CN116803420A - 靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含有靶向PD‑1和TGFβ的双功能蛋白的药物组合物及其用途。该药物组合物含有靶向PD‑1和TGFβ的双功能蛋白和缓冲液，其中所述靶向PD‑1和TGFβ的双功能蛋白包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。本发明还提供含有所述药物组合物的注射剂以及所述药物组合物和注射剂在制备通过消除、抑制或降低PD‑1和/或TGFβ的活性来治疗癌症的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及治疗性药物组合物领域，具体涉及靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的药物组合物及其用途。
背景技术
免疫检查点(immune checkpoint)是免疫系统中存在的一类抑制性信号分子，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受。研究发现，肿瘤细胞能够逃避体内免疫系统而失控增殖的原因之一是利用了免疫检查点的抑制性信号通路，由此抑制了T淋巴细胞活性，使得T淋巴细胞不能有效发挥对肿瘤的杀伤效应。
程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)为CD28超家族成员。PD-1是一种重要的免疫检查点蛋白，目前也是肿瘤免疫治疗的一个重要靶标。PD-1表达于活化的T细胞，B细胞及髓系细胞，其有两个配体，即程序性死亡配体-1(programmed death ligand 1，PD-L1)和程序性死亡配体-2(PD-L2)。PD-L1与T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。PD-1/PD-L1通路抑制剂可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答，因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对肿瘤抑制有重要的意义。
转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)属于调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。TGF-β通过异源四聚体受体复合物传递信号，这个受体复合物是由两个I型和两个II型的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体组成。
转化生长因子-β(TGFβ)是一种多效性细胞因子，其具有免疫调控性质，例如炎性和过敏性免疫应答的限制和终止。TGFβ与炎性、恶性、感染性和自体免疫疾病以及骨质疏松症和纤维化包括肝硬化和系统性硬化症具有一定联系。具体来说，肿瘤中持续高水平的TGFβ与免疫耐受、血管发生、转移和肿瘤细胞外基质沉积的增加相关，所有这些都可能驱动癌症发展和对疗法的抗性。
在免疫微环境中，通过靶向PD-1的抗体阻断PD-1/PD-L1通路，用于阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答，更有效地提高抑制肿瘤发生和发展的效果。
尽管目前已有抗体/TGF-β受体融合蛋白公开，但尚未有包含该种融合蛋白的稳定组合物体系公开，该类蛋白在运输和长期储存过程中保持成分和活性稳定的需求仍有待满足。
发明内容
本发明提供的药物组合物是一种靶向PD-1以及TGFβ的双功能蛋白的高稳定性药物组合物。特别地，本发明通过选择适当的缓冲体系和pH，优化稳定剂和表面活性剂，并进行了该抗体组合物与野生型新冠病毒及其突变株的受体结合域蛋白的结合解离活性、结合活性、细胞活性研究，并对各处方体系的应力稳定性进行了考察，开发得到的高浓度抗体制剂长期稳定，无聚集。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，包含缓冲液和靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白，其中靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含：
(1)抗PD-1抗体的抗原结合片段；
(2)免疫球蛋白Fc结构域；和
(3)TGF-βRⅡ胞外结构域(ECD)；
其中所述抗PD-1抗体的抗原结合片段包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其中所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的浓度为约0.1-250mg/mL，或1～200mg/mL，优选为约0.2-150mg/mL，或2～100mg/mL，更优选为约5～50mg/mL。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其中该药物组合物的pH为约4.0～7.5，优选为约4.3～6.0、4.5-5.7、4.7～5.5或4.8～5.4，更优选为约4.7～5.3或4.9～5.2。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其中该药物组合物的渗透压在250～350mOsm/kg的范围内，优选在260～320mOsm/kg的范围内，更优选在290～310mOsm/kg的范围内。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其中所述缓冲液选自醋酸缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和磷酸盐缓冲液中的一种或多种；优选地，所述缓冲液为醋酸缓冲液；优选地，所述缓冲液的浓度为约5～50mM；更优选地，所述缓冲液的浓度为约10～30mM；优选地，所述缓冲液的pH为约4.0～7.5，优选为约4.3～6.0、4.5-5.7、4.7～5.5或4.8～5.4，更优选为约4.7～5.3或4.9～5.2。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括稳定剂，所述稳定剂选自氯化钠、盐酸精氨酸、甘露醇、蔗糖和海藻糖中的任意一种或多种；优选地，所述稳定剂的浓度为约10～300mM，优选为约20～295mM、50～290mM、80～285mM或120～280mM，更优选为约20-280mM或120～250mM。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其中所述稳定剂选自以下(1)至(8)中的任一项：
(1)氯化钠，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约120～160mM；
(2)盐酸精氨酸，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约120～160mM；
(3)甘露醇，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约200～250mM；
(4)蔗糖，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约200～250mM；
(5)海藻糖，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约200～250mM；
(6)氯化钠与甘露醇的组合，其中氯化钠的浓度为约20～80mM，甘露醇的浓度为约100～180mM，优选地，其中氯化钠的浓度为约30～70mM，甘露醇的浓度为约120～160mM；
(7)氯化钠与蔗糖的组合，其中氯化钠的浓度为约20～80mM，蔗糖的浓度为约100～180mM，优选地，其中氯化钠的浓度为约30～70mM，蔗糖的浓度为约120～160mM；
(8)氯化钠与海藻糖的组合，其中氯化钠的浓度为约20～80mM，海藻糖的浓度为约100～180mM，优选地，其中氯化钠的浓度为约30～70mM，海藻糖的浓度为约120～160mM。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种；优选地，以w/v计算，所述表面活性剂浓度为约0.01％～0.1％，更优选地，所述表面活性剂浓度为约0.01％～0.08％，更优选地，所述表面活性剂的浓度为约0.01％～0.04％。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其中，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其中，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链，氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的TGFβRⅡ胞外结构域(ECD)，所述重链氨基酸与TGFβRⅡ胞外结构域(ECD)氨基酸以(GGGGS)4G肽段相连，形成双功能蛋白的第一亚基。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其分别包含如下述(1)～(26)中任一项所示的组分：
(1)(a)约2～100mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约5.0～7.5；(c)约20～80mM的氯化钠；(d)约100～180mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(2)(a)约2～100mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM组氨酸缓冲液，pH为约5.0～7.5；(c)约20～80mM的氯化钠；(d)约100～180mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(3)(a)约2～100mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM枸橼酸缓冲液，pH为约5.0～7.5；(c)约20～80mM的氯化钠；(d)约100～180mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(4)(a)约2～100mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM磷酸盐缓冲液，pH为约5.0～7.5；(c)约20～80mM的氯化钠；(d)约100～180mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(5)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约120～160mM的氯化钠；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(6)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约120～160mM的盐酸精氨酸；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(7)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约200～250mM的甘露醇；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(8)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约200～250mM的蔗糖；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(9)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约200～250mM的海藻糖；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(10)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.7～5.3；(c)约30～70mM的氯化钠；(d)约120～160mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(11)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约30～70mM的氯化钠；(d)约120～160mM的蔗糖；以及(e)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(12)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约30～70mM的氯化钠；(d)约120～160mM的海藻糖；以及(e)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(13)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约30～70mM的氯化钠；(d)约120～160mM的海藻糖；以及(e)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯20；或
(14)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约135mM的氯化钠；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(15)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约135mM的盐酸精氨酸；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(16)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约240mM的甘露醇；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(17)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约220mM的蔗糖；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(18)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约220mM的海藻糖；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(19)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的甘露醇；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(20)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的蔗糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(21)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(22)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(23)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(24)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(25)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(26)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20；或
(27)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的甘露醇；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(28)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的蔗糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(29)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(30)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(31)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(32)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(33)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(34)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20；或
(35)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(36)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(37)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(38)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(39)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(40)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20；或
(41)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(42)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(43)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(44)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(45)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(46)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20；或
(47)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(48)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(49)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(50)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(51)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(52)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20。
在另一个方面，本发明提供如前文任一项所述的药物组合物的冻干制剂。
在另一个方面，本发明提供由前文所述的冻干制剂复溶获得的复溶制剂。
在另一个方面，本发明提供一种液体制剂，其特征在于，所述液体制剂含有如前文任一项所述的药物组合物，或含有葡萄糖溶液或氯化钠溶液以及如前文所述的制剂；优选地，所述氯化钠溶液浓度为约0.85～0.9％(w/v)，所述葡萄糖溶液浓度为约5～25％(w/v)；优选地，所述液体制剂中，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的浓度为约0.1～50mg/mL，更优选为约0.2～20mg/mL；优选地，所述液体制剂的pH为约5.0～7.0；优选地，所述液体制剂是注射剂。
在另一个方面，本发明提供如前文任一项所述的药物组合物、冻干制剂或液体制剂在制备通过消除、抑制或降低PD-1和/或TGFβ的活性来治疗疾病或病症的药物中的用途；优选地，所述疾病或病症选自癌症、感染性疾病或炎症性疾病；更优选地，所述疾病为癌症。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物和液体制剂，所述药物组合物或液体制剂经静脉注射或皮下注射施用。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物和液体制剂，所述药物组合物或液体制剂于呼吸道或粘膜施用。
在一些实施方式中，如前文所述的液体制剂或冻干制剂于2～8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。
在一些实施方式中，上述液体制剂或冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。
具体实施方式
定义和说明
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。应理解本发明不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然可以对以上进行变化。还应理解本申请所用术语仅为了描述具体的实施方式，并不旨在进行限制。本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书诸如此类，以及其中所引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，在此其全文通过引用并入。如果所并入的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术诸如此类，则以本申请为准。
除非该内容被另外明确说明，否则本说明书以及所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种多肽”包括了两种或更多种多肽等的组合。
术语“药物组合物”或“制剂”表示含有一种或多种本文所述抗体与其他组分的混合物，所述其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“液体制剂”是指处于液体状态下的制剂，且不意图指称重悬浮的冻干制剂。本发明的液体制剂在储存时稳定，并且其稳定性不依赖于冻干(或其他状态改变方法，例如喷雾干燥)。
术语“水性液体制剂”是指使用水作为溶剂的液体制剂。在一些实施方式中，水性液体制剂是不需冻干、喷雾干燥和/或冷冻来维持稳定性(例如化学和/或物理稳定性和/或生物活性)的制剂。
术语“赋形剂”是指可以向制剂添加以提供所需特性(例如稠度、提高的稳定性)和/或调节渗透压的试剂。常用赋形剂的实例包括但不限于糖类、多元醇、氨基酸、表面活性剂和聚合物。
本申请所用的“约”在指代可测量数值(如量、持续时间等)时意在涵盖相对于具体数值±20％或±10％的变化，包括±5％、±2％、±1％和±0.1％，因为这些变化适于进行所公开的方法。
术语“缓冲液pH为约5.0～7.0”是指这样的试剂，通过其酸/碱共轭组分的作用使得包含该试剂的溶液能抵抗pH变化。本发明的制剂中使用的缓冲液可具有约5.0至约7.0范围内的pH、或约5.0至约6.5范围内的pH、或约5.5至约6.5范围内的pH、或约5.0至约6.0范围内的pH。
在本文中，将pH控制在该范围内的“缓冲液”实例包括醋酸、醋酸盐(例如醋酸钠)、琥珀酸、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸、组氨酸、组胺酸盐(例如组氨酸盐酸盐)、甲硫氨酸、柠檬酸(枸橼酸)、柠檬酸盐(枸橼酸盐)、磷酸盐、柠檬酸盐/磷酸盐、咪唑、其组合和其他有机酸缓冲剂。
术语“稳定剂”表示药学上可接受的赋形剂，其在制造，储存和应用过程中保护活性药物成分和/或制剂免受化学和/或物理降解。稳定剂包括但不限于如以下定义的糖，氨基酸，盐，多元醇和他们的代谢产物，例如氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、精氨酸或其盐(如盐酸精氨酸)、甘氨酸、丙氨酸(α-丙氨酸、β-丙氨酸)、甜菜碱、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、奥品类(opines)、丙氨奥品、章鱼碱、甘氨奥品(strombine)和三甲胺的N-氧化物(TMAO)、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(BSA)、α-酪蛋白、球蛋白、α-乳白蛋白、LDH、溶菌酶、肌红蛋白、卵清蛋白和RNAase A。部分稳定剂，如氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖等也可起到控制渗透压的作用。在本发明中具体地使用的稳定剂选自多元醇、氨基酸、盐、糖中的一种或一种以上。优选的盐为氯化钠，优选的糖为蔗糖和海藻糖，优选的多元醇为山梨醇和甘露醇。优选的氨基酸为精氨酸、甘氨酸、脯氨酸，氨基酸可以以其D-和/或L-型存在，但典型是L-型，氨基酸可以任何合适的盐存在，例如盐酸盐，如盐酸精氨酸。优选的稳定剂为氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、盐酸精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、氯化钠-山梨醇、氯化钠-甘露醇、氯化钠-蔗糖、氯化钠-海藻糖、盐酸精氨酸-甘露醇、盐酸精氨酸-蔗糖。
术语“表面活性剂”一般包括保护蛋白质例如抗体免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/表面诱导的应力的影响以减少抗体的聚集或使制剂中颗粒物的形成最小化的试剂。示例性的表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、聚乙烯-聚丙烯共聚物、聚乙烯-聚丙烯二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚、例如聚氧乙烯单月桂基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)、十二烷基硫酸钠(SDS)。本文中，如无特别说明，术语“聚山梨醇酯20的浓度”和“聚山梨醇酯80的浓度”均是指质量体积浓度(w/v)，如“约0.04％聚山梨醇酯80”中“0.04％”即指“100mL液体中含有0.04g的聚山梨醇酯80”。
本文所用的术语“粘度”可以是“运动粘度”或“绝对粘度”。“运动粘度”是对流体在重力影响下所产生的抵抗性流动的一种测量指标。“绝对粘度”，有时称为动态粘度或简单粘度，是运动粘度与流体密度的乘积(绝对粘度＝运动粘度X密度)。运动粘度的量纲是L2/T，其中L是长度，T是时间。通常，运动粘度以厘沲(cSt)表示。运动粘度的国际单位制单位是mm2/s，即lcSt。绝对粘度以厘泊(cP)单位表示。绝对粘度的国际单位制单位是毫帕斯卡·秒(mPa·s)，其中1cP＝lmPa·s。
术语“等渗”是指该制剂具有与人血液基本相同的渗透压。等渗制剂一般具有约250至350mOsm/kg的渗透压。可使用蒸汽压或冰点下降式的渗透压计测量等渗性。
术语“稳定的”制剂是其中的抗体在制造过程期间和/或储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。即使所含的抗体在经过一定时间储存之后未能保持其100％的化学结构或生物功能，医药制剂也可以是稳定的。在某些情况下，在经过一定时间储存之后，能维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能，也可被认为是“稳定的”。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本技术领域中是可得的，并综述在《肽和蛋白质药物递送》(Peptide and Protein Drug Delivery)247～301，Vincent Lee主编，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)，和Jones，A.(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29～90中(二者引入作为参考)。
制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，通过测定其中剩余的天然抗体的百分比(及其它方法)，可以测量其稳定性。除其它方法外，天然抗体的百分比可以通过尺寸排阻色谱法(例如尺寸排阻高效液相色谱法[SEC-HPLC])来测量，“天然的”指未聚集的和未降解的。在一些实施方式中，蛋白质的稳定性按照具有低百分比的降解(例如片段化)和/或聚集蛋白质的溶液中单体蛋白质的百分数来确定。在一些实施方式中，制剂可以在室温、约25～30℃或40℃下稳定储存至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长，最多不超过约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％，或0.1％聚集形式的抗体。
通过测定在离子交换期间在此抗体主馏分(“主要荷电形式”)较为酸性的馏分中迁移的抗体(“酸性形式”)的百分比(及其它方法)，可以测量稳定性，其中稳定性与酸性形式抗体的百分比成反比。除其它方法外，“酸化”抗体的百分比可以通过离子交换色谱法(例如阳离子交换高效液相色谱法[CEX-HPLC])来测量。在一些实施方式中，可接受程度的稳定性意为当制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出的酸性形式的抗体最多不超过约49％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。在测量稳定性之前储存的一定时间可以是至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长。当评估稳定性时，容许储存医药制剂的一定温度可以是约-80℃至约45℃范围内的任何温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约2～8℃、约5℃、约25℃，或约40℃。
如果抗体在颜色和/或澄清度目测检查时或通过UV光散射或通过孔径排阻层析测量时基本上不显示出例如聚集、沉淀和/或变性的迹象，则所述抗体在该药物组合物中“保持其物理稳定性”。聚集是单个分子或复合物共价或非共价缔合以形成聚集体的过程。聚集可以进行到形成可见沉淀物的程度。
制剂的稳定性例如物理稳定性可以通过本技术领域中公知的方法来评估，包括测量样品的表观消光度(吸光度或光密度)。这样的消光测量与制剂的浊度相关。制剂的浊度部分地是溶解在溶液中的蛋白质的固有性质，并且通常通过比浊法来测量，并用比浊法浊度单位(NTU)来量度。
随着例如溶液中一种或多种组分的浓度(例如蛋白质和/或盐浓度)而变化的浊度水平也被称为制剂的“乳浊”或“乳浊外观”。浊度水平可以参照使用已知浊度的悬液产生的标准曲线来计算。用于测定药物组合物的浊度水平的参比标准品可以基于《欧洲药典》标准(《欧洲药典》(European Pharmacopoeia)，第四版，“欧洲药品质量委员会指令”(Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe)(EDQM)，Strasbourg，France)。根据《欧洲药典》标准，澄清溶液被定义为浊度低于或等于按照《欧洲药典》标准具有约3的参比悬液的浊度的溶液。比浊法的浊度测量可以检测在不存在缔合或非理想效应的情况下的瑞利散射，其通常随浓度线性变化。用于评估物理稳定性的其他方法在本技术领域中是公知的。
如果抗体在给定时间点的化学稳定性使得抗体被认为仍保持如下文中所定义的其生物活性，则所述抗体在药物组合物中“保持其化学稳定性”。可以通过例如检测或定量抗体的化学改变的形式来评估化学稳定性。化学改变可以包括尺寸改变(例如剪短)，其可以使用例如孔径排阻层析、SDS-PAGE和/或基质辅助的激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)来评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如作为脱酰胺或氧化的结果而发生)，其可以通过例如离子交换层析来评估。
如果药物组合物中的抗体对于其预期目的来说是生物活性的，则所述抗体在药物组合物中“保持其生物活性”。例如，如果制剂于例如5℃、25℃、45℃等温度下储存一定时间(例如1至12个月)之后，该制剂所含靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白分别与PD-1和TGFβ结合的亲和力为所述储存之前抗体结合亲和力的至少90％、95％或以上，则可认为本发明之制剂是稳定的。结合亲和力也可用例如ELISA或等离子共振技术测定。
在本发明的情形中，在药理学意义上，抗体的“治疗有效量”或“有效量”是指在抗体可以有效治疗的障碍的症状的预防或治疗或减轻方面有效的量。本发明中，药物的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时保护受试者免于疾病发作或促进疾病消退的任何量的药物，所述疾病消退通过疾病症状的严重性的降低，疾病无症状期的频率和持续时间的增加，或由疾病痛苦引起的损伤或失能的预防来证明。药物促进疾病消退的能力可以使用本领域技术人员已知的多种方法来评价，比如在临床试验期间的人受试者中，在预测人类功效的动物模型系统中，或通过在体外测定法中测定所述药剂的活性。药物治疗有效量包括“预防有效量”，即当单独或如与其它治疗药物组合给与处于患病风险的受试者或患病复发的受试者时，抑制疾病的发展或复发的任何量的药物。
术语“受试者”或“患者”意图包括哺乳动物生物体。受试者/患者的实例包括人类和非人类哺乳动物，例如非人灵长动物、狗、奶牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人类动物。在本发明的特定实施方式中，受试者是人类。
术语“施用”、“给与”及“处理”是指采用本领域技术人员已知的各种方法或递送系统中的任意一种将包含治疗剂的组合物引入受试者。靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的给药途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜、脊髓或其他胃肠外给药途径，比如注射或输注。“胃肠外给药”是指除了肠内或局部给药以外的通常通过注射的给药方式，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、损伤内、囊内、框内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜内和胸骨内注射和输注以及经体内电穿孔。
靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白
本文所用的术语“抗体”应被理解为包括完整抗体分子及其抗原结合片段。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指抗体中保持了与人PD-1或其表位特异性结合能力的一个或多个片段。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和单结构域抗体。
术语“分离的抗体”是指结合化合物的纯化状态，且在这种情况下意指该分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。术语“分离(的)”并非意指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本文所述结合化合物的实验或治疗应用的量存在。
术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
术语“鼠源抗体”或“杂交瘤抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的抗人PD-1的单克隆抗体。制备时用人PD-1抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体”是具有第一抗体的可变结构域和第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。通常，可变结构域获自啮齿动物等的抗体(“亲代抗体”)，而恒定结构域序列获自人抗体，使得与亲代啮齿动物抗体相比，所得嵌合抗体在人受试者中诱导不良免疫应答的可能性较低。
术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如小鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体包含基本所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本所有的超变环相当于非人免疫球蛋白的超变环，而所有或基本所有的构架(FR)区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分的人免疫球蛋白恒定区(Fc)。
术语“全长抗体”或“完整抗体分子”指包含四条肽链的免疫球蛋白分子，两条重(H)链(全长时约50～70kDa)和两条轻(L)链(全长时约25kDa)通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分为具有高可变性的互补决定区(CDR)和其间隔以更保守的称为框架区(FR)的区域。每一个VH或VL区由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。
术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的各个可变区中存在3个CDR，其对于各个重链和轻链可变区被命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3或LCDR1、LCDR2和LCDR3。这些CDR的准确边界按照不同的系统有不同的定义。
本发明的所述抗体的可变区CDR的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案的任何方案来确定，包括基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997)基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(1999NucleicAcids Research,27,209-212)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。本发明抗体的CDR可以由本领域的技术人员根据本领域的任何方案(例如不同的指派系统或组合)确定边界。
本文所使用的“抗原结合片段”包括抗体的片段或其衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当抗体的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或其衍生物通常保持亲代抗体抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或其衍生物保持亲代抗体的抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。还预期抗体的抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
本发明所述的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包括申请号为CN202011038252.5中描述的任意一个靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白，本文将其所公开的全部内容以引入的方式纳入本文。在一些实施方式中，在本发明的方法和组合物中使用的抗体的CDR序列包括来自于CN202011038252.5中描述的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白JS-TZO3。
在一些实施方式中，在本发明的方法和组合物中使用的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白中，抗PD-1抗体的抗原结合片段包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。优选地，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白中，抗PD-1抗体的抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。进一步优选地，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白为双功能蛋白JS-TZO3，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链，氨基酸序列如SEQID NO:10所示的轻链，氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的TGFβRⅡ胞外结构域(ECD)，所述重链氨基酸与TGFβRⅡ胞外结构域(ECD)氨基酸以(GGGGS)4G肽段相连，形成双功能蛋白的第一亚基，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链为双功能蛋白JS-TZO3的第二亚基。
SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:12的具体序列如下：
SEQ ID NO:1(HCDR1)
DYEMH
SEQ ID NO:2(HCDR2)
VIESETGGTAYNQKFKG
SEQ ID NO:3(HCDR3)
EGITTVATTYYWYFDV
SEQ ID NO:4(LCDR1)
RSSQSIVHSNGNTYLE
SEQ ID NO:5(LCDR2)
KVSNRFS
SEQ ID NO:6(LCDR3)
FQGSHVPLT
SEQ ID NO:7(PD-1抗体重链可变区)
QGQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPIHGLEWIGVIESETGGT
AYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGITTVATTYYWYFDVWGQGTT
VTVSS
SEQ ID NO:8(PD-1抗体轻链可变区)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:9(PD-1抗体的重链)
QGQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPIHGLEWIGVIESETGGTAYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGITTVATTYYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL
SEQ ID NO:10(PD-1抗体的轻链或双功能蛋白JS-TZO3的第二亚基)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:11(TGF-βRⅡ的胞外结构域(ECD)，TGFRECD)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
SEQ ID NO:12(双功能蛋白JS-TZO3的第一亚基：PD-1抗体的重链+linker+TGFRECD)
QGQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPIHGLEWIGVIESETGGTAYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGITTVATTYYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
在一些实施方式中，在本发明的方法和组合物中使用的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段，优选为人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，在本发明的方法和组合物中使用的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白为人源化抗体或嵌合抗体，且可包括人恒定区。在一些实施方式中，恒定区是选自人IgG1、IgG2、IgG3及IgG4恒定区组成的组；优选地，适用于本发明所述的方法和组合物的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含人IgG1或IgG4同种型的重链恒定区，更优选为人IgG4恒定区。在一些实施方式中，可在本文中所提供的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，如在靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的IgG4重链恒定区的序列引入S228P突变，其用IgG1同种型抗体的相应位置处通常存在的脯氨酸残基替代铰链区中的丝氨酸残基。
医药制剂
本发明所述的药物组合物是一种含有与PD-1和/或TGFβ特异性结合的抗体的高稳定性药物组合物，其包含：(1)缓冲液；(2)靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白。
本发明所述药物组合物中的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白如本申请“靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白”部分任一实施方案所述。
例如，本发明所述药物组合物中的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白中，抗PD-1抗体的抗原结合片段包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。优选地，上述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白中的PD-1抗体部分选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段，优选为人源化抗体或其抗原结合片段。优选地，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白中，抗PD-1抗体的抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。进一步优选地，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含SEQ ID NO:9所示的重链氨基酸序列，和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链氨基酸序列。进一步优选地，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
本发明所述药物组合物中的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的浓度为约0.1-250mg/mL，1～200mg/mL，优选为约0.2-150mg/mL，1～200mg/mL，更优选为约5～50mg/mL；优选地，上述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的浓度约为5mg/mL，10mg/mL，15mg/mL，20mg/mL，25mg/mL，30mg/mL，35mg/mL，40mg/mL，45mg/mL，50mg/mL，55mg/mL，60mg/mL，65mg/mL，70mg/mL，75mg/mL，80mg/mL，85mg/mL，90mg/mL，95mg/mL，100mg/mL，更优选为5mg/mL，10mg/mL，15mg/mL，20mg/mL，25mg/mL，30mg/mL，35mg/mL，40mg/mL，45mg/mL，50mg/mL。
本发明所述药物组合物中的缓冲液选自醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液中的一种或多种；优选地，所述缓冲液为组氨酸缓冲液。优选地，组氨酸缓冲液选自组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液或组氨酸-组氨酸醋酸盐缓冲液，优选组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液。优选地，缓冲液的浓度为约5～50mM，优选为约10～30mM；更优选为约15～25mM。优选地，缓冲液的pH为约4.0～7.5，优选为约4.7～5.3，更优选为约4.9～5.2本文中，缓冲液的pH非限制性实施例为约5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4和7.5，优选为约4.7，4.8，4.9，5.0，5.1或5.2。
因此，本发明的药物组合物可含有：pH约为5.0～7.0的醋酸-醋酸盐缓冲液，其在药物组合物中的浓度约为10～30mM；和约2～100mg/mL的前文任一实施方案所述的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白。优选地，所述人源化抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
因此，本发明的药物组合物可含有：pH约为5.0～7.0的醋酸-醋酸盐缓冲液，其在药物组合物中的浓度约为10～30mM；约2～100mg/mL的前文任一实施方案所述的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白，尤其是本文所述的双功能蛋白JS-TZO3；以及约100～300mM的稳定剂，优选地，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、甘氨酸和海藻糖中的一种或多种。优选地，所述稳定剂为蔗糖或海藻糖。优选地，上述稳定剂为浓度约120～280mM的蔗糖或海藻糖。
在一些实施方式中，上述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种。优选地，以w/v计算，上述表面活性剂浓度为约0.001％～0.1％，优选为约0.01％～0.1％，更优选为约0.01％～0.08％，更优选为约0.01％～0.04％，更优选为约0.01％～0.02％，最优选为约0.02％。
因此，本发明的药物组合物可含有：pH约为5.0～7.0的醋酸-醋酸盐缓冲液，其在药物组合物中的浓度约为10～30mM；约2～100mg/mL的前文任一实施方案所述的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；和以w/v计，约0.01％～0.04％的聚山梨醇酯80。
本发明的药物组合物为液体制剂或冻干制剂。
本发明的药物组合物的渗透压在250～350mOsm/kg，优选在260～320mOsm/kg的范围内，更优选在290～310mOsm/kg的范围内。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含组氨酸缓冲液，所述组氨酸缓冲液为组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液。在一些实施方式中，上述组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液由组氨酸和组氨酸盐酸盐制成，优选L-组氨酸和L-组氨酸单盐酸盐。在一些实施方式中，组氨酸缓冲液由1～30mM的L-组氨酸和1～30mM的L-组氨酸单盐酸盐制成。在一些实施方式中，组氨酸缓冲液由摩尔比为1:1到1:4的组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些实施方式中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:1组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些实施方式中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:3的组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些实施方式中，组氨酸制剂为：由约4.5mM的L-组氨酸和约15.5mM的L-组氨酸单盐酸盐制成的pH为约5.5的组氨酸缓冲剂。在一些实施方式中，组氨酸制剂为：由约7.5mM的L-组氨酸和约22.5mM的L-组氨酸单盐酸盐制成的pH为约5.5的组氨酸缓冲剂。在一些实施方式中，组氨酸制剂为：由约10mM的组氨酸和约10mM的组氨酸盐酸盐制成的pH为约6.0的组氨酸缓冲液。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含醋酸缓冲液，优选地，所述醋酸缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钾缓冲液，优选醋酸-醋酸钠缓冲液。在一些实施方式中，醋酸缓冲液由1～30mM的醋酸和1～30mM的醋酸钠制成。在一些实施方式中，醋酸缓冲液由摩尔比为约1:2.1的醋酸和醋酸钠制成。在一些实施方式中，醋酸缓冲液由摩尔比为约1:3.8的醋酸和醋酸钠制成。在一些实施方式中，醋酸缓冲液由摩尔比为约1:5.7的醋酸和醋酸钠制成。在一些实施方式中，醋酸缓冲液为：由约6.5mM的醋酸和约13.5mM的醋酸钠制成的pH为约5.0的醋酸缓冲液。在一些实施方式中，醋酸缓冲液为：由约4.3mM的醋酸和约16.2mM的醋酸钠制成的pH为约5.1的醋酸缓冲液。在一些实施方式中，醋酸缓冲液为：由约3mM的醋酸和约17mM的醋酸钠制成的pH为约5.5的醋酸缓冲液。在一些实施方式中，醋酸缓冲液为：由约11mM的醋酸和约9mM的醋酸钠制成的pH为约4.7的醋酸缓冲液。在一些实施方式中，醋酸缓冲液为：由约5.7mM的醋酸和约14.3mM的醋酸钠制成的pH为约5.3的醋酸缓冲液。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含柠檬酸缓冲液，优选地，所述柠檬酸缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在一些实施方式中，柠檬酸缓冲液由1～30mM的柠檬酸和1～30mM的柠檬酸钠制成。在一些实施方式中，柠檬酸缓冲液由摩尔比为约1:1到1:4的柠檬酸和柠檬酸钠制成。在一些实施方式中，柠檬酸缓冲液为：由约5.0mM的柠檬酸和约15.0mM的柠檬酸钠制成的pH为约6.5的柠檬酸缓冲液。在一些实施方式中，柠檬酸缓冲液为：由约10mM的柠檬酸和约10mM的柠檬酸钠制成的pH为约6.0的柠檬酸缓冲液。
在一些方案中，上述缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选地，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。在一些方案中，磷酸盐缓冲液由约1～20mM的磷酸氢二钠和约1～20mM的磷酸二氢钠制成。在一些方案中，磷酸盐缓冲液由摩尔比为约1:1到1:4的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠制成。在一些方案中，磷酸盐缓冲液为：由约13mM的磷酸氢二钠和约7mM的磷酸二氢钠制成的pH为约7.0的磷酸盐缓冲液。在一些方案中，磷酸盐缓冲液为：由约16.5mM的磷酸氢二钠和约3.5mM的磷酸二氢钠制成的pH为约7.5的磷酸盐缓冲液。在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含缓冲液，缓冲液的浓度为约5～100mM，优选为约10～50mM，优选为约10～30mM；优选为约15～25mM；上述缓冲液浓度非限制性实施例为约15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM，45mM或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约15mM、20mM或25mM。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂的浓度为约10～300mM，优选为约20～295mM、50～290mM、80～285mM或120～280mM，更优选为约20-280mM或120～250mM；上述稳定剂浓度非限制性实施例为约120mM，125mM，130mM，135mM，140mM，145mM，150mM，160mM，170mM，180mM，185mM，190mM，195mM，200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约130mM，135mM，140mM，190mM，200mM，210mM，220mM，230mM，240mM或250mM。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂为海藻糖。在一些实施方式中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的海藻糖，优选为约120～280mM，更优选为约200～250mM；上述海藻糖浓度的非限制性实施例为约180mM，200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM或280mM，优选为约210mM，220mM或230mM。优选地，上述药物组合物还包括(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约0.02％的聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂为蔗糖。在一些实施方式中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的蔗糖，上述蔗糖的浓度优选为约120～280mM，更优选为200～250mM；上述蔗糖浓度的非限制性实施例为约180mM，200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM或280mM，优选为约210mM，220mM或230mM。优选地，上述药物组合物还包括(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约0.02％的聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂为精氨酸或精氨酸盐；优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。在一些实施方式中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的精氨酸或精氨酸盐，优选为约120～280mM，更优选为约120～160mM；上述精氨酸或精氨酸盐浓度的非限制性实施例为约110mM，120mM，125mM，130mM，135mM，140mM，145mM，150mM，155mM，160mM，170mM和180mM优选约135mM，140mM，145mM，150mM或155mM。优选地，上述药物组合物还包括(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约0.02％的聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂为氯化钠。在一些实施方式中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的氯化钠，优选为约120～280mM，更优选为120～160mM，上述氯化钠浓度的非限制性实施例为约110mM，120mM，125mM，130mM，135mM，140mM，145mM，150mM，155mM，160mM，170mM和180mM，优选约130mM，135mM，140mM，145mM或150mM。优选地，上述药物组合物还包括(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约0.02％的聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂为甘露醇。在一些实施方式中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的甘露醇，优选为约120～280mM，优选为约200～250mM；上述甘露醇浓度的非限制性实施例为约205mM，210mM，215mM，220mM，225mM，230mM，235mM，240mM，245mM，250mM，260mM，270mM，280mM，优选约230mM，235mM，240mM，245mM或250mM。优选地，上述药物组合物还包括(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约0.02％的聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂为山梨醇。在一些实施方式中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的山梨醇，优选为约200～300mM，优选为约220～250m；上述甘露醇浓度的非限制性实施例为约205mM，210mM，215mM，220mM，225mM，230mM，235mM，240mM，245mM，250mM，255mM，260mM，265mM，270mM，275mM，优选约230mM，235mM，240mM，245mM或250mM。优选地，上述药物组合物还包括(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约0.02％的聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂为氯化钠与甘露醇的组合。在一些实施方式中，上述稳定剂为约20～200mM的氯化钠与约20～200mM的甘露醇的组合，优选约20～80mM的氯化钠与约100～180mM的甘露醇的组合，优选约30～70mM的氯化钠与约120～160mM的甘露醇的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mM的氯化钠与约130mM，132mM，135mM，138mM，140mM，142mM，145mM，148mM或150mM的甘露醇的组合。优选地，上述药物组合物还包括(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约0.02％的聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂为氯化钠与蔗糖的组合。在一些实施方式中，上述稳定剂为约20～200mM的氯化钠与约20～200mM的蔗糖的组合，优选约20～80mM的氯化钠与约100～180mM的蔗糖的组合，优选约30～70mM的氯化钠与约120～160mM的蔗糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mM的氯化钠与约130mM，132mM，135mM，138mM，140mM，142mM，145mM，148mM，或150mM的蔗糖的组合。优选地，上述药物组合物还包括(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约0.02％的聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，如前文所述的药物组合物，其包含稳定剂，所述稳定剂为氯化钠与海藻糖的组合。在一些实施方式中，上述稳定剂为约20～200mM的氯化钠与约20～200mM的海藻糖的组合，优选约20～80mM的氯化钠与约100～180mM的海藻糖的组合，优选约30～70mM的氯化钠与约120～160mM的海藻糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mM的氯化钠与约130mM，132mM，135mM，138mM，140mM，142mM，145mM，148mM或150mM的海藻糖的组合。优选地，上述药物组合物还包括(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约0.02％的聚山梨醇酯80。
医药用途和方法
本发明还提供了本文任一实施方式中所述的药物组合物或注射剂在制备通过消除、抑制或降低PD-1和/或TGFβ活性来治疗疾病或病症的药物中的用途。
本发明还提供了用在通过消除、抑制或降低PD-1和/或TGFβ活性来治疗疾病或病症的方法中的本文任一实施方式中所述的药物组合物或注射剂。
本发明还提供了一种通过消除、抑制或降低PD-1和/或TGFβ活性来治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文任一实施方式中所述的药物组合物或注射剂。
在一些实施方式中，上述疾病或病症选自癌症、感染性疾病或炎症性疾病。优选地，所述上述疾病或病症为癌症。
实施例
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。本文已经详细描述了本发明，其中也公开了其具体实施方式。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下，针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和材料。
本发明采用下述缩略词：
hr表示小时；
D表示日，例如表15中的3D表示震摇3日；
W表示周；
M表示月；
C表示冻融循环的次数，例如表15中的3C表示3个冻融循环；
FT表示冻融循环；
RT表示室温；
T0表示处方样品经放样处理前的起始测试；
MFI表示微流成像分析。
实施例1：缓冲液体系和稳定剂筛选初步实验
液体型药物组合物中，缓冲液体系和pH密切影响抗体的稳定性，每种具有独特理化性质的抗体都具有最适宜的缓冲液的种类和pH。本实施例旨在初步筛选出最佳缓冲液体系和稳定剂，使本发明公开的靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白具有最佳的稳定性以适宜临床应用。
1.1实验步骤
本实施例以双功能蛋白JS-TZO3进行。先将样品(批号：20191110)使用MilliporePellicon388cm2膜进行UF/DF换液至处方FS1-8(20mM磷酸缓冲液)，其他蛋白量平均分配，每个处方3.5mL，浓度40.5mg/mL，透析至相应缓冲液(如表1)，每个处方透析三次，每次透析体积1L，每次透析时间大于4小时。最终浓度调至约40mg/mL，根据体积添加终浓度为0.02％的吐温80，在超净台无菌灌装到2R西林瓶0.6mL/瓶，进行稳定性放样和检测。
表1：缓冲液体系和稳定剂初步筛选实验方案
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1.2实验结果
1.2.1外观和浓度结果
根据表2中的结果，经加速条件或长期条件，FS1-1和FS1-3两个处方蛋白含量均未出现显著变化，其他处方由于外观出现沉淀终止浓度检测。
根据表3中的结果，所有样品在T0时均未发现明显可见异物，无明显乳光。经加速和长期条件下放置4周，除FS1-1和FS1-3处方无明显异常，其余处方均出现蛋白沉淀终止检测。
表2：第一轮处方筛选—蛋白含量数据
表3：第一轮处方筛选—外观数据
1.2.2SEC-HPLC纯度结果
根据表4中的SEC-HPLC纯度结果，经加速条件下放置4周，处方FS1-1和FS1-3均出现显著的聚体和片段增加；经长期条件放置下放置4周，FS1-1和FS1-3处方均未出现SEC纯度的显著降低，其他处方终止检测(外观异常)。
表4：第一轮处方筛选—SEC-HPLC数据
1.2.3 NR-CE-SDS纯度结果
根据表5中的NR-CE-SDS纯度结果，经加速条件下放置4周处方FS1-1和FS1-3纯度下降，经长期条件放置下放置4周，处方FS1-1和FS1-3未出现显著变化。其它处方因外观异常终止检测。
表5：第一轮处方筛选—NR-CE-SDS结果
1.2.4R-CE-SDS纯度结果
根据表6中的R-CE-SDS纯度结果，经加速条件下放置4周处方FS1-1和FS1-3纯度下降，经长期条件放置下放置4周，处方FS1-1和FS1-3未出现显著变化。其它处方因外观异常终止检测。
表6：第一轮处方筛选—R-CE-SDS结果
1.2.5R-CE-SDS纯度结果
根据表7中的结合活性结果，经加速条件4周，处方FS1-1和FS1-3 TGFβ一端活性下降。长期条件下，处方FS1-1和FS1-3结合活性无明显异常。其它处方终止检测(外观异常)。
表7：第一轮处方筛选—结合活性结果
1.2.6NR-CE-SDS纯度结果
根据表8中的细胞活性结果，经加速条件4周，或长期条件下，处方FS1-1和FS1-3细胞活性均无明显异常。其它处方因外观异常终止检测。
表8：第一轮处方筛选—细胞活性结果
1.3第一轮处方筛选结论
从外观来看，处方FS2-2/4/5/6/7/8外观结果均出现蛋白沉淀；只有处方FS1-1和FS1-3外观无异常，从SEC-HPLC结果来看，处方FS1-3优于FS1-1。
综上所述，FS1-1和FS1-3两个处方较好。因此选择20mM醋酸缓冲液作为缓冲体系进入下一轮筛选实验，考察醋酸缓冲体系下的不同pH范围。
实施例2：第二轮处方筛选——pH及浓度筛选
2.1实验步骤
本实施例以双功能蛋白JS-TZO3进行。将样品(批号：20191201)使用透析袋进行透析换液，每个处方25mL，浓度约20mg/mL，平均分配蛋白量透析至相应缓冲液(如表9)，每个处方透析三次，每次透析体积1L，每次透析时间大于4小时。最终浓度调至目标浓度为20mg/mL、10mg/mL和5mg/mL，根据体积添加终浓度为0.02％的吐温80，在超净台无菌灌装到2R西林瓶0.6mL/瓶，进行稳定性放样和检测。
表9：第二轮处方筛选实验方案
2.2实验结果
2.2.1外观和浓度结果
根据表10中的结果，经加速条件和长期条件下放置4周，所有样品的蛋白含量均未出现显著变化。
根据表11中的结果，经加速条件和长期外观均未出现显著变化。
表10：第二轮处方筛选—蛋白含量数据
表11：第二轮处方筛选—外观数据
2.2.2SEC-HPLC纯度结果
根据表12中的SEC-HPLC纯度结果，在加速40℃条件下放置4周，加速25℃条件以及长期4℃条件，除处方FS1-1-1之外的处方均无明显差异。
表12：高浓度药物组合物处方筛选—SEC-HPLC结果
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2.2.3R-CE-SDS纯度结果
根据表13中的R-CE-SDS纯度结果，经加速条件下放置4周，所有样品均出现纯度下降，主要形成片段，pH越高纯度相对较高；经长期条件下放置4周，均未出现纯度的显著变化。
表13：第二轮处方筛选—R-CE-SDS结果
2.2.4结合活性结果
根据表14中的结合活性结果，经加速条件或长期条件下放置4周，所有样品均未出现结合活性的显著变化。
表14：高浓度药物组合物处方筛选—结合活性结果
2.3第二轮处方筛选结论
从蛋白含量、结合活性和外观来看，所有处方未出现显著差异。从R-CE-SDS纯度、SEC-HPLC纯度结果来看，片段含量和聚体含量的增加与pH有较强的相关性，pH越低(例如4.7)，越容易产生片段和聚集体。此外，聚体含量的增加与蛋白浓度有较强的相关性，蛋白浓度越高，聚体含量的增加速率越快。FS1-3-3-5mg/mL、FS1-3-3-10mg/mL和FS1-2-2-5mg/mL三个处方的稳定性较好。因此，最优的pH范围是5.0～5.3，最优的蛋白浓度约为5mg/mL。
实施例3：第三轮处方筛选——稳定剂和表面活性剂筛选
3.1实验步骤
本实施例以双功能蛋白JS-TZO3进行。将样品(批号：20191220)使用MilliporePellicon30.1m2膜进行UF/DF换液至处方FS2-8，每个处方50mL，浓度约11mg/mL，平均分配蛋白量透析至相应缓冲液(如表15)每个处方透析三次，每次透析体积1L，每次透析时间大于4小时。最终浓度调至目标浓度为5mg/mL，根据体积添加适量吐温80。在超净台无菌灌装到2R西林瓶0.5mL/瓶，进行稳定性放样和检测。
表15：第三轮处方筛选实验方案
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3.2实验结果
3.2.1外观和浓度结果
根据表16中的结果，经加速条件和长期条件下放置4周，所有样品的蛋白含量均未出现显著变化。
根据表17中的结果，所有样品在T0时均未发现明显可见异物，无明显乳光。经加速条件或长期条件下放置8周，FS2-6、FS2-11、FS2-12和FS2-13处方外观出现明显蛋白沉淀，其余处方未见明显变化。
表16：强制降解实验—蛋白含量数据
表17第三轮处方筛选—外观数据
3.2.2SEC纯度结果
根据表18中的SEC纯度结果，所有样品经加速条件4周均出现大量片段，其中处方FS2-2和FS2-14相对较好，经长期条件下放置4周均未出现SEC纯度的显著变化。
表18：第三轮处方筛选—SEC-HPLC结果
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3.2.3 R-CE-SDS纯度结果
根据表19中的R-CE-SDS纯度结果，经加速条件下放置4周，所有样品均出现纯度下降，含糖或醇类和电解质组合的纯度相对较高，处方F2-14表现最好；经长期条件下放置4周，均未出现纯度的显著变化(处方FS2-2 CE重链信号低导致无法直接检测)，处方F2-14表现最好。
表19：第三轮处方筛选—R-CE-SDS结果
3.2.4结合活性结果
根据表20中的结合活性结果，经加速条件下放置4周处方FS2-1/2/4/5/10/11/12在TGFβ一端活性出现明显下降低于活性标准，在长期条件下放置4周，所有样品均未出现结合活性的显著变化。
表20：第三轮处方筛选—结合活性数据
*T0实际检测时间点和2W时间点重合因此未检测。
3.2.5MFI结果
根据表21中的MFI结果，经加速条件或长期条件下放置4周，所有样品≥10μm无明显增长。
表21：第三轮处方筛选—MFI结果
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3.3第三轮处方筛选结论
外观结果显示FS2-11、FS2-12和FS2-13四组外观出现明显蛋白沉淀。结合活性结果显示处方FS2-1/2/4/5/10/11/12在TGFβ一端活性出现明显下降，从加速SEC-HPLC纯度结果来看，含单一电解质氯化钠和糖醇的处方稍高于组合处方。FS2-2 SEC纯度较高，R-CE-SDS重链响应信号较低无法检测，从蛋白含量和R-CE-SDS结果来看，所有处方未出现显著差异。
综上所述，含单一辅料处方(FS2-1/3/4/5)加速条件下聚体含量相对较高，电解质和糖醇类组合处方优于含单一辅料，其他组间差异不大，FS2-2 SEC纯度最高，选择候选处方FS2-2、FS2-6和FS2-8开展应力稳定性考察。
实施例4：应力稳定性考察
4.1实验步骤
选取FS2-2、FS2-6和FS2-8两个处方进行应力条件下稳定性，方案如表22。
表22：应力稳定性方案
4.2考察结果
表23应力稳定性考察数据汇总
4.3应力稳定性考察结论
经过应力稳定性考察冻融和振摇条件下，SEC-HPLC、外观和MFI无显著变化，搅拌条件下外观三个处方外观均出现蛋白浑浊情况，FS2-2较优FS2-8次之。
实施例5：渗透压考察
5.1实验步骤
选取FS2-8处方进行应力条件下稳定性，方案如表24。
表24：渗透压方案
5.2考察结果
表25应力稳定性考察数据汇总(单位：mOsm/kg)
5.3渗透压考察结论
无论是在长期和加速条件下，处方FS2-8的药物组合物均能较好地保持稳定的渗透压水平。
Claims (16)
1.一种药物组合物，包含缓冲液和靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白，其中靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含：
(1)抗PD-1抗体的抗原结合片段；
(2)免疫球蛋白Fc结构域；和
(3)TGF-βRⅡ胞外结构域(ECD)；
其中所述抗PD-1抗体的抗原结合片段包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的浓度为约0.1-250mg/mL，或1～200mg/mL，优选为约0.2-150mg/mL，或2～100mg/mL，更优选为约5～50mg/mL。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中该药物组合物的pH为约4.0～7.5，优选为约4.3～6.0、4.5-5.7、4.7～5.5或4.8～5.4，更优选为约4.7～5.3或4.9～5.2。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其中该药物组合物的渗透压在250～350mOsm/kg的范围内；优选在260～320mOsm/kg的范围内，更优选在290～310mOsm/kg的范围内。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液选自醋酸缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和磷酸盐缓冲液中的一种或多种；优选地，所述缓冲液为醋酸缓冲液；优选地，所述缓冲液的浓度为约5～50mM；更优选地，所述缓冲液的浓度为约10～30mM；优选地，所述缓冲液的pH为约4.0～7.5，优选为约4.3～6.0、4.5-5.7、4.7～5.5或4.8～5.4，更优选为约4.7～5.3或4.9～5.2。
6.如权利要求1-5任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括稳定剂，所述稳定剂为氯化钠、盐酸精氨酸、甘露醇、蔗糖和海藻糖中的任意一种，或所述稳定剂为氯化钠、盐酸精氨酸、甘露醇、蔗糖和海藻糖中多种的组合；优选地，所述稳定剂的浓度为约10～300mM，优选为约20～295mM、50～290mM、80～285mM或120～280mM，更优选为约20-280mM或120～250mM。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述稳定剂选自以下(1)至(8)中的任一项：
(1)氯化钠，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约120～160mM；
(2)盐酸精氨酸，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约120～160mM；
(3)甘露醇，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约200～250mM；
(4)蔗糖，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约200～250mM；
(5)海藻糖，浓度为约120～280mM，优选地，其浓度为约200～250mM；
(6)氯化钠与甘露醇的组合，其中氯化钠的浓度为约20～80mM，甘露醇的浓度为约100～180mM，优选地，其中氯化钠的浓度为约30～70mM，甘露醇的浓度为约120～160mM；
(7)氯化钠与蔗糖的组合，其中氯化钠的浓度为约20～80mM，蔗糖的浓度为约100～180mM，优选地，其中氯化钠的浓度为约30～70mM，蔗糖的浓度为约120～160mM；
(8)氯化钠与海藻糖的组合，其中氯化钠的浓度为约20～80mM，海藻糖的浓度为约100～180mM，优选地，其中氯化钠的浓度为约30～70mM，海藻糖的浓度为约120～160mM。
8.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种；优选地，以w/v计算，所述表面活性剂浓度为约0.01％～0.1％，更优选地，所述表面活性剂浓度为约0.01％～0.08％，更优选地，所述表面活性剂的浓度为约0.01％～0.04％。
9.如权利要求1中任一项所述的药物组合物，其中，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链，氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的TGFβRⅡ胞外结构域(ECD)，所述重链氨基酸与TGFβRⅡ胞外结构域(ECD)氨基酸以(GGGGS)4G肽段相连，形成双功能蛋白的第一亚基。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的第一亚基。
12.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其分别包含如下述(1)～(44)中任一项所示的组分：
(1)(a)约2～100mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约5.0～7.5；(c)约20～80mM的氯化钠；(d)约100～180mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(2)(a)约2～100mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM组氨酸缓冲液，pH为约5.0～7.5；(c)约20～80mM的氯化钠；(d)约100～180mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(3)(a)约2～100mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM枸橼酸缓冲液，pH为约5.0～7.5；(c)约20～80mM的氯化钠；(d)约100～180mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(4)(a)约2～100mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM磷酸盐缓冲液，pH为约5.0～7.5；(c)约20～80mM的氯化钠；(d)约100～180mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(5)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约120～160mM的氯化钠；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(6)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约120～160mM的盐酸精氨酸；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(7)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约200～250mM的甘露醇；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(8)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约200～250mM的蔗糖；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(9)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约200～250mM的海藻糖；以及(d)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(10)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.7～5.3；(c)约30～70mM的氯化钠；(d)约120～160mM的甘露醇；以及(e)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(11)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约30～70mM的氯化钠；(d)约120～160mM的蔗糖；以及(e)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(12)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约30～70mM的氯化钠；(d)约120～160mM的海藻糖；以及(e)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(13)(a)约5～50mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约4.9～5.2；(c)约30～70mM的氯化钠；(d)约120～160mM的海藻糖；以及(e)约0.01％～0.08％的聚山梨醇酯20；或
(14)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约135mM的氯化钠；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(15)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约135mM的盐酸精氨酸；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(16)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约240mM的甘露醇；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(17)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约220mM的蔗糖；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(18)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约220mM的海藻糖；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(19)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的甘露醇；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(20)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的蔗糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(21)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(22)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(23)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(24)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(25)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(26)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM～150mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20；或
(27)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的甘露醇；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(28)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的蔗糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(29)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(30)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(31)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(32)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(33)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(34)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约140mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20；或
(35)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(36)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(37)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(38)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(39)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(40)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的甘露醇；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20；或
(41)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(42)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(43)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(44)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(45)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(46)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的蔗糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20；或
(47)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(48)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯80；或
(49)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯80；或
(50)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.02％的聚山梨醇酯20；或
(51)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.04％的聚山梨醇酯20；或
(52)(a)约5mg/mL的所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白；(b)约20mM醋酸缓冲液，pH为约5.1～5.2；(c)约50mM的氯化钠；(d)约150mM的海藻糖；以及(e)约0.08％的聚山梨醇酯20。
13.如权利要求1-12中任一项所述的药物组合物的冻干制剂。
14.由权利要求13所述的冻干制剂复溶获得的复溶制剂。
15.一种液体制剂，其特征在于，所述液体制剂含有权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，或含有葡萄糖溶液或氯化钠溶液以及权利要求14所述的复溶制剂；优选地，所述氯化钠溶液浓度为约0.85～0.9％(w/v)，所述葡萄糖溶液浓度为约5～25％(w/v)；优选地，所述液体制剂中，所述靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白的浓度为约0.1～50mg/mL，更优选为约0.2～20mg/mL；更优选为0.2～5mg/mL；优选地，所述液体制剂的pH为约5.0～7.0；优选地，所述液体制剂是注射剂。
16.如权利要求1-12中任一项所述的药物组合物、如权利要求13所述的冻干制剂、或如权利要求14或15所述的制剂在制备通过消除、抑制或降低PD-1和/或TGFβ的活性来治疗疾病或病症的药物中的用途；优选地，所述疾病或病症选自癌症、感染性疾病或炎症性疾病；更优选地，所述疾病为癌症。
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