KR20230129229A - Tigit- 및 light-기반 키메라 단백질을 이용한 암 치료방법 - Google Patents

Tigit- 및 light-기반 키메라 단백질을 이용한 암 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은, 특히, 질환 치료에서의 용도를 발견하는 키메라 단백질을 포함하는 조성물 및 방법, 및 키메라 단백질을 이용한 약물 내성 암의 검출 및 치료에 관한 것이다.

Description

TIGIT- 및 LIGHT-기반 키메라 단백질을 이용한 암 치료 방법
우선권
본 출원은 2020년 12월 3일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/121,083호; 2021년 4월 9일자로 출원된 제63/173,090호; 2021년 6월 28일자로 출원된 제63/215,735호; 및 2021년 11월 5일자로 출원된 제63/276,066호의 유익 및 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
기술분야
본 개시내용은, 특히, 질환 치료에서의 용도를 발견하는 키메라 단백질을 포함하는 조성물 및 방법, 및 키메라 단백질을 이용한 약물 내성 암의 검출 및 치료에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 텍스트파일의 설명
본 명세서와 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다: 서열목록의 컴퓨터 판독 가능한 형식 사본(파일명: SHK-038PC2_ST25; 생성일: 2021년 12월 1일; 용량 177,048 바이트).
암 면역요법 분야는 지난 몇 년 동안 엄청나게 성장했다. 이는 대체로 다수의 종양 유형에서 관문 분자(예를 들어, CTLA-4 및 PD-1/L1) 패밀리를 표적화하는 항체의 임상 효능에 의해 유도되었다. 그러나, 이 성공에도 불구하고, 단일 요법으로서 이들 제제에 대한 임상 반응은 소수의 환자(다양한 고형 종양에서 10 내지 45%)에서 발생하며, 이들 요법은 부작용에 의해 방해받는다.
이러한 제제의 적절한 용량 및 요법의 발견은 암의 효능있는 치료에 중요하다. 투약 및 요법을 포함하는 신규한 치료 전략의 개발은 인간 면역계의 복잡성, 고비용 및 이러한 개입으로부터 초래될 수 있는 독성에 대한 가능성을 고려할 때 엄청난 작업으로 남아있다.
또한, 약제 내성은 면역요법을 포함하는 암 요법에서 가장 큰 난제 중 하나로 남아있다. 또한 암이 진행된 환자는 이들의 종양을 수축시키는 것을 돕는 약물을 투여받지만, 이어서, 몇 주 또는 몇 개월 후에, 암이 다시 발생되고 약물이 더 이상 효과가 없는 것이 통상적이다. 따라서, 치료 전에 존재하거나(내재 또는 1차 내성) 또는 요법(획득 내성) 후에 발생된 약제 내성은 주된 사망 원인 중 하나인 대부분의 암 재발을 초래한다. 따라서, 장래의 암 치료에 대한 가이드를 제공하기 위해 약제 내성 메커니즘을 더 양호하게 이해하는 것이 필요하다. 불행하게도, 항-관문 요법에 내성이 있는 암이 있는 일부 환자에 대해서는 효과적인 치료 옵션이 거의 없다. 따라서, 약물 내성 암을 앓고 있는 환자에 대한 신규한 요법 및 약물-내성 암을 갖는 환자에 대해 적절한 약물을 선택하기 위한 방법은 암 환자에서의 결과를 개선시키는 데 필요하다.
다양한 양상에서, 본 기술은 암 면역요법에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 개시내용은, 부분적으로, 암 치료를 위한 환자를 선택하기 위한 방법, 및, 예를 들어, 항-PD-1 내성암의 유전자 발현 프로파일에 기반한, 암 치료를 위한 방법을 제공한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(herpesvirus entry mediator: HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함). 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 50.0㎎/㎏이며, 선택적으로 약 1㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 6㎎/㎏, 또는 약 10㎎/㎏, 약 12㎎/㎏, 약 15㎎/㎏, 약 18㎎/㎏, 약 20㎎/㎏, 약 22㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 27㎎/㎏, 약 30㎎/㎏, 약 33㎎/㎏, 약 35㎎/㎏, 약 37㎎/㎏, 약 40㎎/㎏, 약 42㎎/㎏, 약 45㎎/㎏, 약 48㎎/㎏, 내지 약 50㎎/㎏으로부터 선택된다. 실시형태에서, 대상체는 인간, 선택적으로는 성인 인간이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 림프구 확장 유도를 필요로 하는 대상체에서 림프구 확장을 유도하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함).
일 양상에서, 본 개시내용은 림프구 변연화 유도를 필요로 하는 대상체에서 림프구 변연화를 유도하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함).
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질의 용량을 투여하는 단계로서, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이되(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함), 상기 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏인, 단계; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대해 분석을 수행하여 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 1종의 사이토카인의 수준 및/또는 활성 증가를 갖는다면 투약을 계속하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 요법에 의한 치료를 위해 대상체를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질의 용량을 투여하는 단계로서, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이되(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함), 상기 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏인, 단계; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대해 분석을 수행하여 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 1종의 사이토카인의 수준 및/또는 활성 증가를 갖는다면 암 요법에 의한 치료를 위한 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (ii) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절; 및/또는 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립(chylomicron) 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제, 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절에 대해 샘플을 평가하는 단계; 및 (iii) 단계 (b)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 위해 환자를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (ii) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절; 및/또는 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절에 대해 샘플을 평가하는 단계; 및 (iii) 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하며, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (ii) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절; 및/또는 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절에 대해 샘플을 평가하는 단계; 및 (iii) 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성(recalcitrance)을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본이다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생검 샘플이다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함한다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함한다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 본 명세서에서 확인된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 본 명세서에서 확인된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 핵산 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 환자를 고위험 또는 저위험 그룹으로 분류하는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 고위험 분류는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성을 갖는 고수준의 종양 세포를 포함한다. 실시형태에서, 저위험 분류는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성을 갖는 저수준의 종양 세포를 포함한다.
실시형태에서, 상향조절은 건강한 조직과 비교된다. 실시형태에서, 상향조절은 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교된다. 실시형태에서, 상향조절은 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플과 비교된다. 실시형태에서, 하향조절은 건강한 조직과 비교된다. 실시형태에서, 하향조절은 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교된다. 실시형태에서, 하향조절은 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플과 비교된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 유효량의 약제학적 조성물을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료 방법에 관한 것이며, 약제학적 조성물은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단을 포함하는 키메라 단백질을 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되고, 암은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항-관문 제제에 내성이 있거나 내성이 있는 것으로 여겨진다.
실시형태에서, 링커는 가요성 아미노산 서열, IgG 힌지 영역 또는 항체 서열로부터 선택된 폴리펩타이드이다. 실시형태에서, 링커는 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG1로부터 유래된다. 실시형태에서, 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG4로부터 유래된다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 2개 이상의 결합 링커를 포함하며, 각각의 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 독립적으로 선택되되; 1개의 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 N 말단이고, 다른 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 C 말단이다.
실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 재조합 융합 단백질이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 환자에 대해 암 치료를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는 (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자의 발현에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는 (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자의 발현에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는 (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자의 발현에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 암 요법이 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 단계; 및 (VI) 선택적으로 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 본 개시내용은 환자에 대해 암 치료를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 활성화를 위해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계로서, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 활성화를 위해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계로서, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하는 단계를 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 활성화를 위해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (II) 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 단계; 및 (IV) 선택적으로 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 항-관문 제제는 니볼루맙(OPDIVO), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA), 피딜리주맙(CT-011, CURE TECH), MK-3475(MERCK), BMS 936559, MPDL328OA(ROCHE), 세미플리맙(LIBTAYO), 아테졸리주맙(TECENTRIQ), 아벨루맙(BAVENCIO) 및 더발루맙(imfinzi)으로부터 선택된 항체이다.
실시형태에서, 상기 방법은 항-관문 제제의 투여를 더 포함한다. 실시형태에서, 항-관문 제제는 니볼루맙(OPDIVO), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA), 피딜리주맙(CT-011, CURE TECH), MK-3475(MERCK), BMS 936559, MPDL328OA(ROCHE), 세미플리맙(LIBTAYO), 아테졸리주맙(TECENTRIQ), 아벨루맙(BAVENCIO) 및 더발루맙(imfinzi)으로부터 선택된 항체이다. 실시형태에서, 키메라 단백질 및 항-관문 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 일시에 또는 동시에 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 항-관문 제제가 투여된 후에 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 항-관문 제제가 투여된 전에 투여된다.
본 명세서에 개시된 임의의 양상은 임의의 다른 양상과 조합될 수 있다.
특허 또는 특허 출원은 컬러로 시행한 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 이런 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불 시 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1A 및 도 1B는 항-PD-1-내성 CT26 종양의 생성을 도시한다. 도 1A는 항-PD-1-내성 CT26 종양의 생성에 사용된 방법의 개략적 표현을 나타낸다. 간략하게, BALB/C 마우스에 500,000개의 뮤린 결장 암종 CT26 세포를 접종하였고, 평균 종양 용적이 80 내지 100㎣에 도달되었을 때(표시 제0일), 마우스를 항-PD-1(클론 RMP1-14; BioXcell) 항체로 처리하였다. 종양을 절개하고, 살아있는 종양 세포를 분리시키고, 시험관내에서 배양시킨다. 이런 세포를 "제1 라운드", "제1 세대" 또는 "F1 세대" 세포로 부른다. 1세대 세포를 BALB/C 마우스에 접종하고, 항-PD-1의 다른 처리 과정 후에 "제2 라운드", "2세대" 또는 "F2 세대" 세포를 단리시켰다. 항-PD-1 선택의 2회 추가 라운드(총 4회 라운드) 후에, "제4 라운드", "4세대" 또는 "F4 세대" 세포를 단리시켰다. 도 1B는 CT26 모 세포 및 PD-1 내성 세포를 보유하는 BALB/C 마우스에서 항-PD-1 항체(100㎍ 항-PD-1 클론 RMP1-14; BioXcell) 효능을 비교하는 그래프를 나타낸다. BALB/C 마우스는 뒤 옆구리에서 CT26 모 세포 및 PD-1 내성 4세대 세포를 접종하였다. 시작 종양 용적(STV)이 80 내지 100㎣에 도달되었을 때, 마우스를 다음의 두 처리군에서 무작위로 나누었다: (1) 비히클(PBS), 및 (2) 항-PD-1 항체. 마우스에 제0일, 제3일 및 제6일에 비히클 또는 100㎍ 항-PD-1(클론 RMP1-14; BioXcell)의 일련의 복강내 주사를 제공하였다. 표시일에 종양 용적을 측정하였다.
도 2A 내지 도 2D는 RNA-seq를 이용한 항-PD-1 내성 세포주의 전사체 프로파일링을 도시한다. 도 2A(상단 패널)는 전사체 발현에 기반하여 샘플로부터 공간적으로 분리된 주성분 분석(Principal Component Analysis: PCA)을 나타낸다. 도 2A(하단 패널)은 그룹(모체 대 2세대, 모체 대 4세대, 2세대 대 4세대) 간에 결정된 차별 발현 유전자(Differentially Expressed Gene: DEG)를 나타내고, 히트맵에 플롯팅한다. 계층적 클러스터링을 수행하여 각 행에서 순서 유전자에 순위를 매기고, 각 비교에서 유전자를 2개의 주요 클러스터로 분리하였으며, 여기서, 유전자 발현의 서브세트는 하나의 데이터세트에서 더 낮았고(청색) 다른 데이터세트에서 더 높았다(적색). 도 2B는 각 데이터세트에서 상향- 또는 하향-조절된 유전자를 나타낸다. 유전자를 각 유전자 세트와 관련된 유전자 온톨로지(GO)를 확인하기 위해 PANTHER에 입력하였다. 유전자 세트를 관련된 p-값과 함께 나타낸다. 도 2C(상단 패널)은 모든 데이터세트 사이의 유전자 발현에서의 중복의 벤 다이어그램을 나타낸다. 도 2C(하단 패널)는 선택 유전자에서의 백만개당 전사체(TPM; 정규화된 발현 데이터)를 나타내며, 이는 다른 데이터세트의 다른 것보다 더, PD-L1, 항원 처리/제시, 단백질 번역, ER 수송과 관련된 유전자의 더 높은 기준선 발현을 입증한다. 도 2D는 선택 유전자의 백만개당 전사체(TPM; 정규화된 발현 데이터)를 나타내며, 이는 다른 데이터세트의 다른 것보다 더, PD-L1, 항원 처리/제시, 단백질 번역, ER 수송과 관련된 유전자의 더 높은 기준선 발현을 입증한다.
도 3은 PD-L1/2 MHC 클래스 I 및 B2M의 유전자 발현 및 세포 표면 단백질 발현의 부조화가 있다는 것을 도시한다. 모체 및 4세대 항-PD-1 내성 세포를 배양물로부터 채취하고, PD-L1, PD-L2, MHC 클래스 I 및 β2 마이크로글로불린(B2M)의 표면 발현을 위해 유세포분석에 의해 분석하였다. 게이트를 나타낸 바와 같이 도시하고, 각 플롯 위에는 각 게이트의 세포 백분율을 나타내며, 각 백분율 우측에는, 각 마커의 MFI(평균 형광 강도)를 표시한다.
도 4A 및 도 4B는 항-PD-1 내성 세포주의 전사체 프로파일링을 나타낸다. 도 4A는 2세대- 및 4세대의 비교에서 B16.F10을 갖는 항-PD-1 내성 세포주는 항-PD-1 "1차 내성"의 모델로서 작용하는 뮤린 흑색종 종양인데 이들 종양이 항-PD-1 요법에 반응성이 아니기 때문이라는 것을 나타낸다. 세포를 IFNγ에서 24시간 동안 배양시켜 시험관내 반응성을 평가하였다. 이는 면역 세포 침윤물로서 생체내에서 종양 세포가 반응하는 방법을 모방하고, IFNγ와 같은 효과기 사이토카인을 분비한다. 도 4A(좌측 패널)은 비처리와 IFNγ 처리 모체 CT26 사이에서 확인된 DEG를 나타낸다. 이 중에서, 338개의 유전자는 다른 데이터세트로부터의 사용 가능한 데이터를 갖고; 해당 값은 다른 열에 나타낸다. Log2 배수 변화는 히트맵에 플롯팅하였고, 유전자는 모체 CT26에 기반하여 계층적 클러스터링된다. 유전자를 3개의 주요 클러스터로 분리시켰다. 도 4A(우측 패널)은 DEG와 관련된 GO 경로를 나타낸다. 관련 유전자를 하향조절된 유전자와 관련된 경로를 확인하기 위해 PANTHER에 입력하였다. 도 4B는 CT26 항-PD-1 내성 세포가 I형 및 II형 인터페론의 기준선 과활성화를 갖지만, 해당 세포가 IFNγ로 시험감염될 때, 해당 세포가 이들 유전자를 하향조절한다는 것을 입증하는, 선택 유전자에서의 백만개당 전사체를 나타낸다(TPM: 정규화된 발현 데이터).
도 5A 내지 도 5D는 항-PD-1에 대한 획득 내성과 관련된 특정 유전자의 역설적 하향조절을 도시한다. 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 과발현된 CD274(도 5A) 및 B2m(도 5B)을 암호화하는 유전자를 야생형 CT26 세포에서 과발현시키지만, IFNγ의 존재 하에서 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 억제하였다. 반면에, 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 억제된 Trim7(도 5C) 및 Lrg1(도 5D)을 암호화하는 유전자는 야생형 CT26 세포에서 억제되지만, IFNγ에 반응하여 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 과발현된다. 2세대 항-PD-1 내성 세포는 중간 표현형을 나타낸다.
도 6A 및 도 6F는 항-PD-1에 대한 획득 내성에 관련된 드라이버 유전자의 식별 및 드라이버 유전자에 의해 영향받는 기능성 경로를 나타낸다. 도 6A, 패널 1 내지 4는 드라이버 유전자의 확인을 위해 사용한 방법을 나타낸다. 도 6A(패널 1)는 CT26 세포에 비해 IFNγ의 존재 하의 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 1,999개의 유전자가 하향조절되고 3607개의 유전자가 상향조절된다는 것을 나타낸다. 도 6A(패널 2)는 1,060개의 유전자가 4세대 항-PD-1 내성 세포를 하향조절하지만 CT26 세포를 상향조절한다는 것을 나타낸다. 도 6A(패널 3)는 IFNγ에 대한 반응성에 따른 분류에 의해 나타나는 바와 같이 688개의 유전자가 CT26 세포에 비해 4세대 항-PD-1 내성 세포를 하향조절한다는 것을 나타낸다. 도 6A(패널 4)는 70개의 유전자가 CT26 세포에 비해 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 생체내에서 상향조절된다는 것을 나타낸다. 도 6B는 도 6A의 방법을 이용하여 확인된 유전자와 관련된 유전자 온톨로지(GO) 경로를 나타낸다. 도 6C는 단백질의 TRIM 패밀리에 의해 영향받는 기능성 경로를 나타낸다. 도 6D는 Elk1 및 c-Jun이 어떤 역할을 하는 기능성 경로를 나타낸다. 도 6E는 Lrg1, B2m 및 Arg1와 다른 유전자 사이의 기능성 관련성을 나타낸다. 도 6F는 암 게놈 지도(Cancer Genome Atlas: TCGA) 암 게놈 프로그램에서 종양 및 주변의 정상 조직에서의 Elk1 발현 수준을 나타낸다.
도 7A 내지 도 7D는 Stat1(도 7A), Stat2(도 7B), Irf1(도 7C) 및 Tap1(도 7D) 유전자가 IFNγ에 반응하여 과발현되고, 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 과발현되고, IFNγ의 존재 하에 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 억제된다는 것을 나타낸다. 2세대 항-PD-1 내성 세포는 중간 표현형을 나타낸다.
도 8A 및 도 8D는 Ras 및 Rap1 신호전달 경로의 확인을 야기하는 찰별 발현 유전자의 경로 분석을 나타낸다. 도 8A는 도 6A(패널 2)로부터의 상단 1,000개의 세포를 이용한 WEB-기반 GEne SeT AnaLysis Toolkit(WebGestalt)를 이용하는 경로의 확인을 나타낸다. 도 8B는 도 8A에 제시된 데이터의 볼케이노 플롯을 나타낸다. 도 8C는 RAS 신호전달 경로를 나타낸다. Raf/Mek/Erk 신호전달에 의한 수렴을 타원을 이용하여 나타낸다. 도 8D는 RAP1 신호전달 경로를 나타낸다. Raf/Mek/Erk 신호전달에 의한 수렴을 타원을 이용하여 나타낸다.
도 9A 내지 도 9C는 IFNγ에 반응하여 과발현된 Ccl5(RANTES)(도 9A), Cxcl10(IP-10)(도 9B) 및 Ifnb1(도 9C) 유전자가 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 과발현되고, IFNγ의 존재 하에 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 억제된다는 것을 나타낸다. 2세대 항-PD-1 내성 세포는 중간 표현형을 나타낸다.
도 10A 내지 도 10H는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 작제 및 특성규명을 나타낸다. 도 10A는 중앙 IgG4 Fc 도메인의 이량체화 및 TNF-리간드 도메인의 삼량체화와 함께 PDB(단백질 데이터 뱅크) 구조에 기반한 LIGHT 삼량체의 2개의 기능성 세트를 갖는 육량체로서 존재하는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 분자 모델을 나타낸다. 도 10B는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 특성규명을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 웨스턴 블롯은 키메라 단백질의 천연 상태 및 다량체를 형성하는 경향을 입증한다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 비처리 샘플(즉, 환원제 또는 탈글리코실화제 없이, 아직 비등됨)은 블롯 각각의 NR로서 표시된 레인에 장입하였다. R로서 표시된 레인의 샘플은 환원제, β-머캅토에탄올로 처리하였고, 비등시켰다. DG로서 표시된 레인의 샘플을 탈글리코실화제인 환원제로 처리하고, 비등시켰다. L로서 표시된 레인은 단백질 크기 사다리를 포함하였다. 키메라 단백질의 각 개개 도메인을 항- TIGIT 항체(좌측 블롯), 항-Fc 항체(중앙 블롯) 또는 항-LIGHT 항체(우측 블롯)를 이용하여 프로빙하였다. 도 10C는 골수성, CD8+ T 및 NK 세포(LTβR 및 HVEM) 상에서 발현된 관문 표적(PVR) 및 면역 공자극 수용체에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 동시 결합을 입증하는 중규모 디스커버리(Meso Scale Discovery: MSD) ELISA 분석을 나타낸다. 도 10D는 (인간 LTβR을 발현시키는 hPVR, hHVEM 및 또한 A375 세포를 발현시키도록 조작된 CHOK1 세포를 이용하여) 세포 표면 수용체 결합을 평가하기 위해 개발한 세포 기반 결합 분석을 나타낸다. 도 10E는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 Jurkat 효과기 세포의 하향 신호전달 활성화를 나타낸다. NFκB/NIK 수용체 세포를 재조합 Fc-LIGHT 대조군 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(각각 18nM)과 함께 인큐베이션시켰고, 루시퍼라제 검출을 통해 신호전달 활성을 평가하였다. 도 10F는 3일 동안 슈퍼-항원 SEB와 함께 공동 배양시킨 인간 PBMC 또는 마우스 비장세포에서 평가한 바와 같이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(또는 둘 다 10nM에서 뮤린 대리(surrogate))이 IL-2 유도를 통해 T 세포를 활성화시킨다는 것을 나타낸다. 도 10G는 효과기 세포 - 상업적 2 세포 수용체 시스템의 부분 -가 유세포분석을 이용하여 나타낸 바와 같이 TIGIT, DNAM-1 및 HVEM을 발현시킨다는 것을 나타낸다. 도 10H는 Jurkat 효과기 및 CHO/hPVR 수용체 세포의 활성화를 나타낸다. 이 세포들을 6시간 동안 LIGHT 차단 항체와 함께 사전 인큐베이션시킨 (모두 150nM) IgG4 대조군, DNAM-1 차단 항체, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질, 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 함께 공동배양하고, 이어서, 루미노미터를 이용하여 루시퍼라제 신호전달 활성을 평가하였다.
도 11은 표시된 바와 같이 처리된 마우스에서 비히클-단독 처리 마우스에 비교되는 CT26(좌측 패널), CT26 항-PD-1 내성 세포(중간 패널) 또는 B16.F10(우측 패널) 동종 이식편의 종양 성장 저해를 나타낸다. 점선은 종양 성장 저해의 양이 항-PD-1 항체(클론 10F.9G2)를 야기하였다는 것을 나타낸다.
도 12A 내지 도 12J는 암에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 생체내 효능을 나타낸다. 도 12A는 개개 동물 종양 성장 곡선, 각 그룹이 종양 부담에 도달된 평균 일수, 및 처리에 반응하여 종양을 완전히 거부한 마우스의 수를 나타낸다. 도 12B는 실험 과정에 걸쳐 CT26 결장직장암 종양의 동종 이식편, 항-PD-1 내성 CT26 종양 또는 B16.F10 종양을 보유하는 마우스의 전체 생존을 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 나타낸다. 도 12C는 CT26 야생형 종양을 보유하고 200㎍의 뮤린 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(mTIGIT-Fc-LIGHT), 또는 100㎍의 항-LTβR, 항-TIGIT, Fc-LIGHT, 항-PD-1, 항-PD-L1, 또는 표시된 조합물로 처리한 마우스의 개개 동물 종양 성장 곡선을 나타낸다. 또한 전체 그룹이 종양 부담에 도달된 평균 일수(또한 점선으로 나타냄), 및 종양을 완전히 거부한 마우스의 수/분석한 총 그룹 크기를 나타낸다. 도 12D는 도 12C로부터의 시간 과정 36일 내내의 카플란-마이어 생존 플롯을 나타낸다. 도 12E는 B16.F10 종양을 보유하고 200㎍의 mTIGIT-Fc-LIGHT, 또는 100㎍의 항-TIGIT, Fc-LIGHT, 항-PD-1, 항-PD-L1, 또는 표시된 조합물로 처리한 마우스의 개개 동물 종양 성장 곡선을 나타낸다. 또한 전체 그룹이 종양 부담에 도달된 평균 일수(또한 점선으로 나타냄), 및 종양을 완전히 거부한 마우스의 수/분석한 총 그룹 크기를 나타낸다. 도 12F는 도 12E로부터의 시간 과정 36일 내내의 카플란-마이어 생존 플롯을 나타낸다. 도 12G는 종양 접종 7일 후(제0일, 제3일, 제6일 처리 후) 종양 접종 항원-특이적 CD8+ T 세포(AH1+) 및 NK 세포 침윤성 CT26 결장직장암 종양 또는 항-PD-1 내성 CT26 종양(CT26/AR)의 비율을 나타낸다. 도 12H는 B16.F10 모델에서 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 생체내 활성에 대한 CD4+ T, CD8+ T 또는 NK 세포 고갈의 영향을 나타낸다. B16.F10 종양이 112.57㎣의 평균 시작 종양 용적(STV)에 도달되었을 때, 제0일을 나타낸다. 마우스를 -제1일, 제1일 및 제7일에 CD4, CD8 또는 NK 고갈 항체 과정으로 처리하였다. 마우스에 제0일, 제3일 및 제6일에 3회의 IP 주사로 제공하고; 각각은 200㎎의 mTIGIT-Fc-LIGHT로 이루어지고 제0일에서 제11일까지의 종양 용적 변화를 플롯팅하였다. 도 12I는 항-PD-1 내성 CT26 종양을 보유하고 200㎍의 mTIGIT-Fc-LIGHT, 또는 100㎍의 항-TIGIT, Fc-LIGHT, 항-PD-1, 항-PD-L1, 또는 표시된 조합물로 처리한 마우스의 개개 동물 종양 성장 곡선을 나타낸다. 또한 전체 그룹이 종양 부담에 도달된 평균 일수(또한 점선으로 나타냄), 및 종양을 완전히 거부한 마우스의 수/분석한 총 그룹 크기를 나타낸다. 도 12J는 도 12I로부터의 시간 과정 36일 내내의 카플란-마이어 생존 플롯을 나타낸다. 도 12K는 표시된 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리한 마우스에서 총 CD8+ 세포의 유도를 나타낸다. 도 12L은 표시된 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리한 마우스에서 총 CD4+DNAM1+ 세포의 유도를 나타낸다. 도 12M은 표시된 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리한 마우스에서 총 CD4+ 세포의 유도를 나타낸다. 도 12N은 표시된 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리한 마우스에서 총 CD11b+ 세포의 유도를 나타낸다. 도 12O는 표시된 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리한 마우스에서 활성화된 CD11b+CD80+ 세포의 유도를 나타낸다. 도 12P는 표시된 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리한 마우스에서 활성화된 CD11b+CD86+ 세포의 유도를 나타낸다.
도 13A 내지 도 13G는 다양한 말초 혈액 세포 서브타입에 걸쳐 그리고 인간 및 마우스 TIL 내의 면역 공자극 수용체의 발현을 나타낸다. 도 13A는 모든 종양 유형에 걸쳐 높은 평균 발현에서 낮은 평균 발현에 기반한 순서로 순위를 매긴 TCGA 암에 걸친 53개의 면역 공자극 유전자의 상대 발현을 도시하는 히트맵을 나타낸다. 도 13B는 모든 TCGA 종양 유형에 걸쳐 TNFRSF14, CD226 및 LTBR의 정규화된 발현 수준을 동일한 규모로 플롯팅하여, 서로에 대해 이들 표적 유전자의 상대 mRNA 발현을 도시하는 것을 나타낸다. 도 13C는 미경험() CD8+ T 세포(Tn) 및 T 줄기 세포 기억 CD8+ T 세포(Tscm)에서의 HVEM 및 DNAM-1의 상대 수준을 나타낸다. 자기 분리를 이용한 건강한 공여자 PBMC로부터 단리된 인간 미경험 CD8+ T 세포를 CD3/CD28 비드, 인간 재조합 IL-2 및 GSK3β 저해제 TWS119가 있는 AIMV 배지에서 9일 동안 배양시켰다. 이 시간 과정 후에, 세포를 단리시키고, 미경험 CD8+ T 세포(Tn) 및 T 줄기 세포 기억 CD8+ T 세포(Tscm)를 특성규명하는 앞서 확인한 항체 패널에 따라 유세포분석에 의해 평가하였다. HVEM 및 DNAM-1의 상대 수준을 도시하고, Tscm과 Tn 세포 둘 다에 대해 정량화하였다. 도 13D는 Seurat 확인 클러스터(상단) 및 ImmuneExp에 따른 SingleR 면역 세포 서브타입(하단)에서의 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 공간 조직화를 나타낸다. 2일 동안 AIMV 배지에서 배양시킨 인간 PBMC를 단리시키고, 단세포 RNA 서열분석(scRNA-seq)을 실시하였다. Seurat 확인 클러스터(상단) 및 ImmuneExp에 따른 면역 세포 서브타입을 플롯팅하기 위한 SingleR(하단)을 이용하여 UMAP 공간 조직화를 평가하였다. 도 13E는 Seurat 확인 클러스터에 걸쳐 53개의 면역 공자극 유전자의 상대 발현을 도시하는 히트맵을 나타낸다. 유전자를 모든 클러스터에 걸쳐 높은 평균 발현에서 낮은 평균 발현에 기반한 순서로 순위를 매긴다. 각 열에서의 최소값 및 최대값에 기반하여 발현 강도를 나타낸다. 관심의 3개 유전자, 즉, TNFRSF14(HVEM), CD226(DNAM-1) 및 LTBR(LTβR)을 강조한다. 도 13F는 Seurat 확인 클러스터에 걸쳐 TNFRSF14, CD226 및 LTBR의 정규화된 발현 수준을 동일한 규모로 플롯팅하여, 서로에 대해 이들 표적 유전자의 상대 mRNA 발현을 도시하는 것을 나타낸다. 도 13G는 종양 침윤성 림프구(TIL) 뮤린 CT26 야생형 결장직장(CT26/WT) 종양, CPI 획득 내성을 발생시키도록 조작된 CT26 종양(CT26/AR) 또는 B16.F10 흑색종 종양에서의 HVEM 및 DNAM-1의 상대 세포 표면 발현을 이들 각각의 수용자 마우스에 접종하였다는 것을 나타낸다. 종양을 확립하고, 이들이 80 내지 110㎣(초기 접종 후 대략 10 내지 14일)에 도달되었을 때, 종양을 절개하고 나서, 분리시키고, 얻어진 종양 침윤성 림프구(TIL)를 유세포 분석에 의해 평가하였다. HVEM 및 DNAM-1의 상대 세포 표면 발현을 NK 세포(CT26 종양에서 NKP46+ 세포 및 B16.F10 종양에서 NK1.1 상에서 게이팅) 및 CD8+ T 세포(CD3+CD8+ 세포 상에서 게이팅)에서 평가하였다.
도 14A 내지 도 14H는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 Fc 조성물과 상관없이 골수성, T 및 NK 세포를 직접 활성화시킨다는 것을 나타낸다. 인간 공여자 PBMC를 비처리하거나(UT) 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 IgG1 또는 IgG4 변이체가 있는 AIMV 배지에서 배양시키고; TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 키메라 단백질 또는 G1 및 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질 또는 G4로서 지칭하였다. 도 14A는 플레이트에 대한 세포의 접착 및 방추체-유사 골수성 형태 형상을 도시하는, 7일 동안 배양시킨 PBMC +/- TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 또는 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질의 위상 콘트라스트 이미지를 나타낸다. 도 14B는 PBMC 배양물의 증식/합류를 Incucyte 타임 랩스 이미저 상에서 인큐베이션시켰고, 증식/합류를 150nM의 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT의 존재 또는 부재 하에 6일 시간-과정에 걸쳐 평가하였다는 것을 나타낸다. 4개의 시야(fields of view)에 걸쳐 각각 3명의 공여자에 대해 2회 중복해서 20x 이미지를 촬영하였다. 도 14C는 중규모 디스커버리(MSD) ELISA 분석을 이용하여 배양물 상청액에서 배양시킨 바와 같이 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의해 유도된 사이토카인을 나타낸다. 배양물에서 2일 후, 상청액을 제거하고, MSD 다중복합 사이토카인 패널을 이용하여 일련의 사이토카인을 평가하였다. 도 14D는 단세포 RNA 서열분석에 의해 평가한 바와 같은 차별 발현 유전자(DEG) 수를 나타낸다. 제2일에, 비처리(UT), TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT-처리(G1) 및 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT-처리(G4) PBMC 단세포를 단리시키고, 단세포 RNA 서열분석을 실시하였다. TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT와 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질과 도 13D 및 도 13E에서 확인한 16개의 Seurat 클러스터 각각에 걸친 비처리 그룹 간의 차별 발현 유전자(DEG)를 확인하였다. 도 14E는 모든 16개의 Seurat 클러스터에 걸쳐 확인한 DEG에서의 발현의 상대 차이를 도시하는 히트맵을 나타낸다. 관심 유전자를 골수성, NK 및 CD8+ T 세포 집단에 대응하는 클러스터에서 표지한다. 도 14F는 비처리, TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT, 및 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 데이터세트의 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 공간 분포를 나타낸다. 골수성, NK 및 CD8+ T 세포(ImmuneExp 주석을 이용하여 확인한 바와 같음)에 대응하는 세포 집단을 강조하고, 처리군에 걸쳐 해당 게이트에 속하는 세포의 백분율을 나타낸다. 도 14G는 진화적 관계를 통한 단백질 분석(PANTHER)에 의해 확인한 바와 같은 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질와 관련된 경로가 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 유도하였다는 것을 나타낸다. DEG의 수 및 방향성을 나타낸다. 유전자 온톨로지 분석(PANTHER 이용)을 상향- 및 하향-조절 유전자의 목록에 대해 수행하였고, 유의미하게 풍부화된 경로(FDR p-값 < 0.05)를 나타낸다. 도 14H는 비처리 마우스에 비교되는 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 및 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질로 처리한 마우스로부터의 인간 PBMC로부터 단리시킨 골수성 세포의 배수 변화를 나타낸다.
도 15는 비히클 단독, 항-TIGIT 항체(클론 1G9), 항-PD-1 항체(클론 RPM1-14), 항-TIGIT와 항-PD-1 항체의 조합, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질, 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 항-PD-1 항체의 조합으로 처리한 마우스에서의 CT26 또는 항-PD-1 내성 CT26(CT26/AR) 종양 동종 이식편의 종양 용적을 나타낸다.
도 16은 예시적인 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 구조(상단 패널), 및 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 특성규명을 나타내는 웨스턴 블롯(하단 패널)을 나타내는 카툰을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 키메라 단백질의 천연 상태 및 다량체를 형성하는 경향을 입증한다. 분자량 마커를 각 블롯의 첫 번째 레인에 로딩하였다. 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 비처리 샘플(즉, 환원제 또는 탈글리코실화제 없음, 아직 비등됨)을 블록 각각의 두 번째 레인에 장입하였다. 환원제, β-머캅토에탄올로 처리하고 비등시킨 샘플을 블롯 각각의 세 번째 레인에 장입하였다. 블롯 각각의 네 번째 레인의 샘플을 탈글리코실화제인 환원제로 처리하고, 비등시켰다. 키메라 단백질의 각각의 개개 도메인을 항-인간 SIRPα 항체(좌측 블롯), 항-Fc(H + L) 항체(중앙 블롯) 또는 항-4-1BBL 항체(우측 블롯)를 이용하여 프로빙하였다.
도 17A 내지 도 17C는 중규모 디스커버리(MSD) 플랫폼을 이용하여 측정한 바와 같은 인간 CD47, 인간 4-1BB에 대한 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합 분석을 나타낸다. 도 17A는 인간 CD47-His에 대한 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합을 나타낸다. 도 17B는 인간 4-1BB-His에 대한 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합을 나타낸다. 도 17C는 인간 4-1BB-His 및 CD47-His에 대한 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 동시 결합을 나타낸다.
도 18A 내지 도 18C는 4-1BB를 발현시키는 세포에 대한 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합 및 세포의 활성화에 의한 결합을 나타낸다. 도 18A는 유세포분석에 의해 분석된 바와 같이 4-1BB를 과발현시키는 HT1080 세포에 대한 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합을 나타낸다. 도 18B는 유세포분석에 의해 분석된 바와 같이 4-1BB를 과발현시키는 HT1080 세포에 대한 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합의 정량화를 나타낸다. 도 18C는 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질에 의해 유도된 4-1BB/4-1BBL 신호전달에 반응한 IL-8 분비를 나타낸다.
도 19는 예시적인 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 구조(상단 패널), 및 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 특성규명을 나타내는 웨스턴 블롯(하단 패널)을 나타내는 카툰을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 키메라 단백질의 천연 상태 및 다량체를 형성하는 경향을 입증한다. 분자량 마커를 각 블롯의 첫 번째 레인에 로딩하였다. 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 비처리 샘플(즉, 환원제 또는 탈글리코실화제 없음, 아직 비등됨)을 블록 각각의 두 번째 레인에 장입하였다. 환원제, β-머캅토에탄올로 처리하고 비등시킨 샘플을 블롯 각각의 세 번째 레인에 장입하였다. 블롯 각각의 네 번째 레인의 샘플을 탈글리코실화제인 환원제로 처리하고, 비등시켰다. 키메라 단백질의 각각의 개개 도메인을 항-마우스 SIRPα 항체(좌측 블롯), 항-Fc(H + L) 항체(중앙 블롯) 또는 항-4-1BBL 항체(우측 블롯)를 이용하여 프로빙하였다.
도 20A 내지 도 20D는 중규모 디스커버리(MSD) 플랫폼을 이용하여 측정한 바와 같은 마우스 CD47, 마우스 4-1BB에 대한 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합 분석을 나타낸다. 도 20A는 항-마우스 Fc 항체에 대한 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합을 나타낸다. 도 20B는 마우스 4-1BB-His에 대한 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합을 나타낸다. 도 20C는 마우스 CD47-His에 대한 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합을 나타낸다. 도 20D는 마우스 4-1BB-His 및 CD47-His에 대한 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 동시 결합을 나타낸다.
도 21A 내지 도 21C는 CT26 동종 이식편 모델 및 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질 및 항-PD-1 항체의 항-종양 활성 비교를 나타낸다. 도 21A는 시간의 함수로서 평균 종양 성장의 선 그래프를 나타낸다. 도 21B는 제17일의 종양 용적을 나타내는 막대 그래프를 나타낸다. 도 21C는 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 22A 내지 도 22H는 사이노몰거스 마카크(cynomolgus macaque)에서 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 약력학적(PD) 활성을 나타낸다. 도 22A는 림프구의 용량 의존적 감소 또는 변연화를 나타낸다. 도 22B는 CD3+ T 세포의 감소 또는 변연화를 나타낸다. 도 22C는 투약 후 2시간에 사이토카인 서명에 기반한 동물의 주성분 분석(principal component analysis: PCA) 분포를 나타낸다. 도 22D는 PCA 벡터 플롯의 전염증 사이토카인의 2시간 투약 후 사이토카인 서명을 나타낸다. 도 22E는 중규모 디스커버리(MSD) 분석을 이용하여 평가한 바와 같은 사이토카인 반응을 나타낸다. 도 22F는 IL-2의 배수 유도를 나타낸다. 도 22G는 IP-10의 배수 유도를 나타낸다. 도 22H는 제1, 제2 및 제3 용량 동안 및 투약 후의 CXCL-10의 수준을 나타낸다.
도 23A 내지 도 23C는 mRNA 및 세포 표면 발현을 이용하는 면역 세포 표현형 분석을 나타낸다. 도 23A는 단리된 T 줄기 세포 기억(Tscm), T 중심 기억(Tcm), T 효과기 기억(Tem) 및 미경험 T 세포(Tn)에 대한 이전에 공개된 Affymetrix 마이크로어레이 데이터의 분석을 나타낸다. 데이터를 TNFRSF14(HVEM), CD226(DNAM-1) 및 TIGIT의 발현에 대해 분석하였다. 도 23B는 2개의 추가 면역 유전자 세트 주석에서의 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 공간 조직화를 나타낸다. HPCA(인간 1차 세포 Atlas) 및 Novershtern(Physical Module Networks)를 사용하여 도 13D에 제시한 인간 PBMC scRNA-seq 데이터의 UMAP 공간 분포를 평가하였다. 도 23C는 항-마우스 CD3/CD28 비드 및 IL-2, 또는 뮤린 NK 세포(둘 다 건강한 동물의 비장으로부터 단리)로 2일 동안 자극한 뮤린 T 세포에 대한 TIGIT, DNAM-1 및 HVEM의 세포 표면 발현을 평가하기 위해 사용한 유세포 분석 결과를 나타낸다. T 세포를 CD3상에서 미리 게이팅하고, NK 세포를 NKP46 상에서 미리 게이팅하였다.
도 24A 내지 도 24G는 마우스 및 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 분자의 뮤린 대리 및 기능 활성의 특성규명을 나타낸다. 도 24A는 비환원, 환원 및 환원 + 탈글리코실화 조건 하에 각각 도메인(TIGIT, Fc 및 LIGHT)을 프로빙한 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 평가한 바와 같은 뮤린 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 대리(mTIGIT-Fc-LIGHT로도 지칭함)의 특성규명을 나타낸다. 도 24B는 재조합 인간 Nectin-4에 대한 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 결합을 MSD를 이용하여 평가하였다는 것을 나타낸다. 도 24C(좌측 패널)는 인간 건강한 공여자 및 암 환자로부터 수집한 혈액 혈청 샘플 중 DcR3의 수준을 나타낸다. 도 24C(우측 패널)는 가용성 DcR3의 존재 하에 HVEM에 대한 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 결합을 나타낸다. 혈청 가용성 DcR3이 HVEM에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 결합을 방해할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 혈청 샘플 각각에서 독립적으로 얼음 상에서 20분 동안 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 이중 역가 분석을 수행하였다. 이어서, MSD 플랫폼을 이용하여 이중 역가 분석을 실행하였다. 도 24D는 재조합 표적에 대한 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(mTIGIT-Fc-LIGHT)의 결합을 ELISA에 의해 평가하였다는 것을 나타낸다. 유세포 분석을 이용하여 마우스 LTβR 발현 CHO-K1 세포에 대한 결합을 평가하였다. 도 24E는 유세포 분석에 의해 평가한 바와 같은 CT26/WT, CT26/AR 및 B16.F10 종양 세포에 대한 mTIGIT-Fc-LIGHT의 결합을 나타낸다. 도 24F는 Incuctye 플랫폼을 이용하여 평가한 바와 같은 NK 세포 또는 CD8+ T 세포(항-마우스 CD3/CD28 비드로 2일 동안 자극)에 의한 CT26 종양 세포의 사멸을 향상시키는 mTIGIT-Fc-LIGHT의 능력을 나타내며, 여기서, 절단된 카스파제 3/7 형광을 시간에 따라 평가하였다. 도 24G는 TIGIT Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 CXCL8 및 CCL2의 유전자 발현 유도를 나타낸다. 인간 A375 세포를 항-LTβR 작용제 항체 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 함께 3시간 동안 인큐베이션시켰다. RNA를 채취하고, 역전사시키고, qPCR을 이용하여 ACTB, GAPDH, CXCL8 및 CCL2의 유전자 발현을 평가하였다.
도 25A 내지 도 25G는 HVEM+ 및 LTβR+ 면역 세포를 자극함에 있어서 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT, 또는 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT) 활성을 나타낸다. 도 25A는 비환원, 환원 및 비환원, 환원 및 환원 + 탈글리코실화 조건 하에서 각 도메인(TIGIT, Fc 및 LIGHT)을 프로빙한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의한 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 키메라 단백질 분자의 평가를 나타낸다. 도 25B는 인간 PBMC +/- TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT, 또는 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT(각각 150nM)에 의해 수행한 바와 같은AIMV 증식 분석 결과를 나타낸다. 세포 형태를 Promega MTS 증식 분석(우측)을 이용한 배양물의 증식 능력에 추가로 2일(좌측)에 평가하였다. 도 25C는 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 키메라 단백질를 이용하여 표적 수용체에 대한 결합을 입증하기 위해 수행한 MSD 수용체 결합 분석을 나타낸다. IgG1 분자는 또한 효과기 Fc 감마 수용체(10㎍/㎖의 약물 농도)와 맞물리는 것으로 나타났고, 또한 도 25D는 도 14A 내지 도 14C에 제시된 동일한 공여자 PBMC로부터 제2일에 AIMV PBMC 배양물을 이용하는 사이토카인 분석을 나타낸다. PBMC를 Fc 효과기 적격 TIGIT 항체 +/- 항-PD-1(펨브롤리주맙)(모두 150nM)로 처리한 MSD 다중복합을 이용하여 사이토카인을 평가하였다. 비처리 막대는 이들을 도 14C에 제시하는 방법과 동일하다. 도 25E는 비처리(UT), TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 및 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 처리군으로부터 생성된 인간 PBMC scRNA-seq 데이터 세트로부터의 TIGIT, LTBR, TNFRSF14, CD226, PVR, PVRL2, PVRL3 및 NECTIN4의 공간 발현의 UMAP 도시를 나타낸다. 도 25F는 scRNA-seq 데이터세트로부터 단리된 관심 유전자의 정규화된 발현을 나타낸다. 도 25G는 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT와 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 처리군 사이의 차별 발현 유전자 평가를 나타내며, 이는 특히, 데이터세트가 거의 동일하다는 것을 나타낸다(배수 변화 >2-배 또는 <-2-배, 및 조절된 p-값 < 0.05).
도 26A 내지 도 26H는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 항-종양 활성을 나타낸다. 도 26A는 도 12C에서 제시된 추가적인 CT26/WT 처리군으로부터의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 도 26B는 상업적 마우스 항-LTβR 항체의 항-종양 활성을 나타낸다. 도 26C는 2차 종양에 대한 기억 면역 반응의 평가 결과를 나타낸다. 초기 처리 후 29일에 이용 가능한 마우스에 반대쪽 옆구리 상에 두 번째 CT26 종양을 접종하고, 후속적인 재처리는 없었다. 처리 동물에서 기억 면역 반응이 생성되었는지 여부의 표시로서 2차 종양의 성장을 시간에 따라 평가하였다. 비히클 처리군은 종양 성장에 대한 참조로서 CT26 종양을 접종한 마우스로 이루어진다. 도 26D는 이중 양성 효과기 기억 T 세포(DEPC)를 나타낸다. 재시험감염 동물에서, 말초혈액을 제39일에 수집하였고, 유세포 분석을 이용하여 이중 양성 효과기 기억 T 세포(DEPC)를 평가하였다. 도 26E는 분리된 종양에서의 종양 침윤성 림프구(TIL)의 분석을 나타낸다. 처리 동물의 코호트에서, 처음 처리 후 9일에 종양을 단리시키고, 이어서, 분리시키고, 얻어진 세포를 유세포분석에 의해 분석하였다. 도 26F는 분리된 종양에서의 사이토카인 분석을 나타낸다. Luminex 다중복합 어레이를 이용하여 사이토카인 발현에 대해 분리된 종양으로부터의 상청액을 평가하였다. 도 26G는 도 12F에서 제시된 추가적인 B16.F10 처리군으로부터의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 도 26H는 (말초 혈액 수집 전) -제1일, 제1일, 및 제7일에 고갈 항체의 3회 IP 투약 후, 제7일에 말초 혈액 중 CD4/CD8 T 세포 또는 NK 세포 고갈의 유세포 분석을 나타낸다.
도 27A 내지도 27D는 CT26/AR 모델로부터의 추가적인 활성 및 항-종양 효능 데이터를 나타낸다. 도 27A는 도 12J에서 제시된 추가적인 CT26/AR 처리군으로부터의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 도 27B는 Clustal Omega 다중 서열 정렬을 이용한, CD226 및 HVEM의 세포질 일부의 아미노산 정렬을 나타낸다. DNAM-1의 PD-1 조절에 이미 관련된 잔기는 밑줄 표시된다. 도 27C는 총 CD3+ 단핵 세포(MNC) 중 항원-특이적 CD8+ T 세포(CD8+AH1 사량체+)의 백분율을 나타내는 유세포 분석에 의한 TIL 분석을 나타낸다. 도 27D는 총 CD3- MNC 중 NK 세포(NKP46+)의 백분율을 나타내는 유세포 분석에 의한 TIL 분석을 나타낸다.
도 28A 내지 도 28C는 비인간 영장류 독성 연구에서의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 약력학적 활성을 나타낸다. 도 28A는 투약 전 동물 1로부터 단리시킨 말초 혈액에 대한 예시적인 HVEM 발현의 유세포분석 표현형을 나타내고, CD45+CD3+CD8+ T 세포 상에서 게이팅하였다. 도 28B는 각각의 개개 동물에 대해 모든 용량 그룹에 걸쳐 플롯팅한 최대 투약 후 사이토카인 반응을 나타낸다. 용량 반응을 강조하기 위해 음영을 사용하였다. 도 28C는 마우스 혈청 사이토카인 분석이 mTIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 처리 9일 후 수집한 혈액 혈청을 수행하였다는 것을 나타낸다.
본 개시내용은 항-PD-1 요법에 대한 내성(획득 내성 또는 1차 내성)과 관련된 특정 기능의 상향조절 또는 하향조절의 발견에 부분적으로 기반하며, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 또는 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 항-PD-1 요법에 대해 획득 내성 또는 1차 내성을 갖는 암에서 효과적이다. 놀랍게도, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 PD-1/PD-L1 축을 차단하는 제제의 조합은 항-PD-1 요법에 대해 획득 내성 또는 1차 내성인 암에 대해 효과적이다. 따라서, 이런 결과는 항-PD-1 요법에 대해 획득 내성 또는 1차 내성을 갖는 암 요법을 확립한다.
본 개시내용은 최대 40㎎/㎏의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 비-인간 영장류(NHP)에서 안전하게 용인된다는 발견, 및 사이토카인 방출 증후군의 증거 없이 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 NHP의 처리가 림프구 확장, 림프구 변연화 및 특정 투약 후 사이토카인 서명을 유도한다는 발견에 부분적으로 기반한다.
실시형태에서, 이들 결과는 항-PD-1 요법에 대한 후천성 및 1차 내성과 관련된 바이오마커를 확립한다. 따라서, 이들 바이오마커에 기반하여, 본 명세서에 개시된 실시형태에서, 환자는 환자로부터의 생물학적 샘플에서 본 명세서에 개시된 하나 이상의 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 유전자의 존재, 부재 또는 수준에 대해 샘플을 평가하는 것에 기반한 항-PD-1 요법에 의한 처리를 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 다양한 GO 기능과 관련된 하나 이상의 유전자의 관찰된 상향조절 또는 하향조절은 항-PD-1 요법에 대한 내성(획득 내성 또는 1차 내성)을 진단하기 위해 사용될 수 있다.
PD-1 저해 항체에 대한 본 명세서에 개시된 획득 내성이 발생된 종양의 단세포 RNA 서열분석은 전사적으로 과활성인 표현형의 진행성 획득을 입증하였다. 구체적으로는, 다수의 전사체는 모체 PD-1 항체 민감성 종양보다 PD-1 획득 내성 종양에서 하향조절보다는 상향조절되었다. 이 관찰은, 이론에 의해 구속되는 일 없이, 획득 내성이 특정 경로에서 유전자를 상향조절하는 종양 세포가 상향조절하지 않거나 전사 활성을 하향조절하는 해당 세포에 비해 생존 이점을 획득하는 활성 과정이라는 것을 시사한다. 따라서, 실시형태에서, PD-1 또는 PD-L1 차단제를 포함하는 관문 저해제에 대해 획득 내성을 갖는 종양은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질에 증가된 민감성을 가질 수 있되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
또한, 본 명세서에 제시된 데이터는 획득 내성 종양이 전사적으로 과활성인 표현형을 특징으로 하지만, 상향조절된 다수의 전사체는 대응하는 단백질 발현의 증가를 수반하지 않는다는 것을 입증한다. 예를 들어, CD274(PD-L1)와 관련된 유전자, 베타 2 마크로글로불린, 및 인터페론 민감성 및 항원 제시와 관련된 다른 전사체는 획득 내성 종양에서 상향조절되지만, 그러나 획득 내성 종양에서 PD-L1 또는 베타 2 마크로글로불린 단백질 발현 양의 대응하는 증가가 없다. 종합하면, 이들 결과는, 특히, 획득 내성 종양이 항-종양 면역 반응에 대해 증가된 민감성을 유도하는 다수의 중요한 유전자를 상향조절하는 시도를 하지만, 번역 후 단백질 또는 단백질들의 획득 결함이 반응을 붕괴시킨다는 것을 시사한다. 예를 들어, 증가된 PD-L1 mRNA 수준은 증가된 PD-L1 단백질 수준으로 전환되는 것으로 예상될 것이다. 따라서, 실시형태에서, 단백질 번역(예를 들어, 리보솜 복합체의 조립체 및/또는 기능, tRNA의 적절한 발현 및/또는 기능, 아미노산의 적절한 합성 및/또는 흡수 등), 번역 후 변형(예를 들어, 기능 또는 분해로부터의 보호에 중요한 탄수화물에 의한 번역 단백질의 장식), 또는 수송 메커니즘(예를 들어, 번역 후 펩타이드 가공, 신호 펩타이드 인식 및 절단, ER/골지 네트워크를 통한 수송 등)을 포함하는 하나 이상의 과정의 조절자는 PD-1 또는 PD-L1 차단제에 대한 내성이 발생되는 암 세포 집단에서 합성의 치명적 표현형을 생성하는 번역 후 과정에서 결함을 조합하는 데 도움을 줄 수 있다. 실시형태에서, 화학요법 부류는 신보강화학요법(neoadjuvant therapy)으로서 또는 보강요법(adjuvant therapy)으로서 사용될 수 있다.
키메라 단백질
일부 양상에서, 키메라 단백질은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖고, (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이되, I형 막 단백질은 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 갖는 링커이고(힌지-CH2-CH3 Fc 도메인이 인간 IgG4로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 그리고 (c)는 4-1BBL, GITRL, TL1A 및 LIGHT로부터 선택되는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 제1 및 제2 세포외 도메인 중 하나는 면역 저해 신호이고, 제1 및 제2 세포외 도메인 중 하나는 면역 자극 신호이다. 예시적인 키메라 단백질은 WO2018157162에 개시되어 있으며, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 예시적인 키메라 단백질의 분자 모델, 즉, LIGHT 삼량체의 기능성 세트를 갖는 육량체로서 존재하는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 도 10A에 나타낸다.
일부 양상에서, 키메라 단백질은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖고, (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이되, I형 막 단백질은 신호 조절 단백질 α(SIRPα)이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 갖는 링커이고(힌지-CH2-CH3 Fc 도메인이 인간 IgG4로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 그리고 (c)는 4-1BBL, CD40L, OX40L, CD30L 및 GITRL로부터 선택되는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 제1 및 제2 세포외 도메인 중 하나는 면역 저해 신호이고, 제1 및 제2 세포외 도메인 중 하나는 면역 자극 신호이다. 예시적인 키메라 단백질은 WO 2017/059168, WO 2018/157163, WO 2018/157164, WO 2018/157165, WO 2018/157162, WO 2019/246508, WO 2020/047325, WO 2020/047327, WO 2020/047328, WO 2020/047329, WO 2020/047319, WO 2020/047322, WO 2020/146393, WO 2020/176718, WO 2020/232365에 개시되며, 이들 각각의 전문은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 재조합 융합 단백질, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 세포외 도메인을 갖는 단일 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 실시형태에서, 키메라 단백질은 세포에서 단일 단위로서 번역된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 합성 링커에 의해), 예를 들어, 시험관내에서 단일 단위를 수득하도록 연결된 다중 폴리펩타이드의 재조합 단백질, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 다중 세포외 도메인을 지칭한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 하나의 폴리펩타이드로서 화학적으로 합성되거나 또는 각각의 도메인은 화학적으로 별개로 합성될 수 있고, 이어서, 조합될 수 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 일부는 번역되고, 일부는 화학적으로 합성된다.
실시형태에서, 세포외 도메인은 세포외 환경과 상호작용할 수 있는 막관통 단백질의 일부를 지칭한다. 실시형태에서, 세포외 도메인은 리간드 또는 수용체에 결합하기에 충분하고 신호를 세포에 전송하는 데 효과적인 막관통 단백질의 일부를 지칭한다. 실시형태에서, 세포외 도메인은 세포 또는 세포막 외부인 막관통 단백질의 전체 아미노산 서열이다. 실시형태에서, 세포외 도메인은 세포 또는 세포막의 외부이고 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 시험관내 리간드 결합 및/또는 세포 활성화 분석)을 이용하여 분석될 수 있는 신호 전달 및/또는 리간드 결합에 필요한 막관통 단백질의 아미노산 서열의 해당 부분이다.
실시형태에서, 면역 저해 신호는 면역 반응을 감소시키거나 제거하는 신호를 지칭한다. 예를 들어, 종양학과 관련하여, 이러한 신호는 항종양 면역을 감소시키거나 제거할 수 있다. 정상 생리 조건 하에서, 저해 신호는 자기 관용(self-tolerance)의 유지(예를 들어, 자가면역 예방)에 유용하며, 또한 면역계가 병원성 감염에 반응할 때 조직을 손상으로부터 보호하는 데 유용하다. 예를 들어, 제한 없이, 면역 저해 신호는 이러한 저해 신호가 차단될 때 세포 증식, 사이토카인 생성, 세포 사멸 활성 또는 탐식능의 증가를 검출함으로써 확인될 수 있다.
실시형태에서, 면역 자극 신호는 면역 반응을 향상시키는 신호를 지칭한다. 예를 들어, 종양학과 관련하여, 이러한 신호는 항종양 면역을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 면역 자극 신호는 증식, 사이토카인 생성, 사멸 활성 또는 백혈구의 탐식능을 직접 자극함으로써 확인될 수 있다. 특정 예는 수용체 작용제 항체를 이용하거나 또는 이러한 수용체에 대한 리간드(각각 OX40L, LIGHT, 4-1BBL, TL1A)를 암호화하는 키메라 단백질을 이용하여 TNF 슈퍼패밀리 수용체, 예컨대, OX40, LTβR, 4-1BB 또는 TNFRSF25의 직접 자극을 포함한다. 이들 수용체 중 어느 하나로부터의 자극은 개개 T 세포 서브세트의 증식 및 사이토카인 생성을 직접 자극할 수 있다. 다른 예는 이러한 면역 억제 세포의 활성을 저해하는 수용체를 통한 면역 저해 세포의 직접 자극을 포함한다. 이는, 예를 들어, 통상적인 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증식을 억제하는 해당 조절 T 세포의 능력을 감소시키는 GITR 작용제 항체 또는 GITRL 함유 키메라 단백질에 의한 CD4+FoxP3+ 조절 T 세포의 자극을 포함한다. 다른 예에서, 이는 CD40 작용제 항체 또는 CD40L을 함유하는 키메라 단백질을 이용한 항원 제시 세포 표면 상에서의 CD40의 자극을 포함하여, B7 또는 TNF 슈퍼패밀리의 분자를 비롯하여 적절한 천연 공자극 분자와 관련하여 항원을 제시하는 해당 세포의 향상된 능력을 포함하는 항원 제시 세포의 활성화를 야기한다. 다른 예에서, 이는 LIGHT 함유 키메라 단백질을 이용한 림프 또는 기질 세포의 표면 상에서의 LTBR의 자극을 포함하여, 면역 반응, 선택적으로 종양 내에서 면역 반응을 추가로 자극하도록 림프 세포의 활성화 및/또는 전염증 사이토카인 또는 케모카인의 생성을 야기한다.
막 단백질은 전형적으로 세포외 도메인, 하나 또는 일련의 막관통 도메인, 및 세포내 도메인으로 이루어진다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 막 단백질의 세포외 도메인은 가용성 또는 막 결합 수용체 또는 리간드와 상호작용하는 역할을 한다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 막관통 도메인(들)은 단백질을 혈장막에 국재화시키는 역할을 한다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 막 단백질의 세포내 도메인은 세포외 환경과의 세포내 반응을 조정하기 위해 세포 신호전달 분자와의 상호작용을 조정하는 역할을 한다(또는 반대임). 2가지 유형의 단일 패스 막 단백질, 즉, 세포외 아미노 말단 및 세포내 카복시 말단(I형)을 갖는 것 및 세포외 카복시 말단 및 세포내 아미노 말단을 갖는 것(II형)이 있다. I형과 II형 막 단백질 둘 다 수용체 또는 리간드 중 하나일 수 있다. I형 막 단백질의 경우, 단백질의 아미노 말단은 세포 밖에서 접하며, 따라서, 세포외 환경에서 다른 결합 상대(리간드 또는 수용체)와 상호작용하는 역할을 하는 기능성 도메인을 포함한다. I형 막 단백질의 경우, 단백질의 카복시 말단은 세포 밖에서 접하며, 따라서, 세포외 환경에서 다른 결합 상대(리간드 또는 수용체)와 상호작용하는 역할을 하는 기능성 도메인을 포함한다. 따라서, 단백질 중 이런 두 유형은 서로에 대해 반대 배향을 갖는다.
I형 및 II형 막 단백질의 바깥으로 접하는 도메인이 반대이기 때문에, 분자의 '바깥으로 접하는' 도메인이 또한 서로 마주보는 배향이 되도록, I형 및 II형 막 단백질의 세포외 도메인을 연결할 수 있다. 따라서 얻어진 작제물은 링커 서열을 이용하여 분자 '우'측 상에서 II형 막 단백질의 세포외 도메인에 연결된 분자 '좌'측 상에서 I형 막 단백질의 세포외 도메인으로 이루어질 것이다. 이 작제물은 이들 3개의 단편(I형 단백질의 세포외 도메인, 다음에 링커 서열, 다음에 II형 단백질의 세포외 도메인)을 벡터(플라스미드, 바이러스 또는 기타)에 클로닝함으로써 생성될 수 있되, 완전한 서열의 아미노 말단은 I형 단백질을 함유하는 분자의 '좌'측에 대응하고, 완전한 서열의 카복시 말단은 II형 단백질을 함유하는 분자의 '우'측에 대응한다. 따라서, 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 이렇게 조작된다.
실시형태에서, 세포외 도메인은 해당 수용체의 리간드에 의해 신호전달을 경쟁적으로 저해하기 위해 가용성 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있다. 실시형태에서, 세포외 도메인은 인공 신호전달을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
실시형태에서, I형 막관통 단백질의 세포외 도메인은 면역 저해 신호이다. 실시형태에서, II형 막관통 단백질의 세포외 도메인은 면역 자극 신호이다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인, 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인, 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인, 또는 이의 기능성 단편, 및 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인, 또는 이의 기능성 단편을 포함한다.
조절 T 세포의 활성화는 공자극 및 공동저해 신호에 의해 결정적으로 영향받는다. 공자극 분자의 두 주요 패밀리는 B7 및 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리를 포함한다. 이들 분자는 각각 CD28 또는 TNF 수용체 패밀리에 속하는 T 세포 상의 수용체에 결합한다. 다수의 잘 규정된 공동저해제 및 이들의 수용체는 B7 및 CD28 패밀리에 속한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은, 예를 들어, TIGIT를 포함하는 면역 저해에 관련된 하나 이상의 분자를 표적화하도록 조작될 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은, 예를 들어, TIGIT를 포함하는 면역 저해제의 세포외 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은, 예를 들어, SIRPα를 포함하는 면역 저해에 관련된 하나 이상의 분자를 표적화하도록 조작될 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은, 예를 들어 SIRPα를 포함하는 면역 저해제의 세포외 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 면역 저해 특성을 갖는 I형 막 단백질의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 면역 저해 신호의 전달을 붕괴, 차단, 감소 및/또는 저해하도록 조작된다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 LIGHT(CD258)인 면역 자극 신호의 세포외 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 동족 수용체에 대한 저해 신호 리간드의 결합(예를 들어, CD155/PVR, Nectin-2, Nectin-3 및/또는 Nectin-4에 대한 TIGIT)을 시뮬레이션하지만, 면역 세포(예를 들어, T 세포, 대식세포 또는 다른 백혈구)에 대한 저해 신호 전달을 저해한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 동족 수용체에 대한 저해 신호 리간드(예를 들어, CD47에 대한 SIRPα)의 결합을 시뮬레이션하지만, 면역 세포에 대한 저해 신호 전달(예를 들어, 대식세포, B 세포 또는 다른 식세포 또는 항원 제시 세포에 대해 나를 먹으라는 신호)을 저해한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은, 제한 없이, 종양 세포의 면역 저해 신호를 가리면서 T 세포에 대한 면역 자극을 전달할 수 있는, 면역 저해 수용체 세포외 도메인 및 면역 자극 리간드 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 T 세포 활성화의 순 결과를 갖는 신호를 전달한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 면역 저해 신호 수용체의 ECD인 면역 저해 신호를 포함하고, 이는 면역 저해 신호의 동족 리간드를 보유하는 종양 세포 상에서 작용한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 면역 자극 신호 리간드의 ECD인 면역 자극 신호를 포함하고, 이는 면역 자극 신호의 동족 수용체를 보유하는 T 세포 상에서 작용한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은, (i) 면역 저해 신호의 수용체이며, 면역 저해 신호의 동족 리간드를 보유하는 종양 세포 상에서 작용하는, 면역 저해 신호, 및 (ii) 면역 자극 신호의 리간드이고 면역 자극 신호의 동족 수용체를 보유하는 T 세포 상에서 작용하는, 면역 자극 신호를 둘 다 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 문헌[Mahoney, Nature Reviews Drug Discovery 2015:14;561-585]에 기재된 면역 조절제 중 하나 이상의 세포외 도메인을 포함하며, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 뮤린 리간드(들)/수용체(들)에 결합할 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 인간 리간드(들)/수용체(들)에 결합할 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 면역 자극 특성을 갖는 II형 막 단백질의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 면역 자극 신호의 전달을 향상, 증가 및/또는 자극하도록 조작된다.
예를 들어, 실시형태에서, I형 막관통 단백질의 세포외 도메인은 TIGIT로부터 유래된다.
TIGIT는 면역글로불린 및 면역수용체 타이로신 기반 저해 모티프(ITIM) 도메인을 함유하는 T 세포 상에서 발현된 면역수용체인 폴리오바이러스 수용체(PVR)-유사 단백질이다. 이렇게 해서, TIGIT는 T 세포와 자연 살해(NK) 세포 상에서 저해 면역 관문으로서 작용하여, 면역계의 적응 아암과 선천성 아암 둘 다를 표적화하는 기회를 제공한다.
TIGIT는 NK 세포 및 활성화된, 기억 및 조절 T 세포의 서브세트 상에서, 특히 2차 림프구 기관 내의 소포 헬퍼 T 세포 상에서 발현되고, CD155/PVR은 IFN-감마에 의해 내피세포 상에서 상향조절되며, 미숙 흉선세포, 림프절 수지상 세포 및 상피 및 뉴런 기원의 종양 세포 상에서 고도로 발현된다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, TIGIT ECD 포함)은 (예를 들어, 면역 시냅스와 관련하여) 바로 위에 기재된 임의의 세포를 조절한다.
TIGIT는 CD155/PVR, Nectin-2, Nectin-3 및 Nectin-4에 결합한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, TIGIT ECD 포함)은 CD155/PVR에 대한 TIGIT의 결합을 조절한다(예를 들어, 결합 또는 신호 전달을 감소시키거나 붕괴시킨다). 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, TIGIT ECD 포함)은 Nectin-2에 대한 TIGIT의 결합을 조절한다(예를 들어, 결합 또는 신호 전달을 감소시키거나 붕괴시킨다). 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, TIGIT ECD 포함)은 Nectin-3에 대한 TIGIT의 결합을 조절한다(예를 들어, 결합 또는 신호 전달을 감소시키거나 붕괴시킨다). 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, TIGIT ECD 포함)은 Nectin-4에 대한 TIGIT의 결합을 조절한다(예를 들어, 결합 또는 신호 전달을 감소시키거나 붕괴시킨다).
실시형태에서, 키메라 단백질은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖고, (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며(힌지-CH2-CH3 Fc 도메인이 인간 IgG4로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL, GITRL, TL1A 및 LIGHT로부터 선택되며, 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 결합 링커를 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 면역 저해제 TIGIT의 세포외 도메인을 포함하고, 다음과 같은 면역 자극제와 짝지어진다: TIGIT/OX-40L; TIGIT/4-1BBL, TIGIT/LIGHT; TIGIT/GITRL; TIGIT/CD70; TIGIT/CD30L; TIGIT/CD40L; TIGIT/CD137L; TIGIT/TL1A; 및 TIGIT/OX40L. 실시형태에서, 키메라 단백질은 TIGIT-Fc-4-1BBL, TIGIT-Fc-GITRL, TIGIT-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-OX40L 또는 TIGIT-Fc-TL1A 키메라 단백질이며, 이때 Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다.
예를 들어, 실시형태에서, II형 막관통 단백질의 세포외 도메인은 LIGHT로부터 유래된다.
LIGHT(HVEM-L, TNFSF14 또는 CD258), 림프독소와 상동성이며, 유도성 특성을 가지며, 헤르페스 바이러스 침투 매개체(HVEM)/종양 괴사 인자 (TNF)-관련 2에 대해 단순포진 바이러스 당 단백질 D와 경쟁할 수 있는 독립체는 TNF 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이는 29-kDa II형 막관통 단백질이고, 활성화된 T 세포뿐만 아니라 DC 상의 동형삼량체로서 발현되며, 3개의 수용체, 즉, HVEM, LT-β 수용체(LTβR, TNFRSF3) 및 미끼 수용체 3(DcR3)을 갖는다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 별도의 세포 발현 패턴을 갖는 3개의 수용체는 LIGHT와 상호작용하는 것으로 알려졌다: 활성화된 DC, T 및 B 세포, NK 세포, 단핵구 및 내피세포 상에서 검출된 HVEM(TNFRSF14, CD270); 소포 DC 및 기질 세포 상에서 발견되고 LIGHT에 결합한 LTβR; 및 다양한 암 세포, 예컨대, 다발성 골수종 및 미만성 거대 B-세포 림프종 상에서 검출된 가용성 독립체 미끼 수용체 3(DcR3). 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 이들 3개의 수용체 중 하나 이상과 LIGHT의 상호작용을 붕괴시키거나 감소시킬 수 있다.
LIGHT는 LTBR, 및 잠재적으로 HVEM뿐만 아니라 DcR3에 결합한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, LIGHT ECD 포함)은 LTBR에 대한 LIGHT의 결합을 조절한다(예를 들어, 결합 또는 신호 전달을 증가시키거나 촉진시킨다). LTBR은 내장, 림프구, 및 기타 간질, 상피 및 골수성 세포에 의해 발현되지만, 림프구에 의해서는 발현되지 않는다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, LIGHT ECD 포함)은 내장, 림프구, 및 기타 간질, 상피 및 골수성 세포 중 하나 이상을 조절한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, LIGHT ECD 포함)은 HVEM에 대한 LIGHT의 결합을 조절한다(예를 들어, 결합 또는 신호 전달을 증가시키거나 촉진시킨다). 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, LIGHT ECD 포함)은 DcR3에 대한 LIGHT의 결합을 조절한다(예를 들어, 결합 또는 신호 전달을 증가시키거나 촉진시킨다).
실시형태에서, 4-1BBL의 일부는 4-1BBL의 세포외 도메인의 일부이다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 면역 자극 분자 4-1BB 리간드(4-1BBL)의 도메인, 예를 들어, 세포외 도메인을 추가로 포함한다. 4-1BBL은 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리에 속하는 II형 막관통 단백질이다.
실시형태에서, 제2 도메인은 4-1BBL의 일부이다. 실시형태에서, 제2 도메인은 4-1BBL의 실질적으로 모든 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 제2 도메인은 4-1BB(분화 클러스터 137(CD137) 또는 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 9(TNFSF9)로도 알려짐)에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 4-1BB에 대한 결합은 면역 자극 신호를 증가시키거나 활성화시킨다. 실시형태에서, 4-1BB에 대한 결합은 CD4 및/또는 CD8 T-세포를 공자극한다. 4-1BBL은 분화 클러스터 137 리간드(CD137L)로도 알려진다. 따라서, 본 개시내용 전체적으로, 4-1BBL 및 CD137L은 동의어이며, 단독으로 언급될 때 그리고/또는 키메라 단백질과 관련하여 언급될 때, 이에 따라, 예를 들어, SIRPα-Fc-4-1BBL은 SIRPα-Fc-CD137L과 동일한 키메라 단백질이다.
4-1BB 리간드(4-1BBL)는 활성화된 T 림프구 및 항원-제시 세포(APC) 상의 4-1BB 수용체에 결합한다. 4-1BB 신호전달은 4-1BB+ 림프구 및 4-1BBL+ 항원-제시 세포에 의해 형성된 면역 시냅스에 따르는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 4-1BBL 결합은 B 세포 증식 및 면역글로불린 생성을 유도한다. T 세포는 주요 4-1BB-발현 세포이고, 이들의 활성화를 위해 대식세포 및 또는 APC 상에서 4-1BBL에 관여할 수 있다. CD8+ T 세포는 4-1BB 신호전달을 통해 IL-13뿐만 아니라 IFN-γ를 방출한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 인간 4-1BBL의 도메인, 예를 들어, 세포외 도메인을 포함한다. 인간 4-1BBL은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
세포외 도메인 인간 4-1BBL의 아미노산 서열(서열번호 102의 아미노산 50 내지 254)은 다음과 같다:
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 인간 4-1BBL의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 4-1BBL의 세포외 도메인, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 4-1BBL의 세포외 도메인의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 상기 제공한 바와 같은 4-1BBL의 세포외 도메인의 서열, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편을 포함할 수 있다.
4-1BBL 유도체는 문헌[Won et al., "The structure of the trimer of human 4-1BB ligand is unique among members of the tumor necrosis factor superfamily." J. Biol. Chem. 285: 9202-9210(2010); Gilbreth et al., "Crystal structure of the human 4-1BB/4-1BBL complex." J Biol Chem 293: 9880-9891(2018); 및 Bitra et al., "Crystal structures of the human 4-1BB receptor bound to its ligand 4-1BBL reveal covalent receptor dimerization as a potential signaling amplifier." J Biol Chem 293: 9958-9969 (2018)]에 의해 기재된 것을 포함하는 이용 가능한 구조 데이터로부터 작제될 수 있다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 신호 펩타이드(예를 들어, 서열번호 59에 제공된 바와 같음)가 대안의 신호 펩타이드로 대체된 4-1BBL의 변이체 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 중국 햄스터 난소(CHO) 또는 HEK 세포와 같은 단백질 생성 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 cDNA로부터 발현된 4-1BBL의 변이체 세포외 도메인을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 4-1BBL의 세포외 도메인은 세포외 환경과 상호작용할 수 있는 단백질의 일부를 지칭한다. 실시형태에서, 4-1BBL의 세포외 도메인은 세포 또는 세포막 외부인 단백질의 전체 아미노산 서열이다. 실시형태에서, 4-1BBL의 세포외 도메인은 세포 또는 세포막의 외부이고 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분석될 수 있는 신호 전달 및/또는 리간드 결합에 필요한 단백질의 아미노산 서열의 해당 부분이다.
실시형태에서, 4-1BBL의 세포외 도메인은 4-1BB 수용체에 결합할 수 있는 단백질 일부를 지칭한다. 다른 TNF 슈퍼패밀리 구성원과 같이, 막-결합 4-1BBL은 동형삼량체로서 존재한다. 4-1BBL은 항원 제시 세포 상에서 우세하게 발현되는 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원인 4-1BB에 결합한다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 (예를 들어, 표면 플라스몬 공명 또는 생물층 간섭계로 측정할 때) 약 1μM, 약 900nM, 약 800nM, 약 700nM, 약 600nM, 약 550nM, 약 530nM, 약 500nM, 약 400nM, 약 300nM, 약 200nM, 약 100nM, 약 90nM, 약 80nM, 약 70nM, 약 60nM, 약 55nM, 약 50nM, 약 45nM, 약 40nM, 약 35nM, 약 30nM, 약 25nM, 약 20nM, 약 15nM, 약 10nM, 또는 약 5nM, 또는 약 1nM 미만의 KD로 인간 4-1BB에 결합한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 (예를 들어, 표면 플라스몬 공명 또는 생물층 간섭계로 측정할 때) 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM 약 55pM 약 50pM 약 45pM, 약 40pM, 약 35pM, 약 30pM, 약 25pM, 약 20pM, 약 15pM, 또는 약 10pM, 또는 약 1pM 미만의 KD로 인간 4-1BB에 결합한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 300pM 내지 약 700pM의 KD로 인간 4-1BB에 결합한다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 제1 도메인, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 제2 도메인, 및 (c) 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 링커.
예를 들어, 실시형태에서, I형 막관통 단백질의 세포외 도메인은 신호 조절 단백질 α(SIRPα)로부터 유래된다.
신호 조절 단백질 α(SIRPα)는 광범위하게 발현되는 막관통 단백질 CD47("나를 먹지 말라"는 신호로도 불림)의 저해 수용체이다. SIRPα는 대식세포 및 다른 골수성 세포에 의해 주로 발현되는 SIRP 패밀리로부터의 조절 막 당단백질이다.
SIRPα와 CD47 사이의 상호작용은 식세포 시냅스의 서브막(submembrane) 조립체 부위에서 미오신 축적을 저해하여, 식세포작용의 차단을 초래하는 타이로신 포스파타제의 활성화를 야기한다. 따라서, CD47은 건강한 자기-세포에 대해 "나를 먹지 말라는 신호"로서 작용하며; 따라서, CD47의 손실은 노화되거나 손상된 세포의 식세포작용을 야기한다. CD47에 의해 제공된 이런 항-식세포작용 신호의 이점을 취하여, 다수 유형의 종양은 이런 단백질을 과발현시킴으로써, 대식세포에 의한 식세포작용을 피하고, 암 세포의 생존을 보조한다. SIRPα는 CD47에 결합한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, SIRPα ECD 포함)은 CD47에 대한 SIRPα의 결합을 조절한다(예를 들어, 결합 또는 신호 전달을 감소시키거나 붕괴시킨다).
실시형태에서, 본 키메라 단백질(예를 들어, SIRPα ECD 포함)은 (예를 들어, 면역 시냅스와 관련하여) 바로 위에 기재된 임의의 세포를 조절한다.
실시형태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 키메라 단백질은 다음의 아미노산 서열을 포함하는 인간 SIRPα(CD172a)의 세포외 도메인을 포함한다:
실시형태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 키메라 단백질은 SIRPα(CD172a)의 세포외 도메인의 변이체를 포함한다. 예로서, 변이체는 서열번호 7과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
실시형태에서, SIRPα(CD172a)의 세포외 도메인의 변이체는 서열번호 7과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다.
당업자는, 예를 들어, 문헌[LEE, et al., "Novel Structural Determinants of SIRPα that Mediate Binding of CD47," The Journal of Immunology, 179, 7741-7750, 2007 및 HATHERLEY, et al., "The Structure of the Macrophage Signal Regulatory Protein a (SIRPα) Inhibitory Receptor Reveals a Binding Face Reminiscent of That Used by T Cell Receptors," The Journal Of Biological Chemistry, Vol. 282, No. 19, pp. 14567-14575, 2007]을 참고함으로써 SIRPα(CD172a)의 공지된 아미노산 서열의 변이체를 선택할 수 있으며, 이들 참고문헌 각각은 전문이 참조에 의해 원용된다.
실시형태에서, 이종성 키메라 단백질은 SIRPα(CD172a)의 실질적으로 전체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인, 및/또는 4-1BBL의 실질적으로 전체의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 SIRPα(CD172a)의 실질적으로 전체의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 제2 도메인은 4-1BBL의 실질적으로 전체의 세포외 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖고, (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 SIRPα이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며(힌지-CH2-CH3 Fc 도메인이 인간 IgG4로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL, GITRL, TL1A 및 LIGHT로부터 선택되며, 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 결합 링커를 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 면역 저해제 SIRPα의 세포외 도메인을 포함하고, 다음과 같은 면역 자극제와 짝지어진다: CD172a(SIRPα)/OX-40L; CD172a(SIRPα)/4-1BBL, CD172a(SIRPα)/LIGHT; CD172a(SIRPα)/GITRL; CD172a(SIRPα)/CD70; CD172a(SIRPα)/CD30L; CD172a(SIRPα)/CD40L; CD172a(SIRPα)/CD137L; CD172a(SIRPα)/TL1A; 및 CD172a(SIRPα)/OX40L. 실시형태에서, 키메라 단백질은 SIRPα-Fc-4-1BBL, SIRPα-Fc-GITRL, SIRPα-Fc-LIGHT, SIRPα-Fc-OX40L 또는 SIRPα-Fc-TL1A이며, 이때 Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖고, (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 PD-1, CD172a(SIRPα) 및 TIGIT로부터 선택되고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며(힌지-CH2-CH3 Fc 도메인이 인간 IgG4로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이며, 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 결합 링커를 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖고, (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 CD172a(SIRPα)로부터 선택되고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며(힌지-CH2-CH3 Fc 도메인이 인간 IgG4로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이며, 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 결합 링커를 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 면역 자극제 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하고, 다음과 같은 면역 저해제와 짝지어진다: PD-1/LIGHT, CD172a(SIRPα)/LIGHT 및 TIGIT/LIGHT. 실시형태에서, 키메라 단백질은 PD-1-Fc-LIGHT, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이며, 이때, Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 면역 자극제 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하고, 다음과 같은 면역 저해제와 짝지어진다: CD172a(SIRPα)/OX-40L; CD172a(SIRPα)/4-1BBL, CD172a(SIRPα)/LIGHT; CD172a(SIRPα)/GITRL; CD172a(SIRPα)/CD70; CD172a(SIRPα)/CD30L; CD172a(SIRPα)/CD40L; CD172a(SIRPα)/CD137L; CD172a(SIRPα)/TL1A; 및 CD172a(SIRPα)/OX40L. 실시형태에서, 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L, CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT 및 CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L이며, 이때, Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 면역 저해제의 세포외 도메인을 포함하고, 면역 자극제와 짝지어진다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 1nM 내지 약 5nM, 예를 들어, 약 1nM, 약 1.5nM, 약 2nM, 약 2.5nM, 약 3nM, 약 3.5nM, 약 4nM, 약 4.5nM, 또는 약 5nM의 KD로 동족 수용체 또는 리간드에 결합한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 5nM 내지 약 15nM, 예를 들어, 약 5nM, 약 5.5nM, 약 6nM, 약 6.5nM, 약 7nM, 약 7.5nM, 약 8nM, 약 8.5nM, 약 9nM, 약 9.5nM, 약 10nM, 약 10.5nM, 약 11nM, 약 11.5nM, 약 12nM, 약 12.5nM, 약 13nM, 약 13.5nM, 약 14nM, 약 14.5nM, 또는 약 15nM의 KD로 동족 수용체 또는 리간드에 결합한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 향상된 안정성 및 단백질 반감기를 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 고친화도로 FcRn에 결합한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 1nM 내지 약 80nM의 KD로 FcRn에 결합할 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질은 약 1nM, 약 2nM, 약 3nM, 약 4nM, 약 5nM, 약 6nM, 약 7nM, 약 8nM, 약 9nM, 약 10nM, 약 15nM, 약 20nM, 약 25nM, 약 30nM, 약 35nM, 약 40nM, 약 45nM, 약 50nM, 약 55nM, 약 60nM, 약 65nM, 약 70nM, 약 71nM, 약 72nM, 약 73nM, 약 74nM, 약 75nM, 약 76nM, 약 77nM, 약 78nM, 약 79nM, 또는 약 80nM의 KD로 FcRn에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 9nM의 KD로 FcRn에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 효과기 기능을 갖는 다른 Fc 수용체(즉, FcRn 이외)에 실질적으로 결합하지 않는다.
실시형태에서, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, PD-1-Fc-LIGHT, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 중 하나 이상을 대상체에 투여함으로써 암 및/또는 염증 질환(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 것 중 어느 하나)을 치료하는 방법이 제공되며, 이때, Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다. 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 재발을 예방할 수 있는 기억 반응을 생성한다. 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 느린 오프 속도(Kd 또는 Koff)로 이들 각각의 결합 상대에 대한 세포외 도메인 구성성분의 결합으로 인해, PD-1-Fc-LIGHT, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 중 하나 이상의 지속된 치료 효과를 포함하여, 선택적으로 지속된 음성 신호 마스킹 효과 및/또는 더 긴 양성 신호 효과를 제공하고, 예를 들어, 항-종양 효과를 위해 효과기 세포가 적절하게 자극되게 한다. 실시형태에서, CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L, CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT 및 CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L 키메라 단백질 중 하나 이상을 대상체에 투여함으로써 암 및/또는 염증 질환(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 것 중 어느 하나)을 치료하는 방법이 제공되며, 이때, Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다.
실시형태에서, CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L, CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT 및 CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L 키메라 단백질 중 하나 이상을 대상체에 투여함으로써 암 또는 염증 질환(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 것 중 어느 하나)을 치료하는 방법이 제공되고, 이들 중 하나 이상을 투여함으로써 암 및/또는 염증 질환(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 것 중 어느 하나)을 치료하는 방법이 제공되고, 이때 Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고, 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타내며, 키메라 단백질에서, Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다. 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 재발을 예방할 수 있는 기억 반응을 생성한다. 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 느린 오프 속도(Kd 또는 Koff)로 이들 각각의 결합 상대에 대한 세포외 도메인 구성성분의 결합으로 인해, TIGIT-Fc-4-1BBL, TIGIT-Fc-GITRL, TIGIT-Fc-TL1A 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 중 하나 이상의 지속된 치료 효과를 포함하여, 선택적으로 지속된 음성 신호 마스킹 효과 및/또는 더 긴 양성 신호 효과를 제공하고, 예를 들어, 항-종양 효과를 위해 효과기 세포가 적절하게 자극되게 한다.
실시형태에서, CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L, CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT 및 CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L 키메라 단백질 중 하나 이상을 대상체에 투여함으로써 암 또는 염증 질환(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 것 중 어느 하나)을 치료하는 방법이 제공되고, 이들 중 하나 이상을 투여함으로써 암 및/또는 염증 질환(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 것 중 어느 하나)을 치료하는 방법이 제공되고, 이때 Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고, 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타내며, 키메라 단백질에서, Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다. 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 재발을 예방할 수 있는 기억 반응을 생성한다. 실시형태에서, 상기 방법은 실시형태 중 하나 이상의 지속된 치료 효과를 포함하며, CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L, CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT 및 CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L 키메라 단백질 중 하나 이상을 대상체에게 투여함으로써, 암 및/또는 염증 질환(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 것 중 어느 하나)을 치료하는 방법이 제공되며, 이때 Fc는, 예를 들어, 느린 오프 속도(Kd 또는 Koff)로 이들 각각의 결합 상대에 대한 세포외 도메인 구성성분의 결합으로 인해, 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하여, 선택적으로 지속된 음성 신호 마스킹 효과 및/또는 더 긴 양성 신호 효과를 제공하고, 예를 들어, 효과기 세포가 항-종양 효과를 위해 적절하게 자극되게 하는 링커를 나타낸다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 본 명세서에 기재된 세포외 도메인의 변이체, 예를 들어, 임의의 개시된 세포외 도메인, 예를 들어, 인간 세포외 도메인의 공지된 아미노산 또는 핵산 서열, 예를 들어, 서열번호 2, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 27, 29, 31, 37, 41 또는 103 중 하나 이상과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 LIGHT의 세포외 도메인(서열번호 2)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 PD-1의 세포외 도메인(서열번호 4)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 TIGIT의 세포외 도메인(서열번호 10)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(서열번호 7)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 4-1BBL의 세포외 도메인(서열번호 13)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(서열번호 7) 및 4-1BBL의 세포외 도메인(서열번호 13)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 LIGHT의 세포외 도메인(서열번호 2) 및 PD-1의 세포외 도메인(서열번호 4)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 LIGHT의 세포외 도메인(서열번호 2) 및 TIGIT의 세포외 도메인(서열번호 10)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 LIGHT의 세포외 도메인(서열번호 2) 및 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(서열번호 7)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 IgG4 항체 서열(서열번호 46, 47 또는 48)로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 IgG4 항체 서열(서열번호 46, 47 또는 48)로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하고, 이 서열은 SKYGPPCPSCP(서열번호 49), SKYGPPCPPCP(서열번호 50), IEGRMD 서열번호 52로부터 선택된 적어도 하나의 결합 링커에 측접된다(선택적으로 SKYGPPCPSCP(서열번호 49) 또는 SKYGPPCPPCP(서열번호 50)는 N 말단이고, IEGRMD 서열번호 52 중 하나는 C 말단이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 IgG1 항체 서열(서열번호 112, 113)로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 IgG1 항체 서열(서열번호 112, 113)로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하고, 이 서열은 SKYGPPCPSCP(서열번호 49), SKYGPPCPPCP(서열번호 50), IEGRMD 서열번호 52로부터 선택된 적어도 하나의 결합 링커에 측접된다(선택적으로 SKYGPPCPSCP(서열번호 49) 또는 SKYGPPCPPCP(서열번호 50)는 N 말단이고, IEGRMD 서열번호 52 중 하나는 C 말단이다).
실시형태에서, 키메라 단백질은 모듈 링커를 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 LIGHT의 세포외 도메인 및 PD-1의 세포외 도메인을 포함한다(이 PD-1-Fc-LIGHT 키메라는 서열번호 5이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 LIGHT의 세포외 도메인 및 TIGIT의 세포외 도메인을 포함한다(이 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라는 서열번호 11이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 TIGIT의 세포외 도메인 및 LIGHT의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라는 다음의 서열을 갖는다(인간 TIGIT의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄로 표시되며, 변이체 IgG4 CH2-CH3-Fc 도메인은 이탤릭체 폰트로 나타내고, 결합 링커는 볼드체 폰트로 나타내며, 인간 LIGHT의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄, 이탤릭체 폰트로 표시된다):
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG1 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 TIGIT의 세포외 도메인 및 LIGHT의 세포외 도메인을 포함한다. 이 단백질은 본 명세서에서 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 키메라 단백질로도 지칭된다. 실시형태에서, 인간 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 키메라는 다음의 서열을 갖는다(인간 TIGIT의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄로 표시되고, IgG1로부터 유래된 CH2-CH3-Fc 도메인은 이탤릭체 폰트로 나타내고, 결합 링커는 볼드체 폰트로 나타내며, 인간 LIGHT의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄, 이탤릭체 폰트로 표시된다):
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG1 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 TIGIT의 세포외 도메인 및 LIGHT의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라는 다음의 서열을 갖는다(인간 TIGIT의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄로 표시되고, 변이체 IgG1 CH2-CH3-Fc 도메인(IgG1-LALA)은 이탤릭체 폰트로 나타내며, 두서너 개의 돌연변이는 볼드체로 나타내고, 결합 링커는 볼드체로 나타내고, 인간 LIGHT의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄, 이탤릭체로 나타낸다):
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 마우스 IgG1 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 마우스 TIGIT의 세포외 도메인 및 마우스 LIGHT의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라는 다음의 서열을 갖는다(마우스 TIGIT의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄로 표시되고, 변이체 IgG1 CH2-CH3-Fc 도메인은 이탤릭체 폰트로 나타내며, 두서너 개의 돌연변이는 볼드체로 나타내고, 결합 링커는 볼드체로 나타내고, 마우스 LIGHT의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄, 이탤릭체로 나타낸다):
실시형태에서, 본 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 본 명세서에 기재된 변이체일 수 있고, 예를 들어, 본 키메라 단백질은 서열번호 11, 109 및 110 중 하나의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 SIRPα의 세포외 도메인 및 4-1BBL의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라는 다음의 서열을 갖는다(SIRPα의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄로 표시되며, 변이체 IgG4 CH2-CH3-Fc 도메인은 이탤릭체 폰트로 나타내고, 결합 링커는 볼드체 폰트로 나타내며, 4-1BBL의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄, 이탤릭체 폰트로 표시된다):
실시형태에서, 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라는 다음의 서열을 갖는다(SIRPα의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄로 표시되며, 마우스 IgG1 CH2-CH3-Fc 도메인은 이탤릭체 폰트로 나타내고, 결합 링커는 볼드체 폰트로 나타내며, 4-1BBL의 세포외 도메인(ECD)은 밑줄, 이탤릭체 폰트로 표시된다):
실시형태에서, 본 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 본 명세서에 기재된 변이체일 수 있고, 예를 들어, 본 키메라 단백질은 서열번호 103의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 LIGHT의 세포외 도메인 및 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인을 포함한다(이 CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT 키메라는 서열번호 8이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 TIGIT의 세포외 도메인(서열번호 10)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 4-1BBL의 세포외 도메인(서열번호 13)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 GITRL의 세포외 도메인(서열번호 16)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 TL1A의 세포외 도메인(서열번호 19)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 LIGHT의 세포외 도메인(서열번호 2)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 OX40L의 세포외 도메인(서열번호 22)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 TIGIT의 세포외 도메인(서열번호 10) 및 4-1BBL의 세포외 도메인(서열번호 13)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 TIGIT의 세포외 도메인(서열번호 10) 및 GITRL의 세포외 도메인(서열번호 16)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 TIGIT의 세포외 도메인(서열번호 10) 및 TL1A의 세포외 도메인(서열번호 19)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 TIGIT의 세포외 도메인(서열번호 10) 및 LIGHT의 세포외 도메인(서열번호 2)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 TIGIT의 세포외 도메인(서열번호 10) 및 OX40L의 세포외 도메인(서열번호 22)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(서열번호 7) 및 4-1BBL의 세포외 도메인(서열번호 13)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(서열번호 7) 및 GITRL의 세포외 도메인(서열번호 16)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(서열번호 7) 및 TL1A의 세포외 도메인(서열번호 19)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(서열번호 7) 및 LIGHT의 세포외 도메인(서열번호 2)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(서열번호 7) 및 OX40L의 세포외 도메인(서열번호 22)을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 IgG4 항체 서열(서열번호 46, 47 또는 48)로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 IgG1 항체 서열(서열번호 112 또는 113)로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 IgG4 항체 서열(서열번호 46, 47 또는 48)로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하고, 이 서열은 SKYGPPCPSCP(서열번호 49), SKYGPPCPPCP(서열번호 50), IEGRMD 서열번호 52로부터 선택된 적어도 하나의 결합 링커에 측접된다(선택적으로 SKYGPPCPSCP(서열번호 49) 또는 SKYGPPCPPCP(서열번호 50)는 N 말단이고, IEGRMD 서열번호 52 중 하나는 C 말단이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 IgG1 항체 서열(서열번호 112 또는 113)로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하고, 이 서열은 SKYGPPCPSCP(서열번호 49), SKYGPPCPPCP(서열번호 50), IEGRMD 서열번호 52로부터 선택된 적어도 하나의 결합 링커에 측접된다(선택적으로 SKYGPPCPSCP(서열번호 49) 또는 SKYGPPCPPCP(서열번호 50)는 N 말단이고, IEGRMD 서열번호 52 중 하나는 C 말단이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 TIGIT의 세포외 도메인 및 4-1BBL의 세포외 도메인을 포함한다(이 TIGIT-Fc-4-1BBL 키메라는 서열번호 14이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 TIGIT의 세포외 도메인 및 GITRL의 세포외 도메인을 포함한다(이 TIGIT-Fc-GITRL 키메라는 서열번호 17이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 TIGIT의 세포외 도메인 및 TL1A의 세포외 도메인을 포함한다(이 TIGIT-Fc-TL1A 키메라는 서열번호 20이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 TIGIT의 세포외 도메인 및 LIGHT의 세포외 도메인을 포함한다(이 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라는 서열번호 11이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 TIGIT의 세포외 도메인 및 OX40L의 세포외 도메인을 포함한다(이 TIGIT-Fc-OX40L 키메라는 서열번호 23이다).
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 링커로서 인간 IgG4 항체 서열로부터의 힌지-CH2-CH3 도메인을 이용하여 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 4-1BBL의 세포외 도메인을 포함한다(이 CD172a(SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라는 서열번호 103이다).
실시형태에서, 키메라 단백질은 본 명세서에서 확인된 다른 서열로부터의 세포외 도메인과 조합된 본 명세서에서 확인된 서열로부터의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, TIGIT-Fc-TL1A 키메라 단백질의 서열은 서열번호 10에서 위에 개시된 바와 같은 TIGIT의 세포외 도메인 및 서열번호 19에서 위에 개시된 바와 같은 TL1A의 세포외 도메인을 포함할 수 있었다.
실시형태에서, (예를 들어, 암을 치료하고/하거나 염증 질환을 치료함에 있어서) 추가적인 키메라 단백질 및 추가적인 키메라 단백질을 이용하는 방법: TIGIT-Fc-4-1BBL, TIGIT-Fc-CD30L, TIGIT-Fc-FasL, TIGIT-Fc-GITRL, TIGIT-Fc-TL1A 및 TIGIT-Fc-TRAIL. 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL, TL1A 및 TRAIL 각각에 대한 아미노산 서열은 서열번호 12, 26, 30, 15, 18 및 40을 포함한다. 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL, TL1A 및 TRAIL 각각의 세포외 도메인에 대한 아미노산 서열은 서열번호 13, 27, 31, 16, 19 및 41이다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 본 명세서에 기재된 변이체일 수 있고, 예를 들어, 본 키메라 단백질은 본 키메라 단백질의 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 42, 43, 44, 45 또는 103 중 하나 이상과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%) 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 본 명세서에 기재된 임의의 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 치환, 삽입, 결실 및 절단으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
실시형태에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이고, 보존적 및/또는 비보존적 치환을 포함할 수 있다.
"보존적 치환"은, 예를 들어, 관련된 아미노산 잔기의 극성, 전하, 용량, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양극성 특성의 유사성에 기반하여 이루어질 수 있다. 20개의 천연 유래 아미노산은 다음의 6개의 표준 아미노산 그룹으로 그룹화될 수 있다: (1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
본 명세서에서 사용되는 "보존적 치환"은 아미노산을 위에 나타낸 6개의 표준 아미노산 그룹의 동일 그룹 내에 열거된 다른 아미노산으로 교환하는 것으로 정의된다. 예를 들어, Asp의 Glu에 의한 교환은 이렇게 변형된 폴리펩타이드에서 하나의 음전하를 보유한다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 붕괴시키는 이들의 능력에 기반하여 서로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "비-보존적 치환"은 아미노산을 위에 나타낸 6개의 표준 아미노산 그룹 (1) 내지 (6)의 상이한 그룹에서 열거된 다른 아미노산으로 교환하는 것으로 정의된다.
실시형태에서, 치환은 또한 비고전적 아미노산(예를 들어, 일반적으로, 셀레노시스테인, 피롤라이신, N-폼일메티오닌 β-알라닌, GABA 및 δ-아미노레불린산, 4-아미노벤조산(PABA), 공통 아미노산의 D-이성질체, 2,4-다이아미노뷰티르산, α-아미노 아이소뷰티르산, 4-아미노뷰티르산, Abu, 2-아미노 뷰티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 아이소뷰티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코스메(sarcosme), 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-뷰틸글리신, t-뷰틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예컨대, β 메틸 아미노산, C α-메틸 아미노산, N α-메틸 아미노산 및 아미노산 유사체)를 포함할 수 있다.
돌연변이는 또한 코돈 축퇴를 고려하는 것을 포함하여, 유전자 암호를 참조로 하여 키메라 단백질의 뉴클레오타이드 서열로 이루어질 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 링커를 포함한다. 실시형태에서, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 이황화 결합을 형성할 수 있는 이러한 적어도 하나의 시스테인 잔기는 이론에 의해 구속되는 일 없이, 키메라 단백질의 적절한 다량체 상태를 유지하고 효율적인 생성을 가능하게 하는 역할을 한다.
실시형태에서, 링커는 천연 유래 다중 도메인 단백질로부터 유래될 수 있거나, 예를 들어, 문헌[Chichili et al., (2013), Protein Sci. 22(2):153-167, Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369]에 기재된 바와 같은 경험적 링커이고, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 실시형태에서, 링커는 문헌[Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369 및 Crasto et. al., (2000), Protein Eng. 13(5):309-312]에 기재된 것과 같은 링커 설계 데이터베이스 및 컴퓨터 프로그램을 이용하여 설계될 수 있으며, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
실시형태에서, 링커는 PEG와 같은 합성 링커이다.
실시형태에서, 링커는 폴리펩타이드이다. 실시형태에서, 링커는 약 500개의 아미노산 길이, 약 450개의 아미노산 길이, 약 400개의 아미노산 길이, 약 350개의 아미노산 길이, 약 300개의 아미노산 길이, 약 250개의 아미노산 길이, 약 200개의 아미노산 길이, 약 150개의 아미노산 길이, 또는 약 100개 미만의 아미노산 길이이다. 예를 들어, 링커는 약 100, 약 95, 약 90, 약 85, 약 80, 약 75, 약 70, 약 65, 약 60, 약 55, 약 50, 약 45, 약 40, 약 35, 약 30, 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 12, 약 11, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 또는 약 2개 미만의 아미노산 길이일 수 있다. 실시형태에서, 링커는 가요성이다. 다른 실시형태에서, 링커는 강성이다.
실시형태에서, 링커는 글리신 및 세린 잔기(예를 들어, 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%, 또는 약 100% 글리신 및 세린)로 실질적으로 이루어진다.
실시형태에서, 링커는 항체의(예를 들어, IgG, IgA, IgD 및 IgE(하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2) 포함)의) 힌지 영역이다. IgG, IgA, IgD 및 IgE 부류 항체에서 발견된 힌지 영역은 가요성 스페이서로서 작용하여, Fab 부분은 공간에서 자유롭게 움직이게 된다. 불변 영역과 대조적으로, 힌지 도메인은 구조적으로 다양하여, 면역글로불린 부류와 하위부류에서 서열과 길이가 둘 다 변화된다. 예를 들어, 힌지 영역의 길이 및 가요성은 IgG 하위부류에서 달라진다. IgG1의 힌지 영역은 아미노산 216 내지 231을 포괄하며, 이것이 자유롭게 가요성이기 때문에, Fab 단편은 이들의 대칭 축에 관해 회전할 수 있고, 2개의 중쇄간 다이설파이드 브리지 중 첫 번째에 집중된 구체 내에서 움직인다. IgG2는 12개의 아미노산 잔기 및 4개의 다이설파이드 브리지를 갖는 IgG1보다 더 짧은 힌지를 갖는다. IgG2의 힌지 영역은 글리신 잔기가 없으며, 상대적으로 짧고, 여분의 중쇄간 다이설파이드 브리지에 의해 안정화된 강성의 폴리-프롤린 나선을 함유한다. 이런 특성들은 IgG2 분자의 가요성을 제한한다. IgG3은 62개의 아미노산(21개의 프롤린 및 11개의 시스테인 포함)을 함유하는 고유한 연장된 힌지 영역(길이가 IgG1 힌지의 약 4배)에 의해 다른 하위 부류와 다르며, 비가요성의 폴리-프롤린 이중 나선을 형성한다. IgG3에서, Fab 단편은 Fc 단편으로부터 상대적으로 멀리 떨어져서, 분자에 더 큰 가요성을 제공한다. IgG3의 신장된 힌지는 또한 다른 하위부류에 비해 더 큰 분자량을 초래한다. IgG4의 힌지 영역은 IgG1보다 더 짧으며, 이의 가요성은 IgG1과 IgG2 사이의 중간이다. 힌지 영역의 가요성은 알려진 바에 의하면 IgG3>IgG1>IgG4>IgG2의 순서로 감소된다. 실시형태에서, 링커는 인간 IgG4로부터 유래될 수 있고, 이량체화(S228P 포함) 또는 FcRn 결합을 향상시키기 위해 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
결정학적 연구에 따르면, 면역글로불린 힌지 영역은 추가로 3개의 영역: 상부 힌지 영역, 코어 영역 및 하부 힌지 영역으로 다시 나누어질 수 있다. 문헌[Shin et al., 1992 Immunological Reviews 130:87] 참조. 상부 힌지 영역은 CH1의 카복실 단부에서 움직임을 제한하는 힌지의 제1 잔기까지, 일반적으로 2개의 중쇄 사이에 쇄간 이황화결합을 형성하는 제1 시스테인 잔기까지 아미노산을 포함한다. 상부 힌지 영역의 길이는 항체 세그먼트의 가요성과 상관관계가 있다. 코어 힌지 영역은 중쇄간 이황화 브리지를 함유하고, 보다 하부의 힌지 영역은 CH2 도메인의 아미노 말단 단부에 결합하고, CH2에 잔기를 포함한다. 위와 동일. 야생형 인간 IgG1의 코어 힌지 영역은, 이황화 결합 형성에 의해 이량체화될 때, 중심축으로서 작용하는 것으로 여겨진 환식 옥타펩타이드를 초래하고, 따라서 가요성을 부여하는 서열 Cys-Pro-Pro-Cys를 포함한다. 실시형태에서, 본 링커는 상부 힌지 영역, 코어 영역, 및 임의의 항체의(예를 들어, IgG, IgA, IgD 및 IgE(하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2) 포함)의) 하부 힌지 영역 중 하나 또는 둘 또는 셋을 포함한다. 힌지 영역은 또한 탄수화물 부착을 위한 다수의 구조적으로 별개 유형의 부위를 포함하는 하나 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, IgA1은 힌지 영역의 17개 아미노산 세그먼트 내에 5개의 글리코실화 부위를 포함하여, 분비 면역글로불린에 대한 유리한 특성으로 간주되는 장 프로테아제에 대한 힌지 영역 폴리펩타이드의 내성을 부여한다. 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함한다.
실시형태에서, 링커는 항체의(예를 들어, IgG, IgA, IgD 및 IgE(하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2) 포함)의) Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 인간 IgG4 항체로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 인간 IgG1 항체로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, Fc 도메인은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 증가된 친화도 및 향상된 결합을 나타낸다. 실시형태에서, Fc 도메인은 FcRn에 대해 친화도를 증가시키고 결합을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, FcRn에 대한 증가된 친화도 및 향상된 결합은 본 키메라 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것으로 여겨진다.
실시형태에서, Fc 도메인 링커는 아미노산 잔기 250, 252, 254, 256, 308, 309, 311, 416, 428, 433 또는 434(본 명세서에 명백히 참조에 의해 원용된 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 Kabat 넘버링에 따름), 또는 이들의 동등물에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 250에서의 아미노산 치환은 글루타민과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 252에서 아미노산 치환은 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 트레오닌과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 254에서의 아미노산 치환은 트레오닌과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 256에서의 아미노산 치환은 세린, 아르기닌, 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 또는 트레오닌과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 308에서의 아미노산 치환은 트레오닌과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 309에서의 아미노산 치환은 프롤린과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 311에서의 아미노산 치환은 세린과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 385에서의 아미노산 치환은 아르기닌, 아스파르트산, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 글리신과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 386에서의 아미노산 치환은 트레오닌, 프롤린, 아스파르트산, 세린, 라이신, 아르기닌, 아이소류신 또는 메티오닌과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 387에서의 아미노산 치환은 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌 또는 알라닌과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 389에서의 아미노산 치환은 프롤린, 세린 또는 아스파라긴과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 416에서의 아미노산 치환은 류신과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 428에서의 아미노산 치환은 세린과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 433에서의 아미노산 치환은 아르기닌, 세린, 아이소류신, 프롤린 또는 글루타민과의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 히스티딘, 페닐알라닌 또는 타이로신과의 치환이다.
실시형태에서, Fc 도메인 링커(예를 들어, IgG 불변 영역 포함)는 아미노산 잔기 252, 254, 256, 433, 434 또는 436에서의 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다(본 명세서에서 명백히 참조에 의해 원용된 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 Kabat 넘버링에 따름). 실시형태에서, IgG 불변 영역은 삼중 M252Y/S254T/T256E 돌연변이 또는 YTE 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgG 불변 영역은 삼중 H433K/N434F/Y436H 돌연변이 또는 KFH 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, IgG 불변 영역은 조합하여 YTE 및 KFH 돌연변이를 포함한다.
실시형태에서, 본 발명의 변형된 인간화된 항체는 아미노산 잔기 250, 253, 307, 310, 380, 416, 428, 433, 434 및 435에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IgG 불변 영역을 포함한다. 예시적인 돌연변이는 T250Q, M428L, T307A, E380A, I253A, H310A, R416S, M428L, H433K, N434A, N434F, N434S 및 H435A를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 M428L/N434S 돌연변이 또는 LS 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgG 불변 영역은 T250Q/M428L 돌연변이 또는 QL 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgG 불변 영역은 N434A 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgG 불변 영역은 T307A/E380A/N434A 돌연변이 또는 AAA 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgG 불변 영역은 I253A/H310A/H435A 돌연변이 또는 IHH 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgG 불변 영역은 H433K/N434F 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgG 불변 영역은 M252Y/S254T/T256E 및 H433K/N434F 돌연변이를 조합하여 포함한다.
IgG 불변 영역의 추가적인 예시적 돌연변이는, 예를 들어, 문헌[Robbie, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2013), 57(12):6147-6153, Dall'Acqua et al., JBC (2006), 281(33):23514-24, Dall'Acqua et al., Journal of Immunology (2002), 169:5171-80, Ko et al. Nature (2014) 514:642-645, Grevys et al. Journal of Immunology. (2015), 194(11):5497-508], 및 미국 특허 제7,083,784호에 기재되며, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
실시형태에서, 링커는 서열번호 46의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 또는 93%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99% 동일성을 포함한다. 실시형태에서, 돌연변이는 안정성 및/또는 반감기를 증가시키기 위해 서열번호 46으로 이루어진다. 예를 들어, 실시형태에서, 링커는 서열번호 47의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 또는 93%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99% 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 48의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 또는 93%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99% 동일성을 포함한다.
실시형태에서, 링커는 서열번호 113의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 또는 93%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99% 동일성을 포함한다. 실시형태에서, 돌연변이는 안정성 및/또는 반감기를 증가시키기 위해 서열번호 113으로 이루어진다. 예를 들어, 실시형태에서, 링커는 서열번호 47의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 또는 93%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99% 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 48의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 또는 93%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99% 동일성을 포함한다.
이론에 의해 구속되는 일 없이, 키메라 단백질에서 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하는 링커를 포함하는 것은 불용성 및, 가능하게는, 비-기능성 단백질 콘카타머(concatemer) 및/또는 응집물의 형성을 피하게 한다. 이는 부분적으로, 키메라 단백질 사이에 이황화 결합을 형성할 수 있는 Fc 도메인에서의 시스테인의 존재로 인한 것이다.
예시적인 Fc 안정화 돌연변이체는 S228P이다. 예시적인 Fc 반감기 연장 돌연변이체는 T250Q, M428L, V308T, L309P 및 Q311S이고, 본 링커는 이들 돌연변이체 중 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4 또는 5개를 포함할 수 있다.
추가로, 하나 이상의 결합 링커는 링커에서 Fc 도메인(예를 들어, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 112 또는 서열번호 113 중 하나, 또는 이에 대해 적어도 90%, 또는 93%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99% 동일성) 및 세포외 도메인을 연결하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 중 어느 하나, 또는 이들의 변이체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 도메인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 링커를 연결할 수 있다. 선택적으로, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 중 어느 하나, 또는 이들의 변이체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 도메인과 본 명세서에 기재된 바와 같은 링커 사이에서 전위된다. 선택적으로, 서열번호 49 내지 95 중 어느 하나, 또는 이들의 변이체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 도메인과 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 사이에 위치된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 Fc 도메인 앞에 1개의 결합 링커 및 Fc 도메인 다음에 제2 결합 링커를 포함하고; 따라서, 키메라 단백질은 다음의 구조를 포함할 수 있다:
ECD 1 - 결합 링커 1 - Fc 도메인 - 결합 링커 2 - ECD 2.
실시형태에서, 제1 및 제2 결합 링커는 상이할 수 있거나 또는 이들은 동일할 수 있다.
예시적인 링커의 아미노산 서열은 아래의 표 1에 제공된다:
추가적인 예시적인 결합 링커는 서열 LE, GGGGS(서열번호 70), (GGGGS)n (n=1 내지 4)(서열번호 70 내지 73), (Gly)8(서열번호 79), (Gly)6(서열번호 80), (EAAAK)n (n=1 내지 3)(서열번호 81 내지 83), A(EAAAK)nA(n = 2 내지 5)(서열번호 84 내지 87), AEAAAKEAAAKA(서열번호 84), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 88), PAPAP(서열번호 89), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 90), EGKSSGSGSESKST(서열번호 57), GSAGSAAGSGEF(서열번호 91) 및 (XP)n을 갖는 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, X는 임의의 아미노산, 예를 들어, Ala, Lys 또는 Glu을 표기한다.
실시형태에서, 결합 링커는 글리신 및 세린 잔기(예를 들어, 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%, 또는 약 100% 글리신 및 세린)로 실질적으로 이루어진다. 예를 들어, 실시형태에서, 결합 링커는 (Gly4Ser)n이되, n은 약 1 내지 약 8, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8(각각 서열번호 70 내지 서열번호 77)이다. 실시형태에서, 결합 링커 서열은 GGSGGSGGGGSGGGGS(서열번호 78)이다. 추가적인 예시적인 결합 링커는 서열 LE, (Gly)8(서열번호 79), (Gly)6(서열번호 80), (EAAAK)n (n=1 내지 3)(서열번호 81 - 서열번호 83), A(EAAAK)nA (n = 2 내지 5)(서열번호 84 내지 서열번호 87), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 88), PAPAP(서열번호 89), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 90), GSAGSAAGSGEF(서열번호 91) 및 (XP)n을 갖는 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, X는 임의의 아미노산, 예를 들어, Ala, Lys 또는 Glu을 표시한다. 실시형태에서, 결합 링커는 GGS이다.
실시형태에서, 결합 링커는 GGGSE(서열번호 92), GSESG(서열번호 93), GSEGS(서열번호 94), GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGGSEGGS(서열번호 95) 및 4개의 아미노산 간격마다 무작위로 위치된 G, S 및 E의 결합 링커 중 하나 이상이다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 모듈 링커를 포함한다.
실시형태에서, 링커는 고도의 가요성을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 가요성일 수 있다. 실시형태에서, 링커는 강성의 알파 나선을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 강성일 수 있다.
실시형태에서, 링커는 기능성일 수 있다. 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 링커는 폴딩 및/또는 안정성을 개선시키고/시키거나, 발현을 개선시키고/시키거나, 약물동력학을 개선시키고/시키거나, 본 키메라 단백질의 생활성을 개선시키는 작용을 할 수 있다. 다른 예에서, 링커는 특정 세포 유형 또는 위치에 키메라 단백질을 표적화하는 작용을 할 수 있다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 (예를 들어, 종양에 대해) 면역 활성화를 촉진시키는 것을 포함할 수 있고, 포함하는 방법에서 사용될 수 있다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 (예를 들어, 종양이 생존하는 것을 가능하게 하는) 면역 저해를 억제할 수 있고, 억제하는 것을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 작제물의 키메라 특성에 의해 제공된 신호전달의 근접함으로 인해 개선된 면역 활성화 및/또는 면역 저해의 개선된 억제를 제공한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 면역 반응의 크기를 조절하는 것, 예를 들어, 효과기 출력 수준을 조절할 수 있거나, 또는 조절하는 것을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다. 실시형태에서, 예를 들어, 암 치료를 위해 사용될 때, 본 키메라 단백질은 T 세포 반응의 진폭을 증가시키기 위한 면역 억제에 비해 면역 자극 정도를 변경하며, 이는 사이토카인 생성, 증식 또는 표적 사멸 가능성의 증가된 수준을 자극하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은, 실시형태에서, 종양 세포 표면 상에서 저해 리간드를 마스킹하고 면역 저해 리간드를 면역 자극 리간드로 대체하는 것을 수반할 수 있거나, 수반하는 방법에서의 용도를 발견한다. 따라서, 본 키메라 단백질은, 실시형태에서, 저해 면역 신호를 수반하거나, 감소시키거나 제거하고/하거나 면역 자극 신호를 증가 또는 활성화시킬 수 있거나, 이런 방법에서의 용도를 발견한다. 예를 들어, 저해 신호를 보유하는(따라서 면역 반응을 피하는) 종양 세포는, 이어서, 종양 세포를 공격할 수 있는 T 세포 상에서 결합하는 양의 신호를 대체할 수 있다. 따라서, 실시형태에서, 저해 면역 신호는 본 작제물에 의해 마스킹되고, 자극 면역 신호는 활성화된다. 이러한 유리한 특성은 본 키메라 단백질의 신호 작제물 접근에 의해 향상된다. 예를 들어, 신호 대체는 거의 동시에 달성될 수 있고, 신호 대체는 임상적으로 중요한 부위(예를 들어, 종양 미세 환경)에서 국소적이 되도록 맞춤된다. 추가 실시형태는 다른 키메라 단백질 작제물, 예를 들어, 특히, (i) TIGIT의 세포외 도메인 및 (ii) 4-1BBL의 세포외 도메인; (i) TIGIT의 세포외 도메인 및 (ii) GITRL의 세포외 도메인; (i) TIGIT의 세포외 도메인 및 (ii) TL1A의 세포외 도메인; (i) TIGIT의 세포외 도메인 및 (ii) LIGHT의 세포외 도메인; 및 (i) PD-1의 세포외 도메인 및 (ii) LIGHT의 세포외 도메인; 및 (i) CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 (ii) LIGHT의 세포외 도메인; 및 (i) TIGIT의 세포외 도메인 및 (ii) LIGHT의 세포외 도메인; (i) CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 (ii) 4-1BBL의 세포외 도메인; (i) CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 (ii) GITRL의 세포외 도메인; (i) CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 (ii) TL1A의 세포외 도메인; (i) CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 (ii) LIGHT의 세포외 도메인; 및 (i) PD-1의 세포외 도메인 및 (ii) LIGHT의 세포외 도메인; 및 (i) CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 (ii) LIGHT의 세포외 도메인; 및 (i) CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 (ii) LIGHT의 세포외 도메인에 동일한 원칙을 적용한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 면역 자극 수용체/리간드 쌍의 결합을 자극하거나 향상시킬 수 있거나, 이를 포함하는 방법에서의 용도를 발견한다. 예시적인 T 세포 공자극 수용체 및 이들의 리간드는 OX-40:OX40-L, CD27:CD70, CD30:CD30-L, CD40:CD40-L; CD137:CD137-L, HVEM:LIGHT, GITR:GITR-L, TNFRSF25:TL1A, DR5:TRAIL, 및 BTLA:HVEM을 포함한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 면역 저해 수용체/리간드 쌍의 결합을 저해하거나 감소시킬 수 있거나, 또는 이를 포함하는 방법에서의 용도를 발견한다. 예시적인 T 세포 공동저해 수용체 및 이들의 리간드는, 예를 들어, 특히, CTLA-4:CD80/CD86, PD-1:PD-L1/PD-L2, BTLA:HVEM, TIM-3:갈렉틴-9/포스파티딜세린, TIGIT/CD155 또는 CD112, CD172a(SIRPα)/CD47, B7H3R/B7H3, B7H4R/B7H4, CD244/CD48, TMIGD2/HHLA2를 포함한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 PD-1 및 PD-L1 또는 PD-L2, 및/또는 PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2와의 결합을 차단, 감소 및/또는 저해한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 CTLA-4의 활성 및/또는 CTLA-4와 AP2M1, CD80, CD86, SHP-2 및 PPP2R5A 중 하나 이상과의 결합을 차단, 감소 및/또는 저해한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 GITR, 및/또는 GITR과 GITR 리간드 중 하나 이상과의 결합을 증가 및/또는 자극한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 OX40, 및/또는 OX40과 OX40 리간드 중 하나 이상과의 결합을 증가 및/또는 자극한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 면역 조절을 향상, 회복, 촉진 및/또는 자극할 수 있거나, 이를 수반하는 방법에서의 용도를 발견한다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 본 키메라 단백질은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 종양 세포에 대해 하나 이상의 면역 세포의 활성 또는 활성화를 회복, 촉진 및/또는 자극한다: T 세포, 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 항-종양 대식세포(예를 들어, M1 대식세포), B 세포 및 수지상 세포. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은, 비제한적 예시의 방법에 의해, 생존전 신호를 비롯한 하나 이상의 T- 세포 고유 신호의 활성화 및/또는 자극; 자가분비 또는 주변분비 성장 신호; p38 MAPK-, ERK-, STAT-, JAK-, AKT- 또는 PI3K-매개 신호; 항-세포자멸사 신호; 및/또는 신호 촉진성, 및/또는 전염증 사이토카인 생성 또는 T 세포 이동 또는 T 세포 종양 침윤 중 하나 이상에 필수적을 포함하는, T 세포의 활성 및/또는 활성화를 향상, 회복, 촉진 및/또는 자극한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 종양 또는 종양 미세환경 내로의 T 세포(세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포(예를 들어, M1 및 M2 중 하나 이상) 중 하나 이상의 증가를 야기할 수 있거나 야기하는 것을 수반하는 방법에서의 용도를 발견한다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 종양 및/또는 종양 미세환경(TME)에 대한 면역억제 세포(예를 들어, 골수성-유래 억제 세포(MDSC), 조절 T 세포(Treg), 종양 관련 호중구(TAN), M2 대식세포 및 종양 관련 대식세포(TAM))의 보충을 저해하고/하거나 보충의 감소를 야기하는 것을 수반할 수 있거나, 수반하는 방법에서의 용도를 발견한다. 실시형태에서, 본 요법은 M1 대식세포를 선호하도록 종양 부위 및/또는 TME에서 M1 대 M2 대식세포의 비를 변경시킬 수 있다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 유효량의 본 명세서에 기재된 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양에 대한 T 세포 활성화 및/또는 면역 관용을 저해 및/또는 감소시킬 수 있고, 이를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17F 및 IL-22 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 사이토카인의 혈청 수준을 증가시킬 수 있다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 치료된 대상체의 혈청 중 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-22, TNFα 또는 IFNγ를 향상시킬 수 있다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질의 투여는 TNFα 분비를 향상시킬 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 키메라 단백질의 투여는 백혈구에 의한 슈퍼 항원 매개 TNFα 분비를 향상시킬 수 있다. 이러한 사이토카인 반응의 검출은 표시된 키메라 단백질에 대한 최적 투약 요법을 결정하는 방법을 제공할 수 있다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 항-종양 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포의 세포사를 저해, 차단 및/또는 감소시키거나; 또는 종양 전 T 세포의 세포사를 자극, 유도 및/또는 증가시킨다. T 세포 고갈은 증식성 및 효과기 기능의 진행성 상실로 클로 고갈로 끝나는 것을 특징으로 하는 T 세포 기능장애 상태이다. 따라서, 종양 전 T 세포는 다수의 만성 감염 및 암 동안 생기는 T 세포 기능장애 상태를 지칭한다. 이 기능장애는 불량한 증식성 및/또는 효과기 기능, 기능성 효과기 또는 기억 T 세포와 별개인 저해 수용체의 지속적 발현 및 전사 상태로 정의된다. 고갈은 감염 및 종양의 최적의 제어를 막는다. 또한, 항-종양 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포는 종양에 대한 면역 반응을 시작할 수 있는 T 세포를 지칭한다. 예시적인 종양 전 T 세포는 Treg, 하나 이상의 관문 저해 수용체를 발현시키는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, Th2 세포 및 Th17 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 관문 저해 수용체는 제어되지 않는 면역 반응을 방지하거나 저해하는 면역 세포 상에서 발현된 수용체를 지칭한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 효과기 T 세포 대 조절 T 세포의 비를 증가시킬 수 있고, 이를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다. 예시적인 효과기 T 세포는 ICOS+ 효과기 T 세포; 세포독성 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD8+, CD45RO+); CD4+ 효과기 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD4+, CCR7+, CD62Lhi, IL-7R/CD127+); CD8+ 효과기 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD8+, CCR7+, CD62Lhi, IL-7R/CD127+); 효과기 기억 T 세포(예를 들어, CD62Llow, CD44+, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+, CCR7low); 중심 기억 T 세포(예를 들어, CCR7+, CD62L+, CD27+; 또는 CCR7hi, CD44+, CD62Lhi, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+); CD62L+ 효과기 T 세포; 초기 효과기 기억 T 세포(CD27+ CD62L-) 및 후기 효과기 기억 T 세포(CD27- CD62L-)(각각 TemE 및 TemL)를 비롯한 CD8+ 효과기 기억 T 세포(TEM); CD127(+)CD25(low/-) 효과기 T 세포; CD127(-)CD25(-) 효과기 T 세포; CD8+ 줄기 세포 기억 효과기 세포(TSCM)(예를 들어, CD44(low)CD62L(high)CD122(high)sca(+)); TH1 효과기 T-세포(예를 들어, CXCR3+, CXCR6+ 및 CCR5+; 또는 αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-12R+, IFNγR+, CXCR3+), TH2 효과기 T 세포(예를 들어, CCR3+, CCR4+ 및 CCR8+; 또는 αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-4R+, IL-33R+, CCR4+, IL-17RB+, CRTH2+); TH9 효과기 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD4+); TH17 효과기 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-23R+, CCR6+, IL-1R+); CD4+CD45RO+CCR7+ 효과기 T 세포, CD4+CD45RO+CCR7(-) 효과기 T 세포; 및 효과기 T 세포 분비 IL-2, IL-4 및/또는 IFN-γ를 포함한다. 예시적인 조절 T 세포는 ICOS+ 조절 T 세포, CD4+CD25+FOXP3+ 조절 T 세포, CD4+CD25+ 조절 T 세포, CD4+CD25- 조절 T 세포, CD4+CD25high 조절 T 세포, TIM-3+PD-1+ 조절 T 세포, 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)+ 조절 T 세포, CTLA-4/CD152+ 조절 T 세포, 뉴로필린-1(Nrp-1)+ 조절 T 세포, CCR4+CCR8+ 조절 T 세포, CD62L(L-셀렉틴)+ 조절 T 세포, CD45RBlow 조절 T 세포, CD127low 조절 T 세포, LRRC32/GARP+ 조절 T 세포, CD39+ 조절 T 세포, GITR+ 조절 T 세포, LAP+ 조절 T 세포, 1B11+ 조절 T 세포, BTLA+ 조절 T 세포, 1형 조절 T 세포(Tr1 세포),T 헬퍼 3형(Th3) 세포, 자연 살해 T 세포 표현형의 조절 세포(NKTregs), CD8+ 조절 T 세포, CD8+CD28- 조절 T 세포 및/또는 조절 T-세포 분비 IL-10, IL-35, TGF-β, TNF-α, 갈렉틴-1, IFN-γ 및/또는 MCP1을 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은, 예를 들어, 재발을 방지하거나 동물을 재시험감염으로부터 보호할 수 있는 기억 반응을 생성한다. 따라서, 키메라 단백질로 처리한 동물은 이후에 종양 세포를 공격할 수 있고/있거나 키메라 단백질에 의한 초기 처리 후 재시험감염될 때 종양의 발생을 방지한다. 따라서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 재발을 방지할 수 있는 기억 반응을 프로그래밍하는 데 필수적인 활성 종양 파괴 및 또한 종양 항원의 면역 인식을 모두 자극한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간 또는 약 96시간 또는 약 1주 또는 약 2주 이하 동안 효과기 T 세포를 일시적으로 자극할 수 있고, 이를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다. 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간 또는 약 96시간 또는 약 1주 또는 약 2주 이하 동안 조절 T 세포를 일시적으로 고갈 또는 저해할 수 있고, 이를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다. 실시형태에서, 효과기 T 세포의 일시적 자극 및/또는 조절 T 세포의 일시적 고갈 또는 저해는 실질적으로 환자의 혈류에서 또는 림프구 조직, 예를 들어, 골수, 림프절, 비장, 흉선, 점막-관련 림프구 조직(MALT), 비-림프종 조직을 포함하는 특정 조직/위치에서 또는 종양 미세환경에서 일어난다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 사용의 용이함 및 생산의 용이함을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 이점을 제공한다. 이는 2가지 별개의 면역요법 제제가 2가지의 독립적 제조 공정 대신 단일 제조 공정을 가능하게 하는 단일 생성물에 조합되기 때문이다. 또한, 2종의 별개의 제제 대신에 단일 제제의 투여는 더 용이한 투여 및 더 큰 환자 수용 상태를 가능하게 한다. 추가로, 예를 들어, 수많은 이황화 결합 및 번역 후 변형, 예컨대, 글리코실화를 함유하는 거대 다량체 단백질인 단클론성 항체와 대조적으로, 본 키메라 단백질은 제조가 더 용이하며 더 비용 효과적이다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 분비 가능하고 완전히 기능성인 단일 폴리펩타이드 쇄로서 포유류 숙주 세포에서 생산 가능하다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 예상치 못하게, 느린 오프 속도(Kd 또는 Koff)로 각각의 결합 상대에 대한 세포외 도메인 구성성분의 결합을 제공한다. 실시형태에서, 이는 예상치 못하게 리간드에 대한 수용체의 긴 상호작용 및 그 반대를 제공한다. 이러한 효과는 지속된 음성 신호 마스킹 효과를 가능하게 한다. 추가로, 실시형태에서, 이는, 예를 들어, 효과기 세포가 항-종양 효과를 위해 적절하게 자극되는 것을 가능하게 하는 더 긴 양의 신호 효과를 전달한다. 예를 들어, 본 키메라 단백질은, 예를 들어, 긴 오프 속도 결합을 통해, 충분한 신호 전달을 가능하게 하여 T 세포 증식을 제공하고 항-종양 공격을 가능하게 한다. 추가 예로서, 본 키메라 단백질은, 예를 들어, 긴 오프 속도 결합을 통해 자극 신호, 예를 들어, 사이토카인의 방출을 제공하는 데 충분한 신호 전달을 가능하게 한다.
본 제제에 의해 촉진된 세포의 안정적인 시냅스(예를 들어, 음성 신호를 보유하는 종양 세포 및 종양을 공격할 수 있는 T 세포)는 종양 감소에 바람직한 공간 배향 - 예컨대, T 세포가 종양 세포를 공격하도록 위치시키는 것 및/또는 종양 세포가 본 발명의 키메라 단백질에 의해 마스킹된 것 이상의 음의 신호를 포함하는 음의 신호를 전달하는 것을 입체적으로 방지하는 것을 제공한다.
실시형태에서, 이는 키메라 단백질의 혈청 t1/2에 비해 더 긴 표적 상(on-target)(예를 들어, 종양 내) 반감기(t1/2)를 제공한다. 이러한 특성은 키메라 단백질의 전신 분포와 관련될 수 있는 비표적 독성을 감소시키는 조합된 이점을 가질 수 있었다.
실시형태에서, 본 제제는, 예를 들어, 항종양 방식으로, TIGIT를 통한 신호를 차단함으로써 NK 세포 및/또는 활성화된, 기억 및/또는 조절 T 세포 및/또는 헬퍼 T 세포의 서브세트의 저해를 방지하고/하거나 붕괴시킴으로써 특정 면역 세포가 작용하는 것을 가능하게 하고, 선택적으로, 4-1BBL-, 및/또는 GITRL-, 및/또는 TL1A-, 및/또는 LIGHT-기반 자극 신호전달을 통한 추가 면역 반응을 생성한다.
실시형태에서, 본 제제는 특정 면역 세포가, 예를 들어, 항종양 방식으로, 자극 LIGHT-기반 신호전달의 자극 및/또는 증가에 의해, 예를 들어, 내장 및/또는 림프구 및/또는 기타 간질 및/또는 상피 및/또는 골수성 세포 상에서 작용하는 것을 가능하게 하고, 선택적으로, PD-1-, 및/또는 CD172a(SIRPα)- 및/또는 TIGIT-기반 저해 신호전달의 차단 또는 감소를 통한 추가 면역 반응을 생성한다.
추가로, 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 두 면역요법 제제의 개선된 부위-특이적 상호작용을 가능하게 하기 때문에 상승적 치료 효과를 제공한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 오프-부위 및/또는 전신 독성을 감소시키기 위한 가능성을 제공한다.
실시형태에서, 본 키메라 단백질은 현재의 면역요법, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 관문 분자와 관련된 항체에 대해 감소된 부작용, 예를 들어, GI 합병증을 제공한다. 예시적인 GI 합병증은 복통, 식욕 상실, 자가면역 효과, 변비, 크램핑, 탈수, 설사, 섭식 문제, 피로, 고창, 복부 내 유체 또는 복수, 위장(GI) 장내 세균 불균형, GI 점막염, 염증성 장질환, 과민성 대장 증후군(IBS-D 및 IBS-C), 구역, 통증, 대변 또는 소변 변화, 궤양성 대장염, 구토, 유체 보유로부터의 체중 증가 및/또는 쇠약을 포함한다.
실시형태에서, 링커는 가요성 아미노산 서열, IgG 힌지 영역 또는 항체 서열로부터 선택된 폴리펩타이드이다. 실시형태에서, 링커는 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG1로부터 유래된다. 실시형태에서, 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG4로부터 유래된다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112, 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 둘 이상의 결합 링커를 포함하며, 각각의 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 독립적으로 선택되되; 1개의 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 N 말단에 있으며, 다른 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 C 말단에 있다.
실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 재조합 융합 단백질이다.
치료 방법
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁한다). 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 50.0㎎/㎏이며, 선택적으로 약 1㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 6㎎/㎏, 또는 약 10㎎/㎏, 약 12㎎/㎏, 약 15㎎/㎏, 약 18㎎/㎏, 약 20㎎/㎏, 약 22㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 27㎎/㎏, 약 30㎎/㎏, 약 33㎎/㎏, 약 35㎎/㎏, 약 37㎎/㎏, 약 40㎎/㎏, 약 42㎎/㎏, 약 45㎎/㎏, 약 48㎎/㎏, 내지 약 50㎎/㎏으로부터 선택된다. 실시형태에서, 대상체는 인간, 선택적으로는 성인 인간이다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 1주에 적어도 약 1회로 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 1개월에 적어도 약 1회로 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 1개월에 적어도 약 2회로 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 1개월에 적어도 약 3회로 투여된다.
실시형태에서, 암은 고형 종양(국소 및/또는 전이성) 또는 림프종을 포함한다. 실시형태에서, 암은 진행된 암이다. 실시형태에서, 암은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양(bulky disease) NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 림프구 확장 유도를 필요로 하는 대상체에서 림프구 확장을 유도하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁한다).
일 양상에서, 본 개시내용은 림프구 변연화 유도를 필요로 하는 대상체에서 림프구 변연화를 유도하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함).
실시형태에서, 대상체는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된 투약 요법으로 투약된다.
실시형태에서, 제1 도메인은 TIGIT 리간드에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제1 도메인은 실질적으로 모든 TIGIT의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 제2 도메인은 LIGHT 수용체에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제2 도메인은 실질적으로 모든 LIGHT의 세포외 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 링커는 가요성 아미노산 서열, IgG 힌지 영역 및/또는 항체 서열로부터 선택된 폴리펩타이드이다. 실시형태에서, 링커는 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유래된다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112, 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 결합 링커를 포함하고, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 독립적으로 선택된다. 실시형태에서, 링커는 둘 이상의 결합 링커를 포함하며, 각각의 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 독립적으로 선택되되; 1개의 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 N 말단에 있으며, 다른 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 C 말단에 있다.
실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, (a) 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (b) 제2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 그리고 (c) 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, (a) 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, (b) 제2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 그리고 (c) 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 SKYGPPCPSCP(서열번호 49), SKYGPPCPPCP(서열번호 50), IEGRMD(서열번호 52)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 결합 링커를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 IEGRMD(서열번호 52)의 아미노산 서열을 포함하는 결합 링커를 포함한다. 실시형태에서, IEGRMD의 아미노산 서열은 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열의 C-말단에 위치된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.2% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.4% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.6% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.8% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 상기 치료는 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인의 수준 및/또는 활성 증가를 유도한다. 실시형태에서, 치료는 사이토카인 방출 증후군을 유도하지 않는다. 실시형태에서, 상기 치료는 다른 면역요법제, 예컨대, 특정 항-CD40 항체 또는 항-PD-1 제제에 비해 IL-6를 더 적게 증가시킨다.
실시형태에서, 대상체는 표준요법을 투여 받거나, 내약성이 있거나 또는 부적격이고/이거나 암은 표준치료로 간주되는 승인된 요법이 없다. 실시형태에서, 상기 대상체는 병행 화학요법, 면역요법, 생물요법 또는 호르몬 요법을 투여받고 있지 않다.
환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법; 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질의 용량을 투여하는 단계로서, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 인간 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 (c)는 인간 LIGHT(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고 T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대한 HSV 당단백질 D와 경쟁함)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏인, 단계; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 분석을 수행하여 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체가 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성 증가를 갖는다면 투약을 계속하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 요법에 의한 치료를 위해 대상체를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질의 용량을 투여하는 단계로서, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 인간 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 (c)는 인간 LIGHT(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고 T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대한 HSV 당단백질 D와 경쟁함)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏인, 단계; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 분석을 수행하여 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체가 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성 증가를 갖는다면 암에 대한 요법을 이용하는 치료를 위한 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포, 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본이다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생검 샘플이다. 실시형태에서, 생검 샘플은 내시경 생검, 골수 생검, 내시경 생검(예를 들어, 방광내시경, 기관지내시경 및 결장경 검사), 바늘 생검(예를 들어, 세침 흡인, 중심 바늘 생검, 진공-흡인 생검, X-선 보조 생검, 컴퓨터 단층촬영(CT)-보조 생검, 자기 공명 영상(MRI)-보조 생검 및 초음파-보조 생검), 피부 생검(예를 들어, 표층 생검, 펀치 생검 및 절개 생검) 및 수술 생검으로부터 선택된다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함한다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 스크레이프, 면봉 및 생검으로부터 선택된 기법에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 브러쉬, (면)봉, 스패튤라, 린스/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 수술 기기에 의한 구멍의 천공의 사용에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함한다.
실시형태에서, 종양은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함; 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택된다.
실시형태에서, 분석은 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행된다.
실시형태에서, 분석은 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 제제와 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 적어도 1종의 사이토카인에 특이적으로 결합하는 제제는 하나 이상의 항체, 항체-유사 분자 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 분석은 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인을 암호화하는 적어도 1종의 핵산에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 제제와 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 적어도 1종의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브이다.
이는 TIGIT 리간드에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제1 도메인은 실질적으로 모든 TIGIT의 세포외 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 제2 도메인은 LIGHT 수용체에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제2 도메인은 실질적으로 모든 LIGHT의 세포외 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 링커는 가요성 아미노산 서열, IgG 힌지 영역 및/또는 항체 서열로부터 선택된 폴리펩타이드이다. 실시형태에서, 링커는 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유래된다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112, 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 결합 링커를 포함하고, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 독립적으로 선택된다. 실시형태에서, 링커는 둘 이상의 결합 링커를 포함하며, 각각의 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 독립적으로 선택되되; 1개의 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 N 말단에 있으며, 다른 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 C 말단에 있다.
실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, (a) 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (b) 제2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 그리고 (c) 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, (a) 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, (b) 제2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 그리고 (c) 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 SKYGPPCPSCP(서열번호 49), SKYGPPCPPCP(서열번호 50), IEGRMD(서열번호 52)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 결합 링커를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 IEGRMD(서열번호 52)의 아미노산 서열을 포함하는 결합 링커를 포함한다. 실시형태에서, IEGRMD의 아미노산 서열은 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열의 C-말단에 위치된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.2% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.4% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.6% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.8% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 환자에 대해 암 치료를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) 하기로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 존재, 부재 또는 수준에 대해 샘플을 평가하는 단계: (i) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리 및 제시의 음성 조절, 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시; 및/또는 (ii) 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정; 및 (c) 단계 (b)의 평가에 기반하여 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 위해 환자를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) 하기로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 존재, 부재 또는 수준에 대해 샘플을 평가하는 단계: (i) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리 및 제시의 음성 조절, 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시; 및/또는 (ii) 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정; 및 (c) PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) 하기로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 존재, 부재 또는 수준에 대해 샘플을 평가하는 단계: (i) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리 및 제시의 음성 조절, 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시; 및/또는 (ii) 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정; 및 (III) N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 이용하는 암 요법을 선택하는 단계로서, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 단계; 및 (IV) 선택적으로 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계를 포함한다.
비제한적 실시형태에서, 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리 및 제시의 음성 조절, 및 항원 처리, MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된 GO 경로와 관련된 유전자의 상향조절이 관찰되지 않는 경우 및/또는 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 GO 경로와 관련된 유전자의 하향조절이 관찰되지 않은 경우, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 것을 계속한다.
비제한적 실시형태에서, 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리 및 제시의 음성 조절, 및 항원 처리, MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된 GO 경로와 관련된 유전자의 상향조절이 관찰되지 않는 경우 및/또는 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 GO 경로와 관련된 유전자의 하향조절이 관찰된 경우, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 것을 계속하되, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 이용한 암 요법 투여를 보충하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
비제한적 실시형태에서, 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리 및 제시의 음성 조절, 및 항원 처리, MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된 GO 경로와 관련된 유전자의 상향조절이 관찰되지 않는 경우 및/또는 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 GO 경로와 관련된 유전자의 하향조절이 관찰된 경우, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 것을 계속하지 않되, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 이용한 암 요법 투여는, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
실시형태에서, 건강한 조직에 비해 (i)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (i)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다. 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (i)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성의 발생 또는 반항성 결여를 나타낸다.
실시형태에서, 건강한 조직에 비해 (i)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (i)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (i)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 건강한 조직에 비해 (ii)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (ii)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다. 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (ii)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성의 발생 또는 반항성 결여를 나타낸다.
실시형태에서, 건강한 조직에 비해 (ii)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (ii)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (ii)에서 열거된 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타내되, GO 경로는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리 및 제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된다. 실시형태에서, 항PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타내되, GO 경로는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리 및 제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된다. 실시형태에서, 표준에 비해 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타내되, GO 경로는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리 및 제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타내되, GO 경로는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리 및 제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된다. 실시형태에서, 항PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타내되, GO 경로는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리 및 제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된다. 실시형태에서, 표준에 비해 GO 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타내되, GO 경로는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리 및 제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 세포주기 과정의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 세포주기 과정의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 세포주기 과정의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 세포주기 과정의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 세포주기 과정의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 세포주기 과정의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 G1/S 이행의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 G1/S 이행의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 G1/S 이행의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 G1/S 이행의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 G1/S 이행의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 G1/S 이행의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 세포분열의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 세포분열의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 세포분열의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 세포분열의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 세포분열의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 세포분열의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 세포 증식의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 세포 증식의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 세포 증식의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 세포 증식의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 세포 증식의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 세포 증식의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 선천적 면역 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 선천적 면역 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 선천적 면역 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 선천적 면역 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 선천적 면역 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 선천적 면역 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 항원 처리/제시의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 항원 처리/제시의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 항원 처리/제시의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 항원 처리/제시의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 항원 처리/제시의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 항원 처리/제시의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IFNα 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IFNα 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IFNα 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IFNα 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IFNα 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IFNα 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 방어 반응의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 방어 반응의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 방어 반응의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 방어 반응의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 방어 반응의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 방어 반응의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IFNβ 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IFNβ 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IFNβ 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 IFNβ 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 IFNβ 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 IFNβ 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 염증 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 염증 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 염증 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 염증 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 염증 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 염증 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 섬유소용해현상의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 섬유소용해현상의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 섬유소용해현상의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 섬유소용해현상의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 섬유소용해현상의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 섬유소용해현상의 음성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 암죽미립 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 암죽미립 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 암죽미립 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 암죽미립 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 암죽미립 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 암죽미립 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 혈장막 수선과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 혈장막 수선과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 혈장막 수선과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 혈장막 수선과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 혈장막 수선과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 혈장막 수선과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 리보솜 소형 서브유닛 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 리보솜 소형 서브유닛 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 리보솜 소형 서브유닛 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 리보솜 소형 서브유닛 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 리보솜 소형 서브유닛 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 리보솜 소형 서브유닛 조립체와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 인지질 유출과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 번역의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 번역의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 번역의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 번역의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 번역의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 번역의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 미토콘드리아 번역 신장과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 미토콘드리아 번역 신장과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 미토콘드리아 번역 신장과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 미토콘드리아 번역 신장과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 미토콘드리아 번역 신장과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 미토콘드리아 번역 신장과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 DNA-의존적 DNA 복제와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 DNA-의존적 DNA 복제와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 DNA-의존적 DNA 복제와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 DNA-의존적 DNA 복제와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 DNA-의존적 DNA 복제와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 DNA-의존적 DNA 복제와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 ATP 생합성 과정과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 ATP 생합성 과정과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 ATP 생합성 과정과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성, 반응 결여 또는 반항성을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터의 사전 생물학적 샘플에 비해 ATP 생합성 과정과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자에 비해 ATP 생합성 과정과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 표준에 비해 ATP 생합성 과정과 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법은, 예를 들어, Rpl41, Rps15 및 Rps8 중 하나 이상의 발현이 높고/높거나 Cd274, B2M, Tap1, Tap2, Casp1 및 Gasta3 중 하나 이상의 발현이 낮을 때, 지시될 수 있다. 실시형태에서, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법은, 예를 들어, Rpl41, Rps15 및 Rps8 중 하나 이상의 발현이 낮고/낮거나 Cd274, B2M, Tap1, Tap2, Casp1 및 Gasta3 중 하나 이상의 발현이 높을 때, 지시되지 않을 수 있다. 실시형태에서, Rpl41, Rps15 및 Rps8 중 하나 이상의 저발현 및/또는 Cd274, B2M, Tap1, Tap2, Casp1 및 Gasta3 중 하나 이상의 고발현을 특징으로 하는 환자는 PD-1-비반응성 세포를 제거하는 면역보강 또는 신면역보강 요법으로부터 유익을 얻을 가능성이 있다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본이다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생검 샘플이다. 실시형태에서, 생검 샘플은 내시경 생검, 골수 생검, 내시경 생검(예를 들어, 방광내시경, 기관지내시경 및 결장경 검사), 바늘 생검(예를 들어, 세침 흡인, 중심 바늘 생검, 진공-흡인 생검, X-선 보조 생검, 컴퓨터 단층촬영(CT)-보조 생검, 자기 공명 영상(MRI)-보조 생검 및 초음파-보조 생검), 피부 생검(예를 들어, 표층 생검, 펀치 생검 및 절개 생검) 및 수술 생검으로부터 선택된다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 스크레이프, 면봉 및 생검으로부터 선택된 기법에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 브러쉬, (면)봉, 스패튤라, 린스/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 수술 기기에 의한 구멍의 천공의 사용에 의해 얻어진다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함한다. 실시형태에서, 종양은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함; 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암이다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 (i) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리 및 제시의 음성 조절, 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시; 및/또는 (ii) 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리 및 제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 IFNα 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 방어 반응의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 IFNβ 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 염증 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 (i) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리 및 제시의 음성 조절, 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시; 및/또는 (ii) 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리 및 제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 IFNα 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 방어 반응의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 IFNβ 생산의 양성 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 염증 반응의 조절과 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브이다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 환자를 고위험 또는 저위험 그룹으로 분류하는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 고위험 분류는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성을 갖는 고수준의 종양 세포를 포함한다. 실시형태에서, 저위험 분류는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성을 갖는 저수준의 종양 세포를 포함한다.
실시형태에서, 저위험 또는 고위험 분류는 신보강화학요법의 중지를 나타낸다. 실시형태에서, 저위험 또는 고위험 분류는 보강요법의 중지를 나타낸다. 실시형태에서, 평가하는 것은 암 치료에 대한 양성 반응 및/또는 유익을 예측한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 암 치료에 대한 음성 또는 중성 반응 및/또는 유익을 예측한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 신면역보강 화학요법에 대한 양성 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 신면역보강 화학요법에 대한 비반응 및/또는 이로부터의 유익 결여를 예측한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 면역보강 화학요법에 대한 양성 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 면역보강 화학요법에 대한 비반응 및/또는 이로부터의 유익 결여를 예측한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 신면역보강 화학요법에 대한 음성 또는 중성 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 신면역보강 화학요법에 대한 비반응 및/또는 이로부터의 유익 결여를 예측한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 면역보강 화학요법에 대한 음성 또는 중성 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 면역보강 화학요법에 대한 비반응 및/또는 이로부터의 유익 결여를 예측한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 암 치료의 투여 또는 중지의 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 신보강화학요법 투여의 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 보강 요법 투여의 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 신보강화학요법 중지의 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가하는 것은 보강요법 중지의 정보를 제공한다. 실시형태에서, 신보강화학요법 및/또는 보강요법은 화학치료제이다. 실시형태에서, 신보강화학요법 및/또는 보강요법은 세포독성제이다. 실시형태에서, 신보강화학요법 및/또는 보강요법은 관문 저해제이다.
실시형태에서, 신보강화학요법 및/또는 보강요법은 단백질 번역 저해제(예를 들어, 실베스트롤 및 오마세탁신) 리보솜 생물발생설 저해제(예를 들어, 다이아자보린, 라모트리긴 및 리보지노인돌), rRNA 및/또는 tRNA 합성의 저해제(예를 들어, 쿠아르플록신(CX-3543) 및 CX-5461), 아미노산 합성의 저해제(예를 들어, GLUD1 저해제 R162, BCAT1 저해제 가바펜틴, 글루타미나제 저해제 비스-2-(5-페닐아세트아미도-1,2,4-티아다이아졸-2-일)에틸 설파이드(BPTES), PAGDH 저해제 NCT-503), 아미노산 흡수의 저해제(예를 들어, SLC7A11 저해제 설파살라진, 에라스틴 또는 소라페닙), 번역 후 변형의 조절제(예를 들어, 글리코실화 저해제 투니카마이신, ppGalNAc-T3), 단백질 분해의 조절제, 및 단백질 수송의 조절제(예를 들어, 사이클로스포린 A, 펜딜린, 파르벤다졸, 파록세틴, 파르테놀라이드, 퀴나크린, 설트랄린, 스피페론, 티메로살, 아스테미졸, 퍼헥실린, HUN-7293, CAM741, CK147, 및 코트란신)로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 환자에 대해 암 치료를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (ii) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절; 및/또는 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절에 대해 샘플을 평가하는 단계; 및 (iii) 단계 (b)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 위해 환자를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (ii) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절; 및/또는 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절에 대해 샘플을 평가하는 단계; 및 (iii) 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (ii) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절; 및/또는 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절에 대해 샘플을 평가하는 단계; 및 (iii) 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
실시형태에서, 상향조절은 건강한 조직과 비교된다. 실시형태에서, 상향조절은 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교된다. 실시형태에서, 상향조절은 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플과 비교된다. 실시형태에서, 하향조절은 건강한 조직과 비교된다. 실시형태에서, 하향조절은 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교된다. 실시형태에서, 하향조절은 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플과 비교된다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본이다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생검 샘플이다. 실시형태에서, 생검 샘플은 내시경 생검, 골수 생검, 내시경 생검(예를 들어, 방광내시경, 기관지내시경 및 결장경 검사), 바늘 생검(예를 들어, 세침 흡인, 중심 바늘 생검, 진공-흡인 생검, X-선 보조 생검, 컴퓨터 단층촬영(CT)-보조 생검, 자기 공명 영상(MRI)-보조 생검 및 초음파-보조 생검), 피부 생검(예를 들어, 표층 생검, 펀치 생검 및 절개 생검) 및 수술 생검으로부터 선택된다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 스크레이프, 면봉 및 생검으로부터 선택된 기법에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 브러쉬, (면)봉, 스패튤라, 린스/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 수술 기기에 의한 구멍의 천공의 사용에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함한다.
실시형태에서, 종양은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함; 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 (i) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절, 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시; 및/또는 (ii) 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리/제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 (i) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절, 및 항원 처리/MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시; 및/또는 (ii) 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리/제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브이다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 환자를 고위험 또는 저위험 그룹으로 분류하는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 고위험 분류는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성을 갖는 고수준의 종양 세포를 포함한다. 실시형태에서, 저위험 분류는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성을 갖는 저수준의 종양 세포를 포함한다. 실시형태에서, 저위험 분류는 암요법의 중지를 나타낸다. 실시형태에서, 고위험 분류는 암 요법의 투여를 나타낸다.
일 양상에서, 본 개시내용은 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는 (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된, 유전자의 발현을 위한 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 환자에 대해 암 치료를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는 (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자의 발현에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 환자에 대한 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는 (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된, 유전자의 발현을 위한 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는 (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자의 발현에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계를 포함하되, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는 (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자의 발현에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하는 단계로서, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 단계; (IV) 선택적으로 신보강화학요법 및/또는 보강요법을 선택하는 단계; (V) 선택적으로 신보강화학요법 및/또는 보강요법을 투여하는 단계; 및 (VI) PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계를 포함한다.
비제한적 실시형태에서, CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자의 과발현의 상향조절이 관찰되지 않는다면; 그리고/또는 RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자의 하향조절이 관찰되지 않는다면, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계를 계속한다.
비제한적 실시형태에서, CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자의 과발현의 상향조절이 관찰된다면; 그리고/또는 RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자의 하향조절이 관찰된다면, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계를 계속하되, 암 요법 투여의 보충은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
비제한적 실시형태에서, CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자의 과발현의 상향조절이 관찰된다면; 그리고/또는 RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자의 하향조절이 관찰된다면, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계를 계속하지 않되, 암 요법 투여는 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
실시형태에서, 생물학적 샘플이 적어도 하나의 종양 세포를 포함할 때 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법이 선택되며, CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자는 건강한 조직, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 적어도 하나의 종양 세포에서 상향조절되지 않고; 그리고/또는 RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자는 건강한 조직, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 적어도 하나의 종양 세포에서 하향조절되지 않는다.
실시형태에서, 생물학적 샘플이 적어도 하나의 종양 세포를 포함할 때, CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자는 건강한 조직, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 적어도 하나의 종양 세포에서 상향조절되고; 그리고/또는 RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자는 건강한 조직, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 적어도 하나의 종양 세포에서 하향조절되고, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하며, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
실시형태에서, 건강한 조직에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다. 실시형태에서, 건강한 조직에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다.
실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여의 발생을 나타낸다. 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여의 발생을 나타낸다.
실시형태에서, 건강한 조직에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 건강한 조직에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다.
실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응 결여의 발생을 나타낸다. 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응 결여의 발생을 나타낸다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본이다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생검 샘플이다. 실시형태에서, 생검 샘플은 내시경 생검, 골수 생검, 내시경 생검(예를 들어, 방광내시경, 기관지내시경 및 결장경 검사), 바늘 생검(예를 들어, 세침 흡인, 중심 바늘 생검, 진공-흡인 생검, X-선 보조 생검, 컴퓨터 단층촬영(CT)-보조 생검, 자기 공명 영상(MRI)-보조 생검 및 초음파-보조 생검), 피부 생검(예를 들어, 표층 생검, 펀치 생검 및 절개 생검) 및 수술 생검으로부터 선택된다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 스크레이프, 면봉 및 생검으로부터 선택된 기법에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 브러쉬, (면)봉, 스패튤라, 린스/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 수술 기기에 의한 구멍의 천공의 사용에 의해 얻어진다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함한다. 실시형태에서, 종양은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함; 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 (b)(i) 및/또는 (b)(ii)에 열거된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제는 항체, 항체-유사 분자 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 본 명세서에서 확인된 (b)(i) 및/또는 (b)(ii)에 열거된 유전자와 관련된 하나 이상의 유전자의 핵산 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 환자에 대해 암 치료를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 활성화를 위해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계로서, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하는, 단계를 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 활성화를 위해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계로서, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하는 단계를 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (II) Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 활성화를 위해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 (II) 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하는 단계로서, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는 단계; 및 (IV) 선택적으로 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법은 생물학적 샘플이 적어도 하나의 종양 세포를 포함할 때 선택되고, Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로는 건강한 조직에 비해 적어도 하나의 종양 세포, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에서 상향조절되지 않는다.
실시형태에서, 생물학적 샘플이 적어도 하나의 종양 세포를 포함할 때 선택되고, Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로는 건강한 조직에 비해 적어도 하나의 종양 세포, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에서 상향조절되지 않으며, 암 요법은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
실시형태에서, 건강한 조직에 비해 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교하여 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타낸다. 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여의 발생을 나타낸다.
실시형태에서, 건강한 조직에 비해 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교하여 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응 결여의 발생을 나타낸다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본이다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생검 샘플이다. 실시형태에서, 생검 샘플은 내시경 생검, 골수 생검, 내시경 생검(예를 들어, 방광내시경, 기관지내시경 및 결장경 검사), 바늘 생검(예를 들어, 세침 흡인, 중심 바늘 생검, 진공-흡인 생검, X-선 보조 생검, 컴퓨터 단층촬영(CT)-보조 생검, 자기 공명 영상(MRI)-보조 생검 및 초음파-보조 생검), 피부 생검(예를 들어, 표층 생검, 펀치 생검 및 절개 생검) 및 수술 생검으로부터 선택된다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 스크레이프, 면봉 및 생검으로부터 선택된 기법에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 브러쉬, (면)봉, 스패튤라, 린스/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 수술 기기에 의한 구멍의 천공의 사용에 의해 얻어진다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함한다. 실시형태에서, 종양은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함; 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택된다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제는 항체, 항체-유사 분자 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브이다.
Trim7은 대략 80개의 별개의 삼중 모티프 단백질(삼중 모티프-함유(TRIM))을 포함하는 거대 패밀리의 구성원이다. 단백질 패밀리는 인간에서의 80 TRIM 단백질 구성원을 포함한다. 실시형태에서, Trim-패밀리 활성화는 IFN 반응성 유전자(즉, IRF1/IRF3/IRF7, JAK/STAT 및 NFκB의 제어를 통한 선천성 면역 반응의 조절에 의해 분석될 수 있다. 실시형태에서, Trim-패밀리 구성원은 (예를 들어, Trim6 및 Trim7에서) C-말단의 SPRY 도메인을 갖고, 실시형태에서, Trim7은 증식의 유도, EMT, 및 화학-내성 표현형의 획득에 기반하여 분석된다.
실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 이용하여 분석될 수 있다. 실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 Ras-Raf-MEK-ERK 신호전달에 의한 분석된 c-Jun/AP1 활성화일 수 있다. 실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 단백질 유비퀴틴화를 분석함으로써 분석될 수 있다.
실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 AP1 보조활성인자(co-activator) RACO-1의 유비퀴틴화 및 안정화 및/또는 AP1 매개 유전자 발현의 증가를 이용하여 분석될 수 있다. AP1-매개 유전자 발현 신호는 당업계에 잘 공지되어 있다.
실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 세포 증식 및 선천성 면역 반응과 관련된 단백질을 포함하는 표적 단백질의 K63-연결 유비퀴틴화에 기반하여 분석될 수 있다. 실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 Trim7 인산화, K63-연결 유비퀴틴화 및/또는 RACO-1로 알려진 AP-1 보조활성인자의 단백질 수준에 기반하여 분석될 수 있다. 실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 STING(인터페론 유전자의 자극제, MITA, ERIS, MPYS, TMEM173)의 수준 또는 활성에 기반하여 분석될 수 있다. 실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 STING의 K48-연결 유비퀴틴화를 통해 분석될 수 있다. 실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 IFNb, IP-10 및 Rantes의 상향조절이 분석될 수 있다. 실시형태에서, Trim7 경로 활성화는 도 6C에 나타낸 단백질의 활성화에 기반하여 분석될 수 있다.
미토겐-활성화 단백질 키나제 8 상호작용 단백질 1(Mapk8ip1)은 c-Jun-아미노-말단의 키나제-상호작용 단백질 1로도 알려져 있다. 실시형태에서, Mapk8ip1 경로 활성화는 RAC1 또는 RAC2, MAP3K11/MLK3 또는 MAP3K7/TAK1, MAP2K7/MKK7, MAPK8/JNK1 및/또는 MAPK9/JNK2를 포함하는 JNK 경로의 상이한 구성성분에서 기능성 다중단백질 복합체의 분석에 기반하여 분석될 수 있다. 실시형태에서, Mapk8ip1 경로 활성화는 세포자멸사에 의한 세포예정사에 대한 수준 및/또는 민감도에 기반하여 분석될 수 있다.
실시형태에서, ETS 유사-1 단백질(Elk1) 경로 활성화는 당업계에 잘 공지된 Ras-Raf-MEK-ERK 신호전달의 활성화에 기반하여 분석될 수 있다. 실시형태에서, Elk1 경로 활성화는 Elk1 인산화에 기반하여 분석될 수 있다. 실시형태에서, Elk1 경로 활성화는 당업계에 잘 공지된 Elk1 표적 유전자의 활성화에 기반하여 분석될 수 있다(예를 들어, 문헌[Odrowaz and Sharrocks, ELK1 Uses Different DNA Binding Modes to Regulate Functionally Distinct Classes of Target Genes, PLOS Genetics 8(5):e1002694 (2012)]).
실시형태에서, 류신-풍부 알파-2-당단백질 1(Lrg1) 경로 활성화는 TGFβ 및/또는 SMAD1/5/8 신호전달의 유도에 기반하여 분석될 수 있다.
실시형태에서, Ras 경로 활성화는 도 8C에 나타낸 단백질의 활성화에 기반하여 분석될 수 있다.
실시형태에서, Rap1 경로 활성화는 도 8D에 나타낸 단백질의 활성화에 기반하여 분석될 수 있다.
실시형태에서, 아르기나제 1(Arg1) 경로 활성화는 아르기닌의 오르니틴 및 유레아로의 가수분해 분석에 기반하여 분석될 수 있다. 실시형태에서, 아르기나제 1(Arg1) 경로 활성화는 종양 침윤성 림프구(TIL)의 억제에 기반하여 분석될 수 있다. 실시형태에서, 아르기나제 1(Arg1) 경로 활성화는 (L-오르니틴을 통해) 폴리아민의 수준 또는 합성에 기반하여 분석될 수 있다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료 방법에 관한 것이며, 암 요법을 투여하는 단계를 포함하는 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되고, 대상체는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항암 치료를 받은 적이 있거나 받고 있고, 대상체는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성의 결여가 발생되었다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (a) PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항암 치료를 투여하는 단계; (b) 대상체의 종양 크기 감소를 모니터링함으로써 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항암 치료에 의한 항-종양 반응을 평가하는 단계; (c) 종양 크기 감소의 결여가 관찰된다면, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되고; (d) 대상체의 종양 크기 감소를 모니터링함으로써 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항암 치료에 의한 항-종양 반응을 재평가하는 단계; 및 (e) 종양 크기 감소가 관찰되지 않는다면, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질의 투여를 중지하는 단계, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (a) PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항암 치료를 투여하는 단계; (b) (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (ii) TRIM7의 과발현 및/또는 활성화에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계를 이용하여, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항암 치료를 이용하여 항-종양 반응을 평가하는 단계; (c) N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 단계; (d) (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (ii) TRIM7의 과발현 및/또는 활성화에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계를 이용하여, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항암 치료를 이용하여 항-종양 반응을 재평가하는 단계; 및 (e) TRIM7의 과발현 및/또는 활성화가 관찰된다면, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질의 투여를 중지하는 단계를 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, (a) PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항암 치료를 투여하는 단계; (b) (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 (ii) TRIM7의 과발현 및/또는 활성화에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계를 이용하여 TRIM7의 과발현 및/또는 활성화를 평가하는 단계; (c) TRIM7의 과발현 및/또는 활성화가 관찰된다면, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 단계; (d) (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (ii) TRIM7의 과발현 및/또는 활성화에 대해 생물학적 샘플을 평가하는 단계를 이용하여, TRIM7의 과발현 및/또는 활성화를 재평가하는 단계; 및 (e) TRIM7의 과발현 및/또는 활성화가 관찰된다면, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질의 투여를 중지하는 단계를 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이며, 막관통 단백질은 TIGIT이고, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이며, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 링커는 제1 도메인을 제2 도메인에 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 접합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택된다.
실시형태에서, TRIM7의 과발현 및/또는 활성화는 생물학적 샘플을 Trim7 조절제로 처리함으로써 관찰된다. 실시형태에서, Trim7 조절제는 Trim 7 저해제이다. 실시형태에서, Trim7 조절제는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 RNA, 가이드 RNA(gRNA), 소분자, 항체, 펩타이드 및 펩타이드모방체(peptidomimetic)로부터 선택된다. 실시형태에서, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 RNA 또는 가이드 RNA(gRNA)는 Trim7 단백질의 생성을 저해한다. 실시형태에서, 펩타이드모방체는 Trim7의 표적을 모방하고, 이에 의해 Trim7의 활성을 저해한다. 실시형태에서, Trim 7 저해제는 MAAVGPRTGPGTGAEALALAAEL(서열번호 104), AATRAPPFPLPCP(서열번호 105), HGSQAAAARAAAARCG(서열번호 106) 및 NVSLKTFVLKGMLKKFKEDLRGELEKEEKV(서열번호 107)로부터 선택된 하나 이상의 Trim7 단백질 세그먼트에 의해 괄호로 묶은 영역을 표적화하는 소분자 또는 펩타이드 저해제이다. 실시형태에서, Trim7 조절제는 미토겐- 및 스트레스-활성화된 키나제 1(MSK1) 저해제이되, MSK1 저해제는 MSK1의 저해의 하류 효과를 통해 Trim7을 조절한다. 실시형태에서, MSK1 저해제는 Ro 31-8220, SB-747651A 및 H89로부터 선택된다. 실시형태에서, MSK1 저해제는 SB-747651A이다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 Trim7 경로에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제는 항체, 항체-유사 분자 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 본 명세서에서 확인된 Trim7 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 핵산 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 실시형태에서, 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브이다.
실시형태에서, 평가하는 단계는 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 분석함으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 인터페론 유전자(STING) 및/또는 AP-1 보조활성인자 RACO-1의 자극제의 단백질 유비퀴틴화 및/또는 K48-연결 유비퀴틴화를 분석함으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 Ras-Raf-MEK-ERK 신호전달을 통한 c-Jun/AP1 활성화 및/또는 AP1 매개 유전자 발현의 증가를 분석함으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 AP1 보조활성인자 RACO-1의 유비퀴틴화 및 안정화를 분석함으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 세포 증식 및 선천성 면역 반응과 관련된 단백질을 포함하는 표적 단백질의 K63-연결 유비퀴틴화를 분석함으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 AP-1 보조활성인자 RACO-1의 Trim7 인산화, K63-연결 유비퀴틴화 및/또는 단백질 수준을 분석함으로써 수행된다. 실시형태에서, 평가하는 단계는 IFNβ, IP-10 및/또는 Rantes의 상향조절을 분석함으로써 수행된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 유효량의 약제학적 조성물을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 암 치료 방법에 관한 것이며, 약제학적 조성물은 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단을 포함하는 키메라 단백질을 포함하되, (A) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 TIGIT이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는 (B) (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 막관통 단백질은 SIRPα이며, (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고 (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되며, 암은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항-관문 제제에 내성이 있거나 내성이 있는 것으로 여겨진다.
실시형태에서, 항-관문 제제는 니볼루맙(OPDIVO), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA), 피딜리주맙(CT-011, CURE TECH), MK-3475(MERCK), BMS 936559, MPDL328OA(ROCHE), 세미플리맙(LIBTAYO), 아테졸리주맙(TECENTRIQ), 아벨루맙(BAVENCIO) 및 더발루맙(imfinzi)으로부터 선택된 항체이다.
실시형태에서, 상기 방법은 항-관문 제제의 투여를 더 포함한다. 실시형태에서, 항-관문 제제는 니볼루맙(OPDIVO), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA), 피딜리주맙(CT-011, CURE TECH), MK-3475(MERCK), BMS 936559, MPDL328OA(ROCHE), 세미플리맙(LIBTAYO), 아테졸리주맙(TECENTRIQ), 아벨루맙(BAVENCIO) 및 더발루맙(imfinzi)으로부터 선택된 항체이다. 실시형태에서, 키메라 단백질 및 항-관문 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 일시에 또는 동시에 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 항-관문 제제가 투여된 후에 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 항-관문 제제가 투여된 전에 투여된다.
실시형태에서, 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 용량은 항-관문 제제에 의한 치료를 받은 적이 없거나 치료를 받고 있지 않은 대상체에게 투여되는 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 용량보다 더 적다. 실시형태에서, 투여되는 항-관문 제제의 용량은 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 의한 치료를 받은 적이 없거나 받고 있지 않은 대상체에게 투여되는 항-관문 제제의 용량보다 적다. 실시형태에서, 대상체는 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 의한 치료만을 받았거나 이런 치료만을 받고 있는 대상체에 비해 위장 염증 및 체중감소 없이 증가된 생존 기회, 및/또는 종양 크기 또는 암 유병률의 감소를 갖는다. 실시형태에서, 대상체는 항-관문 제제에 의한 치료만을 받았거나 이런 치료만을 받고 있는 대상체에 비해 위장 염증 및 체중감소 없이 증가된 생존 기회, 및/또는 종양 크기 또는 암 유병률의 감소를 갖는다.
제형
본 명세서에 기재된 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 무기산 또는 유기산과 반응할 수 있는 충분히 염기성인 작용기, 또는 무기 염기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 카복실기를 가져서 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 산 부가염은 당업계에 잘 공지된 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 산으로부터 형성된다. 이러한 염은, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 문헌[Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) 및 The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.), Verlag, Zurich (Switzerland) 2002]에 열거된 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태이다.
추가로, 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물의 구성성분으로서 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 선택적으로 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적 부형제는 석유, 동물, 식물성 또는 합성 유래, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 오일 및 물과 같은 액체일 수 있다. 약제학적 부형제는, 예를 들어, 식염수, 아카시아검, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드 실리카, 유레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체에게 투여될 때 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 멸균이다. 본 명세서에 기재된 임의의 제제가 정맥내로 투여될 때 물은 유용한 부형제이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 부형제로서, 구체적으로는 주사용 용액용으로 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 또한 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제제는, 원한다면, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 식염수 완충제(TBS, PBS 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음) 중에서 재현탁된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 반감기를 연장시키기 위해 또 다르게는 약력학적 및 약물동력학 특성을 개선시키기 위해 다른 제제와 접합되고/되거나 융합될 수 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 PEG, XTEN(예를 들어, rPEG로서), 폴리시알산(POLYXEN), 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 HAS), 엘라스틴-유사 단백질(ELP), PAS, HAP, GLK, CTP, 트랜스페린 등 중 하나 이상과 융합되거나 접합될 수 있다. 실시형태에서, 개개 키메라 단백질의 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[BioDrugs (2015) 29:215-239]에 기재된 제제 중 하나 이상에 융합된다.
투여, 투약 및 치료 요법
본 개시내용은 다양한 제형에서 기재된 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 용액, 현탁액, 에멀션, 점적, 정제, 알약, 펠릿, 캡슐, 액체를 함유하는 캡슐, 분말, 지속 방출 제형, 좌약, 에멀션, 에어로졸, 스프레이, 좌약의 형태 또는 사용에 적합한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다. 단백질 서열을 암호화하는 DNA 또는 RNA 작제물이 또한 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 캡슐 형태이다(예를 들어, 미국 특허 제5,698,155호 참조). 적합한 약제학적 부형제의 다른 예는 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995)]에 기재되어 있다.
필요한 경우, 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)을 포함하는 제형은 또한 가용화제를 포함할 수 있다. 또한, 제제는 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 비히클 또는 전달 장치에 의해 전달될 수 있다. 본 명세서에 약술된 병용 요법은 단일 전달 비히클 또는 전달 장치에서 공동 전달될 수 있다. 투여를 위한 조성물은 선택적으로, 예를 들어, 주사 부위에서 통증을 줄이기 위해 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)을 포함하는 제형은 단위 투약 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 약학 분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 치료제를 하나 이상의 부속 성분을 구성하는 담체와 합치는 단계를 포함한다. 전형적으로, 제형은 액체 담체, 미세하게 분할된 고체 담체, 또는 둘 다와 균일하게 그리고 친밀하게 합치고, 이어서, 필요하다면, 생성물을 목적하는 제형(예를 들어, 습식 또는 건식 과립, 분말 배합물 등, 다음에 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용하여 정제화)의 투약 형태로 성형함으로써 제조된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 본 명세서에 기재된 투여 방식에 적합한 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다.
투여 경로는, 특히 귀, 코, 눈 또는 피부에, 예를 들어, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 경구, 설하, 비강내, 대뇌내, 질내, 경피, 직장으로, 흡입에 의해 또는 국소를 포함한다. 실시형태에서, 투여하는 단계는 경구로 또는 비경구 주사에 의해 달성된다. 대부분의 예에서, 투여는 본 명세서에 기재된 임의의 제제의 혈류로의 방출을 초래한다.
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 경구 투여될 수 있다. 이러한 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 또한 임의의 다른 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 정맥내 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 내벽(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜에서의 캡슐화, 마이크로캡슐, 캡슐 등이 알려져 있으며, 투여를 위해 사용될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 영역에 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어, 암 치료에서, 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 종양 미세환경(예를 들어, 종양 세포를 둘러싸고/싸거나 공급하는 세포, 분자, 세포외 기질 및/또는 혈관, 예를 들어, 종양 혈관구조; 종양-침윤성 림프구; 섬유아세포 세망세포; 혈관내피 전구세포(EPC); 암관련 섬유아세포; 주피세포; 기타 간질 세포; 세포외 기질(ECM)의 구성성분; 수지상 세포; 항원 제시 세포; T-세포; 조절 T 세포; 대식세포; 호중구; 및 종양에 근접하여 위치된 다른 면역 세포를 포함) 또는 림프절에서 투여되고/되거나 종양 미세환경 또는 림프절으로 표적화된다. 실시형태에서, 예를 들어, 암 치료에서, 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 종양내로 투여된다.
다양한 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 통상적인 면역요법(예를 들어, OPDIVO, KEYTRUDA, YERVOY 및 TECENTRIQ 중 하나 이상에 의한 치료)에서 알수 있는 것보다 더 적은 부작용을 제공하는 이중 효과를 가능하게 한다. 예를 들어, 본 키메라 단백질은 피부, 위장관, 신장, 말초 및 중추 신경계, 간, 림프절, 눈, 췌장 및 내분비계를 포함하는 다양한 조직 및 기관에 영향을 미치는 통상적으로 관찰되는 면역-관련 이상반응; 예컨대, 뇌하수체염, 결장염, 간염, 폐렴, 발진 및 류마티스 질환을 감소시키거나 예방한다. 추가로, 예를 들어, 종양 내로의 본 국소 투여는 통상적인 면역요법(예를 들어, OPDIVO, KEYTRUDA, YERVOY 및 TECENTRIQ 중 하나 이상에 의한 치료)과 함께 사용된 바와 같은 표준 전신 투여, 예를 들어, IV 주입에 의해 보이는 이상반응을 제거한다.
비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복막내, 피하 및 관절내 주사 및 주입)에 적합한 투약형태는, 예를 들어, 용액, 현탁액, 분산액, 에멀션 등을 포함한다. 이들은 또한 사용 직전에 멸균 주사 매질 중에 용해 또는 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물(예를 들어, 동결건조 조성물)의 형태로 제작될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 당업계에 공지된 현탁제 또는 분산제를 함유할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)의 투약량뿐만 아니라 투약 스케줄은 치료 중인 질환, 대상체의 일반 건강상태 및 투여하는 의사의 재량을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 파라미터에 따를 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질은 추가 제제의 투여 전에(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 전에), 추가 제제의 투여와 병행하여 또는 후속적으로(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 후에) 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질 및 추가 제제는 1분 간격, 10분 간격, 30분 간격, 1시간 미만의 간격, 1시간 간격, 1시간 내지 2시간 간격, 2시간 내지 3시간 간격, 3시간 내지 4시간 간격, 4시간 내지 5시간 간격, 5시간 내지 6시간 간격, 6시간 내지 7시간 간격, 7시간 내지 8시간 간격, 8시간 내지 9시간 간격, 9시간 내지 10시간 간격, 10시간 내지 11시간 간격, 11시간 내지 12시간 간격, 1일 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 6일 간격, 1주 간격, 2주 간격, 3주 간격 또는 4주 간격으로 투여된다.
실시형태에서, 본 개시내용은 선천성 면역 반응을 유도하는 키메라 단백질과 적응 면역 반응을 유도하는 다른 키메라 단백질의 공동 투여에 관한 것이다. 이러한 실시형태에서, 선천성 면역 반응을 유도하는 키메라 단백질은 적응 면역 반응을 유도하는 키메라 단백질의 투여 전에, 투여와 병행하여 또는 투여에 후속하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질은 1분 간격, 10분 간격, 30분 간격, 1시간 미만 간격, 1시간 간격, 1시간 내지 2시간 간격, 2시간 내지 3시간 간격, 3시간 내지 4시간 간격, 4시간 내지 5시간 간격, 5시간 내지 6시간 간격, 6시간 내지 7시간 간격, 7시간 내지 8시간 간격, 8시간 내지 9시간 간격, 9시간 내지 10시간 간격, 10시간 내지 11시간 간격, 11시간 내지 12시간 간격, 1일 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 6일 간격, 1주 간격, 2주 간격, 3주 간격, 또는 4주 간격으로 투여될 수 있다. 예시적 실시형태에서, 선천성 면역 반응을 유도하는 키메라 단백질 및 적응 반응을 유도하는 키메라 단백질은 1주 간격으로 투여되거나, 또는 격주로 투여된다(즉, 적응 면역 반응 등을 유도하는 키메라 단백질의 투여 1주 후에 선천성 면역 반응을 유도하는 키메라 단백질의 투여가 이어진다).
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)의 투약량은 병태의 중증도, 병태가 치료 또는 예방되는지의 여부, 및 치료될 대상체의 연령, 체중 및 건강상태를 포함하는 여러 인자에 따를 것이다. 추가적으로, 특정 대상체에 관한 약물유전체학(약물동태학, 약력학 또는 치료제의 효능 프로파일에 대한 게놈형의 효과) 정보는 사용된 투약량에 영향을 미칠 수 있다. 더 나아가, 정확한 개개 투약량은 투여 중인 제제, 투여 시간, 투여 경로, 제형의 특성, 배설 속도, 치료 중인 특정 질환, 장애의 중증도, 및 장애의 해부학적 위치의 구체적 조합을 포함하는 다양한 인자에 따라 다소 조절될 수 있다. 투약량의 일부 변화가 예상될 수 있다.
비경구 주사에 의한 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)에 대해, 투약량은 1일당 약 0.1㎎ 내지 약 250㎎, 1일당 약 1㎎ 내지 약 20㎎, 또는 1일당 약 3㎎ 내지 약 5㎎일 수 있다. 일반적으로, 경구 또는 비경구로 투여될 때, 본 명세서에 기재된 임의의 제제의 투약량은 1일당 약 0.1㎎ 내지 약 1500㎎, 또는 1일당 약 0.5㎎ 내지 약 10㎎, 또는 1일당 약 0.5㎎ 내지 약 5㎎, 또는 1일당 약 200 내지 약 1,200㎎(예를 들어, 1일당 또는 1주당 약 200㎎, 약 300㎎, 약 400㎎, 약 500㎎, 약 600㎎, 약 700㎎, 약 800㎎, 약 900㎎, 약 1,000㎎, 약 1,100㎎, 약 1,200㎎, 약 1300㎎, 약 1400㎎, 약 1500㎎, 약 1600㎎, 약 1700㎎, 약 1800㎎, 약 1900㎎, 약 2,000㎎, 약 2,100㎎, 약 2,200㎎, 약 2300㎎, 약 2400㎎, 약 2500㎎, 약 2600㎎, 약 2700㎎, 약 2800㎎, 약 2900㎎, 약 3,000㎎, 약 3,100㎎, 약 3,200㎎, 약 3300㎎, 약 3400㎎, 약 3500㎎, 약 3600㎎, 약 3700㎎, 약 3800㎎, 약 3900㎎, 약 4,000㎎, 약 4,100㎎, 약 4,200㎎, 약 4300㎎, 약 4400㎎, 약 4500㎎, 약 4600㎎, 약 4700㎎, 약 4800㎎, 약 4900㎎, 약 5000㎎)이다.
실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)의 투여는 치료당 약 0.1㎎ 내지 약 1500㎎, 또는 치료당 약 0.5㎎ 내지 약 10㎎, 또는 치료당 약 0.5㎎ 내지 약 5㎎, 또는 치료당 약 200 내지 약 1,200㎎(예를 들어, 치료당 약 200㎎, 약 300㎎, 약 400㎎, 약 500㎎, 약 600㎎, 약 700㎎, 약 800㎎, 약 900㎎, 약 1,000㎎, 약 1,100㎎, 약 1,200㎎, 약 1300㎎, 약 1400㎎, 약 1500㎎, 약 1600㎎, 약 1700㎎, 약 1800㎎, 약 1900㎎, 약 2,000㎎, 약 2,100㎎, 약 2,200㎎, 약 2300㎎, 약 2400㎎, 약 2500㎎, 약 2600㎎, 약 2700㎎, 약 2800㎎, 약 2900㎎, 약 3,000㎎, 약 3,100㎎, 약 3,200㎎, 약 3300㎎, 약 3400㎎, 약 3500㎎, 약 3600㎎, 약 3700㎎, 약 3800㎎, 약 3900㎎, 약 4,000㎎, 약 4,100㎎, 약 4,200㎎, 약 4300㎎, 약 4400㎎, 약 4500㎎, 약 4600㎎, 약 4700㎎, 약 4800㎎, 약 4900㎎, 약 5000㎎)의 투약량으로 비경구 주사 또는 주입에 의한다.
실시형태에서, 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)의 적합한 투약량은 대상체의 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 또는 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 체중, 예를 들어, 또는 약 0.01㎎/㎏, 또는 약 0.02㎎/㎏, 또는 약 0.03㎎/㎏, 또는 약 0.04㎎/㎏, 또는 약 0.05㎎/㎏, 또는 약 0.06㎎/㎏, 또는 약 0.07㎎/㎏, 또는 약 0.08㎎/㎏, 또는 약 0.09㎎/㎏, 또는 약 0.1㎎/㎏, 또는 약 0.2㎎/㎏, 또는 약 0.3㎎/㎏, 또는 약 0.4㎎/㎏, 또는 약 0.5㎎/㎏, 또는 약 0.6㎎/㎏, 또는 약 0.7㎎/㎏, 또는 약 0.8㎎/㎏, 또는 약 0.9㎎/㎏, 또는 약 1㎎/㎏, 또는 약 1.1㎎/㎏, 또는 약 1.2㎎/㎏, 또는 약 1.3㎎/㎏, 또는 약 1.4㎎/㎏, 또는 약 1.5㎎/㎏, 또는 약 1.6㎎/㎏, 또는 약 1.7㎎/㎏, 또는 약 1.8㎎/㎏, 1.9㎎/㎏, 또는 약 2㎎/㎏, 또는 약 3㎎/㎏, 또는 약 4㎎/㎏, 또는 약 5㎎/㎏, 또는 약 6㎎/㎏, 또는 약 7㎎/㎏, 또는 약 8㎎/㎏, 또는 약 9㎎/㎏, 또는 약 10㎎/㎏, 또는 약 11㎎/㎏, 또는 약 12㎎/㎏, 또는 약 13㎎/㎏, 또는 약 14㎎/㎏, 또는 약 15㎎/㎏, 또는 약 16㎎/㎏, 또는 약 17㎎/㎏, 또는 약 18㎎/㎏, 또는 약 19㎎/㎏, 또는 약 20㎎/㎏, 또는 약 21㎎/㎏, 또는 약 22㎎/㎏, 또는 약 23㎎/㎏, 또는 약 24㎎/㎏, 또는 약 25㎎/㎏, 또는 약 26㎎/㎏, 또는 약 27㎎/㎏, 또는 약 28㎎/㎏, 또는 약 29㎎/㎏, 또는 약 30㎎/㎏, 또는 약 31㎎/㎏, 또는 약 32㎎/㎏, 또는 약 33㎎/㎏, 또는 약 34㎎/㎏, 또는 약 35㎎/㎏, 또는 약 36㎎/㎏, 또는 약 37㎎/㎏, 또는 약 38㎎/㎏, 또는 약 39㎎/㎏, 또는 약 40㎎/㎏, 또는 약 41㎎/㎏, 또는 약 42㎎/㎏, 또는 약 43㎎/㎏, 또는 약 44㎎/㎏, 또는 약 45㎎/㎏, 또는 약 46㎎/㎏, 또는 약 47㎎/㎏, 또는 약 48㎎/㎏, 또는 약 49㎎/㎏, 또는 약 50㎎/㎏, 또는 약 75㎎/㎏의 체중(그 사이의 모든 값 및 범위를 포함)의 범위이다.
다른 실시형태에서, 전달은 소수포, 특히 리포솜일 수 있다(문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365(1989)] 참조).
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 제어 방출 또는 지속 방출 수단에 의해 또는 당업자에게 잘 공지된 전달 장치에 의해 투여될 수 있다. 예는 미국 특허 제3,845,770호; 제3,916,899호; 제3,536,809호; 제3,598,123호; 제4,008,719호; 제5,674,533호; 제5,059,595호; 제5,591,767호; 제5,120,548호; 제5,073,543호; 제5,639,476호; 제5,354,556호; 및 제5,733,556호에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이들 각각은 이의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 이러한 투약 형태는 다양한 비율로 목적하는 방출 프로파일을 제공하기 위해, 예를 들어, 하이드로프로필메틸 셀룰로스, 다른 중합체 기질, 겔, 침투성 막, 삼투 시스템, 다중층 코팅, 마이크로입자, 리포솜, 마이크로스피어, 또는 이들의 조합물를 이용하여 1종 이상의 활성 성분의 제어 또는 지속 방출을 제공하는 데 유용할 수 있다. 활성 성분의 제어 또는 지속 방출은 pH의 변화, 온도 변화, 적절한 파장의 광에 의한 자극, 효소의 농도 또는 이용 가능성, 물의 농도 또는 이용 가능성 또는 다른 생리적 조건 또는 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 조건에 의해 자극될 수 있다.
다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조).
다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템은 치료될 표적 영역의 근위에 위치될 수 있고, 치료될 표적 영역의 근위에 위치될 수 있고, 따라서, 전신 용량의 분획만을 필요로 한다(예를 들어, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 검토에 논의된 다른 제어 방출 시스템이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)의 투여는 독립적으로 1일당 1 내지 4회 또는 1개월당 1 내지 4회 또는 1년당 1 내지 6회 또는 2, 3, 4 또는 5년마다 1회일 수 있다. 투여는 1일 또는 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년의 지속기간 동안일 수 있고, 심지어 대상체의 수명 동안 일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)을 이용한 투약 요법은 대상체의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 병태; 치료될 병태의 중증도; 투여 경로; 대상체의 신장 또는 간 기능; 개체의 약물유전체학 구성; 및 사용되는 본 발명의 특정 화합물을 포함하는 다수의 인자에 따라 선택될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 단일 1일 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 총 1일 투약량은 1일에 2, 3 또는 4회의 분할 용량으로 투여될 수 있다. 더 나아가, 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)은 투약 요법 내내 간헐적이기보다는 지속적으로 투여될 수 있다.
림프구 변연화, 효능 평가를 유도하고 환자를 선택하는 치료 방법
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 (c)는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다, 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다 선택된 투약 요법으로 인간 LIGHT(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고 CD258 또는 TNFSF14로도 알려진 T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 또는 약 2주마다 내지 약 4주마다이다.
일부 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 면역 조절을 향상, 회복, 촉진 및/또는 자극할 수 있거나, 이를 수반하는 방법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 본 키메라 단백질은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 종양 세포에 대해 하나 이상의 면역 세포의 활성 또는 활성화를 회복, 촉진 및/또는 자극한다: T 세포, 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 항-종양 대식세포(예를 들어, M1 대식세포), B 세포 및 수지상 세포. 일부 실시형태에서, 본 키메라 단백질은, 비제한적 예시의 방법에 의해, 생존전 신호를 비롯한 하나 이상의 T- 세포 고유 신호의 활성화 및/또는 자극; 자가분비 또는 주변분비 성장 신호; p38 MAPK-, ERK-, STAT-, JAK-, AKT- 또는 PI3K-매개 신호; 항-세포자멸사 신호; 및/또는 신호 촉진성, 및/또는 전염증 사이토카인 생성 또는 T 세포 이동 또는 T 세포 종양 침윤 중 하나 이상에 필수적을 포함하는, T 세포의 활성 및/또는 활성화를 향상, 회복, 촉진 및/또는 자극한다.
일부 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 종양 또는 종양 미세환경 내로의 T 세포(세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포(예를 들어, M1 및 M2 중 하나 이상) 중 하나 이상의 증가를 야기할 수 있거나 야기하는 것을 수반하는 방법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 CD8+ T 세포에 의한 종양 항원, 특히 종양 미세환경에 침윤된 해당 T 세포의 인식을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 CD19 발현을 유도하고/하거나 CD19 양성 세포(예를 들어, CD19 양성 B 세포) 수를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 IL-15Rα 발현을 유도하고/하거나 IL-15Rα 양성 세포(예를 들어, IL-15Rα 양성 수지상 세포)의 수를 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 특히 종양 및/또는 종양 미세환경(TME) 내에서 면역억제 세포(예를 들어, 골수성-유래 억제 세포(MDSC), 조절 T 세포(Treg), 종양 관련 호중구(TAN), M2 대식세포 및 종양 관련 대식세포(TAM))의 저해하고/하거나 감소를 야기하는 것을 수반할 수 있거나, 수반하는 방법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 본 요법은 M1 대식세포를 선호하도록 종양 부위 및/또는 TME에서 M1 대 M2 대식세포의 비를 변경시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12) 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 사이토카인의 혈청 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 키메라 단백질은 치료 대상체의 혈청에서 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)를 향상시킬 수 있다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, CD258 또는 TNFSF14로도 알려진 T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함). 일부 실시형태에서, 대상체는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된 투약 요법으로 투약된다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 또는 약 2주마다 내지 약 4주마다이다. 일부 실시형태에서, 초기 용량은 약 0.03㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏, 약 1㎎/㎏, 약 2㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 4㎎/㎏, 약 5㎎/㎏, 약 6㎎/㎏, 약 7㎎/㎏, 약 8㎎/㎏, 약 9㎎/㎏, 약 10㎎/㎏, 약 12㎎/㎏, 약 15㎎/㎏, 약 18㎎/㎏, 약 21㎎/㎏, 약 24㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 27㎎/㎏, 약 30㎎/㎏, 약 33㎎/㎏, 약 35㎎/㎏, 약 36㎎/㎏, 약 40㎎/㎏, 약 42㎎/㎏, 약 45㎎/㎏, 약 48㎎/㎏, 및 약 50㎎/㎏으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 0.03㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏, 약 1㎎/㎏, 약 2㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 4㎎/㎏, 약 5㎎/㎏, 약 6㎎/㎏, 약 7㎎/㎏, 약 8㎎/㎏, 약 9㎎/㎏, 약 10㎎/㎏, 약 12㎎/㎏, 약 15㎎/㎏, 약 18㎎/㎏, 약 21㎎/㎏, 약 24㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 27㎎/㎏, 약 30㎎/㎏, 약 33㎎/㎏, 약 35㎎/㎏, 약 36㎎/㎏, 약 40㎎/㎏, 약 42㎎/㎏, 약 45㎎/㎏, 약 48㎎/㎏, 및 약 50㎎/㎏으로부터 선택된다. 실시형태에서, 용량은 1주 1회 또는 2주마다 1회 스케줄로 투여된다. 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에 대한 프라이밍 용량의 투여를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 림프구 확장 유도를 필요로 하는 대상체에서 림프구 확장을 유도하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, CD258 또는 TNFSF14로도 알려진 T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함). 일부 실시형태에서, 대상체는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된 투약 요법으로 투약된다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 또는 약 2주마다 내지 약 4주마다이다. 일부 실시형태에서, 초기 용량은 약 0.03㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏, 약 1㎎/㎏, 약 2㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 4㎎/㎏, 약 5㎎/㎏, 약 6㎎/㎏, 약 7㎎/㎏, 약 8㎎/㎏, 약 9㎎/㎏, 약 10㎎/㎏, 약 12㎎/㎏, 약 15㎎/㎏, 약 18㎎/㎏, 약 21㎎/㎏, 약 24㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 27㎎/㎏, 약 30㎎/㎏, 약 33㎎/㎏, 약 35㎎/㎏, 약 36㎎/㎏, 약 40㎎/㎏, 약 42㎎/㎏, 약 45㎎/㎏, 약 48㎎/㎏, 및 약 50㎎/㎏으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 0.03㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏, 약 1㎎/㎏, 약 2㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 4㎎/㎏, 약 5㎎/㎏, 약 6㎎/㎏, 약 7㎎/㎏, 약 8㎎/㎏, 약 9㎎/㎏, 약 10㎎/㎏, 약 12㎎/㎏, 약 15㎎/㎏, 약 18㎎/㎏, 약 21㎎/㎏, 약 24㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 27㎎/㎏, 약 30㎎/㎏, 약 33㎎/㎏, 약 35㎎/㎏, 약 36㎎/㎏, 약 40㎎/㎏, 약 42㎎/㎏, 약 45㎎/㎏, 약 48㎎/㎏, 및 약 50㎎/㎏으로부터 선택된다. 실시형태에서, 용량은 1주 1회 또는 2주마다 1회 스케줄로 투여된다. 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에 대한 프라이밍 용량의 투여를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 림프구 변연화 유도를 필요로 하는 대상체에서 림프구 변연화를 유도하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며, 그리고 (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, CD258 또는 TNFSF14로도 알려진 T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함). 일부 실시형태에서, 대상체는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된 투약 요법으로 투약된다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 또는 약 2주마다 내지 약 4주마다이다. 일부 실시형태에서, 초기 용량은 약 0.03㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏, 약 1㎎/㎏, 약 2㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 4㎎/㎏, 약 5㎎/㎏, 약 6㎎/㎏, 약 7㎎/㎏, 약 8㎎/㎏, 약 9㎎/㎏, 약 10㎎/㎏, 약 12㎎/㎏, 약 15㎎/㎏, 약 18㎎/㎏, 약 21㎎/㎏, 약 24㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 27㎎/㎏, 약 30㎎/㎏, 약 33㎎/㎏, 약 35㎎/㎏, 약 36㎎/㎏, 약 40㎎/㎏, 약 42㎎/㎏, 약 45㎎/㎏, 약 48㎎/㎏, 및 약 50㎎/㎏으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 0.03㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏, 약 1㎎/㎏, 약 2㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 4㎎/㎏, 약 5㎎/㎏, 약 6㎎/㎏, 약 7㎎/㎏, 약 8㎎/㎏, 약 9㎎/㎏, 약 10㎎/㎏, 약 12㎎/㎏, 약 15㎎/㎏, 약 18㎎/㎏, 약 21㎎/㎏, 약 24㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 27㎎/㎏, 약 30㎎/㎏, 약 33㎎/㎏, 약 35㎎/㎏, 약 36㎎/㎏, 약 40㎎/㎏, 약 42㎎/㎏, 약 45㎎/㎏, 약 48㎎/㎏, 및 약 50㎎/㎏으로부터 선택된다. 실시형태에서, 용량은 1주 1회 또는 2주마다 1회 스케줄로 투여된다. 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에 대한 프라이밍 용량의 투여를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질의 용량을 투여하는 단계로서, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 인간 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 (c)는 인간 LIGHT(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, CD258 또는 TNFSF14로도 알려진 T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대한 HSV 당단백질 D와 경쟁함)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏인, 단계; 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 생물학적 샘플에 대한 분석을 수행하여 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체가 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성 증가를 갖는다면 투약을 계속하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 요법에 의한 치료를 위해 대상체를 선택하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질의 용량을 투여하는 단계로서, (a)는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 인간 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 (c)는 인간 LIGHT(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, CD258 또는 TNFSF14로도 알려진 T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대한 HSV 당단백질 D와 경쟁함)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏인, 단계; 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 생물학적 샘플에 대한 분석을 수행하여 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체가 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성 증가를 갖는다면 암 요법에 의한 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
실시예
본 명세서의 실시예는 본 개시내용의 이점 및 유익을 예시하고, 항-PD-1, 항-PD-L1 및/또는 항-PD-L2 요법에 내성인 세포를 제조하거나 이용하여 당업자를 추가로 돕기 위해 제공된다. 본 명세서의 실시예는 본 개시내용의 바람직한 양성을 더욱 완전히 예시하기 위해 제시된다. 실시예는 첨부하는 청구범위에 의해 규정된다면 결코 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실시예는 상기 기재된 본 개시내용의 임의의 변형, 양상 또는 실시형태를 포함하거나 원용할 수 있다. 상기 기재된 변화, 양상 또는 실시형태는 또한 추가로 각각 본 개시내용의 임의의 또는 모든 다른 변화, 양상 또는 실시형태를 포함하거나 원용할 수 있다.
실시예 1: 항-PD-1-내성 CT26 종양의 생성
뮤린 결장 암종 CT26 세포는 항-PD-1- 항체 내성 CT26 세포를 생성하기 위해 항-PD-1 처리를 생존을 위한 선택에 적용하였다. 항-PD-1-내성 CT26 종양 세포의 생성에 사용한 방법은 도 1A에 도시된다. 간략하게, BALB/C 마우스를 Jackson Laboratory로부터 획득하였고, 며칠의 순응 후에, 마우스를 뒤 옆구리 상에서 500,000개의 뮤린 결장 암종 CT26 세포로 접종하였다. 평균 종양 용적이 80 내지 100㎣에 도달되었을 때(제0일로 표시), 마우스에 제0일, 제3일 및 제6일에 100㎍의 항-PD-1(클론 RMP1-14; BioXcell)의 일련의 복강내 주사를 제공하였다. 초기 처리 후 대략 10 내지 14일에 항-PD-1 요법에 반응하지 않은 마우스로부터 종양을 절개하였다. 콜라게나제(StemCell Technologies)를 이용하여 종양을 분리시키고, 1× PBS 중에서 세척하고, 10% 소 태아 혈청, 1% GLUTiMAX 및 1% 항생제-항진균제(모두 GIBCO)로 보충한 IMDM 배양 배지에 플레이팅하였다. 세포를 적어도 5회 계대시키고, 이어서, 위에 기재한 것에 따라 새로운 수용자 마우스에 접종하였다(라운드 2). 또한, 종양이 80 내지 100㎣에 도달되었을 때, 항-PD-1의 다른 치료 과정을 개시하였고: 100㎍ 항-PD-1(클론 RMP1-14; BioXcell)의 복강내 주사를 제0일, 제3일 및 제6일에 투여하였다. 이 과정을 총 4회 라운드 동안 반복하였고, 이 시점에 치료된 마우스 중 어느 것도 항-PD-1 요법에 반응하지 않았다. 항-PD-1 선택의 2회 라운드 후에 생성된 세포주는 본 개시내용 전체적으로 "제2 라운드", "2세대" 또는 "F2 세대"로 지칭된다. 4 라운드의 항-PD-1 선택 후에 생성된 세포주는 "제4 라운드", "4세대" 또는 "F4 세대"로 지칭된다.
CT26 세포- 또는 항-PD-1-항체 내성 CT26 세포-동종 이식편에서 항-PD-1 항체의 효능을 비교하였다. 간략하게, BALB/C 마우스는 뒤 옆구리에서 CT26 모 세포 및 PD-1 내성 4세대 세포를 접종하였다. 시작 종양 용적(STV)이 80 내지 100㎣에 도달되었을 때, 마우스를 다음의 두 처리군에서 무작위로 나누었다: (1) 비히클(PBS), 및 (2) 항-PD-1 항체. 마우스에 제0일, 제3일 및 제6일에 비히클 또는 100㎍ 항-PD-1(클론 RMP1-14; BioXcell)의 일련의 복강내 주사를 제공하였다. 표시일에 종양 용적을 측정하였고, 시간의 함수로서 플롯팅하였다. 도 1B에 나타낸 바와 같이, CT26 모체 세포 종양의 성장은 비히클-단독 대조군에 비해 항-PD-1 항체로 처리하였을 때 유의미하게 지연되었다(도 1B의 회색 실선과 검정 실선을 비교). 대조적으로, PD-1 내성 세포는 종양 지연이 있다고 해도 거의 나타나지 않았다. 이들 결과는 특히 항-PD-1 내성 세포의 항-PD-1 내성이 면역 적격 마우스에서 요법(획득 내성) 후에 발생되었다는 것을 입증한다.
따라서, 항-PD-1 항체-내성 세포가 발생되었다. 또한, 항-PD-1 내성 세포를 보유하는 세포의 마우스 모델이 발생되었다. 따라서, 본 명세서에 개시된 마우스 모델은 항-PD-1-항체 내성 CT26 세포-동종 이식편을 보유하는 마우스에게 항암 약물 후보를 투여하고, 항암 약물 후보가 암 성장을 늦추거나 저해하는 데 효과적인지의 여부를 평가함으로써 항암 약물 후보를 시험하는 데 유용하다. 암 성장을 늦추거나 또는 저해하는 데 효과적인 항암 약물 또는 후보는 인간 환자에 대한 투여용으로 제형화될 수 있다.
실시예 2: RNA-seq를 이용한 항-PD-1 내성 세포주의 전사체 프로파일링
모체 CT26 세포(ATCC; "실험 복제물")의 3개의 별개의 바이알, "제2 라운드" 마우스로부터의 2개의 독립적으로 단리된 종양, "제4 라운드" 마우스로부터의 4개의 독립적으로 단리된 종양(둘 다 "생물학적 복제물")을 20ng/㎖의 마우스 IFNγ(Biolegend)의 유무와 상관없이 24시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양시켰다. 다음 날, QIASHREDDER 균질화 및 칼럼 상의 DNaseI 분해를 포함하는 제조업자의 지침에 따라 Qiagen RNeasy 시약을 이용하여 세포로부터 RNA를 단리시켰다. 단리된 RNA에 RNA-seq 및 데이터 분석을 실시하였다. 간략하게, 서열분석 라이브러리를 생성하였고, ILLUMINA HISEQ(2×150 짝지어진 단부 판독(paired end read)) 상에서 서열분석하여, 샘플당 20×106개 초과의 판독을 표적화하였다. TRIMMOMATIC v.0.36을 이용하여 서열을 다듬고, STAR ALIGNER v.2.5.2b를 이용하여 무스 무스쿨루스(Mus musculus) GRCm38 참조 게놈에 맵핑하였다. SUBREAD 패키지 v.1.5.2로부터 FEATURECOUNTS를 이용함으로써 고유 유전자 히트 계수를 계산하였다. 엑손 영역 내에 속하는 고유 판독만을 계산하였다. DESeq2를 이용하여 차별 유전자 발현을 결정하였고, Wald 검정을 사용하여 p-값 및 log2 배수 변화를 생성하였다; 1초과의 log2 배수 변화 및 유의도에 대한 컷오프로서 0.05 미만의 조정된 p-값을 이용함.
도 2A(상단 패널)에 나타낸 바와 같이, 주성분 분석(PCA)은 샘플이 전사체 발현에 기반하여 공간적으로 분리될 수 있다는 것을 예시하였다. 차별 발현 유전자(Differentially Expressed Gene: DEG)를 그룹(모체 대 2세대, 모체 대 4세대, 2세대 대 4세대) 간에 결정하였고, 히트맵에 플롯팅하였다. 도 2A(하단 패널)에 나타낸 바와 같이, 계층적 클러스터링을 수행하여 각 행에서 순서 유전자에 순위를 매기고, 각 비교에서 유전자를 2개의 주요 클러스터로 분리하였으며, 여기서, 유전자 발현의 서브세트는 하나의 데이터세트에서 더 낮았고(청색) 다른 데이터세트에서 더 높았다(적색). 이어서, 각 유전자 세트와 관련된 유전자 온톨로지(GO)를 확인하기 위해 PANTHER 적용을 이용하여 유전자에 분석을 실시하였다. 유전자 세트를 관련된 p-값과 함께 나타낸다. 각 데이터세트에서 상향- 또는 하향-조절된 유전자를 확인하였다. 도 2B에 나타낸 바와 같이, 다음의 GO와 관련된 유전자를 모체 CT26 세포: 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절 및 세포 증식의 조절에 비해 2세대 세포에서 상향조절하였다. 다음의 GO와 관련된 유전자는 모체 CT26 세포에 비해 2세대 세포에서 하향조절되었다: 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체 및 혈장막 수선(도 2B). 추가로, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 다음의 GO와 관련된 유전자는 모체 CT26 세포에 비해 4세대 세포에서 상향조절되었다: IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, 선천적 면역 반응의 조절. 이는 특히 IFNγ에 대한 세포 반응이 항-PD-1 및 다른 면역치료제에 대한 민감성에 관련된다는 것이 널리 알려져 있기 때문에 놀랍다. 다음의 GO와 관련된 유전자는 모체 CT26 세포에 비해 4세대 세포에서 하향조절되었다: 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절(도 2B). 흥미롭게도, 다음의 GO와 관련된 유전자는 2세대 세포에 비해 4세대 세포에서 상향조절되었다: IFNγ에 대한 세포 반응, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 항원 처리/MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시(도 2B). 다음의 GO와 관련된 유전자는 2세대 세포에 비해 4세대 세포에서 하향조절되었다: 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정(도 2B). 모든 데이터세트 사이의 유전자 발현에서의 중복의 벤 다이어그램을 생성하였다. 도 2C(상단 패널)에 나타낸 바와 같이, DEG는 4세대 세포와 2세대 세포 사이의 유의미한 중첩을 나타냈다. 도 2A(하단 패널)는 선택 유전자에서의 백만개당 전사체(TPM; 정규화된 발현 데이터)를 나타내며, 이는 다른 데이터세트의 다른 것보다 더, PD-L1, 항원 처리/제시, 단백질 번역, ER 수송과 관련된 유전자의 더 높은 기준선 발현을 입증한다. 도 2C(하단 패널)에 나타낸 바와 같이, 유전자 Cd274, B2M, Tap1, Tap2, Casp1 및 Gasta3은 CT26 모 세포에서 2세대 세포까지 그리고 4세대 세포까지 계속해서 증가되는 발현을 나타냈다. 추가로, 유전자 Rpl41, Rps15 및 Rps8은 CT26 모 세포에서 2세대 세포까지 그리고 4세대 세포까지 계속해서 감소되는 발현을 나타냈다(도 2C(하단 패널)). 도 2D에 나타낸 바와 같이, 유전자 Stat1, Stat2, Irf, Ltbr 및 Pvr은 CT26 모 세포에서 2세대 세포까지 그리고 4세대 세포까지 계속해서 증가되는 발현을 나타냈다.
이들 결과는 특히 항-PD-1 요법에 대해 획득 내성과 관련된 바이오마커를 확립한다. 이러한 바이오마커는 항-PD-1 요법이 유리할 수 있는 환자 또는 항-PD-1 요법이 유리하지 않은 환자를 확인하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 이들 바이오마커에 기반하여, 환자는 환자로부터의 생물학적 샘플에서 본 명세서에 개시된 하나 이상의 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 유전자의 존재, 부재 또는 수준에 대해 샘플을 평가하는 것에 기반한 항-PD-1 요법에 의한 처리를 위해 선택될 수 있다. PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법은, 예를 들어, Rpl41, Rps15 및 Rps8 중 하나 이상의 발현이 높고/높거나 Cd274, B2m, Tap1, Tap2, Casp1 및 Gasta3 중 하나 이상의 발현이 낮을 때, 지시될 수 있다. 대조적으로, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법은, 예를 들어, Rpl41, Rps15 및 Rps8 중 하나 이상의 발현이 낮고/낮거나 Cd274, B2m, Tap1, Tap2, Casp1 및 Gasta3 중 하나 이상의 발현이 높을 때, 지시되지 않을 수 있다. Rpl41, Rps15 및 Rps8 중 하나 이상의 저발현 및/또는 Cd274, B2m, Tap1, Tap2, Casp1 및 Gasta3 중 하나 이상의 고발현을 특징으로 하는 환자는 PD-1-비반응성 세포를 제거하는 면역보강 또는 신면역보강 요법으로부터 유익을 얻을 가능성이 있다.
실시예 3: 항-PD-1 내성 CT26에서 PD-L1, PD-L2, MHC 클래스 I 및 β2 마이크로글로불린의 세포 표면 발현
Cd274 (PD-L1), β2 마이크로글로불린(B2m), 및 Tap1 및 Tap2 유전자(소포체에 대한 주조직적합 복합체 클래스 I-관련 항원의 가공 및 수송에 잠재적으로 관련됨)는 CT26 모 세포에서 2세대 세포까지 그리고 4세대 세포까지 계속해서 하향조절되었기 때문에, PD-L1, PD-L2, MHC 클래스 I 및 β2 마이크로글로불린(B2m)의 표면 발현을 연구하였다. 간략하게, 모체를 배양물로부터 채취하고, PD-L1, PD-L2, MHC 클래스 I 및 β2 마이크로글로불린(B2M)의 표면 발현을 위해 유세포분석에 의해 분석하였다. 게이트를 나타낸 바와 같이 도시하고, 각 플롯 위에는 각 게이트의 세포 백분율을 나타내며, 각 백분율 우측에는, 각 마커의 MFI(평균 형광 강도)를 표시한다. 도 3에 나타낸 바와 같이, PD-L1, MHC 클래스 I 및 β2 마이크로글로불린(B2M)의 표면 발현은 모 세포에 비해 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 하향조절되지 않았다. 반면에, PD-L2의 표면 발현은 모 세포에 비해 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 하향조절되었다. 이들 데이터는 유전자 발현 및 세포 표면 단백질 발현의 부조화가 RNA 발현에 비해 PD-L1/2 MHC 클래스 I 및 B2M에서 표면 발현이 관찰되었다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 항-PD-1 내성 세포주 및 주요 내성 항-PD-1 내성 세포주의 전사체 프로파일링
다음에, 2세대 및 4세대 항-PD-1 내성 세포주의 전사체 프로파일을 서로 비교에 의해 그리고 항-PD-1 주요 내성 세포주와의 비교에 의해 연구하였다. B16.F10 뮤린 흑색종 종양 세포주를, 이들 종양이 항-PD-1 요법에 반응하지 않기 때문에 항-PD-1 "1차 내성"의 모델로서 사용하였다. 모체 CT26 세포(ATCC; "실험 복제물")의 3개의 별개의 바이알, "제2 라운드" 마우스로부터의 2개의 독립적으로 단리된 종양, "제4 라운드" 마우스로부터의 4개의 독립적으로 단리된 종양(둘 다 "생물학적 복제물"), 및 모체 B16.F10 세포의 2개의 별개의 바이알(ATCC; "실험 복제물)을 20ng/㎖의 마우스 IFNγ(Biolegend) 유무와 상관없이 24시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양시켜 시험관내 반응성을 평가하였다. 이는 면역 세포 침윤물로서 생체내에서 종양 세포가 반응하는 방법을 모방하고, IFNγ와 같은 효과기 사이토카인을 분비한다. 다음 날, QIASHREDDER 균질화 및 칼럼 상의 DNaseI 분해를 포함하는 제조업자의 지침에 따라 Qiagen RNeasy 시약을 이용하여 세포로부터 RNA를 단리시켰다. 단리된 RNA에 RNA-seq 및 데이터 분석을 실시하였다. 간략하게, 서열분석 라이브러리를 생성하였고, ILLUMINA HISEQ(2×150 짝지어진 단부 판독) 상에서 서열분석하여, 샘플당 20×106개 초과의 판독을 표적화하였다. TRIMMOMATIC v.0.36을 이용하여 서열을 다듬고, STAR ALIGNER v.2.5.2b를 이용하여 무스 무스쿨루스(Mus musculus) GRCm38 참조 게놈에 맵핑하였다. SUBREAD 패키지 v.1.5.2로부터 FEATURECOUNTS를 이용함으로써 고유 유전자 히트 계수를 계산하였다. 엑손 영역 내에 속하는 고유 판독만을 계산하였다. DESeq2를 이용하여 차별 유전자 발현을 결정하였고, Wald 검정을 사용하여 p-값 및 log2 배수 변화를 생성하였다; 1초과의 log2 배수 변화 및 유의도에 대한 컷오프로서 0.05 미만의 조정된 p-값을 이용함. DEG를 비처리와 IFNγ 처리 모체 CT26 사이에서 확인하였다. 도 4A(좌측 패널)에 나타낸 바와 같이, Log2 배수 변화는 히트맵에 플롯팅하였고, 유전자는 모체 CT26에 기반하여 계층적 클러스터링된다. 이 중에서, 338개의 유전자는 다른 데이터세트로부터의 사용 가능한 데이터를 갖고; 해당 값은 다른 열에 나타낸다(도 4A(좌측 패널)). 유전자를 3개의 주요 클러스터로 분리시켰다(도 4A(좌측 패널)). 관련 유전자를 하향조절된 유전자와 관련된 경로를 확인하기 위해 PANTHER에 입력하였고, DEG와 관련된 GO 경로를 확인하였다. 도 4A(우측 패널)에 나타낸 바와 같이, 다음의 GO 경로와 관련된 유전자 발현의 상향조절은 모체 CT26 세포와 B16.F10 세포 둘 다에 비해 2세대 세포 및 4세대 세포에서 풍부하였다: L-페닐 알라닌 이화작용 과정, 인지질 유출, 타이로신 이화작용 과정, 산성 pH에 반응한 RNA 중합효소 II 프로모터로부터의 전사의 양성 조절, 및 약물 수송. 따라서, 해당 GO 경로 중 하나 이상과 관련된 유전자의 상향조절은 항-PD-1 요법에 대한 획득 내성과 관련될 가능성이 있다. 추가로, 다음의 GO 경로와 관련된 유전자 발현의 하향조절은 모체 CT26 세포와 B16.F10 세포 둘 다와 비교되는 4세대 세포에서 관찰되었다: NK 세포 매개 세포독성의 보호, IGS15-단백질 접합, 항원 처리/MHC 클래스 I을 통한 제시, MHC 단백질 복합체 조립체 및 사이토졸에서 ER 수송까지(도 4A(우측 패널)). 따라서, 해당 GO 경로 중 하나 이상의 하향조절은 항-PD-1 요법에 대한 획득 내성과 관련될 가능성이 있다. 도 4A(우측 패널)에 나타낸 바와 같이, 다음의 GO 경로와 관련된 유전자 발현의 하향조절은 모체 CT26 세포와 비교되는 4세대 세포 및 B16.F10 세포에서 풍부하였다: IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절 및 염증 반응의 조절. 따라서, 해당 GO 경로 중 하나 이상의 하향조절은 항-PD-1 요법에 대한 내성과 관련될 가능성이 있다. 도 4B는 선택 유전자에서 백만개당 전사체(TPM; 정규화된 발현 데이터)를 나타낸다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, CT26 항-PD-1 내성 세포가 I형 및 II형 인터페론의 기준선 과활성화를 갖지만, 해당 세포가 IFNγ로 시험감염될 때, 해당 세포가 이들 유전자를 하향조절한다. 이는 특히 IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절 및 염증 반응의 조절이 모두 항-PD-1 및 다른 면역치료제에 대한 민감성에 관련된다는 것이 널리 알려져 있기 때문에 놀랍다.
이런 결과들은, 특히, 항-PD-1 요법에 대한 획득 내성과 관련된 바이오마커, 및 항-PD-1 요법에 대한 내성(획득 또는 1차 내성)과 관련된 바이오마커를 확립한다. 이러한 바이오마커는 항-PD-1 요법이 유리할 수 있는 환자 또는 항-PD-1 요법이 유리하지 않은 환자를 확인하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 이들 바이오마커에 기반하여, 환자는 환자로부터의 생물학적 샘플에서 본 명세서에 개시된 하나 이상의 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 유전자의 존재, 부재 또는 수준에 대해 샘플을 평가하는 것에 기반한 항-PD-1 요법에 의한 처리를 위해 선택될 수 있다. PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법은, 예를 들어, Trim7 및/또는 Ank3의 발현이 높고/높거나 Tap2 및/또는 Casp1의 발현이 낮을 때, 지시될 수 있다. 대조적으로, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법은, 예를 들어, Trim7 및/또는 Ank3의 발현이 높고/높거나 Tap2 및/또는 Casp1의 발현이 낮을 때, 지시되지 않을 수 있다. Trim7 및/또는 Ank3의 고발현, 및/또는 Tap2 및/또는 Casp1의 저발현을 특징으로 하는 환자는 PD-1-비반응성 세포를 제거하는 면역보강제 또는 신면역보강제로부터 유익을 얻을 가능성이 있다.
실시예 5: 비경구 세포에 비해 항-PD-1 내성 세포에서 차별 조절된 유전자의 역설적 조절장애
다음에, 야생형 CT26 세포와 비교되는 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 차별 발현되는 특정 유전자의 발현에 대한 IFNγ의 효과를 연구하였다. 간략하게, 모체 CT26 세포, 2세대 항-PD-1 내성 세포 및 4세대 항-PD-1 내성 세포를 20ng/㎖의 마우스 IFNγ(Biolegend)의 유무와 상관없이 24시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양시켰다. 다음 날, QIASHREDDER 균질화 및 칼럼 상의 DNaseI 분해를 포함하는 제조업자의 지침에 따라 Qiagen RNeasy 시약을 이용하여 세포로부터 RNA를 단리시켰다. 단리된 RNA에 RNA-seq 및 데이터 분석을 실시하였다. 간략하게, 서열분석 라이브러리를 생성하였고, ILLUMINA HISEQ(2Х150 짝지어진 단부 판독(paired end read)) 상에서 서열분석하여, 샘플당 20×106개 초과의 판독을 표적화하였다. TRIMMOMATIC v.0.36을 이용하여 서열을 다듬고, STAR ALIGNER v.2.5.2b를 이용하여 무스 무스쿨루스(Mus musculus) GRCm38 참조 게놈에 맵핑하였다. SUBREAD 패키지 v.1.5.2로부터 FEATURECOUNTS를 이용함으로써 고유 유전자 히트 계수를 계산하였다. 엑손 영역 내에 속하는 고유 판독만을 계산하였다. DESeq2를 이용하여 차별 유전자 발현을 결정하였고, Wald 검정을 사용하여 p-값 및 log2 배수 변화를 생성하였다; 1초과의 log2 배수 변화 및 유의도에 대한 컷오프로서 0.05 미만의 조정된 p-값을 이용함.
IFNγ 효과를 이해하기 위해, 과발현(Cd274 및 B2m) 또는 억제된(Trim7 및 Lrg1) 대표적인 유전자의 백만개당 전사체(TPM; 정규화된 발현 데이터)를 분석하였다. 예상한 바와 같이, Cd274 (PD-L1)의 발현은 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포(도 5A(좌측 패널))까지 증가되었다. 야생형 CT26 세포에서 증가된 Cd274의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 5A(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Cd274(PD-L1)의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 5A(우측 패널)).
B2M의 발현은 또한 예상한 바와 같이 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 증가되었다(도 5B(좌측 패널)). 야생형 CT26 세포에서 증가된 B2M의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 5B(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, B2M의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 5B(우측 패널)).
예상한 바와 같이, Trim7의 발현은 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 5C(좌측 패널)). 야생형 CT26 세포에서 증가된 Trim7의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 5C(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Trim7의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 5C(우측 패널)).
유사하게, Lrg1의 발현은 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포(도 5D(좌측 패널))까지 감소되었다. 야생형 CT26 세포에서 증가된 Lrg1의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 5D(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Lrg1의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 5D(우측 패널)).
이런 결과들은 특히 IFNγ의 존재 또는 부재 하에 성장될 때 모체 암세포에 비해 Cd274, B2m, Trim7 및 Lrg1과 같은 유전자의 역설적 조절장애를 시사한다.
실시예 6: 내성의 드라이버 유전자 확인
이론에 의해 구속되는 일 없이, 다중 유전자에 의해 조절장애가 관찰되었기 때문에, 역설적 조절장애가 항-PD-1 제제에 대한 획득 내성의 기능적 결과라는 가설을 세웠다. 관찰된 역설적 조절장애에 관련된 드라이버 유전자를 확인하기 위해, 도 6A에 개시된 분석을 수행하였다. 간략하게, IFNγ의 존재 하에 성장되었을 때 모체 CT 26 세포에 비해 4세대 항-PD-1 내성 세포에서의 차별 발현 유전자(DEG)를 확인하였다. 도 6A(패널 1)에 나타낸 바와 같이, CT26 세포에 비해 IFNγ의 존재 하의 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 1,999개의 유전자가 하향조절되고 3607개의 유전자가 상향조절된다. 이들 유전자로부터, 4세대 항-PD-1 내성 세포를 하향조절하였지만, CT26 세포를 상향조절한 것을 확인하였다. 도 6A(패널 2)에 나타난 바와 같이, 이 기준(4세대 항-PD-1 내성 세포를 하향조절하였지만, CT26 세포를 상향조절함)을 이용하여 1,060개의 유전자를 좁혔다. 이들 유전자를 IFNγ에 대한 반응성에 기반하여 추가로 좁혔다. 도 6A(패널 3)에 나타낸 바와 같이, IFNγ에 대한 반응성에 따른 분류에 의해 나타나는 바와 같이 688개의 유전자가 CT26 세포에 비해 4세대 항-PD-1 내성 세포를 하향조절한다. 이들 유전자는 Lrg1, Spry2, Arg1, Trim8, Trim2, Mapk8ip1, Trim7, Trim6 등을 포함한다. (도 6A(패널 3)).
이어서, 이들 유전자를 추가로 좁히기 위해, 모체 CT26 세포, 2세대 항-PD-1 내성 세포 및 4세대 항-PD-1 내성 세포를 마우스에서 생체내에서 성장시켰다. RNA를 종양으로부터 단리시키고, RNA-seq 및 데이터 분석을 실시하였다. (도 6A(패널 3)로부터의 688개의 유전자로부터, 또한 생체내에서 상향조절된 해당 유전자를 확인하였다. 도 6A(패널 4)에 나타낸 바와 같이, 70개의 유전자는 CT26 세포에 비해 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 생체내에서 상향조절되었고, 이들 유전자는 Krt8, Mapk8ip1, Arg1 및 Lrg1을 포함하였다. 도 6B는 도 6A에서 적어도 2개의 단계에서 풍부화된 유전자 온톨로지(GO) 경로를 나타낸다. 이 분석은 드라이버 중 일부가 되는 단백질의 TRIM 패밀리(특히, Trim7), Mapk8ip1, Elk1, Lrg1, Arg1을 확인하였다. 도 6C는 단백질의 TRIM 패밀리에 의해 영향받는 기능성 경로를 나타낸다. 도 6D는 Elk1 및 c-Jun이 어떤 역할을 하는 기능성 경로를 나타낸다. 도 6E는 Lrg1, B2m 및 Arg1와 다른 유전자 사이의 기능성 관련성을 나타낸다. 도 6F는 암 게놈 지도(Cancer Genome Atlas: TCGA) 암 게놈 프로그램에서 종양 및 주변의 정상 조직에서의 Elk1 발현 수준을 나타낸다.
실시예 7: 추가 차별 조절 유전자의 역설적 조절장애
과발현된 추가적인 대표적인 유전자(Stat1, Stat2, Irf1 및 Tap1)에 대한 백만개당 전사체(TPM; 정규화된 발현 데이터)를 분석하였다. Stat1의 발현은 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 증가되었다(도 7A(좌측 패널)). 야생형 CT26 세포에서 증가된 Stat1의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 7A(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Stat1의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 7A(우측 패널)).
Stat2의 발현은 또한 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포(도 7B(좌측 패널))까지 증가되었다. 야생형 CT26 세포에서 증가된 Stat2의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 7B(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Stat2의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 7B(우측 패널)).
유사하게, Irf1의 발현은 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포(도 7C(좌측 패널))까지 증가되었다. 야생형 CT26 세포에서 증가된 Irf1의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 7C(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Irf1의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 7C(우측 패널)).
예상한 바와 같이, Tap1의 발현은 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 증가되었다(도 7D(좌측 패널)). 야생형 CT26 세포에서 증가된 Tap1의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 7D(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Tap1의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 7D(우측 패널)).
실시예 8: 차별 조절 유전자의 경로 분석
WEB-기반 GEne SeT AnaLysis Toolkit(WebGestalt)를 이용하여 경로 분석을 수행하였다. 간략하게, 4세대 항-PD-1 내성 세포를 하향조절하였지만 CT26 세포를 상향조절한 상위 1,000개의 유전자를 (도 6A(패널 2) 참조) 4세대 항-PD-1 내성 세포와 모체 CT-26 샘플 사이의 발현의 배수 차이에 기반한 순서로 순위를 매겼다. 유전자 세트 풍부화 분석(GSEA) 및 유전자 및 게놈의 교토 백과사전(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes: KEGG) 경로 기능성 데이터베이스를 이용하여, 이들 유전자와 관련된 풍부화/탈풍부화 경로를 확인하기 위해 WebGestalt에 이들 유전자 및 순위를 입력하였다. 통계학적 유의도에 대해 벤자미니-호흐베르크(Benjamini-Hochberg) 거짓 발견 비율(false discovery rate: FDR)을 사용하였다. 이 분석은 다음의 경로가 모체 CT-26 세포에 비해 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 과반응성이었다는 것을 나타냈다: 일주기 동조(circardian entrainment), cAMP 신호전달 경로, 콜린작동성 시냅스, 멜라닌 형성, Rap1 신호전달 경로, 인간 거대세포 바이러스 감염, 인간 면역결핍 1 바이러스 감염, 글루탐산성 시냅스, 암에서의 경로 및 Ras 신호전달 경로(도 8A). 다음의 경로는 모체 CT-26 세포에 비해 4세대 항-PD-1 내성 세포에서 억제되었다: 전신 홍반 루푸스, 암에서의 마이크로RNA, 간세포 암종, 결핵 및 소포체에서의 단백질 가공. 풍부 점수 및 유의도의 시각화하기 위해, 도 8A에 제시된 데이터에 기반하여 볼케이노 플롯을 제조하였다. 도 8B는 볼케이노 플롯을 나타낸다. 도 8B에 나타낸 바와 같이, 일주기 동조가 우측에 대해 가장 먼 '점'이었지만, 암 및 Ras 신호전달 경로는 가장 높았다(즉, 가장 유의한 FDR 값을 가짐). 강한 유의도는 없었지만(모든 FDR >.05, 이는 종종 게놈 노이즈에서 생김), Ras/Rap1 신호전달 경로를 이런 비편향 분석에서 확인하였다. 도 8C는 Raf/Mek/Erk 신호전달을 갖는 수렴을 예시하는 RAS 신호전달 경로를 나타낸다. 도 8D는 Raf/Mek/Erk 신호전달을 갖는 수렴을 예시하는 RAP1 신호전달 경로를 나타낸다.
실시예 9: Ccl5(RANTES), Cxcl10(IP-10) 및 Ifnb1의 역설적 조절장애
다음에, Ccl5(RANTES), Cxcl10(IP-10) 및 Ifnb1에 대한 백만개당 전사체(TPM; 정규화된 발현 데이터)를 분석하였다. 이들 유전자를 Trim7의 활성화에 의해 유도한다.
Ccl5(RANTES) 및 Cxcl10(IP-10)은 IFNγ에 의해 조절된 유전자 중에 있다. Ccl5(RANTES) 및 Cxcl10(IP-10)을 조절하는 프로모터는 STAT1 이량체 및/또는 ISGF3에 대한 결합 부위를 포함한다. 예상한 바와 같이, Ccl5(RANTES)의 발현은 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 증가되었다(도 9A(좌측 패널)). 야생형 CT26 세포에서 증가된 Ccl5(RANTES)의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 9A(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Ccl5(RANTES)의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 9A(우측 패널)).
예상한 바와 같이, Cxcl10(IP-10)의 발현은 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 증가되었다(도 9B(좌측 패널)). 야생형 CT26 세포에서 증가된 Cxcl10(IP-10)의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 9B(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Cxcl10(IP-10)의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 9B(우측 패널)).
Ifnb1의 발현은 또한 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포(도 9C(좌측 패널))까지 증가되었다. 야생형 CT26 세포에서 증가된 Ifnb1의 발현은 야생형 CT26 세포가 IFNγ에 의해 유도되었을 때 증가되었다(도 9C(좌측 및 우측 패널)의 속이 찬 원형 데이터와 비교함). 역설적으로, Ifnb1의 발현은 IFNγ에 반응하여 야생형 CT26 세포에서 2세대 항-PD-1 내성 세포까지 그리고 4세대 항-PD-1 내성 세포까지 감소되었다(도 9C(우측 패널)).
이런 결과들은 특히 항-PD-1에 대한 획득 내성이 Trim7-조절 유전자, 예컨대, Ccl5(RANTES), Cxcl10(IP-10) 및 Ifnb1의 역설적 조절과 관련된다는 것을 예시한다.
실시예 10: 물질 및 방법
작제물 생성 및 단백질 정제
인간 및 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT의 서열을 코돈 최적화하고, 포유류 발현 벡터에 방향성 있게 클로닝하였다. 이어서, 벡터를 Expi293 세포에 일시적으로 형질감염시키거나, CHO 세포에 안정적으로 형질감염시키고, 친화도 크로마토그래피를 이용하여 얻어진 융합 단백질을 정제하였다.
웨스턴 블롯
인간(h) 및 마우스(m) TIGIT-Fc-LIGHT 단백질을 제조업자의 권고에 따라 1시간 동안 37℃에서 +/- 탈글리코실화된 PNGase F(NEB)로 처리하고, 이어서, +/- 환원제 베타-머캅토에탄올(BME)로 처리하였고, SDS-PAGE에 의한 분리 전에 SDS 로딩 완충제 중에서 희석시켰다. hTIGIT-Fc-LIGHT 및 mTIGIT-Fc-LIGHT를 프로빙하기 위해 사용한 1차 항체를 Cell Signaling Technologies, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 및 RandD Systems로부터 얻었다.
MSD 및 ELISA 검출
이중 결합 역가 분석
TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 경우; MSD 다중-어레이 플레이트(MSD)를 4℃에서 재조합 인간 LTβR-Fc 또는 HVEM-Fc(Acro Biosystems)로 밤새 사전코팅하였다. 플레이트를 적어도 1시간 동안 실온에서 진탕기에서 Diluent 100(MSD)으로 차단시켰다. 세척 후에, 분석 샘플을 첨가하고, 이어서, 3배 연속 희석시키고, 8 내지 10개의 시험 농도를 생성하기 위해 중복해서 웰에 로딩하였다. 결합된 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질을 재조합 바이오틴일화된 인간 PVR(Acro Biosystems)로 검출하였다. 루테늄에 접합된 스트렙타비딘(MSD)을 첨가하여 바이오틴 표지 검출기에 결합시켰다. MSD Gold 판독 완충제(MSD)를 플레이트에 첨가하고, 전기적 하전의 적용 시, 전기 화학적 발광 신호를 생성하고, MSD MESO QuickPlex SQ 120MM, 모델 1300으로 검출하여, 상대 광 단위(RLU)를 생성하였다. mTIGIT-Fc-LIGHT 및 뮤린 재조합 PVR, HVEM, 및 LR(Acro Biosystems)을 이용하여 유사한 분석을 수행하였다.
항체 기반 결합 분석
위의 이중 역가 분석에 대해 기재한 것과 동일한 방법을 수행하였지만, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질을 항-인간 TIGIT로 포획하고, 항-인간 LIGHT-바이오틴(모두 RandD Systems로부터의 항체) 다음에, 스트렙타비딘 설포-태그 설포-태그로 검출하였다.
DcR3 차단 분석
인간 건강한 공여자(2명의 별개의 공여자) 및 암 환자(신장, 비소세포 폐암 및 전립선) 혈청 샘플을 Innovative Research로부터 얻었다. MSD DcR3 검출 시약을 사용하여 제조업자의 지침에 따라 각 샘플에서 가용성 DcR3의 수준을 프로파일링하였다. DcR3의 혈청 수준이 PVR 또는 HVEM에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 결합을 저해하는 데 충분한지의 여부를 평가하기 위해, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질을 얼음 상에서 20분 동안 각 혈청 샘플에서 개개로 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 후에, 샘플을 인간 재조합 HVEM으로 사전 코팅한 MSD 플레이트 상에 로딩하였다. 이어서, 플레이트를 위에 기재한 이중 역가 분석에 따라 처리하였고, 여기서 인간 재조합 PVR을 검출 시약으로서 사용하였다.
수용체/리간드 상호작용의 생물층 간섭계 기반 친화도 시험
생물층 간섭계 기반 친화도 검사를 사용하여 인간 재조합 단백질(PVR, HVEM, LTβR, PVRL2, PVRL3 및 Nectin-4; Acro Biosystems 또는 Sino Biological로부터 구입)의 히스티딘 또는 바이오틴-태그 형태를 이용하여, 의도된 결합 표적에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 온-속도(Ka), 오프-속도(Kd) 및 결합 친화도(KD)를 결정하였다. 상업적으로 입수 가능한 또는 내부 생산 단면 융합 단백질 대조군(TIGIT-Fc 및 Fc-LIGHT)을 또한 동시에 시험하였다. 표적을 동력학 완충제(PBS/.1% Tween-20/1% BSA; pH7.0) 중 3㎍/㎖의 농도로 항-펜타His 또는 스트렙타비딘 코팅 바이오센서에 고정시켰다. 각각 90 및 120초의 결합 및 해리 시간을 이용하여 재조합 표적 단백질에 대한 융합 단백질의 직접 결합을 Octet-Red96 BLI 기기 상에서 수행하였다.
세포 배양물
CHO-K1, CT26/WT, B16.F10, CT26/AR, Jurkat 및 A375 세포를 ATCC로부터 얻었고, 이들의 가이드라인에 따라 배양시키고; 5% CO2 중 37℃에서 유지하였다. 활성 배양물 중 모든 모체 세포주를 Venor GeM Mycoplasma 검출 키트(Sigma)를 이용하여 매달 시험한다. 모든 형질감염 세포주를 추가 2회 시험하고, 형질감염 후 적어도 2주만큼 분리시키고, 마이코플라스마에 대해 음성으로 남아있는 것을 확인하였다.
시험관내 세포주 생성
CHO-K1/hPVR, CHO-K1/hHVEM 및 CHO-K1/㎖TβR을 포함하는 인간 또는 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 시험관내 결합을 평가하기 위해 안정적인 세포주를 생성하였다. 간략하게, cDNA 벡터를 RandD 시스템 또는 Origene으로부터 얻었고, pcDNA3.1(-)(Thermo Fisher)에 클로닝시키고, 이어서, 모체 CHO-K1 또는 Jurkat 세포를 제조업자의 지침에 따라 4D-Nucleofector 및 Cell Line Nucleofector Kit SE(Lonza)로 뉴클레오펙션시켰다. 제한 희석을 이용하는 항생제 선택 및 단세포 클로닝 후에, 유세포분석을 이용하여 수용체 발현을 확인하였고, 시험관내 결합 분석을 위해 얻어진 세포주를 사용하였다.
시험관내 기능성 분석
NFkB-신호전달: 비정규
LTβR을 발현시키는 U2OS/NIK/NFκB 수용체 세포를 Eurofins/DiscoverX로부터 구입하고, 이들의 권고에 따라 배양하였다. 분석 일에, Fc-LIGHT 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 중 하나가 있는 96-웰 플레이트의 각 웰에 1×104개 U2OS/NIK/NFκB 수용체 세포를 플레이팅하였다. 배양물에서 6시간 후에, 루미노미터(Promega) 상에서 발광 활성을 평가하였다.
TIGIT/PVR/DNAM1 리포터 분석
CD155(PVR)/TIGIT 차단 분석(Promega)을 제조업자의 지침에 따라 사용하였다. 시약은 인간 CD155(PVR)를 발현시키는 CHO-K1 표적 세포 및 인간 TIGIT를 발현시키는 효과기 Jurkat 세포, CD226(DNAM1), 및 공동 자극제 반응성 루시퍼라제 발현 벡터로 이루어진다. Jurkat 효과기는 또한 유세포 분석기를 이용하여 인간 HVEM을 발현시키는 것을 확인하였다. 분석을 위해, Jurkat 효과기 세포를 백색 96 웰 플레이트(Costar)에 플레이팅하고, 밤새 37℃/5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 다음 날, 세포를 CHO-K1 표적 세포 및 다음의 시험 항목 - 재조합 인간 IgG4 (음성 대조군), 항-DNAM1 차단 항체, Fc-LIGHT 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 함께 공동배양시켰다. 항-LIGHT 차단 항체를 또한 사용하여 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 공자극 도메인의 기능을 차단하였다. 모든 항체 및 시약을 Acro Biosystems, Sino Biologics 또는 RandD Systems로부터 구입하였다. 추가 배양 6시간 후에, Bio-Glo 시약(Promega)을 Promega Navigator 루미노미터 상의 자동 주사기를 이용하여 웰에 첨가하고, 상대 발광(RLU)을 결정하였다.
NK/T 세포 사멸 분석
CT26 종양 세포를 깨끗한 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 37℃/5% CO2에서 배양시켰다. NK 세포를 EasySep 마우스 NK 세포 단리 키트(StemCell Technologies)를 이용하여 BALB/c 마우스의 비장으로부터 단리시켰다. 총 T 세포를 또한 EasySep 마우스 T 세포 단리 키트(StemCell Technologies)를 이용하여 BALB/c 마우스의 비장으로부터 단리시켰다. T 세포를 항-마우스 CD3/CD28 자기 비드(StemCell Technologies; 권장 농도의 1/10)로 48시간 동안 차선으로 자극하였다. 공동 배양일에, NK(2.5 효과기:1 표적 세포비) 또는 T(5 효과기:1 표적 세포비) 세포를 종양 세포 사멸을 평가하기 위해 CT26 종양 세포 +/- mTIGIT-Fc-LIGHT, 및 카스파제 3/7-녹색 시약(Essen Bioscience)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. Incucyte S3 플랫폼에서 영상을 촬영하였고, Incucyte 소프트웨어를 이용하여 시간에 따라 형광 신호(세포사 증가)를 정량화하였다.
T 미경험(Tn) 및 T 줄기 세포 기억(Tscm) 분화 및 분석
건강한 인간 공여자 PBMC를 얻었고, 미경험 CD8 자기 단리 키트(세포 및 StemCell Technology로부터의 단리 키트)를 이용하여 CD8+ T 세포를 단리시켰다. 단리된 세포를 1:3 세포 대 비드 비의 항-인간 CD3/CD28 자기 비드(Invitrogen), 20 IU㎖-1 인간 재조합 IL-2(RandD Systems), 및 5M TWS119(SelleckChem)의 존재 하에 9일 동안 AIMV 배지(GIBCO)에서 배양하였다. 문헌[Gattinoni et al., A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nat Med 17, 1290-1297(2011)]. 인큐베이션 후에, 세포를 단리시키고, 인간 TruStain FcX Fc 수용체 차단 용액(BioLegend)을 이용하여 Fc 수용체를 차단시켰다. 이어서, 세포를 CD3, CD8, CCR7, CD45RO, CD62L, CD45RA, CD27, IL7Rα, IL2Rβ 및 CD95에 형광 접합된 항체(모두 BioLegend로부터의 항체)를 이용하여 유세포분석에 의해 분석하였다.
AIMV 증식 분석 및 사이토카인 분석
건강한 인간 공여자 PBMC를 비히클(PBS), TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT(150nM), TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT(150nM), 항-TIGIT(150nM, IgG1 클론 #HuTIG1-IgG1.AA, Creative Biolabs), 항-PD-1(150nM, 펨브롤리주맙), 또는 항-TIGIT와 항-PD-1의 조합이 있는 24 웰 플레이트에서 AIM-V 배지(Gibco)에서 ㎖당 2백만개의 세포 밀도로 플레이팅하였다. TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT에 대해, 인간 공여자 처리 PBMC의 합류를 6일의시간 과정에 걸쳐 평가하였다. TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT와 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 둘 다에 대해, 제조업자의 권고에 따라 배양 7일 후에 Promega MTS 증식 분석을 수행하였다. 대략 7일 기간에 걸쳐 Incucyte S3 이미저 상에서 플레이트를 영상화하였다. 제2일 및 제7일에, 처리군 사이의 형상 차이를 입증하기 위해 정지 영상을 촬영하였다. 실험 종료 시, Incucyte 소프트웨어를 이용하여 합류 백분율을 결정하였다. 동일한 처리군을 갖는 복제 플레이트를 동일한 세포 밀도로 파종하였고, 37℃/5% CO2에서 2일 동안 표준 세포 배양물 인큐베이터에 넣었다. 시간 과정의 종료 시, 배지를 제거하고, 제조업자의 권고에 따라 MSD 다중복합 어레이를 이용하여 IFN, IL-8, IL-10, IL-12/p70 및 SDF-1a(CXCL12) 수준에 대해 평가하였다.
AIMV 단세포 RNA-seq(scRNA-seq)
TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 또는 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 중 하나의 150nM과 함께 2일 동안 배양시킨 PBMC의 면역 전사체 프로파일을 평가하기 위해, 개개 오일 점적에 10x Genomics Chromium 핸들러를 이용하여 치료한 건강한 공여자 인간 PBMC로부터의 단세포를 단리시켰다. 제조업자 지침에 따라 10x Genomics Chromium Next GEM 단세포 3' v3.1: Dual Index 시약을 이용하여 단세포 라이브러리를 생성하였다. 라이브러리를 Illumina NovaSeq 6000 상에서 서열분석하였고, 역다중화, 바코드 및 UMI 계수 및 판독 정렬에 대해 10X 셀레인저(cellranger) 파이프라인(v 6.0.2)을 이용하여 처리하였다. 10,000개 초과의 개개 세포로부터의 판독(350×106 초과)를 인간 hg38 참조 게놈(평균 12K 세포/샘플)에 맵핑하였다. 이어서, 여과된 유전자 계수 매트릭스를 품질 관리, 정규화, 적분, 차수 감소, 시각화, 세포 클러스터링 및 DEG 분석을 위해 Seurat(v 4.0.2)에 의해 분석하였다. 200개 미만, 2500개 초과의 유전자를 갖거나 15% 미토콘드리아 계수를 갖는 세포를 여과시켰다. 유전자 계수를 총 판독 계수에 대해 정규화시키고, 10,000으로 조정한 다음, log 변환시켰다. 배취 효과를 제거하기 위해 2000개의 앵커 특징을 이용하여 모든 샘플을 통합하였다. 이어서, 통합 데이터를 조정하고, 균일 매니폴드 근사 및 투영(uniform manifold approximation and projection: UMAP) 시각화를 위해 상위 30개의 주성분(PC)을 사용하였다. 상위 30개의 PC를 이용하여 공유 인접 이웃(Shared nearest neighbor: SNN)을 확인하고, 세포 클러스터링에 대해 분해능을 0.4로 설정하였다. 이어서, 본 발명자들은 세포 유형 주석을 위해 SingleR(v 1.6.1)을 사용하였다. Wilcox 방법을 이용하여 각 클러스터 내의 처리 세포 대 대조군에 대한 차별 발현 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 그룹 간 0.25의 log 배수 변화 역치로 유전자에 대한 시험을 제한하였다.
SEB 슈퍼 항원 분석
1차 PBMC(또는 마우스 비장세포)를 건강한 공여자(Stemcell technologies) 또는 BALB/c 마우스로부터 얻었고, 인간 또는 마우스 IgG 대조군(10㎍/㎖; Jackson Immunoresearch, Inc.) 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 존재 하에 200ng/㎖의 슈퍼-항원 SEB(List Biological Laboratories)와 함께 인큐베이션시켰다. 3일 후에, 배양물 상청액을 수집하였고, 인간 또는 마우스 IL-2(BioLegend) 수준에 대해 ELISA에 의해 평가하였다.
A375 세포 자극
LTβR을 발현시키는 인간 A375 세포주는 LIGHT를 통한 공자극에 반응하는 것으로 보고되었다(Hehlgans and Mannel, 2001). 간략하게, A375 세포를 24 웰 플레이트에서 밤새 웰당 2×105개 세포로 플레이팅하였다. 다음 날 오전, 세포를 비처리로 또는 인간 항-LTβR(클론 71315, RandD Systems) 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 중 하나의 100nM과 함께 배양시켰다. 3시간 후에, 배지를 세포로부터 제거하고, 5% 베타 머캅토에탄올을 함유하는 Qiagen RLT 완충제를 웰에 직접 첨가하여 RNA 단리를 위한 세포를 용해시켰다. QiaShredder 칼럼(Qiagen)을 통해 세포 물질을 통과시키고, 이어서, 칼럼 상 DNaseI 분해를 포함하는 Qiagen RNeasy 키트를 이용하여 RNA를 정제하였다. Origene First-Strand cDNA 합성 시약을 이용하여 0.5 내지 1㎍의 RNA를 역전사하였다. 인간 GAPDH, ACTB, CXCL8 및 CCL2에 대한 입증된 qPCR 프라이머를 Origene으로부터 얻었다. Sybr Green 시약 및 BioRad CFX96 Touch Real-Time PCR 검출 시스템을 이용하여 cDNA를 증폭시켰다. 델타-델타 Ct 방법을 이용하여 유전자 발현의 배수 변화를 결정하였고, 여기서, 치료 대조군 없음 대 하우스키핑 유전자 ACTB의 표적 유전자 발현을 1의 값으로 설정하였다. 치료에 반응한 발현을 변화시키지 않은 유전자의 예로서 제2 하우스키핑 유전자(GAPDH)를 또한 사용하였다.
유세포 분석
간략하게, 적절한 경우 세포를 Fc 수용체 차단 시약(BioLegend)과 함께 인큐베이션시켰고, 후속적으로 암실 내 얼음 상에서 30분 동안 형광 항체로 염색하였다. BioLegend 또는 Abcam으로부터 표시된 항체를 구입하였다. AH1-사량체 시약을 MBL International로부터 구입하고, 항체 칵테일의 나머지를 첨가하기 전에 암실 내 얼음 상에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 기간 후에, 염색 세포를 세척하고, FACS 완충제(1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.02% 아자이드 나트륨 및 2mM EDTA를 함유하는 1X PBS 완충제)에서 재현탁시켰다. BD LSRII Fortessa 상에서 유세포 분석을 수행하였다.
종양 모델 시스템
CT26/WT, 항-PD-1 내성 CT26 종양(CT26/AR), 및 B16.F10 연구의 경우, BALB/c 또는 C57BL/6 마우스 각각에 5×105개의 종양 세포로 뒤 옆구리에 피하 이식하였다. 종양 용적이 대략 80 내지 115㎣에 도달되었을 때, 제0일로 표시하고, 마우스를 종양 용적에 따라 무작위화하고, 처리를 개시하였다. 각 개개 실험으로부터의 평균 시작 종양 용적(STV)을 대응하는 도면에 열거한다. 처리일에, 마우스를 비히클(멸균 PBS), 항-PD-1(클론 RMP1-14), 항-PD-L1(클론 10F.9G2), 항-TIGIT(클론 1G9), 항-LTβR(클론 4H8 WH2), Fc-LIGHT 또는 mTIGIT-Fc-LIGHT에 의해 복강내(IP) 주사로 처리하였다. LTβR 항체를 Adipogen 및 LSBio로부터 얻었고, 모든 다른 치료 항체를 BioXCell로부터 얻었다. 각 제제의 용량 및 스케줄을 대응하는 도면 및 도면 범례에 열거한다. 시간 과정 내내 종양 용적(㎣) 및 전체 생존을 평가하였다. 생존 기존은 종양 궤양 징후 없이 1800㎣ 미만의 총 종양 용적을 포함하였다. 종양이 확립되고 후속적으로 거부된 완전 반응자를 적절한 도면에 열거한다. CT26 실험 마우스의 코호트를 유세포분석을 이용한 종양 조직에서의 면역 프로파일링을 위해 그리고 혈청 중 사이토카인 분석을 위해 다양한 실험 동안 안락사시켰고, 제조업자의 지침에 따른 Luminex 다중복합 어레이를 이용하여 종양을 단리시켰다. 이런 마우스로부터 종양을 절개하였고, 종양 분리 키트(Miltenyi)를 이용하여 분리시키고, 100μM 스트레이너를 통해 균질화시켜 종양 세포 및 침윤성 면역 세포를 단리시켰다. 실험군 크기를 각 도면에 기재하고, 두 독립적 실험의 최소값으로부터 생성한다.
CD4, CD8 및 NK 고갈 실험
-제1일, 제1일 및 제7일에 100㎍의 항-CD4(클론 GK1.5), 100㎍의 항-CD8(클론 2.43) 또는 500㎍의 항-NK(클론 NK1.1)의 IP 주사를 통해 마우스를 처리하였다. 말초 혈액 중 CD4, CD8 및 NK 세포 집단을 유세포분석에 의해 평가하여 고갈을 입증하였다.
항-PD-1-내성 CT26 종양의 생성
위와 같이, 마우스에 뒤 옆구리 상에 5×105개의 CT26을 접종하였다. 평균 종양 용적이 80 내지 100㎣에 도달되었을 때(제0일로 표시), 마우스에 제0일, 제3일 및 제6일에 각각 100㎍으로 이루어진 항-PD-1(클론 RMP1-14; BioXcell)의 복강내 주사를 제공하였다. 종양을 항-PD-1 요법에 반응하지 않은 마우스로부터 절개하고, 콜라게나제(StemCell Technologies)를 이용하여 분리시키고, 1X PBS 중에서 세척하고, 배양 배지에서 플레이팅하였다. 세포를 2 내지 4회 계대하고, 이어서, 위와 동일한 프로토콜에 따라 새로운 수용자 마우스에 접종하였다. 또한, 종양이 80 내지 100㎣에 도달되었을 때, 항-PD-1의 다른 치료 과정을 시작하였다. 이 과정을 총 5회 라운드 동안 반복하였고, 이 시점에 처리된 마우스 중 어느 것도 항-PD-1 요법에 반응하지 않았다. 항-PD-1 획득 내성이 발생될 이런 생체내 압력 후에 생성된 세포주를 CT26/AR(본 명세서에서 앞에서 특성규명됨)로서 지칭한다.
사이노몰거스 마카크에서 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 투여
목적에 맞게 사육된, 아시아 기원 사이노몰거스 마카크(Macaca fascicularis)를 Charles River Laboratories(미시간주 마타완 소재)에 수용하였고, 이런 동물에 의한 실험을 실험동물 관리 및 사용을 위한 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 약술된 원칙을 고수하는 Charles River Laboratories의 실험동물운영위원회에 의해 승인받았다. 비히클 대조군 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질을 30분에 걸쳐 정맥내 주사를 통해 투여하였다. 비히클(5마리 수컷, 5마리 암컷), 0.1㎎/㎏(3마리 수컷, 3마리 암컷), 1㎎/㎏(3마리 수컷, 3마리 암컷), 10㎎/㎏(3마리 수컷, 3마리 암컷) 또는 40㎎/㎏의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(5마리 수컷, 5마리 암컷)을 총 4회 용량 동안 7일마다(제1일, 제8일, 제15일, 제22일) 투여하였다. 시험 항목 투여 전 및 후에, 잠재적 임상 관찰, 체중, 식품 섭취, 수의학적 신체 검사, 안검사, 심전도 검사, 혈압 평가 및 신경학적 평가를 위해 모든 동물을 관찰하였다. 투약 전 및 투약 후 임상 병리 평가는 혈액학, 응고, 임상 화학을 포함하였고, 소변검사를 또한 수행하였다. 혈청 사이토카인의 경우 칼륨 EDTA 항응고, 및 말초 혈액 유세포 연구의 경우 헤파린 나트륨 항응고를 이용한 말초 혈액의 투약 전 및 투약 후 수집을 포함하는 약력학적 평가. 유세포분석을 위해 말초 면역세포를 염색하는 데 사용한 항체 패널은 BD Biosciences로부터의 CD45 및 CD3, 및 Biolegend로부터의 CD8 및 HVEM를 표적화하는 시약을 포함하였다.
실험 동물 가이드라인
모든 뮤린 동물 연구를 실험동물운영 위원회(IACUC)에 따라 그리고 이의 승인으로 수행하였고; 면허가 있는 수의사가 검토하고 승인하였다. 실험 마우스를 매일 모니터링하고, 임의의 고통 징후 전에 CO2 질식 다음에 경추 탈구에 의해 안락사시켰다.
생물정보학 및 통계학적 분석
NIH GDC(EBPlusPlusAdjustPANCAN_ IlluminaHiSeq_RNASeqV2.geneExp.tsv)를 통해 TCGA 데이터를 평가하였다. 유전자 발현에 대해 상위 사분위 수를 1000으로 설정하도록 판독 계수를 정규화하였다.
실험 복제물(N)을 도면 및 도면 범례에 나타낸다. 달리 언급되지 않는 한, 플롯팅한 값은 2회의 별개 실험의 최소값으로부터의 평균을 나타내고, 오차는 SEM이다. 독립표본 t-검정 또는 다중비교에 의한 일원분산분석(One-Way ANOVA)을 이용하여 통계학적 유의도(p-값)를 결정하였다. 유의미한 p-값을 하나 이상의 '*'로 표지하고, *p<.05, **p<.01, ***p<.001 및 ****p<.0001로 나타낸다. Mantel-Cox 통계학적 검정을 사용하여 생존 곡선 사이의 유의도를 결정하였다. 이들 도면과 보충에 대한 범례에서 P-값을 주목한다.
실시예 11: 항-PD-1 내성 세포주 및 주요 내성 항-PD-1 내성 세포주에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 효능
TIGIT- 및 LIGHT-기반 키메라 단백질을 암호화하는 작제물을 생성하였다. "TIGIT-Fc-LIGHT" 작제물은 IgG1로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 통해 인간 LIGHT의 ECD에 융합된 인간 TIGIT의 세포외 도메인(ECD)를 포함하였다. 도 10A 참조.
작제물을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고, CHO 세포에 형질감염시키고, 고발현을 위해 개개 클론을 선택하였다. 이어서 무혈청 배지에서의 교반 생물반응기에서 소규모 제조를 위해 고발현 클론을 사용하였고, 단백질 A 결합 수지 칼럼을 이용하여 관련 키메라 융합 단백질을 정제하였다.
TIGIT-Fc-LIGHT 작제물을 코돈 최적화하고, 293 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질-A 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 천연 구조를 이해하기 위해, 비처리 변성 샘플(즉, 환원제 또는 탈글리코실화제에 의한 처리 없이, SDS의 존재 하에 비등시킴)을 (i) 탈글리코실화되지 않은 환원 샘플(즉, β-머캅토에탄올만으로 처리하고, SDS의 존재 하에 비등시킴); 및 (ii) 환원 및 탈글리코실화된 샘플(즉, β-머캅토에탄올과 탈글리코실화제 둘 다로 처리하고, SDS의 존재 하에 비등시킴)과 비교하였다. 또한, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 각 도메인의 존재를 확인하기 위해, 겔을 3회 중복해서 실행하고, 항-TIGIT 항체(도 10B, 좌측 블롯), 항-Fc 항체(도 10B, 중앙 블롯) 또는 항-LIGHT 항체(도 10B, 우측 블롯)을 이용하여 프로빙하였다. 웨스턴 블롯은 비환원 레인에서 우성 이량체 밴드의 존재(도 10B, 각 블롯에서의 레인 NR)를 나타냈고, 이를 환원제인 β-머캅토에탄올의 존재 하에 글리코실화된 단량체 밴드로 환원시켰다(도 10B, 각 블롯에서의 레인 R)는 것을 나타냈다. 도 10B에 나타낸 바와 같이, 각 블롯에서 레인 DG, 키메라 단백질을 환원제(β-머캅토에탄올)와 탈글리코실화제와 둘 다의 존재 하에 약 73kDa의 예측 분자량으로 단량체로서 실행하였다.
TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 포유류 생성 세포주에서 단일 발현 벡터로부터 합성된 이작용성 Fc-연결 융합 단백질이고, 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이전에, 크기-배제 크로마토그래피/다각도 광산란(SEC-MALS) 및 전자현미경법(EM)을 사용하여 TNF-리간드 함유 융합 단백질 치료제의 이런 부류 구조를 연구하였다. 일부 경우에, 이황화 유도 중앙 Fc 도메인의 이량체화, 및 TNF-리간드 도메인의 전하-기반 삼량체화는; 이론에 의해 구속되는 일 없이, 용액 중 삼량체의 이량체를 수득하는 것으로 여겨진다. 문헌[de Silva et al., CD40 Enhances Type I Interferon Responses Downstream of CD47 Blockade, Bridging Innate and Adaptive Immunity. Cancer Immunol Res 8: 230-245(2020); Fromm et al., Agonist redirected checkpoint, PD-1-Fc-OX40L, for cancer immunotherapy. J Immunother Cancer 6: 149 (2018)]. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 육량체 구조를 갖는 것으로 예측하였다(도 10A). 비환원 SDS-PAGE 하의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 분석은 대략 140kDa의 글리코실화된 이황화연결 이량체의 존재를 확인하였고(SDS는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 전하-기반 삼량체화를 중화시킴), 이는 β-머캅토에탄올 및 PNGase-F와 함께 인큐베이션 후 59.3kDa의 예상 분자량을 갖는 탈글리코실화된 단량체로 환원시킬 수 있었다(도 10B). 인간과 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 작제물 둘 다의 모두 3개의 단백질 도메인은 웨스턴 블롯을 통한 상업적 항체에 의해 인식되었다(도 10B 및 도 24A).
재조합 단백질과 세포 기반 방법을 둘 다 이용하여 융합 단백질과 이들의 동족 결합 상대 사이의 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 특성규명하였다. 처음에, 생물층 간섭 측정-기반 친화도 시험을 사용하여 수용체/리간드 결합의 동력학을 평가하였다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 3.52nM 친화도로 재조합 인간 LTβR에 결합되고(상업적으로 입수 가능한 재조합 Fc-LIGHT 대조군보다 대략 8배 더 큼), 4.07nM로 인간 PVR에 결합되었다(인간 TIGIT-Fc와 일치됨). TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 Fc-LIGHT 결합(2.12nM)과 유사한 6.49nM로 인간 HVEM에 결합되었다(아래의 표 참조).
위의 표는 재조합 인간(rh) LTβR, HVEM, PVR, PVRL2 및 PVRL3에 대한 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 또는 Fc-LIGHT 및 TIGIT-Fc 단면 융합 단백질 대조군의 생물층 간섭계(Octet) 결합 동력학을 나타낸다.
PVRL2(CD112), PVRL3(CD113) 및 Nectin-4를 포함하는 다른 PVR 리간드 패밀리 구성원에 대한 결합을 입증하기 위해 생물층 간섭 측정 및 중규모 디스커버리(MSD) 분석의 조합을 개발하였다(위의 표 및 도 24B 참조). 수용체에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 결합은 중규모 디스커버리(MSD) ELISA 분석을 특징으로 한다. 간략하게, LTβR-Fc를 플레이트 상에 코팅하고, 증가된 양의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질을 플레이트-결합된 LTβR-Fc에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였다. PVR-바이오틴을 이용하고 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 LTβR-Fc에 대한 키메라 단백질의 결합을 검출하였다. 도 10C에 나타낸 바와 같이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 LTβR-Fc와 PVR 둘 다에 결합되었다. HVEM-Fc를 플레이트 상에 코팅하고, 증가된 양의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질을 플레이트-결합된 HVEM-Fc에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였다. PVR-바이오틴을 이용하고 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 HVEM-Fc에 대한 키메라 단백질의 결합을 검출하였다. 도 10C에 나타낸 바와 같이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 HVEM-Fc와 PVR 둘 다에 결합되었다. 항-TIGIT 항체를 플레이트 상에 코팅하고, 증가된 양의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질을 플레이트-결합된 항-TIGIT 항체에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였다. 항-LIGHT 항체를 이용하고 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 항-TIGIT 항체에 대한 키메라 단백질의 결합을 검출하였다. 도 10C에 나타낸 바와 같이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 항-TIGIT와 항-LIGHT 항체 둘 다에 결합되었다. 이런 결과는 용량-의존적 및 포화 가능한 결합을 나타냈다. 따라서, 도 10C는 골수성, CD8+ T 및 NK 세포(LTβR 및 HVEM) 상에서 발현된 관문 표적(PVR) 및 면역 공자극 수용체에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 동시 결합을 입증한다.
또한 MSD를 사용하여 개개 표적에 대한 결합뿐만 아니라 PVR과 HVEM(28.31nM의 EC50) 또는 PVR과 LTβR(85.99nM의 EC50) 둘 다에 대한 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 동시 결합을 평가하였고; 이는 전체 융합 단백질이 무손상이며, 이의 표적에 관여할 수 있었다는 것을 나타낸다(도 10C). LIGHT는 또한 상승될 수 있는 가용성 미끼 수용체 3(DcR3)에 결합할 수 있고, 이는 특정 자가면역질환이다. 암 환자의 가용성 혈청 DcR3이 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 LIGHT 도메인을 방해하기에 충분한 수준에 도달하였는지의 여부를 평가하기 위해, DcR3의 농도를 건강체 및 암성 인간 공여자 혈청 샘플의 범위에서 정량화하였다. 대부분의 혈청 샘플에서, 분석의 정량상한을 뛰어넘는 전립선암 샘플을 제외하고 DcR3 수준은 2,000pg/㎖ 이하였다(15,000pg/㎖ 초과)). TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 각 혈청 샘플에서 사전인큐베이션된 모든 경우에, DcR3의 이런 수준은 이중 HVEM/PVR 역가 분석에서의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 결합을 방해하는 데 충분하지 않았다(도 24C).
인간 PVR 또는 HVEM을 안정적으로 발현시키도록 조작한 CHO-K1 세포를 이용하여 세포막에서 발현된 표적에 대한 인간과 마우스 융합 단백질의 결합을 특성규명하기 위해 세포 표면 결합 분석을 개발하였다. 유세포 측정 분석은 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 세포 표면 PVR(EC50 = 35.42nM), 세포 표면 LTβR(EC50 = 87.12nM) 및 세포 표면 HVEM (EC50 = 65.77nM)에 결합되었다는 것을 입증하였다(도 10D). 더 나아가, 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 ELISA를 이용하여 표적에 그리고 야생형 CT26(CT26/WT), CPI-획득 내성 CT26(CT26/AR) 및 B16.F10 종양 세포에 용량 의존적 방식으로 결합하는 것으로 나타났다(도 24D 내지 도 24E). 따라서, 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리하였을 때 이런 3가지의 전임상 상승 마우스 종양 모델은 항-종양 효능의 평가에 적절하다.
추가적인 세포-기반 기능성 분석을 이용하여 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 활성에 대해 정보를 제공하였다. 처음에, 고수준의 LTβR을 발현시키는 인간 뼈 골육종 세포주인 U2OS를 이용한 NIK 의존적 비정규 NFkB 신호전달 분석(도 10E)을 사용하여 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 LIGHT 도메인의 활성을 시험하였다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 처리 시, 상업적으로 입수 가능한 재조합 Fc-LIGHT에 의해 생성된 것보다 유의미하게 더 큰 수준에서 생물발광이 검출되었다(도 10E). 둘째로, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 항원-의존적 방식으로 CD8+ T 세포에 대한 HVEM을 통한 공자극을 제공하는 것으로 예상된다. 이를 평가하기 위해, 포도상구균 엔테로톡신 B(SEB) 슈퍼항원 분석을 사용하되, 인간 PBMC 또는 마우스 비장세포를 SEB, 및 인간 또는 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 중 하나와 함께 3일 동안 각각 배양하였다. 이어서, IL-2 분비를 배양 배지에서 평가하였고, 인간 및 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 적응 사이토카인의 생산을 유도할 수 있었다는 것을 나타냈다(도 10F). 셋째로, CD8+ T 세포 및 NK 세포의 표면 상에서 HVEM에 대한 LIGHT의 결찰은 표적 종양 세포의 사멸을 향상시키는 것으로 예측된다. 단리된 뮤린 T 또는 NK 효과기 세포를 형광 활성화된 절단된 카스파제 3/7 리포터의 존재 하에 CT26 종양 세포와 함께 공동 배양시켰다. 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 첨가는 표적 종양 세포에서 카스파제 활성의 증가를 자극하였고, 이는 특히, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 활성이 배양물에서 효과기 세포의 세포독성 잠재력을 증가시켰다는 것을 나타낸다(도 24F). 넷째로, 인간 흑색종 세포주 A375를, LIGHT에 의한 자극 후 IL-8 관련 유전자의 LTβR-의존적 생산을 통해 LIGHT/LTβR 신호전달의 직접 기능성 판독으로서 사용하였다. Hehlgans 및 Mannel 재조합체인 가용성 LIGHT(HVEM 리간드)는 A375 흑색종 세포에서 증가된 IL-8 분비 및 성장 저지를 유도한다. 문헌[J Interferon Cytokine Res 21: 333-338 (2001)]. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 또는 상업적으로 입수 가능한 LTβR 작용제 항체를 A375 세포와 함께 배양시켰을 때, 항-LTβR 대조군 항체에 비해 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 것보다 유의미하게 큰 규모로 CXCL8(IL-8을 암호화하는 유전자) 및 CCL2는 3시간 이내에 유의미하게 상향조절되었다(도 24G). 마지막으로, 상업적으로 입수 가능한 TIGIT/DNAM-1 리포터 시스템을 이용하여 효과기 림프구의 HVEM 공자극이 DNAM-1에 대한 불필요한 신호전달 경로를 이용하였는지의 여부를 결정하였다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 TIGIT 도메인이 PVR에 결합하기 때문에, 이 상호작용은 DNAM-1과 상호작용하는 PVR의 능력을 경쟁적으로 저해할 것이다. 따라서, DNAM-1 매개 공자극은 TIGIT의 세포외 도메인을 함유하는 재조합 작제물에 의해 저해되는 것으로 예상된다. 이 분석에서, TIGIT 및 DNAM-1 발현 Jurkat T 세포(효과기)를 PVR 발현 CHO-K1 세포와 공동 배양시켰다. 효과기 세포는 또한 T-세포 수용체(TCR)와 DNAM-1 공자극 둘 다에 반응성인 루시퍼라제 리포터를 함유한다. 본 분석에서 사용한 효과기 세포는 Jurkat T 세포이기 때문에, 이들 세포가 인간 HVEM을 내인성으로 발현시켰다는 것을 확인하였다(도 10G). CHO-K1 수용체 세포에서, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 LIGHT에 의한 직접 HVEM 공자극을 통해 DNAM-1 공자극을 우회할 수 있었다(도 10H). 예상한 바와 같이, DNAM-1 차단 항체 대조군은 분석에서 신호 리포터의 형광을 감소시키는 것으로 나타났다. 대조적으로, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 함께 이런 세포의 인큐베이션은 신호 형광의 유의미한 증가를 야기하였고, 이는 LIGHT 차단 항체에 의해 경쟁적으로 저해할 수 있었기 때문에 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 LIGHT 도메인에 특이적인 것을 확인하였다(도 10H).
고형 종양 조직 내에서 그리고 골수성 세포에 의해 특이적으로 LTβR의 발현이 관찰되었는데(도 13A 내지 도 13G), 이는 특히 Fcγ 수용체의 관여를 통해 보고된 것과 유사한 방식으로 LIGHT가 골수성 세포 활성화를 제공할 수 있었다는 것을 나타낸다. 이를 추가로 시험하기 위해, 인간의 천연 IgG1 및 효과기 FcγR 침묵 IgG4 변이체, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질, TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 키메라 단백질을 생성하였다. TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 키메라 단백질은 효과기 Fcγ 수용체와 맞물리는 능력을 포함하는 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질 변이체와 유사한 구조적 특징을 갖는 것으로 나타났다(도 25A 내지 도 25C). IgG1 및 IgG4 변이체를 인간 PBMC와 함께 배양시켰고, 1주 후에, 융합 단백질 둘 다 세포 배양 플레이트에 대한 세포의 부착, 골수성 세포 활성화와 일치되는 형태로의 분화를 유도하였고, 유의미한 증식을 자극하였다(도 14A 내지 도 14B). 사실, 인간 PBMC의 골수 분화에 대한 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 키메라 단백질과 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질 둘 다의 분명한 형태 영향은 배양 2일 후에만 분명하였다(도 25B). TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 키메라 단백질과 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질을 둘 다 또한 효과기(IFNγ)와 골수성-특이적(IL-8, IL12/p70 및 CXCL12) 사이토카인을 둘 다 유도하였다(도 14C). IgG1과 IgG4 융합 단백질 사이에서 세포 형태, 증식 규모에 대해서도 사이토카인 유도에 대해서도 유의미한 영향은 발견되지 않았다(도 14A 내지 도 14C). 단독으로 그리고 항-PD-1 항체인 펨브롤리주맙과 조합하여 상업적으로 입수 가능한 Fc-적격 IgG1 TIGIT 항체로 처리한 PBMC에서 사이토카인 반응을 평가하였다. 흥미롭게도, 이런 연구에서, IFNγ와 IL-8의 적은 유도만이 관찰되었지만, 그러나, 이들은 대조군 처리 배양물과 유의미하게 다르지 않았다(도 25D).
TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 면역 자극 활성 및 IgG1과 IgG4 변이체 사이의 잠재적인 기능성 차이를 추가로 평가하기 위해, 인간 PBMC 배양물의 자극 2일 후에 단세포 RNA 서열분석을 수행하였다. UMAP를 이용하여 TIGIT, HVEM, LTβR, DNAM1 및 모든 PVR 리간드를 발현시키는 세포의 분포를 시각화하였다(도 25E). 확인된 모든 16개의 Seurat 클러스터에 걸쳐 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 및 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질 변이체 모두와 비처리 대조군 사이에서 차별 발현된 유전자(DEG)를 확인하였다(도 14D). 골수, NK 및 CD8+ T 세포와 관련된 클러스터를 가로지른 DEG는 CCL3, ITGAX(CD11c를 암호화하는 유전자), CXCL8, CD68, CD74(HLA-DR을 암호화하는 유전자), B2M, IL32, CD7, JUNB, IER2 및 CXCR4를 포함하였다(도 14E 및 도 25F). 골수성 활성화 유전자의 상향조절은 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 또는 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 버전 중 하나에 의한 처리 후(도 14F) 클러스터 6 집단(LTβR의 고발현을 갖는 클러스터, 도 13F 참조)에서의 확장을 수반하였다. NK 집단(도 14D 내지 도 14E에서 클러스터 7, 10 및 11에서 발견)은 보통으로 증가되었고, CD8+ T 세포의 약간의 감소에도 불구하고(클러스터 5 및 8, T 세포 지지 사이토카인이 배양물에 첨가되지 않았다는 것을 주목함), T 세포 및 적응 면역 활성화와 관련된 유전자는 상향조절되었다(도 14F). 골수성, NK, 및 CD8+ T 세포 클러스터와 관련된 DEG 상의 유전자 온톨로지 경로 분석은 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 또는 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질이 다수의 면역 세포 분획에 걸쳐 광범위한 면역 세포 활성화를 자극하였다는 것을 확인하였다(도 14G). 흥미롭게도, 모든 Seurat 클러스터에 걸쳐 평가한 모든 DEG 중에서, 총 2개의 유전자만이 TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 또는 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질 사이에서 차별적으로 발현되는 것을 발견하였다(도 25G). 총괄적으로, 이런 결과는 특히 FcγR 결합 또는 비결합 Fc 도메인의 선택에 의해 추가로 영향받지 않은 LIGHT에 의한 직접적인 골수성 세포 활성화에 대한 증거를 제공하였다.
TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT 및 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 키메라 단백질로 처리한 마우스로부터의 인간 PBMC로부터 단리시킨 골수성 세포의 배수 변화를 비처리 마우스와의 비교에서 평가하였다. 구체적으로, HLADRB1m HLA-DRB, CD80, CD86, CD40 또는 B2M 발현 세포를 평가하였다. 도 14H에 나타낸 바와 같이, 유도는 Fc-적격 뮤린 항체에 의해 관찰된 것보다 더 컸다(예를 들어, 문헌[Han, et al., Effective Anti-tumor Response by TIGIT Blockade Associated With FcγR Engagement and Myeloid Cell Activation Frontiers in Immunology 11:573405(2020)] 참조). 이런 결과는, 이론에 의해 구속되는 일 없이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 LIGHT:LTbR 상호작용을 통해 골수성 세포를 활성화시키고, Fc 도메인의 조성에 의존하지 않는다는 것을 시사한다.
뮤린 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(mTIGIT-Fc-LIGHT)의 생체내 항-종양 활성을 결장직장 암종(CT26/WT) 및 흑색종(B16.F10) 모델에서 평가하였다. 둘 다 CPI에 민감성(CT26/WT) 또는 비민감성(B16.F10)인 모델로서 널리 사용된다. 항-PD-1/L1 차단에 대한 1차 내성을 모방하기 위해 B16.F10 모델을 사용할 수 있다.
BALB/c 마우스는 CT26/WT 종양을 뒷 옆구리에 접종하였고, when 평균 시작 종양 용적(STV)이 대략 84㎣에 도달되었을 때, 마우스를 무작위화하고, mTIGIT-Fc-LIGHT 또는 기준 항체로 처리하였다(도 12A). mTIGIT-Fc-LIGHT는 종양 성장을 유의미하게 지연시켰고; 초기 처리 후에, 융합 단백질 처리군이 종양 부담에 도달된 평균 일수는 초기 처리 후 28일(+/- 6.87일)이었고, 이를 비히클 대조군에 대해 제15일(+/- 3.01일)과 비교하였다(도 12C). TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 활성을 뮤린 TIGIT, PD-1, PD-L1, LTβR, Fc-LIGHT 융합 단백질을 표적화하는 항체의 활성과 비교하였고, 이들 제제의 조합을 아래의 표에 나타낸다:
위의 표는 시험 제제, 용량 및 CT26 WT 종양 효능 실험에 대한 스케줄을 나타낸다.
위의 표는 시험 제제, 용량 및 CT26 WT 종양 효능 실험에 대한 스케줄을 나타낸다.
상업적으로 입수 가능한 항-TIGIT(클론 1G9)만이 효과기 침묵 마우스 IgG1이고, 단일요법으로서 여전히 보통의 활성을 보여주며, 제18일까지의 종양 부담까지의 시간(+/- 4.38일)을 증가시킨다. Fc-LIGHT 자체는 종양 부담까지의 시간을 20일(+/- 1.92일)까지 지연시켰지만, 항-TIGIT와의 조합은 이를 추가로 연장시킬 수 없었으며, 이는 이론에 구속되지 않고, 대부분의 항종양 활성이, LIGHT로부터 유래되었다는 것을 시사한다. 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT는 항-TIGIT 및 Fc-LIGHT의 별개의 투여 이상으로 생존을 유의미하게 개선시켰고, 이는 이들 저해 및 공자극 신호의 공동 국재화가 항-종양 효능을 최대화하는 데 중요하다는 것을 나타낸다(도 12D, 도 26A, 아래의 표).
위의 표는 CT26 WT 종양 효능 실험에 대한 생존 통계를 나타낸다.
상업적으로 입수 가능한 LTβR 항체(클론 4H8 WH2)를 평가하였지만, CT26/WT 모델에서 임의의 활성을 나타내지 않았다(도 26B). 고무적이게도, mTIGIT-Fc-LIGHT 단일요법은 처리 동물의 12.9%에서 완전한 종양 퇴행을 유도하였다.
원발성 종양을 거부한 개개 마우스를 후속 재처리 없이 반대편 뒷 옆구리 상에서 CT26/WT 종양 세포의 두 번째 접종으로 제29일에 재시험감염시켰다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 초기 처리 과정 후 완전한 종양 거부를 갖는 것으로 관찰된 마우스는 2차 종양의 진행을 방지한 보호 면역을 갖는 것이 발견되었다(도 26C). TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 초기에 처리한 6마리 마우스 및 항-PD-L1 단일요법으로 처리한 3마리 마우스를 포함한 이런 동물들로부터, 제39일(제29일 재시험감염 후 10일)에 말초 혈액을 단리시켰다. 이중 양성 효과기 기억 세포(총 CD8+ PBMC 중 CD127+KLRG1+)의 비교 수준을 이들 마우스에서 평가하였고, 세포의 이런 집단은 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처음에 처리한 동물에서 유의미하게 확장되는 것을 발견하였다(도 26D). TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 초기 항-종양 활성은 CD25+ 및 FOXP3+ CD4 조절 T 세포의 고갈과 함께 IFNg+ NK 세포, 항원-특이적 CD8+ T 세포 및 CD86+ 수지상세포의 증가된 종양 침윤과 관련되었다(도 26E). 흥미롭게도, FOXP3 수준은 또한 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 IgG1 및 IgG4 변이체 둘 다에 의한 처리 후 인간 PBMC에서, 구체적으로는 조절 T 세포에 대한 ImmuneExp 정의 주석에서 하향조절되는 것이 관찰되었다(도 25F). 또한, 이들 뮤린 연구에서, 분리된 종양 조직으로부터 생성된 상청액을 이용하여 일련의 효과기 및 골수성-특이적 사이토카인을 종양 환경에서 평가하였다. mTIGIT-Fc-LIGHT 처리 동물의 종양 미세환경 내에서 IL-2, TNFα, CCL3, CCL4, IL-12(p70) 및 CCL2의 증가된 종양 수준이 발견되었다(도 26F). 항-TIGIT와 Fc-LIGHT 및 항-PD-1 또는 항-PD-L1 중 하나의 조합은 기준 대조군의 가장 큰 활성을 수득하였고, 종양 부담을 31(+/- 3.75일) 및 32(+/- 3.82일)일이 되게 하였고 그리고 각각 처리된 동물의 7.7% 및 23.1%에서 완전한 종양 거부가 일어났다(도 12C). mTIGIT-Fc-LIGHT와 항-PD-1 또는 항-PD-L1 중 하나의 조합은 또한 효능을 유의미하게 개선시켰고, 종양 부담은 제33일에 도달되었다(각각 +/- 4.94 또는 4.64일). 항-PD-1과 항-PD-L1 조합 둘 다에 대해 동물의 40.9%에서 완전한 종양 거부가 관찰되었다.
마우스 TIGIT-Fc-LIGHT는 또한 B16.F10 흑색종에서 단일요법 활성이 입증되었고, 종양 부담에 도달하는 평균 시간은 항-TIGIT + Fc-LIGHT 조합 그룹에서 비히클 대조군에서 10(+/- 2.00), 및 14(+/- 2.27)일에 비해 19(+/- 4.47)일로 보였다(도 12A, 도 12E, 및 아래의 표).
아래의 표는 시험 제제, 용량 및 B16.F10 종양 효능 실험에 대한 스케줄을 나타낸다.
위의 표는 그룹 샘플 크기 및 B16.F10 종양 효능 실험에서 원발성 종양을 완전히 거부한 동물의 수를 나타낸다.
항-TIGIT, Fc-LIGHT, 및 항-PD-1 또는 항-PD-L1 중 하나의 삼중 조합은 중간의 이점을 제공하여, 제18일(각각 +/- 3.02 또는 2.56일)까지 종양 성장을 지연시킨다. mTIGIT-Fc-LIGHT와 항-PD-1 또는 항-PD-L1의 조합은 효능 및 생존을 추가로 개선시켰다(각각 제24일(+/- 4.85) 및 제26일(+/- 4.02)), 항-PD-L1과의 조합은 한 마리의 동물에서 완전한 종양 거부를 유도하였다. 이런 결과는 공격적 종양 유형 및 평균 시작 종양 용적이 110㎣ 초과인 것을 고려할 때 유의미하다(도 12E, 도 12F, 도 26G, 및 아래의 표).
위의 표는 B16.F10 종양 효능 실험에 대한 생존 통계를 나타낸다.
B16.F10 모델에서, 항-종양 활성에 대한 면역 세포 서브세트의 기여를 평가하였다. 마우스의 코호트를 시간 과정의 -제1일, 제1일 및 제7일에 CD4, CD8 또는 NK 고갈 항체로 처리하였고, 유세포 분석에 의해 세포 고갈을 확인하였다(도 12A, 도 12H, 및 도 26H). CD4 세포의 고갈은 mTIGIT-Fc-LIGHT 활성에 영향을 미치지 않았지만, 그러나, CD8 세포 또는 NK 세포의 고갈은 종양 성장 제어를 부분적으로 감소시켰고, 이는 TIGIT 및 HVEM의 발현 패턴과 일치된다(도 12H). CD8도 NK 고갈도 항-종양 반응을 완전히 없애지 않았다는 사실은, 이론에 의해 구속되는 일 없이, CD8+ T 세포와 NK 세포 둘 다TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 항 종양 활성에 독립적으로 기여하며, 이는 그럼에도 불구하고 세포 집단 둘 다 존재할 때 향상되었다는 것을 시사한다.
TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 항종양 활성 효과를 평가하기 위해, 마우스에 결장직장 종양 CT26 세포, CT26 항-PD-1 내성 세포(획득 내성) 또는 B16.F10 흑색종 종양(주로 내성)을 뒤 옆구리에 접종하였다. 마우스를 다음의 처리군에서 무작위로 분할하였다: (1) 비히클-단독, (2) 항-PD-1 항체(클론 RMP1-14)의 용량당 100㎍, (3) 항-PD-L1 항체(클론 10F.9G2)의 용량당 100㎍, (4) TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질, 항-PD-L1 항체의 용량당 200㎍, (5) 항-PD-1 항체의 용량당 100㎍ + TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 용량당 200㎍, 및 (6) 항-PD-L1 항체의 용량당 100㎍ + TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 용량당 200㎍. 마우스에 복강내 주사를 통한 종양 접종 후 제0일, 제3일 및 제6일에 투약하였다. B16.F10 모델에서 종양 접종 후 제11일에, 그리고 CT26 및 CT26 항-PD-1 내성 모델에서 종양 접종 후 제14일에 종양 크기를 측정하였다. 단독-처리 마우스에 비해 종양 성장 저해를 계산하고, 플롯팅하였다.
도 11(좌측 패널)에 나타낸 바와 같이, 처리 각각은 CT26 종양의 종양 성장 저해를 야기하였다. 항-PD-1 항체 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 조합 처리는 항-PD-1 항체 단독(p=0.0027)에 의한 처리뿐만 아니라 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독(p = 0.0264)에 의한 처리에 비해 유의미하게 더 높은 종양 성장 저해를 나타냈다(도 11, 좌측 패널). 유사한 실험에서, 시작 평균 종양 크기가 86.6㎣에 도달되었을 때, 동일한 처리를 개시하였고, 전체 생존을 측정하고, 플롯팅하였다. 도 12A는 개개 동물 종양 성장 곡선, 각 그룹이 종양 부담에 도달된 평균 일수, 및 처리에 반응하여 종양을 완전히 거부한 마우스의 수를 나타낸다. 도 12B(좌측 패널)에 나타낸 바와 같이, 관찰된 종양 성장 저해와 일치되게, 처리 각각은 비히클 처리 마우스에 비해 카플란-마이어 곡선에 나타낸 바와 같이 마우스의 증가된 생존을 야기하였다. 항-PD-1 항체 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 조합 처리는 항-PD-1 항체 단독에 의한 처리에 비해 유의미하게 더 높은 생존(p=0.0238)뿐만 아니라 카플란-마이어 곡선에 나타낸 바와 같이 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독에 의한 처리에 비해 더 높은 생존(p = 0.1445)을 나타냈다(도 12B, 좌측 패널).
CT26 항-PD-1 내성 세포 동종 이식편 모델에 의해 유사한 분석을 수행하였다. 도 11(중간 패널)에 나타낸 바와 같이, 항-PD-1 항체에 의한 처리를 제외하고, 처리 각각은 CT26 항-PD-1 내성 종양의 종양 성장 저해를 야기하였다. 흥미롭게도, 항-PD-1 항체 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 조합 처리는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독에 의한 처리에 비해 유의미하게 더 높은 종양 성장 저해를 나타냈다(p = 0.032)(도 11, 중간 패널). 이들 데이터는 특히 항-PD-1 항체 단독에 의한 처리가 CT26 항-PD-1 내성 종양 모델에서 효과적이지 않았기 때문에 놀랍다(도 11, 중간 패널). 항-PD-1 항체 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 조합 처리는 또한 항-PD-L1 항체 단독에 의한 처리에 비해 유의미하게 더 높은 종양 성장 저해를 나타냈다(p = 0.014)(도 11, 중간 패널). 유사한 실험에서, 시작 평균 종양 크기가 89.49㎣에 도달되었을 때, 처리를 개시하였다. 전체 생존을 측정하고 플롯팅하였다. 도 12B(중간 패널)에 나타낸 바와 같이, 항-PD-1 항체 단독에 의한 처리는, 만약에 있다면, CT26 항-PD-1 내성 종양 모델에서의 생존 개선을 거의 야기하지 않았고, 이는 종양 성장 저해의 관찰된 결여와 일치된다. 항-PD-L1 항체 단독에 의한 처리는 비히클 처리 마우스에 비해 카플란-마이어 곡선에 나타낸 바와 같이 CT26 항-PD-1 내성 종양 모델에서 생존의 일부 개선을 야기하였다(도 12B, 중간 패널). 흥미롭게도, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 항-PD-1 항체에 의한 조합 치료는 카플란-마이어 곡선에 나타낸 바와 같이 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독에 의한 처리에 비해 개선된 생존을 나타냈다(p = 0.1672)(도 12B, 중간 패널). 유사하게, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 항-PD-L1 항체에 의한 조합 치료는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독에 의한 처리에 비해 유의미하게 개선된 생존을 나타냈다(p = 0.0443)(도 12B, 중간 패널). 이들 데이터는 특히 항-PD-1 항체 단독에 의한 처리가 CT26 항-PD-1 내성 종양 모델에서 효과적이지 않았기 때문에 놀랍고(도 11, 중간 패널; 도 12B, 중간 패널), 항-PD-1 항체와 조합할 때 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 유의미하게 개선된 효능이 예상되지 않을 것이다.
B16.F10 세포 동종 이식편 모델에 의해 유사한 분석을 수행하였다. 도 11(우측 패널)에 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1 항체 단독 또는 항-PD-L1 항체 단독에 의한 처리는 종양 성장 저해의 매우 적은 개선을 나타냈다. 대조적으로, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독에 의한 처리는 B16.F10 세포 동종 이식편 모델에서 항-PD-L1 항체 단독 또는 항-PD-L1 항체 단독에 비해 종양 성장 저해의 더 큰 개선을 야기하였다. 흥미롭게도, 항-PD-L1 항체 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 조합 처리는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독(p = 0.0353) 또는 항-PD-L1 항체 단독(p < 0.0001)에 의한 처리에 비해 B16.F10 세포 동종 이식편 모델에서 유의미하게 더 높은 종양 성장 저해를 나타냈다(도 11, 우측 패널). 항-PD-1 항체 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 조합 치료는 또한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독에 의한 처리에 비해 B16.F10 세포l 동종 이식편 모델에서 더 높은 종양 성장 저해를 나타냈다(도 11, 우측 패널). 유사한 실험에서, 시작 평균 종양 크기가 99.03㎣에 도달되었을 때, 처리를 개시하였다. 전체 생존을 측정하고 플롯팅하였다. 도 12B(우측 패널)에 나타낸 바와 같이, 항-PD-1 항체 단독 또는 항-PD-L1 항체 단독에 의한 처리는 B16.F10 종양 모델에서 생존의 약간의 개선을 야기하였고, 이는 관찰된 작은 종양 성장 저해와 일치된다. 흥미롭게도, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 항-PD-1 항체에 의한 조합 치료는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독에 의한 처리에 비해 유의미하게 개선된 생존을 나타냈다(p = 0.0031)(도 12B, 우측 패널). 유사하게, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 항-PD-L1 항체에 의한 조합 치료는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단독에 의한 처리에 비해 개선된 생존을 나타냈다(p = 0.2268)(도 12B, 우측 패널). 이들 데이터는 특히 항-PD-1 항체 또는 PD-L1 항체 단독에 의한 처리가 B16.F10 종양 모델에서 효과적이지 않았기 때문에 놀랍고 (도 11, 우측 패널; 도 12B, 우측 패널), TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 조합하였을 때 효능을 유의미하게 개선시키는 것으로 예상되지 않을 것이다.
관문 저해제 획득 내성의 전임상 모델을 생성하고, 특성규명하였다. 상기 모델은 PD-1/L1 획득 내성 NSCLC 환자에서 관찰된 다수의 특징을 반영한다. 이 모델은 확립된 CT26/WT 종양을 갖는 마우스를 항-PD-1 항체로 처리하고, 부분적으로 제어되지만 처리 후에 거부되지 않은 종양을 절개함으로써 개발되었다. 절개된 종양을 분리시키고, 생체외에서 확장하고, 항-PD-1 항체에 의한 반복 처리를 위해 새로운 수용자 마우스에 재접종하였다. 이 절차는 마우스 중 어느 것도 PD-1 차단으로부터의 이점을 나타내지 않을 때까지, 지속적인 항-PD-1 선택적 압력을 제공하기 위해 생체내에서 연속해서 5회 반복하였다. 얻어진 종양은 CT26/AR(획득 내성)로 명명하였다. CT26/AR 종양 및 PD-1/L1 항체 획득 내성 NSCLC 환자로부터 단리된 종양의 전사체를 비교하였고, JAK/STAT 및 IFN 신호전달 경로에서 유사한 섭동(perturbation)을 공유하는 것이 발견되었다. 따라서, CT26/AR 모델은 PD-1/L1 내성의 설정에서 신규한 치료제의 잠재적 항-종양 활성을 평가하기 위한 유용한 도구일 수 있다.
이전에 제시된 기준 대조군 처리군과 함께 마우스 TIGIT-Fc-LIGHT는 수용자 마우스에서 100㎣ 초과의 시작 종양 용적에 도달된 후에 CT26/AR 종양에서 평가하였다(도 12A, 및 아래의 표).
아래의 표는 시험 제제, 용량 및 CT26 AR 종양 효능 실험에 대한 스케줄을 나타낸다.
위의 표는 그룹 샘플 크기 및 CT26 AR 종양 효능 실험에서 원발성 종양을 완전히 거부한 동물의 수를 나타낸다.
평균적으로, CT26/AR 종양은 이들의 CT26/WT 상대보다 생체내에서 더 빠르게 성장하며, 비히클 처리 동물은 처리 개시 후 평균 14(+/- 3.02)일에 종양 부담에 도달된다(도 12I). 항-TIGIT 또는 항-PD-1에 의한 처리는 종양 성장을 적절하게 지연시키지 않았지만, Fc-LIGHT 및 항-PD-L1은 17(+/- 3.38) 및 19(+/- 5.07)일에 각각 종양 부담을 지연시켰다. Fc-LIGHT의 보통의 단일요법 활성은 또한, 이론에 의해 구속되는 일 없이, HVEM 및/또는 LTβR을 통한 LIGHT 신호전달이 PD-1로부터 독립적으로 작용하며, 단일요법 항-TIGIT 처리와 별개였다는 것을 시사하였다(도 12I). 이런 계통 중에서, HVEM과 DNAM-1 사이의 세포질 아미노산 서열의 정렬은 최소 상동성을 확인하였고, 이에 의해 HVEM은 DNAM-1에서 발견된 타이로신 잔기를 결여하였고, 이는 PD-1의 SHP-2 도메인에 의해 탈인산화되는 것으로 보고되었다; DNAM-1 공자극의 PD-1 저해에 관련되었다(도 27B).
마우스 TIGIT-Fc-LIGHT 단일요법은 제24일(+/- 6.05일)까지 종양 부담을 지연시켰고, 항-TIGIT 및 Fc-LIGHT의 별개의 투여에 비해 생존을 유의미하게 지연시켰다(Mantel-Cox p-값 <0.0001; 도 12I- 도 12J, 도 27A, 및 아래의 표).
위의 표는 CT26 AR 종양 효능 실험에 대한 생존 통계를 나타낸다.
항-PD-1 또는 항-PD-L1 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 조합은 종양 부담을 제29일(+/- 5.95일) 및 31(+/- 5.18일)까지 지연시켰고, 마우스의 9.1% 및 18.2%에서 각각 완전한 종양 거부를 유도하였다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 조합은 둘 다 항-TIGIT, Fc-LIGHT, 및 항-PD-1 또는 항-PD-L1 중 하나의 삼중 조합에 비해 생존을 유의미하게 개선시켰다(도 12J 및 도 27A). 흥미롭게도, CT26/AR 종양은 CT26/WT 종양보다 약간 더 적은 CD8+ T 세포 침윤을 가졌지만, 유사한 수준의 NK 세포를 가졌다(도 27C 내지 도 27D). T 세포 침윤물을 치료적으로 향상시키는 능력은 CT26/AR 종양에서 제한되었지만, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단일요법은 여전히 항원-특이적 CD8+ T 세포를 종양 내로 적당히 향상시켰다. 더 나아가, 이 종양 모델에서, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 항-PD-L1의 조합은 CT26/WT 종양에서 관찰된 수준과 비슷한 효과기 CD8+ T 세포 침윤의 유의미한 증가를 야기하였다(도 27C). NK 세포는 CT26/AR 모델에서 더 적게 영향을 받는 것을 나타나며, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 단일요법과 항-PD-L1과의 조합은 둘 다 NK 세포의 유의미한 증가를 야기하였다(도 27D). 이런 결과는 앞서 기재된 세포 고갈 연구에서 확인된 면역 세포 기여와 일치되며(도 12H) 특히 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 광범위한 면역 자극 활성이 관문 획득 내성의 설정에서 항-종양 면역을 강화시킬 수 있다는 것을 시사한다.
이런 결과는 특히 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 관문 차단에 대한 내성과 상관없이 암에 효과적이라는 것을 입증한다. 또한, PD-1/PD-L1 축 차단에 민감한 암은 PD-1/PD-L1 축 차단제와 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 조합으로 처리될 수 있다.
골수성 세포의 활성화를 평가하기 위해, 뮤린 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(mTIGIT-Fc-LIGHT)은 종양을 보유하는 마우스에서 IV 주사하였고, 증가된 용량의 뮤린 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(mTIGIT-Fc-LIGHT)을 마우스에 주사하였다. 1일 후 말초 혈액을 추출하였고, 유세포분석을 이용하여 세포의 면역 표현형을 수행하였다.
도 12K에 나타낸 바와 같이, 200㎍ 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 CD8+ 세포의 계수를 감소시켰다. 도 12L에 나타낸 바와 같이, 20, 100, 200 및 300㎍ 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 활성화된 CD8+ DNAM1+세포의 계수를 유의미하게 감소시켰다. 반면에, 도 12M에 나타낸 바와 같이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 CD4+ 세포의 계수를 유의미하게 변화시킨다. 이런 결과는 CD8+ T 세포, 구체적으로는 CD8+DNAM1+ 세포가 주변부에서 "변연화"되며; 약 10㎎/㎏의 인체 등가 용량인 200ug의 용량에서 최대가 된다는 것을 시사한다.
도 12N에 나타낸 바와 같이, 100, 200 및 300㎍ 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 CD11+ 세포 계수를 유의미하게 증가시켰다. 도 12O에 나타낸 바와 같이, 100, 200 및 300㎍ 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 활성화된 CD11+ CD80+ 세포 계수를 유의미하게 증가시켰다. 유사하게, 도 12P에 나타낸 바와 같이, 100, 200 및 300㎍ 용량의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 활성화된 CD11+CD86+ 세포 계수를 유의미하게 증가시켰다. 이 결과들은 총 활성화된 CD11b+ 세포가 증가하여, 약 10㎎/㎏의 인간 등가 용량인 200㎍의 용량에서 최대가 된다는 것을 시사한다.
실시예 12: TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 선천성 면역과 적응 면역을 둘 다 활성화시킨다
53개의 면역 공자극 수용체의 발현을 TCGA 종양에 대해 평가하였다(도 13A). 모든 TCGA 종양에 대한 각 유전자의 평균 발현에 기반한 높음에서 낮음의 순서로 유전자에 순위를 매겼다. 진행된 종양에서의 DNAM-1 발현의 앞서 기재한 하향조절과 일치되게, 본 발명자들은 DNAM-1이 가장 덜 풍부한 면역 공동자극제 중 하나로서 순위가 매겨졌다는 것을 발견하였다(도 13A). 종양 유형에 걸쳐 더 일치된 발현 패턴을 갖는 공자극 수용체 중에서, 헤르페스 바이러스 침투 매개체 A(HVEM, TNFRSF14)와 림포톡신 베타 수용체(LTβR, TNFRSF3)는 둘 다 DNAM-1에 비해 유의미하게 더 높은 전사체 계수로 상위 10개 중에 순위가 정해졌다(도 13A 내지 도 13B). TNF-수용체로서 HVEM 및 LTβR의 발현은 모든 TCGA 암에 걸쳐 종양에서 고도로 발현되었고, 상위 10개에서 HVEM 및 LTBR을 식별한다(도 13A). HVEM 및 LTβR은 둘 다 LIGHT로 알려진 TNF 리간드에 대한 수용체이다(TNFSF14, '림포톡신에 상동성은 유도성 발현을 나타내고, T 림프구 상에서 발현된 수용체인 HVEM에 대한 결합에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁한다).
Tscm 세포 상의 HVEM 및 DNAM-1의 상대 발현을 평가하기 위해, 앞서 기재한 시험관내 분화 프로토콜을 사용하였다. 문헌[Gattinoni et al., A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nat Med 17, 1290-1297(2011)]. HVEM 및 LTβR은 LIGHT에 대한 수용체이지만, TIGIT는 DNAM-1의 활성화 효과를 길항한다. 따라서, T 줄기 세포 기억(Tscm) 세포 상의 HVEM 및 DNAM-1의 발현을 특성규명하였다. 미경험 CD8+ 세포를 건강한 공여자 인간 PBMC로부터 단리시키고, 항-인간 CD3/CD28 비드, IL-2 및 GSK3β 저해제와 함께 배양시켰다. 배양물에서 9일 후에, 세포를 단리시키고, Tscm 세포로부터 미경험 CD8+ T 세포(Tn)를 분리시키는 항체의 패널을 이용하여 표현형을 나타냈다(도 13C). 문헌[Gattinoni et al., A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nat Med 17, 1290-1297(2011)]. CD3/CD28, IL-2 및 GSK3β 저해제로 9일 동안 유도한 T 줄기 세포 기억(Tscm) 세포 상의 DNAM-1 발현에 대해 HVEM 발현을 특성규명하였다. HVEM 및 DNAM-1의 발현을 분석하였다. 따라서, 대다수의 Tn 세포가 HVEM을 발현시키지만(74.1%는 HVEM 단독을 발현시키고, 21.8%는 HVEM과 DNAM-1을 공동발현시킴), 1.15%의 Tn만이 DNAM-1 단독을 발현시킨다는 것이 발견되었다. 최근의 공개되지 않은 발견과 일치되게, Tscm 세포는 이들의 Tn 상대보다 더 DNAM-1을 발현시켰지만, 대다수의 DNAM-1+ 세포는 또한 HVEM을 발현시켰다(54.25% 중 45.5%). 또한, 총 Tscm의 86.7%는 고수준의 HVEM을 발현시켰다. 이 데이터세트에서, HVEM은 Tscm을 포함하는 모든 T 세포 집단 상에서 고도로 발현된 반면, DNAM-1 발현은 상이한 기억 T 세포 서브세트 간에 달랐다(도 13C 및 도 23A). 따라서, TNF-수용체로서 HVEM 및 DNAM-1은 미경험 CD8+ T 세포 및 CD8+ T 줄기 세포 기억 세포 상에서 고도로 발현되었다.
이 분석을 연장시키고 면역 세포 상에서 공자극 신호의 존재비를 체계적으로 평가하기 위해, 단세포 RNA 서열분석(scRNA-seq)을 인간 PBMC 상에서 수행하였고, 전사체 클러스터링(Seurat) 및 면역 세포 유형 예측을 통해 세포 집단을 생물정보학적으로 정하였다(도 13D). 위에 평가한 53개의 면역 공자극 유전자의 발현을 또한 16개의 Seurat 정의된 클러스터에 대해 정보를 얻었다(도 13D). 모든 클러스터에 대한 각 유전자의 평균 발현에 기반한 높음에서 낮음의 순서로 유전자에 순위를 매겼다. TNFRSF14(HVEM) 및 CD226(DNAM-1)을 이런 히트맵에서 높음으로 순위를 매겼고, 이는 이들이 다수의 면역 세포에서 고도로 발현되며, 특히, CD8+ T 세포에 대응된 클러스터 5 및 8, 및 자연 살해(NK) 세포를 나타낸 클러스터 7, 10 및 11에서 고도로 발현되었다는 것을 나타낸다(도 13E 및 도 13F). 노버슈테른(Novershtern) 및 HPCA 주석을 또한 데이터에 적용하였고, 유사한 세포 유형 예측을 생성하였다(도 23B). 예상한 바와 같이, LTBR 발현은 클러스터 6을 제외하고, 골수성 세포를 나타내는 대부분의 PBMC 집단에서 다른 TNF-수용체에 비해 낮았다(도 13F).
선천성 및 적응 면역에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 효과를 연구하였다. 간략하게, 마우스는 결장직장 종양 CT26 세포 또는 CT26 항-PD-1 내성 세포 종양을 뒤 옆구리에 접종하였다. 실험 마우스의 코호트를 종양 접종 후 14일에 인도적으로 안락사시켰고, 종양을 절개하고 분리시키고 나서, 면역 침윤을 유세포분석에 의해 평가하였다. T 및 NK 세포를 발현시키는 HVEM/DNAM1을 절개된 CT26 또는 CT26 항-PD-1 내성 종양으로부터 유세포분석에 의해 평가하였다. 도 13G에 나타낸 바와 같이, 약 93%의 NK 종양 침윤성 림프구(TIL)는 HVEM+였고, 이는 약 61%인 DNAM1+ NK TIL과 비교하였다. 게다가, CD8 T TIL의 약 95%는 HVEM+였고, 이를 약 58%인 DNAM1+ CD8 T TIL과 비교하였다(도 13G). 이런 결과는 특히 HVEM의 발현이 DNAM에 비해 TIL에서 더 흔하지만, 선천성과 적응 면역 세포 둘 다 TIL에 존재한다는 것을 시사한다.
TIL 상에서 DNAM-1 보다 더 HVEM의 우선적인 발현이 다양한 뮤린 종양 유형에 대해 전임상으로 번역되는지의 여부를 평가하기 위해, 마우스에 CT26 야생형 (CT26/WT), CT26 CPI-획득 내성(CT26/AR) 또는 B16.F10 종양을 접종하였다(도 13G). 종양을 확립시켰고, 이어서, 마우스로부터 단리시키고, 분리시키고, CD8+ T 및 NK 세포 침윤을 유세포분석에 의해 평가하였다. 모두 3개의 종양 유형에서, HVEM은 DNAM-1보다 CD8+ T 및 NK 세포 둘 다에서 훨씬 더 크게 발현되는 것이 발견되었는데, 이는 인간 PBMC 결과와 일치된다(도 13G). 추가적으로, HVEM은 마우스 비장세포로부터 단리된 T 및 NK 세포 상에서 고수준으로 발현되는 것이 발견되었다(도 23C). 종합하면 이런 결과는 HVEM 및 LTβR을 통해 공자극 신호전달을 제공할 수 있는 치료 후보의 탐구에 대한 근거를 제공하였다.
면역 세포 상의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 효과를 평가하기 위해, 인간 PBMC를 AIMV 배지에서 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 IgG1 또는 IgG4 변이체와 함께 배양시켰다. 배양 2일 후에 단세포 RNA-seq를 수행하였고, 고차원(hi-dimensionality) 감소 알고리즘에 의해 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP)을 분석하였다. 도 14F에 나타낸 바와 같이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 IgG1 또는 IgG4 변이체는 둘 다 비처리 세포와 비교할 때 유사한 변화를 생성하였다. 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 유도한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질와 관련된 경로를 진화적 관계를 통한 단백질 분석(PANTHER)에 의해 확인하였다. 도 14G에 나타난 바와 같이, 골수성 세포 기능과 관련된 106개의 DEG는 비처리 세포에 비해 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리된 PBMC에서 상향조절되었다. 골수성 세포 기능과 관련된 130개의 DEG는 비처리 세포에 비해 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리된 PBMC에서 하향조절되었다(도 14G). NK 세포 기능과 관련된 47개의 DEG는 비처리 세포에 비해 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리된 PBMC에서 상향조절되었다(도 14G). NK 세포 기능과 관련된 17개의 DEG는 비처리 세포에 비해 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리된 PBMC에서 하향조절되었다(도 14G). CD8+ T 세포 기능과 관련된 37개의 DEG는 비처리 세포에 비해 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리된 PBMC에서 상향조절되었다(도 14G). CD8+ T 세포 기능과 관련된 12개의 DEG는 비처리 세포에 비해 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리된 PBMC에서 하향조절되었다(도 14G). 이런 결과는 특히 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 골수성, CD8+ T 또는 NK 세포에 대응한 세포 집단의 기능에 영향을 미쳤다는 것을 나타냈다. SingleR 및 ImmuneExp를 이용하여 유사한 결과를 얻었다(도 13D).
TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 함께 PBMC의 배양 2일 후에, 중규모 디스커버리(MSD) ELISA 분석을 이용하여 다수의 사이토카인을 분석하였다. 도 14C에 나타낸 바와 같이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(버전 둘 다 IgG1 또는 IgG4로부터의 Fc 도메인을 포함함)은 IFNγ, IL-8, IL-10, IL-12/p70 및 SDF1a(CXCL12)를 유의미하게 유도하였다. 총괄적으로, 이런 결과는 특히, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 골수성, CD8+ T 또는 NK 세포 집단을 자극하였고, 해당 세포가 사이토카인을 생성하도록 유도하였다는 것을 시사한다.
HVEM의 발현을 위해 상업적으로 입수 가능한 PVR:DNAM1 리포터 분석으로부터의 Jurkat 효과기 세포를 분석하였다. 도 14C(상부 패널)에 나타낸 바와 같이, 이런 Jurkat 효과기 세포는 또한 인간 HVEM을 발현시켰다. 이런 세포를 (LIGHT 차단 유무와 상관없이) 항-IgG4 대조군, 항-DNAM-1 항체, Fc-LIGHT 단면 단백질 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 함께 인큐베이션시켰다. 흥미롭게도, 이런 세포의 배경 생물발광을 항-DNAM-1 항체에 의해 저해하였고(도 14C), 이는 DNAM-1 공자극에 대한 역할을 나타낸다. 도 14C(하부 패널)에 나타낸 바와 같이, Jurkat 효과기 세포는 LIGHT-Fc 단백질 또는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질과 함꼐 인큐베이션시켰을 때 생물발광에 의해 분석한 활성화를 나타냈다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 Fc-LIGHT 단백질에 비해 더 많은 생물발광을 생성하였다(도 14C). 그러나, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의해 생성된 생물발광은 LIGHT 항체 차단에 의해 차단되었다(도 14C). 이런 데이터는, 이론에 의해 구속되는 일 없이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 특히 DNAM-1 공자극에 대한 필요를 우회하고, HVEM을 통한 하류의 신호전달을 직접적으로 활성화시켰다는 것을 시사하였다.
항-PD-1의 효과를 평가하기 위해, 선천성 및 적응 면역에 대한 항-PD-L1 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질을 다음에 연구하였다. 간략하게, 마우스는 결장직장 종양 CT26 세포 또는 CT26 항-PD-1 내성 세포를 뒤 옆구리에 접종하였다. 마우스를 다음의 처리군에서 무작위로 분할하였다: (1) 비히클-단독, (2) 항-PD-1 항체(클론 RMP1-14)의 용량당 100㎍, (3) 항-PD-L1 항체(클론 10F.9G2)의 용량당 100㎍, (4) TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질, 항-PD-L1 항체의 용량당 200㎍, (5) 항-PD-1 항체의 용량당 100㎍ + TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 용량당 200㎍, 및 (6) 항-PD-L1 항체의 용량당 100㎍ + TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 용량당 200㎍. 마우스에 복강내 주사를 통한 종양 접종 후 제0일, 제3일 및 제6일에 투약하였다. 처리군에 대해 항원-특이적 CD8+ T 세포(AH1+) 및 NK 세포의 비율을 결정하였다.
도 12G(상단 좌측 패널)에 나타낸 바와 같이, 처리 각각에 의한 야생형 CT26 종양의 처리는 비히클 처리 마우스에 비해 AH1+ CD8+ T 세포(p<0.05)를 유의미하게 증가시켰다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체의 조합에 의한 야생형 CT26 종양의 조합 처리는 단일 처리에 비해 AH1+ CD8+ T 세포의 양을 추가로 증가시켰다(도 12G, 상단 좌측 패널). 추가로, 도 12G(하단 좌측 패널)에 나타낸 바와 같이, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 야생형 CT26 종양의 처리는 비히클 처리 마우스에 비해 NKP46+ NK 세포를 유의미하게 증가시켰지만, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체는 그렇지 않았다(p<0.0001). TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체의 조합에 의한 야생형 CT26 종양의 처리는 또한 비히클 처리 마우스에 비해 NKP46+ NK 세포의 양을 유의미하게 증가시켰다(도 12G, 하단 좌측 패널).
항-PD-1 항체에 의한 CT26 항-PD-1 내성 세포 종양의 처리는 AH1+ CD8+ T 세포(도 12G, 상단 우측 패널) 또는 NKP46+ NK 세포(도 12G, 하단 우측 패널) 중 하나의 비율을 유의미하게 증가시키지 않았다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 항-PD-L1 항체의 조합에 의한 CT26 항-PD-1 내성 세포 종양의 처리는 AH1+ CD8+ T 세포의 비율을 유의미하게 증가시켰다(도 12G, 상단 우측 패널). 또한, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 CT26 항-PD-1 내성 세포 종양의 처리는 단독으로, 또는 항-PD-L1 항체와 조합하여 NKP46+ NK 세포의 비율을 유의미하게 증가시켰다(도 12G, 하단 우측 패널).
이런 결과는 특히 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 선천성 면역과 적응 면역을 둘 다 활성화시킨다는 것을 나타낸다. 이론으로 구속되는 일 없이, 이런 결과는 특히 항-PD-1 획득 내성 CT26 모델에서 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 활성이 선천성과 적응 항-종양 면역 반응을 둘 다 활성화시키는 이의 능력에 의해 독특하게 유도되고 NK 세포와 항원-특이적 CD8+ T 세포 둘 다의 침윤을 촉진시킨다는 것을 시사한다.
TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 항-종양 활성에 대한 다양한 유형의 면역 세포의 역할을 평가하기 위해, 종양 보유 마우스는 TIGIT-Fc-LIGHT에 의한 처리 전에 CD4+ T 세포, CD8+ 세포 또는 NK 세포를 고갈시켰다. 간략하게, 마우스는 뒤 옆구리에 B16.F10 종양을 접종하였다. 마우스를 다음의 처리군에서 무작위로 분할하였다: (1) 비히클-단독, (2) TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질(고갈 없음)의 용량당 200㎍, (3) TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 + CD4+ T 세포 고갈(-CD4)의 용량당 200㎍, (4) TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 + CD8+ T 세포 고갈(-CD8)의 용량당 200㎍, 및 (5) TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 +NK 세포 고갈 (-NK)의 용량당 200㎍. 표시된 세포를 고갈시킨 항체로 마우스를 처리하였고, 복강내 주사를 통한 종양 접종 후 제0일, 제3일 및 제6일에 투약하였다. 종양 접종 후 11일에 종양 크기를 측정하였다. 단독-처리 마우스에 비해 종양 성장 저해를 계산하고, 플롯팅하였다. 도 12H에 나타낸 바와 같이, 비히클-처리 대조군에 비해, 고갈 없음 대조군, -CD4 및 -CD8 그룹은 유의미한 종양 감소를 나타냈다. 고갈 없음 마우스에 비해, -CD8 마우스 및 -NK 마우스는 (통계학적으로 유의미한) 감소된 항암 반응을 나타냈다. CD4- 마우스는 만약에 있다고 해도 더 작은 영향이 있었다. 이런 데이터는 특히 CD8+ 및 NK 세포가 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의해 생성된 항-종양 반응에서 어떤 역할을 한다는 것을 나타낸다.
이어서, 종양 침윤성 림프구를 분석하였다. 간략하게, 마우스는 결장직장 종양 CT26 세포 또는 CT26 항-PD-1 내성 세포를 뒤 옆구리에 접종하였다. 마우스를 다음의 처리군에서 무작위로 분할하였다: (1) 비히클-단독, (2) 항-PD-1 항체(클론 RMP1-14)의 용량당 100㎍, (3) 항-PD-L1 항체(클론 10F.9G2)의 용량당 100㎍, (4) TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 용량당 200㎍, (5) 항-PD-1 항체의 용량당 100㎍ + TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 용량당 200㎍, 및 (6) 항-PD-L1 항체의 용량당 100㎍ + TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 용량당 200㎍. 마우스에 복강내 주사를 통한 종양 접종 후 제0일, 제3일 및 제6일에 투약하였다. 처리군에 대해 항원-특이적 CD8+ T 세포(AH1+) 및 NK 세포의 비율을 결정하였다. 도 12G(상단 좌측 패널)에 나타낸 바와 같이, 축적된 CT26 종양은 각각의 제제로 처리하였을 때 CD8+ T 세포(AH1 사량체+)의 수를 증가시켰다. 축적된 CT26 종양은 단독으로 CD8+ T 세포(AH1 사량체+)의 보통의 증가를 나타낸 항-PD-L1 항체와의 공동 처리에 의해 추가로 향상되는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리될 때, CD8+ T 세포(AH1 사량체+)의 수를 증가시켰다(도 12G(상단 우측 패널)). 도 12G(하단 좌측 패널)에 나타낸 바와 같이, 축적된 CT26 종양은 각각의 제제로 처리하였을 때 NK 세포의 수를 증가시켰다. 축적된 CT26 종양은 단독으로 NK 세포의 보통의 증가를 나타낸 항-PD-L1 항체와의 공동 처리에 의해 추가로 향상되는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리될 때, NK 세포의 수를 증가시켰다(도 12G(상단 우측 패널)).
실시예 13: 항-TIGIT 및/또는 항-PD-1 항체와 비교되는 항-PD-1 내성 세포주 및 주요 내성 항-PD-1 내성 세포주에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 효능
간략하게, 마우스에 결장직장 종양 CT26 세포, CT26 항-PD-1 내성 세포(획득 내성) 또는 B16.F10 흑색종 종양(주로 내성)을 뒤 옆구리에 접종하였다. 마우스를 다음의 처리군에서 무작위로 분할하였다: (1) 비히클-단독, (2) 항-TIGIT 항체(클론 1G9)의 용량당 100㎍, (3) 항-PD-1 항체(클론 RMP1-14)의 용량당 100㎍, (4) 항-PD-1 항체 + 항-TIGIT 항체 각각의 용량당 100㎍, (5) TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질, 항-PD-1 항체의 용량당 200㎍, 및 (6) 항-PD-1 항체의 용량당 100㎍ + TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 용량당 200㎍. 마우스에 복강내 주사를 통한 종양 접종 후 제0일, 제3일 및 제6일에 투약하였다. 종양 접종 후 14일에 종양 크기를 측정하였다. 종양 용적을 측정하고, 플롯팅하였다.
도 15(상단 패널)에 나타낸 바와 같이, 항-TIGIT 항체 단독에 의한 처리는 비히클 단독 처리 마우스에 비해 CT26 종양을 보유하는 마우스에서 종양 크기를 유의미하게 감소시켰다(p<0.05). 항-PD-1 항체, 항-TIGIT 및 항-PD-1 항체의 조합, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 항-PD-1 항체의 조합에 의한 처리는 비히클 단독 처리 마우스에 비해 CT26 종양을 보유하는 마우스에서 종양 크기를 유의미하게 감소시켰다(p<0.0001)(도 15, 상단 패널). 흥미롭게도, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 처리는 항-TIGIT 항체 단독으로 처리한 마우스에 비해 CT26 종양을 보유한 마우스에서 종양 크기를 유의미하게 감소시켰다(p<0.05)(도 15, 상단 패널). 또한, 항-PD-1 항체와 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 조합에 의한 처리는 항-TIGIT 항체 단독(p<0.001), 항-PD-1 항체 단독(p<0.05), 또는 항-TIGIT 항체와 항-PD-1 항체 단독의 조합 (p<0.05)으로 처리한 마우스에 비해 CT26 종양을 보유하는 마우스에서 종양 크기를 유의미하게 감소시켰다(도 15, 상단 패널).
도 15(하단 패널)에 나타낸 바와 같이, 항-TIGIT 항체 단독, 항-PD-1 항체 단독, 또는 항-TIGIT와 항-PD-1 항체의 조합에 의한 처리는 비히클 단독 처리 마우스에 비해 CT26 항-PD-1 내성 세포 종양을 보유하는 마우스에서 종양 크기를 유의미하게 감소시키지 않았다. 반면에, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질, 및 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 및 항-PD-1 항체의 조합물에 의한 처리는 비히클 단독 처리 마우스에 비해 CT26 항-PD-1 내성 세포 종양을 보유하는 마우스에서 종양 크기를 유의미하게 감소시켰다(p<0.0001)(도 15, 하단 패널). 흥미롭게도, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질에 의한 처리는 항-TIGIT 항체 단독(p<0.05), 항-PD-1 항체 단독(p<0.01), 또는 항-TIGIT 및 항-PD-1 항체의 조합(p<0.05)으로 처리한 마우스에 비해 CT26 항-PD-1 내성 세포 종양을 보유하는 마우스에서 종양 크기를 유의미하게 감소시켰다(도 15, 하단 패널). 추가로, 항-PD-1 항체와 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 조합에 의한 처리는 항-TIGIT 항체 단독(p<0.001), 항-PD-1 항체 단독(p<0.001), 또는 항-TIGIT와 항-PD-1 항체의 조합(p<0.001)으로 처리한 마우스에 비해 CT26 항-PD-1 내성 세포 종양을 보유하는 마우스에서 종양 크기를 유의미하게 감소시켰다(도 15, 하단 패널).
이들 결과는 특히 TIGIT-Fc-LIGHT가 WT CT26과 획득 내성 CT26 종양 모델 둘 다에서 고도로 활성이고, 항-TIGIT, 항-PD-1, 항-PD-L1, 또는 항-TIGIT/항-PD-1의 조합의 관문 차단을 능가한다는 것을 시사한다.
실시예 14: 예시적인 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 작제 및 특성규명
SIRPα- 및 4-1BBL-기반 키메라 단백질을 암호화하는 작제물을 생성하였다. "hSIRPα-Fc-4-1BBL" 작제물은 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 통해 인간 4-1BBL의 ECD에 융합된 인간 SIRPα의 세포외 도메인(ECD)을 포함하였다. 도 16(상단 패널).
작제물을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고, CHO 세포에 형질감염시키고, 고발현을 위해 개개 클론을 선택하였다. 이어서 무혈청 배지에서의 교반 생물반응기에서 소규모 제조를 위해 고발현 클론을 사용하였고, 단백질 A 결합 수지 칼럼을 이용하여 관련 키메라 융합 단백질을 정제하였다.
hSIRPα-Fc-4-1BBL 작제물을 293 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질-A 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 천연 구조를 이해하기 위해, 비처리 변성 샘플(즉, 환원제 또는 탈글리코실화제에 의한 처리 없이, SDS의 존재 하에 비등시킴)을 (i) 탈글리코실화되지 않은 환원 샘플(즉, β-머캅토에탄올만으로 처리하고, SDS의 존재 하에 비등시킴); 및 (ii) 환원 및 탈글리코실화된 샘플(즉, β-머캅토에탄올과 탈글리코실화제 둘 다로 처리하고, SDS의 존재 하에 비등시킴)과 비교하였다. 또한, SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 각 도메인의 존재를 확인하기 위해, 겔을 삼중으로 실행하고, 항-SIRPα 항체(도 16, 하단 패널, 좌측 블롯), 항-인간 Fc(H +L) 항체(도 16, 중앙 블롯) 또는 항-4-1BBL 항체(도 16, 하단 패널, 우측 블롯)를 이용하여 프로빙하였다. 웨스턴 블롯은 비환원 레인에서 우성 이량체 밴드의 존재(도 16, 하단 패널, 각 블롯에서 두 번째 레인)를 나타냈고, 이를 환원제인 β-머캅토에탄올의 존재 하에 글리코실화된 단량체 밴드로 환원시켰다(도 16, 하단 패널, 각 블롯에서 세 번째 레인)는 것을 나타냈다. 도 16, 하단 패널에 나타낸 바와 같이, 각 블롯에서 네 번째 레인, 키메라 단백질을 환원제(β-머캅토에탄올)와 탈글리코실화제와 둘 다의 존재 하에 단량체로서 실행하였다. 이런 결과는 인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 글리코실화되고 천연 상태에서 다량체를 형성하는 경향을 갖는다는 것을 입증한다.
두 단부의 리간드, 즉, 인간 CD47, 인간 4-1BB에 대한 hSIRPα-Fc-4-1BBL의 결합을 중규모 디스커버리(MSD) ELISA 분석을 이용하여 평가하였다. 이를 위해, 인간 CD47-His을 플레이트 상에 코팅하고, 증가된 양의 hSIRPα-Fc-4-1BBL 또는 PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 플레이트-결합 인간 CD47-His에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였다. PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질을 인간 CD47에 대한 결합을 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 항-SIRPα 항체 및 항-양 설포-태그 2차 항체를 이용하여 CD47-His에 대한 키메라 단백질의 결합을 검출하였다. 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 결합을 분석하였다. 도 17A에 나타낸 바와 같이, hSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질 각각은 용량-의존적 및 포화 가능한 방식으로 인간 CD47-His에 결합되었다. 대조적으로, PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 인간 CD47-His에 결합하지 않았다. 이 데이터들은 hSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 SIRPα의 리간드인 인간 CD47에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
유사한 실험에서, 인간 4-1BB-His을 플레이트 상에 코팅하고, 증가된 양의 hSIRPα-Fc-4-1BBL, PD-1-Fc-4-1BBL 또는 hSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 플레이트-결합 인간 4-1BB-His에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였다. hSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 인간 4-1BB에 대한 결합을 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 항-4-1BBL 항체 및 항-양 설포-태그 2차 항체를 이용하여 4-1BB-His에 대한 키메라 단백질의 결합을 검출하였다. 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 결합을 분석하였다. 도 17B에 나타낸 바와 같이, hSIRPα-Fc-4-1BBL 및 PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질 각각은 용량-의존적 및 포화 가능한 방식으로 인간 4-1BB-His에 결합되었다. 대조적으로, hSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 인간 4-1BB-His에 결합하지 않았다. 이 데이터들은 hSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 4-1BBL의 리간드인 인간 4-1BB에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 인간 4-1BB 및 CD47에 동시에 결합할 수 있는지의 여부를 이해하기 위해, 인간 4-1BB-His을 플레이트 상에 코팅하고, 증가된 양의 hSIRPα-Fc-4-1BBL 또는 PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질을 플레이트-결합된 인간 4-1BB-His에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였다. PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질을 음성 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 인간 CD47-His-바이오틴을 임의의 키메라 단백질에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였고, 결국 인간 4-1BB에 의해 포획되었다. 검출을 위해 스트렙타비딘 설포-태그 2차를 사용하였다. 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 결합을 분석하였다. 도 17C에 나타낸 바와 같이, hSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 인간 4-1BB-His 및 CD47-His에 대한 동시의, 용량-의존적 결합과 일치되는 신호를 생성하였다. 대조적으로, PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 신호를 생성하지 않았다. 이들 데이터는 hSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 인간 4-1BB 및 CD47에 동시에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
4-1BB를 발현시키는 세포에 대한 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합을 추가로 연구하기 위해, 표준 기법을 이용하여 4-1BB를 발현시키는 인간 섬유육종 HT1080 세포(HT1080/4-1BB 세포)를 생성하였다. 결합 연구를 위해 2개의 양성 클론, 즉, HT1080/4-1BB+ 클론 A 및 B를 사용하였다. SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 HT1080/4-1BB 세포에 특이적으로 결합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 유세포분석-기반 분석을 수행하였다. HT1080/4-1BB 세포를 완충제 단독 또는 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질과 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 세포를 Pacific Blue에 접합된 항-마우스 Fc 항체로 대비염색하고, SIRPα-Fc-4-1BBL 결합의 결합을 유세포분석에 의해 검출하였다. 도 18A에 나타낸 바와 같이, SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질로 염색한 HT1080/4-1BB 세포는 비염색 HT1080/4-1BB 세포에 비해 더 많은 염색을 나타냈다. 이런 데이터는 또한 HT1080/4-1BB 세포의 양쪽 클로즈(close)에 대한 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 결합을 입증하였다.
결합을 정량화하기 위해, HT1080/4-1BB 세포를 증가된 농도의 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질과 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 세포를 Pacific Blue에 접합된 항-마우스 Fc 항체로 대비염색하고, SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질 결합의 결합을 유세포분석에 의해 검출하였다. 평균 형광 강도(MFI)를 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 log 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 도 18B에 나타낸 바와 같이, SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 HT1080/4-1BB 세포에 대한 용량 의존적 결합을 나타냈다.
SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 4-1BB/4-1BBL 신호전달을 활성화시킬 수 있는지의 여부를 다음에 연구하였다. 4-1BB/4-1BBL 신호전달의 활성화 시 IL-8을 분비하는 HT1080/h4-1BB 세포를 모델로서 사용하였다. HT1080/h4-1BB 세포를 밤새 성장시켰고, 완충제 단독, 1㎍/㎖ 또는 3.33㎍/㎖의 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질을 첨가하였다. 추가 3시간 동안 인큐베이션을 계속하였다. 3시간 후에, HT1080/h4-1BB 세포 배양물로부터 배지를 제거하고, IL-8을 ELISA에 의해 평가하였다. 중규모 디스커버리(MSD) ELISA 분석을 이용하여 배양물 상청액에서 IL-8 생성을 평가하였다. 도 18C에 나타낸 바와 같이, 완충제 단독 처리 HT1080/h4-1BB 세포에 비해, 1㎍/㎖ (p<0.01) 또는 3.33㎍/㎖(p<0.001)의 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질로 처리된 HT1080/h4-1BB 세포에서 유의미하게 더 많은 IL-8 생성이 관찰되었다.
이런 결과는 특히 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 4-1BB/4-1BBL 신호전달을 활성화시킨다는 것을 나타냈다.
실시예 15: 예시적인 마우스 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 작제 및 특성규명
마우스 모델에서 생체내 연구를 위해 마우스 SIRPα- 및 4-1BBL-기반 키메라 단백질을 암호화하는 작제물을 생성하였다. "mSIRPα-Fc-4-1BBL" 작제물은 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 통해 마우스 4-1BBL의 ECD에 융합된 마우스 SIRPα의 세포외 도메인(ECD)을 포함하였다. 도 19(상단 패널).
작제물을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고, CHO 세포에 형질감염시키고, 고발현을 위해 개개 클론을 선택하였다. 이어서 무혈청 배지에서의 교반 생물반응기에서 소규모 제조를 위해 고발현 클론을 사용하였고, 단백질 A 결합 수지 칼럼을 이용하여 관련 키메라 융합 단백질을 정제하였다.
mSIRPα-Fc-4-1BBL 작제물을 293 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질-A 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 천연 구조를 이해하기 위해, 비처리 변성 샘플(즉, 환원제 또는 탈글리코실화제에 의한 처리 없이, SDS의 존재 하에 비등시킴)을 (i) 탈글리코실화되지 않은 환원 샘플(즉, β-머캅토에탄올만으로 처리하고, SDS의 존재 하에 비등시킴); 및 (ii) 환원 및 탈글리코실화된 샘플(즉, β-머캅토에탄올과 탈글리코실화제 둘 다로 처리하고, SDS의 존재 하에 비등시킴)과 비교하였다. 또한, SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 각 도메인의 존재를 확인하기 위해, 겔을 삼중으로 실행하고, 항-SIRPα 항체(도 19, 하단 패널, 좌측 블롯), 항-마우스 Fc 항체(도 19, 중앙 블롯) 또는 항-4-1BBL 항체(도 19, 하단 패널, 우측 블롯)를 이용하여 프로빙하였다. 웨스턴 블롯은 비환원 레인에서 우성 이량체 밴드의 존재(도 19, 하단 패널, 각 블롯에서 두 번째 레인)를 나타냈고, 이를 환원제인 β-머캅토에탄올의 존재 하에 글리코실화된 단량체 밴드로 환원시켰다(도 19, 하단 패널, 각 블롯에서 세 번째 레인)는 것을 나타냈다. 도 19, 하단 패널에 나타낸 바와 같이, 각 블롯에서 네 번째 레인, 키메라 단백질을 환원제(β-머캅토에탄올)와 탈글리코실화제와 둘 다의 존재 하에 단량체로서 실행하였다. 이런 결과는 mSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 글리코실화되고 천연 상태에서 다량체를 형성하는 경향을 갖는다는 것을 입증한다.
3개 도메인, 즉, 마우스 CD47, 항-Fc 항체, 및 마우스 4-1BB의 리간드에 대한 mSIRPα-Fc-4-1BBL의 결합을 중규모 디스커버리(MSD) ELISA 분석을 이용하여 평가하였다.
항-마우스 Fc-y 항체를 플레이트 상에 코팅하고, 증가된 양의 mSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질을 플레이트-결합된 마우스 항-마우스 Fc-y 항체에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였다. 항-마우스-설포-태그 항체를 이용하여 항-마우스 Fc-y 항체에 대한 키메라 단백질의 결합을 검출하였다. 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 결합을 분석하였다. 도 20A에 나타낸 바와 같이, mSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질 각각은 마우스 항-마우스 Fc-y 항체에 용량-의존적으로 결합되었다. 이런 데이터는 mSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 Fc 도메인의 리간드인 마우스 항-마우스 Fc-y 항체에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
마우스 4-1BB-His을 플레이트 상에 코팅하고, 플레이트-결합된 마우스 4-1BB-His에 의한 포획을 위해 증가된 양의 mSIRPα-Fc-4-1BBL 또는 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 플레이트에 첨가하였다. mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 마우스 4-1BB에 대한 결합을 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 항-마우스 설포-태그 항체를 이용하여 4-1BB-His에 대한 키메라 단백질의 결합을 검출하였다. 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 결합을 분석하였다. 도 20B에 나타낸 바와 같이, mSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 용량-의존적 및 포화 가능한 방식으로 마우스 4-1BB-His에 결합되었다. 대조적으로, mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 마우스 4-1BB-His에 결합하지 않았다. 이 데이터들은 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 4-1BBL의 리간드인 마우스 4-1BB에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
마우스 CD47-His을 플레이트 상에 코팅하고, 플레이트-결합된 마우스 CD47-His에 의한 포획을 위해 증가된 양의 mSIRPα-Fc-4-1BBL 또는 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 플레이트에 첨가하였다. mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 마우스 CD47에 대한 결합을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. 항-마우스 설포-태그 항체를 이용하여 CD47-His에 대한 키메라 단백질의 결합을 검출하였다. 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 결합을 분석하였다. 도 20C에 나타낸 바와 같이, mSIRPα-Fc-4-1BBL 및 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 각각은 용량-의존적 및 포화 가능한 방식으로, 그리고 비슷한 동력학으로 마우스 CD47-His에 결합되었다. 이 데이터들은 mSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 SIRPα의 리간드인 마우스 CD47에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
인간 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 마우스 4-1BB 및 CD47에 동시에 결합할 수 있는지의 여부를 이해하기 위해, 마우스 CD47-Fc를 플레이트 상에 코팅하고, 증가된 양의 mSIRPα-Fc-4-1BBL 또는 PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질을 플레이트-결합된 마우스 CD47-Fc에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였다. PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질을 음성 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 마우스 4-1BB-His을 임의의 키메라 단백질에 의한 포획을 위해 플레이트에 첨가하였고, 결국 마우스 CD47-Fc 단백질에 의해 포획되었다. 검출을 위해 항-His-바이오틴 및 스트렙타비딘-설포-태그를 사용하였다. 전기화학발광(ECL) 판독을 이용하여 결합을 분석하였다. 도 20D에 나타낸 바와 같이, mSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 마우스 4-1BB-His 및 CD47-Fc에 대한 동시의, 용량-의존적 결합과 일치되는 신호를 생성하였다. 대조적으로, PD-1-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 신호를 생성하지 않았다. 이들 데이터는 mSIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 마우스 4-1BB 및 CD47에 동시에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 16: 항-PD-1 민감성 및 항-PD-1 내성 종양에 대한 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 효능
Balb/c 마우스를 500,000개의 결장직장 종양 CT26 세포 또는 4세대 항-PD-1 내성 세포로 뒤 옆구리에 접종하였다. 평균 시작 종양 용적이 대략 90㎣(제0일)에 도달되었을 때, 마우스를 다음의 처리군으로 무작위로 나누었다: (1) 비히클-단독(PBS, n=8), (2) 항-PD-1 항체의 용량당 100㎍(클론 RMP1-14, n=7), 및 (6) SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 용량당 200㎍(n=8). 마우스에 복강내 주사를 통해 제0일, 제3일 및 제6일에 투약하였다.
야생형 CT26 동종 이식편을 보유하는 마우스에 대한 종양 용적(도 21A의 실선)을 측정하고, 처리를 개시한 후 시간의 함수로서 플롯팅하였다. 도 21A에 나타낸 바와 같이, 항-PD-1 항체 또는 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질 중 하나에 의한 처리는 비히클-단독 처리 마우스에 비해 (도 21A의 곡선 2 및 3을 곡선 1과 비교) CT26(야생형) 종양 성장의 저해를 야기하였다. SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질의 효능은 항-PD-1 항체와 유사한 것으로 나타냈다. 종양 접종 후 17일에 종양 크기를 측정하고, 플롯팅하였다. 도 21B에 나타낸 바와 같이, 야생형 CT26 종양을 보유하는 마우스는 비히클-단독 처리 마우스에 비해 항-PD-1 항체(p<0.0001) 또는 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질(p<0.0001)에 의한 처리 후 종양 크기의 통계적으로 유의미한 감소를 나타냈다. 카플란-바이어 생존 곡선을 야생형 CT26 동종 이식편을 보유하는 마우스에 대해 플롯팅하였다(도 21C에서 실선). 도 21C에 나타낸 바와 같이, 야생형 CT26 종양을 보유하는 모든 마우스는 제21일까지 사망하였지만, 야생형 CT26 동종 이식편을 보유하는 마우스는 항-PD-1 항체(Mantel-Cox p 값 0.0004) 또는 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질(Mantel-Cox p 값 0.0005)에 의한 처리 후 개선된 생존을 나타냈다.
4세대 항-PD-1 내성 세포 동종 이식편을 보유하는 마우스에 대한 종양 용적(도 21A의 점선)을 측정하고, 처리를 개시한 후 시간의 함수로서 플롯팅하였다. 도 21A에 나타낸 바와 같이, SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질은 비히클-단독 처리 마우스에 비해 (도 21A의 곡선 6을 곡선 4와 비교) 4세대 항-PD-1 내성 세포 종양의 저해를 야기하였다. 반면에, 항-PD-1 항체에 의한 처리는 4세대 항-PD-1 내성 세포 동종 이식편 종양 크기에 대해 약간의 효과가 있었다(도 21A의 곡선 5를 곡선 4와 비교). 종양 접종 후 17일에 종양 크기를 측정하고, 플롯팅하였다(도 21B의 패턴화된 막대 참조). 도 21B에 나타낸 바와 같이, 야생형 4세대 항-PD-1 내성 종양을 보유하는 마우스는 비히클-단독 처리 마우스에 비해 SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질(p<0.01)에 의한 처리 후 종양 크기의 통계적으로 유의미한 감소를 나타냈다. 반면에, 항-PD-1 항체에 의한 4세대 항-PD-1 내성 세포 동종 이식편을 보유하는 마우스의 처리는 종양 크기에 대해 약간의 효과를 가졌다(도 21B). 카플란-바이어 생존 곡선을 4세대 항-PD-1 내성 세포 동종 이식편을 보유하는 마우스에 대해 플롯팅하였다(도 21C에서 점선). 도 21C에 나타낸 바와 같이, 야생형 4세대 항-PD-1 내성 종양을 보유한 모든 마우스는 제18일까지 사망하였지만, 4세대 항-PD-1 내성 세포 동종 이식편을 보유한 마우스는, 항-PD-1 항체에 의한 처리와 달리(Mantel-Cox p 값 0.3907), SIRPα-Fc-4-1BBL 키메라 단백질(Mantel-Cox p value 0.0111)에 의한 처리 후 개선된 생존을 나타냈다.
이런 결과는 특히 SIRPα -Fc-4-1BBL 키메라 단백질이 종양 성장을 유의미하게 저해하였고, 항-PD-1 민감성과 항-PD-1 내성 종양으로 고통받는 동물의 생존을 개선시켰다는 것을 입증한다.
실시예 17: 사이노몰거스 마카크에서 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 안전성 및 약력학적 활성(PD)
사이노몰거스 마카크는 사이노몰거스 마카크 표적에 대한 인간 TIGIT 및 LIGHT의 교차 결합으로 인해 잠재적 독성 및 인간 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 면역 특성을 시험하기 위해 적절한 종인 것으로 결정하였다(데이터 미제시). 처리 미경험 사이노몰거스 마카크 그룹을 연구의 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 투여한 0.1, 1.0, 10, 40㎎/㎏ 용량의 TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT 또는 비히클 대조군의 정맥내 주입으로 반복 처리하였다. TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 모든 용량 그룹에 의해 잘 용인되었다.
투약 전 및 투약 후 림프구 계수를 제15일에 제3 투약 전 및 제16일에 제3 투약 후 대략 24시간에 얻었다. 이 실험에서, 유세포분석을 수행하여 림프구 계수의 관찰된 변화가 말초 순환에서 HVEM 발현 림프구의 선택적 변연화에 의해 유도되었는지의 여부를 결정하였다. 일관되게, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 용량 직후 완전한 혈액 계수 분석에서 분명한 말초 림프구의 용량-의존적 변연화를 자극하였다(도 22A). 따라서, 제15일에서 제16일까지 투약 후 림프구 변연화가 관찰되었다(도 22A). 말초 혈액 림프구의 수는 제15일 투약 후 용량 의존적 방식으로 감소되는 것이 관찰되었고, (100 - ((제16일의 림프구 수)/(제15일의 림프구 수) x 100)로서 플롯팅한다. 각 데이터 지점은 개개 동물을 나타낸다. 도 22A에 나타낸 바와 같이, 대조군 원숭이에 비해 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리한 원숭이에서 말초 혈액 림프구 수의 용량-의존적 감소가 있었다.
말초 CD3+ T 세포에 대한 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 효과는 사이노몰거스 원숭이에서 추가로 탐구되었다. 사이노몰거스 마카크에 비히클 또는 40㎎/㎏의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 IV 주입을 제공하였다. 투약 전 및 투약 후 림프구 계수를 투약 전 및 투약 후 6시간에 얻었다. 도 22B는 샘플 투약 후 6시간으로부터의 CD3+ T 세포의 투약 후 변연화를 나타낸다. 도 22B에 나타낸 바와 같이, 말초 혈액 CD3+ T 세포의 수는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질로 처리된 원숭이에서 약 30%만큼 감소되었다. 대조적으로, 말초 혈액 CD3+ T 세포의 수는 비히클-처리 원숭이에서 2.65%만큼 증가되었다(도 22B). 이런 데이터는 CD3+ T 세포의 투약 후 변연화를 설명한다. 이런 데이터는 투약 후 림프구 변연화를 설명한다. 더 구체적으로는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 초기 주입 후 6시간 이내에 말초에서 CD3+ T 세포의 변연화를 유도하였고(도 22B), 이런 세포가 고수준의 HVEM을 발현시키는 것이 입증되었다(도 28A). 말초 림프구의 변화는 림프구 구획으로 제한되었고, 말초 호중구, 호염기구, 호산구, 혈소판 수의 유의미한 차이도, 헤모글로빈 또는 헤마토크리트 수준의 차이도 관찰되지 않았다(데이터 미제시).
사이노몰거스 마카크에 비히클 또는 0.1, 1.0, 10 또는 40㎎/㎏의 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 4주마다의 IV 주입(제1일, 제8일, 제15일, 제22일)을 제공하였다. 사이토카인 서명을 결정하기 위해 투약 후 2시간에 다양한 사이토카인을 측정하였다. 투약 후 2-시간에 사이토카인 서명에 기반한 동물의 분포를 시각화하기 위해 주성분 분석(PCA)을 수행하였다. 다중 전염증 사이토카인의 혈청 농도의 용량 의존적 증가를 주목하였고, 비편향 주성분 분석(PCA)은 다중목합 어레이로부터의 모든 30개의 사이토카인이 분석에 포함되었을 때의 용량 처리군의 분리를 나타냈다(도 22C). 도 22C에 나타낸 바와 같이, 동물의 사이토카인 프로파일은 비히클-처리 원숭이에 비한 용량-의존적 변화의 경향을 나타냈다. 다양한 사이토카인의 경향을 플롯팅하였다. JMP 소프트웨어를 사용하여 특정 사이토카인 서명에 기반한 PCA 사분면에 걸쳐 개개 동물의 이동에서 지배적인 사이토카인을 확인한 벡터 플롯을 생성하였다(도 22D). 도 22D에 나타낸 바와 같이, 전염증 사이토카인은 Q3 및 Q4 사분면에서 샘플의 클로스터링을 지배하였고, 적응 면역 사이토카인(예를 들어, IL-2 및 IL-17)은 Q2를 지배하였다. 다양한 사이토카인의 투약 후 2시간 수준을 중규모 디스커버리(MSD) 분석을 이용하여 평가하였고, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질 용량의 함수로서 플롯팅하였다. 도 22E에 나타낸 바와 같이, IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)는 용량 의존적 증가를 나타냈다. 3 및 4 사분면으로 이동한 동물 반응을 야기한 서명은 전염증 사이토카인, 예컨대, CXCL10, CCL2, CCL4, CCL17 및 IL-10을 포함하였다. 적응 면역 사이토카인은 또한 용량 반응을 따르는 것으로 관찰되었고, IL-2 및 IL-17을 포함하는 2사분면에서 클러스터링되었다(도 22E 및 도 28B). 뮤린 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질을 이용한 관찰에 따라 다수의 혈청 사이토카인 반응이 보존되었다(도 28C). 종합하면, 이런 결과는 특히, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 TIGIT 및 LIGHT 경로에 관련된 수용체/리간드 상호작용에 기반한 강한 면역학적 효과를 발휘하였다는 것이 나타났다. 고무적으로, 비인간 영장류에서 관찰된 다수의 혈청 사이토카인 변화는 마우스 생체내 및 인간 시험관내 분석에서 관찰된 사이토카인 변화와 중복되었다(도 24 및 도 26). 도 22E는 중규모 디스커버리(MSD) 분석을 이용하여 평가한 바와 같은 사이토카인 반응을 나타낸다. IL-2 및 IP-10의 유도 정도는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질의 용량 함수로서 분석하였다. 도 22F에 나타낸 바와 같이, IL-2의 유도는 용량 의존적 방식으로 관찰되었다. 유사하게, 도 22G에 나타낸 바와 같이, IP-10의 유도는 용량 의존적 방식으로 관찰되었다. 유도 동력학을 연구하였다. 도 22G는 IP-10의 배수 유도를 나타낸다. 도 22H는 제1, 제2 및 제3 용량 동안 및 투약 후의 CXCL-10의 유도 동력학을 나타낸다. 도 22H에 나타낸 바와 같이, 용량 2시간 후에 유도 정점이 관찰되었고, 약 8시간에 배경 수준이 달성되었다.
이런 데이터는 IL-2 및 IP-10(상기)을 포함하는 혈청 사이토카인의 별개의 프로파일이 용량-의존적 방식으로 관찰되었다는 것을 나타낸다. 총괄적으로, 이런 결과는 TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질이 T 세포의 변연화, 및 사이토카인, 예컨대, IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)의 유도를 야기한다는 것을 입증한다.
전반적으로, TIGIT-Fc-LIGHT 키메라 단백질은 적어도 40㎎/㎏까지 잘 용인되었다. 중요하게는, 관찰된 사이토카인 프로파일 및 IL-6의 상대적으로 적은 증가에도 불구하고 사이토카인 방출 증후군의 증거는 없었다.
참조에 의한 원용
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전에 이들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 개시내용이 선행 발명에 의해 이러한 간행물에 선행한다는 자격을 부여하지 않는다는 용인으로서 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 모든 표제는 단순히 조직화를 위한 것이고, 임의의 방식으로 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 임의의 개개 부문의 내용은 모든 부문에 동일하게 적용 가능할 수 있다.
균등론
본 발명은 구체적 실시형태와 관련하여 개시하였지만, 추가 수정이 가능하고, 본 출원이 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지되거나 관례적인 관행 내에 있고, 본 명세서에서 전술한 필수 특징에 적용될 수 있는 바와 같고 그리고 첨부된 청구범위의 범주 내에 따르는 바와 같이, 본 개시내용의 이러한 벗어남을 포함하여, 본 발명의 임의의 변화, 용도 또는 각색을 아우르는 것으로 의도된다는 것이 이해될 것이다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여, 본 명세서에 구체적으로 개시된 구체적 실시형태에 대한 수많은 균등물을 인식하거나, 확인할 수 있다. 이러한 균등물은 다음의 청구범위의 범주 내에 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> SHATTUCK LABS, INC. <120> METHODS OF TREATING CANCER USING TIGIT- AND LIGHT-BASED CHIMERIC PROTEINS <130> WO/2022/120191 <140> PCT/US2021/061841 <141> 2021-12-03 <150> US 63/121083 <151> 2020-12-03 <150> US 63/173090 <151> 2021-04-09 <150> US 63/215735 <151> 2021-06-28 <150> US 63/276066 <151> 2021-11-05 <160> 113 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser 20 25 30 Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly 35 40 45 Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg 50 55 60 Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala 85 90 95 His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu 100 105 110 Leu Trp Glu Thr Gln 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Pro Gln Val Tyr Thr Leu 245 250 255 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 260 265 270 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 275 280 285 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 290 295 300 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 305 310 315 320 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 325 330 335 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 350 Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met 355 360 365 Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile 370 375 380 Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly 385 390 395 400 Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr 405 410 415 Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala 420 425 430 Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln 435 440 445 Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His 450 455 460 Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu 465 470 475 480 Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val 485 490 495 Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly 500 505 510 Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg 515 520 525 Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 530 535 540 <210> 110 <211> 540 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 110 Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys 1 5 10 15 Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln 20 25 30 Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys 35 40 45 Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val 50 55 60 Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn 65 70 75 80 Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr 85 90 95 Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu 100 105 110 His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 115 120 125 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 145 150 155 160 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 165 170 175 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 180 185 190 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 195 200 205 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 210 215 220 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 225 230 235 240 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 245 250 255 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 260 265 270 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 275 280 285 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 290 295 300 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 305 310 315 320 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 325 330 335 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 350 Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met 355 360 365 Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile 370 375 380 Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly 385 390 395 400 Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr 405 410 415 Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala 420 425 430 Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln 435 440 445 Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His 450 455 460 Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu 465 470 475 480 Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val 485 490 495 Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly 500 505 510 Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg 515 520 525 Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 530 535 540 <210> 111 <211> 534 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 111 Thr Ile Asp Thr Lys Arg Asn Ile Ser Ala Glu Glu Gly Gly Ser Val 1 5 10 15 Ile Leu Gln Cys His Phe Ser Ser Asp Thr Ala Glu Val Thr Gln Val 20 25 30 Asp Trp Lys Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Tyr Ser Val Asp Leu 35 40 45 Gly Trp His Val Ala Ser Val Phe Ser Asp Arg Val Val Pro Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Thr Phe Gln Ser Leu Thr Met Asn Asp Thr Gly Glu 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Thr Tyr His Thr Tyr Pro Gly Gly Ile Tyr Lys Gly Arg 85 90 95 Ile Phe Leu Lys Val Gln Glu Ser Ser Asp Asp Arg Asn Gly Leu Ala 100 105 110 Gln Phe Gln Thr Ala Pro Leu Gly Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys 115 120 125 Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr 145 150 155 160 Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser 165 170 175 Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg 180 185 190 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile 195 200 205 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 210 215 220 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 225 230 235 240 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 245 250 255 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 260 265 270 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 275 280 285 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 290 295 300 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 305 310 315 320 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 325 330 335 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met 340 345 350 Asp Leu His Gln Arg Leu Gly Asp Ile Val Ala His Leu Pro Asp Gly 355 360 365 Gly Lys Gly Ser Trp Glu Lys Leu Ile Gln Asp Gln Arg Ser His Gln 370 375 380 Ala Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu Ile Gly 385 390 395 400 Ile Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Phe Leu 405 410 415 Arg Gly Leu Thr Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Thr Met Glu Pro Gly 420 425 430 Tyr Tyr Tyr Val Tyr Ser Lys Val Gln Leu Ser Gly Val Gly Cys Pro 435 440 445 Gln Gly Leu Ala Asn Gly Leu Pro Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg 450 455 460 Thr Ser Arg Tyr Pro Lys Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Arg Arg Ser 465 470 475 480 Pro Cys Gly Arg Ala Asn Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe 485 490 495 Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg 500 505 510 Val Pro Gly Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr 515 520 525 Phe Gly Ala Phe Met Val 530 <210> 112 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 112 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 113 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 113 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

Claims (157)

  1. 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료 방법으로서,
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 상기 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고
    (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함),
    투여되는 상기 키메라 단백질의 용량은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 50.0㎎/㎏이며, 선택적으로 약 1㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 6㎎/㎏, 또는 약 10㎎/㎏, 약 12㎎/㎏, 약 15㎎/㎏, 약 18㎎/㎏, 약 20㎎/㎏, 약 22㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 27㎎/㎏, 약 30㎎/㎏, 약 33㎎/㎏, 약 35㎎/㎏, 약 37㎎/㎏, 약 40㎎/㎏, 약 42㎎/㎏, 약 45㎎/㎏, 약 48㎎/㎏, 내지 약 50㎎/㎏으로부터 선택되는, 암 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 인간, 선택적으로 성인 인간인, 암 치료 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 1주에 적어도 약 1회 투여되는, 암 치료 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 1개월에 적어도 약 1회 투여되는, 암 치료 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 1개월에 적어도 약 2회 투여되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 1개월에 적어도 약 3회 투여되는, 암 치료 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 고형 종양(국소 및/또는 전이성) 또는 림프종을 포함하는, 암 치료 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양(bulky disease) NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택되는, 암 치료 방법.
  9. 림프구 확장 유도를 필요로 하는 대상체의 림프구 확장을 유도하는 방법으로서,
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    식 중:
    (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 상기 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고
    (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인인(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(herpesvirus entry mediator: HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함), 림프구 확장을 유도하는 방법.
  10. 림프구 변연화 유도를 필요로 하는 대상체의 림프구 변연화를 유도하는 방법으로서,
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조를 갖는 유효량의 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 상기 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고
    (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인인(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함), 림프구 변연화를 유도하는 방법.
  11. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된 투약 요법으로 투약되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 TIGIT 리간드에 결합할 수 있는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 실질적으로 모든 상기 TIGIT의 세포외 도메인을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 LIGHT 수용체에 결합할 수 있는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 실질적으로 모든 상기 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 가요성 아미노산 서열, IgG 힌지 영역 및/또는 항체 서열로부터 선택된 폴리펩타이드인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유래된, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112, 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 하나 이상의 결합 링커를 포함하고, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 독립적으로 선택된, 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 링커는 둘 이상의 결합 링커를 포함하며, 각각의 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 독립적으로 선택되되; 1개의 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 N 말단에 있으며, 다른 결합 링커는 상기 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 C 말단에 있는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 제2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
    (c) 상기 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 제2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 그리고
    (c) 상기 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 SKYGPPCPSCP(서열번호 49), SKYGPPCPPCP(서열번호 50), IEGRMD(서열번호 52)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 결합 링커를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 IEGRMD(서열번호 52)의 아미노산 서열을 포함하는 결합 링커를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, IEGRMD의 아미노산 서열은 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112 또는 서열번호 113의 아미노산 서열의 C-말단에 위치된, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.2% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.4% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.6% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 99.8% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 표준요법을 투여 받거나, 내약성이 있거나 또는 부적격이고/이거나 상기 암은 표준치료로 간주되는 승인된 요법이 없는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 병행 화학요법, 면역요법, 생물요법 또는 호르몬 요법을 투여받고 있지 않은, 방법.
  39. 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료 효능을 평가하는 방법으로서,
    (i) N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질의 용량을 투여하는 단계로서,
    (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 상기 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고
    (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이되(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함),
    상기 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏인, 상기 투여하는 단계;
    (ii) 상기 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (iii) 상기 생물학적 샘플에 대한 분석을 수행하여 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및
    (iv) 상기 대상체가 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성 증가를 갖는다면 투약을 계속하는 단계
    를 포함하는, 암 치료 효능을 평가하는 방법.
  40. 암 요법에 의한 치료를 위해 대상체를 선택하는 방법으로서,
    (i) N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질의 용량을 투여하는 단계로서,
    (a)는 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)을 갖는 인간 T 세포 면역수용체의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 및 제2 도메인에 인접한 링커이되, 상기 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 그리고
    (c)는 인간 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이되(림프독소-유사는 유도성 발현을 나타내고, T 림프구에 의해 발현된 수용체인 헤르페스바이러스 침투 매개체(HVEM)에 대해 HSV 당단백질 D와 경쟁함),
    상기 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏인, 상기 투여하는 단계;
    (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (iii) 상기 생물학적 샘플에 대한 분석을 수행하여 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및
    (iv) 상기 대상체가 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성 증가를 갖는다면, 상기 암 요법으로 치료를 위한 상기 대상체를 선택하는 단계
    를 포함하는, 암 요법에 의한 치료를 위해 대상체를 선택하는 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본인, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 생검 샘플인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 생검 샘플은 내시경 생검, 골수 생검, 내시경 생검(예를 들어, 방광내시경, 기관지내시경 및 결장경 검사), 바늘 생검(예를 들어, 세침 흡인, 중심 바늘 생검, 진공-흡인 생검, X-선 보조 생검, 컴퓨터 단층촬영(CT)-보조 생검, 자기 공명 영상(MRI)-보조 생검 및 초음파-보조 생검), 피부 생검(예를 들어, 표층 생검, 펀치 생검 및 절개 생검) 및 수술 생검으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함하는, 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 스크레이프, 면봉 및 생검으로부터 선택된 기법에 의해 얻은, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 브러쉬, (면)봉, 스패튤라, 린스/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 수술 기기에 의한 구멍의 천공의 사용에 의해 얻어진, 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 종양은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택되는, 방법.
  49. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석은 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 분석은 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 제제와 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 적어도 1종의 사이토카인에 특이적으로 결합하는 제제는 하나 이상의 항체, 항체-유사 분자 또는 이의 결합 단편을 포함하는, 방법.
  52. 제49항에 있어서, 상기 분석은 IL-2, IL-10, IP-10(CXCL10), MCP-1, MIP-1β(CCL4) TARC(CCL17), IFNγ, IL-8, IL-12 및 SDF1a(CXCL12)로부터 선택된 사이토카인을 암호화하는 적어도 하나의 핵산에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 제제와 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 적어도 1종의 핵산에 특이적으로 결합하는 상기 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브인, 방법.
  54. 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (ii) 상기 샘플을
    세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절; 및/또는
    인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립(chylomicron) 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절
    에 대해, 평가하는 단계;
    및
    (iii) 단계 (b)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계로서, 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는 단계
    를 포함하는, 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법.
  55. 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (ii) 상기 샘플을,
    세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절; 및/또는
    인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절
    에 대해 평가하는 단계;
    및
    (iii) 암 요법을 선택하는 단계
    를 포함하되, 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법.
  56. 암 치료 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (ii) 상기 샘플을,
    세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 상향조절; 및/또는
    인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하향조절
    에 대해 평가하는 단계;
    및
    (iii) 암 요법을 선택하는 단계
    를 포함하되, 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 암 치료 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상향조절은 건강한 조직과 비교되는, 방법.
  58. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상향조절은 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교되는, 방법.
  59. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상향조절은 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플과 비교되는, 방법.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하향조절은 건강한 조직과 비교되는, 방법.
  61. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하향조절은 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교되는, 방법.
  62. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하향조절은 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플과 비교되는, 방법.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본인, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 생검 샘플인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 생검 샘플은 내시경 생검, 골수 생검, 내시경 생검(예를 들어, 방광내시경, 기관지내시경 및 결장경 검사), 바늘 생검(예를 들어, 세침 흡인, 중심 바늘 생검, 진공-흡인 생검, X-선 보조 생검, 컴퓨터 단층촬영(CT)-보조 생검, 자기 공명 영상(MRI)-보조 생검 및 초음파-보조 생검), 피부 생검(예를 들어, 표층 생검, 펀치 생검 및 절개 생검) 및 수술 생검으로부터 선택되는, 방법.
  66. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함하는, 방법.
  67. 제54항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 스크레이프, 면봉 및 생검으로부터 선택된 기법에 의해 얻은, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 브러쉬, (면)봉, 스패튤라, 린스/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 수술 기기에 의한 구멍의 천공의 사용에 의해 얻어진, 방법.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 종양은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택되는, 방법.
  71. 제54항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행되는, 방법.
  72. 제54항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는,
    (i) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시; 및/또는
    (ii) 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정
    으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리/제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  76. 제54항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는,
    (i) 세포주기 과정의 양성 조절, G1/S 이행의 조절, 세포분열의 조절, 세포 증식의 조절, IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, I형 IFN 신호전달 경로, IFNγ에 대한 세포 반응, IFNα 생산의 양성 조절, 방어 반응의 양성 조절, IFNβ 생산의 양성 조절, 염증 반응의 조절, 선천적 면역 반응의 조절, 항원 처리/제시의 음성 조절 및 MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 항원 처리/제시; 및/또는
    (ii) 인지질 유출, 섬유소용해현상의 음성 조절, 암죽미립 조립체, 혈장막 수선, 막을 표적화하는 SRP-의존적 공동번역 단백질, 리보솜 소형 서브유닛 조립체, 인지질 유출, 번역의 조절, 미토콘드리아 호흡 연쇄 복합체 I, 미토콘드리아 번역 신장, DNA-의존적 DNA 복제 및 ATP 생합성 과정
    으로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 (a) IFNγ에 대한 세포 반응, (b) 항원 처리/제시의 음성 조절, (c) I형 IFN 신호전달 경로, (d) IκB 키나제/NFκB 신호전달의 양성 조절, 및 항원 처리, 및 (e) MHC 클래스 I을 통한 내인성 펩타이드의 제시로부터 선택된 유전자 온톨로지(GO) 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 IFNγ에 대한 세포 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  79. 제76항 또는 제78항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 I형 IFN 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브인, 방법.
  81. 제54항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 상기 환자를 고위험 또는 저위험 그룹으로 분류하는 정보를 제공하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 고위험 분류는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성을 갖는 고수준의 종양 세포를 포함하는, 방법.
  83. 제81항에 있어서, 상기 저위험 분류는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대해 내성을 갖는 저수준의 종양 세포를 포함하는, 방법.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저위험 부류는 상기 암 요법의 중지를 나타내는, 방법.
  85. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고위험 부류는 상기 암 요법의 투여를 나타내는, 방법.
  86. 유효량의 약제학적 조성물을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암 치료 방법으로서, 상기 약제학적 조성물은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    을 포함하는 키메라 단백질을 포함하되,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되고,
    상기 암은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 항-관문 제제에 내성이 있거나 내성이 있는 것으로 여겨지는, 암 치료 방법.
  87. 제54항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 가요성 아미노산 서열, IgG 힌지 영역 또는 항체 서열로부터 선택된 폴리펩타이드인, 방법.
  88. 제54항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
  89. 제54항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유래된, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 112, 또는 서열번호 113의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  91. 제54항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 둘 이상의 결합 링커를 포함하며, 각각의 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 독립적으로 선택되되; 1개의 결합 링커는 상기 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 N 말단에 있으며, 다른 결합 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해 C 말단에 있는, 방법.
  92. 제54항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  93. 제54항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  94. 제54항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  95. 제54항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 11, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  96. 제54항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 재조합 융합 단백질인, 방법.
  97. 제54항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-관문 제제는 니볼루맙(OPDIVO), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA), 피딜리주맙(CT-011, CURE TECH), MK-3475(MERCK), BMS 936559, MPDL328OA(ROCHE), 세미플리맙(LIBTAYO), 아테졸리주맙(TECENTRIQ), 아벨루맙(BAVENCIO) 및 더발루맙(imfinzi)으로부터 선택된 항체인, 방법.
  98. 제86항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 항-관문 제제의 투여를 더 포함하는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 항-관문 제제는 니볼루맙(OPDIVO), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA), 피딜리주맙(CT-011, CURE TECH), MK-3475(MERCK), BMS 936559, MPDL328OA(ROCHE), 세미플리맙(LIBTAYO), 아테졸리주맙(TECENTRIQ), 아벨루맙(BAVENCIO) 및 더발루맙(imfinzi)으로부터 선택된 항체인, 방법.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 키메라 단백질 및 상기 항-관문 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 일시에 또는 동시에 투여되는, 방법.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질을 포함하는 상기 약제학적 조성물은 항-관문 제제가 투여된 후에 투여되는, 방법.
  102. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질을 포함하는 상기 약제학적 조성물은 항-관문 제제가 투여되기 전에 투여되는, 방법.
  103. 제98항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질을 포함하는 상기 약제학적 조성물의 용량은 항-관문 제제에 의한 치료를 받은 적이 없거나 치료를 받고 있지 않은 대상체에게 투여되는 상기 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 용량보다 더 적은, 방법.
  104. 제98항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 상기 항-관문 제제의 용량은 상기 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 의한 치료를 받은 적이 없거나 받고 있지 않은 대상체에게 투여되는 항-관문 제제의 용량보다 적은, 방법.
  105. 제98항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 의한 치료만을 받았거나 이런 치료만을 받고 있는 대상체에 비해 위장 염증 및 체중감소 없이 증가된 생존 기회, 및/또는 종양 크기 또는 암 유병률의 감소를 갖는, 방법.
  106. 제98항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 항-관문 제제에 의한 치료만을 받았거나 이런 치료만을 받고 있는 대상체에 비해 위장 염증 및 체중감소 없이 증가된 생존 기회, 및/또는 종양 크기 또는 암 유병률의 감소를 갖는, 방법.
  107. 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법으로서,
    (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (II) 상기 생물학적 샘플을,
    (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는
    (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자
    의 발현에 대해, 평가하는 단계; 및
    (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계로서, 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는 단계
    를 포함하는, 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법.
  108. 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법으로서,
    (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (II) 상기 생물학적 샘플을,
    (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는
    (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자
    의 발현에 대해 평가하는 단계; 및
    및
    (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계
    를 포함하되, 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법.
  109. 암 치료 방법으로서,
    (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (II) 상기 생물학적 샘플을,
    (i) CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자; 및/또는
    (ii) RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자
    의 발현에 대해, 평가하는 단계; 및
    (III) 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 단계; 및
    (IV) 선택적으로 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계
    를 포함하는, 암 치료 방법.
  110. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 상기 암 요법은, 생물학적 샘플이 적어도 하나의 종양 세포를 포함할 때, 선택되고,
    CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자는 건강한 조직, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 적어도 하나의 종양 세포에서 상향조절되지 않고; 그리고/또는
    RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자는 건강한 조직, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 적어도 하나의 종양 세포에서 하향조절되지 않는, 방법.
  111. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함하고,
    CD274, B2M, STAT1, STAT2, TRIM7, IRF1, TAP1, TAP2, CASP1, IRF, LTBR, PVR, GASTA3, LRG1, SPRY2, ARG1, TRIM8, TRIM2, MAPK8IP1, TRIM6 및 KRT1로부터 선택된 유전자는 건강한 조직, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 적어도 하나의 종양 세포에서 상향조절되고; 그리고/또는
    RPL41, RPS15, RPS8, TRIM7 및 LRG1로부터 선택된 유전자는 건강한 조직에 비해 적어도 하나의 종양 세포, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에서 하향조절되고, 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 방법.
  112. 제107항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 건강한 조직에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성(recalcitrance) 결여를 나타내는, 방법.
  113. 제107항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 건강한 조직에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타내는, 방법.
  114. 제107항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타내는, 방법.
  115. 제107항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타내는, 방법.
  116. 제107항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (b)(i)에 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한, 반응, 내성 또는 반항성의 결여의 발생을 나타내는, 방법.
  117. 제107항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (b)(ii)에 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한, 반응, 내성 또는 반항성의 결여의 발생을 나타내는, 방법.
  118. 제107항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건강한 조직에 비해 (b)(i)에 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타내는, 방법.
  119. 제107항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건강한 조직에 비해 (b)(ii)에 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타내는, 방법.
  120. 제107항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타내는, 방법.
  121. 제107항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타내는, 방법.
  122. 제107항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (b)(i)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응 결여의 발생을 나타내는, 방법.
  123. 제107항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 (b)(ii)에서 열거된 하나 이상의 유전자의 하향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응 결여의 발생을 나타내는, 방법.
  124. 제107항 또는 제123항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본인, 방법.
  125. 제107항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 생검 샘플이되, 선택적으로, 상기 생검 샘플은 내시경 생검, 골수 생검, 내시경 생검(예를 들어, 방광내시경, 기관지내시경 및 결장경 검사), 바늘 생검(예를 들어, 세침 흡인, 중심 바늘 생검, 진공-흡인 생검, X-선 보조 생검, 컴퓨터 단층촬영(CT)-보조 생검, 자기 공명 영상(MRI)-보조 생검 및 초음파-보조 생검), 피부 생검(예를 들어, 표층 생검, 펀치 생검 및 절개 생검) 및 수술 생검으로부터 선택되는, 방법.
  126. 제107항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함하는, 방법.
  127. 제107항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 스크레이프, 면봉 및 생검으로부터 선택된 기법에 의해 얻되, 선택적으로 상기 생물학적 샘플은 브러쉬, (면)봉, 스패튤라, 린스/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 수술 기기에 의한 구멍의 천공의 사용에 의해 얻어진, 방법.
  128. 제121항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함하는, 방법.
  129. 제108항, 제109항 및 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택되는, 방법.
  130. 제107항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행되는, 방법.
  131. 제107항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 (b)(i) 및/또는 (b)(ii)에 열거된 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되되, 선택적으로 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제는 항체, 항체-유사 분자 또는 이의 결합 단편을 포함하는, 방법.
  132. 제107항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 본 명세서에서 확인된 (b)(i) 및/또는 (b)(ii)에 열거된 유전자와 관련된 하나 이상의 유전자의 핵산 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  133. 제132항에 있어서, 상기 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브인, 방법.
  134. 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법으로서,
    (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (II) Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 활성화를 위해 상기 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및
    (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계
    를 포함하되, 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법.
  135. 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법으로서,
    (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (II) Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 활성화를 위해 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및
    (III) 단계 (II)의 평가에 기반하여 암 요법을 선택하는 단계
    를 포함하되, 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하되,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 암 치료를 위한 환자를 선택하는 방법.
  136. 암 치료 방법으로서,
    (I) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (II) Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 활성화를 위해 상기 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및
    (II) 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하며,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 단계; 및
    (IVI) 선택적으로 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법을 투여하는 단계
    를 포함하는, 암 치료 방법.
  137. 제134항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 상기 암 요법은, 생물학적 샘플이 적어도 하나의 종양 세포를 포함할 때 선택되고,
    Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로는 건강한 조직에 비해 적어도 하나의 종양 세포, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에서 상향조절되지 않는, 방법.
  138. 제134항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함하되,
    Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로는 건강한 조직에 비해 적어도 하나의 종양 세포, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플, 또는 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플에서 상향조절되지 않으며, 상기 암 요법은
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    의 일반 구조의 키메라 단백질을 포함하고,
    (A)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 TIGIT이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 LIGHT이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되거나; 또는
    (B)
    (a)는 I형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, 상기 막관통 단백질은 SIRPα이며,
    (b)는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커이고, 그리고
    (c)는 II형 막관통 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이며, 상기 막관통 단백질은 4-1BBL이되, 상기 링커는 상기 제1 도메인을 상기 제2 도메인과 연결하고, 선택적으로 하나 이상의 결합 링커를 포함하며, 이러한 결합 링커는 서열번호 49 내지 95로부터 선택되는, 방법.
  139. 제134항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 건강한 조직에 비해 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타내는, 방법.
  140. 제134항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교하여 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여를 나타내는, 방법.
  141. 제134항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응, 내성 또는 반항성 결여의 발생을 나타내는, 방법.
  142. 제134항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건강한 조직에 비해 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타내는, 방법.
  143. 제134항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-PD-1 요법에 민감한 것으로 알려진 환자로부터의 다른 생물학적 샘플과 비교하여 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응을 나타내는, 방법.
  144. 제134항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터 얻은 사전 생물학적 샘플에 비해 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로의 상향조절의 결여는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 기능 및/또는 활성을 저해하는 능력을 갖는 암 요법에 대한 반응 결여의 발생을 나타내는, 방법.
  145. 제134항 또는 제144항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양 세포 또는 포말린-고정 파라핀-포매 종양 조직 표본인, 방법.
  146. 제134항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 생검 샘플인, 방법.
  147. 제146항에 있어서, 상기 생검 샘플은 내시경 생검, 골수 생검, 내시경 생검(예를 들어, 방광내시경, 기관지내시경 및 결장경 검사), 바늘 생검(예를 들어, 세침 흡인, 중심 바늘 생검, 진공-흡인 생검, X-선 보조 생검, 컴퓨터 단층촬영(CT)-보조 생검, 자기 공명 영상(MRI)-보조 생검 및 초음파-보조 생검), 피부 생검(예를 들어, 표층 생검, 펀치 생검 및 절개 생검) 및 수술 생검으로부터 선택되는, 방법.
  148. 제134항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 유동 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 배설물, 림프, 부인과 체액, 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정 또는 세척, 예컨대, 젖관세척 또는 기관지폐포 세척, 흡입물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 표본, 수술 표본, 배설물, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물, 및/또는 이들로부터의 세포로부터 선택된 체액을 포함하는, 방법.
  149. 제134항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 스크레이프, 면봉 및 생검으로부터 선택된 기법에 의해 얻은, 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 브러쉬, (면)봉, 스패튤라, 린스/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘 또는 수술 기기에 의한 구멍의 천공의 사용에 의해 얻어진, 방법.
  151. 제134항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함하는, 방법.
  152. 제135항, 제136항 및 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 호지킨 및 비호지킨 림프종, B-세포 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL) 포함); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 또는 만성 골수아구성 백혈병, 기저세포암종, 담도암; 방광암; 뼈암; 뇌 및 중추 신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간암종; 간암; 상피내 신생물; 신장 또는 신세포암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종을 포함하는 림프종(저등급/소포 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌 종양과 관련), 메이그 증후군 암과 관련된 비정상적 혈관증식; 신장 암종; 결장직장암; 및 부신암으로부터 선택되는, 방법.
  153. 제134항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 DNA 서열분석, RNA 서열분석, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합물에 의해 수행되는, 방법.
  154. 제134항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  155. 제154항에 있어서, 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 제제는 항체, 항체-유사 분자 또는 이의 결합 단편을 포함하는, 방법.
  156. 제134항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가하는 단계는 Mapk8ip1, Trim7, Elk1, Lrg1, Arg1, Rap1 및 Ras로부터 선택된 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 수행되는, 방법.
  157. 제156항에 있어서, 상기 핵산 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 제제는 핵산 프라이머 또는 프로브인, 방법.
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