TW202132335A - 用於治療腎臟障礙之方法 - Google Patents

Abstract

本揭露關於治療腎臟損傷之方法，該方法藉由投與抑制ST2傳訊和RAGE傳訊兩者的抗IL-33治療劑來實現。

Description

用於治療腎臟障礙之方法

本揭露關於用於治療腎臟損傷，例如糖尿病性腎病之方法。

慢性腎臟疾病（CKD）係世界範圍內的公共健康問題（Ritz等人 1999；Nwankwo等人 2005），其與顯著的發病率和死亡率相關（Brenner等人 2001；Lewis等人 2001；Go等人 2004）。在美國，糖尿病占第二階段腎臟疾病病例的發病率的約45%，其中約90%的該等病例係患有2型糖尿病的患者（USRDS 2009）。用於治療糖尿病性腎病（DKD）的公認護理標準係使用血管張力素轉化酶抑制劑（ACEi）或血管張力素受體阻斷劑（ARB）。其他通路，例如RAGE傳訊和經由IL-33/ST2軸的傳訊已經成為疾病進展的促成因素。該等通路係由免疫系統，藉由浸潤性免疫細胞和促炎細胞介素、趨化因子和黏附分子介導的（Hickey 2018；Ferhat等人JASN 2018 29:1272-1288）。DKD的複雜病理生理學（Brenner等人 2001；Lewis等人 2001）意味著ACEi和ARB的血液動力學效應提供不完全保護而免於腎功能的進行性喪失。

因此，在這一領域中，存在未滿足的醫學需求。

如實例中所示並且出於以下闡述的原因，藉由ST2受體和RAGE兩者抑制傳訊提供了對於腎臟損傷的有效治療。本揭露首次證明IL-33經由不同通路，在不同腎臟細胞類型仲介導病理傳訊。更具體地，顯示IL-33的還原形式（redIL-33）經由ST2通路在腎小球上皮細胞中引發傳訊。此外，描述了迄今未知的傳訊通路，其中顯示氧化型IL-33（oxIL-33）在腎上皮細胞亞型中經由RAGE/EGFR引發傳訊。儘管oxIL-33先前未被公認係RAGE的配位基，但RAGE傳訊已牽涉到腎臟疾病病理學。因此，本揭露提供了用於藉由抑制oxIL-33傳訊來治療腎臟疾病之新機制。然而，治療效果可以不限於抑制oxIL-33，因為結合並且中和IL-33也可以抑制病理性redIL-33活性。此外，本揭露鑒定出，兩種同種型的IL-33對系膜細胞具有不同的潛在病理作用。顯示RedIL-33在此細胞類型中引發炎性細胞介素的產生，而oxIL-33誘導系膜細胞增殖。系膜擴張係某些慢性腎臟疾病，例如糖尿病性腎病（DKD）之病理特點。這樣，本揭露證明了藉由靶向單個細胞介素IL-33來阻斷與腎臟疾病有關的多個不同病理通路的可能性，以減少或抑制腎臟中IL-33介導的炎症，減少或抑制與oxIL-33傳訊相關的異常上皮生理學，和/或減少或抑制系膜擴張。

因此，第一方面提供了用於治療腎臟損傷之方法，該方法包括投與抑制ST2傳訊和RAGE傳訊兩者的抗IL-33治療劑。在一些實施方式中，該方法減弱或抑制還原型IL-33蛋白（redIL-33）的活性，並且由此抑制ST2傳訊。在一些實施方式中，該方法減弱或抑制氧化型IL-33蛋白（oxIL-33）的活性，並且由此抑制RAGE傳訊。

在一些實施方式中，該腎臟損傷包括炎症。在一些實施方式中，該腎臟損傷係炎性的。

在一些實施方式中，該腎臟損傷選自糖尿病性腎病、纖維化、腎小球腎炎（例如非增生性（例如輕微病變性腎小球腎炎、膜型腎小球腎炎、局灶性節段性腎小球硬化）或增生性（例如IgA腎病、膜性增生性腎小球腎炎、感染後腎小球腎炎、和急進性腎小球腎炎[例如古巴士德氏症候群（Goodpastures syndrome）和血管炎性障礙{其包括韋格納肉芽腫病（Wegners granulomatosis）和顯微鏡下多血管炎}]）、全身性紅斑狼瘡、蛋白尿、單側輸尿管梗阻、奧爾波特症候群（Alport syndrome）、多囊腎病（PCKD）、高血壓性腎小球硬化症、慢性腎小球硬化症、慢性梗阻性尿路病、慢性腎小管-間質腎炎和缺血性腎病。在一些實施方式中，該腎臟損傷係糖尿病性腎病。

在一些實施方式中，該治療劑係化學抑制劑或結合分子，例如抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方式中，其中該治療劑係抗體或其抗原結合片段，其特異性結合IL-33。在一些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段特異性結合redIL-33，並且減弱或抑制redIL-33的活性，由此抑制ST2傳訊。在一些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 pM、或小於或等於10 pM，例如小於或等於1 pM，例如0.5 pM，尤其是0.05 pM的結合親和力（例如當使用KinExA進行測量時）結合redIL-33。在一些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段以大於或等於10³ M^-1 sec^-1 、5 X 10³ M^-1 sec^-1 、10⁴ M^-1 sec^-1 或5 X 10⁴ M^-1 sec^-1 的結合速率（k(on)）結合redIL-33。在一些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段以小於或等於5 X 10^-1 sec^-1 、10^-1 sec^-1 、5 X 10^-2 sec^-1 、10^-2 sec^-1 、5 X l0^-3 sec^-1 或l0^-3 sec^-1 的解離速率（k(off)）結合redIL-33。具有該等結合特徵的抗體係特別有利的，因為它們結合並且螯合還原形式的IL-33，由此使得能夠抑制或減弱redIL-33的活性。結合的強度還可足以在靶標接合之前（即在與ST-2結合之前）螯合redIL-33。此外，結合的強度還可以阻止從redIL-33/結合分子複合物釋放redIL-33，從而阻止red-IL-33轉化為氧化形式。這樣，該等結合分子或抗原結合片段因此抑制或減弱oxIL-33的活性，由此抑制經由RAGE的傳訊。因此，在一些實施方式中，該抗體或抗原結合片段減弱或抑制oxIL-33的活性，並且由此抑制RAGE傳訊。

在一些實施方式中，該抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 37的序列的VHCDR1、具有SEQ ID NO: 38的序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO: 39的序列的VHCDR3、具有SEQ ID NO: 40的序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO: 41的序列的VLCDR2、以及具有SEQ ID NO: 42的序列的VLCDR3。

在一些實施方式中，該抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 1的序列的VH和具有SEQ ID NO: 19的序列的VL。

在另一方面，提供了用於在治療受試者的腎臟損傷之方法中使用的抗IL-33治療劑，其中將該抗IL-33治療劑投與於受試者，以減弱或抑制IL-33介導的ST2傳訊和IL-33介導的RAGE傳訊。

在一些實施方式中，該IL-33介導的RAGE傳訊係IL-33介導的RAGE-EGFR傳訊。在一些實施方式中，抑制或減弱RAGE-EGFR傳訊減弱或抑制了RAGE-EGFR介導的效應。在一些實施方式中，該RAGE-EGFR介導的效應包括異常上皮生理學。在一些實施方式中，該異常上皮生理學係異常上皮重塑。在一些實施方式中，該RAGE-EGFR介導的效應包括異常系膜擴張。在一些實施方式中，該異常系膜擴張包括異常系膜細胞增殖。

在一些實施方式中，抑制或減弱ST2傳訊減弱或抑制了ST2介導的效應。在一些實施方式中，該ST2介導的效應包括腎臟中的異常炎症。在一些實施方式中，該異常炎症包括增加的IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、TNFa和/或IL1b分泌或表現，視需要增加的IL-4、IL-6、IL-8和/或IL-12分泌或表現。在一些實施方式中，該異常炎症包括MAP激酶激活。在一些實施方式中，MAP激酶激活包括p38或JNK激酶激活。在一些實施方式中，該炎症係在內皮、腎小球、或兩者中。

在另一方面，提供了用於治療腎臟損傷的治療劑，該治療劑抑制或減弱還原型IL-33的活性，從而抑制或減弱ST2傳訊，其中該治療進一步包括抑制或減弱氧化型IL-33的活性，從而抑制或減弱RAGE傳訊。

在另一方面，提供了治療劑在製造用於治療腎臟損傷的藥物中之用途，該治療劑抑制或減弱還原型IL-33的活性，從而抑制或減弱ST2傳訊，其中該治療進一步包括抑制或減弱氧化型IL-33的活性，從而抑制或減弱RAGE傳訊。

在另一方面，提供了用於治療腎臟損傷的治療劑，該治療劑抑制或減弱氧化型IL-33的活性，從而抑制或減弱RAGE傳訊，其中該治療進一步包括抑制或減弱還原型IL-33的活性，從而抑制或減弱ST2傳訊。

在另一方面，提供了治療劑在製造用於治療腎臟損傷的藥物中之用途，該治療劑抑制或減弱氧化型IL-33的活性，從而抑制或減弱RAGE傳訊，其中該治療進一步包括抑制或減弱還原型IL-33的活性，從而抑制或減弱ST2傳訊。

在另一方面，提供了抑制或減弱還原型IL-33的活性從而抑制或減弱ST2傳訊的治療劑，以及抑制或減弱氧化型IL-33的活性從而抑制或減弱RAGE傳訊的治療劑，這兩種治療劑用於治療腎臟損傷。

在另一方面，提供了抑制或減弱還原型IL-33的活性從而由此抑制或減弱ST2傳訊的治療劑、以及抑制或減弱氧化型IL-33的活性從而由此抑制或減弱RAGE傳訊的治療劑在製造用於治療腎臟損傷的藥物中之用途。

在另一方面，提供了用於治療腎臟損傷的治療劑，該治療劑抑制或減弱還原型IL-33和氧化型IL-33的活性，從而抑制或減弱ST2傳訊和RAGE傳訊。

在另一方面，提供了治療劑在製造用於治療腎臟損傷的藥物中之用途，該治療劑抑制或減弱還原型IL-33和氧化型IL-33的活性，從而抑制或減弱ST2傳訊和RAGE傳訊。

一般定義

如本文所用的「經分離」係指尤其是自自然界分離的處於非天然環境中的蛋白質，例如該術語不包括體內蛋白質，也不包括取自人體或動物體的樣本中的蛋白質。通常，蛋白質將處於載體（諸如液體或介質）中，或可配製、冷凍或冷凍乾燥，並且在適當時所有該等形式可由「經分離」涵蓋。在一個實施方式中，經分離不指呈凝膠狀的蛋白質，例如在西方墨點法分析中使用的凝膠或相似物。

如本文所用的「IL-33」蛋白係指白介素33，尤其是哺乳動物白介素33蛋白，例如以UniProt編號095760保藏的人類蛋白。此實體不以單一種類存在而是以還原和氧化形式存在（Cohen等人 Nature Comms [自然通訊]）。鑒於還原形式在體內例如在5分鐘至40分鐘時段內和在體外快速氧化，通常先前技術對IL-33的提及實際上為對氧化形式的提及。術語「IL-33」和「IL-33多肽」以及「IL-33蛋白」可互換使用。在某些實施方式中，IL-33係全長。在另一實施方式中，IL-33係成熟的截短IL-33（胺基酸112-270）。最近研究表明全長IL-33係有活性的（Cayrol和Girard, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊] 106(22):9021-6 (2009)；Hayakawa等人, Biochem Biophys Res Commun [生物化學和生物物理學研究通訊] 387(1):218-22 (2009)；Talabot-Ayer等人, J Biol Chem. [生物化學雜誌] 284(29): 19420-6 (2009)）。然而，N-末端處理的或截短的IL-33（包括但不限於aa 72-270、79-270、95-270、99-270、107-270、109-270、111-270、112-270）可具有增強的活性（Lefrancais 2012、2014）。在另一實施方式中，IL-33可包括全長IL-33、其片段或IL-33突變體或變體多肽，其中IL-33的片段或IL-33變體多肽保留活性IL-33的一些或所有功能特性。

氧化型IL-33、oxIL-33、IL-33-DSB（二硫鍵結合的）和DSB IL-33在本文中也可互換使用。氧化型IL-33係指作為獨特帶可見的蛋白質，例如藉由在非還原條件下的西方墨點法分析，尤其是其質量比相應還原形式小4 Da。具體而言，其係指在獨立地選自半胱胺酸208、227、232和259的半胱胺酸之間具有一個或兩個二硫鍵的蛋白質。氧化型IL-33係指結合RAGE並且觸發RAGE介導的傳訊的IL-33的形式。在一個實施方式中，氧化型IL-33顯示不與ST2結合。

還原型IL-33和redIL-33在本文中可互換使用。如本文所用的還原型IL-33係指與ST2結合且觸發ST2依賴性傳訊的IL-33形式。具體而言，該還原形式的半胱胺酸208、227、232和259並非係二硫鍵鍵合的。如本文所用的redIL-33活性片段係指具有與redIL-33可比的活性（例如相似程度的ST2依賴性傳訊）的片段。在一個實施方式中，活性片段係全長redIL-33的活性的20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。

如本文所用的「ST2傳訊」係指IL-33/ST2系統，其中由ST2識別的IL-33促進在細胞表面上與IL1-RAcP二聚以及在細胞內將受體複合物組分MyD88、TRAF6和IRAK1-4募集到胞內TIR結構域中。由可位於腎臟中的Th2細胞、肥大細胞和其他免疫細胞類型表現在基線處的ST2受體。胞外IL-33形式藉由與ST2結合且隨後激活NFκB和MAP激酶途徑而刺激靶細胞，導致包括產生細胞介素和趨化因子的一系列功能反應。因此，ST2依賴性傳訊可藉由擾動IL-33與ST2的相互作用或者可替代地藉由中斷與IL-1RAcP的相互作用來中斷。如本文所用的ST-2傳訊「抑制或減弱」係指減少或阻斷藉由ST-2/IL-33系統的傳訊。可以藉由測定由於ST-2傳訊而上調的炎性細胞介素（例如IL-4、IL-6、IL-8和IL-12）的濃度水平，來確定ST-2傳訊的程度（並且因此確定對其的抑制或減弱）。可以例如使用ELISA測定或定量質譜分析法，從獲得自經歷本文所述之治療方法的受試者的生物樣本測量細胞介素的濃度。

「RAGE傳訊」，也稱為「AGER傳訊」，係指IL-33/RAGE系統，其中IL-33結合該受體，由此產生促炎性基因激活。如本文所用的RAGE傳訊的抑制或減弱係指藉由RAGE/IL-33系統減少或阻斷病理傳訊，例如促炎性傳訊，或減少或阻斷誘導腎小球中的異常上皮重塑或系膜細胞擴張的傳訊。

用於本揭露中的「結合分子」或「抗原結合分子」在其最廣泛意義上係指特異性結合抗原決定簇的分子。在一個實施方式中，該結合分子或其抗原結合片段特異性地結合IL-33，尤其是redIL-33和/或oxIL-33。在另一實施方式中，本揭露之結合分子係抗體或其抗原結合片段。

如本文所用的「抗體」係指如下文更詳細論述的免疫球蛋白分子，尤其是全長抗體或包含全長抗體的分子，例如DVD-Ig分子等。

「結合片段」或「抗原結合片段」係抗體片段的表位/抗原結合片段，例如包含結合結構域，尤其是包含6個CDR，諸如重鏈可變區中的3個CDR和輕鏈可變區中的3個CDR的那些。

除非確切地提及全尺寸的抗體諸如天然存在的抗體，否則術語「抗IL-33」涵蓋全尺寸抗體以及這類抗體的抗原結合片段、變體、類似物或衍生物，例如天然存在的抗體或免疫球蛋白分子或工程化的抗體分子或以與抗體分子類似的方式結合抗原的片段。

本文所用的抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物可以就抗原的一個或多個表位或一個或多個部分，例如其識別或特異性結合的本文所揭露的靶多肽（例如，全長或成熟IL-33）而言進行描述或規定。特異性地與抗體的抗原結合結構域相互作用的靶多肽的部分係「表位」或「抗原決定簇」。取決於抗原的尺寸、構型和類型，靶多肽可包含單一表位，但典型地包含至少兩個表位，並且可以包括任何數目的表位。此外，應注意的是，靶多肽上的「表位」可以是或可包括非多肽元素，例如表位可包括碳水化合物側鏈。

抗體的肽或多肽表位的最小尺寸被認為係約四至五個胺基酸。肽或多肽表位較佳的是含有至少七個，更較佳的是至少九個且最較佳的是至少約15至約30個胺基酸。由於CDR可以識別三級形式的抗原肽或多肽，所以包含表位的胺基酸不必連續，並且在一些情況下甚至可不在同一肽鏈上。被用於本揭露中的抗IL-33抗體識別的肽或多肽表位可含有IL-33的至少4、至少5、至少6、至少7,更較佳的是至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25個、或約15至約30個之間的連續或非連續胺基酸的序列。

如本文所用，術語「治療（treat或treatment）」係指治療性治療和防治性或預防性措施，其中目標係預防或減慢（減輕）不希望的生理變化或障礙，諸如炎性病症的進展。有益或所希望的臨床結果包括但不限於症狀緩解、疾病程度減輕、疾病狀態穩定化（即未惡化）、疾病進展延遲或減緩、疾病狀態改善或緩和、以及減輕（無論是部分減輕還是全部減輕），無論是可檢測的還是不可檢測的。「治療」還可以意指當與未接受治療時的預期存活相比，延長存活。需要治療的那些包括已患有病症或障礙的那些以及易於患上病症或障礙的那些或打算預防病症或障礙的那些。

「受試者」或「個體」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意指希望進行診斷、預後或治療的任何受試者，尤其是哺乳動物受試者。哺乳動物受試者包括人、家畜、農畜、以及動物園動物、體育動物、或寵物動物，諸如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。在一個實施方式中，患者係人。

如本文所用的「減弱……的活性」係指減少相關活性或停止相關活性。除非上下文另外指示，否則減弱和抑制通常在本文中可互換使用。 治療用途

如本文所述，抑制藉由ST2受體和RAGE兩者進行的傳訊可以為腎臟損傷提供有效治療。如本文所定義的，「腎臟損傷」係指腎臟的長期的或慢性的疾病或損傷，例如來自疾病或創傷（包括物理的或化學的創傷）。換句話說，如本文所用，「腎臟損傷」係指一種疾病，其中腎功能係慢性損害的和/或其中腎臟組織係慢性受損的，例如其中該等異常持續至少三個月。

本文所述之方法與至少部分地由IL-33介導的腎臟損傷的治療相關。已經顯示在患有腎臟損傷的受試者的腎臟中，IL-33的水平係局部增加的。還原型IL-33（redIL-33）藉由激活由直接結合受體ST2進行的傳訊而刺激腎臟中的炎症。本揭露鑒定出，IL-33介導的ST2發生在多種細胞類型中，包括內皮細胞和系膜細胞。本揭露還描述了還描述了存在迄今為止未知的IL-33傳訊通路，藉由此通路，氧化形式的IL-33（oxIL-33）引發經由RAGE/EGFR的傳訊。實例描述了RAGE-EGFR傳訊在腎臟上皮中被激活。出人意料地，本揭露還鑒定出，oxIL-33介導的RAGE/EGFR傳訊包括增加系膜細胞增殖，潛在促進在腎臟的慢性疾病（例如糖尿病性腎病）中觀察到的系膜擴張。因此，本文所述之方法不僅可用於治療腎臟疾病的IL-33介導的炎症方面，例如由ST2傳訊介導的那些，而且還可用於治療藉由經由RAGE/EGFR的oxIL-33病理傳訊介導的腎臟疾病的要素。

更具體地，IL-33介導的ST2依賴性和RAGE依賴性傳訊（例如RAGE-EGFR傳訊）的雙重阻斷可以為患有腎臟損傷的受試者的治療提供改善的結果。腎臟疾病的體內建模已經顯示了IL-33的水平和腎臟受損之間的相關性。處於還原形式的IL-33經由很好描述的ST2傳訊通路進行傳訊。經由ST2通路的傳訊產生促成腎臟損傷和疾病的病理學的炎性反應。

此外，經由RAGE的病理傳訊已經與不同腎臟障礙相關（D’Agati等人Nat Rev Nephrol [腎臟病學自然綜述] 2010:352-60）。RAGE係結合晚期糖基化終產物的IgG超家族的多配位基受體。這樣，已經提出RAGE傳訊的拮抗作用可作為用於治療慢性腎臟疾病的治療策略。

然而，由於RAGE係多配位基受體（FritzTrends in Biochemical Sciences [生物化學趨勢] 2011 36:625-632），所以除了腎臟疾病中的任何功效以外，直接抑制RAGE還可能具有脫靶效應和毒性。在腎臟上皮生物學的背景下，藉由抑制迄今為止未知的RAGE的配位基，認為與完全抑制RAGE相比，本文揭露的治療策略係有利的。這係因為它允許藉由直接抑制RAGE配位基oxIL-33來抑制或減弱病理RAGE傳訊。在患有腎臟損傷的受試者中的血清中，IL-33表現通常較低（Bao等人J Clin Immunol [臨床免疫學雜誌] 2012:587-94；Caner等人Renal Failure [腎衰竭] 2014:78-80；Musolino等人Br. J. Haematol [英國血液學雜誌] 2013:709-710；Mok等人Rheumatology [風濕病學] 2010:520-527）。這樣，靶向oxIL-33-RAGE介導的傳訊使得能夠抑制或減弱（即，減少）病理腎臟損傷的該等要素，同時藉由直接抑制RAGE潛在減小可能顯現的脫靶毒性。這係因為本揭露使得能夠藉由靶向主要在疾病部位（即腎臟）發現的RAGE配位基，以局部方式抑制或減弱病理RAGE傳訊。此外，該策略可以與redIL-33 ST2通路的抑制組合，從而允許腎臟損傷中涉及的兩個重要病理通路的抑制和/或減弱。

如實例中證明，在多個患有糖尿病性腎病的受試者中，以及在多個腎臟疾病的臨床前模型中，IL-33腎臟表現係升高的。實例還證明，在腎臟上皮、內皮、和腎小球中，ST2和RAGE IL-33傳訊通路兩者都被激活。實例還顯示，抑制IL-33傳訊活性阻止了炎症介質的釋放。因此，藉由抑制或減弱IL-33介導的ST2和RAGE依賴性傳訊兩者，本揭露為腎臟損傷的治療提供了新治療策略。

這樣，提供了治療腎臟損傷之方法，該方法包括向受試者投與抗IL-33治療劑，其中投與該抗IL-33治療劑以抑制ST2傳訊和RAGE傳訊兩者。治療劑係如本文其他地方所定義的。

本揭露還首次顯示，氧化型IL-33結合RAGE，該RAGE繼而與EGFR複合。這樣，本揭露提供了使用可以抑制氧化型IL-33的傳訊的治療劑的可能性，由此抑制對RAGE的潛在的oxIL-33介導的病理激活。例如，該等治療劑可以抑制RAGE-EGFR複合。本文揭露的數據證明，阻止RAGE-EGFR複合物的形成阻止了IL-33介導的RAGE/EGFR傳訊，這可以預防oxIL-33誘導的腎小管上皮功能障礙，和/或藉由抑制oxIL-33介導的系膜細胞增殖，預防系膜功能障礙，如系膜擴張。

因此，除了抑制ST2傳訊以外，用於本文揭露之用途之方法和治療劑還抑制RAGE-EGFR傳訊，用於治療腎臟損傷。

在一些實例中，該治療劑抑制EGFR傳訊。在一些實例中，該治療劑抑制RAGE-EGFR傳訊。在一些實例中，該治療劑抑制氧化型IL33-RAGE-EGFR傳訊。

在一些實例中，該治療劑抑制氧化型IL-33與RAGE的結合。在一些實例中，該治療劑抑制RAGE-EGFR複合物的形成。在一些實例中，該治療劑抑制氧化型IL33-RAGE-EGFR複合物的形成。

在一些實例中，該治療劑抑制EGFR的激活。在一些實例中，該治療劑抑制EGFR的磷酸化。

在一些實例中，該治療劑抑制RAGE-EGFR介導的效應。在一些實例中，該治療劑抑制RAGE-EGFR複合物介導的效應。在一些實例中，該治療劑抑制氧化型IL33-RAGE-EGFR複合物介導的效應。

在一些實例中，該治療劑抑制氧化型IL-33與RAGE的結合，由此抑制RAGE-EGFR複合，由此抑制RAGE-EGFR介導的效應，例如下游傳訊。

在一些實例中，該治療劑抑制IL-33介導的EGFR效應。在一些實例中，該治療劑抑制IL-33介導的EGFR傳訊。在一些實例中，該治療劑抑制氧化型IL-33介導的EGFR效應。在一些實例中，該治療劑抑制氧化型IL-33介導的EGFR傳訊。在一些實例中，該治療劑抑制氧化型IL-33介導的RAGE-EGFR效應。適合地，該治療劑抑制氧化型IL-33介導的RAGE-EGFR傳訊。

在一些實例中，RAGE-EGFR介導的效應係由RAGE-EGFR複合物引起的，例如由氧化型IL-33-RAGE-EGFR複合物引起的。此類效應可以典型地包括下游傳訊，其在本文中可以稱為RAGE傳訊、EGFR傳訊或RAGE-EGFR傳訊。在一些實例中，此類傳訊可以包括磷酸化和/或趨化因子釋放。

如本文列舉的「RAGE-EGFR介導的效應」係指在細胞膜中由RAGE與EGFR複合以及所得的異常EGFR活性引起的任何生理學效應。此類RAGE-EGFR介導的效應可以呈現為異常腎臟上皮生理學。異常腎臟上皮生理學可以包括對以下的負面影響：屏障完整性；組織和腔之間的化學實體的調節和交換；化學物質分泌到腔中；適應不良的的組織修復；和/或組織重塑（例如纖維化）。

在一些實例中，此類RAGE-EGFR傳訊包括EGFR的磷酸化，以及隨後EGFR通路中的組分（例如EGFR、PLC、JNK、MAPK/ERK 1/2、p38、和STAT5）的磷酸化。適合地，EGFR傳訊包括酪胺酸激酶（例如JNK、MAPK/ERK、p38）的磷酸化。

因此，在一些實例中，該治療劑抑制EGFR通路中的組分的磷酸化。在一些實例中，該治療劑抑制以下中的任一項的磷酸化：EGFR、PLC、JNK、MAPK/ERK 1/2、p38、和STAT5。在一些實例中，該治療劑抑制以下中的任一項的EGFR介導的磷酸化：EGFR、PLC、JNK、MAPK/ERK 1/2、p38、和STAT5。在一些實例中，治療劑抑制酪胺酸激酶的磷酸化。在一些實例中，該治療劑抑制選自以下的酪胺酸激酶的磷酸化：JNK、MAPK/ERK、p38。在一些實例中，該治療劑抑制選自以下的酪胺酸激酶的EGFR介導的磷酸化：JNK、MAPK/ERK、和p38。

因此，在一些實例中，該治療劑抑制趨化因子的釋放。在一些實例中，該治療劑抑制IL-8的釋放。在一些實例中，該治療劑抑制IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、TNFa和/或IL1b的釋放。在一些實例中，該治療劑抑制趨化因子的EGFR介導的釋放。在一些實例中，該治療劑抑制IL-8的EGFR介導的釋放。

在一些實例中，該RAGE-EGFR介導的效應可以呈現為異常系膜擴張。在一些實例中，該異常系膜擴張包括增加的系膜擴張。在一些實例中，該系膜擴張包括異常系膜細胞增殖。在一些實例中，該異常系膜細胞增殖包括增加的系膜細胞增殖。

該等方法和治療劑用於治療或預防腎臟損傷。

本揭露還提供了如本文其他地方所定義的治療劑中的任一項在製造用於治療腎臟損傷的藥物中之用途。

在腎臟疾病的臨床前模型中，已經顯示本揭露之方法減小了炎性負擔。此外，本揭露證明，患有慢性腎臟疾病的受試者表現升高水平的白介素-33。因此，在一些實施方式中，該方法包括治療作為炎症的腎臟損傷。在一些實施方式中，該方法包括治療包含炎症的腎臟損傷。在一些實施方式中，該方法包括治療包含慢性炎症的腎臟損傷。在一些實施方式中，該方法可以治療或預防與腎臟損傷相關的炎症。在一些實施方式中，該等方法可以治療或預防與腎臟損傷相關的急性炎症。在一些實施方式中，該等方法可以治療或預防與腎臟損傷相關的慢性炎症。在一些實施方式中，該方法可用於治療與腎臟損傷相關的炎性病症。

在一些實例中，該等方法包括抑制或減弱IL-33介導的ST2傳訊。在一些實例中，該IL-33介導的ST2傳訊係redIL-33介導的ST2傳訊。在一些實例中，抑制或減弱IL-33介導的ST2傳訊包括抑制或減弱ST2介導的效應。

在一些實例中，該ST2介導的效應係腎臟中的異常炎症。在一些實例中，該腎臟中的異常炎症係腎臟中的增加的炎症。在一些實例中，該異常炎症係在內皮中。在一些實例中，該異常炎症係在腎小球中。在一些實例中，在腎小球中的異常炎症係由於系膜細胞刺激。在一些實例中，該異常炎症包括增加的IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、TNFa和/或IL1b分泌或表現，視需要增加的IL-4、IL-6、IL-8和/或IL-12分泌或表現。在一些實例中，該異常炎症包括增加的IL-8分泌或表現。在一些實例中，該異常炎症包括MAP激酶激活。在一些實例中，該MAP激酶激活包括p38或JNK激酶激活。

在一些實施方式中，本文所述之方法改善了與腎臟損傷相關的一個或多個症狀。在一些實施方式中，該方法可以減少體重損失、水腫、呼吸短促、疲勞、失眠、痙攣、噁心、皮膚瘙癢或頭痛。在一些實施方式中，該方法可以改善食欲。該等症狀中的許多可能與腎臟損傷相關的腎功能的潛在損害有關。這樣，藉由進行本文揭露之方法減小腎臟損傷來改善腎功能可以改善該等症狀中的任何一個或多個。

如本文所定義的，「改善」意指藉由進行本文所述之方法減輕受試者的關於疾病的一個或多個症狀的不適。當進行該方法時，可以藉由監測以評估受試者體內顯現症狀的次數並且以觀看該等事件如何隨時間減少來確定受試者的改善。

在一些實施方式中，本文所述之方法減少了受試者中的尿白蛋白:肌酸酐比率（UACR）。例如，當進行該方法時，受試者的UACR可能降低。UACR係從受試者收集的尿液樣本中總白蛋白量的量度，其歸一化為肌酸酐的濃度。更高UACR評分指示受試者在尿中具有增加濃度的白蛋白（蛋白尿）。白蛋白通常由於腎臟損傷而釋放到尿中。因此，該方法可以用於降低受試者的UACR評分，其中「降低」意指與治療開始前的UACR相比，在治療期間或治療之後，UACR評分減小。可以使用本領域中可用的多種UACR測試中的任一項，從收集自患者的尿液樣本測量UACR評分。

在一些實施方式中，該腎臟損傷選自糖尿病性腎病、纖維化、腎小球腎炎（例如非增生性（例如輕微病變性腎小球腎炎、膜型腎小球腎炎、局灶性節段性腎小球硬化）或增生性（例如IgA腎病、膜性增生性腎小球腎炎、感染後腎小球腎炎、和急進性腎小球腎炎[例如古巴士德氏症候群和血管炎性障礙{其包括韋格納肉芽腫病和顯微鏡下多血管炎}]）、全身性紅斑狼瘡、蛋白尿、單側輸尿管梗阻、奧爾波特症候群、多囊腎病（PCKD）、高血壓性腎小球硬化症、慢性腎小球硬化症、慢性梗阻性尿路病、慢性腎小管-間質腎炎和缺血性腎病。所有該等病症都與炎性組分相關，並且因此可以受益於使用本文所述之方法或治療劑進行的治療。

在一些實施方式中，該方法用於治療糖尿病性腎病。本文所定義的糖尿病性腎病係指II型糖尿病的診斷和30-75 ml/min的估算的腎小球濾過率（eGFR）。典型地，DKD進一步定義為從100至3000 mg白蛋白與g肌酸酐的UACR比率的診斷。

用於計算eGFR的測試係本領域可獲得的。此類測試典型地考慮到血清肌酸酐值、血清半胱胺酸蛋白酶抑制劑C值、年齡、性別和種族。計算還可以考慮到體表調整值，例如身高和/或質量。典型地，肌酸酐值和半胱胺酸蛋白酶抑制劑C值係標準化值。例如，肌酸酐值可追溯到同位素稀釋質譜法（IDMS）。半胱胺酸蛋白酶抑制劑C值應可追溯到國際臨床化學和檢驗醫學聯合會（IFCC）/參考材料和測量研究所（IRMM）工作組。典型地，30-75 ml/min的eGFR表明受試者具有輕度至中重度的腎功能喪失。這樣，該等方法可以用於治療或預防具有輕度至中重度的腎功能喪失的DKD。在一些實施方式中，該等方法用於改善患有DKD的受試者的腎功能。

可以與用於治療腎臟損傷的已知方法組合來進行本文所述之方法。對於腎臟損傷（包括對於與腎臟損傷相關的併發症）的已知治療包括投與：1) 血管張力素轉化酶（ACE）抑制劑，2) 他汀類，3) 利尿劑，4) 促紅血球生成素，5) 鐵補充劑，6) 血管張力素受體阻斷劑，7) 類固醇類，或8) 鈉-葡萄糖運輸蛋白-2抑制劑（SGLT2i - 也稱為格列淨（gliflozin））。

因此，該方法可以用於已經歷或正在經歷用ACE抑制劑進行治療的受試者中。

因此，該方法可以用於已經歷或正在經歷用他汀進行治療的受試者中。

因此，該方法可以用於已經歷或正在經歷用利尿劑進行治療的受試者中。

因此，該方法可以用於已經歷或正在經歷用EPO進行治療的受試者中。

因此，該方法可以用於已經歷或正在經歷用鐵補充劑進行治療的受試者中。

因此，該方法可以用於已經歷或正在經歷用ARB進行治療的受試者中。

因此，該方法可以用於已經歷或正在經歷用類固醇進行治療的受試者中。

因此，該方法可以用於已經歷或正在經歷用SGLT2i進行治療的受試者中。在一些實例中，該SGLT2i係達格列淨（dagliflozin）。在該方法包括另一種治療的組合投與的情況下，本揭露之方法涵蓋使用單獨配製物或單一藥物配製物共投與、以及以任一順序連續投與。在本揭露之一些實施方式中，本文所述之治療劑與消炎藥組合投與，其中治療劑（例如IL-33或其抗原結合片段）和另外的治療可以任一順序依次或同時（即，同時或在同一時間範圍內）投與。

在一些實施方式中，該方法用於治療在腎臟中具有升高水平的IL-33表現（也稱為「上調的IL-33」）的受試者。如本文所述，患有腎臟損傷的受試者，例如患有糖尿病性腎病的受試者，在腎小球和腎小管間質中具有增加的IL-33表現。因此，該等方法可以特別有益於治療具有上調的IL-33的腎臟損傷受試者。該等方法可以特別有益於治療在腎小球中具有上調的IL-33的腎臟損傷受試者。該等方法可以特別有益於治療在腎小管間質中具有上調的IL-33的腎臟損傷受試者。因此，該等方法可以特別有益於治療在腎小球和腎小管間質中具有上調的IL-33的腎臟損傷受試者。

用於檢測細胞中IL-33表現之方法係本領域熟知的，並且包括但不限於PCR技術、免疫組織化學、流動式細胞測量術、西方墨點法、ELISA等。該等方法可以用於鑒定具有上調的IL-33的患者。

在一個實施方式中，該方法包括在受試者或患者患有腎臟損傷、具有腎臟損傷的症狀、或具有腎臟損傷的易患病體質的情況下，向受試者或患者應用或投與治療劑（例如，IL-33抗體或其抗原結合片段），或向來自受試者或患者的分離組織或細胞系應用或投與該抗IL-33抗體或其抗原結合片段。在另一實施方式中，該方法也旨在包括向受試者或患者應用或投與包含治療劑（例如，抗IL-33結合分子）的藥物組成物，或向來自受試者或患者的分離組織或細胞系應用或投與包含該抗IL-33結合分子的藥物組成物，該受試者或患者患有腎臟損傷、具有腎臟損傷的症狀或具有疾病的易患病體質。

根據本揭露之方法，如本文其他地方所定義的至少一種治療劑（例如，抗IL-33結合分子或其抗原結合片段）用於促進相對於腎臟損傷中的炎性反應的陽性治療反應。相對於炎症治療的「陽性治療反應」旨在指與該等結合分子（例如，抗體或其片段）的抗炎活性相關的疾病改善和/或與疾病相關的症狀改善。即，可以觀察到抗炎作用，進一步炎症預防和/或現有炎症減輕，和/或與疾病相關的一種或多種症狀減少。因此，例如，疾病的改善可被表徵為完全應答。術語「完全應答」旨在藉由任何先前測試結果的歸一化，不存在臨床上可檢測的疾病。在一個實施方式中，這樣一種應答必須持續在根據本揭露之方法治療之後至少一個月。可替代地，疾病的改善可被歸類為部分應答。

包括投與至少一種治療劑（例如抗IL-33結合分子或其抗原結合片段）的本揭露之方法還可以用於治療與表現IL-33的細胞相關的免疫系統的炎性疾病和缺陷或障礙（它們顯現為腎臟損傷）。炎性疾病由炎症和組織破壞或其組合表徵。「抗炎活性」旨在指炎症減輕或預防。「炎性疾病」包括任何炎性免疫介導的過程，其中免疫反應的引發事件或靶標涉及一種或多種非自身抗原，包括例如同種抗原、異種抗原、病毒抗原、細菌抗原、未知抗原、過敏原或毒素。

根據本揭露之方法，至少一種治療劑（例如，抗IL-33結合分子或其抗原結合片段）用於促進相對於治療或預防炎性腎臟損傷的陽性治療反應。相對於炎性腎臟損傷的「陽性治療反應」旨在指與該等抗體的抗炎活性等相關的疾病改善，和/或與疾病相關的症狀改善。即，可以觀察到炎性反應減少，包括但不限於炎性細胞介素、黏附分子、蛋白酶、免疫球蛋白、其組合等的分泌減少；抗炎蛋白的產生增加；自體反應細胞的數目減少；免疫耐受性增加；自體反應細胞存活抑制；細胞凋亡減少；內皮細胞遷移減少；自發單核細胞遷移增加；藉由刺激表現IL-33的細胞所介導的一種或多種症狀減輕和/或減少。這類陽性治療反應不受限於投與途徑。

臨床反應可以使用篩選技術評估，諸如磁共振成像（MRI）掃描、x射線照相成像、電腦斷層成像（CT）掃描、流動式細胞測量術或螢光活化細胞分選儀（FACS）分析、組織學、宏觀病理學以及血液化學，包括但不限於可藉由ELISA、RIA、層析等檢測的變化。除了該等陽性治療反應之外，正經受用抗IL-33結合分子（例如，抗體或其抗原結合片段）進行的治療的受試者可經歷與該疾病相關的症狀改善的有益效果。

本揭露之另一實施方式係抗IL-33結合分子（例如，抗體或其抗原結合片段）之用途，其用於診斷監測組織中的蛋白質水平作為臨床測試程序的一部分，例如以確定給定治療方案的功效。例如，藉由使抗體偶聯到可檢測物質上可以促進檢測。可檢測物質的實例包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料和放射性材料。合適酶的實例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適輔基複合物的實例包括鏈黴抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適螢光材料的實例包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三𠯤基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光材料的實例包括魯米諾；生物發光材料的實例包括螢光素酶、螢光素和水母素；並且合適放射性材料的實例包括¹²⁵ I、¹³¹ I、³⁵ S或³ H。 治療劑

「治療劑」係指向受試者投與的活性藥物成分，目的係為了對受試者的疾病狀態產生有益影響。如本文所用，治療劑係設計用於向受試者投與的、用於治療或預防腎臟損傷的活性成分。腎臟損傷係如本文其他地方所定義的。更具體地，設計該一種或多種治療劑來抑制ST2傳訊、RAGE傳訊、或兩者，用於治療腎臟損傷。在一些實施方式中，該一種或多種活性成分減弱或抑制還原型IL-33蛋白（redIL-33）的活性，由此抑制ST2傳訊。在一些實施方式中，該一種或多種活性成分減弱或抑制氧化型IL-33蛋白（oxIL-33）的活性，由此抑制RAGE傳訊。本文其他地方描述了在治療腎臟損傷的背景下，抑制這兩個傳訊通路的優勢。

在一些實施方式中，該一種或多種治療劑包括「化學抑制劑」。如本文所用，「化學抑制劑」係指具有抑制活性的合成的或半合成的分子，例如其中該分子具有500或更小的分子量。

可以設計該化學抑制劑來抑制ST-2傳訊、RAGE傳訊或兩者。在一些實施方式中，該化學抑制劑用於抑制ST-2傳訊。該化學抑制劑可以藉由直接結合ST-2並且拮抗ST-2的傳訊活性來抑制ST-2傳訊。這可以藉由結合ST-2，從而阻止ST-2激活配位基redIL-33的結合來實現。可替代地，該化學抑制劑可以直接結合redIL-33並且抑制結合ST-2。

在一些實施方式中，該化學抑制劑可以抑制RAGE傳訊。該化學抑制劑可以藉由直接結合RAGE並且拮抗RAGE的傳訊活性來抑制RAGE傳訊。在一些實施方式中，該化學抑制劑可以減弱或抑制oxIL-33的活性，並且由此抑制RAGE傳訊。可替代地，該化學抑制劑可以直接結合oxIL-33並且抑制結合RAGE。

在一些實施方式中，該化學抑制劑可以抑制ST-2傳訊和RAGE傳訊。這可以例如藉由結合與ST-2和RAGE兩者接合的IL-33上的介面，從而激活傳訊來實現。

在一個實施方式中，該一種或多種治療劑包括結合分子。適合地，該結合分子係抗體或其抗原結合片段、變體、或衍生物。抗體或抗原結合片段係如本文其他地方所描述的。

適合地，該結合分子特異性結合IL-33。這樣一種結合分子也稱為「IL-33結合分子」或「抗IL-33結合分子」。適合地，該結合分子特異性結合IL-33並且抑制或減弱IL-33活性，例如，抑制或減弱還原型IL-33活性、氧化型IL-33活性或兩者的活性。

適合地，該IL-33結合分子特異性結合還原型IL-33、氧化型IL-33或還原型IL-33和氧化型IL-33兩者。

適合地，該結合分子可以藉由結合處於還原或氧化形式的IL-33來減弱或抑制IL-33活性。適合地，其中該結合分子抑制或減弱還原型IL-33活性和氧化型IL-33活性，這藉由結合處於還原形式的IL-33（即藉由結合還原型IL-33）來實現。

適合地，該結合分子抑制或減弱redIL-33和oxIL-33兩者的活性，由此抑制或減弱ST2傳訊和RAGE傳訊兩者。

適合地，對氧化型IL-33的活性的抑制下調或關閉RAGE依賴性傳訊和/或RAGE介導的效應。適合地，該抑制下調或關閉RAGE-EGFR依賴性傳訊和/或RAGE-EGFR介導的效應。適合地，該抑制下調或關閉EGFR依賴性傳訊。適合地，該抑制下調或關閉EGFR介導的效應。具體而言，已經顯示，結合還原型IL-33的IL33拮抗劑可以阻止氧化型IL-33結合RAGE，由此抑制RAGE-EGFR傳訊。

適合地，對氧化型IL-33的活性的抑制下調或阻止RAGE-EGFR複合。適合地，該抑制下調或阻止EGFR激活，適合地是RAGE介導的EGFR激活。

適合地，該結合分子或其片段或變體可以按以下結合親和力（Kd）特異性結合redIL-33：小於5 x 10^-2 M、10^-2 M、5 x 10^-3 M、10^-3 M、5 x 10^-4 M、10^-4 M、5 x 10^-5 M、10^-5 M、5 x 10^-6 M、10^-6 M、5 x 10^-7 M、10^-7 M、5 x 10^-8 M、10^-8 M、5 x 10^-9 M、10^-9 M、5 x 10^-10 M、10^-10 M、5 x 10^-11 M、10^-11 M、5 x 10^-12 M、10^-12 M、5 x 10^-13 M、10^-13 M、5 x 10^-14 M、10^-14 M、5 x 10^-15 M、或10^-15 M。適合地，與redIL-33的結合親和力小於5 x 10^-14 M（即0.05 pM）。適合地，使用動力學排阻測定（KinExA）或BIACORE^TM ，適合地，使用KinExA、使用例如WO 2016/156440中描述的那些方案（參見例如實例11，將該文獻藉由引用以其整體併入本文）來測量結合親和力。以此結合親和力與redIL-33結合的結合分子似乎與redIL-33足夠緊密地結合，以阻止結合分子/redIL-33複合物在生物學相關的時間範圍內解離。不希望被理論束縛，認為此結合強度阻止了在體內抗體/抗原複合物降解之前釋放抗原，使得redIL-33不被釋放並且不能進行從redIL-33向oxIL-33的轉化。因此，結合分子當以此結合親和力與redIL-33結合時，可以藉由阻止oxIL-33的形成來抑制或減弱oxIL-33的活性，從而抑制RAGE傳訊。

在一些實例中，該結合分子或其片段可以按大於或等於10³ M^-1 sec^-1 、5 X 10³ M^-1 sec^-1 、10⁴ M^-1 sec^-1 或5 X 10⁴ M^-1 sec^-1 的結合速率（k(on)）特異性結合redIL-33。例如，本揭露之結合分子可以按大於或等於10⁵ M^-1 sec^-1 、5 X 10⁵ M^-1 sec^-1 、10⁶ M^-1 sec^-1 或5 X 10⁶ M^-1 sec^-1 或10⁷ M^-1 sec^-1 的結合速率（k(on)）結合redIL-33或其片段或變體。適合地，該k(on)速率大於或等於10⁷ M^-1 sec^-1 。

在一些實例中，該結合分子或其片段可以按小於或等於5 X 10^-1 sec^-1 、10^-1 sec^-1 、5 X 10^-2 sec^-1 、10^-2 sec^-1 、5 X l0^-3 sec^-1 或10^-3 sec^-1 的解離速率（k(off)）特異性結合redIL-33。例如，可以說，本揭露之結合分子按小於或等於5 X 10^-4 sec^-1 、10^-4 sec^-1 、5 X 10^-5 sec^-1 或10^-5 sec^-1 5 X 10^-6 sec^-1 、10^-6 sec^-1 、5 X 10^-7 sec^-1 或10^-7 sec^-1 的解離速率（k(off)）結合redIL-33或其片段或變體。適合地，該k(off)速率小於或等於10^-3 sec^-1 。IL-33係響應於炎症刺激迅速且以高濃度釋放的警報蛋介白素。在釋放到細胞外環境後約5-45 min，redIL-33被轉化成氧化型。因此，為了阻止redIL-33轉化為oxIL-33，本文所述之結合分子可以按該等k(on)和/或k(off)速率與redIL-33結合。不希望受理論約束，認為該等k(on)/k(off)速率確保了結合分子可以在redIL-33轉化成oxIL-33之前快速與redIL-33結合，由此減少oxIL-33的形成，由此減弱或抑制RAGE傳訊。

適合地，IL-33結合分子可以競爭性抑制IL-33與表1中引用的結合分子中的任一項結合： [表1]：示例性抗IL-33抗體VH和VL配對

配對	SEQ ID NO:	HCVR 胺基酸序列	SEQ ID NO:	LCVR 胺基酸序列
1	SEQ ID NO: 1	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISAIDQSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQKFMQLWGGGLRYPFGYWGQGTMVTVSS	SEQ ID NO: 19	SYVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGEGMGDKYAAWYQQKPGQSPVLVIYRDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCGVIQDNTGVFGGGTKLTVL
2	SEQ ID NO: 2	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFAMSWVRQAPGKGLELVSDLRTSGGSTYYADSVKGRLTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSHYSTSWFGGFDYWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 20	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGFSSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITNLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK
3	SEQ ID NO: 3	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLELIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNHFSLKLSSVTAADTAVYYCARSQYTSSWYGSFDIWGQGTMVTVSS	SEQ ID NO: 21	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISTWLAWFQQKPGKAPKLLIYAASTLQGGVPSRFSGSGSGPEFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPWTFGQGTKVEIK
4	SEQ ID NO: 4	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISSHNGNSHYVQKFQGRVSMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARHSYTTSWYGGFDYWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 22	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGFSSWLAWYQQKPGKAPQLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK
5	SEQ ID NO: 5	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYALTWVRQAPGKGLEWVSFISGSGGRPFYADSVKGRFTISRDNSKNMLYLQMNSLRAEDTAIYYCAKSLYTTSWYGGFDSWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 23	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVVSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPFTLGPGTKVDIK
6	SEQ ID NO: 6	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSTISGSGDNTYYADSVQGRFTISRGHSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPTYSRSWYGAFDFWGQGTMVTVSS	SEQ ID NO: 24	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPQLLIYAASRLQSGVPSRFWGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANNFPFTFGPGTKVDIK
7	SEQ ID NO: 7	EVQLVESGGNLEQPGGSLRLSCTASGFTFSRSAMNWVRRAPGKGLEWVSGISGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLSAEDTAAYYCAKDSYTTSWYGGMDVWGHGTTVTVSS	SEQ ID NO: 25	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIFSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQANSVPITFGQGTRLEIK
8	SEQ ID NO: 8	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMNWVRQAPGKGLEWVSSISRYSSYIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIGGMDVWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 26	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAVYDVHWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQTYDSSRWVFGGGTKLTVL
9	SEQ ID NO: 9	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMHWVRQAPGKGLEWVSSISARSRYHYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLATRHNAFDIWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 27	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVSWYQQLPGTAPKLLIYASNMRVIGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDDSQKALVFGGGTKLTVL
10	SEQ ID NO: 10	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMHWVRQAPGKGLEWVSSISARSSYIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLATRNNAFDIWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 28	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGRNAVNWYQQLPGTAPKLLIYASNMRVSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCWAWDDSQKVGVFGGGTKLTVL
11	SEQ ID NO: 11	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQAPGKGLEWVSSISAQSSHIYYADSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLATRQNAFDIWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 29	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGRNAVNWYQQLPGTAPKLLIYASNMRRSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSAWDDSQKVVVFGGGTKLTVL
12	SEQ ID NO: 12	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMHWVRQAPGKGLEWVSSISARSSYLYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLATRHVAFDIWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 30	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGTAPKLLIYASNMRRPGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCEAWDDSQKAVVFGGGTKLTVL
13	SEQ ID NO: 13	MRAWIFFLLCLAGRALAQVQLMQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPRNSNTDYNQKFKARVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARPLYYYLTSPPTLFWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 31	MRAWIFFLLCLAGRALADIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKTYPFTFGSGTKLEIKR
14	SEQ ID NO: 14	EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTLHGIRAAYDAFIIWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 32	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGINLSWYQQKPGQAPRLLIYGASHRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYSQSPPFTFGGGTKVEIK
15	SEQ ID NO: 15	EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSFYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTLHGIRAAYDAFIIWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 33	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGINLSWYQQKPGQAPRLLIYGASHRLTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYSQPPPFTFGGGTKVEIK
16	SEQ ID NO: 16	EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSFYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIHGIRAAYDAFIIWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 34	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGINLSWYQQKPGQAPRLLIYGASHRLTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYSQPPPFTFGGGTKVEIK
17	SEQ ID NO: 17	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGEDYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 35	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNQGWTFGGGTKVEIK
18	SEQ ID NO: 18	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVATISGGKTFTDYVDSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRANYGNWFFEVWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO: 36	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVAKYGLSLLNWFQQKPGQPPRLLIFAASNRGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPFTFGQGTKVEIK

已經報導了所有該等結合分子均結合IL-33，並且抑制或減弱ST-2傳訊。因此，與表1中揭露的抗體中的任一項競爭結合redIL-33的結合分子或其結合片段可以抑制或減弱ST-2傳訊。

如果結合分子或其片段以在某種程度上阻斷參考抗體與給定表位結合的程度與該表位結合，則稱該結合分子或其片段競爭性抑制參考抗體與該表位的結合。競爭性抑制可藉由本領域已知的任何方法確定，例如固相測定（諸如競爭ELISA測定）、解離增強鑭系螢光免疫測定（DELFIA®，珀金埃爾默公司（Perkin Elmer））和放射性配位基結合測定。例如，技術人員可以藉由使用體外競爭性結合測定，例如以下實例中詳細描述的HTRF測定，來確定結合分子或其片段是否競爭結合redIL-33。例如，技術人員可以用供體螢光團標記表1的重組抗體，並且將多個濃度的重組抗體與受體螢光團標記的redIL-33的固定濃度樣本混合。隨後，可以測量每個樣本內供體與受體螢光團之間的螢光共振能量轉移，以確定結合特徵。為了闡明競爭性結合分子，技術人員可以首先將各種濃度的測試結合分子與固定濃度的表1的標記抗體混合。當將混合物與標記的IL-33一起孵育時，與僅標記抗體的陽性對照相比，FRET訊號的減少指示競爭性結合IL-33。可以稱結合分子或其片段將參考抗體與給定表位的結合競爭性抑制至少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。

適合地，IL-33結合分子可以競爭性地抑制IL-33與結合分子33_640087-7B的結合（如WO 2016/156440中所述）。適合地，WO 2016/156440揭露了33_640087-7B以特別高的親和力與redIL-33結合並且減弱了ST-2和RAGE依賴性IL-33傳訊。因此，競爭性抑制IL-33與結合分子33_640087-7B的結合的結合分子極有可能抑制redIL-33和oxIL-33傳訊兩者，因此特別適用於本文所述之方法。

在一些實例中，抑制或減弱IL-33活性的結合分子選自以下抗IL-33抗體中的任一項：33_640087-7B（如WO 2016/156440中所述）、稱為埃托克單抗（Etokimab）的ANB020（如WO 2015/106080中所述）、9675P（如US 2014/0271658中所述）、A25-3H04（如US 2017/0283494中所述）、Ab43（如WO 2018/081075中所述）、IL33-158（如US 2018/0037644中所述）、10C12.38.H6、87Y.581 lgG4（如WO 2016/077381中所述）或其結合片段，將該等文獻各自藉由引用併入本文。在表1中引用了所有該等抗體。

適合地，該結合分子或抗原結合片段包含選自表1的可變重結構域（VH）和可變輕結構域（VL）配對的互補決定區（CDR）。配對1對應於WO 2016/156440中所述之33_640087-7B的VH和VL結構域序列。配對2-7對應於US 2014/0271658中所述之抗體的VH和VL結構域序列。配對8-12對應於US 2017/0283494中所述之抗體的VH和VL結構域序列。配對13對應於WO 2015/106080中所述之ANB020的VH和VL結構域序列。配對14-16對應於WO 2018/081075中所述之抗體的VH和VL結構域序列。配對17對應於US 2018/0037644中所述之IL33-158的VH和VL結構域序列。配對18對應於WO 2016/077381中所述之10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4的VH和VL結構域序列。

適合地，IL-33結合分子係包含以下的抗體或抗原結合片段：包含SEQ ID NO: 1的序列的重鏈可變區（HCVR）的互補決定區（CDR），和包含SEQ ID NO: 19的序列的輕鏈可變區（LCVR）的互補決定區（CDR）。該等CDR對應於源自33_640087-7B的CDR（如WO 2016/156440中所述），33_640087-7B結合還原型IL-33並抑制其轉化為氧化型IL-33。在WO 2016/156440中充分描述了33_640087-7B，將該文獻藉由引用併入本文。因此，此抗體可以特別適用於本文所述之方法中以抑制或減弱ST-2和RAGE傳訊兩者。

適合地，IL-33結合分子係包含以下的抗體或抗原結合片段：包含SEQ ID NO: 7的序列的重鏈可變區（HCVR）的互補決定區（CDR），和包含SEQ ID NO: 25的序列的輕鏈可變區（LCVR）的互補決定區（CDR）。該等CDR對應於源自抗體9675P的那些CDR。在US 2014/0271658中充分描述了9675P，將該文獻藉由引用併入本文。

適合地，IL-33結合分子係包含以下的抗體或抗原結合片段：包含SEQ ID NO: 11的序列的重鏈可變區（HCVR）的互補決定區（CDR），和包含SEQ ID NO: 29的序列的輕鏈可變區（LCVR）的互補決定區（CDR）。該等CDR對應於源自抗體A25-3H04的那些CDR。在US2017/0283494中充分描述了A25-3H04，將該文獻藉由引用併入本文。

適合地，IL-33結合分子係包含以下的抗體或抗原結合片段：包含SEQ ID NO: 13的序列的重鏈可變區（HCVR）的互補決定區（CDR），和包含SEQ ID NO: 31的序列的輕鏈可變區（LCVR）的互補決定區（CDR）。該等CDR對應於源自抗體ANB020的那些CDR。在WO 2015/106080中充分描述了ANB020，將該文獻藉由引用併入本文。

適合地，IL-33結合分子係包含以下的抗體或抗原結合片段：包含SEQ ID NO: 16的序列的重鏈可變區（HCVR）的互補決定區（CDR），和包含SEQ ID NO: 34的序列的輕鏈可變區（LCVR）的互補決定區（CDR）。該等CDR對應於源自抗體Ab43的那些CDR。在WO 2018/081075中充分描述了Ab43，將該文獻藉由引用併入本文。

適合地，IL-33結合分子係包含以下的抗體或抗原結合片段：包含SEQ ID NO: 17的序列的重鏈可變區（HCVR）的互補決定區（CDR），和包含SEQ ID NO: 35的序列的輕鏈可變區（LCVR）的互補決定區（CDR）。該等CDR對應於源自抗體IL33-158的那些CDR。在US 2018/0037644中充分描述了IL33-158，將該文獻藉由引用併入本文。

適合地，IL-33結合分子係包含以下的抗體或抗原結合片段：包含SEQ ID NO: 18的序列的重鏈可變區（HCVR）的互補決定區（CDR），和包含SEQ ID NO: 36的序列的輕鏈可變區（LCVR）的互補決定區（CDR）。該等CDR對應於源自抗體10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4的那些CDR。在WO 2016/077381中充分描述了10C12.38.H6. 87Y.581 lgG4，將該文獻藉由引用併入本文。

適合地，技術人員已知本領域中可用於鑒定抗體或其抗原結合片段的重鏈和輕鏈可變區內的CDR之方法。適合地，技術人員可以例如進行基於序列的注釋。CDR之間的區域通常是高度保守的，並且因此，可以使用邏輯規則來確定CDR位置。技術人員可以使用用於常規抗體的一組基於序列的規則（Pantazes和Maranas, Protein Engineering, Design and Selection [蛋白質工程化、設計和選擇], 2010），可替代地或另外，他還可以基於多序列比對來完善規則。可替代地，技術人員可以使用BLAST +的BLASTP指令將抗體序列與根據Kabat、Chothia或IMGT方法操作的公眾可獲得的數據庫進行比較，以鑒定最類似的注釋序列。該等方法中的每一種均設計了獨特的殘基編號方案，根據該編號方案對高變區殘基進行編號，然後根據某些關鍵位置確定六個CDR中的每一個的起始和結束。在例如與最類似的注釋序列比對後，可以將CDR從注釋序列外推至非注釋序列，從而鑒定CDR。合適的工具/數據庫係：例如，Kabat數據庫、Kabatman、Scalinger、IMGT、Abnum。

適合地，IL-33治療劑係包含選自表1的可變重結構域（VH）和可變輕結構域（VL）配對的抗體或抗原結合片段。

因此，適合地，IL33抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 1的序列的VH結構域和SEQ ID NO: 19的序列的VL結構域。

因此，適合地，IL33抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 7的序列的VH結構域和SEQ ID NO: 25的序列的VL結構域。

因此，適合地，IL33抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 11的序列的VH結構域和SEQ ID NO: 29的序列的VL結構域。

因此，適合地，IL33抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 13的序列的VH結構域和SEQ ID NO: 31的序列的VL結構域。

因此，適合地，IL33抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 16的序列的VH結構域和SEQ ID NO: 34的序列的VL結構域。

因此，適合地，IL33抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 17的序列的VH結構域和SEQ ID NO: 35的序列的VL結構域。

因此，適合地，IL33抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 18的序列的VH結構域和SEQ ID NO: 36的序列的VL結構域。

因此，適合地，治療劑係結合分子，該結合分子可以包含例如獨立地選自SEQ ID NO: 1、7、11、13、16、17和18的重鏈可變區中的3個CDR。

適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子包含根據SEQ ID NO: 1的重鏈可變區中的3個CDR。

適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子可以包含獨立地選自SEQ ID NO: 19、25、29、31、34、35和36的輕鏈可變區中的3個CDR。

適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子包含根據SEQ ID NO: 19的輕鏈可變區中的3個CDR。

因此，適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子可以包含例如獨立地選自SEQ ID NO: 1、7、11、13、16、17和18的重鏈可變區中的3個CDR，以及例如獨立地選自SEQ ID NO: 19、25、29、31、34、35和36的輕鏈可變區中的3個CDR。

因此，適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子包含根據SEQ ID NO: 1的重鏈可變區中的3個CDR，以及根據SEQ ID NO: 19的輕鏈可變區中的3個CDR。

因此，適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子可以包含具有VH CDR 1-3的可變重結構域（VH）和可變輕結構域（VL），VH CDR 1-3分別具有SEQ ID NO: 37、38和39的序列，其中一個或多個VHCDR具有3個或更少的單個胺基酸取代、插入和/或缺失。

因此，適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子包含VH結構域，該VH結構域分別包含SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39的VHCDR 1-3。

因此，適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子包含VH結構域，該VH結構域包含分別由SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39組成的VHCDR 1-3。

因此，適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子可以包含具有VL CDR 1-3的可變重結構域（VH）和可變輕結構域（VL），VL CDR 1-3分別具有SEQ ID NO: 40、41和42的序列，其中一個或多個VLCDR具有3個或更少的單個胺基酸取代、插入和/或缺失。

因此，適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子包含VL結構域，該VL結構域分別包含SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 42的VLCDR 1-3。

因此，適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子包含VL結構域，該VL結構域包含分別由SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 42組成的VLCDR 1-3。

因此，適合地，IL-33治療劑係結合分子，該結合分子可以包含具有SEQ ID NO: 37的序列的VHCDR1、具有SEQ ID NO: 38的序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO: 39的序列的VHCDR3、具有SEQ ID NO: 40的序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO: 41的序列的VLCDR2、以及具有SEQ ID NO: 42的序列的VLCDR3。

因此，適合地，IL-33治療劑係包含VH和VL的抗體或其結合片段，其中VH具有與根據SEQ ID NO: 1、7、11、13、16、17和18的VH具有至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。

因此，適合地，IL-33治療劑係包含VH和VL的抗體或其結合片段，其中VH具有與根據SEQ ID NO: 1的VH具有至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。

因此，適合地，IL-33治療劑係包含VH和VL的抗體或其結合片段，其中以上揭露的VH具有以下序列，其中框架中的1、2、3或4個胺基酸缺失、被不同胺基酸插入和/或獨立地替換。

因此，適合地，IL-33治療劑係包含VH和VL的抗體或其結合片段，其中VL具有與根據SEQ ID NO: 19、25、29、31、34、35和36的VL具有至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。

因此，適合地，IL-33治療劑係包含VH和VL的抗體或其結合片段，其中VL具有與根據SEQ ID NO: 19的VL具有至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。

因此，適合地，IL-33治療劑係包含VH和VL的抗體或其結合片段，其中以上揭露的VL具有以下序列，其中框架中的1、2、3或4個胺基酸獨立地缺失、被不同胺基酸插入和/或替換。

因此，適合地，IL-33治療劑係包含VH和VL的抗體或其結合片段，其中VH具有與根據SEQ ID NO: 1、7、11、13、16、17和18的VH具有至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列，並且VL具有與根據SEQ ID NO: 19、25、29、31、34、35和36的VL具有至少90%，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。

因此，適合地，IL-33治療劑係包含VH和VL的抗體或其結合片段，其中VH具有由SEQ ID NO: 1、7、11、13、16、17和18組成的胺基酸序列，並且VL具有由SEQ ID NO: 19、25、29、31、34、35和36組成的胺基酸序列。

因此，適合地，IL-33治療劑係包含VH和VL的抗體或其結合片段，其中VH具有由SEQ ID NO: 1組成的胺基酸序列，並且VL具有由SEQ ID NO: 19組成的胺基酸序列。

適合地，該結合分子可以選自：抗體、其抗原結合片段、適配位基、參考抗體分子的至少一個重鏈或輕鏈CDR、以及來自一個或多個參考抗體分子的至少六個CDR。

適合地，IL-33治療劑係抗體或其結合片段。適合地，IL-33治療劑係抗IL-33抗體或其結合片段。適合地，抗IL-33抗體或其結合片段特異性結合IL-33，尤其是還原型IL-33或氧化型IL-33。

適合地，IL-33治療劑適合地藉由抑制氧化型IL-33的形成來抑制氧化型IL-33的活性。適合地，IL-33治療劑抑制還原型IL-33轉化成氧化型IL-33。

適合地，IL-33結合分子或其抗原結合片段係還原型IL-33結合分子或其抗原結合片段。換句話說，IL-33結合分子或其抗原結合片段抑制或減弱還原型IL-33的活性。適合地，減弱係藉由結合還原型IL-33來進行。適合地，藉由結合還原型IL-33，該結合分子或其抗原結合片段還適合地藉由阻止還原型IL-33轉化成氧化型IL-33形式來減弱氧化型IL-33的活性。

適合地，對氧化型IL-33的活性的抑制下調或關閉RAGE依賴性傳訊和/或RAGE介導的效應。

適合地，IL-33治療劑具有以上所述之所有抑制作用。適合地，還原型IL-33治療劑具有以上所述之所有抑制作用。

適合地，IL-33治療劑係還原型IL-33結合分子或其片段。適合地，IL-33治療劑係還原型IL-33抗體或其結合片段，適合地是抗還原型IL33抗體或其結合片段。

適合地，治療劑可以藉由結合ST-2來抑制或減弱IL-33傳訊。此類治療劑在本文稱為「ST-2抑制劑」。ST2抑制劑可以是本領域已知的任何此類抑制劑，例如GSK3772847（WO 2013/165894中所述）和RG6149（WO 2013/173761），將該等文獻藉由引用併入本文。ST-2抑制劑可以與抑制或減弱RAGE傳訊的第二治療劑組合使用。在需要潛在病理學的情況下，使用不同治療劑來抑制ST-2傳訊和RAGE傳訊可能對於遞送不同劑量以抑制這兩個通路係有利的。 配製物

在本文所述之醫學用途和方法中的治療劑可以按藥物組成物的形式投與於患者。

適合地，本文對「治療劑」的任何引用還可以指藥物組成物，該藥物組成物包含例如減弱或抑制redIL-33和/或oxIL-33的活性的化學抑制劑或抗體或其抗原結合片段。適合地，藥物組成物可以包含一種或多種治療劑。

適合地，在本文的醫學用途和治療方法方面，可以按用於體內治療腎臟損傷（適合地糖尿病性腎病）的藥學有效量投與治療劑。

適合地，「藥學有效量」或「治療有效量」的所述一種或多種治療劑應意指一個量，該量足以實現對redIL-33和oxIL-33活性的有效抑制，並且足以實現益處，例如改善如在本文的醫學用途/方法中列舉的疾病或病症的症狀。

適合地，一種或多種治療劑或其藥物組成物可以根據前述治療方法/醫學用途，按足以產生治療效果的量投與於人或其他動物。

適合地，一種或多種治療劑或其藥物組成物可以按常規劑型來投與於這樣的人或其他動物，該劑型係藉由根據已知技術，將一種或多種治療劑與常規藥學上可接受的載體或稀釋劑相組合來製備的。

熟悉該項技術者應認識到，藥學上可接受的載體或稀釋劑的形式和特徵係藉由與其組合的一種或多種活性成分的量、投與途徑以及其他熟知變數來確定。

可以與載體材料組合以產生單一劑型的一種或多種治療劑的量將根據所治療的受試者和具體的投與方式而變化。適合地，藥物組成物可以以單次劑量、多次劑量或經確定時間段以輸注形式投與。適合地，也可以調整劑量方案以提供最佳期望反應（例如，治療性或防治性反應）。

適合地，將配製一種或多種治療劑，以有助於投與並且促進該一種或多種治療劑的穩定性。

適合地，藥物組成物被配製為包含藥學上可接受的、無毒性的、無菌的載體，諸如生理鹽水、無毒性的緩衝劑、防腐劑等。適合地，藥物組成物可以包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液以及乳液。用於本文揭露的治療方法的適合配製物描述於Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明頓氏藥物科學]（麥克出版公司（Mack Publishing Co.））第16版（1980）。

適合地，用於可注射用途的藥物組成物可以包括無菌水溶液（在可溶於水時）或分散液和用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。在這樣的情況下，該組成物必須是無菌的並且必須具有達到容易注射的程度的流動性。在製造和存儲條件下它應當係穩定的，並且將被保存以防止微生物（諸如細菌和真菌）的污染作用。適合地，載體可以是含有以下物質的溶劑或分散介質：例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其合適的混合物。可以例如藉由使用塗層（諸如卵磷脂）、藉由在分散液的情況下維持所需顆粒大小以及藉由使用表面活性劑來維持適當的流動性。適合地，阻止微生物的作用可以藉由各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、三氯三級丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來實現。在許多情況下，在藥物組成物中適合地包括等滲劑，例如，糖、多元醇（諸如甘露醇、山梨醇）或氯化鈉。可以藉由在組成物中包括延遲吸收的試劑（例如，單硬脂酸鋁和明膠）來實現可注射組成物的延長吸收。

適合地，無菌可注射溶液可以藉由在具有本文所列舉的成分之一或組合的適當溶劑中併入所需量的活性化合物（例如，本文所定義的一種或多種治療劑，單獨地或與其他活性劑組合），視需要隨後過濾滅菌來製備。通常，藉由將活性化合物併入無菌媒劑來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質以及來自以上列舉的所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，製備方法可以是真空乾燥和冷凍乾燥，該等方法產生活性成分的粉末以及來自其以前的無菌過濾溶液的任何其他期望成分。

將一種或多種治療劑或其藥物組成物投與至有需要的受試者之方法係熟悉該項技術者所熟知的或熟悉該項技術者容易確定的。

適合地，一種或多種治療劑或其藥物組成物的投與途徑可以是例如口服、腸胃外、藉由吸入或局部投與。適合地，如本文使用的術語腸胃外包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸或經陰道投與。

適合地，可以按可接受的劑型，包括例如膠囊、片劑、水性懸浮液或溶液，口服投與一種或多種治療劑或其藥物組成物。

適合地，可以藉由鼻氣霧劑或吸入劑投與一種或多種治療劑或其藥物組成物。使用苄醇或其他合適的防腐劑、提高生體可用率的吸收促進劑和/或其他常規增溶劑或分散劑，這樣的組成物可以作為鹽水中的溶液來製備。

適合地，腸胃外配製物可以是單次推注劑量，輸注或上樣推注劑量，隨後是維持劑量。該等組成物可以按特定的固定或可變的間隔投與，例如每天一次，或基於「根據需要」投與。

適合地，將一種或多種治療劑或其藥物組成物直接遞送至疾病或病症的部位，例如腎臟，由此增加患病組織對治療劑的暴露。適合地，將一種或多種治療劑或其藥物組成物直接投與至疾病或病症的部位。因此，適合地，將一種或多種治療劑或其藥物組成物投與至腎臟損傷的部位。

因此，適合地，將一種或多種治療劑或其藥物組成物配製為液體組成物。

適合地，可以將上文所述之用於製備本文所述之藥物組成物的組分以套組（kit）的形式包裝和出售。此種套組適合地具有標籤或包裝說明書以指示相關藥物組成物可用於治療患有或傾向於患有疾病或障礙的受試者。

適合地，將用於液體配製物的組分處理，填充至容器諸如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶中，並根據本領域中已知之方法密封在無菌條件下。適合地，該等容器可以被加壓，適合地，它們可以是氣霧劑容器。該等容器可以包括在如以上所述之套組中。適合地，套組可以進一步包含吸入器裝置。適合地，吸入器裝置包含本文所述之一種或多種治療劑或藥物組成物，或係可操作的以包含如以上所述之容器，該容器可以包含本文所述之一種或多種治療劑或藥物組成物。 概述

除非另外說明，本發明之實踐將使用本領域技術範圍內的化學、生物化學、分子生物學、免疫學和藥理學的常規方法。此類技術在文獻中得到充分解釋。參見例如參考文獻（Gennaro (2000)Remington: The Science and Practice of Pharmacy. [雷明頓：藥物科學與實踐], 第20版, ISBN: 0683306472；Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course [分子生物學技術：密集實驗課], （Ream等人編輯, 1998, 學術出版社（Academic Press）；Methods In Enzymology [酶學方法]（S. Colowick和N. Kaplan編輯, 學術出版社公司（Academic Press, Inc.））；Handbook of Experimental Immunology [實驗免疫學手冊], 卷I-IV（D.M. Weir和C.C. Blackwell, 編輯, 1986, 英國布萊克威爾出版公司（Blackwell Scientific Publications））；Sambrook等人 (2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], 第3版（冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press））；Handbook of Surface and Colloidal Chemistry [表面和膠體化學手冊]（Birdi, K.S.編輯, CRC出版社（CRC Press）, 1997）；Ausubel等人（編輯）(2002)Short protocols in molecular biology [精編分子生物學實驗指南], 第5版（Current Protocols[當代實驗指南]）；PCR (Introduction to Biotechniques Series) [PCR （生物技術導論系列）], 第2版（Newton和Graham編輯, 1997, 施普林格出版社（Springer Verlag））。

術語「包含（comprising）」涵蓋「包括（including）」以及「由……組成（consisting）」，例如，組成物「包含」X可以僅由X組成，或可以包括其他物質，例如X + Y。

相對於數值x 的術語「約」係視需要的，並且意指例如x + 10%。

詞語「基本上」並不排除「完全地」，例如「基本上不含」Y的組成物可以完全不含Y。必要時，詞語「基本上」可以從本發明之定義中省略。

提及兩個核苷酸序列之間的序列同一性百分比意指當進行比對時，在比較兩個序列時，核苷酸或胺基酸的百分比係相同的。可以使用本領域已知的軟體程式，例如Current Protocols in Molecular Biology [當前分子生物學方法]（F.M. Ausubel等人編輯, 1987）增刊30中的部分7.7.18所述之那些，確定此比對以及同源性或序列同一性百分比。藉由Smith-Waterman同源性搜索演算法，使用空位開放罰分為12且空位延伸罰分為2的仿射空位搜索（BLOSUM 62矩陣）確定較佳的比對。Smith-Waterman同源性搜索演算法揭露於Smith和Waterman (1981)Adv. Appl. Math. [應用數學進展] 2:482-489中。

除非明確聲明，包括多個步驟的製程或方法可以在該方法開始或結束時包括另外的步驟，或可以包括另外的插入步驟。而且，如果適當，步驟可以組合、省略或以替代順序進行。

本文描述了本發明之不同實施方式。應當理解，各個實施方式中指定的特徵可以與其他指定特徵組合以提供另外的實施方式。具體而言，本文突出顯示為係合適的、典型的或較佳的實施方式可以彼此組合（除了當它們係相互排的時）。實施方式

實施方式1針對治療腎臟損傷之方法，該方法包括投與抑制ST2傳訊和RAGE傳訊兩者的治療，其中所述治療包括一種或多種治療劑，例如1種或2種治療劑。

實施方式2針對根據實施方式1所述之方法，該方法減弱或抑制還原型IL-33蛋白（redIL-33）的活性，並且由此抑制ST2傳訊。

實施方式3針對根據實施方式1或2所述之方法，該方法減弱或抑制氧化型IL-33蛋白（oxIL-33）的活性，並且由此抑制RAGE傳訊。

實施方式4針對根據實施方式1至3中任一項所述之方法，其中該腎臟損傷包括炎症。

實施方式5針對根據實施方式4所述之方法，其中該腎臟損傷係炎性的。

實施方式6針對根據實施方式4或5所述之方法，其中該腎臟損傷選自糖尿病性腎病、纖維化、腎小球腎炎（例如非增生性（例如輕微病變性腎小球腎炎、膜型腎小球腎炎、局灶性節段性腎小球硬化）或增生性（例如IgA腎病、膜性增生性腎小球腎炎、感染後腎小球腎炎、和急進性腎小球腎炎[例如古巴士德氏症候群和血管炎性障礙{其包括韋格納肉芽腫病和顯微鏡下多血管炎}]）、全身性紅斑狼瘡、蛋白尿、單側輸尿管梗阻、奧爾波特症候群、多囊腎病（PCKD）、高血壓性腎小球硬化症、慢性腎小球硬化症、慢性梗阻性尿路病、慢性腎小管-間質腎炎和缺血性腎病。

實施方式7針對根據實施方式1至6中任一項所述之方法，其中該腎臟損傷係糖尿病性腎病。

實施方式8針對根據實施方式1至7中任一項所述之方法，其中該一種或多種治療劑獨立地選自化學抑制劑以及抗體或其抗原結合片段。

實施方式9針對根據實施方式8所述之方法，其中該一種或多種治療劑包含抗體或其抗原結合片段。

實施方式10針對根據實施方式8或9所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合IL-33。

實施方式11針對根據實施方式10所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段具有選自表1的可變重結構域（VH）和可變輕結構域（VL）配對的互補決定區（CDR）。

實施方式12針對根據實施方式10或11所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合redIL-33，並且減弱或抑制redIL-33的活性，由此抑制ST2傳訊。

實施方式13針對根據實施方式10至12中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段阻止氧化型IL-33結合RAGE，由此抑制RAGE-EGFR傳訊。

實施方式14針對根據實施方式10至13中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 pM、或小於或等於10 pM，例如小於或等於1 pM，例如0.5 pM，尤其是0.05 pM的結合親和力（例如當使用KinExA進行測量時）結合redIL-33。

實施方式15針對根據實施方式10至14中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段以大於或等於10⁵ M^-1 sec^-1 、5 X 10⁵ M^-1 sec^-1 、10⁶ M^-1 sec^-1 、或5 X 10⁶ M^-1 sec^-1 或10⁷ M^-1 sec^-1 、尤其是大於或等於10⁷ M^-1 sec^-1 的k(on)結合redIL-33。

實施方式16針對根據實施方式10至15中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於5 X 10^-1 sec^-1 、10^-1 sec^-1 、5 X 10^-2 sec^-1 、10^-2 sec^-1 、5 X l0^-3 sec^-1 或10^-3 sec^-1 、尤其是小於或等於10^-3 sec^-1 的k(off)結合redIL-33。

實施方式17針對根據實施方式10至16中任一項所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段減弱或抑制oxIL-33的活性，並且由此抑制RAGE傳訊。

實施方式18針對根據實施方式9至17中任一項所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 37的序列的VHCDR1、具有SEQ ID NO: 38的序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO: 39的序列的VHCDR3、具有SEQ ID NO: 40的序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO: 41的序列的VLCDR2、和具有SEQ ID NO: 42的序列的VLCDR3。

實施方式19針對根據實施方式9至18中任一項所述之方法，其中該抗體或所述抗體或其抗原結合片段的抗原結合VH和VL分別包含與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 19具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。

實施方式20針對根據實施方式19所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 1的序列的VH和具有SEQ ID NO: 19的序列的VL。

實施方式21針對根據實施方式8至20中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係人抗體、嵌合抗體、和人源化抗體。

實施方式22針對根據實施方式8至21中任一項所述之方法，其中該抗體或者該抗體或其抗原結合片段係天然存在的抗體、scFv片段、Fab片段、F(ab')2片段、微型抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體或單鏈抗體。

實施方式23針對根據實施方式8至22中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係單株抗體。

實施方式24針對根據實施方式1至23中任一項所述之方法，其中使用了至少兩種治療劑，例如其中一種治療劑抑制ST2傳訊，並且第二種治療劑抑制RAGE傳訊，例如其中該治療劑阻止一種或多種配位基與一種或多種受體結合。

實施方式25針對根據實施方式1至24中任一項所述之方法，其中使用了一種種治療劑，其中該治療劑抑制ST2和RAGE傳訊兩者，例如其中該藥劑阻止該配位基與這兩種受體結合。

實施方式26針對根據任一前述實施方式所述之方法，其中該RAGE傳訊係RAGE-EGFR傳訊。

實施方式27針對根據實施方式26所述之方法，其中抑制RAGE-EGFR傳訊下調或抑制RAGE-EGFR介導的效應。

實施方式28針對根據實施方式27所述之方法，其中該RAGE-EGFR介導的效應係異常上皮重塑。

實施方式29針對用於治療腎臟損傷或用於在製造用於治療腎臟損傷的藥物中使用的治療劑，該治療劑抑制或減弱還原型IL-33的活性，從而抑制或減弱ST2傳訊，其中該治療進一步包括抑制或減弱氧化型IL-33的活性，從而抑制或減弱RAGE傳訊。

實施方式30針對用於治療腎臟損傷或用於在製造用於治療腎臟損傷的藥物中使用的治療劑，該治療劑抑制或減弱氧化型IL-33的活性，從而抑制或減弱RAGE傳訊，其中該治療進一步包括抑制或減弱還原型IL-33的活性，從而抑制或減弱ST2傳訊。

實施方式31針對抑制或減弱還原型IL-33的活性從而抑制或減弱ST2傳訊的治療劑、以及抑制或減弱氧化型IL-33的活性從而抑制或減弱RAGE傳訊的治療劑，這兩種治療劑用於治療腎臟損傷，或用於在製造用於治療腎臟損傷的藥物中使用。

實施方式32針對用於治療腎臟損傷或用於在製造用於治療腎臟損傷的藥物中使用的治療劑，該治療劑抑制或減弱還原型IL-33和氧化型IL-33的活性，從而抑制或減弱ST2傳訊和RAGE傳訊。

實施方式33針對用於根據實施方式29至32中任一項所述使用或使用的治療劑，該治療劑係抗體或其抗原結合片段。

實施方式34針對用於根據實施方式33所述使用的治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段如實施方式10至23中任一項所表徵。

實施方式35針對用於根據實施方式29至34中任一項所述使用的治療劑，其中該腎臟損傷如實施方式4至7中任一項所表徵。

實施方式36針對用於根據實施方式29至35中任一項所述使用的治療劑，其中該RAGE傳訊係RAGE-EGFR傳訊。

實施方式37針對用於根據實施方式29至36中任一項所述使用的治療劑，其中抑制或減弱RAGE-EGFR傳訊下調或抑制RAGE-EGFR介導的效應。

實施方式38針對用於根據實施37中任一項所述使用的治療劑，其中該RAGE-EGFR介導的效應係異常上皮重塑。

實施方式39針對根據實施方式9至26中任一項所述之方法，或針對用於據實施方式31至38中任一項所述使用的治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段與33_640087-7B競爭結合redIL-33，例如，如藉由均相時間分辨螢光所確定的。實例 實例 1 - 評估 IL-33 生物學在人糖尿病性腎病中的作用

已經顯示，在腎臟疾病的背景下，一系列炎症介質上調（Thomas等人, Nat reviews Dis Primers.[自然綜述疾病導論], 2015）。使用以下所述之方法來確定已知涉及腎臟疾病的其他炎症介質中白介素-33（IL-33）的表現水平如何分級。

分析了來自患有糖尿病性腎病的患者的三個不同組群的公開的RNA轉錄組材料（圖1：歐洲腎臟cDNA庫組群（圖1A），Hu 2013組群（圖1B）、和Woroniecka, 2013組群（圖1C））。測量腎小球和腎小管間質組織樣本內的RNA表現水平。根據標準化之方法學，基於RNA序列計數讀數進行轉錄組分析（Ju等人 2013；Woroniecka等人 2013）。

從所有三個組群發現，在患有糖尿病性腎病（DN）的受試者的腎臟中，IL-33係最高過表現的細胞介素之一。在DN腎臟中，在腎小球和腎小管間質兩者中，IL-33表現上調（圖1）。出人意料地，發現在至少一個組群的糖尿病性腎病患者的腎小球中，IL-33同源受體ST2（IL1RL1）的表現下調（圖2B）。先前已經顯示，與體內的其他組織相比，在腎臟（主要是腎皮質）中，ST2以比較高的水平表現（圖2A）。這表明可以存在某種補償機制以下調ST2表現，以阻止由於升高水平的IL-33產生的過度活性。 實例 2 - 評估 IL-33 在腎臟疾病的臨床前模型中的腎臟中的水平

使用以下所述之方法來評估在腎臟疾病的一系列臨床前模型中，IL-33表現的水平是否升高。在源自II型糖尿病性腎病（T2DN）小鼠模型（獲得自傑克遜實驗室（Jackson laboratory）的db/db小鼠，目錄號000697，它們已經進行單側腎切除（unx））、高血壓性腎病（HN）小鼠模型（藉由手術干預移除BL6小鼠的5/6腎元質量獲得的5/6 Npx小鼠（參見Wang等人 J. Vis. Exp.[視覺化實驗雜誌], 129; e55825; 2017））、梗阻性腎病小鼠模型（ON）（獲得自對BL6小鼠進行的手術單側輸尿管梗阻（參見Hesketh等人 J. Vis. Exp.[視覺化實驗雜誌], 94; e52559; 2014））和1型糖尿病性腎病（T1DN）的小鼠模型（使用化學消融與STZ，參見Chow等人 69; 73-80; Kidney International [國際腎臟期刊], 2006）的腎臟樣本中，將IL-33 mRNA表現水平進行量化。

按照公認的方案進行疾病建模（參見例如Wang等人 J. Vis. Exp.[視覺化實驗雜誌], 129; e55825; 2017；Hesketh等人 J. Vis. Exp.[視覺化實驗雜誌], 94; e52559; 2014；Chow等人 69; 73-80; Kidney International [國際腎臟期刊], 2006；Zhou等人 Am J Transl Res [美國翻譯研究雜誌] 8: 1339-54, 2016；Yang等人 Drug Discov Today Dis Models [今日藥物發現：疾病模型], 7; 13-19; 2010）。

對於T2DN小鼠，在具有單側腎切除的db/db小鼠（db/db + unx）中，在8週齡或在16週齡的db/db小鼠中，測定相對的IL-33腎臟表現水平。對於T1DN小鼠，在12週時，在使用STZ和不使用STZ的小鼠中，測定相對的IL-33腎臟表現水平。對於HN小鼠，在6週時，在5/6 NPX後的小鼠和假手術小鼠中，測定相對的IL-33腎臟表現水平。對於ON小鼠，在7天時，在UUO小鼠和假手術對照中，測定相對的IL-33腎臟表現水平。製備樣本用於根據Zhou等人 Am J Transl Res [美國翻譯研究雜誌] 8: 1339-54, 2016所述進行轉錄組分析。在每個組群中，將表現的相對水平歸一化為GAPDH的相對表現水平。

如圖3中所示，在 (a) T2DN db/db unx小鼠，(b) 使用STZ的T1DN小鼠，(c) 具有5/6 NPX的HN小鼠和 (d) 具有UUO的ON小鼠中，歸一化的IL-33表現升高。在每個組群中，將表現水平歸一化為GAPDH。該等結果顯示，與對照相比，在腎臟疾病的所有臨床前模型中，IL-33在腎臟中的表現水平升高。 實例 3 - 在腎臟疾病的模型中， RAGE 上調

先前已經描述了存在兩種生物活性形式的IL-33，即redIL-33和oxIL-33。如WO 2016/156440中所報導，還原型IL-33（redIL-33）顯示為經由ST2傳訊通路進行傳訊的同種型。藉由在天然半胱胺酸之間形成二硫鍵而將red-IL33轉化成氧化型（oxIL-33）被提出為redIL-33傳訊的關閉機制。然而，在WO 2016/156440中，發明人表徵了新的傳訊通路，通過該通路，oxIL-33經由RAGE刺激傳訊（參見例如WO 2016/156440中的圖58）。

假定存在RAGE傳訊通路，確定在腎臟疾病的臨床前模型中RAGE表現譜的變化。

使用實例2中所述之相同模型和方法，將RAGE表現進行量化。如圖4中所示，在 (a) T2DN db/db unx小鼠，(b) 使用STZ的T1DN小鼠，(c) 具有5/6 NPX的HN小鼠和 (d) 具有UUO的ON小鼠中，歸一化的RAGE表現升高。在每個組群中，將表現水平歸一化為GAPDH。該等結果顯示，在腎臟疾病的所有測試的臨床前模型中，RAGE表現上調。 實例 4 - RAGE 和 ST2 傳訊促成體內腎臟功能障礙

由於在CKD的臨床前模型中觀察到RAGE和IL-33這兩者表現水平升高，所以確定了涉及該等分子的傳訊通路促成腎臟疾病的病理學。

簡言之，在以上所述之db/db單側腎切除小鼠模型中，研究ST2和RAGE介導的細胞毒性效應。在單獨的小鼠中，阻斷了ST2和RAGE依賴性傳訊。藉由監測尿液中白蛋白的濃度來評估腎臟受損（蛋白尿）。蛋白尿被測量為：尿液中歸一化為肌酸酐的濃度（以補償尿液濃度變化）的白蛋白的量。此值稱為白蛋白:肌酸酐比率（UACR）。

如圖5中所示進行該研究。簡言之，在第7週，將小鼠進行單側腎切除，以加速腎臟受損。向小鼠給予10 mg/Kg 3x/週的抗RAGE hu-IgG1、抗ST2 muIgG1或用作陰性對照的huNUP228 IgG1。在第10、13和15天時收集尿液樣本，並且使用Cobas®免疫化學測定白蛋白和肌酸酐水平。還藉由使用系膜擴張、細胞核的缺乏和減小毛細血管腔的空間的內科病理學評分來測定腎小球受損。

結果顯示，阻斷ST2和RAGE傳訊兩者都導致UACR評分的顯著降低（圖6和圖7）。圖8還證明，與陰性對照相比，藉由阻斷ST2傳訊實現了腎小球受損的顯著減少（*指示與同型對照相比，顯著更小（P ＜ 0.05）的GDS）。 實例 5 - 氧化型 IL-33 驅動 RAGE 和 EGFR 之間的傳訊複合物的形成

在Cohen, E. S.等人 Nat. Commun.[自然通訊] 6:8327 (2015) 中，描述了氧化型二硫鍵鍵合形式的IL-33（oxIL-33）的發現。顯示OxIL-33並不結合ST2或激活ST2依賴性傳訊。隨後（參見WO 2016156440 A1），顯示oxIL-33結合晚期糖基化終產物的受體（RAGE），並且以RAGE依賴性方式進行傳訊，以激活STAT5並且影響上皮細胞遷移。

為了進一步探索oxIL-33的功能，用處於還原或氧化形式的IL-33（redIL-33和oxIL-33）刺激上皮細胞，並且研究傳訊通路。本文顯示，oxIL-33係晚期糖基化終產物的受體（RAGE）和表皮生長因子受體（EGFR）的複合物的新型配位基，從而對上皮功能產生深遠的影響。1.    IL33 的人成熟和半胱胺酸突變變體的選殖和表現

藉由引物延伸PCR合成編碼人IL-33成熟組分（112-270）（登錄號（UniProt）095760）（也稱為IL33-01或IL-33）和4個半胱胺酸殘基突變為絲胺酸的變體（也稱為IL33-16或IL-33[C-＞S]）的cDNA分子，並將其選殖至pJexpress 411（DNA 2.0）中。修飾野生型（WT）和突變型IL-33編碼序列以在蛋白質的N-末端含有10xHis、Avitag和因子Xa蛋白酶切割位點（MHHHHHHHHHHAAGLNDIFEAQKIEWHEAAIEGR SEQ ID NO: 43）。藉由轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞產生N-末端標籤化的His10/Avitag IL33-01（WT，SEQ ID NO: 44）和N-末端標籤化的His10/Avitag IL33-16（WT，SEQ ID NO: 45）。在37°C下，在自體誘導培養基（Overnight Express™自體誘導系統1，默克密理博公司（Merck Millipore），71300-4）中培養轉化的細胞18小時，隨後藉由離心收穫細胞且儲存在-20°C下。將細胞再懸浮於含有完全無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物片劑（羅氏公司（Roche），11697498001）和50 U/ml Benzonase核酸酶（默克密理博公司，70746-3）的2x DPBS中，並藉由超音波處理裂解。藉由在4°C下以50,000 x g離心30 min來使細胞裂解物變澄清。將IL-33蛋白藉由固定的金屬親和層析法，以5 ml/min載入到在2x DPBS、1 mM DTT中平衡的HisTrap excel柱（GE醫療公司（GE Healthcare），17371205）上來從上清液中純化。用2x DPBS、1 mM DTT、20 mM咪唑（pH 7.4）洗滌柱以去除雜質，然後用2x DPBS、0.1% Triton X-114洗滌以去除固定的內毒素蛋白。用2x DPBS、1 mM DTT、20 mM咪唑（pH 7.4）進一步洗滌後，將樣本用2x DPBS、1 mM DTT、400 mM咪唑（pH 7.4）洗脫。藉由使用在2x DPBS中的HiLoad Superdex 75 26/600 pg柱（GE醫療公司，28989334）的、以2.5 ml/min進行的尺寸排阻層析法，進一步純化IL-33。藉由SDS PAGE分析峰級分。將含有純IL-33的級分合併，並且藉由280 nm下的吸光度來確定濃度。藉由SDS-PAGE分析最終樣本。

為了產生未標籤化的IL-33，使N-末端標籤化的His10/Avitag IL33與10個單位因子Xa（GE醫療公司，27084901）/mg蛋白質在室溫下在2x DPBS緩衝液中一起孵育1小時。在2x DPBS中，在HiLoad 16/600 Superdex 75 pg柱（GE醫療公司，28989333）上，以1 ml/min的流速使用SEC層析法來純化未標籤化的IL-33。2. 氧化型 IL-33 （ oxIL-33 ）的產生和純化

藉由在60% IMDM培養基（無酚紅）、40% DPBS中稀釋至0.5 mg/ml的最終濃度，並在37°C下孵育18小時，將還原型IL33氧化。藉由將樣本載入到HiTrap Capto Q ImpRes陰離子交換柱（GE醫療公司，17547055）上，從樣本中去除氧化過程中產生的聚集體。載入之前，藉由添加1 M Tris（pH 9.0）直至pH達到8.3並添加5 M NaCl至125 mM的最終濃度來修飾樣本-在該等載入條件下，聚集體與柱結合並且單體oxIL-33流過而沒有結合並被收集。藉由在22°C下與因子Xa（NEB，P8010L）以1 µg因子Xa/50 µg oxIL-33的最終濃度孵育120 min來從oxIL-33切割標籤。為了消耗具有任何剩餘還原型IL-33的樣本，將與人IgG1 Fc-His6融合的可溶性人ST2S胞外結構域與樣本在22°C下孵育30 min，並結合還原型IL-33。將樣本在截留值為3,000 Da的離心濃縮器中進行濃縮，並以2 ml/min的流速載入到HiLoad Superdex 75 26/600 pg柱（GE醫療公司，28989334）上，從而將單體oxIL-33與其他樣本組分分離。合併含有純oxIL-33的級分並濃縮，並且藉由UV吸收光譜法在280 nm下測定樣本的最終濃度。最終產品品質藉由SDS-PAGE、HP-SEC和RP-HPLC進行評估。3. 人 ST2 ECD 的選殖、表現和純化

藉由PCR用引物擴增編碼不含內源訊息肽（胺基酸殘基19-328）的ST2的天然存在的ST2S可溶性同型（UniProt登錄號Q01638-2）的cDNA，該等引物編碼與Gibson組裝相容的延伸序列和與ST2S編碼序列的N-末端融合的CD33訊息肽。類似地擴增具有C-末端His6-標籤的人IgG1 Fc的編碼序列。使用Gibson組裝用pDEST12.2 OriP組裝ST2S cDNA和IgG1 Fc-His6 cDNA，pDEST12.2 OriP係一種哺乳動物CMV啟動子驅動的表現載體，其帶有來自EBV的OriP複製起點，從而可在表現EBNA-1蛋白的細胞系中進行游離基因維持（episomal maintenance）。為進行蛋白質表現，使用聚乙烯亞胺作為轉染試劑，將質體暫態轉化到過表現EBNA-1的CHO細胞懸浮培養物中。轉染後7天收集含有分泌的ST2S-Fc-His6融合蛋白的條件培養基，並以2 ml/min載入到HiTrap MabSelect SuRe（蛋白A，GE醫療公司，11-0034-95）親和層析柱上。用2x DPBS洗滌柱，並用25 mM乙酸鈉（pH 3.6）洗脫蛋白質。合併含有ST2S-Fc-His6的級分，並以2 ml/min載入到在2x DPBS中平衡的HiLoad Superdex 200 26/600 pg柱（GE醫療公司，28989336）上。合併含有純ST2S-Fc-His6蛋白的級分，並藉由在280 nm下的吸光度確定濃度。藉由SDS-PAGE分析最終樣本。 4.人脫唾液酸糖蛋白受體（ ASGPR ） ECD 的選殖、表現和純化

在Geneart化學合成了編碼無細胞質和跨膜結構域（胺基酸殘基62-291）的脫唾液酸糖蛋白受體（UniProt登錄號P07306）的胞外結構域（ECD）的cDNA，其具有CD33訊息肽後接與ECD結構域的N-末端融合的His10_Avi Tag序列。將構建體直接選殖到pDEST12.2 OriP中，pDEST12.2 OriP係一種哺乳動物CMV啟動子驅動的表現載體，其帶有來自EBV的OriP複製起點，從而可在表現EBNA-1蛋白的細胞系中進行游離基因維持。為進行蛋白質表現，使用293 Fectin作為轉染試劑將質體暫態轉化到HEK Freestyle 293F細胞的懸浮培養物中。轉染後7天，藉由以4 ml/min載入到在2x DPBS中平衡的HisTrap excel柱（GE醫療公司，17371205）上的固定金屬親和層析法來收集含有分泌的HisAVi_hASGPR ECD融合蛋白的條件培養基。用2x DPBS、40 mM咪唑（pH 7.4）洗滌柱以去除雜質，並用2x DPBS、400 mM咪唑（pH 7.4）洗脫樣本。藉由使用在2x DPBS中的HiLoad Superdex 75 16/600 pg柱（GE醫療公司，28-9893-33）的、以1 ml/min進行的尺寸排阻層析法進一步純化人ASGPR ECD。藉由SDS PAGE分析峰級分。將含有純單體ASGPR的級分合併，並且藉由280 nm下的吸光度來確定濃度。藉由SDS-PAGE分析最終樣本。5.    IL-33 的氧化形式激活 MAP 激酶通路

從龍沙公司（Lonza）獲得正常人支氣管上皮（NHBE）細胞（CC-2540），並根據製造商的方案維持在完全BEGM培養基（龍沙公司）中。用accutase（PAA，# L1 1-007）收穫NHBE，並以1 x 10⁶ 個/2 ml接種在6孔培養皿（康寧公司（Corning）Costar，3516）中的培養基[BEGM（龍沙公司CC-3171）和補充套組（龍沙公司CC-4175）]中。將細胞在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。此後，吸出培養基，並將細胞用1 ml PBS洗滌兩次，隨後添加饑餓培養基（補充有1%青黴素/鏈黴素的BEGM（龍沙公司CC-3171））。然後將該等板在37°C、5% CO₂ 下再孵育18-24小時，之後進行刺激。

MAP激酶磷酸化抗體陣列套組（ab211061）購自艾博抗公司（Abcam），並根據製造商的說明書進行實驗。對已經饑餓18-24 h的6孔培養皿中的NHBE不處理或用30 ng/ml還原型IL-33、IL-33-16或氧化型IL-33處理，隨後放回37°C、5% CO₂ 下的孵育箱維持10 min（對於此測定中使用的活化劑，參見表2）。從孵育箱中移出該等板，並用冰冷的PBS洗滌細胞，隨後添加100 µl/孔由套組提供的1x裂解緩衝液。將蛋白質提取物轉移至1.5 ml管中，隨後在4°C下以14,000 rpm使其變澄清。使用BCA技術（賽默公司（Thermo），23225）測定蛋白質濃度，並且每個陣列膜使用250 µg總蛋白。按照製造商的說明進行所有後續步驟。將膜在LiCor C-digit上視覺化，並使用Image Lite studio定量。 [表 2 ]

促效劑	鑒定劑	在以下中重構	最終濃度（ µg/ml ）
未標籤化的氧化型IL33-01	RD15	PBS	100
未標籤化的IL33-01	07/24/2015	PBS	100
未標籤化的IL33-16	11/12/2015	PBS	100
EGF	236-EG-200	PBS	100

與野生型（IL-33）和IL-33的C-＞S（IL-33[C-＞S]）還原形式（分別為IL33-01和IL33-16）相比，氧化型IL33（oxIL-33）激活了與受體酪胺酸激酶（RTK）參與的路徑一致的多個關鍵傳訊分子（圖9）。6.    IL-33 的氧化形式激活表皮生長因子受體（ EGFR ）

為了嘗試和鑒定被oxIL-33激活的受體酪胺酸激酶（RTK），使用71 RTK陣列進行篩選。RTK磷酸化抗體陣列套組（ab193662）購自艾博抗公司，並根據製造商的說明書進行實驗。培養NHBE，並以1 x 10⁶ 個/2 ml接種在6孔板（康寧公司Costar，3516）中的培養基[BEGM（龍沙公司CC-3171）和補充套組（龍沙公司CC-4175）]中。將細胞在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。此後，吸出培養基，並將細胞用1 ml PBS洗滌兩次，隨後添加饑餓培養基（無補充套組的BEGM（龍沙公司CC-3171））。然後將該等板在37°C、5% CO₂ 下再孵育18-24小時，之後進行刺激。遵循先前對於MAP激酶陣列所述之相同步驟，將細胞激活（表2的活化劑），裂解，並且每個陣列膜使用250 µg總蛋白。按照製造商的說明進行所有後續步驟。將膜在LiCor C-digit上視覺化，並使用Image Lite studio定量。未檢測到對還原的野生型（IL-33）或C-＞S（IL-33 [C-＞S]）IL-33（分別為IL33-01和IL33-16）的反應。但是，oxIL-33（氧化型IL-33-01）在RTK陣列上觸發了與表皮生長因子受體（EGFR）相對應的陽性訊號（圖10）。

藉由其他方法證實了oxIL-33（氧化型IL-33-01）刺激EGFR傳訊的能力。激活後，將EGFR在Tyr1068處磷酸化，並且此磷酸-EGFR可以使用均相FRET（螢光共振能量轉移）HTRF®（均相時間分辨螢光，齊斯博國際公司（Cisbio International））測定（Cisbio套組# 64EG1PEH）檢測到。簡言之，將NHBE以5 x 10⁵ 個/100 µl鋪在96孔板（康寧公司Costar，3598）中的培養基[BEGM（龍沙公司CC-3171）和補充套組（龍沙公司CC-4175）]中。將該等板在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。此後，吸出培養基，並將細胞用0.2 ml PBS洗滌兩次，隨後添加饑餓培養基（無補充套組的BEGM（龍沙公司CC-3171））。然後將板在37°C、5% CO₂ 下再孵育18-24小時，隨後用濃度增加的IL-33-01、IL-33-16和oxIL-33（氧化型IL-33-01）以及EGFR配位基（表2和表3）刺激，隨後放回37°C、5% CO₂ 下的孵育箱維持10 min。吸出培養基，並且每孔用50 µl裂解緩衝液（齊斯博公司，64EG1PEH）替換。然後按照製造商的說明書（齊斯博公司，64EG1PEH）進行測定。使用EnVision讀板儀（珀金埃爾默公司）在620 nm和665 nm發射波長下讀取時間分辨螢光。藉由計算665/620 nm比率和使用GraphPad Prism軟體藉由使用四參數對數方程進行曲線擬合確定的EC50值來分析數據。 [表 3 ]

促效劑	供應商	鑒定劑	在以下中重構	最終濃度（ µg/ml ）
TGFα	R&D系統公司	239-A-100	10 mM乙酸	100
HB-EGF	R&D系統公司	259-HE-050/CF	PBS	100
雙調蛋白（AREG）	R&D系統公司	262-AR-100/CF	PBS	100
β動物纖維素/BTC	R&D系統公司	261-CE-010/CF	PBS	100
上皮調節蛋白	R&D系統公司	1195-EP-025/CF	PBS	100
上皮細胞有絲分裂蛋白抗體（Epigen）	R&D系統公司	6629-EP-025/CF	PBS	100
HMGB1	R&D系統公司	1690-HMB-050	PBS	200
S100A8/A9	R&D系統公司	8226-S8-050	PBS	500
S100A12	R&D系統公司	1052-ER-050	PBS	200
S100B	R&D系統公司	1820-SB-050	PBS	200

類似地，使用如本部分先前提及的HTRF測定評估上皮細胞系A549中的EGFR磷酸化。簡言之，從ATCC獲得A549，並在補充有1%青黴素/鏈黴素和10% FBS的RPMI GlutaMax培養基中培養。用accutase（PAA，# L1 1-007）收穫細胞，以5 x 10⁵ 個/100 µl接種到96孔板中，並在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。然後將孔用100 µl PBS洗滌兩次，隨後添加100 µl饑餓培養基（補充有1%青黴素/鏈黴素的RPMI GlutaMax培養基），並在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。用濃度增加的IL-33-01、IL-33-16和oxIL-33、EGFR配位基和RAGE配位基（表2和表3）刺激細胞，隨後放回37°C、5% CO₂ 的培養箱維持10 min。吸出培養基，並且每孔用50 µl裂解緩衝液（齊斯博公司，64EG1PEH）替換。然後按照製造商的說明書（齊斯博公司，64EG1PEH）進行測定。使用EnVision讀板儀（珀金埃爾默公司）在620 nm和665 nm發射波長下讀取時間分辨螢光。藉由計算665/620 nm比率和使用GraphPad Prism軟體藉由使用四參數對數方程進行曲線擬合確定的EC50值來分析數據。

在NHBE和A549細胞兩者中，oxIL-33均與真正的促效劑EGF類似地促進EGFR的磷酸化（圖11）。這未被測試的其他RAGE配位基重複。7. 傳訊組分的西方墨點法

進行了西方墨點法實驗，以進一步研究響應於oxIL-33，EGFR傳訊複合物的哪些元件被激活。如以上部分5中所述，將NHBE培養並鋪在6孔培養皿中。血清饑餓後，用oxIL-33（30 ng/ml）刺激細胞持續5至240分鐘之間。然後吸出培養基，並用冰冷的PBS洗滌細胞，隨後添加150 µl裂解緩衝液[1x LDS樣本緩衝液（賽默公司，NP0008）、10 mM MgCl2（VWR，7786-30-3）、2.5% β-巰基乙醇（西格瑪公司（Sigma），M6250）和0.4 µg/ml benzonase（密理博公司，70746）]。將細胞在冰上放置10 min，隨後將裂解物轉移至1.5 ml管中，並加熱至90°C後維持5 min。將溶液轉移至新的1.5 ml管中，並在4%-12% SDS-PAGE凝膠（賽默公司，NW04127BOX）上在MES運行緩衝液（B0002）中運行10 µl樣本以及5 µl蛋白梯（伯樂公司（BioRad），1610374）。使用Transblot Turbo（伯樂公司）將凝膠轉移到PVDF膜（伯樂公司，1704156）上。將PVDF膜在含有5%脫脂奶粉（Marvel）的PBS-吐溫溶液中阻斷10分鐘。然後將膜與一級抗體在含有5% BSA的PBS-吐溫中在4°C下孵育過夜。然後將膜用PBS-吐溫洗滌五次，接著在室溫下在含有5%脫脂奶粉的PBS-吐溫中與HRP標籤化的二級抗體一起孵育1小時。然後用PBS-吐溫將膜洗滌五次，隨後添加ECL（伯樂公司，1705062）並用Licor C-digit視覺化。

結果顯示，oxIL-33激活幾種EGFR傳訊組分（圖12）。8.    Ox-IL-33 誘導 STAT-5 磷酸化，這被 EGFR 中和性 Ab 阻斷

接下來試圖確定是否可以藉由阻止與EGFR結合來抑制oxIL33介導的STAT5激活。簡言之，在補充有1%青黴素/鏈黴素和10% FBS的RPMI GlutaMax培養基中培養A549細胞。用accutase收穫細胞，以5 x 10⁵ 個/100 µl接種到96孔板中，並在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。然後將孔用100 µl PBS洗滌兩次，隨後添加100 µl饑餓培養基（補充有1%青黴素/鏈黴素的RPMI GlutaMax培養基），並在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。將抗EGFR抗體（殖株LA1（05-101，密理博公司）或同型對照（MAB002，R&D系統公司）以劑量依賴性方式添加至各孔中，並將板放回孵育箱維持30 min。然後用氧化型IL-33（30 ng/ml）刺激板30 min，隨後按照製造商的說明書，使用磷酸-STAT5 ELISA套組裂解緩衝液（85-86112-11，賽默飛世爾科技公司（ThermoFischer Scientific））裂解並顯影，然後讀取450 nM下的吸光度。如圖13中所示，用oxIL-33-01激活的細胞呈現出STAT5磷酸化，該磷酸化在存在抗EGFR抗體的情況下會降低（圖13）。 實例 6 - 氧化型 IL-33 誘導 EGFR 和 RAGE 之間的複合物形成 9.    OxIL-33 誘導 EGFR 和 RAGE 之間的複合物形成

為了瞭解RAGE和EGFR如何參與促進oxIL-33的傳訊，進行了免疫沈澱實驗以探索傳訊複合物。首先，使抗EGFR抗體與Dynabead共價偶聯。按照製造商的說明書，將兩個100 µg小瓶的抗EGFR抗體（R&D系統公司，AF231）與40 mg Dynabead（賽默公司，14311D）一起孵育，並共價偶聯。成功偶聯後，將珠粒以30 mg/ml再懸浮於PBS中，並保持在4°C下。

從龍沙公司獲得NHBE（CC-2540），並且將冷凍小瓶以每培養皿1x10⁶ 個細胞直接接種到15 cm培養皿（賽默公司，157150）中。根據製造商的方案，將NHBE維持在完全BEGM培養基（龍沙公司）中一個月，其中每三天更換一次培養基，直到細胞達到匯合為止。將該等板在37°C、5% CO₂ 下孵育此時間段。在刺激前一天，將板用20 ml PBS洗滌兩次，隨後添加15 ml饑餓培養基（無補充套組的BEGM（龍沙公司CC-3171））。然後將板在37°C、5% CO₂ 下再孵育18-24小時，隨後用單獨的培養基（未刺激的對照）、30 ng/ml還原型IL-33-01、30 ng/mL oxIL-33或30 ng/mL EGF刺激，並放回37°C、5% CO₂ 中維持10 min。吸出培養基，並用冰冷的PBS洗滌板兩次，隨後每15 cm培養皿添加1 ml含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑（賽默公司，78440）的裂解緩衝液（艾博抗公司，ab152163）。將細胞刮入裂解緩衝液中，隨後轉移至2 ml蛋白LoBind管（艾本德公司（Eppendorf），Z666513）中，並藉由在4°C下以14,000 rpm離心變得澄清。使用BCA套組（賽默公司，23225）測定蛋白質濃度，並用裂解緩衝液將所有蛋白質提取物標準化至3 mg/ml。將6 mg總蛋白提取物在具有100 µl抗EGFR Dynabead（如上所述）的2 ml潔淨LoBind管中孵育。然後將管放置在4°C下的立式圓筒形混合機（end-over-end mixer）上5 h。使用磁鐵（伯樂公司，1614916）將Dynabead固定，吸出蛋白質提取物，並用2 ml洗滌緩衝液1（50 mM Tris-HCl pH 7.5（賽默公司，15567027）、0.5 % TritonX 100（西格瑪公司，X100）、0.3 M NaCl）替換。將此再重複四次。然後用洗滌緩衝液2（50 mM Tris-HCl pH 7.5）以相同方式將珠粒再洗滌十次。在最後的洗滌步驟之後，將在50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中的50 µl 1% Rapigest（w/v）（沃特世公司（Waters），186001861）添加到珠粒中，並在60°C下加熱10 min。然後將上清液轉移至新的LoBind 2 ml管中。再將100 µl 50 mM Tris-HCl pH 8.0添加到樹脂中並混合，隨後將其與第一次洗脫物組合。然後添加TCEP（西格瑪公司，646547）至最終濃度為5 mM，並將樣本在60°C下加熱10 min。然後藉由在黑暗中在室溫下添加碘乙醯胺（西格瑪公司，16125）至10 mM使洗脫液烷基化20 min。藉由添加DTT（西格瑪公司，D5545）至10 mM來淬滅烷基化。然後添加Tris-HCl緩衝液50 mM pH 8.0，得到500 µl的最終樣本體積。每管添加0.5 µg胰蛋白酶（普洛麥格公司（Promega），V5111），並在30°C下在400 rpm的振盪平臺上將樣本消化過夜。然後將樣本用三氟乙酸（西格瑪公司，302031）酸化至最終濃度為2.0%（v/v），並在37°C下孵育1 h。然後將樣本以14,000 rpm離心30 min，並將上清液轉移至新的2 ml LoBind管中。然後按照製造商的說明書通過C18柱（賽默公司，87784）處理樣本。然後使用speed-vac乾燥樣本，隨後儲存在-20°C下。然後藉由肽質量指紋質譜法（PMF-LC-MS）分析樣本。使用Scaffold軟體分析結果。

在所有4種條件下均類似地檢測到了EGFR，這表明免疫沈澱在所有樣本中均表現良好。與用IL33-01（IL-33）或EGF處理的樣本相比，在用oxIL-33處理的樣本中檢測到RAGE和IL-33，這表明在傳訊期間oxIL-33和RAGE與EGFR相關。與先前用oxIL-33和EGF在該等細胞中激活EGFR的觀察結果一致（還原型IL33-01除外），用該等配位基刺激後，檢測到先前報導的參與EGFR傳訊和內吞作用的蛋白質（表4）。

表4顯示了用還原型IL-33-01（IL-33）、oxIL-33（氧化型IL-33-01）或EGF刺激的NHBE的LCMS分析。用oxIL-33刺激後，檢測到IL-33和RAGE與EGFR複合，但用還原型IL33-01（IL-33）或EGF刺激後未檢測到。括弧指示對於每種蛋白質鑒定的獨特肽的數量。 [表 4 ]

未刺激的	IL-33	oxIL-33	EGF
EGFR（63）	EGFR（62）	EGFR（60）	EGFR（57）
-	-	IL-33（11）	-
-	-	RAGE（11）	-
-	-	AP-2α1（20）	AP-2α1（14）
-	-	AP-2α2（16）	AP-2α2（10）
-	-	AP-2β（15）	AP-2β（16）
-	-	AP-2µ（20）	AP-2µ（20）
-	-	AP-2σ（10）	AP-2σ（11）
-	-	CBL-B（5）	CBL-B（4）

為了證實該等觀察結果，還對根據上述方案製備的細胞裂解物進行了免疫沈澱和西方墨點法。確定NHBE蛋白提取物的濃度後，將3 mg總蛋白與6 µg抗EGFR抗體（R&D系統公司，AF231）一起在1.5 ml管中孵育，並放置在4°C下的立式圓筒形混合機上2.5 h。然後將1.5 mg蛋白A/G磁珠（賽默公司，88802）添加到每個管中，隨後將管放回4°C在混合下再維持1 h。然後用磁鐵（伯樂公司，1614916）收集珠粒，並用500 µl（50 mM Tris（pH 7.5）、1% TritonX和0.25 M NaCl）洗滌三次，並用500 µl 10 mM Tris（pH 7.5）洗滌一次。然後使用35 µl具有還原劑（賽默公司，NP0004）的LDS樣本緩衝液（賽默公司，NP0008）從磁珠釋放蛋白質，並在95°C下加熱5分鐘。將溶液轉移至新的1.5 ml管中，並在4%-12% SDS-PAGE凝膠（賽默公司，NW04127BOX）上在MES運行緩衝液（B0002）中運行10 µl樣本以及5 µl蛋白梯（伯樂公司（BioRad），1610374）。使用Transblot Turbo（伯樂公司）將凝膠轉移到PVDF膜（伯樂公司，1704156）上。將PVDF膜在含有5%脫脂奶粉（Marvel）的PBS-吐溫溶液中阻斷10分鐘。然後將膜與一級抗體（抗EGFR（細胞傳訊技術公司（Cell Signaling Technology），2232）、抗RAGE（細胞傳訊技術公司，6996）或抗IL-33（R&D系統公司，AF3625））在含有5% BSA的PBS-吐溫中在4°C下孵育過夜。然後將膜用PBS-吐溫洗滌五次，接著在室溫下在含有5%脫脂奶粉的PBS-吐溫中與抗兔HRP標籤化的二級抗體（細胞傳訊技術公司，7074）或抗山羊HRP標籤化的二級抗體（R&D系統公司，HAF109）一起孵育1小時。然後用PBS-吐溫將膜洗滌五次，隨後添加ECL（伯樂公司，1705062）並用Licor C-digit視覺化。西方墨點法證實在oxIL-33存在下RAGE與EGFR共沈澱，而在EGF刺激下未檢測到RAGE（圖14）。該等發現揭露，RAGE和EGFR係氧化型IL-33傳訊複合物的功能部分。10.  oxIL-33 需要 RAGE 與 EGFR 形成複合物

上述實驗顯示，oxIL-33係引起下游傳訊的EGF受體（EGFR）複合物的配位基。本部分中的實驗經設計以確定oxIL-33是否是RAGE或EGFR的直接結合配位基。為了更多地瞭解有關傳訊複合物的形成並評估oxIL-33是否直接與EGFR相互作用，使用ELISA形式探索oxIL-33與RAGE、ST2-Fc和EGFR的結合。

蛋白質和修飾：遵循製造商的方案使用生物素連接酶（BirA）（Avidty，Bulk BirA）將含有Avitag序列模體（GLNDIFEAQKIEWHE SEQ ID NO: 46）的蛋白質生物素化。遵循製造商的方案使用EZ連接磺基-NHS-LC-生物素（賽默公司/皮爾斯公司（Pierce），21335）經由游離胺將本文所用的所有修飾的無Avitag的蛋白質生物素化。表5係使用的生物素化蛋白的列表。 [表 5 ].

試劑

生物素化的EGF（賽默公司）

Avitag人ASGPR

Avitag_IL-33-01（還原型IL-33）

Avitag_IL-33-01（氧化型IL-33）

Avitag_IL-33-16

HMGB1

在室溫下用100 µl/孔生物素化的抗原（10 µg/ml，PBS中）塗布鏈黴抗生物素蛋白板（賽默科技公司（Thermo Scientific），AB-1226），持續1小時。將板用200 µl PBS-T（PBS + 1%（v/v）吐溫-20）洗滌3次，並用300 µl/孔封閉緩衝液（含1% BSA的PBS（西格瑪公司，A9576））阻斷1小時。將板用PBS-T洗滌3次。將RAGE-Fc（R&D系統公司# 1145-RG）或ST2-Fc（R&D系統公司# 523-ST）在含PBS的封閉緩衝液中稀釋至10 µg/mL，添加至相關孔中，並在室溫下孵育1小時。可替代地，在存在或不存在PBS中的10 µg/mL未標籤化的RAGE（北京義翹神州生物公司（Sino Biological），11629-HCCH）的情況下，添加100 µl的PBS中的10 µg/mL EGFR-Fc（R&D系統公司# 344-ER-050），持續1小時。將板用200 µl PBS-T洗滌三次。然後在室溫下用在100 µl/孔封閉緩衝液中以1:10000稀釋的抗人IgG HRP（西格瑪公司AO170，5.1 mg/mL）檢測RAGE-Fc、ST2-Fc和EGFR-Fc，持續1小時。將板用PBS-T洗滌3次且用100 µl/孔TMB（西格瑪公司，T0440）顯影。用50 µl/孔的0.1M H₂ SO₄ 淬滅反應。在Cytation Gen5或類似設備上讀取450 nm下的吸光度。結果顯示，oxIL-33呈現出與RAGE明顯相互作用（圖15A），而oxIL-33與EGFR的直接結合可忽略（15B）。僅藉由向此測定中添加sRAGE可觀察到EGFR與oxIL-33結合（圖15B）。如果用oxIL-33取代真正的RAGE促效劑HMGB1，則此不能重現（圖15B）。

使用RAGE缺陷型細胞系進一步證實了oxIL-33觸發的EGFR傳訊中需要RAGE。如下產生敲除RAGE的A549細胞系：

產生哺乳動物質體，其含有紅色螢光蛋白（RFP）的表現載體、靶向AGER的外顯子3的指導RNA（TGAGGGGATTTTCCGGTGC SEQ ID NO: 47）和Cas9內切核酸酶。藉由使A549細胞在T-175燒瓶中在F12K堅果混合物（吉博科公司（Gibco），補充有10% FBS和1%青黴素/鏈黴素）中生長兩天來產生A549條件培養基。將消耗的培養基從A549取出，過濾，並在新鮮的吉博科公司F12K堅果混合物（補充有20% FBS和1%青黴素/鏈黴素）中進行五倍稀釋。將A549以2x10⁵ 個細胞/ml接種到三個T-75燒瓶中，共15 ml，並置於37°C、5% CO2孵育箱中過夜。使用1.6 ml F12K堅果混合物（補充1%青黴素/鏈黴素）以及8 µg AGER指導RNA質體和22.5 µg PEI（波利塞斯公司（Polysciences），23966-2）製備轉染混合物。然後將混合物渦旋10秒，並在室溫下放置15 min。然後將0.75 ml轉染混合物添加到每個T-75燒瓶中。將燒瓶放回孵育箱，維持兩天。然後使用Accutase使A549細胞分開，轉移到含1% FBS的PBS中，並根據RFP在96孔培養皿中的表現，在Aria細胞分選儀（BD）上分選單個細胞。每3-5天用條件培養基餵養細胞。一旦細胞超過50%匯合後，將其轉移到24孔板中並使其生長。將此過程繼續放大，直至每個成功的殖株被分到T15燒瓶中。然後將細胞分到12孔板中，並使其生長直至超過50%匯合，隨後分析基因組PCR以獲得成功敲除情況。使每孔的細胞在100 µl DNA裂解緩衝液（維亞根生物技術公司（Viagen Bitoech），301-C，補充有0.3 µg/ml蛋白酶K）中裂解。將該等樣本在55°C下孵育4小時，隨後在85°C下孵育15 min。使用具有以下序列的正向和反向引物進行RAGE的PCR：正向引物 - gttgcagcctcccaacttc（SEQ ID NO: 48），反向引物 - aatgaggccagtggaagtca（SEQ ID NO: 49）。反應和循環的設定如下：反應體積為50 µl [25 µl Q5聚合酶混合物、2.5 µl正向引物（10 µM儲備液）、2.5 µl反向引物（10 µM儲備液）、2 µl模板DNA裂解物、18 µl無核酸酶的水]。運行PCR反應，其中在98°C下進行初始變性30秒，隨後進行如下35個循環：在98°C下5秒，在57°C下10秒以及在72°C下20秒，隨後最後一步在72°C下2分鐘。將4 µl PCR產物與6 µl無核酸酶的水和2 µl 6x DNA載入緩衝液（賽默科技公司，R0611）混合。將樣本在90V下在1%瓊脂糖凝膠（1 : 10000 SYBR safe）上運行1小時，隨後在Versadoc成像儀上視覺化。然後遵循製造商的方案，使用QIAquick PCR純化套組（凱傑公司（Qiagen），28104）清理其餘的PCR產物。使用nanodrop測量DNA-50濃度。發送幾個殖株（從結果中選擇）進行內部定序。結果顯示，在殖株RAGE09和RAGE10中成功插入了終止密碼子。

為了確定RAGE對oxIL-33介導的EGFR傳訊的必要性，然後對A549和RAGE缺陷型A549細胞進行了免疫沈澱和西方墨點法。簡言之，在不同時間點（0-15分鐘）用oxIL-33激活細胞系。隨後進行EGFR或RAGE的免疫沈澱，然後遵循部分9中詳述的相關實驗方案用抗RAGE、抗EGFR和抗IL-33進行西方墨點法。結果顯示了RAGE在與oxIL-33和EGFR形成複合物中的關鍵作用（圖16）。11. 氧化型 IL-33 誘導 STAT5 磷酸化，該磷酸化被 RAGE 阻斷，但未被 ST2 中和性抗體阻斷

為了證實oxIL-33傳訊中RAGE的重要性優於ST2，測試了阻斷抗體。簡言之，在補充有1%青黴素/鏈黴素和10% FBS的RPMI GlutaMax培養基中培養A549。用accutase收穫細胞，以5x10⁵ 個/100 µl接種到96孔板中，並在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。然後將孔用100 µl PBS洗滌兩次，隨後添加100 µl饑餓培養基（補充有1%青黴素/鏈黴素的RPMI GlutaMax培養基），並在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。將抗RAGE（M4F4；WO 2008137552）、抗ST2（AF532；RnD系統公司）或同型對照（MAB002，R&D系統公司）以劑量依賴性方式添加至孔中，並將板放回孵育箱維持30 min。然後用氧化型IL-33（30 ng/ml）刺激板30 min，隨後按照製造商的說明書，使用磷酸-STAT5 ELISA套組裂解緩衝液（85-86112-11，賽默飛世爾科技公司）裂解並顯影，隨後讀取450 nM下的吸光度。如圖17中所示，用oxIL-33-01激活的細胞呈現出STAT5磷酸化，該磷酸化在存在抗RAGE抗體而非抗ST2抗體的情況下會降低（圖17）。 實例 7 - 在 PTEC 腎臟細胞中經由 RAGE 進行 oxIL-33 傳訊

先前實例已經顯示，在腎臟疾病中，IL-33表現升高。RAGE表現也升高。顯示阻斷ST2和RAGE傳訊減少了小鼠模型中的UACR和腎臟受損。還已經顯示，在上皮細胞中，oxIL-33介導的傳訊由與EGFR的複合物形成而驅動。以下所述實驗試圖確定在腎臟上皮中是否還存在新的傳訊通路。

在PTEC（一種人近端小管上皮細胞系）中測量對oxIL-33的反應。

簡言之，使PTEC（原代人腎小管上皮細胞系）生長至匯合，並且用腎臟炎症介質處理24 h。根據製造商的方案，使用中尺度診斷測定法在細胞裂解產物中測量IL-33。

如圖18A中所示，與用蔗糖或葡萄糖對照處理時相比，當用IFN-γ和TNF處理PTEC時，IL-33胞內濃度升高。該等結果表明，在PTEC中，炎症介質IFN γ和TNF上調IL-33的產生和分泌。

然後將PTEC用redIL-33處理，以檢查redIL-33經由ST2和NFkB在炎症通路上的潛在自分泌或旁分泌效應。使PTEC生長至匯合，並且用各劑量濃度的redIL-33或IL-1作為陽性對照進行處理（獲得自派普泰克公司（peprotec）200-01B）。如WO 2016/156440所述製備RedIL-33。藉由免疫螢光（遵循Noursadeghi等人J Immunol Methods [免疫學方法雜誌]2008 中所述之方法）測量作為激活標記的NFkB易位至細胞核。圖18B顯示了用劑量增加的IL-1或redIL-33處理的PTEC中的NFkB易位。該等結果顯示，在PTEC中，與IL-1相比，red-IL33更少地引起炎性反應。

藉由分析在PTEC中響應於濃度增加的redIL-33，炎症標誌物的劑量依賴性釋放，進一步證實了這一點。簡言之，將原代人PTEC（龍沙公司）培養至達到匯合，然後接種到24孔板（無血清饑餓）上，並且用全劑量範圍的IL-33還原形式（劑量從12.8 pM至200 nM）刺激24 hr。在此時間後，收集上清液以檢測促炎性細胞介素。根據製造商的說明，藉由使用中尺度診斷測定法進行細胞介素的檢測。

沒有檢測到炎性細胞介素IL-6、IL8、TNFa和IL1b的水平的劑量依賴性增加（圖18C）。

類似地，還在PTEC中，在用還原型IL-33處理後，分析了MAP激酶的激活。MAP激酶的激活係由ST2依賴性通路調節的另一細胞功能。

簡言之，將原代人PTEC培養至達到匯合，然後接種到24孔板上，該研究不需要血清饑餓。用30 ng/ml單一濃度的還原形式的IL-33刺激細胞30 min，持續30 min。30 min後，裂解細胞以測量MAP激酶（p38和JNK）的磷酸化。根據製造商的說明，藉由使用中尺度診斷測定法檢測磷酸化的MAP激酶。

結果顯示，PTEC並不展現出響應於還原型IL-33的增加的MAP激酶傳訊（圖18D），這進一步說明，PTEC並不經由經典ST2傳訊軸而響應於還原型IL-33。

為了檢查PTEC是否響應於具有oxIL-33的傳訊，在用oxIL-33和redIL-33進行刺激後，測量EGFR激活。如WO 2016/156440中或以上所述製備OxIL-33和redIL-33。簡言之，使PTEC生長至匯合，並且用oxIL-33和redIL-33刺激10-15 min，之後藉由均相時間分辨螢光（HTRF）測量RAGE/EGFR傳訊。

HTRF®測定係在非常接近的供體與受體螢光團之間利用螢光共振能量轉移進行的均相測定技術（Mathis等人Clin Chem [臨床化學] 41(9):1391-7 (1995)）。該等測定用於藉由使目的分子之一與供體螢光團（例如銪（Eu3+）穴狀化合物）直接或間接偶聯、以及使另一目的分子與受體螢光團（例如XL665（穩定交聯的別藻藍蛋白））偶聯來測量大分子相互作用。在此供體/受體系統中，穴狀化合物分子的激發（在337 nm下）導致在620 nm下的螢光發射。將來自此發射的能量轉移至非常接近Eu3+穴狀化合物的XL665，這導致特定長壽命螢光（在665 nm下）自XL665發射。可以測量供體（在620 nm下）和受體（在665 nm下）兩者的特定訊號，這允許計算665/620 nm比率，該比率在該測定中補償有色化合物的存在。

使用兩種不同的特異性抗體，一種用Eu3+穴狀化合物（供體）標記，並且第二種用d2（受體）標記，以夾心測定形式檢測磷酸化EGFR（Tyr1068）。當染料非常靠近時，用光源（雷射或閃光燈）激發供體引發了朝向受體的螢光共振能量轉移（FRET），該受體繼而在特定波長（665 nm）下發出螢光。該特定訊號正向調節與磷酸化EGFR（Tyr1068）的比例。因此，將僅在EGFR傳訊複合物激活時，觀察到FRET訊號。

如圖18E中所示，ox-IL33誘導與陽性對照（EGF）的水平可比的PTEC中的EGFR的磷酸化（p-EGFR）。與未處理的對照相比，RAGE的天然配位基（S1001A9）並不導致p-EGFR的增加。redIL-33也沒有導致增加。

為了證實p-EGFR的增加係由oxIL33 RAGE-EGFR傳訊通路介導的，在抗RAGE和抗EGFR抗體存在下，用氧化型IL-33刺激PTEC。

將原代人PTEC培養至達到匯合，然後接種到96孔板上，並且血清饑餓過夜。然後在有/沒有抗RAGE和抗EGFR抗體（最終10 ug/ml）的情況下，用單劑量的氧化型IL-33（最終200 nM）刺激細胞。將PTEC與抗體預孵育40 min，並且隨後是使用氧化型IL-33刺激10 min。在此時間（總計50 min）後，藉由裂解細胞而終止刺激，並且使用均相時間分辨螢光（HTRF）進行EGFR的磷酸化水平的檢測。測定的細節已在前面描述。根據齊斯博供應商的方案進行測定。

結果顯示，阻斷RAGE和EGFR減少了oxIL-33對EGFR的激活（圖18F）。這指示在PTEC中，響應於oxIL33的EGFR激活係由RAGE和EGFR介導的。

該等結果顯示，在PTEC細胞中，oxIL-33，而不是redIL-33，激活RAGE/EGFR依賴性傳訊。這表明，在具有升高的IL33的腎臟疾病內的腎小管區域中，氧化型IL33可以介導上皮反應。

為了評估oxIL33傳訊在腎臟上皮中的生物學影響，用oxIL33和redIL-33刺激PTEC，並且測量腎臟損傷分子1（KIM-1）的釋放。KIM-1係腎小管損傷的關鍵標誌物（Han等人 2002, Kidney Int.[國際腎臟期刊] 62(1)237-44）。

將原代人PTEC培養至達到匯合，然後接種到24孔板上，血清饑餓過夜，並且用單劑量的氧化型IL-33或和突變體還原型IL-33（兩者皆為1 ug/ml）進行刺激（為了特異性控制僅對氧化形式具有特異性的效應）。刺激持續8 hr，在此時間後，收集上清液用於隨後檢測腎臟損傷標誌物KIM-1。根據製造商的方案，使用中尺度診斷測定法進行檢測。

結果顯示，oxIL-33，而不是還原型IL-33同種型，上調KIM-1（圖18G），這表明在PTEC中，損傷係激活oxIL-33傳訊軸的特徵。 實例 8 - 在人腎小球上皮細胞中阻斷 ST2 依賴性傳訊

以下所述實驗確定了不同腎臟細胞類型是否響應於redIL-33傳訊。

使原代人腎小球上皮細胞（GEnC）生長至匯合，並且用腎臟炎症介質處理24 h。如實例7中所述，使用MSD，在細胞裂解產物中測量IL-33。如圖19A中所示，與用蔗糖或葡萄糖對照處理時相比，當用IFN-γ和TNF處理GEnC時，IL-33胞內濃度升高。該等數據表明，在GEnC中，炎症介質IFN γ和TNF上調IL-33的產生和分泌。

然後將GEnC用redIL-33處理，以檢查redIL-33經由ST2和NFkB在炎症通路上的潛在自分泌或旁分泌效應。使GEnC生長至匯合，並且用各劑量濃度的redIL-33或IL-1（獲得自R&D系統公司 - 目錄號3625-IL-010、201-LB-025）作為陽性對照進行處理。如WO 2016/156440或以上所述製備RedIL-33。藉由免疫螢光（遵循Noursadeghi等人J Immunol Methods [免疫學方法雜誌]2008 中所述之方法）測量作為激活標記的NFkB易位至細胞核。圖19B顯示了用劑量增加的IL-1或redIL-33處理的GEnC中的NFkB易位。該等結果顯示，在GEnC中，等效劑量的red-IL33引起與IL-1可比的炎性反應。

為了檢查阻斷IL-33對腎臟中ST2依賴性傳訊的作用，用WO 2016/156440中的單株抗體33_640087-7B（SEQ ID NO: 616和SEQ ID NO: 618）處理GEnC。簡言之，使GEnC生長至匯合，並且在有或沒有0.0001-100nM nM 33_640087-7B或同型對照的情況下，用IL-33或對照劑處理24 h。將NFkB易位用作ST2傳訊和內皮激活的標記，並且如前述實例所述進行測定。

如圖19C中所示，在用IL-33處理的GEnC中，redIL-33誘導NFkB易位，該易位受到33_640087-7B抑制。同型對照並不抑制激活，33_640087-7B也不抑制IL1介導的NFkB傳訊，將後者用作陽性對照。

進行另外的實驗來分析redIL-33對內皮細胞的刺激作用。

將原代人HGMEC（細胞系統公司（Cell Systems））培養至達到匯合，然後接種到24孔板上，並且用單劑量（30 ng/ml）的還原或氧化形式的IL-33刺激24 hr。在此時間後，收集上清液用於檢測促炎性IL-6和IL-8細胞介素。根據製造商的說明，藉由使用中尺度診斷測定法實現細胞介素的檢測。

結果顯示，redIL-33誘導IL-6和IL-8的釋放（圖20D），oxIL-33並不誘導IL-6或IL-8釋放。

還測量了在HGMEC中，在redIL-33刺激後，炎性細胞介素IL-8、TNFa、IL1b和IL-6的劑量依賴性釋放。使原代人HGMEC（細胞系統公司）培養至達到匯合，然後接種到24孔板上，並且用全劑量範圍的還原形式的IL-33（劑量從200 nM至12.8 pM）刺激24 hr。在此時間後，收集上清液以檢測促炎性細胞介素。根據製造商的說明，藉由使用中尺度診斷測定法實現細胞介素的檢測。

結果顯示，由內皮細胞分泌IL-1b、IL-6、IL-8和TNFa係以劑量依賴方式對redIL-33具有特異性。

為了進一步探索redIL-33誘導的體外腎小球上皮細胞NFkB激活，在與redIL-33孵育一起孵育24 h後，測量GEnC中的炎性細胞介素的產生。

如以上，使GEnC生長至匯合，並且與IL33或陽性對照（具有或沒有33_640087-7B）一起孵育。根據製造商的方案，使用中尺度診斷（MSD）測定法，從上清液測量細胞介素水平。

還在原代人內皮細胞中測量了33-640087_7B抑制MAP激酶傳訊的激活的能力。將原代人HGMEC（細胞系統公司）培養至達到匯合，然後接種到24孔板上，並且在有/沒有1 ug/ml的33-640087_7B的情況下，用單劑量的30 ng/ml的redIL-33刺激30 min。30 min後，裂解細胞以測量MAP激酶的磷酸化和33-640087_7B的阻斷作用。根據製造商的說明，藉由使用中尺度診斷測定法檢測MAP激酶。

結果顯示，在24 h後，如從GEnC上清液所測量的，33_640087-7B顯著抑制IL-4、IL-6、IL-8和IL-12的分泌（圖20A）。此外，33_640087-7B抑制MAP激酶p38和JNK的磷酸化（圖20B）。

這證明，IL-33拮抗劑可以用於減輕或抑制腎臟中由IL-33/ST2傳訊介導的炎症。這可用於治療在腎臟中具有異常炎症的疾病，例如糖尿病性腎病。 實例 9 在人原代系膜細胞中的 IL33 傳訊

鑒於已經顯示出不同的IL-33同種型在腎上皮和內皮細胞中具有不同的病理學效應，因此還分析了系膜細胞中的IL-33傳訊。

系膜細胞係特化細胞，它們係腎小球的另一種主要組分。系膜細胞的主要功能係從基底膜去除捕獲的殘餘物和聚集的蛋白質，由此使濾膜保持不含碎片。糖尿病性腎病的特徵在於進行性系膜擴張和基質沈積，這導致腎小球肥大和腎小球硬化症，最終堵塞腎小球毛細血管並且損害腎功能。

用一系列慢性腎臟疾病應激物刺激系膜細胞，以確定它們是否誘導IL-33表現。

使原代人系膜細胞（龍沙公司）生長至匯合，然後接種到6孔板上，並且用腎臟炎症介質處理24 h。如以上實例中所述，使用MSD，在細胞裂解產物中測量IL-33。如圖21A中所示，與其他應激物相比，當用IFN-γ和TNF-α處理系膜細胞時，IL-33胞內濃度上調。

接下來測試了在系膜細胞內，IL-33表現的自分泌和旁分泌效應。分析了當用redIL-33處理後，IL-8從原代人系膜細胞的劑量依賴性釋放。

係原代系膜細胞（龍沙公司）生長至匯合，然後接種到24孔板上，並且用全劑量範圍的還原形式的IL-33（劑量從200 nM至12.8 pM）處理24 hr。收集上清液用於檢測促炎性IL8。根據製造商的說明，藉由使用中尺度診斷測定法檢測IL-8。對於阻斷實驗，使原代系膜細胞（龍沙公司）生長至匯合，然後接種到24孔板上，並且再有/沒有1 ug/ml的33-640087_7B的情況下，用單劑量的30 ng/ml的還原型IL-33處理24 hr。收集上清液用於檢測促炎性IL8。根據製造商之說明，藉由使用中尺度診斷測定法檢測IL8。

結果指示，IL-8釋放係劑量依賴性的（圖21B）。存在33_640087_7B抑制了IL-8的釋放（圖21C）。因此，在系膜細胞中，IL-33拮抗劑可用於抑制還原型IL-33介導的自分泌或旁分泌炎性反應。

為了研究IL-33傳訊可能促成在DKD中觀察到的系膜擴張，用IL-33刺激原代人系膜細胞，並且在體外測量該等細胞的增殖。簡言之，使人原代系膜細胞生長至匯合，接種在96孔板中，然後饑餓24 h，並且用各劑量濃度的redIL-33、oxIL-33或作為陽性對照的PDGF-BB處理18 h。然後，將細胞用10 uM EdU溶液再脈衝處理4 h。EdU暴露允許直接測量合成DNA的細胞。遵循製造商的說明，藉由使用Amplex™ UltraRed試劑並且測量螢光發射來評估EdU摻入。

如圖21D中所示，oxIL-33以劑量依賴性方式誘導人系膜細胞的增殖。該等結果表明，在糖尿病性腎病進展期間，oxIL-33，但不是redIL-33，可能參與系膜細胞擴張。 實例 10 - OxIL-33 損害深層單層上皮培養物中的刮傷修復反應 與 EGF 相反， oxIL-33 損害 A549 和 NHBE 細胞中的刮傷閉合

從ATCC獲得A549上皮細胞，並在補充有1%青黴素/鏈黴素和10% FBS的RPMI GlutaMax培養基中培養。用accutase（PAA，# L1 1-007）收穫細胞，以5 x 10⁵ 個/100 µl接種到96孔板中，並在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。然後將孔用100 µl PBS洗滌兩次，隨後添加100 µl饑餓培養基（補充有1%青黴素/鏈黴素的RPMI GlutaMax培養基），並在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。使用WoundMakerTM（埃森生物科學公司（Essen Bioscience））刮傷細胞，然後將孔用200 µl PBS洗滌2次，隨後添加補充有0.1% FBS（v/v）和1%（v/v）青黴素/鏈黴素的、含有指定刺激的RPMI GlutaMax培養基或單獨的培養基（未刺激的對照）、30 ng/ml還原型IL-33、30 ng/mL氧化型IL-33或30 ng/mL EGF，並放回37°C、5% CO₂ 中。將板放置在IncucyteZoom中以在48小時內進行傷口癒合成像和分析。藉由Incucyte Zoom軟體中的傷口癒合演算法計算相對傷口密度。

從龍沙公司獲得正常的人支氣管上皮細胞（NHBE）（CC-2540），並根據製造商的方案維持在完全BEGM培養基[BEGM（龍沙公司CC-3171）和補充套組（龍沙公司CC-4175）]中。用accutase收穫細胞，並以5x10⁵ 個/100 µl接種在96孔ImageLock板（賽多利斯公司（Sartorius），4379）中的培養基中。將該等板在37°C、5% CO₂ 下孵育18-24小時。此後，吸出培養基，並將細胞用100 µl PBS洗滌兩次，隨後添加饑餓培養基（BEGM（龍沙公司CC-3171），無補充套組，補充有1%青黴素/鏈黴素）。然後將該等板在37°C、5% CO₂ 下再孵育18-24小時，之後進行刮傷。使用WoundMakerTM（埃森生物科學公司）刮傷細胞，然後將孔用200 µl PBS洗滌2次，隨後添加補充有0.1% FBS（v/v）和1%（v/v）青黴素/鏈黴素的、含有指定刺激的BEBM培養基（龍沙公司）或單獨的培養基（未刺激的對照）、30 ng/ml還原型IL-33、30 ng/mL氧化型IL-33或30 ng/mL EGF，並放回37°C、5% CO₂ 中。將板放置在IncucyteZoom中以在48小時內進行傷口癒合成像和分析。藉由Incucyte Zoom軟體中的傷口癒合演算法計算相對傷口密度。如圖22中所示，oxIL-33抑制A549細胞（圖22A）和NHBE細胞（圖22B）的深層培養物中的傷口癒合，這與EGF（在其中觀察到受傷細胞密度增加）有相反的作用。可以藉由中和 RAGE 或 EGFR 而不中和 ST2 的抗體來阻止氧化型 IL-33 對刮傷閉合的損害

為了瞭解oxIL-33的該等功能作用是否藉由RAGE/EGFR介導，如以上所述，但在中和不同受體組分的抗體存在下，在NHBE細胞中進行刮傷測定。在10 µg/mL抗ST2（AF532，R&D系統公司）、抗RAGE（M4F4，WO 2008137552）或抗EGFR（殖株LA1，05-101，密理博公司）存在下，用單獨的培養基（未刺激的對照）、還原型IL-33或氧化型IL-33處理NHBE細胞。OxIL-33，而不是還原型IL-33，抑制刮傷閉合。oxIL-33的此作用可被抗RAGE和抗EGFR而非抗ST2逆轉，這再次證明RAGE和EGFR係參與氧化型IL-33傳訊通路的必需受體（圖23）。

刮傷測定還可以用於檢查上皮細胞對慢性腎臟疾病微環境中提到的損傷的反應。簡言之，按20,000-30,000/孔，將RPTEC接種在96孔板中，持續24 hr（第1天）。在第2天，使PTEC細胞血清饑餓過夜。在第3天，使用傷口標記（埃森生物科學公司）造成刮傷，並且用PBS洗滌細胞兩次，以去除脫離的細胞。然後施加刺激（100 ul/孔），並且在0.1%血清培養基中進行稀釋，除了用作陽性對照的在充分補充的培養基中的細胞以外。將板插入Incucyte（Incucyte S3 2019A）並且根據製造商的說明進行設置，以測量0 hr時的相對傷口密度（基線），並且然後每4 hr進行測量，持續4天，以測量相對傷口閉合。

總之，實例中呈現的數據證明，在腎臟上皮、內皮和腎小球中，炎症介質上調IL-33的產生。在腎臟內皮細胞中，RedIL-33似乎藉由NFkB激活（ST2依賴性的）、經由自分泌或旁分泌機制來進行傳訊。Red-IL33傳訊介導腎小球內皮分泌促炎性細胞介素，這可能加劇了體內腎臟損傷。此外，在腎臟上皮中，oxIL-33激活RAGE/EGFR傳訊通路（RAGE依賴性的）。懷疑RAGE/EGFR傳訊促成腎臟損傷的病理生理學。還已經顯示，在腎臟疾病的多個臨床前模型中，RAGE在腎臟中的表現增強。在腎臟疾病中，Il-33表現增強。這意味著在CKD的腎臟中，redIL-33和oxIL-33兩者的濃度都可能增加。鑒於在損傷期間的腎臟中ST-2似乎出人意料地下調，RAGE-EGFR/IL-33系統可能促成腎臟疾病中的IL-33介導的病理學。另外的序列 配對1 HCDR1       SEQ ID NO 37: SYAMS 配對1 HCDR2       SEQ ID NO 38: GISAIDQSTYYADSVKG 配對1 HCDR3       SEQ ID NO 39: QKFMQLWGGGLRYPFGY 配對1 LCDR1       SEQ ID NO 40: SGEGMGDKYAA 配對1 LCDR2       SEQ ID NO 41: RDTKRPS 配對1 LCDR3       SEQ ID NO 42: GVIQDNTGV N末端His10/Avitag/因子Xa蛋白酶切割位點 SEQ ID NO 43: MHHHHHHHHHHAAGLNDIFEAQKIEWHEAAIEGR IL-33-01 SEQ ID NO 44: SITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET IL-33-16 SEQ ID NO 45: SITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKSEKPLPDQAFFVLHNMHSNSVSFESKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLSTENILFKLSET Avitag序列模體 SEQ ID NO 46: GLNDIFEAQKIEWHE 靶向RAGE外顯子3的gRNA載體 SEQ ID NO 47: TGAGGGGATTTTCCGGTGC RAGE正向引物 SEQ ID NO 48: gttgcagcctcccaacttc RAGE反向引物 SEQ ID NO 49: aatgaggccagtggaagtca

無

[圖 1 ]： 從ERCB組群（A）、Ju 2013組群（B）和Woroniecka組群（C）分析IL33的腎小球和腎小管間質RNA表現。

[圖 2 ]： (A) 在正常和糖尿病腎臟中的ST2的RNA表現，和 (B) ST2的RNA表現在腎臟皮質中是富集的（穩定狀態）。

[圖 3 ]： IL33 mRNA在臨床前CKD小鼠模型中之表現。

[圖 4 ]： RAGE mRNA在臨床前CKD小鼠模型中之表現。

[圖 5 ]： 使用具有抗ST2和抗RAGE干預的db/db UNX模型，臨床前CKD模型設計

[圖 6 ]： 與同型對照抗體治療（NIP）相比，在抗ST2和抗RAGE治療的小鼠中，在第13和15週時測量的db/db UNX CKD模型中的UACR變化，顯示為絕對值

[圖 7 ]： 與同型對照抗體治療（NIP）相比，在抗ST2和抗RAGE治療的小鼠中，在第13和15週時測量的db/db UNX CKD模型中的UACR變化，顯示為與第10週相比，在第13和15週的百分比變化。

[圖 8 ]： 當用抗ST2或同型對照抗體治療（NIP）進行治療時，在db/db UNX臨床前CKD模型中的腎小球損傷評分（GDS）

[圖 9 ]： 顯示了對於在MAP激酶磷酸化抗體陣列上的檢測測定中的每一種而言，與未處理的對照相比，在激酶磷酸化中倍數增加之灰度熱圖。還原型IL-33（分別是IL-33-01和IL-33-16）不引起高於基線的任何訊號。oxIL-33（氧化型IL-33-01）引起多種激酶的磷酸化增加；

[圖 10 ]： 顯示了在受體酪胺酸激酶（RTK）活性陣列上針對每種刺激條件的訊號模式。oxIL-33（但分別不是還原型IL33-01和IL33-16）在RTK陣列上引發對應於表皮生長因子受體（EGFR）的正訊號。點強度與受體酪胺酸激酶磷酸化相關；

[圖 11A ]： 顯示了在用濃度增加的IL-33或EGFR配位基刺激的正常人支氣管上皮（NHBE）細胞中之pEGFR（Tyr1068）活性。oxIL-33，而不是還原型IL-33（IL33-01），促進EGFR的與EGF、HB-EGF和TGFα類似的磷酸化；

[圖 11B ]： 顯示了在用濃度增加的IL-33或EGFR配位基刺激的A549細胞中之pEGFR（Tyr1068）活性。oxIL-33（氧化型IL-33-01），而不是還原型IL-33（IL-33-01），以與NHBE細胞中所見的類似模式，促進EGFR的與EGF、HB-EGF和TGFα類似的磷酸化；

[圖 11C ]： 顯示了在用濃度增加的IL-33、EGFR配位基或RAGE配位基刺激的A549細胞中之pEGFR（Tyr1068）活性。oxIL-33，而不是野生型（WT）IL-33（IL-33-01）、C-＞S突變的（mut）IL-33（IL-33-16）或RAGE配位基，促進EGFR的與EGF類似的磷酸化；

[圖 12 ]： 顯示了氧化型IL-33誘導EGFR通路中涉及的多種分子（EGFR、PLC、AKT、JNK、ERK 1/2、p38）的磷酸化，如藉由西方墨點法進行分析；

[圖 13 ]： 顯示了與同型對照相比，藉由劑量增加的抗EGFR抗體，減少了oxIL-33誘導的STAT5磷酸化；

[圖 14 ]： 顯示了用抗EGFR進行免疫沈澱，隨後藉由西方墨點法檢測EGFR、RAGE或IL-33。在用oxIL-33刺激NHBE之後，IL-33和RAGE與EGFR共沈澱，這表明它們形成了複合物。與EGF相比，RAGE似乎係oxIL-33傳訊複合物所特有的；

[圖 15A ]： 顯示了oxIL-33直接結合RAGE。HMGB1係已知的RAGE配位基，並且充當此研究中的陽性對照；

[圖 15B ]： 顯示了oxIL-33並不直接結合EGFR（但是已知的EGFR配位基EGF直接結合EGFR）。然而，當將RAGE與oxIL-33組合添加至此測定中時，則見到EGFR結合；

[圖 16 ]： 顯示了在指示的時間點，在用oxIL-33激活後，在野生型和RAGE缺陷型A549細胞中，用抗EGFR或抗RAGE進行免疫沈澱，隨後針對EGFR、RAGE和IL-33進行西方墨點法；

[圖 17 ]： 顯示了抗RAGE抗體，而不是抗ST2抗體，減少了由oxIL-33-01誘導的STAT5磷酸化；

[圖 18 ]： 顯示了 (A) 響應於炎症介質，原代近端腎小管上皮細胞（PTEC）分泌IL33。還顯示了藉由NFkB易位而檢測到的PTEC響應於外源IL-1b（但不響應於外源redIL-33），(B) (C) 顯示了藉由分泌炎性細胞介素IL-6、IL8、TNFa和IL1b，PTEC不以劑量依賴性方式響應於IL-33。(D) 顯示了當用redIL-33處理時，PTEC不增加p38或JNK（高於基線水平的ST2傳訊軸激活的兩種下游介質）的激活。(E) 顯示了當用外源oxIL33或EGF（而不是redIL-33或S1001A9（RAGE配位基））處理時，檢測到PTEC中磷酸化EGFR（pEGFR）增加。在抗RAGE和抗EGFR抗體存在下，當oxIL33處理時，PTEC中增加的pEGFR係減少的 (F)。(G) 顯示了當暴露於oxIL-33但不暴露於還原型IL-33時，KIM-1在PTEC中是增加的。

[圖 19 ]： (A) 顯示了響應於炎症介質，體外原代腎小球內皮細胞（GEnC）分泌IL33增加。(B) 顯示了藉由增加NFkB易位，GEnC響應於外源redIL33處理。在抗IL-33抗體存在下，響應被阻斷 (C)。(D) 顯示了當用redIL-33而不用oxIL-33刺激時，GEnC分泌炎性細胞介素IL-6和IL-8。IL-8的分泌。當用redIL33處理時，來自GEnC的TNFa、IL1b和IL-6以劑量依賴性方式增加 (E)

[圖 20 ]： (A) 顯示了響應於IL33，原代腎小球內皮細胞（GEnC）分泌炎性細胞介素。在抗IL33抗體存在下，分泌被阻斷。(B) 顯示了redIL-33激活p38和JNK激酶活性，該激酶活性在33-640087_7B存在下受到抑制。

[圖 21 ]： (A) 顯示了在人原代系膜細胞中的IL-33傳訊。當被干擾素γ和TNFα脅迫時，系膜細胞上調IL-33的水平。當暴露於濃度增加的IL-33時，系膜細胞以劑量依賴性方式分泌IL-8 (B)。(C) 顯示了在33-640087_7B存在下，系膜細胞分泌IL-8受到抑制。(D) 顯示了濃度增加的oxIL-33增加系膜細胞增殖。

[圖 22A ]：顯示了在用還原型IL-33、oxIL-33或EGF處理後，A549細胞的相對傷口癒合密度。橫條圖顯示了每種條件下，來自6個技術重複的平均值和SEM；

[圖 22B ]：顯示了在用還原型IL-33、oxIL-33或EGF處理後，NHBE細胞的相對傷口癒合密度。橫條圖顯示了每種條件下，來自6個技術重複的平均值和SEM；

[圖 23 ]：顯示了在抗ST2、抗RAGE或抗EGFR存在下，用單獨的培養基（未刺激的對照）、還原型IL-33、氧化型IL-33、或氧化型IL-33處理的NHBE細胞的刮傷閉合百分比。橫條圖顯示了每種條件下，來自6個技術重複的平均值和SEM。

無

Claims (72)

1. 一種用於在治療受試者的腎臟損傷之方法中使用的抗IL-33治療劑，其中將該抗IL-33治療劑投與於受試者，以減弱或抑制IL-33介導的ST2傳訊和IL-33介導的RAGE傳訊。
2. 用於如請求項1所述使用的抗IL-33治療劑，其中該IL-33介導的RAGE傳訊係IL-33介導的RAGE-EGFR傳訊。
3. 用於如請求項1所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗IL-33治療劑減弱或抑制還原型IL-33蛋白（redIL-33）的活性，並且由此抑制ST2傳訊。
4. 用於如請求項1至3中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗IL-33治療劑減弱或抑制氧化型IL-33蛋白（oxIL-33）的活性，並且由此抑制RAGE傳訊。
5. 用於如請求項1至4中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該腎臟損傷包括炎症。
6. 用於如請求項5所述使用的抗IL-33治療劑，其中該腎臟損傷係炎性腎臟損傷。
7. 用於如請求項5或6所述使用的抗IL-33治療劑，其中該腎臟損傷選自糖尿病性腎病、纖維化、腎小球腎炎（例如非增生性（例如輕微病變性腎小球腎炎、膜型腎小球腎炎、局灶性節段性腎小球硬化）或增生性（例如IgA腎病、膜性增生性腎小球腎炎、感染後腎小球腎炎、和急進性腎小球腎炎[例如古巴士德氏症候群和血管炎性障礙{其包括韋格納肉芽腫病和顯微鏡下多血管炎}]）、全身性紅斑狼瘡、蛋白尿、單側輸尿管梗阻、奧爾波特症候群、多囊腎病（PCKD）、高血壓性腎小球硬化症、慢性腎小球硬化症、慢性梗阻性尿路病、慢性腎小管-間質腎炎和缺血性腎病。
8. 用於如請求項1至7中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該腎臟損傷係糖尿病性腎病。
9. 用於如請求項1至8中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗IL-33治療劑選自化學抑制劑以及抗體或其抗原結合片段。
10. 用於如請求項9所述使用的抗IL-33治療劑，其中該治療劑包含抗體或其抗原結合片段。
11. 用於如請求項9或10所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合IL-33。
12. 用於如請求項11所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或抗原結合片段具有選自表1的可變重結構域（VH）和可變輕結構域（VL）配對的互補決定區（CDR）。
13. 用於如請求項11或12所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合redIL-33，並且減弱或抑制redIL-33的活性，由此抑制ST2傳訊。
14. 用於如請求項11至13中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段阻止氧化型IL-33結合RAGE，由此抑制RAGE-EGFR傳訊。
15. 用於如請求項11至14中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 pM、或小於或等於10 pM，例如小於或等於1 pM，例如0.5 pM，尤其是0.05 pM的結合親和力（例如當使用KinExA進行測量時）結合redIL-33。
16. 用於如請求項11至15中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段以大於或等於10⁵ M^-1 sec^-1 、5 X 10⁵ M^-1 sec^-1 、10⁶ M^-1 sec^-1 、或5 X 10⁶ M^-1 sec^-1 或10⁷ M^-1 sec^-1 、尤其是大於或等於10⁷ M^-1 sec^-1 的k(on)結合redIL-33。
17. 用於如請求項11至16中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於5 X 10^-1 sec^-1 、10^-1 sec^-1 、5 X 10^-2 sec^-1 、10^-2 sec^-1 、5 X l0^-3 sec^-1 或10^-3 sec^-1 、尤其是小於或等於10^-3 sec^-1 的k(off)結合redIL-33。
18. 用於如請求項11至17中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或抗原結合片段減弱或抑制oxIL-33的活性，並且由此抑制RAGE傳訊。
19. 用於如請求項10至18中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 37的序列的VHCDR1、具有SEQ ID NO: 38的序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO: 39的序列的VHCDR3、具有SEQ ID NO: 40的序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO: 41的序列的VLCDR2、以及具有SEQ ID NO: 42的序列的VLCDR3。
20. 用於如請求項10至19中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或者所述抗體或其抗原結合片段的抗原結合VH和VL分別包含與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 19具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
21. 用於如請求項20所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 1的序列的VH和具有SEQ ID NO: 19的序列的VL。
22. 用於如請求項10至21中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段係人類抗體、嵌合抗體、和人源化抗體。
23. 用於如請求項10至22中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或該抗體或其抗原結合片段係天然存在的抗體、scFv片段、Fab片段、F(ab')2片段、微型抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體或單鏈抗體。
24. 用於如請求項10至23中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該抗體或其抗原結合片段係單株抗體。
25. 用於如請求項2至24中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中抑制或減弱RAGE-EGFR傳訊下調或抑制了RAGE-EGFR介導的效應。
26. 用於如請求項25所述使用的抗IL-33治療劑，其中該RAGE-EGFR介導的效應包括異常上皮生理學，例如異常上皮重塑。
27. 用於如請求項25所述使用的抗IL-33治療劑，其中該RAGE-EGFR介導的效應包括異常系膜擴張。
28. 用於如請求項27所述使用的抗IL-33治療劑，其中異常系膜擴張包括異常系膜細胞增殖。
29. 用於如請求項1至28中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中抑制或減弱ST2傳訊下調或抑制了ST2介導的效應。
30. 用於如請求項29所述使用的抗IL-33治療劑，其中該ST2介導的效應係腎臟中的異常炎症。
31. 用於如請求項30所述使用的抗IL-33治療劑，其中該異常炎症係在內皮中。
32. 用於如請求項31所述使用的抗IL-33治療劑，其中該異常炎症包括增加的IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、TNFa和/或IL1b分泌或表現，視需要增加的IL-4、IL-6、IL-8和/或IL-12分泌或表現。
33. 用於如請求項31或32中任一項所述使用的抗IL-33治療劑，其中該異常炎症包括MAP激酶激活。
34. 用於如請求項33所述使用的抗IL-33治療劑，其中MAP激酶激活包括p38或JNK激酶激活。
35. 用於如請求項30所述使用的抗IL-33治療劑，其中該異常炎症係在腎小球中。
36. 用於如請求項35所述使用的抗IL-33治療劑，其中該異常炎症包括增加的IL-8分泌或表現。
37. 一種治療有需要的受試者中的腎臟損傷之方法，該方法包括向該受試者投與抗IL-33治療劑，以減弱或抑制IL-33介導的ST2傳訊和IL-33介導的RAGE傳訊。
38. 如請求項37所述之方法，其中該IL-33介導的RAGE傳訊係IL-33介導的RAGE-EGFR傳訊。
39. 如請求項37或38所述之方法，其中該抗IL-33治療劑減弱或抑制還原型IL-33蛋白（redIL-33）的活性，並且由此抑制ST2傳訊。
40. 如請求項37至39所述之方法，其中該抗IL-33治療劑減弱或抑制氧化型IL-33蛋白（oxIL-33）的活性，並且由此抑制RAGE傳訊。
41. 如請求項37至40中任一項所述之方法，其中該腎臟損傷包括炎症。
42. 如請求項41所述之方法，其中該腎臟損傷係炎性腎臟損傷。
43. 如請求項41或42所述之方法，其中該腎臟損傷選自糖尿病性腎病、纖維化、腎小球腎炎（例如非增生性（例如輕微病變性腎小球腎炎、膜型腎小球腎炎、局灶性節段性腎小球硬化）或增生性（例如IgA腎病、膜性增生性腎小球腎炎、感染後腎小球腎炎、和急進性腎小球腎炎[例如古巴士德氏症候群和血管炎性障礙{其包括韋格納肉芽腫病和顯微鏡下多血管炎}]）、全身性紅斑狼瘡、蛋白尿、單側輸尿管梗阻、奧爾波特症候群、多囊腎病（PCKD）、高血壓性腎小球硬化症、慢性腎小球硬化症、慢性梗阻性尿路病、慢性腎小管-間質腎炎和缺血性腎病。
44. 如請求項37至43中任一項所述之方法，其中該腎臟損傷係糖尿病性腎病。
45. 如請求項37至44中任一項所述之方法，其中該抗IL-33治療劑選自化學抑制劑以及抗體或其抗原結合片段。
46. 如請求項45所述之方法，其中該治療劑包含抗體或其抗原結合片段。
47. 如請求項45或46所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合IL-33。
48. 如請求項47所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段具有選自表1的可變重結構域（VH）和可變輕結構域（VL）配對的互補決定區（CDR）。
49. 如請求項47或48所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合redIL-33，並且減弱或抑制redIL-33的活性，由此抑制ST2傳訊。
50. 如請求項47至49中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段阻止氧化型IL-33結合RAGE，由此抑制RAGE-EGFR傳訊。
51. 如請求項47至50中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 pM、或小於或等於10 pM，例如小於或等於1 pM，例如0.5 pM，尤其是0.05 pM的結合親和力（例如當使用KinExA進行測量時）結合redIL-33。
52. 如請求項47至51中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段以大於或等於10⁵ M^-1 sec^-1 、5 X 10⁵ M^-1 sec^-1 、10⁶ M^-1 sec^-1 、或5 X 10⁶ M^-1 sec^-1 或10⁷ M^-1 sec^-1 、尤其是大於或等於10⁷ M^-1 sec^-1 的k(on)結合redIL-33。
53. 如請求項47至52中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於5 X 10^-1 sec^-1 、10^-1 sec^-1 、5 X 10^-2 sec^-1 、10^-2 sec^-1 、5 X l0^-3 sec^-1 或10^-3 sec^-1 、尤其是小於或等於10^-3 sec^-1 的k(off)結合redIL-33。
54. 如請求項47至53中任一項所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段減弱或抑制oxIL-33的活性，並且由此抑制RAGE傳訊。
55. 如請求項47至54中任一項所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 37的序列的VHCDR1、具有SEQ ID NO: 38的序列的VHCDR2、具有SEQ ID NO: 39的序列的VHCDR3、具有SEQ ID NO: 40的序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO: 41的序列的VLCDR2、以及具有SEQ ID NO: 42的序列的VLCDR3。
56. 如請求項47至55中任一項所述之方法，其中該抗體或者所述抗體或其抗原結合片段的抗原結合VH和VL分別包含與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 19具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
57. 如請求項56所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 1的序列的VH和具有SEQ ID NO: 19的序列的VL。
58. 如請求項47至57中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係人類抗體、嵌合抗體、和人源化抗體。
59. 如請求項47至57中任一項所述之方法，其中該抗體或該抗體或其抗原結合片段係天然存在的抗體、scFv片段、Fab片段、F(ab')2片段、微型抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體或單鏈抗體。
60. 如請求項47至59中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係單株抗體。
61. 如請求項48至60所述之方法，其中抑制或減弱RAGE-EGFR傳訊下調或抑制了RAGE-EGFR介導的效應。
62. 如請求項61所述之方法，其中該RAGE-EGFR介導的效應包括異常上皮生理學，例如異常上皮重塑。
63. 如請求項61所述之方法，其中該RAGE-EGFR介導的效應包括異常系膜擴張。
64. 如請求項63所述之方法，其中異常系膜擴張包括異常系膜細胞增殖。
65. 如請求項47至64中任一項所述之方法，其中抑制或減弱或ST2傳訊下調或抑制了ST2介導的效應。
66. 如請求項65所述之方法，其中該ST2介導的效應係腎臟中的異常炎症。
67. 如請求項66所述之方法，其中該異常炎症係在內皮中。
68. 如請求項67所述之方法，其中該異常炎症包括增加的IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、TNFa和/或IL1b分泌或表現，視需要增加的IL-4、IL-6、IL-8和/或IL-12分泌或表現。
69. 如請求項67所述之方法，其中該異常炎症包括MAP激酶激活。
70. 如請求項69所述之方法，其中MAP激酶激活包括p38或JNK激酶激活。
71. 如請求項66所述之方法，其中該異常炎症係在腎小球中。
72. 用於如請求項71所述使用的抗IL-33治療劑，其中該異常炎症包括增加的IL-8分泌或表現。

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