KR20220092927A - 신장 장애를 치료하기 위한 항 il-33 치료제 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 ST2 신호전달과 RAGE 신호전달을 둘 다 저해하는 항-IL-33 치료제를 투여하는 것에 의한 신장 손상의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

신장 장애를 치료하기 위한 항 IL-33 치료제

본 출원은 2019년 11월 4일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/930,179호; 및 2020년 8월 21일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/068,601호에 대한 우선권을 주장한다. 이들 출원의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.

기술분야

본 개시내용은 신장 손상, 예컨대, 당뇨병성 신장 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

만성 신장 질환(CKD)은 유의미한 이환율 및 사망률과 연관된(Brenner et al. 2001; Lewis et al. 2001; Go et al. 2004) 전세계적인 공중보건 문제이다(Ritz et al. 1999; Nwankwo et al. 2005). 당뇨병은 미국에서 2기 신장 질환 사례 발생률의 대략 45%를 차지하며, 이러한 사례의 대략 90% 2형 당뇨병을 갖는 환자에서이다(USRDS 2009). 당뇨병성 신장 질환(DKD)의 치료에 대해 허용되는 치료 표준은 안지오텐신 전환효소 저해제(ACEi) 또는 안지오텐신 수용체 차단제(ARB)의 사용이다. RAGE 신호전달 및 IL-33/ST2 축을 통한 신호전달과 같은 다른 경로는 질환 진행에 대한 기여자로서 나타났다. 이들 경로는 침윤성 면역 세포 및 전염증 사이토카인, 케모카인 및 접착 분자를 통해 면역계에 의해 매개된다(Hickey 2018; Ferhat et al JASN 2018 29:1272-1288). DKD의 복잡한 병리생리는(Brenner et al. 2001; Lewis et al. 2001) ACEi 및 ARB의 혈류역학 효과가 신장 기능의 진행성 상실로부터 불완전한 보호를 제공한다는 것을 의미한다.

따라서, 이 분야에 충족되지 않은 요구가 있다.

실시예에 나타내는 바와 같이 그리고 이하에 제시하는 이유로, ST2 수용체와 RAGE 둘 다를 통해 신호전달을 저해하는 것은 신장 손상에 대한 유효한 치료를 제공한다. 본 개시내용은 IL-33이 별개의 경로를 통해 상이한 신장 세포 유형에서 병리학적 신호전달을 매개한다는 것을 처음으로 입증한다. 더 구체적으로는, IL-33의 환원된 형태(redIL-33)는 ST2 경로를 통해 사구체 내피 세포에서 신호전달을 개시하는 것으로 나타났다. 또한, 산화된 IL-33(oxIL-33)이 신장 상피 세포의 하위 유형에서 RAGE/EGFR을 통해 신호전달을 개시하는 것으로 나타난, 지금까지 알려지지 않은 신호전달 경로가 기재된다. oxIL-33은 이전에 RAGE에 대한 리간드로서 인식되지 않았지만, RAGE 신호전달은 신장 질환 병리와 관련되었다. 따라서, 본 개시내용은 oxIL-33 신호전달을 저해함으로써 신장 질환을 치료하기 위한 신규한 메커니즘을 제공한다. 그러나, IL-33의 결합 및 중화는 또한 병리학적 redIL-33 활성을 저해할 수 있기 때문에, 치료 효과는 oxIL-33의 저해로 제한되지 않을 수도 있다. 더 나아가, 본 개시내용은 IL-33의 아이소폼이 둘 다 혈관사이세포에 대해 차별적, 잠재적으로 병리학적인 효과를 가진다는 것을 확인한다. RedIL-33은 이 세포 유형에서 염증 사이토카인의 생성을 개시하는 것으로 나타난 반면, oxIL-33은 혈관사이세포 증식을 유도한다. 혈관사이 확장은 특정 만성 신장 질환, 예컨대, 당뇨병성 신장 질환(DKD)의 병리학적 특질이다. 이렇게 해서, 본 개시내용은 신장에서 IL-33-매개 염증을 감소 또는 저해하고/하거나, oxIL-33 신호전달과 연관된 비정상적 상피 생리를 감소 또는 저해하고/하거나, 혈관사이 확장을 감소 또는 저해하기 위해 단일 사이토카인인 IL-33을 표적화함으로써, 신장 질환과 연관된 여러개의, 별개의 병리학적 경로를 차단하는 가능성을 입증한다.

따라서, 제1 양상은 신장 손상의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 ST2 신호전달과 RAGE 신호전달을 둘 다 저해하는 항-IL-33 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 환원된 IL-33 단백질(redIL-33)의 활성을 약화 또는 저해하여, ST2 신호전달을 저해한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 산화된 IL-33 단백질(oxIL-33)의 활성을 약화 또는 저해하여, RAGE 신호전달을 저해한다.

일부 실시형태에서, 신장 손상은 염증을 포함한다. 일부 실시형태에서, 신장 손상은 염증이다.

일부 실시형태에서, 신장 손상은 당뇨병성 신장 질환, 섬유증, 사구체신염(예를 들어, 비증식성(예컨대, 미세변화 사구체신염, 막 사구체신염, 국소조각토리굳음증) 또는 증식성(예컨대, IgA 신장병증, 막증식성 사구체신염, 감염 후 사구체신염, 및 급성 진행 사구체신염[예컨대, 굿파스쳐 증후군 및 맥관염 장애{베게너 육아종증 및 현미경 다발혈관염을 포함함}]), 전신 홍반 루푸스, 단백뇨증, 일측성 요관 폐쇄, 알포트 증후군, 다낭성 신장 질환(PCKD), 고혈압 토리굳음증, 만성 토리굳음증, 만성 폐쇄성 요로 병증, 만성 세뇨관 간질성 신염 및 허혈성 신장병증으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 신장 손상은 당뇨성 신장질환이다.

일부 실시형태에서, 치료제는 화학적 저해제 또는 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

일부 실시형태에서, 치료제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 이는 IL-33에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 redIL-33에 특이적으로 결합하고, redIL-33의 활성을 약화 또는 저해하여, ST2 신호전달을 저해한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (예를 들어, KinExA를 이용하여 측정될 때) 100 pM 이하, 또는 10 pM 이하, 예를 들어, 1 pM 이하, 예컨대, 0.5 pM, 특히, 0.05 pM의 결합 친화도로 redIL-33에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 10³ M^-1 sec^-1, 5×10³ M^-1 sec^-1, 10⁴ M^-1 sec^-1 또는 5×10⁴ M^-1 sec^-1 이상의 온 속도(k(on))로 redIL-33에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원 이의 결합 단편은 5×10^-1 sec^-1, 10^-1 sec^-1, 5×10^-2 sec^-1, 10^-2 sec^-1, 5×10^-3 sec^-1 또는 10^-3 sec^-1 이하의 오프 속도(k(off))로 redIL-33에 결합한다. 이들 결합 특징을 갖는 항체는, IL-33의 환원된 형태에 결합하고 격리시킴으로써, redIL-33의 저해를 가능하게 하거나 이의 활성을 약화시키기 때문에, 특히 유리하다. 결합 강도는 또한 표적 맞물림 전에(즉, ST-2에 대한 결합 전에) redIL-33을 격리시키는 데 충분할 수 있다. 또한, 결합 강도는 또한 redIL-33/결합 분자 복합체로부터의 redIL-33의 방출을 방지하여, red-IL-33의 산화된 형태로의 전환을 방지할 수 있다. 이렇게 해서, 이들 결합 분자 또는 항원-결합 단편은 따라서, oxIL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜, RAGE을 통해 신호전달을 저해한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 oxIL-33의 활성을 약화 또는 저해하여, RAGE 신호전달을 저해한다.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 37의 서열을 갖는 VHCDR1, 서열번호 38의 서열을 갖는 VHCDR2, 서열번호 39의 서열을 갖는 VHCDR3, 서열번호 40의 서열을 갖는 VLCDR1, 서열번호 41의 서열을 갖는 VLCDR2 및 서열번호 42의 서열을 갖는 VLCDR3을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 1의 서열을 갖는 VH 및 서열번호 19의 서열을 갖는 VL을 포함한다.

다른 양상에서, 대상체에서의 신장 손상을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 항-IL-33 치료제가 제공되되, 항-IL-33 치료제는 IL-33-매개 ST2 신호전달 및 IL-33-매개 RAGE 신호전달을 약화 또는 저해하기 위해 대상체에게 투여될 것이다.

일부 실시형태에서, IL-33-매개 RAGE 신호전달은 IL-33-매개 RAGE-EGFR 신호전달이다. 일부 실시형태에서, RAGE-EGFR 신호전달의 저해 또는 약화는 RAGE-EGFR 매개 효과를 약화 또는 저해한다. 일부 실시형태에서, RAGE-EGFR 매개 효과는 비정상적 상피 생리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비정상적 상피 생리는 비정상적 상피 리모델링이다. 일부 실시형태에서, RAGE-EGFR 매개 효과는 비정상적 혈관사이 확장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비정상적 혈관사이 확장은 비정상적 혈관사이세포 증식을 포함한다.

일부 실시형태에서, ST2 신호전달의 저해 또는 약화는 ST2 매개 효과를 약화 또는 저해한다. 일부 실시형태에서, ST2 매개 효과는 신장에서의 비정상적 염증을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비정상적 염증은 증가된 IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa 및/또는 IL1b 분비 또는 발현, 선택적으로 증가된 IL-4, IL-6, IL-8 및/또는 IL-12 분비 또는 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비정상적 염증은 MAP 키나제 활성화를 포함한다. 일부 실시형태에서, MAP 키나제 활성화는 p38 또는 JNK 키나제 활성화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염증은 내피, 사구체 또는 둘 다에 있다.

다른 양상에서, 신장 손상의 치료에서 사용하기 위한, 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제가 제공되되, 치료는 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 것을 추가로 포함한다.

다른 양상에서, 신장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제의 용도가 제공되되, 치료는 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 것을 추가로 포함한다.

다른 양상에서, 신장 손상의 치료에서 사용하기 위해, 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제가 제공되되, 상기 치료는 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 것을 추가로 포함한다.

다른 양상에서, 신장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서, 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜, RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제의 용도가 제공되되, 치료는 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 것을 추가로 포함한다.

다른 양상에서, 신장 손상의 치료에서 사용하기 위한, 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제, 및 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제가 제공된다.

다른 양상에서, 신장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제, 및 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜, RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제의 용도가 제공된다.

다른 양상에서, 신장 손상의 치료에서 사용하기 위한, 환원된 IL-33 및 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜, ST2 신호전달 및 RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제가 제공된다.

다른 양상에서, 신장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 환원된 IL-33 및 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달 및 RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제의 용도가 제공된다.

도 1: ERCB 코호트(a), Ju 2013 코호트(b) 및 Woroniecka 코호트(c)로부터 분석한 IL33의 사구체 및 관형 사이질 RNA 발현.
도 2: (a) 정상 및 당뇨병 신장에서의 ST2의 RNA 발현 및 (b) ST2의 RNA 발현은 신장 피질(정상 상태)에서 풍부화된다.
도 3: 전임상 CKD 마우스 모델에서의 IL33 mRNA의 발현
도 4: 전임상 CKD 마우스 모델에서의 RAGE mRNA의 발현
도 5: 항-ST2 및 항-RAGE 개입이 있는 db/db UNX 모델을 이용하는 전임상 CKD 모델 설계
도 6: 절대값으로 나타낸 아이소타입 대조군 항체 처리(NIP)와 비교되는 항-ST2 및 항-RAGE 처리 마우스에서 제13주 및 제15주에 측정한 db/db UNX CKD 모델에서의 UACR 변화
도 7: 제10주와 비교한 제13주 및 제15주에 변화%로서 나타낸, 아이소타입 대조군 항체 처리(NIP)와 비교되는 항-ST2 및 항-RAGE 처리 마우스에서 제13주 및 제15주에 측정한 db/db UNX CKD 모델에서의 UACR 변화.
도 8: 항-ST2 또는 아이소타입 대조군 항체 처리(NIP)로 처리할 때 db/db UNX 전임상 CKD 모델에서의 사구체 손상 점수(GDS)
도 9: MAP 키나제 인산화 항체 어레이 상에서 검출 어레이 각각에 대해 비처리 대조군과 비교되는 키나제 인산화의 배수 증가의 그레이스케일 히트맵을 나타낸다. 환원된 IL-33(각각 IL-33-01 및 IL-33-16)은 기준선 초과의 임의의 신호를 야기하지 않았다. oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 여러 키나제에서 증가된 인산화를 야기하였다;
도 10: 수용체 타이로신 키나제(RTK) 활성 어레이 상에서의 각 자극 상태에 대한 신호 패턴을 나타낸다. oxIL-33(각각 환원된 IL33-01 및 IL33-16은 아님)은 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대응하는 RTK 어레이 상의 양성 신호를 촉발하였다. 도트 강도는 수용체 타이로신 키나제 인산화와 상관 관계가 있다;
도 11a: 정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포에서 pEGFR(Tyr1068) 활성이 IL-33 또는 EGFR 리간드의 농도가 증가됨에 따라 자극되었다는 것을 나타낸다. oxIL-33은 EGF, HB-EGF 및 TGFα와 유사하게 EGFR의 인산화를 촉진시켰지만, 환원된 IL-33(IL33-01)은 그렇지 않았다;
도 11b: A549 세포에서의 pEGFR(Tyr1068) 활성이 IL-33 또는 EGFR 리간드의 농도가 증가됨에 따라 자극되었다는 것을 나타낸다. oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 NHBE 세포에서 보이는 것과 유사한 패턴으로 EGF, HB-EGF 및 TGFα와 유사하게 EGFR의 인산화를 촉진시켰지만, 환원된 IL-33(IL-33-01)은 그렇지 않았다;
도 11c: A549 세포에서의 pEGFR(Tyr1068) 활성이 IL-33, EGFR 리간드 또는 RAGE 리간드의 농도가 증가됨에 따라 자극되었다는 것을 나타낸다. oxIL-33은 EGF와 유사하게 EGFR의 인산화를 촉진시켰지만, 야생형(WT) IL-33(IL-33-01), C->S 돌연변이된(mut) IL-33(IL-33-16) 또는 RAGE 리간드는 그렇지 않았다;
도 12: 산화된 IL-33이 웨스턴 블롯에 의해 분석된 바와 같은 EGFR 경로(EGFR, PLC, AKT, JNK, ERK 1/2, p38)에 관련된 여러 분자의 인산화를 유도한다는 것을 나타낸다;
도 13: oxIL-33에 의해 유도된 STAT5 인산화가 아이소타입 대조군에 비해 증가된 용량의 항-EGFR 항체에 의해 감소된다는 것을 나타낸다;
도 14: 항-EGFR에 의한 면역침전 후에 웨스턴 블롯에 의한 EGFR, RAGE 또는 IL-33의 검출을 나타낸다. IL-33 및 RAGE는 oxIL-33에 의한 NHBE 자극 후 EGFR과 함께 공동침전시켰고, 이는 이들이 복합체를 형성한다는 것을 시사한다. RAGE는 EGF에 비해 oxIL-33 신호전달에 대해 고유한 것으로 나타난다;
도 15a: oxIL-33이 RAGE에 직접 결합한다는 것을 나타낸다. HMGB1은 알려진 RAGE 리간드이며, 본 연구에서 양성 대조군으로서 작용한다;
도 15b: oxIL-33이 EGFR에 직접 결합하지 않는다(그러나 알려진 EGFR 리간드 EGF는 직접 결합한다)는 것을 나타낸다. 그러나, RAGE가 oxIL-33과 조합하여 이 분석에 첨가될 때, EGFR 결합이 보인다;
도 16: 항-EGFR 또는 항-RAGE에 의한 면역침전 다음에, 표시된 시점에 oxIL-33에 의한 활성화 후 야생형 및 RAGE-결핍 A549 세포에서의 EGFR, RAGE 및 IL-33에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다;
도 17: oxIL-33-01에 의해 유도되는 STAT5 인산화는 항-RAGE 항체에 의해 감소되지만 항-ST2 항체에 의해서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다;
도 18: (a) 염증 매개체에 반응한 IL33의 1차 근위관 상피 세포(PTEC) 분비를 나타낸다. NFkB 전좌에 의해 검출되는 외인성 IL-1b에 대한 PTEC 반응이 또한 나타나지만, 외인성 redIL-33에 대해서는 나타나지 않는다(b). (c) 염증 사이토카인 IL-6, IL8, TNFa 및 IL1b를 분비함으로써 PTEC가 용량-의존적 방식으로 IL-33에 반응하지 않는다는 것을 나타낸다. (d) PTEC는 redIL-33로 처리할 때 기준선 수준 초과의 ST2 신호전달 축 활성화의 2개의 하류 매개체인 p38 또는 JNK의 활성화를 증가시키지 않는다는 것을 나타낸다. (e) 인산화된 EGFR(pEGFR)의 검출이 외인성 oxIL33 또는 EGF에 의한 처리 시 PTEC에서 증가하지만, redIL-33 또는 S1001A9(RAGE 리간드)는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. oxIL33 처리 시 PTEC에서 증가된 pEGFR은 항-RAGE 및 항-EGFR 항체의 존재 하에 감소된다(f). (g) KIM-1이 oxIL-33에 대한 노출 시 PTEC에서 증가되지만, 환원된 IL-33은 그렇지 않다는 것을 나타낸다
도 19: (a) 염증 매개체에 반응하여 IL33의 1차 사구체 내피 세포(GEnC)를 나타낸다. (b) GEnC가 NFkB 전좌를 증가시킴으로써 외인성 redIL33 처리에 반응한다는 것을 나타낸다. 반응은 항-IL-33 항체의 존재 하에 차단된다(c). (d) GEnC는 redIL-33에 의한 자극 시 염증 사이토카인 IL-6 및 IL-8을 분비시키지만, oxIL-33은 그렇지 않다는 것을 나타낸다. IL-8의 분비. redIL33에 의한 처리 시 GEnC로부터의 TNFa, IL1b 및 IL-6은 용량-의존적 방식으로 증가한다(e)
도 20: (a) 1차 사구체 내피 세포(GEnC)가 IL33에 반응하여 염증 사이토카인을 분비한다는 것을 나타낸다. 분비는 항-IL33 항체의 존재 하에 차단된다. (b) redIL-33이 33-640087_7B의 존재 하에 저해되는 p38 및 JNK 키나제 활성을 활성화시킨다는 것을 나타낸다.
도 21: (a) 인간 1차 혈관사이세포에서의 IL-33 신호전달을 나타낸다. 혈관사이세포는 인터페론 감마 및 TNF 알파에 의해 응력을 받을 때 IL-33 수준을 상향조절한다. 혈관사이세포는 증가된 농도의 IL-33에 노출 시 용량-의존적 방식으로 IL-8을 분비한다(b). (c) 혈관사이세포로부터의 IL-8 분비가 33-640087_7B의 존재 하에 저해된다는 것을 나타낸다. (d) 증가된 농도의 oxIL-33이 혈관사이세포 증식을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 22a: 환원된 IL-33, oxIL-33 또는 EGF에 의한 처리 후 A549 세포에 대한 상대 상처 치유 밀도를 나타낸다. 막대 다이어그램은 조건 당 6개의 기술적 복제물로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다;
도 22b: 환원된 IL-33, oxIL-33 또는 EGF에 의한 처리 후 NHBE 세포에 대한 상대 상처 치유 밀도를 나타낸다. 막대 다이어그램은 조건 당 6개의 기술적 복제물로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다;
도 23: 배지 단독(비자극 대조군), 환원된 IL-33, 산화된 IL-33, 또는 항-ST2, 항-RAGE 또는 항-EGFR의 존재 하에 산화된 IL-33으로 처리된 NHBE 세포의 긁힌 상처 치유 봉합 백분율을 나타낸다. 막대 다이어그램은 조건 당 6개의 기술적 복제물로부터의 평균 및 SEM을 나타낸다.

일반 정의

본 명세서에서 이용되는 "단리된"은 비-자연적 환경의, 특히 자연으로부터 단리된 단백질을 나타내며, 예를 들어, 용어는 생체내 단백질이나 인간 또는 동물 신체에서 채취한 샘플 내 단백질은 포함하지 않는다. 일반적으로 단백질은 담체, 예컨대, 액체 또는 배지 중에 있을 것이거나 제형화, 냉동 또는 동결 건조될 수 있고, 이들 형태가 모두 "단리된" 것으로 적절하게 포괄될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 단리된이란 겔, 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석 또는 유사한 것에서 이용되는 겔 내의 단백질을 나타내지 않는다.

본 명세서에서 이용되는 'IL-33' 단백질은 인터류킨 33, 특히 포유류 인터류킨 33 단백질, 예를 들어, UniProt 번호 095760으로 기탁된 인간 단백질을 나타낸다. 이 독립체는 단일 종이 아니지만, 대신에 환원 및 산화된 형태로서 존재한다(Cohen et al Nature Comms). 생체내 그리고 시험관내 환원 형태의 빠른, 예를 들어, 5분 내지 40분 기간 내의 산화에 기반하여, 일반적으로 IL-33에 대한 선행 기술에서의 언급은 실제로 산화 형태에 대한 언급이다. 용어 "IL-33" 및 "IL-33 폴리펩타이드" 및 "IL-33 단백질"은 상호 호환적으로 사용된다. 특정 실시형태에서, IL-33은 전장이다. 다른 실시형태에서, IL-33은 성숙, 절단된 IL-33(아미노산 112 내지 270)이다. 최근의 연구는 전장 IL-33이 활성이라는 것을 시사한다(문헌[Cayrol and Girard, Proc Natl Acad Sci USA 106(22): 9021-6 (2009)]; 문헌[Hayakawa et al., Biochem Biophys Res Commun. 387(1):218-22 (2009)]; 문헌[Talabot-Ayer et al, J Biol Chem. 284(29): 19420-6 (2009)]). 그러나, 비제한적으로 aa 72 내지 270, 79 내지 270, 95 내지 270, 99 내지 270, 107 내지 270, 109 내지 270, 111 내지 270, 112 내지 270을 포함하는 N-말단 가공되거나 절단된 IL-33이 향상된 활성을 가질 수 있다(Lefrancais 2012, 2014). 다른 실시형태에서, IL-33은 전장 IL-33, 이의 단편, 또는 IL-33 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 여기서 IL-33의 단편 또는 IL-33 변이체 폴리펩타이드는 활성 IL-33의 일부 또는 모든 기능적 특성을 보유한다.

산화된-IL-33, oxIL-33, IL-33-DSB(이황화결합) 및 DSB IL-33은 본 명세서에서 상호 호환적으로 이용된다. 산화된 IL-33은, 예를 들어, 비환원성 조건 하에 웨스턴 블롯 분석에 의해, 특히 대응하는 환원 형태보다 4 Da 적은 질량을 갖는 구별되는 밴드로 가시적인 단백질을 나타낸다. 특히, 이는 독립적으로 시스테인 208. 227, 232 및 259로부터 선택된 시스테인 사이에 1개 또는 2개의 이황화결합을 갖는 단백질을 나타낸다. 산화된 IL-33은 RAGE에 결합하고, RAGE-매개 신호전달을 촉발시키는 IL-33의 형태를 지칭한다. 일 실시형태에서, 산화된 IL-33은 ST2에 대한 결합을 나타내지 않는다.

환원된 IL-33 및 redIL-33은 본 명세서에서 상호 호환적으로 이용된다. 본 명세서에서 이용되는 환원된 IL-33은 ST2에 결합하고 ST2 의존적 신호전달을 유발하는 IL-33의 형태를 나타낸다. 특히, 환원 형태의 시스테인 208, 227, 232 및 259는 이황화결합되지 않는다. 본 명세서에서 이용되는 redIL-33의 활성 단편은 redIL-33과 비슷한 활성, 예를 들어, 유사한 정도의 ST2-의존적 신호전달을 갖는 단편을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 활성 단편은 전장 redIL-33의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 활성이다.

본 명세서에서 이용되는 "ST2 신호전달"은 ST2에 의한 IL-33 인식이 세포 표면 상에서의 IL1-RAcP와의 이량체화, 및 세포 내에서, 수용체 복합체 성분 MyD88, TRAF6 및 IRAK1-4의 세포내 TIR 도메인에 대한 보충(recruitment)을 촉진하는 IL-33/ST2 시스템을 나타낸다. ST2 수용체는 신장에 위치될 수 있는 Th2 세포, 비만 세포 및 기타 면역 세포 유형에 의해 기준선에서 발현된다. IL-33의 세포외 형태는 ST2에 결합하여 표적 세포를 자극한 후 NFκB 및 MAP 키나제 경로를 활성화함으로써, 사이토카인 및 케모카인의 생성을 포함하는 범위의 기능적 반응을 야기한다. 따라서, ST2-의존적 신호전달은 IL-33의 ST2와의 상호작용 교란에 의해 또는 대안적으로 IL-1RAcP와의 상호작용 방해에 의해 방해를 받을 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 ST-2 신호전달 "저해 또는 약화"는 ST-2/IL-33 시스템을 통해 신호전달을 감소 또는 차단시키는 것을 지칭한다. ST-2 신호전달 정도(및 그에 따른 이의 저해 또는 약화)는 ST-2 신호전달 결과로서 상향조절된 염증성 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-6, IL-8 및 IL-12)의 농도 수준을 분석함으로써 결정될 수 있다. 사이토카인의 농도는, 예를 들어, ELISA 분석 또는 정량적 질량 분석법을 이용하여, 본 명세서에 기재된 치료 방법을 받고 있는 대상체로부터 얻는 생물학적 샘플로부터 측정될 수 있다.

"AGER 신호전달"로도 지칭되는 "RAGE 신호전달"은 IL-33이 수용체에 결합하여 전염증 유전자 활성화를 생성하는 IL-33/RAGE 시스템을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 RAGE 신호전달의 저해 또는 약화는 RAGE/IL-33 시스템을 통한 병리학적 신호전달, 예컨대, 전-염증 신호전달, 또는 사구체에서 비정상적 상피 리모델링 또는 혈관사이세포 확장을 유도하는 신호전달을 감소 또는 차단시키는 것을 지칭한다.

본 개시내용에서 사용되는 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 이의 가장 넓은 의미로 항원성 결정소에 특이적으로 결합하는 분자를 나타낸다. 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원-이의 결합 단편은 IL-33, 특히 redIL-33 및/또는 oxIL-33에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 결합 분자는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

본 명세서에서 이용되는 "항체"는 보다 상세히 아래에서 논의되는 면역글로불린 분자, 특히 전장 항체 또는 전장 항체를 포함하는 분자, 예를 들어, DVD-Ig mole 등을 나타낸다.

"결합 단편" 또는 "항원-결합 단편"은, 예를 들어, 결합 도메인을 포함하는, 특히 6개 CDR, 예컨대, 중쇄 가변 영역 내의 3개 CDR 및 경쇄 가변 영역 내의 3개 CDR을 포함하는, 항체 단편의 에피토프/항원 결합 단편이다.

전장 항체, 예컨대, 천연 유래 항체를 특이적으로 언급하지 않는 한, "항-IL-33 항체"라는 용어는 전장 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 항원-결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체, 예로, 천연 유래 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 조작 항체 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 단편을 포괄한다.

본 명세서에서 사용되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 이들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 항원, 예로, 본 명세서에 개시되는 표적 폴리펩타이드(예로, 전장 또는 성숙 IL-33)의 에피토프(들) 또는 부분(들)에 관해 기재되거나 명시될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩타이드 부분은 "에피토프", 또는 "항원 결정소"이다. 표적 폴리펩타이드는 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로 적어도 2개의 에피토프를 포함하며, 항원의 크기, 입체형태 및 유형에 따라 임의 수의 에피토프가 포함될 수 있다. 또한, 표적 폴리펩타이드 상의 "에피토프"는 비-폴리펩타이드 요소일 수도 있고 또는 이를 포함할 수도 있음이, 예로 에피토프에 탄수화물 측쇄가 포함될 수 있음이 주지되어야 한다.

항체에 대한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 4개 내지 5개 아미노산인 것으로 여겨진다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 바람직하게는 적어도 7개, 보다 바람직하게는 적어도 9개 및 가장 바람직하게는 적어도 약 15개 내지 약 30개 아미노산을 함유한다. CDR은 이의 3차 형태로 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인식할 수 있으므로, 에피토프를 포함하는 아미노산이 반드시 인접할 필요는 없고, 일부 경우는 심지어 동일한 펩타이드쇄 상에 없을 수도 있다. 본 개시내용에서 사용되는 항-IL-33 항체에 의해 인식되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 IL-33의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 보다 바람직하게는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 약 15개 내지 약 30개의 인접하거나 인접하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 "치료하다" 또는 "치료"와 같은 용어는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내며, 여기서 목적은 원치 않는 생리적 변화 또는 장애, 예컨대, 염증성 질환의 진행을 예방하거나 지연하는(경감하는) 것이다. 유리한 또는 원하는 임상 결과는 검출 가능하든 검출 불가능하든 관계없이 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 병태의 개선 또는 경감, 및 (부분적이든지 전체적이든지) 관해를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존에 비해 생존이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 질환 또는 장애를 이미 갖는 대상체뿐만 아니라 상기 질환 또는 장애를 갖기 쉬운 대상체, 또는 상기 질환 또는 장애가 예방되어야 할 대상체를 포함한다.

"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 그에 대한 진단, 예후 또는 요법이 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간; 가축 동물; 농장 동물; 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 양, 소 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 환자는 인간이다.

본 명세서에서 이용되는 "의 활성을 약화시킨다"란 관련 활성의 감소 또는 관련 활성의 정지를 나타낸다. 일반적으로 약화 및 저해는 맥락 상 달리 나타내지 않는 한 본 명세서에서 상호 호환적으로 이용된다.

치료 용도

본 명세서에 기재된 바와 같은, ST2 수용체와 RAGE 둘 다를 통해 신호전달을 저해하는 것은 신장 손상의 유효한 치료를 제공할 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 "신장 손상"은, 예를 들어, 질병 또는 외상(신체 또는 화학적 외상을 포함함)으로부터의 신장의 장기간 또는 만성 질환 또는 손상을 지칭한다. 다시 말해서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "신장 손상"은 신장 기능이 만성으로 손상되고/되거나 신장 조직이 만성으로 손상된 질환을 지칭하되, 예를 들어, 이들 이상은 적어도 3개월 동안 지속된다.

본 명세서에 기재된 방법은 적어도 부분적으로 IL-33에 의해 매개되는 신장 손상의 치료에 관한 것이다. IL-33의 수준은 신장 손상을 갖는 대상체에서의 신장에서 국소적으로 증가되는 것으로 나타났다. 환원된 IL-33(redIL-33)은 수용체 ST2에 직접 결합함으로써 신호전달을 활성화시키는 것에 의해 신장에서 염증을 자극한다. 본 개시내용은 IL-33-매개 ST2가 내피세포 및 혈관사이세포를 포함하는 여러 세포 유형에서 생긴다는 것을 확인한다. 본 개시내용은 또한 IL-33의 산화된 형태(oxIL-33)가 RAGE/EGFR를 통해 신호전달을 개시하는 지금까지 알려지지 않은 IL-33 신호전달 경로의 존재를 기재한다. 예로서 RAGE-EGFR 신호전달이 신장 상피에서 활성화된다는 것을 기재한다. 놀랍게도, 본 개시내용은 또한 oxIL-33-매개 RAGE/EGFR 신호전달이 신장의 만성 질환, 예컨대, 당뇨병성 신장 질환에서 관찰된 혈관사이 확장에 잠재적으로 기여하는 혈관사이세포 증식의 증가를 포함한다는 것을 확인한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 신장 질환의 IL-33-매개 염증 양상, 예컨대, ST2-신호전달에 의해 매개되는 것의 치료에 적용 가능할 뿐만 아니라, RAGE/EGFR을 통해 oxIL-33 병리학적 신호전달에 의해 매개되는 신장 질환 요소의 치료에도 적용 가능하다.

더 구체적으로는, IL-33-매개 ST2-의존적 및 RAGE-의존적 신호전달(예컨대, RAGE-EGFR 신호전달)의 이중 차단은 신장 손상을 갖는 대상체의 치료를 위한 개선된 결과를 제공할 수 있다. 신장 질환의 생체내 모델링은 IL-33과 신장 손상 수준 사이의 상관관계를 나타내었다. 환원된 형태의 IL-33은 잘 기재되어 있는 ST2 신호전달 경로를 통해 신호를 전달한다. ST2 경로를 통한 신호전달은 신장 손상 및 질환의 병리에 기여하는 염증 반응을 생성한다.

또한, RAGE를 통한 병리학적 신호전달은 다양한 신장 장애와 연관되었다(D'Agati et al Nat Rev Nephrol 2010:352-60). RAGE는 최종 당화 산물에 결합하는 IgG 슈퍼패밀리의 다중-리간드 수용체이다. 이렇게 해서, RAGE 신호전달의 길항작용은 만성 신장 질환의 치료를 위한 치료적 전략으로서 제안되었다.

그러나, RAGE가 다중리간드 수용체이기 때문에(Fritz Trends in Biochemical Sciences 2011 36:625-632), RAGE의 직접 저해는 신장 질환에서의 임의의 효능을 넘어서는 비표적(off target) 효과 및 독성을 가질 가능성이 있다. 신장 상피 생물학과 관련하여 RAGE의 지금까지 알려지지 않은 리간드를 저해함으로써, 본 명세서에 개시된 치료 전략은 RAGE의 완전한 저해와 비교할 때 유리한 것으로 여겨진다. 이는 RAGE 리간드인 oxIL-33을 직접 저해함으로써 병리학적 RAGE 신호전달의 저해 또는 약화를 가능하게 하기 때문이다. IL-33 발현은 신장 손상을 갖는 대상체의 혈청에서 일반적으로 낮다(문헌[Bao et al. J Clin Immunol 2012:587-94; Caner et al. Renal Failure 2014:78-80]; 문헌[Musolino et al. Br. J. Haematol 2013:709-710 Mok et al. Rheumatology 2010:520-527]). 이렇게 해서, oxIL-33-RAGE-매개 신호전달의 표적화는 병적 신장 손상의 이들 요소의 저해 또는 약화(즉, 둔화)를 가능하게 하는 한편, RAGE를 직접 저해함으로써 나타날 수 있는 비표적 독성을 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 이는 본 개시내용이 질환 부위, 즉, 신장에서 우세하게 발견되는 RAGE 리간드를 표적화함으로써 국한된 방식으로 병리학적 RAGE 신호전달의 저해 또는 약화를 가능하게 하기 때문이다. 게다가, 전략은 redIL-33 ST2 경로의 저해와 조합되어, 신장 손상에 관련된 2가지의 중요한 병리학적 경로의 저해 및/또는 약화를 가능하게 할 수 있다.

실시예에서 입증되는 바와 같이, IL-33 신장 발현은 당뇨병성 신장병증을 갖는 다수 대상체에서 뿐만 아니라 신장 질환의 다수의 전임상 모델에서 상승된다. ST2와 RAGE IL-33 신호전달 경로가 둘 다 신장 상피, 내피 및 사구체에서 활성화된다는 것을 입증한다. 실시예는 또한 IL-33 신호전달 활성을 저해하는 것이 염증 매개체의 방출을 방지한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 개시내용은 IL-33에 의해 매개되는 ST2 의존적 신호전달과 RAGE 의존적 신호전달을 둘 다 저해 또는 약화시킴으로써 신장 손상의 치료를 위한 신규한 치료 전략을 제공한다.

이렇게 해서, 신장 손상의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-IL-33 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항-IL-33 치료제는 ST2 신호전달과 RAGE 신호전달을 둘 다 저해하기 위해 투여된다. 치료제는 본 명세서의 다른 곳에 정의되는 바와 같다.

본 개시내용은 또한 산화된 IL-33이 RAGE에 결합하고, 이것이 결국 EGFR과 복합체화된다는 것을 처음으로 나타낸다. 이렇게 해서, 본 개시내용은 산화된 IL-33의 신호전달을 저해하여, RAGE의 잠재적 oxIL-33-매개 병리학적 활성화를 저해할 수 있는 치료제의 사용 가능성을 제공한다. 예를 들어, 치료제는 RAGE-EGFR 복합체화를 저해할 수 있다. 본 명세서에 개시된 데이터는 RAGE-EGFR 복합체 형성을 방지하는 것이 oxIL-33 매개 혈관사이세포 증식을 저해함으로써 oxIL-33에 의해 유도되는 관형 상피 기능장애를 방지하고/하거나 혈관사이 기능장애, 예컨대, 혈관사이 확장을 방지할 수 있는 IL-33-매개 RAGE/EGFR 신호전달을 방지한다는 것을 입증한다.

따라서, ST2 신호전달을 저해하는 것에 추가로, 본 명세서에 개시된 용도를 위한 방법 및 치료제는 신장 손상의 치료를 위해 RAGE-EGFR 신호전달을 저해한다.

일부 예에서, 치료제는 EGFR 신호전달을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 RAGE-EGFR 신호전달을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 산화된-IL33-RAGE-EGFR 신호전달을 저해한다.

일부 예에서, 치료제는 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 RAGE-EGFR 복합체의 형성을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 산화된-IL33-RAGE-EGFR 복합체의 형성을 저해한다.

일부 예에서, 치료제는 EGFR의 활성화를 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 EGFR의 인산화를 저해한다.

일부 예에서, 치료제는 RAGE-EGFR 매개 효과를 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 RAGE-EGFR 복합체에 의해 매개되는 효과를 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 산화된 IL33-RAGE-EGFR 복합체에 의해 매개되는 효과를 저해한다.

일부 예에서, 치료제는 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 저해하여, RAGE-EGFR 복합체화를 저해함으로써, RAGE-EGFR 매개 효과, 예컨대, 하류의 신호전달을 저해한다.

일부 예에서, 치료제는 IL-33-매개 EGFR 효과를 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 IL-33-매개 EGFR 신호전달을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 산화된 IL-33-매개 EGFR 효과를 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 산화된 IL-33-매개 EGFR 신호전달을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 산화된 IL-33-매개 RAGE-EGFR 효과를 저해한다. 적합하게는, 치료제는 산화된 IL-33-매개 RAGE-EGFR 신호전달을 저해한다.

일부 예에서, RAGE-EGFR 매개 효과는 RAGE-EGFR 복합체에 의해, 예컨대, 산화된 IL-33-RAGE-EGFR 복합체에 의해 야기된다. 이러한 효과는 전형적으로는 본 명세서에서 RAGE 신호전달, EGFR 신호전달 또는 RAGE-EGFR 신호전달로서 지칭될 수 있는 하류의 신호전달을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이러한 신호전달은 인산화 및/또는 케모카인 방출을 포함할 수 있다.

본 명세서에 열거되는 바와 같은 "RAGE-EGFR 매개 효과"는 세포막에서 EGFR과 RAGE의 복합체화 및 얻어진 비정상적 EGFR 활성에 의해 야기되는 임의의 생리학적 효과를 지칭한다. 이러한 RAGE-EGFR 매개 효과는 비정상적 신장 상피 생리로서 존재할 수 있다. 비정상적 신장 상피 생리는 장벽 무결성(barrier integrity); 조직과 강 사이의 화학물질 독립체의 조절 및 교환; 강 내로의 화학물질의 분비; 부적응 조직 회복; 및/또는 조직 리모델링(예를 들어, 섬유증)에 대해 부정적인 효과를 포함할 수 있다.

일부 예에서, 이러한 RAGE-EGFR 신호전달은 EGFR의 인산화 및 EGFR 경로에서의 후속적 인산화 성분, 예컨대, EGFR, PLC, JNK, MAPK/ERK 1/2, p38 및 STAT5를 포함한다. 적합하게는 EGFR 신호전달은 타이로신 키나제, 예컨대, JNK, MAPK/ERK, p38의 인산화를 포함한다.

따라서, 일부 예에서, 치료제는 EGFR 경로에서 성분의 인산화를 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 다음 중 어느 하나의 인산화를 저해한다: EGFR, PLC, JNK, MAPK/ERK 1/2, p38 및 STAT5. 일부 예에서, 치료제는 다음 중 어느 하나의 EGFR-매개 인산화를 저해한다: EGFR, PLC, JNK, MAPK/ERK 1/2, p38 및 STAT5. 일부 예에서, 치료제는 타이로신 키나제의 인산화를 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 JNK, MAPK/ERK, p38로부터 선택된 타이로신 키나제의 인산화를 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 JNK, MAPK/ERK 및 p38로부터 선택된 타이로신 키나제의 EGFR-매개 인산화를 저해한다.

따라서, 일부 예에서, 치료제는 케모카인의 방출을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 IL-8의 방출을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa 및/또는 IL1b의 방출을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 케모카인의 EGFR-매개 방출을 저해한다. 일부 예에서, 치료제는 IL-8의 EGFR-매개 방출을 저해한다.

일부 예에서, RAGE-EGFR 매개 효과는 비정상적 혈관사이 확장으로서 존재할 수 있다. 일부 예에서, 비정상적 혈관사이 확장은 증가된 혈관사이 확장을 포함한다. 일부 예에서, 혈관사이 확장은 비정상적 혈관사이세포 증식을 포함한다. 일부 예에서, 비정상적 혈관사이세포 증식은 증가된 혈관사이세포 증식을 포함한다.

신장 손상의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 방법 및 치료제.

본 개시내용은 또한 신장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서 본 명세서의 다른 곳에 정의되는 바와 같은 치료제 중 임의의 것의 용도를 제공한다.

본 개시내용의 방법은 신장 질환의 전임상 모델에서 염증 부담을 감소시키는 것으로 나타났다. 더 나아가, 본 개시내용은 만성 신장 질환을 갖는 대상체가 상승된 수준의 인터류킨-33을 발현시킨다는 것을 입증한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 상기 방법은 염증인 신장 손상의 치료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 염증을 포함하는 신장 손상의 치료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 만성 염증을 포함하는 신장 손상의 치료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 신장 손상과 연관된 염증을 치료 또는 예방할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 신장 손상과 연관된 급성 염증을 치료 또는 예방할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 신장 손상과 연관된 만성 염증을 치료 또는 예방할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 신장 손상과 연관된 염증 병태의 치료에 유용할 수 있다.

일부 예에서, 상기 방법은 IL-33-매개 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서, IL-33-매개 ST2 신호전달은 redIL-33-매개 ST2 신호전달이다. 일부 예에서, IL-33-매개 ST2 신호전달의 저해 또는 약화는 ST2-매개 효과의 저해 또는 약화를 포함한다.

일부 예에서, ST2-매개 효과는 신장에서의 비정상적 염증이다. 일부 예에서, 신장에서의 비정상적 염증은 신장에서의 증가된 염증이다. 일부 예에서, 비정상적 염증은 내피에 있다. 일부 예에서, 비정상적 염증은 사구체에 있다. 일부 예에서, 사구체에서의 비정상적 염증은 혈관사이세포 자극의 결과이다. 일부 예에서, 비정상적 염증은 증가된 IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa 및/또는 IL1b 분비 또는 발현, 선택적으로 증가된 IL-4, IL-6, IL-8 및/또는 IL-12 분비 또는 발현을 포함한다. 일부 예에서, 비정상적 염증은 증가된 IL-8 분비 또는 발현을 포함한다. 일부 예에서, 비정상적 염증은 MAP 키나제 활성화를 포함한다. 일부 예에서, MAP 키나제 활성화는 p38 또는 JNK 키나제 활성화를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 신장 손상과 연관된 하나 이상의 증상을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 체중감소, 부종, 숨가쁨, 피로, 불면증, 경련, 구역, 피부 가려움증 또는 두통을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 식욕을 개선시킬 수 있다. 이들 증상 중 다수는 신장 손상과 연관된 신장 기능의 손상을 겪는 것과 관련될 수 있다. 이렇게 해서, 본 명세서에 개시된 방법을 수행함으로써 신장 손상을 감소시키는 것에 의한 신장 기능의 개선은 이들 증상 중 임의의 하나 이상을 개선시킬 수 있다.

본 명세서에 정의된 바와 같은 "개선시키다"는 질환의 하나 이상의 증상에 대해 대상체의 문제들이 본 명세서에 기재된 방법을 수행함으로써 줄어든다는 것을 의미한다. 대상체의 개선은 대상체 내에서 증상이 나타나는 횟수를 평가하고 방법을 수행할 때 시간이 지남에 따라 이러한 발생이 어떻게 감소하는지를 알아보기 위해 모니터링함으로써 확인될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 대상체에서 소변 알부민:크레아티닌비(UACR)를 감소시킨다. 예를 들어, 방법을 수행할 때, 대상체의 UACR은 낮아질 수 있다. UACR은 대상체로부터 수집된 소변 샘플 중의 총 알부민 양을 크레아티닌 농도에 정규화시킨 척도이다. UACR 점수가 높을수록 대상체는 소변 중 알부민 농도가 증가되었다(단백뇨증)는 것을 나타낸다. 알부민은 정상적으로는 신장 손상의 결과로서 소변에 방출된다. 따라서, 상기 방법은 대상체에서의 UACR 점수를 낮추기 위해 사용될 수 있되, "낮추다"는 UACR 점수가 요법의 개시 전 UACR에 비해 치료 동안 또는 치료 후에 감소된다는 것을 의미한다. UACR 점수는 당업계에서 입수 가능한 수많은 UACR 검사 중 어느 하나를 이용하여 환자로부터 수집한 소변 샘플로부터 측정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 신장 손상은 당뇨병성 신장 질환, 섬유증, 사구체신염(예를 들어, 비증식성(예컨대, 미세변화 사구체신염, 막 사구체신염, 국소조각토리굳음증) 또는 증식성(예컨대, IgA 신장병증, 막증식성 사구체신염, 감염 후 사구체신염, 및 급성 진행 사구체신염[예컨대, 굿파스쳐 증후군 및 맥관염 장애{베게너 육아종증 및 현미경 다발혈관염을 포함함}]), 전신 홍반 루푸스, 단백뇨증, 일측성 요관 폐쇄, 알포트 증후군, 다낭성 신장 질환(PCKD), 고혈압 토리굳음증, 만성 토리굳음증, 만성 폐쇄성 요로 병증, 만성 세뇨관 간질성 신염 및 허혈성 신장병증으로부터 선택된다. 이들 병태는 모두 연관된 염증 성분을 갖고, 따라서 본 명세서에 기재된 방법 또는 치료제를 이용하여 치료로부터 유익을 얻을 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 당뇨병성 신장 질환을 치료하기 위한 것이다. 본 명세서에 정의된 당뇨병성 신장 질환은 II형 당뇨병의 진단 및 30 내지 75 ㎖/분의 추정 사구체여과율(eGFR)을 지칭한다. 전형적으로, DKD는 100 내지 3000 ㎎의 알부민 대 g의 크레아티닌의 UACR 비의 진단으로서 추가로 정의된다.

eGFR을 계산하기 위한 시험은 당업계에서 이용 가능하다. 이러한 시험은 전형적으로 혈청 크레아티닌 값, 혈청 시스타틴 C 값, 연령, 성별 및 인종을 고려한다. 계산은 또한 체표면 조절값, 예컨대, 신장 및/또는 체중을 고려할 수 있다. 전형적으로, 크레아티닌 값과 시스타틴 C 값은 표준화된 값이다. 예를 들어, 크레아티닌 값은 동위원소 희석 질량분석법(IDMS)에 대해 추적 가능하다. 시스타틴 C 값은 국제임상화학회 및 진단검사의학(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine: IFCC)/표준물질 및 측정 연구소(Institute for Reference Materials and Measurements: IRMM) 워킹 그룹에 대해 추적 가능하여야 한다. 전형적으로, 30 내지 75 ㎖/분의 eGFR은 신장 기능의 경증 내지 중등증-내지-중증을 갖는 대상체를 나타낸다. 이렇게 해서, 상기 방법은 신장 기능의 경증 내지 중증등-내지-중증의 상실을 갖는 DKD의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 DKD를 갖는 대상체에서 신장 기능을 개선시키기 위한 것이다.

본 명세서에 기재된 방법은 신장 손상의 치료를 위해 공지된 방법과 조합하여 수행될 수 있다. 신장 손상과 연관된 합병증을 포함하는 신장 손상에 대한 알려진 치료는 1) 안지오텐신 전환효소(ACE) 저해제, 2) 스타틴, 3) 이뇨제, 4) 에리스로포이에틴, 5) 철 보충제, 6) 안지오텐신-수용체 차단제, 7) 스테로이드 또는 8) 나트륨-글루코스 수송 단백질-2 저해제(SGLT2i - 글리플로진으로도 알려짐)의 투여를 포함한다.

따라서, 상기 방법은 ACE 저해제를 이용하는 요법을 받은 적이 있거나 받고 있는 대상체에서의 사용을 위한 것일 수 있다.

따라서, 상기 방법은 스타틴을 이용하는 요법을 받은 적이 있거나 받고 있는 대상체에서의 사용을 위한 것일 수 있다.

따라서, 상기 방법은 이뇨제를 이용하는 요법을 받은 적이 있거나 받고 있는 대상체에서의 사용을 위한 것일 수 있다.

따라서, 상기 방법은 EPO를 이용하는 요법을 받은 적이 있거나 받고 있는 대상체에서의 사용을 위한 것일 수 있다.

따라서, 상기 방법은 철 보충제를 이용하는 요법을 받은 적이 있거나 받고 있는 대상체에서의 사용을 위한 것일 수 있다.

따라서, 상기 방법은 ARB를 이용하는 요법을 받은 적이 있거나 받고 있는 대상체에서의 사용을 위한 것일 수 있다.

따라서, 상기 방법은 스테로이드를 이용하는 요법을 받은 적이 있거나 받고 있는 대상체에서의 사용을 위한 것일 수 있다.

따라서, 상기 방법은 SGLT2i를 이용하는 요법을 받은 적이 있거나 받고 있는 대상체에서의 사용을 위한 것일 수 있다. 일부 예에서, SGLT2i는 다글리플로진이다. 상기 방법이 다른 요법의 병용 투여를 포함하는 경우, 본 개시내용의 방법은 별도 제형 또는 단일 약제학적 제형을 이용한 공동투여 및 어느 순서로든 연속 투여를 포괄한다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료제는 항-염증 약물과 병용하여 투여되되, 치료제(예를 들어, IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 및 추가적인 요법은 순차적으로, 어느 순서로든, 또는 동시에(즉, 병행하여 또는 동일한 시간틀 내에서) 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 신장에서 상승된 수준의 IL-33 발현("상향조절된 IL-33"으로도 지칭됨)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 신장 손상을 갖는 대상체, 예를 들어, 당뇨병성 신장병증을 갖는 대상체는 신장 사구체 및 관상 사이질(tubulointerstitium)에서 IL-33의 증가된 발현을 가진다. 따라서, 상기 방법은 상향조절된 IL-33을 갖는 신장 손상을 갖는 대상체를 치료하는 데 특히 유리할 수 있다. 상기 방법은 사구체에서 상향조절된 IL-33을 갖는 신장 손상을 갖는 대상체를 치료하는 데 특히 유리할 수 있다. 상기 방법은 관상 사이질에서 상향조절된 IL-33을 갖는 신장 손상을 갖는 대상체를 치료하는 데 특히 유리할 수 있다. 상기 방법은 사구체 및 관상 사이질에서 상향조절된 IL-33을 갖는 신장 손상을 갖는 대상체를 치료하는 데 특히 유리할 수 있다.

세포 내 IL-33 발현의 검출 방법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 PCR 기법, 면역조직화학, 유세포 측정, 웨스턴 블롯, ELISA 등이 포함된다. 이들 방법은 상향조절된 IL-33을 갖는 환자를 확인하는 데 사용될 수 있다.

일 실시형태에서, 상기 방법은 대상체 또는 환자에 대한 치료제, 예를 들어, IL-33 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 적용 또는 투여, 또는 대상체 또는 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포주에 대한 항-IL-33 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 적용 또는 투여를 포함하며, 대상체 또는 환자는 신장 손상, 신장 손상의 증상 또는 신장 손상에 대한 소인을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 또한 신장 손상, 신장 손상의 증상 또는 질환에 대한 소인을 갖는 대상체 또는 환자에 대한 치료제, 예를 들어, 항-IL-33 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 적용 또는 투여, 또는 대상체 또는 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포에 대한 항-IL-33 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 적용 또는 투여를 포함하는 것으로 의도된다.

본 개시내용의 방법에 따르면, 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 적어도 1종의 치료제, 예를 들어, 항-IL-33 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 신장 손상에서 염증 반응에 대해 긍정적 치료 반응을 촉진시키기 위해 사용된다. 염증성 치료에 대한 "긍정적 치료 반응"이란 이들 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 단편의 항-염증성 활성과 연관된 질환에서의 개선, 및/또는 질환과 연관된 증상에서의 개선을 의미한다. 즉, 항-염증성 효과, 추가 염증의 예방 및/또는 기존 염증의 감소, 및/또는 질환과 연관된 하나 이상의 증상에서의 감소가 관찰될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 질환에서의 개선은 완전 반응으로 특성규명될 수 있다. "완전 반응"이란 임의의 이전 평가 결과의 정상화를 포함하는 임상적으로 검출 가능한 질환의 부재를 의미한다. 일 실시형태에서, 이러한 반응은 본 개시내용의 방법에 따라 치료 후 적어도 1개월 동안 지속되어야 한다. 대안적으로, 질환에서의 개시는 부분 반응인 것으로 분류될 수 있다.

적어도 1종의 치료제, 예를 들어, 항-IL-33 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편의 투여를 포함하는 본 개시내용의 방법은 또한 신장 손상으로서 나타나는 IL-33 발현 세포와 연관된 염증 질환 및 면역계의 결핍증 또는 장애의 치료에서의 용도를 발견할 수 있다. 염증성 질환은 염증 및 조직 파괴, 또는 이의 조합을 특징으로 한다. "항-염증성 활성"이란 염증의 감소 또는 예방을 의미한다. "염증성 질환"은 면역 반응의 개시 사건 또는 표적이, 예를 들어, 자가항원, 이종항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 알려지지 않은 항원, 알레르겐 또는 독소를 비롯한 비-자가 항원(들)이 관여되는 임의의 염증성 면역-매개 과정이 포함된다.

본 개시내용의 방법에 따르면, 적어도 1종의 치료제, 예를 들어, 항-IL-33 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 염증성 신장 손상의 치료 또는 예방에 대해 긍정적인 치료 반응을 촉진시키기 위해 사용된다. 염증성 신장 손상에 대한 "긍정적 치료 반응"이란 이들 항체의 항-염증성 활성과 연관된 질환에서의 개선 등, 및/또는 질환과 연관된 증상에서의 개선을 의미한다. 즉, 염증성 사이토카인, 접착 분자, 프로테아제, 면역글로불린, 이의 조합 등의 감소된 분비, 항-염증성 단백질의 증가된 생성, 자가반응성 세포수의 감소, 면역 관용성의 증가, 자가반응성 세포 생존의 저해, 세포자멸사의 감소, 내피 세포 이동의 감소, 자발적 단핵구 이동의 증가, IL-33-발현 세포의 자극에 의해 매개되는 하나 이상의 증상의 감소 및/또는 저하를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 염증성 반응의 감소가 관찰될 수 있다. 이러한 긍정적 치료 반응은 투여 경로에 제한되지 않는다.

임상 반응은 스크리닝 기법, 예컨대, 자기 공명 조영(MRI) 스캐닝, x-방사측정 조영, 컴퓨터 연산 단층촬영(CT) 스캐닝, 유세포 측정 또는 형광-활성화 세포 정렬장치(FACS) 분석, 조직학, 거시 병리학 및 비제한적으로 ELISA, RIA, 크로마토그래피 등에 의해 검출 가능한 변화를 포함하는 혈액 화학을 이용해서 평가될 수 있다. 이러한 긍정적 치료 반응에 부가하여, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용한 치료법을 거치고 있는 대상체는 질환과 연관된 증상에서 유익한 개선 효과를 경험할 수 있다.

본 개시내용의 추가 실시형태는, 예로, 주어진 치료 방식의 유효성을 결정하기 위해, 임상 평가 절차의 일환으로서 조직 내 단백질 수준의 진단적 모니터링을 위한, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도이다. 예를 들어, 검출은 검출 가능한 물질에 대한 항체의 결합에 의해 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질 및 방사활성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 겨자무과산화효소, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하며; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀이 포함되고; 생체발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사활성 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다.

치료제

"치료제"는 대상체의 질환 상태에 대해 유리한 효과를 가질 목적으로 대상체에게 투여되는 활성 약제 성분을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 치료제는 신장 손상의 치료 또는 예방을 위해 대상체에 투여하도록 설계된 활성 성분이다. 신장 손상은 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같다. 더 구체적으로는, 치료제(들)는 신장 손상의 치료를 위해 ST2 신호전달, RAGE 신호전달 또는 둘 다를 저해하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 활성 성분(들)은 환원된 IL-33 단백질(redIL-33)의 활성을 약화 또는 저해함으로써, ST2 신호전달을 저해한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 활성 성분(들)은 산화된 IL-33 단백질(oxIL-33)의 활성을 약화 또는 저해함으로써, RAGE 신호전달을 저해한다. 신장 손상의 치료와 관련하여 이들 신호전달 경로를 둘 다 저해하는 것의 이점은 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다.

일부 실시형태에서, 1종 이상의 치료제는 "화학적 저해제"를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "화학적 저해제"는 저해제 활성을 갖는 합성 또는 반-합성 분자를 지칭하되, 예를 들어, 분자는 분자량이 500 이하이다.

화학적 저해제는 ST-2 신호전달, RAGE 신호전달 또는 둘 다를 저해하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학적 저해제는 ST-2 신호전달을 저해하기 위한 것이다. 화학적 저해제는 ST-2에 직접 결합하고 ST-2의 신호전달 활성을 길항함으로써 ST-2 신호전달을 저해할 수 있다. 이는 ST-2 활성화 리간드 redIL-33의 결합을 방지하기 위해 ST-2에 결합함으로써 달성될 수 있었다. 대안적으로, 화학적 저해제는 redIL-33에 직접 결합하고 ST-2에 대한 결합을 저해할 수 있다.

일부 실시형태에서, 화학적 저해제는 RAGE 신호전달을 저해할 수 있다. 화학적 저해제는 RAGE에 직접 결합하고 RAGE의 신호전달 활성을 길항함으로써 RAGE 신호전달을 저해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학적 저해제는 oxIL-33의 활성을 약화 또는 저해하여 RAGE 신호전달을 저해할 수 있다. 대안적으로, 화학적 저해제는 oxIL-33에 직접 결합하고 RAGE에 대한 결합을 저해할 수 있다.

일부 실시형태에서, 화학적 저해제는 ST-2 신호전달 및 RAGE 신호전달을 저해할 수 있다. 이는, 예를 들어, 신호전달을 활성화시키기 위해 ST-2와 RAGE 둘 다와 맞물리는 IL-33 상의 계면에 결합함으로써 달성될 수 있다.

일 실시형태에서, 1종 이상의 치료제(들)는 결합 분자를 포함한다. 적합하게는, 결합 분자는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다.

적합하게는, 결합 분자는 IL-33에 특이적으로 결합한다. 이러한 결합 분자는 또한 "IL-33 결합 분자" 또는 "항-IL-33 결합 분자"로서 지칭된다. 적합하게는, 결합 분자는 IL-33에 특이적으로 결합하고, IL-33 활성을 저해 또는 약화시키며, 예를 들어, 환원된 IL-33 활성, 산화된 IL-33 활성 또는 둘 다의 활성을 저해 또는 약화시킨다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 환원된 IL-33, 산화된 IL-33 또는 환원된 IL-33과 산화된 IL-33 둘 다에 특이적으로 결합한다.

적합하게는, 결합 분자는 환원 또는 산화된 형태에서 IL-33에 결합함으로써 IL-33 활성을 약화 또는 저해할 수 있다. 적합하게는, 결합 분자는 환원된 IL-33 활성 및 산화된 IL-33 활성을 저해 또는 약화시키며, 이는 환원된 형태로 IL-33에 결합함으로써(즉, 환원된 IL-33에 결합함으로써) 달성된다.

적합하게는, 결합 분자는 redIL-33과 oxIL-33 둘 다의 활성을 저해 또는 약화시킴으로써, ST2 신호전달과 RAGE 신호전달을 둘 다 저해 또는 약화시킨다.

적합하게는, 산화된 IL-33의 활성 저해는 RAGE 의존적 신호전달 및/또는 RAGE 매개 효과를 하향 조절하거나 끊어버린다. 적합하게는, 저해는 RAGE-EGFR 의존적 신호전달 및/또는 RAGE-EGFR 매개 효과를 하향 조절하거나 끊어버린다. 적합하게는, 저해는 EGFR 의존적 신호전달을 하향 조절하거나 끊어버린다. 적합하게는, 저해는 EGFR 매개 효과를 하향 조절하거나 끊어버린다. 특히, 환원된 IL-33에 결합하는 IL33 길항제는 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 방지하여, RAGE-EGFR 신호전달을 저해할 수 있다는 것이 나타났다.

적합하게는, 산화된 IL-33의 활성 저해는 RAGE-EGFR 복합체화를 하향 조절하거나 방지한다. 적합하게는, 저해는 EGFR 활성화, 적합하게는 RAGE 매개 EGFR 활성화를 하향 조절하거나 방지한다.

적합하게는, 결합 분자 또는 이의 단편 또는 변이체는 5×10^-2 M, 10^-2 M, 5×10^-3 M, 10^-3 M, 5×10^-4 M, 10^-4 M, 5×10^-5 M, 10^-5 M, 5×10^-6 M, 10^-6 M, 5×10^-7 M, 10^-7 M, 5×10^-8 M, 10^-8 M, 5×10^-9 M, 10^-9 M, 5×10^-10 M, 10^-10 M, 5×10^-11 M, 10^-11 M, 5×10^-12 M, 10^-12 M, 5×10^-13 M, 10^-13 M, 5×10^-14 M, 10^-14 M, 5×10^-15 M 또는 10^-15 M 미만의 결합 친화도(Kd)로 redIL-33에 특이적으로 결합할 수 있다. 적합하게는, redIL-33에 대한 결합 친화도는 5×10^-14 M(즉, 0.05 pM) 미만이다. 적합하게는, 결합 친화도는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 WO2016/156440(예를 들어, 실시예 11)에 기재된 것과 같은 프로토콜을 이용하는 동력학 배제 분석(Kinetic Exclusion Assay: KinExA) 또는 BIACORE™을 이용하여, 적합하게는 KinExA를 이용하여 측정되는 바와 같다. 이런 결합 친화도로 redIL-33에 결합하는 결합 분자는 생물학적으로 적절한 기간 이내에 결합 분자/redIL-33 복합체의 해리를 방지하기 위해 redIL-33에 충분히 단단하게 결합하는 하는 것으로 나타난다. 이론으로 구속되는 것을 원하지는 않지만, 이런 결합 강도는, redIL-33이 방출되지 않고 redIL-33에서 oxIL-33으로의 전환을 겪을 수 없도록, 생체내 항체/항원 복합체의 분해 전에 항원의 방출을 방지하는 것으로 여겨진다. 따라서, 이런 결합 친화도로 redIL-33에 결합할 때, 결합 분자는 이의 형성을 방지함으로써 oxIL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜, RAGE 신호전달을 저해할 수 있다.

일부 예에서, 결합 분자 또는 이의 단편은 10³ M^-1 sec^-1, 5×10³ M^-1 sec^-1, 10⁴ M^-1 sec^-1 또는 5×10⁴ M^-1 sec^-1 이상의 온 속도(k(on))로 redIL-33에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 결합 분자는 10⁵ M^-1 sec^-1, 5×10⁵ M^-1 sec^-1, 10⁶ M^-1 sec^-1 또는 5×10⁶ M^-1sec^-1 또는 10⁷ M^-1sec^-1 이상의 온 속도(k(on))로 redIL-33 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다. 적합하게는, k(on) 속도는 10⁷ M^-1sec^-1 이상이다.

일부 예에서, 결합 분자 또는 이의 단편은 5×10^-1 sec^-1, 10^-1 sec^-1, 5×10^-2 sec^-1, 10^-2 sec^-1, 5×10^-3 sec^-1 또는 10^-3 sec^-1 이하의 오프 속도(k(off))로 redIL-33에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 결합 분자는 5×10^-4 sec^-1, 10^-4 sec^-1, 5×10^-5 sec^-1 또는 10^-5 sec^-1, 5×10^-6 sec^-1, 10^-6 sec^-1, 5×10^-7 sec^-1 또는 10^-7 sec^-1 이하의 오프 속도(k(off))로 redIL-33 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 언급될 수 있다. 적합하게는, k(off) 속도는 10^-3 sec^-1 이하이다. IL-33은 염증 자극에 반응하여 빠르게 고농도로 방출되는 알라민(alarmin) 사이토카인이다. redIL-33은 세포외 환경에 방출 후 대략 5 내지 45분에 산화로 전환된다. 따라서, redIL-33의 oxIL-33으로의 전환을 방지하기 위해, 본 명세서에 기재된 결합 분자는 이러한 k(on) 및/또한 k(off) 속도로 redIL-33에 결합할 수 있다. 이론으로 구속되는 것을 원하지는 않지만, 이들 k(on)/k(off) 속도는 결합 분자가 oxIL-33으로 전환되기 전에 redIL-33에 빠르게 결합하여, oxIL-33의 형성을 감소시킴으로써, RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 것을 보장하는 것으로 여겨진다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 표 1에 언급되는 결합 분자 중 임의의 것에 대한 IL-33의 결합을 경쟁적으로 저해할 수 있다:

모든 이들 결합 분자는 IL-33에 결합하고, ST-2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 것으로 보고되었다. 따라서, redIL-33에 대한 결합에 대해 표 1에 개시된 항체 중 임의의 것과 경쟁하는 결합 분자 또는 이의 결합 단편은 ST-2 신호전달을 저해 또는 약화시킬 수 있다.

결합 분자 또는 이의 단편은 이것이 어느 정도로 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 차단하는 정도까지 해당 에피토프에 특이적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것으로 언급된다. 경쟁적 저해는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 고상 분석, 예컨대, 경쟁 ELISA 검정, 해리-향상 란탄족 원소 형광 면역분석(DELFIA^®, Perkin Elmer) 및 방사성리간드 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 결합 분자 또는 이의 단편이 시험관내 경쟁적 결합 분석, 예컨대, 이하의 실시예에 상세히 설명하는 HTRF 분석을 이용함으로써 redIL-33에 대한 결합에 대해 경쟁하는지의 여부를 결정할 수 있었다. 예를 들어, 당업자는 표 1의 재조합 항체를 공여자 형광단으로 표지하고, 다양한 농도를 고정된 농도의 수용자(acceptor) 형광단 표지-redIL-33의 샘플과 혼합한다. 후속적으로, 결합 특징을 확인하기 위해 각 샘플 내에서 공여자와 수용자 형광단 사이의 형광 공명 에너지 전달이 측정될 수 있다. 경쟁적 결합 분자를 설명하기 위해, 당업자는 우선 다양한 농도의 시험 결합 분자를 표 1의 고정된 농도의 표지된 항체와 혼합할 수 있었다. 혼합물이 표지된 항체-유일한 양성 대조군에 비해 표지된 IL-33과 함께 인큐베이션될 때 FRET 신호의 감소는 IL-33에 대한 경쟁적 결합을 나타낼 것이다. 결합 분자 또는 이의 단편은 주어진 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 경쟁적으로 저해하는 것으로 언급될 수 있다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 (WO2016/156440에 기재된 바와 같이) 결합 분자 33_640087-7B에 대한 IL-33의 결합을 경쟁적으로 저해할 수 있다. 적합하게는, WO2016/156440은 33_640087-7B가 특히 고친화도로 redIL-33에 결합하고 ST-2와 RAGE-의존적 IL-33 신호전달을 둘 다 약화시킨다는 것을 개시한다. 따라서, 결합 분자 33_640087-7B에 대한 IL-33의 결합을 경쟁적으로 저해하는 결합 분자는 redIL-33과 oxIL-33 신호전달을 둘 다 저해할 가능성이 크며, 따라서 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기에 특히 적합하다.

일부 예에서, IL-33 활성을 저해 또는 약화시키는 결합 분자는 다음의 항-IL-33 항체 중 임의의 것으로부터 선택된다: 33_640087-7B(WO2016/156440에 기재된 바와 같음), 에토키맙(Etokimab)으로 알려진 ANB020(WO2015/106080에 기재된 바와 같음), 9675P(US2014/0271658에 기재된 바와 같음), A25-3H04(US2017/0283494에 기재된 바와 같음), Ab43(WO2018/081075에 기재된 바와 같음), IL33-158(US2018/0037644에 기재된 바와 같음), 10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4(WO2016/077381에 기재된 바와 같음) 또는 이들의 결합 단편, 이들 문헌 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨. 이들 항체 모두는 표 1에서 언급된다.

적합하게는, 결합 분자 또는 항원-결합 단편은 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 쌍 1은 WO2016/156440에 기재된 33_640087-7B의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 2 내지 7은 US2014/0271658에 기재된 항체의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 8 내지 12는 US2017/0283494에 기재된 항체의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 13은 WO2015/106080에 기재된 ANB020의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 14 내지 16은 WO2018/081075에 기재된 항체의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 17은 US2018/0037644에 기재된 IL33-158의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다. 쌍 18은 WO2016/077381에 기재된 10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4의 VH 및 VL 도메인 서열에 대응한다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 서열번호 1의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 19의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 환원된 IL-33에 결합하고 산화된 IL-33으로의 전환을 저해하는 33_640087-7B(WO2016/156440에 기재된 바와 같음)로부터 유래된 것에 대응한다. 33_640087-7B는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2016/156440에 전체가 기재된다. 따라서, 이 항체는 ST-2와 RAGE 신호전달을 둘 다 저해 또는 약화시키기 위해 본 명세서에 기재된 방법에서 특히 유용할 수 있다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 서열번호 7의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 25의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 9675P로부터 유래된 것에 대응한다. 9675P는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 US2014/0271658에 전체가 기재된다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 서열번호 11의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 29의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 A25-3H04로부터 유래된 것에 대응한다. A25-3H04는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 US2017/0283494에 전체가 기재된다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 서열번호 13의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 31의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 ANB020로부터 유래된 것에 대응한다. ANB020는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2015/106080에 전체가 기재된다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 서열번호 16의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 34의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 Ab43으로부터 유래된 것에 대응한다. Ab43은 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2018/081075에 전체가 기재된다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 서열번호 17의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 35의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 IL33-158로부터 유래된 것에 대응한다. IL33-158은 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 US2018/0037644에 전체가 기재된다.

적합하게는, IL-33 결합 분자는 서열번호 18의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 36의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이들 CDR은 항체 10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4. 10C12.38.H6.으로부터 유래된 것에 대응한다. 87Y.581 lgG4는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2016/077381에 전체가 기재된다.

적합하게는, 당업자는 항체 또는 항원-이의 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내에서 CDR을 확인하기 위해 당업계에서 이용 가능한 방법을 안다. 적합하게는, 당업자는, 예를 들어, 서열-기반 주석을 수행할 수 있다.　CDR 사이의 영역은 일반적으로 고도로 보존되며, 따라서, 논리 규칙을 사용하여 CDR 위치를 결정할 수 있다. 당업자는 통상적인 항체에 대한 서열-기반 규칙의 세트(Pantazes and Maranas,　Protein Engineering, Design and Selection, 2010)를 사용할 수 있고, 대안적으로 또는 추가적으로 다중 서열 정렬에 기반하여 규칙을 개정할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 가장 유사한 주석 서열을 확인하기 위해 BLAST+의 BLASTP 명령을 이용하여 Kabat, Chothia 또는 IMGT 방법에 대해 작동하는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스와 항체 서열을 비교할 수 있다. 이들 방법 각각은 초가변 영역 잔기를 넘버링하고 그에 따라 6개의 CDR 각각의 개시 및 종료가 특정의 중요한 위치에 따라 결정되는 고유한 잔기 넘버링 체계를 고안하였다. 가장 유사한 주석 서열로 정렬 시, 예를 들어, CDR은 주석 서열에서 비주석 서열로 외삽되어, CDR을 확인할 수 있다. 적합한 도구/데이터베이스는, 예를 들어, Kabat 데이터베이스, Kabatman, Scalinger, IMGT, Abnum이다.

적합하게는, IL-33 치료제는 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다.

적합하게는, 따라서 IL33 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 19의 서열의 VL 도메인을 포함한다.

적합하게는, 따라서 IL33 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 7의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 25의 서열의 VL 도메인을 포함한다.

적합하게는, 따라서 IL33 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 11의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 29의 서열의 VL 도메인을 포함한다.

적합하게는, 따라서 IL33 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 13의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 31의 서열의 VL 도메인을 포함한다.

적합하게는, 따라서 IL33 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 16의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 34의 서열의 VL 도메인을 포함한다.

적합하게는, 따라서 IL33 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 35의 서열의 VL 도메인을 포함한다.

적합하게는, 따라서 IL33 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 18의 서열의 VH 도메인 및 서열번호 36의 서열의 VL 도메인을 포함한다.

적합하게는, 따라서, 치료제는, 예를 들어, 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18로부터 독립적으로 선택된 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함할 수 있는 결합 분자이다.

적합하게는, IL-33 치료제는 서열번호 1에 따른 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함하는 결합 분자이다.

적합하게는, IL-33 치료제는 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36으로부터 독립적으로 선택된 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함할 수 있는 결합 분자이다.

적합하게는, IL-33 치료제는 서열번호 19에 따른 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함하는 결합 분자이다.

적합하게는, 따라서, IL-33 치료제는, 예를 들어, 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18로부터 독립적으로 선택된 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR 및, 예를 들어, 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36으로부터 독립적으로 선택된 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함할 수 있는 결합 분자이다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 서열번호 1에 따른 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR, 및 서열번호 19에 따른 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR을 포함하는 결합 분자이다.

적합하게는, 따라서, IL-33 치료제는 서열번호 37, 38 및 39의 서열을 각각 갖는 VH CDR 1 내지 3을 갖는 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함할 수 있는 결합 분자이되, 하나 이상의 VHCDR은 3개 이하의 단일 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는다.

적합하게는, 따라서, IL-33 치료제는 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39의 VHCDR 1 내지 3을 각각 포함하는 VH 도메인을 포함하는 결합 분자이다.

적합하게는, 따라서, IL-33 치료제는 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 VHCDR 1 내지 3을 각각 포함하는 VH 도메인을 포함하는 결합 분자이다.

적합하게는, 따라서, IL-33 치료제는 서열번호 40, 41 및 42의 서열을 각각 갖는 VL CDR 1 내지 3을 갖는 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함할 수 있는 결합 분자이되, 하나 이상의 VLCDR은 3개 이하의 단일 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는다.

적합하게는, 따라서, IL-33 치료제는 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42의 VLCDR 1 내지 3을 각각 포함하는 VL 도메인을 포함하는 결합 분자이다.

적합하게는, 따라서, IL-33 치료제는 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 VLCDR 1 내지 3을 각각 포함하는 VL 도메인을 포함하는 결합 분자이다.

적합하게는, 따라서, IL-33 치료제는 서열번호 37의 서열을 갖는 VHCDR1, 서열번호 38의 서열을 갖는 VHCDR2, 서열번호 39의 서열을 갖는 VHCDR3, 서열번호 40의 서열을 갖는 VLCDR1, 서열번호 41의 서열을 갖는 VLCDR2 및 서열번호 42의 서열을 갖는 VLCDR3을 포함할 수 있는 결합 분자이다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18에 따른 VH에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1에 따른 VH에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, 상기 개시된 VH는 결실되고/되거나, 삽입되고/되거나 상이한 아미노산으로 독립적으로 대체되는 프레임워크에 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산을 갖는 서열이다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VL은 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36에 따른 VL에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VL는 서열번호 19에 따른 VL에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, 상기 개시된 VL은 결실되고/되거나, 삽입되고/되거나 상이한 아미노산으로 독립적으로 대체되는 프레임워크에 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산을 갖는 서열이다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18에 따른 VH에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖고, VL은 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36에 따른 VL에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1, 7, 11, 13, 16, 17 및 18로 이루어진 아미노산 서열을 갖고, VL은 서열번호 19, 25, 29, 31, 34, 35 및 36으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다.

적합하게는, 따라서 IL-33 치료제는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이되, VH는 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열을 갖고, VL은 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다.

적합하게는, 결합 분자는 항체, 이의 항원-결합 단편, 앱타머, 기준 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR 및 하나 이상의 기준 항체 분자로부터의 적어도 6개의 CDR로부터 선택될 수 있다.

적합하게는, IL-33 치료제는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 적합하게는, IL-33 치료제는 항-IL-33 항체 또는 이의 결합 단편이다. 적합하게는, 항-IL-33 항체 또는 이의 결합 단편은 IL-33, 특히 환원된 IL-33 또는 산화된 IL-33에 특이적으로 결합한다.

적합하게는, IL-33 치료제는 적합하게는 산화된 IL-33의 형성을 저해함으로써 산화된 IL-33의 활성을 저해한다. 적합하게는, IL-33 치료제는 환원된 IL-33의 산화된 IL-33으로의 전환을 저해한다.

적합하게는, IL-33 결합 분자 또는 항원-이의 결합 단편은 환원된 IL-33 결합 분자 또는 항원-이의 결합 단편이다. 다시 말해서, IL-33 결합 분자 또는 항원-이의 결합 단편은 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시킨다. 적합하게는, 약화는 환원된 IL-33에 결합하는 것에 의한다. 적합하게는, 환원된 IL-33에 결합함으로써, 상기 결합 분자 또는 항원-이의 결합 단편은 또한 적합하게는 산화된 IL-33 형태로의 전환을 방지함으로써, 산화된 IL-33의 활성을 약화시킨다.

적합하게는, 산화된 IL-33의 활성 저해는 RAGE 의존적 신호전달 및/또는 RAGE 매개 효과를 하향 조절하거나 끊어버린다.

적합하게는, IL-33 치료제는 상기 기재한 모든 저해 효과를 갖는다. 적합하게는, 환원된 IL-33 치료제는 상기 기재한 모든 저해 효과를 갖는다.

적합하게는, IL-33 치료제는 환원된 IL-33 결합 분자 또는 이의 단편이다. 적합하게는, IL-33 치료제는 환원된 IL-33 항체 또는 이의 결합 단편, 적합하게는 항-환원된 IL33 항체 또는 이의 결합 단편이다.

적합하게는, 치료제는 ST-2에 결합함으로써 IL-33 신호전달을 저해 또는 약화시킬 수 있다. 이러한 치료제는 본 명세서에서 "ST-2 저해제"로서 지칭된다. ST2 저해제는 당업계에 공지된 임의의 이러한 저해제, 예를 들어, GSK3772847 (WO2013/165894에 기재됨) 및 RG6149(WO2013/173761)일 수 있으며, 이들 둘 다 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. ST-2 저해제는 RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 제2 치료제와 병용하여 사용될 수 있다. ST-2 신호전달 및 RAGE-신호전달을 저해하기 위한 상이한 치료제의 용도는 겪고 있는 병리가 필요로 하는 경로를 둘 다 저해하기 위해 상이한 용량을 전달하는 데 유리할 수 있다.

제형

본 명세서에 기재된 의학적 용도 및 방법에서 치료제는 약제학적 조성물의 형태로 환자에게 투여될 수 있다.

적합하게는, '치료제'에 대한 본 명세서의 임의의 언급은 또한, 예를 들어, redIL-33 및/또는 oxIL-33의 활성을 약화 또는 저해하는 화학적 저해제 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 지칭할 수 있다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 1종 이상의 치료제를 포함할 수 있다.

적합하게는, 치료제는 본 명세서의 치료 양상의 의학적 용도 및 방법에서 신장 손상, 적합하게는 당뇨병성 신장 질환의 생체내 치료를 위한 약제학적 유효량으로 투여될 수 있다.

적합하게는 상기 1종 이상의 치료제(들)의 '약제학적 유효량' 또는 '치료적 유효량'은 redIL-33 및 oxIL-33 활성의 유효한 저해를 달성하고, 이점을 달성하기 위한, 예를 들어, 본 명세서의 의학적 용도/방법에 열거된 바와 같은 질환 또는 병태의 증상을 개선시키기 위한 충분한 양을 의미하는 것으로 간주될 것이다.

적합하게는, 1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물은 치료적 효과를 생성하는 데 충분한 양으로 앞서 언급한 치료 방법/의학적 용도에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다.

적합하게는, 1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물은 알려진 기법에 따라 통상적인 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 1종 이상의 치료제(들)를 조합함으로써 제조된 통상적인 투약 형태로 이러한 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다.

당업자는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징이 이것이 조합되는 활성 성분(들)의 양, 투여 경로 및 다른 널리 공지된 변수에 의해 지정됨을 인식할 것이다.

단일 투여 형태를 제조하기 위하여 담체 물질과 조합될 수 있는 1종 이상의 치료제(들)의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 단일 용량, 다중 용량으로서 또는 주입에 확립된 시기에 걸쳐 투여될 수 있다. 적합하게는, 투여량 방식은 또한 최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.

적합하게는, 1종 이상의 치료제(들)는 투여를 용이하게 하고 1종 이상의 치료제(들)의 안정성을 촉진시키도록 제형화될 수 있다.

적합하게는, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한, 비독성, 멸균 담체, 예컨대, 생리 식염수, 비독성 완충제, 보존제 등을 포함하도록 제형화된다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 치료 방법에서의 이용을 위해 적합한 제형물은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기재되어 있다.

적합하게는, 주사용 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 생체외 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 조성물은 멸균성이어야 하며, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도까지 유체여야 한다. 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하며, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존될 것이다. 적합하게는, 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 적합하게는, 미생물 작용 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 여러 경우에 있어서, 약제학적 조성물 중에 등장성 제제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 적합할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 초래될 수 있다.

적합하게는, 멸균 주사 용액은 필요한 경우, 적절한 용매 중 필요한 양의 활성 화합물(예를 들어, 본 명세서에 정의된 1종 이상의 치료제(들) 단독 또는 다른 활성 제제와의 조합물)을 본 명세서에 열거된 성분의 하나 또는 조합물과 함께 혼입한 후에 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 냉동-건조일 수 있으며, 이것으로 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 목적하는 성분을 더한 분말을 수득한다.

1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계는 잘 공지되어 있거나, 당업자에 의해 용이하게 결정된다.

적합하게는, 1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물의 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 적합하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 비경구라는 용어는 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다.

적합하게는, 1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 허용 가능한 투약 형태로 경구 투여될 수 있다.

적합하게는, 1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 생체이용률을 향상시키기 위해 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 흡수 촉진제를 및/또는 다른 통상적 가용화제 또는 분산제를 이용하여, 식염수 중 용액으로 제조될 수 있다.

적합하게는, 비경구 제형은 단일 볼루스 용량, 주입 또는 로딩 볼루스 용량 다음에 유지 용량이 이어질 수 있다. 이들 조성물은 특정한 고정 또는 가변 간격으로, 예를 들어, 1일 1회, 또는 "필요한 경우"에 투여될 수 있다.

적합하게는, 1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물은 질환 또는 병태 부위, 예를 들어, 신장에 직접 전달되어, 치료제에 대한 질환 조직의 노출을 증가시킨다. 적합하게는, 1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물은 질환 또는 병태 부위에 직접 투여된다. 적합하게는, 따라서, 1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물은 신장 손상 부위에 투여된다.

적합하게는, 따라서, 1종 이상의 치료제(들) 또는 이의 약제학적 조성물은 액체 조성물로서 제형화된다.

적합하게는, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 제조를 위해 본 명세서에서 상기 열거된 바와 같은 성분이 패키징되고 키트 형태로 판매될 수 있다. 이러한 키트는 관련된 약제학적 조성물이 질환 또는 장애를 앓고 있거나 질병 또는 장애에 취약한 대상체를 치료하는 데에 유용함을 표시하는 표지 또는 포장 삽입물을 적합하게 가질 것이다.

적합하게는, 액체 제형에 대한 성분은 가공되고, 용기, 예컨대, 앰플, 가방, 병, 주사기 또는 바이알 내로 충전되고, 당분야에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에 밀봉된다. 적합하게는, 용기는 가압될 수 있고, 적합하게는 에어로졸 용기일 수 있다. 이들 용기는 상기 기재한 바와 같은 키트에 포함될 수 있다. 적합하게는, 키트는 흡입기 장치를 추가로 포함할 수 있다. 적합하게는, 흡입기 장치는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 치료제(들) 또는 약제학적 조성물을 포함하거나, 본 명세서에 기재된 1종 이상의 치료제(들) 또는 약제학적 조성물을 포함할 수 있는 상기 기재한 바와 같은 용기를 포함하도록 작동할 수 있다.

일반

본 발명의 실행은, 달리 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에서, 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 참고문헌(문헌[Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472]; 문헌[Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press; Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)]; 문헌[Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; 문헌[Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)]; 문헌[Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols)]; 문헌[PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)]을 참조한다.

용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"뿐만 아니라 "이루어진(consisting)"을 포괄하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수 있거나 또는 추가적인 것, 예를 들어, X + Y를 포함할 수 있다.

수치 값 x와 관련하여 용어 "약"은 선택적이고, 예를 들어, x +10%를 의미한다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 제외하지 않으며, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.

두 뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 동일성 백분율에 대한 언급은 정렬될 때, 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 백분율이 두 서열을 비교하는 데 동일하다는 것을 의미한다. 이런 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성 백분율은 당업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, 부문 7.7.18 Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) 부록 30에 기재된 것을 이용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 12의 갭 개방 페널티 및 2의 갭 연장 페널티, 62의 BLOSUM 매트릭스로 아핀(affine) 갭 검색을 이용하는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 문헌[Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489]에 개시되어 있다.

달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 수많은 단계를 포함하는 과정 또는 방법은 방법의 시작 또는 종료 시 추가 단계들을 포함할 수 있거나, 추가적인 중간 단계들을 포함할 수 있다. 또한, 적절한 경우, 단계들은 조합되거나, 생략되거나, 대안의 순서로 수행될 수 있다.

본 발명의 다양한 실시형태는 본 명세서에 기재되어 있다. 각 실시형태에 구체화된 특징은 추가 실시형태를 제공하기 위해 다른 구체화된 특징과 조합될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 특히, 본 명세서에서 적합하거나, 전형적이거나 또는 바람직한 것으로 강조되는 실시형태는 (이들이 상호 배타적일 때를 제외하고) 서로 조합될 수 있다.

실시형태

실시형태 1은, 신장 손상을 치료하는 방법으로서, ST2 신호전달과 RAGE 신호전달을 둘 다 저해하는 요법을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 요법은 1종 이상의 치료제, 예컨대, 1 또는 2종의 치료제를 포함하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 2는, 실시형태 1에 있어서, 환원된 IL-33 단백질(redIL-33)의 활성을 약화 또는 저해하여, ST2 신호전달을 저해하는 방법에 대한 것이다.

실시형태 3은, 실시형태 1 또는 2에 있어서, 산화된 IL-33 단백질(oxIL-33)의 활성을 약화 또는 저해하여, RAGE 신호전달을 저해하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 4는, 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 신장 손상은 염증을 포함하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 5는, 실시형태 4에 있어서, 신장 손상은 염증인, 방법에 대한 것이다.

실시형태 6은, 실시형태 4 또는 5에 있어서, 신장 손상은 당뇨병성 신장 질환, 섬유증, 사구체신염(예를 들어, 비증식성(예컨대, 미세변화 사구체신염, 막 사구체신염, 국소조각토리굳음증) 또는 증식성(예컨대, IgA 신장병증, 막증식성 사구체신염, 감염 후 사구체신염, 및 급성 진행 사구체신염[예컨대, 굿파스쳐 증후군 및 맥관염 장애{베게너 육아종증 및 현미경 다발혈관염을 포함함}]), 전신 홍반 루푸스, 단백뇨증, 일측성 요관 폐쇄, 알포트 증후군, 다낭성 신장 질환(PCKD), 고혈압 토리굳음증, 만성 토리굳음증, 만성 폐쇄성 요로 병증, 만성 세뇨관 간질성 신염 및 허혈성 신장병증으로부터 선택된, 방법에 대한 것이다.

실시형태 7은, 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 신장 손상은 당뇨병성 신장 질환을 포함하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 8은, 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 치료제 또는 제제는 화학적 저해제 및 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 독립적으로 선택된 방법에 대한 것이다.

실시형태 9는, 실시형태 8에 있어서, 치료제 또는 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 10은, 실시형태 8 또는 9에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 결합하는 방법에 대한 것이다.

실시형태 11은, 실시형태 10에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 12는, 실시형태 10 또는 11에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 redIL-33에 특이적으로 결합하고, redIL-33의 활성을 약화 또는 저해하여, ST2 신호전달을 저해하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 13은, 실시형태 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 방지하여, RAGE-EGFR 신호전달을 저해하는 방법에 대한 것이다.

실시형태 14는, 실시형태 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (예를 들어, KinExA를 이용하여 측정될 때) 100 pM 이하, 또는 10 pM 이하, 예를 들어, 1 pM 이하, 예컨대, 0.5 pM, 특히, 0.05 pM의 결합 친화도로 redIL-33에 결합하는 방법에 대한 것이다.

실시형태 15는, 실시형태 10 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 10⁵ M^-1 sec^-1, 5×10⁵ M^-1 sec^-1, 10⁶ M^-1 sec^-1, 또는 5×10⁶ M^-1sec^-1 또는 10⁷ M^-1sec^-1 이상, 특히 10⁷ M^-1sec^-1 이상인 k(on)로 redIL-33에 결합하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 16은, 실시형태 10 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 5×10^-1 sec^-1, 10^-1 sec^-1, 5×10^-2 sec^-1, 10^-2 sec^-1, 5×10^-3 sec^-1 또는 10^-3 sec^-1 이하, 특히 10^-3 sec^-1 이하의 k(off)로 redIL-33에 결합하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 17은, 실시형태 10 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 oxIL-33의 활성을 약화 또는 저해하여 RAGE 신호전달을 저해하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 18은, 실시형태 9 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 37의 서열을 갖는 VHCDR1, 서열번호 38의 서열을 갖는 VHCDR2, 서열번호 39의 서열을 갖는 VHCDR3, 서열번호 40의 서열을 갖는 VLCDR1, 서열번호 41의 서열을 갖는 VLCDR2 및 서열번호 42의 서열을 갖는 VLCDR3을 포함하는 방법에 대한 것이다.

실시형태 19는, 실시형태 9 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 VH 및 VL 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 1 및 서열번호 19에 대해 각각 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 20은, 실시형태 19에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 1의 서열을 갖는 VH 및 서열번호 19의 서열을 갖는 VL을 포함하는 방법에 대한 것이다.

실시형태 21은, 실시형태 8 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체인, 방법에 대한 것이다.

실시형태 22는, 실시형태 8 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 천연 유래 항체, scFv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 단일쇄 항체인, 방법에 대한 것이다.

실시형태 23은, 실시형태 8 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단클론성 항체인, 방법에 대한 것이다.

실시형태 24는, 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 적어도 2종의 치료제가 사용되되, 예를 들어, 1종의 치료제는 ST2 신호전달을 저해하고, 제2 치료제는 RAGE 신호전달을 저해하며, 예를 들어, 치료제는 상기 수용체 또는 수용체들에 대한 리간드 또는 리간드들의 결합을 방지하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 25는, 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 1종의 치료제가 사용되되, 치료제는 ST2 신호전달과 RAGE 신호전달을 둘 다 저해하고, 예를 들어, 제제는 수용체 둘 다에 대한 리간드의 결합을 방지하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 26은, 선행하는 실시형태 중 임의의 것에 있어서, 상기 RAGE 신호전달은 RAGE-EGFR-신호전달인, 방법에 대한 것이다.

실시형태 27은, 실시형태 26에 있어서, RAGE-EGFR 신호전달의 저해는 RAGE-EGFR 매개 효과를 하향조절하거나 저해하는, 방법에 대한 것이다.

실시형태 28은, 실시형태 27에 있어서, RAGE-EGFR 매개 효과는 비정상적 상피 리모델링인, 방법에 대한 것이다.

실시형태 29는, 신장 손상 치료에서 사용하기 위한 또는 신장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한, 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제로서, 치료는 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 것을 추가로 포함하는, 치료제에 대한 것이다.

실시형태 30은, 신장 손상 치료에서 사용하기 위한 또는 신장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한, 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜, RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제로서, 치료는 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 것을 추가로 포함하는, 치료제에 대한 것이다.

실시형태 31은, 신장 손상 치료에서 사용하기 위한 또는 신장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한, 환원된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜 ST2 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제, 및 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜, RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제에 대한 것이다.

실시형태 32는, 신장 손상 치료에서 사용하기 위한 또는 신장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한, 환원된 IL-33 및 산화된 IL-33의 활성을 저해 또는 약화시켜, ST2 신호전달 및 RAGE 신호전달을 저해 또는 약화시키는 치료제에 대한 것이다.

실시형태 33은, 실시형태 29 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원 이의 결합 단편인, 사용하기 위한 치료제 또는 용도에 대한 것이다.

실시형태 34는 실시형태 33에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 실시형태 10 내지 23 중 어느 하나를 특징으로 하는, 사용하기 위한 치료제에 대한 것이다.

실시형태 35는, 실시형태 29 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 신장 손상은 실시형태 4 내지 7 중 어느 하나를 특징으로 하는, 사용하기 위한 치료제에 대한 것이다.

실시형태 36은, 실시형태 29 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 RAGE 신호전달은 RAGE-EGFR-신호전달인, 사용하기 위한 치료제에 대한 것이다.

실시형태 37은, 실시형태 29 내지 36 중 어느 하나에 있어서, RAGE-EGFR 신호전달의 저해 또는 약화는 RAGE-EGFR 매개 효과를 하향조절 또는 저해하는 치료제에 대한 것이다.

실시형태 38은, 실시형태 37에 있어서, RAGE-EGFR 매개 효과가 비정상적 상피 리모델링인, 사용하기 위한 치료제에 대한 것이다.

실시형태 39는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 예를 들어, 균질 시간 분해 형광법에 의해 결정된 바와 같이, redIL-33에 대한 결합에 대해 33_640087-7B와 경쟁하는, 실시형태 9 내지 26 중 어느 하나의 방법, 또는 실시형태 31 내지 38 중 어느 하나에 따른, 사용하기 위한 치료제에 대한 것이다.

실시예

실시예 1 - 인간 당뇨병성 신장 질환에서의 IL-33 생물학의 역할 평가

신장 질환과 관련하여 다양한 염증 매개체가 상향조절된 것으로 나타났다(Thomas et al., Nat reviews Dis Primers., 2015). 신장 질환과 관련된 것으로 알려진 다른 염증 매개체 중에서 인터류킨-33(IL-33)의 발현 수준의 순위를 정하는 방법을 결정하기 위해 이하에 기재하는 방법을 사용하였다.

당뇨병성 신장병증을 갖는 환자의 3가지 상이한 코호트(도 1: 유럽 신장 cDNA 은행 코호트(도 1a), Hu 2013 코호트(도 1b), 및 Woroniecka, 2013 코호트(도 1c))로부터의 공개된 RNA 전사체 물질을 분석하였다. 사구체 및 관형 사이질 조직 샘플 내에서 RNA 발현 수준을 측정하였다. 표준화된 방법에 따라 RNA 서열 계수 판독에 기반하여 전사체 분석을 수행하였다(Ju et al 2013; Woroniecka et al, 2013).

모두 3가지 코호트로부터의 당뇨병성 신장병증(DN)을 갖는 대상체의 신장에서 가장 크게 과발현된 사이토카인 중에서 IL-33이 랭크된 것으로 확인되었다. IL-33 발현은 사구체와 관형 사이질 둘 다의 DN 신장에서 상향조절되었다(도 1). 놀랍게도, IL-33 동족 수용체 ST2(IL1RL1)의 발현은 당뇨병성 신장병증 환자의 적어도 하나의 코호트의 사구체에서 하향조절되었다는 것이 발견되었다(도 2b). ST2는 신체 내 다른 조직에 대해 신장, 주로 신피질에서 비교적 높은 수준으로 발현된다는 것이 이전에 나타났다(도 2a). 이는 상보성 메커니즘의 일부 부류가 IL-33의 상승된 수준으로부터 초래된 과활성을 방지하기 위해 ST2 발현을 하향조절하는 데 존재할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 2 - 신장 질환의 전임상 모델에서 신장에서의 IL-33 수준 평가

IL-33 발현 수준이 신장 질환의 다양한 전임상 모델에서 상승되는지의 여부를 평가하기 위해 이하에 기재하는 방법을 사용하였다. II형 당뇨병성 신장병증(T2DN) 마우스 모델(Jackson laboratory, 카탈로그 번호 000697로부터 얻은 db/db 마우스, 단일 신적출술(uninephrectomy: unx)을 받음), 고혈압성 신장병증(HN) 마우스 모델(BL6 마우스에서 5/6 네프론 집단을 제거하는 수술적 개입에 의해 얻은 5/6 Npx 마우스(문헌[Wang et al J. Vis. Exp., 129; e55825; 2017] 참조), 폐쇄성 신장병증 마우스 모델(ON)(BL6 마우스에서 수술적 일측성 요관 폐쇄로부터 얻음(문헌[Hesketh et al J. Vis. Exp., 94; e52559; 2014)] 참조) 및 1형 당뇨병성 신장병증(T1DN)의 마우스 모델(STZ에 의한 화학적 제거를 이용, 문헌[Chow et al 69; 73-80; Kidney International, 2006] 참조)로부터 유래된 신장 샘플에서 IL-33 mRNA 발현 수준을 정량화하였다.

잘-확립된 프로토콜에 따라 질환 모델링을 수행하였다(예를 들어, 문헌[Wang et al J. Vis. Exp., 129; e55825]; 문헌[2017, Hesketh et al J. Vis. Exp., 94; e52559; 2014, Chow et al 69; 73-80]; 문헌[Kidney International, 2006, Zhou et al Am J Transl Res 8: 1339-54, 2016]; 문헌[Yang et al Drug Discov Today Dis Models, 7; 13-19; 2010] 참조).

T2DN 마우스에 대해, 상대 IL-33 신장 발현 수준을 db/db 마우스에서 8주령에 또는 단일 신적출술을 한 db/db 마우스(db/db + unx)에서 제16주에 분석하였다. T1DN 마우스에 대해, 상대 IL-33 신장 발현 수준을 STZ가 있는 마우스 및 STZ가 없는 마우스에서 제12주에 분석하였다. HN 마우스에 대해, 상대 IL-33 신장 발현 수준을 5/6 NPX 후의 마우스 및 모의 마우스에서 제6주에 분석하였다. ON 마우스에 대해, 상대 IL-33 신장 발현 수준을 UUO 마우스에서 그리고 모의 대조군에서 제7일에 분석하였다. 문헌[Zhou et al Am J Transl Res 8: 1339-54,2016]에 따라 전사체 분석을 위해 샘플을 준비하였다. 상대 발현 수준을 각 코호트에서의 GAPDH의 상대 발현 수준에 대해 정규화시켰다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 정규화된 IL-33 발현이 (a) T2DN db/db unx 마우스, (b) STZ를 갖는 T1DN 마우스, (c) 5/6 NPX를 갖는 HN 마우스 및 (d) UUO를 갖는 ON 마우스에서 상승된다. 발현 수준을 각 코호트에서 GAPDH에 대해 정규화시켰다. 이들 결과는 신장 질환의 모든 전임상 모델에 걸쳐 IL-33 발현 수준이 대조군에 비해 신장에서 증가된다는 것을 나타낸다.

실시예 3 - RAGE는 신장 질환의 모델에서 상향조절된다

IL-33의 2가지의 생물학적으로 활성인 형태, 즉, redIL-33 및 oxIL-33의 존재는 앞서 기재되었다. WO2016/156440에 보고된 바와 같이, 환원된 IL-33(redIL-33)은 ST2 신호전달 경로를 통해 신호전달을 나타낸 아이소폼이다. 천연 시스테인 사이의 이황화결합 형성에 의한 red-IL33의 산화된 형태(oxIL-33)로의 전환을 redIL-33 신호전달에 대한 스위치-오프 메커니즘으로서 제안한다. 그러나, WO2016/156440에서, 본 발명자들은 oxIL-33이 RAGE를 통해 신호전달을 자극하는 신규한 신호전달 경로를 특성규명하였다(예를 들어, WO2016/156440의 도 58).

RAGE 신호전달 경로의 존재를 고려하여, 신장 질환의 전임상 모델에서 RAGE의 발현 프로파일 변화를 결정하였다.

실시예 2에 기재한 동일한 모델 및 방법을 이용하여 RAGE 발현을 정량화하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 정규화된 RAGE 발현을 (a) T2DN db/db unx 마우스, (b) STZ를 갖는 T1DN 마우스, (c) 5/6 NPX를 갖는 HN 마우스 및 (d) UUO를 갖는 ON 마우스에서 상승시킨다. 발현 수준을 각 코호트에서 GAPDH에 대해 정규화시켰다. 이들 결과는 RAGE 발현이 신장 질환의 모든 시험된 전임상 모델에서 상향조절된다는 것을 나타낸다.

실시예 4 - RAGE 및 ST2 신호전달은 생체내 신장 기능장애에 기여한다

RAGE와 IL-33 발현 수준 둘 다의 증가가 CKD의 전임상 모델에서 관찰되었기 때문에, 신장 질환의 병리에 대한 이들 분자와 관련된 신호전달 경로의 기여를 결정하였다.

간략히 말해서, ST2 및 RAGE-매개 세포독성 효과를 상기 기재한 db/db 단일 신적출술 마우스 모델에서 연구하였다. 별도의 마우스에서 ST2 및 RAGE-의존적 신호전달을 차단시켰다. 소변 중 알부민 농도(단백뇨증)를 모니터링함으로써 신장 손상을 평가하였다. 소변 농도 중의 변화를 보상하기 위해 크레아티닌 농도에 정규화시킨 소변 중 알부민 양으로서 단백뇨증을 측정하였다. 이 값을 알부민:크레아티닌 비(UACR)로 부른다.

연구를 도 5에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 간략히 말해서, 신장 손상을 가속화시키기 위해 제7주에 마우스에 단일 신적출술을 수행하였다. 마우스에 10㎎/Kg 3x/주로 항-RAGE hu-IgG1, 항-ST2 muIgG1 또는 음성 대조군으로서 작용하는 huNUP228 IgG1 중 하나를 투약하였다. 제10일, 제13일 및 제15일에 소변 샘플을 수집하였고, Cobas® 면역화학을 이용하여 알부민 및 크레아티닌 수준에 대해 분석하였다. 또한 혈관사이 확장, 핵 부족 및 모세관 내강 공간 감소를 이용하여 내부 병리에 의한 사구체 손상을 분석하였다.

결과는 ST2와 RAGE 신호전달을 둘 다 차단하는 것이 UACR 점수의 유의미한 감소를 야기하였다는 것을 나타낸다(도 6 및 도 7). 도 8은 또한 음성 대조군에 비해 ST2 신호전달을 차단시킴으로써 사구체 손상의 유의미한 감소가 달성되었다는 것을 입증한다(*는 아이소타입 대조군보다 유의미하게 더 적은(P<0.05) GDS를 나타낸다).

실시예 5 - 산화된 IL-33은 RAGE와 EGFR 사이의 신호전달 복합체의 형성을 유도한다

문헌[Cohen, E. S. et al. Nat. Commun. 6:8327 (2015)]에서, IL-33의 산화된, 이황화결합 형태(oxIL-33)의 발견이 기재된다. OxIL-33은 ST2에 결합하지 않거나 또는 ST2-의존적 신호전달을 활성화시키지 않는 것으로 나타났다. 후속적으로(WO2016156440A1 참조), 이는 oxIL-33이 최종당화산물에 대한 수용체(RAGE)에 결합하고, STAT5를 활성화시키며 상피 이동에 영향을 미치는 RAGE-의존적 방식으로 신호를 전달한다는 것을 나타내었다.

oxIL-33의 기능을 추가로 탐구하기 위해, 상피 세포를 환원 또는 산화된 형태의 IL-33(redIL-33 및 oxIL-33)으로 자극하고, 신호전달 경로를 연구하였다. 본 명세서에 oxIL-33이 상피 기능에 엄청난 효과를 야기하는 최종당화산물에 대한 수용체(RAGE)와 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 복합체에 대한 신규한 리간드라는 것을 나타낸다.

1. IL33의 인간 성숙 및 시스테인-돌연변이 변이체의 클로닝 및 발현

인간 IL-33(112 내지 270)의 성숙 성분을 암호화하는 cDNA 분자; 수탁번호(UniProt) 095760(IL33-01 또는 IL-33으로도 지칭됨), 및 세린으로 돌연변이되는 4개의 시스테인 잔기를 갖는 변이체(IL33-16 또는 IL-33[C->S]으로도 지칭됨)를 프라이머 연장 PCR에 의해 합성하고, pJexpress 411(DNA 2.0)에 클로닝시켰다. 단백질의 N-말단에 10xHis, Avitag, 및 인자-Xa 프로테아제 절단 부위(MHHHHHHHHHHAAGLNDIFEAQKIEWHEAAIEGR 서열번호 43)를 포함하도록 야생형(WT) 및 돌연변이체 IL-33 암호화 서열을 변형시켰다. 이콜라이(E. coli) BL21(DE3) 세포를 형질전환시킴으로써 N-말단 태그된 His10/Avitag IL33-01(WT, 서열번호 44) 및 N-말단 태그된 His10/Avitag IL33-16(WT, 서열번호 45)을 생성하였다. 형질전환 세포를 18시간 동안 37℃에서 자동유도 배지(Overnight Express™ Autoinduction System 1, Merck Millipore, 71300-4)에 배양시킨 후 원심분리에 의해 세포를 채취하고 -20℃에서 보관하였다. 세포를 적격 무 EDTA(EDTA-free) 프로테아제 저해제 칵테일 정제(Roche, 11697498001) 및 50 U/㎖ 벤조나제 뉴클레아제(Merck Millipore, 70746-3)를 함유하는 2×DPBS에 재현탁시키고, 음파처리에 의해 용해시켰다. 세포 용해물을 50,000×g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 정제하였다. IL-33 단백질을 5 ㎖/분으로 2×DPBS, 1 mM DTT에서 평형상태로 만든 HisTrap excel 칼럼(GE Healthcare, 17371205) 상에 장입하여 고정된 금속 친화도 크로마토그래피에 의해 상청액으로부터 정제하였다. 고정된 내독소 단백질을 고갈시키기 위해 칼럼을 2×DPBS, 1 mM DTT, 20 mM 이미다졸, pH 7.4, 다음에, 2×DPBS, 0.1% Triton X-114로 세척하여 불순물을 제거하였다. 2×DPBS, 1 mM DTT, 20 mM 이미다졸, pH 7.4로 추가적인 세척 후에, 샘플을 2×DPBS, 1 mM DTT, 400 mM 이미다졸, pH 7.4로 용리시켰다. 2.5 ㎖/분으로 2×DPBS에서 HiLoad Superdex 75 26/600 pg 칼럼(GE Healthcare, 28989334)을 이용하여 IL-33을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. SDS PAGE에 의해 피크 분획을 분석하였다. 순수한 IL-33을 함유하는 분획을 풀링하고, 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 농도를 결정하였다. SDS-PAGE에 의해 최종 샘플을 분석하였다.

비태그 IL-33을 생성하기 위해, N-말단 태그된 His10/Avitag IL33을 RT에서 1시간 동안 2×DPBS 완충제에서 단백질의 ㎎당 10개 단위의 인자 Xa(GE healthcare, 27084901)와 함께 인큐베이션시켰다. 1 ㎖/분의 유속으로 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 칼럼(GE healthcare, 28989333) 상에서 2×DPBS 중의 SEC 크로마토그래피를 이용하여 비태그 IL-33을 정제하였다.

2. 산화된 IL-33의 생성 및 정제(oxIL-33)

환원된 IL33을 60% IMDM 배지(페놀 레드 없음), 40% DPBS에서 0.5 ㎎/㎖의 최종 농도로 희석, 및 37℃에서 18시간 동안의 인큐베이션에 의해 산화시켰다. 산화 과정 동안 생성된 응집물을 HiTrap Capto Q ImpRes 음이온 교환 칼럼(GE Healthcare, 17547055) 상에 장입함으로써 샘플로부터 제거하였다. 장입 전에, 샘플을 pH가 8.3에 도달될 때까지 pH 9.0인 1 M Tris의 첨가, 및 125 mM의 최종 농도가 되도록 5 M NaCl의 첨가에 의해 변형시켰고, 이들 장입 조건 하에 응집물은 칼럼에 결합되었고, 단량체 oxIL-33은 결합 없이 통과하고, 수집되었다. 태그를 120분 동안 22℃에서 50 ㎍의 oxIL-33당 1 ㎍ 인자 Xa의 최종 농도로 인자 Xa(NEB, P8010L)와 함께 인큐베이션에 의해 oxIL-33로부터 절단시켰다. 임의의 남아있는 환원된 IL-33의 샘플을 고갈시키기 위해, 인간 IgG1 Fc-His6에 융합된 가용성 인간 ST2S 세포외 도메인을 30분 동안 22℃에서 샘플과 함께 인큐베이션시키고, 환원된 IL-33에 결합시켰다. 샘플을 3,000 Da 컷오프로 원심분리 농축기에서 농축시키고, 2 ㎖/분의 유속으로 HiLoad Superdex 75 26/600 pg 칼럼(GE Healthcare, 28989334) 상에 장입시켜, 다른 샘플 성분으로부터 단량체 oxIL-33을 분리시켰다. 순수한 oxIL-33을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, 280 ㎚에서 UV 흡광도 분광학을 통해 샘플의 최종 농도를 결정하였다. SDS-PAGE, HP-SEC 및 RP-HPLC에 의해 최종 생성물 품질을 평가하였다.

3. 인간 ST2 ECD의 클로닝, 발현 및 정제

ST2S 암호화 서열의 N-말단에 융합된 Gibson 어셈블리 및 CD33 신호 펩타이드와 양립 가능한 연장을 암호화하는 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 내인성 신호 펩타이드(아미노산 잔기 19 내지 328) 없이 ST2의 천연 유래 ST2S 가용성 아이소폼을 암호화하는 cDNA(UniProt 수탁번호 Q01638-2)를 증폭시켰다. C-말단의 His6-태그를 갖는 인간 IgG1 Fc에 대한 암호화 서열을 유사하게 증폭시켰다. pDEST12.2 OriP, 포유류, EBV로부터의 OriP 복제기점을 보유하는 CMV-프로모터 유도 발현 벡터를 갖는 Gibson 조립체를 이용하여 ST2S cDNA 및 IgG1 Fc-His6 cDNA를 조립하여, EBNA-1 단백질을 발현시키는 세포주의 에피솜 유지를 가능하게 하였다. 단백질 발현을 위해, 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민을 이용하여 EBNA-1을 과발현시키는 CHO 세포의 현탁액 배양물에 플라스미드를 일시적으로 형질전환시켰다. 분비된 ST2S-Fc-His6 융합 단백질을 함유하는 조건화된 배지를 형질감염 후 7일에 수집하였고, 2 ㎖/분으로 HiTrap MabSelect SuRe(Protein A, GE Healthcare, 11-0034-95) 친화도 크로마토그래피 칼럼에 장입하였다. 칼럼을 2×DPBS로 세척하고, 단백질을 25 mM 아세트산나트륨, pH 3.6으로 용리시켰다. ST2S-Fc-His6을 함유하는 분획을 풀링하고, 2 ㎖/분으로 2×DPBS에서 평형상태로 만든 HiLoad Superdex 200 26/600 pg 칼럼(GE Healthcare, 28989336) 상에 장입하였다. 순수한 ST2S-Fc-His6 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 농도를 결정하였다. SDS-PAGE에 의해 최종 샘플을 분석하였다.

4. 인간 아시알로글리코단백질 수용체(ASGPR) ECD의 클로닝, 발현 및 정제

세포질 및 막관통 도메인(아미노산 잔기 62 내지 291)이 없는 아시알로글리코단백질 수용체(UniProt 수탁번호 P07306)의 세포외 도메인(ECD)을 암호화하는 cDNA를 CD33 신호 펩타이드 다음에 ECD 도메인의 N-말단에 융합된 His10_Avi 태그 서열로 Geneart에서 화학적으로 합성하였다. 작제물을 pDEST12.2 OriP, 포유류, EBV로부터의 OriP 복제기점을 보유하는 CMV-프로모터 유도 발현 벡터에 직접 클로닝시켜, EBNA-1 단백질을 발현시키는 세포주의 에피솜 유지를 가능하게 하였다. 단백질 발현을 위해, 형질감염 시약으로서 293 Fectin을 이용하여 HEK Freestyle 293F 세포의 현탁액 배양물로 플라스미드를 일시적으로 형질전환시켰다. 분비된 HisAVi_hASGPR ECD 융합 단백질을 함유하는 조건화 배지를, 4 ㎖/분으로 2×DPBS에서 평형상태로 만든 HisTrap excel 칼럼(GE Healthcare, 17371205) 상에 장입하여 고정된 금속 친화도 크로마토그래피에 의한 형질감염 7일 후에 수집하였다. 칼럼을 2×DPBS, 40 mM 이미다졸, pH 7.4로 세척하여 불순물을 제거하고, 샘플을 2×DPBS, 400 mM 이미다졸, pH 7.4로 용리시켰다. 1 ㎖/분으로 2×DPBS에서 HiLoad Superdex 75 16/600 pg 칼럼(GE Healthcare, 28-9893-33)을 이용하여 인간 ASGPR ECD를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. SDS PAGE에 의해 피크 분획을 분석하였다. 순수한 단량체 ASGPR을 함유하는 분획을 풀링하고, 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 농도를 결정하였다. SDS-PAGE에 의해 최종 샘플을 분석하였다.

5. IL-33의 산화된 형태는 MAP 키나제 경로를 활성화시킨다

정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포(CC-2540)를 Lonza로부터 얻었고, 제조업자의 프로토콜에 따라 완전 BEGM 배지(Lonza)에서 유지하였다. NHBE를 어큐타제(accutase)(PAA, #L1 1-007)로 채취하고, 배양 배지[BEGM (Lonza CC-3171) 및 보충 키트(Lonza CC-4175)]에서 6-웰 접시(Corning Costar, 3516)에 1×10⁶개/2 ㎖로 파종하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 1 ㎖ PBS로 2회 세척한 후에 기아상태(starve) 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 자극 전에 37℃, 5% CO₂에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다.

MAP 키나제 인산화 항체 어레이 키트(ab211061)를 Abcam으로부터 구입하였고, 제조업자의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다. 18 내지 24시간 동안 기아상태로 만든 6웰 접시의 NHBE를 비처리로 남겨두거나 또는 30 ng/㎖의 환원된 IL-33, IL-33-16 또는 산화된 IL-33 중 하나로 처리한 후에, 10분 동안 인큐베이터 37℃, 5% CO₂에 복귀시켰다(본 분석에서 사용한 활성체에 대해 표 2 참조). 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고, 세포를 빙랭 PBS로 세척한 후에 키트가 공급된 1× 용해 완충제의 웰마다 100 ㎕를 첨가하였다. 단백질 추출물을 1.5 ㎖ 관에 옮긴 후에 14,000 rpm으로 4℃에서 정제하였다. BCA 기법(Thermo, 23225)을 이용하여 단백질 농도를 결정하였고, 250 ㎍의 총 단백질을 어레이 막마다 사용하였다. 제조업자의 설명서에 따라 모든 후속 단계를 수행하였다. 막을 LiCor C-digit 상에서 시각화하고, Image Lite studio를 이용하여 정량화하였다.

IL-33 야생형(IL-33) 및 C->S(IL-33[C->S]) 환원된 형태(각각 IL33-01 및 IL33-16)와 대조적으로, 산화된 IL33(oxIL-33)은 수용체 타이로신 키나제(RTK)에 의해 관여되는 경로와 일치되는 다수의 중요한 신호전달 분자를 활성화시켰다(도 9).

6. IL-33의 산화된 형태는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)를 활성화시킨다

oxIL-33에 의해 활성화된 수용체 타이로신 키나제(RTK)를 시험하고 확인하기 위해, 71개의 RTK 어레이를 이용하여 선별을 수행하였다. RTK 인산화 항체 어레이 키트(ab193662)를 Abcam으로부터 구입하였고, 제조업자의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다. NHBE를 배양시키고, 배양 배지[BEGM(Lonza CC-3171) 및 보충 키트(Lonza CC-4175)]에서 6-웰 플레이트(Corning Costar, 3516)로 1×10⁶개/2 ㎖로 파종하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 1 ㎖의 PBS로 2회 세척한 후에 기아상태 배지(보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 자극 전에 37℃, 5% CO₂에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. MAP 키나제 어레이에 대해 앞서 기재한 동일한 단계 후에, 세포를 활성화시키고(표 2 활성체), 용해시키고, 250 ㎍의 총 단백질을 어레이 막마다 사용하였다. 제조업자의 설명서에 따라 모든 후속 단계를 수행하였다. 막을 LiCor C-digit 상에서 시각화하고, Image Lite studio를 이용하여 정량화하였다. 환원된 야생형(IL-33) 또는 C->S(IL-33[C->S]) IL-33(각각 IL33-01 및 IL33-16) 중 하나에 대해 검출된 반응은 없었다. 그러나, oxIL-33(산화된 IL-33-01)은 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대응하는 RTK 어레이 상의 양성 신호를 촉발하였다(도 10).

추가적인 방법에 의해 EGFR 신호전달을 자극하는 oxIL-33(산화된 IL-33-01)의 능력을 확인하였다. 활성화 시, EGFR을 Tyr1068에서 인산화시키고, 이 포스포-EGFR을 균질 FRET(형광 공명 에너지 전달) HTRF®(균질 시간 분해 형광법, Cisbio International) 분석(Cisbio 키트 #64EG1PEH)을 이용하여 검출하였다. 간략히 말해서, NHBE를 배양 배지[BEGM(Lonza CC-3171) 및 보충 키트(Lonza CC-4175)] 내 96-웰 플레이트(Corning Costar, 3598)에서 5×10⁵개/100 ㎕로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 0.2 ㎖ PBS로 2회 세척한 후에 기아상태 배지(보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에, IL-33-01, IL-33-16 및 oxIL-33(산화된 IL-33-01) 및 EGFR 리간드(표 2 및 표 3)의 농도를 증가시키면서 자극한 후에 인큐베이터 37℃, 5% CO₂에 10분 동안 복귀시켰다. 배지를 흡입하고, 웰당 50 ㎕의 용해 완충제(Cisbio, 64EG1PEH)로 대체하였다. 이어서, 분석을 제조업자의 프로토콜(Cisbio, 64EG1PEH)에 따라 수행하였다. 시간 분해 형광을 EnVision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 파장에서 판독하였다. 665/620 ㎚ 비를 계산함으로써 데이터를 분석하고, 4-모수 로지스틱 방정식을 이용하여 곡선 적합화함으로써 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 결정하였다.

유사하게, EGFR 인산화를 본 부문에서 앞서 언급한 바와 같은 HTRF 분석을 이용하여 상피 세포주 A549에서 평가하였다. 간략히 말해서, A549를 ATCC로부터 얻었고, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충한 RPMI GlutaMax 배지에서 배양하였다. 세포를 어큐타제(PAA, #L1 1-007)로 채취하고, 5×10⁵개/100 ㎕로 96웰 플레이트에 파종하고 나서, 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 100 ㎕의 PBS로 2회 세척한 후에 100 ㎕의 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지)를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 증가하는 농도의 IL-33-01, IL-33-16 및 oxIL-33, EGFR 리간드 및 RAGE 리간드(표 2 및 표 3)로 자극시킨 후에, 인큐베이터 37℃, 5% CO₂에 10분 동안 복귀시켰다. 배지를 흡입하고, 웰당 50 ㎕의 용해 완충제(Cisbio, 64EG1PEH)로 대체하였다. 이어서, 분석을 제조업자의 프로토콜(Cisbio, 64EG1PEH)에 따라 수행하였다. 시간 분해 형광을 EnVision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 파장에서 판독하였다. 665/620 ㎚ 비를 계산함으로써 데이터를 분석하고, 4-모수 로지스틱 방정식을 이용하여 곡선 적합화함으로써 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 결정하였다.

NHBE와 A549 세포 둘 다에서, oxIL-33은 진짜 작용제인 EGF와 유사하게 EGFR의 인산화를 촉진시켰다(도 11). 이는 시험한 다른 RAGE 리간드에 의해서는 재현되지 않았다.

7. 신호전달 성분의 웨스턴 블롯팅

EGFR 신호전달 복합체의 요소가 oxIL-33에 반응하여 활성화되는지를 추가로 연구하기 위해 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. NHBE를 배양시키고, 부문 5에서 상기 기재한 바와 같이 6웰 접시에 플레이팅하였다. 혈청 기아상태 후에, 5 내지 240분 동안 세포를 oxIL-33(30 ng/㎖)으로 자극하였다. 이어서, 배지를 흡입하고, 세포를 빙랭 PBS로 세척한 후 150 ㎕의 용해 완충제 [1x LDS 샘플 완충제(Thermo, NP0008), 10 mM MgCl2(VWR, 7786-30-3), 2.5% β-머캅토에탄올(Sigma, M6250) 및 0.4 ㎍/㎖ 벤조나제(Millipore, 70746)]를 첨가하였다. 세포를 얼음 상에 10분 동안 둔 후에, 용해물을 1.5 ㎖ 관에 옮기고, 90℃로 5분 동안 가열하였다. 용액을 새로운 1.5 ㎖ 관에 옮기고, 5 ㎕의 단백질 사다리(protein ladder)(BioRad, 1610374)에 따라 10 ㎕의 샘플을 MES 실행 완충제(B0002)에서 4 내지 12%의 SDS-PAGE 겔(Thermo, NW04127BOX) 상에서 실행하였다. Transblot Turbo(BioRad)을 이용하여 겔을 PVDF 막(BioRad, 1704156) 상에 옮겼다. PVDF 막을 5% 탈지유 분말(Marvel)을 함유하는 PBS-tween 용액에서 10분 동안 차단시켰다. 이어서, 막을 4℃에서 밤새 5% BSA를 함유하는 PBS-tween에서 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 PBS-tween으로 5회 세척하고, 이어서, 1시간 동안 실온에서 5% 탈지유 분말을 함유하는 PBS-tween에서 2차 HRP 태그 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 PBS-tween으로 5회 세척한 후에, ECL(BioRad, 1705062)을 첨가하고 Licor C-digit로 시각화하였다.

결과는 oxIL-33이 몇몇 EGFR 신호전달 성분을 활성화시켰다는 것을 나타낸다(도 12)

8. Ox-IL-33은 EGFR-중화 Ab에 의해 차단되는 STAT-5 인산화를 유도한다

다음에, EGFR에 대한 결합을 방지함으로써 oxIL33-매개 STAT5 활성화가 저해될 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다. 간략히 말해서, A549 세포를 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충한 RPMI GlutaMax 배지에서 배양하였다. 세포를 어큐타제로 채취하고, 5×10⁵개/100 ㎕로 96웰 플레이트에 파종하고 나서, 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 100 ㎕의 PBS로 2회 세척한 후에 100 ㎕의 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지)를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 항-EGFR 항체(Clone LA1(05-101, Millipore) 또는 아이소타입 대조군(MAB002, R&D Systems)을 용량 의존적 방식으로 웰에 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 인큐베이터에 복귀시켰다. 이어서, 플레이트를 산화된 IL-33(30 ng/㎖)으로 30분 동안 자극한 후에 포스포-STAT5 ELISA 키트 용해 완충제(85-86112-11, ThermoFischer Scientific)를 이용하여 용해시키고, 제조업자의 지침에 따라 전개시킨 후 450 nM에서 흡광도를 판독하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, oxIL-33-01로 활성화시킨 세포는 STAT5의 인산화를 나타내고, 이는 항-EGFR 항체의 존재를 감소시킨다(도 13).

실시예 6 - 산화된 IL-33은 EGFR과 RAGE 간의 복합체 형성을 유도한다

9. OxIL-33은 EGFR과 RAGE 간의 복합체 형성을 유도한다

RAGE 및 EGFR이 oxIL-33의 신호전달을 촉진시키는 데 어떻게 관련되는지를 이해하기 위해, 신호전달 복합체를 탐구하도록 면역침전 실험을 수행하였다. 우선, 항-EGFR 항체를 Dynabeads에 공유 결합시켰다. 항-EGFR 항체(R&D systems, AF231)의 2개의 100 ㎍ 바이알을 40 ㎎의 Dynabeads(Thermo, 14311D)와 함께 인큐베이션시키고 제조업자의 지침에 따라 공유결합시켰다. 성공적인 결합 후에, 비드를 30 ㎎/㎖로 PBS 중에 재현탁시키고, 4℃에서 유지시켰다.

NHBE를 Lonza(CC-2540)로부터 얻었고, 동결 바이알을 접시마다 1×10⁶개의 세포로 15 ㎝ 접시(Thermo, 157150)에 직접 파종하였다. 세포가 합류(confluency)에 도달될 때까지 3일마다 배지를 교체하면서 제조업자의 프로토콜에 따라 완전 BEGM 배지(Lonza)에 NHBE를 1개월간 유지시켰다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 이 지속 시간 동안 인큐베이션시켰다. 자극 전날에, 플레이트를 20 ㎖ PBS로 2회 세척한 후에 15 ㎖의 기아상태 배지(보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에 배지 단독(비자극 대조군), 30 ng/㎖ 환원된 IL-33-01, 30 ng/㎖ oxIL-33 또는 30 ng/㎖ EGF로 자극하고, 37℃, 5% CO₂로 10분 동안 복귀시켰다. 배지를 흡입하고, 플레이트를 빙랭 PBS로 2회 세척한 후 15 ㎝ 접시마다 포스파타제 및 프로테아제 저해제(Thermo, 78440)를 함유하는 1 ㎖의 용해 완충제(Abcam, ab152163)를 첨가하였다. 세포를 용해 완충제에 스크레이핑한 후에 2 ㎖ Protein LoBind 관(Eppendorf, Z666513)에 옮기고, 14,000 rpm, 4℃에서 교반시킴으로서 정제하였다. BCA 키트(Thermo, 23225)를 이용하여 단백질 농도를 결정하였고, 용해 완충제를 이용하여 모든 단백질 추출물을 3 ㎎/㎖로 정규화시켰다. 6 ㎎의 총 단백질 추출물을 100 ㎕의 항-EGFR Dynabead(상기 기재)가 있는 깨끗한 2 ㎖ LoBind 관에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 관을 4℃에서 5시간 동안 회전 믹서에 두었다. 자석(BioRad, 1614916)을 이용하여, Dynabead를 고정시키고, 단백질 추출물을 흡입하고 나서, 2 ㎖의 세척 완충제 1(50 mM Tris-HCl pH 7.5(Thermo, 15567027), 0.5% TritonX 100(Sigma, ×100), 0.3 M NaCl로 대체하였다. 이를 4회 더 반복하였다. 이어서, 비드를 세척 완충제 2(50 mM Tris-HCl pH 7.5)를 사용하여 동일한 방식으로 추가 10회 세척하였다. 최종 세척 단계 후에, 50 mM Tris-HCl pH8.0 중의 50 ㎕의 1% Rapigest(w/v)(Waters, 186001861)를 비드에 첨가하고, 60℃에서 10분 동안 가열하였다. 이어서, 상청액을 새로운 LoBind 2 ㎖ 관에 옮겼다. 추가 100 ㎕의 50 mM Tris-HCl pH8.0을 수지에 첨가하고, 혼합한 후에 이를 제1 용출물과 합하였다. 이어서, TCEP(Sigma, 646547)를 5 mM의 최종 농도로 첨가하고, 샘플을 60℃에서 10분 동안 가열하였다. 이어서, 용출액을 아이오도아세트아마이드(Sigma, 16125)의 첨가에 의해 실온에서 20분 동안 암실 내에서 10 mM까지 알킬화시켰다. DTT(Sigma, D5545)를 10 mM까지 첨가하여 알킬화를 퀀칭시켰다. 이어서, Tris-HCl 완충제 50 mM pH8.0을 첨가하여 500 ㎕의 최종 샘플 용적을 제공하였다. 관마다 0.5 ㎍의 트립신(Promega, V5111)을 첨가하고, 샘플을 400 rpm에서 진탕 플랫폼 상에서의 30℃에서 밤새 분해시켰다. 이어서, 샘플을 트리플루오로아세트산(Sigma, 302031)을 이용하여 2.0%(v/v)의 농도로 산성화시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 14,000 rpm에서 30분 동안 원심분리시키고, 상청액을 새로운 2 ㎖ LoBind 관에 옮겼다. 이어서, 샘플을 제조업자의 지침에 따라 C18 칼럼(Thermo, 87784)을 통해 처리하였다. 이어서, 샘플을 speed-vac을 이용하여 건조시킨 후에 -20℃에서 저장하였다. 이어서, 샘플을 펩타이드 질량 지문법 질량 분석법(PMF-LC-MS)에 의해 분석하였다. 결과를 분석하기 위해 Scaffold 소프트웨어를 사용하였다.

EGFR를 모두 4개 조건에 걸쳐 유사하게 검출하였고, 이는 면역침전이 모든 샘플에 걸쳐 제대로 작용하였다는 것을 시사한다. IL33-01(IL-33) 또는 EGF로 처리한 것과 대조적으로 oxIL-33으로 처리한 샘플에서 RAGE 및 IL-33이 검출되었고, 이는 oxIL-33 및 RAG가 신호전달 동안 EGFR과 연관된다는 것을 시사한다. oxIL-33 및 EGF를 갖는 이들 세포에서의 EGFR 활성화의 사전 관찰과 일치되게, EGFR 신호전달 및 내포작용에 관련된 것으로 이전에 보고된 단백질은 이들 리간드에 의한 자극 후에 검출되었지만, 환원된 IL33-01은 그렇지 않았다(표 4).

표 4는 환원된 IL-33-01(IL-33), oxIL-33(산화된 IL-33-01) 또는 EGF로 자극한 NHBE의 LCMS 분석을 나타낸다. IL-33 및 RAGE는 oxIL-33에 의한 자극 후 EGFR과의 복합체에서 검출되지만, 환원된 IL33-01(IL-33) 또는 EGF에 의한 자극 후에는 그렇지 않다. 괄호는 각 단백질에 대해 확인된 고유 펩타이드의 수를 나타낸다.

이들 관찰을 확인하기 위해, 상기 프로토콜에 따라 제조한 세포 용해물에 대해 면역침전 및 웨스턴 블롯을 또한 수행하였다. NHBE 단백질 추출물 농도 결정 후에, 3 ㎎의 총 단백질을 1.5 ㎖ 관에서 6 ㎍의 항-EGFR 항체(R&D systems, AF231)와 함께 인큐베이션시키고, 4℃에서 2.5시간 동안 회전 믹서에 넣었다. 이어서, 1.5 ㎎의 단백질 A/G 자기 비드(Thermo, 88802)를 각 관에 첨가한 다음, 관을 혼합하면서 4℃까지 다시 1시간 동안 복귀시켰다. 이어서, 비드를 자석(BioRad, 1614916)으로 수집하고, 500 ㎕의 (50 mM Tris(pH 7.5), 1% TritonX 및 0.25 M NaCl)로 3회 세척하고, 500 ㎕의 10 mM Tris(pH 7.5)로 1회 세척하였다. 이어서, 단백질을 환원제(Thermo, NP0004)와 함께 35 ㎕의 LDS 샘플 완충제(Thermo, NP0008)를 이용하여 자기 비드로부터 방출시키고, 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 용액을 새로운 1.5 ㎖ 관에 옮기고, 5 ㎕의 단백질 사다리(BioRad, 1610374)에 따라 10 ㎕의 샘플을 MES 실행 완충제(B0002)에서 4 내지 12%의 SDS-PAGE 겔(Thermo, NW04127BOX) 상에서 실행하였다. Transblot Turbo(BioRad)을 이용하여 겔을 PVDF 막(BioRad, 1704156) 상에 옮겼다. PVDF 막을 5% 탈지유 분말(Marvel)을 함유하는 PBS-tween 용액에서 10분 동안 차단시켰다. 이어서 막을 5% BSA를 함유하는 PBS-tween에서 밤새 4℃에서 1차 항체 (항-EGFR(Cell Signaling Technology, 2232), 항-RAGE (Cell Signaling Technology, 6996) 또는 항-IL-33(R&D systems, AF3625)과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 PBS-tween으로 5회 세척하고, 이어서, 1시간 동안 실온에서 5% 탈지유 분말을 함유하는 PBS-tween에서 항-토끼 2차 HRP 태그 항체(Cell Signalling Technology, 7074) 또는 항-염소 2차 HRP 태그 항체(R&D systems, HAF109)와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 PBS-tween으로 5회 세척한 후에, ECL(BioRad, 1705062)을 첨가하고 Licor C-digit로 시각화하였다. 웨스턴 블롯은 RAGE가 oxIL-33의 존재 하에 EGFR과 함께 공동침전된 반면 EGF 자극에 의해 RAGE가 검출되지 않았다는 것을 확인하였다(도 14). 이들 결과는 RAGE 및 EGFR이 산화된 IL-33 신호전달 복합체의 기능적 부분이라는 것을 나타낸다.

10. RAGE는 EGFR과의 복합체를 형성하기 위해 oxIL-33을 필요로 한다

상기 기재한 실험은 oxIL-33이 하류의 신호전달을 생성하는 EGF 수용체(EGFR)의 복합체에 대한 리간드라는 것을 나타내었다. oxIL-33이 RAGE 또는 EGFR 중 하나에 대한 직접 결합 리간드인지의 여부를 결정하기 위해 본 부문의 실험을 설계한다. 신호전달 복합체의 형성에 관해 더욱 이해하고 oxIL-33이 EGFR과 직접 상호작용하는지의 여부를 평가하기 위해, RAGE, ST2-Fc 및 EGFR에 대한 oxIL-33의 결합을 탐구하는 데 ELISA 형식을 사용하였다.

단백질 및 변형: Avitag 서열 모티프(GLNDIFEAQKIEWHE 서열번호 46)를 함유하는 단백질을 제조업체의 프로토콜에 따라 바이오틴 리가제(BirA) 효소(Avidty, Bulk BirA)를 이용해서 바이오티닐화하였다. 본 명세서에서 이용되는 Avitag가 없는 모든 변형 단백질을 제조업자의 프로토콜에 따라 EZ 링크 설포-NHS-LC-바이오틴(Thermo/Pierce, 21335)을 이용해서 유리 아민을 통해 바이오티닐화하였다. 표 5는 사용한 바이오티닐화된 단백질의 목록이다.

스트렙타비딘 플레이트(Thermo Scientific, AB-1226)를 100 ㎕/의 바이오티닐화된 항원(PBS 중 10 ㎍/㎖)으로 1시간 동안 실온에서 코팅하였다. 플레이트를 200 ㎕의 PBS-T(PBS + 1%(v/v) Tween-20)로 3회 세척하고 1시간 동안 300 ㎕/웰 차단 완충액(1% BSA 함유 PBS(Sigma, A9576))으로 차단하였다. 플레이트를 PBS-T로 3x 세척하였다. RAGE-Fc(R&D Systems #1145-RG) 또는 ST2-Fc(R&D Systems #523-ST)를 차단 완충제에서 PBS 중 10 ㎍/㎖로 희석시키고, 적절한 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 대안적으로, PBS 중 10 ㎍/㎖에서 1시간 동안 비태그 RAGE(Sino Biological, 11629-HCCH)의 존재 또는 부재 하에 PBS 중 10 ㎍/㎖에서 100 ㎕의 EGFR-Fc(R&D Systems #344-ER-050)를 첨가하였다. 플레이트를 200 ㎕ PBS-T로 3회 세척하였다. 이어서, RAGE-Fc, ST2-Fc 및 EGFR-Fc를 1시간 동안 실온에서 100 ㎕/웰로 차단 완충제에서 1:10000로 희석시킨 항-인간 IgG HRP(Sigma AO170, 5.1 ㎎/㎖)로 검출하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, TMB, 100 ㎕/웰(Sigma, T0440)로 전개시켰다. 50 ㎕/웰 0.1M H₂SO₄로 반응을 ??칭시켰다. Cytation Gen5 또한 유사한 장비 상에서 450 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. 결과는 oxIL-33이 RAGE와의 분명한 상호작용을 나타낸 반면(도 15a) EGFR에 대한 oxIL-33의 직접적인 결합은 무시 가능하였다는 것을 나타낸다(도 15b). oxIL-33에 대한 EGFR 결합은 본 분석에 대한 sRAGE의 첨가에 의해서만 관찰되었다(도 15b). 이는 oxIL-33이 진짜 RAGE 작용제인 HMGB1을 대체하는 경우에는 재현될 수 없었다(도 15b).

oxIL-33에 의해 촉발되는 EGFR 신호전달에서 RAGE의 필요성은 RAGE-결핍 세포주를 사용하여 추가로 확인되었다. RAGE 넉아웃 A549 세포주를 다음과 같이 생성하였다:

적색 형광 단백질(RFP), AGER의 엑손 3에 표적화된 가이드 RNA(TGAGGGGATTTTCCGGTGC 서열번호 47) 및 Cas9 엔도뉴클레아제에 대한 발현 벡터를 포함하는 포유류 플라스미드를 생성하였다. 2일 동안 T-175 플라스크에서 F12K 너트 믹스(Gibco, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충)에서 A549 세포를 성장시킴으로써 A549 조건화 배지를 생성하였다. 소모한 배지를 A549에서 제거하고, 여과시키고 나서, 신선한 Gibco F12K 너트 믹스(20% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충)에서 5배 희석시켰다. A549를 총 15 ㎖ 중 2×10⁵개의 세포/㎖에서 3개의 T-75 플라스크에 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 두었다. 8 ㎍의 AGER 가이드 RNA 플라스미드 및 22.5 ㎍의 PEI(Polysciences, 23966-2)가 있는 1.6 ㎖의 F12K 너트 믹스(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충)를 이용하여 형질감염 혼합물을 제조하였다. 이어서, 혼합물을 10초 동안 교반하고, 실온에서 15분 동안 두었다. 이어서, 0.75 ㎖의 형질감염 혼합물을 각 T-75 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 2일 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. 이어서, 아큐타제를 이용하여 A549 세포를 분리시키고, 1% FBS를 함유하는 PBS에 옮기고, 단일 세포를 Aria 세포 분류기(BD) 상에서 RFP의 발현에 기반하여 96-웰 접시에 분류하였다. 세포를 조건화 배지를 이용하여 3 내지 5일마다 공급하였다. 일단 세포가 50% 초과의 합류가 되면, 이들을 24-웰 플레이트에 옮기고 성장시켰다. 각각의 성공적인 클론이 T15 플라스크에 분할될 때까지 이 업스케일링 과정을 계속하였다. 이어서, 세포를 12개의 웰 플레이트로 분할시키고, 성공적인 넉아웃에 대한 게놈 PCR 분석 전에 50% 초과의 합류까지 성장시켰다. 세포를 웰당 100 ㎕ DNA 용해 완충제(Viagen Bitoech, 301-C, 0.3 ㎍/㎖ 프로테이나제 K로 보충)에 용해시켰다. 이들 샘플을 55℃에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후에 15분 동안 85℃에서 인큐베이션시켰다. 다음의 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 RAGE의 PCR을 수행하였다: 정방향 - gttgcagcctcccaacttc (서열번호 48), 역방향 - aatgaggccagtggaagtca (서열번호 49). 50 ㎕ 반응 용적에서 다음과 같이 반응 및 사이클링을 설정하였다[25 ㎕ Q5 중합효소 혼합, 2.5 ㎕ 정방향 프라이머(10 μM 저장액), 2.5 ㎕ 역방향 프라이머(10 μM 저장액), 2 ㎕의 주형 DNA 용해물, 18 ㎕의 무 뉴클레아제 워터]. 98℃에서 30초 동안 초기 변성, 다음에 35주기의 5초 동안 98℃, 10초 동안 57℃ 및 20초 동안 72℃ 후에 2분 동안 72℃에서 최종 단계로 PCR 반응을 실행하였다. 4 ㎕의 PCR 산물을 6 ㎕의 무 뉴클레아제 워터 및 2 ㎕의 6× DNA 로딩 완충제(Thermo Scientific, R0611)와 혼합하였다. Versadoc Imager 상에서 시각화 전 1시간 동안 90 V에서 1% 아가로스겔(1:10000 SYBR safe) 상에서 샘플을 실행하였다. 이어서, PCR 산물의 나머지를 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, 28104)로 세정하였다. nanodrop을 이용하여 DNA-50 농도를 측정하였다. 사내 서열분석을 위해 몇몇 클론(결과로부터 선택)을 보냈다. 결과는 클론 RAGE09 및 RAGE10에서 정지 코돈의 성공적인 삽입을 나타내었다.

oxIL-33-매개 EGFR 신호전달에 대한 RAGE의 본질을 확인하기 위해, 이어서, A549 및 RAGE-결핍 A549 세포 상에서 면역침전 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. 간략히 말해서, oxIL-33을 이용하여 세포주를 다양한 시점(0 내지 15분)에 활성화시켰다. EGFR 또는 RAGE의 후속적 면역침전 다음에 부문 9에서 상술한 적절한 실험 프로토콜에 따라 항-RAGE, 항-EGFR 및 항-IL-33에 의한 웨스턴 블롯팅이 이어졌다. 결과는 oxIL-33 및 EGFR과의 복합체 형성에서 RAGE의 필수적 역할을 나타낸다(도 16)

11. 산화된 IL-33은 STAT5 인산화를 유도하며, 이는 RAGE에 의해 차단되지만 ST2 중화 항체에 의해서는 차단되지 않는다

oxIL-33 신호전달에서 ST2에 비하여 RAGE의 중요성을 확인하기 위해, 차단 항체를 시험하였다. 간략히 말해서, A549를 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충한 RPMI GlutaMax 배지에서 배양하였다. 세포를 어큐타제로 채취하고, 5×10⁵개/100 ㎕로 96웰 플레이트에 파종하고 나서, 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 100 ㎕의 PBS로 2회 세척한 후에 100 ㎕의 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지)를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 항-RAGE(M4F4; WO 2008137552); 항-ST2(AF532; RnD Systems) 또는 아이소타입 대조군(MAB002, R&D Systems)을 용량 의존적 방식으로 웰에 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 인큐베이터에 복귀시켰다. 이어서, 플레이트를 산화된 IL-33(30 ng/㎖)으로 30분 동안 자극한 후에 포스포-STAT5 ELISA 키트 용해 완충제(85-86112-11, ThermoFisher Scientific)를 이용하여 용해시키고, 제조업자의 지침에 따라 전개시킨 후 450 nM에서 흡광도를 판독하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, oxIL-33-01로 활성화시킨 세포는 항-RAGE의 존재 하에 감소된 STAT5의 인산화를 나타내지만 항-ST2 항체의 존재 하에서는 그렇지 않았다(도 17).

실시예 7 - PTEC 신장 세포에서 RAGE를 통한 oxIL-33 신호전달

앞의 실시예는 IL-33 발현이 신장 질환에서 상승된다는 것을 나타내었다. RAGE 발현이 또한 상승된다. ST2 및 RAGE 신호전달의 차단은 마우스 모델에서 UACR 및 신장 손상을 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 상피 세포에서 EGFR과의 복합체 형성에 의해 oxIL-33-매개 신호전달이 유도된다는 것이 나타났다. 이하에 기재하는 실험은 신규한 신호전달 경로가 또한 신장 상피에 존재하는지의 여부를 결정하고자 하였다.

oxIL-33에 대한 반응을 인간 근위관 상피 계통인 PTEC에서 측정하였다.

간략히 말해서, PTEC(1차 인간 관형 상피 세포주)를 합류까지 성장시키고, 24시간 동안 신장 염증 매개체로 처리하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 중규모 진단 분석을 이용하여 IL-33을 세포 용해물에서 측정하였다.

도 18a에 나타낸 바와 같이, 수크로스 또는 글루코스 대조군으로 처리할 때에 비해 PTEC를 IFN-감마 및 TNF로 처리할 때 IL-33 세포내 농도가 증가된다. 이들 결과는 염증 매개체 IFN 감마 및 TNF가 PTEC에서 IL-33 생성 및 분비를 상향조절한다는 것을 시사한다.

이어서, ST2 및 NFkB를 통한 염증 경로 상의 redIL-33의 잠재적 자가분비 또는 주변분비 효과를 시험하기 위해 PTEC를 redIL-33으로 처리하였다. PTEC를 합류까지 성장시키고, 양성 대조군으로서 redIL-33 또는 IL-1(peprotec 200-01B로부터 얻음)의 용량 농도로 처리하였다. RedIL-33을 WO2016/156440에 기재한 바와 같이 제조하였다. 활성화의 마커로서 핵에 대한 NFkB 전좌를 면역형광에 의해 측정하였다(문헌[Noursadeghi et al J Immunol Methods 2008]에 기재한 방법에 따름). 도 18b는 증가된 용량의 IL-1 또는 redIL-33으로 처리한 PTEC 중의 NFkB 전좌를 나타낸다. 이들 결과는 red-IL33이 PTEC에서 IL-1보다 더 적은 염증 반응을 유발한다는 것을 나타낸다.

이는 증가된 농도의 redIL-33에 반응하여 PTEC에서 염증 마커의 용량-의존적 방출을 분석함으로써 추가로 확인되었다. 간략히 말해서, 1차 인간 PTEC(Lonza)를 합류에 도달될 때까지 배양시키고, 이어서, 24-웰 플레이트(혈청 기아상태 없음) 상에서 파종하고, IL-33 환원된 형태의 전체 용량 범위(12.8 pM 내지 200 nM의 용량)로 24시간 동안 자극하였다. 이 후에, 전염증 사이토카인의 검출을 위해 상청액을 수집하였다. 제조업자의 지침에 따라 중규모 진단 분석을 이용함으로써 사이토카인의 검출을 수행하였다.

염증 사이토카인 IL-6, IL8, TNFa 및 IL1b 수준의 용량 의존적 증가는 검출되지 않았다(도 18c).

유사하게, 환원된 IL-33으로 처리 시 PTEC에서 MAP 키나제의 활성화를 또한 분석하였다. MAP 키나제의 활성화는 ST2 의존적 경로에 의해 조절되는 다른 세포 기능이다.

간략히 말해서, 1차 인간 PTEC를 합류에 도달될 때까지 배양시키고, 이어서, 24-웰 플레이트 상에 파종하고, 이 연구를 위해 혈청 기아상태는 필요하지 않았다. 30 ng/㎖의 단일 농도에서 30분 동안 IL-33의 환원된 형태로 세포를 30분 동안 자극하였다. 30분 후에, MAP 키나제의 인산화(p38 및 JNK)를 측정하기 위해 세포를 용해시켰다. 제조업자의 지침에 따라 중규모 진단 분석을 이용함으로써 인산화된 MAP 키나제를 검출하였다.

결과는 PTEC가 환원된 IL-33에 반응하여 증가된 MAP 키나제 신호전달을 나타내지 않는다는 것을 나타내며(도 18d), PTEC가 고전적 ST2 신호전달 축을 통해 환원된 IL-33에 반응하지 않는다는 것을 추가로 도시한다.

PTEC가 oxIL-33에 의한 신호전달에 반응하는지를 시험하기 위해, oxIL-33 및 redIL-33에 의한 자극 후에 EGFR 활성화를 측정하였다. OxIL-33 및 redIL-33을 WO2016/156440 또는 상기에 기재한 바와 같이 제조하였다. 간략히 말해서, PTEC를 합류까지 성장시키고, oxIL-33 및 redIL-33으로 10 내지 15분 동안 자극한 후에, 균질 시간 분해 형광법(HTRF)에 의해 RAGE/EGFR 신호전달을 측정하였다.

HTRF® 분석은 가까이 인접해 있는 공여자와 수용자 형광단 사이의 형광 공명 에너지 전달을 이용하는 균질 분석 기술이다(Mathis, et al. Clin Chem 41(9):1391-7 (1995)). 이들 분석은 관심 분자 중 하나를 공여자 형광단, 예로, 유로퓸(Eu3+) 크립테이트에 직접적으로 또는 간접적으로 결합하고, 다른 관심 분자를 수신체 형광단, 예로 XL665(안정 가교된 알로피코시아닌)에 결합시켜 거대분자 상호작용을 측정하기 위해 이용하였다. 본 공여자/수용자 시스템에서, (337 ㎚에서의) 크립테이트 분자의 여기는 620 ㎚에서의 형광 방출을 야기하였다. 상기 방출로부터의 에너지는 Eu3+ 크립테이트에 근위인 XL665로 전달되어 XL665로부터 특이적인 장기-지속 형광의 방출을 (665 ㎚에서) 일으켰다. 공여자(620 ㎚) 및 수신체(665 ㎚) 모두의 특이적 신호를 측정하여, 분석에서 유색 화합물의 존재를 보상하는 665/620 ㎚ 비의 계산을 가능하게 할 수 있다.

포스포-EGFR(Tyr1068)를 2개의 상이한 특이적 항체, 즉, Eu3+-크립테이트로 표지한 하나(공여자) 및 d2로 표지한 두 번째(수용자)를 이용하여 샌드위치 분석 형식에서 검출하였다. 염료에 근위에 있을 때, 광원(레이저 또는 플래시 램프)을 이용하는 공여자의 여기는 수용자로 향하는 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 촉발시키며, 이는 결국 특정 파장(665 ㎚)에서 형광을 낸다. 특정 신호는 포스포-EGFR(Tyr1068)에 정비례하여 조절한다. 따라서, FRET 신호는 EGFR 신호전달 복합체가 활성화될 때에만 관찰될 것이다.

도 18e에 나타낸 바와 같이, ox-IL33은 양성 대조군(EGF)의 수준과 비슷한 PTEC 중의 EGFR(p-EGFR) 인산화를 유도한다. RAGE의 천연 리간드(S1001A9)는 비처리 대조군에 비해 p-EGFR의 증가를 초래하지 않았다. redIL-33도 마찬가지였다.

p-EGFR의 증가가 oxIL33 RAGE-EGFR 신호전달 경로에 의해 매개된다는 것을 확인하기 위해, PTEC를 항-RAGE 및 항-EGFR 항체의 존재 하에 산화된 IL-33으로 자극하였다.

1차 인간 PTEC를 합류에 도달되도록 배양시키고, 이어서, 96-웰 플레이트 상에 파종하고, 밤새 혈청 기아상태로 만들었다. 이어서, 세포를 항-RAGE 및 항-EGFR 항체(최종 10 ㎍/㎖에서)와 함께/없이 산화된 IL-33(최종 200 nM에서)의 단일 용량으로 자극하였다. PTEC를 항체와 함께 40분 동안 사전 인큐베이션시키고, 다음에 산화된 IL-33을 이용하여 10분간 자극하였다. 그 후에(총 50분), 세포를 용해시킴으로써 자극을 종결하고, 균질 시간 분해 형광법(HTRF)을 이용하여 EGFR의 인산화된 수준 검출을 위해 처리하였다. 분석 세부사항을 앞에서 설명하였다. Cisbio 공급업체의 프로토콜에 따라 분석을 수행하였다.

결과는 RAGE 및 EGFR의 차단이 oxIL-33에 의해 EGFR의 활성화를 감소시켰다는 것을 나타낸다(도 18f). 이는 oxIL33에 반응한 PTEC에서의 EGFR 활성화가 RAGE 및 EGFR에 의해 매개된다는 것을 나타낸다.

이들 결과는 oxIL-33이 PTEC 세포에서 RAGE/EGFR-의존적 신호전달을 활성화시키지만, redIL-33은 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 이는 IL33이 상승된 신장 질환에서 산화된 IL33이 관형 영역에서의 상피 반응을 매개할 수 있다는 것을 시사한다.

신장 상피에서의 oxIL33 신호전달의 생물학적 영향을 평가하기 위해, PTEC를 oxIL33 및 redIL-33으로 자극하고, 신장-손상-분자(Kidney-Injury-Molecule-1: KIM-1)의 방출을 측정하였다. KIM-1은 신세뇨관 손상의 중요한 마커이다(Han et al 2002, Kidney Int. 62(1)237-44).

1차 인간 PTEC를 합류에 도달하도록 배양하였고, 이어서, 24-웰 플레이트 상에 파종하고, 혈청을 밤새 기아상태로 만들고, (산화된 형태에 대해서만 특이적인 효과에 대해 특이적으로 제어하기 위해) 단일 용량의 산화된 IL-33 또는 및 돌연변이체 환원된 IL-33(둘 다 1 ㎍/㎖에서)으로 자극하였다. 자극을 8시간 동안 진행하였고, 그 후에 신장 손상 KIM-1 마커의 후속적 검출을 위해 상청액을 수집하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 중규모 진단 분석을 이용하여 검출을 수행하였다.

결과는 oxIL-33이 KIM-1을 상향조절하지만, 환원된 IL-33 아이소폼은 그렇지 않다는 것을 나타내며(도 18g), 이는 손상이 PTEC에서 oxIL-33 신호전달 축을 활성화시키는 특징이라는 것을 나타낸다.

실시예 8 - 인간 사구체 내피 세포에서의 ST2 의존적 신호전달의 차단

이하에 기재하는 실험은 상이한 신장 세포 유형이 redIL-33 신호전달에 반응하는지를 확립한다.

1차 인간 사구체 내피 세포(GEnC)를 합류까지 성장시키고, 24시간 동안 신장 염증 매개체로 처리하였다. 실시예 7에 기재한 바와 같이 MSD를 이용하여 세포 용해물에서 IL-33을 측정하였다. 도 19a에 나타낸 바와 같이, 수크로스 또는 글루코스 대조군으로 처리할 때에 비해 GEnC를 IFN-감마 및 TNF로 처리할 때 IL-33 세포내 농도가 증가한다. 이들 데이터는 염증 매개체 IFN 감마 및 TNF가 GEnC에서 IL-33 생성 및 분비를 상향조절한다는 것을 시사한다.

이어서, ST2 및 NFkB를 통한 염증 경로 상의 redIL-33의 잠재적 자가분비 또는 주변분비 효과를 시험하기 위해 GEnC를 redIL-33으로 처리하였다. GEnC를 합류까지 성장시키고, 양성 대조군으로서 redIL-33 또는 IL-1(R&D Systems - 카탈로그 번호 3625-IL-010, 201-LB-025로부터 얻음)의 용량 농도로 처리하였다. RedIL-33을 WO2016/156440에 또는 상기에 기재한 바와 같이 제조하였다. 활성화의 마커로서 핵에 대한 NFkB 전좌를 면역형광에 의해 측정하였다(문헌[Noursadeghi et al J Immunol Methods 2008]에 기재한 방법에 따름). 도 19b는 증가된 용량의 IL-1 또는 redIL-33으로 처리한 GEnC 중의 NFkB 전좌를 나타낸다. 이들 결과는 동등한 용량에서 red-IL33이 GEnC에서 IL-1에 대해 비슷한 염증 반응을 유발한다는 것을 나타낸다.

신장에서 ST2-의존적 신호전달에 대해 IL-33을 차단하는 효과를 시험하기 위해, GEnC을 WO2016/156440의 단클론성 항체 33_640087-7B로 처리하였다(서열번호 616 및 서열번호 618). 간략히 말해서, GEnC를 합류까지 성장시키고, 0.0001-100 nM nM 33_640087-7B 또는 아이소타입 대조군과 함께 또는 이들 없이 24시간 동안 IL-33 또는 대조군 제제로 처리하였다. NFkB 전좌를 ST2 신호전달 및 내피 활성화의 마커로서 사용하였고, 앞의 실시예에 기재한 바와 같이 분석하였다.

도 19c에 나타낸 바와 같이, redIL-33은 33_640087-7B에 의해 저해되는 IL-33으로 처리되는 GEnC에서 NFkB 전좌를 유도하였다. 아이소타입 대조군은 활성화를 저해하지도 않았고, 33_640087-7B도 양성 대조군으로서 사용되는 IL1-매개 NFkB 신호전달을 저해하지 않았다.

내피세포의 redIL-33 자극 효과를 분석하기 위해 추가 실험을 수행하였다.

1차 인간 HGMEC(Cell Systems)를 합류에 도달되도록 배양시키고, 이어서, 24-웰 플레이트 상에 파종하고, 환원된 또는 산화된 형태의 IL-33의 단일 용량(30 ng/㎖)으로 24시간 동안 자극하였다. 이 후에, 전염증 IL-6 및 IL-8 사이토카인의 검출을 위해 상청액을 수집하였다. 제조업자의 지침에 따라 중규모 진단 분석을 이용함으로써 사이토카인의 검출을 달성하였다.

결과는 redIL-33이 IL-6 및 IL-8의 방출을 유도한다는 것을 나타낸다(도 20d). oxIL-33은 IL-6 또는 IL-8 방출을 유도하지 않았다.

HGMEC에서 redIL-33 자극 후에 염증 사이토카인 IL-8, TNFa, IL1b 및 IL-6의 용량-의존적 방출을 또한 측정하였다. 1차 인간 HGMEC(Cell Systems)를 합류에 도달하도록 배양시키고, 이어서, 24-웰 플레이트 상에 파종하고, 환원된 형태의 IL-33의 전체 용량 범위(200 nM 내지 12.8 pM의 용량)로 24시간 동안 자극하였다. 이 후에, 전염증 사이토카인의 검출을 위해 상청액을 수집하였다. 제조업자의 지침에 따라 중규모 진단 분석을 이용함으로써 사이토카인의 검출을 달성하였다.

결과는 내피세포로부터의 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNFa의 분비가 용량 의존적 방식으로 redIL-33에 특이적이라는 것을 나타낸다.

시험관내 redIL-33-유도된 사구체 내피 세포 NFkB 활성화를 추가로 연구하기 위해, 24시간 동안 redIL-33 인큐베이션으로 인큐베이션한 후에 GEnC 중 염증 사이토카인의 생성을 측정하였다.

상기와 같이, GEnC를 합류까지 성장시키고, 33_640087-7B와 함께 또는 이것 없이 IL33 또는 양성 대조군과 함께 인큐베이션시켰다. 제조업자 프로토콜에 따라 중규모 진단(MSD) 분석을 이용하여 상청액으로부터 사이토카인 수준을 측정하였다.

1차 인간 내피세포에서 MAP 키나제 신호전달의 활성화를 저해하는 33-640087_7B의 능력을 또한 측정하였다. 1차 인간 HGMEC(Cell Systems)를 합류까지 배양시키고, 이어서, 24-웰 플레이트 상에 파종하고, 1 ㎍/㎖에서 33-640087_7B와 함께/이것 없이 30 ng/㎖에서 redIL-33의 단일 용량으로 30분 동안 자극하였다. 30분 후에, MAP 키나제의 인산화 및 33-640087_7B의 차단 효과를 측정하기 위해 세포를 용해시켰다. 제조업자의 지침에 따라 중규모 진단 분석을 이용함으로써 MAP 키나제를 검출하였다.

결과는 24시간 후에 GEnC 상청액으로부터 측정한 바와 같이 33_640087-7B가 IL-4, IL-6, IL-8 및 IL-12의 분비를 유의미하게 저해한다는 것을 나타낸다(도 20a). 더 나아가, 33_640087-7B는 MAP 키나제 p38 및 JNK의 인산화를 저해한다(도 20b).

이는 IL-33 길항제가 IL-33/ST2 신호전달에 의해 매개되는 신장에서의 염증을 감소 또는 저해하는 데 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 이는 신장에서 비정상적 염증을 갖는 질환, 예컨대, 당뇨병성 신장 질환의 치료에서 유용할 수 있다.

실시예 9 인간 1차 혈관사이세포에서의 IL33 신호전달

IL-33의 상이한 아이소폼이 신장 상피 및 내피세포에서의 상이한 병리학적 효과를 가졌다는 것을 고려하여, 혈관사이세포에서의 IL-33 신호전달을 또한 분석하였다.

혈관사이세포는 신장 사구체의 다른 주요 성분인 전문화된 세포이다. 혈관사이세포의 주요 기능은 기저막으로부터 트랩핑된 잔기 및 응집된 단백질을 제거하고, 따라서 파편이 없는 필터를 유지하는 것이다. 당뇨병성 신장 질환은 궁극적으로는 사구체모세관을 막고 신장 기능을 손상시키는 사구체 비대증 및 토리굳음증을 야기하는 진행성 혈관사이 확장 및 기질 침착을 특징으로 한다.

혈관사이세포가 IL-33 발현을 유도하는지의 여부를 확고히 하기 위해 다양한 만성 신장 질환 스트레스원으로 혈관사이세포를 자극하였다.

1차 인간 혈관사이세포(Lonza)를 합류까지 성장시키고, 이어서, 6웰 플레이트 상에 파종하고, 신장 염증 매개체로 24시간 동안 처리하였다. 상기 실시예에 기재한 바와 같이 MSD를 이용하여 세포 용해물에서 IL-33을 측정하였다. 도 21a에 나타낸 바와 같이, IL-33 세포내 농도는, 혈관사이세포를 IFN-감마 및 TNF-알파로 처리할 때에 다른 스트레스원에 비해 상향조절된다.

혈관사이세포 내의 IL-33 발현의 자가분비 및 주변분비 효과를 다음에 시험하였다. redIL-33으로 처리 시 1차 인간 혈관사이세포로부터의 IL-8의 용량-의존적 방출을 분석하였다.

1차 혈관사이세포(Lonza)를 합류까지 성장시켰고, 이어서, 24-웰 플레이트에 파종하고, 환원된 형태의 IL-33의 전체 용량 범위(200 nM 내지 12.8 pM의 용량)로 24시간 동안 처리하였다. 전염증 IL8의 검출을 위해 상청액을 수집하였다. 제조업자의 지침에 따라 중규모 진단 분석을 이용함으로써 IL-8을 검출하였다. 차단 실험을 위해, 1차 혈관사이세포(Lonza)를 합류까지 성장시키고, 이어서, 24-웰 플레이트 상에 파종하고, 24시간 동안 1 ㎍/㎖에서 33-640087_7B와 함께/이것 없이 환원된 IL-33의 단일 용량(30 ng/㎖)으로 처리하였다. 전염증 IL8의 검출을 위해 상청액을 수집하였다. 제조업자의 지침에 따라 중규모 진단 분석을 이용함으로써 IL8을 검출하였다.

결과는 IL-8 방출이 용량-의존적이라는 것을 나타낸다(도 21b). IL-8의 방출은 33_640087_7B의 존재에 의해 저해된다(도 21c). 따라서, IL-33 길항제는 혈관사이세포에서 환원된 IL-33에 의해 매개된 자가분비 또는 주변분비 염증 반응을 저해하는 데 유용할 수 있다.

DKD에서 관찰되는 혈관사이 확장에 대한 IL-33 신호전달의 가능한 기여를 조사하기 위해, 1차 인간 혈관사이세포를 IL-33으로 자극하고, 이들 세포의 증식을 시험관내에서 측정하였다. 간략히 말해서, 인간 1차 혈관사이세포를 합류까지 성장시키고, 96 웰 플레이트에서 파종하고, 24시간 동안 기아 상태로 만들고, 18시간 동안 redIL-33, oxIL-33 또는 양성 대조군으로서 PDGF-BB의 용량 농도로 처리하였다. 이 후에, 세포를 10 μM EdU 용액으로 추가 4시간 동안 펄싱하였다. EdU 노출은 DNA를 합성하는 세포의 직접 측정을 가능하게 한다. Amplex™ UltraRed 시약을 이용하고 제조업자의 지침에 따라 형광 방출을 측정함으로써 EdU 혼입을 평가하였다.

도 21d에 나타낸 바와 같이, oxIL-33은 용량-의존적 방식으로 인간 혈관사이세포의 증식을 유도한다. 이들 결과는 oxIL-33이 당뇨병성 신장 질환의 진행 동안 혈관사이세포 확장에 관련될 수 있지만, redIL-33은 그렇지 않다는 것을 시사한다.

실시예 10 - OxIL-33은 침지 단일층 상피 배양물에서의 긁힌 상처 회복 반응을 손상시킨다

oxIL-33은 EGF와 대조적으로 A549 및 NHBE 세포에서의 긁힌 상처 봉합을 손상시킨다

A549 상피 세포를 ATCC로부터 얻었고, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충한 RPMI GlutaMax 배지에서 배양하였다. 세포를 어큐타제(PAA, #L1 1-007)로 채취하고, 5×10⁵개/100 ㎕로 96웰 플레이트에 파종하고 나서, 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 100 ㎕의 PBS로 2회 세척한 후에 100 ㎕의 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지)를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. WoundMaker™(Essen Bioscience)을 이용하여, 세포를 긁어내고, 이어서, 웰을 200 ㎕의 PBS로 2× 세척한 후에 표시된 자극; 배지 단독(비자극 대조군), 30 ng/㎖ 환원된 IL-33, 30 ng/㎖ 산화된 IL-33 또는 30 ng/㎖ EGF를 포함하는 0.1% FBS(v/v) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI GlutaMax 배지를 첨가하고 37℃, 5% CO₂로 복귀시켰다. 상처 치유 영상화를 위해 플레이트를 IncucyteZoom에 두었고, 48시간에 걸쳐 분석하였다. Incucyte Zoom 소프트웨어 내의 상처 치유 알고리즘을 통해 상대 상처 밀도를 계산하였다.

정상 인간 기관지 상피 세포(NHBE)(CC-2540)를 Lonza로부터 얻고, 제조업자의 프로토콜에 따라 완전 BEGM 배지[BEGM(Lonza CC-3171) 및 보충 키트(Lonza CC-4175)]에서 유지하였다. 세포를 어큐타제로 채취하고, 배양 배지 중 96-웰 플레이트 ImageLock 플레이트(Sartorius, 4379)에서 5×10⁵개/100 ㎕에서 파종하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 후에, 배지를 흡입하고, 세포를 100 ㎖의 PBS로 2회 세척한 후에 기아상태 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 보충 키트 없이 BEGM(Lonza CC-3171))를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 긁힘 상처 전에 37℃, 5% CO₂에서 추가 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. WoundMaker™(Essen Bioscience)을 이용하여, 세포를 긁어내고, 이어서, 웰을 200 ㎕의 PBS로 2× 세척한 후에 표시된 자극; 배지 단독 (비자극 대조군), 30 ng/㎖ 환원된 IL-33, 30 ng/㎖ 산화된 IL-33 또는 30 ng/㎖ EGF를 포함하는 0.1% FBS(v/v) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 BEBM 배지(Lonza)를 첨가하고 37℃, 5% CO₂로 복귀시켰다. 상처 치유 영상화를 위해 플레이트를 IncucyteZoom에 두었고, 48시간에 걸쳐 분석하였다. Incucyte Zoom 소프트웨어 내의 상처 치유 알고리즘을 통해 상대 상처 밀도를 계산하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, oxIL-33은 A549 세포(도 22a) 및 NHBE 세포(도 22b)의 침지된 배양물에서 상처 치유를 저해하였고, 이는 증가된 상처 세포 밀도가 관찰된 EGF와 반대 효과를 갖는다.

산화된 IL-33에 의한 긁힘 상처 봉합의 손상은 항체 중화 RAGE 또는 EGFR에 의해 방지될 수 있지만 ST2에 의해서는 방지될 수 없다

oxIL-33의 이들 기능적 효과가 RAGE/EGFR을 통해 매개되었는지 여부를 이해하기 위해, 상기 기재된 바와 같은, 그러나 상이한 수용체 성분을 중화시킨 항체의 존재 하에서 NHBE 세포에서 긁힘 분석을 수행하였다. NHBE 세포를 10㎍/㎖ 항-ST2(AF532, R&D Systems), 항-RAGE(M4F4, WO 2008137552) 또는 항-EGFR(Clone LA1, 05-101 Millipore)의 존재 하에 배지 단독(비자극 대조군), 환원된 IL-33, 또는 산화된 IL-33으로 처리하였다. OxIL-33은 긁힘 봉합을 저해하지만, 환원된 IL-33은 그렇지 않았다. oxIL-33의 이런 효과는 항-RAGE 및 항-EGFR에 의해 반전되지만 항-ST2에 의해서는 반전되지 않으며, 이는 RAGE 및 EGFR이 산화된 IL-33 신호전달 경로에 관련된 필수 수용체라는 것을 재차 입증한다(도 23).

만성 신장 질환 미세환경에서 주목한 손상에 대한 상피 세포 반응을 시험하기 위해 긁힌 상처 분석을 사용할 수 있다. 간략히 말해서, RPTEC를 96 웰 플레이트에서 24시간 동안 20,000 내지 30,000개/웰에서 파종한다(제1일). 제2일에, PTEC 세포를 밤새 혈청 기아상태로 만든다. 제3일에, 상처 마커(Essen Bioscience)를 이용하여 긁힌 상처를 만들고, 분리된 세포를 제거하기 위해 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 자극을 적용하고(웰당 100 ㎕), 양성 대조군으로서 사용한 완전 보충 배지의 세포를 제외하고, 0.1% 혈청 배지에서 희석시켰다. 플레이트를 Incucyte(Incucyte S3 2019A)에 삽입하고, 0시간(기준선)에 상대 상처 밀도를 측정하기 위해 제조업자의 지침에 따라 설정하고, 이어서, 상대 상처 봉합을 측정하기 위해 4일 동안 4시간마다 측정하였다.

결론적으로, 실시예에 제시한 데이터는 염증 매개체가 신장 상피, 내피 및 사구체에서 IL-33의 생성을 상향조절한다는 것을 입증한다. RedIL-33은 신장 내피세포에서 NFkB 활성화(ST2 의존적)를 통한 자가분비 또는 주변분비 메커니즘을 통해 신호를 전달하는 것으로 나타난다. Red-IL33 신호전달은 생체내 신장 손상을 악화시킬 가능성이 있는 사구체 내피로부터의 전염증 사이토카인 분비를 매개한다. 또한, oxIL-33은 신장 상피에서 RAGE/EGFR 신호전달 경로(RAGE-의존적)를 활성화시킨다. RAGE/EGFR 신호전달은 신장 손상의 병리생리에 기여하는 것으로 의심된다. 또한 RAGE 발현은 신장 질환의 다중 전임상 모델에서 신장에서 향상된다는 것이 나타났다. Il-33 발현은 신장 질환에서 향상된다. 이는 redIL-33과 oxIL-33 둘 다의 농도가 CKD에서 신장 내에서 향상될 수 있다는 것을 의미한다. ST-2가 손상 동안 신장에서 놀랍게 하향조절되는 것으로 나타나는 것을 고려하여, RAGE-EGFR/IL-33 시스템은 신장 질환에서 IL-33-매개 병리에 기여할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE LIMITED <120> METHODS FOR TREATING RENAL DISORDERS <130> IL33-106-US-PROV <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Ala Ile Asp Gln Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Lys Phe Met Gln Leu Trp Gly Gly Gly Leu Arg Tyr Pro 100 105 110 Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 2 VH <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 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Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr 35 40 45 Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 50 55 60 Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 85 90 95 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Lys Thr Tyr Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 14 VL <400> 32 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ile Asn 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser His Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ser Gln Ser Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 33 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 15 VL <400> 33 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ile Asn 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser His Arg Leu Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ser Gln Pro Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 16 VL <400> 34 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ile Asn 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser His Arg Leu Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ser Gln Pro Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 17 VL <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys His 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr Asn Gln Gly Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 18 VL <400> 36 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ala Lys Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Leu Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 HCDR1 <400> 37 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 HCDR2 <400> 38 Gly Ile Ser Ala Ile Asp Gln Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 HCDR3 <400> 39 Gln Lys Phe Met Gln Leu Trp Gly Gly Gly Leu Arg Tyr Pro Phe Gly 1 5 10 15 Tyr <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 LCDR1 <400> 40 Ser Gly Glu Gly Met Gly Asp Lys Tyr Ala Ala 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 LCDR2 <400> 41 Arg Asp Thr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIR 1 LCDR3 <400> 42 Gly Val Ile Gln Asp Asn Thr Gly Val 1 5 <210> 43 <211> 34 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> N terminal His10/Avitag/Factor Xa protease cleavage site <400> 43 Met His His His His His His His His His His Ala Ala Gly Leu Asn 1 5 10 15 Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Ala Ile Glu 20 25 30 Gly Arg <210> 44 <211> 159 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> IL-33-01 <400> 44 Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr 20 25 30 Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val 35 40 45 Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp 50 55 60 Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp 65 70 75 80 Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys 85 90 95 Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met 100 105 110 His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe 115 120 125 Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser 130 135 140 Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 145 150 155 <210> 45 <211> 159 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> IL-33-16 <400> 45 Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr 20 25 30 Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val 35 40 45 Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp 50 55 60 Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp 65 70 75 80 Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys 85 90 95 Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met 100 105 110 His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe 115 120 125 Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser 130 135 140 Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 145 150 155 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Avitag sequence motif <400> 46 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> gRNA vector targeting RAGE exon 3 <400> 47 tgaggggatt ttccggtgc 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RAGE forward primer <400> 48 gttgcagcct cccaacttc 19 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RAGE reverse primer <400> 49 aatgaggcca gtggaagtca 20

Claims (72)

1. 대상체에서의 신장 손상을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 항-IL-33 치료제로서, 상기 항-IL-33 치료제는 IL-33-매개 ST2 신호전달 및 IL-33-매개 RAGE 신호전달을 약화 또는 저해하기 위해 상기 대상체에게 투여될 것인, 항-IL-33 치료제.
2. 제1항에 있어서, 상기 IL-33-매개 RAGE 신호전달은 IL-33-매개 RAGE-EGFR 신호전달인, 항-IL-33 치료제.
3. 제1항에 있어서, 상기 항-IL-33 치료제는 환원된 IL-33 단백질(redIL-33)의 활성을 약화 또는 저해하여, ST2 신호전달을 저해하는, 항-IL-33 치료제.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-33 치료제는 산화된 IL-33 단백질(oxIL-33)의 활성을 약화 또는 저해하여, RAGE 신호전달을 저해하는, 항-IL-33 치료제.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장 손상은 염증을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
6. 제5항에 있어서, 상기 신장 손상은 염증성 신장 손상인, 항-IL-33 치료제.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 신장 손상은 당뇨병성 신장 질환, 섬유증, 사구체신염(예를 들어, 비증식성(예컨대, 미세변화 사구체신염, 막 사구체신염, 국소조각토리굳음증) 또는 증식성(예컨대, IgA 신장병증, 막증식성 사구체신염, 감염 후 사구체신염, 및 급성 진행 사구체신염[예컨대, 굿파스쳐 증후군 및 맥관염 장애{베게너 육아종증 및 현미경 다발혈관염을 포함함}]), 전신 홍반 루푸스, 단백뇨증, 일측성 요관 폐쇄, 알포트 증후군, 다낭성 신장 질환(PCKD), 고혈압 토리굳음증, 만성 토리굳음증, 만성 폐쇄성 요로 병증, 만성 세뇨관 간질성 신염 및 허혈성 신장병증으로부터 선택된, 항-IL-33 치료제.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장 손상은 당뇨병성 신장 질환인, 항-IL-33 치료제.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-33 치료제는 화학적 저해제 및 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된, 항-IL-33 치료제.
10. 제9항에 있어서, 상기 치료제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 결합하는, 항-IL-33 치료제.
12. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 갖는, 항-IL-33 치료제.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 redIL-33에 특이적으로 결합하고, redIL-33의 활성을 약화 또는 저해하여, ST2 신호전달을 저해하는, 항-IL-33 치료제.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 방지하여, RAGE-EGFR 신호전달을 저해하는, 항-IL-33 치료제.
15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (예를 들어, KinExA를 이용하여 측정될 때) 100 pM 이하, 또는 10 pM 이하, 예를 들어, 1 pM 이하, 예컨대, 0.5 pM, 특히, 0.05 pM의 결합 친화도로 redIL-33에 결합하는, 항-IL-33 치료제.
16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 10⁵ M^-1 sec^-1, 5×10⁵ M^-1 sec^-1, 10⁶ M^-1 sec^-1, 또는 5×10⁶ M^-1sec^-1 또는 10⁷ M^-1sec^-1 이상, 특히 10⁷ M^-1sec^-1 이상인 k(on)로 redIL-33에 결합하는, 항-IL-33 치료제.
17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 5×10^-1 sec^-1, 10^-1 sec^-1, 5×10^-2 sec^-1, 10^-2 sec^-1, 5×10^-3 sec^-1 또는 10^-3 sec^-1 이하, 특히 10^-3 sec^-1 이하의 k(off)로 redIL-33에 결합하는, 항-IL-33 치료제.
18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 oxIL-33의 활성을 약화 또는 저해하여 RAGE 신호전달을 저해하는, 항-IL-33 치료제.
19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 37의 서열을 갖는 VHCDR1, 서열번호 38의 서열을 갖는 VHCDR2, 서열번호 39의 서열을 갖는 VHCDR3, 서열번호 40의 서열을 갖는 VLCDR1, 서열번호 41의 서열을 갖는 VLCDR2 및 서열번호 42의 서열을 갖는 VLCDR3을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 VH 및 VL 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 1 및 서열번호 19에 대해 각각 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
21. 제20항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 1의 서열을 갖는 VH 및 서열번호 19의 서열을 갖는 VL을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
22. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체인, 항-IL-33 치료제.
23. 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 천연 유래 항체, scFv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 단일쇄 항체인, 항-IL-33 치료제.
24. 제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단클론성 항체인, 항-IL-33 치료제.
25. 제2항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, RAGE-EGFR 신호전달의 저해 또는 약화는 RAGE-EGFR 매개 효과를 하향조절 또는 저해하는, 항-IL-33 치료제.
26. 제25항에 있어서, 상기 RAGE-EGFR 매개 효과는 비정상적 상피 생리, 예컨대, 비정상적 상피 리모델링을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
27. 제25항에 있어서, 상기 RAGE-EGFR 매개 효과는 비정상적 혈관사이 확장을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
28. 제27항에 있어서, 비정상적 혈관사이 확장은 비정상적 혈관사이세포 증식을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, ST2 신호전달의 저해 또는 약화는 ST2 매개 효과를 하향조절 또는 저해하는, 항-IL-33 치료제.
30. 제29항에 있어서, 상기 ST2 매개 효과는 신장에서의 비정상적 염증인, 항-IL-33 치료제.
31. 제30항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 내피에 있는, 항-IL-33 치료제.
32. 제31항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 증가된 IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa 및/또는 IL1b 분비 또는 발현, 선택적으로 증가된 IL-4, IL-6, IL-8 및/또는 IL-12 분비 또는 발현을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 MAP 키나제 활성화를 포함하는, 항-IL-33 치료제.
34. 제33항에 있어서, MAP 키나제 활성화는 p38 또는 JNK 키나제 활성화를 포함하는, 항-IL-33 치료제.
35. 제30항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 사구체에 있는, 항-IL-33 치료제.
36. 제35항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 증가된 IL-8 분비 또는 발현을 포함하는, 항-IL-33 치료제.
37. 신장 손상의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 신장 손상의 치료 방법으로서, IL-33-매개 ST2 신호전달 및 IL-33-매개 RAGE 신호전달을 약화 또는 저해하기 위해 항-IL-33 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 IL-33-매개 RAGE 신호전달은 IL-33-매개 RAGE-EGFR 신호전달인, 방법.
39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 항-IL-33 치료제는 환원된 IL-33 단백질(redIL-33)의 활성을 약화 또는 저해하여, ST2 신호전달을 저해하는, 방법.
40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-33 치료제는 산화된 IL-33 단백질(oxIL-33)의 활성을 약화 또는 저해하여, RAGE 신호전달을 저해하는, 방법.
41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장 손상은 염증을 포함하는, 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 신장 손상은 염증성 신장 손상인, 방법.
43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 신장 손상은 당뇨병성 신장 질환, 섬유증, 사구체신염(예를 들어, 비증식성(예컨대, 미세변화 사구체신염, 막 사구체신염, 국소조각토리굳음증) 또는 증식성(예컨대, IgA 신장병증, 막증식성 사구체신염, 감염 후 사구체신염, 및 급성 진행 사구체신염[예컨대, 굿파스쳐 증후군 및 맥관염 장애{베게너 육아종증 및 현미경 다발혈관염을 포함함}]), 전신 홍반 루푸스, 단백뇨증, 일측성 요관 폐쇄, 알포트 증후군, 다낭성 신장 질환(PCKD), 고혈압 토리굳음증, 만성 토리굳음증, 만성 폐쇄성 요로 병증, 만성 세뇨관 간질성 신염 및 허혈성 신장병증으로부터 선택된, 방법.
44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장 손상은 당뇨병성 신장 질환인, 방법.
45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-33 치료제는 화학적 저해제 및 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된, 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 치료제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 결합하는, 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 표 1로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL) 쌍의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는, 방법.
49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 redIL-33에 특이적으로 결합하고, redIL-33의 활성을 약화 또는 저해하여, ST2 신호전달을 저해하는, 방법.
50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 RAGE에 대한 산화된 IL-33의 결합을 방지하여, RAGE-EGFR 신호전달을 저해하는, 방법.
51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (예를 들어, KinExA를 이용하여 측정될 때) 100 pM 이하, 또는 10 pM 이하, 예를 들어, 1 pM 이하, 예컨대, 0.5 pM, 특히, 0.05 pM의 결합 친화도로 redIL-33에 결합하는, 방법.
52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 10⁵ M^-1 sec^-1, 5×10⁵ M^-1 sec^-1, 10⁶ M^-1 sec^-1, 또는 5×10⁶ M^-1sec^-1 또는 10⁷ M^-1sec^-1 이상, 특히 10⁷ M^-1sec^-1 이상인 k(on)로 redIL-33에 결합하는, 방법.
53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 5×10^-1 sec^-1, 10^-1 sec^-1, 5×10^-2 sec^-1, 10^-2 sec^-1, 5×10^-3 sec^-1 또는 10^-3 sec^-1 이하, 특히 10^-3 sec^-1 이하의 k(off)로 redIL-33에 결합하는, 방법.
54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 oxIL-33의 활성을 약화 또는 저해하여 RAGE 신호전달을 저해하는, 방법.
55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 37의 서열을 갖는 VHCDR1, 서열번호 38의 서열을 갖는 VHCDR2, 서열번호 39의 서열을 갖는 VHCDR3, 서열번호 40의 서열을 갖는 VLCDR1, 서열번호 41의 서열을 갖는 VLCDR2 및 서열번호 42의 서열을 갖는 VLCDR3을 포함하는, 방법.
56. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 VH 및 VL 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 1 및 서열번호 19에 대해 각각 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
57. 제56항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 1의 서열을 갖는 VH 및 서열번호 19의 서열을 갖는 VL을 포함하는, 방법.
58. 제47항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체인, 방법.
59. 제47항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 천연 유래 항체, scFv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 단일쇄 항체인, 방법
60. 제47항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단클론성 항체인, 방법.
61. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RAGE-EGFR 신호전달의 저해 또는 약화는 RAGE-EGFR 매개 효과를 하향조절 또는 저해하는, 방법.
62. 제61항에 있어서, 상기 RAGE-EGFR 매개 효과는 비정상적 상피 생리, 예컨대, 비정상적 상피 리모델링을 포함하는, 방법.
63. 제61항에 있어서, 상기 RAGE-EGFR 매개 효과는 비정상적 혈관사이 확장을 포함하는, 방법.
64. 제63항에 있어서, 비정상적 혈관사이 확장은 비정상적 혈관사이세포 증식을 포함하는, 방법
65. 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, ST2 신호전달의 저해 또는 약화는 ST2 매개 효과를 하향조절 또는 저해하는, 방법.
66. 제65항에 있어서, 상기 ST2 매개 효과는 신장에서의 비정상적 염증인, 방법.
67. 제66항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 내피에 있는, 방법.
68. 제67항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 증가된 IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa 및/또는 IL1b 분비 또는 발현, 선택적으로 증가된 IL-4, IL-6, IL-8 및/또는 IL-12 분비 또는 발현을 포함하는, 방법.
69. 제67항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 MAP 키나제 활성화를 포함하는, 방법.
70. 제69항에 있어서, MAP 키나제 활성화는 p38 또는 JNK 키나제 활성화를 포함하는, 방법.
71. 제66항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 사구체에 있는, 방법.
72. 제71항에 있어서, 상기 비정상적 염증은 증가된 IL-8 분비 또는 발현을 포함하는, 항-IL-33 치료제.

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