BR112019021547A2 - Anticorpos agonistas de btla e seu uso - Google Patents

Anticorpos agonistas de btla e seu uso Download PDF

Info

Publication number
BR112019021547A2
BR112019021547A2 BR112019021547-6A BR112019021547A BR112019021547A2 BR 112019021547 A2 BR112019021547 A2 BR 112019021547A2 BR 112019021547 A BR112019021547 A BR 112019021547A BR 112019021547 A2 BR112019021547 A2 BR 112019021547A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
acid sequence
fact
Prior art date
Application number
BR112019021547-6A
Other languages
English (en)
Inventor
Krummen Atwell Shane
H. Obungu Victor
Charles Vendel Andrew
Original Assignee
Eli Lilly And Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly And Company filed Critical Eli Lilly And Company
Publication of BR112019021547A2 publication Critical patent/BR112019021547A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

anticorpos que se ligam ao btla e métodos de seu uso são fornecidos, ditos anticorpos são úteis como agentes para o tratamento de condições associadas com a doença autoimune, incluindo o tratamento de lúpus.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ’’ANTICORPOS AGONISTAS DE BTLA E SEU USO.
[0001] A presente invenção está no campo da medicina. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a anticorpos direcionados contra o Atenuador de Linfócitos B e T (BTLA) e suas composições farmacêuticas. Espera-se que os anticorpos da presente invenção sejam úteis no tratamento de doenças autoimunes tais como lúpus.
[0002] O lúpus é uma doença autoimune com características heterogêneas, incluindo as manifestações na pele, orais, musculares e articulações, cardíacas, no sangue periférico, pulmonares, renais, reprodutivas e no CNS. Os pacientes com lúpus estão em risco de doenças cardiovasculares, renais e neuropsiquiátricas graves e potencialmente letais.O padrão de cuidado inclui numerosos esteroides, os quais possuem muitos efeitos colaterais desfavoráveis e/ou perigosos. Existe uma necessidade com relação a terapias para o controle de doenças e que leve em conta a redução ou eliminação do uso de esteroides.
[0003] O Atenuador de Linfócitos B e T (BTLA; CD272) é um membro da superfamília de Ig e parte de uma família de receptores do ponto de controle que regulam negativamente a ativação da célula imune. O BTLA é príncipalmente expresso nas células B, células T e células dendríticas. O ligante natural para o BTLA é o membro da superfamília de receptor de TNF, mediador de entrada do vírus do herpes (HVEM; TNFRSF14).
[0004] O HVEM-Fc humano tem sido relatado de se ligar ao BTLA humano expresso nas células 293T com uma Kd de 112 nM conforme detectado pela citometria de fluxo. (Cheung et al., PNAS, Sept. 13, 2005, 102:37; 13218-13223). A ligação de HVEM ao BTLA leva à fosforilação da tirosina de dois domínios de motivo inibidores à base
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 15/116
2/43 de tirosina imunorreceptores conservados no domínio citoplásmico de BTLA. Esta fosforilação leva ao recrutamento, por meio de dois domínios de homologia de Src 2, da proteína tirosina fosfatases que conferem a atividade inibitória do BTLA através da desfosforilação e infrarregulação da sinalização do receptor de células positivas (por exemplo, cascatas de transdução de sinal do receptor de célula T ou do receptor da célula B), levando assim à supressão da ativação de células imunes. Em um modelo de camundongo propenso a desenvolver espontaneamente doenças semelhantes a lúpus (camundongos MRL-lpr), os camundongos deficientes de BTLA possuem infiltração linfocítica mais severa nas glândulas salivares, pulmões, pâncreas, rins e articulações em comparação com camundongos que expressam o BTLA. Portanto, os anticorpos agonistas de BTLA podem fornecer um benefício para pacientes tendo doenças autoimunes tais como lúpus.
[0005] Os anticorpos agonistas de BTLA sâo conhecidos na técnica. Por exemplo, a Patente U.S. Número 8.563.694 (a patente '694) divulga anticorpos de agonista de BTLA que bloqueiam (Mab21H6 e Mab19A7) ou não bloqueiam (Mab8D5 e Mab8A3) HVEM que se ligam ao BTLA. A patente'694 descreve uma necessidade contínua de desenvolver tratamentos que exploram o papel inibidor do BTLA em respostas de linfócitos, enquanto que leva em conta a ligação de BTLA-HVEM. No entanto, existe uma falta de anticorpos agonistas de BTLA que imitam a ligação de HVEM ao BTLA Para o tratamento de doenças autoimunes. Um anticorpo imita a ligação de HVEM ao BTLA se o anticorpo tiver um epitopo que se sobrepõe significativamente ao sítio de ligação do HVEM, e existe uma similaridade estrutural entre o anticorpo e o HVEM. Existe também uma carência de anticorpos agonistas de BTLA que se ligam ao BTLA humano e são úteis para estudar em modelos pré-clínicos in vivo de
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 16/116
3/43 doenças autoimunes tais como modelos de murinos e macacos cinomolgos. Assim, permanece a necessidade de anticorpos antagonistas de BTLA alternativos.
[0006] Os anticorpos da presente invenção procuram fornecer anticorpos agonistas de BTLA alternativos. Tais anticorpos agonistas de BTLA podem ser úteis no tratamento de doenças autoimunes tais como lúpus. Tais anticorpos agonistas de BTLA são capazes de se ligar ao BTLA de múltiplas espécies tais como o BTLA de ser humano, macaco cinomolgo e/ou murino. Além disso, tais anticorpos agonistas de BTLA demonstram atividade in vitro aumentada em comparação com um anticorpo tendo a mesma região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve como Mab8D5. Os anticorpos da presente invenção possuem pelo menos uma destas características desejáveis.
[0007] Um tal anticorpo agonista de BTLA é capaz de se ligar ao BTLA de ser humano, macaco cinomolgo e murino. Surpreendentemente, este anticorpo tem esta reatividade cruzada desejada porque imita a ligação de HVEM ao BTLA. Este anticorpo também possui uma afinidade de ligação mais elevada com o BTLA em comparação com o HVEM que se liga ao BTLA. Isto pode fornecer um benefício para os pacientes tendo estados doentios com níveis transitórios de HVEM, em que pode ser desejável ter um anticorpo agonista de imitação de BTLA embarcado durante os momentos quando o paciente tem uma redução no HVEM.
[0008] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam ao BTLA e ativam e/ou intensificam a sinalização mediada por BTLA (anticorpos agonistas de BTLA). A presente invenção fornece um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) e uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que a LCVR compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDRs)
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 17/116
LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e a HCVR compreende as CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e em que a sequência de aminoácido da LCDR1 é a SEQ ID NO: 22, a sequência de aminoácido da LCDR2 é a SEQ ID NO: 25, a sequência de aminoácido da LCDR3 é a SEQ ID NO: 28, a sequência de aminoácido da HCDR1 é a SEQ ID NO: 13, a sequência de aminoácido da HCDR2 é a SEQ ID NO: 16 e a sequência de aminoácido da HCDR3 é a SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma LCVR e uma HCVR, e em que a sequência de aminoácido da LCVR é a SEQ ID NO: 4, e a sequência de aminoácido da HCVR é a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, ο anticorpo compreende uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), e em que a sequência de aminoácido da LC é a SEQ ID NO: 2 e a sequência de aminoácido da HC é a SEQ ID NO: 1. Em mais outra modalidade, o anticorpo compreende 2 LCs e 2 HCs, em que a sequência de aminoácido de cada LC é a SEQ ID NO: 2 e a sequência de aminoácido de cada HC é a SEQ ID NO: 1.
[0009] A presente invenção também fornece um anticorpo agonista de BTLA em que a sequência de aminoácido da LCDR1 é a SEQ ID NO: 23, a sequência de aminoácido da LCDR2 é a SEQ ID NO: 26, a sequência de aminoácido da LCDR3 é a SEQ ID NO: 29, a sequência de aminoácido da HCDR1 é a SEQ ID NO: 14, a sequência de aminoácido da HCDR2 é a SEQ ID NO: 17 e a sequência de aminoácido da HCDR3 é a SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da LCVR é a SEQ ID NO: 8 e a sequência de aminoácido da HCVR é a SEQ ID NO: 7. Em outra modalidade, a sequência de aminoácido da LC é a SEQ ID NO: 6 e a sequência de aminoácido da HC é a SEQ ID NO: 5. Em mais outra modalidade, o anticorpo compreende 2 LCs e 2 HCs, em que a sequência de aminoácido de cada LC é a SEQ ID NO: 6 e a sequência de aminoácido de cada HC é a SEQ ID NO: 5.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 18/116
5/43
[0010] A presente invenção também fornece um anticorpo agonista de BTLA em que a sequência de aminoácido da LCDR1 é a SEQ ID NO: 24, a sequência de aminoácido da LCDR2 é a SEQ ID NO: 27, a sequência de aminoácido da LCDR3 é a SEQ ID NO: 30, a sequência de aminoácido da HCDR1 é a SEQ ID NO: 15, a sequência de aminoácido da HCDR2 é a SEQ ID NO: 18 e a sequência de aminoácido da HCDR3 é a SEQ ID NO: 21. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da LCVR é a SEQ ID NO: 12 e a sequência de aminoácido da HCVR é a SEQ ID NO: 11. Em outra modalidade, a sequência de aminoácido da LC é a SEQ ID NO: 10 e a sequência de aminoácido da HC é a SEQ ID NO: 9. Em mais outra modalidade, o anticorpo compreende 2 LCs e 2 HCs, em que a sequência de aminoácido de cada LC é a SEQ ID NO: 10 e a sequência de aminoácido de cada HC é a SEQ ID NO: 9.
[0011] A presente invenção também fornece um anticorpo que se liga ao BTLA, em que o anticorpo é gerado por etapas que compreendem a imunização de coelhos com domínio extracelular marcado com Fc (ECD) de BTLA humano e reforço com proteínas marcadas com BTLA-Fc de ser humano e camundongo. A sequência de aminoácido do ECD de BTLA de ser humano é os aminoácidos de 31 a 150 da SEQ ID NO: 31.
[0012] A presente invenção fornece um anticorpo agonista de BTLA que imita o HVEM que se liga ao BTLA. A presente invenção também fornece um anticorpo agonista de BTLA que é capaz de se ligar ao BTLA de ser humano, macaco cinomolgo e murino.
[0013] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da presente invenção, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas no tratamento de uma ou
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 19/116
6/43 mais doenças reumáticas, neurais e dermatológicas, por meio do qual tal tratamento compreende a administração a um paciente com sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modalidades particulares, a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide. Em outras modalidades particulares, a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase. Em outras modalidades particulares, a doença neural é esclerose múltipla.
[0014] A presente invenção também fornece um método de tratamento de um paciente tendo uma ou mais de doença reumático, neural e dermatológica, compreendendo a administração a um paciente com sua necessidade de uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. Em algumas dessas modalidades, a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide. Em outras modalidades particulares, a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase. Em outras modalidades particulares, a doença neural é esclerose múltipla.
[0015] A presente invenção também fornece um anticorpo da presente invenção ou sua composição farmacêutica para uso em terapia. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção ou sua composição farmacêutica para uso no tratamento de uma ou mais de doença reumática, neural e dermatológica. Em algumas tais modalidades, a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide. Em outras modalidades particulares, a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase. Em outras modalidades particulares, a doença neural é esclerose múltipla.
[0016] A presente invenção também fornece o uso de um
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 20/116
7/43 anticorpo da presente invenção ou uma composição farmacêutica deste na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma ou mais de doença reumática, neural e dermatológica. Em algumas dessas modalidades, a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide. Em outras modalidades particulares, a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase. Em outras modalidades particulares, a doença neural é esclerose múltipla.
[0017] A presente invenção fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 9. A presente invenção também fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10.
[0018] A presente invenção fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. A presente invenção também fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possuí a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade particular, a sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 é a SEQ ID NO: 35 e a sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 é a SEQ ID NO: 36.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 21/116
8/43
[0019] A presente invenção também fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6. A presente invenção também fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade particular, a sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 é a SEQ ID NO: 37, a sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 é a SEQ ID NO: 38.
[0020] A presente invenção também fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. A presente invenção também fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade particular, a sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 é a SEQ ID NO: 39, a sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 é a SEQ ID
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 22/116
9/43
NO: 40.
[0021] Além disso, a presente invenção fornece uma célula de mamífero que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. A presente invenção também fornece uma célula de mamífero que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6. A presente invenção também fornece uma célula de mamífero que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a linhagem celular de mamífero é uma linhagem celular de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou rim embriônico de Hamster (HEK).
[0022] A presente invenção também fornece uma célula de mamífero compreendendo uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e/ou uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo compreendendo uma HC tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e uma LC tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Preferivelmente, a célula de mamífero compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 23/116
10/43 um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a linhagem celular de mamífero é uma linhagem celular de CHO ou HEK.
[0023] A presente invenção também fornece uma célula de mamífero compreendendo uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e/ou uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo compreendendo uma HC tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e uma LC tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6. Preferivelmente a célula de mamífero compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, a linhagem celular de mamífero é uma linhagem celular de CHO ou HEK.
[0024] A presente invenção também fornece uma célula de mamífero compreendendo uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e/ou uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo compreendendo uma HC tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e uma LC tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. Preferivelmente, a célula de mamífero compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 24/116
11/43 que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a linhagem celular de mamífero é uma linhagem celular de CHO ou HEK.
[0025] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um processo para a produção de um anticorpo que compreende uma LC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 e uma HC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, em que o processo compreende o cultivo de uma célula de mamífero que compreende um DNA que codifica uma LC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 e/ou uma HC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 sob condições tais que o anticorpo é expresso, e a recuperação do anticorpo expresso. A invenção inclui um anticorpo obtenível pelo processo da invenção conforme descrito imediatamente acima.
[0026] A presente invenção também fornece um processo para a produção de um anticorpo compreendendo uma LC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e uma HC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5, em que o processo compreende o cultivo de uma célula de mamífero que compreende um DNA que codifica uma LC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e/ou uma HC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 sob condições tais que o anticorpo é expresso, e a recuperação do anticorpo expresso. A invenção inclui um anticorpo obtenível pelo processo da invenção conforme descrito imedíatamente acima.
[0027] A presente invenção também fornece um processo para a produção de um anticorpo compreendendo uma LC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 e uma HC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, em que o processo
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 25/116
12/43 compreende o cultivo de uma célula de mamífero que compreende um DNA que codifica uma LC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 e/ou uma HC tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 sob condições tais que o anticorpo é expresso, e a recuperação do anticorpo expresso. A invenção inclui um anticorpo obtenível pelo processo da invenção conforme descrito imediatamente acima.
[0028] A presente invenção inclui um processo para a produção de um anticorpo, cujo anticorpo compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácido de cada uma das duas HCs é a SEQ ID NO: 1, e a sequência de aminoácido de cada uma das duas LCs é A SEQ ID NO: 2, e cujo processo compreende: a) o cultivo de uma célula de mamífero da invenção, conforme descrito acima, sob condições tais que o anticorpo é expresso, e b) a recuperação do anticorpo expresso. A invenção inclui um anticorpo obtenível pelo processo da invenção conforme descrito imediatamente acima.
[0029] A presente Invenção também inclui um processo para a produção de um anticorpo, cujo anticorpo compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácido de cada uma das duas HCs é a SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácido de cada uma das duas LCs é a SEQ ID NO: 6, e cujo processo compreende: a) o cultivo de uma célula de mamífero da invenção, conforme descrito acima, sob condições tais que o anticorpo é expresso, e b) a recuperação do anticorpo expresso. A invenção inclui um anticorpo obtenível pelo processo da invenção conforme descrito imediatamente acima.
[0030] A presente invenção também inclui um processo para a produção de um anticorpo, cujo anticorpo compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácido de cada uma das duas HCs é a SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácido de cada uma das duas LCs é a SEQ ID NO: 10, e cujo processo compreende: a) o
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 26/116
13/43 cultivo de uma célula de mamífero da invenção, conforme descrito acima, sob condições tais que o anticorpo é expresso, e b) a recuperação do anticorpo expresso. A invenção inclui um anticorpo obtenível pelo processo da invenção conforme descrito imediatamente acima.
[0031] A presente invenção fornece um anticorpo que entra em contato com o BTLA humano em um epítopo estrutural e funcional tendo os seguintes resíduos da SEQ ID NO: 31: Arg na posição 42 e His na posição 127. A presente invenção também fornece um anticorpo que entra em contato com o BTLA humano em um epítopo estrutural e funcional compreendendo Arg na posição 42 da sequência de aminoácido dada pela SEQ ID NO: 31.
[0032] A presente invenção fornece um anticorpo que entra em contato com o BTLA humano em um novo epítopo estrutural tendo os seguintes resíduos da SEQ ID NO: 31: Asp na posição 35, Gin na posição 37, Arg na posição 42, Leu na posição 74, Gly na posição 76, Cys na posição 79, Arg na posição 114, Phe na posição 119, Gin na posição 120, Asn na posição 122, Ser na posição 128. Em uma modalidade preferida, o anticorpo 22B3 é dito de imitar o HVEM que se liga ao BTLA porque a HCDR3 do anticorpo 22B3 é estruturalmente similar ao HVEM. De preferência, quando a estrutura cristalina de BTLA:anticorpo é alinhada com a estrutura cristalina de BTLA:HVEM em um programa tal como PyMOL™, uma alça calibrada da CDR do anticorpo adota uma conformação similar à alça calibrada de HVEM compreendendo resíduos de aminoácidos 69 a 72 (aminoácidos ELTG da SEQ ID NO: 41).
[0033] A presente invenção fornece um anticorpo que entra em contato com o BTLA de ser humano em um epítopo funcional tendo Asp na posição 52 da SEQ ID NO: 31. O anticorpo entra em contato com um novo epítopo estrutural tendo os seguintes resíduos da SEQ
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 27/116
14/43
ID NO: 31: His na posição 46, Glu na posição 55, Giu na posição 103, Pro na posição 104, Leu na posição 106, Pro na posição 107, Thr na posição 134, Ala na posição 139.
[0034] A presente invenção fornece um anticorpo que entra em contato com o BTLA de ser humano em um epítopo funcional que possui His na posição 68 e Lys na posição 81 da SEQ ID NO: 31. Em uma modalidade, o anticorpo entra em contato com um novo epítopo estrutural tendo os seguintes resíduos de SEQ ID NO: 31: Tyr na posição 62, Ala na posição 64, His na posição 68, Arg na posição 85, Glu na posição 91, Phe na posição 98, Asn na posição 118.
[0035] A presente invenção fornece um anticorpo que entra em contato com o BTLA humano em um novo epítopo estrutural tendo os seguintes resíduos de SEQ ID NO: 31: Asp na posição 35, Gin na posição 37, Arg na posição 42, Leu na posição 74, Gly na posição 76, Cys na posição 79, Arg na posição 114, Phe na posição 119, Gin na posição 120, Asn na posição 122, e He na posição 124, Ser na posição 128.
[0036] Como aqui utilizado, um anticorpo é uma molécula de imunoglobulina compreendendo 2 HCs e 2 LCs interconectados por ligações de dissulfeto. A parte amino terminal de cada LC e HC inclui uma região variável de cerca de 100 a 120 aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno através das CDRs nela contidas. As CDRs são intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada LCVR e HCVR é composta de 3 CDRs e 4 FRs, dispostas do aminoterminal até o carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As 3 CDRs da LC são referidas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3, e as 3 CDRs da HC são referidas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3. As CDRs contêm a maioria dos resíduos que formam interações especificas com o antígeno. Isto é, as CDRs
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 28/116
15/43 contêm a maior parte dos resíduos que estão em contato com (dentro de 4,5 A) os resíduos do antígeno. A capacidade funcionai de um anticorpo de se ligar a um antígeno particular é, portanto, grandemente influenciada pelos resíduos de aminoácidos dentro das seis CDRs. A designação de aminoácidos aos domínios de CDR dentro das regiões LCVR e HCVR dos anticorpos da presente invenção baseia-se na convenção da numeração Kabat bem conhecida (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)), e Chothia (Chothia C, Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 1987;196:901-17. Chothia C, Lesk AM, Tramontane A, Levitt M, Smith-Gill SJ, Air G, Sheriff S, Padlan EA, Davies D, Tulip WR, et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989;342:877-83). O resíduo de aminoácido de partida de HCDR1 é definido por Chothia e o resíduo de aminoácido final de HCDR1 é definido por Kabat. Os resíduos de aminoácido de partida e final para HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 São definidos por Kabat.
[0037] O termo epítopo conforme aqui utilizado pode se referir a um epítopo estrutural (sítios de um antígeno que estão em contato com a região variável de um anticorpo) e/ou a um epítopo funcional (sítios de um antígeno que pode ou não estar em contato com a região variável de um anticorpo e são necessários para ligação de anticorpo). O epítopo estrutural é determinado pela cristalografia de raios X em que qualquer resíduo no BTLA de ser humano dentro de 4,5Â de outro resíduo no Fab ligado é considerado ser um sítio de contato.
[0038] Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados e purificados utilizando métodos conhecidos. Por exemplo, as sequências de cDNA que codificam uma HC (por exemplo, a
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 29/116
16/43 sequência de aminoácido dada pela SEQ ID NO: 1) e uma LC (por exemplo, a sequência de aminoácido dada pela SEQ ID NO: 2) podem ser clonadas e planejadas em um vetor de expressão de GS (glutamina sintetase). O vetor de expressão de imunoglobulina planejado pode então ser estavelmente transfectado em células de CHO. Como uma pessoa versada na técnica irá observar, a expressão de anticorpos de mamífero resultará na glicosilação, tipicamente em sítios de N-glicosilação altamente conservados na região Fc. Clones estáveis podem ser verificados para a expressão de um anticorpo que se liga especificamente ao BTLA. Clones positivos podem ser expandidos em meio de cultura livre de soro para a produção de anticorpos em biorreatores. O meio, no qual um anticorpo foi secretado, pode ser purificado por técnicas convencionais. Por exemplo, o meio pode ser convenientemente aplicado a uma coluna de Proteína A ou G Sepharose FF que foi equilibrada com um tampão compatível, tal como solução salina tamponada com fosfato. A coluna é lavada para remover os componentes de ligação não específicos. O anticorpo ligado é eluído, por exemplo, pelo gradiente de pH e frações de anticorpos são detectados, tais como por SDS-PAGE, e depois reunidos. O anticorpo pode ser concentrado e/ou filtrado estéril utilizando técnicas comuns. Agregados solúveis e multímeros podem ser eficazmente removidos por técnicas comuns, incluindo a exclusão de tamanho, a interação hidrofóbioa, a troca iônica ou a cromatografia de hidroxiapatita. O produto pode ser imediatamente congelado, por exemplo, a ~70°C, ou pode ser llofilizado.
[0039] Um anticorpo da presente invenção pode ser incorporado em uma composição farmacêutica que pode ser preparada por métodos bem conhecidos na técnica e compreende um anticorpo da presente invenção e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 30/116
17/43
[0040] Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção pode ser administrada a um paciente em risco de, ou que apresenta, doenças ou distúrbios conforme descrito nesta invenção por vias parentais (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular ou transdérmica). Uma quantidade eficaz refere-se a uma quantidade necessária (em dosagens e durante períodos de tempo e pelo meio de administração) para obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade eficaz do anticorpo pode variar de acordo com fatores tais como o estado doentio, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo de produzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade eficaz também é aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo da presente invenção são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[0041] Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados no tratamento de pacientes. Mais particularmente os anticorpos da presente invenção são esperados de tratar uma ou mais doenças reumáticas, neurais e dermatológicas. As doenças reumáticas são caracterizadas por inflamação que pode afetar as articulações, músculos e/ou órgãos da pessoa. Uma tal doença reumática é o lúpus eritematoso sistêmico (SLE).
[0042] Como aqui utilizado de modo trocável, tratamento e/ou tratando e/ou tratar destinam-se a se referir a todos os processos em que pode haver um retardo, interrupção, retenção, controle, interrupção ou reversão da progressão dos distúrbios aqui descritos, mas não indica necessariamente uma eliminação total de todos os sintomas do distúrbio. O tratamento inclui a administração de um anticorpo da presente invenção para o tratamento de uma doença ou condição em um ser humano que se beneficiaria de um aumento na atividade do BTLA, e inclui: (a) inibição da progressão adicional da
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 31/116
18/43 doença; e (b) alívio da doença, isto é, causando a regressão da doença ou distúrbio ou alívio dos sintomas ou suas complicações. Engenharia de Anticorpos
[0043] Os anticorpos da presente invenção foram gerados pela imunização de coelhos com domínio extracelular marcado com Fc (ECD) de BTLA humano e reforço com proteína marcada com BTLAFc de camundongo (25F7) ou alternadamente com proteínas marcadas com BTLA-Fc de ser humano e de camundongo (22B3 e 23C8). A triagem foi feita com um BTLA de ser humano, camundongo e macaco cinomolgo marcado com histidina para identificar a reatividade cruzada. A sequência de aminoácido do BTLA de ser humano é dada pela SEQ ID NO: 31, a sequência de aminoácido do BTLA de camundongo Balbc é dada pela SEQ ID NO: 32, a sequência de aminoácido de C57BL6 é dada pela SEQ ID NO: 33 e a sequência de aminoácido de BTLA de macaco cinomolgo é dada pela SEQ ID NO: 34. Os anticorpos foram então humanizados e amadurecidos por afinidade.
Exemplos
Expressão e purificação de anticorpos agonístas de BTLA planejados
[0044] Os anticorpos agonistas de BTLA da presente invenção podem ser expressos e purificados essencialmente como se segue. Uma célula hospedeira apropriada, tal como HEK 293 ou CHO, pode ser transitoriamente ou estavelmente transfectada com um sistema de expressão para secretar anticorpos utilizando uma relação de vetor de HC:LC HC predeterminada ideal (tal como 1:3 ou 1:2) ou um sistema de vetor único que codifica tanto a HC quanto a LC. Meios clarificados, nos quais o anticorpo foi secretado, podem ser purificados utilizando qualquer uma das muitas técnicas geralmente utilizadas. Por exemplo, o meio pode ser convenientemente aplicado a uma coluna MabSelect
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 32/116
19/43 (GE Healthcare), ou uma coluna de KappaSelect (GE Healthcare) para o fragmento Fab, que foi equilibrado com um tampão compatível, tal como solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). A coluna pode ser lavada para remover componentes de ligação não específicos. O anticorpo ligado pode ser eluído, por exemplo, através do gradiente de pH (tal como tampão Tris 20 mM, pH 7,0 em tampão de citrato de sódio 10 mM, pH 3,0, ou solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 em tampão de glicina 100 mM, pH 3,0). As frações de anticorpo podem ser detectadas, tais como por SDS-PAGE, e depois podem ser processadas em pool. Outra purificação é opcional, dependendo do uso planejado. O anticorpo pode ser concentrado e/ou filtrado estéril utilizando técnicas comuns. Agregados solúveis e multímeros podem ser eficazmente removidos por técnicas comuns, incluindo exclusão por tamanho, interação hidrofóbica, troca iônica, multimodal ou cromatografia de hidroxiapatita. A pureza do anticorpo após estas etapas de cromatografia está entre cerca de 95% a cerca de 99%. O produto pode ser mantido refrigerado, imediatamente congelado a 70°C, ou pode ser liofilizado. As SEQ ID NOs do aminoácido para os anticorpos exemplificados da presente invenção são mostradas abaixo.
Tabela 1. Sequências de aminoácido de anticorpos agonistas de BTLA exemplificados.
SEQ ID NOs de Anticorpos
Anticorpo HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
22B3 13 16 19 22 25 28
23C8 14 17 20 23 26 29
2SF7 15 18 21 24 27 30
Afinidade de ligação e cinética
[0045] A afinidade de ligação e a cinética dos anticorpos agonistas de BTLA da presente invenção (22B3, 23C8 e 25F7) com o BTLA são medidas por ressonância de plásmon superficial utilizando Biacore®
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 33/116
20/43
3000 (GE Healthcare). A afinidade de ligação é medida através de imobilização ao redor de 120 RU de proteína de BTLA (BTLA de ser humano, rato, murino (Balbc ou C57BL6) ou macaco cinomolgo) por meio do acoplamento de amina em um chip Biacore® CM5, e um anticorpo agonista de BTLA de circulação, partindo de 500 nM em diluição em série de 2 vezes até 15,6 nM. Os experimentos são realizados a 25°C em tampão de HBS-EP (GE Healthcare BR100669; HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante a 0,05% P20, pH 7,4). Para cada ciclo, 250 μΙ de amostra de anticorpo são circulados através das células de fluxo 1 e 2 em 50 μΙ/min, e depois dissociados durante 10 minutos. A superfície do chip é regenerada com injeção de 5 μΙ de tampão de glicina em pH 1,5 na taxa de fluxo de 10 μΙ/ml. Os dados são ajustados a um modelo de ligação de Langmiur 1:1 para derivar kon, kOff, e calcular a Kd. Seguindo os procedimentos essencialmente como descritos acima, os seguintes parâmetros (mostrados na Tabela 2) foram observados. Os dados mostrados abaixo são a média de três experimentos para ser humano, cino, rato e murino com relação à 22B3.
Tabela 2. Afinidade de ligação e cinética.
Anticorpo Antígeno (BTLA) kon (1/Ms) koff(1/s) KD (nM)
22B3 Ser humano 5,87E+06 2.19E-03 0,365
Cino 2.45E+06 6.47E-04 0,27
Murino (balbc) 2,60E+06 8.58E-02 32,5
Murino (C57BL6) 1,89E+06 2.65E-01 147
Rato 2,10E+06 4.62E-02 24,1
23C8 Ser humano 1,59E+05 2.93E-04 1,93 (n = 3)
Cino 8,71 E+04 3.09E-03 35,35 (n = 2)
Murino (balbc) Nenhuma Ligação Nenhuma Ligação Nenhuma Ligação
Murino Nenhuma Nenhuma Nenhuma
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 34/116
21/43
(C57BL6) Ligação Ligação Ligação
Rato Não Testada Não Testada Não Testada
25F7 Ser humano 6.8622E+04 1,42E-02 206,2 (n = 2)
Cino Não Testada Não Testada Não Testada
Murino (balbc) Não Testada Não Testada Não Testada
Murino (C57BL6) 7,70E+04 3.50E-04 4,63 (n = 1)
Rato Não Testada Não Testada Não Testada
[0046] Como mostrado acima na Tabela 2, os anticorpos agonistas de BTLA da presente invenção se ligam ao BTLA. Especificamente, o anticorpo 22B3 é capaz de se ligar ao BTLA de ser humano, murino e macaco cinomolgo.
Ligação às células primárias
[0047] A capacidade dos anticorpos de BTLA da presente invenção (22B3, 23C8 e 25F7) de se ligar às células primárias de diferentes espécies é determinada por FACS. Células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) são isoladas de uma amostra de sangue de doador (San Diego Blood Bank, #LRS~WBC) utilizando Ficoll (GE #17-1440-02) e tubos SepMate (STEMCELL #15450), conforme o protocolo do fabricante. As PBMCs de cino (Worldwide Primates #CA-10) são descongeladas do nitrogênio líquido e lavadas uma vez com tampão FACS (de forma idêntica como acima).
[0048] Os baços de camundongos C57BL6 machos (JAX) ou ratos Sprague Dawley fêmeas (Harlan) são colhidos, processados em pool e dissociados em suspensões de células isoladas utilizando um filtro de células e êmbolo de seringa sobre um tubo cônico de 50 ml, enxaguado com RPMI 1640 completo com FBS inativado por calor a 10% e EDTA 2 mM. As células são granuladas, o meio removido, e os glóbulos vermelhos submetidos à lise pela colocação novamente em suspensão do grânulo em 2 ml de ACK Lysing Buffer (gibco #A1049201) durante aproximadamente 2 minutos antes da supressão com
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 35/116
22/43
RPMI completo. As células submetidas à lise podem ser granuladas e lavadas uma vez em tampão FACS (DPBS IX contendo FBS a 3%, HEPES 20 mM e EDTA 2 mM).
[0049] As células primárias isoladas são quantificadas utilizando um contador de células Countess, e colocadas novamente em suspensão em 2 x 106 células por ml em tampão FACS. Os experimentos de citometria de fluxo são executados no mesmo dia como o isolamento de célula por plaqueamento de 50 μ! (--0,1 x 106) de células em uma placa de 96 reservatórios (Greiner #650101). A ligação de anticorpo não específica é evitada pela adição de 1 μΙ de bloco Fc (por exemplo, de BD #553142) durante 15 minutos a 4 °C sem lavagem.
[0050] A ligação de anticorpo ao BTLA é testada em várias concentrações, através da diluição em série com tampão FACS. Por exemplo, um anticorpo purificado e controles começando em concentrações diferentes são em primeiro lugar diluídos para 30 pg/ml e diluições em série de 1:3 do material de partida são executadas para um total de 10 titulações (acrescido de controle não tratado). As titulações de anticorpos são incubadas com células durante 20 minutos a 4 °C e lavadas com tampão FACS antes da coloração. As células são coradas utilizando anticorpos conjugados com fluorocromo para identificar tipos específicos de células (por exemplo, células B CD19, células T CD4 ou células T CD8) ou utilizando um anticorpo secundário para identificar a presença ou ausência de ligação de anticorpos a esse subconjunto. A coloração é executada durante 20 minutos a 4°C e lavada 3 vezes com tampão FACS antes da análise em um citômetro de fluxo. Os resultados são analisados utilizando o software de análise FACS padrão (por exemplo, FACSDiva) e relatados como intensidade fluorescente média do anticorpo secundário para cada titulação. Um resultado positivo, que indica
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 36/116
23/43 ligação, é determinado pela coloração de intensidade fluorescente média acima de fundo.
[0051] Após os procedimentos essencialmente como descritos acima, o anticorpo 22B3 se liga às células de expressão de BTLA de ser humano, macaco cinomolgo, rato e camundongo, o anticorpo 23C8 se liga às células de expressão de BTLA de ser humano e macaco cinomolgo e o anticorpo 25F7 se liga às células de expressão de BTLA de ser humano, macaco cinomolgo e camundongo.
Fosforilação induzida por anticorpos agonistas de BTLA
[0052] Para determinar a capacidade dos anticorpos agonistas de BTLA da presente invenção (22B3 e 25F7) para induzir a fosfonlação de tirosina em uma linhagem celular B humana, um anticorpo de BTLA é ligado a uma placa de cultura de 24 reservatórios em 10 pg/ml durante uma hora a 37°C. A placa é lavada com PBS para remover qualquer anticorpo não ligado. Uma linhagem celular B de expressão de BTLA de ser humano, tal como a linhagem celular de Hnfócitos B de ser humano Ramos.2G6.4C10 (ATCC), pode ser adicionada aos reservatórios em 10 x 10Λ6 células/ml e incubada a 37°C durante 30 min. As células são removidas e submetidas à lise em Tampão de Lise Completo (MSD), e congeladas a ~80°C durante pelo menos 30 minutos.
[0053] O BTLA fosforilado é detectado pelo Meso Sector S 600. Placas de detecção de estreptavidina são preparadas através da incubação em solução de bloqueio (MSD) durante uma hora na temperatura ambiente. Um anticorpo de captura de BTLA bíotinilado (5A5) é revestido sobre a placa durante uma hora na temperatura ambiente seguido por três ou mais etapas de Tris-lavagem. Os lisados de célula são incubados durante duas horas na temperatura ambiente. O BTLA total é detectado com um anticorpo anti-BTLA SULFO-TAG (ANC6E9) e o BTLA fosforilado é medido com um anticorpo anti
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 37/116
24/43 fosfotriosina SULFO-TAG (PY20: MSD) seguido por três ou mais etapas de Tris-lavagem. A adição de 2x Read Buffer T (MSD) é então acrescentada aos reservatórios imediatamente antes da análise utilizando um Meso Sector S 600.
[0054] Seguindo procedimentos essencialmente como descritos acima, o anticorpo 22B3 resultou em um aumento de 2,41 vezes na fosforilação de tirosina de BTLA sobre o fundo em comparação com o controle negativo, e o anticorpo 25F7 resultou em um aumento de 1,47 vezes na fosforilação da tirosina de BTLA sobre o fundo em comparação com o controle negativo. Estes dados demonstram que os anticorpos agonistas de BTLA 22B3 e 25F7 são capazes de induzir a fosforilação de BTLA em uma linhagem celular B humana.
Inibição da proliferação de células B primárias humanas
[0055] A potência in vitro de anticorpos agonistas de BTLA da presente invenção é avaliada pela capacidade de inibir a proliferação de células B primárias humanas. As células B primárias humanas são isoladas de células mononucleares do sangue periférico humano saudáveis utilizando o kit de isolamento de células B humanas (EasySep) e são colocadas novamente em suspensão em meio apropriado de células primárias humanas. O anti-lgM é revestido em placas junto de titulações de controle de isótipo ou anticorpo de BTLA e incubado durante uma hora a 37°C seguido pela etapa de lavagem com PBS. As células B humanas isoladas são adicionadas a cada reservatório e incubadas durante 72 horas a 37°C com CO2 a 5% seguido por pulso de [3H]-timidina durante as últimas 18 horas. Após a incubação, as placas são removidas e colocadas em gelo seco durante 30 minutos e depois armazenadas a -20°C até que prontas para colheita. As células são submetidas à lise através do descongelamento e colhidas com Harvester9600 (Tomtec). A proliferação é avaliada por medir a incorporação de [-Hj-timidina com
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 38/116
25/43 um MicroBeta2 2450 Microplate Counter (Perkin Elmer).
[0056] As contagens são utilizadas para avaliar a resposta proliferativa relativa neste ensaio, e a inibição percentual é calculada utilizando a equação [% Inhibition - (AVGmaxsignalsignalsample)/AVGmaxsignal x 100], que pode ser utilizada para determinar os valores de IC50 utilizando 0 software de gráficos (GraphPad Prism).
[0057] Seguindo os procedimentos essencialmente como descritos acima, 0 anticorpo agonista de BTLA 22B3 foi capaz de inibir a proliferação de células B primárias in vitro com uma IC50 calculada de 0,32 +/- 0,1 nM, 0 anticorpo 23C8 foi capaz de inibir a proliferação de células B primárias in vitro com uma IC50 calculada de 0,14 nM, e 0 anticorpo 25F7 foi capaz de inibir a proliferação de células B primárias in vitro com uma IC50 calculada de 0,17 nM. Em um experimento semelhante, 0 anticorpo 22B3 foi capaz de inibir a proliferação de células B primárias com uma IC50 calculada de 0,32 nM, e um anticorpo tendo as mesmas HCVRs e LCVRs como Mab8D5 (SEQ ID NO: 11 e 18 da patente '694, respectivamente) inibiu a proliferação de células B primárias com uma IC50 calculada de 6,38 nM. Estes dados demonstram que os anticorpos agonistas de BTLA 22B3, 23C8 e 25F7 são capazes de inibir a proliferação de células B in vitro, e que 0 anticorpo 22B3 possui maior atividade in vitro em comparação com Mab8D5.
Modelo de camundongo NSG humanizado de GvHD
[0058] A prevenção de enxerto acionado por PBMC humana vs. doença hospedeira (GvHD) é determinada In vivo.
[0059] Resumidamente, os camundongos NSG fêmeas (JAX Labs, Stock # 05557), aproximadamente 8 a 10 semanas de idade, são normalizados e divididos em grupos de tratamento (n - 8 camundongos por grupo de tratamento) com base nas medições de
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 39/116
26/43 peso corporal no valor de referência. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) sâo isoladas a partir de um programa de doadores de sangue (San Diego Blood Bank, # LRS-WBC) utilizando Ficoll (GE # 17-1440-02) e tubos SepMate (STEMCELL # 15450), conforme o protocolo do fabricante. As PBMCs são colocadas novamente em suspensão em aproximadamente 150 x 106 células por ml de PBS. Os grupos de tratamento são cegos antes da dosagem.
[0060] No dia 1, 100 μΙ (15 x 10® células) de PBMCs colocados em suspensão em PBS (conforme descrito acima) (ou 100 μΙ de PBS para controles não enxertados) são injetados por via intravenosa (IV) na cauda de cada camundongo. Os camundongos sâo dosados semanalmente (QW) com o anticorpo da presente invenção (22B3 ou 23C8) ou controles em concentrações variáveis com veículo PBS, por injeções subcutâneas (SQ). Três estudos independentes são executados essencialmente conforme descrito nesta invenção. As concentrações de dosagem para cada estudo são [Estudo 1 (anticorpo 22B3): 0,1, 1,0, 5,0, 10,0 e 20,0 mg/kg; Estudo 2 (anticorpo 22B3 ou 23C8): 0,001, 0,01, 10,0 e 100 mpk; e Estudo 3: 0,001, 0,005, 0,01, 0,1,0,5 e 1,0 mpk].
[0061] O estudo termina e os camundongos são submetidos à eutanásia antes dos animais de controle de isótipo que perdem 20% de perda de peso corporal do valor de referência (Estudos 1 e 2) ou dia 28 (Estudo 3). Os pesos são registrados (Estudo 1 e Estudo 2), o soro é coletado para análise de citocina (Estudo 1; a análise é executada por MSD ELISA; as citocinas analisadas sâo TNFa, IL-10, IL-6, IL-4, IL12p70, IL-13, IL-2 e IL-8), e os baços são colhidos para análises de fenotipagem/farmacodinâmicas (medidas por uma redução na população de células T de CD 8, Estudo 1 e Estudo 3).
[0062] Seguindo os procedimentos essencialmente como descritos acima, os seguintes dados foram obtidos.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 40/116
27/43
[0063] Os animais tratados com anticorpo 22B3 no Estudo 1 demonstraram o seguinte (em doses de 0,1, 1,0, 5,0, 10,0 ou 20,0 mg/kg de anticorpo): (i) pesos corporais semelhantes no final do estudo em comparação com os pesos corporais de animais de controle não enxertados; (ii) uma redução nas citocinas TNFa, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-12p70 em comparação com os animais de controle de isótipo; e (iii) redução na população de células T CD 8 em comparação com os animais de controle de isótipo (análise de fenotipagem/farmacodinâmicas).
[0064] Os dados do Estudo 2 demonstram que os camundongos tratados com 0,05 mg/kg de anticorpo 22B3, ou 1,0, 5,0 ou 10,0 mg/kg de anticorpo 23C8, tiveram pesos corporais similares no final do estudo em comparação com os pesos corporais de animais de controle não enxertados. O Estudo 2 não demonstrou atividade de 22B3 no peso corporal em 10,0 mg/kg, o que pode refletir a variabilidade natural do doador deste modelo. No Estudo 3, o anticorpo 22B3 demonstrou atividade farmacodinâmica in vivo nas seguintes doses de anticorpo: 0,01, 0,1, 0,5 e 1,0 mg/kg. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o anticorpo 22B3 e o anticorpo 23C8 foram eficazes na prevenção de GvHD in vivo.
Nefrite lúpica induzida por mlFNa
[0065] O modelo de nefrite lúpica induzida por interferon-alfa (IFNa) é um modelo de camundongo de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) em que o IFNa é utilizado para sincronizar o início e acelerar a progressão da doença em um cruzamento com camundongos New Zealand Black e New Zealand White (NZB/W). O modelo de camundongo NZB/W é um modelo clássico de nefrite lúpica espontânea. A progressão da doença nesses camundongos pode ser acelerada com a administração exógena de IFNa utilizando vetores adenovirais. Este modelo de nefrite lúpica é utilizado para demonstrar
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 41/116
28/43 a atividade dos anticorpos agonistas de BTLA da presente invenção. [0066] Um dia antes do início do estudo, camundongos C57B/W fêmeas de onze semanas de idade são aleatoriamente classificados com base no peso corporal. Os camundongos são distribuídos nos seguintes grupos de tratamento: (1) vírus adeno-associado com LacZ (AAV + 10 mg/kg de controle de isótipo de lgG4 PAA humano (PAA é as mutações S228P, F234A e L235A), (2) AAV com IFNa + 10 mg/Kg de controle do isótipo de lgG4 PAA humano, (3) AAV com IFNa + 3 mg/kg de anticorpo 22B3, (4) AAV com IFNa + 10 mg/kg de anticorpo 22B3 ou (5) AAV com IFNa + 50 mg/kg de ciclofosfamida. Na data de início do estudo (Dia 0), os camundongos são administrados uma vez com 1011 cópias do genoma (GC) de AAV que expressa o gene LacZ (não doente) ou IFNa de camundongo (doente) em PBS por via intravenosa. Nos grupos 1 a 4, os camundongos são tratados com anticorpos de controle de isótipo ou anticorpo 22B3 em PBS por via subcutânea uma vez por semana começando no Dia 0. No grupo 5, os camundongos são tratados com ciclofosfamida em PBS por via intraperitoneal a cada 10 dias. Amostras de urina são coletadas dos camundongos a cada 2 semanas até o término do estudo 6 semanas após o início do tratamento. O ELISA de microalbumina de camundongo Kamiya Biomedical™ é utilizado para quantificar os níveis de albumina na urina. A creatinina na urina é medida utilizando um ensaio de creatinina enzimática (Roche Diagnostics). A albuminúria, um biomarcador da função renal, é definida como maior do que 300 pg de albumina por mg de creatinina detectada na urina. [0067] Seguindo os procedimentos essencialmente como descritos acima, pela semana 4, a incidência de albuminúria no grupo doente tratado com isótipo (AAV com IFNa + hlgG4 PAA) alcançou 100% e permaneceu elevada até o final do estudo, enquanto que os camundongos tratados por AAV com LacZ (não doentes) não
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 42/116
29/43 apresentaram nenhuma incidência de aibuminúria. A ciclofosfamida, que pode ser acentuadamente nefrotóxica, provocou um aumento transiente nas aibuminas em camundongos doentes, mas a incidência de aibuminúria no grupo de ciciofosfamida foi reduzida a zero peio término do estudo. O anticorpo 22B3 em 3 mg/kg e 10 mg/kg foi capaz de reduzir a incidência de aibuminúria em 50% e 20%, respectivamente, no dia 28, e 60% e 70%, respectivamente, no dia 42. Estes resultados indicaram que o anticorpo 22B3 foi capaz de preservar a função renal no modelo.
[0068] Um gráfico de Kaplan-Meier (dados não mostrados) da porcentagem de sobrevivência durante o estudo mostrou que a insuficiência renal no grupo doente tratado com isótipo levou a óbitos começando no dia 28. Ao finai do estudo, a taxa de sobrevivência no grupo doente tratado com isótipo era de 60%. Os grupos não doentes e tratados com ciclofosfamida tiveram taxas de sobrevivência de 100%. Os camundongos tratados com 10 mg/kg de anticorpo 22B3 também mostraram 100% de sobrevivência no final do estudo, enquanto que os camundongos tratados com 3 mg/kg apresentaram sobrevivência de 80%. Estes resultados indicaram que o anticorpo 22B3 foi capaz de prevenir mortes relacionadas com a doença neste modelo.
Modelo de psoríase induzida por imlquimod
[0069] A capacidade de um anticorpo da presente invenção de limitar a gravidade da dermatite semelhante à psoríase induzida pela aplicação do agonista TLR7/8 imiquimod (IMQ) é testada. Camundongos fêmeas B6.SJL-Pfprca Pepcb/BoyJ de sete semanas de idade (JAX stock number: 002014), ou camundongos HVEiWl·' (descritos em Wang et al, J. Clin. Invest., 115:3, 711-717, March 2005) são injetados por via intraperitoneal com 3 mg/kg ou 1 mg/kg de anticorpo 22B3 ou anticorpo 25F7, respectivamente, no dia 0, e as
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 43/116
30/43 costas dos camundongos são raspada. Os animais injetados com controle de isótipo hlgG4 serviram como controles. Nos dias 1 a 3, os camundongos são anestesiados com isoflurano inalado (VetOne) e creme de IMQ a 5% (50 mg, Fougera) é então aplicado em uma área definida da pele raspada. No dia 4, a área tratada da pele é cortada e analisada com relação à gravidade da doença e a expressão gênica relacionada à inflamação.
[0070] Seguindo os procedimentos essencialmente como descritos acima, a análise histológica demonstrou espessamento da camada epidérmica com paraceratose e hiperceratose nos grupos tratados com controle de isótipo hlgG4 ou 1 mg/kg de anticorpo 22B3. Os camundongos tratados com 3 mg/kg de anticorpo 22B3 ou 3 mg/kg de anticorpo 25F7 apresentaram uma redução significativa na espessura epidérmica, com algumas áreas aparecendo histologicamente normais. A expressão do gene na pele foi analisada por qPCR utilizando a iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Os camundongos tratados com 3 mg/kg de anticorpo 22B3 apresentaram uma diminuição significativa na expressão de IFNs do Tipo I (IFNa, ΙΡΝβ) e IFNy, assim como genes de resposta de IFN (Isg15, Mx1, Mx2, Oas2). A análise das citocinas envolvidas no estabelecimento da dermatite induzida por IMQ também demonstrou uma redução significativa na expressão de IL-22 e IL-23 no grupo de tratamento de 3 mg/kg de anticorpo 22B3. Estes dados demonstram que os anticorpos agonistas de BTLA 22B3 e 25F7 são capazes de reduzir a espessura epidérmica em um modelo de camundongo de dermatite semelhante à psoríase.
Determinação do epítopo
[0071] Os epítopos funcionais dos anticorpos agonistas de BTLA da presente invenção são determinados por ELISA, e os epítopos estruturais são determinados pela cristalografia de raios-x.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 44/116
31/43
Métodos
ELISA: Epítopo funcional
[0072] O seguinte conjunto de mutações de superfície de BTLA foi introduzido individualmente em uma proteína de BTLA humana fundida á Fc (ser humano): D35R, Q37R, Y39E, R42D, Q43A, E45R, S47H, L49R, D52R, E55R, E57R, D84R, N65R, H68A, V80R, K81E, E83R, S88H, K90H, E91H, I95R, E103H, L106R, N108R, R114V, S121Y, N122R, E125H, H127E, T130R, Y132R e T134H.
[0073] A ligação de 22B3 e 23C8 foi determinada utilizando um ELISA em que o anticorpo a ser mapeado por epítopo foi capturado por um anticorpo anticoelho imobilizado e após a lavagem cada mutante de BTLA foi incubado como uma série de diluições de 4 pontos 4 vezes com o anticorpo capturado e detectado com um reagente Fc anti-humano ligado à enzima. O sinal resultante foi comparado entre os anticorpos e para controlar os anticorpos. O epítopo funcional é normalmente indicado em si por uma redução dramática no sinal para um ou dois mutantes. Para o anticorpo 25F7, um ELISA intercalado foi executado, em que 22B3 humanizado foi imobilizado, os mutantes de BTLA foram capturados e ligados por 25F7 de coelho. Isto deu um sinal muito mais forte e o epítopo 25F7 pode ser identificado após a eliminação do epítopo de 22B3. Cnstalografia de raios-X: Epítopo estrutural
[0074] A fim de determinar as interfaces de interação e, portanto, o epítopo físico sobre o BTLA dos vários anticorpos, o BTLA de ser humano foi cocristalizado com a parte Fab de um anticorpo da presente invenção e uma estrutura cristalina foi determinada. A partir da estrutura cristalina resultante, os resíduos de BTLA dentro de 4,5A de qualquer átomo de anticorpo foram contados como parte do epítopo (utilizando o software de visualização Pymol). 4,5 angstroms são medidos a partir do centro do átomo até o centro do átomo. Qualquer
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 45/116
32/43 resíduo com pelo menos um átomo que é 4,5 angstroms próximo a qualquer átomo no anticorpo é parte do epítopo.
[0075] Duas estruturas de 22B3 foram determinadas no complexo com BTLA de ser humano. A primeira utilizou o anticorpo 22B3 de coelho de origem Fab, Histidina marcada e purificada com um mutante S47H (mutação de estabilização) de BTLA de ser humano expressa como uma Fusão Fc e depois clivada e purificada. Estas duas proteínas foram misturadas em uma relação aproximadamente equimolar e peneiradas em telas comercialmente disponíveis para cristalização. Os cristais foram obtidos e os dados de difração coletados na Advanced Photon Source. Estes dados foram reduzidos e resolvidos por substituição molecular e refinados para produzir uma estrutura de alta resolução do complexo entre 22B3 e BTLA. O segundo complexo estava entre uma versão amadurecida por afinidade (com mutações HC Í56Q/T57H/G98A e LC S95H) da 22B3 humanizado (parte Fab) e BTLA de ser humano. Estes foram coexpressos, purificados como um complexo e similarmente submetidos à triagem. A estrutura resultante e o epítopo eram semelhantes à primeira estrutura.
[0076] A estrutura de 23C8 no complexo foi obtida do mesmo modo que o primeiro complexo 22B3, a saber, através da purificação do Fab de origem de coelho marcado com Hís, mistura com BTLA de ser humano de S47H monomérica e cristalização.
[0077] A estrutura de 25F7 no complexo com BTLA de ser humano foi obtida de acordo com o segundo complexo de 22B3, isto é, através da coexpressão, copurificação e cristalização. Um mutante duplo do CDF7 humanizado com ligação melhorada ao BTLA de ser humano foi utilizado (25F7 humanizado utilizado para determinação do epítopo possui mutações em HC S30W/LC E27R).
Resultados
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 46/116
33/43
[0078] Anticorpo 22B3: Entre um conjunto de mutantes de superfície de BTLA, R42D e H127E tiveram um impacto negativo significativo na ligação ao anticorpo 22B3 de coelho (compreendendo as mesmas CDRs conforme 22B3, mas com uma estrutura de coelho). O epítopo funcional compreende Arg na posição 42 e His na posição 127 do BTLA humano (SEQ ID NO: 31). Os resíduos de BTLA que estão dentro de 4,5 angstroms de 22B3 no complexo de estrutura cristalina entre o BTLA de ser humano e Fab de 22B3 de coelho, e são o epítopo estrutural, são os seguintes resíduos da SEQ ID NO: 31: Asp na posição 35, Gin na posição 37, Arg na posição 42, Leu na posição 74, Gly na posição 76, Cys na posição 79, Arg na posição 114, Phe na posição 119, Gin na posição 120 e Asn na posição 122, Ser na posição 128. Os resíduos de BTLA que estão dentro de 4,5 angstroms de 22B3 no complexo de estrutura cristalina entre BTLA de ser humano e uma Fab variante de 22B3 de ser humano (HC I56Q/T57H/G98A LC S95H) são Asp na posição 35, Gin na posição 37, Arg na posição 42, Leu na posição 74, Gly na posição 76, Cys na posição 79, Arg na posição 114, Phe na posição 119, Gin na posição 120, Asn na posição 122 e lie na posição 124, Ser na posição 128 da SEQ ID NO: 31.
[0079] Em um estudo semelhante, o epítopo estrutural para HVEM que se liga ao BTLA era os seguintes aminoácidos de BTLA: Gin na posição 37, Arg na posição 42, Leu na posição 74, Gly na posição 76, Thr na posição 77, Ser na posição 112, Arg na posição 114, Asn na posição 118, Ser na posição 121, Ser na posição 128 e Thr na posição 130. A similaridade estrutural entre o anticorpo 22B3 e HVEM foi avaliada pela superposição da estrutura cristalina do anticorpo:BTLA sobre a estrutura cristalina de HVEIVLBTLA que alinha as moléculas de BTLA. O desvio quadrático médio da cadeia principal na região HVEM contendo resíduos de aminoácido 69 a 72 e na região de anticorpo
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 47/116
34/43 correspondente foi determinado de ser 1,4 angstroms.
[0080] Anticorpo 23C8: D52R bloqueia o 23C8 de coelho (compreendendo a mesma HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1 e LCDR2 como 23C8, tendo a LCDR3 de QCTYGGWGSTSDDNP, e tendo uma estrutura de coelho) ao BTLA de ser humano em um ELISA. O epítopo funcional compreende Asp na posição 52 do BTLA de ser humano (SEQ ID NO: 31). Os resíduos de BTLA que estão dentro de 4,5 angstroms de 23C8 no complexo de estrutura cristalina entre BTLA de ser humano (S47H) e Fab de 23C8 de coelho, e são o epítopo estrutural, são His na posição 46, Glu na posição 55, Glu na posição 103, Pro na posição 104, Leu na posição 106, Pro na posição 107, Thr na posição 134 e Ala na posição 139 da SEQ ID NO: 31. O anticorpo 23C8 não imita a ligação de HVEM.
[0081] Anticorpo 25F7: Entre um conjunto de mutantes da superfície do BTLA, H68A e K61E tiveram um impacto negativo significativo sobre a ligação ao anticorpo 25F7 de coelho (compreendendo as mesmas CDRs como 25F7, mas com uma estrutura de coelho). O epítopo funcional compreende His na posição 68 e Lys na posição 81 de BTLA de ser humano (SEQ ID NO: 31). Os resíduos de BTLA que estão dentro de 4,5 angstroms de 25F7 no complexo de estrutura cristalina entre BTLA de ser humano e variante de Fab 25F7 humanizado (HC S30W, LC E27R), e são o epítopo estrutural, são Tyr na Posição 62, Ala na posição 64, His na posição 68, Arg na posição 85, Glu na posição 91, Phe na posição 98 e Asn na posição 118 da SEQ ID NO: 31. O anticorpo 25F7 não imita a ligação de HVEM.
Sequências
HC de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 1) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSSYGVSWVRQAPGQGL EWMGAISYDGITYYASWAKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 48/116
35/43
YYCARGDYYDDYVYVYALDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCS
RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS
RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 2)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLI YAASTLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGYSSS
NLDNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HCVR de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 3)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSSYGVSWVRQAPGQGL EWMGAISYDGITYYASWAKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV
YYCARGDYYDDYVYVYALDIWGQGTLVTVSS
LCVR de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 4)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLI
YAASTLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTÍSRLEPEDFAVYYCQQGYSSS
NLDNVFGGGTKVEIK
HC de Anticorpo 23C8 (SEQ ID NO: 5)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDISKYNIQWVRQAPGKGLE
WVGFINYGGSAYYASRAKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVY
YCARGLSNSDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV
PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 49/116
36/43
SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC de Anticorpo 2308 (SEQ ID NO: 6)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKLL IYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQSTYGGV VGSTSDDNPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HCVR de Anticorpo 23C8 (SEQ ID NO: 7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDISKYNIQWVRQAPGKGLE VWGFINYGGSAYYASRAKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVY YCARGLSNSDLWGQGTLVTVSS
LCVR de Anticorpo 23C8 (SEQ ID NO: 8)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKLL
IYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQSTYGGV
VGSTSDDNPFGGGTKVEIK
HC de Anticorpo 25F7 (SEQ ID NO: 9)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSTYAMNWVRQAPGQGL
EWMGIISDDGTTYYATWAKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV
YYCARDAGAGGVQDYLTLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRS
TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
LC de Anticorpo 25F7 (SEQ ID NO: 10)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASENIYNFLAWYQQKPGQPPKLLI
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 50/116
37/43
YSASTLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGSSNS
NIDNPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HCVR de Anticorpo 25F7 (SEQ ID NO: 11)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSTYAMNWVRQAPGQGL EWMGIISDDGTTYYATWAKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YYCARDAGAGGVQDYLTLWGQGTLVTVSS
LCVR de Anticorpo 25F7 (SEQ ID NO: 12)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASENIYNFLAWYQQKPGQPPKLLI
YSASTLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGSSNS
NIDNPFGGGTKVEIK
HCDR1 de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 13)
GFSLSSYGVS
HCDR1 de Anticorpo 23C8 (SEQ ID NO: 14)
GFDISKYNIQ
HCDR1 de Anticorpo 2SF7 (SEQ ID NO: 15)
GFSLSTYAMN
HCDR2 de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 16)
AISYDGITYYASWAKS
HCDR2 de Anticorpo 23C8 (SEQ ID NO: 17)
FINYGGSAYYASRAKG
HCDR2 de Anticorpo 2SF7 (SEQ ID NO: 18)
IISDDGTTYYATWAKG
HCDR3 de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 19)
GDYYDDYVYVYALDI
HCDR3 de Anticorpo 23C8 (SEQ ID NO: 20)
GLSNSDL
HCDR3 de Anticorpo 25F7 (SEQ ID NO: 21)
DAGAGGVQDYLTL
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 51/116
38/43
LCDR1 de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 22)
QASQSISTALA
LCDR1 de Anticorpo 23C8 (SEQ ID NO: 23)
QASQSISSWLS
LCDR1 de Anticorpo 25F7 (SEQ ID NO: 24)
QASENIYNFLA
LCDR2 de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 25)
AASTLAS
LCDR2 de Anticorpo 23C8 (SEQ ID NO: 26)
RASTLAS
LCDR2 de Anticorpo 25F7 (SEQ ID NO: 27)
SASTLAS
LCDR3 de Anticorpo 22B3 (SEQ ID NO: 28)
QQGYSSSNLDNV
LCDR3 de Anticorpo 2308 (SEQ ID NO: 29)
QSTYGGVVGSTSDDNP
LCDR3 de Anticorpo 25F7 (SEQ ID NO: 30)
QQGSSNSNIDNP
BTLA de ser humano (SEQ ID NO: 31)
MKTLPAMLGTGKLFWVFFLIPYLDIWNIHGKESCDVQLYIKRQSEHSIL
AGDPFELECPVKYCANRPHVTWCKLNGTTCVKLEDRQTSWKEEKNI
SFFILHFEPVLPNDNGSYRCSANFQSNLIESHSTTLYVTDVKSASERP
SKDEMASRPWLLYRLLPLGGLPLLITTCFCLFCCLRRHQGKQNELSD TAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQ
EGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASI CVRS
BTLA de camundongo Balbc (SEQ ID NO: 32)
MKTVPAMLGTPRLFREFFILHLGLWSILCEKATKRNDEECEVQLNIKR
NSKHSAWTGELFKIECPVKYCVHRPNVTWCKHNGTIWVPLEVGPQL
YTSWEENRSVPVFVLHFKPIHLSDNGSYSCSTNFNSQVINSHSVTIHV
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 52/116
39/43
RERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTMEERPGRTWLLYTLLPLG ALLLLLACVCLLCFLKRIQGKEKKPSDLAGRDTNLVDIPASSRTNHQA LPSGTGIYDNDPWSSMQDESELTISLQSERNNQGIVYASLNHCVIGR NPRQENNMQEAPTEYASICVRS
BTLA de camundongo C57BL6 (SEQ ID NO: 33) MKTVPAMLGTPRLFREFFILHLGLWSILCEKATKRNDEECPVQLTITR NSKQSARTGELFKIQCPVKYCVHRPNVTWCKHNGTICVPLEVSPQLY TSWEENQSVPVFVLHFKPIHLSDNGSYSCSTNFNSQVINSHSVTIHVT ERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTIVIEERPGRTWLLYTLLPLGAL LLLLACVCLLCFLKRIQGK
EKKPSDLAGRDTNLVDIPASSRTNHQALPSGTGIYDNDPWSSMQDE SELTISLQSERNNQGIVYASLNHCVIGRNPRQENNMQEAPTEYASICV RS
BTLA de macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 34)
MKTLPAMLGSGRLFWWFLIPYLDIWNIHGKESCDVQLYIKRQSYHSI FAGDPFKLECPVKYCAHRPQVTWCKLNGTTCVKLEGRHTSWKQEK NLSFFILHFEPVLPSDNGSYRCSANFLSAIIESHSTTLYVTDVKSASER PSKDEMASRPWLLYSLLPLGGLPLLITTCFCLFCFLRRHQGKQNELS DTTGREITLVDVPFKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNEPDFCFRM QEGSEVYSNPCLEENKPGIIYASLNHSIIGLNSRQARNVKEAPTEYASI CVRS
DNA Exemplificado para a Expressão da Cadeia Pesada de Anticorpo 22B3 da SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 35) caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctg caag g catctg g attctccctcagtag ctatg g agtgag ctg g gtg eg acag g cccctg g acaag g g ettg agtg g atg g g ag ccattagttatg atg gtattacatactacg eg ag ctg g g eg aaaag c agagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgag atetg ag g acacg g ccgtgtattactg tg eg agag g g g actactacg atg attat g ttt atg ttt atg ctttagacatctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaagggcccatcgg tcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtc
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 53/116
40/43 aaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtg cacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccct ccag cag cttg g g cacg aag acctacacctg caacgtag atcacaag cccag caacaccaag gtg g acaag ag agttg agtccaaatatggtcccccatg cccaccctg cccag cacctg ag g ccg ccg g g g g accatcagtcttcctgttccccccaaaacccaag g acactctcatg atctcccg g acc cctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggt acgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagc acgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtaca agtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaag g g cag ccccg ag ag ccacag gtgtacaccctg cccccatcccag g ag g ag atg accaag aa ccag gtcag cctg acctg cctg gtcaaag g cttctaccccag eg acatcg ccgtg g agtg g g aa ag caatg g g cag ccg g ag aacaactacaag accacg cctcccgtg etg g act ccg acg g etc cttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcat gctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
DNA Exemplificado para a Expressão da Cadeia Leve de Anticorpo 22B3 da SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 36)
Gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcct g ccag gccagtcagag cattagtactg cattag cctg gtaccag cag aaacctgg ccag gctcc cag g ctcctcatctatg etg catccactctg g catctg g catcccag acag gttcagtg g cagtg g gtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtc aacagggttatagtagtagtaatcttgataatgttttcggcggagggaccaaggtggagatcaaac g g accgtg g etg caccatctgtcttcatcttcccg ccatctg atg ag cagttg aaatctg g aactg c ctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataa eg ccctccaatcg g gtaactcccag g ag agtgtcacag ag cag g acag caag g acag cacct acagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctg cgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc
DNA Exemplificado para a Expressão da Cadela Pesada de Anticorpo 23C8 da SEQ ID NO: 5 (SEQ ID NO: 37)
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 54/116
41/43 gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctg tg cag cctctg g attcg acatcagtaagtacaacatccaatg g gtccg ccag g ctccag g g aag gggctggagtgggttggcttcattaattatggtggtagcgcatactacgcgagccgggcgaaagg cagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaa ccgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggactaagtaatagcgacctctggggccaggg caccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaagggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctcc aggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtg acg gtgtcgtg g aactcag g eg ccctg accag eg g cgtg cacaccttcccg g ctgtcctaca gtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaga cctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtcc aaatatg gtcccccatg cccaccctg cccag cacctg ag g ccg cog g g g g accatcagtcttcct gttccccccaaaacccaag g acactctcatg atctcccg g acccctg ag gtcacgtg cgtg gtg g tggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgc ataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcc tcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaag g cctcccgtcctccatcg ag aaaaccatctccaaag ccaaag g g cag ccccg ag ag ccacag gtgtacaccctg cccccatcccag g ag g ag atg accaag aaccag gtcag cctg acctg cctg gtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaa caactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaac cgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgc acaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
DNA Exemplificado para a Expressão da Cadeia Leve de Anticorpo 23C8 da SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NO: 38) g acatccag atg acccagtctccatcctccctgtctg catctgtag g ag acag agtcaccatcactt gccaggccagtcagagcattagtagttggttatcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccc taagctcctgatctacagggcatccactctggcatctggggtcccatcaaggttcagtggaagtgg atctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtc aatccacttatggtggtgttgttggcagtactagtgatgataatcctttcggcggagggaccaaggt g g ag atcaaacg g accgtg g etg caccatctgtcttcatcttcccg ccatctg atg ag cagttg aa
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 55/116
42/43 atctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgg aaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaa ggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacac aaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca ggggagagtgc
DNA Exemplificado para a Expressão da Cadeia Pesada de Anticorpo 2SF7 da SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 39) caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctg caag g catctg g attctccctcagtacctatg caatg aactg g gtg eg acag g cccctg g acaag g g ettg agtg g atg g g aatcattagtg atg atg gtaccacatactacg eg acctg ggegaaagge agagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgag atctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagatgctggtgctggtggtgtccaagactactta accttgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaagggcccatcggtcttc ccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaag g actacttccccg aaccg gtg acg gtgtcgtg g aactcag g eg ccctg accag eg g cgtg caca ccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccag cagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtgg acaag ag agttg agtccaaatatg gtcccccatg cccaccctg cccag cacctg ag g ccg ccg g g g g accatcagtcttcctgttccccccaaaacccaag g acactctcatg atctcccg g acccctg aggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgt ggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtg caaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggca g ccccg ag ag ccacag gtgtacaccctgcccccatcccag g ag g ag atg accaag aaccag gtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagca atgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttctt cctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctcc gtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 56/116
A3IA3
DNA Exemplificado para a Expressão da Cadeia Leve de Anticorpo 2SF7 da SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 40)
Gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaa ctgccaggccagtgagaatatttacaactttttggcctggtaccagcagaaaccaggacagcctc ctaagctgctcatttactctgcatccactctggcatctggggtccctgaccgattcagtggcagcgg gtctg g g acag atttcactctcaccatcag cagcctg cag g ctg aag atgtg g cagtttattactg tc aacagggttctagtaatagtaatattgataatcctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa cggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactg cctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggata acgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcac ctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacg cctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt gc
HVEM de ser humano (SEQ ID NO: 41) MEPPGDWGPPPWRSTPKTDVLRLVLYLTFLGAPCYAPALPSCKEDE YPVGSECCPKCSPGYRVKEACGELTGTVCEPCPPGTYIAHLNGLSK CLQCQMCDPAMGLRASRNCSRTENAVCGCSPGHFCIVQDGDHCAA CRAYATSSPGQRVQKGGTESQDTLCQNCPPGTFSPNGTLEECQHQ TKCSWLVTKAGAGTSSSHWVWWFLSGSLVIVIVCSTVGLIICVKRRK PRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFT GRSPNH

Claims (87)

1. Anticorpo que se liga ao BTLA, caracterizado pelo fato de que compreende a HCDR1 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 13, a HCDR2 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16, a HCDR3 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19, a LCDR1 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22, a LCDR2 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 25 e a LCDR3 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada (HC) tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve (LC) tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.
4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo duas HC e duas LC, caracterizado pelo fato de que cada HC possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e cada cadeia leve (LC) possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um ou mais veículos, díluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
6. Método de tratamento de um paciente tendo uma doença reumática, neural e/ou dermatológica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 58/116
2/12
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase.
9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença neural é esclerose múltipla.
10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma ou mais de doença reumática, neural e dermatológica.
12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.
13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase.
14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a doença neural é esclerose múltipla.
15. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma ou mais de doença reumática, neural e dermatológica.
16. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 59/116
3/12
17. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase.
18. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença neural é esclerose múltipla.
19. Composição farmacêutica para uso no tratamento de uma condição selecionada de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
20. Composição farmacêutica para uso no tratamento de uma condição selecionada de dermatite atópica e psoríase, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
21. Composição farmacêutica para uso no tratamento de esclerose múltipla, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
22. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de anticorpo dada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.
23. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de anticorpo dada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.
24. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de anticorpo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e uma sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de anticorpo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.
25. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 24,
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 60/116
4/12 caracterizada pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de anticorpo é a SEQ ID NO: 35, e a sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de anticorpo é a SEQ ID NO: 36.
26. Célula de mamífero que compreende a molécula de DNA como definida na reivindicação 22 e a molécula de DNA como definida na reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a célula é capaz de expressar um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que a sequência de aminoácido de cada cadeia pesada é dada pela SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácido de cada cadeia leve é dada pela SEQ ID NO: 2.
27. Célula de mamífero que compreende a molécula de DNA como definida na reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que a célula é capaz de expressar um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que a sequência de aminoácido de cada cadeia pesada é dada pela SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácido de cada cadeia leve é dada pela SEQ ID NO: 2.
28. Processo para a produção de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de cada uma das duas HCs é a SEQ ID NO: 1, e a sequência de aminoácido de cada um das duas LCs é a SEQ ID NO: 2, e em que o processo compreende: a) o cultivo da célula de mamífero como definida na reivindicação 26 ou 27 sob condições tais que o anticorpo é expresso, e b) a recuperação do anticorpo expresso.
29. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é obtenível pelo processo como definido na reivindicação 28.
30. Anticorpo que se liga ao BTLA, caracterizado pelo fato de que compreende HCDR1 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14, HCDR2 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 61/116
5/12
NO: 17, HCDR3 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20, LCDR1 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 23, LCDR2 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 26 e LCDR3 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 29.
31. Anticorpo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8.
32. Anticorpo de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada (HC) tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5, e uma cadeia leve (LC) tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.
33. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, compreendendo duas HCs e duas LCs, caracterizado pelo fato de que cada HC possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e cada cadeia leve (LC) possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.
34. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 33, e um ou mais veículos, díluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
35. Método de tratamento de um paciente tendo uma doença reumática, neurai e/ou dermatológica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 33.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.
37. Método de acordo com a reivindicação 35,
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 62/116
6/12 caracterizado pelo fato de que a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase.
38. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a doença neural é esclerose múltipla.
39. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
40. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma ou mais de doença reumática, neural e dermatológica.
41. Anticorpo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.
42. Anticorpo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase.
43. Anticorpo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a doença neural é esclerose múltipla.
44. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma ou mais de doença reumática, neural e dermatológica.
45. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.
46. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase.
47. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 44,
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 63/116
7/12 caracterizado pelo fato de que a doença neural é esclerose múltipla.
48. Composição farmacêutica para uso no tratamento de uma condição selecionada de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 33.
49. Composição farmacêutica para uso no tratamento de uma condição selecionada de dermatite atópica e psoríase, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 33.
50. Composição farmacêutica para uso no tratamento de esclerose múltipla, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 33.
51. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de anticorpo dada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5.
52. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de anticorpo dada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.
53. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de anticorpo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e uma sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de anticorpo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.
54. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de anticorpo é a SEQ ID NO: 37, e a sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de anticorpo é a SEQ ID NO: 38.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 64/116
8/12
55. Célula de mamífero que compreende a molécula de DNA como definida na reivindicação 51 e a molécula de DNA como definida na reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que a célula é capaz de expressar um anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que a sequência de aminoácido de cada cadeia pesada é dada pela SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácido de cada cadeia leve é dada pela SEQ ID NO: 6.
56. Célula de mamífero que compreende a molécula de DNA como definida na reivindicação 53 ou 54, caracterizada pelo fato de que a célula é capaz de expressar um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que a sequência de aminoácido de cada cadeia pesada é dada pela SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácido de cada cadeia leve é dada pela SEQ ID NO: 6.
57. Processo para a produção de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de cada uma das duas HCs é a SEQ ID NO: 5, e a sequência de aminoácido de cada uma das duas LCs é a SEQ ID NO: 6, e em que o processo compreende: a) o cultivo da célula de mamífero como definida na reivindicação 55 ou 56 sob condições tais que o anticorpo é expresso, e b) a recuperação do anticorpo expresso.
58. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é obtenível pelo processo como definido na reivindicação 57.
59. Anticorpo que se liga ao BTLA, caracterizado pelo fato de que compreende a HCDR1 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 15, a HCDR2 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18, a HCDR3 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 21, a LCDR1 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 24, a LCDR2 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 27 e a LCDR3 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 30.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 65/116
9/12
60. Anticorpo de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12.
61. Anticorpo de acordo com a reivindicação 59 ou 60, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada (HC) tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve (LC) tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10.
62. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, compreendendo duas HC e duas LC, caracterizado pelo fato de que cada HC possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e cada cadeia leve (LC) possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10.
63. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 59 a 62, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
64. Método de tratamento de um paciente tendo uma doença reumática, neural e/ou dermatológica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 59 a 62.
65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.
66. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase.
67. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a doença neural é esclerose múltipla.
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 66/116
10/12
68. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 62, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
69. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 62, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma ou mais de doença reumática, neural e dermatológica.
70. Anticorpo de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.
71. Anticorpo de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase.
72. Anticorpo de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a doença neural é esclerose múltipla.
73. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 59 a 62, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma ou mais de doença reumática, neural e dermatológica.
74. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a doença reumática é pelo menos uma de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.
75. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a doença dermatológica é pelo menos uma de dermatite atópica e psoríase.
76. Uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a doença neural é esclerose múltipla.
77. Composição farmacêutica para uso no tratamento de uma condição selecionada de nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide, caracterizada pelo fato de que
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 67/116
11/12 compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 59 a 62.
78. Composição farmacêutica para uso no tratamento de uma condição selecionada de dermatite atópica e psoríase, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 59 a 62.
79. Composição farmacêutica para uso no tratamento de esclerose múltipla, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 59 a 62.
80. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de anticorpo dada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9.
81. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de anticorpo dada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10.
82. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de anticorpo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e uma sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de anticorpo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10.
83. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada de anticorpo é a SEQ ID NO: 39 e a sequência de polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de anticorpo é a SEQ ID NO: 40.
84. Célula de mamífero que compreende a molécula de DNA como definida na reivindicação 80 e a molécula de DNA como definida na reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que a célula é capaz de expressar um anticorpo que compreende duas cadeias
Petição 870190103217, de 14/10/2019, pág. 68/116
12/12 pesadas e duas cadeias leves, em que a sequência de aminoácido de cada cadeia pesada é dada pela SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácido de cada cadeia leve é dada pela SEQ ID NO: 10.
85. Célula de mamífero compreendendo a molécula de DNA como definida na reivindicação 82 ou 83, caracterizada pelo fato de que a célula é capaz de expressar um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, em que a sequência de aminoácido de cada cadeia pesada é dada pela SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácido de cada cadeia leve é dada pela SEQ ID NO: 10.
86. Processo para a produção de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de cada uma das duas HCs é a SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácido de cada uma das duas LCs é a SEQ ID NO: 10, e em que o processo compreende: a) o cultivo da célula de mamífero como definida na reivindicação 84 ou 85 sob condições tais que o anticorpo é expresso, e b) a recuperação do anticorpo expresso.
87. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é obtenível pelo processo como definido na reivindicação 86.
BR112019021547-6A 2017-05-19 2018-05-11 Anticorpos agonistas de btla e seu uso BR112019021547A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762508510P 2017-05-19 2017-05-19
US62/508,510 2017-05-19
PCT/US2018/032218 WO2018213113A1 (en) 2017-05-19 2018-05-11 Btla agonist antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112019021547A2 true BR112019021547A2 (pt) 2020-05-12

Family

ID=62245543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112019021547-6A BR112019021547A2 (pt) 2017-05-19 2018-05-11 Anticorpos agonistas de btla e seu uso

Country Status (25)

Country Link
US (2) US10604573B2 (pt)
EP (1) EP3625257A1 (pt)
JP (2) JP6790304B2 (pt)
KR (3) KR20210106033A (pt)
CN (3) CN117402244A (pt)
AR (1) AR111752A1 (pt)
AU (2) AU2018269585B2 (pt)
BR (1) BR112019021547A2 (pt)
CA (2) CA3064518A1 (pt)
CL (1) CL2019003215A1 (pt)
CO (1) CO2019012756A2 (pt)
CR (1) CR20190521A (pt)
DO (1) DOP2019000293A (pt)
EA (1) EA201992460A1 (pt)
EC (1) ECSP19082184A (pt)
JO (1) JOP20190261A1 (pt)
MA (1) MA49133A (pt)
MX (1) MX2019013604A (pt)
MY (1) MY197425A (pt)
NZ (1) NZ758360A (pt)
PE (1) PE20191843A1 (pt)
PH (1) PH12019502575A1 (pt)
TW (4) TW202334237A (pt)
WO (1) WO2018213113A1 (pt)
ZA (1) ZA201906954B (pt)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201820554D0 (en) * 2018-12-17 2019-01-30 Univ Oxford Innovation Ltd BTLA antibodies
JP2022552323A (ja) 2019-10-15 2022-12-15 イーライ リリー アンド カンパニー 組換え操作された、リパーゼ／エステラーゼ欠損哺乳動物細胞株
GB202008860D0 (en) 2020-06-11 2020-07-29 Univ Oxford Innovation Ltd BTLA antibodies
JP2023546713A (ja) * 2020-10-23 2023-11-07 アナプティスバイオ インコーポレイティッド Ｂ及びｔリンパ球アテニュエータ（ｂｔｌａ）調節因子及びその使用方法
WO2023143565A1 (en) * 2022-01-29 2023-08-03 Hifibio (Hk) Limited Anti-btla antibodies and uses thereof in treating cancer
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8546541B2 (en) 2002-06-20 2013-10-01 Washington University Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
CA2503125C (en) * 2002-10-25 2013-04-30 Hilary Clark Novel composition and methods for the treatment of immune related diseases
EA200970477A1 (ru) * 2006-11-15 2009-12-30 Медарекс, Инк. Человеческие моноклональные антитела к btla и способы применения
EA201270228A1 (ru) * 2009-07-31 2012-09-28 Медарекс, Инк. Полноценные человеческие антитела к btla
US9533039B2 (en) * 2010-09-27 2017-01-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating systemic lupus erythematosus (SLE) using anti-CD48 antibodies
WO2014018931A1 (en) * 2012-07-26 2014-01-30 The General Hospital Corporation Methods and compositions for treating autoimmune disease
WO2014183885A1 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antagonist of the btla/hvem interaction for use in therapy
WO2016176583A1 (en) * 2015-04-29 2016-11-03 Sanford-Burnham Medical Research Institute Modulation of immune response using btla agonist antibodies
WO2017096017A1 (en) * 2015-12-02 2017-06-08 Stsciences, Inc. Antibodies specific to glycosylated btla (b- and t- lymphocyte attenuator)

Also Published As

Publication number Publication date
US10604573B2 (en) 2020-03-31
ZA201906954B (en) 2021-06-30
CN117402244A (zh) 2024-01-16
EP3625257A1 (en) 2020-03-25
MX2019013604A (es) 2019-12-18
CN110621699A (zh) 2019-12-27
JOP20190261A1 (ar) 2019-11-05
TWI677504B (zh) 2019-11-21
JP2021019642A (ja) 2021-02-18
TW201904991A (zh) 2019-02-01
ECSP19082184A (es) 2019-11-30
JP7072622B2 (ja) 2022-05-20
TW201946932A (zh) 2019-12-16
CA3184628A1 (en) 2018-11-22
TWI747043B (zh) 2021-11-21
DOP2019000293A (es) 2019-12-15
TW202334237A (zh) 2023-09-01
US20200239578A1 (en) 2020-07-30
US11396545B2 (en) 2022-07-26
CL2019003215A1 (es) 2020-04-13
CR20190521A (es) 2020-01-06
JP2020518288A (ja) 2020-06-25
MA49133A (fr) 2020-03-25
TW202233681A (zh) 2022-09-01
MY197425A (en) 2023-06-16
PH12019502575A1 (en) 2020-07-13
AU2018269585A1 (en) 2019-10-31
NZ758360A (en) 2022-10-28
CO2019012756A2 (es) 2020-01-17
AU2021277743A1 (en) 2021-12-23
AR111752A1 (es) 2019-08-14
EA201992460A1 (ru) 2020-03-18
US20180334502A1 (en) 2018-11-22
WO2018213113A1 (en) 2018-11-22
KR20220158847A (ko) 2022-12-01
AU2018269585B2 (en) 2021-09-02
KR20210106033A (ko) 2021-08-27
JP6790304B2 (ja) 2020-11-25
KR20190140969A (ko) 2019-12-20
PE20191843A1 (es) 2019-12-31
CN117402245A (zh) 2024-01-16
KR102294051B1 (ko) 2021-08-27
CN110621699B (zh) 2023-10-31
TWI804044B (zh) 2023-06-01
CA3064518A1 (en) 2018-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112019021547A2 (pt) Anticorpos agonistas de btla e seu uso
RU2562874C1 (ru) Антитела против ох40 и способы их применения
JP7194104B2 (ja) 抗ｔｌ１ａモノクローナル抗体の中和
JP6830533B2 (ja) 抗ｉｌ−３３抗体およびその使用
JP6744313B2 (ja) 血漿カリクレインおよび第ｘｉｉ因子に対する二重特異性抗体
US20080044409A1 (en) Inflammatory mediator antagonists
TWI779253B (zh) 抗IL-23p19抗體及其用途
WO2020034941A1 (zh) 抗IL-1β的抗体、其药物组合物及其用途
KR20220002891A (ko) 자가항체-매개 자가면역 질병의 치료를 위한 항-cd38 항체 및 이의 약제학적 조성물
CN105085679B (zh) 全人源抗rankl抗体
WO2024077987A1 (zh) Prdx1 IgG中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用
KR20220084152A (ko) Trem2 항체 및 그의 용도
JP2023549150A (ja) 抗ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子抗体及びその製造方法と使用
JP7246306B2 (ja) 抗ｒａｎｋｌ抗体およびその使用
JP2023515480A (ja) 抗ｉｌ－２抗体、その抗原結合断片及びその医薬用途
KR20210080400A (ko) 인간화 항-n-절단 아밀로이드 베타 단일 클론 항체
EA043345B1 (ru) Антитела-агонисты btla и их применение
RU2799044C2 (ru) Антитела против фактора d и их применения
JP2024073462A (ja) 抗ｒａｎｋｌ抗体およびその使用
TW202342517A (zh) 使用抗組織因子抗體之炎性疾病治療
CN116606373A (zh) 新型冠状病毒中和抗体及其用途
TW200944230A (en) Anti-VEGF monoclonal antibody

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]