CN116847866A - 使用基于tigit和基于light的嵌合蛋白治疗癌症的方法 - Google Patents

使用基于tigit和基于light的嵌合蛋白治疗癌症的方法 Download PDF

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T·施赖伯
G·弗罗姆
S·达西瓦
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Shattuck Labs Inc
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Abstract

本公开尤其涉及组合物和方法，包括可用于治疗疾病的嵌合蛋白，并且涉及使用嵌合蛋白检测和治疗抗药性癌症。

Description

使用基于TIGIT和基于LIGHT的嵌合蛋白治疗癌症的方法
优先权
本申请要求2020年12月3日提交的美国临时申请号63/121,083；2021年4月9日提交的美国临时申请号63/173,090；2021年6月28日提交的美国临时申请号63/215,735；2021年11月5日提交的美国临时申请号63/276,066的权益和优先权，其每一篇的内容均通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本公开尤其涉及包括可用于治疗疾病的嵌合蛋白的组合物和方法，以及使用嵌合蛋白检测和治疗抗药性癌症的方法。
以电子方式提交的文本文件的描述
以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：SHK-038PC2_ST25；创建日期：2021年12月1日；大小177,048字节)。
背景技术
癌症免疫疗法领域在过去几年中取得了巨大的发展。这在很大程度上是由靶向许多肿瘤类型中的检查点分子家族(例如CTLA-4和PD-1/L1)的抗体的临床功效推动的。然而，尽管取得了这一成功，但少数患者(各种实体瘤中的10-45％)对这些作为单一疗法的药剂产生了临床反应，并且这些疗法因副作用而受到阻碍。
发现此类药剂的适当剂量和方案对于有效治疗癌症至关重要。考虑到人类免疫系统的复杂性、高成本以及此类干预措施可能导致的潜在毒性，开发新的治疗策略(包括给药和方案)仍然是一项艰巨的任务。
此外，抗药性仍然是癌症疗法(包括免疫疗法)中最大的挑战之一。晚期癌症患者接受有助于缩小他们的肿瘤的药物也很常见，但几周或几个月后癌症复发，药物不再起作用。因此，抗药性，无论是治疗前存在的(固有的抗性或原发性抗性)还是疗法后产生的(获得性抗性)，都是导致大多数癌症复发的原因，而癌症复发是死亡的主要原因之一。因此，需要更好地了解抗药机制，为未来的癌症治疗提供指导。不幸的是，对于一些患有耐受检查点疗法的癌症的患者来说，几乎没有可用的治疗选择。因此，需要为患有抗药性癌症的患者开发新疗法的方法和为患有抗药性癌症的患者选择适当的药物的方法。
发明内容
在各个方面，本技术提供了可用于癌症免疫疗法的组合物和方法。此外，本公开部分地提供了选择患者进行癌症治疗的方法，以及基于例如基于抗PD-1抗性癌症的基因表达谱进行癌症治疗的方法。
一方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是由T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域的第二结构域。在实施方案中，施用的嵌合蛋白的剂量在约0.0001mg/kg至约50.0mg/kg之间，任选地选自约1mg/kg、约3mg/kg、约6mg/kg、或约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约20mg/kg、约22mg/kg、约25mg/kg、约27mg/kg、约30mg/kg、约33mg/kg、约35mg/kg、约37mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约45mg/kg、约48mg/kg和约50mg/kg。在实施方案中，受试者是人，任选地是成年人。
一方面，本公开涉及一种用于在有需要的受试者中诱导淋巴细胞扩增的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域的第二结构域。
一方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中诱导淋巴细胞边缘化(margination)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT的(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是由T淋巴细胞表达的受体)胞外结构域的第二结构域。
一方面，本公开涉及一种评价有需要的受试者的癌症治疗的功效的方法，该方法包括以下步骤：(i)施用一个剂量的嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是由T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域的第二结构域，其中剂量为约0.03mg/kg至约50mg/kg；(ii)从受试者获得生物样品；(iii)对生物样品进行测定以确定选自以下的细胞因子的水平和/或活性：IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)；和(iv)如果受试者的选自以下的至少一种细胞因子的水平和/或活性增加，则继续给药：IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)。
一方面，本公开涉及选择受试者以用癌症疗法进行治疗的方法，该方法包括以下步骤：(i)施用一个剂量的嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是由T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域的第二结构域，其中剂量为约0.03mg/kg至约50mg/kg；(ii)从受试者获得生物样品；(iii)对生物样品进行测定以确定选自以下的细胞因子的水平和/或活性：IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)；和(iv)如果受试者的选自以下的至少一种细胞因子的水平和/或活性增加，则选择该受试者进行癌症疗法的治疗：IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)。
一方面，本公开涉及一种为患者确定癌症疗法的方法，该方法包括：(i)从受试者获得生物样品；(ii)评价样品中与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递；和/或与选自以下的基因本体(GO)途径相关的一种或多种基因的下调：磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程：和(iii)基于步骤(b)的评价选择癌症疗法，其中该癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：(i)从受试者获得生物样品；(ii)评价样品中与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递；和/或与选自以下的基因本体(GO)途径相关的一种或多种基因的下调：磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程：和(iii)选择癌症疗法，其中该癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括：(i)从受试者获得生物样品；(ii)评价样品中与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递；和/或与选自以下的基因本体(GO)途径相关的一种或多种基因的下调：磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程：和(iii)选择癌症疗法，其中该癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症治疗的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。在实施方案中，生物样品是活检样品。在实施方案中，生物样品包含选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物的体液，和/或来自其中的细胞。
在实施方案中，生物样品包含至少一种肿瘤细胞。
在实施方案中，通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行评价。
在实施方案中，通过使样品与特异性结合与本文鉴定的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触进行评价。
在实施方案中，通过将样品与特异性结合与本文鉴定的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的试剂接触来进行评估。
在实施方案中，评价告知将患者分类为高风险组或低风险组。在实施方案中，高风险分类包括高水平的肿瘤细胞，该肿瘤细胞对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法具有抗性。在实施方案中，低风险分类包括低水平的肿瘤细胞，该肿瘤细胞对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法具有抗性。
在实施方案中，上调是与健康组织进行比较。在实施方案中，上调是与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品进行比较。在实施方案中，上调是与从受试者获得的先前生物样品进行比较。在实施方案中，下调是与健康组织进行比较。在实施方案中，下调是与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品进行比较。在实施方案中，下调是与从受试者获得的先前生物样品进行比较。
一方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95，其中所述癌症对或被认为对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗检查点剂具有抗性。
在实施方案中，接头是选自柔性氨基酸序列、IgG铰链区或抗体序列的多肽。在实施方案中，接头包含源自IgG1或IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。在实施方案中，铰链-CH2-CH3 Fc结构域源自人IgG1。在实施方案中，铰链-CH2-CH3 Fc结构域源自人IgG4。在实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，接头包含两个或更多个连接接头，每个连接接头独立地选自SEQ ID NO:49-95；其中一个连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的N末端，而另一连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的C末端。
在实施方案中，第一结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，第一结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白是重组融合蛋白。
一方面，本公开涉及一种为患者确定癌症疗法的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品的以下表达：(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中该癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ IDNO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品的以下表达：(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中该癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ IDNO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品的以下表达：(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和(III)其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；和(VI)任选地施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症治疗。一方面，本公开涉及为患者确定癌症疗法的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品对选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的激活；和(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中该癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品对选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的激活；和(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中该癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ IDNO:49-95。
一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品对选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的激活；和(II)其中该癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；和(IV)任选地施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
在实施方案中，抗检查点剂是选自以下的抗体：纳武单抗(nivolumab)(OPDIVO)、派姆单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011，CURETECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559、MPDL328OA(ROCHE)、西米普利单抗(Cemiplimab)(LIBTAYO)、阿特珠单抗(Atezolizumab)(TECENTRIQ)、阿维鲁单抗(Avelumab)(BAVENCIO)和度伐鲁单抗(Durvalumab)(imfinzi)。
在实施方案中，该方法还包括施用抗检查点剂。在实施方案中，抗检查点剂是选自以下的抗体：纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地利珠单抗(CT-011，CURETECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559、MPDL328OA(ROCHE)、西米普利单抗(LIBTAYO)、阿特珠单抗(TECENTRIQ)、阿维鲁单抗(BAVENCIO)和度伐鲁单抗(imfinzi)。在实施方案中，包含嵌合蛋白和抗检查点剂的药物组合物同时或同期施用。在实施方案中，在施用抗检查点剂之后施用包含嵌合蛋白的药物组合物。在实施方案中，在施用抗检查点剂之前施用包含嵌合蛋白的药物组合物。
本文公开的任何方面可以与任何其他方面组合。
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图1A和图1B示出抗PD-1抗性CT26肿瘤的产生。图1A显示用于产生抗PD-1抗性CT26肿瘤的方法的示意图。简而言之，将BALB/C小鼠接种500,000个鼠结肠癌CT26细胞，当平均肿瘤体积达到80-100mm3(表示第0天)时，用抗PD-1(克隆RMP1-14；BioXcell)抗体治疗小鼠。切除肿瘤，分离存活的肿瘤细胞并在体外培养。这些细胞被称为“第一轮”、“第一代”或“F1代”细胞。将第一代细胞接种到BALB/C小鼠中，并在抗PD-1“第二轮”、“第二代”或“F2代”细胞的另一个疗程后分离。再进行两轮(总共4轮)抗PD-1选择后，分离出“第4轮”、“第4代”或“F4代”细胞。图1B显示比较抗PD-1抗体(100μg抗PD-1克隆RMP1-14；BioXcell)在携带CT26亲代细胞和PD-1抗性细胞的BALB/C小鼠中的功效的图。BALB/C小鼠在后胁接种CT26亲代细胞和PD-1抗性第四代细胞。当起始肿瘤体积(STV)达到80-100mm3时，将小鼠随机分为以下两个治疗组：(1)溶媒(PBS)和(2)抗PD-1抗体。在第0、3和6天，对小鼠给予一系列腹膜内注射溶媒或100μg抗PD-1(克隆RMP1-14；BioXcell)。在指定天数时测量肿瘤体积。
图2A至图2D显示使用RNA-seq对抗PD-1抗性细胞系进行的转录组分析。图2A(上图)显示了基于转录组表达在空间上分离样品的主成分分析(PCA)。图2A(下图)显示了在各组(亲代与第2代、亲代与第4代、第2代与第4代)之间确定的差异表达基因(DEG)，并绘制在热图中。进行层次聚类对每一行上的基因进行排序，在每次比较中将基因分为2个主要簇，其中一个基因表达子集在一个数据集中较低(蓝色)，而在另一个数据集中较高(红色)。图2B显示了每个数据集中上调或下调的基因。将基因输入PANTHER以确定与每个基因集相关的基因本体(GO)。基因集与相关p值一起显示。图2C(上图)显示了所有数据集之间基因表达重叠的维恩图。图2C(下图)显示了选定基因的每百万份转录本(TPM；标准化表达数据)，证明了与PD-L1、抗原加工/呈递、蛋白翻译、ER运输相关的基因基线表达更高；在某些数据集中高于其他数据集。图2D显示了所选基因的每百万份转录本(TPM；标准化表达数据)，证明了与PD-L1、抗原加工/呈递、蛋白翻译、ER运输相关的基因的基线表达更高；在某些数据集中优于其他数据集。
图3示出PD-L1/2MHC I类和B2M中的基因表达和细胞表面蛋白表达存在不一致。从培养物中收获亲代和第四代抗PD-1抗性细胞，并通过流式细胞术分析PD-L1、PD-L2、MHC I类和β2微球蛋白(B2M)的表面表达。如图所示绘制门控，每个图上方显示的是每个门控中的细胞百分比，每个百分比的右侧显示每个标志物的MFI(平均荧光强度)。
图4A和图4B显示抗PD-1抗性细胞系的转录组分析。图4A显示了第二代和第四代抗PD-1抗性细胞系与B16.F10的比较，B16.F10是一种鼠黑色素瘤肿瘤，它用作抗PD-1“原发性抗性”的模型，因为这些肿瘤对抗PD-1疗法没有反应。将细胞在IFNγ中培养24小时以评估体外反应性。这模仿了肿瘤细胞在体内如何反应，因为免疫细胞浸润并分泌效应细胞因子(如IFNγ)。图4A(左图)显示了在未处理的和IFNγ处理的亲代CT26之间鉴定的DEG。其中，338个基因具有来自其他数据集的可用数据；并且这些值显示在其他列中。Log2倍数变化绘制在热图中，并且基因基于亲代CT26进行分层聚类。基因分为3个主要簇。图4A(右图)显示了与DEG相关的GO通路。将相关基因输入PANTHER中，以鉴定与失调基因相关的通路。图4B显示了选定基因的每百万份转录本(TPM；标准化表达数据)，证明了尽管CT26抗PD-1抗性细胞具有I型和II型干扰素的基线过度激活，但当这些细胞受到IFNγ攻击时，这些细胞下调这些基因。
图5A至图5D示出了与抗PD-1的获得性抗性相关的某些基因的矛盾失调。在第四代抗PD-1抗性细胞中过表达的编码CD274(图5A)和B2m(图5B)的基因在野生型CT26细胞中过表达，但在第四代抗PD-1抗性细胞中在IFNγ的存在下被抑制。另一方面，在第四代抗PD-1抗性细胞中被抑制的编码Trim7(图5C)和Lrg1(图5D)的基因在野生型CT26细胞中被抑制，但在对IFNγ有反应的第四代抗PD-1抗性细胞中被过表达。第二代抗PD-1抗性细胞显示出中间表型。
图6A和图6F显示了参与抗PD-1获得性抗性的驱动基因的鉴定以及受驱动基因影响的功能通路。图6A，小图1-4显示了用于鉴定驱动基因的方法。图6A(小图1)显示，与CT26细胞相比，在IFNγ的存在下，第四代抗PD-1抗性细胞有1,999个基因被下调，3607个基因被上调。图6A(小图2)显示1,060个基因在第四代抗PD-1抗性细胞中下调，但在CT26细胞中上调。图6A(小图3)显示与CT26细胞相比，第四代抗PD-1抗性细胞有688个基因下调，如通过根据对IFNγ的响应性排序所揭示的。图6A(小图4)显示与CT26细胞相比，在第四代抗PD-1抗性细胞中体内上调的70个基因。图6B显示与使用图6A的方法鉴定的基因相关的基因本体(GO)通路。图6C显示受TRIM蛋白家族影响的功能通路。图6D显示了Elk1和c-Jun发挥作用的功能通路。图6E显示了Lrg1、B2m和Arg1与其他基因之间的功能连接。图6F显示了癌症基因组图谱(TCGA)癌症基因组程序中肿瘤和周围正常组织中Elk1的表达水平。
图7A至图7D显示响应IFNγ而过表达的Stat1(图7A)、Stat2(图7B)、Irf1(图7C)和Tap1(图7D)基因在第四代抗PD-1抗性细胞中过表达，并且在IFNγ的存在下在第四代抗PD-1抗性细胞中受到抑制。第二代抗PD-1抗性细胞显示出中间表型。
图8A和图8D显示了差异表达基因的通路分析，这导致了Ras和Rap1信号传导通路的鉴定。图8A显示使用基于WEB的GEne SeT分析工具包(WebGestalt)使用来自图6A(小图2)的前1,000个基因来鉴定通路。图8B示出了图8A中呈现的数据的Volcano图。图8C显示RAS信号传导通路。使用椭圆形显示与Raf/Mek/Erk信号传导的融合。图8D显示RAP1信号传导通路。使用椭圆形显示与Raf/Mek/Erk信号传导的融合。
图9A至图9C显示响应于IFNγ而过表达的Ccl5(RANTES)(图9A)、Cxcl10(IP-10)(图9B)和Ifnb1(图9C)基因在第四代抗PD-1抗性细胞中被过表达，并且在IFNγ的存在下在第四代抗PD-1抗性细胞中被抑制。第二代抗PD-1抗性细胞显示出中间表型。
图10A至图10H显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的构建和表征。图10A显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的分子模型，其以具有两个基于PDB(蛋白质数据库)结构的LIGHT三聚体的功能组的六聚体存在，其中使中央IgG4 Fc结构域二聚化以及使TNF-配体结构域三聚化。图10B是显示TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的表征的蛋白质印迹。蛋白质印迹证明了嵌合蛋白的天然状态和形成多聚体的趋势。将未经处理的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白样品(即，没有还原剂或去糖基化剂，但已煮沸)加载到每个印迹中标记为NR的泳道中。标记为R的泳道中的样品用还原剂β-巯基乙醇处理，并煮沸。标记为DG的泳道中的样品用去糖基化剂、还原剂处理，并煮沸。标记为L的泳道包括蛋白大小标准。使用抗TIGIT抗体(左印迹)、抗Fc抗体(中间印迹)或抗LIGHT抗体(右印迹)探测嵌合蛋白的每个个体结构域。图10C显示了MesoScale Discovery(MSD)ELISA测定，证明TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白同时结合检查点靶点(PVR)和在骨髓、CD8+T和NK细胞上发现的免疫共刺激受体(LTβR和HVEM)。图10D显示了开发用于评估细胞表面受体结合的基于细胞的结合测定(使用被工程化以表达hPVR、hHVEM的CHOK1细胞以及表达人LTβR的A375细胞)。图10E显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白对Jurkat效应细胞中下游信号传导的激活。将NFκB/NIK报告细胞与重组Fc-LIGHT对照或TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(各自18nM)一起孵育，并通过荧光素酶检测评估信号传导活性。图10F显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(或鼠替代物，均为10nM)通过IL-2诱导激活T细胞，如在与超抗原SEB共培养3天的人PBMC或小鼠脾细胞中所评估的。图10G显示了Jurkat效应细胞-商业2细胞报告系统的一部分-表达TIGIT、DNAM-1和HVEM，如使用流式细胞术所示。图10H显示了Jurkat效应细胞和CHO/hPVR报告细胞的激活。这些细胞与(全都为150nM)IgG4对照、DNAM-1封闭抗体、TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白或用LIGHT封闭抗体预孵育的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白共培养6小时，然后使用光度计评估荧光素酶信号传导活性。
图11显示了与仅用溶媒处理的小鼠相比，CT26(左小图)、CT26抗PD-1抗性细胞(中间小图)或B16.F10(右小图)同种异体移植物在按所示处理的小鼠中的肿瘤生长抑制。虚线显示了抗PD-1抗体(克隆10F.9G2)引起的肿瘤生长抑制的量。
图12A至图12J显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白抗癌的体内功效。图12A显示了个体动物肿瘤生长曲线、每组达到肿瘤负荷的平均天数以及响应于治疗而完全排斥肿瘤的小鼠的数量。图12B显示了Kaplan-Meier曲线，显示携带CT26结直肠癌肿瘤、抗PD-1抗性CT26肿瘤或B16.F10的同种异体移植物的小鼠在整个实验过程中的总体生存率。图12C显示了携带CT26野生型肿瘤并用200μg鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(mTIGIT-Fc-LIGHT)或100μg抗LTβR、抗TIGIT、Fc-LIGHT、抗PD-1、抗PD-L1或所示的组合处理的小鼠的个体动物肿瘤生长曲线。还显示了整个组达到肿瘤负荷的平均天数(也用虚线表示)，以及完全排斥肿瘤的小鼠数量/分析的总组大小。图12D显示了直到图12C的时间进程的第36天的Kaplan-Meier生存图。图12E显示了携带B16.F10肿瘤并用200μg mTIGIT-Fc-LIGHT或100μg抗TIGIT、Fc-LIGHT、抗PD-1、抗PD-L1或所示的组合治疗的小鼠的个体动物肿瘤生长曲线。还显示了整个组达到肿瘤负荷的平均天数(也用虚线表示)，以及完全排斥肿瘤的小鼠数量/分析的总组大小。图12F显示了直到图12E的时间进程的第36天的Kaplan-Meier生存图。图12G显示了肿瘤接种后7天(在第0、3、6天的治疗后)浸润CT26结直肠癌肿瘤或抗PD-1抗性CT26肿瘤(CT26/AR)的抗原特异性CD8+T细胞(AH1+)和NK细胞的比例。图12H显示了在B16.F10模型中CD4+T、CD8+T或NK细胞耗竭对TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的体内活性的影响。当B16.F10肿瘤达到112.57mm3的平均起始肿瘤体积(STV)时，显示为第0天。在第-1、1和7天用一个疗程的CD4、CD8或NK耗竭抗体治疗小鼠。在第0、3和6天对小鼠进行3次IP注射；每次由200mgmTIGIT-Fc-LIGHT组成，并绘制了从第0天到第11天肿瘤体积的变化。图12I显示了携带抗PD-1抗性CT26肿瘤并用200μg mTIGIT-Fc-LIGHT或100μg抗TIGIT、Fc-LIGHT、抗PD-1、抗PD-L1或所示的组合治疗的小鼠的个体动物肿瘤生长曲线。还显示了整个组达到肿瘤负荷的平均天数(也用虚线表示)，以及完全排斥肿瘤的小鼠数量/分析的总组大小。图12J显示了直到图12I的时间进程的第36天的Kaplan-Meier生存图。图12K显示了用所示剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的小鼠中总CD8+细胞的诱导。图12L显示了用所示剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的小鼠中总CD4+DNAM1+细胞的诱导。图12M显示了用所示剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的小鼠中总CD4+细胞的诱导。图12N显示了用所示剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的小鼠中总CD11b+细胞的诱导。图12O显示了用所示剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的小鼠中激活的CD11b+CD80+细胞的诱导。图12P显示了用所示剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的小鼠中激活的CD11b+CD86+细胞的诱导。
图13A至图13G显示了跨各种外周血细胞亚型以及人和小鼠TIL内的免疫共刺激受体的表达。图13A显示了描绘TCGA癌症中53种免疫共刺激基因的相对表达的热图，基于所有肿瘤类型中的平均表达从高到低进行排序。图13B显示了以相同比例绘制所有TCGA肿瘤类型中TNFRSF14、CD226和LTBR的归一化表达水平，以描绘这些靶基因相对于彼此的相对mRNA表达。图13C显示了初始CD8+T细胞(Tn)和T干细胞记忆CD8+T细胞(Tscm)中HVEM和DNAM-1的相对水平。将使用磁力分离从健康供体PBMC中分离的人初始CD8+T细胞在含有CD3/CD28珠、人重组IL-2和GSK3β抑制剂TWS119的AIMV培养基中培养9天。按照这一时间进程，根据先前鉴定的表征初始CD8+T细胞(Tn)和T干细胞记忆CD8+T细胞(Tscm)的抗体组，通过流式细胞术分离和评估细胞。描述并定量了Tscm和Tn细胞中HVEM和DNAM-1的相对水平。图13D显示在了Seurat鉴定的簇(上图)和根据ImmuneExp的SingleR免疫细胞亚型(下图)中的一致流形逼近和投影(Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP)空间组织。分离在AIMV培养基中培养2天的人PBMC，并对其进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)。使用Seurat鉴定的簇(上图)和根据ImmuneExp绘制免疫细胞亚型的SingleR(下图)来评估UMAP空间组织。图13E显示了描绘Seurat鉴定的簇中53种免疫共刺激基因的相对表达的热图。基于所有簇中的平均表达从高到低对基因进行排序。基于每列中的最小值和最大值来显示表达强度。突出显示了三种目标基因：TNFRSF14(HVEM)、CD226(DNAM-1)和LTBR(LTβR)。图13F显示了以相同比例绘制Seurat鉴定的簇中TNFRSF14、CD226和LTBR的归一化表达水平，以描绘这些靶基因相对于彼此的相对mRNA表达。图13G显示了在被接种到其各自的接受小鼠中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)鼠CT26野生型结直肠(CT26/WT)肿瘤、工程化以产生CPI获得性抗性(CT26/AR)的CT26肿瘤或B16.F10黑色素瘤肿瘤中HVEM和DNAM-1的相对细胞表面表达。允许肿瘤建立，当它们达到80-110mm3(初次接种后约10-14天)时，将肿瘤切割下来，解离，并通过流式细胞术评估所得肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在NK细胞(在CT26肿瘤中以NKP46+细胞为门控，在B16.F10肿瘤中以NK1.1为门控)和CD8+T细胞(以CD3+CD8+细胞为门控)中评估HVEM和DNAM-1的相对细胞表面表达。
图14A至图14H显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白直接激活骨髓细胞、T细胞和NK细胞，无论Fc组成如何。人类供体PBMC未经处理(UT)或在含有TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的IgG1或IgG4变体的AIMV培养基中培养；称为TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT嵌合蛋白或G1和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白或G4。图14A显示了在+/-TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT或TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白的情况下培养7天的PBMC的相位衬度图像，描绘细胞对板的粘附以及纺锤状骨髓形态的形成。图14B显示了在Incucyte延时成像仪上孵育的PBMC培养物的增殖/融合，并且在存在或不存在150nM TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT的情况下在为期6天的时间进程中评估增殖/融合。采集20倍图像，在4个视野中对3个供体中的每个一式二份地采集。图14C显示了由TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白诱导的细胞因子，如使用Meso Scale Discovery(MSD)ELISA测定在培养物上清液中所评估的。培养2天后，除去上清液，并使用MSD多重细胞因子组评估一系列细胞因子。图14D显示通过单细胞RNA测序评估的差异表达基因(DEG)的数量。第2天，分离未经处理的(UT)、经TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT-处理的(G1)和经TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT-处理的(G4)PBMC单细胞，并对其进行单细胞RNA测序。在图13D和图13E中鉴定的16个Seurat簇中的每一个中，鉴定了在TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白与未经处理组之间的差异表达基因(DEG)。图14E显示了描绘所有16个Seurat簇中鉴定的DEG表达的相对差异的热图。将目标基因标记在与骨髓、NK和CD8+T细胞群相对应的簇上。图14F显示了未经处理的、TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT数据集的一致流形逼近和投影(UMAP)空间分布。突出显示了与骨髓细胞、NK细胞和CD8+T细胞相对应的细胞群(如使用ImmuneExp注释鉴定的)，并显示了各处理组中落入这些门控中的细胞的百分比。图14G显示了与TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白诱导的差异表达基因(DEG)相关的通路，如通过进化关系的蛋白分析(protein analysis throughevolutionary relationships，PANTHER)所鉴定的。显示了DEG的数量和方向性。对上调和下调基因列表进行基因本体分析(使用PANTHER)，并显示了显著富集的通路(FDR p值<0.05)。图14H显示了与未经处理的小鼠相比，从来自用TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白处理的小鼠的人PBMC分离的骨髓细胞的倍数变化。
图15显示了仅用溶媒、抗TIGIT抗体(克隆1G9)、抗PD-1抗体(克隆RPM1-14)、抗TIGIT和抗PD-1抗体的组合、TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白、以及TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白和抗PD-1抗体的组合处理的小鼠中CT26或抗PD-1抗性CT26(CT26/AR)同种异体肿瘤移植物的肿瘤体积。
图16显示了显示示例性人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的结构的卡通图(上小图)，以及显示人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的表征的蛋白质印迹(下小图)。蛋白质印迹证明了嵌合蛋白的天然状态和形成多聚体的趋势。将分子量标志物加载到每个印迹的第一泳道中。将未经处理的人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白样品(即，没有还原剂或去糖基化剂，但已煮沸)加载到每个印迹的第二泳道中。将用还原剂β-巯基乙醇处理并煮沸的样品加载到每个印迹的第三泳道中。将每个印迹的第四泳道中的样品用去糖基化剂、还原剂处理，并煮沸。使用抗人SIRPα抗体(左印迹)、抗Fc(H+L)抗体(中间印迹)或抗4-1BBL抗体(右印迹)探测嵌合蛋白的每个个体结构域。
图17A至图17C显示了使用Meso Scale Discovery(MSD)平台测量的人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与人CD47、人4-1BB的结合分析。图17A显示了人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与人CD47-His的结合。图17B显示了人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与人4-1BB-His的结合。图17C显示了人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与人4-1BB-His和CD47-His的同时结合。
图18A至图18C显示了人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与表达4-1BB的细胞的结合以及细胞的激活。图18A显示了通过流式细胞术测定的人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与过度表达4-1BB的HT1080细胞的结合。图18B显示了通过流式细胞术测定的人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与过度表达4-1BB的HT1080细胞的结合的定量。图18C显示了响应于人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白诱导的4-1BB/4-1BBL信号传导的IL-8分泌。
图19显示了显示示例性小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的结构的卡通图(上小图)，以及显示小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的表征的蛋白质印迹(下小图)。蛋白质印迹证明了嵌合蛋白的天然状态和形成多聚体的趋势。将分子量标志物加载到每个印迹的第一泳道中。将未经处理的小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白样品(即，没有还原剂或去糖基化剂，但已煮沸)加载到每个印迹的第二泳道中。将用还原剂β-巯基乙醇处理并煮沸的样品加载到每个印迹的第三泳道中。将每个印迹的第四泳道中的样品用去糖基化剂、还原剂处理，并煮沸。使用抗小鼠SIRPα抗体(左印迹)、抗Fc(H+L)抗体(中间印迹)或抗4-1BBL抗体(右印迹)探测嵌合蛋白的每个个体结构域。
图20A至图20D显示了使用Meso Scale Discovery(MSD)平台测量的小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与小鼠CD47、小鼠4-1BB的结合分析。图20A显示了小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与抗小鼠Fc抗体的结合。图20B显示了小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与小鼠4-1BB-His的结合。图20C显示了小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与小鼠CD47-His的结合。图20D显示了小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与小鼠4-1BB-His和CD47-His的同时结合。
图21A至图21C显示了SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白和抗PD-1抗体在CT26同种异体移植模型和第四代抗PD-1抗性细胞中的抗肿瘤活性的比较。图21A显示了作为时间的函数的平均肿瘤生长的线图。图21B显示了显示第17天肿瘤体积的条形图。图21C显示了Kaplan-Meier生存曲线。
图22A至图22H显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在食蟹猴中的药效学(PD)活性。图22A显示了淋巴细胞的剂量依赖性减少或边缘化。图22B显示了CD3+T细胞的减少或边缘化。图22C显示了基于给药后2小时细胞因子特征的动物的主成分分析(principal componentanalysis，PCA)分布。图22D显示了PCA矢量图中促炎细胞因子的给药后2小时细胞因子特征。图22E显示了使用Meso Scale Discovery(MSD)测定评估的细胞因子反应。图22F显示了IL-2的诱导倍数。图22G显示了IP-10的诱导倍数。图22H显示了第一、第二和第三剂量期间和之后的CXCL-10水平。
图23A至图23C显示了使用mRNA和细胞表面表达的免疫细胞表型分析。图23A显示了先前公开的关于分离的T干细胞记忆(T stem cell memory，Tscm)、T中央记忆(Tcentral memory，Tcm)、T效应记忆(T effector memory，Tem)和初始T细胞(T effectormemory，Tn)的Affymetrix微阵列数据的分析。对数据分析TNFRSF14(HVEM)、CD226(DNAM-1)和TIGIT的表达。图23B显示了两个另外的免疫基因集注释中的一致流形逼近和投影(UMAP)空间组织。使用HPCA(人类原代细胞图谱，Human Primary Cell Atlas)和Novershtern(物理模块网络)来评估图13D中呈现的人PBMC scRNA-seq数据的UMAP空间分布。图23C显示了流式细胞术分析的结果，其用于评估用抗小鼠CD3/CD28珠和IL-2刺激2天的鼠T细胞、或鼠NK细胞(二者都是从健康动物的脾脏中分离出来)上TIGIT、DNAM-1和HVEM的细胞表面表达。T细胞在CD3上预门控，NK细胞在NKP46上预门控。
图24A至图24G显示了小鼠替代物的表征以及小鼠和人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白分子的功能活性。图24A显示了鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白替代物(也称为mTIGIT-Fc-LIGHT)的表征，如使用探测每个结构域(TIGIT、Fc和LIGHT)的抗体在非还原、还原、还原+去糖基化条件下通过蛋白质印迹评估的。图24B显示了使用MSD评估人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与重组人连接蛋白(Nectin-4)的结合。图24C(左小图)显示了从人类健康供体和癌症患者收集的血清样品中DcR3的水平。图24C(右小图)显示了在可溶性DcR3存在的情况下人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与HVEM的结合。为了评估血清可溶性DcR3是否会干扰TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与HVEM的结合，使用在每个血清样品中独立地在冰上预孵育20分钟的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白进行双重效力测定。然后使用MSD平台运行双重效力测定。图24D显示了通过ELISA评估小鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(mTIGIT-Fc-LIGHT)与重组靶标的结合。使用流式细胞术评估与表达小鼠LTβR的CHO-K1细胞的结合。图24E显示了使用流式细胞术评估的mTIGIT-Fc-LIGHT与CT26/WT、CT26/AR和B16.F10肿瘤细胞的结合。图24F显示了使用Incuctye平台评估的mTIGIT-Fc-LIGHT增强NK细胞或CD8+T细胞(用抗小鼠CD3/CD28珠刺激2天)杀伤CT26肿瘤细胞的能力，其中随时间评估裂解的胱天蛋白酶3/7荧光。图24G显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白对CXCL8和CCL2基因表达的诱导。将人A375细胞与抗LTβR激动剂抗体或TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白一起孵育3小时。收获RNA，逆转录，并使用qPCR评估ACTB、GAPDH、CXCL8和CCL2的基因表达。
图25A至图25G显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT或TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT)在刺激HVEM+和LTβR+免疫细胞中的活性。图25A显示了使用探测每个结构域(TIGIT、Fc和LIGHT)的抗体在非还原、还原和还原+去糖基化条件下通过蛋白质印迹对TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT嵌合蛋白分子的评估。图25B显示了用人PBMC+/-TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT或TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT(各150nM)进行的AIMV增殖测定的结果。除了使用PromegaMTS增殖测定评估培养物的增殖能力(右图)外，还评估了2天时的细胞形态(左图)。图25C显示了使用TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT嵌合蛋白进行的MSD受体结合测定，以证明与靶受体的结合。还显示了IgG1分子与效应Fcγ受体(药物浓度为10μg/mL)的结合，并且图25D也显示了使用来自图14A至图14C中呈现的相同供体PBMC的第2天的AIMV PBMC培养物进行的细胞因子分析。使用MSD多重评估细胞因子，其中PBMC用具有Fc效应物能力的TIGIT抗体+/-抗PD-1(派姆单抗)(全都为150nM)处理。未经处理的条与它们在图14C中呈现的方式相同。图25E显示了来自由未经处理的(UT)、TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT处理组产生的人PBMC scRNA-seq数据集的TIGIT、LTBR、TNFRSF14、CD226、PVR、PVRL2、PVRL3和连接蛋白4的空间表达的UMAP描绘。图25F显示了从scRNA-seq数据集中分离的目标基因的归一化表达。图25G显示了对TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT处理组之间的差异表达基因的评估，尤其表明数据集几乎相同(倍数变化>2倍或<-2倍)，并且调整后的p值<0.05)。
图26A至图26H显示了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的抗肿瘤活性。图26A显示了来自图12C中呈现的另外的CT26/WT处理组的Kaplan-Meier生存曲线。图26B显示了商业小鼠抗LTβR抗体的抗肿瘤活性。图26C显示了对继发性肿瘤的记忆免疫应答的评估结果。初次治疗后29天可用的小鼠在其相对侧腹接种了第二CT26肿瘤，随后不再进行再次治疗。随着时间的推移，对继发性肿瘤的生长进行评估，作为经治疗的动物中是否产生记忆免疫应答的指标。溶媒治疗组由接种了CT26肿瘤的新小鼠组成，作为肿瘤生长的参考。图26D显示了双阳性效应记忆T细胞(DEPC)。在再次攻毒的动物中，在第39天收集外周血，并使用流式细胞术评估双阳性效应记忆T细胞(DEPC)。图26E显示了解离肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的分析。在经治疗的动物队列中，在初次治疗后9天分离肿瘤，然后解离，并通过流式细胞术分析所得细胞。图26F显示了解离肿瘤中细胞因子的分析。使用Luminex多重阵列评估解离肿瘤上清液的细胞因子表达。图26G显示了来自在图12F中呈现的另外的B16.F10处理组的Kaplan-Meier生存曲线。图26H显示了在第-1天、第1天和第7天(外周血收集前)3次IP剂量的耗竭抗体后，第7天外周血中CD4/CD8 T细胞或NK细胞耗竭的流式细胞术分析。
图27A至图27D显示了来自CT26/AR模型的另外的活性和抗肿瘤功效数据。图27A显示了来自图12J中呈现的另外的CT26/AR处理组的Kaplan-Meier生活曲线。图27B显示了使用Clustal Omega多重序列比对，CD226和HVEM的细胞质部分的氨基酸比对。之前与DNAM-1的PD-1调节有关的残基用下划线标出。图27C显示了通过流式细胞术进行的TIL分析，显示抗原特异性CD8+T细胞(CD8+AH1四聚体+)占总CD3+单核细胞(MNC)的百分比。图27D显示了通过流式细胞术进行的TIL分析，显示了NK细胞(NKP46+)占总CD3-MNC的百分比。
图28A至图28C显示了在非人灵长类毒理学研究中TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的药效学活性。图28A显示了在从第一次给药前动物分离的并在CD45+CD3+CD8+T细胞上门控的外周血上示例性HVEM的流式细胞术表型分析。图28B显示了对于每只个体动物在所有剂量组中绘制的最大给药后细胞因子反应。使用阴影来突出剂量反应。图28C显示了对用mTIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗后9天收集的血清进行的小鼠血清细胞因子分析。
具体实施方式
本公开部分地基于以下发现：与抗PD-1疗法的抗性(获得性或原发性抗性)相关的某些功能的上调或下调，并且TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白或SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白对对抗PD-1疗法具有获得性或原发性抗性的癌症有效。令人惊讶的是，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与阻断PD-1/PD-L1轴的药剂的组合有效地抵抗对抗PD-1疗法具有获得性或原发性抗性的癌症。因此，这些结果确立了对抗PD-1疗法具有获得性或原发性抗性的癌症的疗法。
本公开部分地基于以下发现：高达40mg/kg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在非人灵长类动物(NHP)中是安全耐受的，并且用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗NHP诱导淋巴细胞扩增、淋巴细胞边缘化和特定的给药后细胞因子特征，没有细胞因子释放综合征的证据。
在实施方案中，这些结果建立了与抗PD-1疗法的获得性抗性和原发性抗性相关的生物标志物。因此，基于这些生物标志物，在本文公开的实施方案中，可以基于对来自患者的生物样品评价与本文公开的一种或多种基因本体(GO)通路相关的基因在该样品中的存在、不存在或水平，可以为患者选择采用抗PD-1疗法的治疗。例如，在实施方案中，观察到的与本文公开的各种GO功能相关的一种或多种基因的上调或下调可用于诊断对抗PD-1疗法的抗性(获得性或原发性抗性)。
本文公开的已经对PD-1抑制性抗体产生获得性抗性的肿瘤的单细胞RNA测序证明了转录过度活跃表型的渐进获得。具体而言，与亲代PD-1抗体敏感肿瘤相比，PD-1获得性抗性肿瘤中上调的转录本数量多于下调的转录本数量。这一观察表明，不希望受理论的束缚，获得性抗性是一个主动过程，其中在某些通路中上调基因的肿瘤细胞与那些不上调或下调总体转录活性的细胞相比获得了生存优势。因此，在实施方案中，具有对检查点抑制剂(包括PD-1或PD-L1阻断剂)的获得性抗性的肿瘤可能对具有以下通用结构的嵌合蛋白具有增加的敏感性：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
此外，本文提供的数据证明了，虽然获得性抗性肿瘤的特征是转录过度活跃表型，但许多上调的转录物并不伴随相应蛋白表达的增加。例如，与CD274(PD-L1)、β2巨球蛋白以及其他与干扰素敏感性和抗原呈递相关的转录物相关的基因在获得性抗性肿瘤中上调，但是PD-L1或β2巨球蛋白表达在获得性抗性肿瘤中的量没有相应增加。总之，这些发现尤其表明，获得性抗性肿瘤正试图上调许多关键基因，这些基因将驱动抗肿瘤免疫应答的敏感性增加，但在一种或多种转录后蛋白中获得性缺陷已经破坏了该应答。例如，PD-L1 mRNA水平的增加预计会转化为PD-L1蛋白水平的增加。因此，在实施方案中，包括以下的一种或多种过程的调节剂可能有所帮助，因为结合翻译后过程中的缺陷，以在对PD-1或PD-L1阻断剂产生抗性的癌细胞群中创建合成致死表型：蛋白翻译(例如，核糖体复合物的组装和/或功能、tRNA的充分表达和/或功能、氨基酸的充分合成和/或摄取等)，翻译后修饰(例如，用对功能或防止降解重要的碳水化合物修饰翻译的蛋白)或转运机制(例如，翻译后肽加工、信号肽识别和切割、通过ER/高尔基体网络转运等)。在实施方案中，所述类别的化学疗法可以用作新辅助疗法或辅助疗法。
嵌合蛋白
在一些方面，嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，其中I型膜蛋白是具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)，(b)是具有至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头(包括但不限于铰链-CH2-CH3 Fc结构域，源自人IgG4)，和(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该II型跨膜蛋白选自4-1BBL、GITRL、TL1A和LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域且任选地包含一个或多个如本文所述的连接接头，其中第一和第二胞外结构域之一是免疫抑制信号并且第一和第二胞外结构域之一是免疫刺激信号。示例性嵌合蛋白公开于WO2018157162，其全部内容通过引用并入本文。图10A中显示了示例性嵌合蛋白TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的分子模型，其以具有LIGHT三聚体功能组的六聚体存在。
在一些方面，嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，其中I型膜蛋白是信号调节蛋白α(SIRPα)，(b)是具有至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头(包括但不限于，铰链-CH2-CH3Fc结构域，源自人IgG4)，和(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该II型跨膜蛋白选自4-1BBL、CD40L、OX40L、CD30L和GITRL，其中接头连接第一结构域和第二结构域，并且任选地包含一个或多个如本文所述的连接接头，其中第一和第二胞外结构域之一是免疫抑制信号并且第一和第二胞外结构域之一是免疫刺激信号。示例性嵌合蛋白公开于WO2017/059168、WO 2018/157163、WO 2018/157164、WO 2018/157165、WO 2018/157162、WO2019/246508、WO 2020/047325、WO 2020/047327、WO 2020/047328、WO 2020/047329、WO2020/047319、WO 2020/047322、WO 2020/146393、WO 2020/176718、WO 2020/232365，其各自的内容通过引用以其整体并入本文。
在实施方案中，嵌合蛋白是指重组融合蛋白，例如具有本文所述的胞外结构域的单一多肽。例如，在实施方案中，嵌合蛋白被翻译为细胞中的单个单元。在实施方案中，嵌合蛋白是指例如在体外(例如，用一个或多个本文描述的合成接头)连接以产生单个单元的多个多肽(例如本文描述的多个胞外结构域)的重组蛋白。
在实施方案中，嵌合蛋白作为一个多肽被化学合成，或者每个结构域可以单独化学合成然后组合。在实施方案中，嵌合蛋白的一部分被翻译并且一部分被化学合成。
在实施方案中，胞外结构域是指跨膜蛋白的能够与胞外环境相互作用的部分。在实施方案中，胞外结构域是指足以结合配体或受体并有效地将信号传递至细胞的跨膜蛋白的一部分。在实施方案中，胞外结构域是跨膜蛋白在细胞或细胞膜外部的完整氨基酸序列。在实施方案中，胞外结构域是跨膜蛋白的氨基酸序列的一部分，该部分在细胞或细胞膜的外部并且是信号转导和/或配体结合所需要的，如可以使用本领域已知的方法(例如，体外配体结合和/或细胞激活测定)测定的。
在实施方案中，免疫抑制信号是指减弱或消除免疫应答的信号。例如，在肿瘤学背景下，此类信号可以减弱或消除抗肿瘤免疫力。在正常生理条件下，抑制信号可用于维持自我耐受(例如，预防自身免疫)，并且还可在免疫系统对病原体感染做出反应时保护组织免受损伤。例如但不限于，当免疫抑制信号被封闭时，可以通过检测细胞增殖、细胞因子产生、细胞杀伤活性或吞噬活性的增加来鉴定此类抑制信号。
在实施方案中，免疫刺激信号是指增强免疫应答的信号。例如，在肿瘤学背景下，此类信号可以增强抗肿瘤免疫力。例如但不限于，可以通过直接刺激白细胞的增殖、细胞因子产生、杀伤活性或吞噬活性来鉴定免疫刺激信号。具体实例包括使用受体激动剂抗体或使用编码此类受体的配体(分别为OX40L、LIGHT、4-1BBL、TL1A)的嵌合蛋白直接刺激TNF超家族受体，如OX40、LTβR、4-1BB或TNFRSF25。来自这些受体中任何一种的刺激都可能直接刺激个体T细胞亚群的增殖和细胞因子产生。另一个实例包括通过抑制此类免疫抑制细胞的活性的受体直接刺激免疫抑制细胞。这将包括，例如，用GITR激动剂抗体或含GITRL的嵌合蛋白刺激CD4+FoxP3+调节T细胞，这将降低这些调节T细胞阻抑常规CD4+或CD8+T细胞增殖的能力。在另一个实例中，这将包括使用CD40激动性抗体或含有CD40L的嵌合蛋白刺激抗原呈递细胞表面上的CD40，引起抗原呈递细胞的激活，包括这些细胞在适当天然共刺激分子(包括B7或TNF超家族中的那些)的情况下呈递抗原的能力增强。在另一个实例中，这将包括使用含LIGHT的嵌合蛋白刺激淋巴或基质细胞表面上的LTBR，引起淋巴细胞的激活和/或促炎细胞因子或趋化因子的产生以进一步刺激免疫应答，任选地在肿瘤内。
膜蛋白通常由胞外结构域、一个或一系列跨膜结构域和胞内结构域组成。不希望受理论束缚，膜蛋白的胞外结构域负责与可溶性或膜结合受体或配体相互作用。不希望受理论束缚，跨膜结构域负责将蛋白定位至质膜。不希望受理论束缚，膜蛋白的胞内结构域负责协调与细胞信号传导分子的相互作用，以协调胞内响应与胞外环境(或反之亦然)。有两种类型的单跨膜蛋白，即具有胞外氨基末端和胞内羧基末端的单跨膜蛋白(I型)和具有胞外羧基末端和胞内氨基末端的单跨膜蛋白(II型)。I型和II型膜蛋白都可以是受体或配体。对于I型膜蛋白，该蛋白的氨基末端面向细胞外，因此含有负责与细胞外环境中的其他结合配偶体(配体或受体)相互作用的功能结构域。对于II型膜蛋白，蛋白的羧基末端面向细胞外，因此含有负责与细胞外环境中的其他结合配偶体(配体或受体)相互作用的功能结构域。因此，这两种类型的蛋白质具有彼此相反的方向。
由于I型和II型膜蛋白的外向结构域是相反的，因此可以连接I型和II型膜蛋白的胞外结构域，使得分子的“外向”结构域也与彼此处于相反的方向。因此，所得的构建体将由分子“左”侧的I型膜蛋白的胞外结构域和使用接头序列连接至分子“右”侧的II型膜蛋白的胞外结构域组成。该构建体可以通过将这三个片段(I型蛋白的胞外结构域，随后是接头序列，随后是II型蛋白的胞外结构域)克隆到载体(质粒、病毒或其他)中来产生，其中完整序列的氨基末端对应于分子的含有I型蛋白的“左”侧，完整序列的羧基末端对应于分子的含有II型蛋白的“右”侧。因此，在实施方案中，本发明的嵌合蛋白被原样工程化。
在实施方案中，胞外结构域可用于产生可溶性蛋白以竞争性抑制该受体配体的信号传导。在实施方案中，胞外结构域可用于提供人工信号传导。
在实施方案中，I型跨膜蛋白的胞外结构域是免疫抑制信号。在实施方案中，II型跨膜蛋白的胞外结构域是免疫刺激信号。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含I型跨膜蛋白的胞外结构域或其功能片段。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含II型跨膜蛋白的胞外结构域或其功能片段。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含I型跨膜蛋白的胞外结构域或其功能片段，以及II型跨膜蛋白的胞外结构域或其功能片段。
调节T细胞的激活受到共刺激信号和共抑制信号的极大影响。共刺激分子的两个主要家族包括B7和肿瘤坏死因子(TNF)家族。这些分子分别与T细胞上属于CD28或TNF受体家族的受体结合。许多明确的共抑制剂及其受体属于B7和CD28家族。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可被工程化以靶向参与免疫抑制的一种或多种分子，包括例如TIGIT。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含免疫抑制剂的胞外结构域，包括例如TIGIT。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可被工程化以靶向参与免疫抑制的一种或多种分子，包括例如SIRPα。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含免疫抑制剂的胞外结构域，包括例如SIRPα。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含具有免疫抑制性质的I型膜蛋白的胞外结构域。在实施方案中，嵌合蛋白被工程化以破坏、封闭、减少和/或抑制免疫抑制信号的传递。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含为免疫刺激信号的LIGHT(CD258)的胞外结构域。
在实施方案中，嵌合蛋白模拟抑制信号配体与其同源受体(例如，TIGIT与CD155/PVR、连接蛋白-2、连接蛋白-3和/或连接蛋白-4)的结合，但抑制抑制信号传递至免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞或其他白细胞)。
在实施方案中，嵌合蛋白模拟抑制信号配体与其同源受体(例如，SIRPα与CD47)的结合，但抑制抑制信号传递至免疫细胞(例如，巨噬细胞的eat me信号、B细胞或其他吞噬细胞或抗原呈递细胞)。
在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制受体胞外结构域和免疫刺激配体胞外结构域，其可以但不限于向T细胞递送免疫刺激，同时掩蔽肿瘤细胞的免疫抑制信号。在实施方案中，嵌合蛋白递送具有T细胞激活的最终结果的信号。
在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制信号，其是免疫抑制信号受体的ECD并且这作用于带有免疫抑制信号的同源配体的肿瘤细胞。在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫刺激信号，其是免疫刺激信号的配体的ECD并且这作用于带有免疫刺激信号的同源受体的T细胞。在实施方案中，嵌合蛋白包含(i)免疫抑制信号，其是免疫抑制信号的受体并且这作用于带有免疫抑制信号的同源配体的肿瘤细胞，和(ii)免疫刺激信号，其是免疫刺激信号的配体并且这作用于带有免疫刺激信号的同源受体的T细胞。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含以下文献中描述的一种或多种免疫调节剂的胞外结构域：Mahoney,Nature Reviews Drug Discovery2015:14；561-585，其全部内容通过引用并入本文。
在实施方案中，嵌合蛋白能够结合鼠配体/受体。
在实施方案中，嵌合蛋白能够结合人配体/受体。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含具有免疫刺激性质的II型膜蛋白的胞外结构域。在实施方案中，嵌合蛋白被工程化以增强、增加和/或刺激免疫刺激信号的传递。
例如，在实施方案中，I型跨膜蛋白的胞外结构域来自TIGIT。
TIGIT是一种脊髓灰质炎病毒受体(PVR)样蛋白，是一种在T细胞上表达的免疫受体，含有免疫球蛋白和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)结构域。因此，TIGIT作为抑制性免疫检查点作用于T细胞和自然杀伤(NK)细胞，提供了靶向免疫系统的适应性和先天性分系统的机会。
TIGIT在NK细胞以及激活的、记忆和调节T细胞的亚群上表达，特别是在次级淋巴器官内的滤泡辅助T细胞上表达。CD155/PVR在内皮细胞上通过IFN-γ上调，并在未成熟胸腺细胞、淋巴结树突状细胞以及上皮和神经元来源的肿瘤细胞上高度表达。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含TIGIT ECD)调节上文刚刚描述的任何细胞(例如，在免疫突触的背景下)。
TIGIT结合CD155/PVR、连接蛋白-2、连接蛋白-3和连接蛋白-4。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含TIGIT ECD)调节TIGIT与CD155/PVR的结合(例如，减少或破坏结合或信号传递)。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含TIGIT ECD)调节TIGIT与连接蛋白-2的结合(例如，减少或破坏结合或信号传递)。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含TIGIT ECD)调节TIGIT与连接蛋白-3的结合(例如，减少或破坏结合或信号传递)。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含TIGIT ECD)调节TIGIT与连接蛋白-4的结合(例如，减少或破坏结合或信号传递)。
在实施方案中，嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，其中该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头(包括但不限于，铰链-CH2-CH3 Fc结构域，源自人IgG4)，和(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白选自4-1BBL、GITRL、TL1A和LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域且任选地包含一个或多个如本文所述的连接接头。
在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂TIGIT的胞外结构域并与如下免疫刺激剂配对：TIGIT/OX-40L；TIGIT/4-1BBL,TIGIT/LIGHT；TIGIT/GITRL；TIGIT/CD70；TIGIT/CD30L；TIGIT/CD40L；TIGIT/CD137L；TIGIT/TL1A；和TIGIT/OX40L。在实施方案中，嵌合蛋白是TIGIT-Fc-4-1BBL、TIGIT-Fc-GITRL、TIGIT-Fc-LIGHT、TIGIT-Fc-OX40L或TIGIT-Fc-TL1A嵌合蛋白，其中Fc代表接头，该接头包含抗体的Fc结构域的至少一部分并且包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。
例如，在实施方案中，II型跨膜蛋白的胞外结构域来自LIGHT。
LIGHT(HVEM-L、TNFSF14或CD258)是与淋巴毒素同源的实体，具有诱导性，能够与单纯疱疹病毒糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(herpes virus entry mediator，HVEM)/肿瘤坏死因子(TNF)相关2，是TNF超家族的成员。它是一种29-kDa的II型跨膜蛋白，作为同三聚体在激活的T细胞以及DC上表达，并具有三个受体，即HVEM、LT-β受体(LTβR，TNFRSF3)和诱饵受体3(DcR3)。不希望受理论束缚，已知具有不同细胞表达模式的三种受体与在激活的DC、T细胞和B细胞、NK细胞、单核细胞和内皮细胞上检测到的LIGHT:HVEM(TNFRSF14，CD270)；在滤泡DC和基质细胞上发现的并结合LIGHT的LTβR；在不同的癌细胞(如多发性骨髓瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)上检测的可溶性实体诱饵受体3(DcR3)相互作用。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以破坏或减少LIGHT与这三种受体中的一种或多种的相互作用。
LIGHT结合LTBR，并可能结合HVEM以及DcR3。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含LIGHT ECD)调节LIGHT与LTBR的结合(例如，增加或促进结合或信号传递)。LTBR被内脏细胞、淋巴细胞和其他基质细胞、上皮细胞和骨髓细胞表达，但不被淋巴细胞表达。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含LIGHT ECD)调节内脏细胞、淋巴细胞和其他基质细胞、上皮细胞和骨髓细胞中的一种或多种。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含LIGHT ECD)调节LIGHT与HVEM的结合(例如，增加或促进结合或信号传递)。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含LIGHT ECD)调节LIGHT与DcR3的结合(例如，增加或促进结合或信号传递)。
在实施方案中，4-1BBL的部分是4-1BBL胞外结构域的部分。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白进一步包含免疫刺激分子4-1BB配体(4-1BBL)的结构域，例如胞外结构域。4-1BBL是一种属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的II型跨膜蛋白。
在实施方案中，第二结构域是4-1BBL的一部分。在实施方案中，第二结构域包含4-1BBL的基本上所有的胞外结构域。在实施方案中，第二结构域能够结合4-1BB(也称为分化簇137(CD137)或肿瘤坏死因子配体超家族成员9(TNFSF9))。在实施方案中，与4-1BB的结合增加或激活免疫刺激信号。在实施方案中，与4-1BB的结合共刺激CD4和/或CD8 T细胞。4-1BBL也称为分化簇137配体(CD137L)。因此，在本公开通篇中，当单独提及时和/或当在嵌合蛋白的上下文中提及时，4-1BBL和CD137L是同义的，因此，例如，SIRPα-Fc-4-1BBL是与SIRPα-Fc-CD137L相同的嵌合蛋白。
4-1BB配体(4-1BBL)与激活的T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC)上的4-1BB受体结合。4-1BB信号传导被认为跟随由4-1BB+淋巴细胞和4-1BBL+抗原呈递细胞形成的免疫突触。例如，4-1BBL结合诱导B细胞增殖和免疫球蛋白产生。T细胞是主要的4-1BB表达细胞，并可以与巨噬细胞和/或APC上的4-1BBL结合以激活它们。CD8+T细胞通过4-1BB信号传导释放IL-13和IFN-γ。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含人4-1BBL的结构域，例如胞外结构域。人4-1BBL包含以下氨基酸序列：
MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE(SEQ ID NO:102)
人4-1BBL的胞外结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:102的氨基酸50-254)如下所示：
ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE(SEQ ID NO:13)
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含人4-1BBL的胞外结构域，其具有SEQ IDNO:13的氨基酸序列。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含如本文所述的4-1BBL的胞外结构域或其变体或功能片段。例如，嵌合蛋白可包含如上所提供的4-1BBL胞外结构域的序列，或其与本文描述的4-1BBL胞外结构域的氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的变体或功能片段。
4-1BBL衍生物可以从可用的结构数据构建，包括以下文献中描述的数据：Won等人,“The structure of the trimer of human 4-1BB ligand is unique among membersof the tumor necrosis factor superfamily.”J.Biol.Chem.285:9202–9210(2010)；Gilbreth等人,“Crystal structure of the human4-1BB/4-1BBL complex.”J Biol Chem293:9880-9891(2018)；和Bitra等人,“Crystal structures of the human 4-1BBreceptor bound to its ligand 4-1BBL reveal covalent receptor dimerization asa potential signaling amplifier.”J Biol Chem 293:9958-9969(2018)。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含4-1BBL的变体胞外结构域，其中信号肽(例如，如SEQ ID NO:59中提供的)被替代信号肽替换。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含4-1BBL的变体胞外结构域，其由cDNA表达，该cDNA已进行了密码子优化以在蛋白产生细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)或HEK细胞中表达。
在实施方案中，4-1BBL的胞外结构域是指能够与胞外环境相互作用的蛋白的一部分。在实施方案中，4-1BBL的胞外结构域是蛋白的细胞或细胞膜外部的完整氨基酸序列。在实施方案中，4-1BBL的胞外结构域是蛋白的位于细胞或细胞膜外部的氨基酸序列的一部分，并且是信号转导和/或配体结合所需要的，如可以使用本领域已知的方法测定的。
在实施方案中，4-1BBL的胞外结构域是指蛋白的能够结合4-1BB受体的一部分。与其他TNF超家族成员一样，膜结合4-1BBL以同三聚体形式存在。4-1BBL结合4-1BB，其是TNF受体超家族的成员，主要在抗原呈递细胞上表达。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白结合人4-1BB，其KD为小于约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约550nM、约530nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约55nM、约50nM、约45nM、约40nM、约35nM、约30nM、约25nM、约20nM、约15nM、约10nM、或约5nM、或约1nM(例如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法测量的)。在实施方案中，嵌合蛋白结合人4-1BB，其KD为小于约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约55pM约50pM、约45pM、约40pM、约35pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、或约10pM、或约1pM(例如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法测量的)。在实施方案中，嵌合蛋白以约300pM至约700pM的KD结合人4-1BB。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含：(1)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的第一结构域，(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第二结构域，和(c)包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113具有至少95％同一性的氨基酸序列的接头。
例如，在实施方案中，I型跨膜蛋白的胞外结构域来自信号调节蛋白α(SIRPα)。
信号调节蛋白α(SIRPα)是广泛表达的跨膜蛋白CD47的抑制性受体(也称为“不要吃我”(“don’t eat me”)信号)。SIRPα是主要由巨噬细胞和其他骨髓细胞表达的SIRP家族的一种调节膜糖蛋白。
SIRPα和CD47的相互作用导致抑制吞噬细胞突触的膜下组装位点的肌球蛋白积累的酪氨酸磷酸酶的激活，从而阻断吞噬作用。因此，CD47对于健康的自身细胞来说作为一个“不要吃我信号”起作用；因此，CD47的缺失会导致衰老或受损细胞的吞噬作用。利用CD47提供的这种抗吞噬信号，许多类型的肿瘤过度表达这种蛋白，从而避免巨噬细胞的吞噬作用并有助于癌细胞的生存。SIRPα结合CD47。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含SIRPαECD)调节SIRPα与CD47的结合(例如，减少或破坏结合或信号传递)。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白(例如，包含SIRPαECD)调节上文刚刚描述的任何细胞(例如，在免疫突触的背景下)。
在实施方案中，本发明的方法中使用的嵌合蛋白包含人SIRPα(CD172a)的胞外结构域，其包含以下氨基酸序列：
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIY(SEQ ID NO:7)。
在实施方案中，本发明的方法中使用的嵌合蛋白包含SIRPα(CD172a)的胞外结构域的变体。作为实例，变体可具有与SEQ ID NO:7至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的序列同一性。
在实施方案中，SIRPα(CD172a)的胞外结构域的变体具有与SEQ ID NO:7至少约95％的序列同一性。
普通技术人员可以通过查阅文献来选择SIRPα(CD172a)的已知氨基酸序列的变体，例如LEE,等人,"Novel Structural Determinants of SIRPαthat Mediate Bindingof CD47,"The Journal of Immunology,179,7741-7750,2007和HATHERLEY,等人,"TheStructure of the Macrophage Signal Regulatory Protein a(SIRPα)InhibitoryReceptor Reveals a Binding Face Reminiscent of That Used by T CellReceptors,"The Journal Of Biological Chemistry,Vol.282,No.19,pp.14567-14575,2007，每一篇均通过引用以其整体并入。
在实施方案中，异源嵌合蛋白包含基本上包含SIRPα(CD172a)的整个胞外结构域的第一结构域，和/或基本上包含4-1BBL的整个胞外结构域的第二结构域。在实施方案中，第一结构域基本上包含SIRPα(CD172a)的整个胞外结构域。在实施方案中，第二结构域基本上包含4-1BBL的整个胞外结构域。
在实施方案中，嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头(包括但不限于，源自人IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域)，并且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白选自4-1BBL、GITRL、TL1A和LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个如本文所述的连接接头。
在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂SIRPα的胞外结构域并与如下免疫刺激剂配对：CD172a(SIRPα)/OX-40L；CD172a(SIRPα)/4-1BBL；CD172a(SIRPα)/LIGHT；CD172a(SIRPα)/GITRL；CD172a(SIRPα)/CD70；CD172a(SIRPα)/CD30L；CD172a(SIRPα)/CD40L；CD172a(SIRPα)/CD137L；CD172a(SIRPα)/TL1A；和CD172a(SIRPα)/OX40L。在实施方案中，嵌合蛋白是SIRPα-Fc-4-1BBL、SIRPα-Fc-GITRL、SIRPα-Fc-LIGHT、SIRPα-Fc-OX40L或SIRPα-Fc-TL1A，其中Fc代表包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。
在实施方案中，嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白选自PD-1、CD172a(SIRPα)和TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头(包括但不限于，源自人IgG4的铰链-CH2-CH3Fc结构域)，并且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白质是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个如本文所述的连接接头。
在实施方案中，嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白选自CD172a(SIRPα)，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头(包括但不限于，源自人IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域)，并且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个如本文所述的连接接头。
在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫刺激剂LIGHT的胞外结构域并与如下免疫抑制剂配对：PD-1/LIGHT、CD172a(SIRPα)/LIGHT和TIGIT/LIGHT。在实施方案中，嵌合蛋白是PD-1-Fc-LIGHT、CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白，其中Fc表示包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。
在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫刺激剂LIGHT的胞外结构域并与如下免疫抑制剂配对：CD172a(SIRPα)/OX-40L；CD172a(SIRPα)/4-1BBL；CD172a(SIRPα)/LIGHT；CD172a(SIRPα)/GITRL；CD172a(SIRPα)/CD70；CD172a(SIRPα)/CD30L；CD172a(SIRPα)/CD40L；CD172a(SIRPα)/CD137L；CD172a(SIRPα)/TL1A；和CD172a(SIRPα)/OX40L。在实施方案中，嵌合蛋白是CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL、CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L、CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT和CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L，其中Fc代表包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂的胞外结构域并与免疫刺激剂配对。在实施方案中，嵌合蛋白以约1nM至约5nM，例如约1nM、约1.5nM、约2nM、约2.5nM、约3nM、约3.5nM、约4nM、约4.5nM或约5nM的KD结合同源受体或配体。在实施方案中，嵌合蛋白以约5nM至约15nM，例如约5nM、约5.5nM、约6nM、约6.5nM、约7nM、约7.5nM、约8nM、约8.5nM、约9nM、约9.5nM、约10nM、约10.5nM、约11nM、约11.5nM、约12nM、约12.5nM、约13nM、约13.5nM、约14nM、约14.5nM或约15nM的KD结合同源受体或配体。
在实施方案中，嵌合蛋白表现出增强的稳定性和蛋白半衰期。在实施方案中，嵌合蛋白以高亲和力结合FcRn。在实施方案中，嵌合蛋白可以以约1nM至约80nM的KD结合FcRn。例如，嵌合蛋白可以以约1nM、约2nM、约3nM、约4nM、约5nM、约6nM、约7nM、约8nM、约9nM、约10nM、约15nM、约20nM、约25nM、约30nM、约35nM、约40nM、约45nM、约50nM、约55nM、约60nM、约65nM、约70nM、约71nM、约72nM、约73nM、约74nM、约75nM、约76nM、约77nM、约78nM、约79nM或约80nM的KD结合FcRn。在一个实施方案中，嵌合蛋白可以以约9nM的KD结合FcRn。在实施方案中，嵌合蛋白基本上不与具有效应物功能的其他Fc受体(即除了FcRn之外)结合。
在实施方案中，提供了一种通过向受试者施用CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT、PD-1-Fc-LIGHT、CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白中的一种或多种来治疗癌症和/或炎性疾病(例如，本文别处描述的那些中的任一种)的方法，其中Fc代表包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。在实施方案中，该方法生成可以例如能够防止复发的记忆响应。在实施方案中，该方法包括PD-1-Fc-LIGHT、CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白中的一种或多种的持续治疗作用，例如，归因于以缓慢的解离速率(Kd或Koff)结合细胞外结构域组分与其各自的结合配偶体，以任选地提供持续的负信号掩蔽效应和/或更长的正信号效应，例如，以允许效应细胞被充分刺激以达到抗肿瘤作用。在实施方案中，提供了通过向受试者施用CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL、CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L、CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT和CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L嵌合蛋白中的一种或多种来治疗癌症和/或炎性疾病(例如，本文别处描述的那些中的任一种)的方法，其中Fc代表包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。
在实施方案中，提供了通过向受试者施用一种或多种嵌合蛋白来治疗癌症或炎性疾病(例如，本文别处描述的那些疾病中的任一种)的方法。在实施方案中，提供了通过向受试者施用CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL、CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L、CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT和CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L嵌合蛋白中的一种或多种来治疗癌症和/或炎性疾病(例如，本文别处描述的那些中的任一种)的方法，其中Fc代表包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。嵌合蛋白中的Fc代表包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。在实施方案中，该方法生成可以例如能够防止复发的记忆响应。在实施方案中，该方法包括TIGIT-Fc-4-1BBL、TIGIT-Fc-GITRL、TIGIT-Fc-TL1A和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白中的一种或多种的持续治疗作用，例如，由于以缓慢的解离速率(Kd或Koff)结合细胞外结构域组分与其各自的结合配偶体，以任选地提供持续的负信号掩蔽效应和/或更长的正信号效应，例如，以允许效应细胞被充分刺激以达到抗肿瘤作用。
在实施方案中，提供了一种通过向受试者施用一种或多种嵌合蛋白来治疗癌症或炎性疾病(例如，本文别处描述的那些疾病中的任何一种)的方法。在实施方案中，提供了一种通过向受试者施用CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL、CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L、CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT和CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L嵌合蛋白中的一种或多种来治疗癌症和/或炎性疾病(例如，本文别处描述的那些疾病中的任何一种)的方法，其中Fc代表包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。嵌合蛋白中的Fc代表包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。在实施方案中，该方法生成可以例如能够防止复发的记忆响应。在实施方案中，该方法包括一种或多种嵌合蛋白的持续治疗作用。在实施方案中，提供了一种通过向受试者施用CD172a(SIRPα)-Fc-4-1BBL、CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L、CD172a(SIRPα)/-Fc-LIGHT和CD172a(SIRPα)-Fc-CD30L嵌合蛋白中的一种或多种来治疗癌症和/或炎性疾病(例如，本文别处描述的那些中的任一种)的方法，其中Fc代表包含抗体的Fc结构域的至少一部分的接头，并且其包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基，例如，由于以缓慢的解离速率(Kd或Koff)结合细胞外结构域组分与其各自的结合配偶体，以任选地提供持续的负信号掩蔽效应和/或更长的正信号效应，例如，以允许效应细胞被充分刺激以达到抗肿瘤作用。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以包含本文所述的胞外结构域的变体，例如与任何所公开的胞外结构域(例如人胞外结构域)的已知氨基酸或核酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％)的序列同一性的序列，例如SEQ ID NO:2、4、7、10、13、16、19、22、25、27、29、31、37、41或103中的一个或多个。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含LIGHT的胞外结构域(SEQ ID NO:2)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含PD-1的胞外结构域(SEQ ID NO:4)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域(SEQ ID NO:10)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含CD172a(SIRPα)的胞外结构域(SEQ ID NO:7)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含4-1BBL的胞外结构域(SEQ ID NO:13)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含CD172a(SIRPα)的胞外结构域(SEQ ID NO:7)和4-1BBL的胞外结构域(SEQ ID NO:13)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含LIGHT的胞外结构域(SEQ ID NO:2)和PD-1的胞外结构域(SEQ ID NO:4)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含LIGHT的胞外结构域(SEQ ID NO:2)和TIGIT的胞外结构域(SEQ ID NO:10)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含LIGHT的胞外结构域(SEQ ID NO:2)和CD172a(SIRPα)的胞外结构域(SEQ ID NO:7)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:46、47或48)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:46、47或48)，并且该序列侧翼为至少一个选自以下的连接接头：SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)、SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)、IEGRMD SEQ ID NO:52(任选地SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)或SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)是N末端且IEGRMD SEQ IDNO:52之一是C末端)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含来自人IgG1抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:112、113)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含来自人IgG1抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:112、113)，并且该序列侧翼为至少一个选自以下的连接接头：SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)、SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)、IEGRMD SEQ ID NO:52(任选地，SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)或SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)是N末端，而IEGRMD SEQ IDNO:52之一是C末端)
在实施方案中，嵌合蛋白包含模块接头。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含LIGHT的胞外结构域和PD-1的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头(这种PD-1-Fc-LIGHT嵌合体是SEQ ID NO:5)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含LIGHT的胞外结构域和TIGIT的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头(这种TIGIT-Fc-LIGHT嵌合体是SEQ ID NO:11)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域和LIGHT的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头。在实施方案中，人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合体具有以下序列(人TIGIT的胞外结构域(ECD)以下划线表示，变体IgG4 CH2-CH3-Fc结构域以斜体字体显示，连接接头以粗体字体显示，并且人LIGHT的胞外结构域(ECD)以下划线斜体字体表示)：
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域和LIGHT的胞外结构域，使用来自人IgG1抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头，该蛋白在本文中也称为TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT嵌合蛋白。在实施方案中，人TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT嵌合体具有以下序列(人TIGIT的胞外结构域(ECD)以下划线表示，源自IgG1的CH2-CH3-Fc结构域用斜体字体显示，连接接头以粗体字体显示，人LIGHT的细胞外结构域(ECD)以下划线斜体字体表示)：
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT胞外结构域和LIGHT胞外结构域，使用来自人IgG1抗体序列的铰链-CH2-CH3域作为接头。在实施方案中，人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合体具有以下序列(人TIGIT的胞外结构域(ECD)以下划线表示，变体IgG1 CH2-CH3-Fc结构域(IgG1-LALA)以斜体字体显示，其中几个突变以粗体字体表示，连接接头是以粗体字体显示，人LIGHT的胞外结构域(ECD)以下划线斜体字体表示)：
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含小鼠TIGIT的胞外结构域和小鼠LIGHT的胞外结构域，使用来自小鼠IgG1抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头。在实施方案中，小鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合体具有以下序列(小鼠TIGIT的胞外结构域(ECD)以下划线表示，变体IgG1 CH2-CH3-Fc结构域以斜体字体显示，其中几个突变以粗体字体显示，连接接头以粗体字体显示，小鼠LIGHT的胞外结构域(ECD)以下划线斜体字体表示)：
在实施方案中，本发明的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白可以是本文所述的变体，例如，本发明的嵌合蛋白可以具有与SEQ ID NO:11、109和110之一的氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的序列。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含SIRPα的胞外结构域和4-1BBL的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头。在实施方案中，人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合体具有以下序列(SIRPα的胞外结构域(ECD)以下划线表示，变体IgG4 CH2-CH3-Fc结构域以斜体字体显示，连接接头以粗体字体显示，4-1BBL的胞外结构域(ECD)以下划线斜体字体表示)：
在实施方案中，小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合体具有以下序列(SIRPα的胞外结构域(ECD)以下划线表示，小鼠IgG1 CH2-CH3-Fc结构域以斜体字体显示，连接接头以粗体字体显示，并且4-1BBL的胞外结构域(ECD)以下划线斜体字体表示)：
/>
在实施方案中，本发明的SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白可以是本文所述的变体，例如，本发明的嵌合蛋白可以具有与SEQ ID NO:103的氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的序列。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含LIGHT的胞外结构域和CD172a(SIRPα)的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头(这种CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT嵌合体是SEQ ID NO:8)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域(SEQ ID NO:10)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含4-1BBL的胞外结构域(SEQ ID NO:13)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含GITRL的胞外结构域(SEQ ID NO:16)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TL1A的胞外结构域(SEQ ID NO:19)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含LIGHT的胞外结构域(SEQ ID NO:2)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含OX40L的胞外结构域(SEQ ID NO:22)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域(SEQ ID NO:10)和4-1BBL的胞外结构域(SEQ ID NO:13)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域(SEQ ID NO:10)和GITRL的胞外结构域(SEQ ID NO:16)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域(SEQ ID NO:10)和TL1A的胞外结构域(SEQ ID NO:19)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域(SEQ ID NO:10)和LIGHT的胞外结构域(SEQ ID NO:2)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域(SEQ ID NO:10)和OX40L的胞外结构域(SEQ ID NO:22)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含CD172a(SIRPα)的胞外结构域(SEQ ID NO:7)和4-1BBL的胞外结构域(SEQ ID NO:13)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含CD172a(SIRPα)的胞外结构域(SEQ ID NO:7)和GITRL的胞外结构域(SEQ ID NO:16)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含CD172a(SIRPα)的胞外结构域(SEQ ID NO:7)和TL1A的胞外结构域(SEQ ID NO:19)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含CD172a(SIRPα)的胞外结构域(SEQ ID NO:7)和LIGHT的胞外结构域(SEQ ID NO:2)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含CD172a(SIRPα)的胞外结构域(SEQ ID NO:7)和OX40L的胞外结构域(SEQ ID NO:22)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:46、47或48)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含来自人IgG1抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:112或113)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:46、47或48)，并且该序列侧翼有至少一个选自以下的连接接头：SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)、SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)、IEGRMD SEQ ID NO:52(任选地，SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)或SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)是N末端，且IEGRMD SEQID NO:52之一是C末端)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含来自人IgG1抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:112或113)，并且该序列侧翼有至少一个选自以下的连接接头：SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)、SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)、IEGRMD SEQ ID NO:52(任选地，SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)或SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)是N末端，且IEGRMD SEQ IDNO:52之一是C末端)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域和4-1BBL的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头(这种TIGIT-Fc-4-1BBL嵌合体是SEQ ID NO:14)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域和GITRL的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头(这种TIGIT-Fc-GITRL嵌合体是SEQ ID NO:17)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域和TL1A的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头(这种TIGIT-Fc-TL1A嵌合体是SEQ ID NO:20)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域和LIGHT的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头(这种TIGIT-Fc-LIGHT嵌合体是SEQ ID NO:11)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含TIGIT的胞外结构域和QX40L的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3结构域作为接头(这种TIGIT-Fc-OX40L嵌合体是SEQ ID NO:23)。
在实施方案中，本公开的嵌合蛋白包含CD172a(SIRPα)的胞外结构域和4-1BBL的胞外结构域，使用来自人IgG4抗体序列的铰链-CH2-CH3域作为接头(这种CD172a(SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合体是SEQ ID NO:103)。
在实施方案中，嵌合蛋白可包含来自本文鉴定的序列的胞外结构域与来自本文鉴定的另一序列的胞外结构域的组合。例如，TIGIT-Fc-TL1A嵌合蛋白的序列可包括如上文SEQ ID NO:10中公开的TIGIT的胞外结构域和如上文SEQ ID NO:19中公开的TL1A的胞外结构域。
在实施方案中，另外的嵌合蛋白和方法使用另外的嵌合蛋白(例如，在治疗癌症和/或治疗炎性疾病中)：TIGIT-Fc-4-1BBL、TIGIT-Fc-CD30L、TIGIT-Fc-FasL、TIGIT-Fc-GITRL、TIGIT-Fc-TL1A和TIGIT-Fc-TRAIL。4-1BBL、CD30L、FasL、GITRL、TL1A和TRAIL的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:12、26、30、15、18和40。4-1BBL、CD30L、FasL、GITRL、TL1A和TRAIL的胞外结构域的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:13、27、31、16、19和41。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以是本文所述的变体，例如，本发明的嵌合蛋白可以具有与本发明的嵌合蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:5、8、11、14、17、20、23、42、43、44、45或103中的一个或多个)具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的序列同一性的序列。
在实施方案中，嵌合蛋白可包含相对于本文所述的任何蛋白序列具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在实施方案中，一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。
在实施方案中，氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
“保守取代”可以例如基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。20种天然存在的氨基酸可分为以下六个标准氨基酸组：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
如本文所用，“保守取代”被定义为一个氨基酸被上文所示六个标准氨基酸组中的同一组中列出的另一个氨基酸交换。例如，用Glu交换Asp在这样修饰的多肽中保留一个负电荷。此外，甘氨酸和脯氨酸基于它们破坏α-螺旋的能力可以相互取代。
如本文所用，“非保守取代”被定义为一个氨基酸被上文所示六个标准氨基酸组(1)至(6)中的不同组中列出的另一个氨基酸交换。
在实施方案中，取代还可以包括非经典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸、设计师氨基酸(designer amino acid)如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物)。
也可以参考遗传密码，包括考虑密码子简并性，对嵌合蛋白的核苷酸序列进行突变。
在实施方案中，嵌合蛋白包含接头。在实施方案中，接头包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。如本文别处所述，不希望受理论束缚，此类至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基负责维持嵌合蛋白的适当多聚体状态并允许有效生产。
在实施方案中，接头可以源自天然存在的多结构域蛋白或者是如例如以下文献中所述的经验接头：Chichili等人,(2013),Protein Sci.22(2):153-167，Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369，其全部内容通过引用并入本文。在实施方案中，可以使用接头设计数据库和计算机程序来设计接头，例如以下文献中描述的那些：Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369以及Crasto等人,(2000),ProteinEng.13(5):309-312，其全部内容通过引用并入本文。
在实施方案中，接头是合成接头，如PEG。
在实施方案中，接头是多肽。在实施方案中，接头为小于约500个氨基酸长、约450个氨基酸长、约400个氨基酸长、约350个氨基酸长、约300个氨基酸长、约250个氨基酸长、约200个氨基酸长、约150个氨基酸长、或约100个氨基酸长。例如，接头可以为少于约100个、约95个、约90个、约85个、约80个、约75个、约70个、约65个、约60个、约55个、约50个、约45个、约40个、约35个、约30个、约25个、约20个、约19个、约18个、约17个、约16个、约15个、约14个、约13个、约12个、约11个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个、约5个、约4个、约3个或约2个氨基酸长。在实施方案中，接头是柔性的。在另一个实施方案中，接头是刚性的。
在实施方案中，接头基本上由甘氨酸和丝氨酸残基(例如，约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％、或约98％、或约99％、或约100％的甘氨酸和丝氨酸)组成。
在实施方案中，接头是抗体(例如，IgG、IgA、IgD和IgE，包括亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2))的铰链区。在IgG、IgA、IgD和IgE类抗体中发现的铰链区充当柔性间隔子，允许Fab部分在空间中自由移动。与恒定区相反，铰链结构域在结构上是多样的，在免疫球蛋白类别和亚类之间的序列和长度上都不同。例如，铰链区的长度和柔性因IgG亚类而异。IgG1的铰链区包含氨基酸216-231，并且因为它是自由柔性的，Fab片段可以绕其对称轴旋转并在以两个重链间二硫桥中的第一个为中心的球体内移动。IgG2的铰链比IgG1短，具有12个氨基酸残基和四个二硫桥。IgG2的铰链区缺少甘氨酸残基，相对较短，并含有刚性聚脯氨酸双螺旋，由额外的重链间二硫桥稳定。这些性质限制了IgG2分子的柔性。IgG3与其他亚类的不同之处在于其独特的延伸铰链区(大约是IgG1铰链的四倍)，含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成刚性聚脯氨酸双螺旋。在IgG3中，Fab片段距离Fc片段相对较远，使分子具有更大的柔性。与其他亚类相比，IgG3中的细长铰链也是其较高分子量的原因。IgG4的铰链区比IgG1短，其柔性介于IgG1和IgG2之间。据报道，铰链区的柔性按IgG3>IgG1>IgG4>IgG2的顺序降低。在实施方案中，接头可源自人IgG4并含有一个或多个突变以增强二聚化(包括S228P)或FcRn结合。
根据晶体学研究，免疫球蛋白铰链区在功能上可进一步细分为三个区域：上铰链区、核心区和下铰链区。参见Shin等人，1992Immunological Reviews 130:87。上铰链区包括从CH1的羧基端到限制运动的铰链中第一个残基(通常是在两条重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基)的氨基酸。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区包含重链间二硫桥，下铰链区连接CH2结构域的氨基末端并包括CH2中的残基。同上。野生型人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其在通过形成二硫键而二聚化时得到环状八肽，该环状八肽被认为充当枢轴，从而赋予柔性。在实施方案中，本发明的接头包含任何抗体(例如，IgG、IgA、IgD和IgE，包括亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2))的上铰链区、核心区和下铰链区中的一个、或两个或三个。铰链区还可以含有一个或多个糖基化位点，其包括许多结构上不同的类型的碳水化合物连接位点。例如，IgA1在铰链区的17个氨基酸片段中含有五个糖基化位点，赋予铰链区多肽对肠蛋白酶的抗性，这被认为是分泌性免疫球蛋白的有利性质。在实施方案中，本公开的接头包含一个或多个糖基化位点。
在实施方案中，接头包含抗体(例如，IgG、IgA、IgD和IgE，包括亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4以及IgA1和IgA2))的Fc结构域。在实施方案中，接头包含源自人IgG4抗体的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。在实施方案中，接头包含源自人IgG1抗体的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。在实施方案中，Fc结构域表现出增加的对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力和增强的结合。在实施方案中，Fc结构域包括增加亲和力并增强与FcRn的结合的一个或多个突变。不希望受理论束缚，据信增加的亲和力和增强的与FcRn的结合增加了本发明的嵌合蛋白的体内半衰期。
在实施方案中，Fc结构域接头在氨基酸残基250、252、254、256、308、309、311、416、428、433或434(根据Kabat编号，如在Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)中所述的，该文献明确通过引用并入本文)或其等同物处包含一个或多个氨基酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基250处的氨基酸取代是谷氨酰胺取代。在一个实施方案中，氨基酸残基252处的氨基酸取代为酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或苏氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基254处的氨基酸取代为苏氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基256处的氨基酸取代为丝氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或苏氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基308处的氨基酸取代为苏氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基309处的氨基酸取代为脯氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基311处的氨基酸取代为丝氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基385处的氨基酸取代为精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基386处的氨基酸取代是苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基387处的氨基酸取代为精氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基389处的氨基酸取代为脯氨酸、丝氨酸或天冬酰胺取代。在一个实施方案中，氨基酸残基416处的氨基酸取代是亮氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基428处的氨基酸取代是丝氨酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基433处的氨基酸取代为精氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或谷氨酰胺取代。在一个实施方案中，氨基酸残基434处的氨基酸取代为组氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸取代。
在实施方案中，Fc结构域接头(例如，包含IgG恒定区)包含一个或多个突变，例如氨基酸残基252、254、256、433、434或436(根据Kabat编号，如在Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中所述的，该文献明确通过引用并入本文)处的取代。在一个实施方案中，IgG恒定区包括三重M252Y/S254T/T256E突变或YTE突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包括三重H433K/N434F/Y436H突变或KFH突变。在又一个实施方案中，IgG恒定区包括组合的YTE和KFH突变。
在实施方案中，本发明的修饰的人源化抗体包含IgG恒定区，其在氨基酸残基250、253、307、310、380、416、428、433、434和435处含有一个或多个突变。示例性突变包括T250Q、M428L、T307A、E380A、I253A、H310A、R416S、M428L、H433K、N434A、N434F、N434S和H435A。在一个实施方案中，IgG恒定区包含M428L/N434S突变或LS突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含T250Q/M428L突变或QL突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含N434A突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含T307A/E380A/N434A突变或AAA突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含I253A/H310A/H435A突变或IHH突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含H433K/N434F突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含组合的M252Y/S254T/T256E和H433K/N434F突变。
IgG恒定区中的另外的示例性突变描述于例如Robbie等人，AntimicrobialAgents and Chemotherapy(2013),57(12):6147-6153；Dall’Acqua等人，JBC(2006),281(33):23514-24；Dall’Acqua等人，Journal of Immunology(2002),169:5171-80；Ko等人，Nature(2014)514:642-645；Grevys等人，Journal of Immunology.(2015),194(11):5497-508；和美国专利号7,083,784，其全部内容通过引用并入本文。
在实施方案中，接头包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，对SEQ ID NO:46进行突变以增加稳定性和/或半衰期。例如，在实施方案中，接头具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的氨基酸列。在实施方案中，接头包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，接头包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，对SEQ ID NO:113进行突变以增加稳定性和/或半衰期。例如，在实施方案中，接头具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，接头包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。
不希望受理论束缚，在嵌合蛋白中包括包含至少部分Fc结构域的接头有助于避免形成不溶性且可能无功能的蛋白多联体和/或聚集体。这部分是由于Fc结构域中存在半胱氨酸，半胱氨酸能够在嵌合蛋白之间形成二硫键。
示例性的Fc稳定突变体是S228P。示例性的Fc半衰期延长突变体是T250Q、M428L、V308T、L309P和Q311S，并且本发明的接头可包含这些突变体中的1个、或2个、或3个、或4个或5个。
此外，可以采用一个或多个连接接头来连接接头(例如，SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性中的一个)中的Fc结构域和胞外结构域。例如，SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54中的任一个或其变体可以连接如本文所述的胞外结构域和如本文所述的接头。任选地，SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54中的任一个或其变体在如本文所述的胞外结构域和如本文所述的接头之间被置换。任选地，SEQID NO:49至95中的任一个或其变体位于如本文所述的胞外结构域和如本文所述的Fc结构域之间。在实施方案中，嵌合蛋白包含Fc结构域之前的一个连接接头和Fc结构域之后的第二连接接头；因此，嵌合蛋白可以包含以下结构：
ECD 1–连接接头1–Fc结构域–连接接头2–ECD 2。
在实施方案中，第一和第二连接接头可以不同或者它们可以相同。
示例性接头的氨基酸序列提供于下表1中：
表1：示例性接头(Fc结构域接头和连接接头)
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另外的示例性连接接头包括但不限于具有以下序列的接头：LE、GGGGS(SEQ IDNO:70)、(GGGGS)n(n＝1-4)(SEQ ID NO:70-73)、(Gly)8(SEQ ID NO:79)、(Gly)6(SEQ IDNO:80)、(EAAAK)n(n＝1-3)(SEQ ID NO:81-83)、A(EAAAK)nA(n＝2-5)(SEQ ID NO:84-87)、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:84)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQ ID NO:88)、PAPAP(SEQ IDNO:89)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:90)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:57)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:91)和(XP)n，其中X表示任何氨基酸，例如Ala、Lys或Glu。
在实施方案中，连接接头基本上由甘氨酸和丝氨酸残基(例如，约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％、或约98％、或约99％、或约100％的甘氨酸和丝氨酸)组成。例如，在实施方案中，连接接头是(Gly4Ser)n，其中n是约1至约8，例如1、2、3、4、5、6、7或8(分别为SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:77)。在实施方案中，连接接头序列是GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:78)。另外的示例性连接接头包括但不限于具有以下序列的接头：LE、(Gly)8(SEQ ID NO:79)、(Gly)6(SEQ ID NO:80)、(EAAAK)n(n＝1-3)(SEQ ID NO:81-SEQ ID NO:83)、A(EAAAK)nA(n＝2-5)(SEQ ID NO:84–SEQ IDNO:87)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQ ID NO:88)、PAPAP(SEQ ID NO:89)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:90)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:91)和(XP)n，其中X表示任何氨基酸，例如Ala、Lys或Glu。在实施方案中，连接接头是GGS。
在实施方案中，连接接头是GGGSE(SEQ ID NO:92)、GSESG(SEQ ID NO:93)、GSEGS(SEQ ID NO:94)、GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGGSEGGS(SEQ ID NO:95)和每4个氨基酸间隔随机放置G、S和E的连接接头中的一种或多种。
在实施方案中，嵌合蛋白包含模块接头。
在实施方案中，接头可以是柔性的，包括但不限于高度柔性。在实施方案中，接头可以是刚性的，包括但不限于刚性α螺旋。
在实施方案中，接头可以是功能性的。例如但不限于，接头可以起到改善本发明的嵌合蛋白的折叠和/或稳定性、改善表达、改善药代动力学和/或改善生物活性的作用。在另一个实例中，接头可以起到将嵌合蛋白靶向特定细胞类型或位置的作用。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够促进免疫激活(例如，抗肿瘤)并且可以用于包括促进免疫激活(例如，抗肿瘤)的方法中。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够阻抑免疫抑制(例如，允许肿瘤存活)，并且可以用于包括阻抑免疫抑制(例如，允许肿瘤存活)的方法中。在实施方案中，由于构建体的嵌合性质提供的信号传导的接近性，本发明的嵌合蛋白提供了改善的免疫激活和/或改善的免疫抑制阻抑。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够调节免疫应答的幅度，例如调节效应物输出水平或可以用于包括调节免疫应答的幅度、例如调节效应物输出水平的方法中。在实施方案中，例如，当用于治疗癌症时，与免疫抑制相比，本发明的嵌合蛋白改变免疫刺激的程度，以增加T细胞应答的幅度，包括但不限于刺激细胞因子产生水平的增加，增殖或靶向杀伤潜力。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够掩蔽肿瘤细胞表面上的抑制性配体并用免疫刺激性配体替换该免疫抑制性配体或可用于涉及掩蔽肿瘤细胞表面上的抑制性配体并用免疫刺激性配体替换该免疫抑制性配体的方法。因此，在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够减少或消除抑制性免疫信号和/或增加或激活免疫刺激信号或在可用于涉及减少或消除抑制性免疫信号和/或增加或激活免疫刺激信号的方法中发现用途。例如，携带抑制信号(并因此逃避免疫应答)的肿瘤细胞可以被在T细胞上的阳性信号结合取代，然后T细胞可以攻击肿瘤细胞。因此，在实施方案中，抑制性免疫信号被本发明的构建体掩蔽而刺激性免疫信号被激活。本发明的嵌合蛋白的单一构建体方法增强了此类有益性质。例如，信号替换可以几乎同时实现，并且信号替换被定制为在具有临床重要性的部位(例如，肿瘤微环境)局部进行。其他实施方案将相同原理应用于其他嵌合蛋白构建体，例如(i)TIGIT的胞外结构域和(ii)4-1BBL的胞外结构域；(i)TIGIT的胞外结构域和(ii)GITRL的胞外结构域；(i)TIGIT的胞外结构域和(ii)TL1A的胞外结构域；(i)TIGIT的胞外结构域和(ii)LIGHT的胞外结构域；和(i)PD-1的胞外结构域和(ii)LIGHT的胞外结构域；和(i)CD172a(SIRPα)的胞外结构域和(ii)LIGHT的胞外结构域；和(i)TIGIT的胞外结构域和(ii)LIGHT的胞外结构域；(i)CD172a(SIRPα)的胞外结构域和(ii)4-1BBL的胞外结构域；(i)CD172a(SIRPα)的胞外结构域和(ii)GITRL的胞外结构域；(i)CD172a(SIRPα)的胞外结构域和(ii)TLIA的胞外结构域；(i)CD172a(SIRPα)的胞外结构域和(ii)LIGHT的胞外结构域；(i)PD-1的胞外结构域和(ii)LIGHT的胞外结构域；和(i)CD172a(SIRPα)的胞外结构域和(ii)LIGHT的胞外结构域；以及(i)CD172a(SIRPα)的胞外结构域和(ii)LIGHT的胞外结构域；等等。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够刺激或增强免疫刺激受体/配体对的结合或在可用于包括刺激或增强免疫刺激受体/配体对的结合的方法中发现用途。示例性T细胞共刺激受体及其配体包括OX-40:OX40-L、CD27:CD70、CD30:CD30-L、CD40:CD40-L；CD137:CD137-L、HVEM:LIGHT、GITR:GITR-L、TNFRSF25:TL1A、DR5:TRAIL和BTLA:HVEM。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够抑制或减少免疫抑制受体/配体对的结合或在可用于包括抑制或减少免疫抑制受体/配体对的结合的方法中发现用途。示例性T细胞共抑制受体及其配体包括例如CTLA-4:CD80/CD86、PD-1:PD-L1/PD-L2、BTLA:HVEM、TIM-3:半乳凝素-9/磷脂酰丝氨酸、TIGIT/CD155或CD112、CD172a(SIRPα)/CD47、B7H3R/B7H3、B7H4R/B7H4、CD244/CD48、TMIGD2/HHLA2等等。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白阻断、减少和/或抑制PD-1和PD-L1或PD-L2和/或PD-1与PD-L1或PD-L2的结合。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白阻断、降低和/或抑制CTLA-4的活性和/或CTLA-4与AP2M1、CD80、CD86、SHP-2和PPP2R5A中的一种或多种的结合。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白增加和/或刺激GITR和/或GITR与一种或多种GITR配体的结合。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白增加和/或刺激OX40和/或OX40与一种或多种OX40配体的结合。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增强、恢复、促进和/或刺激免疫调节或在可用于涉及增强、恢复、促进和/或刺激免疫调节的方法中发现用途。在实施方案中，本文所述的本发明的嵌合蛋白恢复、促进和/或刺激一种或多种针对肿瘤细胞的免疫细胞的活性或活化，所述免疫细胞包括但不限于：T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤细胞(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如，M1巨噬细胞)、B细胞和树突细胞。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白增强、恢复、促进和/或刺激T细胞的活性和/或活化，包括(作为非限制性实例)活化和/或刺激一种或多种T细胞内在信号，包括促生存信号；自分泌或旁分泌生长信号；p38 MAPK-、ERK-、STAT-、JAK-、AKT-或PI3K-介导的信号；抗凋亡信号；和/或促进以下一项或多项和/或以下一项或多项所必需的信号：促炎细胞因子产生或T细胞迁移或T细胞肿瘤浸润。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够引起一种或多种T细胞(包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、天然杀伤T(NKT)细胞)、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞(例如，M1和M2中的一个或多个)增加进入肿瘤或肿瘤微环境中或在可涉及引起一种或多种T细胞(包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、天然杀伤T(NKT)细胞)、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞(例如，M1和M2中的一个或多个)增加进入肿瘤或肿瘤微环境中的方法中发现用途。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够抑制和/或引起免疫抑制细胞(例如，髓源性抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)、肿瘤相关中性粒细胞(TAN)、M2巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM))对肿瘤和/或肿瘤微环境(TME)的募集减少或在涉及抑制和/或引起免疫抑制细胞(例如，髓源性抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)、肿瘤相关中性粒细胞(TAN)、M2巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM))对肿瘤和/或肿瘤微环境(TME)的募集减少的方法中发现用途。在实施方案中，本疗法可改变肿瘤部位和/或TME中M1与M2巨噬细胞的比率以有利于M1巨噬细胞。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够抑制和/或降低T细胞失活和/或对肿瘤的免疫耐受并且在可用于包括抑制和/或降低T细胞失活和/或对肿瘤的免疫耐受的方法中发现用途，包含将有效量的本文所述的嵌合蛋白施用于受试者。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增加多种细胞因子(包括但不限于IFNγ、TNFα、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-17F和IL-22中的一种或多种)的血清水平。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增强所治疗受试者的血清中的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-22、TNFα或IFNγ。在实施方案中，施用本发明的嵌合蛋白能够增强TNFα分泌。在一个具体的实施方案中，施用本发明的嵌合蛋白能够增强白细胞的超抗原介导的TNFα分泌。此类细胞因子反应的检测可以提供确定所示嵌合蛋白的最佳配量方案的方法。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白抑制、阻断和/或减少抗肿瘤CD8+和/或CD4+T细胞的细胞死亡；或刺激、诱导和/或增加促肿瘤T细胞的细胞死亡。T细胞耗竭是一种T细胞功能障碍的状态，其特征是增殖和效应物功能的逐渐丧失，最终导致克隆缺失。因此，促肿瘤T细胞是指在许多慢性感染和癌症期间出现的T细胞功能障碍的状态。这种功能障碍的定义是增殖和/或效应物功能差、抑制性受体的持续表达以及与功能性效应物或记忆T细胞不同的转录状态。耗竭会妨碍对感染和肿瘤的最佳控制。此外，抗肿瘤CD8+和/或CD4+T细胞是指可以对肿瘤产生免疫应答的T细胞。说明性的促肿瘤T细胞包括但不限于表达一种或多种检查点抑制受体的Treg、CD4+和/或CD8+T细胞、Th2细胞和Th17细胞。检查点抑制受体是指在免疫细胞上表达的受体，其防止或抑制不受控制的免疫应答。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增加效应T细胞与调节性T细胞的比率并且在包括增加效应T细胞与调节性T细胞的比率的方法中发现用途。说明性的效应T细胞包括ICOS+效应T细胞；细胞毒性T细胞(例如，αβTCR、CD3+、CD8+、CD45RO+)；CD4+效应T细胞(例如，αβTCR、CD3+、CD4+、CCR7+、CD62Lhi、IL-7R/CD127+)；CD8+效应T细胞(例如，αβTCR、CD3+、CD8+、CCR7+、CD62Lhi、IL-7R/CD127+)；效应记忆T细胞(例如，CD62Llow、CD44+、TCR、CD3+、IL-7R/CD127+、IL-15R+、CCR7low)；中央记忆T细胞(例如，CCR7+、CD62L+、CD27+；或CCR7hi、CD44+、CD62Lhi、TCR、CD3+、IL-7R/CD127+、IL-15R+)；CD62L+效应T细胞；CD8+效应记忆T细胞(TEM)，包括早期效应记忆T细胞(CD27+CD62L-)和晚期效应记忆T细胞(CD27-CD62L-)(分别为TemE和TemL)；CD127(+)CD25(low/-)效应T细胞；CD127(-)CD25(-)效应T细胞；CD8+干细胞记忆效应细胞(TSCM)(例如，CD44(low)CD62L(high)CD122(high)sca(+))；TH1效应T细胞(例如，CXCR3+、CXCR6+和CCR5+；或αβTCR、CD3+、CD4+、IL-12R+、IFNγR+、CXCR3+)、TH2效应T细胞(例如，CCR3+、CCR4+和CCR8+；或αβTCR、CD3+、CD4+、IL-4R+、IL-33R+、CCR4+、IL-17RB+、CRTH2+)；TH9效应T细胞(例如，αβTCR、CD3+、CD4+)；TH17效应T细胞(例如，αβTCR、CD3+、CD4+、IL-23R+、CCR6+、IL-1R+)；CD4+CD45RO+CCR7+效应T细胞、CD4+CD45RO+CCR7(-)效应T细胞；和分泌IL-2、IL-4和/或IFN-γ的效应T细胞。说明性的调节性T细胞包括ICOS+调节性T细胞、CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25-调节性T细胞、CD4+CD25high调节性T细胞、TIM-3+PD-1+调节性T细胞、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)+调节性T细胞、CTLA-4/CD152+调节性T细胞、神经纤毛蛋白-1(Nrp-1)+调节性T细胞、CCR4+CCR8+调节性T细胞、CD62L(L-选择蛋白)+调节性T细胞、CD45RBlow调节性T细胞、CD127low调节性T细胞、LRRC32/GARP+调节性T细胞、CD39+调节性T细胞、GITR+调节性T细胞、LAP+调节性T细胞、1B11+调节性T细胞、BTLA+调节性T细胞、1型调节性T细胞(Tr1细胞)、T辅助3型(Th3)细胞、天然杀伤T细胞的调节性细胞(NKTreg)、CD8+调节性T细胞、CD8+CD28-调节性T细胞和/或分泌IL-10、IL-35、TGF-β、TNF-α、半乳凝素-1、IFN-γ和/或MCP1的调节性T细胞。
在实施方案中，嵌合蛋白产生记忆应答，其可以例如能够防止复发或保护动物免于再次攻击。因此，用嵌合蛋白治疗的动物随后在用嵌合蛋白初始治疗后再次攻毒时能够攻击肿瘤细胞和/或阻止肿瘤的发展。因此，本公开的嵌合蛋白刺激主动肿瘤破坏以及肿瘤抗原的免疫识别，这对于编程能够防止复发的记忆应答是必需的。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够瞬时刺激效应T细胞不超过约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或约96小时或约1周或约2周并且可在包括瞬时刺激效应T细胞不超过约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或约96小时或约1周或约2周的方法中发现用途。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够瞬时消耗或抑制调节性T细胞不超过约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或约96小时或约1周或约2周并且可在包括瞬时消耗或抑制调节性T细胞不超过约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或约96小时或约1周或约2周的方法中发现用途。在实施方案中，效应T细胞的瞬时刺激和/或调节性T细胞的瞬时消耗或抑制基本上发生在患者的血流中或特定组织/位置中，包括淋巴组织，例如骨髓、淋巴结、脾脏、胸腺、粘膜相关淋巴组织(MALT)、非淋巴组织或肿瘤微环境中。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白提供了包括但不限于易于使用和易于生产的优点。这是因为两种不同的免疫治疗剂组合成一个单独的产品，这允许单一的制造过程而不是两个独立的制造过程。此外，施用单一的剂而不是两种分开的剂允许更容易施用和更大的患者依从性。此外，与例如单克隆抗体相比(单克隆抗体是包含大量二硫键和翻译后修饰(例如糖基化)的大多聚体蛋白质)，本发明的嵌合蛋白更容易制造且更具成本效益。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可在哺乳动物宿主细胞中作为可分泌的且全功能的单多肽链产生。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白出乎意料地提供了胞外结构域组分与其各自的结合配偶体以缓慢的解离速率(Kd或Koff)的结合。在实施方案中，这提供了受体与配体的出乎意料的长相互作用，反之亦然。这种效应允许持续的负信号掩蔽效应。此外，在实施方案中，这递送更长的正信号效应，例如，以允许效应细胞被充分刺激以获得抗肿瘤作用。例如，本发明的嵌合蛋白例如经由长解离速率结合允许足够的信号传输以提供T细胞增殖并允许抗肿瘤攻击。作为进一步的实例，本发明的嵌合蛋白例如经由长解离速率结合允许足够的信号传输以提供刺激信号例如细胞因子的释放。
由本发明的药剂促进的细胞的稳定突触(例如，带有负信号的肿瘤细胞和可以攻击肿瘤的T细胞)提供了有利于肿瘤减少的空间定向-例如定位T细胞以攻击肿瘤细胞和/或在空间上阻止肿瘤细胞传递负信号，包括超出被本发明的嵌合蛋白掩蔽的那些的负信号。
在实施方案中，与嵌合蛋白的血清t1/2相比，这提供了更长的在靶(例如，肿瘤内)半衰期(t1/2)。这些性质可能具有减少脱靶毒性的综合优势，这可能与嵌合蛋白的全身分布有关。
在实施方案中，本发明的药剂允许某些免疫细胞通过通过阻断经由TIGIT的信号来防止和/或破坏NK细胞和/或活化、记忆和/或调节T细胞和/或辅助T细胞亚群的抑制，例如以抗肿瘤方式来发挥作用，并且任选地，经由基于4-1BBL、和/或GITRL、和/或TL1A、和/或LIGHT的刺激信号传导产生进一步的免疫应答。
在实施方案中，本发明的药剂允许某些免疫细胞通过刺激和/或增加基于LIGHT的刺激信号传导，例如在内脏和/或淋巴和/或其他基质和/或上皮细胞和/或骨髓细胞上，以例如抗肿瘤的方式起作用，并且任选地，经由阻断或减少基于PD-1和/或CD172a(SIRPα)和/或TIGIT的抑制信号传导来产生进一步的免疫应答。
此外，在实施方案中，本发明的嵌合蛋白提供协同治疗作用，因为其允许改善两种免疫治疗剂的位点特异性相互作用。
在实施方案中，本发明的嵌合蛋白提供了减少位点外(off-site)和/或全身毒性的潜力。
在实施方案中，相对于当前的免疫疗法，例如针对本文所述的检查点分子的抗体，本发明的嵌合蛋白提供减少的副作用，例如GI并发症。示例性的GI并发症包括腹痛、食欲不振、自身免疫效应、便秘、痉挛、脱水、腹泻、饮食问题、疲劳、胀气、腹部或腹水中的液体、胃肠(GI)生态失调、GI粘膜炎、炎性肠病、肠易激综合征(IBS-D和IBS-C)、恶心、疼痛、粪便或尿液变化、溃疡性结肠炎、呕吐、液体滞留导致体重增加和/或虚弱。
在实施方案中，接头是选自柔性氨基酸序列、IgG铰链区或抗体序列的多肽。在实施方案中，接头包含源自IgG1或IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。在实施方案中，铰链-CH2-CH3 Fc结构域源自人IgG1。在实施方案中，铰链-CH2-CH3 Fc结构域源自人IgG4。在实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，接头包含两个或更多个连接接头，每个连接接头独立地选自SEQ ID NO:49-95；其中一个连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的N末端，而另一连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的C末端。
在实施方案中，第一结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，第一结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白是重组融合蛋白。
治疗方法
一方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域的第二结构域。在实施方案中，施用的嵌合蛋白的剂量在约0.0001mg/kg至约50.0mg/kg之间，任选地选自约1mg/kg、约3mg/kg、约6mg/kg、或约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约20mg/kg、约22mg/kg、约25mg/kg、约27mg/kg、约30mg/kg、约33mg/kg、约35mg/kg、约37mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约45mg/kg、约48mg/kg以及约50mg/kg。在实施方案中，受试者是人，任选地是成年人。
在实施方案中，嵌合蛋白每周施用至少约一次。在实施方案中，嵌合蛋白每月施用至少约一次。在实施方案中，嵌合蛋白每月施用至少约两次。在实施方案中，嵌合蛋白每月施用至少约三次。
在实施方案中，癌症包括实体瘤(局部的和/或转移性的)或淋巴瘤。在实施方案中，癌症是晚期癌症。在实施方案中，癌症选自霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性成髓细胞白血病；基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒膜癌；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝脏癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；以及其他癌和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)、梅格斯综合征癌症(Meigs’syndrome)、肾癌、结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
一方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中诱导淋巴细胞扩增的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域的第二结构域。
一方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中诱导淋巴细胞边缘化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域的第二结构域。
在实施方案中，以选自如下的给药方案对受试者进行给药：约每3天至约每10天、约每周至约每2周、约每10天至约每3周、约每2周至约每4周、约每3周至约每5周、约每4周至约每6周、约每5周至约每7周、约每6周至约每8周以及约每6周至约每2个月。
在实施方案中，第一结构域能够结合TIGIT配体。在实施方案中，第一结构域包含TIGIT的基本上全部胞外结构域。在实施方案中，第二结构域能够结合LIGHT受体。在实施方案中，第二结构域包含LIGHT的基本上全部胞外结构域。
在实施方案中，接头是选自柔性氨基酸序列、IgG铰链区和/或抗体序列的多肽。在实施方案中，接头包含源自IgG1或IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。在实施方案中，铰链-CH2-CH3 Fc结构域源自人IgG1或人IgG4。在实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，接头包含一个或多个连接接头，此类连接接头独立地选自SEQ ID NO:49-95。在实施方案中，接头包含两个或更多个连接接头，每个连接接头独立地选自SEQ ID NO:49-95；其中一个连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的N末端，而另一个连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的C末端。
在实施方案中，第一结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，第二结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，(a)第一结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，(b)第二结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且(c)接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQID NO:113的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，(a)第一结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，(b)第二结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且(c)接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，嵌合蛋白还包含至少一个连接接头，该连接接头包含选自SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)、SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)、IEGRMD(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含连接接头，该连接接头包含氨基酸序列IEGRMD(SEQID NO:52)。在实施方案中，IEGRMD的氨基酸序列位于SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列的C末端。
在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQID NO:110的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.2％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQID NO:110的氨基酸序列具有至少99.4％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.6％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.8％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在实施方案中，治疗诱导选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的一种或多种细胞因子的水平和/或活性的增加。在实施方案中，治疗不诱导细胞因子释放综合征。在实施方案中，与其他免疫治疗剂如某些抗CD40抗体或抗PD-1剂相比，治疗对IL-6的增加较小。
在实施方案中，受试者已经接受标准疗法、已经耐受标准疗法或不适合标准疗法和/或癌症没有经批准的被认为是标准护理的疗法。在实施方案中，受试者没有接受同时的化疗、免疫疗法、生物疗法或激素疗法。
确定对患者的癌症治疗的方法；选择患者进行癌症治疗的方法
一方面，本公开涉及一种评价癌症治疗在有需要的受试者中的功效的方法，该方法包括以下步骤：(i)施用一个剂量的嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域的第二结构域，其中剂量为约0.03mg/kg至约50mg/kg；(ii)从受试者获得生物样品；(iii)对生物样品进行测定以确定选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的细胞因子的水平和/或活性；和(iv)如果受试者的选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的至少一种细胞因子的水平和/或活性增加，则继续给药。
一方面，本公开涉及选择受试者用癌症疗法进行治疗的方法，该方法包括以下步骤：(i)施用一个剂量的嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域的第二结构域，其中剂量为约0.03mg/kg至约50mg/kg；(ii)从受试者获得生物样品；(iii)对生物样品进行测定以确定选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的细胞因子的水平和/或活性；和(iv)如果受试者的选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的至少一种细胞因子的水平和/或活性增加，则选择该受试者用癌症疗法进行治疗。
在实施方案中，生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。在实施方案中，生物样品是活检样品。在实施方案中，活检样品选自内窥镜活检、骨髓活检、内窥镜活检(例如，膀胱镜检查、支气管镜检查和结肠镜检查)、针吸活检(例如，细针吸取、针穿活检、真空辅助活检、X射线辅助活检、计算机断层扫描(CT)辅助活检、磁共振成像(MRI)辅助活检和超声辅助活检)、皮肤活检(例如刮取活检、穿刺活检和切取活检)和手术活检。在实施方案中，生物样品包含体液，所述体液选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物，和/或来自其中的细胞。
在实施方案中，生物样品通过选自刮取、拭子和活检的技术获得。在实施方案中，生物样品通过使用刷子、(棉)拭子、抹刀、冲洗/清洗液、穿刺活检装置、用针或手术器械穿刺腔体来获得。在实施方案中，生物样品包含至少一种肿瘤细胞。
在实施方案中，肿瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病(bulkydisease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性粒细胞白血病。在一些实施方案中，癌症是基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关)、梅格斯综合征癌症(Meigs’syndrome cancer)；肾癌；结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
在实施方案中，通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行测定。
在实施方案中，通过将样品与一种或多种特异性结合选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的至少一种细胞因子的药剂接触来进行测定。在实施方案中，特异性结合至少一种细胞因子的药剂包含一种或多种抗体、抗体样分子或其结合片段。
在实施方案中，通过使样品与一种或多种特异性结合编码选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12的细胞因子的至少一种核酸的药剂接触来进行测定。在实施方案中，特异性结合至少一种核酸的药剂是核酸引物或探针。
第一结构域能够结合TIGIT配体。在实施方案中，第一结构域包含TIGIT的基本上全部胞外结构域。在实施方案中，第二结构域能够结合LIGHT受体。在实施方案中，第二结构域包含LIGHT的基本上全部胞外结构域。
在实施方案中，接头是选自柔性氨基酸序列、IgG铰链区和/或抗体序列的多肽。在实施方案中，接头包含源自IgG1或IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。在实施方案中，铰链-CH2-CH3 Fc结构域源自人IgG1或人IgG4。在实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，接头包含一个或多个连接接头，此类连接接头独立地选自SEQ ID NO:49-95。在实施方案中，接头包含两个或更多个连接接头，每个连接接头独立地选自SEQ ID NO:49-95；其中一个连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的N末端，而另一个连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的C末端。
在实施方案中，第一结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，第二结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，(a)第一结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，(b)第二结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且(c)接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQID NO:113的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，(a)第一结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，(b)第二结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且(c)接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，嵌合蛋白还包含至少一个连接接头，该连接接头包含选自SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)、SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)、IEGRMD(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含连接接头，该连接接头包含氨基酸序列IEGRMD(SEQID NO:52)。在实施方案中，IEGRMD的氨基酸序列位于SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列的C末端。
在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQID NO:110的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQID NO:110的氨基酸序列具有至少99.2％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.4％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.6％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.8％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列。在实施方案中，嵌合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
一个方面，本公开涉及一种为患者确定癌症治疗的方法，该方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)评价样品中与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的存在、不存在或水平，所述GO通路选自：(i)细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工和呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工、呈递；和/或(ii)磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程；和(c)基于步骤(b)的评价，选择能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
一方面，本公开涉及选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)评价样品中与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的存在、不存在或水平，所述GO通路选自：(i)细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工和呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工、呈递；和/或(ii)磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程；和(c)选择能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价样品中与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的存在、不存在或水平：(i)细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工和呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工呈递；和/或(ii)磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程：和(III)选择采用嵌合蛋白的癌症疗法，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；和(IV)任选地施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
在非限制性实施方案中，如果未观察到与选自细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工和呈递的负调控，以及内源肽经由MHCI类的抗原加工、呈递的GO通路相关的基因的上调，和/或如果未观察到与选自磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程的GO通路相关的基因的下调，则继续施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
在非限制性实施方案中，如果观察到与选自细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工和呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工、呈递的GO通路相关的基因的上调，和/或如果观察到与选自磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程的GO通路相关的基因的下调，则继续施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法，其中进行癌症疗法的补充施用，所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ IDNO:49-95。
在非限制性实施方案中，如果观察到与选自细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工和呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工、呈递的GO通路相关的基因的上调，和/或如果观察到与选自磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程的GO通路相关的基因的下调，则不再继续施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法，其中施用具有以下通用结构的嵌合蛋白的癌症疗法：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ IDNO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
在实施方案中，与健康组织相比，与(i)中列出的GO通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，与(i)中列出的GO通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，与(i)中列出的GO通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法产生抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与健康组织相比，与(i)中列出的GO通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，与(i)中列出的GO通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，与(i)中列出的GO通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与健康组织相比，与(ii)中列出的GO通路相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，与(ii)中列出的GO通路相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，与(ii)中列出的GO通路相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。
在实施方案中，与健康组织相比，与(ii)中列出的GO通路相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，与(ii)中列出的GO通路相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，与(ii)中列出的GO通路相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与GO通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应，其中GO通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工和呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与GO通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应，其中GO通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工和呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。在实施方案中，与标准相比，与GO通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应，其中GO通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工和呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与GO通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从，其中GO通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工和呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与GO通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从，其中GO通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工和呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。在实施方案中，与标准相比，与GO通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从，其中GO通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工和呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与细胞周期过程的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与细胞周期过程的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与细胞周期过程的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与细胞周期过程的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与细胞周期过程的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与细胞周期过程的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与G1/S转变的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与G1/S转变的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与G1/S转变的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与G1/S转变的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与G1/S转变的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与G1/S转变的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与细胞分裂的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与细胞分裂的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与细胞分裂的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与细胞分裂的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与细胞分裂的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与细胞分裂的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与细胞增殖的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与细胞增殖的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与细胞增殖的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与细胞增殖的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与细胞增殖的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与细胞增殖的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与IκB激酶/NFκB信号传导的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与IκB激酶/NFκB信号传导的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与IκB激酶/NFκB信号传导的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与IκB激酶/NFκB信号传导的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与IκB激酶/NFκB信号传导的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与IκB激酶/NFκB信号传导的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与先天免疫应答的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与先天免疫应答的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与先天免疫应答的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与先天免疫应答的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1治疗敏感的患者相比，与先天免疫应答的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与先天免疫应答的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与抗原加工/呈递的负调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与抗原加工/呈递的负调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与抗原加工/呈递的负调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与抗原加工/呈递的负调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与抗原加工/呈递的负调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与抗原加工/呈递的负调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与IFNα产生的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与IFNα产生的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与IFNα产生的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与IFNα产生的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与IFNα产生的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与IFNα产生的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与防御反应的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与防御反应的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与防御反应的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与防御反应的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1治疗敏感的患者相比，与防御反应的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与防御反应的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与IFNβ产生的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与IFNβ产生的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与IFNβ产生的正调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与IFNβ产生的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与IFNβ产生的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与IFNβ产生的正调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与炎症反应的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与炎症反应的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与炎症反应的调控相关的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与炎症反应的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1治疗敏感的患者相比，与炎症反应的调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与炎症反应调控相关的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与纤维蛋白溶解的负调控相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与纤维蛋白溶解的负调控相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与纤维蛋白溶解的负调控相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与纤维蛋白溶解的负调控相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与纤维蛋白溶解的负调控相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与纤维蛋白溶解的负调控相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与乳糜微粒组装相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与乳糜微粒组装相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与乳糜微粒组装相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与乳糜微粒组装相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与乳糜微粒组装相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与乳糜微粒组装相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与质膜修复相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与质膜修复相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与质膜修复相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与质膜修复相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1治疗敏感的患者相比，与质膜修复相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与质膜修复相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与核糖体小亚基组装相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与核糖体小亚基组装相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与核糖体小亚基组装相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与核糖体小亚基组装相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与核糖体小亚基组装相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与核糖体小亚基组装相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与磷脂流出相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与翻译调控相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与翻译调控相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与翻译调控相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与翻译调控相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与翻译调控相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与翻译调控相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与线粒体呼吸链复合物I相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与线粒体呼吸链复合物I相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与线粒体呼吸链复合物I相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与线粒体呼吸链复合物I相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与线粒体呼吸链复合物I相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与线粒体呼吸链复合物I相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与线粒体翻译延伸相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与线粒体翻译延伸相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与线粒体翻译延伸相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与线粒体翻译延伸相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与线粒体翻译延伸相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与线粒体翻译延伸相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与DNA依赖性DNA复制相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与DNA依赖性DNA复制相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与DNA依赖性DNA复制相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与DNA依赖性DNA复制相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与DNA依赖性DNA复制相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与DNA依赖性DNA复制相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与ATP生物合成过程相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与已知对抗PD-1疗法敏感的患者相比，与ATP生物合成过程相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。在实施方案中，与标准相比，与ATP生物合成过程相关的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的抗性、缺乏反应或不顺从。
在实施方案中，与来自受试者的先前生物样品相比，与ATP生物合成过程相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与已知对抗PD-1治疗敏感的患者相比，与ATP生物合成过程相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与标准相比，与ATP生物合成过程相关的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，例如当Rpl41、Rps15和Rps8中的一种或多种的表达高和/或Cd274、B2M、Tap1、Tap2、Casp1和Gasta3中的一种或多种的表达低时，可以指示能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。在实施方案中，例如当Rpl41、Rps15和Rps8中的一种或多种表达低和/或Cd274、B2M、Tap1、Tap2、Casp1和Gasta3中的一种或多种的表达高时，可以不指示能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。在实施方案中，以Rpl41、Rps15和Rps8中的一种或多种的低表达和/或Cd274、B2M、Tap1、Tap2、Casp1和Gasta3中的一种或多种的高表达为特征的患者可能受益于消除PD-1无反应细胞的辅助或新辅助疗法。
在实施方案中，生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。在实施方案中，生物样品是活检样品。在实施方案中，活检样品选自内窥镜活检、骨髓活检、内窥镜活检(例如，膀胱镜检查、支气管镜检查和结肠镜检查)、针吸活检(例如，细针吸取、针穿活检、真空辅助活检、X射线辅助活检、计算机断层扫描(CT)辅助活检、磁共振成像(MRI)辅助活检和超声辅助活检)、皮肤活检(例如刮取活检、穿刺活检和切取活检)和手术活检。
在实施方案中，生物样品包含选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物，和/或来自其中的细胞。在实施方案中，生物样品通过选自刮取、拭子和活检的技术获得。在实施方案中，生物样品通过使用刷子、(棉)拭子、抹刀、冲洗/清洗液、穿刺活检装置、用针或手术器械穿刺腔体来获得。
在实施方案中，生物样品包含至少一种肿瘤细胞。在实施方案中，肿瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性粒细胞白血病(chronicmyeloblastic leukemia)。在一些实施方案中，癌症是基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关)、梅格斯综合征癌症(Meigs’syndrome cancer)；肾癌；结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
在实施方案中，通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行评价。
在实施方案中，通过使样品与特异性结合与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂进行评价，所述GO通路选自：(i)细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工和呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工、呈递；和/或(ii)磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程。
在实施方案中，通过使样品与特异性结合由与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价，所述基因本体(GO)通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工和呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与IFNα产生的正调控相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与防御反应的正调控相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与IFNβ产生的正调控相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与炎症反应的调控相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。
在实施方案中，通过使样品与特异性结合与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价，所述GO通路选自：(i)细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工和呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工、呈递；和/或(ii)磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程。
在实施方案中，通过使样品与特异性结合与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价，所述GO通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工和呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与IFNα产生的正调控相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与防御反应的正调控相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与IFNβ产生的正调控相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与炎症反应的调控相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，特异性结合一种或多种核酸的药剂是核酸引物或探针。
在实施方案中，评价告知将患者分类为高风险组或低风险组。在实施方案中，高风险分类包括高水平的肿瘤细胞，其对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法具有抗性。在实施方案中，低风险分类包括低水平的肿瘤细胞，其对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法具有抗性。
在实施方案中，低风险或高风险分类指示停止新辅助疗法。在实施方案中，低风险或高风险分类指示停止辅助疗法。在实施方案中，评价预测对癌症治疗的阳性反应和/或受益于癌症治疗。在实施方案中，评价预测对癌症治疗的阴性或中性反应和/或受益于癌症治疗。在实施方案中，评价预测对新辅助化疗的阳性反应和/或受益于新辅助化疗，或者对新辅助化疗无反应和/或不能受益于新辅助化疗。在实施方案中，评价预测对辅助化疗的阳性反应和/或受益于辅助化疗，或对辅助化疗无反应或和/或不能受益于辅助化疗。在实施方案中，评价预测对新辅助化疗的阴性或中性反应和/或受益于新辅助化疗或对新辅助化疗无反应和/或不能受益于新辅助化疗。在实施方案中，评价预测对辅助化疗的阴性或中性反应和/或受益于辅助化疗，或者对辅助化疗无反应和/或不能受益于辅助化疗。在实施方案中，评价告知癌症治疗的施用或停止。在实施方案中，评价告知新辅助疗法的施用。在实施方案中，评价告知辅助治疗的施用。在实施方案中，评价告知停止新辅助治疗。在实施方案中，评价告知停止辅助治疗。在实施方案中，新辅助疗法和/或辅助疗法是化疗剂。在实施方案中，新辅助疗法和/或辅助疗法是细胞毒性剂。在实施方案中，新辅助疗法和/或辅助疗法是检查点抑制剂。
在实施方案中，新辅助疗法和/或辅助疗法选自蛋白翻译抑制剂(例如，silvestrol和高三尖杉酯碱)；核糖体生物发生抑制剂(例如，diazaborine、拉莫三嗪和ribozinoindole)、rRNA和/或tRNA合成抑制剂(例如喹氟拉辛(CX-3543)和CX-5461)、氨基酸合成抑制剂(例如GLUD1抑制剂R162、BCAT1抑制剂加巴喷丁、谷氨酰胺酶抑制剂双-2-(5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基)乙硫醚(BPTES)、PAGDH抑制剂NCT-503)、氨基酸摄取抑制剂(例如SLC7A11抑制剂柳氮磺吡啶、erastin或索拉非尼)、翻译后修饰调节剂(例如，糖基化抑制剂衣霉素、ppGalNAc-T3)、蛋白降解调节剂和蛋白转运调节剂(例如，环孢菌素A、芬地林、帕苯达唑、帕罗西汀、小白菊内酯、奎纳克林、舍曲林、螺哌隆、硫柳汞、阿司咪唑、哌克昔林、HUN-7293、CAM741、CK147和cotransin)。
一方面，本公开涉及为患者确定癌症疗法的方法，该方法包括：(i)从受试者获得生物样品；(ii)评价样品中与选自以下的基因本体(GO)途径相关的一种或多种基因的上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递；和/或与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的下调：磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程；和(iii)基于步骤(b)的评价选择癌症疗法，其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：(i)从受试者获得生物样品；(ii)评价样品中与选自以下的基因本体(GO)途径相关的一种或多种基因的上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递；和/或与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的下调：磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程；和(iii)选择癌症疗法，其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括：(i)从受试者获得生物样品；(ii)评价样品中与选自以下的基因本体(GO)途径相关的一种或多种基因的上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递；和/或与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的下调：磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程；和(iii)选择癌症疗法，其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
在实施方案中，上调是与健康组织进行比较。在实施方案中，上调是与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品进行比较。在实施方案中，上调是与从受试者获得的先前生物样品进行比较。在实施方案中，下调是与健康组织进行比较。在实施方案中，下调是与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品进行比较。在实施方案中，下调是与从受试者获得的先前生物样品进行比较。
在实施方案中，生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。在实施方案中，生物样品是活检样品。在实施方案中，活检样品选自内窥镜活检、骨髓活检、内窥镜活检(例如膀胱镜检查、支气管镜检查和结肠镜检查)、针吸活检(例如细针吸取、针穿活检、真空辅助活检、X射线辅助活检、计算机断层扫描(CT)辅助活检、磁共振成像(MRI)辅助活检和超声辅助活检)、皮肤活检(例如刮取活检、穿刺活检和切取活检)和手术活检。在实施方案中，生物样品包含体液，所述体液选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物，和/或来自其中的细胞。在实施方案中，生物样品通过选自刮取、拭子和活检的技术获得。在实施方案中，生物样品通过使用刷子、(棉)拭子、抹刀、冲洗/清洗液、穿刺活检装置、用针或手术器械穿刺腔体来获得。在实施方案中，生物样品包含至少一种肿瘤细胞。
在实施方案中，肿瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性粒细胞白血病。在一些实施方案中，癌症是基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关)、梅格斯综合征癌症；肾癌；结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
在实施方案中，通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价，所述GO通路选自(i)细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHCI类的抗原加工/呈递；和/或(ii)磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程。
在实施方案中，通过使样品与特异性结合与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价，所述基因本体(GO)通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工/呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。
在实施方案中，通过使样品与特异性结合与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价，所述GO通路选自：(i)细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控、以及内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递；和/或(ii)磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价，所述基因本体(GO)通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工/呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHC I类的呈递。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，特异性结合一种或多种核酸的药剂是核酸引物或探针。
在实施方案中，评价告知将患者分类为高风险组或低风险组。在实施方案中，高风险分类包括高水平的肿瘤细胞，其对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法具有抗性。在实施方案中，低风险分类包括低水平的肿瘤细胞，其对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法具有抗性。在实施方案中，低风险分类指示停止癌症疗法。在实施方案中，高风险分类指示施用癌症疗法。
一方面，本公开涉及一种为患者确定癌症治疗的方法，该方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)评价生物样品的以下的表达：(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因，和/或(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和(c)基于步骤(b)的评价选择癌症疗法。
一方面，本公开涉及为患者确定癌症疗法的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品的以下表达：(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)评价生物样品的以下的表达：(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和(c)基于步骤(b)的评价选择癌症疗法。
一方面，本发明涉及一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品的以下表达：(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ IDNO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品的以下表达：(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；(IV)任选地选择和/或新辅助疗法和/或辅助疗法；(V)任选地施用新辅助疗法和/或辅助疗法；以及(VI)施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
在非限制性实施方案中，如果未观察到选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因的过表达的上调，和/或未观察到选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因的下调，则继续施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
在非限制性实施方案中，如果观察到选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因的过度表达的上调，和/或观察到选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因的下调，则继续施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法，其中补充施用的癌症治疗包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
在非限制性实施方案中，如果观察到选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因的过度表达的上调；和/或观察到选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因的下调，则不再继续施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法，其中癌症治疗的施用包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
在实施方案中，当生物样品包含至少一种肿瘤细胞，并且与健康组织、从受试者获得的先前生物样品、或从已知对抗PD-1疗法敏感的患者获得的另一种生物样品相比，选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM和KRT1的基因在该至少一种肿瘤细胞中没有上调；和/或与健康组织、从受试者获得的先前生物样品、或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因在该至少一种肿瘤细胞中没有下调时，选择能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
在实施方案中，当生物样品包含至少一种肿瘤细胞，并且与健康组织、从受试者获得的先前生物样品、或从已知对抗PD-1疗法敏感的患者获得的另一种生物样品相比，选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因在该至少一种肿瘤细胞中上调；和/或与健康组织、从受试者获得的先前生物样品、或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因在该至少一种肿瘤细胞中下调时；癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
在实施方案中，与健康组织相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。在实施方案中，与健康组织相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。
在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。
在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。
在实施方案中，与健康组织相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与健康组织相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
在实施方案中，生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。在实施方案中，生物样品是活检样品。在实施方案中，活检样品选自内窥镜活检、骨髓活检、内窥镜活检(例如，膀胱镜检查、支气管镜检查和结肠镜检查)、针吸活检(例如，细针吸取、针穿活检、真空辅助活检、X射线辅助活检、计算机断层扫描(CT)辅助活检、磁共振成像(MRI)辅助活检和超声辅助活检)、皮肤活检(例如刮取活检、穿刺活检和切取活检)和手术活检。在实施方案中，生物样品包含体液，所述体液选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物，和/或来自其中的细胞。在实施方案中，生物样品通过选自刮取、拭子和活检的技术获得。在实施方案中，生物样品通过使用刷子、(棉)拭子、抹刀、冲洗/清洗液、穿刺活检装置、用针或手术器械穿刺腔体来获得。
在实施方案中，生物样品包含至少一种肿瘤细胞。在实施方案中，肿瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性粒细胞白血病，基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关)、梅格斯综合征癌症；肾癌；结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
在实施方案中，通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合由与(b)(i)和/或(b)(ii)中列出的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。在实施方案中，特异性结合一种或多种蛋白的药剂包括抗体、抗体样分子或结合其片段。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与(b)(i)和/或(b)(ii)中列出的基因相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，特异性结合一种或多种核酸的药剂是核酸引物或探针。
一方面，本公开涉及为患者确定癌症疗法的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品对选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的激活；和(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品对选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的激活；和(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括：(I)从受试者获得生物样品；(II)评价生物样品对选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的激活；和(II)其中癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；以及(IV)任选地施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
在实施方案中，当生物样品包含至少一种肿瘤细胞，并且与健康组织、从该受试者获得的先前生物样品或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路在该至少一种肿瘤细胞中没有上调时，选择能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
在实施方案中，当生物样品包含至少一种肿瘤细胞，并且与健康组织、从该受试者获得的先前生物样品或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路在该至少一种肿瘤细胞中被上调时，癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
在实施方案中，与健康组织相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、产生抗性或不顺从。
在实施方案中，与健康组织相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。在实施方案中，与从受试者获得的先前生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法发展缺乏反应。
在实施方案中，生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。在实施方案中，生物样品是活检样品。在实施方案中，活检样品选自内窥镜活检、骨髓活检、内窥镜活检(例如，膀胱镜检查、支气管镜检查和结肠镜检查)、针吸活检(例如，细针吸取、针穿活检、真空辅助活检、X射线辅助活检、计算机断层扫描(CT)辅助活检、磁共振成像(MRI)辅助活检和超声辅助活检)、皮肤活检(例如刮取活检、穿刺活检和切取活检)和手术活检。在实施方案中，生物样品包含体液，所述体液选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物，和/或来自其中的细胞。在实施方案中，生物样品通过选自刮取、拭子和活检的技术获得。在实施方案中，生物样品通过使用刷子、(棉)拭子、抹刀、冲洗/清洗液、穿刺活检装置、用针或手术器械穿刺腔体来获得。
在实施方案中，生物样品包含至少一种肿瘤细胞。在实施方案中，肿瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性粒细胞白血病，基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关)、梅格斯综合征癌症；肾癌；结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
在实施方案中，通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合由选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。在实施方案中，特异性结合一种或多种蛋白的药剂包括抗体、抗体样分子或结合其片段。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，特异性结合一种或多种核酸的药剂是核酸引物或探针。
Trim7是一个大家族的成员，该家族包含大约80个不同的三元基序蛋白(含三元基序(TRIM))。该蛋白家族在人体中包含80个TRIM蛋白成员。在实施方案中，Trim家族激活可以通过控制IFN应答基因(即，IRF1/IRF3/IRF7、JAK/STAT和NFκB)调控先天免疫应答来测定。在实施方案中，Trim家族成员具有C末端SPRY结构域(例如，在Trim6和Trim7中)。在实施方案中，基于增殖的诱导、EMT和化疗抗性表型的获得来测定Trim7。
在实施方案中，可以使用E3泛素连接酶活性来测定Trim7通路激活。在实施方案中，Trim7通路激活可以通过Ras-Raf-MEK-ERK信号传导的c-Jun/AP1激活来测定。在实施方案中，Trim7通路激活可以通过测定蛋白泛素化来测定。
在实施方案中，可以使用AP1共激活剂RACO-1的泛素化和稳定化和/或AP1介导的基因表达的增加来测定Trim7通路激活。AP1介导的基因表达特征是本领域众所周知的。
在实施方案中，Trim7通路激活可以基于靶蛋白的K63连接的泛素化来测定，靶蛋白包括参与细胞增殖和先天免疫应答的蛋白。在实施方案中，Trim7通路激活可以基于Trim7磷酸化、K63连接的泛素化和/或AP-1共激活剂(被称为RACO-1)的蛋白质水平来测定。在实施方案中，可以基于STING(干扰素基因刺激物、MITA、ERIS、MPYS、TMEM173)的水平或活性来测定Trim7通路激活。在实施方案中，可以通过STING的K48连接的泛素化来测定Trim7通路激活。在实施方案中，可以通过IFNb、IP-10和Rantes的上调来测定Trim7通路激活。在实施方案中，可以基于图6C中所示的蛋白的激活来测定Trim7通路激活。
促分裂原活化的蛋白激酶8相互作用蛋白1(Mapk8ip1)也称为c-Jun氨基末端激酶相互作用蛋白1。在实施方案中，可以基于对JNK通路的不同组分中的功能性多蛋白复合物的测定来测定Mapk8ip1通路激活，所述组分包括RAC1或RAC2、MAP3K11/MLK3或MAP3K7/TAK1、MAP2K7/MKK7、MAPK8/JNK1和/或MAPK9/JNK2。在实施方案中，可以基于细胞凋亡引起的程序性细胞死亡的水平和/或敏感性来测定Mapk8ip1通路激活。
在实施方案中，可以基于本领域众所周知的Ras-Raf-MEK-ERK信号传导的激活来测定ETS样-1蛋白(Elk1)通路激活。在实施方案中，可以基于Elk1磷酸化来测定Elk1通路激活。在实施方案中，可以基于本领域中众所周知的Elkl靶基因的激活来测定Elkl通路激活(参见，例如，Odrowaz和Sharrocks,ELK1 Uses Different DNA Binding Modes toRegulate Functionally Distinct Classes of Target Genes,PLOS Genetics 8(5):e1002694(2012)。
在实施方案中，可以基于TGFβ和/或SMAD1/5/8信号传导的诱导来测定富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(Lrg1)通路激活。
在实施方案中，可以基于图8C中所示的蛋白的激活来测定Ras通路激活。
在实施方案中，可以基于图8D中所示的蛋白的激活来测定Rap1通路激活。
在实施方案中，可以基于精氨酸水解为鸟氨酸和尿素的测定来测定精氨酸酶1(Arg1)通路激活。在实施方案中，可以基于抑制肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来测定精氨酸酶1(Arg1)通路激活。在实施方案中，可以基于多胺的水平或合成(经由L-鸟氨酸)来测定精氨酸酶1(Arg1)通路激活。
一方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括施用癌症疗法，该癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95，其中所述受试者已经接受或正在接受能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗癌治疗，并且其中所述受试者对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法已发展缺乏反应、具有抗性或不顺从。
一方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：(a)施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗癌治疗；(b)通过监测受试者的肿瘤尺寸的减小来评价能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗癌治疗的抗肿瘤反应；(c)如果观察到肿瘤尺寸没有减小，则施用具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；(d)通过监测受试者的肿瘤减小来重新评价采用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗癌治疗的抗肿瘤反应；和(e)如果观察到肿瘤尺寸减小，则停止施用具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本公开涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：(a)施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗癌治疗；(b)使用以下步骤评价采用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗癌治疗的抗肿瘤反应：(i)从受试者获得生物样品；(ii)评价生物样品的TRIM7的过度表达和/或激活；(c)施用具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；(d)使用以下步骤重新评价用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗癌治疗的抗肿瘤反应：(i)从受试者获得生物样品；(ii)评价生物样品的TRIM7的过度表达和/或激活；和(e)如果没有观察到TRIM7的过度表达和/或激活，则停止施用具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
一方面，本公开涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：(a)施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗癌治疗；(b)使用以下步骤评价TRIM7的过度表达和/或激活：(i)从受试者获得生物样品；和(ii)评价生物样品的TRIM7的过度表达和/或激活；(c)如果观察到TRIM7的过度表达和/或激活，施用具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ IDNO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；(d)使用以下步骤重新评价TRIM7的过度表达和/或激活：(i)从受试者获得生物样品；(ii)评价生物样品的TRIM7的过度表达和/或激活；和(e)如果没有观察到TRIM7的过度表达和/或激活，则停止施用具有以下通用结构的嵌合蛋白：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
在实施方案中，通过用Trim7调节剂处理生物样品来观察TRIM7的过度表达和/或激活。在实施方案中，Trim7调节剂是Trim 7抑制剂。在实施方案中，Trim7调节剂选自小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、反义RNA、指导RNA(gRNA)、小分子、抗体、肽和肽模拟物。在实施方案中，小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、反义RNA或指导RNA(gRNA)抑制Trim7蛋白的产生。在实施方案中，肽模拟物模拟Trim7的靶标并由此抑制Trim7的活性。在实施方案中，Trim 7抑制剂是小分子或肽抑制剂，其靶向由选自MAAVGPRTGPGTGAEALALAAEL(SEQ ID NO:104)、AATRAPPFPLPCP(SEQ ID NO:105)、HGSQAAAARAAAARCG(SEQ ID NO:106)和NVSLKTFVLKGMLKKFKEDLRGELEKEEKV(SEQ ID NO:107)的一个或多个Trim7蛋白区段包围的区域。在实施方案中，Trim7调节剂是促分裂原和应激激活的激酶1(MSK1)抑制剂，其中MSK1抑制剂经由抑制MSK1的下游效应来调控Trim7。在实施方案中，MSK1抑制剂选自Ro 31-8220、SB-747651A和H89。在实施方案中，MSK1抑制剂是SB-747651A。
在实施方案中，通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行评价。在实施方案中，通过使样品与特异性结合由Trim7通路编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行评价。在实施方案中，特异性结合一种或多种蛋白的试剂包括抗体、抗体样分子或结合其片段。在实施方案中，通过使样品与特异性结合与Trim7通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行评价。在实施方案中，特异性结合一种或多种核酸的药剂是核酸引物或探针。
在实施方案中，通过测定E3泛素连接酶活性来进行评价。在实施方案中，通过测定干扰素基因刺激物(STING)和/或AP-1共激活剂RACO-1的蛋白泛素化和/或K48连接的泛素化来进行评价。在实施方案中，通过测定经由Ras-Raf-MEK-ERK信号传导的c-Jun/AP1激活和/或AP1介导的基因表达的增加来进行评价。在实施方案中，通过测定AP1共激活剂RACO-1的泛素化和稳定化来进行评价。在实施方案中，通过测定靶蛋白的K63连接的泛素化来进行评价，所述靶蛋白包括参与细胞增殖和先天免疫应答的蛋白。在实施方案中，通过测定Trim7磷酸化、AP-1共激活剂RACO-1的K63连接的泛素化和/或蛋白质水平来进行评价。在实施方案中，通过测定IFNβ、IP-10和/或Rantes的上调来进行评价。
一方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(A)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或(B)(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，且(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95，其中所述癌症对或被认为对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗检查点剂具有抗性。
在实施方案中，抗检查点剂是选自纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地利珠单抗(CT-011，CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559、MPDL328OA(ROCHE)、西米普利单抗(LIBTAYO)、阿特珠单抗(TECENTRIQ)、阿维鲁单抗(BAVENCIO)和度伐鲁单抗(imfinzi)的抗体。
在实施方案中，该方法还包括施用抗检查点剂。在实施方案中，抗检查点剂是选自纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地利珠单抗(CT-011，CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559、MPDL328OA(ROCHE)、西米普利单抗(LIBTAYO)、阿特珠单抗(TECENTRIQ)、阿维鲁单抗(BAVENCIO)和度伐鲁单抗(imfinzi)的抗体。在实施方案中，包含嵌合蛋白和抗检查点剂的药物组合物同时或同期施用。在实施方案中，包含嵌合蛋白的药物组合物在施用抗检查点剂之后施用。在实施方案中，包含嵌合蛋白的药物组合物在施用抗检查点剂之前施用。
在实施方案中，包含嵌合蛋白的药物组合物的剂量小于向尚未接受或未正在接受抗检查点剂治疗的受试者施用的包含嵌合蛋白的药物组合物的剂量。在实施方案中，施用的抗检查点剂的剂量小于向尚未接受或未正在接受包含嵌合蛋白的药物组合物治疗的受试者施用的抗检查点剂的剂量。在实施方案中，与仅接受过或正在仅接受包含嵌合蛋白的药物组合物治疗的受试者相比，受试者的生存机会增加，且没有胃肠道炎症和体重减轻，和/或肿瘤尺寸减小或癌症患病率降低。在实施方案中，与仅接受过或正在仅接受抗检查点剂治疗的受试者相比，受试者的生存机会增加，且没有胃肠道炎症和体重减轻，和/或肿瘤尺寸减小或癌症患病率降低。
制剂
本文所述的嵌合蛋白(和/或另外的药剂)可具有足够碱性的官能团，其可与无机酸或有机酸反应；或羧基，其可与无机碱或有机碱反应，以形成药学上可接受的盐。药学上可接受的酸加成盐由药学上可接受的酸形成，如本领域众所周知的。此类盐包括在例如以下文献中列出的药学上可接受的盐：Journal of Pharmaceutical Science,66,2-19(1977)和The Handbook of Pharmaceutical Salts；Properties,Selection,andUse.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(eds.),Verlag,Zurich(瑞士)2002，其全部内容通过引用并入本文。
在实施方案中，本文描述的组合物是药学上可接受的盐的形式。
此外，本文描述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)可以作为包含药学上可接受的载体或赋形剂的组合物的组分施用于受试者。此类组合物可以任选地包含适量的药学上可接受的赋形剂，以提供适当施用的形式。药物赋形剂可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物赋形剂可以是例如盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。此外，还可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用于受试者时，药学上可接受的赋形剂是无菌的。当静脉内施用本文所述的任何药剂时，水是有用的赋形剂。盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体赋形剂，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、干燥的脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等等。如果需要，本文描述的任何药剂还可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。
在实施方案中，将本文描述的组合物重悬于盐水缓冲液(包括但不限于TBS、PBS等)中。
在实施方案中，嵌合蛋白可以通过与另一种药剂缀合和/或融合来延长半衰期或以其他方式改善药效学和药代动力学性质。在实施方案中，嵌合蛋白可以与PEG、XTEN(例如，作为rPEG)、聚唾液酸(POLYXEN)、白蛋白(例如，人血清白蛋白或HAS)、弹性蛋白样蛋白(ELP)、PAS、HAP、GLK、CTP、转铁蛋白等中的一种或多种融合或缀合。在实施方案中，个体嵌合蛋白中的每一个均与BioDrugs(2015)29:215–239中描述的一种或多种药剂融合，该文献的全部内容通过引用并入本文。
施用、给药和治疗方案
本公开包括所描述的各种制剂中的嵌合蛋白(和/或另外的药剂)。本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)可以采取溶液、悬浮液、乳液、滴剂、片剂、丸剂、微丸剂(pellets)、胶囊、含有液体的胶囊、粉末、缓释制剂、栓剂、乳液、气雾剂、喷雾剂、悬浮液或任何其他适合使用的形式。也可以使用编码蛋白序列的DNA或RNA构建体。在一个实施方案中，组合物是胶囊的形式(参见例如美国专利号5,698,155)。合适的药物赋形剂的其他实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaro eds.,19th ed.1995)，其通过引用并入本文。
必要时，包含嵌合蛋白(和/或另外的药剂)的制剂还可包含增溶剂。而且，可以用本领域已知的合适的溶媒或递送装置来递送药剂。本文概述的组合疗法可以在单一递送溶媒或递送装置中共同递送。用于施用的组合物可以任选地包括局部麻醉剂，例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。
包含本公开的嵌合蛋白(和/或另外的药剂)的制剂可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法来制备。此类方法通常包括将治疗剂与载体结合的步骤，所述载体构成一种或多种辅助成分。通常，通过将治疗剂与液体载体、细碎的固体载体或这两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，将产品成型为所需制剂的剂型(例如，湿法或干法制粒、粉末混合物等，然后使用本领域已知的常规方法压片)来制备制剂。
在一个实施方案中，本文描述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)根据常规程序配制为适合本文描述的施用模式的组合物。
施用途径包括例如：皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、直肠、通过吸入或外部，特别是施用于耳、鼻、眼或皮肤。在实施方案中，施用通过口服或肠胃外注射实现。在大多数情况下，施用导致本文所述的任何药剂释放到血流中。
本文描述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)可以口服施用。此类嵌合蛋白(和/或另外的药剂)还可以通过任何其他方便的途径施用，例如通过静脉内输注或推注、通过上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与另一种生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。各种递送系统是已知的，例如封装在脂质体、微粒、微囊、胶囊等中，并且可用于施用。
在具体的实施方案中，可能需要局部施用至需要治疗的区域。在一个实施方案中，例如在癌症的治疗中，在肿瘤微环境(例如，围绕和/或供给肿瘤细胞的细胞、分子、细胞外基质和/或血管，包括例如肿瘤脉管系统；肿瘤浸润淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(EPC)；癌症相关成纤维细胞；周细胞；其他基质细胞；细胞外基质(ECM)的组分；树突细胞；抗原呈递细胞；T细胞；调控性T细胞；巨噬细胞；中性粒细胞；以及位于肿瘤附近的其他免疫细胞)或淋巴结和/或靶向于肿瘤微环境或淋巴结施用嵌合蛋白(和/或另外的药剂)。在实施方案中，例如在癌症的治疗中，瘤内施用嵌合蛋白(和/或另外的药剂)。
在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白允许双重效应，其提供比常规免疫疗法(例如，用OPDIVO、KEYTRUDA、YERVOY和TECENTRIQ中的一种或多种进行的治疗)中所见的副作用更少的副作用。例如，本发明的嵌合蛋白减少或预防常见的免疫相关不良事件，这些不良事件影响多种组织和器官，包括皮肤、胃肠道、肾脏、外周和中枢神经系统、肝脏、淋巴结、眼睛、胰腺和内分泌系统；如垂体炎、结肠炎、肝炎、肺炎、皮疹和风湿性疾病。此外，本发明的局部施用(例如瘤内施用)避免了用标准全身施用(例如IV输注)观察到的不良事件，如与常规免疫疗法(例如，用OPDIVO、KEYTRUDA、YERVOY和TECENTRIQ中的一种或多种进行的治疗)一起使用时所观察到的不良事件。
适合于肠胃外施用(例如静脉内、肌内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注)的剂型包括例如溶液剂、混悬剂、分散剂、乳剂等。它们还可以以无菌固体组合物(例如冻干组合物)的形式制造，该无菌固体组合物(例如冻干组合物)可以在即将使用前溶解或悬浮于无菌注射介质中。它们可以含有例如本领域已知的悬浮剂或分散剂。
本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)的剂量以及给药方案可以取决于各种参数，包括但不限于正在被治疗的疾病、受试者的一般健康状况和施用医师的判断。本文描述的任何嵌合蛋白可以在另一种药剂施用之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用于有此需要的受试者。在实施方案中，本文所述的任何嵌合蛋白和另外的药剂间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔小于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔1周、间隔2周、间隔3周或间隔4周施用。
在实施方案中，本公开涉及诱导先天性免疫应答的嵌合蛋白和诱导适应性免疫应答的另一种嵌合蛋白的共同施用。在此类实施方案中，诱导先天性免疫应答的嵌合蛋白可以在施用诱导适应性免疫应答的嵌合蛋白之前、同时或之后施用。例如，嵌合蛋白可以间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔小于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时施用、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔1周、间隔2周、间隔3周或间隔4周。在一个示例性实施方案中，诱导先天性免疫应答的嵌合蛋白和诱导适应性应答的嵌合蛋白间隔1周施用，或隔周施用(即，施用诱导先天性免疫应答的嵌合蛋白1周后施用诱导适应性免疫应答的嵌合蛋白，如此反复)。
本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)的剂量可取决于若干因素，包括病况的严重程度、是否要治疗或预防病况以及待治疗的受试者的年龄、体重和健康状况。此外，有关特定受试者的药物基因组学(基因型对治疗药物的药代动力学、药效学或功效谱的影响)信息可能会影响所使用的剂量。此外，确切的个体剂量可以根据多种因素进行一定程度的调整，包括被施用的药剂的具体组合、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速率、正在治疗的具体疾病、病症的严重程度以及病症的解剖位置。可以预期剂量的一些变化。
对于通过肠胃外注射施用本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)，剂量可以是每天约0.1mg至约250mg、每天约1mg至约20mg、或每天约3mg至约5mg。一般而言，当口服或肠胃外施用时，本文所述的任何药剂的剂量可为每天约0.1mg至约1500mg，或每天约0.5mg至约10mg，或每天约0.5mg至约5mg，或每天约200至约1,200mg(例如，每天或每周约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1,000mg、约1,100mg、约1,200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2,000mg、约2,100mg、约2,200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约2600mg、约2700mg、约2800mg、约2900mg、约3,000mg、约3,100mg、约3,200mg、约3300mg、约3400mg、约3500mg、约3600mg、约3700mg、约3800mg、约3900mg、约4,000mg、约4,100mg、约4,200mg、约4300mg、约4400mg、约4500mg、约4600mg、约4700mg、约4800mg、约4900mg、约5000mg)。
在实施方案中，本文所述的嵌合蛋白(和/或另外的药剂)的施用通过肠胃外注射或输注进行，剂量为每次治疗约0.1mg至约1500mg，或每次治疗约0.5mg至约10mg，或每次治疗约0.5mg至约5mg，或每次治疗约200至约1,200mg(例如，每次治疗约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1,000mg、约1,100mg、约1,200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2,000mg、约2,100mg、约2,200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约2600mg、约2700mg、约2800mg、约2900mg、约3,000mg、约3,100mg、约3,200mg、约3300mg、约3400mg、约3500mg、约3600mg、约3700mg、约3800mg、约3900mg、约4,000mg、约4,100mg、约4,200mg、约4300mg、约4400mg、约4500mg、约4600mg、约4700mg、约4800mg、约4900mg、约5000mg)。
在实施方案中，嵌合蛋白(和/或另外的药剂)的合适剂量在约0.01mg/kg至约100mg/kg体重或约0.01mg/kg至约10mg/kg受试者体重的范围内，例如，或约0.01mg/kg、或约0.02mg/kg、或约0.03mg/kg、或约0.04mg/kg、或约0.05mg/kg、或约0.06mg/kg、或约0.07mg/kg、或约0.08mg/kg、或约0.09mg/kg、或约0.1mg/kg、或约0.2mg/kg、或约0.3mg/kg、或约0.4mg/kg、或约0.5mg/kg、或约0.6mg/kg、或约0.7mg/kg、或约0.8mg/kg、或约0.9mg/kg、或约1mg/kg、或约1.1mg/kg、或约1.2mg/kg、或约1.3mg/kg、或约1.4mg/kg、或约1.5mg/kg、或约1.6mg/kg、或约1.7mg/kg、或约1.8mg/kg,1.9mg/kg、或约2mg/kg、或约3mg/kg、或约4mg/kg、或约5mg/kg、或约6mg/kg、或约7mg/kg、或约8mg/kg、或约9mg/kg、或约10mg/kg、或约11mg/kg、或约12mg/kg、或约13mg/kg、或约14mg/kg、或约15mg/kg、或约16mg/kg、或约17mg/kg、或约18mg/kg、或约19mg/kg、或约20mg/kg、或约21mg/kg、或约22mg/kg、或约23mg/kg、或约24mg/kg、或约25mg/kg、或约26mg/kg、或约27mg/kg、或约28mg/kg、或约29mg/kg、或约30mg/kg、或约31mg/kg、或约32mg/kg、或约33mg/kg、或约34mg/kg、或约35mg/kg、或约36mg/kg、或约37mg/kg、或约38mg/kg、或约39mg/kg、或约40mg/kg、或约41mg/kg、或约42mg/kg、或约43mg/kg、或约44mg/kg、或约45mg/kg、或约46mg/kg、或约47mg/kg、或约48mg/kg、或约49mg/kg、或约50mg/kg、或约75mg/kg体重，包括其间的所有值和范围。
在另一个实施方案中，递送可以在囊泡中，特别是脂质体中(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat等人,Liposomes in therapy of Infectious Diseaseand Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss,New York,pp.353-365(1989)。
本文描述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)可以通过控释或缓释方式或通过本领域普通技术人员众所周知的递送装置来施用。实例包括但不限于以下专利中描述的那些：美国专利号3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；和5,733,556，每一篇均通过引用以其整体并入本文。使用例如羟丙甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球或它们的组合以不同比例提供所需的释放曲线，此类剂型可用于提供一种或多种活性成分的控释或缓释。活性成分的控释或缓释可以通过各种条件来刺激，包括但不限于pH变化、温度变化、适当波长的光刺激、酶的浓度或可用性、水的浓度或可用性，或其他生理条件或化合物。
在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(参见Medical Applications ofControlled Release,Langer和Wise(编),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy等人,1985,Science 228:190；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105)。
在另一个实施方案中，控释系统可以放置在待治疗的靶区域附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。可以使用Langer,1990,Science 249:1527-1533)的综述中讨论的其他控释系统。
本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)的施用可以独立地是每天一至四次或每月一至四次或每年一至六次或每两年、三年、四年或五年一次。施用可以持续一天或一个月、两个月、三个月、六个月、一年、两年、三年，甚至可以持续受试者的一生。
利用本文描述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)的剂量方案可以根据多种因素来选择，包括受试者的类型、物种、年龄、体重、性别和医疗状况；待治疗病况的严重程度；施用途径；受试者的肾或肝功能；个体的药物基因组学构成；以及所使用的本发明的具体化合物。本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)可以以单日剂量施用，或者总日剂量可以以每天两次、三次或四次的分剂量施用。此外，本文描述的任何嵌合蛋白(和/或另外的药剂)可以在整个剂量方案中连续施用而不是间歇施用。
治疗方法、诱导淋巴细胞边缘化、评价功效和选择患者
一方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是被T淋巴细胞表达的受体，也称为CD258或TNFSF14)的胞外结构域的第二结构域，其中给药方案选自约每3天至约每10天、约每周至约每2周、约每10天至约每3周、约每2周至约每4周、约每3周至约每5周、约每4周至约每6周、约每5周至约每7周、约每6周至约每8周以及约每6周至约每2个月。在一些实施方案中，给药方案为约每周至约每2周、约每10天至约每3周、或约每2周至约每4周。
在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增强、恢复、促进和/或刺激免疫调节或可在涉及增强、恢复、促进和/或刺激免疫调节的方法中发现用途。在一些实施方案中，本文所述的本发明的嵌合蛋白恢复、促进和/或刺激一种或多种针对肿瘤细胞的免疫细胞的活性或活化，所述免疫细胞包括但不限于：T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤细胞(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如，M1巨噬细胞)、B细胞和树突细胞。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白增强、恢复、促进和/或刺激T细胞的活性和/或活化，包括(作为非限制性实例)活化和/或刺激一种或多种T细胞内在信号，包括促生存信号；自分泌或旁分泌生长信号；p38 MAPK-、ERK-、STAT-、JAK-、AKT-或PI3K-介导的信号；抗凋亡信号；和/或促进以下一项或多项和/或以下一项或多项所必需的信号：促炎细胞因子产生或T细胞迁移或T细胞肿瘤浸润。
在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够引起一种或多种T细胞(包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、天然杀伤T(NKT)细胞)、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞(例如，M1和M2中的一个或多个)增加进入肿瘤或肿瘤微环境中或在涉及引起一种或多种T细胞(包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、天然杀伤T(NKT)细胞)、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞(例如，M1和M2中的一个或多个)增加进入肿瘤或肿瘤微环境中的方法中发现用途。在一些实施方案中，嵌合蛋白增强CD8+T细胞、特别是那些已经浸润到肿瘤微环境中的T细胞对肿瘤抗原的识别。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白诱导CD19表达和/或增加CD19阳性细胞(例如，CD19阳性B细胞)的数量。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白诱导IL-15Rα表达和/或增加IL-15Rα阳性细胞(例如，IL-15Rα阳性树突细胞)的数量。
在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够抑制和/或引起免疫抑制细胞(例如，髓源性抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)、肿瘤相关中性粒细胞(TAN)、M2巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM))减少或在涉及抑制和/或引起免疫抑制细胞(例如，髓源性抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)、肿瘤相关中性粒细胞(TAN)、M2巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM))减少的方法中发现用途，特别是在肿瘤和/或肿瘤微环境(TME)中。在实施方案中，本发明的疗法可改变肿瘤部位和/或TME中M1与M2巨噬细胞的比率以有利于M1巨噬细胞。
在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增加各种细胞因子的血清水平，所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)中的一种或多种。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增强经过治疗的受试者血清中的IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)。
一方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是被T淋巴细胞表达的受体，也称为CD258或TNFSF14)的胞外结构域的第二结构域。在一些实施方案中，以选自以下的给药方案对受试者进行给药：每3天至约每10天、约每周至约每2周、约每10天至约每3周、约每2周至约每4周、约每3周至约每5周、约每4周至约每6周、约每5周至约每7周、约每6周至约每8周以及约每6周至约每2个月。在一些实施方案中，给药方案为约每周至约每2周、约每10天至约每3周或约每2周至约每4周。在一些实施方案中，初始剂量选自约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约21mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约27mg/kg、约30mg/kg、约33mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约45mg/kg、约48mg/kg和约50mg/kg。在一些实施方案中，剂量选自约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约21mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约27mg/kg、约30mg/kg、约33mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约45mg/kg、约48mg/kg和约50mg/kg。在实施方案中，剂量以每周一次或每两周一次的时间表施用。在实施方案中，该方法还包括向受试者施用致敏剂量。
一方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中诱导淋巴细胞扩增的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是被T淋巴细胞表达的受体，也称为CD258或TNFSF14)的胞外结构域的第二结构域。在一些实施方案中，以选自以下的给药方案对受试者进行给药：约每3天至约每10天、约每周至约每2周、约每10天至约每3周、约每2周至约每4周、约每3周至约每5周、约每4周至约每6周、约每5周至约每7周、约每6周至约每8周、以及约每6周至约每2个月。在一些实施方案中，给药方案为约每周至约每2周、约每10天至约每3周、或约每2周至约每4周。在一些实施方案中，初始剂量选自约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约21mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约27mg/kg、约30mg/kg、约33mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约45mg/kg、约48mg/kg和约50mg/kg。在一些实施方案中，剂量选自约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约21mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约27mg/kg、约30mg/kg、约33mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约45mg/kg、约48mg/kg和约50mg/kg。在一些实施方案中，剂量以每周一次或每两周一次的时间表施用。在实施方案中，该方法还包括向受试者施用致敏剂量。
一方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中诱导淋巴细胞边缘化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是被T淋巴细胞表达的受体，也称为CD258或TNFSF14)的胞外结构域的第二结构域。在一些实施方案中，以选自以下的给药方案对受试者进行给药：约每3天至约每10天、约每周至约每2周、约每10天至约每3周、约每2周至约每4周、约每3周至约每5周、约每4周至约每6周、约每5周至约每7周、约每6周至约每8周、以及约每6周至约每2个月。在一些实施方案中，给药方案为约每周至约每2周、约每10天至约每3周、或约每2周至约每4周。在一些实施方案中，初始剂量选自约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约21mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约27mg/kg、约30mg/kg、约33mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约45mg/kg、约48mg/kg和约50mg/kg。在一些实施方案中，剂量选自约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约21mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约27mg/kg、约30mg/kg、约33mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约45mg/kg、约48mg/kg和约50mg/kg。在实施方案中，剂量以每周一次或每两周一次的时间表施用。在实施方案中，该方法还包括向受试者施用致敏剂量。
一方面，本公开涉及一种评价癌症治疗在有需要的受试者中的功效的方法，该方法包括以下步骤：施用一定剂量的嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是被T淋巴细胞表达的受体，也称为CD258或TNFSF14)的胞外结构域的第二结构域，其中剂量为约0.03mg/kg至约50mg/kg；从受试者获取生物样品；对生物样品进行测定以确定选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的细胞因子的水平和/或活性；如果受试者的选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的至少一种细胞因子的水平和/或活性增加，则继续给药。
一方面，本公开涉及选择受试者以用癌症疗法进行治疗的方法，该方法包括以下步骤：施用一定剂量的嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：(a)是包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域的第一结构域，(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且(c)是包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)，其是被T淋巴细胞表达的受体，也称为CD258或TNFSF14)的胞外结构域的第二结构域，其中剂量为约0.03mg/kg至约50mg/kg；从受试者获得生物样品；对生物样品进行测定以确定选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的细胞因子的水平和/或活性；如果受试者的选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的至少一种细胞因子的水平和/或活性增加，则选择该受试者以用癌症疗法进行治疗。
实施例
提供本文的实施例是为了说明本公开的优点和益处，并进一步帮助本领域普通技术人员制备或使用对抗PD-1、抗PD-L1和/或抗PD-L2疗法有抗性的细胞。还呈现本文的实施例以便更全面地说明本公开的优选方面。这些实施例决不应被解释为限制由所附权利要求限定的本公开的范围。实施例可以包括或并入上述本公开的任何变型、方面或实施方案。上述变型、方面或实施方案还可各自包括或并入本公开的任何或所有其他变型、方面或实施方案的变型。
实施例1：抗PD-1抗性CT26肿瘤的产生
对鼠结肠癌CT26细胞进行选择以在抗PD-1治疗中存活以产生抗PD-1抗体抗性CT26细胞。用于产生抗PD-1抗性CT26肿瘤细胞的方法在图1A中示出。简言之，BALB/C小鼠获自Jackson Laboratory，经过几天的适应后，在小鼠后胁上接种500,000个鼠结肠癌CT26细胞。当平均肿瘤体积达到80-100mm3(表示第0天)时，在第0、3和6天对小鼠进行一系列腹膜内注射100μg抗PD-1(克隆RMP1-14；BioXcell)。在初始治疗后大约10-14天，从对抗PD-1疗法没有反应的小鼠中切除肿瘤。使用胶原酶(StemCell Technologies)解离肿瘤，在1x PBS中洗涤，并铺在补充有10％胎牛血清、1％GLUTiMAX和1％抗生素-抗真菌剂(全来自GIBCO)的IMDM培养基中。细胞传代至少5次，然后如上述(第2轮)接种到新的接受小鼠中。同样，当肿瘤达到80-100mm3时，开始另一个抗PD-1疗程：在第0、3和6天腹膜内注射100μg抗PD-1(克隆RMP1-14；BioXcell)。这一过程总共重复了4轮，此时所有接受治疗的小鼠均不对抗PD-1疗法产生反应。2轮抗PD-1选择后产生的细胞系在本公开全文中被称为“第二轮”、“第二代”或“F2代”。4轮抗PD-1选择后产生的细胞系被称为“第4轮”、“第4代”或“F4代”。
比较了抗PD-1抗体在CT26细胞或抗PD-1抗体抗性CT26细胞-同种异体移植物中的功效。简而言之，BALB/C小鼠在后胁接种CT26亲代细胞和PD-1抗性第四代细胞。当起始肿瘤体积(STV)达到80-100mm3时，将小鼠随机分为以下两个治疗组：(1)溶媒(PBS)和(2)抗PD-1抗体。在第0、3和6天，对小鼠给予一系列腹膜内注射的溶媒或100μg抗PD-1(克隆RMP1-14；BioXcell)。在指定天数测量肿瘤体积并绘制为时间的函数。如图1B所示，与仅用溶媒的对照相比，当用抗PD-1抗体治疗时，CT26亲代细胞肿瘤的生长显著延缓(比较图1B中的灰色实线与黑色实线)。相比之下，PD-1抗性细胞几乎没有表现出对肿瘤的抑制(如果有的话)。这些结果尤其证明，在具有免疫能力的小鼠中在疗法后出现抗PD-1抗性细胞的抗PD-1抗性(获得性抗性)。
因此，开发了抗PD-1抗体抗性细胞。此外，还开发了含有抗PD-1抗性细胞的小鼠细胞模型。因此，本文公开的小鼠模型可用于通过向携带抗PD-1抗体抗性CT26同种异体移植物的小鼠施用抗癌候选药物来测试抗癌候选药物，并评价该抗癌候选药物是否有效减缓或抑制癌症的生长。可以将有效减缓或抑制癌症生长的抗癌药物或候选药物配制，用于施用于人类患者。
实施例2：使用RNA-seq对抗PD-1抗性细胞系进行转录组分析
三瓶不同的亲代CT26细胞(ATCC；“实验重复”)、从“第二轮”小鼠独立分离的两个肿瘤、从“第四轮”小鼠独立分离的四个肿瘤(均为“生物重复”)在有或没有20ng/mL小鼠IFNγ(Biolegend)的情况下在37℃/5％ CO2下培养24小时。第二天，根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy试剂从细胞中分离RNA，包括QIASHREDDER匀浆和柱上DNaseI消化。对分离的RNA进行RNA-seq和数据分析。简而言之，生成测序文库并在ILLUMINA HISEQ(2x150配对末端读数)上进行测序，目标每个样品>20×106个读数。使用TRIMMOMATIC v.0.36调整序列，并使用STAR ALIGNER v.2.5.2b将序列映射到小家鼠(Mus musculus)GRCm38参考基因组。使用来自SUBREAD软件包v.1.5.2的FEATURECOUNTS计算独特的基因命中计数。仅计数位于外显子区域内的独特读数。使用DESeq2确定差异基因表达，并使用Wald检验生成p值和log2倍数变化；log2倍数变化>1且调整后的p值<0.05作为显著性的截止值。
如图2A(上图)所示，主成分分析(PCA)说明样品可以基于转录组表达在空间上分离。在各组(亲代与第2代、亲代与第4代、第2代与第4代)之间确定差异表达基因(DEG)，并绘制在热图中。如图2A(下图)所示，进行层次聚类对每一行上的基因进行排序，在每次比较中将基因分为2个主要簇，其中一个基因表达子集在一个数据集中较低(蓝色)，而在另一个数据集中较高(红色)。然后使用PANTHER应用程序对基因进行分析，以确定与每个基因集相关的基因本体(GO)。基因集与相关p值一起显示。在每个数据集中确定了上调或下调的基因。如图2B所示，与亲代CT26细胞相比，与以下GO相关的基因在第二代细胞中上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控和细胞增殖的调控。与亲代CT26细胞相比，与以下GO相关的基因在第二代细胞中下调：磷脂外流、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装和质膜修复(图2B)。进一步地，如图2B所示，与亲代CT26细胞相比，在第四代细胞中与以下GO相关的基因上调：IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、先天免疫应答的调控。这是令人惊讶的，尤其是因为众所周知，针对IFNγ的细胞应答涉及对抗PD-1和其他免疫治疗剂的敏感性。与亲代CT26细胞相比，在第四代细胞中与以下GO相关的基因下调：靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控(图2B)。有趣的是，与第二代细胞相比，第四代细胞中与以下GO相关的基因上调：针对IFNγ的细胞应答、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、抗原加工/呈递的负调控以及内源肽经由MHC I类的抗原加工/呈递(图2B)。与第二代细胞相比，在第四代细胞中与以下GO相关的基因下调：线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程(图2B)。创建了所有数据集之间基因表达重叠的维恩图。如图2C(上图)所示，DEG显示第四代细胞和第二代细胞之间存在显著重叠。图2A(下图)显示了选定基因处的每百万份转录本(TPM；标准化表达数据)，证明了与PD-L1、抗原加工/呈递、蛋白翻译、ER运输相关的基因基线表达更高；在某些数据集中高于其他数据集。如图2C(下图)所示，基因Cd274、B2M、Tap1、Tap2、Casp1和Gasta3显示出从CT26亲代细胞到第二代细胞以及到第四代细胞的表达逐渐增加。此外，基因Rpl41、Rps15和Rps8显示从CT26亲代细胞到第二代细胞以及到第四代细胞的表达逐渐降低(图2C(下图))。如图2D所示，基因Stat1、Stat2、Irf、Ltbr和Pvr显示出从CT26亲代细胞到第二代细胞以及到第四代细胞的表达逐渐增加。
这些结果尤其确定了与对抗PD-1疗法的获得性耐药相关的生物标志物。此类生物标志物可用于识别可能从抗PD-1疗法中受益的患者或不会从抗PD-1疗法中受益的患者。因此，基于这些生物标志物，可以基于对来自患者的生物样品评价与本文公开的一种或多种基因本体(GO)通路相关的基因在该样品中的存在、不存在或水平来选择患者进行采用抗PD-1疗法的治疗。例如，当Rpl41、Rps15和Rps8中的一种或多种的表达高和/或Cd274、B2m、Tap1、Tap2、Casp1和Gasta3中的一种或多种的表达低时，可以指示能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。相比之下，例如，当Rpl41、Rps15和Rps8中的一种或多种的表达低和/或Cd274、B2m、Tap1、Tap2、Casp1和Gasta3中的一种或多种的表达高时，可以不指示能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。以Rpl41、Rps15和Rps8中的一种或多种的低表达和/或Cd274、B2m、Tap1、Tap2、Casp1和Gasta3中的一种或多种的高表达为特征的患者可能受益于消除PD-1-无反应细胞的辅助或新辅助疗法。
实施例3：抗PD-1抗性CT26中PD-L1、PD-L2、MHC I类和β2微球蛋白的细胞表面表达
由于Cd274(PD-L1)、β2微球蛋白(B2m)以及Tap1和Tap2基因(可能参与主要组织相容性复合物I类相关抗原向内质网的加工和转运)从CT26亲代细胞到第二代细胞以及到第四代细胞逐渐下调，研究了PD-L1、PD-L2、MHC I类和β2微球蛋白(B2m)的表面表达。简而言之，从培养物中收获亲代和第二代细胞以及第四代细胞，并通过流式细胞术分析PD-L1、PD-L2、MHC I类和β2微球蛋白(B2M)的表面表达。如图所示绘制门控，每个图上方显示的是每个门控中的细胞百分比，每个百分比的右侧是每个标志物的MFI(平均荧光强度)。如图3所示，与亲代细胞相比，在第四代抗PD-1抗性细胞中PD-L1、MHC I类和β2微球蛋白(B2M)的表面表达没有下调。另一方面，与亲代细胞相比，在第四代抗PD-1抗性细胞中PD-L2的表面表达下调。这些数据表明，与RNA表达相比，在PD-L1/2MHC I类和B2M中观察到表面表达的基因表达和细胞表面蛋白表达不一致。
实施例4：抗PD-1抗性细胞系和原发性抗性抗PD-1抗性细胞系的转录组分析
接下来，通过相互比较以及与抗PD-1原发性抗性细胞系的比较，研究了第二代和第四代抗PD-1抗性细胞系的转录组谱。使用B16.F10鼠黑色素瘤肿瘤细胞系作为抗PD-1“原发性抗性”模型，因为这些肿瘤对抗PD-1疗法没有反应。三瓶不同的亲代CT26细胞(ATCC；“实验复制”)、从“第二轮”小鼠独立分离的两个肿瘤、从“第四轮”小鼠独立分离的四个肿瘤(均为“生物复制”)，以及两瓶不同的亲代B16.F10细胞(ATCC；“实验重复)在有或没有20ng/mL小鼠IFNγ(Biolegend)的情况下在37℃/5％ CO2下培养24小时，以评估体外反应性。这模仿了肿瘤细胞在体内如何反应，因为免疫细胞浸润并分泌效应细胞因子如IFNγ。第二天，根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy试剂从细胞中分离RNA，包括QIASHREDDER匀浆和柱上DNaseI消化。对分离的RNA进行RNA-seq和数据分析。简而言之，生成测序文库并在ILLUMINAHISEQ(2×150配对末端读数)上进行测序，目标每个样品>20×106读数。使用TRIMMOMATICv.0.36调整序列，并使用STAR ALIGNER v.2.5.2b将序列映射到小家鼠GRCm38参考基因组。使用来自SUBREAD软件包v.1.5.2的FEATURECOUNTS计算独特的基因命中计数。仅计数位于外显子区域内的独特读数。使用DESeq2确定差异基因表达，并使用Wald检验生成p值和log2倍数变化；log2倍数变化>1且调整后的p值<0.05作为显著性的截止值。在未处理和IFNγ处理的亲代CT26之间鉴定了DEG。如图4A(左图)所示，Log2倍数变化绘制在热图中，并且基于亲代CT26对基因进行层次聚类。其中，338个基因具有来自其他数据集的可用数据；并且这些值显示在其他列中(图4A(左图))。基因分为3个主要簇(图4A(左图))。将相关基因输入PANTHER以识别与失调基因相关的通路，并识别与DEG相关的GO通路。如图4A(右图)所示，与亲代CT26细胞和B16.F10细胞相比，与以下GO通路相关的基因的表达上调在第二代细胞和第四代细胞中都被富集：L-苯丙氨酸分解代谢过程、磷脂外流、酪氨酸分解代谢过程、RNA聚合酶II启动子响应于酸性pH的转录的正调控以及药物输出。因此，与这些GO通路中的一种或多种相关的基因上调可能与对抗PD-1疗法的获得性耐药相关。此外，与亲代CT26细胞和B16.F10细胞相比，在第四代细胞中观察到与以下GO通路相关的基因的表达下调：保护免受NK细胞介导的细胞毒性、IGS15蛋白缀合、经由MHC I类的抗原加工/呈递、MHC蛋白复合物组装、以及胞质溶胶至ER运输(图4A(右图))。因此，这些GO通路中的一种或多种的下调可能与对抗PD-1疗法的获得性抗性相关。如图4A(右图)所示，与亲代CT26细胞相比，在第四代细胞和B16.F10细胞中与以下GO通路相关的基因的表达下调得到富集：IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控以及炎症反应的调控。因此，这些GO通路中的一种或多种的下调可能与对抗PD-1疗法的抗性相关。图4B显示了所选基因处的每百万份转录本(TPM；标准化表达数据)。如图4B所示，虽然CT26抗PD-1抗性细胞具有I型和II型干扰素的基线过度活化，但当这些细胞受到IFNγ攻击时，这些细胞下调这些基因。这尤其令人惊讶，因为众所周知，IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控以及炎症反应的调控全都涉及抗PD-1和其他免疫治疗剂的敏感性。
这些结果尤其建立了与对抗PD-1疗法的获得性抗性相关的生物标志物，以及与对抗PD-1疗法的抗性相关的生物标志物(获得性或原发性抗性)。此类生物标志物可用于识别可能从抗PD-1疗法中受益的患者或不会从抗PD-1疗法中受益的患者。因此，基于这些生物标志物，可以基于对来自患者的生物样品评价与本文公开的一种或多种基因本体(GO)通路相关的基因在该样品中的存在、不存在或水平来选择患者进行采用抗PD-1疗法的治疗。例如，当Trim7和/或Ank3的表达高和/或Tap2和/或Casp1的表达低时，可以指示能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。相比之下，例如，当Trim7和/或Ank3的表达高和/或Tap2和/或Caspl的表达低时，不指示能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。以Trim7和/或Ank3高表达时和/或Tap2和/或Caspl低表达时为特征的患者可能受益于消除PD-1无反应细胞的辅助或新辅助疗法。
实施例5：与亲代细胞相比，在抗PD-1抗性细胞中差异调控的基因的矛盾失调
接下来，研究了与野生型CT26细胞相比IFNγ对在第四代抗PD-1抗性细胞中差异表达的某些基因的表达的影响。简而言之，将亲代CT26细胞、第二代抗PD-1抗性细胞和第四代抗PD-1抗性细胞在有或没有20ng/mL小鼠IFNγ(Biolegend)的情况下在37℃/5％ CO2下培养24小时。第二天，根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy试剂从细胞中分离RNA，包括QIASHREDDER匀浆和柱上DNaseI消化。对分离的RNA进行RNA-seq和数据分析。简而言之，生成测序文库并在ILLUMINA HISEQ(2×150配对末端读数)上进行测序，目标每个样品>20×106个读数。使用TRIMMOMATIC v.0.36调整序列并使用STAR ALIGNER v.2.5.2b映射到小家鼠GRCm38参考基因组。使用来自SUBREAD软件包v.1.5.2中的FEATURECOUNTS计算独特的基因命中计数。仅对落在外显子区域内的独特读数进行计数。使用DESeq2确定差异基因表达，并使用Wald检验生成p值和log2倍数变化；Iog2倍数变化>1且调整后的p值<0.05作为显著性的截止值。
为了了解IFNγ的影响，对被过表达(Cd274和B2m)或抑制(Trim7和Lrg1)的代表性基因的每百万份转录本(TPM；标准化表达数据)进行了分析。正如预期的，Cd274(PD-L1)的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞增加(图5A(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的Cd274的表达增加(比较图5A中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Cd274(PD-L1)的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图5A(右图))。
正如所预期的，B2M的表达也从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞增加(图5B(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的B2M的表达增加(比较图5B中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、B2M的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图5B(右图))。
正如所预期的，Trim7的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图5C(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的Trim7的表达增加(比较图5C中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Trim7的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图5C(右图))。
类似地，Lrg1的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图5D(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的Lrg1的表达增加(比较图5D中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Lrg1的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞降低(图5D(右图))。
这些结果尤其表明，当在存在或不存在IFNγ的情况下生长时，与亲代癌细胞相比，Cd274、B2m、Trim7和Lrg1等基因出现矛盾失调。
实施例6：鉴定抗性驱动基因
由于在多个基因上观察到失调，不受理论的束缚，因此假设矛盾失调是对抗PD-1剂的获得性抗性的功能性结果。为了鉴定参与观察到的矛盾失调的驱动基因，进行了图6A中公开的分析。简而言之，鉴定了在IFNγ的存在下生长时，与亲代CT 26细胞相比，第四代抗PD-1抗性细胞中的差异表达基因(DEG)。如图6A(小图1)所示，与CT26细胞相比，在IFNγ的存在下，第四代抗PD-1抗性细胞有1,999个基因被下调，3607个基因被上调。从这些基因中，鉴定出那些在第四代抗PD-1抗性细胞中下调但在CT26细胞中上调的基因。如图6A(小图2)所示，使用这种标准缩减到1,060个基因在第四代抗PD-1抗性细胞中下调但在CT26细胞中上调，基于对IFNγ的响应性对这些基因进行进一步缩减。如图6A(小图3)所示，根据对IFNγ的响应性排序显示，与CT26细胞相比，第四代抗PD-1抗性细胞有688个基因被下调。这些基因包括Lrg1、Spry2、Arg1、Trim8、Trim2、Mapk8ip1、Trim7、Trim6等(图6A(小图3))。
然后，为了进一步缩减这些基因，在小鼠体内培养亲代CT26细胞、第二代抗PD-1抗性细胞和第四代抗PD-1抗性细胞。从肿瘤中分离RNA并进行RNA-seq和数据分析。来自688个基因(图6A(小图3))。鉴定出那些在体内也上调的基因。如图6A(小图4)所示，与CT26细胞相比，在体内在第四代抗PD-1抗性细胞中有70个基因上调，这些基因包括Krt8、Mapk8ip1、Arg1和Lrg1。图6B显示在图6A中的至少两个步骤中富集的基因本体(GO)通路。该分析确定了TRIM家族的蛋白(尤其是Trim7)、Mapk8ip1、Elk1、Lrg1、Arg1是一些驱动因素。图6C显示受TRIM家族蛋白影响的功能通路。图6D显示了Elk1和c-Jun发挥作用的功能通路。图6E显示Lrg1、B2m和Arg1与其他基因之间的功能连接。图6F显示在癌症基因组图谱(TCGA)癌症基因组程序中肿瘤和周围正常组织中的Elk1的表达水平。
实施例7：另外的差异调控基因的矛盾失调
分析了过表达的其他代表性基因(Stat1、Stat2、Irf1和Tap1)的每百万份转录本(TPM；标准化表达数据)。Stat1的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞增加(图7A(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的Stat1的表达增加(比较图7A中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Stat1的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞降低(图7A(右图))。
Stat2的表达也从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞增加(图7B(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的Stat2的表达增加(比较图7B中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Stat2的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图7B(右图))。
类似地，Irf1的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞增加(图7C(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的Irf1的表达增加(比较图7C中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Irf1的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图7C(右图))。
正如所预期的，Tap1的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞增加(图7D(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的Tap1的表达增加(比较图7D中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Tap1的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图7D(右图))。
实施例8；差异调控基因的通路分析
使用基于WEB的GEne SeT分析工具包(WebGestalt)进行通路分析。简而言之，基于第四代抗PD-1抗性细胞和亲代CT-26样品之间表达的倍数差异，对在第四代抗PD-1抗性细胞中下调但在CT26细胞中上调的前1,000个基因(参见图6A(小图2))进行排序。将这些基因和排序输入WebGestalt，以使用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路功能数据库来鉴定与这些基因相关的富集/去富集通路。使用Benjamini-Hochberg错误发现率(false discovery rate，FDR)进行统计显著性。该分析表明，与亲代CT-26细胞相比，第四代抗PD-1抗性细胞中以下通路过度活跃：昼夜节律诱导(circardian entrainment)、cAMP信号传导通路、胆碱能突触、黑色素生成、Rap1信号传导通路、人巨细胞病毒感染、人免疫缺陷病毒1感染、谷氨酸能突触、癌症中的通路和Ras信号传导通路(图8A)。与亲代CT-26细胞相比，在第四代抗PD-1抗性细胞中以下通路受到抑制：系统性红斑狼疮、癌症中的微RNA、肝细胞癌、结核病和内质网中的蛋白加工。为了可视化富集分数和显著性，基于图8A中呈现的数据制备火山平台(volcano plat)。图8B显示火山图(volcano plot)。如图8B所示，虽然昼夜节律诱导是右侧最远的“点”，但癌症和Ras信号传导的通路最高(即具有最显著的FDR值)。尽管没有很强的显著性(所有FDR>.05，这通常发生在基因组学的噪音中)，Ras/Rap1信号传导通路在这种无偏见分析中被鉴定出来。图8C显示RAS信号传导通路，说明与Raf/Mek/Erk信号传导的融合。图8D显示RAP1信号传导通路，说明与Raf/Mek/Erk信号传导的融合。
实施例9：Ccl5(RANTES)、Cxcl10(IP-10)和Ifnb1的矛盾失调
接下来分析了Ccl5(RANTES)、Cxcl10(IP-10)和Ifnb1的每百万份转录本(TPM；标准化表达数据)。这些基因是由Trim7的激活诱导的。
Ccl5(RANTES)和Cxcl10(IP-10)属于受IFNγ调控的基因。调控Ccl5(RANTES)和Cxcl10(IP-10)的启动子含有STAT1二聚体和/或ISGF3的结合位点。正如所预期的，Ccl5(RANTES)的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞和第四代抗PD-1抗性细胞增加(图9A(左图))。当野生型CT26细胞用IFNγ诱导时，野生型CT26细胞中增加的Ccl5(RANTES)的表达增加(比较图9A中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Ccl5(RANTES)的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图9A(右图))。
正如所预期的，Cxcl10(IP-10)的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞增加(图9B(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的Cxcl10(IP-10)的表达增加(比较图9B中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Cxcl10(IP-10)的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图9B(右图))。
Ifnb1的表达也从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞增加(图9C(左图))。当用IFNγ诱导野生型CT26细胞时，野生型CT26细胞中增加的Ifnb1的表达增加(比较图9C中的闭合圆圈数据(左图和右图))。矛盾的是，响应于IFNγ、Ifnb1的表达从野生型CT26细胞到第二代抗PD-1抗性细胞以及到第四代抗PD-1抗性细胞减少(图9C(右图))。
这些结果尤其说明，对抗PD-1的获得性抗性与Trim7调控基因(例如Ccl5(RANTES)、Cxcl10(IP-10)和Ifnb1)的矛盾调控相关。
实施例10：材料和方法
构建体生成和蛋白纯化
人和小鼠TIGIT-Fc-LIGHT的序列经过密码子优化并定向克隆到哺乳动物表达载体中。然后将载体瞬时转染至Expi293细胞或稳定转染至CHO细胞，并使用亲和色谱法纯化所得融合蛋白。
蛋白质印迹
根据制造商的建议，将人(h)和小鼠(m)TIGIT-Fc-LIGHT蛋白用+/-去糖基酶PNGase F(NEB)在37℃下处理1小时，然后是+/-还原剂β-巯基乙醇(BME)，并在SDS上样缓冲液中稀释，然后通过SDS-PAGE进行分离。用于探测hTIGIT-Fc-LIGHT和mTIGIT-Fc-LIGHT的一抗获自Cell Signaling Technologies、Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.和RandD Systems。
MSD和ELISA检测
双重结合效力测定
对于TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白；将MSD多阵列板(MSD)在4℃下用重组人LTβR-Fc或HVEM-Fc(Acro Biosystems)预包被过夜。将板在室温下在摇床上用Diluent 100(MSD)封闭至少一小时。洗涤后，添加分析样品，然后连续稀释3倍并加载到一式两份孔中以产生8-10个测试浓度。用重组生物素化人PVR(Acro Biosystems)检测结合的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白。添加与钌(MSD)缀合的链霉亲和素以结合生物素标记的检测器。将MSD Gold Reading缓冲液(MSD)添加到板中，施加电荷后，产生电化学发光信号，并使用MSD MESO QuickPlex SQ120MM(型号1300)进行检测，以生成相对光单位(RLU)。使用mTIGIT-Fc-LIGHT和鼠重组PVR、HVEM和LTβR(Acro Biosystems)进行类似的测定。
基于抗体的结合测定
如对上文双重效力测定所述进行相同的方法，但是用抗人TIGIT捕获TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白，并用抗人LIGHT-生物素检测(所有抗体均来自RandD Systems)，然后用链霉亲和素磺基-标签检测。
DCR3封闭测定
人类健康供体(2名不同的供体)和癌症患者(肾癌、非小细胞肺癌和前列腺癌)血清样品均从Innovative Research获得。根据制造商的说明，使用MSD DcR3检测试剂来分析每个样品中可溶性DcR3的水平。为了评估DcR3的血清水平是否足以抑制TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与PVR或HVEM的结合，将每个血清样品中的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在冰上单独孵育20分钟。这一孵育之后，将样品加载到用人重组HVEM预包被的MSD板上。然后根据上文所述双重效力测定法处理板，其中使用人重组PVR作为检测试剂。
受体/配体相互作用的基于生物层干涉测量法的亲和力测试
使用组氨酸或生物素标记版本的人重组蛋白(PVR、HVEM、LTβR、PVRL2、PVRL3和连接蛋白-4；购自Acro Biosystems或Sino Biological)，使用基于生物层干涉测量法的亲和力测试来确定TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与预期结合靶标的结合率(Ka)、解离率(Kd)和结合亲和力(KD)。还并行测试了市售或内部生产的单侧融合蛋白对照(TIGIT-Fc和Fc-LIGHT)。将靶标以在动力学缓冲液(PBS/.1％ Tween-20/1％BSA；pH7.0)中为3μg/mL的浓度固定到抗-pentaHis或链霉亲和素包被的生物传感器上。在Octet-Red96BLI仪器上进行融合蛋白与重组靶蛋白的直接结合，使用分别为90秒和120秒的结合和解离时间。
细胞培养
CHO-K1、CT26/WT、B16.F10、CT26/AR、Jurkat和A375细胞获自ATCC，并根据其指南进行培养；保持在5％ CO2、37℃下。每月使用Venor GeM支原体检测试剂盒(Sigma)检测活跃培养物中的所有亲代细胞系。所有转染的细胞系在转染后进行另外两次测试(间隔至少两周)，并确认支原体保持阴性。
体外细胞系生成
生成稳定细胞系以评估人或小鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的体外结合；包括CHO-K1/hPVR、CHO-K1/hHVEM和CHO-K1/mLTβR。简而言之，cDNA载体获自RandD systems或Origene，并将其克隆到pcDNA3.1(-)(Thermo Fisher)中，然后根据制造商的说明书用4D-Nucleofector and Cell Line Nucleofector Kit SE(Lonza)对亲代CHO-K1或Jurkat细胞进行核转染。使用有限稀释进行抗生素选择和单细胞克隆后，使用流式细胞术验证受体表达，并将所得细胞系用于体外结合测定。
体外功能测定
NFkB-信号传导：非规范
表达LTβR的U2OS/NIK/NFκB报告细胞购自Eurofins/DiscoverX，并根据他们的建议进行培养。测定当天，将1×104个U2OS/NIK/NFκB报告细胞接种到含有Fc-LIGHT或TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的96孔板的每个孔中。培养6小时后，在发光计(Promega)上评估发光活性。
TIGIT/PVR/DNAM1报告基因检测
根据制造商的说明使用CD155(PVR)/TIGIT封闭测定(Promega)。该试剂由表达人CD155(PVR)的CHO-K1靶细胞和表达人TIGIT、CD226(DNAM1)的Jurkat效应细胞和共刺激物响应荧光素酶表达载体组成。还使用流式细胞术证实Jurkat效应物表达人HVEM。为了进行测定，将Jurkat效应细胞铺板到白色96孔板(Costar)中，并在37℃/5％ CO2下孵育过夜。第二天，将细胞与CHO-K1靶细胞和以下测试品共培养：重组人IgG4(阴性对照)、抗DNAM1封闭抗体、Fc-LIGHT或TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白。还使用抗LIGHT封闭抗体来封闭TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的共刺激结构域的功能。所有抗体和试剂均购自Acro Biosystems、SinoBiologics或RandD Systems。额外培养6小时后，使用Promega Navigator发光计上的自动注射器将Bio-Glo试剂(Promega)添加到孔中，并测定相对发光(RLU)。
NK/T细胞杀伤测定
将CT26肿瘤细胞铺板到透明的96孔板中，并在37℃/5％ CO2下培养过夜。使用EasySep小鼠NK细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)从BALB/c小鼠的脾脏中分离NK细胞。还使用EasySep小鼠T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)从BALB/c小鼠的脾脏中分离出总T细胞。使用抗小鼠CD3/CD28磁珠(StemCell Technologies；推荐浓度的1/10)对T细胞进行次优刺激48小时。在共培养当天，将NK(2.5个效应物：1个靶细胞比例)或T(5个效应物：1个靶细胞比例)细胞添加到含有CT26肿瘤细胞+/-mTIGIT-Fc-LIGHT和胱天蛋白酶3/7-green试剂(Essen Bioscience)的板中，用于评估肿瘤细胞杀伤力。在IncucyteS3平台上拍摄图像，并使用Incucyte软件对随时间推移的荧光信号(细胞死亡的增加)进行定量。
T初始(Tn)和T干细胞记忆(Tscm)分化和分析
获得健康人类供体PBMC，并使用初始CD8磁性分离试剂盒(细胞和分离试剂盒来自StemCell Technology)分离CD8+T细胞。将分离的细胞在AIMV培养基(GIBCO)中在细胞与珠子比例为1:3的抗人CD3/CD28磁珠(Invitrogen)、20IU ml-1人重组IL-2(RandD Systems)和5μM TWS119(SelleckChem)的存在下培养9天。Gattinoni等人,A human memory T cellsubset with stem cell-like properties.Nat Med 17,1290-1297(2011)。孵育后，分离细胞并使用Human TruStain FcX Fc受体封闭溶液(BioLegend)封闭Fc受体。然后使用与CD3、CD8、CCR7、CD45RO、CD62L、CD45RA、CD27、IL7Rα、IL2Rβ和CD95荧光缀合的抗体(所有抗体均来自BioLegend)通过流式细胞术分析细胞。
AIMV增殖测定和细胞因子分析
将健康人供体PBMC以在每mL AIM-V培养基(Gibco)中200万个细胞的密度铺板在含有溶媒(PBS)、TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT(150nM)、TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT(150nM)、抗TIGIT(150nM，IgG1克隆#HuTIG1-IgG1.AA，Creative Biolabs)、抗PD-1(150nM，派姆单抗)或抗TIGIT和抗PD-1的组合的24孔板中。对于TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT，在为期6天的时间进程中评估人类供体处理的PBMC的融合。对于TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT，根据制造商的建议，在培养7天后进行Promega MTS增殖测定。在为期～7天的过程中在Incucyte S3成像仪上对板进行成像。在第2天和第7天，拍摄静态图像以证明处理组之间形态的差异。实验结束时，使用Incucyte软件确定汇合百分比。采用相同处理组的重复板以相同的细胞密度接种，并置于37℃/5％ CO2的标准细胞培养箱中2天。在时间进程结束时，取出培养基，并根据制造商的建议，使用MSD多路阵列评估IFN、IL-8、IL-10、IL-12/p70和SDF-1a(CXCL12)的水平。
AIMV单细胞RNA测序(scRNA-seq)
为了评估用150nM TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT或TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT培养2天的PBMC的免疫转录组谱，使用10x Genomics Chromium处理器将来自经过处理的健康供体人PBMC中的单细胞分离成个体油滴。根据制造商的说明，使用10x Genomics Chromium NextGEM Single Cell 3’v3.1：双索引试剂生成单细胞文库。文库在Illumina NovaSeq 6000上进行测序，并使用10X cellranger pipeline(v 6.0.2)进行处理，以进行多路分离、条形码和UMI计数以及读取比对。来自>10,000个个体细胞的读数(>350×106)被映射到人hg38参考基因组(平均12K细胞/样品)。然后通过Seurat(v 4.0.2)分析过滤后的基因计数矩阵，以进行质量控制、标准化、整合、降维、可视化、细胞聚类和DEG分析。过滤少于200个、多于2500个基因或线粒体计数>15％的细胞。将基因计数标准化为总读取计数并缩放至10,000，然后进行对数转换。所有样品均使用2000个锚点特征进行集成，以消除批次效应。然后对集成数据进行缩放，并将前30个主成分(PC)用于一致流形逼近和投影(UMAP)可视化。使用前30个PC鉴定共享最近邻(SNN)，并将分辨率设置为0.4以进行细胞聚类。然后我们使用SingleR(v1.6.1)进行细胞类型注释。使用Wilcox方法对每个簇内的处理细胞与对照细胞进行差异表达分析。我们将测试限制为组间对数倍数变化阈值为0.25的基因。
SEB超抗原测定
原代PBMC(或小鼠脾细胞)获自健康供体(Stemcell technologies)或BALB/c小鼠，并在人或小鼠IgG对照(10μg/mL；Jackson Immunoresearch,Inc.)或TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的存在下与200ng/mL的超抗原SEB(List Biological Laboratories)一起孵育。3天后，收集培养物上清液并通过ELISA评估人或小鼠IL-2(BioLegend)的水平。
A375细胞刺激
据报道，表达LTβR的人A375细胞系经由LIGHT对共刺激做出反应(Hehlgans andMannel,2001)。简言之，将A375细胞以每孔2×105个细胞铺在24孔板中过夜。第二天早上，对细胞不经处理，或与100nM人抗LTβR(克隆71315，RandD Systems)或TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白一起培养。3小时后，从细胞中除去培养基，并将含有5％β巯基乙醇的Qiagen RLT缓冲液直接添加到孔中以裂解细胞进行RNA分离。使细胞材料通过QiaShredder柱(Qiagen)，然后使用Qiagen RNeasy试剂盒纯化RNA，包括柱上DNaseI消化。使用Origene First-StrandcDNA合成试剂对0.5-1μg RNA进行逆转录。人GAPDH、ACTB、CXCL8和CCL2的经验证的qPCR引物获自Origene。使用Sybr Green试剂和BioRad CFX96 Touch实时PCR检测系统(BioRadCFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)扩增cDNA。使用δ-δCt方法确定基因表达的倍数变化，其中将未处理对照与管家基因ACTB的靶基因表达设置为1的值。还使用第二管家基因(GAPDH)，作为响应于处理但不改变表达的基因的实例。
流式细胞术
简言之，适当时将细胞与Fc受体封闭剂(BioLegend)一起孵育，随后在冰上于黑暗中用荧光抗体染色30分钟。所示抗体购自BioLegend或Abcam。AH1-四聚体试剂购自MBLInternational，并在冰上于黑暗中孵育细胞1小时，然后添加其余的抗体混合物。在该孵育期之后，洗涤染色的细胞并重悬于FACS缓冲液(含有1％牛血清白蛋白(BSA)、0.02％叠氮化钠和2mM EDTA的1X PBS缓冲液)中。在BD LSRII Fortessa上进行流式细胞术。
肿瘤模型系统
对于CT26/WT、抗PD-1抗性CT26肿瘤(CT26/AR)和B16.F10研究，对BALB/c或C57BL/6小鼠分别在后胁皮下植入5×105个肿瘤细胞。当肿瘤体积达到～80-115mm3时，即第0天，根据肿瘤体积对小鼠进行随机分组并开始治疗。每个个体实验的平均起始肿瘤体积(STV)列于相应的图中。在治疗日，通过腹膜内(IP)注射溶媒(无菌PBS)、抗PD-1(克隆RMP1-14)、抗PD-L1(克隆10F.9G2)、抗TIGIT(克隆1G9)、抗LTβR(克隆4H8 WH2)、Fc-LIGHT或mTIGIT-Fc-LIGHT来治疗小鼠。LTβR抗体获自Adipogen和LSBio，所有其他治疗抗体均获自BioXCell。每种药剂的剂量和时间表列在相应的图和图例中。在整个时间进程中评估肿瘤体积(mm3)和总体生存率。生存标准包括肿瘤总体积小于1800mm3，且无肿瘤溃疡迹象。完全应答者(其中肿瘤已建立并随后被排斥)列在适当的图中。根据制造商的说明，在使用流式细胞术对肿瘤组织进行免疫分析以及使用Luminex多路阵列对血清和分离肿瘤进行细胞因子分析的各种实验期间，对CT26实验小鼠队列实施安乐死。从这些小鼠身上切下肿瘤，并使用肿瘤解离试剂盒(Miltenyi)解离肿瘤，并通过100μM过滤器匀浆，以分离肿瘤细胞和浸润免疫细胞。每幅图中都描述了实验组的大小，并且其是由最少两个独立实验生成的。
CD4、CD8和NK耗竭实验
在第-1天、第1天和第7天经由IP注射100μg抗CD4(克隆GK1.5)、100μg抗CD8(克隆2.43)或500μg抗NK(克隆NK1.1)来治疗小鼠。通过流式细胞术评估外周血中的CD4、CD8和NK细胞群以验证耗竭情况。
抗PD-1抗性CT26肿瘤的生成
如上所述，在小鼠后胁接种5×105CT26。当平均肿瘤体积达到80-100mm3(表示第0天)时，在第0、3和6天对小鼠给予腹膜内注射抗PD-1(克隆RMP1-14；BioXcell)，各自由100ug组成。从对抗PD-1疗法无反应的小鼠中切除肿瘤，使用胶原酶(StemCellTechnologies)解离，在1X PBS中洗涤，并铺在培养基中。将细胞传代2-4次，然后根据与上述相同的方案接种到新的接受小鼠中。同样，当肿瘤达到80-100mm3时，开始另一个抗PD-1疗程。这一过程总共重复了5轮，此时所有经过治疗的小鼠均未对抗PD-1疗法产生反应。在这种产生抗PD-1获得性抗药性的体内压力之后生成的细胞系被称为CT26/AR(本文先前已表征)。
人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在食蟹猴中的施用
将专门饲养的亚洲原产食蟹猴(Macaca fascicularis)饲养在Charles RiverLaboratories(Mattawan,MI)，采用这些动物进行的实验得到了Charles RiverLaboratories的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)的批准，遵循实验动物护理和使用指南(the Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)中阐述的原则。经由历经30分钟的静脉输注施用溶媒对照或TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白。每7天(第1、8、15、22天)施用溶媒(5名男性，5名女性)、0.1mg/kg(3名男性，3名女性)，1mg/kg(3名男性，3名女性)、10mg/kg(3名男性，3名女性)或40mg/kg TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(5名男性，5名女性)，总共4剂。在施用测试物品之前和之后，观察所有动物的潜在临床观察、体重、食物消耗、兽医体检、眼科检查、心电学检查、血压评估和神经系统评估。还进行了给药前和给药后临床病理学评估，包括血液学、凝血、临床化学和尿液分析。药效学评估包括对于血清细胞因子使用EDTA钾抗凝以及对于外周血流式细胞术研究使用肝素钠抗凝在给药前和给药后采集外周血。用于对外周免疫细胞进行染色以进行流式细胞术分析的抗体组包括来自BD Biosciences的靶向CD45和CD3的试剂以及来自Biolegend的靶向CD8和HVEM的试剂。
实验动物指南
所有鼠科动物研究均按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)并在获得其批准的情况下进行；并由有执照的兽医审查和批准。每天对实验小鼠进行监测，并在出现任何痛苦迹象之前通过CO2窒息然后是颈椎脱位对其进行安乐死。
生物信息学和统计分析
TCGA数据通过NIH GDC(EBPlusPlusAdjustPANCAN_IlluminaHiSeq_RNASeqV2.geneExp.tsv)访问。将读取计数标准化，以将基因表达的上四分位计数设置为1000。
实验重复次数(N)显示在图和图例中。除非另有说明，绘制的值代表最少2个不同实验的平均值，误差为SEM。使用未配对t检验或单向ANOVA与多重比较来确定统计显著性(p值)。显著性p值用一个或多个‘*’标记，表示*p<.05、**p<.01、***p<.001和****p<.0001。Mantel-Cox统计检验用于确定生存曲线之间的显著性。P值在这些图和补充的图例中注明。
实施例11：TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白针对抗PD-1抗性细胞系和原发抗性抗PD-1抗性细胞系的功效
生成了编码基于TIGIT和LIGHT的嵌合蛋白的构建体。“TIGIT-Fc-LIGHT”构建体包括经由源自IgG1的铰链-CH2-CH3 Fc结构域与人LIGHT的ECD融合的人TIGIT的胞外结构域(ECD)。参见图10A。
对该构建体进行了密码子优化以在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，转染至CHO细胞中，并选择高表达的个体克隆。然后将高表达克隆用于在搅拌生物反应器中在无血清培养基中进行小规模生产，并用Protein A结合树脂柱纯化相关嵌合融合蛋白。
TIGIT-Fc-LIGHT构建体经过密码子优化并在293细胞中瞬时表达，并使用protein-A亲和色谱法进行纯化。为了了解TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的天然结构，将未经处理的变性样品(即，在SDS的存在下煮沸，未经还原剂或去糖基化剂处理)与以下样品进行比较：(i)还原样品，其未经去糖基化(即仅用β-巯基乙醇处理，并在SDS的存在下煮沸)；和(ii)还原且去糖基化样品(即用β-巯基乙醇和去糖基化剂处理，并在SDS的存在下煮沸)。此外，为了确认TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的每个结构域的存在，将凝胶一式三份运行并使用抗TIGIT抗体(图10B，左印迹)、抗Fc抗体(图10B，中间印迹)或抗LIGHT抗体(图10B，右印迹)进行探测。蛋白质印迹表明在非还原泳道(图10B，每个印迹中的泳道NR)中存在占优势的二聚体带，其在还原剂β-巯基乙醇的存在下被还原为糖基化单体带(图10B，每个印迹中的泳道R)。如图10B所示，每个印迹中的泳道DG，在还原剂(β-巯基乙醇)和去糖基化剂的存在下，嵌合蛋白以约73kDa的预测分子量的单体形式运行。
TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白是一种双功能的Fc连接的融合蛋白，其是由哺乳动物生产细胞系中的单一表达载体合成并使用亲和色谱法纯化的。先前，使用尺寸排阻色谱法/多角度光散射(SEC-MALS)和电子显微镜(EM)来研究此类含有融合蛋白治疗剂的TNF配体的结构。在某些情况下，不希望受理论束缚，据信二硫键诱导中央Fc结构域的二聚化，以及TNF-配体结构域的基于电荷的三聚化；以在溶液中产生三聚体的二聚体。de Silva等人,CD40Enhances Type I Interferon Responses Downstream of CD47Blockade,BridgingInnate and Adaptive Immunity.Cancer Immunol Res 8:230-245(2020)；Fromm等人,Agonist redirected checkpoint,PD-1-Fc-OX40L,for cancer immunotherapy.JImmunother Cancer 6:149(2018)。预测TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白具有六聚体结构(图10A)。在非还原SDS-PAGE下对TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的分析证实了～140kDa的糖基化二硫键连接的二聚体的存在(SDS中和了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的基于电荷的三聚化)，在与β-巯基乙醇和PNGase-F一起孵育后，其可以被还原为预期分子量为59.3kDa的去糖基化单体(图10B)。人和小鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白构建体的所有三个蛋白结构域均经由蛋白质印迹被商业抗体识别(图10B和图24A)。
使用重组蛋白和基于细胞的方法对融合蛋白及其同源结合配偶体之间的蛋白-蛋白相互作用(PPI)进行了表征。首先，使用基于生物层干涉测量法的亲和力测试来评估受体/配体结合的动力学。TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白以3.52nM(比市售重组Fc-LIGHT对照高大约8倍)的亲和力与重组人LTβR结合，以4.07nM(与人TIGIT-Fc一致)的亲和力与人PVR结合。TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白以6.49nM与人HVEM结合，类似于Fc-LIGHT结合(2.12nM)(参见下表)。
靶标 分子 KD(nM) Kon(1/Ms) Koff(1/s) R2
rhLTβR Fc-LIGHT 2.84E-08 2.66E+05 7.54E-03 .7412
rhLTβR TIGIT-Fc-LIGHT 3.52E-09 2.12E+04 7.44E-05 .9992
rhHVEM Fc-LIGHT 2.12E-09 4.10E+05 8.76E-04 .9679
rhHVEM TIGIT-Fc-LIGHT 6.49E-09 2.61E+04 1.73E-04 .9942
rhPVR TIGIT-Fc 5.24E-09 2.96E+05 1.54E-03 .9633
rhPVR TIGIT-Fc-LIGHT 4.07E-09 2.53E+04 1.03E-04 .9984
rhCD112(PVRL2) TIGIT-Fc-LIGHT 3.00E-09 1.72E+05 4.71E-04 .7148
rhCD113(PVRL3) TIGIT-Fc-LIGHT 5.14E-09 1.30E+05 1.26E-03 .3389
上表显示了人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白或Fc-LIGHT和TIGIT-Fc单侧融合蛋白对照与重组人(rh)LTβR、HVEM、PVR、PVRL2和PVRL3的生物层干涉测量法(Octet)结合动力学。
开发了生物层干涉测量法和Meso Scale Discovery(MSD)测定的组合，以证明与其他PVR配体家族成员(包括PVRL2(CD112)、PVRL3(CD113)和连接蛋白-4)的结合(参见上表和图24B)。TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与其受体的结合通过Meso Scale Discovery(MSD)ELISA测定进行表征。简言之，在板上包被LTβR-Fc，并将逐渐增加量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白添加到板中，以被板结合的LTβR-Fc捕获。使用PVR-生物素并使用电化学发光(ECL)读数检测嵌合蛋白与LTβR-Fc的结合。如图10C所示，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与LTβR-Fc和PVR都结合。在板上包被HVEM-Fc，并将逐渐增加量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白添加到板上，以被板结合的HVEM-Fc捕获。使用PVR-生物素并使用电化学发光(ECL)读数检测嵌合蛋白与HVEM-Fc的结合。如图10C所示，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与HVEM-Fc和PVR都结合。在板上包被抗TIGIT抗体，并将逐渐增加量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白添加到板中以被板结合的抗TIGIT抗体捕获。使用抗LIGHT抗体并使用电化学发光(ECL)读数来检测嵌合蛋白与抗TIGIT抗体的结合。如图10C所示，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与抗TIGIT和抗LIGHT抗体都结合。这些结果表明剂量依赖性和可饱和的结合。因此，图10C证明了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与检查点靶标(PVR)和在骨髓、CD8+T和NK细胞上发现的免疫共刺激受体(LTβR和HVEM)的同时结合。
MSD还用于评价与个体靶标的结合，以及人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与PVR和HVEM(EC50为28.31nM)或PVR和LTβR(EC50为85.99nM)的同时结合；表明整个融合蛋白是完整的并且能够接合其靶标(图10C)。LIGHT还能够结合可溶性诱饵受体3(DcR3)，其在某些自身炎性疾病中会升高。为了评估癌症患者中的可溶性血清DcR3是否会达到足以干扰TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的LIGHT结构域的水平，对一系列健康和癌症人类供体血清样品中的DcR3浓度进行了定量。在大多数血清样品中，DcR3水平为2,000pg/mL或更低，但前列腺癌样品除外，其超过了测定定量上限(>15,000pg/mL))。在所有情况下，当TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在每个血清样品中预孵育时，这些DcR3水平不足以干扰双重HVEM/PVR效力测定中的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白结合(图24C)。
开发了细胞表面结合测定，以使用经工程化以稳定表达人PVR或HVEM的CHO-K1细胞表征人和小鼠融合蛋白与其在细胞膜中表达的靶标的结合。流式细胞术分析证明人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白结合细胞表面PVR(EC50＝35.42nM)、细胞表面LTβR(EC50＝87.12nM)和细胞表面HVEM(EC50＝65.77nM)(图10D)。此外，使用ELISA表明小鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白以剂量依赖性方式与其靶标以及野生型CT26(CT26/WT)、CPI获得性抗性CT26(CT26/AR)和B16.F10肿瘤细胞结合(图24D-图24E)。因此，这3种临床前同基因小鼠肿瘤模型在用小鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗时，对于抗肿瘤功效的评价是相关的。
利用其他基于细胞的功能测定来获悉TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的活性。首先，使用表达高水平LTβR的人骨骨肉瘤细胞系U2OS(图10E)进行NIK依赖性非典型NFκB信号传导测定来测试TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的LIGHT结构域的活性。在用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白处理后，检测到的生物发光水平显著高于用市售重组Fc-LIGHT产生的水平(图10E)。其次，预期TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白经由HVEM以抗原依赖性方式向CD8+T细胞提供共刺激。为了评价这一点，使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)超抗原测定，其中将人PBMC或小鼠脾细胞分别与SEB以及人或小鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白一起培养3天。然后评估培养基中的IL-2分泌，其表明人和小鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白能够诱导适应性细胞因子的产生(图10F)。第三，预测将LIGHT与CD8+T细胞和NK细胞表面上的HVEM连接增强对靶肿瘤细胞的杀伤。在荧光激活的裂解胱天蛋白酶3/7报告蛋白的存在下，将分离的鼠T或NK效应细胞与CT26肿瘤细胞共培养。小鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的添加刺激了靶肿瘤细胞中胱天蛋白酶活性的增加，这尤其表明TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白主动增加了培养物中效应细胞的细胞毒性潜力(图24F)。第四，人黑色素瘤细胞系A375已被用作LIGHT/LTβR信号传导的直接功能读数，经由LIGHT刺激后IL-8相关基因的LTβR依赖性产生。Hehlgans和Mannel Recombinant,soluble LIGHT(HVEM ligand)induces increased IL-8secretion and growth arrestin A375melanoma cells.J Interferon Cytokine Res 21:333-338(2001)。当TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白或市售LTβR激动抗体与A375细胞一起培养时，CXCL8(编码IL-8的基因)和CCL2在3小时内显著上调，与抗LTβR对照抗体相比，其幅度在采用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白时显著更高(图24G)。最后，利用市售的TIGIT/DNAM-1报告系统来确定效应淋巴细胞的HVEM共刺激是否利用了DNAM-1的冗余信号传导通路。因为TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的TIGIT结构域与PVR结合，这种相互作用将竞争性抑制PVR与DNAM-1相互作用的能力。因此，预期DNAM-1介导的共刺激被含有TIGIT的胞外结构域的重组构建体抑制。在此测定中，表达TIGIT和DNAM-1的Jurkat T细胞(效应物)与表达PVR的CHO-K1细胞共培养。效应细胞还含有对T细胞受体(TCR)和DNAM-1共刺激都有反应的荧光素酶报告基因。由于该测定中使用的效应细胞是Jurkat T细胞，因此证实这些细胞内源性表达人HVEM(图10G)。在CHO-K1报告细胞中，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白能够通过LIGHT的直接HVEM共刺激来绕过DNAM-1共刺激(图10H)。正如预期的那样，DNAM-1封闭抗体对照显示降低了测定中信号报告基因的荧光。相反，这些细胞与TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白一起孵育导致信号荧光显著增加，这被证实对TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的LIGHT结构域具有特异性，因为它可以完全被LIGHT封闭抗体抑制(图10H)。
在实体瘤组织内并且特别是在骨髓细胞中观察到LTβR的表达(图13A-图13G)，这尤其表明LIGHT可以以与已报道的经由Fcγ受体的接合相似的方式提供骨髓细胞活化。为了进一步测试这一点，产生了人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的天然IgG1和效应FcγR沉默IgG4变体，TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT嵌合蛋白。TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT嵌合蛋白显示出与TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白变体具有相似的结构特征，包括接合效应Fcγ受体的能力(图25A-图25C)。将IgG1和IgG4变体与人PBMC一起培养，一周后，这两种融合蛋白诱导细胞粘附至细胞培养板，分化成与骨髓细胞活化一致的形态，并刺激显著的增殖(图14A-图14B)。事实上，在培养仅2天后，TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT嵌合蛋白和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白对人PBMC的骨髓分化的明显形态学影响都是明显的(图25B)。TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT嵌合蛋白和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白也都诱导了效应物(IFNγ)和骨髓特异性(IL-8、IL12/p70和CXCL12)细胞因子(图14C)。在IgG1和IgG4融合蛋白之间没有发现对细胞形态、增殖程度或细胞因子诱导的显著影响(图14A-图14C)。在单独使用市售具Fc能力的IgG1TIGIT抗体以及与抗PD-1抗体派姆单抗联合处理的PBMC中评估了细胞因子反应。有趣的是，在这些研究中仅观察到IFNγ和IL-8的小量诱导，然而它们与对照处理的培养物没有显著不同(图25D)。
为了进一步评估TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的免疫刺激活性以及IgG1和IgG4变体之间的潜在功能差异，在刺激人PBMC培养物两天后进行了单细胞RNA测序。使用UMAP可视化表达TIGIT、HVEM、LTβR、DNAM1和所有PVR配体的细胞的分布(图25E)。在所鉴定的所有16个Seurat簇中，鉴定了TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白变体与未经处理的对照之间的差异表达基因(DEG)(图14D)。与骨髓、NK和CD8+T细胞相关的簇之间的DEG包括CCL3、ITGAX(编码CD11c的基因)、CXCL8、CD68、CD74(编码HLA-DR的基因)、B2M、IL32、CD7、JUNB、IER2和CXCR4(图14E和图25F)。在用TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT或TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT版本治疗后骨髓激活基因的上调伴随着簇6群体(具有高LTβR表达的簇，参见图13F)的扩增(图14F)。NK群体(在图14D-图14E中的簇7、10和11中发现的)适度增加，尽管在CD8+T细胞中略微降低(簇5和8，注意未将T细胞支持性细胞因子添加到培养物)，与T细胞和适应性免疫激活相关的基因被上调(图14F)。对与骨髓、NK和CD8+T细胞簇相关的DEG的基因本体通路分析证实，TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT或TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白都刺激了一系列免疫细胞级分中的广泛免疫细胞活化(图14G)。有趣的是，在所有Seurat簇中评估的所有DEG中，发现共计仅2个基因在TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT或TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白之间差异表达(图25G)。总的来说，这些结果尤其提供了LIGHT直接激活骨髓细胞的证据，其没有进一步受到FcγR结合或非结合Fc结构域的选择的影响。
与未经治疗的小鼠相比，评价从来自用TIGIT-Fc(IgG1)-LIGHT和TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT嵌合蛋白治疗的小鼠的人PBMC分离的骨髓细胞的变化。具体而言，对表达HLADRB1m HLA-DRB、CD80、CD86、CD40或B2M的细胞进行了评价。如图14H所示，诱导大于用具Fc能力的鼠抗体观察到的诱导(参见例如Han等人,Effective Anti-tumor Response byTIGIT Blockade Associated With FcγR Engagement and Myeloid Cell ActivationFrontiers in Immunology 11:573405(2020)。这些结果表明，不受理论的束缚，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白通过LIGHT:LTbR相互作用激活骨髓细胞并且不依赖于Fc结构域的组成。
在结直肠癌(CT26/WT)和黑色素瘤(B16.F10)模型中评价了鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(mTIGIT-Fc-LIGHT)的体内抗肿瘤活性。两者都被广泛用作对CPI敏感(CT26/WT)或不敏感(B16.F10)的模型。可以使用B16.F10模型模拟抗PD-1/L1封闭的原发性抗性。
在BALB/c小鼠的后胁腹上接种CT26/WT肿瘤，当平均起始肿瘤体积(STV)达到～84mm3时，对小鼠进行随机化并用mTIGIT-Fc-LIGHT或基准抗体治疗(图12A)。mTIGIT-Fc-LIGHT显著延迟肿瘤生长；初始治疗后，融合蛋白治疗组达到肿瘤负荷的平均天数为初始治疗后第28天(+/-6.87天)，相比之下溶媒对照组为第15天(+/-3.01天)(图12C)。将TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白活性与靶向鼠TIGIT、PD-1、PD-L1、LTβR、Fc-LIGHT融合蛋白的抗体的活性进行比较，这些药剂的组合如下表所示：
靶标 克隆 剂量(ug) 时间表
抗TIGIT 1G9 100 第0、3、6天
抗PD-1 RMP1-14 100 第0、3、6天
抗PD-L1 10F.9G2 100 第0、3、6天
抗LTβR 4H8 WH2 100 第0、3、6天
Fc-LIGHT - 100 第0、3、6天
TIGIT-Fc-LIGHT - 200 第0、3、6天
上表显示了CT26 WT肿瘤功效实验的测试药剂、剂量和时间表。
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上表显示了CT26 WT肿瘤功效实验的测试药剂、剂量和时间表。
唯一市售的抗TIGIT(克隆1G9)是一种效应沉默小鼠IgG1，作为单一疗法仍表现出适度的活性，将到达肿瘤负荷的时间延长至第18天(+/-4.38天)。Fc-LIGHT本身将到达肿瘤负荷的时间延迟至第20天(+/-1.92天)，但与抗TIGIT的组合无法进一步延长这一时间，这表明，不希望受到理论的束缚，大部分抗肿瘤活性源自LIGHT。相对于单独施用抗TIGIT和Fc-LIGHT，小鼠TIGIT-Fc-LIGHT显著提高了生存率，表明这些抑制信号和共刺激信号的共定位对于最大化抗肿瘤功效至关重要(图12D、图26A以及下表)。
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上表显示了CT26 WT肿瘤功效实验的生存统计数据。
对市售LTβR抗体(克隆4H8 WH2)进行评价，但其在CT26/WT模型中未显示任何活性(图26B)。令人鼓舞的是，mTIGIT-Fc-LIGHT单一疗法在12.9％的治疗动物中诱导肿瘤完全消退。
在第29天对排斥原发肿瘤的个体小鼠通过在相对的后胁腹上第二次接种CT26/WT肿瘤细胞进行重新攻击，无需随后重新治疗。发现在用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白进行初始治疗疗程后观察到具有完全肿瘤排斥的小鼠具有防止继发性肿瘤进展的保护性免疫力(图26C)。从这些动物(包括6只最初接受TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的小鼠和3只接受抗PD-L1单一疗法治疗的小鼠)中，在第39天(第29天再次攻击后的10天)分离外周血。在这些小鼠中评价了双阳性效应记忆细胞(总CD8+PBMC中的CD127+KLRG1+)的比较水平，并且发现该细胞群在最初用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的动物中显著扩增(图26D)。TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的初始抗肿瘤活性与IFNg+NK细胞、抗原特异性CD8+T细胞和CD86+树突细胞的肿瘤浸润增加以及CD25+和FOXP3+CD4调节性T细胞的耗竭有关(图26E)。有趣的是，还观察到，在用人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的IgG1和IgG4变体两者处理后，FOXP3水平在人PBMC中下调，特别是在ImmuneExp定义的调节性T细胞注释中(图25F)。此外，在这些鼠研究中，使用解离的肿瘤组织产生的上清液在肿瘤环境中评估了一系列效应物和骨髓特异性细胞因子。在mTIGIT-Fc-LIGHT治疗的动物的肿瘤微环境内发现IL-2、TNFα、CCL3、CCL4、IL-12(p70)和CCL2的肿瘤水平增加(图26F)。抗TIGIT与Fc-LIGHT以及抗PD-1或抗PD-L1的组合产生了基准对照组的最大活性，肿瘤负荷推至31(+/-3.75天)和32(+/-3.82天)天，并且分别在7.7％和23.1％的治疗动物中完全肿瘤排斥(图12C)。mTIGIT-Fc-LIGHT与抗PD-1或抗PD-L1的组合也显著提高了功效，在第33天(分别+/-4.94或4.64天)达到肿瘤负荷。抗PD-1和抗PD-L1组合在40.9％的动物中观察到完全肿瘤排斥。
小鼠TIGIT-Fc-LIGHT还表现出了在B16.F10黑色素瘤中的单一疗法活性，其中达到肿瘤负荷的平均时间为19(+/-4.47)天，相比之下，溶媒对照组为10(+/-2.00)天，抗TIGIT+Fc-LIGHT组合组为14(+/-2.27)天(图12A、图12E和下表)。
靶标 克隆 剂量(ug) 时间表
抗TIGIT 1G9 100 第0、3、6天
抗PD-1 RMP1-14 100 第0、3、6天
抗PD-L1 10F.9G2 100 第0、3、6天
Fc-LIGHT - 100 第0、3、6天
TIGIT-Fc-LIGHT - 200 第0、3、6天
上表显示了B16.F10肿瘤功效实验的测试药剂、剂量和时间表。
组 样本量(n) 排斥
溶媒 17 0
抗TIGIT 14 0
抗PD-1 14 0
抗PD-L1 14 0
Fc-LIGHT 8 0
抗TIGIT+Fc-LIGHT 8 0
抗TIGIT+Fc-LIGHT+抗PD-1 8 0
抗TIGIT+Fc-LIGHT+抗PD-L1 8 0
抗TIGIT+抗PD-1 8 0
抗TIGIT+抗PD-L1 8 0
TIGIT-Fc-LIGHT 16 0
TIGIT-Fc-LIGHT+抗PD-1 17 0
TIGIT-Fc-LIGHT+抗PD-L1 17 1
上表显示了B16.F10肿瘤功效实验中完全排斥原发肿瘤的组样本大小和动物数量。
抗TIGIT、Fc-LIGHT以及抗PD-1或抗PD-L1的三联组合提供了中等益处，将肿瘤生长延迟至第18天(分别+/-3.02或2.56天)。mTIGIT-Fc-LIGHT与抗PD-1或抗PD-L1的组合进一步提高了功效和生存率(分别为第24(+/-4.85)天和第26(+/-4.02)天)，并且与抗PD-L1的组合在一只动物中诱导肿瘤完全排斥。考虑到侵袭性肿瘤类型和平均>110mm3的起始肿瘤体积，这些发现是显著的(图12E、图12F、图26G和下表)。
上表显示了B16.F10肿瘤功效实验的生存统计数据。
在B16.F10模型中，评价了免疫细胞亚群对抗肿瘤活性的贡献。在时间进程的第-1、1和7天用CD4、CD8或NK消耗抗体处理一组小鼠，并通过流式细胞术确认细胞耗竭(图12A、图12H和图26H)。CD4细胞的耗竭对mTIGIT-Fc-LIGHT活性没有影响，然而CD8细胞或NK细胞的耗竭部分地降低了肿瘤生长控制，与TIGIT和HVEM的表达模式一致(图12H)。CD8和NK耗竭都没有完全消除抗肿瘤反应的事实表明，不希望受理论的束缚，CD8+T细胞和NK细胞都独立地贡献于TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的抗肿瘤活性，尽管如此，当两种细胞群都存在时，这种情况仍然得到增强。
为了评价TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的抗肿瘤活性效果，在小鼠后胁腹接种结直肠肿瘤CT26细胞、CT26抗PD-1抗性细胞(获得性抗性)或B16.F10黑色素瘤(原发性抗性)。将小鼠随机分为以下治疗组：(1)单用溶媒，(2)每剂100μg的抗PD-1抗体(克隆RMP1-14)，(3)每剂100μg的抗PD-L1抗体(克隆10F.9G2)，(4)每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白，一种抗PD-L1抗体，(5)每剂100μg的抗PD-1抗体+每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白，和(6)每剂100μg的抗PD-L1抗体+每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白。在经由腹膜内注射进行肿瘤接种后的第0、3和6天对小鼠进行给药。在B16.F10中在肿瘤接种后第11天以及在CT26和CT26抗PD-1抗性模型中在肿瘤接种后第14天测量肿瘤大小。计算并绘制与单用溶媒治疗的小鼠相比的肿瘤生长抑制。
如图11(左小图)所示，每种治疗均导致CT26肿瘤的肿瘤生长抑制。与单用抗PD-1抗体治疗(p＝0.0027)以及单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗(p＝0.0264)相比，用抗PD-1抗体和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合治疗显示了显著更高的肿瘤生长抑制(图11，左小图)。在类似的实验中，当起始平均肿瘤大小达到86.6mm3时开始相同的治疗，测量并绘制总体生存率。图12A显示了个体动物肿瘤生长曲线、每组达到肿瘤负荷的平均天数以及响应于治疗而完全排斥肿瘤的小鼠的数量。如图12B(左小图)所示，与观察到的肿瘤生长抑制一致，每种治疗都导致小鼠生存率增加，如与溶媒治疗的小鼠相比的Kaplan-Meier曲线所示。用抗PD-1抗体和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合治疗显示出与单用抗PD-1抗体治疗(p＝0.0238)相比显著更高的生存率，以及与Kaplan-Meier曲线中所示的单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗(p＝0.1445)相比更高的生存率(图12B，左小图)。
采用CT26抗PD-1抗性细胞同种异体移植物模型进行了类似的分析。如图11(中间小图)所示，不包括抗PD-1抗体治疗，每种治疗均导致CT26抗PD-1抗性肿瘤的肿瘤生长抑制。有趣的是，与单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的治疗(p＝0.032)相比，用抗PD-1抗体和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合治疗显示出显著更高的肿瘤生长抑制(图11，中间小图)。这些数据尤其是令人惊讶的，因为单用抗PD-1抗体的治疗在CT26抗PD-1抗性肿瘤模型中无效(图11，中间小图)。与单用抗PD-L1抗体的治疗(p＝0.014)相比，用抗PD-1抗体和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合治疗也显示出显著更高的肿瘤生长抑制(图11，中间小图)。在类似的实验中，当开始平均肿瘤大小达到89.49mm3时开始治疗。测量并绘制总体生存率。如图12B(中间小图)所示，在CT26抗PD-1抗性肿瘤模型中，单用抗PD-1抗体的治疗引起的生存率(如果有的话)改善甚微，这与观察到的缺乏肿瘤生长抑制一致。与溶媒治疗的小鼠相比，单用抗PD-L1抗体的治疗在CT26抗PD-1抗性肿瘤模型中引起生存率的一些改善，如Kaplan-Meier曲线所示(图12B，中间小图)。有趣的是，与如Kaplan-Meier曲线所示的单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的治疗(p＝0.1672)相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白和抗PD-1抗体的组合治疗显示出改善的生存率(图12B，中间小图)。类似地，与单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的治疗(p＝0.0443)相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白和抗PD-L1抗体的组合治疗显示出显著改善的生存率(图12B，中间小图)。这些数据是尤其令人惊讶的，因为单用抗PD-1抗体的治疗在CT26抗PD-1抗性肿瘤模型中无效(图11，中间小图；图12B，中间小图)，人们将不会预期TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在与抗PD-1抗体联合后具有显著改善的功效。
采用B16.F10细胞同种异体移植模型进行了类似的分析。如图11(右小图)所示，单用抗PD-L1抗体或单用抗PD-L1抗体的治疗显示出非常小的肿瘤生长抑制改善。相比之下，与单用抗PD-L1抗体或单用抗PD-L1抗体相比，单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的治疗在B16.F10细胞同种异体移植模型中引起了更大的肿瘤生长抑制改善。有趣的是，与单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(p＝0.0353)或单用抗PD-L1抗体(p<0.0001)的治疗相比，用抗PD-L1抗体和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合治疗在B16.F10细胞同种异体移植模型中显示出显著更高的肿瘤生长抑制(图11，右小图)。与单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的治疗相比，用抗PD-1抗体和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合治疗在B16.F10细胞同种异体移植模型中也显示出更高的肿瘤生长抑制(图11，右小图)。在类似的实验中，当开始平均肿瘤大小达到99.03mm3时开始治疗。测量并绘制总体生存率。如图12B(右小图)所示，在B16.F10肿瘤模型中单用抗PD-1抗体或单用抗PD-L1抗体的治疗导致B16的生存率略有改善，这与观察到的小的肿瘤生长抑制一致。有趣的是，与单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的治疗(p＝0.0031)相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白和抗PD-1抗体的组合治疗显示出显著改善的生存率(图12B，右小图)。类似地，与单用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的治疗(p＝0.2268)相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白和抗PD-L1抗体的组合治疗显示出改善的生存率(图12B，右小图)。这些数据是尤其令人惊讶的，因为单用抗PD-1抗体或PD-L1抗体的治疗在B16.F10肿瘤模型中无效(图11，右小图；图12B，右小图)，人们将不会预期当与TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白组合时具有显著改善的功效。
生成并表征了检查点抑制剂获得性抗性的临床前模型。该模型反映了在PD-1/L1获得性抗性NSCLC患者中观察到的许多特征。该模型是通过用抗PD-1抗体治疗已建立了CT26/WT肿瘤的小鼠，并切除治疗后得到部分控制但并未排斥的肿瘤而开发的。切除的肿瘤被解离、离体扩增，并重新接种到新的接受小鼠中，用抗PD-1抗体重复治疗。该程序在体内连续重复五次，以提供连续的抗PD-1选择性压力，直到小鼠全都未表现出从PD-1封闭中获益。所得肿瘤被命名为CT26/AR(获得性抗性)。对CT26/AR肿瘤和从PD-1/L1抗体获得性抗性NSCLC患者分离的肿瘤的转录组进行比较，发现在JAK/STAT和IFN信号传导通路中具有相似的扰动。因此，CT26/AR模型可能是用于评估新疗法在PD-1/L1抗性情况下的潜在抗肿瘤活性的有用工具。
在接受小鼠中达到>100mm3的起始肿瘤体积后，在CT26/AR肿瘤中评价小鼠TIGIT-Fc-LIGHT以及先前提出的基准对照治疗组(图12A和下表)。
靶标 克隆 剂量(ug) 时间表
抗TIGIT 1G9 100 第0、3、6天
抗PD-1 RMP1-14 100 第0、3、6天
抗PD-L1 10F.9G2 100 第0、3、6天
Fc-LIGHT - 100 第0、3、6天
TIGIT-Fc-LIGHT - 200 第0、3、6天
上表显示了CT26 AR肿瘤功效实验的测试药剂、剂量和时间表。
组 样本量(n) 排斥
溶媒 24 0
抗PD-1 23 0
抗PD-L1 23 0
抗TIGIT 14 0
Fc-LIGHT 13 0
抗TIGIT+Fc-LIGHT 13 0
抗TIGIT+抗PD-1 13 0
抗TIGIT+抗PD-L1 13 0
抗TIGIT+Fc-LIGHT+抗PD-1 13 0
抗TIGIT+Fc-LIGHT+抗PD-L1 13 0
TIGIT-Fc-LIGHT 22 1
TIGIT-Fc-LIGHT+抗PD-1 22 2
TIGIT-Fc-LIGHT+抗PD-L1 22 4
上表显示了CT26 AR肿瘤功效实验中完全排斥原发肿瘤的组样本量和动物数量。
平均而言，CT26/AR肿瘤在体内比其CT26/WT对应物生长得更快，其中溶媒治疗的动物在治疗开始后在平均14(+/-3.02)天时达到肿瘤负荷(图12I)。抗TIGIT或抗PD-1治疗并未明显延迟肿瘤生长，而Fc-LIGHT和抗PD-L1则分别将肿瘤负荷延迟至17(+/-3.38)和19(+/-5.07)天。Fc-LIGHT的适度单一疗法活性还表明，不希望受到理论的束缚，通过HVEM和/或LTβR的LIGHT信号传导独立于PD-1起作用，并且与单一疗法抗TIGIT治疗不同(图12I)。沿着这些思路，在HVEM和DNAM-1之间的细胞质氨基酸序列的比对确定了最小的同源性，由此HVEM缺乏DNAM-1中发现的酪氨酸残基，据报道，DNAM-1中的酪氨酸残基被PD-1的SHP-2结构域去磷酸化；参与DNAM-1共刺激的PD-1抑制(图27B)。
与单独施用抗TIGIT和Fc-LIGHT相比，小鼠TIGIT-Fc-LIGHT单一疗法将肿瘤负荷延迟直至第24天(+/-6.05天)，并且显著改善了生存率(Mantel-Cox p值<0.0001；图12I-图12J、图27A和下表)。
上表显示了CT26 AR肿瘤功效实验的生存统计数据。
抗PD-1或抗PD-L1与TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合将肿瘤负荷延迟至29天(+/-5.95天)和31天(+/-5.18天)，并分别在9.1％和18.2％的小鼠中诱导完全肿瘤排斥。与抗TIGIT、Fc-LIGHT以及抗PD-1或抗PD-L1的三联体组合相比，两种TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白组合均显著改善生存率(图12J和图27A)。有趣的是，CT26/AR肿瘤具有比CT26/WT肿瘤略少的CD8+T细胞浸润，但NK细胞水平相似(图27C-图27D)。虽然治疗性增强T细胞浸润的能力在CT26/AR肿瘤中受到限制，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白单一疗法仍然适度增强抗原特异性CD8+T细胞进入肿瘤。此外，在该肿瘤模型中，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与抗PD-L1的组合导致效应CD8+T细胞浸润显著增加，这与在CT26/WT肿瘤中观察到的水平相当(图27C)。NK细胞在CT26/AR模型中似乎受到较小影响，并且TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白单一疗法和与抗PD-L1的组合均导致NK细胞显著增加(图27D)。这些结果与之前描述的细胞耗竭研究中鉴定的免疫细胞贡献一致(图12H)，并且尤其表明，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的广泛免疫刺激活性可以增强检查点获得性抗性情况中的抗肿瘤免疫力。
这些结果尤其证明TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白有效对抗癌症，而不管对检查点封闭的抗性如何。此外，对PD-1/PD-L1轴封闭敏感的癌症可以用PD-1/PD-L1轴封闭剂和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合来治疗。
为了评价骨髓细胞的活化，将鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(mTIGIT-Fc-LIGHT)静脉注射到携带肿瘤的小鼠中，并在小鼠中注射剂量逐渐增加的鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(mTIGIT-Fc-LIGHT)。一天后抽取外周血，并使用流式细胞术对细胞进行免疫表型分析。
如图12K所示，200μg剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白减少了CD8+细胞的计数。如图12L所示，20、100、200和300μg剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白显著减少了活化的CD8+DNAM1+细胞的计数。另一方面，如图12M所示，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白显著改变CD4+细胞的计数。这些结果表明CD8+T细胞，特别是CD8+DNAM1+细胞在外周之外的“边缘化”；在200ug剂量下达到峰值，这是约～10mg/kg的人体等效剂量。
如图12N所示，100、200和300μg剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白显著增加了CD11+细胞的计数。如图12O所示，100、200和300μg剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白显著增加了活化的CD11+CD80+细胞的计数。类似地，如图12P所示，100、200和300μg剂量的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白显著增加了活化的CD11+CD86+细胞的计数。这些结果表明总的和活化的CD11b+细胞的增加，在200μg剂量下达到峰值，这是约～10mg/kg的人体等效剂量。
实施例12：TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白激活先天性和适应性免疫
在TCGA肿瘤中评估了53种免疫共刺激受体的表达(图13A)。基于所有TCGA肿瘤中每个基因的平均表达，对基因从高到低进行排序。与先前描述的晚期肿瘤中DNAM-1表达的下调一致，我们发现DNAM-1被列为最不丰富的免疫共刺激剂之一(图13A)。在肿瘤类型中表达模式更加一致的共刺激受体中，疱疹病毒侵入介质A(HVEM，TNFRSF14)和淋巴毒素β受体(LTβR，TNFRSF3)均位列前十，与DNAM-1相比，具有显著更高的转录本计数(图13A-图13B)。HVEM和LTβR作为TNF受体的表达在所有TCGA癌症的肿瘤中高度表达，确定了HVEM和LTBR位于前10名中(图13A)。HVEM和LTβR都是已知为LIGHT的TNF配体的受体(TNFSF14，“与淋巴毒素同源，表现出诱导型表达，并与HSV糖蛋白D竞争与HVEM的结合，一种在T淋巴细胞上表达的受体)。
为了评价HVEM和DNAM-1在Tscm细胞上的相对表达，使用了先前描述的体外分化方案。Gattinoni等人,A human memory T cell subset with stem cell-likeproperties.Nat Med 17,1290-1297(2011)。但是HVEM和LTβR是LIGHT的受体，而TIGIT拮抗DNAM-1的激活作用。因此，对HVEM和DNAM-1在T干细胞记忆(Tscm)细胞上的表达进行了表征。从健康供体人PBMC中分离初始CD8+细胞，并与抗人CD3/CD28珠、IL-2和GSK3β抑制剂一起培养。培养9天后，分离细胞并使用一组抗体对细胞进行表型分析，所述抗体组将初始CD8+T细胞(Tn)与Tscm细胞分开(图13C)。Gattinoni等人,A human memory T cell subsetwith stem cell-like properties.Nat Med 17,1290-1297(2011)。在用CD3/CD28、IL-2和GSK3β抑制剂诱导9天的T干细胞记忆(Tscm)细胞上表征与DNAM-1表达有关的HVEM表达。测定HVEM和DNAM-1的表达。因此，发现大多数Tn细胞表达HVEM(74.1％表达单独的HVEM，21.8％共表达HVEM和DNAM-1)，而只有1.15％的Tn细胞表达单独的DNAM-1。与最近尚未发表的研究结果一致，Tscm细胞比它们的Tn对等物表达更多的DNAM-1，但大多数DNAM-1+细胞也表达HVEM(54.25％中的45.5％)。此外，总Tscm的86.7％表达高水平的HVEM。在此数据集中，HVEM在包括Tscm的所有T细胞群体上高度表达，而DNAM-1表达在不同记忆T细胞亚群之间变化(图13C和图23A)。因此，HVEM和DNAM-1作为TNF受体在初始CD8+T细胞和CD8+T干细胞记忆细胞上高度表达。
为了扩展该分析并系统地评价免疫细胞上共刺激信号的丰度，对人PBMC进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)，并通过转录组聚类(Seurat)和免疫细胞类型预测以生物信息学方式定义了细胞群(图13D)。还在16个Seurat定义的簇中询问了上面评估的53种免疫共刺激基因的表达(图13D)。基于所有簇中每个基因的平均表达，将基因从高到低进行排序。TNFRSF14(HVEM)和CD226(DNAM-1)在此热图中排名靠前，表明它们在许多免疫细胞中高度表达，特别是在对应于CD8+T细胞的簇5和8以及代表自然杀伤(NK)细胞的簇7、10、11中(图13E和图13F)。Novershtern和HPCA注释也应用于数据并生成类似的细胞类型预测(图23B)。正如所预期的，在大多数PBMC群体中，与其他TNF受体相比，LTBR表达较低，但代表骨髓细胞的簇6除外(图13F)。
研究了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白对先天性和适应性免疫的影响。简言之，在小鼠后胁腹接种结直肠肿瘤CT26细胞或CT26抗PD-1抗性细胞肿瘤。肿瘤接种后14天，将一组实验小鼠人道安乐死，切除并解离肿瘤，并通过流式细胞术评估免疫浸润。通过流式细胞术对切除的CT26或CT26抗PD-1抗性肿瘤中表达HVEM/DNAM1的T细胞和NK细胞进行评估。如图13G所示，约93％的NK肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是HVEM+，相比之下DNAM1+NK TIL是约61％。此外，约95％的CD8T TIL是HVEM+，相比之下DNAM1+CD8 T TIL为约58％(图13G)。这些结果尤其表明，尽管与DNAM相比，HVEM在TIL中的表达更丰富，但先天免疫细胞和适应性免疫细胞都存在于TIL中。
为了评估TIL上HVEM相对于DNAM-1的优先表达是否在临床前转化为一系列鼠肿瘤类型，给小鼠接种了CT26野生型(CT26/WT)、CT26 CPI获得性抗性(CT26/AR)或B16.F10肿瘤(图13G)。使肿瘤建立，然后从小鼠中分离、解离，并通过流式细胞术评估CD8+T和NK细胞浸润物。在所有三种肿瘤类型中，发现HVEM在CD8+T和NK细胞上都比DNAM-1更广泛地表达，这与人PBMC的发现结果一致(图13G)。另外，发现HVEM在从小鼠脾细胞分离的T和NK细胞上以高水平表达(图23C)。这些结果共同为探索能够通过HVEM和LTβR提供共刺激信号的治疗候选药物提供了理论基础。
为了评价TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白对免疫细胞的影响，将人PBMC在AIMV培养基中与TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的IgG1或IgG4变体一起培养。培养2天后进行单细胞RNA-seq，并使用高降维算法(hi-dimensionality reduction algorithm)一致流形逼近和投影(UMAP)进行分析。如图14F所示，与未经处理的细胞相比，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的IgG1或IgG4变体均产生了相似的变化。通过进化关系(PANTHER)进行蛋白分析，鉴定了与TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白诱导的差异表达基因(DEG)相关的通路。如图14G所示，与未经处理的细胞相比，在用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白处理的PBMC中，106个与骨髓细胞功能相关的DEG上调。与未经处理的细胞相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白处理的PBMC中与骨髓细胞功能相关的130个DEG下调(图14G)。与未经处理的细胞相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白处理的PBMC中与NK细胞功能相关的47个DEG上调(图14G)。与未经处理的细胞相比，在用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白处理的PBMC中与NK细胞功能相关的17个DEG下调(图14G)。与未经处理的细胞相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白处理的PBMC中与CD8+T细胞功能相关的37个DEG上调(图14G)。与未经处理的细胞相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白处理的PBMC中与CD8+T细胞功能相关的12个DEG下调(图14G)。这些结果尤其表明TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白影响对应于骨髓、CD8+T或NK细胞的细胞群的功能。使用SingleR和ImmuneExp获得了类似的结果(图13D)。
将PBMC与TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白一起培养2天后，使用Meso Scale Discovery(MSD)ELISA测定法对多种细胞因子进行测定。如图14C所示，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(包含来自IgG1或IgG4的Fc结构域的两种版本)显著诱导了IFNγ、IL-8、IL-10、IL-12/p70和SDF1a(CXCL12)。总的来说，这些结果尤其表明TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白刺激骨髓、CD8+T或NK细胞群并诱导这些细胞产生细胞因子。
对来自市售PVR:DNAM1报告蛋白测定的Jurkat效应细胞进行HVEM表达测定。如图14C(上小图)所示，这些Jurkat效应细胞也表达人HVEM。将这些细胞与抗IgG4对照、抗DNAM-1抗体、Fc-LIGHT单侧蛋白或TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(有或没有LIGHT封闭)一起孵育。有趣的是，这些细胞的背景生物发光被抗DNAM-1抗体抑制(图14C)，表明DNAM-1共刺激的作用。如图14C(下小图)所示，Jurkat效应细胞显示当与LIGHT-Fc蛋白或TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白一起孵育时激活，如通过生物发光测定的。与Fc-LIGHT蛋白相比，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白产生更多的生物发光(图14C)。然而，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白产生的生物发光被LIGHT抗体封闭剂封闭(图14C)。不希望受到理论的束缚，这些数据表明TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白尤其绕过了对DNAM-1共刺激的需要并经由HVEM直接激活下游信号传导。
为了评价抗PD-1、抗PD-L1和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白对先天性和适应性免疫的影响，接下来进行了研究。简言之，在小鼠后胁腹接种结直肠肿瘤CT26细胞或CT26抗PD-1抗性细胞。将小鼠随机分为以下治疗组：(1)单用溶媒组，(2)每剂100μg的抗PD-1抗体(克隆RMP1-14)，(3)每剂100μg的抗PD-L1抗体(克隆10F.9G2)，(4)每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白，一种抗PD-L1抗体，(5)每剂100μg的抗PD-1抗体+每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白，和(6)每剂100μg的抗PD-L1抗体+每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白。在肿瘤接种后的第0、3和6天经由腹膜内注射对小鼠进行给药。确定各治疗组中抗原特异性CD8+T细胞(AH1+)和NK细胞的比例。
如图12G(左上小图)所示，与溶媒治疗的小鼠相比，用每种治疗治疗野生型CT26肿瘤均显著增加AH1+CD8+T细胞(p<0.05)。与单一治疗相比，使用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的组合对野生型CT26肿瘤的组合治疗进一步增加了AH1+CD8+T细胞的量(图12G，左上小图)。进一步地，如图12G(左下小图)所示，与溶媒治疗的小鼠相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白而非抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体治疗野生型CT26肿瘤，显著增加了NKP46+NK细胞(p<0.0001)。与溶媒治疗的小鼠相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白和抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的组合治疗野生型CT26肿瘤也显著增加了NKP46+NK细胞的量(图12G，左下小图)。
用抗PD-1抗体治疗CT26抗PD-1抗性细胞肿瘤没有显著增加AH1+CD8+T细胞(图12G，右上小图)或NKP46+NK细胞(图12G，右下小图)的比例。TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与抗PD-L1抗体的组合治疗CT26抗PD-1抗性细胞瘤，显著增加AH1+CD8+T细胞的比例(图12G，右上小图)。此外，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白单独或与抗PD-L1抗体组合治疗CT26抗PD-1抗性细胞肿瘤显著增加了NKP46+NK细胞的比例(图12G，右下小图)。
这些结果尤其表明TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白激活先天性免疫和适应性免疫。不受理论的束缚，这些结果尤其表明，抗PD-1获得性抗性CT26模型中TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的活性可能独特地由其激活先天性和适应性抗肿瘤免疫应答促进NK细胞和抗原特异性CD8+T细胞的浸润的能力来驱动。
为了评价各种类型的免疫细胞对TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的抗肿瘤活性的作用，在用TIGIT-Fc-LIGHT治疗之前，耗竭了荷瘤小鼠体内的CD4+T细胞、CD8+细胞或NK细胞。简言之，在小鼠后胁腹接种B16.F10肿瘤。将小鼠随机分为以下治疗组：(1)单用溶媒组，(2)每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(无耗竭)，(3)每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白+CD4+T细胞耗竭(-CD4)，(4)每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白+CD8+T细胞耗竭(-CD8)，和(5)每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白+NK细胞耗竭(-NK)。用耗竭所示细胞的抗体对小鼠进行处理。在肿瘤接种后的第0、3和6天，经由腹膜内注射给药。在肿瘤接种后第11天测量肿瘤大小。计算并绘制与单用溶媒治疗的小鼠相比的肿瘤生长抑制。如图12H所示，与溶媒处理的对照相比，无耗竭对照、-CD4和-CD8组显示出显著的肿瘤减少。与无耗竭小鼠相比，-CD8小鼠和-NK小鼠(具有统计学显著性)显示出降低的抗癌反应。CD4-小鼠的影响较小(如果有的话)。这些数据尤其表明CD8+和NK细胞在TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白产生的抗肿瘤反应中发挥作用。
然后分析肿瘤浸润淋巴细胞。简言之，在小鼠后胁腹接种结直肠肿瘤CT26细胞或CT26抗PD-1抗性细胞。将小鼠随机分为以下治疗组：(1)单用溶媒，(2)每剂100μg的抗PD-1抗体(克隆RMP1-14)，(3)每剂100μg抗PD-L1抗体(克隆10F.9G2)，(4)每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白，(5)每剂100μg的抗PD-1抗体+每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白，和(6)每剂100μg的抗PD-L1抗体+每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白。在肿瘤接种后第0、3和6天经由腹膜内注射对小鼠进行给药。确定各治疗组中抗原特异性CD8+T细胞(AH1+)和NK细胞的比例。如图12G(左上小图)所示，当用每种药剂治疗时，CT26肿瘤积累的CD8+T细胞(AH1四聚体+)的数量增加。当用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗时，CT26肿瘤积累的CD8+T细胞(AH1四聚体+)的数量增加，这通过与抗PD-L1抗体共同治疗得到进一步增强，而抗PD-L1抗体本身显示出弱的CD8+T细胞增加(图12G(右上小图))。如图12G(左下小图)所示，当用每种药剂治疗时，CT26肿瘤积累的NK细胞的数量增加。当用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗时，CT26肿瘤积累的NK细胞的数量增加，这通过与抗PD-L1抗体共同治疗得到进一步增强，而抗PD-L1抗体本身显示出弱的NK细胞增加(图12G(右上小图))。
实施例13：与抗TIGIT和/或抗PD-1抗体相比，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白针对抗PD-1抗性细胞系和原发抗性抗PD-1抗性细胞系的功效
简言之，在小鼠后胁腹接种结直肠肿瘤CT26细胞、CT26抗PD-1抗性细胞(获得性抗性)或B16.F10黑色素瘤(原发性抗性)。将小鼠随机分为以下治疗组：(1)单用溶媒，(2)每剂100μg的抗TIGIT抗体(克隆1G9)，(3)每剂100μg剂量的抗PD-1抗体(克隆RMP1-14)，(4)每剂各100μg的抗PD-1抗体+抗TIGIT抗体，(5)每剂200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白(一种抗PD-1抗体)，和(6)每剂100μg的抗PD-1抗体+200μg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白。在肿瘤接种后的第0、3和6天经由腹膜内注射对小鼠进行给药。在肿瘤接种后第14天测量肿瘤大小。测量并绘制肿瘤体积。
如图15(上小图)所示，与单用溶媒治疗的小鼠相比，单用抗TIGIT抗体的治疗显著减小了携带CT26肿瘤的小鼠的肿瘤大小(p<0.05)。与单用溶媒治疗的小鼠相比，用抗PD-1抗体、抗TIGIT和抗PD-1抗体的组合、TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白以及TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白和抗PD-1抗体的组合的治疗显著减小了携带CT26肿瘤的小鼠的肿瘤大小(p<0.0001)(图15，上小图)。有趣的是，与单用抗TIGIT抗体治疗的小鼠相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的治疗显著减小了携带CT26肿瘤的小鼠的肿瘤大小(p<0.05)(图15，上小图)。此外，与单用抗TIGIT抗体(p<0.001)、单用抗PD-1抗体(p<0.05)或单用抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体的组合(p<0.05)治疗的小鼠相比，用PD-1抗体和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合的治疗显著降低了携带CT26肿瘤的小鼠的肿瘤大小(图15，上小图)。
如图15(下小图)所示，与单用溶媒治疗的小鼠相比，单用抗TIGIT抗体、单用抗PD-1抗体或用抗TIGIT和抗PD-1抗体的组合的治疗并没有显著减小携带CT26抗PD-1抗性细胞肿瘤的小鼠的肿瘤大小。另一方面，与单用溶媒治疗的小鼠相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白以及TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白与抗PD-1抗体的组合的治疗显著减小了携带CT26抗PD-1抗性细胞肿瘤的小鼠的肿瘤大小(p<0.0001)(图15，下小图)。有趣的是，与单用抗TIGIT抗体(p<0.05)、单用抗PD-1抗体(p<0.01)或抗TIGIT和抗PD-1抗体的组合(p<0.05)治疗的小鼠相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的治疗显著降低了携带CT26抗PD-1抗性细胞肿瘤的小鼠的肿瘤大小(图15，下小图)。此外，与单用抗TIGIT抗体(p<0.001)、单用抗PD-1抗体(p<0.001)或抗TIGIT和抗PD-1抗体的组合(p<0.001)治疗的小鼠相比，用抗PD-1抗体和TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的组合的治疗显著减小了携带CT26抗PD-1抗性细胞肿瘤的小鼠的肿瘤大小(图15，下小图)。
这些结果尤其表明，TIGIT-Fc-LIGHT在WT CT26和获得性抗性CT26肿瘤模型中均高度活跃，并且优于抗TIGIT、抗PD-1、抗PD-L1或抗TIGIT/抗PD-1的组合的检查点封闭。
实施例14：示例性人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的构建和表征
产生编码基于SIRPα和4-1BBL的嵌合蛋白的构建体。“hSIRPα-Fc-4-1BBL”构建体包括经由铰链-CH2-CH3 Fc结构域与人4-1BBL的ECD融合的人SIRPα的胞外结构域(ECD)。参见图16(上小图)。
对该构建体进行了密码子优化以在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，转染至CHO细胞中，并选择高表达的个体克隆。然后将高表达克隆用于在搅拌生物反应器中在无血清培养基中进行小规模生产，并用Protein A结合树脂柱纯化相关嵌合融合蛋白。
hSIRPα-Fc-4-1BBL构建体在293细胞中瞬时表达，并使用protein-A亲和色谱法进行纯化。为了了解SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的天然结构，将未经处理的变性样品(即，在SDS的存在下煮沸，未经还原剂或去糖基化剂处理)与以下样品进行比较：(i)还原样品，其未经去糖基化(即仅用β-巯基乙醇处理，并在SDS的存在下煮沸)；和(ii)还原且去糖基化样品(即用β-巯基乙醇和去糖基化剂处理，并在SDS的存在下煮沸)。此外，为了确认SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的每个结构域的存在，将凝胶一式三份运行并使用抗SIRPα抗体(图16，下小图，左印迹)、抗人Fc(H+L)抗体(图16，中间印迹)或抗4-1BBL抗体(图16，下小图，右印迹)进行探测。蛋白质印迹表明在非还原泳道(图16，下小图，每个印迹中的第二泳道)中存在占优势的二聚体带，其在还原剂β-巯基乙醇的存在下被还原为糖基化单体带(图16，下小图，每个印迹中的第三泳道)。如图16(下小图，每个印迹中的第四泳道)所示，在还原剂(β-巯基乙醇)和去糖基化剂的存在下，嵌合蛋白以单体形式运行。这些结果证明了人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白被糖基化并且具有在天然状态下形成多聚体的倾向。
使用Meso Scale Discovery(MSD)ELISA测定评价hSIRPα-Fc-4-1BBL与两端的配体(人CD47、人4-1BB)的结合。为此，将人CD47-His包被在板上，并将逐渐增加量的hSIRPα-Fc-4-1BBL或PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白添加到板中，以被板结合的人CD47-His捕获。使用PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白作为与人CD47结合的阴性对照。使用抗SIRPα抗体和抗绵羊SULFO-TAG二抗检测嵌合蛋白与CD47-His的结合。使用电化学发光(ECL)读数测定结合。如图17A所示，每个hSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白均以剂量依赖性和可饱和的方式与人CD47-His结合。相比之下，PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白不与人CD47-His结合。这些数据表明hSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白特异性结合人CD47(SIRPα的配体)。
在类似的实验中，将人4-1BB-His包被在板上，并将逐渐增加量的hSIRPα-Fc-4-1BBL、PD-1-Fc-4-1BBL或hSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白添加到板中，以被板结合的人4-1BB-His捕获。使用hSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白作为与人4-1BB结合的阴性对照。使用抗4-1BBL抗体和抗绵羊SULFO-TAG二抗检测嵌合蛋白与4-1BB-His的结合。使用电化学发光(ECL)读数测定结合。如图17B所示，hSIRPα-Fc-4-1BBL和PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白中的每一个均以剂量依赖性和可饱和的方式与人4-1BB-His结合。相比之下，hSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白不与人4-1BB-His结合。这些数据表明hSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白特异性结合人4-1BB(4-1BBL的配体)。
为了了解人SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白是否可以与人4-1BB和CD47同期结合，将人4-1BB-His包被在板上，并将逐渐增加量的hSIRPα-Fc-4-1BBL或PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白添加到板中，以被板结合的人4-1BB-His捕获。使用PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白作为阴性对照。然后，将人CD47-His-生物素添加到板中以被任何嵌合蛋白捕获，该嵌合蛋白又被人4-1BB捕获。使用链霉亲和素SULFO-TAG二抗进行检测。使用电化学发光(ECL)读数测定结合。如图17C所示，hSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白产生与人4-1BB-His和CD47-His的同期、剂量依赖性结合一致的信号。相比之下，PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白不产生信号。这些数据表明hSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白可以与人4-1BB和CD47同期结合。
为了进一步研究SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与表达4-1BB的细胞的结合，使用标准技术产生表达4-1BB的人纤维肉瘤HT1080细胞(HT1080/4-1BB细胞)。使用两个阳性克隆HT1080/4-1BB+克隆A和B进行结合研究。为了确定SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白是否可以特异性结合HT1080/4-1BB细胞，进行了基于流式细胞术的测定。将HT1080/4-1BB细胞与单独的缓冲液或SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白一起孵育。将结合的细胞用与太平洋蓝缀合的抗小鼠Fc抗体复染，并通过流式细胞术检测SIRPα-Fc-4-1BBL结合的结合。如图18A所示，与未染色的HT1080/4-1BB细胞相比，用SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白染色的HT1080/4-1BB细胞显示出更多的染色。这些数据还证明了SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白与HT1080/4-1BB细胞的两个克隆都结合。
为了定量结合，将HT1080/4-1BB细胞与浓度逐渐增加的SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白一起孵育。将结合的细胞用与太平洋蓝缀合的抗小鼠Fc抗体复染，并通过流式细胞术检测SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白结合的结合。将平均荧光强度(MFI)绘制为SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的对数浓度的函数。如图18B所示，SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白显示出与HT1080/4-1BB细胞的剂量依赖性结合。
接下来研究SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白是否能够激活4-1BB/4-1BBL信号传导。使用在激活4-1BB/4-1BBL信号传导后分泌IL-8的HT1080/h4-1BB细胞作为模型。使HT1080/h4-1BB细胞生长过夜，并添加单独的缓冲液、1μg/ml或3.33μg/ml的SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白。继续孵育另外3小时。3小时后，从HT1080/h4-1BB细胞培养物中除去培养基，并通过ELISA评估IL-8。使用Meso Scale Discovery(MSD)ELISA测定法在培养物上清液中评价IL-8的产生。如图18C所示，与仅用缓冲液处理的HT1080/h4-1BB细胞相比，在用1μg/ml(p<0.01)或3.33μg/ml(p<0.001)的SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白处理的HT1080/h4-1BB细胞中观察到显著更多的IL-8产生。
这些结果尤其表明SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白激活4-1BB/4-1BBL信号传导。
实施例15：示例性小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的构建和表征
产生编码基于小鼠SIRPα和4-1BBL的嵌合蛋白的构建体用于小鼠模型的体内研究。“mSIRPα-Fc-4-1BBL”构建体包括经由铰链-CH2-CH3 Fc结构域与小鼠4-1BBL的ECD融合的小鼠SIRPα的胞外结构域(ECD)。参见图19(上小图)。
对该构建体进行了密码子优化以在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，转染至CHO细胞中，并选择高表达的个体克隆。然后将高表达克隆用于在搅拌生物反应器中在无血清培养基中进行小规模生产，并用Protein A结合树脂柱纯化相关嵌合融合蛋白。
mSIRPα-Fc-4-1BBL构建体在293细胞中瞬时表达，并使用protein-A亲和色谱法进行纯化。为了了解SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的天然结构，将未经处理的变性样品(即，在SDS的存在下煮沸，未经还原剂或去糖基化剂处理)与以下样品进行比较：(i)还原样品，其未经去糖基化(即仅用β-巯基乙醇处理，并在SDS的存在下煮沸)；和(ii)还原且去糖基化样品(即用β-巯基乙醇和去糖基化剂处理，并在SDS的存在下煮沸)。此外，为了确认SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的每个结构域的存在，将凝胶一式三份运行并使用抗SIRPα抗体(图19，下小图，左印迹)、抗小鼠Fc抗体(图19，中间印迹)或抗4-1BBL抗体(图19，下小图，右印迹)进行探测。蛋白质印迹表明在非还原泳道(图19，下小图，每个印迹中的第二泳道)中存在占优势的二聚体带，其在还原剂β-巯基乙醇的存在下被还原为糖基化单体带(图19，下小图，每个印迹中的第三泳道)。如图19(下小图，每个印迹中的第四泳道)所示，在还原剂(β-巯基乙醇)和去糖基化剂的存在下，嵌合蛋白以单体形式运行。这些结果证明了mSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白被糖基化并且具有在天然状态下形成多聚体的倾向。
使用Meso Scale Discovery(MSD)ELISA测定法评价了mSIRPα-Fc-4-1BBL与三个结构域(小鼠CD47、抗Fc抗体和小鼠4-1BB)的配体的结合。
将抗小鼠Fc-y抗体包被在板上，并将逐渐增加量的mSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白添加到板中，以被板结合的小鼠抗小鼠Fc-y抗体捕获。使用抗小鼠-SULFO-TAG抗体检测嵌合蛋白与抗小鼠Fc-y抗体的结合。使用电化学发光(ECL)读数测定结合。如图20A所示，每个mSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白均以剂量依赖性方式与小鼠抗小鼠Fc-y抗体结合。这些数据表明mSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白特异性结合小鼠抗小鼠Fc-y抗体(Fc结构域的配体)。
将小鼠4-1BB-His包被在板上，并将逐渐增加量的mSIRPα-Fc-4-1BBL或mSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白添加到板中，以被板结合的小鼠4-1BB-His捕获。使用mSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白作为与小鼠4-1BB结合的阴性对照。使用抗小鼠-SULFO-TAG抗体检测嵌合蛋白与4-1BB-His的结合。使用电化学发光(ECL)读数测定结合。如图20B所示，mSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白以剂量依赖性和可饱和的方式与小鼠4-1BB-His结合。相比之下，mSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白不与小鼠4-1BB-His结合。这些数据表明mSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白特异性结合小鼠4-1BB(4-1BBL的配体)。
将小鼠CD47-His包被在板上，并将逐渐增加量的mSIRPα-Fc-4-1BBL或mSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白添加到板中，以被板结合的小鼠CD47-His捕获。使用mSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白作为与小鼠CD47结合的阳性对照。使用抗小鼠SULFO-TAG抗体检测嵌合蛋白与CD47-His的结合。使用电化学发光(ECL)读数测定结合。如图20C所示，mSIRPα-Fc-4-1BBL和mSIRPα-Fc-CD40L嵌合蛋白中的每一个以剂量依赖性和可饱和的方式与小鼠CD47-His结合。这些数据表明mSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白特异性结合小鼠CD47(SIRPα的配体)。
为了了解小鼠SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白是否可以与小鼠4-1BB和CD47同期结合，将小鼠CD47-Fc包被在板上，并将逐渐增加量的mSIRPα-Fc-4-1BBL或PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白添加到板中，以被板结合的小鼠CD47-Fc捕获。使用PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白作为阴性对照。然后，将小鼠4-1BB-His添加到板中以被任何嵌合蛋白捕获，该嵌合蛋白接着被小鼠CD47-Fc蛋白捕获。使用抗-His-生物素和链霉亲和素-SULFO-TAG进行检测。使用电化学发光(ECL)读数测定结合。如图20D所示，mSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白产生与小鼠4-1BB-His和CD47-Fc的同期、剂量依赖性结合一致的信号。相比之下，PD-1-Fc-4-1BBL嵌合蛋白不产生信号。这些数据表明mSIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白可以与小鼠4-1BB和CD47同期结合。
实施例16：SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白针对抗PD-1敏感和抗PD-1抗性肿瘤的功效
在Balb/c小鼠的后胁腹接种了500,000个结直肠肿瘤CT26细胞或第四代抗PD-1抗性细胞。当平均起始肿瘤体积达到大约90mm3(第0天)时，将小鼠随机分为以下治疗组：(1)单用溶媒(PBS,n＝8)，(2)每剂100μg的抗PD-1抗体(克隆RMP1-14，n＝7)，和(6)每剂200μg的SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白(n＝8)。在第0、3和6天经由腹膜内注射对小鼠进行给药。
测量携带野生型CT26同种异体移植物的小鼠的肿瘤体积(图21A中的实线)并将其绘制为开始治疗后的时间的函数。如图21A所示，与单用溶媒治疗的小鼠相比，用抗PD-1抗体或SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的治疗导致CT26(野生型)肿瘤生长的抑制(比较图21A中的曲线2和3与曲线1)。SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白的功效似乎与抗PD-1抗体的功效相似。在肿瘤接种后第17天测量肿瘤大小并绘图。如图21B所示，与单用溶媒治疗的小鼠相比，携带野生型CT26肿瘤的小鼠在用抗PD-1抗体(p<0.0001)或SIRPα-Fc-4-1BB嵌合蛋白(p<0.0001)治疗后表现出统计学上显著的肿瘤大小减小。对携带野生型CT26同种异体移植物的小鼠绘制Kaplan-Meier生存曲线(图21C中的实线)。如图21C所示，所有携带野生型CT26肿瘤的小鼠在第21天死亡，但是携带野生型CT26同种异体移植物的小鼠在用抗PD-1抗体(Mantel-Cox p值为0.0004)或SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白(Mantel-Cox p值为0.0005)治疗后显示出改善的生存率。
测量携带第4代抗PD-1抗性细胞同种异体移植物的小鼠的肿瘤体积(图21A中的虚线)并将其绘制为开始治疗后的时间的函数。如图21A所示，与单用溶媒治疗的小鼠相比，SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白导致第4代抗PD-1抗性细胞肿瘤生长的抑制(比较图21A中的曲线6与曲线4)。另一方面，用抗PD-1抗体的治疗对第四代抗PD-1抗性细胞同种异体移植物肿瘤大小具有轻微影响(比较图21A中的曲线5与曲线4)。在肿瘤接种后第17天测量肿瘤大小并绘图(参见图21B中的图案条)。如图21B所示，与仅用溶媒治疗的小鼠相比，携带野生型第四代抗PD-1抗性肿瘤的小鼠在用SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白治疗后表现出统计学上显著的肿瘤大小减小(p<0.01)。另一方面，用抗PD-1抗体治疗携带第四代抗PD-1抗性细胞同种异体移植物的小鼠对肿瘤大小具有轻微影响(图21B)。对携带第4代抗PD-1抗性细胞同种异体移植物的小鼠绘制Kaplan-Meier生存曲线(图21C中的虚线)。如图21C所示，所有携带野生型第4代抗PD-1抗性肿瘤的小鼠到第18天死亡，但是与用抗PD-1抗体(Mantel-Cox p值为0.3907)治疗不同，携带第4代抗PD-1抗性细胞同种异体移植物的小鼠在用SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白治疗后显示出改善的生存率(Mantel-Cox p值为0.0111)。
这些结果尤其证明了，SIRPα-Fc-4-1BBL嵌合蛋白显著抑制肿瘤生长并改善患有抗PD-1敏感肿瘤和抗PD-1抗性肿瘤的动物的生存率。
实施例17：TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在食蟹猴中的安全性和药效活性(PD)
由于人TIGIT和LIGHT与食蟹猴靶标的交叉结合(数据未显示)，食蟹猴被确定为考查人TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的潜在毒性和免疫性质的合适物种。在研究的第1、8、15和22天首次接受治疗的食蟹猴组用剂量为0.1、1.0、10、40mg/kg的TIGIT-Fc(IgG4)-LIGHT静脉输注或施用的溶媒对照进行重复治疗。TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在所有剂量组中均具有良好的耐受性。
在第三次给药前第15天和第三次给药后第16天约24小时获得给药前和给药后淋巴细胞计数。在本实验中，进行流式细胞术以确定观察到的淋巴细胞计数变化是否是由表达HVEM的淋巴细胞在外周循环外的选择性边缘化驱动。一致地，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白刺激外周淋巴细胞的剂量依赖性边缘化，这在给药后立即进行的全血计数分析中是明显的(图22A)。因此，观察到从第15天到第16天的给药后淋巴细胞边缘化(图22A)。在第15天给药后，观察到外周血淋巴细胞的数量以剂量依赖性方式减少，并将其按照(100–((第16天的淋巴细胞数量)/(第15天的淋巴细胞数量)x 100)进行绘制。每个数据点代表一个个体动物。如图22A所示，与对照猴相比，用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的猴的外周血淋巴细胞数量存在剂量依赖性减少。
在食蟹猴中进一步探讨了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白对外周CD3+T细胞的影响。对食蟹猴静脉输注溶媒或40mg/kg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白。在给药前和给药后6小时获得给药前和给药后淋巴细胞计数。图22B显示来自给药后六小时样品的CD3+T细胞的剂量后边缘化。如图22B所示，在用TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白治疗的猴中，外周血CD3+T细胞的数量减少了约30％。相比之下，在溶媒处理的猴中外周血CD3+T细胞的数量增加了2.65％(图22B)。这些数据说明了CD3+T细胞的给药后边缘化。这些数据说明了给药后淋巴细胞边缘化。更具体地，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在初次输注后6小时内诱导CD3+T细胞边缘化到外周之外(图22B)，并且这些细胞被证明表达高水平的HVEM(图28A)。外周淋巴细胞的变化被限于淋巴区室，并且在外周中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、血小板的数量方面没有观察到显著变化，在血红蛋白或血细胞比容水平方面也没有观察到差异(数据未显示)。
对食蟹猴给予4次的每周IV输注(第1、8、15、22天)溶媒或0.1、1.0、10或40mg/kg的TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白。给药后2小时测量各种细胞因子以确定细胞因子特征。进行主成分分析(PCA)，以基于给药后2小时细胞因子特征可视化动物的分布。注意到多种促炎细胞因子的血清浓度的剂量依赖性增加，并且当来自多路阵列的所有30种细胞因子都被包括在分析中时，无偏主成分分析(PCA)揭示了剂量治疗组的分离(图22C)。如图22C所示，与溶媒治疗的猴相比，动物的细胞因子谱显示出剂量依赖性变化的趋势。绘制了各种细胞因子的趋势。使用JMP软件来生成矢量图，其基于特定的细胞因子特征鉴定了主导个体动物跨PCA象限迁移的细胞因子(图22D)。如图22D所示，促炎细胞因子在象限Q3和Q4中的样本聚类中占主导地位，适应性免疫细胞因子(例如IL-2和IL-17)在象限Q2中占主导地位。使用MesoScale Discovery(MSD)测定评估各种细胞因子的给药后2小时水平，并绘制为TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白剂量的函数。如图22E所示，IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)、TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)显示剂量依赖性增加。导致动物反应迁移到象限3和4的特征包括促炎细胞因子，如CXCL10、CCL2、CCL4、CCL17和IL-10。还观察到适应性免疫细胞因子遵循剂量反应，并且在象限2中聚类，包括IL-2和IL-17(图22E和图28B)。通过使用鼠TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白的观察结果，许多血清细胞因子应答是保守的(图28C)。总之，这些结果尤其表明，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白基于TIGIT和LIGHT通路中涉及的受体/配体相互作用发挥了有效的免疫作用。令人鼓舞的是，在非人灵长类动物中观察到的许多血清细胞因子变化与在小鼠体内和人体外测定中观察到的细胞因子变化重叠(图24和图26)。图22E显示了如使用Meso Scale Discovery(MSD)测定评估的细胞因子反应。测定IL-2和IP-10的诱导程度作为TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白剂量的函数。如图22F所示，观察到以剂量依赖性方式的IL-2的诱导。类似地，如图22G所示，观察到以剂量依赖性方式的IP-10的诱导。研究了诱导的动力学。图22G显示了IP-10的倍数诱导。图22H显示第一、第二和第三次给药期间和之后CXCL-10诱导的动力学。如图22H所示，在给药后2小时观察到诱导峰值，并在约8小时内达到背景水平。
这些数据表明，观察到剂量依赖性方式的血清细胞因子(包括IL-2和IP-10(上文))的独特谱。总的来说，这些结果证明了TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白导致T细胞边缘化，并诱导细胞因子，如IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)、TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)。
总之，TIGIT-Fc-LIGHT嵌合蛋白在高达至少40mg/kg的剂量下具有良好的耐受性。重要的是，尽管观察到细胞因子谱和IL-6的相对较小增加，但没有细胞因子释放综合征的证据。
通过引用并入
本文提及的所有专利和出版物均通过引用以其整体并入本文。
本文讨论的出版物仅是为了它们在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文中的任何内容均不应被解释为承认本公开无权凭借在先发明而早于此类出版物。
如本文所使用的，所有标题仅用于组织目的并且旨在不以任何方式限制本公开。任何个体部分的内容可能同样适用于所有部分。
等同方案
尽管已经结合其特定实施方案公开了本发明，但是应当理解，其能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖本发明的任何变化、用途或改编，其通常遵循本发明的原理并包括对本公开的偏离，这些偏离属于本发明所属领域内的已知或习惯实践，并且可以应用于上文所述的以及在所附权利要求的范围内如下所述的基本特征。
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文具体公开的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案旨在包含在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 沙塔克实验室有限公司（SHATTUCK LABS, INC.）
<120> 使用基于TIGIT和基于LIGHT的嵌合蛋白治疗癌症的方法
<130> SHK-038PC2/116981-5038
<150> US 63/121083
<151> 2020-12-03
<150> US 63/173090
<151> 2021-04-09
<150> US 63/215735
<151> 2021-06-28
<150> US 63/276066
<151> 2021-11-05
<160> 113
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser
20 25 30
Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly
35 40 45
Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg
50 55 60
Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala
85 90 95
His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu
100 105 110
Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr
115 120 125
His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr
130 135 140
Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser
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Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu
165 170 175
Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser
180 185 190
Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His
195 200 205
Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu
210 215 220
Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
225 230 235 240
<210> 2
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp
1 5 10 15
Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His
20 25 30
Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe
50 55 60
Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys
85 90 95
Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr
100 105 110
Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro
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Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe
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Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg
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Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr
165 170 175
Phe Gly Ala Phe Met Val
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<210> 3
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
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Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
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Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
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Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln
165
<210> 4
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln
145
<210> 5
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Ser
130 135 140
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
145 150 155 160
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met
165 170 175
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
180 185 190
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
195 200 205
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
210 215 220
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly
225 230 235 240
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
245 250 255
Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
260 265 270
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
275 280 285
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
305 310 315 320
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
325 330 335
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu
340 345 350
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
355 360 365
Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu
370 375 380
Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu
385 390 395 400
Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His
405 410 415
Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu
420 425 430
Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His
435 440 445
Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser
450 455 460
Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr
465 470 475 480
Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu
485 490 495
Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser
500 505 510
Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu
515 520 525
Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val
530 535 540
Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
545 550 555
<210> 6
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
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Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr
370
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<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
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Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr
340
<210> 8
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
340 345 350
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
355 360 365
Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
370 375 380
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
385 390 395 400
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
405 410 415
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
420 425 430
Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
435 440 445
Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr
450 455 460
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
465 470 475 480
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
485 490 495
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
500 505 510
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
515 520 525
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
530 535 540
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
545 550 555 560
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met
565 570 575
Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro
580 585 590
Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser
595 600 605
His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu
610 615 620
Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala
625 630 635 640
Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys
645 650 655
Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly
660 665 670
Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg
675 680 685
Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser
690 695 700
Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser
705 710 715 720
Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val
725 730 735
Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser
740 745 750
Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
755
<210> 9
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1 5 10 15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
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Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115 120 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro
130 135 140
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
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Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro
115 120
<210> 11
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg
340 345 350
Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu
355 360 365
Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg
370 375 380
Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser
385 390 395 400
Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu
405 410 415
Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr
420 425 430
Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val
435 440 445
Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys
450 455 460
Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln
465 470 475 480
Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser
485 490 495
Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val
500 505 510
Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg
515 520 525
Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
530 535
<210> 12
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 13
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
35 40 45
Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
50 55 60
Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
65 70 75 80
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
100 105 110
Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
130 135 140
Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
145 150 155 160
Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
165 170 175
Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
180 185 190
Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200 205
<210> 14
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg
340 345 350
Met Asp Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly
355 360 365
Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
370 375 380
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
385 390 395 400
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
405 410 415
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
420 425 430
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
435 440 445
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
465 470 475 480
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
485 490 495
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
500 505 510
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
515 520 525
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
530 535 540
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
545 550 555
<210> 15
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr
1 5 10 15
Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro
20 25 30
Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu
35 40 45
Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser
50 55 60
Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys
65 70 75 80
Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser
85 90 95
Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu
100 105 110
Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn
115 120 125
Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp
130 135 140
Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly
145 150 155 160
Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser
165 170 175
Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu
180 185 190
Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
195
<210> 16
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu
1 5 10 15
Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys
20 25 30
Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe
50 55 60
Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn
65 70 75 80
Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly
85 90 95
Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn
100 105 110
Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
115 120 125
<210> 17
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg
340 345 350
Met Asp Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly
355 360 365
Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val
370 375 380
Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr
385 390 395 400
Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala
405 410 415
Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu
420 425 430
Thr Asp Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His
435 440 445
Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu
450 455 460
Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe
465 470 475 480
Ile Ser
<210> 18
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Met Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ser Phe Gly Glu Thr Ala Ser Val Glu
1 5 10 15
Met Leu Pro Glu His Gly Ser Cys Arg Pro Lys Ala Arg Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Arg Trp Ala Leu Thr Cys Cys Leu Val Leu Leu Pro Phe Leu Ala
35 40 45
Gly Leu Thr Thr Tyr Leu Leu Val Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu
50 55 60
Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser
65 70 75 80
His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg
85 90 95
Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn
100 105 110
Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr
115 120 125
Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser
130 135 140
Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser
145 150 155 160
Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser
165 170 175
Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr
180 185 190
Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp
195 200 205
Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp
210 215 220
Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys
225 230 235 240
Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
245 250
<210> 19
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Arg Ala Gln Gly Glu Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln
1 5 10 15
Glu Phe Ala Pro Ser His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp
20 25 30
Gly Asp Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr
35 40 45
Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu
50 55 60
Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe
85 90 95
Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro
100 105 110
Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser
115 120 125
Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu
130 135 140
Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser
145 150 155 160
Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu
165 170 175
Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
180 185 190
<210> 20
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg
340 345 350
Met Asp Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu Ala Cys Val Gln Phe Gln
355 360 365
Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser His Gln Gln Val Tyr Ala
370 375 380
Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Val Val
385 390 395 400
Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His
405 410 415
Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr
420 425 430
Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr
435 440 445
Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg
450 455 460
Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr
465 470 475 480
Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr
485 490 495
Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu
500 505 510
Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val
515 520 525
Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe
530 535 540
Gly Ala Phe Leu Leu
545
<210> 21
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu
130
<210> 23
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg
340 345 350
Met Asp Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
355 360 365
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
370 375 380
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
385 390 395 400
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
405 410 415
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
420 425 430
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
435 440 445
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
450 455 460
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
465 470 475 480
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
485
<210> 24
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
1 5 10 15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
20 25 30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
35 40 45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
50 55 60
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65 70 75 80
Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
85 90 95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
100 105 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
115 120 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
130 135 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser
145 150
<210> 25
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His
1 5 10 15
Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
20 25 30
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr
35 40 45
Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn
50 55 60
Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn
65 70 75 80
Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser
85 90 95
His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg
100 105 110
Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg
115 120 125
<210> 26
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly
20 25 30
Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu
35 40 45
Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg
50 55 60
Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly
65 70 75 80
Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys
85 90 95
Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys
100 105 110
Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp
115 120 125
Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln
130 135 140
Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu
145 150 155 160
Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val
165 170 175
Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln
180 185 190
Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val
195 200 205
Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val
210 215 220
Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp
225 230
<210> 27
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Gln Arg Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro
20 25 30
Phe Lys Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys
35 40 45
Thr Lys Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr
50 55 60
Gln Asp Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile
65 70 75 80
Cys Gln Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu
85 90 95
Lys Leu Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val
100 105 110
Thr Val Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu
115 120 125
Ser Gln Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val
130 135 140
Asn Val Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu
145 150 155 160
Asn Val Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp
165 170
<210> 28
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 29
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp
1 5 10 15
Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser
20 25 30
Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe
35 40 45
Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser
50 55 60
Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val
65 70 75 80
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu
85 90 95
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly
100 105 110
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln
115 120 125
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile
130 135 140
Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu
145 150 155 160
Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe
180 185 190
Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr
195 200 205
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
210 215
<210> 30
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50 55 60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65 70 75 80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu
145 150 155 160
Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
165 170 175
Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
180 185 190
Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
195 200 205
His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
210 215 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225 230 235 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
245 250 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
260 265 270
Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
275 280
<210> 31
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr
1 5 10 15
Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro
20 25 30
Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr
35 40 45
Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr
50 55 60
Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val
65 70 75 80
Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg
85 90 95
Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg
100 105 110
Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met
115 120 125
Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly
130 135 140
Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser
145 150 155 160
Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu
165 170 175
Tyr Lys Leu
<210> 32
<400> 32
000
<210> 33
<400> 33
000
<210> 34
<400> 34
000
<210> 35
<400> 35
000
<210> 36
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly
195 200
<210> 37
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50 55 60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85 90 95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130 135 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145 150 155 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Ile Arg Ile Gly
180
<210> 38
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Met Gly Ser Pro Gly Met Val Leu Gly Leu Leu Val Gln Ile Trp Ala
1 5 10 15
Leu Gln Glu Ala Ser Ser Leu Ser Val Gln Gln Gly Pro Asn Leu Leu
20 25 30
Gln Val Arg Gln Gly Ser Gln Ala Thr Leu Val Cys Gln Val Asp Gln
35 40 45
Ala Thr Ala Trp Glu Arg Leu Arg Val Lys Trp Thr Lys Asp Gly Ala
50 55 60
Ile Leu Cys Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Gly Ser Leu Ser Leu Gly Val
65 70 75 80
Cys Gly Pro Gln Gly Arg Leu Ser Trp Gln Ala Pro Ser His Leu Thr
85 90 95
Leu Gln Leu Asp Pro Val Ser Leu Asn His Ser Gly Ala Tyr Val Cys
100 105 110
Trp Ala Ala Val Glu Ile Pro Glu Leu Glu Glu Ala Glu Gly Asn Ile
115 120 125
Thr Arg Leu Phe Val Asp Pro Asp Asp Pro Thr Gln Asn Arg Asn Arg
130 135 140
Ile Ala Ser Phe Pro Gly
145 150
<210> 39
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Leu Ser Val Gln Gln Gly Pro Asn Leu Leu Gln Val Arg Gln Gly Ser
1 5 10 15
Gln Ala Thr Leu Val Cys Gln Val Asp Gln Ala Thr Ala Trp Glu Arg
20 25 30
Leu Arg Val Lys Trp Thr Lys Asp Gly Ala Ile Leu Cys Gln Pro Tyr
35 40 45
Ile Thr Asn Gly Ser Leu Ser Leu Gly Val Cys Gly Pro Gln Gly Arg
50 55 60
Leu Ser Trp Gln Ala Pro Ser His Leu Thr Leu Gln Leu Asp Pro Val
65 70 75 80
Ser Leu Asn His Ser Gly Ala Tyr Val Cys Trp Ala Ala Val Glu Ile
85 90 95
Pro Glu Leu Glu Glu Ala Glu Gly Asn Ile Thr Arg Leu Phe Val Asp
100 105 110
Pro Asp Asp Pro Thr Gln Asn Arg Asn Arg Ile Ala Ser Phe Pro Gly
115 120 125
<210> 40
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
85 90 95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
100 105 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
180 185 190
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
210 215 220
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
260 265 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
275 280
<210> 41
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile
1 5 10 15
Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu
20 25 30
Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln
35 40 45
Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr
50 55 60
Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly
65 70 75 80
Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn
85 90 95
Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys
100 105 110
Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn
115 120 125
Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu
145 150 155 160
Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr
165 170 175
Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys
180 185 190
Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly
195 200 205
Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn
210 215 220
Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe
225 230 235 240
Leu Val Gly
<210> 42
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His
1 5 10 15
Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
20 25 30
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr
35 40 45
Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn
50 55 60
Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn
65 70 75 80
Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser
85 90 95
His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg
100 105 110
Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg Ser
115 120 125
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met
145 150 155 160
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
225 230 235 240
Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu
355 360 365
Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu
370 375 380
Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His
385 390 395 400
Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu
405 410 415
Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His
420 425 430
Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser
435 440 445
Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr
450 455 460
Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu
465 470 475 480
Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser
485 490 495
Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu
500 505 510
Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val
515 520 525
Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
530 535 540
<210> 43
<211> 838
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20 25 30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
50 55 60
Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65 70 75 80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
85 90 95
Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115 120 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
145 150 155 160
Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165 170 175
Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His
180 185 190
Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser
195 200 205
Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
210 215 220
Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu
225 230 235 240
Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu
245 250 255
Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro
260 265 270
Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe
275 280 285
Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
290 295 300
Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu
305 310 315 320
Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu
325 330 335
Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
340 345 350
Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro
355 360 365
Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys
370 375 380
Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr
385 390 395 400
Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala
405 410 415
Leu Pro Ala Gly His Leu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
420 425 430
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
435 440 445
Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
450 455 460
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
465 470 475 480
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
485 490 495
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
500 505 510
His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser
515 520 525
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly
530 535 540
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
545 550 555 560
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
565 570 575
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
580 585 590
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
595 600 605
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
610 615 620
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
625 630 635 640
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp
645 650 655
Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp
660 665 670
Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His
675 680 685
Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr
690 695 700
Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe
705 710 715 720
Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala
725 730 735
Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys
740 745 750
Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr
755 760 765
Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro
770 775 780
Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe
785 790 795 800
Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg
805 810 815
Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr
820 825 830
Phe Gly Ala Phe Met Val
835
<210> 44
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 44
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50 55 60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85 90 95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130 135 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145 150 155 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Ile Arg Ile Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
180 185 190
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
195 200 205
Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
210 215 220
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
225 230 235 240
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
245 250 255
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
260 265 270
Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys
275 280 285
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln
290 295 300
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
305 310 315 320
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
325 330 335
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
340 345 350
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
355 360 365
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
370 375 380
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
385 390 395 400
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu
405 410 415
Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly
420 425 430
Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu
435 440 445
Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu
465 470 475 480
Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly
485 490 495
Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro
500 505 510
Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro
515 520 525
Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys
530 535 540
Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu
545 550 555 560
Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val
565 570 575
Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe
580 585 590
Gly Ala Phe Met Val
595
<210> 45
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 45
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg
340 345 350
Met Asp His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His
355 360 365
Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu
370 375 380
Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu
385 390 395 400
Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu
405 410 415
Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala
420 425 430
His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp
435 440 445
Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu
450 455 460
Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr
465 470 475 480
Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro
485 490 495
Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile
500 505 510
Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln
515 520 525
Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser
530 535 540
Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly
545 550 555 560
Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
565
<210> 46
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 46
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 47
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Thr Pro His
65 70 75 80
Ser Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 48
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 49
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 50
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 52
Ile Glu Gly Arg Met Asp
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 53
Gly Gly Gly Val Pro Arg Asp Cys Gly
1 5
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 54
Ile Glu Gly Arg Met Asp Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 55
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 57
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 58
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 58
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Arg
20
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 64
<400> 64
000
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 65
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 66
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser
1 5
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 68
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro
20
<210> 69
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 69
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 71
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 73
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 73
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 74
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 74
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 75
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 75
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 76
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 76
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 77
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 77
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 78
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 79
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 81
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 82
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 83
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 84
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 86
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala
20
<210> 87
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
20 25
<210> 88
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 88
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
35 40 45
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 90
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 91
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 92
Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 93
Gly Ser Glu Ser Gly
1 5
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 94
Gly Ser Glu Gly Ser
1 5
<210> 95
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 95
Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Glu Gly Ser Ser Ser
1 5 10 15
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 96
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 96
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp
225 230
<210> 97
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 97
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Thr Pro His Ser Asp Trp Leu Ser
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp
225 230
<210> 98
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 98
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp
225 230
<210> 99
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 99
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp
225 230
<210> 100
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 100
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Thr Pro His Ser Asp Trp Leu Ser
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp
225 230
<210> 101
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 101
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp
225 230
<210> 102
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 102
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 103
<211> 782
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 103
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
340 345 350
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
355 360 365
Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
370 375 380
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
385 390 395 400
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
405 410 415
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
420 425 430
Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
435 440 445
Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr
450 455 460
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
465 470 475 480
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
485 490 495
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
500 505 510
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
515 520 525
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
530 535 540
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
545 550 555 560
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met
565 570 575
Asp Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
580 585 590
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
595 600 605
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
610 615 620
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
625 630 635 640
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
645 650 655
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
660 665 670
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
675 680 685
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
690 695 700
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
705 710 715 720
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
725 730 735
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
740 745 750
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
755 760 765
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
770 775 780
<210> 104
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 104
Met Ala Ala Val Gly Pro Arg Thr Gly Pro Gly Thr Gly Ala Glu Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Ala Ala Glu Leu
20
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 105
Ala Ala Thr Arg Ala Pro Pro Phe Pro Leu Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 106
His Gly Ser Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ala Ala Arg Cys Gly
1 5 10 15
<210> 107
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 107
Asn Val Ser Leu Lys Thr Phe Val Leu Lys Gly Met Leu Lys Lys Phe
1 5 10 15
Lys Glu Asp Leu Arg Gly Glu Leu Glu Lys Glu Glu Lys Val
20 25 30
<210> 108
<211> 781
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 108
Lys Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala
1 5 10 15
Gly Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val
20 25 30
Gly Pro Ile Lys Trp Tyr Arg Gly Val Gly Gln Ser Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Phe Thr Gly Glu His Phe Pro Arg Val Thr Asn Val Ser Asp
50 55 60
Ala Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val
65 70 75 80
Thr Pro Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly
85 90 95
Pro Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val
100 105 110
Tyr Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp
115 120 125
Arg Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu
145 150 155 160
Leu His His Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser
165 170 175
Tyr Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val
180 185 190
His Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro
210 215 220
Thr Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Leu Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu
260 265 270
Thr Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val
275 280 285
Asn Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys
290 295 300
His Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Leu
305 310 315 320
Ala His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Gly Asn Asn
325 330 335
Ala Thr His Asn Trp Asn Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
340 345 350
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
385 390 395 400
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
405 410 415
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
420 425 430
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
435 440 445
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
450 455 460
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
465 470 475 480
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
485 490 495
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
500 505 510
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
515 520 525
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
530 535 540
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
545 550 555 560
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Ile Ile Glu Gly Arg Met Asp Arg
565 570 575
Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly
580 585 590
Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly
595 600 605
Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu
610 615 620
Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser
625 630 635 640
Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu
645 650 655
Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val
660 665 670
Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys
675 680 685
Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp
690 695 700
Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met
705 710 715 720
Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys
725 730 735
Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala
740 745 750
Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser
755 760 765
Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu
770 775 780
<210> 109
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 109
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
115 120 125
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
145 150 155 160
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
165 170 175
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
180 185 190
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
195 200 205
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
210 215 220
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
225 230 235 240
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
245 250 255
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
260 265 270
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
275 280 285
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
290 295 300
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
305 310 315 320
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
325 330 335
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met
355 360 365
Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile
370 375 380
Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly
385 390 395 400
Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr
405 410 415
Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala
420 425 430
Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln
435 440 445
Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His
450 455 460
Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu
465 470 475 480
Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val
485 490 495
Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly
500 505 510
Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg
515 520 525
Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
530 535 540
<210> 110
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 110
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
115 120 125
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
145 150 155 160
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
165 170 175
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
180 185 190
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
195 200 205
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
210 215 220
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
225 230 235 240
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
245 250 255
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
260 265 270
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
275 280 285
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
290 295 300
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
305 310 315 320
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
325 330 335
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met
355 360 365
Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile
370 375 380
Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly
385 390 395 400
Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr
405 410 415
Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala
420 425 430
Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln
435 440 445
Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His
450 455 460
Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu
465 470 475 480
Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val
485 490 495
Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly
500 505 510
Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg
515 520 525
Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
530 535 540
<210> 111
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 111
Thr Ile Asp Thr Lys Arg Asn Ile Ser Ala Glu Glu Gly Gly Ser Val
1 5 10 15
Ile Leu Gln Cys His Phe Ser Ser Asp Thr Ala Glu Val Thr Gln Val
20 25 30
Asp Trp Lys Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Tyr Ser Val Asp Leu
35 40 45
Gly Trp His Val Ala Ser Val Phe Ser Asp Arg Val Val Pro Gly Pro
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Thr Phe Gln Ser Leu Thr Met Asn Asp Thr Gly Glu
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Thr Tyr His Thr Tyr Pro Gly Gly Ile Tyr Lys Gly Arg
85 90 95
Ile Phe Leu Lys Val Gln Glu Ser Ser Asp Asp Arg Asn Gly Leu Ala
100 105 110
Gln Phe Gln Thr Ala Pro Leu Gly Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
115 120 125
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
165 170 175
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
195 200 205
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
210 215 220
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
225 230 235 240
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
245 250 255
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
260 265 270
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
275 280 285
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
290 295 300
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
305 310 315 320
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
325 330 335
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met
340 345 350
Asp Leu His Gln Arg Leu Gly Asp Ile Val Ala His Leu Pro Asp Gly
355 360 365
Gly Lys Gly Ser Trp Glu Lys Leu Ile Gln Asp Gln Arg Ser His Gln
370 375 380
Ala Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu Ile Gly
385 390 395 400
Ile Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Phe Leu
405 410 415
Arg Gly Leu Thr Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Thr Met Glu Pro Gly
420 425 430
Tyr Tyr Tyr Val Tyr Ser Lys Val Gln Leu Ser Gly Val Gly Cys Pro
435 440 445
Gln Gly Leu Ala Asn Gly Leu Pro Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg
450 455 460
Thr Ser Arg Tyr Pro Lys Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Arg Arg Ser
465 470 475 480
Pro Cys Gly Arg Ala Asn Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe
485 490 495
Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg
500 505 510
Val Pro Gly Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr
515 520 525
Phe Gly Ala Phe Met Val
530
<210> 112
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 112
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 113
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 113
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230

Claims (157)

1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，所述嵌合蛋白具有以下通用结构：N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，其中：
(a)是第一结构域，其包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域，
(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中所述接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且
(c)是第二结构域，其包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介体(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域，
其中施用的嵌合蛋白的剂量为约0.0001mg/kg至约50.0mg/kg，任选地选自约1mg/kg、约3mg/kg、约6mg/kg、或约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约20mg/kg、约22mg/kg、约25mg/kg、约27mg/kg、约30mg/kg、约33mg/kg、约35mg/kg、约37mg/kg、约40mg/kg、约42mg/kg、约45mg/kg、约48mg/kg和约50mg/kg。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人，任选地是成年人。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述嵌合蛋白每周施用至少约一次。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述嵌合蛋白每月施用至少约一次。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述嵌合蛋白每月施用至少约两次。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述嵌合蛋白每月施用至少约3次。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤(局部的和/或转移性的)或淋巴瘤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症选自霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性成髓细胞白血病；基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒膜癌；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝脏癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；以及其他癌和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)、梅格斯综合征癌症、肾癌、结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
9.一种在有需要的受试者中诱导淋巴细胞扩增的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，所述嵌合蛋白具有以下通用结构：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(a)是第一结构域，其包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域，
(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中所述接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且
(c)是第二结构域，其包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介体(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域。
10.一种在有需要的受试者中诱导淋巴细胞边缘化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的嵌合蛋白的步骤，所述嵌合蛋白具有以下通用结构：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(a)是第一结构域，其包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域，
(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中所述接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且
(c)是第二结构域，其包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介体(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域。
11.根据权利要求1、9或10中任一项所述的方法，其中所述受试者以选自以下的给药方案给药：约每3天至约每10天、约每周至约每2周、约每10天至约每3周、约每2周至约每4周、约每3周至约每5周、约每4周至约每6周、约每5周至约每7周、约每6周至约每8周，以及约每6周至约每2个月。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第一结构域能够结合TIGIT配体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一结构域包含TIGIT的基本上全部的胞外结构域。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述第二结构域能够结合LIGHT受体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第二结构域包含LIGHT的基本上全部的胞外结构域。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述接头是选自柔性氨基酸序列、IgG铰链区和/或抗体序列的多肽。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述接头包含源自IgG1或IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述铰链-CH2-CH3 Fc结构域源自人IgG1或人IgG4。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述接头包含一个或多个连接接头，所述连接接头独立地选自SEQ ID NO:49-95。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述接头包含两个或更多个连接接头，每个连接接头独立地选自SEQ ID NO:49-95；其中一个连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的N末端，而另一个连接接头是铰链-CH2-CH3Fc结构域的C末端。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述第一结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述第二结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中
(a)所述第一结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，
(b)所述第二结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且
(c)所述接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中
(a)所述第一结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，
(b)所述第二结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且
(c)所述接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述嵌合蛋白还包含至少一个连接接头，所述连接接头包含选自SKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:49)、SKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:50)、IEGRMD(SEQID NO:52)的氨基酸序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含所述连接接头，所述连接接头包含IEGRMD(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述IEGRMD的氨基酸序列位于SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列的C末端。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含与选自SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.2％同一性的氨基酸序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.4％同一性的氨基酸序列。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.6％同一性的氨基酸序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含与选自SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少99.8％同一性的氨基酸序列。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含选自SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受、已耐受或不适合标准疗法和/或所述癌症没有被批准的认为是标准护理的疗法。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述受试者未正在接受同步化疗、免疫疗法、生物疗法或激素疗法。
39.一种评价癌症治疗在有需要的受试者中的功效的方法，该方法包括以下步骤：
(i)施用一个剂量的具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(a)是第一结构域，其包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域，
(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中所述接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且
(c)是第二结构域，其包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介体(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域，
其中所述剂量为约0.03mg/kg至约50mg/kg；
(ii)从所述受试者获得生物样品；
(iii)对所述生物样品进行测定以确定选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)、TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的细胞因子的水平和/或活性；和
(iv)如果所述受试者的选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)、TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的至少一种细胞因子的水平和/或活性增加，则继续给药。
40.一种选择受试者用于癌症疗法的治疗的方法，该方法包括以下步骤：
(i)施用一个剂量的具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(a)是第一结构域，其包含具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT)的胞外结构域，
(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中所述接头包含铰链-CH2-CH3 Fc结构域，并且
(c)是第二结构域，其包含人LIGHT(淋巴毒素样，表现出诱导型表达并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介体(HVEM)，一种被T淋巴细胞表达的受体)的胞外结构域，
其中所述剂量为约0.03mg/kg至约50mg/kg；
(ii)从所述受试者获得生物样品；
(iii)对所述生物样品进行测定以确定选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)、TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的细胞因子的水平和/或活性；和
(iv)如果受试者的选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)、TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的至少一种细胞因子的水平和/或活性增加，则选择所述受试者用于癌症疗法的治疗。
41.根据权利要求39至40中任一项所述的方法，其中所述生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述生物样品是活检样品。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述活检样品选自内窥镜活检、骨髓活检、内窥镜活检(例如，膀胱镜检查、支气管镜检查和结肠镜检查)、针吸活检(例如，细针吸取、针穿活检、真空辅助活检、X射线辅助活检、计算机断层扫描(CT)辅助活检、磁共振成像(MRI)辅助活检和超声辅助活检)、皮肤活检(例如刮取活检、穿刺活检和切取活检)和手术活检。
44.根据权利要求39至43中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含体液，所述体液选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物，和/或来自其中的细胞。
45.根据权利要求39至44中任一项所述的方法，其中所述生物样品通过选自刮取、拭子和活检的技术获得。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述生物样品通过使用刷子、(棉)拭子、抹刀、冲洗/清洗液、穿刺活检装置、用针或手术器械穿刺腔体来获得。
47.根据权利要求39至46中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至少一种肿瘤细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述肿瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性粒细胞白血病、基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关)、梅格斯综合征癌症；肾癌；结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
49.根据权利要求39至48中任一项所述的方法，其中通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行所述测定。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述测定通过使样品与一种或多种特异性结合至少一种细胞因子的药剂接触来进行，所述至少一种细胞因子选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)、TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述特异性结合至少一种细胞因子的药剂包含一种或多种抗体、抗体样分子或其结合片段。
52.根据权利要求49所述的方法，其中所述测定通过使所述样品与一种或多种特异性结合至少一种核酸的药剂接触来进行，所述至少一种核酸编码选自IL-2、IL-10、IP-10(CXCL10)、MCP-1、MIP-1β(CCL4)、TARC(CCL17)、IFNγ、IL-8、IL-12和SDF1a(CXCL12)的细胞因子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述特异性结合至少一种核酸的药剂是核酸引物或探针。
54.一种为患者确定癌症疗法的方法，该方法包括：
(i)从受试者获得生物样品；
(ii)对所述样品评价
与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHCI类的抗原加工/呈递；和/或
与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的下调：磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程；
和
(iii)基于步骤(b)的评价选择癌症疗法，其中所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
55.一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：
(i)从受试者获得生物样品；
(ii)对所述样品评价：
与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHCI类的抗原加工/呈递；和/或
与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的下调：磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程；
和
(iii)选择癌症疗法，其中所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
56.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
(i)从受试者获得生物样品；
(ii)对所述样品评价：
与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的上调：细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHCI类的抗原加工/呈递；和/或
与选自以下的基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的下调：磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程；
和
(iii)选择癌症疗法，其中所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述上调是与健康组织进行比较。
58.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述上调是与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品进行比较。
59.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述上调是与从所述受试者获得的先前生物样品进行比较。
60.根据权利要求54至59中任一项所述的方法，其中所述下调是与健康组织进行比较。
61.根据权利要求54至59中任一项所述的方法，其中所述下调是与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品进行比较。
62.根据权利要求54至59中任一项所述的方法，其中所述下调是与从所述受试者获得的先前生物样品进行比较。
63.根据权利要求54至62中任一项所述的方法，其中所述生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述生物样品是活检样品。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述活检样品选自内窥镜活检、骨髓活检、内窥镜活检(例如，膀胱镜检查、支气管镜检查和结肠镜检查)、针吸活检(例如，细针吸取、针穿活检、真空辅助活检、X射线辅助活检、计算机断层扫描(CT)辅助活检、磁共振成像(MRI)辅助活检和超声辅助活检)、皮肤活检(例如刮取活检、穿刺活检和切取活检)和手术活检。
66.根据权利要求54至65中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含体液，所述体液选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物，和/或来自其中的细胞。
67.根据权利要求54至66中任一项所述的方法，其中所述生物样品通过选自刮取、拭子和活检的技术获得。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述生物样品通过使用刷子、(棉)拭子、抹刀、冲洗/清洗液、穿刺活检装置、用针或手术器械穿刺腔体来获得。
69.根据权利要求64至68中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至少一种肿瘤细胞。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述肿瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性粒细胞白血病、基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关)、梅格斯综合征癌症；肾癌；结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
71.根据权利要求54至70中任一项所述的方法，其中通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行所述评价。
72.根据权利要求54至71中任一项所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合由与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行所述评价，所述GO通路选自：
(i)细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHCI类的抗原加工/呈递；和/或
(ii)磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程。
73.根据权利要求72所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合由与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行所述评价，所述GO通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工/呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导的正调控，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHCI类的呈递。
74.根据权利要求72或权利要求73所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合由与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行所述评价。
75.根据权利要求72至74中任一项所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合由与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行所述评价。
76.根据权利要求54至71中任一项所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行所述评价，所述GO通路选自：
(i)细胞周期过程的正调控、G1/S转变的调控、细胞分裂的调控、细胞增殖的调控、IκB激酶/NFκB信号传导的正调控、I型IFN信号传导通路、针对IFNγ的细胞应答、IFNα产生的正调控、防御反应的正调控、IFNβ产生的正调控、炎症反应的调控、先天免疫应答的调控、抗原加工/呈递的负调控，以及内源肽经由MHCI类的抗原加工/呈递；和/或
(ii)磷脂流出、纤维蛋白溶解的负调控、乳糜微粒组装、质膜修复、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白、核糖体小亚基组装、磷脂流出、翻译调控、线粒体呼吸链复合物I、线粒体翻译延伸、DNA依赖性DNA复制和ATP生物合成过程。
77.根据权利要求76所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合与基因本体(GO)通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行所述评价，所述GO通路选自(a)针对IFNγ的细胞应答，(b)抗原加工/呈递的负调控，(c)I型IFN信号传导通路，(d)IκB激酶/NFκB信号传导，和抗原加工，以及(e)内源肽经由MHCI类的呈递。
78.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合与针对IFNγ的细胞应答相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行所述评价。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合与I型IFN信号传导通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行所述评价。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的方法，其中特异性结合一种或多种核酸的药剂是核酸引物或探针。
81.根据权利要求54至80中任一项所述的方法，其中所述评价告知将所述患者分类为高风险组或低风险组。
82.根据权利要求81所述的方法，其中高风险分类包括高水平的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法具有抗性。
83.根据权利要求81所述的方法，其中低风险分类包括低水平的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法具有抗性。
84.根据权利要求81至83中任一项所述的方法，其中低风险分类指示停止所述癌症疗法。
85.根据权利要求81至83中任一项所述的方法，其中高风险分类指示施用所述癌症疗法。
86.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95，
其中所述癌症对或被认为对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的抗检查点剂具有抗性。
87.根据权利要求54至86中任一项所述的方法，其中所述接头是选自柔性氨基酸序列、IgG铰链区或抗体序列的多肽。
88.根据权利要求54至87中任一项所述的方法，其中所述接头包含源自IgG1或IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。
89.根据权利要求54至88中任一项所述的方法，其中所述铰链-CH2-CH3 Fc结构域源自人IgG1或人IgG4。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述接头包含与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
91.根据权利要求54至90中任一项所述的方法，其中所述接头包含两个或更多个连接接头，每个连接接头独立地选自SEQ ID NO:49-95；其中一个连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的N末端，而另一个连接接头是铰链-CH2-CH3 Fc结构域的C末端。
92.根据权利要求54至91中任一项所述的方法，其中所述第一结构域包含与SEQ IDNO:10的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
93.根据权利要求54至92中任一项所述的方法，其中所述第一结构域包含与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
94.根据权利要求54至93中任一项所述的方法，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的氨基酸序列。
95.根据权利要求54至93中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含与选自SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
96.根据权利要求54至95中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白是重组融合蛋白。
97.根据权利要求54至96中任一项所述的方法，其中所述抗检查点剂是选自纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地利珠单抗(CT-011，CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS936559、MPDL328OA(ROCHE)、西米普利单抗(LIBTAYO)、阿特珠单抗(TECENTRIQ)、阿维鲁单抗(BAVENCIO)和度伐鲁单抗(imfinzi)的抗体。
98.根据权利要求86至97中任一项所述的方法，进一步包括施用抗检查点剂。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述抗检查点剂是选自纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地利珠单抗(CT-011，CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559、MPDL328OA(ROCHE)、西米普利单抗(LIBTAYO)、阿特珠单抗(TECENTRIQ)、阿维鲁单抗(BAVENCIO)和度伐鲁单抗(imfinzi)的抗体。
100.根据权利要求98或权利要求99所述的方法，其中包含所述嵌合蛋白和所述抗检查点剂的药物组合物同时或同期施用。
101.根据权利要求98至100中任一项所述的方法，其中在施用所述抗检查点剂之后施用包含所述嵌合蛋白的药物组合物。
102.根据权利要求98至100中任一项所述的方法，其中在施用所述抗检查点剂之前施用包含所述嵌合蛋白的药物组合物。
103.根据权利要求98至102中任一项所述的方法，其中包含所述嵌合蛋白的药物组合物的剂量小于向尚未接受或没有正在接受用所述抗检查点剂治疗的受试者施用的包含所述嵌合蛋白的药物组合物的剂量。
104.根据权利要求98至103中任一项所述的方法，其中施用的抗检查点剂的剂量小于向尚未接受或没有正在接受用包含所述嵌合蛋白的药物组合物治疗的受试者施用的抗检查点剂的剂量。
105.根据权利要求98至104中任一项所述的方法，其中与仅接受或仅正在接受用包含所述嵌合蛋白的药物组合物治疗的受试者相比，所述受试者的生存机会增加，且没有胃肠道炎症和体重减轻，和/或肿瘤大小或癌症患病率降低。
106.根据权利要求98至105中任一项所述的方法，其中与仅接受或仅正在接受用抗检查点剂治疗的受试者相比，所述受试者的生存机会增加，且没有胃肠道炎症和体重减轻，和/或肿瘤大小或癌症患病率降低。
107.一种为患者确定癌症治疗的方法，该方法包括：
(I)从受试者获得生物样品；
(II)评价所述生物样品的以下的表达：
(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或
(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和
(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
108.一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：
(I)从受试者获得生物样品；
(II)评价所述生物样品的以下的表达：
(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或
(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和
和
(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
109.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
(I)从受试者获得生物样品；
(II)评价所述生物样品的以下的表达：
(i)选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因；和/或
(ii)选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因；和
(III)其中所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；和
(IV)任选地施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
110.根据权利要求107至109中任一项所述的方法，其中当所述生物样品包含至少一种肿瘤细胞时，选择能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法，并且
与健康组织、从所述受试者获得的先前生物样品或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因在所述至少一种肿瘤细胞中不上调；和/或
与健康组织、从所述受试者获得的先前生物样品或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因在所述至少一种肿瘤细胞中不下调。
111.根据权利要求107至109中任一项所述的方法，其中当所述生物样品包含至少一种肿瘤细胞时，并且
与健康组织、从所述受试者获得的先前生物样品或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自CD274、B2M、STAT1、STAT2、TRIM7、IRF1、TAP1、TAP2、CASP1、IRF、LTBR、PVR、GASTA3、LRG1、SPRY2、ARG1、TRIM8、TRIM2、MAPK8IP1、TRIM6和KRT1的基因在所述至少一种肿瘤细胞中上调；和/或
与健康组织、从所述受试者获得的先前生物样品或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自RPL41、RPS15、RPS8、TRIM7和LRG1的基因在所述至少一种肿瘤细胞中下调时，并且所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
112.根据权利要求107至111中任一项所述的方法，其中与健康组织相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、具有抗性或不顺从。
113.根据权利要求107至112中任一项所述的方法，其中与健康组织相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、具有抗性或不顺从。
114.根据权利要求107至113中任一项所述的方法，其中与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、具有抗性或不顺从。
115.根据权利要求107至113中任一项所述的方法，其中与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、具有抗性或不顺从。
116.根据权利要求107至115中任一项所述的方法，其中与从所述受试者获得的先前生物样品相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的缺乏反应、具有抗性或不顺从的发展。
117.根据权利要求107至116中任一项所述的方法，其中与从所述受试者获得的先前生物样品相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因的下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的缺乏反应、具有抗性或不顺从的发展。
118.根据权利要求107至117中任一项所述的方法，其中与健康组织相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
119.根据权利要求107至118中任一项所述的方法，其中与健康组织相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
120.根据权利要求107至119中任一项所述的方法，其中与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
121.根据权利要求107至120中任一项所述的方法，其中与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一生物样品相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
122.根据权利要求107至121中任一项所述的方法，其中与从所述受试者获得的先前生物样品相比，(b)(i)中列出的一种或多种基因缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的缺乏反应的发展。
123.根据权利要求107至122中任一项所述的方法，其中与从所述受试者获得的先前生物样品相比，(b)(ii)中列出的一种或多种基因缺乏下调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的缺乏反应的发展。
124.根据权利要求107至123中任一项所述的方法，其中所述生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。
125.根据权利要求107至124中任一项所述的方法，其中所述生物样品是活检样品，任选地，其中所述活检样品选自内窥镜活检、骨髓活检、内窥镜活检(例如膀胱镜检查、支气管镜检查和结肠镜检查)、针吸活检(例如，细针吸取、针穿活检、真空辅助活检、X射线辅助活检、计算机断层扫描(CT)辅助活检、磁共振成像(MRI)辅助活检和超声辅助活检)、皮肤活检(例如，刮取活检、穿刺活检和切取活检)和手术活检。
126.根据权利要求107至125中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含体液，所述体液选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物，和/或来自其中的细胞。
127.根据权利要求107至126中任一项所述的方法，其中所述生物样品通过选自刮取、拭子和活检的技术获得，任选地，其中所述生物样品通过使用刷子、(棉)拭子、抹刀、冲洗/清洗液、穿刺活检装置、用针或手术器械穿刺腔体来获得。
128.根据权利要求121至127中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至少一种肿瘤细胞。
129.根据权利要求108、109或128所述的方法，其中所述肿瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性粒细胞白血病、基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关)、梅格斯综合征癌症；肾癌；结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
130.根据权利要求107至129中任一项所述的方法，其中通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行所述评价。
131.根据权利要求107至130中任一项所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合由(b)(i)和/或(b)(ii)中列出的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行所述评价，任选地，其中特异性结合一种或多种蛋白的药剂包括抗体、抗体样分子或其结合片段。
132.根据权利要求107至131中任一项所述的方法，其中通过使所述样品与特异结合与(b)(i)和/或(b)(ii)中列出的基因相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行所述评价。
133.根据权利要求132所述的方法，其中特异性结合一种或多种核酸的药剂是核酸引物或探针。
134.一种为患者确定癌症治疗的方法，该方法包括：
(I)从受试者获得生物样品；
(II)评价所述生物样品对选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的激活；和
(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
135.一种选择患者进行癌症治疗的方法，该方法包括：
(I)从受试者获得生物样品；
(II)评价生物样品对选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的激活；和
(III)基于步骤(II)的评价选择癌症疗法，其中所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
136.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
(I)从受试者获得生物样品；
(II)评价所述生物样品对选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的激活；和
(II)其中所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；和
(IVI)任选地施用能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
137.根据权利要求134至136中任一项所述的方法，其中当所述生物样品包含至少一种肿瘤细胞，并且
与健康组织、从所述受试者获得的先前生物样品或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路在所述至少一种肿瘤细胞中没有上调时，选择能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法。
138.根据权利要求134至137中任一项所述的方法，其中当所述生物样品包含至少一种肿瘤细胞，并且
与健康组织、从所述受试者获得的先前生物样品或来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路在所述至少一种肿瘤细胞中上调时，并且所述癌症疗法包含具有以下通用结构的嵌合蛋白：
N末端-(a)-(b)-(c)-C末端，
其中：
(A)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是TIGIT，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是LIGHT，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95；或者
(B)
(a)是包含I型跨膜蛋白的胞外结构域的第一结构域，该跨膜蛋白是SIRPα，
(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且
(c)是包含II型跨膜蛋白的胞外结构域的第二结构域，该跨膜蛋白是4-1BBL，其中接头连接第一结构域和第二结构域并且任选地包含一个或多个连接接头，此类连接接头选自SEQ ID NO:49-95。
139.根据权利要求134至138中任一项所述的方法，其中与健康组织相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、具有抗性或不顺从。
140.根据权利要求134至139中任一项所述的方法，其中与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法缺乏反应、具有抗性或不顺从。
141.根据权利要求134至140中任一项所述的方法，其中与从所述受试者获得的先前生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路的上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的缺乏反应、具有抗性或不顺从的发展。
142.根据权利要求134至141中任一项所述的方法，其中与健康组织相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
143.根据权利要求134至142中任一项所述的方法，其中与来自已知对抗PD-1疗法敏感的患者的另一种生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的反应。
144.根据权利要求134至143中任一项所述的方法，其中与从所述受试者获得的先前生物样品相比，选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路缺乏上调指示对能够抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的功能和/或活性的癌症疗法的缺乏反应的发展。
145.根据权利要求134至144中任一项所述的方法，其中所述生物样品是新鲜组织样品、冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞或福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。
146.根据权利要求134至145中任一项所述的方法，其中所述生物样品是活检样品。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述活检样品选自内窥镜活检、骨髓活检、内窥镜活检(例如，膀胱镜检查、支气管镜检查和结肠镜检查)、针吸活检(例如，细针吸取、针穿活检、真空辅助活检、X射线辅助活检、计算机断层扫描(CT)辅助活检、磁共振成像(MRI)辅助活检和超声辅助活检)、皮肤活检(例如刮取活检、穿刺活检和切取活检)和手术活检。
148.根据权利要求134至147中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含体液，所述体液选自血液、血浆、血清、泪液、泪水、骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样品、含有细胞的体液、游离浮动核酸、痰、唾液、尿液、脑脊液、腹膜液、胸腔积液、粪便、淋巴液、妇科液、皮肤拭子、阴道拭子、口腔拭子、鼻拭子、冲洗或灌洗液如导管灌洗或支气管肺泡灌洗、抽吸物、刮取物、骨髓样本、组织活检样本、手术样本、粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物，和/或来自其中的细胞。
149.根据权利要求134至148中任一项所述的方法，其中所述生物样品通过选自刮取、拭子和活检的技术获得。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述生物样品通过使用刷子、(棉)拭子、抹刀、冲洗/清洗液、穿刺活检装置、用针或手术器械穿刺腔体来获得。
151.根据权利要求134至150中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至少一种肿瘤细胞。
152.根据权利要求135、136或151所述的方法，其中所述肿瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；或慢性粒细胞白血病、基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞性NHL；巨大肿块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病、水肿(例如与脑肿瘤相关)、梅格斯综合征癌症；肾癌；结直肠癌和肾上腺癌相关的异常血管增殖。
153.根据权利要求134至152中任一项所述的方法，其中通过DNA测序、RNA测序、免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞内蛋白质印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)或其组合来进行所述评价。
154.根据权利要求134至153中任一项所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合由选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路编码的一种或多种蛋白的药剂接触来进行所述评价。
155.根据权利要求154所述的方法，其中特异性结合一种或多种蛋白的药剂包括抗体、抗体样分子或其结合片段。
156.根据权利要求134至154中任一项所述的方法，其中通过使所述样品与特异性结合与选自Mapk8ip1、Trim7、Elk1、Lrg1、Arg1、Rap1和Ras的通路相关的一种或多种基因的一种或多种核酸的药剂接触来进行所述评价。
157.根据权利要求156所述的方法，其中特异性结合一种或多种核酸的药剂是核酸引物或探针。
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