CN114616249B - 含有抗pd-l1抗体的稳定制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种稳定的抗PD‑L1(程序性细胞死亡蛋白配体1)抗体的药物制剂及其在医药上的应用。该制剂含有抗PD‑L1抗体、缓冲液，还可以含有至少一种稳定剂，任选的还可以含有表面活性剂。本发明提供的药物制剂可以有效的抑制抗体的聚集，阻止抗体产品的降解，具有高稳定性。

Description

含有抗PD-L1抗体的稳定制剂

技术领域

本发明涉及治疗性药物制剂领域。尤其是，本发明涉及医药制剂领域，该制剂含有一种与程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)特异性结合的人源化抗体。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白配体1(Programmed death-ligand 1，PD-L1)，又可称为分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或者B7同源蛋白1(B7 homolog1，B7-H1)，属于肿瘤坏死因子超家族，是由290个氨基酸残基组成的I型跨膜糖蛋白，包含一个IgV样区、一个IgC样区、一个跨膜疏水区和一个30个氨基酸的胞内尾部，完整分子量为40kDa。PD-L1 mRNA在几乎所有组织中都有表达，但PD-L1蛋白只在少部分组织中持续表达，包括肝脏、肺脏、扁桃体以及免疫特赦组织如眼、胎盘等。PD-L1也表达于活化的T细胞，B细胞，单核细胞，树突状细胞，巨噬细胞等。

PD-L1的受体为PD-1，主要表达于CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、B细胞和活化的单核细胞等免疫细胞表面。PD-L1与PD-1结合可以启动PD-1胞浆区ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模块)酪氨酸残基的磷酸化，促使酪氨酸磷脂酶与SHP2结合，活化SHP2，使下游Syk和PI3K发生去磷酸化从而传递终止信号，限制抗原呈递细胞或者树突状细胞与T细胞的相互作用。这种结合还可以进一步抑制T细胞的代谢，抑制抗凋亡蛋白Bcl-X2的分泌，减少效应细胞因子IL-2、IFN-r的分泌，诱导T细胞耗竭和凋亡，从而降低免疫T细胞参与的免疫应答，行使负性调节功能。

T细胞识别抗原并活化后会分泌IFN-r。T细胞来源的IFN-r会扩增和维持T细胞功能，比如上调MHC分子，增强目标细胞的抗原处理和呈递，促进T细胞分化。IFN-r同时也会诱导免疫炎症部位组织的PD-L1表达，防止过度免疫对组织造成伤害。IFN-r可以诱导常规上皮细胞，血管内皮细胞，髓样细胞，幼稚T细胞等细胞表面PD-L1的表达。IFN-r诱导产生的干扰素调节因子1(IRF-1)也可以与PD-L1转录起始位点前200bp和320bp处的干扰素调节因子结合位点结合，从转录水平调节PD-L1。PD-L1可以与T细胞表面的PD-1结合行使负调节功能，从而保护炎性部位。

PD-L1的负性调控功能在肿瘤免疫中发挥着重要作用。2004年，Konishi等率先在非小细胞肺癌病人的组织样本中发现PD-L1的表达，随后PD-L1被发现表达于各种肿瘤病人的组织中，包括胃癌，肺癌，肝癌，肝内胆管癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫颈癌，头颈鳞状细胞癌，鼻咽癌，食管癌，膀胱癌，肾细胞癌，皮肤癌，口腔鳞状细胞癌等。细胞恶变过程中，由于基因突变、外源基因(病毒)表达或静止基因激活等原因会产生新的蛋白分子，这些蛋白质在细胞内降解后，某些降解的肽段可以表达于细胞表面，成为肿瘤抗原。免疫系统可以通过免疫监察识别肿瘤抗原并清除肿瘤细胞，而肿瘤细胞则利用PD-L1逃避免疫攻击。

肿瘤部位PD-L1的表达可以通过多种途径保护肿瘤细胞免受伤害。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分泌IFN-γ可诱导肿瘤细胞及周围基质细胞表达PD-L1。而肿瘤细胞的PD-L1可以与TIL上PD-1结合，抑制TIL细胞的活化，并进一步导致其凋亡。体外实验证明，肿瘤细胞相关PD-L1可以增加肿瘤特异T细胞的调亡，而PD-L1单克隆抗体可以减弱这种作用。肿瘤相关PD-L1可以促进T细胞表达IL-10，进一步抑制免疫反应。PD-L1不仅仅是PD-1的配体，他也可以作为受体传递反向的信号保护肿瘤细胞免受FAS-FASL等其他抗肿瘤途径诱导的凋亡。

多种慢性和急性病毒也利用PD-L1信号逃避人体免疫检测。Wang等发现HIV感染者骨髓来源的树突状细胞上PD-L1的表达明显上调，经过抗病毒感染，抑制HIV复制后，PD-L1的表达下调，同时伴随T细胞数目的上调；Chen等研究发现慢性HBV感染者的T淋巴细胞和村突状细胞上PD-L1的表达也上调。病毒感染会诱导感染细胞高表达PD-L1，同时诱导CD8+T细胞表达PD-1，从而抑制T细胞作用，导致效应T细胞耗竭。

因此，本领域存在着对于高稳定性的蛋白质制剂的需求。

发明内容

本发明通过提供含有与程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)特异性结合的人源抗体的医药制剂。

一方面，本发明提供了一种抗PD-L1抗体药物制剂，包含：(1)缓冲液；(2)稳定剂；(3)抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。

作为一种优选方式，所述的药物制剂还可以包含非离子型表面活性剂。

在一些实施方式中，其中所述的缓冲液为醋酸缓冲液、枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液之一或其组合。

在一些实施方式中，其中所述的缓冲液为组氨酸缓冲液；优选地，所述组氨酸缓冲液选自组氨酸-盐酸盐缓冲液或组氨酸-醋酸盐缓冲液，优选组氨酸-盐酸盐缓冲液。

在一些实施方式中，该组氨酸缓冲液是由L-组氨酸和L-组氨酸单盐酸盐制成。

在一些实施方式中，缓冲液的浓度为约1mM～50mM，优选5mM～40mM，更优选10mM～30mM。

在一些实施方式中，缓冲液为组氨酸缓冲液，其中，组氨酸缓冲液的浓度约10mM～30mM，优选为20mM～30mM。在一些实施方式中，该组氨酸缓冲液的浓度约10mM。在一些实施方式中，该组氨酸缓冲液的浓度约20mM。在一些实施方式中，该组氨酸缓冲液的浓度约30mM。

在一些方案中，上述组氨酸缓冲液为组氨酸-醋酸盐缓冲液，优选地，两者的摩尔比为1∶1到1.5∶1，优选地，此类缓冲液的pH为5.5±0.3，优选约为5.5，优选地，这类缓冲液含有15-20mM的组氨酸和12-15mM的醋酸。

在一些方案中，上述缓冲液为醋酸缓冲液，优选地，所述醋酸缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钾缓冲液，优选醋酸-醋酸钠缓冲液。

在一些方案中，上述缓冲液为柠檬酸缓冲液，优选地，所述柠檬酸缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

在一些方案中，上述缓冲液为琥珀酸缓冲液，优选地，所述琥珀酸缓冲液为琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液。

在一些方案中，上述缓冲液的pH约为5.0-6.5，优选约为5.0-6.0，优选约为5.5-6.5，优选约为5.0-5.5，优选约为5.5-6.0，优选约为6.0-6.5，上述缓冲液的pH非限制性实施例约为5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，优选约为5.0，5.5或6.0。

在一些实施方式中，其中所述的稳定剂包含选自氯化钠、盐酸精氨酸、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖的一种或其组合。在一些实施方式中，其中所述的稳定剂为海藻糖。在一些实施方式中，其中所述的稳定剂为海藻糖与氯化钠的组合。

在本发明的实施方案中，稳定剂的浓度为约50mM～300mM，优选100mM～300mM，更优选200mM～250mM。

在一些实施方式中，所述稳定剂为浓度约30-200mM的氯化钠；或所述稳定剂为浓度约100-300mM的甘露醇；或所述稳定剂为浓度约100-300mM的山梨醇；或所述稳定剂为浓度约100-300mM的蔗糖；或所述稳定剂为浓度约100-300mM的海藻糖；或所述稳定剂为浓度约30-200mM的盐酸精氨酸；或所述稳定剂为约30-200mM的氯化钠与约30-200mM的甘露醇的组合；或所述稳定剂为约30-200mM的氯化钠与约30-200mM的蔗糖的组合；或所述稳定剂为约30-200mM的氯化钠与约30-200mM的蔗糖的组合；或所述稳定剂为约30-200mM的氯化钠与约30-200mM的海藻糖的组合；或所述稳定剂为约30-200mM的盐酸精氨酸与约30-200mM的蔗糖的组合。

在一些实施方式中，所述稳定剂为约100-300mM的海藻糖。

在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约30-200mM的氯化钠，上述氯化钠的浓度优选约为50-190mM，优选约为100-180mM，优选约为120-170mM，优选约为130-150mM，上述氯化钠浓度的非限制性实施例为约100mM，110mM，120mM，125mM，130mM，135mM，140mM，145mM，150mM，155mM，160mM，170mM，180mM，190mM，200mM，优选135mM或140mM。

在一些方案中，上述稳定剂为甘露醇。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100-300mM的甘露醇，上述甘露醇的浓度优选约为150-300mM，优选约为200-280mM，上述甘露醇浓度的非限制性实施例为约200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，优选为240mM。

在一些方案中，上述稳定剂为山梨醇。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100-300mM的山梨醇，上述山梨醇的浓度优选约为150-300mM，优选约为200-280mM，上述山梨醇浓度的非限制性实施例为约200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，优选为240mM。

在一些方案中，上述稳定剂为蔗糖。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100-300mM的蔗糖，上述蔗糖的浓度优选约为150-300mM，优选约为200-280mM，上述蔗糖浓度的非限制性实施例为约200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，优选为240mM。

在一些方案中，上述稳定剂为海藻糖。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100-300mM的海藻糖，上述海藻糖的浓度优选约为150-300mM，优选约为200-250mM，上述海藻糖浓度的非限制性实施例为约180mM，200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，优选为200mM、220mM或240mM。

在一些方案中，上述稳定剂为盐酸精氨酸。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约30-200mM的盐酸精氨酸，上述盐酸精氨酸的浓度优选约为50-190mM，优选约为100-180mM，优选约为120-170mM，优选约为130-150mM，上述盐酸精氨酸浓度的非限制性实施例为约100mM，110mM，120mM，125mM，130mM，135mM，140mM，145mM，150mM，155mM，160mM，170mM，180mM，190mM，200mM，优选135mM或140mM。

在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与甘露醇的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30-200mM的氯化钠与约30-200mM的甘露醇的组合，优选约40-150mM的氯化钠与约40-180mM的甘露醇的组合，优选约40-120mM的氯化钠与约40-150mM的甘露醇的组合，上述稳定剂的非限制性实施例约为59mM的氯化钠与约135mM的甘露醇的组合，约50mM的氯化钠与约135mM的甘露醇的组合，约101mM的氯化钠与约60mM的甘露醇的组合，约28mM的氯化钠与约190mM的甘露醇的组合。

在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与蔗糖的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30-200mM的氯化钠与约30-200mM的蔗糖的组合，优选约30-150mM的氯化钠与约50-190mM的蔗糖的组合，优选约40-100mM的氯化钠与约60-150mM的蔗糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例约为59mM的氯化钠与约135mM的蔗糖的组合，约28mM的氯化钠与约190mM的蔗糖的组合，约101mM的氯化钠与约60mM的蔗糖的组合。

在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与海藻糖的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30-200mM的氯化钠与约30-200mM的海藻糖的组合，优选约30-150mM的氯化钠与约50-190mM的海藻糖的组合，优选约40-100mM的氯化钠与约60-150mM的海藻糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例约为59mM的氯化钠与约135mM的蔗糖的组合。

在一些方案中，上述稳定剂为盐酸精氨酸与蔗糖的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30-200mM的盐酸精氨酸与约30-200mM的蔗糖的组合，优选约40-150mM的盐酸精氨酸与约40-150mM的蔗糖的组合，优选约40-100mM的盐酸精氨酸与约80-150mM的蔗糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例约为59mM的盐酸精氨酸与约135mM的蔗糖的组合。

在一些实施方式中，其中所述的药物制剂的pH为约5.0～6.5。在一些实施方式中，其中所述的药物制剂的pH为约5.5～6.5。在一些实施方式中，其中所述的药物制剂的pH为约5.0。在一些实施方式中，其中所述的药物制剂的pH为约5.5。在一些实施方式中，其中所述的药物制剂的pH为约6.0。在一些实施方式中，其中所述的药物制剂的pH为约6.5。

在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段浓度约为10-200mg/mL，优选约为20-100mg/mL，更优选约为30-80mg/mL；更优选地，上述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段浓度约为30mg/mL，40mg/mL，50mg/mL，60mg/mL，70mg/mL或80mg/mL，优选约为40mg/mL，50mg/mL或60mg/mL。

在一些实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：HCDR1具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；HCDR2具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；HCDR3具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；LCDR1具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；LCDR2具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；并且LCDR3具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。在一个具体的实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH具有的氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示；和VL具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。在一个具体的实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段包含重链(HC)和轻链(LC)，其中HC具有的氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示；和LC具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。在一些实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段浓度约30mg/mL至约80mg/mL。在一些实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段浓度约40mg/mL至约60mg/mL。在一个具体的实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段的浓度约40mg/mL。在一个具体的实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段的浓度约50mg/mL。在一个具体的实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段的浓度约60mg/mL。

在一些实施方式中，本发明提供的药物制剂还包含表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80之一或其组合。在一些实施方式中，本发明提供的药物制剂包含聚山梨醇酯20。

在一些方案中，以w/v计算，上述表面活性剂浓度约为0.001％-0.1％，优选约为0.01％-0.1％，优选约为0.01％-0.05％；作为非限制性实施例，上述表面活性剂的浓度约为0.02％，0.04％或0.08％，优选0.02％。

在一个具体的实施方式中，本发明提供的药物制剂包含浓度约0.01％至约0.05％聚山梨醇酯20。在一个具体的实施方式中，本发明提供的药物制剂包含浓度约0.02％聚山梨醇酯20。

在一些实施方式中，本发明提供的药物制剂包含：(1)约10～30mM的组氨酸缓冲液；(2)约200mM至约250mM的海藻糖稳定剂；(3)约30mg/mL至约80mg/mL的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；以及(4)约0.01％至约0.05％聚山梨醇酯20；其中所述的抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：HCDR1具有的氨基酸序列如SEQID NO：1所示；HCDR2具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；HCDR3具有的氨基酸序列如SEQID NO：3所示；LCDR1具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；LCDR2具有的氨基酸序列如SEQID NO：5所示；并且LCDR3具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在一些实施方式中，所述的药物制剂包含如下(1)-(5)任一项所示的组分：

(1)(a)约30mg/mL至约80mg/mL抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；(b)约10-25mM组氨酸缓冲液，pH约为5.0-6.5；(c)约100mM至约250mM的海藻糖；以及(d)约0％至约0.1％非离子表面活性剂；

(2)(a)约30mg/mL至约80mg/mL抗PD-L1的抗体或其抗原结合片段；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(c)约100mM至约250mM的海藻糖；(d)约20mM至约200mM的氯化钠；以及(e)约0％至约0.1％的非离子表面活性剂；

(3)(a)约50mg/mL抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(c)约220mM的海藻糖；以及(d)约0.02％的聚山梨酯20；

(4)(a)约60mg/mL抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(c)约240mM的海藻糖；以及(d)约0.02％的聚山梨酯20；

(5)(a)约60mg/mL抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(c)约135mM的海藻糖；(d)约59mM的氯化钠；以及(e)约0.02％的聚山梨酯20。

在一些实施方式中，所述的药物制剂包含：

(1)(a)约50mg/mL抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为6.0；(c)约220mM的海藻糖；以及(d)约0.02％的聚山梨酯20；

(2)(a)约60mg/mL抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为6.0；(c)约240mM的海藻糖；以及(d)约0.02％的聚山梨酯20；或

(3)(a)约60mg/mL抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为6.0；(c)约135mM的海藻糖；(d)约59mM的氯化钠；以及(e)约0.02％的聚山梨酯20；

其中，所述抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在一些方案中，所述药物制剂为液体制剂或冻干制剂。

在一些方案中，所述药物制剂为液体制剂。

在一些方案中，上述液体制剂或冻干制剂于2-8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。

在一些方案中，上述液体制剂或冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。

另一方面，本发明提供了上述任一种药物制剂在制备治疗与PD-L1相关疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病包含乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌和黑素瘤，优选为非小细胞肺癌、黑素瘤和肾癌。

附图说明

图1：人源化抗体与人PD-L1的结合。

图2：人源化抗体与293F细胞上PD-L1的结合。

图3：人源化抗体抑制人PD-L1与293F细胞上PD-1的结合。

图4：人源化抗体的Jurkat荧光素分析。

图5：体内实验检测人源化抗体对肿瘤生长抑制作用。

具体实施方式

定义和说明

本发明的特点在于包含抗PD-L1抗体或其抗原结合部分的稳定的水性液体药物制剂，其与本技术领域公认的制剂相比具有改进的性质。本发明提供的制剂具有高浓度和高稳定性。

应理解本发明不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然可以对以上进行变化。还应理解本申请所用术语仅为了描述具体的实施方式，并不旨在进行限制。除非该内容被另外明确说明，否则本说明书以及所附权利要求中所用的单数形式″一个″、″一种″和″该″包括复数指代。因此，例如，提及″一种多肽″包括了两种或更多种多肽等的组合。

本申请所用的″约″在指代可测量数值(如量、持续时间等)时意在涵盖相对于具体数值+20％或±10％的变化，包括±5％、±1％和±0.1％，因为这些变化适于进行所公开的方法。

除非另外定义，本申请所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本申请公开相似或相同的任何方法和材料都可用于测试本发明的实践中，但本申请描述了优选的材料和方法。在描述并要求本发明的权利时，将使用以下术语。

“治疗活性抗体”或“治疗性抗体”是指可用于治疗目的，即用于治疗受试者中的障碍的抗体。应该指出，尽管治疗性蛋白质可用于治疗目的，但本发明不限于这样的用途，因为所述蛋白质也可以用于体外研究。

术语″药物制剂″或“制剂”是一种制品，其采用的形式使得活性成分的生物活性有效，并且不含对该制剂所施用的受试者具有不可接受的毒性的其它成分。该制剂为无菌的。

术语“液体制剂”是指处于液体状态下的制剂，且不意图指称重悬浮的冻干制剂。本发明的液体制剂在储存时稳定，并且其稳定性不依赖于冻干(或其他状态改变方法，例如喷雾干燥)。

术语“水性液体制剂”是指使用水作为溶剂的液体制剂。在一种实施方式中，水性液体制剂是不需冻干、喷雾干燥和/或冷冻来维持稳定性(例如化学和/或物理稳定性和/或生物活性)的制剂。

术语“赋形剂”是指可以向制剂添加以提供所需特性(例如稠度、提高的稳定性)和/或调节渗透压的试剂。常用赋形剂的实例包括但不限于糖类、多元醇、氨基酸、表面活性剂和聚合物。

本文中，术语″约5.0至约6.5的pH的缓冲液″是指这样的试剂，通过其酸/碱共轭组分的作用使得包含该试剂的溶液能抵抗pH变化。本发明的制剂中使用的缓冲液可具有约5.0至约6.5范围内的pH、或约5.5至约6.5范围内的pH、或约5.5至约6.0范围内的pH。在一些实施方式中，pH为约6.0。

在本文中，将pH控制在该范围内的“缓冲液”实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸、组氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐/磷酸盐、咪唑、醋酸、醋酸盐、枸橼酸盐、其组合和其他有机酸缓冲剂。在一些实施方式中，缓冲液不是蛋白质。在一些实施方式中，该缓冲液为组氨酸。在实施方式中，缓冲液的浓度为约5-100mM，如5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围。在一些实施方式中，缓冲液浓度为约20mM。在一些实施方式中，缓冲液浓度为约30mM。

本文中，″组氨酸缓冲液″为包含组氨酸的缓冲液。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸和组氨酸的盐，如组氨酸盐酸盐、组氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐和组氨酸硫酸盐等。本发明优选使用pH为约5.5-6.0的组氨酸缓冲液。在一些实施方式中，组氨酸缓冲液为：由1-20mM的L-组氨酸和1-20mM的L-组氨酸单盐酸盐制成的组氨酸缓冲剂。在一些实施方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为1∶1到1∶4的组氨酸和组氨酸盐酸盐组成。在一些实施方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为1∶1组氨酸和组氨酸盐酸盐组成。在一些实施方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为1∶3的组氨酸和组氨酸盐酸盐组成。在一些实施方式中，组氨酸制剂为：由4.5mM的L-组氨酸和15.5mM的L-组氨酸单盐酸盐制成的pH为5.5的组氨酸缓冲剂。在一些实施方式中，组氨酸制剂为：由15mM的组氨酸和15mM的组氨酸盐酸盐制成的pH为6.0的组氨酸缓冲液。在一些实施方式中，组氨酸制剂为：由10mM的组氨酸和10mM的组氨酸盐酸盐制成的pH为6.0的组氨酸缓冲液。

当在本文中使用时，术语“表面活性剂”一般包括保护蛋白质例如抗体免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/表面诱导的应力的影响以减少抗体的聚集或使制剂中颗粒物的形成最小化的试剂。示例性的表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、聚乙烯-聚丙烯共聚物、聚乙烯-聚丙烯二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚、例如聚氧乙烯单月桂基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)、十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方式中，该非离子型表面活性剂为聚山梨醇酯20。在一些实施方式中，聚山梨醇酯20的浓度为约0至0.1％(w/v)。在一些实施方式中，聚山梨醇酯20的浓度为0.01％至约0.05％(w/v)。在一些实施方式中，聚山梨醇酯20的浓度为约0.02％(w/v)。

当在本文中使用时，术语“稳定剂”可降低抗体及其他蛋白质聚集。示例性的稳定剂包括但不限于：人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、α-酪蛋白、球蛋白、α-乳白蛋白、LDH、溶菌酶、肌红蛋白、卵清蛋白和RNAaseA。稳定剂还包括氨基酸、糖、多元醇和它们的代谢产物，如：氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、盐酸精氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸(α-丙氨酸、β-丙氨酸)、甜菜碱、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、奥品类(opines)(丙氨奥品、章鱼碱、甘氨奥品(strombine))和三甲胺的N-氧化物(TMAO)。本发明制剂中，稳定剂的浓度可在20-300mM的范围内，如50-300mM或50-250mM。在一些实施方式中，该稳定剂为糖。在一些实施方式中，该稳定剂为海藻糖。在一些实施方式中，海藻糖浓度为约20至300mM。在一些实施方式中，海藻糖浓度为约100至250mM。在一些实施方式中，海藻糖浓度为约200至250mM。在一些实施方式中，海藻糖的浓度约200mM、220mM、240mM或250mM。部分稳定剂，如氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖等也可起到控制渗透压的作用。在一些实施方案中，本发明的制剂中含有这类稳定剂，优选是这类稳定剂与海藻糖的组合，如氯化钠与海藻糖的组合。在一些实施方案中，本发明的稳定剂为氯化钠与海藻糖，其中，制剂中氯化钠的浓度为30-80mM、优选40-70mM，海藻糖的浓度为100-200mM、优选100-150mM。应理解，当使用海藻糖与这类具有控制渗透压功能的稳定剂联用时，海藻糖的浓度可在100-200mM、优选100-150mM的范围内，具有控制渗透压功能的稳定剂的浓度可在30-80mM、优选40-70mM的范围内。在一些实施方案中，本发明的制剂中不含有这类能控制渗透压的稳定剂。

″等渗″是指该制剂具有与人血液基本相同的渗透压。等渗制剂一般具有约250至350mOsm的渗透压。可使用蒸汽压或冰点下降式的渗透压计测量等渗性。

“稳定的”制剂是其中的抗体在制造过程期间和/或储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。即使所含的抗体在经过一定时间储存之后未能保持其100％的化学结构或生物功能，医药制剂也可以是稳定的。在某些情况下，在经过一定时间储存之后，能维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能，也可被认为是“稳定的”。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本技术领域中是可得的，并综述在《肽和蛋白质药物递送》(Peptide and Protein Drug Delivery)247-301，Vincent Lee主编，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991))，和Jones，A.(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90中(二者引入作为参考)。

制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，通过测定其中剩余的天然抗体的百分比(及其它方法)，可以测量其稳定性。除其它方法外，天然抗体的百分比可以通过尺寸排阻色谱法(例如尺寸排阻高效液相色谱法[SEC-HPLC])来测量，“天然的”指未聚集的和未降解的。在一些实施方式中，蛋白质的稳定性按照具有低百分比的降解(例如片段化)和/或聚集蛋白质的溶液中单体蛋白质的百分数来确定。在一种实施方式中，制剂可以在室温、约25-30℃或40℃下稳定储存至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长，最多不超过约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％，或0.1％聚集形式的抗体。

通过测定在离子交换期间在比抗体主馏分(“主要荷电形式”)较为酸性的馏分中迁移的抗体(“酸性形式”)的百分比(及其它方法)，可以测量稳定性，其中稳定性与酸性形式抗体的百分比成反比。除其它方法外，“酸化”抗体的百分比可以通过离子交换色谱法(例如阳离子交换高效液相色谱法[CEX-HPLC])来测量。在一些实施方式中，可接受程度的稳定性意为当制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出的酸性形式的抗体最多不超过约49％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。在测量稳定性之前储存的一定时间可以是至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长。当评估稳定性时，容许储存医药制剂的一定温度可以是约-80℃至约45℃范围内的任何温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约2-8℃、约5℃、约25℃，或约40℃。

如果抗体在颜色和/或澄清度目测检查时或通过UV光散射或通过孔径排阻层析测量时基本上不显示出例如聚集、沉淀和/或变性的迹象，则所述抗体在该药物制剂中“保持其物理稳定性”。聚集是单个分子或复合物共价或非共价缔合以形成聚集体的过程。聚集可以进行到形成可见沉淀物的程度。

制剂的稳定性例如物理稳定性可以通过本技术领域中公知的方法来评估，包括测量样品的表观消光度(吸光度或光密度)。这样的消光测量与制剂的浊度相关。制剂的浊度部分地是溶解在溶液中的蛋白质的固有性质，并且通常通过比浊法来测量，并用比浊法浊度单位(NTU)来量度。

随着例如溶液中一种或多种组分的浓度(例如蛋白质和/或盐浓度)而变化的浊度水平也被称为制剂的“乳浊”或“乳浊外观”。浊度水平可以参照使用已知浊度的悬液产生的标准曲线来计算。用于测定药物组合物的浊度水平的参比标准品可以基于《欧洲药典》标准(《欧洲药典》(European Pharmacopoeia)，第四版，“欧洲药品质量委员会指令”(Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe)(EDQM)，Strasbourg，France)。根据《欧洲药典》标准，澄清溶液被定义为浊度低于或等于按照《欧洲药典》标准具有约3的参比悬液的浊度的溶液。比浊法的浊度测量可以检测在不存在缔合或非理想效应的情况下的瑞利散射，其通常随浓度线性变化。用于评估物理稳定性的其他方法在本技术领域中是公知的。

如果抗体在给定时间点的化学稳定性使得抗体被认为仍保持如下文中所定义的其生物活性，则所述抗体在药物制剂中“保持其化学稳定性”。可以通过例如检测或定量抗体的化学改变的形式来评估化学稳定性。化学改变可以包括尺寸改变(例如剪短)，其可以使用例如孔径排阻层析、SDS-PAGE和/或基质辅助的激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)来评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如作为脱酰胺或氧化的结果而发生)，其可以通过例如离子交换层析来评估。

如果药物制剂中的抗体对于其预期目的来说是生物活性的，则所述抗体在药物制剂中“保持其生物活性”。例如，如果制剂于例如5℃、25℃、45℃等温度下储存一定时间(例如1至12个月)之后，该制剂所含抗PD-L1抗体与PD-L1结合的亲和力为所述储存之前抗体结合亲和力的至少90％、95％或以上，则可认为本发明之制剂是稳定的。结合亲和力也可用例如ELISA或等离子共振技术测定。

在本发明的情形中，在药理学意义上，抗体的“治疗有效量”或“有效量”是指在抗体可以有效治疗的障碍的症状的预防或治疗或减轻方面有效的量。

术语“受试者”或“患者”意图包括哺乳动物生物体。受试者/患者的实例包括人类和非人类哺乳动物，例如非人类灵长动物、狗、奶牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人类动物。在本发明的特定实施方式中，受试者是人类。

抗PD-L1抗体

本文所用的术语“抗体”应被理解为包括完整抗体分子及其抗原结合片段。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指抗体中保持了与人PD-L1或其表位特异性结合能力的一个或多个片段。

本文所用的术语“全长抗体”，指包含四条肽链的免疫球蛋白分子，两条重(H)链(全长时约50-70kDa)和两条轻(L)链(全长时约25kDa)通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分为具有高可变性的互补决定区(CDR)和其间隔以更保守的称为框架区(FR)的区域。每一个VH或VL区由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。

当在本文中使用时，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的各个可变区中存在3个CDR，其对于各个重链和轻链可变区被命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3或LCDR1、LCDR2和LCDR3。这些CDR的准确边界按照不同的系统有不同的定义。

本发明的所述抗体的可变区CDR的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案的任何方案来确定，包括基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883；Al-Lazikani等人，“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology，273，927-948(1997))、基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(1999 NucleicAcids Research，27，209-212)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。本发明抗体的CDR可以由本领域的技术人员根据本领域的任何方案(例如不同的指派系统或组合)确定边界。

本发明所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包括国际公开号为WO2018153320A1中描述的任意一个抗PD-L1抗体，本文将其所公开的全部内容以引入的方式纳入本文。在一种实施方式中，在本发明的方法和组合物中使用的抗体包括来自于JS003的CDR序列。

本文所使用的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当抗原的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或衍生物通常保持其抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或衍生物保持亲代抗体的抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。还预期抗体的抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。

在一些实施方式中，本发明所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：HCDR1具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，HCDR2具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，HCDR3具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，LCDR1具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，LCDR2具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，并且LCDR3具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在一些实施方式中，本发明所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，VL具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

在本文实施例中所用的非限制性、示范性抗体被称为“JS003”，其是与人PD-L1特异性结合的人源化完全抗体，其包含重链和轻链，其中重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：9，轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：10。

在一些实施方式中，克隆30(JS003)和克隆38的重链和轻链的CDR序列如下表所示；进一步优选地，克隆或抗体30的轻链可变区和重链可变区序列分别如WO2018153320A1中的SEQ ID NO：42和44所示；克隆或抗体38的轻链可变区和重链可变区序列分别如WO2018153320A1中的SEQ ID NO：46和48所示。下表中CDR的氨基酸序列边界采用IMGT方案。

LCDR1	SEQ ID NO：1
		LCDR2	SEQ ID NO：2
LCDR3	SEQ ID NO：3
		HCDR1	SEQ ID NO：4
HCDR2	SEQ ID NO：5
		HCDR3	SEQ ID NO：6

医药制剂

本发明所述的制剂是一种包含高浓度抗体且具有高稳定性的液体性制剂。特别地，本发明发现单一海藻糖的添加能明显提高制剂的稳定性。

在一些实施方式中，本发明所述的制剂包含：(1)抗PD-L1的抗体或其抗原结合片段；(2)pH约为5.0-6.5的缓冲液；和(3)稳定剂。通常，本发明制剂的pH为约5.0～6.5。

本发明制剂所含的抗PD-L1抗体为本发明任一实施方案所述的抗PD-L1抗体，优选是含有SEQ ID NO：1-3分别作为LCDR1、LCDR2和LCDR3以及SEQ ID NO：4-6分别作为HCDR1、HCDR2和HCDR3的人源化抗体；更优选是VH的氨基酸序列为SEQ ID NO：7、VL的氨基酸序列为SEQ ID NO：的人源化抗体；进一步优选为重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示、轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的抗体。制剂中抗体或其抗原结合片段的浓度可在30mg/mL至80mg/mL的范围内，优选为40-60mg/mL。

本发明制剂所含的缓冲液可选自醋酸缓冲液、枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液之一或其组合。缓冲液的pH可在5.0-6.5的范围内，如在5.5-6.5的范围内，或在5.5-6.0的范围内。优选的缓冲液含有组氨酸与醋酸或组氨酸盐。

在一些实施方案中，本发明制剂中的缓冲液含有组氨酸与醋酸；任选地或优选地，两者的摩尔比为1∶1到1.5∶1；任选地或优选地，此类缓冲液的pH为5.5±0.3，优选约为5.5；任选地或优选地，这类缓冲液含有15-20mM的组氨酸和12-15mM的醋酸。

在一些实施方案中，本发明制剂中的缓冲液含有组氨酸和组氨酸盐(本发明也称这类缓冲液为组氨酸缓冲液)，优选的组氨酸盐是组氨酸盐酸盐，如组氨酸单盐酸盐。这类缓冲液中，组氨酸与组氨酸盐的摩尔比为1∶1到1∶4。优选地，此类缓冲液含有1-20mM的组氨酸和1-20mM的组氨酸单盐酸。

通常，本发明制剂中缓冲液的浓度约为10～30mM。

本发明制剂中的稳定剂可如前文所述，可以是氯化钠、盐酸精氨酸、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖之一或其组合。制剂中稳定剂的浓度可在50-300mM、如50-250mM的范围内。优选地，本发明制剂中的稳定剂为海藻糖和/或氯化钠。当仅含有氯化钠作为稳定剂时，优选地，制剂中氯化钠的浓度不超过140mM，优选在40-70mM的范围内。当含有氯化钠和海藻糖两者作为稳定剂时，优选地，制剂中氯化钠的浓度在40-70mM的范围内，海藻糖的浓度在100-200mM的范围内。当仅含有海藻糖作为稳定剂时，优选地，制剂中海藻糖的浓度为200～250mM。

本发明所述的制剂中还可包含非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂的例子包括但不限于聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80之一或其组合，优选为聚山梨醇酯20。制剂中表面活性剂的浓度为约0.01％至约0.05％。

在一些实施方式中，本发明所述的制剂包含：(1)约30mg/mL至约80mg/mL的抗PD-L1的本文所述抗体或其抗原结合片段；(2)约10-25mM本文所述的组氨酸缓冲液，pH约为5.0-6.5；(3)约100mM至约250mM的海藻糖；以及(4)约0％至约0.1％的本文所述非离子表面活性剂。

在一些实施方式中，本发明所述的制剂包含：(1)约30mg/mL至约80mg/mL的本文所述抗PD-L1的抗体或其抗原结合片段；(2)约20mM本文所述的组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(3)约100mM至约250mM的海藻糖；(4)约20mM至约200mM的氯化钠；以及(5)约0％至约0.1％的本文所述非离子表面活性剂。

在一些实施方式中，本发明所述的制剂包含：(1)约50mg/mL的抗PD-L1的本文所述抗体或其抗原结合片段；(2)约20mM本文所述的组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(3)约220mM的海藻糖；以及(4)约0.02％的聚山梨酯20。

在一些实施方式中，本发明所述的制剂包含：(1)约60mg/mL的抗PD-L1的本文所述抗体或其抗原结合片段；(2)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(3)约240mM的海藻糖；以及(4)约0.02％的聚山梨酯20。

在一些实施方式中，本发明所述的制剂包含：(1)约60mg/mL的抗PD-L1的本文所述抗体或其抗原结合片段；(2)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(3)约135mM的海藻糖；(4)约59mM的氯化钠；以及(5)约0.02％的聚山梨酯80。

在一些实施方式中，本发明所述的制剂包含：(1)约50mg/mL的抗PD-L1的本文所述抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：HCDR1具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、HCDR2具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、HCDR3具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、LCDR1具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：4、LCDR2具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：5、并且LCDR3具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：6；(2)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(3)约220mM的海藻糖；以及(4)约0.02％的聚山梨酯20。

在一些实施方式中，本发明所述的制剂具有5.5-6.5的pH并且包含：(1)约50mg/mL的抗PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH具有的氨基酸序列如为SEQ ID NO：7；和VL氨基酸序列SEQ ID NO：8；(2)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(3)约220mM的海藻糖；以及(4)约0.02％的聚山梨酯20。

在一些实施方式中，本发明所述的制剂包含：(1)约50mg/mL的抗PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为全长抗体，其中重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：9和轻链的氨基酸序列SEQ ID NO：10；(2)约20mM组氨酸缓冲液，pH约为5.5-6.5；(3)约220mM的精氨酸；以及(4)约0.02％的聚山梨酯20。

医药制剂的治疗用途

本发明所述的药物制剂，其可用于预防或治疗PD-L1介导的疾病或病症，所述的疾病优选为癌症；更优选为表达PD-L1的癌症。示例性的PD-L1介导的癌症包括乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌和黑素瘤，优选为非小细胞肺癌、黑素瘤和肾癌。

本发明所述的药物制剂可用于制备药物，所述药物用于预防或治疗PD-1介导的疾病或病症，所述的疾病优选为癌症；更优选为表达PD-L1的癌症。示例性的PD-L1介导的癌症包括乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌和黑素瘤，优选为非小细胞肺癌、黑素瘤和肾癌。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和材料。

实施例1：抗PD-L1抗体处方缓冲液体系和pH筛选实验

液体型药物制剂中，缓冲液体系和pH密切影响抗体的稳定性，每种具有独特理化性质的抗体都具有最适宜的缓冲液的种类和pH。本实施例旨在筛选一种最佳缓冲液体系和pH，使本发明公开的抗PD-L1抗体具有最佳的稳定性以适宜临床应用。

本实施例以约40mg/mL和约60mg/mL浓度的JS003进行的。使用透析袋进行透析换液使JS003蛋白处于相应的处方中，样品放置在密闭的离心管中进行缓冲液筛选。我们筛选了醋酸钠缓冲液、枸橼酸缓冲液和组氨酸缓冲液，pH从5.0到6.5(如表1所示)。将样品在40℃环境下放置，分别在第0周、第2周和第4周取出进行分析检测。蛋白降解的主要途径是聚集物、裂解产品和带电变体的形成。采用尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)测定天然形式(蛋白单体)与聚集形式JS003所占的百分比，采用阳离子交换色谱法(CEX-HPLC)测定酸性与碱性形式mAb所占的百分比。以试验起始(0W)、放置两周(2W)和放置四周(4W)的SEC-HPLC单体含量和CEX-HPLC主峰含量，拟合直线并计算下降斜率(％/周)考察不同缓冲液体系和pH对JS003抗体稳定性的影响，结果汇总见表2和表3所示。

表1：缓冲液体系和pH筛选实验中的处方信息

注：“-”表示未添加。

表2：缓冲液体系和pH筛选实验中单体含量降解速率

表3：缓冲液体系和pH筛选实验中电荷变异体含量降解速率

由表2和表3所示，CEX-HPLC实验检测中，抗体在制剂pH 5.5～6.5范围内均可保持相对稳定，高温40℃放置4周后，样品单体含量下降速率基本在3％/周以下；SEC-HPLC实验检测中，样品主要电荷的下降速率在6％/周以下。当缓冲体系为组氨酸缓冲液并且pH为6.0(处方编号7和8)时，高温40℃放置4周后样品单体纯度的平均下降速率仅为0.29％/周，约为醋酸钠缓冲液(处方2)的10％。基于这些结果，选择pH值为5.5-6.0的组氨酸缓冲剂做进一步的研究。

实施例2：抗PD-L1抗体稳定剂筛选实验

为了进一步探究不同稳定剂对抗体稳定性的影响，我们选取氯化钠、盐酸精氨酸、甘露醇、山梨醇、蔗糖或海藻糖之一或其组合的制剂进行了比较测试。即将上述不同的稳定剂或其组合分别加入含约60mg/mL JS003的20mM组氨酸缓冲液(组氨酸与组氨酸盐的摩尔比为1∶3或1∶1，pH为5.5或6.0)，具体处方信息如表4所示。各处方制剂分装后放置于40℃条件下，分别在第0周、第2周取出进行分析检测。通过分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测JS003单体含量变化、弱阳离子高效液相色谱法(CEX-HPLC)检测JS003电荷主峰含量。结果如表5所示。

根据稳定性考察结果，不同稳定剂的制剂处方样品在40℃高温条件下放置2周后，抗体均有较强的热稳定性。

综合各项数据分析，在pH6.0的组氨酸缓冲体系条件下，含海藻糖的处方18最为稳定。具体的，仅含一种稳定剂的处方13-18中，高温40℃放置2周后，仅含海藻糖的制剂组(处方编号18)：(1)对于抗体结构的稳定性，抗体单体纯度的下降速率明显最低，低至1.2％/周，约为蔗糖组(处方17)的49％，抗体的单体纯度达97.60％；(2)对如抗体电荷的稳定性，抗体主要电荷的下降速率较低，为10.75％/周，主要电荷达78.5％。在使用两种稳定剂的处方19-27中，含海藻糖和氯化钠的制剂组(处方22)也具有非常优异的稳定性，抗体单体纯度的下降速率约为1.5％/周，约为最高的蔗糖+盐酸精氨酸组(处方23)的51％，抗体主要电荷的下降速率仅为10.05％/周。

表4：稳定剂筛选实验中的处方信息

注：“-”表示未添加。

表5：稳定剂筛选实验结果汇总

/>

实施例3：表面活性剂和辅料筛选实验

液体制剂中添加表面活性剂常用于保护蛋白质例如抗体在储存过程中免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/表面诱导的应力的影响以减少抗体的聚集或使制剂中颗粒物的形成最小化的试剂，其利于抗体理化性质的稳定。在含有20mM组氨酸缓冲液(组氨酸与组氨酸盐的摩尔比为1∶1，pH为6.0)和50mg/ml的JS003的制剂中分别加入不同浓度的稳定剂、(0-0.5％)的聚山梨酯20或聚山梨酯80，40℃放置4周后分析检测。结果如表6所示。

综合分析显示，当稳定剂为海藻糖，表面活性剂为浓度0.02％的聚山梨酯20时，制剂中抗体JS003的稳定性最佳，SEC-HPLC单体含量下降速率最低，低至0.43％/周，CEX-HPLC主峰含量下降速率较低，为7.75％/周。

表6：表面活性剂筛选结果

实施例4：抗PD-L1抗体处方稳定性评价

本实施例对JS003抗体处方(处方编号30)进行了24个月的稳定性评价。该抗PD-L1抗体处方含有20mM组氨酸缓冲液(组氨酸与组氨酸盐的摩尔比为1∶1，pH为6.0)、50mg/ml的JS003抗体、220mM海藻糖和0.02％聚山梨酯20。

评价指标包括：1.外观(目检)；2.可见异物(目检)；3.蛋白含量(紫外分光光度法)；4.尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)测量抗体单体、聚体和片段的含量；5.阳离子交换色谱法(CEX-HPLC)测量抗体主峰、酸性峰和碱性峰含量；6.非还原/还原毛细管凝胶电泳(NR/R-CE-SDS)；7.不溶性微粒(光阻法)；8.ELISA法检测抗体相对结合活性和相对阻断活性。

结果如表7中所示，上述JS003抗体制剂处方在2-8℃条件下保存0-24个月，外观、不溶性微粒、蛋白质含量、纯度(SEC-HPLC、CEX-HPLC、NR/R-CE-SDS)和生物学活性均无显著变化，具有非常好的稳定性。

实施例5：ELISA检测人源化抗体与人PD-L1的结合

96乳酶标板上铺板，PD-L1包被，37摄氏度恒温孵育60分钟。然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，加入含有2％BSA的PBS溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后100μl每孔加入生物素标记的IgG4抗体，37摄氏度孵育30分钟后用洗涤缓冲液冲洗3次，然后分别加入不同稀释倍数的人源化抗体30和38(处方编号：30)，37摄氏度孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗三次后，用洗涤缓冲液以1∶10000倍稀释HPR标记的小鼠抗人IgG(H+L)，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μl TMB底物溶液显色，室温反应30分钟后，以100μl2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。

如图1所示，人源化抗体结合PD-L1的EC₅₀值分别为558pg/mL和837pg/mL。

实施例6：人源化抗体与293F细胞上PD-L1的结合

将表达PD-L1的CHO细胞消化后离心重悬到FACS缓冲液中，按细胞量为～2.5×10⁴，体积为50ul加入到1.5ml EP管中，加入50ul不同浓度的抗体(处方编号：30)稀释液混匀，室温孵育30min；用FACS缓冲液洗涤细胞两次后加入100ul山羊抗人IgG-PE抗体，避光孵育30min；用FACS缓冲液洗涤两次后进行FACS检测。

如图2所示，人源化抗体30和38可以与293F细胞上的PD-L1特异性结合。

实施例7：人源化抗体抑制人PD-L1与293F细胞上PD-1的结合

取人源化的抗体(10ug/ml，处方编号30制得)与生物素标记的人PD-L1(1ug/ml)混合，室温孵育30分钟。然后将混合物与293F PD-1稳转细胞株(1.5×10⁵细胞)在37摄氏度孵育15分钟，以PBS洗脱3次后，加入5μg/ml的SA-APC并在4摄氏度孵育15分钟。以PBS洗脱3次后，通过流式细胞仪检测以验证人源化抗体是否可以抑制人PD-L1与293F细胞表面的PD-1结合。

如图3所示，人源化抗体能特异性抑制人PD-L1与293F细胞表面的PD-1结合。

实施例8：人源化抗体的Jurkat荧光素分析

将表达PD-L1的CHO细胞铺到96孔板，每孔细胞量为5×10⁴，37℃，7％CO₂培养过夜，去除细胞上清，每孔中分别加入40ul抗体30和38(处方编号30制得)的稀释液(起始浓度为60ug/ml，3倍浓度梯度稀释)，加入40ul可以持续表达PD-1和NFAT-荧光素酶报告基因的Jurkat报告细胞，总细胞数为1×10⁵细胞，37℃，7％CO₂培养6小时，加入荧光素酶试剂，酶标仪检测发光值。

如图4所示，人源化抗体30和38能特异性抑制人PD-L1与PD-1结合，促进报告基因的表达。

实施例9：人源化抗体对小鼠肿瘤生长的抑制作用

取36只6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠，右侧腋下注射1×10⁶(50μL)MC38-B7H1结肠癌细胞，第5-7天可触摸到肿瘤形成后，测量小鼠肿瘤的体积。分成3组，每组5只。组1每只腹腔注射100μL KLH；组2腹腔注射150μg/100μL抗体30(处方编号30制得)；组3腹腔注射150μg/100μL抗体38(处方编号30制得)。每周注射2次，连续注射3周；每周测量3次。按照长×宽²/2计算肿瘤体积。

如图5所示，人源化抗体可以明显抑制MC38-B7H1诱导的肿瘤的生长。

序列表

<110> 上海君实生物医药科技股份有限公司

苏州君盟生物医药科技有限公司

<120> 含有抗PD-L1抗体的稳定制剂

<130> 198654

<150> CN 201911053752.3

<151> 2019-10-31

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HCDR1

<400> 1

Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly Tyr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HCDR2

<400> 2

Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HCDR3

<400> 3

Ala Thr Ser Thr Gly Trp Leu Asp Pro Val Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LCDR1

<400> 4

Gln Asn Val Asp Thr Ser

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LCDR2

<400> 5

Ser Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体的重链可变区序列

<400> 7

Gln Gly Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Leu Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Ser Thr Gly Trp Leu Asp Pro Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体的轻链可变区序列

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体30的重链氨基酸序列

<400> 9

Gln Gly Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Leu Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Ser Thr Gly Trp Leu Asp Pro Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗体30的轻链氨基酸序列

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims (3)

1.一种抗PD-L1抗体药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含：

（a）50mg/mL的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；（b）20mM的组氨酸缓冲液，pH为6.0，其中，所述组氨酸缓冲液中组氨酸与组氨酸盐的摩尔比为1:1；（c）220mM的海藻糖；以及（d）0.02 % (w/v)的聚山梨酯20；

其中，所述抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

2.如权利要求1所述的药物制剂在制备治疗与PD-L1相关疾病的药物中的应用，其中，所述疾病为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌或黑素瘤。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病为非小细胞肺癌、黑素瘤或肾癌。