JP2020518288A - Btlaアゴニスト抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の抗体は、ウサギをヒトBTLAのFcタグ付き細胞外ドメイン(ECD)ドメインで免疫化し、マウスBTLA−Fcタグ付きタンパク質(25F7)または代替的にはヒトおよびマウスBTLA−Fcタグ付きタンパク質(22B3および23C8)で追加免疫することによって生成した。交差反応性を特定するために、ヒスチジンタグ付きヒト、マウス、およびカニクイザルBTLAを使用してスクリーニングを行った。ヒトBTLAのアミノ酸配列は配列番号31によって定められ、BalbcマウスBTLAのアミノ酸配列は配列番号32によって定められ、C57BL6のアミノ酸配列は配列番号33によって定められ、カニクイザルBTLAのアミノ酸配列は配列番号34によって定められる。次いで、抗体をヒト化し、親和性成熟させた。
本発明のBTLAアゴニスト抗体は、本質的に以下の通りに調製および精製することができる。HEK293またはCHOなどの適切な宿主細胞は、最適な所定のHC:LCベクター比(1:3または1:2など)を用いて抗体を分泌するための発現系、またはHCおよびLCの両方をコードする単一のベクター系で、一過性でまたは安定的にトランスフェクトすることができる。抗体が分泌された清澄化培地は、多くの一般的に使用される技術のうちのいずれかを用いて精製され得る。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)などの適合した緩衝液で平衡化された、Fabフラグメント用のMabSelectカラム(GE Healthcare)またはKappaSelectカラム(GE Healthcare)に好都合に適用され得る。カラムは、非特異的結合構成成分を除去するために洗浄され得る。結合抗体は、例えば、pH勾配(20mMのTris緩衝液pH7.0〜10mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH3.0、またはリン酸緩衝生理食塩水pH7.4〜100mMグリシン緩衝液pH3.0など)によって溶出され得る。抗体画分は、SDS−PAGEなどによって検出され得、次いで、プールされてもよい。意図する使用に応じて、さらなる精製は任意選択的である。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮およびまたは滅菌濾過され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモーダル、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、約95%〜約99%である。生成物は、冷蔵保存するか、すぐに−70℃で凍結するか、または凍結乾燥してもよい。本発明の例示的な抗体のアミノ酸配列番号を以下に示す。
BTLAに対する本発明のBTLAアゴニスト抗体(22B3、23C8、および25F7)の結合親和性および動態を、Biacore(登録商標)3000(GE Healthcare)を使用した表面プラズモン共鳴により測定する。結合親和性は、約120 RU BTLAタンパク質(ヒト、ラット、ネズミ(BalbcまたはC57BL6)、またはカニクイザルBTLA)をBiacore(登録商標)CM5チップ上のアミンカップリングにより固定化し、2倍連続希釈で500nMから開始し15.6nMまで下げ、BTLAアゴニスト抗体を流れさせることによって測定する。実験は、HBS−EP緩衝液(GE Healthcare BR100669、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%界面活性剤P20、pH7.4)中、25℃で行う。各サイクルで、250μLの抗体試料をフローセル1および2に50μl/分で流し、10分間解離させる。チップ表面は、10μL/mLの流量でグリシン緩衝液(pH1.5)の5μL注入で再生される。データを1:1のLangmiurバインディングモデルに適合させてkon、koffを導き出し、KDを計算する。本質的に上に記載される手順に従って、以下のパラメータ(表2に示される)が観察された。以下に示されるデータは、22B3のヒト、カニクイザル、ラット、およびマウスの3つの実験の平均である。
本発明のBTLA抗体(22B3、23C8、および25F7)が異なる種からの初代細胞と結合する能力は、FACSにより決定される。製造者のプロトコルに従って、Ficoll(GE#17−1440−02)およびSepMateチューブ(STEMCELL#15450)を使用して、ドナーの血液試料(San Diego Blood Bank、#LRS−WBC)からヒト末梢血単核細胞(PBMC)を単離する。カニクイザルPBMC(WorldWide Primates#CA−10)を液体窒素から解凍し、FACS緩衝液で1回洗浄する(上記と同じ)。
本発明のBTLAアゴニスト抗体(22B3および25F7)のヒトB細胞株におけるチロシンリン酸化を誘発する能力を判定するために、BTLA抗体を37℃で1時間、24ウェル培養プレートに10μg/mLで結合する。プレートをPBSで洗浄して、任意の結合されていない抗体を除去する。Ramos.2G6.4C10ヒトBリンパ球細胞株(ATCC)などのヒトBTLA発現B細胞株を、10x10^6細胞/mLでウェルに添加し、37℃で30分間インキュベートしてもよい。細胞を除去し、完全溶解緩衝液(MSD)に溶解し、−80℃で少なくとも30分間凍結する。
本発明のBTLAアゴニスト抗体のインビトロ効力を、ヒト一次B細胞増殖を阻害する能力により評価する。ヒト初代B細胞を、ヒトB細胞単離キット(EasySep)を使用して健康なヒト末梢血単核細胞から単離し、適切なヒト初代細胞培地に再懸濁する。抗IgMを、アイソタイプ対照またはBTLA抗体の滴定と共にプレートにコーティングし、37℃で1時間インキュベートし、その後、PBS洗浄ステップを行う。単離されたヒトB細胞を各ウェルに添加し、5%CO2で、37℃で72時間インキュベートし、その後、最後の18時間[3H]−チミジンパルスを行う。インキュベーション後のプレートを除去し、ドライアイス上に30分間置き、次いで、採取の準備ができるまで−20℃で保存する。細胞を解凍することによって溶解し、Harvester9600(Tomtec)で採取する。MicroBeta2 2450 Microplate Counter(Perkin Elmer)で[3H]−チミジンの取り込みを測定することにより、増殖を評価する。
ヒトPBMC駆動移植片対宿主病(GvHD)の予防は、インビボで決定される。
インターフェロンアルファ(IFNα)誘発性ループス腎炎モデルは、IFNαが、ニュージーランドブラックおよびニュージーランドホワイト(NZB/W)マウスとの交配種における疾患の発症を同期し、進行を加速させるのに使用される、全身性エリテマトーデス(SLE)のマウスモデルである。NZB/Wマウスモデルは、自発性ループス腎炎の古典的なモデルである。これらのマウスにおける疾患の進行は、アデノウイルスベクターを使用したIFNαの外因性投与により加速し得る。このループス腎炎モデルを使用して、本発明のBTLAアゴニスト抗体の活性を示す。
TLR7/8アゴニストイミキモド(IMQ)の適用により誘発される乾癬様皮膚炎の重症度を制限する本発明の抗体の能力を試験する。7週齢の雌のB6.SJL−PtprcaPepcb/BoyJマウス(JAX品番:002014)、またはHVEM−/−マウス(Wang et al,J.Clin.Invest.,115:3,711−717,March 2005に記載される)に、0日目にそれぞれ3mg/kgもしくは1mg/kgの抗体22B3または抗体25F7を腹腔内注射し、マウスの背中を剃毛する。hIgG4アイソタイプ対照を注射した動物は、対照として役立った。1〜3日目に、マウスを吸入イソフルラン(VetOne)で麻酔し、次いで、5%IMQクリーム(50mg、Fougera)を剃毛した皮膚の特定の領域に塗布した。4日目に、皮膚の処置された部位を切除し、疾患の重症度および炎症関連遺伝子発現について分析する。
本発明のBTLAアゴニスト抗体の機能的エピトープはELISAにより決定し、構造的エピトープはX線結晶学により決定する。
ELISA:機能的エピトープ
以下の一連のBTLAの表面変異を、(ヒト)Fcに融合したヒトBTLAタンパク質に個別に導入した:D35R、Q37R、Y39E、R42D、Q43A、E45R、S47H、L49R、D52R、E55R、E57R、D84R、N65R、H68A、V80R、K81E、E83R、S88H、K90H、E91H、I95R、E103H、L106R、N108R、R114V、S121Y、N122R、E125H、H127E、T130R、Y132R、およびT134H。
相互作用する界面、したがって様々な抗体のBTLA上の物理的エピトープを決定するために、ヒトBTLAを本発明の抗体のFab部分と共結晶化し、結晶構造を決定した。結果として得られた結晶構造から、任意の抗体原子の4.5A以内のBTLA残基をエピトープの一部としてカウントした(Pymol視覚化ソフトウェアを使用)。4.5オングストロームは、原子中心から原子中心まで測定される。抗体の任意の原子に4.5オングストローム近い少なくとも1つの原子を含む残基は、エピトープの一部である。
22B3抗体:一連のBTLA表面変異体の中で、R42DおよびH127Eは、ウサギ22B3抗体(22B3と同じCDRを含むが、ウサギフレームワークを含む)への結合に有意な負の影響を有した。機能的エピトープは、ヒトBTLA(配列番号31)の42位のArgおよび127位のHisを含む。ヒトBTLAとウサギ22B3 Fabとの間の結晶構造錯体の22B3の4.5オングストローム以内にあり、かつ構造的エピトープであるBTLA残基は、配列番号31の以下の残基:35位のAsp、37位のGln、42位のArg、位置74のLeu、76位のGly、79位のCys、114位のArg、119位のPhe、120位のGln、122位のAsn、128位のSerである。ヒトBTLAとヒト22B3バリアント(HC I56Q/T57H/G98A LC S95H)Fabとの間の結晶構造錯体の22B3の4.5オングストローム以内にあるBTLA残基は、配列番号31の35位のAsp、37位のGln、42位のArg、74位のLeu、76位のGly、79位のCys、114位のArg、119位のPhe、120位のGln、122位のAsn、124位のIle、128位のSerである。
抗体22B3のHC(配列番号1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGAISYDGITYYASWAKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDDYVYVYALDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
抗体22B3のLC(配列番号2)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYAASTLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGYSSSNLDNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗体22B3のHCVR(配列番号3)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGAISYDGITYYASWAKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDDYVYVYALDIWGQGTLVTVSS
抗体22B3のLCVR(配列番号4)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYAASTLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGYSSSNLDNVFGGGTKVEIK
抗体23C8のHC(配列番号5)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDISKYNIQWVRQAPGKGLEWVGFINYGGSAYYASRAKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARGLSNSDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
抗体23C8のLC(配列番号6)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQSTYGGVVGSTSDDNPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗体23C8のHCVR(配列番号7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDISKYNIQWVRQAPGKGLEWVGFINYGGSAYYASRAKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARGLSNSDLWGQGTLVTVSS
抗体23C8のLCVR(配列番号8)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQSTYGGVVGSTSDDNPFGGGTKVEIK
抗体25F7のHC(配列番号9)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSTYAMNWVRQAPGQGLEWMGIISDDGTTYYATWAKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAGAGGVQDYLTLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
抗体25F7のLC(配列番号10)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASENIYNFLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGSSNSNIDNPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗体25F7のHCVR(配列番号11)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLSTYAMNWVRQAPGQGLEWMGIISDDGTTYYATWAKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAGAGGVQDYLTLWGQGTLVTVSS
抗体25F7のLCVR(配列番号12)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASENIYNFLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGSSNSNIDNPFGGGTKVEIK
抗体22B3のHCDR1(配列番号13)
GFSLSSYGVS
抗体23C8のHCDR1(配列番号14)
GFDISKYNIQ
抗体25F7のHCDR1(配列番号15)
GFSLSTYAMN
抗体22B3のHCDR2(配列番号16)
AISYDGITYYASWAKS
抗体23C8のHCDR2(配列番号17)
FINYGGSAYYASRAKG
抗体25F7のHCDR2(配列番号18)
IISDDGTTYYATWAKG
抗体22B3のHCDR3(配列番号19)
GDYYDDYVYVYALDI
抗体23C8のHCDR3(配列番号20)
GLSNSDL
抗体25F7のHCDR3(配列番号21)
DAGAGGVQDYLTL
抗体22B3のLCDR1(配列番号22)
QASQSISTALA
抗体23C8のLCDR1(配列番号23)
QASQSISSWLS
抗体25F7のLCDR1(配列番号24)
QASENIYNFLA
抗体22B3のLCDR2(配列番号25)
AASTLAS
抗体23C8のLCDR2(配列番号26)
RASTLAS
抗体25F7のLCDR2(配列番号27)
SASTLAS
抗体22B3のLCDR3(配列番号28)
QQGYSSSNLDNV
抗体23C8のLCDR3(配列番号29)
QSTYGGVVGSTSDDNP
抗体25F7のLCDR3(配列番号30)
QQGSSNSNIDNP
ヒトBTLA(配列番号31)
MKTLPAMLGTGKLFWVFFLIPYLDIWNIHGKESCDVQLYIKRQSEHSILAGDPFELECPVKYCANRPHVTWCKLNGTTCVKLEDRQTSWKEEKNISFFILHFEPVLPNDNGSYRCSANFQSNLIESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMASRPWLLYRLLPLGGLPLLITTCFCLFCCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS
マウスBalbc BTLA(配列番号32)
MKTVPAMLGTPRLFREFFILHLGLWSILCEKATKRNDEECEVQLNIKRNSKHSAWTGELFKIECPVKYCVHRPNVTWCKHNGTIWVPLEVGPQLYTSWEENRSVPVFVLHFKPIHLSDNGSYSCSTNFNSQVINSHSVTIHVRERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTMEERPGRTWLLYTLLPLGALLLLLACVCLLCFLKRIQGKEKKPSDLAGRDTNLVDIPASSRTNHQALPSGTGIYDNDPWSSMQDESELTISLQSERNNQGIVYASLNHCVIGRNPRQENNMQEAPTEYASICVRS
マウスC57BL6 BTLA(配列番号33)
MKTVPAMLGTPRLFREFFILHLGLWSILCEKATKRNDEECPVQLTITRNSKQSARTGELFKIQCPVKYCVHRPNVTWCKHNGTICVPLEVSPQLYTSWEENQSVPVFVLHFKPIHLSDNGSYSCSTNFNSQVINSHSVTIHVTERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTMEERPGRTWLLYTLLPLGALLLLLACVCLLCFLKRIQGK
EKKPSDLAGRDTNLVDIPASSRTNHQALPSGTGIYDNDPWSSMQDESELTISLQSERNNQGIVYASLNHCVIGRNPRQENNMQEAPTEYASICVRS
カニクイザルBTLA(配列番号34)
MKTLPAMLGSGRLFWVVFLIPYLDIWNIHGKESCDVQLYIKRQSYHSIFAGDPFKLECPVKYCAHRPQVTWCKLNGTTCVKLEGRHTSWKQEKNLSFFILHFEPVLPSDNGSYRCSANFLSAIIESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMASRPWLLYSLLPLGGLPLLITTCFCLFCFLRRHQGKQNELSDTTGREITLVDVPFKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNEPDFCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIIYASLNHSIIGLNSRQARNVKEAPTEYASICVRS
配列番号1の抗体22B3重鎖を発現するための例示的なDNA(配列番号35)
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggattctccctcagtagctatggagtgagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagccattagttatgatggtattacatactacgcgagctgggcgaaaagcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggggactactacgatgattatgtttatgtttatgctttagacatctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaagggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
配列番号2の抗体22B3軽鎖を発現するための例示的なDNA(配列番号36)
Gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgccaggccagtcagagcattagtactgcattagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgctgcatccactctggcatctggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcaacagggttatagtagtagtaatcttgataatgttttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc
配列番号5の抗体23C8重鎖を発現するための例示的なDNA(配列番号37)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcgacatcagtaagtacaacatccaatgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggcttcattaattatggtggtagcgcatactacgcgagccgggcgaaaggcagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggactaagtaatagcgacctctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaagggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
配列番号6の抗体23C8軽鎖を発現するための例示的なDNA(配列番号38)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggccagtcagagcattagtagttggttatcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctacagggcatccactctggcatctggggtcccatcaaggttcagtggaagtggatctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaatccacttatggtggtgttgttggcagtactagtgatgataatcctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc
配列番号9の抗体25F7重鎖を発現するための例示的なDNA(配列番号39)
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggattctccctcagtacctatgcaatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaatcattagtgatgatggtaccacatactacgcgacctgggcgaaaggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagatgctggtgctggtggtgtccaagactacttaaccttgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaagggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
配列番号10の抗体25F7軽鎖を発現するための例示的なDNA(配列番号40)
Gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgccaggccagtgagaatatttacaactttttggcctggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttactctgcatccactctggcatctggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacagggttctagtaatagtaatattgataatcctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc
ヒトHVEM(配列番号41)
MEPPGDWGPPPWRSTPKTDVLRLVLYLTFLGAPCYAPALPSCKEDEYPVGSECCPKCSPGYRVKEACGELTGTVCEPCPPGTYIAHLNGLSKCLQCQMCDPAMGLRASRNCSRTENAVCGCSPGHFCIVQDGDHCAACRAYATSSPGQRVQKGGTESQDTLCQNCPPGTFSPNGTLEECQHQTKCSWLVTKAGAGTSSSHWVWWFLSGSLVIVIVCSTVGLIICVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH
22B3抗体:一連のBTLA表面変異体の中で、R42DおよびH127Eは、ウサギ22B3抗体(22B3と同じCDRを含むが、ウサギフレームワークを含む)への結合に有意な負の影響を有した。機能的エピトープは、ヒトBTLA(配列番号31)の42位のArgおよび127位のHisを含む。ヒトBTLAとウサギ22B3 Fabとの間の結晶構造錯体の22B3の4.5オングストローム以内にあり、かつ構造的エピトープであるBTLA残基は、配列番号31の以下の残基:35位のAsp、37位のGln〜42位のArg、位置74のLeu、76位のGly〜79位のCys、114位のArg、119位のPhe、120位のGln、122位のAsn〜128位のSerである。ヒトBTLAとヒト22B3バリアント(HC I56Q/T57H/G98A LC S95H)Fabとの間の結晶構造錯体の22B3の4.5オングストローム以内にあるBTLA残基は、配列番号31の35位のAsp、37位のGln〜42位のArg、74位のLeu、76位のGly〜79位のCys、114位のArg、119位のPhe、120位のGln、122位のAsn、124位のIle〜128位のSerである。
Claims (87)
- BTLAに結合する抗体であって、配列番号13のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号16のアミノ酸配列を有するHCDR2、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR3、配列番号22のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号25のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号28のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む、抗体。
- 配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)、および配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖(HC)、および配列番号2のアミノ酸配列を有する軽鎖(LC)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
- 2つのHCおよび2つのLCを含み、各HCが配列番号1のアミノ酸配列を有し、各軽鎖(LC)が配列番号2のアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体と、1つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- リウマチ、神経、および/または皮膚疾患を有する患者を治療する方法であって、有効量の請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
- 前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチのうちの少なくとも1つである、請求項6に記載の方法。
- 前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも1つである、請求項6に記載の方法。
- 前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項6に記載の方法。
- 治療で使用するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体。
- リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの1つまたはそれ以上の治療に使用するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチのうちの少なくとも1つである、請求項11に記載の抗体。
- 前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも1つである、請求項11に記載の抗体。
- 前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項11に記載の抗体。
- リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの1つまたはそれ以上を治療するための薬剤の製造における、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- 前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチのうちの少なくとも1つである、請求項15に記載の抗体の使用。
- 前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも1つである、請求項15に記載の抗体の使用。
- 前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項15に記載の抗体の使用。
- ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチから選択される状態の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- アトピー性皮膚炎および乾癬から選択される状態の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 多発性硬化症の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 配列番号1のアミノ酸配列によって定められる抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含むDNA分子。
- 配列番号2のアミノ酸配列によって定められる抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むDNA分子。
- 配列番号1のアミノ酸配列を有する抗体重鎖をコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号2のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列とを含む、DNA分子。
- 前記抗体重鎖をコードする前記ポリヌクレオチド配列が配列番号35であり、前記抗体軽鎖をコードする前記ポリヌクレオチド配列が配列番号36である、請求項24に記載のDNA分子。
- 請求項22に記載のDNA分子および請求項23に記載のDNA分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む抗体を発現することができ、各重鎖のアミノ酸配列が配列番号1によって定められ、各軽鎖のアミノ酸配列が配列番号2によって定められる、哺乳動物細胞。
- 請求項24または25に記載のDNA分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む抗体を発現することができ、各重鎖のアミノ酸配列が配列番号1によって定められ、各軽鎖のアミノ酸配列が配列番号2によって定められる、哺乳動物細胞。
- 抗体を産生するための方法であって、前記2つのHCのそれぞれのアミノ配列が配列番号1であり、前記2つのLCのそれぞれのアミノ酸配列が配列番号2であり、前記方法が、a)前記抗体が発現されるような条件下で請求項26または27に記載の哺乳動物細胞を培養することと、b)発現した前記抗体を回収することとを含む、方法。
- 請求項28に記載の方法によって得られる抗体。
- BTLAに結合する抗体であって、配列番号14のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号17のアミノ酸配列を有するHCDR2、配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3、配列番号23のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号26のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号29のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む、抗体。
- 配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)、および配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む、請求項30に記載の抗体。
- 配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖(HC)、および配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖(LC)を含む、請求項30または31に記載の抗体。
- 2つのHCおよび2つのLCを含み、各HCが配列番号5のアミノ酸配列を有し、各軽鎖(LC)が配列番号6のアミノ酸配列を有する、請求項30〜32のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項30〜33のいずれか一項に記載の抗体と、1つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- リウマチ、神経、および/または皮膚疾患を有する患者を治療する方法であって、有効量の、請求項30〜33のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
- 前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチのうちの少なくとも1つである、請求項35に記載の方法。
- 前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも1つである、請求項35に記載の方法。
- 前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項35に記載の方法。
- 治療で使用するための、請求項30〜33のいずれか一項に記載の抗体。
- リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの1つまたはそれ以上の治療に使用するための、請求項30〜33のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチのうちの少なくとも1つである、請求項40に記載の抗体。
- 前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも1つである、請求項40に記載の抗体。
- 前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項40に記載の抗体。
- リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの1つまたはそれ以上を治療するための薬剤の製造における、請求項30〜33のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- 前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチのうちの少なくとも1つである、請求項44に記載の抗体の使用。
- 前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも1つである、請求項44に記載の抗体の使用。
- 前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項44に記載の抗体の使用。
- ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチから選択される状態の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項30〜33のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- アトピー性皮膚炎および乾癬から選択される状態の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項30〜33のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 多発性硬化症の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項30〜33のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 配列番号5のアミノ酸配列によって定められる抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含むDNA分子。
- 配列番号6のアミノ酸配列によって定められる抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むDNA分子。
- 配列番号5のアミノ酸配列を有する抗体重鎖をコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号6のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列とを含む、DNA分子。
- 前記抗体重鎖をコードする前記ポリヌクレオチド配列が配列番号37であり、前記抗体軽鎖をコードする前記ポリヌクレオチド配列が配列番号38である、請求項53に記載のDNA分子。
- 請求項51に記載のDNA分子および請求項52に記載のDNA分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む抗体を発現することができ、各重鎖のアミノ酸配列が配列番号5によって定められ、各軽鎖のアミノ酸配列が配列番号6によって定められる、哺乳動物細胞。
- 請求項53または54に記載のDNA分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む抗体を発現することができ、各重鎖のアミノ酸配列が配列番号5によって定められ、各軽鎖のアミノ酸配列が配列番号6によって定められる、哺乳動物細胞。
- 抗体を産生するための方法であって、前記2つのHCのそれぞれのアミノ配列が配列番号5であり、前記2つのLCのそれぞれのアミノ酸配列が配列番号6であり、前記方法が、a)前記抗体が発現されるような条件下で請求項55または56に記載の哺乳動物細胞を培養することと、b)発現した前記抗体を回収することとを含む、方法。
- 請求項57に記載の方法によって得られる抗体。
- BTLAに結合する抗体であって、配列番号15のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR2、配列番号21のアミノ酸配列を有するHCDR3、配列番号24のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号27のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号30のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む、抗体。
- 配列番号11のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)、および配列番号12のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)を含む、請求項59に記載の抗体。
- 配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖(HC)、および配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖(LC)を含む、請求項59または60に記載の抗体。
- 2つのHCおよび2つのLCを含み、各HCが配列番号9のアミノ酸配列を有し、各軽鎖(LC)が配列番号10のアミノ酸配列を有する、請求項59〜61のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項59〜62のいずれか一項に記載の抗体と、1つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- リウマチ、神経、および/または皮膚疾患を有する患者を治療する方法であって、有効量の、請求項59〜62のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
- 前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチのうちの少なくとも1つである、請求項64に記載の方法。
- 前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも1つである、請求項64に記載の方法。
- 前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項64に記載の方法。
- 治療で使用するための、請求項59〜62のいずれか一項に記載の抗体。
- リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの1つまたはそれ以上の治療に使用するための、請求項59〜62のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチのうちの少なくとも1つである、請求項69に記載の抗体。
- 前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも1つである、請求項69に記載の抗体。
- 前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項69に記載の抗体。
- リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの1つまたはそれ以上を治療するための薬剤の製造における、請求項59〜62のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- 前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチのうちの少なくとも1つである、請求項73に記載の抗体の使用。
- 前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも1つである、請求項73に記載の抗体の使用。
- 前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項73に記載の抗体の使用。
- ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチから選択される状態の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項59〜62のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- アトピー性皮膚炎および乾癬から選択される状態の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項59〜62のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 多発性硬化症の治療に使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項59〜62のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 配列番号9のアミノ酸配列によって定められる抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含むDNA分子。
- 配列番号10のアミノ酸配列によって定められる抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むDNA分子。
- 配列番号9のアミノ酸配列を有する抗体重鎖をコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号10のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列とを含む、DNA分子。
- 前記抗体重鎖をコードする前記ポリヌクレオチド配列が配列番号39であり、前記抗体軽鎖をコードする前記ポリヌクレオチド配列が配列番号40である、請求項82に記載のDNA分子。
- 請求項80に記載のDNA分子および請求項81に記載のDNA分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む抗体を発現することができ、各重鎖のアミノ酸配列が配列番号9によって定められ、各軽鎖のアミノ酸配列が配列番号10によって定められる、哺乳動物細胞。
- 請求項82または83に記載のDNA分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む抗体を発現することができ、各重鎖のアミノ酸配列が配列番号9によって定められ、各軽鎖のアミノ酸配列が配列番号10によって定められる、哺乳動物細胞。
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- 請求項86に記載の方法によって得られる抗体。
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