TW201904991A - Btla同效劑抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供結合BTLA之抗體及使用其之方法，該等抗體適用作用於治療與自體免疫疾病相關聯之病況，包括治療狼瘡之藥劑。
Description
本發明屬醫學領域。更特定言之，本發明係關於針對B及T淋巴球衰減因子(BTLA)之抗體及其醫藥組合物。本發明之抗體期望適用於治療自身免疫疾病，諸如狼瘡。
狼瘡為具有異質特徵的自體免疫疾病，包括皮膚、口、肌肉及關節、心肌、周邊血液、肺、腎臟、生殖器官及CNS表現。狼瘡患者處於嚴重且危及生命的心臟血管、腎及神經精神疾病的風險下。標準護理包括大量類固醇，其具有許多不利及/或危險副作用。需要療法來控制疾病且允許減少或消除類固醇使用。
B及T淋巴球衰減因子(BTLA；CD272)為Ig超家族成員且為負調節免疫細胞活化之核查點受體家族的部分。BTLA主要表現於B細胞、T細胞及樹突狀細胞上。BTLA之天然配位體為TNF受體超家族成員，疱疹病毒條目介體(HVEM；TNFRSF14)。
據報導如藉由流式細胞量測術所偵測到的人類HVEM-Fc與表現於KD
為112 nM的293T細胞中之人類BTLA。(Cheung等人, PNAS, 2005年9月13日, 102:37;13218-13223)。使HVEM與BTLA結合使得酪胺酸磷酸化BTLA細胞質域上之兩個保守的基於免疫受體酪胺酸之抑制基元域。此磷酸化使得經由兩個Src同源性2域募集蛋白酪胺酸磷酸酶，所述蛋白酪胺酸磷酸酶藉由去磷酸化及下調陽性細胞受體信號傳導(例如，T細胞受體或B細胞受體信號轉導級聯)而賦予BTLA之抑制活性，因此使得抑制免疫細胞活化。在易於自發地出現狼瘡狀疾病之小鼠模型(MRL-lpr小鼠)中，相較於表現BTLA之小鼠，BTLA缺陷型小鼠在唾液腺、肺、胰腺、腎及關節中具有更嚴重淋巴球浸潤。因此，BTLA同效劑抗體可為患有自身免疫疾病(諸如狼瘡)之患者提供益處。
BTLA同效劑抗體為此項技術中已知的。舉例而言，美國專利第8,563,694號('694專利)揭示阻斷(Mab21H6及Mab19A7)或不阻斷(Mab8D5及Mab8A3)與BTLA結合之HVEM的BTLA同效劑抗體。'694專利描述對研發利用BTLA在淋巴球反應中的抑制性作用同時允許BTLA-HVEM結合之治療的持續需求。然而，缺乏模擬HVEM與BTLA之結合以用於治療自身免疫疾病的BTLA同效劑抗體。若抗體具有顯著重疊HVEM之結合位點的抗原決定基，則抗體「模擬」與BTLA結合之HVEM，且在抗體與HVEM之間存在結構類似性。亦缺乏結合人類BTLA且適用於研究自身免疫疾病之活體內臨床前模型(諸如鼠類及食蟹獼猴模型)的BTLA同效劑抗體。因此，仍存在對替代性BTLA同效劑抗體的需求。
本發明之抗體試圖提供替代性BTLA同效劑抗體。此等BTLA同效劑抗體可適用於治療自身免疫疾病，諸如狼瘡。此等BTLA同效劑抗體能夠結合來自多個物種之BTLA，諸如人類、食蟹獼猴及/或鼠類BTLA。另外，相較於具有與Mab8D5相同重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體，此等BTLA同效劑抗體顯示增強的活體外活性。本發明之抗體具有此等所需特徵中之至少一者。
一個此類BTLA同效劑抗體能夠結合人類、食蟹獼猴及鼠類BTLA。出人意料地，由於此抗體模擬與BTLA結合之HVEM，因此其具有此所需交叉反應性。相較於結合BTLA之HVEM，此抗體亦對BTLA具有更高的結合親和力。此可為具有HVEM短暫水平之疾病狀態的患者提供益處，其中在患者HVEM降低的時間期間，可能需要具有攜帶模擬BTLA之同效劑抗體。
本發明提供與BTLA結合且活化及/或增強BTLA介導之信號傳導的抗體(BTLA同效劑抗體)。本發明提供一種抗體，其包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中LCVR包含互補決定區(CDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，且其中LCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO: 22，LCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO: 25，LCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO:28，HCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO: 13，HCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO: 16且HCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO: 19。在一實施例中，抗體包含LCVR及HCVR，且其中LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO: 4，且HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO: 3。在另一實施例中，抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，且其中LC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 2，且HC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 1。在又一實施例中，抗體包含2個LC及2個HC，其中各LC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 2，且各HC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 1。
本發明亦提供一種BTLA同效劑抗體，其中LCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO: 23，LCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:26，LCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO: 29，HCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO: 14，HCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO: 17且HCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO: 20。在一實施例中，LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO: 8，且HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO: 7。在另一實施例中，LC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 6，且HC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 5。在又一實施例中，抗體包含2個LC及2個HC，其中各LC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 6，且各HC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 5。
本發明亦提供一種BTLA同效劑抗體，其中LCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:24，LCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:27，LCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO: 30，HCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO: 15，HCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO: 18且HCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO: 21。在一實施例中，LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO: 12，且HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO: 11。在另一實施例中，LC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 10，且HC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 9。在又一實施例中，抗體包含2個LC及2個HC，其中各LC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 10，且各HC之胺基酸序列為SEQ ID NO: 9。
本發明亦提供一種結合BTLA之抗體，其中該抗體藉由包含以下之步驟產生：用人類BTLA之Fc標記之胞外域(ECD)域來使家兔免疫；及用人類及小鼠BTLA-Fc標記之蛋白質增強。人類BTLA ECD之胺基酸序列為SEQ ID NO: 31之胺基酸31-150。
本發明提供一種模擬與BTLA結合之HVEM之BTLA同效劑抗體。本發明亦提供一種BTLA同效劑抗體，其能夠結合人類、食蟹獼猴及鼠類BTLA。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物可用於治療風濕性、神經性及皮膚病學疾病中之一或多者，從而此類治療包含向有需要之患者投與有效量之本發明之醫藥組合物。在一些特定實施例中，風濕性疾病為狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症及類風濕性關節炎中之至少一者。在其他特定實施例中，皮膚病學疾病為異位性皮膚炎及牛皮癬中之至少一者。在其他特定實施例中，神經性疾病為多發性硬化症。
本發明亦提供一種治療患有風濕性、神經性及皮膚病學疾病中之一或多者之患者的方法，該方法包含向有需要之患者投與有效量之本發明抗體。在一些此等實施例中，風濕性疾病為狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症及類風濕性關節炎中之至少一者。在其他特定實施例中，皮膚病學疾病為異位性皮膚炎及牛皮癬中之至少一者。在其他特定實施例中，神經性疾病為多發性硬化症。
本發明亦提供一種本發明之抗體或其醫藥組合物，以用於療法。在一些實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或其醫藥組合物，以用於治療風濕性、神經性及皮膚病學疾病中之一或多者。在一些此等實施例中，風濕性疾病為狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症及類風濕性關節炎中之至少一者。在其他特定實施例中，皮膚病學疾病為異位性皮膚炎及牛皮癬中之至少一者。在其他特定實施例中，神經性疾病為多發性硬化症。
本發明亦提供本發明之抗體或其醫藥組合物的用途，其用於製造用於治療風濕性、神經性及皮膚病學疾病中之一或多者的藥劑。在一些此等實施例中，風濕性疾病為狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症及類風濕性關節炎中之至少一者。在其他特定實施例中，皮膚病學疾病為異位性皮膚炎及牛皮癬中之至少一者。在其他特定實施例中，神經性疾病為多發性硬化症。
本發明提供包含一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。本發明亦提供一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。
本發明提供一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列，且包含編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。本發明亦提供一種包含編碼具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子，及一種包含編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子。在一特定實施例中，編碼具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列為SEQ ID NO:35且編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列為SEQ ID NO:36。
本發明亦提供一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列，且包含編碼具有ID NO : 6之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。本發明亦提供一種包含編碼具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子，及一種包含編碼具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子。在一特定實施例中，編碼具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 37，編碼具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 38。
本發明亦提供一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列，且包含編碼具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。本發明亦提供一種包含編碼具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子，及一種包含編碼具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子。在一特定實施例中，編碼具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 39，編碼具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列為SEQ ID NO:40。
此外，本發明提供一種哺乳動物細胞，其包含：包含編碼具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子；及包含編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子。本發明亦提供一種哺乳動物細胞，其包含DNA分子，該DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之多肽及具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。本發明亦提供一種哺乳動物細胞，其包含DNA分子，該DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之多肽及具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。在一實施例中，哺乳動物細胞株為中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary；CHO)或倉鼠胚胎腎臟(Hamster embryonic kidney；HEK)細胞株。
本發明亦提供一種哺乳動物細胞，其包含：包含編碼具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子；及/或包含編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子，其中該細胞能夠表現包含具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之HC及具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之LC的抗體。較佳地，哺乳動物細胞包含DNA分子，該DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之多肽及具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。在一實施例中，哺乳動物細胞株為CHO或HEK細胞株。
本發明亦提供一種哺乳動物細胞，其包含：包含編碼具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子；及/或包含編碼具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子，其中該細胞能夠表現包含具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之HC及SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之LC的抗體。較佳地，哺乳動物細胞包含DNA分子，該DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之多肽及具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。在一實施例中，哺乳動物細胞株為CHO或HEK細胞株。
本發明亦提供一種哺乳動物細胞，其包含：包含編碼具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子；及/或包含編碼具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列之DNA分子，其中該細胞能夠表現包含具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之HC及具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之LC的抗體。較佳地，哺乳動物細胞包含DNA分子，該DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之多肽及具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。在一實施例中，哺乳動物細胞株為CHO或HEK細胞株。
在另一實施例中，本發明提供一種用於產生抗體的方法，該抗體包含具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的LC及具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的HC，其中該方法包含：在使得抗體表現之條件下培育包含DNA之哺乳動物細胞，該DNA編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的LC及/或具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的HC；及回收經表現抗體。本發明包括可藉由如上文剛剛描述之本發明方法獲得之抗體。
本發明亦提供一種用於產生抗體之方法，該抗體包含具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的LC及具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HC，其中該方法包含：在使得抗體表現之條件下培育包含DNA之哺乳動物細胞，該DNA編碼具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的LC及/或具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HC；及回收經表現抗體。本發明包括可藉由如上文剛剛描述之本發明方法獲得之抗體。
本發明亦提供一種用於產生抗體之方法，該抗體包含具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的LC及具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的HC，其中該方法包含：在使得抗體表現之條件下培育包含DNA之哺乳動物細胞，該DNA編碼具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的LC及/或具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的HC；及回收經表現抗體。本發明包括可藉由如上文剛剛描述之本發明方法獲得之抗體。
本發明包含一種用於產生抗體之方法，該抗體包含兩個HC及兩個LC，其中兩個HC中之每一者之胺基酸序列為SEQ ID NO: 1，且兩個LC中之每一者之胺基酸序列為SEQ ID NO: 2，且該方法包含：a)在使得抗體表現之條件下培育如上文所描述的本發明之哺乳動物細胞；及b)回收經表現抗體。本發明包括可藉由如上文剛剛描述之本發明方法獲得之抗體。
本發明亦包括一種用於產生抗體之方法，該抗體包含兩個HC及兩個LC，其中兩個HC中之每一者之胺基酸序列為SEQ ID NO: 5，且兩個LC中之每一者之胺基酸序列為SEQ ID NO: 6，且該方法包含：a)在使得抗體表現之條件下培育如上文所描述的本發明之哺乳動物細胞；及b)回收經表現抗體。本發明包括可藉由如上文剛剛描述之本發明方法獲得之抗體。
本發明亦包括一種用於產生抗體之方法，該抗體包含兩個HC及兩個LC，其中兩個HC中之每一者之胺基酸序列為SEQ ID NO: 9，且兩個LC中之每一者之胺基酸序列為SEQ ID NO: 10，且該方法包含：a)在使得抗體表現之條件下培育如上文所描述的本發明之哺乳動物細胞；及b)回收經表現抗體。本發明包括可藉由如上文剛剛描述之本發明方法獲得之抗體。
本發明提供一種抗體，其在具有以下SEQ ID NO: 31之殘基的結構性及功能性抗原決定基處接觸人類BTLA：位置42處之Arg及位置127處之His。本發明亦提供一種抗體，其在包含由SEQ ID NO: 31給出之胺基酸序列的位置42處之Arg的結構性及功能性抗原決定基處接觸人類BTLA。
本發明提供一種抗體，其在具有以下SEQ ID NO: 31之殘基的新穎結構性抗原決定基處接觸人類BTLA：位置35處之Asp、位置37處之Gln、位置42處之Arg、位置74處之Leu、位置76處之Gly、位置79處之Cys、位置114處之Arg、位置119處之Phe、位置120處之Gln、位置122處之Asn、位置128處之Ser。在一較佳實施例中，抗體22B3被稱為模擬與BTLA結合之HVEM，此係因為抗體22B3之HCDR3在結構上類似於HVEM。較佳地，當在諸如PyMOL™之程式中BTLA:抗體晶體結構與BTLA:HVEM晶體結構對齊時，抗體CDR環採用類似於HVEM環之構形，該HVEM環包含胺基酸殘基69至72 (SEQ ID NO:41之胺基酸ELTG)。
本發明提供一種抗體，其在功能性抗原決定基處接觸人類BTLA，該功能性抗原決定基具有SEQ ID NO: 31之位置52處之Asp。抗體接觸具有以下SEQ ID NO: 31之殘基的新穎結構性抗原決定基：位置46處之His、位置55處之Glu、位置103處之Glu、位置104處之Pro、位置106處之Leu、位置107處之Pro、位置134處之Thr、位置139處之Ala。
本發明提供一種抗體，其在功能性抗原決定基處接觸人類BTLA，該功能性抗原決定基具有SEQ ID NO: 31之位置68處之His及位置81處之Lys。在一實施例中，抗體接觸具有以下SEQ ID NO: 31之殘基的新穎結構性抗原決定基：位置62處之Tyr、位置64處之Ala、位置68處之His、位置85處之Arg、位置91處之Glu、位置98處之Phe、位置118處之Asn。
本發明提供一種抗體，其在具有以下SEQ ID NO: 31之殘基的新穎結構性抗原決定基處接觸人類BTLA：位置35處之Asp、位置37處之Gln、位置42處之Arg、位置74處之Leu、位置76處之Gly、位置79處之Cys、位置114處之Arg、位置119處之Phe、位置120處之Gln、位置122處之Asn以及位置124處之Ile、位置128處之Ser。
如本文中所使用，「抗體」為包含由二硫鍵互連之2個HC及2個LC的免疫球蛋白分子。各LC及HC之胺基末端部分包括約100-120個胺基酸之可變區，該可變區主要負責經由其中所含有之CDR識別抗原。CDR與稱為構架區(「FR」)之更保守之區穿插。各LCVR及HCVR由3個CDR及4個FR構成，其按以下順序自胺基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。LC之3個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」，且HC之3個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」。CDR含有與抗原形成特異性相互作用的大多數殘基。亦即，CDR含有與抗原之殘基接觸(在4.5Å內)的大多數殘基。因此，抗體結合特定抗原之功能性能力很大程度上受六個CDR內之胺基酸殘基影響。將胺基酸分配至本發明抗體之LCVR區及HCVR區內之CDR域係基於熟知Kabat編號慣例(Kabat等人, Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)； Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, 美國衛生及人類服務部(U.S.Department of Health and Human Services), NIH Publication第91-3242期(1991))，及Chothia (Chothia C, Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol.Biol. 1987; 196:901-17. Chothia C, Lesk AM, Tramontano A, Levitt M, Smith-Gill SJ, Air G, Sheriff S, Padlan EA, Davies D, Tulip WR等人, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989; 342:877-83)。HCDR1之起始胺基酸殘基由Chothia定義及HCDR1之末端胺基酸殘基由Kabat定義。HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3之起始胺基酸殘基及末端胺基酸殘基由Kabat定義。
如本文中所使用，術語「抗原決定基」可指結構性抗原決定基(與抗體之可變區接觸的抗原之位點)及/或功能性抗原決定基(可或可不與抗體之可變區接觸且對於抗體結合為必要的抗原之位點)。藉由X射線結晶學測定結構性抗原決定基，其中將經結合Fab上之另一個殘基之4.5Å內的人類BTLA上之任何殘基視為接觸位點。
本發明之抗體可使用已知方法製備及純化。舉例而言，編碼HC (例如由SEQ ID NO: 1給出之胺基酸序列)及LC (例如由SEQ ID NO: 2給出之胺基酸序列)之cDNA序列可經選殖且工程改造為GS(麩醯胺酸合成酶)表現載體。經工程改造的免疫球蛋白表現載體可隨後穩定轉染至CHO細胞中。如熟習此項技術者應瞭解，抗體之哺乳動物表現會引起糖基化，通常在Fc區中之極保守的N-糖基化位點處。穩定純系可經檢驗以用於表現與BTLA特異性結合之抗體。可將陽性純系擴增至無血清培養基中以用於在生物反應器中產生抗體。可藉由習知技術純化其中已分泌有抗體之培養基。舉例而言，可將培養基方便地施加至已用相容性緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水)平衡之蛋白A或G瓊脂糖凝膠FF管柱。洗滌管柱以移除非特異性結合組分。例如藉由pH梯度溶離經結合的抗體，且諸如藉由SDS-PAGE偵測抗體溶離份且隨後彙集。可使用常見技術濃縮及/或無菌過濾抗體。可藉由常見技術(包括尺寸排阻、疏水性相互作用、離子交換或羥磷灰石層析)來有效移除可溶聚集體及多聚體。可在例如-70℃下將產物立即冷凍或可將其冷凍乾燥。
本發明之抗體可以併入至一種醫藥組合物中，該醫藥組合物可以藉由此項技術中熟知之方法製備且包含本發明之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
可藉由非經腸途徑(例如，皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內或經皮)向處於如本文所描述之疾病或病症風險下或呈現如本文所描述之疾病或病症之患者投與包含有效量之本發明抗體的醫藥組合物。「有效量」指達成所需治療結果所必需之量(在一定劑量下，及對於一定時間段而言，及對於投與方式而言)。抗體之有效量可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重以及抗體引發個體中期望性反應之能力的因素而變化。有效量亦為本發明之抗體治療有利作用超過其任何毒性或不利作用的量。
本發明之抗體可用於治療患者。更特定言之，期望本發明之抗體治療風濕性、神經性及皮膚病學疾病中之一或多者。風濕性疾病之特徵為發炎，其可影響個人的關節、肌肉及/或器官。一種此類風濕性疾病為全身性紅斑性狼瘡症(SLE)。
如在本文中互換地使用，「治療(treatment)」及/或「治療(treating)」及/或「治療(treat)」旨在指其中可減緩、阻斷、遏制、控制、終止或逆轉本文所描述之病症之進展的所有方法，但未必表示完全消除所有病症症狀。治療包括投與本發明之抗體以用於治療將受益於BTLA活性增加之人類的疾病或病況且包括：(a)抑制疾病之進一步進展；及(b)緩解疾病，即使得疾病或病症消退或緩解其症狀或併發症。
抗體工程改造
藉由用人類BTLA之Fc標記之胞外域(ECD)域來使家兔免疫且用小鼠BTLA-Fc標記之蛋白質(25F7)或替代地用人類及小鼠BTLA-Fc標記之蛋白期望(22B3及23C8)增強來產生本發明之抗體。藉由組胺酸標記之人類、小鼠及食蟹獼猴BTLA完成篩檢以鑑別交叉反應性。人類BTLA之胺基酸序列由SEQ ID NO: 31給出，Balbc小鼠BTLA之胺基酸序列由SEQ ID NO: 32給出，C57BL6之胺基酸序列由SEQ ID NO: 33給出，且食蟹獼猴BTLA之胺基酸序列由SEQ ID NO: 34給出。抗體隨後經人類化及且親和力成熟。
實例 工程改造之 BTLA 同效劑抗體之表現及純化
本發明之BTLA同效劑抗體可基本如下表現及純化。可用分泌抗體之表現系統使用最佳的預定HC:LC載體比率(諸如1:3或1:2)或編碼HC及LC兩者之單個載體系統來瞬時或穩定地轉染合適宿主細胞(諸如HEK 293或CHO)。可使用許多常用技術中之任一種來純化其中已分泌有抗體的經澄清培養基。舉例而言，培養基可方便地施加至用相容性緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4))平衡的用於Fab片段之MabSelect管柱(GE Healthcare)或KappaSelect管柱(GE Healthcare)。可洗滌管柱以移除非特異性結合組分。可例如藉由pH梯度(諸如20 mM Tris緩衝液(pH 7.0)至10 mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0)，或磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)至100 mM甘胺酸緩衝液(pH 3.0))溶離所結合的抗體。抗體溶離份可諸如藉由SDS-PAGE偵測且接著可經合併。視預期用途而定，進一步純化為視情況選用的。可使用常見技術濃縮及或無菌過濾抗體。可藉由常見技術(包括尺寸排阻、疏水性相互作用、離子交換、多模式或羥基磷灰石層析)來有效移除可溶性聚集物及多聚物。在此等層析步驟之後，抗體純度在約95%至約99%之間。產物可保持冷藏，在-70℃下立即冷凍，或可經冷凍乾燥。本發明之例示性抗體的胺基酸SEQ ID NO展示如下。表 1 ：例示性 BTLA 同效劑抗體之胺基酸序列。
結合親和力及動力學
藉由表面電漿共振使用Biacore® 3000 (GE Healthcare)來量測本發明之BTLA同效劑抗體(22B3、23C8及25F7)對BTLA之結合親和力及動力學。藉由經由胺偶合將約120 RU BTLA蛋白質(人類、大鼠、鼠類(Balbc或C57BL6)或食蟹獼猴BTLA)固定於Biacore® CM5晶片上，且使BTLA同效劑抗體流動來量測結合親和力，自500 nM開始，在2倍連續稀釋中降至15.6 nM。實驗在25℃下在HBS-EP緩衝液(GE Healthcare BR100669；10 mM HEPES，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中進行。對於各循環，250 μL之抗體樣品以50 μl/min流動穿過流動細胞1及2，且隨後解離10分鐘。藉由以10 μL/mL流速注射5 μL之pH 1.5之甘胺酸緩衝液來重新產生晶片表面。資料符合1:1朗謬爾結合模型(Langmiur binding model)以衍生kon、koff，並計算KD
。隨後程序基本上如上文所述，觀測到以下參數(展示於表2中)。下文所展示之資料為人類、食蟹獼猴、大鼠及鼠類對於22B3之三個實驗的平均值。表 2 . 結合親和力及動力學。
如上文表2中所展示，本發明之BTLA同效劑抗體結合BTLA。特定言之，抗體22B3能夠結合人類、鼠類及獼猴BTLA。
結合初級細胞
藉由FACS來測定本發明之BTLA抗體(22B3、23C8及25F7)結合來自不同物種之初級細胞的能力。根據製造商的協定，使用Ficoll (GE # 17-1440-02)及SepMate導管(STEMCELL # 15450)將人類周邊血液單核細胞(PBMC)自供體血液樣本(San Diego Blood Bank，# LRS-WBC)分離。食蟹獼猴PBMC (在世界範圍內的靈長類 # CA-10)自液氮解凍且用FACS緩衝液洗滌一次(與上文相同)。
來自雄性C57BL6小鼠(JAX)或雌性史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rats) (Harlan)之脾臟經採集，合併且在用RPMI 1640沖洗之50 mL錐形管上使用細胞過濾器及注射器栓賽將其解離成單細胞懸浮液，用10%熱滅活FBS及2 mM EDTA完成。在用完全RPMI淬滅之前，粒化細胞、移除培養基，且藉由將丸粒再懸浮於2 ml ACK裂解緩衝液(gibco #A10492-01)中約2分鐘來來裂解紅細胞。裂解細胞可經粒化且以在FACS緩衝液(含有3% FBS、20 mM HEPES及2 mM EDTA之DPBS 1×)洗滌一次。
使用Countess細胞計數器定量經分離初級細胞，且以2×106
個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液中。在細胞分離的同一天藉由將50 µl (~0.1 × 106
)個細胞接種至96孔盤(Greiner # 650101)中來執行流式細胞量測術實驗。藉由在4℃下添加1 µl Fc嵌段(例如，來自BD # 553142) 15分鐘且不洗滌來阻止非特異性抗體結合。
藉由在FACS緩衝液中連續稀釋，在不同濃度下測試BTLA抗體結合。舉例而言，以不同濃度開始之純化抗體及對照物首先稀釋至30 µg/mL且起始材料之連續1:3稀釋執行總共10次滴定(加上未處理對照物)。抗體滴定在4℃下與細胞一起培育20分鐘，並在染色之前用FACS緩衝液洗滌。細胞使用螢光染料共軛之抗體染色以鑑別特定細胞類型(例如，CD19 B細胞、CD4 T細胞或CD8 T細胞)或使用二級抗體染色以鑑別是否存在與子集結合之抗體。在流式細胞儀上分析之前，在4℃下執行染色20分鐘且用FACS緩衝液洗滌3次。結果使用標準FACS分析軟體(例如，FACSDiva)分析且報導為針對各滴定之二級抗體之平均螢光強度。藉由高於背景之平均螢光強度染色判定指示結合之陽性結果。
以下程序基本上如上文所描述，抗體22B3與人類、食蟹獼猴、大鼠及小鼠BTLA表現細胞結合，抗體23C8結合人類及食蟹獼猴BTLA表現細胞，且抗體25F7結合人類、食蟹獼猴及小鼠BTLA表現細胞。
BTLA 同效劑抗體誘導之磷酸化
為測定本發明之BTLA同效劑抗體(22B3及25F7)在人類B細胞株中誘導酪胺酸磷酸化的能力，在37℃下以10 μg/mL將BTLA抗體結合至24孔培養盤一個小時。用PBS洗滌盤以移除任何未結合抗體。可以10×106
個細胞/毫升將人類BTLA表現B細胞株(諸如Ramos.2G6.4C10人類B淋巴球細胞株(ATCC))添加至孔且在37℃下培育30 min。細胞經移除且裂解於完全裂解緩衝液(MSD)中，且在-80℃下冷凍至少30 min。
藉由Meso Sector S 600偵測到磷酸化BTLA。藉由在室溫下在阻斷溶液(MSD)中培育一小時來製備抗生蛋白鏈菌素偵測盤。在室溫下將生物素標記之BTLA捕捉抗體(5A5)塗佈至盤上一小時，隨後為三個或更多個Tris洗滌步驟。在室溫下培育細胞裂解物兩個小時。用SULFO-TAG抗BTLA抗體(ANC6E9)偵測到總BTLA，且用SULFO-TAG抗磷酸肌酐抗體(PY20；MSD)，隨後三個或更多個Tris洗滌步驟來量測磷酸化BTLA。在使用Meso Sector S 600分析之前接著立即將2×讀取緩衝液T (MSD)添加物添加至孔。
以下程序基本上如上文所描述，抗體22B3使得背景下酪胺酸磷酸化BTLA相較於陰性對照增加2.41倍，且抗體25F7使得背景下酪胺酸磷酸化BTLA相較於陰性對照增加1.47倍。此等資料顯示BTLA同效劑抗體22B3及25F7能夠在人類B細胞株中誘導BTLA磷酸化。
抑制人類初級 B 細胞 增殖
藉由抑制人類初級B細胞增殖之能力來評估本發明之BTLA同效劑抗體的活體外效能。使用人類B細胞分離套組(EasySep)自健康人類周邊血液單核細胞分離人類初級B細胞係且將其再懸浮於合適人類初級細胞培養基中。伴隨著滴定同型對照物或BTLA抗體將抗IgM塗佈至盤且在37℃下培育一個小時，隨後為PBS洗滌步驟。將經分離人類B細胞添加至各孔且在37℃下與5% CO2
一起培育72小時，隨後為[3
H]-胸苷脈衝最後18小時。移除培育後之盤且將其置放於乾冰上30分鐘且接著在-20℃下儲存直至準備好採集。細胞藉由解凍裂解且藉由Harvester9600(Tomtec)採集。藉由利用MicroBeta2
2450微定量盤式計數器(Perkin Elmer)量測[3
H]-胸苷合併來評定增殖。
計數用於分析此分析中之相對增殖反應，且使用等式[抑制%=AVG最大信號-信號樣本)/AVG最大信號×100]來計算抑制百分比，該等式可用於使用繪圖軟體(GraphPad Prism)來測定IC50值。
以下程序基本上如上文所描述，BTLA同效劑抗體22B3能夠用經計算之0.32 + /-0.1 nM之IC50活體外抑制初級B細胞增殖，抗體23C8能夠用經計算之0.14 nM之IC50活體外抑制初級B細胞增殖，且抗體25F7能夠用經計算之0.17 nM之IC50活體外抑制初級B細胞增殖。在一類似實驗中，抗體22B3能夠用經計算之0.32 nM之IC50抑制初級B細胞增殖，且具有與Mab8D5相同的HCVR及LCVR (分別為'694專利之SEQ ID NO:11及18)之抗體用經計算之6.38 nM之IC50抑制初級B細胞增殖。此等資料顯示BTLA同效劑抗體22B3、23C8及25F7能夠活體外抑制B細胞增殖，且彼抗體22B3相較於Mab8D5具有更大的活體外活性。
GvHD 之人類化 NSG 小鼠模型
活體內測定人類PBMC驅動之移植物抗宿主疾病(graft vs. host disease；GvHD)之預防。
簡言之，雌性NSG小鼠(JAX Labs，Stock # 05557) (約8-10週大)經標準化且基於基線體重量測值劃分為處理組(n=8小鼠/處理組)。根據製造商的協定，使用Ficoll (GE # 17-1440-02)及SepMate導管(STEMCELL # 15450)將人類周邊血液單核細胞(PBMC)自血液供體庫(San Diego Blood Bank，# LRS-WBC)分離。以大約150×106
個細胞/毫升將PBMC再懸浮於PBS。處理組在給藥之前為不知情的。
在第1天，將懸浮於PBS (如上文所描述) (或用於非移植對照物之100 µl PBS)中之100 µl (15×106
個細胞)之PBMC經靜脈內(IV)注至各小鼠之尾部中。藉由皮下(SQ)注射向小鼠每週給藥(QW)含呈不同濃度之本發明之抗體(22B3或23C8)或對照物之PBS媒劑。三個獨立研究係基本上如本文所描述執行三個獨立研究。用於各研究之給藥濃度為[研究1 (抗體22B3)：0.1、1.0、5.0、10.0及20.0 mg/kg；研究2 (抗體22B3或23C8)：0.001、0.01、10.0及100 mpk；以及研究3：0.001、0.005、0.01、0.1、0.5及1.0 mpk]。
終止研究，且在同型對照動物減重20%之前(研究1及2)或第28天(研究3)，對小鼠進行安樂死。記錄體重(研究1及研究2)，收集血清以用於細胞介素分析(研究1；藉由MSD ELISA執行分析；所分析細胞介素為TNFα、IL-10、IL-6、IL-4、IL12p70、IL-13、IL-2及IL-8)，且採集脾臟以用於表型/藥力學分析(藉由CD 8 T細胞群的減少來量測；研究1及研究3)。
以下程序基本上如上文所述，獲得以下資料。
研究1中抗體22B3處理之動物顯示以下(呈0.1、1.0、5.0、10.0或20.0 mg/kg劑量之抗體)：(i)在研究結束時，相較於未移植對照動物之體重，體重類似；(ii)相較於同型對照動物，細胞介素TNFα、IL-10、IL-6、IL-4及IL-12p70減少；以及(iii)相較於同型對照動物，CD 8 T細胞群減少(表型/藥力學分析)。
來自研究2之資料顯示在研究結束時，相較於未移植對照物動物之體重，經0.01 mg/kg抗體22B3，或1.0、5.0或10.0 mg/kg抗體23C8處理之小鼠具有類似體重。研究2未顯示22B3在10.0 mg/kg下對體重之活性，其可反映此模型之天然供體變化性。在研究3中，抗體22B3顯示呈以下劑量之抗體的活體內藥力學活性：0.01、0.1、0.5及1.0 mg/kg。綜合而言，此等資料顯示抗體22B3及抗體23C8有效活體內預防GvHD。
mIFNα 誘導之狼瘡性腎炎
干擾素α (IFNα)誘導之狼瘡性腎炎模型為全身性紅斑性狼瘡症(SLE)之小鼠模型，其中IFNα用於與紐西蘭黑小鼠及紐西蘭白(NZB/W)小鼠雜交中同步發病且加速疾病進展。NZB/W小鼠模型為自發狼瘡性腎炎之經典模型。可使用腺病毒載體藉由外源性投與IFNα來加速此等小鼠體之疾病進展。此狼瘡性腎炎模型用於顯示本發明之BTLA同效劑抗體之活性。
研究開始前一天，基於體重隨機地分選十一週齡之雌性NZB/W小鼠。將小鼠分成以下處理組：(1)LacZ腺相關病毒AAV + 10 mg/kg人類IgG4 PAA同型對照(PAA為S228P、F234A及L235A突變)；(2) IFNα AAV + 10 mg/kg人類IgG4 PAA同型對照；(3) IFNα AAV + 3 mg/kg22B3抗體；(4)IFNα AAV + 10 mg/kg 22B3抗體；或(5) IFNα AAV + 50 mg/kg環磷醯胺。在研究開始之日(第0天)，小鼠經靜脈內一次投與含表現LacZ基因之AAV之1011
個基因組複本(GC) (未患病)或小鼠IFNα (患病)之PBS。在第1-4組中，自第0天開始每週一次經皮下用含同型對照或22B3抗體抗體之PBS處理小鼠。在第5組中，每10天腹膜內用含環磷醯胺之PBS處理小鼠。每2週自小鼠收集尿液樣本直至處理開始後6週研究終止。Kamiya Biomedical™小鼠微量白蛋白ELISA用於定量尿液白蛋白水平。藉由使用酶肌酐分析(Roche Diagnostics)來量測尿液肌酐。將白蛋白尿(腎功能之生物標記)定義為尿液中偵測到的每毫克肌酐大於300 µg白蛋白。
以下程序基本上如上文所描述，第4週，同型處理之患病組(IFNα AAV + hIgG4 PAA)中的白蛋白尿之發病率達到100%且保持升高直至研究結束，而LacZ AAV處理(非患病)之小鼠未展示任何白蛋白尿之發病率。可為急性腎毒性之環磷醯胺致使患病小鼠體內白蛋白尿瞬間增加，但環磷醯胺組中之白蛋白尿之發病率在研究結束時降至零。呈3 mg/kg及10 mg/kg之抗體22B3能夠在第28天時將白蛋白尿之發病率分別降至50%及20%，且在第42天時分別降至60%及70%。此等結果指示抗體22B3能夠保留模型的腎功能。
研究期間之卡普蘭-邁耶曲線圖(Kaplan-Meier plot) (資料未示)之存活%展示，同型處理之患病組之腎機能不全導致在第28天時開始死亡。研究結束之時，同型處理之患病組之存活率為60%。未患病且經環磷醯胺處理之組的存活率為100%。在研究結束之時，經10 mg/kg抗體22B3處理之小鼠亦展示100%存活率，而經3 mg/kg處理之小鼠展示80%存活率。此等結果指示抗體22B3能夠在此模型中預防疾病相關死亡。
牛皮癬之咪喹莫特誘導 ( Imiquimod-induced ) 之 模型
測試本發明之抗體限制由施加TLR7/8同效劑咪喹莫特(IMQ)誘導之牛皮癬狀皮膚炎之嚴重程度的能力。在第0天時，七週齡雌性B6.SJL-Ptprc a Pepc b
/BoyJ小鼠(JAX庫存編號：002014)或HVEM-/-
小鼠(描述於Wang等人, J. Clin. Invest., 115:3, 711-717, 2005年3月中)分別腹膜內注射有3 mg/kg或1 mg/kg之抗體22B3或抗體25F7，且小鼠之背部經刮毛。注射有hIgG4同型對照之動物充當對照物。在第1-3天時，小鼠藉由吸入異氟醚(VetOne)麻醉，且接著將5% IMQ乳霜(50 mg，Fougera)塗覆至經刮毛皮膚之限定區域。在第4天時，切除皮膚之處理區域且分析疾病嚴重程度及發炎相關基因表現。
以下程序基本上如上文所描述，組織學分析顯示，在經hIgG4同型對照或1 mg/kg抗體22B3處理之組中，伴有角化不全及過度角化之表皮層增厚。經3 mg/kg抗體22B3或3 mg/kg抗體25F7處理之小鼠展示表皮厚度的明顯減小，其中一些區域呈現組織學正常。藉由qPCR使用iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)分析在皮膚中之基因表現。經3 mg/kg抗體22B3處理之小鼠展現類型I IFN (IFNa、IFNb)及IFNg，以及IFN反應基因(Isg15、Mx1、Mx2、Oas2)表現的顯著減少。對涉及建立IMQ誘導之皮炎的細胞介素之分析亦顯示3 mg/kg抗體22B3處理組中IL-22及IL-23表現的顯著減少。此等資料顯示BTLA同效劑抗體22B3及25F7能夠減小牛皮癬狀皮膚炎之小鼠模型的表皮厚度。
抗原決定基測定
藉由ELISA測定本發明之BTLA同效劑抗體之功能性抗原決定基，且藉由X射線結晶學測定結構性抗原決定基。
方法 ELISA ： 功能性抗原決定基
將以下一組BTLA之表面突變組單獨地引入至稠合到(人類)Fc之人類BTLA蛋白中：D35R、Q37R、Y39E、R42D、Q43A、E45R、S47H、L49R、D52R、E55R、E57R、D84R、N65R、H68A、V80R、K81E、E83R、S88H、K90H、E91H、I95R、E103H、L106R、N108R、R114V、S121Y、N122R、E125H、H127E、T130R、Y132R及T134H。
使用ELISA測定22B3及23C8之結合，其中待繪製抗原決定基之抗體由固定化抗家兔抗體捕獲，且在洗滌之後，將各BTLA突變體與所捕獲抗體培育為4點4倍稀釋系列且用酶聯抗人類Fc試劑偵測。將所得信號在抗體與對照抗體之間進行比較。功能性抗原決定基通常藉由針對一個或兩個突變體之信號的顯著減少來指示自身。對於25F7抗體，執行夾層ELISA，其中固定人類化22B3，BTLA突變體經捕獲且由家兔25F7結合。此得到更強的信號且可在消除22B3抗原決定基之後鑑別25F7抗原決定基。
X 射線結晶學： 結構性抗原決定基
為測定各種抗體之相互作用介面且因此BTLA上之物理抗原決定基，人類BTLA與本發明抗體之Fab部分共結晶且測定晶體結構。根據所得晶體結構，將任何抗體原子之4.5Å內的BTLA殘基視為抗原決定基之部分(使用Pymol目測軟體)。自原子中心至原子中心量測為4.5埃。具有至少一個原子(亦即接近抗體中之任何原子4.5埃)之任何殘基為抗原決定基之部分。
在具有人類BTLA之複合物中測定兩個22B3結構。首先利用親本家兔22B3抗體Fab，組胺酸經標記且用表現為Fc融合體之人類BTLA之S47H突變體(穩定突變體)純化，且接著分解及純化。此兩種蛋白以大約等莫耳比混合且在可商購的篩網中篩檢以用於結晶。獲得晶體且在高階光子源極(Advanced Photon Source)處收集繞射資料。此資料藉由分子置換減少並解決且經改進以得到在22B3與BTLA之間的複合物的高解析度結構。第二複合物在人類化22B3 (Fab部分)之親和力成熟版本(具有HC突變I56Q/T57H/G98A及LC S95H)與人類BTLA之間。此等經共表現，純化為複合物並進行類似地篩檢。所得結構及抗原決定基類似於第一結構。
以與第一22B3複合物相同之方式，亦即藉由純化His標記之家兔親本Fab，與單體S47H人類BTLA混合及結晶來獲得含23C8結構之複合物。
根據第二22B3複合物，亦即藉由共表現、共純化及結晶來獲得具有人類BTLA之含25F7結構之複合物。利用具有與人類BTLA之經改良結合的人類化25F7之雙突變體(用於抗原決定基測定之人類化25F7在HC S30W/LC E27R處具有突變體)。
結果 22B3 抗體：
在一組BTLA表面突變體中，R42D及H127E對與家兔22B3抗體(包含與22B3相同但具有家兔架構之CDR)結合具有顯著負面影響。功能性抗原決定基包含人類BTLA (SEQ ID NO:31)之位置42處之Arg及位置127處之His。人類BTLA與家兔22B3 Fab之間的晶體結構複合物中之22B3之4.5埃內且為結構性抗原決定基的BTLA殘基為以下SEQ ID NO: 31之殘基：位置35處之Asp、位置37處之Gln、位置42處之Arg、位置74處之Leu、位置76處之Gly、位置79處之Cys、位置114處之Arg、位置119處之Phe、位置120處之Gln以及位置122處之Asn、位置128處之Ser。人類BTLA與人類22B3變體(HC I56Q/T57H/G98A LC S95H) Fab之間的晶體結構複合物中之22B3之4.5埃內的BTLA殘基為SEQ ID NO: 31之位置35處之Asp、位置37處之Gln、位置42處之Arg、位置74處之Leu、位置76處之Gly、位置79處之Cys、位置114處之Arg、位置119處之Phe、位置120處之Gln、位置122處之Asn以及位置124處之Ile、位置128處之Ser。
在類似研究中，用於結合BTLA之HVEM的結構性抗原決定基為以下BTLA之胺基酸：位置37處之Gln、位置42處之Arg、位置74處之Leu、位置76處之Gly、位置77處之Thr、位置112處之Ser、位置114處之Arg、位置118處之Asn、位置121處之Ser、位置128處之Ser以及位置130處之Thr。藉由將抗體:BTLA晶體結構疊加至對準BTLA分子之HVEM:BTLA晶體結構上來評定抗體22B3與HVEM之間的結構類似性。含有胺基酸殘基69-72之HVEM區及對應抗體區之主鏈均方根偏差經測定為1.4埃。
23C8 抗體
：D52R在ELISA中阻斷家兔23C8 (包含與23C8相同之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1及LCDR2，具有QCTYGGVVGSTSDDNP之LCDR3且具有家兔架構)與人類BTLA之結合。功能性抗原決定基包含人類BTLA (SEQ ID NO:31)之位置52處之Asp。人類BTLA (S47H)與家兔23C8 Fab之間的晶體結構複合物中之23C8之4.5埃內且為結構性抗原決定基的BTLA殘基為SEQ ID NO: 31之位置46處之His、位置55處之Glu、位置103處之Glu、位置104處之Pro、位置106處之Leu、位置107處之Pro、位置134處之Thr以及位置139處之Ala。抗體23C8不模擬HVEM結合。
25F7 抗體
：在一組BTLA表面突變體中，H68A及K61E對與家兔25F7抗體(包含與25F7相同但具有家兔架構之CDR)結合具有顯著負面影響。功能性抗原決定基包含人類BTLA (SEQ ID NO:31)之位置68處之His及位置81處之Lys。人類BTLA與人類化25F7 Fab變體(HC S30W，LC E27R)之間的晶體結構複合物中之25F7之4.5埃內且為結構性抗原決定基的BTLA殘基為SEQ ID NO: 31之位置62處之Tyr、位置64處之Ala、位置68處之His、位置85處之Arg、位置91處之Glu、位置98處之Phe以及位置118處之Asn。抗體25F7不模擬HVEM結合。
序列
抗體
22B3
之
HC
(
SEQ
ID
NO
:
1
)
抗體
22B3
之
LC
(SEQ ID NO: 2)
抗體
22B3
之
HCVR
(SEQ ID NO: 3)
抗體
22B3
之
LCVR
(SEQ ID NO: 4)
抗體
23C8
之
HC
(SEQ ID NO: 5)
抗體
23C8
之
LC
(SEQ ID NO: 6)
抗體
23C8
之
HCVR
(SEQ ID NO: 7)
抗體
23C8
之
LCVR
(SEQ ID NO: 8)
抗體
25F7
之
HC
(SEQ ID NO: 9)
抗體
25F7
之
LC
(SEQ ID NO: 10)
抗體
25F7
之
HCVR
(SEQ ID NO: 11)
抗體
25F7
之
LCVR
(SEQ ID NO: 12)
抗體
22B3
之
HCDR1 (SEQ ID NO: 13)
抗體
23C8
之
HCDR1 (SEQ ID NO: 14)
抗體
25F7
之
HCDR1 (SEQ ID NO: 15)
抗體
22B3
之
HCDR2 (SEQ ID NO: 16)
抗體
23C8
之
HCDR2 (SEQ ID NO: 17)
抗體
25F7
之
HCDR2 (SEQ ID NO: 18)
抗體
22B3
之
HCDR3 (SEQ ID NO: 19)
抗體
23C8
之
HCDR3 (SEQ ID NO: 20)
抗體
25F7
之
HCDR3 (SEQ ID NO: 21)
抗體
22B3
之
LCDR1 (SEQ ID NO: 22)
抗體
23C8
之
LCDR1 (SEQ ID NO: 23)
抗體
25F7
之
LCDR1 (SEQ ID NO: 24)
抗體
22B3
之
LCDR2 (SEQ ID NO: 25)
抗體
23C8
之
LCDR2 (SEQ ID NO: 26)
抗體
25F7
之
LCDR2 (SEQ ID NO: 27)
抗體
22B3
之
LCDR3 (SEQ ID NO: 28)
抗體
23C8
之
LCDR3 (SEQ ID NO: 29)
抗體
25F7
之
LCDR3 (SEQ ID NO: 30)
人類
BTLA
(SEQ ID NO: 31)
小鼠
Balbc BTLA
(SEQ ID NO: 32)
小鼠
C57BL6 BTLA (SEQ ID NO: 33)
食蟹獼猴
BTLA
(SEQ ID NO: 34)
用於表現
SEQ
ID
NO
:
1
之
抗體
22B3
重鏈的例示性
DNA
(
SEQ
ID
NO
:
35
)
用於表現
SEQ
ID
NO
:
2
之
抗體
22B3
輕鏈的例示性
DNA
(
SEQ
ID
NO
:
36
)
用於表現
SEQ
ID
NO
:
5
之
抗體
23C8
重鏈的例示性
DNA
(
SEQ
ID
NO
:
37
)
用於表現
SEQ
ID
NO
:
6
之
抗體
23C8
輕鏈的例示性
DNA
(
SEQ
ID
NO
:
38
)
用於表現
SEQ
ID
NO
:
9
之
抗體
25F7
重鏈的例示性
DNA
(
SEQ
ID
NO
:
39
)
用於表現
SEQ
ID
NO
:
10
之
抗體
25F7
輕鏈的例示性
DNA
(
SEQ
ID
NO
:
40
)
人類
HVEM (SEQ ID NO: 41)
Claims (25)
- 一種結合BTLA之抗體，其包含具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的LCDR2以及具有SEQ ID NO:28之胺基酸序列的LCDR3。
- 如請求項1之抗體，其包含具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)及具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)。
- 如請求項1或2之抗體，其包含具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈(HC)及具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈(LC)。
- 如請求項1之抗體，其包含兩個HC及兩個LC，其中各HC具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，且各輕鏈(LC)具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體，其用於療法中。
- 如請求項1之抗體，其用於治療一或多種風濕性、神經性及皮膚病學疾病。
- 如請求項6之抗體，其中該風濕性疾病為狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症及類風濕性關節炎中之至少一者。
- 如請求項6之抗體，其中該皮膚病學疾病為異位性皮膚炎及牛皮癬中之至少一者。
- 如請求項6之抗體，其中該神經性疾病為多發性硬化症。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至4中任一項之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
- 一種如請求項1至4中任一項之抗體的用途，其用於製造用於治療風濕性、神經性及皮膚病學疾病中之一或多者的藥劑。
- 如請求項11之抗體之用途，其中該風濕性疾病為狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症及類風濕性關節炎中之至少一者。
- 如請求項11之抗體之用途，其中該皮膚病學疾病為異位性皮膚炎及牛皮癬中之至少一者。
- 如請求項11之抗體之用途，其中該神經性疾病為多發性硬化症。
- 一種醫藥組合物，其用於治療選自狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症及類風濕性關節炎中之病況，該醫藥組合物包含有效量之如請求項1至4中任一項之抗體。
- 一種醫藥組合物，其用於治療選自異位性皮膚炎及牛皮癬中之病況，該醫藥組合物包含有效量之如請求項1至4中任一項之抗體。
- 一種醫藥組合物，其用於治療多發性硬化症，該醫藥組合物包含有效量之如請求項1至4中任一項之抗體。
- 一種DNA分子，其包含編碼由SEQ ID NO: 1之胺基酸序列給出之抗體重鏈的聚核苷酸。
- 一種DNA分子，其包含編碼SEQ ID NO: 2之胺基酸序列給出之抗體輕鏈的聚核苷酸。
- 一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之抗體重鏈的聚核苷酸序列及編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之抗體輕鏈的聚核苷酸序列。
- 如請求項20之DNA分子，其中編碼該抗體重鏈之該聚核苷酸序列為SEQ ID NO:35，且編碼該抗體輕鏈之該聚核苷酸序列為SEQ ID NO:36。
- 一種哺乳動物細胞，其包含如請求項18之DNA分子及如請求項19之DNA分子，其中該細胞能夠表現包含兩個重鏈及兩個輕鏈之抗體，其中各重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 1給出且各輕鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 2給出。
- 一種哺乳動物細胞，其包含如請求項20或21之DNA分子，其中該細胞能夠表現包含兩個重鏈及兩個輕鏈之抗體，其中各重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 1給出且各輕鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 2給出。
- 一種用於產生抗體之方法，其中該兩個HC中之每一者之胺基酸序列為SEQ ID NO: 1，且該兩個LC中之每一者之胺基酸序列為SEQ ID NO: 2，且其中該方法包含：a)在使得該抗體表現之條件下培育如請求項22或23之哺乳動物細胞，及b)回收該經表現抗體。
- 一種抗體，其可藉由如請求項24之方法獲得。
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