用于该流式分析，我们选择HCC1806和HCC1937进行该实验，结果显示敲低SGCE后这两个细胞系中CD24^lowCD44^high BCSC群细胞数量都显著减少(图4(C-D))；在HCC1806和MDA-MB-231两个细胞系中的乳腺癌微球实验中发现敲低SGCE后肿瘤细胞形成微球体的数量明显减少(图4(E-F))；在HCC1806和MDA-MB-231两个细胞系中进行细胞克隆形成实验后也发现敲低SGCE后形成的克隆数量显著减少(图4(G-H))。这些实验结果说明SGCE参与调控乳腺癌干细胞，在TNBC细胞系中敲低SGCE后显著减少BCSC的数量并能抑制BCSC的自我更新能力。

实施例5SGCE敲低抑制乳腺癌的形成(体内实验)

(1)裸鼠原位成瘤实验

1)准备细胞

HCC1806细胞生长到足够数量后，胰酶消化细胞，PBS洗三遍，计数，将实验组和对照组的细胞调整到一致，并加入Matrigel(BD,356235)形成30％Matrigel的悬液，且将细胞密度调整为4×10⁶个细胞/100μl、4×10⁵个细胞/100μl、4×10⁴个细胞/100μl。

2)注射细胞

裸鼠腹腔注射麻醉剂后标记耳环号，对腹部用酒精进行消毒并剪开，使用医用棉签做辅助小心暴露出第四对乳腺，每侧乳腺注入100μl细胞悬液后用缝合器将皮肤缝合。

3)一周后，用起钉器将缝合部位拆除，6周统计成瘤率。

(2)HCC1806 CD24^lowCD44^high乳腺癌干细胞分选

具体方法同实施例1。

结果如图5显示：在HCC1806细胞中敲低SGCE后，按照10⁶、10⁵、10⁴的梯度稀释进行成瘤率的统计，统计结果显示对照组成瘤率是1/28854，而敲低SGCE组的成瘤率分别为1/108421和1/1463997，显著低于对照组成瘤率(图5(A-B))。另外我们在HCC1806中还用细胞流式分选的方法分选出CD24^lowCD44^high BCSC群，感染病毒后同样进行梯度稀释的成瘤实验，实验的统计结果显示对照组在注入200个BCSCs时有50％的概率可以有效形成肿瘤，而实验组在该梯度时形成肿瘤的概率极少；在用BCSCs进行成瘤实验中对照组成瘤率为1/1656，而敲低SGCE组的成瘤率分别为1/4192和1/8062，显著低于对照组(图5(C-D))。

实施例6SGCE敲低增强TNBC细胞对化疗药物敏感性

(1)药物敏感性实验

该部分实验选用的化疗药物是阿霉素(doxorubicin)和顺铂(cisplatin)。

1)准备细胞

细胞消化后计数并铺入96孔细胞培养板，每个孔8000个细胞，每组6个重复孔，细胞培养板放于37℃细胞培养箱过夜培养。

2)药物处理细胞

准备含有不同浓度阿霉素的培养基：0μM，0.04μM，0.08μM，0.32μM，1.28μM，2.56μM。细胞铺板12-24h后，吸出原来的培养基更换为上述培养基，处理48h。

3)细胞活力检测

细胞活力的检测是通过MTS实验进行的，MTS试剂CellTiter

AQueous OneSolution Reagent(Promega,G3581)一种四唑盐溶液，可被活细胞中产生的NADPH或NADH还原成一种有色的甲臜产物。药物处理结束后，吸出原培养基，更换为MTS混合液，37℃避光孵育1-2h后，检测并统计490nm吸光值。

MTS混合液：按照1:5的比例避光混合MTS试剂和培养基。

(2)SGCE敲低与化疗药物联合使用进行成瘤实验

小鼠的原位成瘤操作步骤同实施例5，裸鼠接瘤后12天后开始腹腔注射阿霉素溶液，根据裸鼠体重按照3mg/kg的量进行药物注射，每四天注射一次并测量小鼠肿瘤生长。

(3)小鼠肿瘤流式分析

取经过阿霉素处理的的裸鼠负荷的肿瘤检测BCSC的变化，具体步骤如下：

1)肿瘤组织裂解

取出肿瘤后用PBS冲洗两遍，取一部分用剪刀尽量剪碎，并用加有300U/ml胶原酶(Sigma,C0130)和100U/ml透明质酸酶(Sigma,H3506)的裂解液，37℃，100rpm摇床，裂解1-2h。

2)4℃，500g，离心5min，轻轻吸出上清。

3)细胞沉淀中加入2ml胰酶，37℃消化2min，加入含有2％FBS的HBSS溶液终止消化。

4)4℃，500g，离心5min，弃上清，加入1ml 5mg/ml分散酶(Sigma,D4693)和10μl0.1mg/ml DNase I(Roche,11248932001)，37℃消化5min充分裂解DNA。

5)加入红细胞裂解液(0.8％NH₄CI和HBSS以4:1比例混合)去除红细胞。

6)4℃，500g，离心5min，弃上清，用含2％FBS的PBS重悬细胞并使用40μm细胞筛过滤。

7)4℃，500g，离心5min，弃上清，用PBS重悬后计数，并将细胞分为

下面几组：阴性组、lin组、CD24单标组、CD44单标组、样品组(包括对照组和敲低SGCE组)，每组取10⁶细胞且将细胞体积调整至100μl。

8)除阴性组外，其它组都加入blocking抗体(CD16/CD32各2μl)，冰上孵育10min。

9)lin组加入CD31-biotin、CD45-biotin、TER119-biotin各2μl；样品组加

入CD31-biotin、CD45-biotin、TER119-biotin各2μl，CD24-PE(human)和CD24-FITC(human)各10ul；冰上避光孵育30min。

10)PBS洗三遍，4℃，500g，离心5min弃上清，用100μl PBS重悬。

11)每组加入下面的抗体：CD24单标组加入10μl CD24抗体；CD44单标组

10μl CD44抗体；lin组加入2μl strep-PEcy7抗体；样品组加入2μl strep-PEcy7抗体，冰上孵育30min。

12)PBS洗三遍，4℃，500g，离心5min，流式检测。

实验结果：使用在线软件(http://kmplot.com/analysis/)分析发现，经过放化疗和内分泌治疗的乳腺癌病人中SGCE高表达患者的生存曲线对应于预后差(图6(A))，鉴于病人经过化疗治疗后会导致肿瘤干细胞富集进而出现耐药性，同时我们前期数据中显示敲低SGCE能够抑制乳腺癌干细胞的自我更新，这暗示敲低SGCE可能能够减弱化疗药物引起的干细胞富集所导致的耐药性。为了进一步验证SGCE低表达是否会增加细胞对化疗药物的敏感性，我们在TNBC细胞HCC1806和MDA-MB-231中敲低SGCE后并用化疗药物阿霉素和顺铂处理细胞，检测结果显示SGCE低表达组的IC₅₀值低于对照组，说明SGCE敲低后增强了细胞对化疗药物的敏感性(图6(B-D))，揭示在敲低SGCE的同时，较小的化疗药物浓度即可杀死乳腺癌细胞。为了进一步验证SGCE在化疗药物敏感性方面的功能，我们进行小鼠成瘤实验同时进行腹腔注射阿霉素观察统计小鼠肿瘤的生长，在未进行阿霉素注射的实验中对照组和敲低SGCE组肿瘤的生长曲线未表现出明显差异；进行阿霉素的腹腔注射后，对照组的肿瘤生长明显比未加药组滞缓，而且加药处理后敲低SGCE组的肿瘤生长显著低于对照组(图6(E))。取加药后的小鼠肿瘤检测CD24^lowCD44^highBCSC的变化发现敲低SGCE后显著减少了CD24^lowCD44^high细胞群的数量(图6(F))。这些实验揭示抑制SGCE基因表达并联合化疗药物治疗明显抑制小鼠肿瘤的生长，为临床应用提供理论依据。

实施例7 SGCE敲低抑制肿瘤细胞转移

(1)细胞迁移实验

实验过程中采用corning生物公司的Transwell板完成以下实验。

1)细胞胰酶消化并收集细胞，PBS洗2遍，用无血清含有0.1％BSA的培养基重悬细胞。

2)取100μl细胞悬液小心加入Transwell板的上室。

3)在Transwell板下室中加入600μl完全培养基。之后细胞在Transwell板中培养8-16h。

4)取出Transwell上室，弃去孔中培养液，小心用棉签将上室中上层膜上的细胞拭去。

5)将上室放入含有0.1％结晶紫染色后显微镜下观察。

(2)细胞侵袭实验

实验过程中采用corning生物公司的Transwell板完成以下实验。

1)接种细胞前，在Transwell板上室中加入Matrigel。

2)消化收集细胞，后用无血清含有0.1％BSA的培养基重悬细胞。小心的取100μl细胞悬液加入含有Matrigel的上室中。

3)在Transwell板下室中加入完全培养基，培养12-24h。

4)取出Transwell上室，弃去孔中培养液，小心用棉签将上室中上层膜上的细胞拭去。

5)将上室放入含有0.1％结晶紫染色15-20min，自然风干后显微镜下观察。

(3)裸鼠肺转移实验

1)构建稳定表达Luciferase的MDA-MB231细胞。

2)将MDA-MB231-Luciferase细胞进行不同组处理。

3)收集细胞并计数，采用1×PBS重悬细胞。

4)采用专门的小鼠固定器固定好小鼠，将尾巴拉直，绷紧。选择两侧的静脉进行注射，每只缓慢注射100ul细胞悬液。其中MDA-MB231注射到裸鼠中。

5)尾静脉注射后，在不同时间点腹部注射100mg/g的D-luciferin，10min后，将小鼠麻醉，用小动物荧光成像细胞记录不同时间的成瘤情况，MDA-MB231在裸鼠中肺转移整个实验周期需要8周左右。

结果如图7所示：实验证明：SGCE敲低后抑制乳腺癌形成，在该实施例中发明人讨论了SGCE抑制后对肿瘤细胞的迁移侵袭的影响。首先在HCC1806和MDA-MB-231细胞中敲低SGCE后进行体外迁移侵袭实验，发现抑制SGCE后乳腺癌细胞的迁移侵袭(图7(A-B))；接下来进行了体内的肺转移实验，敲低SGCE后肺部荧光明显减弱说明转移到肺部的肿瘤细胞减少，说明抑制SGCE后能够抑制乳腺癌转移(图7(C))，从而延长病人的生存期，也能够说明SGCE低表达预测病人预后良好。提示，SGCE三阴性乳腺癌抗肿瘤新药开辟新的途径。

因此，利用生物信息学的方法和体外实验(荧光定量PCR、Western)表明SGCE在三阴性乳腺癌和乳腺癌干细胞中高表达，敲低SCGE可以有效地抑制三阴性乳腺癌的生长以及转移，且生存分析表明SGCE的表达水平与预后密切相关。SGCE基因作为三阴性乳腺癌诊断或预后评估的标志物，并在制备三阴性乳腺癌诊断及预后评估试剂或试剂盒中发挥作用。本发明可通过检测SGCE基因的表达水平，及时检测到SGCE基因的表达异常，提供一种三阴性乳腺癌早期筛查、早期诊断、早期治疗的方法和应用，为乳腺癌患者脱离病痛提供极有前景的策略。本发明的临床意义是跟踪检测三阴性乳腺癌癌变的发生和病理演变过程中SGCE表达变化，预警三阴性乳腺癌发生发展趋势，还对判断三阴性乳腺癌患者预后、是否会复发以及生存状况作出评估，具有重要作用和指导意义。本发明中提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点。

Claims (4)

1.SGCE基因在制备三阴性乳腺癌肿瘤诊断筛查、预后评估的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的三阴性乳腺癌肿瘤诊断筛查、预后评估的试剂盒以SGCE基因作为诊断标记物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的三阴性乳腺癌肿瘤诊断筛查的试剂盒是通过western或定量PCR技术来检测疑似乳腺癌患者的手术切除组织中SGCE基因的表达水平，所述的SGCE基因表达的程度与乳腺癌发生率呈正相关。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的三阴性乳腺癌预后评估试剂盒是通过Western或定量PCR技术检测三阴性乳腺癌患者的手术切除组织中SGCE基因的表达水平，所述的SGCE基因癌内表达的程度与三阴性乳腺癌患者的预后生存期呈负相关。

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