KR20230088722A - Sirp1a 키메라 단백질의 임상적 투여 - Google Patents

Sirp1a 키메라 단백질의 임상적 투여 Download PDF

Info

Publication number
KR20230088722A
KR20230088722A KR1020237012931A KR20237012931A KR20230088722A KR 20230088722 A KR20230088722 A KR 20230088722A KR 1020237012931 A KR1020237012931 A KR 1020237012931A KR 20237012931 A KR20237012931 A KR 20237012931A KR 20230088722 A KR20230088722 A KR 20230088722A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chimeric protein
seq
domain
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
KR1020237012931A
Other languages
English (en)
Inventor
아룬다티 판디트
파티마 랭왈라
톰 램프킨
테일러 슈라이버
조지 프롬
실바 수레쉬 데
Original Assignee
샤턱 랩스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 샤턱 랩스 인코포레이티드 filed Critical 샤턱 랩스 인코포레이티드
Publication of KR20230088722A publication Critical patent/KR20230088722A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

본 개시내용은 특히 용량 및 요법을 포함하여, 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인 및 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 사용하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

SIRP1A 키메라 단백질의 임상적 투여
본 발명은 특히 용량, 2상(biphasic) 투여를 포함하는 투여 요법 또는 3회 주기를 포함하는 투여 요법을 포함하는 질환의 치료, 예컨대, 암을 위한 면역요법에 사용되는 키메라 단백질을 비롯한, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
선행기술
본 출원은 미국 가출원 제63/231,578호(출원일: 2021년 8월 10일); 제63/229,244호(출원일: 2021년 8월 4일); 및 제63/079,982호(출원일: 2020년 9월 17일)의 이익 및 이에 대한 우선권을 주장하며, 상기 기초출원의 내용은 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함
2021년 8월 10일에 작성되고 크기가 65,465바이트이고 파일명이 "SHK-034PC_Sequence Listing_ST25"인 텍스트 파일의 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
암 면역요법의 분야는 지난 수 년에 걸쳐서 상당히 성장하였다. 이것은 주로 많은 종양 유형에서 면역관문 분자의 패밀리(예를 들어, CTLA-4 및 PD-1)를 표적으로 하는 항체의 임상적 효능에 의해 유래되었다. 그러나, 이러한 성공에도 불구하고, 단일요법으로서 이러한 작용제에 대한 임상 반응은 소수의 환자(다양한 고형 종양에서 10 내지 45%)에서 발생하고, 이러한 요법은 부작용으로 인해 방해를 받는다.
이러한 작용제의 적절한 용량 및 요법의 발견은 암의 효능이 있는 치료법에 중요하다. 투여 및 요법을 비롯한 신규한 치료 전략을 개발하는 것은 인간 면역 체계의 복잡성, 높은 비용 및 이러한 개입으로 인해 유발될 수 있는 독성에 대한 가능성을 고려할 때 만만치 않은 작업으로 남아 있다.
다양한 양상에서, 본 개시내용은 암 면역요법에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 부분적으로 면역 저해 신호를 동시에 차단하고 면역 활성화 신호를 자극하는 특이적 키메라 단백질의 용량 및 치료 요법에 관한 것이다. 중요하게는, 특히, 본 개시내용은 안정적이고 재생 가능한 다량체 상태를 유지할 수 있는 개선된 키메라 단백질을 제공한다. 따라서, 본 조성물 및 방법은 이중특이적 작용제의 생산에서 다양한 결점을 극복한다. 이러한 접근법을 사용하면, 동일한 표적 각각에 대해 2개의 개별 항체를 별개로 투여하는 것에 비해서 우수한 전임상 활성을 갖는, 단일 키메라 단백질에 의해서 병용 면역요법이 달성될 수 있다. 추가로, 본 개시내용은 성공적인 요법을 산출하기 위한 양의 본 발명의 키메라 단백질로 인간 암 환자를 치료하는 것을 가능하게 한다.
본 개시내용은 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인 및 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다. CD172a(SIRPα)는 적어도 인간 종양 세포의 표면 상의 CD47에 결합하는 타입 I 막관통 단백질이며; 이러한 결합은 종양 세포 또는 종양 미세환경 내의 다른 세포에 의해서 생산된 저해 신호를 차단한다. 따라서, 키메라 단백질의 CD172a(SIRPα) 단부는 예를 들어, 이의 검출 및/또는 파괴를 회피하려고 시도하는 암 세포로부터 유래하는, 면역 저해 신호의 전달을 방해, 차단, 감소, 저해 및/또는 봉쇄한다. CD40L은 1차 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)뿐만 아니라 조직-상주 항원 제시 세포의 표면 상의 CD40 수용체(예를 들어, CD40)에 결합하는 타입 II 막관통 단백질이고; 이러한 결합은 항암 면역 세포에 면역 자극 특성을 제공한다. 따라서, 키메라 단백질의 CD40L 단부는 CD40 발현 면역 세포로의 면역 자극 신호의 전달을 향상, 증가 및/또는 자극한다. 종합하면, 본 개시내용의 키메라 단백질은 2개의 구별되는 기전을 통해서 암을 치료할 수 있다.
본 개시내용의 키메라 단백질에서, 인간 CD172a(SIRPα)(타입 I 막관통 단백질)의 세포외 도메인은 키메라 단백질의 아미노 말단에 위치되고(비제한적인 예로서, 도 1A, 좌측 단백질 참조), 인간 CD40L(타입 II 막관통 단백질)의 세포외 도메인은 키메라 단백질의 카복시 말단에 위치된다(비제한적인 예로서, 도 1A, 우측 단백질 참조). CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인은 세포외 환경에서 다른 결합 파트너(리간드 또는 수용체)와의 상호작용을 담당하는 기능성 도메인을 함유하고(도 1B, 좌측 단백질 참조), CD40L의 세포외 도메인은 세포외 환경에서 다른 결합 파트너(리간드 또는 수용체)와의 상호작용을 담당하는 기능성 도메인을 함유한다(도 1B, 우측 단백질 참조).
본 개시내용의 일 양상은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법이다. 이 방법은 (i) 인간 대상체에게 하기 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함한다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 비제한적인 예에 의해서, 도 1C 및 도 1D를 참조한다. 또한, 도 3A를 참조한다.
실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.0001㎎/㎏, 예를 들어, 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10.0㎎/㎏이다. 키메라 단백질은 초기 용량(예를 들어, 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6 또는 약 10.0㎎/㎏ 중 하나로 투여될 수 있고) 키메라 단백질은 하나 이상의 후속 투여로 (예를 들어, 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1.0, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6, 약 8 및 약 10㎎/㎏ 중 하나 이상으로) 투여된다. 실시형태에서, 초기 용량은 후속 투여(예를 들어, 후속 투여 각각) 중 적어도 하나에 대한 용량보다 적거나 또는 초기 용량은 후속 투여(예를 들어, 후속 투여 각각) 중 적어도 하나에 대한 용량과 동일하다. 실시형태에서, 출발 용량 및/또는 후속 용량은 최대 내약 용량이거나 최대 내약 용량보다 적다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 1회, 예를 들어, 적어도 약 1개월에 2회, 적어도 약 1개월에 3회 및 적어도 약 1개월에 4회 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 투여되고; 대안적으로, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 1개월당 2회, 예를 들어, 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 2주마다 1회 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형(bell-shaped) 용량 반응을 나타내지 않는다.
실시형태에서, 투여는 정맥내이다. 실시형태에서, 투여는 종양내이다. 실시형태에서, 투여는 주사에 의해서이다. 실시형태에서, 투여는 주입에 의해서이다. 실시형태에서, 투여는 정맥내 주입에 의해서 수행된다. 실시형태에서, 투여는 종양내 주사에 의해서 수행된다.
실시형태에서, 암은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택된다. 실시형태에서, 암은 진행성 고형 종양(국소 및/또는 전이성) 또는 진행성 림프종을 포함한다. 실시형태에서, 암은 고형암이다. 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 실시형태에서, 암은 전이성 암이다. 실시형태에서, 암은 혈액암이다. 실시형태에서, 암은 CD47을 발현한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 인간 대상체에게 하기 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 및 (ii) 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.3㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 0.3㎎/㎏ 또는 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 1㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고; 대상체는 제2 치료제로 치료 중이거나 제2 치료제로 치료된 적이 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 제2 항암 치료제를 투여하는 단계를 포함하되, 대상체는 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질로 치료 중이거나 치료를 받은 적이 있고, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 제2 치료제 이전에 투여된다. 실시형태에서, 제2 치료제는 키메라 단백질 이전에 투여된다. 실시형태에서, 제2 치료제 및 키메라 단백질은 실질적으로 함께 투여된다.
실시형태에서, 제2 치료제는 항체 및 화학치료제로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)이 가능하다. 실시형태에서, 항체는 세툭시맙, 리툭시맙, 오비누투주맙, Hul4.18K322A, Hu3F8, 디누툭시맙 및 트라스투주맙으로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)이 가능하다. 실시형태에서, 항체는 세툭시맙, 다라투쿠맙, 리툭시맙 및 트라스투주맙으로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 암종배아 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), EGFR, HER-2, 상피 세포 접착 분자(EpCAM) 및 인간 상피 뮤신-1, CD20, CD30, CD38, CD40 및 CD52로부터 선택된 분자에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 항체는 EGFR에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 항체는 Mab A13, AMG595, 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux, C225), 파니투무맙(panitumumab)(ABX-EGF, Vectibix), 데파툭시주맙(depatuxizumab)(ABT 806), 데파툭시주맙(depatuxizumab), 마포도틴, 둘리고투주맙(duligotuzumab)(MEHD7945A, RG7597), 푸툭시맙(Futuximab)(Sym004), GC1118, 임가투주맙(imgatuzumab)(GA201), 마투주맙(matuzumab)(EMD 72000), 네시투무맙(necitumumab)(Portrazza), 니모투주맙(nimotuzumab)(h-R3), 아니투무맙(anitumumab)(Vectibix, ABX-EGF), 잘루투무맙(zalutumumab), humMR1 및 토무조툭시맙(tomuzotuximab)으로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 세툭시맙이다.
실시형태에서, 화학치료제는 안트라사이클린이다. 실시형태에서, 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin) 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체로부터 선택된다. 실시형태에서, 화학치료제는 독소루비신이다.
실시형태에서, 화학치료제는 대사길항물질 화학치료제이다. 실시형태에서, 대사길항물질 화학치료제는 5-플루오로우라실, 메토스렉세이트, 카페시타빈, 아자시티딘, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신(DON), 아자세린, 아시비신 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체로부터 선택된다. 실시형태에서, 화학치료제는 아자시티딘이다.
실시형태에서, 화학치료제는 B-세포 림프종-2(Bcl-2) 저해제이다. 실시형태에서, 화학치료제는 BH3-모방체이다. 실시형태에서, Bcl-2 저해제 및/또는 BH3-모방체는 베네토클락스, ABT-737 또는 나비토클락스이다. 실시형태에서, 화학치료제는 베네토클락스이다.
실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.0001㎎/㎏, 예를 들어, 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏이다. 키메라 단백질은 초기 용량(예를 들어, 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6 또는 약 10.0㎎/㎏ 중 하나로 투여될 수 있고) 키메라 단백질은 하나 이상의 후속 투여로 (예를 들어, 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6, 약 8 및 약 10㎎/㎏ 중 하나 이상으로) 투여된다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.3㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 0.3㎎/㎏ 또는 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 1㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 초기 용량은 후속 투여(예를 들어, 후속 투여 각각) 중 적어도 하나에 대한 용량보다 적거나 또는 초기 용량은 후속 투여(예를 들어, 후속 투여 각각) 중 적어도 하나에 대한 용량과 동일하다. 실시형태에서, 출발 용량 및/또는 후속 용량은 최대 내약 용량이거나 최대 내약 용량보다 적다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 1회, 예를 들어, 적어도 약 1개월에 2회, 적어도 약 1개월에 3회 및 적어도 약 1개월에 4회 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 투여되고; 대안적으로, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 1개월당 2회, 예를 들어, 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 2주마다 1회 투여된다.
실시형태에서, 암은 진행성 고형 종양(국소 및/또는 전이성) 또는 림프종을 포함한다. 실시형태에서, 암은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택된다. 실시형태에서, 암은 진행성 고형 종양(국소 및/또는 전이성) 또는 진행성 림프종을 포함한다. 실시형태에서, 암은 고형암이다. 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 실시형태에서, 암은 전이성 암이다. 실시형태에서, 암은 혈액암이다. 실시형태에서, 암은 CD47을 발현한다.
따라서, 일 양상에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 인간 대상체에게 유효량의 하기 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함한다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 용량으로 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능의 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 대상체는 암을 앓고 있고, 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 세포 예정사 단백질 1(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻은 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 키메라 단백질의 치료를 계속하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능의 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 대상체는 암을 앓고 있고, 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 세포 예정사 단백질 1(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻은 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15, IL23 및 TNFα로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 그리고/또는 대상체에서 IL6 및/또는 TNFα의 수준 및/또는 활성의 실질적인 증가가 결핍된 경우 키메라 단백질의 치료를 계속하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능의 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고, 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 대상체에게 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능의 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고, 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15, IL23 및 TNFα로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15 및 IL23으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 그리고/또는 대상체에서 IL6 및/또는 TNFα의 수준 및/또는 활성의 실질적인 증가가 결핍된 경우 대상체에게 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 세포 예정사 단백질 1(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻은 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 대상체를 키메라 단백질을 사용한 치료를 위해서 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 세포 예정사 단백질 1(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻은 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15, IL23 및 TNFα로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 그리고/또는 대상체에서 IL6 및/또는 TNFα의 수준 및/또는 활성의 실질적인 증가가 결핍된 경우 대상체를 키메라 단백질을 사용한 치료를 위해서 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 대상체를 키메라 단백질을 사용한 치료를 위해서 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15, IL23 및 TNFα로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15 및 IL23으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 그리고/또는 대상체에서 IL6 및/또는 TNFα의 수준 및/또는 활성의 실질적인 증가가 결핍된 경우 대상체를 키메라 단백질을 사용한 치료를 위해서 선택하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 암은 진행성 고형 종양(국소 및/또는 전이성) 또는 림프종을 포함한다. 본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 암은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택된다.
도 1A 내지 도 1D는 타입 I 막관통 단백질(도 1A 및 도 1B, 좌측 단백질) 및 타입 II 막관통 단백질(도 1A 및 도 1B, 우측 단백질)의 개략도. 타입 I 막관통 단백질 및 타입 II 막관통 단백질은 이의 막관통 도메인 및 세포내 도메인이 누락되고, 막관통 단백질의 세포외 도메인이 링커 서열을 사용하여 연결되어 단일 키메라 단백질을 생성하도록 조작될 수 있다. 도 1C 및 도 1D에 도시된 바와 같이, 타입 I 막관통 단백질, 예를 들어, CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인, 및 타입 II 막관통 단백질, 예를 들어, CD40L의 세포외 도메인은 단일 키메라 단백질로 합쳐진다. 도 1C는 각각의 단백질의 막관통 도메인 및 세포내 도메인의 누락에 의한 타입 I 막관통 단백질 및 타입 II 막관통 단백질의 연결부를 도시하며, 여기서 각각의 단백질로부터의 해방된 세포외 도메인은 링커 서열에 의해서 연결되어 있다. 본 설명에서 세포외 도메인은 전형적으로는 세포막 외부에 국재화된 타입 I 단백질(예를 들어, CD172a(SIRPα)) 및/또는 타입 II 단백질(예를 들어, CD40L)의 전체 아미노산 서열 또는 의도된 수용체 또는 리간드에 대한 결합을 유지하는 이의 임의의 부분을 포함할 수 있다. 더욱이, 키메라 단백질은, 제1 세포외 도메인(도 1C 및 도 1D에서 키메라 단백질의 좌측 단부에 도시됨)이이의 수용체/리간드에 입체적으로 결합할 수 있고/거나 제2 세포외 도메인(도 1C 및 도 1D에서 키메라 단백질의 우측 단부에 도시됨)이 이의 수용체/리간드에 입체적으로 결합할 수 있도록 충분한 전체 가요성 및/또는 도메인들 사이의 물리적 거리를 포함한다. 도 1D는 선형 키메라 단백질에서 연결된 세포외 도메인을 도시하며, 여기서 키메라 단백질의 각각의 세포외 도메인은 "외부로" 향한다.
도 2는 (전문이 참조에 의해 포함된 문헌[Mahoney, Nature Reviews Drug Discovery 2015:14;561-585]으로부터의) 본 개시내용에 관련된 면역 저해 신호전달 및 면역 자극 신호전달을 도시한 도면.
도 3A 내지 도 3E는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질(본 명세서에서 효능제 재지향된 면역관문(ARC) 융합 단백질이라고도 함)이 적절한 폴딩 및 CD47 및 CD40에 대한 결합을 유지함을 도시한 도면. 도 3A(상단 패널)는 인간 SIRPα-Fc-CD40L(RaptorX; 시카고 대학교, 미국 일리노이주 시카고 소재)의 예측된 3차 구조를 도시한다. 도 3A(하단 패널)는 정제된 단백질을 비환원 조건 및 환원 조건 하에서, 인간 항-SIRPα, 항-Fc 및 항-CD40L로 프로빙함으로써 수행된 SIRPα-Fc-CD40L의 웨스턴 블롯 분석 및 ± 데글리코실라제 PNGase F을 도시한다. 도 3B는 SIRPα-Fc-CD40L 약물 물질의 육량체 구조를 나타내는 전자 현미경을 도시한다. 스케일이 표시되고 밝은 화살표는 각각의 식별된 단량체에 해당한다. Fc 도메인의 이량체화(적색 선 = 이황화 결합) 및 CD40L 도메인의 삼량체화를 도시한 육량체 종의 개략도를 우측에 도시한다. 도 3C는 재조합 hCD40에 의한 포획, 그 다음 재조합 hCD47-His, 이어서 항-His-HRP에 의한 검출을 사용한 기능적 이중 ELISA를 도시한다. 도 3D는 인간 CD47 또는 인간 CD40을 안정적으로 발현하도록 조작된 CHOK1 세포에 대한 SIRPα-Fc-CD40L의 유세포 분석법 기반 결합을 도시한다. MFI, 평균 형광 강도. 도 3E는 hSIRPα-Fc-CD40L 또는 인간 CD47-차단 항체(클론 CC2C6)의 존재 또는 부재 하에서 플레이트-결합된 hCD47에 대한 재조합 hSIRPα-Fc의 결합 파괴를 평가한 경쟁 ELISA를 도시한다.
도 4A 내지 도 4F는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 SIRPα 도메인이 시험관내에서 식세포작용을 자극하고 생체내에서 DC의 활성화를 자극함을 도시한다. 도 4A는 면역형광(IF)을 사용한 식세포작용의 인간 대식세포(적색)/림프종(Toledo; 녹색) 공배양 분석을 도시한다. DAPI를 사용하여 핵(청색)을 표지하였고, 합쳐진 채널 및 위상 영상을 우측에 나타낸다. 인간 IgG 음성 대조군을 0.06μ㏖/ℓ로, 리툭시맙을 0.06μ㏖/ℓ로, hSIRPα-Fc-CD40L은 1μ㏖/ℓ로 사용하였다. 도 4B는 처리 조건 각각에 대해 얻어진 7 내지 13개의 구별되는 IF 영상을 사용하여 정량된 총 대식세포 수당 삼켜진 종양 세포의 수를 도시한다. ImageJ 소프트웨어를 분석에 사용하였다. 도 4C는 IgG 음성 대조군, 단일요법 hSIRPα-Fc-CD40L 및 리툭시맙, 또는 이들 작용제의 조합을 사용하여 유세포 분석법에 의해 평가되고, 2시간 후 분석된 인간 대식세포 및 Toledo 림프종 세포 공배양 식세포작용을 도시한다. 대식세포가 20㎍/㎖의 상업적으로 입수 가능한 Fc 차단 칵테일, 20㎍/㎖의 CD40 차단 항체 또는 5㎍/㎖의 칼레티쿨린 차단 펩타이드와 함께 1시간 동안 사전인큐베이션되는 동일한 검정을 설정하였다. 도 4D는 식세포작용의 분석을 나타낸다. IncuCyte phRodo Red 사전 표지된 Toledo 세포를 인간 대식세포와 함께 공배양하고, 식세포작용을 5시간에 걸쳐 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 평가하였다. 공배양물을 hSIRPα-Fc-CD40L(1μ㏖/ℓ), 리툭시맙(1㎍/㎖), 항-CD47(클론 CC2C6; 33㎍/㎖) 또는 SIRPα-Fc-CD40L과 리툭시맙 또는 항-CD47 및 리툭시맙의 조합물로 처리하였다. 도 4E는 유세포 분석법에 의해 평가된 식세포작용의 분석을 도시한다. 제시된 인간 종양 세포주를 1μ㏖/ℓ의 SIRPα-Fc-CD40L로의 단일요법, 0.06μ㏖/ℓ의 세툭시맙/트라스투주맙 단일요법 또는 작용제의 조합물로 처리하였다. 인간 종양 세포주는 주어진 표적을 발현하는 것으로 확인되었다. K562 세포를 식세포작용에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 도 4F는 양 RBC(1 Х 107 개 세포; 양성 대조군으로서), CD47 및 SIRPα(각각 100㎍)에 대한 차단 항체 또는 mSIRPα-Fc-CD40L(100 또는 300㎍에서)의 단일 정맥내 용량으로 처리된 마우스에서 다양한 세포 유형의 분석을 도시한다. 6시간 또는 24시간 후, 마우스를 안락사시키고, 비장을 절제하고, 해리시키고, 또한 MHC-II(I-Ab), CD11c 및 DC1R2에 대해서 양성인 활성화된 CD4+(좌측) 또는 CD8+ DC(우측) 집단에 대해 유세포 분석법으로 평가하였다. 도 10D 내지 도 10F에서의 상응하는 데이터를 참조한다.
도 5A 내지 도 5F는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 CD40L 도메인이 NFκB 신호전달, 항원-비의존적 PBMC 활성화 및 타입 I IFN 인터페론 반응을 유도함을 도시한 도면. 도 5A는 인간 SIRPα-Fc-CD40L이 CHO-K1/hCD40/NFκB 리포터 세포에서 정규(canonical) NFκB 신호전달을 자극했음을 나타낸다. 6시간 후 발광이 나타난다. 재조합 인간 CD40L-His는 양성 대조군 역할을 한다. 도 5B는 비정규 NIK/NFκB 리포터 U2OS 세포(인간 CD40을 발현함)에서의 생물발광을 나타낸다. NIK/NFκB 리포터 U2OS 세포를 재조합 hCD40L-Fc, 효능제 hCD40 항체 또는 SIRPα-Fc-CD40L의 적정으로 배양하였다. 6시간 후 발광이 나타난다. 33명 내지 50명의 개별 인간 공여자로부터의 CD8-고갈된 PBMC를 배지 단독, 신생항원 양성 대조군 KLH, 임상 단계 비활성화 대조군 엑세나타이드, 또는 0.3, 3, 30 또는 300n㏖/ℓ의 hSIRPα-Fc-CD40L과 함께 배양하였다. 도 5C는 [3H]-티미딘 혼입을 통해 평가된 바와 같은, 제5일, 제6일 및 제7일의 증식을 도시한다. 도 5D는 ELISpot에 의해 평가된 바와 같은 제8일에 IL2-양성 세포를 도시한다. 도 5E는 리툭시맙(0.06μ㏖/ℓ), hSIRPα-Fc-CD40L(1μ㏖/ℓ) 또는 이들 두 작용제의 조합물의 존재 하에서 식세포작용 검정에서 대식세포:Toledo 림프종 세포 공배양물로부터 수거된 대식세포로부터의 IFNα1, IFNβ1, CD80 및 CD86 유전자 발현을 도시한다. 도 5F는 50㎍/㎖의 mSIRPα-Fc-CD40L, 재조합 Fc-mCD40L, mSIRPα-Fc 또는 이들의 조합물 또는 1㎍/㎖의 항-mCD20, 또는 mSIRPα-Fc-CD40L과 항-mCD20의 조합물의 존재 하에서 A20 림프종 세포와 함께 공배양된 RAW 264.7-Lucia ISG 세포에서의 타입 I IFN-유도 발광을 도시한다. 24시간 후, 광도계를 사용하여 타입 I IFN-유도 발광을 평가하였다. 모든 실험에서 발광의 최대 신호를 1로 설정하였고, 다른 모든 값을 그에 따라 정규화하였다.
도 6A 내지 도 6E는 뮤린 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 대용체의 항종양 효능을 도시한 도면. 도 6A는 비히클(PBS; n=21), 항-CD40(클론 FGK4.5; n=8), 항-CD47(클론 MIAP301; n=8), 두 항체의 조합물(n = 9, 100㎍/항체/용량) 또는 mSIRPα-Fc-CD40L(용량당 150 내지 300㎍, n = 10)의 2회 용량으로 처리된 마우스의 CT26 종양 성장 곡선을 도시한다. STV는 치료가 시작된 날의 "시작 종양 부피"를 나타낸다. 도 6B는 사량체 시약을 사용하여 비장 및 종양에서 AH1 항원-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 6C는 제7일, 제9일 및 제11일에 비히클(PBS; n=10) 또는 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질(n=10; 300㎍/용량)로의 처리 시작 전에 CD4, CD8, 또는 CD4 및 CD8 세포 둘 다의 사전 고갈된 마우스에서의 CT26 종양 성장 곡선을 도시한다. 종양이 확립되고 대략 65 내지 70mm3에 도달했을 때; 제7일, 제9일 제11일(WEHI3)에 또는 제10일, 제12일 및 제14일(A20)에 비히클(PBS; 각각의 종양 모델에서 n = 11마리 마우스), 항-CD20(100㎍/용량; A20에서 n = 9 및 WEHI3에서 n = 10), mSIRPα-Fc-CD40L(300㎍/용량; A20에서 n = 11 및 WEHI3에서 n = 10), 또는 mSIRPα-Fc-CD40L과 항-CD20의 조합물(A20에서 n = 10 및 WEHI3에서 n = 9)로 처리된 마우스에서의 WEHI3(도 6D) 또는 A20 종양(도 6E)의 종양 성장 곡선. 또한 치료 개시 전에 IFNAR1 세포가 사저 고갈된 마우스에서의 종양 성장 곡선을 또한 나타낸다. 군은 항-CD20(두 종양 모델 모두에서 n=10), mSIRPα-Fc-CD40L(A20에서 n = 12 및 WEHI3에서 n = 11) 또는 두 작용제의 조합물(A20에서 n = 10 및 WEHI3에서 n = 8)을 포함하였다.
도 7A 내지 도 7C는 mSIRPα-Fc-CD40L이 항-CTLA4 또는 항-PD-1과 조합되었을 때 개선된 항종양 효능을 나타냄을 도시한 도면. 도 7A 및 도 7B는 mSIRPα-Fc-CD40L(제12일, 제14일 및 제16일에 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질과 함께 제7일, 제9일 및 제11일) 이전에, mSIRPα-Fc-CD40L(제7일, 제9일 및 제11일에 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질과 함께 제12일, 제14일 및 제16일) 후에 또는 mSIRPα-Fc-CD40L(제7일, 제9일 및 제11일)와 동시에 투여된 항-CTLA4(클론 9D9; A) 및 항-PD-1(클론 RMP1-14; B)로 치료된 후 더 큰 CT26 종양[평균 시작 종양 부피(STV) 89.76mm3]을 보유한 마우스의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 실험 복제물을 도 13A 및 도 13C에 도시한다. 도 7C는 제7일 및 제9일에 제공된 100mg의 항-CTLA4 또는 항-PD-1의 2회 복강내 용량으로 처리된 마우스에서 유세포분석법에 의한 제11일 CT26 종양 및 침윤성 백혈구 표현형분석을 나타낸다. 세포 집단을 수거 시 취한 세포 계수치 및 종양 중량을 기준으로 CD40+ DC(CD11c+), B 세포(CD19+) 및 T 세포(CD3+; 상단) 및 MHC-I, MHC-II 및 CD47+ 세포(하단)에 대해 평가하였다
도 8A 내지 도 8I는 시노몰거스 마카크에서의 hSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 안전성 및 hSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 안전성의 전반적인 작용 기전을 도시한 도면(이론에 얽매이고자 함은 아님). 도 8A는 말초 적혈구 수치, 헤모글로빈 수준 및 헤마토크리트에 의해 평가된 바와 같은 혈액 화학 분석을 도시한다. 시노몰거스 마카크를 비히클 또는 0.1, 1, 10 및 40㎎/㎏의 SIRPα-Fc-CD40L로 처리하고, 말초 적혈구 수치, 헤모글로빈 수준 및 헤마토크리트를 제시된 시간에 측정하였다. 도 8B는 제1 용량 후 유세포 분석법에 의해 평가된 바와 같은 CD47 수용체 점유율을 도시한다. Free-CD47 유세포 분석법 신호의 역수를 플로팅하는데, 그 이유는 용량 증가에 따른 검출 가능한 CD47 신호의 손실이 CD47 수용체가 이미 hSIRPα-Fc-CD40L에 의해 결합된 세포의 백분율에 정비례하기 때문이다. 도 8C는 투여 전에서 투여 후 24시간까지 말초 림프구 수치의 배수 변화를 나타낸다. 도 8D는 투여 전 배경 수준과 비교한 투여 후 혈청 내 사이토카인 CCL2, IL-8 및 CXCL9의 수준을 나타낸다. 도 8E는 투여 전 배경 수준과 비교하여 투여 후 림프절에서 Ki67 양성 세포의 염색을 나타낸다. 도 8F 내지 도 8I는 SIRPα-Fc-CD40L의 제안된 작용 기전을 나타낸다(이론에 얽매이지 않음). 도 8F는 종양-발현된 CD47이 SIRPα의 결합을 통해 APC에 "나를 먹지 마" 신호를 제공할 수 있음을 나타낸다. 도 8G는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 CD40L에 의한 CD40의 공동자극을 통해 "날 먹어" 신호를 동시에 제공하는 동시에 이러한 저해 신호를 완화할 수 있음을 나타낸다. 이는 종양 식세포작용, APC 활성화, 항원 처리/제시 증가, 항종양 항원-특이적 CD8+ T-세포 반응의 유도를 향상시킨다. 도 8H 및 도 8I는 SIRPα-Fc-CD40L을 표적화된 ADCP-적격 항체와 조합하는 것이 그들의 식세포작용 활성을 강화시킨다는 것을 나타낸다.
도 9A 내지 도 9G는 인간 SIRPα-Fc-CD40L 및 뮤린 mSIRPα-Fc-CD40L 대용체의 추가 특징규명을 나타낸 도면. 도 9A는 재조합 Fc, CD47 및 CD40 포획을 사용한 hSIRPα-Fc-CD40L의 단면 ELISA 검출을 나타낸다. 도 9B는 hSIRPα-Fc-CD40L에 대한 결합을 평가하기 위해 사용된 CHO-K1 세포에서의 인간 CD47 및 인간 CD40 발현의 확인을 나타낸다. 도 9C는 CHO-K1 모체 세포 또는 인간 CD47 또는 CD40을 과발현하도록 조작된 CHO-K1 세포에 대한 SIRPα-Fc-CD40L의 결합을 도시한, 도 3E로부터의 예시적인 유세포 분석법 게이팅을 나타낸다. 이 예에서, 세포를 10㎍/㎖의 인간 SIRPα-Fc-CD40L과 함께 인큐베이션시켰다. 도 3E에서 결합 곡선을 생성하기 위해, SIRPα-Fc-CD40L을 용량 적정하면서 세포를 인큐베이션시켰다. 도 9D는 비-환원, 환원 및 PNGase F/환원 조건 하에서 mSIRPα, mFc 및 mCD40L을 검출하는 항체를 사용한 뮤린 SIRPα-Fc-CD40L 대용체의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 9E는 재조합 마우스 CD47 및 CD40에 대한 동시 결합을 입증하는, 뮤린 SIRPα-Fc-CD40L 대용체의 이중 기능성 ELISA를 나타낸다. 도 9F는 mSIRPα-Fc-CD40L 또는 항-CD47의 존재 하에서 A20 림프종 또는 WEHI3 백혈병 세포와 공배양된 골수 유래 대식세포를 사용한 식세포작용 검정의 뮤린 버전을 나타낸다. 도 9G는 뮤린 CD40 및 NFκB-루시페라제 리포터를 발현하도록 개발된 CHO-K1 세포에서 NFκB-루시페라제 리포터 검정의 뮤린 버전의 결과를 나타낸다.
도 10A 내지 도 10F는 지지적 식세포작용 데이터 및 생체내 수지상 세포의 SIRPα-유도 활성화를 나타낸다. 도 10A는 hSIRPα-Fc-CD40L+/-리툭시맙의 존재 하에서 유세포 분석법을 사용하여 인간 대식세포에 의한 Raji 세포의 식세포작용 정량화를 나타낸다. 도 10B는 도 4E에서 식세포작용 검정에 사용된 인간 종양 세포주에서 표면 발현된 EGFR, HER2, CD40 및 CD47의 유세포 분석법 표현형분석을 나타낸다. 도 10C는 도 4C, 도 4E 및 도 9F에서 유세포 분석법 기반 식세포작용 검정을 위한 예시적인 게이팅을 나타낸다. 도 10D는 개략도를 도시하고 도 10E는 도 4F에 상응하는 생체내 수지상 세포 활성화의 정량화를 도시한다. 또한 CD11c 및 DC1R2에 대해서 게이팅된 CD4+ 및 CD8+ 수지상 세포의 절대 백분율을 나타낸다. 도 10F는 도 4F, 도 10C 및 도 10D의 유세포 분석법을 위한 예시적인 게이팅을 나타낸다. CD8+ DC에 대해 표시된 것과 동일한 게이팅 전략을 CD4+ DC에 대해서 사용하였다.
도 11A 및 도 11B는 Raji 세포와 공배양된 대식세포에서 타입 I 인터페론 발현을 도시한 도면. 도 11A는 도 5C 내지 도 5D에 제시된 인간 PBMC로부터의 CD8 고갈 유세포 분석법을 위한 예시적인 게이팅을 나타낸다. 도 11B는 도 5E에 대한 지지적 데이터를 나타낸다. ACTB 및 미처리 대조군에 대한 유전자 발현의 배수 변화를 h SIRPα-Fc-CD40L +/- 리툭시맙(Ritux)으로 처리된 Raji 세포와 2시간 공배양한 후 CD11b+ 분류된 대식세포에서 평가하였다.
도 12A 내지 도 12E는 CD4, CD8 및 IFNAR1의 차단을 도시한다. 도 12A는 도 6B의 유세포 분석법을 위한 예시적인 게이팅을 나타낸다. 도 12B는 도 6C 내지 도 6E에 상응하는 고갈 항체 처리 후 CD4(좌측), CD8(중간) 및 IFNAR1(우측)의 유세포 분석법에 의한 말초 혈액 분석을 나타낸다. 샘플을 처리되지 않은 동물에 대해서 정규화시켰다. 도 12C는 도 12B에 나타낸 CD4, CD8 및 IFNAR1 고갈에 대한 예시적인 유세포 분석법 게이팅을 나타낸다. 도 12D는 SIRPα-Fc-CD40L로 치료를 시작한 후(제7일, 제9일, 제11일에 치료) CD4 및 CD8 세포가 시간 경과의 제9일, 제11일 및 제15일에 CT26 종양 보유 마우스로부터 고갈되었음을 나타낸다. 이러한 전략은 '후기' 고갈로 지칭되며 도 6C에 나타낸 '조기' CD4/CD8 고갈과 상관관계가 있다. 도 12E는 IFNAR1+ 세포 고갈의 효과를 나타낸다. IFNAR1+ 세포는 SIRPα-Fc-CD40L로 치료를 시작한 후 WEHI3 동물에서는 제9일, 제11일 및 제13일에 그리고 A20 동물에서는 제12일, 제14일 및 제16일에 WEHI3(좌측) 및 A20(우측) 보유 마우스로부터 고갈되었다. 도 6D 내지 도 6E에서와 같이, mSIRPα-Fc-CD40L을 WEHI3 보유 마우스에서는 제7일, 제9 및 제11일에 그리고 A20 보유 마우스에서는 제10일, 제12일 및 제14일에 제공하였다. 이러한 전략은 '후기' 고갈로 지칭되며 도 6D 내지 도 6E에 도시된 '조기' IFNAR1 고갈과 상관관계가 있다.
도 13A 내지 도 13E는 mSIRPα-Fc-CD40L 및 항-CTLA4 또는 항-PD1의 다양한 서열분석을 사용한 CT26 조합 실험을 도시한다. 도 13A 및 도 13C는 각각 항-CTLA4 또는 항-PD1과의 조합을 나타낸다; 각각의 치료군의 마우스의 수, 1차 CT26 종양을 거부한 마우스의 수, 2차 CT26 종양 재시험감염을 거부한 마우스의 수(후속 재치료 없음). 도 13B 및 도 13D는 단일요법군과 조합물군 사이의 Mantle Cox 생존 및 통계 분석을 나타낸다. 'd'는 요법이 투여된 '일'을 나타낸다. 도 13E는 도 7C에 대한 예시적인 유세포 분석법 게이팅을 나타낸다.
도 14A 내지 도 14F는 SIRPα-Fc-CD40L로 처리한 후 말초 B 세포의 용혈 평가 및 약력학적 감소를 도시한다. 도 14A는 도 8B에 대한 예시적인 유세포 분석법 게이팅을 나타낸다. 도 14B는 이전에 RBC 용해를 유도하는 것으로 나타난 CD47 차단 항체인 양성 대조군 Triton X-100의 적정(클론 CC2C6) 및 SIRPα-Fc-CD40L의 3개의 개별 로트의 적정으로 처리된 인간 공여자 RBC를 사용한 시험관내 용혈 검정을 나타낸다. 도 14C는 전체 CD45+ 말초 림프구의 감소가 mSIRPα-Fc-CD40L(300㎍)의 단일 IP 주사 후 24시간에 관찰되었음을 나타낸다. 도 14D는 뮤린 SIRPα-Fc-CD40L 대용체(화살표)의 3회 IP 용량(300㎍)을 제공받은 마우스로부터 말초 혈액이 단리되었음을 나타낸다. 세포 집단을 유세포 분석법으로 평가하였고, 세포 집단은 CD20+ B 세포, CD11C+, CD4+/CD11c+ 및 CD8+/CD11c+ 수지상 세포를 포함하였다. 인터페론 알파 수용체 1 고갈 항체(항-IFNAR1)로 처리된 마우스에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 도 14E는 일정 용량 범위의 mSIRPα-Fc-CD40L의 단일 IP 주사 24시간 후에 관찰된 말초 CD20+ B 세포의 감소를 나타낸다. 도 14F는 도 14C 내지 도 14E에 대한 예시적인 유세포 분석법 게이팅을 나타낸다.
도 15A 및 도 15B는 비인간 영장류에서 SL-172154에 의해 유발된 림프구 변연화(margination)를 나타낸다. 도 15A는 제15일부터 제16일까지 투여 후 림프구 변연화를 나타낸다. 시노몰거스 원숭이를 제1일, 제8일 및 제15일에 SL-172154로 제시된 용량으로 처리하였다. 투여 전 및 투여 후 림프구 수치를 3차 투여 전 제15일 및 3차 투여 대략 24시간 후 제16일에 얻었다. 말초 혈액 림프구의 수는 제15일 투여 후 용량-의존적 방식으로 감소하는 것으로 관찰되었으며, (100 - ((제16일 림프구의 수)/(제15일 림프구의 수) x 100으로 플로팅한다. 각각의 데이터 지점은 개별 동물을 나타낸다. 도 15B는 림프구의 이동을 설명하는 미처리 원숭이 및 SL-172154 -처리 원숭이의 비장의 조직화학적 분석을 나타낸다. 시노몰거스 원숭이에게 5회의 연속 주단위 용량 SL-172154를 투여하였다. 대조군과 SL-172154-처리 동물로부터의 예시적인 비장 부분을 나타낸다.
도 16은 SL-172154의 1상 임상 시험 설계의 개략도를 도시한 도면. 1상 임상 시험은 진행성 고형 종양 또는 림프종을 갖는 대상체에서의 최초의 인간, 공개, 다기관, 용량 증량 및 용량 확장 연구이다. 이 연구의 주요 목적은 SL-172154의 안전성, 내약성을 평가하는 것이다. 이 연구의 2차 목적은 SL-172154의 권장 2상 용량(RP2D), 약동학(PK), 항종양 활성 및 약력학적 효과를 평가하는 것이다. 이 연구의 탐색적 목적은 혈액 및 종양에서 약력학(PD) 마커를 평가하는 것이다. 연구 설계는 각각 좌측 및 중간 패널에 표시된 용량 증량 코호트 및 PD 코호트로 이루어진다. 이 연구에서 사용된 용량 수준(DL)은 0.1㎎/㎏ 내지 10.0㎎/㎏ 범위의 DL1에서 DL5까지였다. 우측 패널은 안전성, PK, PD 및 항종양 활성을 포함하는 전체 연구 데이터를 기반으로 권장 2상 용량(RP2D) 결정을 나타낸다. 사용된 약어는 다음을 포함한다: D = 일; q2wks = 2주마다; PK = 약동학; PD = 약력학; 및 DLT = 용량 제한 독성.
도 17은 난소암에서 SL-172154의 초기 임상 개발 전략의 개략도를 도시한 도면. 이 연구에서 사용된 용량 수준(DL)은 0.1㎎/㎏ 내지 10.0㎎/㎏ 범위의 DL1에서 DL5까지였다.
도 18은 SL-172154의 1상 임상 시험 설계의 개략도를 도시한 도면. 연구의 용량 증량 부분에서, 3명 이상의 환자가 0.003mg 내지 0.1mg 범위의 4가지 용량 수준 각각을 통해 등록될 것이다.
도 19는 CSCC 및 HNSCC에서 SL-172154의 초기 임상 개발 전략의 개략도를 도시한 도면. 연구의 용량 증량 부분에서, 3명 이상의 환자가 0.003mg 내지 0.1mg 범위의 4가지 용량 수준 각각을 통해 등록될 것이다.
도 20은 혈액암, TP53 돌연변이 AML을 비롯한 급성 골수성 백혈병(AML) 및 고위험 골수이형성 증후군(high-risk myelodysplastic syndrome: HR-MDS)에서 SL-172154의 초기 임상 개발 전략의 개략도를 도시한 도면.
본 개시내용은 부분적으로 인간 환자에서 항암 안전성 및 효능에 대한 키메라 단백질의 특정 용량의 발견에 기초하며, 키메라 단백질은 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα)) 및 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 또는 효과기 영역으로부터 조작된다. 또한, 본 개시내용은 부분적으로 인간에서 본 발명의 키메라 단백질의 최대 내약 용량이 약 1㎎/㎏ 초과라는 발견에 기초한다. 추가로, 본 개시내용은 부분적으로 본 발명의 키메라 단백질이 이러한 부류의 작용제에 대해서 예상되는 종형 반응과 상반되게 선형 용량 반응을 나타낸다는 발견에 기초한다.
CD40/CD40L 신호전달의 자극은 실험적인 암 요법을 위한 매우 매력적인 접근법이다. 그러나, 인간 환자에서 사용된 다수의 요법은 최대-내약 용량(MTD)이 0.1 내지 0.2㎎/㎏ 범위인 것으로 나타났다. 예를 들어, 재조합 인간 CD40 리간드(rhuCD40L)(Avrend; 이뮤넥스사(Immunex Corp), 미국 워싱턴주 시애틀 소재)는 0.1㎎/㎏의 MTD를 나타냈다(Vonderheide et al., Phase I study of recombinant human CD40 ligand in cancer patients, J Clin Oncol 19(13): 3280-3287 (2001)). 이 연구에서 발견된 일시적인 3 내지 4등급 간 기능 검사 이상은 CD40 효능제의 계열 효과인 것으로 밝혀져 있다. 문헌[Vonderheide, CD40 Agonist Antibodies in Cancer Immunotherapy, Annu. Rev. Med. 71:47-58 (2020)]을 참조한다. 마찬가지로, CD40 효능제 단클론성 항체, 예컨대, CP-870,893(셀리크렐루맙(Selicrelumab), 화이자사(Pfizer)) 및 APX005M(소티갈리맙(Sotigalimab), 아펙시겐사(Apexigen))은 0.1㎎/㎏ 내지 0.2㎎/㎏ 범위의 MTD를 나타내었다(Nowak et al., A phase 1b clinical trial of the CD40-activating antibody CP-870,893 in combination with cisplatin and pemetrexed in malignant pleural mesothelioma, Annals of Oncology 26(12): 2483-2490 (2015); Vonderheide et al., Phase I study of the CD40 agonist antibody CP-870,893 combined with carboplatin and paclitaxel in patients with advanced solid tumors, Oncoimmunology 2(1): e23033 (2013); Li and Wang, Characteristics and clinical trial results of agonistic anti-CD40 antibodies in the treatment of malignancies (Review), Oncology Letters 20: 176 (2020)). 이러한 연구에 상반되게, 예를 들어, 실시예 8에서 본 명세서에 제시된 데이터와 같이, 3㎎/㎏ 용량 수준의 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 - 이전의 CD40 효능제의 용량 수준보다 약 10배 더 높음-도 용량-제한 독성을 생성하지 않았다.
따라서, 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 인간 대상체에게 하기 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함한다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 약 0.2㎎/㎏ 초과이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 1㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다.
양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 인간 대상체에게 하기 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함한다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.3㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 0.3㎎/㎏ 또는 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다.
종형 용량-반응은 작용제가 낮은 용량에서 치료 효과(예를 들어, 자극 효과)를 발휘하고, 이것은 더 높은 용량에서는 감소되는 현상을 지칭한다. 대신, 더 높은 용량에서는, 저해 효과가 관찰된다. 예를 들어, 이전 연구는 순환계에서 CD40 효능제 항체에 대한 약력학적 바이오마커 반응에 대한 종형 곡선을 입증하였다. 문헌[Smith et al., Rationale and clinical development of CD40 agonistic antibodies for cancer immunotherapy, Expert Opinion on Biological Therapy 17:1-12 (2021)] 참조. 이에 반해서, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명의 키메라 단백질은 선형 용량 반응을 나타낸다.
본 발명의 키메라 단백질은 비제한적으로, 사용 용이성 및 생산 용이성을 포함하는 이점을 제공한다. 이는, 2종의 구별되는 면역치료제가 단일 제품 내에 조합되어, 이것이 2개의 독립적인 제조 공정 대신에 단일 제조 공정을 허용할 수 있기 때문이다. 또한, 2종의 개별 작용제 대신에 단일 작용제를 투여하는 것은 더 용이한 투여 및 더 높은 환자 순응도(patient compliance)를 가능하게 한다. 추가로, 예를 들어, 다수의 이황화 결합 및 번역 후 변형, 예컨대, 글리코실화를 함유하는 큰 다량체 단백질인 단클론성 항체와 대조적으로, 본 발명의 키메라 단백질은 제조하기에 더 용이하고, 더 비용 효율적이다. 또한, 개별 면역요법제가 제자리에서 치료 효과를 발휘할 수도 있고 발휘하지 않을 수도 있지만, 동시에, 2개의 개별 작용제 대신 단일 작용제가 동일한 미세 환경에서 동시에 합동 작용을 보장한다.
SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)이 제공하는 또 다른 이점은 표적화에도 불구하고 환자에서 빈혈 또는 다른 혈구 감소증을 유발하지 않는다는 것이다. 이는 CD47/SIRPα 상호작용이 RBC의 용해에 중요한 역할을 하지만, 본 명세서에 기재된 바와 같이, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 RBC의 용해를 일으키지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명의 방법은 예를 들어, 항-CD47 Ab에서보다 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증을 유발할 가능성이 적다. 추가의 또 다른 이점은 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 용량이 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증 효과에 의해 제한되지 않으며, 따라서 특정 다른 치료제(예를 들어, 항-CD47 항체 또는 SIRPalphaFc 융합 단백질)와 비교하여 더 높은 용량이 허용된다는 것이다. 추가로, 실시형태에서, 저용량 프라이밍이 필요하지 않다.
중요하게는, 본 개시내용의 키메라 단백질(CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인과 암 세포 상의 이의 수용체/리간드의 결합을 통해)은 예를 들어, 식세포 작용 및/또는 파괴를 피하려고 시도하고 (CD40L과 이의 수용체의 결합을 통해) 항암 면역 세포에 대한 면역 자극 신호의 전달을 강화, 증가 및/또는 자극하는 암 세포에서 유래하는, 면역 저해 신호의 전달을 방해, 차단, 감소, 저해 및/또는 봉쇄하기 때문에, 이것은 2개의 구별되는 경로에 의해서 항종양 효과를 제공할 수 있고; 이러한 이중-작용은 환자에서 임의의 항종양 효과를 제공하고/하거나 환자에게 향상된 항종양 효과를 제공할 가능성이 더 크다. 더욱이, 이러한 키메라 단백질은 2개의 구별되는 경로를 통해 작용할 수 있기 때문에, 이것은, 적어도, 두 경로 중 하나를 표적으로 하는 치료에 불량하게 반응하지 않는 환자에서 효능이 있을 수 있다. 따라서, 두 경로 중 하나를 통해 작용하는 치료에 불량한 반응자인 환자는 다른 경로를 표적으로 함으로써 치료적 유익을 제공받을 수 있다.
키메라 단백질
본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 CD40L의 세포외 도메인을 포함하는데, 이것은 함께 동시에 면역 저해 신호를 차단하고 면역 활성화 신호를 자극한다.
본 개시내용의 양상은 하기 일반 구조를 포함하는 키메라 단백질을 제공한다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 예를 들어, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 CD40L의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고, 링커는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결한다.
실시형태에서, 제1 도메인은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 CD172a(SIRPα) 리간드에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제1 도메인은 암 세포 표면 상에서 발현되는 CD172a(SIRPα) 리간드(예를 들어, CD47)에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제1 도메인은 골수 및 조혈 모세포 및 신경에 위치한 CD172a(SIRPα) 단백질에 대한 CD172a(SIRPα) 리간드(예를 들어, CD47)의 결합을 저해할 수 있다. 실시형태에서, 제1 도메인은 면역억제 신호를 저해할 수 있다. 실시형태에서, 제1 도메인은 면역억제 신호를 저해할 수 있다. 실시형태에서, 제1 도메인은은 대식세포 면역관문 또는 "나를 먹지마" 신호를 저해할 수 있다. 실시형태에서 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)을 사용한 요법은 종양 세포를 식균하고 식균된 종양 세포의 종양 항원을 T 세포에 효과적으로 제시하도록 대식세포를 자극한다.
실시형태에서, 제2 도메인은 CD40 수용체에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제2 도메인은 CD40L의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함한다. 실시형태에서, 제2 도메인은 면역 자극 신호를 활성화할 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 재조합 융합 단백질, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 세포외 도메인을 갖는 단일 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 실시형태에서, 키메라 단백질은 원핵 세포, 진핵 세포 또는 세포-유리 발현 시스템에서 단일 단위로 번역된다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 분비성 및 완전 기능성 단일 폴리펩타이드 쇄로서 포유동물 숙주 세포에서 생산 가능하다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 시험관내에서 (공유 또는 비공유 결합을 통해서) 조합되어 단일 단위를 산출하는 다수의 폴리펩타이드의 재조합 단백질, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 다수의 세포외 도메인(예를 들어, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 합성 링커를 가짐)을 지칭한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 하나의 폴리펩타이드로서 화학적으로 합성되거나 또는 각각의 도메인은 개별적으로 화학적으로 합성되고, 그 다음 조합된다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 일부는 번역되고, 일부는 화학적으로 합성된다.
실시형태에서, 세포외 도메인은 세포외 환경과 상호작용할 수 있는 막관통 단백질의 일부를 지칭한다. 실시형태에서, 세포외 도메인은 리간드 또는 수용체에 결합하여, 세포에 신호를 효과적으로 전송하기에 충분한 막관통 단백질의 일부를 지칭한다. 실시형태에서, 세포외 도메인은 세포 또는 세포막의 외부에 일반적으로 제시되는 막관통 단백질의 전체 아미노산 서열이다. 실시형태에서, 세포외 도메인은 세포외 도메인은 세포 또는 세포막의 외부에 존재하는 막관통 단백질의 아미노산 서열의 일부이며, 관련 기술 분야에 공지된 방법(예를 들어, 시험관내 리간드 결합 및/또는 세포 활성화 검정)을 사용하여 검정될 수 있는 바와 같이 신호 변환 및/또는 리간드 결합에 필요하다.
막관통 단백질은 전형적으로 세포외 도메인, 하나 또는 일련의 막관통 도메인, 및 세포내 도메인으로 이루어진다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 막관통 단백질의 세포외 도메인은 가용성 수용체 또는 리간드 또는 막-결합된 수용체 또는 리간드(즉, 인접한 세포의 막)와의 상호작용을 담당한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 막관통 도메인(들)은 막관통 단백질의 원형질막으로의 국재화를 담당한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 막관통 단백질의 세포내 도메인은 세포내 반응을 세포외 환경과 조정하기 위해 세포 신호전달 분자와의 상호작용을 조정을 담당한다(또는 그 역도 마찬가지임).
일반적으로 2가지 유형의 단일-통과 막관통 단백질이 존재하는데: 타입 I 막관통 단백질은 세포외 아미노 말단 및 세포내 카복시 말단을 갖고(도 1A, 좌측 단백질 참조), 타입 II 막관통 단백질은 세포외 카복시 말단 및 세포내 아미노 말단을 갖는다(도 1A, 우측 단백질 참조). 타입 I 막관통 단백질 및 타입 II 막관통 단백질은 수용체 또는 리간드일 수 있다. 타입 I 막관통 단백질(예를 들어, CD172a(SIRPα))의 경우, 단백질의 아미노 말단은 세포 외부로 향하고, 따라서 세포외 환경에서 다른 결합 파트너(리간드 또는 수용체)와의 상호작용을 담당하는 기능성 도메인을 함유한다(도 1B, 좌측 단백질 참조). 타입 II 막관통 단백질(예를 들어, CD40L)의 경우, 단백질의 카복시 말단은 세포 외부로 향하고, 따라서 세포외 환경에서 다른 결합 파트너(리간드 또는 수용체)와 상호작용하는 책임이 있는 기능성 도메인을 함유한다(도 1B, 우측 단백질 참조). 따라서, 이러한 2가지 유형의 막관통 단백질은 세포막에 대해서 서로 대향하는 배향을 갖는다.
광범위한 암에서 "나를 먹지 마시오" 신호로 CD47을 설명하는 것은 "나를 먹어라" 신호의 어떤 조합이 CD47 차단 설정에서 항종양 면역을 향상시킬 수 있는지에 대한 탐색을 자극하였다(Willingham et al., The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 6662-6667 (2012); Jaiswal et al., CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis. Cell 138:271-285 (2009); Weiskopf et al., Engineered SIRPalpha variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies. Science 341:88-91 (2013)). 리툭시맙 및 트라스투주맙을 비롯한 CD47 차단 및 ADCP-적격 항체는 종양 식세포작용을 향상시킨다(Kauder et al., ALX148 blocks CD47 and enhances innate and adaptive antitumor immunity with a favorable safety profile. PLoS One 13: e0201832 (2018); Chao et al., Anti- CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell 142:699-713 (2010); Chao et al., Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47. Sci Transl Med 2:63ra94 (2010); Advani et al., CD47 Blockade by Hu5F9-G4 and rituximab in non-Hodgkin's lymphoma. N Engl J Med 379:1711-1721 (2018); Zhao et al., CD47-signal regulatory protein-alpha (SIRPalpha) interactions form a barrier for antibody-mediated tumor cell destruction. Proc Natl Acad Sci U S A 108:18342-18347 (2011)). 루툭시맙과 조합하여, Hu5F9-G4, 인간화된, IgG4 아이소타입, CD47-차단 mAb로 치료된 재발성 또는 불응성 미만성 거대 B-세포 림프종 또는 여포성 림프종 환자의 적어도 50%가 객관적인 반응을 나타낸다(Advani et al., CD47 Blockade by Hu5F9-G4 and rituximab in non-Hodgkin's lymphoma. N Engl J Med 379:1711-1721 (2018)). CD47 차단은 면역-무시 종양에서 항원 제시를 향상시킬 뿐만 아니라(Tseng et al., Anti-CD47 antibody-mediated phagocytosis of cancer by macrophages primes an effective antitumor T-cell response. Proc Natl Acad Sci U S A 110:11103-11108 (2013)), CD47/SIRPα 차단 치료제를 단일 요법으로 사용하거나 PD-1/L1-차단 항체와 조합하여 사용하는 경우 산발적인 임상 반응이 관찰되었다.
SIRPα에 대한 CD47의 결합을 방해하는 것은 표적 항체의 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 강화함으로써 진행성 암에 대한 유망한 면역치료 전략으로 부상하였다. 전임상에서, CD47/SIRPα 차단은 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 증가시키고 수지상 세포에 의한 CD8+ T 세포에 대한 종양 항원의 교차 제시를 강화함으로써 항종양 활성을 유도하며; 이러한 두 프로세스는 모두 CD40 신호에 의해 강화된다. 여기에서 SIRPα-Fc-CD40L이라고 지칭되는 중심 Fc 도메인이 인접한 SIRPα 및 CD40L의 세포외 도메인을 혼입한 신규한 양면 융합 단백질이 생성되었다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 Fc 수용체 가교의 부재 하에서 높은 친화도로 CD47 및 CD40에 결합하였고, CD40 신호전달을 활성화하였다. 시험관내 또는 시노몰거스 마카크에서 용혈, 혈구응집 또는 혈소판 감소증의 어떠한 증거도 관찰되지 않았다. 추가로, 본 명세서에 나타낸 바와 같이, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 뮤린 CT26 종양 모델에서 CD47 차단 및 CD40 효능제 항체를 능가하고 PD-1 및 CTLA4의 면역 관문 차단과 상승작용하였다. SIRPα-Fc-CD40L은 대식세포에서 타입 I 인터페론 반응을 활성화하고 시험관내 및 생체내 둘 다에서 ADCP-적격 표적 항체의 활성을 강화하였다. 이러한 데이터는, CD47/SIRPα 저해가 종양 세포의 식세포작용을 강화할 수 있는 반면, 타입 I 인터페론 반응의 CD40-매개 활성화가 대식세포-매개 면역과 T 세포-매개 면역 사이의 가교 역할을 하여 지속적인 종양 제어 및 거부를 크게 향상시킨다는 것을 나타내었다.
본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 CD40L의 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 CD40L의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인에 - 직접 또는 링커를 통해 - 연결된 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인을 포함한다. 도 1C 및 도 1D에 도시된 바와 같이, 도메인이 아미노-말단 대 카복시-말단 배향으로 연결될 때, 제1 도메인은 키메라 단백질의 "좌측" 측면에 위치하며 "외부로 향하고" 제2 도메인은 키메라 단백질의 "우측" 측면에 위치하며 "외부로 향한다"
제1 도메인 및 제2 도메인의 다른 구성이 예상되는데, 예를 들어, 제1 도메인은 외부로 향하고 제2 도메인은 내부로 향하고, 제1 도메인은 내부로 향하고 제2 도메인은 외부로 향하고, 제1 및 제2 도메인은 모두 내부로 향한다. 두 도메인이 모두 "내부로 향하는" 경우, 키메라 단백질은 CD40L의 세포외 도메인, 링커 및 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인을 포함하는 아미노-말단 대 카복시-말단 구성을 가질 것이다. 이러한 구성에서, 키메라 단백질의 수용체/리간드 중 하나 또는 둘 다에 대한 키메라 단백질의 도메인이 결합을 허용하기 위해, 키메라 단백질은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 여분의 "슬랙(slack)"을 포함하는 것이 필요할 수 있다.
작제물은 3개의 단편(CD172a (SIRPα)의 세포외 도메인, 그 다음 링커 서열, 그 다음 CD40L의 세포외 도메인)을 벡터(플라스미드, 바이러스 또는 다른 것) 내에 클로닝함으로써 생산될 수 있는데, 여기서 완결된 서열의 아미노 말단은 CD172a (SIRPα)의 세포외 도메인을 함유하는 분자의 '좌'측에 상응하고, 완결된 서열의 카복시 말단은 CD40L의 세포외 도메인을 함유하는 분자의 '우'측에 상응하였다. 다른 구성 중 하나를 갖는 키메라 단백질의 일부 실시형태에서, 상기에 기재된 바와 같이, 작제물은 생성된 번역된 키메라 단백질이 목적하는 구성, 예를 들어, 이중 내향 키메라 단백질을 갖도록 3개의 핵산을 포함할 것이다. 따라서, 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 이와 같이 조작된다.
CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질
실시형태에서, 키메라 단백질은 인간 CD172a(SIRPα) 리간드 및 인간 CD40 수용체에 동시에 결합할 수 있되, CD172a(SIRPα) 리간드는 CD47이고, CD40L 수용체는 CD40이다.
키메라 단백질은 하기 일반 구조식을 갖는다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 실시형태에서, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다.
본 개시내용의 키메라 단백질은 이의 리간드/수용체에 입체적으로 결합할 수 있는 제1 도메인 및/또는 이의 리간드/수용체에 입체적으로 결합할 수 있는 제2 도메인을 갖는다. 이것은, 세포외 도메인의 리간드/수용체 결합 도메인이 이의 리간드 /수용체에 대한 결합에 입체적으로 방해되지 않도록 키메라 단백질에 충분한 전체 유연성 및/또는 키메라 단백질의 세포외 도메인(또는 이의 일부)과 나머지 사이의 물리적 거리가 존재함을 의미한다. 이러한 가요성 및/또는 물리적 거리(이것은 본 명세서에서 "슬랙"이라고 지칭됨)가 세포외 도메인(들)에 일반적으로 존재할 수 있고/있거나, 링커에 일반적으로 존재할 수 있고/있거나, 키메라 단백질(전체로서)에 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 키메라 단백질은 하나 이상의 추가 아미노산 서열(예를 들어, 하기 기재된 결합 링커) 또는 합성 링커(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커)를 포함함으로써 변형될 수 있으며, 이는 입체 장애를 회피하는데 필요한 추가 슬랙을 제공한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인의 변이체를 포함한다. 예로서, 변이체는 CD172a(SIRPα), 예를 들어, 인간 CD172a(SIRPα)의 알려진 아미노산 서열과 적어도 약 60% 또는 적어도 약 61% 또는 적어도 약 62% 또는 적어도 약 63% 또는 적어도 약 64% 또는 적어도 약 65% 또는 적어도 약 66% 또는 적어도 약 67% 또는 적어도 약 68% 또는 적어도 약 69% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 71% 또는 적어도 약 72% 또는 적어도 약 73% 또는 적어도 약 74% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 76% 또는 적어도 약 77% 또는 적어도 약 78% 또는 적어도 약 79% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 81% 또는 적어도 약 82% 또는 적어도 약 83% 또는 적어도 약 84% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 86% 또는 적어도 약 87% 또는 적어도 약 88% 또는 적어도 약 89% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 91% 또는 적어도 약 92% 또는 적어도 약 93% 또는 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
실시형태에서, CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인은 다음 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00001
실시형태에서, 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인의 변이체를 포함한다. 예로서, 변이체는 서열번호 57과 적어도 약 60% 또는 적어도 약 61% 또는 적어도 약 62% 또는 적어도 약 63% 또는 적어도 약 64% 또는 적어도 약 65% 또는 적어도 약 66% 또는 적어도 약 67% 또는 적어도 약 68% 또는 적어도 약 69% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 71% 또는 적어도 약 72% 또는 적어도 약 73% 또는 적어도 약 74% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 76% 또는 적어도 약 77% 또는 적어도 약 78% 또는 적어도 약 79% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 81% 또는 적어도 약 82% 또는 적어도 약 83% 또는 적어도 약 84% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 86% 또는 적어도 약 87% 또는 적어도 약 88% 또는 적어도 약 89% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 91% 또는 적어도 약 92% 또는 적어도 약 93% 또는 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
당업자는 문헌, 예를 들어, 각각의 전문이 참조에 의해서 포함된 문헌[Hatherley et al., "Paired receptor specificity explained by structures of signal regulatory proteins alone and complexed with CD47." Mol Cell 31: 266-277 (2008); Hatherley et al., "The Structure of the Macrophage Signal Regulatory Protein Alpha (Sirpalpha) Inhibitory Receptor Reveals a Binding Face Reminiscent of that Used by T Cell Receptors." J Biol Chem 282: 14567 (2007); Hatherley et al., "Structure of Signal-Regulatory Protein Alpha: A Link to Antigen Receptor Evolution." J Biol Chem 284: 26613 (2009); Hatherley et al., "Polymorphisms in the Human Inhibitory Signal-Regulatory Protein Alpha Do not Affect Binding to its Ligand Cd47." J Biol Chem 289: 10024 (2014); Ring et al., "Anti-SIRP alpha antibody immunotherapy enhances neutrophil and macrophage antitumor activity." Proc Natl Acad Sci U S A 114: E10578-E10585 (2017)]을 검토함으로써 CD172a(SIRPα)의 알려진 아미노산 서열의 변이체를 선택할 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 CD40L의 세포외 도메인의 변이체를 포함한다. 예로서, 변이체는 CD40L, 예를 들어, 인간 CD40L의 알려진 아미노산 서열과 적어도 약 60% 또는 적어도 약 61% 또는 적어도 약 62% 또는 적어도 약 63% 또는 적어도 약 64% 또는 적어도 약 65% 또는 적어도 약 66% 또는 적어도 약 67% 또는 적어도 약 68% 또는 적어도 약 69% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 71% 또는 적어도 약 72% 또는 적어도 약 73% 또는 적어도 약 74% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 76% 또는 적어도 약 77% 또는 적어도 약 78% 또는 적어도 약 79% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 81% 또는 적어도 약 82% 또는 적어도 약 83% 또는 적어도 약 84% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 86% 또는 적어도 약 87% 또는 적어도 약 88% 또는 적어도 약 89% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 91% 또는 적어도 약 92% 또는 적어도 약 93% 또는 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
실시형태에서, CD40L의 세포외 도메인은 다음 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00002
실시형태에서, 키메라 단백질은 CD40L의 세포외 도메인의 변이체를 포함한다. 예로서, 변이체는 서열번호 58과 적어도 약 60% 또는 적어도 약 61% 또는 적어도 약 62% 또는 적어도 약 63% 또는 적어도 약 64% 또는 적어도 약 65% 또는 적어도 약 66% 또는 적어도 약 67% 또는 적어도 약 68% 또는 적어도 약 69% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 71% 또는 적어도 약 72% 또는 적어도 약 73% 또는 적어도 약 74% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 76% 또는 적어도 약 77% 또는 적어도 약 78% 또는 적어도 약 79% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 81% 또는 적어도 약 82% 또는 적어도 약 83% 또는 적어도 약 84% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 86% 또는 적어도 약 87% 또는 적어도 약 88% 또는 적어도 약 89% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 91% 또는 적어도 약 92% 또는 적어도 약 93% 또는 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
당업자는 문헌, 예를 들어, 각각의 전문이 참조에 의해서 포함된 문헌[Karpusas et al., "2 A crystal structure of an extracellular fragment of human CD40 ligand." Structure 3: 1031-1039 (1995); Karpusas et al., "Structure of CD40 ligand in complex with the Fab fragment of a neutralizing humanized antibody." Structure 9: 321-329 (2001); Silvian et al., "Small Molecule Inhibition of the TNF Family Cytokine CD40 Ligand through a Subunit Fracture Mechanism." ACS Chem Biol 6: 636-647 (2011); An et al., "Crystallographic and mutational analysis of the CD40-CD154 complex and its implications for receptor activation." J Biol Chem 286: 11226-11235 (2011); Karnell et al., "A CD40L-targeting protein reduces autoantibodies and improves disease activity in patients with autoimmunity." Sci Transl Med 11 (2019)]을 검토함으로써 CD40L의 알려진 아미노산 서열의 변이체를 선택할 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질의 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 57과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 도메인, (b) 서열번호 58과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 도메인, 및 (c) 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 링커.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 57과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 도메인, (b) 서열번호 58과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 도메인, 및 (c) 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 링커. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 57과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 도메인, (b) 서열번호 58과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 도메인, 및 (c) 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 링커. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 57과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 도메인, (b) 서열번호 58과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 도메인, 및 (c) 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 링커. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 57과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 도메인, (b) 서열번호 58과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 도메인, 및 (c) 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 링커. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 제1 도메인, (b) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 제2 도메인, 및 (c) 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 링커. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 57과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 도메인, (b) 서열번호 58과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 도메인, 및 (c) 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 링커.
실시형태에서, 본 개시내용의 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 다음 아미노산 서열을 갖는다(CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인은 볼드체로 표시하고, CD40L의 세포외 도메인은 밑줄로 표시하고, Fc 도메인은 이탤릭체로 표시한다:
Figure pct00003
CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(SL-172154)의 792 아미노산 서열(리더 서열 포함하지 않음)을 상기에 나타낸다. CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 올리고머 형태의 프로파일로 존재한다. 8개의 가능한 이황화물 쌍과 함께 아미노산 서열에 17개의 시스테인이 존재한다. N 및 O-연결된 글리코실화가 확인되었다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 가능한 N 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 2개의 가능한 N 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 4개의 가능한 N 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 6개의 가능한 N 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 8개의 가능한 N 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 10개의 가능한 N 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 2개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 4개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 6개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 8개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 2개의 가능한 N 글리코실화 부위 및 적어도 2개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 4개의 가능한 N 글리코실화 부위 및 적어도 4개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 6개의 가능한 N 글리코실화 부위 및 적어도 6개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 8개의 가능한 N 글리코실화 부위 및 적어도 8개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 적어도 10개의 가능한 N 글리코실화 부위 및 적어도 8개의 가능한 O 글리코실화 부위를 포함한다. 실시형태에서, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현된 키메라 단백질이 글리코실화된다.
SL-172154 키메라 단백질에는 17개의 시스테인이 존재한다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 이황화 결합을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 적어도 하나 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개의 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 적어도 하나 또는 적어도 2개의 쇄내 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 적어도 하나 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 8개의 쇄내 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C350=C350 쇄내 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C353=C353 쇄내 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C153=C153 쇄내 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C25 = C91 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C140 = C198 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C243 = C301 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C385 = C445 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C491 = C549 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C603 = C615 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C709 = C725 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C140 = C243 = C709/C725 스크램블드(scrambled) 이황화 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, SL-172154 키메라 단백질은 C615(쇄1) = C615(쇄2) 스크램블드 이황화 결합을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 다음 뉴클레오타이드 서열(리더 서열은 볼드체 및 밑줄로 표시함)에 의해서 암호화된다:
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 실시형태에서, 서열번호 60은 다음 아미노산 서열(리더 서열은 이탤릭체로 표시함)을 갖는 본 개시내용의 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질의 전구체를 암호화한다:
Figure pct00006
서열번호 59의 키메라 단백질(본 명세서에서 SL-172154라고도 함)은 인간 CD172a(SIRPα)(PDCD1, CD272a)의 세포외 도메인, 인간 면역글로불린 불변 감마 4(저해 수용체 SHPS-1, IgG4)로부터의 힌지-CH2-CH3 영역을 포함하는 중심 도메인 및 인간 CD40L(TNFSF5, TRAP, CD154)의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 융합 당단백질이다. SL-172154의 선형 구성은 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L이다. RaptorX에 의해서 예측된 이론에 얽매이지 않은 SL-172154의 3차 구조를 도 3A에 도시한다.
서열번호 59의 단량체 키메라 단백질에 대한 예측된 분자량은 88.1kDa이다. 서열번호 59의 글리코시화된 단량체 키메라 단백질에 대한 예측된 분자량은 약 115 kDa이다.
본 명세서에 개시된 키메라 단백질, 예컨대, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)의 양면 특성은 종양 미세환경(TME) 내의 주요 면역억제 경로 중 하나인 CD172a(SIRPα) - CD47 대식세포 면역관문을 차단하도록 설계된다.
종양 세포는 세포 표면 상에 CD47을 발현할 수 있으며, 이는 대식세포에 의해서 발현되는 CD172a(SIRPα)에 결합하여 종양 세포의 식세포 작용을 억제할 수 있다. 따라서, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)은, CD47의 경쟁적 저해를 제공하고 CD47 저해 신호를 기능적으로 삼량체화/육량체화된 CD40L로 대체하여, 들어오는 T 세포가 CD172a (SIRPα) 상호작용을 통한 억제 대신 이의 CD40 수용체를 통한 결속을 통해 공동-자극을 경험하게 하도록 의도된 본 명세서에 개시된 CD172a (SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질의 CD172a(SIRPα) 도메인과 함께, 종양의 표면 상에서 발현된 CD47에 결합할 수 있다. 즉, CD172a(SIRPα) 및 CD40L의 세포외 도메인(ECD)이 서로 물리적으로 연결되어 있고 TME에 국재화되어 있기 때문에, 종양 침윤 T 세포는 그들이 T 세포 수용체(TCR)를 통해 종양 항원을 인식함과 동시에 공동-자극을 제공받을 것이다. 중요하게는, CD172a(SIRPα) 및 CD40L의 ECD이 서로 물리적으로 연결되어 있고 TME에 국재화되어 있기 때문에, 종양 침윤 T 세포는 그들이 T 세포 수용체를 통해 종양 항원을 인식함과 동시에 공동자극을 제공받을 것이다. 함께, 이들은 저해 CD47 신호를 공동-자극 CD40L 신호로 대체하여 T 세포의 항종양 활성을 향상시킬 것이다.
CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)을 포함하는 본 명세서에 개시된 키메라 단백질의 3개의 구성 성분은 이량체화 또는 올리고머화를 촉진하는 고유한 속성을 갖는다. CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인은 일반적으로 단량체로 존재하며 고차 호모머(homomeric) 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있지 않다. 중심 Fc 도메인은 이황화 결합이 가능한 시스테인 잔기를 함유하여 이량체 구조를 형성한다. 실시형태에서, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)을 비롯한 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 Fab 아암 교환을 예방하기 위해서 Fc 도메인의 힌지 영역에 S228P 돌연변이를 함유한다. CD40L 도메인은 동종삼량체 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있으며, 이는 비공유, 정전기적 상호작용을 통해 안정화된다. CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)을 비롯한 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 생산 세포주에 의해 연속적인 단량체 단백질로 발현되지만, 생성된 단량체 단백질은 CD40L의 이러한 이황화물 및 전하-기반 상호작용(삼량체 생성) 및 이러한 인력의 조합된 영향을 기반으로 고차 종으로 자가 조립하여 육량체(삼량체의 이량체)를 생성한다. CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)의 대부분(>80%)은 유사한 활성을 갖는 육량체 및 삼량체 형태를 포함한다. 중요한 것은, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)이 육량체와 삼량체로 구성되기 때문에, 이들이 Fc 수용체 또는 임의의 다른 가교제에 의한 가교 없이 CD40 신호 전달을 자극한다는 것이다. 단량체로서 또는 이황화물(Fc) 및 전하-기반 상호작용에 기초한 다양한 올리고머 상태의 CD172a (SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)의 예측된 3차 구조(CD40L)가 도 3A에 도시되어 있다. 도 3B는 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61), 육량체(하단 2개의 영상) 및 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61) 삼량체(하단 2개의 영상)의 전자 현미경에 의한 시각화를 나타낸다. 따라서 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)은 삼량체/육량체를 형성하고 가교 필요 없이 CD40을 활성화한다. 단클론성 항체와 달리, Fc 수용체 가교는 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)의 기능적 활성에 필요하지 않다는 점이 주목할 만하다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)의 변이체를 포함한다. 예로서, 변이체는 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 60% 또는 적어도 약 61% 또는 적어도 약 62% 또는 적어도 약 63% 또는 적어도 약 64% 또는 적어도 약 65% 또는 적어도 약 66% 또는 적어도 약 67% 또는 적어도 약 68% 또는 적어도 약 69% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 71% 또는 적어도 약 72% 또는 적어도 약 73% 또는 적어도 약 74% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 76% 또는 적어도 약 77% 또는 적어도 약 78% 또는 적어도 약 79% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 81% 또는 적어도 약 82% 또는 적어도 약 83% 또는 적어도 약 84% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 86% 또는 적어도 약 87% 또는 적어도 약 88% 또는 적어도 약 89% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 91% 또는 적어도 약 92% 또는 적어도 약 93% 또는 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 또는 적어도 약 99.2% 또는 적어도 약 99.4% 또는 적어도 약 99.6% 또는 적어도 약 99.8%의 서열 동일성을 갖질 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 제1 도메인은 CD172a(SIRPα) 리간드에 결합할 수 있다.
실시형태에서, 제1 도메인은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함한다.
실시형태에서, 제2 도메인은 CD40 수용체에 결합할 수 있다.
실시형태에서, 제2 도메인은 CD40L의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함한다.
실시형태에서, 링커는 IgG4, 예를 들어, 인간 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, (a) 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하고, (b) 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하고, (c) 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 5 및/또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 5 및/또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 5 및/또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 5 및/또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 95% 동일한, 예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 98% 동일한, 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99% 동일한, 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.2% 동일한, 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.4% 동일한, 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.6% 동일한 또는 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.8% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 개시된 임의의 양상 및 실시형태에서, 키메라 단백질은 본 명세서에 개시된 단백질 서열 중 임의의 것에 비해서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 및 절두로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
실시형태에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이며, 보존적 및/또는 비보존적 치환을 포함할 수 있다. "보존적 치환"은 예를 들어, 포함된 아미노산 잔기의 극성, 전하, 크기, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 본성의 유사성을 기초로 수행될 수 있다. 20종의 자연 발생 아미노산은 하기 6종의 표준 아미노산 군으로 분류될 수 있다: (1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "보존적 치환"은 아미노산을, 상기에 나타낸 6종의 표준 아미노산 군 중 동일한 군에 열거된 또 다른 아미노산에 의해서 교환시키는 것으로서 정의된다. 예를 들어, Asp의 Glu에 의한 교환은 이렇게 변형된 폴리펩타이드에서 하나의 음전하를 보유한다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 파괴하는 이들의 능력을 기초로 또 다른 것에 대해서 치환될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비-보존적 치환"은 아미노산을, 상기에 나타낸 6종의 표준 아미노산 군 (1) 내지 (6) 중 상이한 군에 열거된 또 다른 아미노산에 의해서 교환시키는 것으로서 정의된다.
실시형태에서, 치환은 또한 비고전적 아미노산(예를 들어, 일반적으로 셀레노시스테인, 피로라이신, N-폼일메티오닌 β-알라닌, GABA 및 δ-아미노레불린산, 4-아미노벤조산(PABA), 일반적인 아미노산의 D-이성질체, 2,4-다이아미노부티르산, α-아미노 아이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 아이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코슴(sarcosme), 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너(designer) 아미노산, 예컨대, β 메틸 아미노산, C α-메틸 아미노산, N α-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체)을 포함할 수 있다.
코돈 축퇴를 고려하는 것을 포함하는, 유전자 암호를 참고하여 키메라 단백질의 뉴클레오타이드 서열에 대해서 돌연변이가 또한 행해질 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 인간 리간드(들)/수용체(들)에 결합할 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질의 각각의 세포외 도메인(또는 이의 변이체)은 약 1nM 내지 약 5nM, 예를 들어, 약 1nM, 약 1.5nM, 약 2nM, 약 2.5nM, 약 3nM, 약 3.5nM, 약 4nM, 약 4.5nM, 또는 약 5nM의 KD로 이의 동족 수용체 또는 리간드에 결합한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 5nM 내지 약 15nM, 예를 들어, 약 5nM, 약 5.5nM, 약 6nM, 약 6.5nM, 약 7nM, 약 7.5nM, 약 8nM, 약 8.5nM, 약 9nM, 약 9.5nM, 약 10nM, 약 10.5nM, 약 11nM, 약 11.5nM, 약 12nM, 약 12.5nM, 약 13nM, 약 13.5nM, 약 14nM, 약 14.5nM 또는 약 15nM의 KD로 동족 수용체 또는 리간드에 결합한다.
실시형태에서, 키메라 단백질의 각각의 세포외 도메인(또는 이의 변이체)은 약 1μM, 약 900nM, 약 800nM, 약 700nM, 약 600nM, 약 500nM, 약 400nM, 약 300nM, 약 200nM, 약 150nM, 약 130nM, 약 100nM, 약 90nM, 약 80nM, 약 70nM, 약 60nM, 약 55nM, 약 50nM, 약 45nM, 약 40nM, 약 35nM, 약 30nM, 약 25nM, 약 20nM, 약 15nM, 약 10nM, 또는 약 5nM, 또는 약 1nM 미만(예를 들어, 표면 플라스몬 공명 또는 생물층 간섭계법에 의해서 측정되는 경우)의 KD로 이의 동족 수용체 또는 리간드에 결합한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 약 1nM 내지 약 5nM, 예를 들어, 약 1nM, 약 1.5nM, 약 2nM, 약 2.5nM, 약 3nM, 약 3.5nM, 약 4nM, 약 4.5nM, 또는 약 5nM의 KD로 인간 CD47에 결합한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 3nM, 약 2nM, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM 약 55pM 약 50pM 약 45pM, 약 40pM, 약 35pM, 약 30pM, 약 25pM, 약 20pM, 약 15pM, 또는 약 10pM, 또는 약 1pM 미만(예를 들어, 표면 플라스몬 공명 또는 생물층 간섭계법에 의해서 측정되는 경우)의 KD로 인간 CD47에 결합한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM 약 55pM 약 50pM 약 45pM, 약 40pM, 약 35pM, 약 30pM, 약 25pM, 약 20pM, 약 15pM 또는 약 10pM, 또는 약 1pM 미만(예를 들어, 표면 플라스몬 공명 또는 생물층 간섭계법에 의해서 측정되는 경우)의 KD로 인간 CD40에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 세포외 도메인의 변이체는 천연 세포외 도메이의 수용체/리간드에 결합할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 수용체/리간드에 대한 결합 친화도에 영향을 미치지 않는 세포외 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있거나; 대안적으로, 세포외 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이는 수용체/리간드에 대한 결합 친화도를 개선시킬 수 있거나; 세포외 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이는 수용체/리간드에 대한 결합 친화도를 감소시킬 수 있지만, 결합을 완전히 제거하지는 않는다. 실시형태에서, 하나 이상의 돌연변이는 세포외 도메인이 이의 수용체/리간드와 상호작용하는 결합 포켓 외부에 위치한다. 실시형태에서, 돌연변이가 결합을 완전히 제거하지 않는 한, 하나 이상의 돌연변이가 세포외 도메인이 이의 수용체/리간드와 상호작용하는 결합 포켓 내부에 위치한다. 수용체-리간드 결합에 관한 당업계의 지식 및 당업자의 지식에 기초하여, 그들은 어느 돌연변이가 결합을 허용하고 어느 돌연변이가 결합을 제거할 것인지를 알고 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 향상된 안정성 및 단백질 반감기를 나타낸다.
본 개시내용의 키메라 단백질은 2개 초과의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질은 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 제2 세포외 도메인은 본 명세서에 개시된 바와 같이 링커를 통해서 제3 세포외 도메인으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 제2 세포외 도메인은 (예를 들어, 펩타이드 결합을 통해서) 제3 세포외 도메인에 직접 연결될 수 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 본 명세서에 개시된 바와 같이 링커를 통해서 간접적으로 연결된 세포외 도메인 및 직접적으로 연결된 세포외 도메인을 포함한다.
링커
실시형태에서, 키메라 단백질은 링커를 포함한다.
실시형태에서, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 적어도 하나의 시스테인 잔기는 한 쌍(또는 그 초과)의 키메라 단백질 사이에 이황화 결합을 형성할 수 있다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 이러한 이황화 결합 형성은 키메라 단백질의 유용한 다량체 상태를 유지를 담당한다. 이것은 키메라 단백질의 효율적은 생산을 허용하고; 시험관내 및 생체내에서 목적하는 활성을 허용한다.
본 개시내용의 키메라 단백질에서, 링커는 가요성 아미노산 서열, IgG 힌지 영역 또는 항체 서열로부터 선택된 폴리펩타이드이다.
실시형태에서, 링커는 자연 발생 멀티-도메인 단백질로부터 유래되거나 또는 예를 들어, 전문이 참고로 포함된 문헌[Chichili et al., Protein Sci. 22(2):153-167 (2013); Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369 (2013)]에 기재된 바와 같은 경험적 링커이다. 실시형태에서, 링커는 링커 설계 데이터베이스 및 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 전문이 참고로 포함된 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369 (2013); 및 Crasto et al., Protein Eng. 13(5):309-312 (2000)]에 기재된 것을 사용하여 설계될 수 있다.
실시형태에서, 링커는 폴리펩타이드를 포함한다. 실시형태에서, 폴리펩타이드는 약 500개 미만의 아미노산 길이, 약 450개 미만의 아미노산 길이, 약 400개 미만의 아미노산 길이, 약 350개 미만의 아미노산 길이, 약 300개 미만의 아미노산 길이, 약 250개 미만의 아미노산 길이, 약 200개 미만의 아미노산 길이, 약 150개 미만의 아미노산 길이 또는 약 100개 미만의 아미노산 길이이다. 예를 들어, 링커는 약 100개, 약 95개, 약 90개, 약 85개, 약 80개, 약 75개, 약 70개, 약 65개, 약 60개, 약 55개, 약 50개, 약 45개, 약 40개, 약 35개, 약 30개, 약 25개, 약 20개, 약 19개, 약 18개, 약 17개, 약 16개, 약 15개, 약 14개, 약 13개, 약 12개, 약 11개, 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개, 약 5개, 약 4개, 약 3개 또는 약 2개 미만의 아미노산 길이일 수 있다.
실시형태에서, 링커는 가요성이다.
실시형태에서, 링커는 강성이다.
실시형태에서, 링커는 글리신 및 세린 잔기(예를 들어, 약 30% 또는 약 40% 또는 약 50% 또는 약 60% 또는 약 70% 또는 약 80% 또는 약 90% 또는 약 95% 또는 약 97% 또는 약 98% 또는 약 99% 또는 약 100%의 글리신 및 세린)로 실질적으로 구성된다.
실시형태에서, 링커는 항체의(예를 들어, 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 및 IgA1 및 IgA2)를 포함하는, IgG, IgA, IgD, 및 IgE의) 힌지 영역을 포함한다. IgG, IgA, IgD, 및 IgE 부류 항체에서 발견된 힌지 영역은 가요성 스페이서로서 작용하여, Fab 부분이 공간에서 자유롭게 이동하는 것을 가능하게 한다. 불변 영역과 대조적으로, 힌지 도메인은 구조적으로 다양하며, 면역글로불린 부류 및 하위부류 사이에서 서열 및 길이 둘 모두가 다양하다. 예를 들어, 힌지 영역의 길이 및 가요성은 IgG 하위부류 중에서 다양하다. IgG1의 힌지 영역은 아미노산 216 내지 231을 포함하며, 그것은 자유롭게 가요성이기 때문에, Fab 단편은 이의 대칭축에 대해서 회전하여 2개의 중쇄내 이황화 브리지 중 첫 번째 것에 중심이 있는 구체 내에서 이동할 수 있다. IgG2는 IgG1보다 더 짧은 힌지를 갖고, 12개의 아미노산 잔기 및 4개의 이황화 브리지를 갖는다. IgG2의 힌지 영역은 글리신 잔기가 결핍되어 있고, 비교적 짧으며, 추가의 중쇄내 이황화 브리지에 의해서 안정화된 강성 폴리-프롤린 이중 나선을 함유한다. 이러한 특성은 IgG2 분자의 가요성을 제한한다. IgG3은, 62개의 아미노산(21개의 프롤린 및 11개의 시스테인을 포함함)을 함유하고, 비가요성 폴리-프롤린 이중 나선을 형성하는, 이의 고유한 연장된 힌지 영역(IgG1 힌지의 약 4배 길이임)이 다른 하위부류와 상이하다. IgG3에서, Fab 단편은 Fc 단편으로부터 비교적 멀리 존재하여, 분자에 더 큰 가요성을 제공한다. IgG3 내의 연장된 힌지는 또한 다른 하위부류와 비교할 때 이의 더 높은 분자량에 대해서 책임이 있다. IgG4의 힌지 영역은 IgG1의 힌지 영역보다 더 짧고, 이의 가요성은 IgG1의 힌지 영역과 IgG2의 힌지 영역의 중간이다. 힌지 영역의 가요성은 보고된 바에 따르면 IgG3>IgG1>IgG4>IgG2의 순서로 감소된다. 실시형태에서, 링커는 인간 IgG4로부터 유래되고, 하나 이상의 돌연변이를 함유하여 이량체화(S228P를 포함함) 또는 FcRn 결합을 향상시킬 수 있다.
결정학 연구에 따르면, 면역글로불린 힌지 영역은 3개의 영역: 상부 힌지 영역, 코어 영역, 및 하부 힌지 영역으로 추가로 기능적으로 나뉠 수 있다(문헌[Shin et al., Immunological Reviews 130:87 (1992)] 참고). 상부 힌지 영역은 CH1의 카복실 단부에서부터 운동을 제한하는 힌지 내의 제1 잔기, 일반적으로는 2개의 중쇄 사이에서 쇄내 이황화 결합을 형성하는 제1 시스테인 잔기까지의 아미노산을 포함한다. 상부 힌지 영역의 길이는 항체의 분절 가요성과 상관관계가 있다. 코어 힌지 영역은 중쇄내 이황화 브리지를 함유하고, 하부 힌지 영역은 CH2 도메인의 아미노 말단 단부에 결합되고, CH2 내의 잔기를 포함한다. 상기와 동일하게, 야생형 인간 IgG1의 코어 힌지 영역은 서열 CPPC(서열번호 24)을 함유하고, 이것은 이황화 결합 형성에 의해서 이량체화되는 경우, 중심점으로서 작용한다고 여겨지는 환식 옥타펩타이드를 생성하여, 가요성을 부여한다. 실시형태에서, 본 발명의 링커는 임의의 항체의(예를 들어, 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 및 IgA1 및 IgA2)를 포함하는, IgG, IgA, IgD, 및 IgE의) 상부 힌지 영역, 코어 영역, 및 하부 힌지 영역 중 1개, 2개 또는 3개를 포함한다. 힌지 영역은 또한 하나 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있는데, 이것은 탄수화물 부착을 위해서 다수의 구조적으로 구별되는 유형의 부위를 포함한다. 예를 들어, IgA1은 힌지 영역의 17-아미노산 분절 내에 5개의 글리코실화 부위를 함유하여, 분비성 면역글로불린에 대해서 이로운 특성인 것으로 간주되는, 장 프로테아제에 대한 힌지 영역 폴리펩타이드의 내성을 부여한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 링커는 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함한다.
실시형태에서, 링커는 항체의(예를 들어, 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 및 IgA1 및 IgA2)를 포함하는, IgG, IgA, IgD, 및 IgE의) Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 키메라 단백질에서, 링커는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 인간 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1내지 서열번호 3 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 결합 링커를 포함하고, 상기 결합 링커는 서열번호 4 내지 50(또는 이의 변이체)으로부터 독립적으로 선택된다. 링커는 2개 이상의 결합 링커를 포함하고, 각각의 결합 링커는 서열번호 4 내지 50(또는 이의 변이체)으로부터 독립적으로 선택되고; 하나의 결합 링커는 상기 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해서 N 말단이고, 그리고 또 다른 결합 링커는 상기 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인에 대해서 C 말단이다.
실시형태에서, 링커는 인간 IgG1 항체로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, Fc 도메인은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 증가된 친화도 및 향상된 결합을 나타낸다. 실시형태에서, Fc 도메인은 FcRn에 대한 친화도를 증가시키고, 이에 대한 결합을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, FcRn에 대한 증가된 친화도 및 향상된 결합은 본 발명의 키메라 단백질의 생체내 반감기를 증가시킨다고 여겨진다.
실시형태에서, 링커에서 Fc 도메인은 아미노산 잔기 250, 252, 254, 256, 308, 309, 311, 416, 428, 433 또는 434(본 명세서에 명확하게 참고로 포함된 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 카밧 넘버링에 따름)에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 이의 등가물을 함유한다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 250에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 252에서의 아미노산 치환은 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 트레오닌으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 254에서의 아미노산 치환은 트레오닌으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 256에서의 아미노산 치환은 세린, 아르기닌, 글루타민, 글루탐산, 아스파트산 또는 트레오닌으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 308에서의 아미노산 치환은 트레오닌으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 309에서의 아미노산 치환은 프롤린으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 311에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 385에서의 아미노산 치환은 아르기닌, 아스파트산, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 글리신으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 386에서의 아미노산 치환은 트레오닌, 프롤린, 아스파트산, 세린, 라이신, 아르기닌, 아이소류신 또는 메티오닌으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 387에서의 아미노산 치환은 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌 또는 알라닌으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 389에서의 아미노산 치환은 프롤린, 세린 또는 아스파라긴으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 416에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 428에서의 아미노산 치환은 류신으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 433에서의 아미노산 치환은 아르기닌, 세린, 아이소류신, 프롤린 또는 글루타민으로의 치환이다. 실시형태에서, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 히스티딘, 페닐알라닌 또는 타이로신으로의 치환이다.
실시형태에서, Fc 도메인 링커(예를 들어, IgG 불변 영역을 포함함)는 아미노산 잔기 252, 254, 256, 433, 434, 또는 436(본 명세서에 명확하게 참고로 포함된 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 카밧 넘버링을 따름)에서, 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, 치환을 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 삼중 M252Y/S254T/T256E 돌연변이 또는 YTE 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 삼중 H433K/N434F/Y436H 돌연변이 또는 KFH 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 YTE 및 KFH 돌연변이를 조합하여 포함한다.
실시형태에서, 링커는 아미노산 잔기 250, 253, 307, 310, 380, 428, 433, 434 및 435(본 명세서에 명확하게 참고로 포함된 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 카밧 넘버링을 따름)에서 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 IgG 불변 영역을 포함한다. 예시적인 돌연변이는 T250Q, M428L, T307A, E380A, I253A, H310A, M428L, H433K, N434A, N434F, N434S 및 H435A를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 M428L/N434S 돌연변이 또는 LS 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 T250Q/M428L 돌연변이 또는 QL 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 N434A 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 T307A/E380A/N434A 돌연변이 또는 AAA 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 I253A/H310A/H435A 돌연변이 또는 IHH 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 H433K/N434F 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, IgG 불변 영역은 M252Y/S254T/T256E 및 H433K/N434F 돌연변이를 조합하여 포함한다.
IgG 불변 영역에서의 추가로 예시적인 돌연변이는 예를 들어, 전문이 참고로 포함된 문헌[Robbie, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 57(12):6147-6153 (2013); Dall'Acqua et al., Journal Biol Chem 281(33):23514-24 (2006); Dall'Acqua et al., Journal of Immunology 169:5171-80 (2002); Ko et al. Nature 514:642-645 (2014); Grevys et al. Journal of Immunology 194(11):5497-508 (2015)] 및 미국 특허 제7,083,784호에 기술되어 있다.
예시적인 Fc 안정화 돌연변이체는 S228P이다. 예시적인 Fc 반감기 연장 돌연변이체는 T250Q, M428L, V308T, L309P, 및 Q311S이며, 본 발명의 링커는 이러한 돌연변이체 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 높은 친화도로 FcRn에 결합한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 1nM 내지 약 80nM의 KD로 FcRn에 결합할 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질은 약 1nM, 약 2nM, 약 3nM, 약 4nM, 약 5nM, 약 6nM, 약 7nM, 약 8nM, 약 9nM, 약 10nM, 약 15nM, 약 20nM, 약 25nM, 약 30nM, 약 35nM, 약 40nM, 약 45nM, 약 50nM, 약 55nM, 약 60nM, 약 65nM, 약 70nM, 약 71nM, 약 72nM, 약 73nM, 약 74nM, 약 75nM, 약 76nM, 약 77nM, 약 78nM, 약 79nM 또는 약 80nM의 KD로 FcRn에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 9nM의 KD로 FcRn에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 효과기 기능을 갖는 다른 Fc 수용체(즉, FcRn이 아닌 것)에 실질적으로 결합하지 않는다.
실시형태에서, 링커에서 Fc 도메인은 서열번호 1(하기 표 1 참조)의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99%의 동일성을 갖는다. 실시형태에서, 돌연변이가 서열번호 1에 대해서 수행되어 안정성 및/또는 반감기를 증가시킨다. 예를 들어, 실시형태에서, 링커에서 Fc 도메인은 서열번호 2(하기 표 1 참조)의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99%의 동일성을 포함한다. 예를 들어, 실시형태에서, 링커에서 Fc 도메인은 서열번호 3(하기 표 1 참조)의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99%의 동일성을 포함한다.
추가로, 하나 이상의 결합 링커를 사용하여 링커 내의 Fc 도메인(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3 중 하나 또는 이와 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것)과 세포외 도메인을 연결할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 또는 이의 변이체 중 임의의 하나는 본 명세서에 개시된 바와 같은 세포외 도메인과 본 명세서에 개시된 바와 같은 링커 내의 Fc 도메인을 연결할 수 있다. 선택적으로, 서열번호 4 내지 50 중 임의의 하나 또는 이의 변이체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 세포외 도메인 및 본 명세서에 개시된 바와 같은 Fc 도메인 사이에 위치된다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 하기 표 1에 개시된 결합 링커의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 서열번호 4 내지 50 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
실시형태에서, 제1 결합 링커 및 제2 결합 링커는 상이할 수 있거나 또는 이들은 동일할 수 있다.
이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 키메라 단백질에 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하는 링커를 포함시키는 것은, 불용성 및 가능하게는, 비기능성 단백질 콘카테머(concatemer) 및/또는 응집물의 형성을 회피하는 것을 돕는다. 이는 부분적으로는 키메라 단백질 간에 이황화 결합을 형성할 수 있는 Fc 도메인 내의 시스테인의 존재로 인한 것이다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 결합 링커를 포함할 수 있고, 본 명세서에 개시된 바와 같은 Fc 도메인 링커가 결핍되어 있을 수 있다.
실시형태에서, 제1 및/또는 제2 결합 링커는 서열번호 4 내지 50의 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택되고, 하기 표 1에 제공되어 있다:
Figure pct00007
Figure pct00008
실시형태에서, 결합 링커는 글리신 및 세린 잔기(예를 들어, 약 30% 또는 약 40% 또는 약 50% 또는 약 60% 또는 약 70% 또는 약 80% 또는 약 90% 또는 약 95% 또는 약 97% 또는 약 98% 또는 약 99% 또는 약 100%의 글리신 및 세린)를 실질적으로 포함한다. 예를 들어, 실시형태에서, 결합 링커는 (Gly4Ser)n이며, 여기서 n은 약 1 내지 약 8, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8(각각 서열번호 25 내지 서열번호 9)이다. 실시형태에서, 결합 링커 서열은 GGSGGSGGGGSGGGGS(서열번호 33)이다. 추가로 예시적인 결합 링커는 서열 LE, (EAAAK)n(n=1 내지 3)(서열번호 36 내지 서열번호 38), A(EAAAK)nA(n = 2 내지 5)(서열번호 39 내지 서열번호 42), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 43), PAPAP(서열번호 44), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 45), GSAGSAAGSGEF(서열번호 46), 및 (XP)n(X는 임의의 아미노산, 예를 들어, Ala, Lys 또는 Glu을 나타냄)를 갖는 링커를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 실시형태에서, 결합 링커는 GGS이다. 실시형태에서, 결합 링커는 서열(Gly)n을 갖되, n은 1 내지 100이다: 예를 들어, (Gly)8(서열번호 34) 및 (Gly)6(서열번호 35).
실시형태에서, 결합 링커는 GGGSE(서열번호 47), GSESG(서열번호 48), GSEGS(서열번호 49), GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGGSEGGS(서열번호 50), 및 4개의 아미노산 간격마다 무작위로 위치된 G, S 및 E의 결합 링커 중 하나 이상이다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 5 및/또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 결합 링커를 포함한다.
키메라 단백질이 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(ECD), Fc 도메인 이전에 하나의 결합 링커, Fc 도메인 이후에 제2 결합 링커 및 CD40L의 ECD를 포함하는 실시형태에서, 키메라 단백질은 하기 구조를 포함할 수 있다:
인간 CD172a(SIRPα)의 ECD - 결합 링커 1 - Fc 도메인 - 결합 링커 2 - 인간 CD40L의 ECD.
제1 결합 링커, Fc 도메인 링커 및 제2 결합 링커의 조합은 본 명세서에서 "모듈식 링커"라고 지칭된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 표 2에 나타낸 바와 같은 모듈식 링커를 포함한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 상기 표 2에 개시된 모듈식 링커의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 서열번호 51 내지 56 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
실시형태에서, 링커는 가요성일 수 있고, 비제한적으로 상당히 가요성인 것을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 강성일 수 있고, 비제한적으로 강성 알파 나선을 포함한다. 예시적인 결합 링커의 특징을 하기 표 3에 나타낸다.
Figure pct00011
실시형태에서, 링커는 기능성일 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 링커는 본 발명의 키메라 단백질의 폴딩 및/또는 안정성을 개선시키고/시키거나, 발현을 개선시키고/시키거나 약동학을 개선시키고/시키거나 생물활성도를 개선시키도록 기능할 수 있다. 또 다른 예에서, 링커는 키메라 단백질을 특정 세포 유형 또는 위치에 대해서 표적화하도록 기능할 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 단지 하나의 결합 링커를 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 결합 링커가 결핍되어 있다.
실시형태에서, 링커는 합성 링커, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 이의 리간드/수용체에 입체적으로 결합할 수 있는 제1 도메인 및/또는 이의 리간드/수용체에 입체적으로 결합할 수 있는 제2 도메인을 갖는다. 따라서 세포외 도메인의 리간드/수용체 결합 도메인이 이의 리간드 /수용체에 대한 결합에 입체적으로 방해되지 않도록 키메라 단백질에 충분한 전체 유연성 및/또는 키메라 단백질의 세포외 도메인(또는 이의 일부)과 나머지 사이의 물리적 거리가 존재한다. 이러한 가요성 및/또는 물리적 거리(이것은 "슬랙"이라고 지칭됨)가 세포외 도메인(들)에 일반적으로 존재할 수 있고/있거나, 링커에 일반적으로 존재할 수 있고/있거나, 키메라 단백질(전체로서)에 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 아미노산 서열은 (예를 들어) 입체 장애를 회피하는 데 필요한 슬랙을 제공하기 위해서 하나 이상의 세포외 도메인 및/또는 링커에 첨가될 수 있다. 슬랙을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 첨가될 수 있다. 실시형태에서, 첨가된 아미노산 서열은 서열 (Gly)n을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 100의 임의의 수이다. 첨가될 수 있는 아미노산 서열의 추가 예는 표 1 및 표 3에 기재된 결합 링커를 포함한다. 실시형태에서, 입체 장애를 회피하는 데 필요한 슬랙을 제공하기 위해서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커가 세포외 도메인과 링커 사이에 첨가될 수 있다. 이러한 PEG 링커는 당업계에 널리 공지되어 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(또는 이의 변이체), 링커, 및 인간 CD40L의 세포외 도메인(또는 이의 변이체)을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4를 비롯한, IgG1 또는 IgG4로부터의 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 따라서, 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 인간 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인(또는 이의 변이체), 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하는 링커 및 인간 CD40L의 세포외 도메인(또는 이의 변이체)을 포함한다. 이러한 키메라 단백질은 본 명세서에서 "hCD172a(SIRPα)-Fc-CD40L" 또는 "SL-172154"라고 지칭될 수 있다.
질환, 치료 방법 및 작용 기전
CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)을 비롯한 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 진행성 고형 종양 및 진행성 림프종 둘 다를 치료하는 방법에 사용된다. 이러한 종양 유형은 흑색종, 비-소세포 폐암(편평, 선종, 선편평), 요로상피암, 신세포암, 편평 세포 자궁경부암, 위 또는 위-식도 접합 선암종, 항문의 편평 세포 암종, 두경부의 편평 세포 암종, 피부의 편평 세포 암종, 중추 신경계(CNS) 종양을 제외한 미세부수체 불안정성 높은 또는 미스매치 수선 결함 고형 종양을 포함한다. 다른 관심 종양은 호지킨 림프종(HL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 고위험 골수이형성 증후군(HR-MDS)을 포함한다.
실시형태에서, 암은 진행성 고형 종양(국소 및/또는 전이성)을 포함한다. 실시형태에서, 인간 대상체는 암을 갖되, 치료될 암은 종양 미세환경에서 대식세포를 갖고/거나 종양 내에 CD47+ 세포인 종양 세포를 갖는 것을 특징으로 한다. 실시형태에서, SIRPα- Fc-CD40L 키메라 단백질의 투여는 종양 세포에서 "나를 먹지마" 신호를 차단하고/거나 "나를 먹어" 신호를 자극한다. 실시형태에서 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)을 사용한 요법은 종양 세포를 식균하고 식균된 종양 세포의 종양 항원을 T 세포에 효과적으로 제시하도록 대식세포를 자극한다.
실시형태에서, 암은 고형암이다. 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 실시형태에서, 암은 전이성 암이다. 실시형태에서, 암은 혈액암이다. 실시형태에서, 암은 CD47을 발현한다.
실시형태에서, 암은 진행성 림프종을 포함한다. 실시형태에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함한다. 실시형태에서, 암은 p53 돌연변이체 AML을 포함한다. 실시형태에서, 암은 고위험 골수이형성 증후군(HR-MDS)을 포함한다.
본 개시내용의 양상은 암의 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 투여를 필요로 하는 대상체에게 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 중의 유효량의 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
보통 면역 반응을 증강시키기 위해서, 예를 들어, 환자의 항-종양 면역 반응을 향상시키기 위해서 면역 자극 신호 전달을 향상시키는 것이 바람직하다.
실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 예를 들어, 검출 및/또는 파괴를 피하려고 시도하는 암 세포로부터 유래하는 면역 저해 신호의 전달을 방해, 차단, 감소, 저해 및/또는 봉쇄하는 인간 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 및 항암 면역 세포로의 면역 자극 신호의 전달을 향상, 증가 및/또는 자극하는 인간 CD40L의 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 동시에 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인이 이의 리간드/수용체에 결합하고 CD40L의 세포외 도메인이 수용체에 결합하는 것은 암 세포로부터 억제 신호의 전달을 방지할 것이고 면역계 세포에서 면역 활성을 자극할 것이다. 즉, 본 개시내용의 키메라 단백질은 2개의 구별되는 기전을 통해서 암을 치료할 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용은 암 및/또는 종양; 예를 들어, 암 및/또는 종양의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 본 명세서 다른 곳에 개시된 바와 같이, 암의 치료는 실시형태에서, 면역 자극 신호의 증가 또는 활성화를 선호하도록 면역계를 본 발명의 키메라 단백질로 조정하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 방법은, 미치료 대상체 또는 CD172a(SIRPα), CD40L 및/또는 이의 각각의 리간드 또는 수용체에 지향되는 항체로 치료된 대상체와 비교할 때, 조절 T 세포(Treg)의 양 또는 활성도를 감소시킨다. 실시형태에서, 방법은, 미치료 대상체 또는 CD172a(SIRPα), CD40L 및/또는 이의 각각의 리간드 또는 수용체에 지향되는 항체로 치료된 대상체와 비교할 때 대상체의 드레이닝 림프절(draining lymph node)에서 효과기 T 세포의 프라이밍(priming)을 증가시킨다. 실시형태에서, 방법은, 미치료 대상체 또는 CD172a(SIRPα), CD40L 및/또는 이의 각각의 리간드 또는 수용체에 지향되는 항체로 치료된 대상체와 비교할 때, 면역억제성 세포의 전체 감소 및 더 염증성인 종양 환경으로의 이동을 초래한다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 면역 반응의 정도를 조정하는, 예를 들어, 효과기 생산량의 수준을 조정하는 단계를 포함하는 방법에서 사용 가능하고, 사용될 수 있다. 실시형태에서, 예를 들어, 암의 치료를 위해서 사용되는 경우, 본 발명의 키메라 단백질은, 사이토카인 생산, 증식 또는 표적 사멸 가능성의 증가된 수준을 자극하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, T 세포 반응의 크기를 증가시키기 위해서 면역 저해와 비교할 때 면역 자극의 정도를 변경한다. 실시형태에서, 환자의 T 세포는 키메라 단백질에 의해서 활성화되고/되거나 자극되고, 활성화된 T 세포는 사이토카인을 분열 및/또는 분비할 수 있다.
암 또는 종양은 신체 기관 및 시스템의 정상 기능을 방해하는 세포의 제어되지 않는 성장 및/또는 비정상적으로 증가된 세포 생존력 및/또는 세포자멸의 저해를 지칭한다. 양성 암 및 악성 암, 폴립, 이상증식뿐만 아니라 휴지기 종양 또는 소전이(micrometastas)가 포함된다. 또한, 면역계에 의해서 저지되지 않은 비정상적인 증식을 갖는 세포(예를 들어, 바이러스 감염된 세포)가 포함된다. 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다. 원발성 암은 임상적으로 검출 가능한 본래 부위에서의 암 세포의 면적일 수 있고, 원발성 종양일 수 있다. 이에 반해서, 전이성 암은 하나의 기관 또는 부위로부터 또 다른 비인접한 기관 또는 부위로의 질환의 확산일 수 있다. 전이성 암은 국지 영역에서 정상 조직 주변을 관통 및 침윤하여, 국소 전이성일 수 있는 새로운 종양을 형성하는 능력을 획득한 암 세포에 의해서 유발될 수 있다. 암은 또한 림프관 및/또는 혈관의 벽을 관통하는 능력을 획득한 암 세포에 의해서 유발될 수 있는데, 그 후 암 세포는 혈류를 통해서 신체의 다른 부위 및 조직으로 순환할 수 있다(이로 인해서 순환 종양 세포임). 암은 림프성 또는 혈행성 확산과 같은 과정으로 인한 것일 수 있다. 암은 또한 또 다른 부위에서 멈춰서, 혈관 또는 벽을 통해서 재침투하고, 증식을 계속하고, 결국 또 다른 임상적으로 검출 가능한 종양을 형성하는 종양 세포에 의해서 유발될 수 있다. 암은 이러한 새로운 종양일 수 있고, 이것은 전이성(또는 2차) 종양일 수 있다.
암은 전이된 종양 세포에 의해서 유발될 수 있고, 이것은 2차 또는 전이성 종양일 수 있다. 종양의 세포는 본래 종양에서의 것과 유사할 수 있다. 예로서, 유방암 또는 결장암이 간으로 전이되면, 2차 종양은, 간에 존재하면서, 비정상적인 간세포가 아닌 비정상적인 유방 또는 결장 세포로 구성된다. 따라서 간에서의 종양은 간암이 아닌 전이성 유방암 또는 전이성 결장암일 수 있다.
암은 임의의 조직으로부터의 기원을 가질 수 있다. 암은 각각 흑색종, 결장, 유방 또는 전립선으로부터 기원할 수 있고, 따라서 각각 본래 피부, 결장, 유방 또는 전립선에 존재하는 세포로 구성될 수 있다. 암은 또한 혈액 악성종양일 수 있고, 이것은 백혈병 또는 림프종일 수 있다. 암은 조직, 예컨대, 간, 폐, 방광 또는 장을 침범할 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 치료-난치성 암을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 1종 이상의 면역-조정제에 난치성인 대상체를 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 실시형태에서, 키메라 단백질은 12주 정도의 치료 후에, 치료에 반응을 나타내지 않거나 질환이 진행된 대상체를 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 실시형태에서, 대상체는 하나 이상의 CD172a(SIRPα) 및/또는 CD47 작용제에 난치성, 예를 들어, 마그롤리맙(Magrolimab)(5F9), Hu5F9-G4, CC-90002, Ti-061, SRF231, TTI-621, TTI-622 또는 ALX148 난치성 화자이다. 예를 들어, 실시형태에서, 대상체는 항-CTLA-4 작용제에 대해서 난치성이고, 예를 들어, 이필리무맙(ipilimumab)(YERVOY)-난치성 환자(예를 들어, 흑색종 환자)이다. 따라서, 실시형태에서 본 개시내용은 1종 이상의 면역-조정제의 단일요법을 비롯하여, 다양한 요법에 비반응성인 환자를 구제하는 암 치료 방법을 제공한다.
실시형태에서, 본 개시내용은 종양 미세환경 내의 세포 또는 조직을 표적으로 하는 키메라 단백질을 제공한다. 실시형태에서, 종양 미세환경 내의 세포 또는 조직은 키메라 단백질의 1종 이상의 표적 또는 결합 파트너를 발현한다. 종양 미세환경은 종양이 존재하는 세포, 분비된 단백질, 생리학적 소분자 및 혈관을 비롯한 세포 환경을 지칭한다. 실시형태에서, 종양 미세환경 내의 세포 또는 조직은 종양 맥관구조; 종양-침윤 림프구; 섬유모세포 망상 세포; 내피 조상 세포(EPC); 암-연관된 섬유모세포; 주연세포; 다른 기질 세포; 세포외 기질(ECM)의 구성성분; 수지상 세포; 항원 제시 세포; T-세포; 조절 T 세포; 대식세포; 호중구; 및 종양에 인접하게 위치된 다른 면역 세포 중 하나 이상이다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 암 세포를 표적으로 한다. 실시형태에서, 암 세포는 키메라 단백질의 표적 또는 결합 파트너 중 하나 이상을 발현한다.
조절 T 세포와 활성화는 공자극 및 공저해 신호에 의해서 상당히 영향을 받는다. 공자극 분자의 2개의 주요 패밀리는 B7 및 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리를 포함한다. 이러한 분자는 각각 CD28 또는 TNF 수용체 패밀리에 속하는 T 세포 상의 수용체에 결합한다. 다수의 널리 정의된 공저해제 및 이의 수용체는 B7 및 CD28 패밀리에 속한다.
실시형태에서, 면역 자극 신호는 면역 반응을 향상시키는 신호를 지칭한다. 예를 들어, 종양학과 관련하여, 이러한 신호는 항종양 면역을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 면역 자극 신호는 증식, 사이토카인 생산, 백혈구의 사멸 활성도 또는 식세포 활성도를 직접 자극함으로써 식별될 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질은 개별 T 세포 하위세트의 증식 및 사이토카인 생산을 직접 자극할 수 있다. 또 다른 예는 이러한 면역 억제인자 세포의 활성도를 저해하는 수용체를 통해서 면역 저해 세포를 직접 자극하는 것을 포함한다. 이것은 예를 들어, CD4+FoxP3+ 조절 T 세포의 자극을 포함할 것인데, 이것은 종래의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증식을 억제하는 조절 T 세포의 능력을 감소시킬 것이다. 또 다른 예에서, 이것은 항원 제시 세포의 표면 상의 CD40의 자극을 포함할 것인데, 이것은 B7 또는 TNF 슈퍼패밀리에서의 것을 비롯한, 적절한 천연 공자극 분자와 관련하여 항원을 제시하는 이러한 세포의 향상된 능력을 비롯하여, 항원 제시 세포의 활성화를 유발할 것이다. 또 다른 예에서, 키메라 단백질은 림프계 세포의 활성화 및/또는 전염증성 사이토카인 또는 케모카인의 생산을 유발하여 선택적으로 종양 내에서, 면역 반응을 추가로 자극할 것이다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 면역 조정을 향상, 회복, 촉진 및/또는 자극하는 것을 포함하는 방법에서 사용 가능하거나 사용된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 키메라 단백질은 T 세포, 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 항종양 대식세포(예를 들어, M1 대식세포), B 세포 및 수지상 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 종양 세포에 대한 1종 이상의 면역 세포의 활성도 또는 활성화를 회복, 촉진 및/또는 자극한다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 비제한적인 예의 방식으로 생존 촉진 신호(pro-survival signal); 자가 분비 또는 주변분비 성장 신호; p38 MAPK-, ERK-, STAT-, JAK-, AKT- 또는 PI3K-매개 신호; 항-세포사멸 신호; 및/또는 전염증성 사이토카인 생산 또는 T 세포 이동 또는 T 세포 종양 침윤 중 하나 이상을 촉진시키고/거나 이에 필수적인 신호를 비롯한 1종 이상의 T-세포 내인성 신호를 활성화 및/또는 자극하는 것을 포함하여, T 세포의 활성도 및/또는 활성화를 향상, 복귀, 촉진 및/또는 자극한다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 종양 또는 종양 미세환경 내에서 T 세포(비제한적으로 포함함 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 수지상 세포, 단핵구, 및 대식세포(예를 들어, M1 및 M2 하나 이상) 중 1종 이상의 증가를 유발하는 것을 포함하는 방법에서 사용 가능하거나 사용된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종양 미세환경 내로 침윤된 CD8+ T 세포, 특히 이러한 T 세포에 의해서 종양 항원의 인식을 향상시킨다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 CD19 발현을 유도하고/유도하거나 CD19 양성 세포(예를 들어, CD19 양성 B 세포)의 수를 증가시킨다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 IL-15Rα 발현을 유도하고/유도하거나 IL-15Rα 양성 세포(예를 들어, IL-15Rα 양성 수지상 세포)의 수를 증가시킨다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 특히, 종양 미세환경(TME) 내에서, 면역억제성 세포(예를 들어, 골수-유래 억제인자 세포(MDSC), 조절 T 세포(Treg), 종양 연관된 호중구 (TAN), M2 대식세포, 및 종양 연관 대식세포(TAM))를 억제하고/하거나 이의 감소를 유발하는 것을 포함하는 방법에서 사용 가능하거나 사용된다. 실시형태에서, 본 발명의 요법은 종양 부위 및/또는 TME에서 M1 대 M2 대식세포의 비를, M1 대식세포를 선호하도록 조정할 수 있다. 실시형태에서, SIRPα- Fc-CD40L 키메라 단백질은 Sipr1a/CD47을 통해서 "나를 먹지마" 신호가 종양 세포에 전달되는 것을 억제/감소/제거한다. 실시형태에서, SIRPα- Fc-CD40L 키메라 단백질은 종양을 대상체의 면역계에 의해서 공격될 가능성이 더 크게 만든다. 실시형태에서, SIRPα- Fc-CD40L 키메라 단백질은 종양을 대상체의 선천 면역계에 의해서 공격될 가능성이 더 크게 만든다. 실시형태에서, SIRPα- Fc-CD40L 키메라 단백질은 종양을 대상체의 후천 면역계에 의해서 공격될 가능성이 더 크게 만든다. 실시형태에서, SIRPα- Fc-CD40L 키메라 단백질은 종양-과발현된 CD47과 식세포-발현된 SIRPα의 결합을 억제/감소/제거하여 암 세포의 식세포작용적 제거 및/또는 대식세포 및/또는 수지상 세포에 의한 종양 항원의 면역학적 처리를 허용할 수 있다. 실시형태에서, SIRPα- Fc-CD40L 키메라 단백질의 투여는 종양 세포에서 "나를 먹지마" 신호를 차단하고/거나 "나를 먹어" 신호를 자극한다. 실시형태에서 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)을 사용한 요법은 종양 세포를 식균하고 식균된 종양 세포의 종양 항원을 T 세포에 효과적으로 제시하도록 대식세포를 자극한다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17F 및 IL-22 중 1종 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 사이토카인의 혈청 수준을 증가시킬 수 있다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 치료된 대상체의 혈청에서 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-22 또는 IFNγ를 향상시킬 수 있다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 특정 사이토카인의 혈청 수준을 증가시키지 않는다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 IL-6 및/또는 TNFα의 혈청 수준을 증가시키지 않는다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 치료된 대상체의 혈청에서 f IL-6 및/또는 TNFα의 혈청 수준을 증가시키지 않는다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 치료된 대상체의 혈청에서 f IL-6 및/또는 TNFα의 혈청 수준을 증가시키지 않으면서, 치료된 대상체의 혈청에서 다른 사이토카인, 예를 들어, 비제한적으로 CCL2, IL-8 및 CXCL9의 수준을 증가시킨다. 이러한 사이토카인 반응의 검출은 제시된 키메라 단백질에 대한 최적의 투여 요법을 결정하기 위한 방법을 제공할 수 있다.
본 개시내용의 키메라 단백질에서, 키메라 단백질은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위 집단을 증가시키거나 이의 감소를 예방할 수 있다.
본 개시내용의 키메라 단백질에서, 키메라 단백질은 T 세포에 의해서 종양 사멸 활성도를 향상시킬 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 키메라 단백질의 CD40L 도메인에 의해서 결합되는 경우 인간 대상체의 T 세포를 활성화하고; (a) 키메라 단백질의 제1 도메인에 의해서 결합될 때 하나 이상의 종양 세포는 면역억제성 신호 전송이 예방되고/예방되거나, (b) 대상체의 말초 혈액에서 정량화 가능한 사이토카인 반응이 달성되고/달성되거나 (c) CD40 효능제 항체 및/또는 CD47 차단 항체로 치료된 대상체와 비교할 때 종양 성장의 감소를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장이 감소된다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항종양 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포의 세포사를 저해, 차단 및/또는 감소시키거나; 또는 프로(pro)-종양 T 세포의 세포사를 자극, 유도 및/또는 증가시킨다. T 세포 고갈은 증식성 및 효과기 기능의 점진적인 손실을 특징으로 하는 T 세포 기능장애의 상태이며, 클론 결실로 이어진다. 따라서, 프로-종양 T 세포는 다수의 만성 감염, 염증성 질환 및 암 동안 발생하는 T 세포 기능장애의 상태를 지칭한다. 이러한 기능장애는 불량한 증식성 및/또는 효과기 기능, 저해 수용체의 지속되는 발현 및 기능성 효과기 또는 기억 T 세포의 것과 구별되는 전사 상태에 의해서 정의된다. 고갈은 감염 및 종양의 최적의 제어를 방해한다. 예시적인 프로-종양 T 세포는 Treg, 1종 이상의 면역관문 저해 수용체를 발현하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, Th2 세포 및 Th17 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 면역관문 저해 수용체는 제어되지 않는 면역 반응을 방지 또는 저해하는 면역 세포 상에서 발현되는 수용체를 지칭한다. 이에 반해서, 항종양 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포는 종양에 대한 면역 반응을 시작하는 T 세포를 지칭한다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 효과기 T 세포 대 조절 T 세포의 비를 증가시키는 것을 포함하는, 방법에서 사용 가능하고, 사용될 수 있다. 예시적인 효과기 T 세포는 ICOS+ 효과기 T 세포; 세포독성 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD8+, CD45RO+); CD4+ 효과기 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD4+, CCR7+, CD62L고, IL-7R/CD127+); CD8+ 효과기 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD8+, CCR7+, CD62L고, IL-7R/CD127+); 효과기 기억 T 세포(예를 들어, CD62L저, CD44+, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+, CCR7저); 중심 기억 T 세포(예를 들어, CCR7+, CD62L+, CD27+; 또는 CCR7고, CD44+, CD62L고, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+); CD62L+ 효과기 T 세포; CD8+ 효과기 기억 T 세포(TEM), 예컨대, 초기 효과기 기억 T 세포(CD27+ CD62L-) 및 후기 효과기 기억 T 세포 (CD27- CD62L-)(각각 TemE 및 TemL); CD127(+)CD25(저/-) 효과기 T 세포; CD127(-)CD25(-) 효과기 T 세포; CD8+ 줄기세포 기억 효과기 세포(TSCM)(예를 들어, CD44(저)CD62L(고)CD122(고)sca(+)); TH1 효과기 T-세포(예를 들어, CXCR3+, CXCR6+ 및 CCR5+; 또는 αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-12R+, IFNγR+, CXCR3+), TH2 효과기 T 세포(예를 들어, CCR3+, CCR4+ 및 CCR8+; 또는 αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-4R+, IL-33R+, CCR4+, IL-17RB+, CRTH2+); TH9 효과기 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD4+); TH17 효과기 T 세포(예를 들어, αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-23R+, CCR6+, IL-1R+); CD4+CD45RO+CCR7+ 효과기 T 세포, CD4+CD45RO+CCR7(-) 효과기 T 세포; 및 IL-2, IL-4 및/또는 IFN-γ를 분비하는 효과기 T 세포를 포함한다. 예시적인 조절 T 세포는 ICOS+ 조절 T 세포, CD4+CD25+FOXP3+ 조절 T 세포, CD4+CD25+ 조절 T 세포, CD4+CD25- 조절 T 세포, CD4+CD25고 조절 T 세포, TIM-3+CD172a(SIRPα)+ 조절 T 세포, 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)+ 조절 T 세포, CTLA-4/CD152+ 조절 T 세포, 뉴로필린-1(Nrp-1)+ 조절 T 세포, CCR4+CCR8+ 조절 T 세포, CD62L(L-셀렉틴)+ 조절 T 세포, CD45RB저 조절 T 세포, CD127저 조절 T 세포, LRRC32/GARP+ 조절 T 세포, CD39+ 조절 T 세포, GITR+ 조절 T 세포, LAP+ 조절 T 세포, 1B11+ 조절 T 세포, BTLA+ 조절 T 세포, 타입 1 조절 T 세포(Tr1 세포), T 헬퍼 타입 3 (Th3) 세포, 자연 살해 T 세포 표현형의 조절 세포(NKTreg), CD8+ 조절 T 세포, CD8+CD28- 조절 T 세포 및/또는 IL-10, IL-35, TGF-β, TNF-α, 갈렉틴-1, IFN-γ 및/또는 MCP1을 분비하는 조절 T-세포를 포함한다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 효과기 T 세포(예를 들어, CD4+CD25- T 세포)의 증가를 유발한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 조절 T 세포(예를 들어, CD4+CD25+ T 세포)의 감소를 유발한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 재발을 예방할 수 있거나 동물을 재발로부터 보호할 수 있고/있거나 전이를 예방하거나 전이 가능성을 감소시킬 수 있는 기억 반응을 생성시킨다. 따라서, 키메라 단백질로 치료된 동물은 키메라 단백질로의 초기 치료 후에 재감염되는 경우, 이후에 종양 세포를 공격할 수 있고/거나 종양의 발달을 예방할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 활성 종양 파괴 및 또한 종양 항원의 면역 인식(이것은 재발을 예방할 수 있는 기억 반응을 프로그래밍하는 데 필수적임) 둘 모두를 자극한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 항원 제시 세포의 활성화를 유발할 수 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 존재하는 항원에 대한 항원 제시 세포의 능력을 향상시킬 수 있다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간 또는 약 96시간 또는 약 1주 또는 약 2주 초과 동안 효과기 T 세포를 일시적으로 자극하는 것을 포함하는, 방법에서 사용 가능하고, 사용될 수 있다. 실시형태에서, 효과기 T 세포의 일시적인 자극은 환자의 혈류에서 또는 특정 조직/위치, 예컨대, 림프계 조직, 예를 들어, 골수, 림프절, 비장, 흉선, 점막-연관 림프계 조직(MALT), 비-림프계 조직 등에서 또는 종양 미세환경에서 실질적으로 일어난다.
본 개시내용의 키메라 단백질에서, 본 발명의 키메라 단백질은 예상치 못하게, 느린 오프 레이트(Kd 또는 Koff)로 각각의 결합 파트너에 대한 세포외 도메인 성분의 결합을 제공한다. 실시형태에서, 이것은 리간드에 대한 수용체의 예기치 못한 긴 상호작용을 제공한다. 이러한 효과는 더 긴 양성 신호 효과, 예를 들어 면역 자극 신호의 증가 또는 활성화를 허용한다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 단백질은, 예를 들어, 긴 오프 레이트 결합을 통해서, 면역 세포 증식을 제공하기에 충분한 신호 전달을 가능하게 하고, 항종양 공격을 가능하게 하고, 자극 신호, 예를 들어 사이토카인의 방출을 제공하기에 충분한 신호 전달을 가능하게 한다.
본 개시내용의 키메라 단백질에서, 키메라 단백질은 세포들 사이에 안정한 시냅스를 형성할 수 있다. (예를 들어, 음성 신호 보유하는 세포들 사이에서) 키메라 단백질에 의해서 촉진되는 세포의 안정적인 시냅스는, 종양 감소를 선호하는 공간적인 배향을 제공하며, 예컨대, 종양 세포를 공격하도록 T 세포를 배치하고/하거나 종양 세포가 본 발명의 키메라 단백질에 의해서 차폐되는 것을 초과하는 음성 신호를 비롯한, 음성 신호를 전달하는 것을 입체적으로 방지한다. 실시형태에서, 이는 키메라 단백질의 혈청 t1/2과 비교할 때 더 긴 온-타깃(예를 들어, 종양내) 반감기(t1/2)를 제공한다. 이러한 특성은 키메라 단백질의 전신 분포와 연관된 오프-타깃 독성을 감소시키는 조합된 이점을 가질 수 있다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 지속적인 면역조정 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 상승작용적 치료 효과(예를 들어, 항종양 효과)를 제공하는데, 그 이유는 그것이 2종의 면역치료제의 개선된 부위 특이적 상호작용을 가능하게 하기 때문이다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 오프-사이트 및/또는 전신 독성 감소의 가능성을 제공한다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 향상된 안전성 프로파일을 나타낸다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 감소된 독성 프로파일을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 단백질의 투여는 부작용, 예컨대, 설사, (예를 들어, 장의) 염증, 또는 체중 감소 중 하나 이상의 감소를 유발할 수 있는데, 이는 본 발명의 키메라 단백질의 세포외 도메인에 의해 표적화된 리간드(들)/수용체(들)에 지향되는 항체의 투여 후에 발생한다. 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 효능을 희생시키지 않으면\서, 본 발명의 키메라 단백질의 세포외 도메인에 의해서 표적화된 리간드(들)/수용체(들)에 지향되는 항체와 비교할 때, 개선된 안전성을 제공하다.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 현재 면역요법, 예를 들어, 본 발명의 키메라 단백질의 세포외 도메인에 의해서 표적화된 리간드(들)/수용체(들)에 지향되는 항체에 비해서, 감소된 부작용, 예를 들어, GI 합병증을 제공한다. 예시적인 GI 합병증은 복통, 식욕 부진, 자가면역 효과, 변비, 경련, 탈수, 설사, 섭취 문제, 피로, 헛배, 복부의 유체 또는 복수, 위장(GI) 세균 불균형, GI 점막염, 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군(IBS-D 및 IBS-C), 구역, 통증, 대변 및 소변 변화, 궤양성 장염, 구토, 체액 유지로부터의 체중 증가 및/또는 쇠약을 포함한다.
약제학적 조성물
본 개시내용의 양상은 본 명세서에 개시된 바와 같은 치료적 유효량의 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 명세서에 개시된 임의의 키메라 단백질이 약제학적 조성물에 사용될 수 있다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 바이알 내에 멸균 동결 용액으로서 또는 바이알 내에 멸균 액체 용액으로서 제공된다. 본 명세서에 개시된 키메라 단백질을 포함하는 약물 제품은 Flurotec® 고무 마개로 닫혀있고 알루미늄 플립 오프 밀봉으로 밀봉된 10㎖ 일회용 유리 바이알에 채워진 본 명세서에 개시된 멸균 여과되고 제형화된 키메라 단백질 용액을 포함한다. 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 주사용수 중의 약 10mg/㎖ 내지 약 30mg/㎖, 예를 들어, 약 20mg/㎖, 약 30mM 내지 약 70mM의 L-히스티딘, 예를 들어, 약 50mM의 L-히스티딘 및 약 125mM 내지 약 400mM의 수크로스, 예를 들어, 약 250mM의 수크로스로 제형화된다. 실시형태에서, 각각의 바이알은 약 1㎖의 약물 제품 또는 약 20mg의 본 명세서에 개시된 키메라 단백질을 함유한다.
CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)을 비롯한 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성하기 위해서 무기산 또는 유기산과 반응할 수 있는 충분히 염기성인 작용기, 또는 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 카복실기를 보유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 산 부가염은 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 약제학적으로 허용 가능한 산으로부터 형성된다. 이러한 염은 예를 들어 문헌[Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) 및 The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.), Verlag, Zurich (Switzerland) 2002](전문이 참고로 포함됨)에 기재된 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태이다.
추가로, 본 명세서에 개시된 임의의 키메라 단백질은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물의 성분으로서 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 적절한 투여를 위한 형태를 제공하도록 적합한 양의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 선택적으로 포함할 수 있다. 약제학적 부형제는 액체, 예컨대, 물 및 오일, 예컨대, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등일 수 있다. 약제학적 부형제는 예를 들어, 식염수, 아카시아 검, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 활택제 및 착색제를 사용할 수 있다. 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 대상체에게 투여될 때 멸균성이다. 물은 본 명세서에 개시된 임의의 작용제가 정맥내로 투여될 때 유용한 부형제이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 구체적으로 주사용 용액을 위한 액체 부형제로서 또한 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 또한 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카젤, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 본 명세서에 개시된 임의의 작용제는, 바람직한 경우, 또한 소량의 습윤 또는 유화 물질, 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물은 식염수 완충제(비제한적으로 TBS, PBS 등 포함) 중에 재현탁된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 반감기를 연장하거나 또는 약물학적 및 약동학적 특성을 달리 개선시키도록 또 다른 작용제와 접합되고/되거나 융합될 수 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 PEG, XTEN(예를 들어, rPEG로서), 폴리시알산(폴리XEN), 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 HAS), 엘라스틴 유사 단백질(ELP), PAS, HAP, GLK, CTP, 트랜스페린 등 중 하나 이상과 융합되거나 접합될 수 있다. 실시형태에서, 각각의 개별 키메라 단백질은 문헌[Strohl, BioDrugs 29(4):215-239 (2015)](이의 전문은 참고로 포함됨)에 기재된 작용제 중 하나 이상에 융합된다.
본 개시내용은 개시된 키메라 단백질을 다양한 약제학적 조성물의 제형으로 포함한다. 본 명세서에 개시된 임의의 키메라 단백질은 용액, 현탁액, 에멀션, 드롭, 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 액체 함유 캡슐, 분말, 서방형 제형, 좌제, 에멀션, 에어로졸, 스프레이, 현탁액의 형태, 또는 사용에 적합한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다. 단백질 서열을 암호화하는 DNA 또는 RNA 작제물을 또한 사용할 수 있다. 실시형태에서, 조성물은 캡슐의 형태이다(예를 들어, 미국 특허 제5,698,155호). 적합한 약제학적 부형제의 다른 예는 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995)]에 기술되어 있다.
필요한 경우, 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 또한 가용화제를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 작용제는 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 적합한 비히클 또는 전달 장치에 의해 전달될 수 있다. 투여를 위한 조성물은 선택적으로 국소 마취제, 예컨대, 예를 들어, 주사의 부위에서 통증을 경감시키는 리그노카인을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 편리하게는 단위 제형으로 존재할 수 있고, 약학의 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 치료제를 1종 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 치료제를 액체 담체, 미분 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고, 친밀하게 회합시키고, 이어서, 필요한 경우, 생성물을 목적하는 제형의 투여형으로 성형(예를 들어, 습식 또는 건식 과립화, 분말 블렌드 등, 그 다음 관련 기술 분야에 공지된 종래의 방법을 이용한 타정)함으로써 제조된다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 키메라 단백질은 본 명세서에 개시된 투여 방식에 채택된 약제학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다.
투여, 투약 및 치료 요법
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 선택적으로 10㎖ 유리 바이알에 약 20mg/㎖의 농도 및 약 1㎖의 총 부피의 멸균 동결 용액으로서 제공된다. 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 생리 식염수로의 희석 후에 정맥내(IV) 주입에 의해서 투여된다. 특정 실시형태의 시작 용량, 용량 증량 계획 및 용량 스케줄을 하기에 제시한다.
실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 0.0001㎎/㎏, 예를 들어, 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.3㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 0.3㎎/㎏ 또는 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 1㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 용량이 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증 효과에 의해 제한되지 않으며, 따라서 특정 다른 치료제(예를 들어, 항-CD47 항체 또는 SIRPalphaFc 융합 단백질)와 비교하여 더 높은 용량이 허용된다. 추가로, 실시형태에서, 저용량 프라이밍이 필요하지 않다.
실시형태에서, 투여는 정맥내이다. 실시형태에서, 투여는 종양내이다. 실시형태에서, 투여는 주사에 의해서이다. 실시형태에서, 투여는 주입에 의해서이다. 실시형태에서, 투여는 정맥내 주입에 의해서 수행된다. 실시형태에서, 투여는 종양내 주사에 의해서 수행된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 초기 용량(예를 들어, 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6, 약 8 또는 약 10㎎/㎏ 중 약 하나로 투여될 수 있고) 키메라 단백질은 하나 이상의 후속 투여로 투여된다. 실시형태에서, 1회 이상의 후속 투여는 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6 또는 약 8, 10㎎/㎏ 중 하나 이상의 용량을 갖는다.
실시형태에서, 출발 용량 및/또는 후속 용량은 최대 내약 용량이거나 최대 내약 용량보다 적다.
실시형태에서, 용량은 로그 증분, 예를 들어, 0.0001㎎/㎏에서 0.001㎎/㎏, 0.001㎎/㎏에서 0.01㎎/㎏, 및 0.01㎎/㎏에서 0.1㎎/㎏으로 하나 이상의 후속 용량 사이에서 증가한다.
실시형태에서, 용량은 로그 증분의 대략 절반, 예를 들어, 0.001㎎/㎏ 내지 0.003㎎/㎏ 및 0.003㎎/㎏ 내지 0.01㎎/㎏으로 하나 이상의 후속 용량 사이에서 증가한다.
실시형태에서, 인간 대상체는 백금계 요법에 실패하였고, 선택적으로 추가 백금 요법에 부적격이다. 실시형태에서, 인간 대상체는 동시 화학요법, 면역요법, 생물학 또는 호르몬 요법을 제공받고 있지 않고/않거나 인간 대상체는 표준 요법을 제공받은 적이 있거나, 표준 요법에 내약성이었거나, 표준 요법에 부적격이고/이거나 암은 표준 치료인 것으로 간주되는 승인된 요법이 없다.
실시형태에서, 초기 용량은 후속 투여 중 적어도 하나, 예를 들어, 후속 투여 각각에 대한 용량보다 적다.
실시형태에서, 초기 용량은 후속 투여 중 적어도 하나, 예를 들어, 후속 투여 각각에 대한 용량과 동일하다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 1회 투여된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 2회 투여된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 3회 투여된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고, 그 다음 키메라 단백질은 약 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 투여된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고, 그 다음 키메라 단백질은 약 1개월당 2회 투여된다. 예를 들어, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고, 그 다음 키메라 단백질은 약 2주마다 1회 투여된다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 4회 투여된다. 예를 들어, 키메라 단백질은 약 주 1회 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 1주마다 1회(7일마다 1회) 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 2주마다 1회 투여된다.
실시형태에서, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 투여는 환자에서 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증을 유발하지 않는다. 실시형태에서, 이러한 용량의 투여는 RBC의 용해를 초래하지 않는다. 실시형태에서, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 투여는 예를 들어, 항-CD47 Ab보다 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증을 유발할 가능성이 적다. 실시형태에서, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 용량이 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증 효과에 의해 제한되지 않으며, 따라서 특정 다른 치료제(예를 들어, 항-CD47 항체 또는 SIRPalphaFc 융합 단백질)와 비교하여 더 높은 용량이 허용된다. 추가로, 실시형태에서, 저용량 프라이밍이 필요하지 않다.
SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)이 제공하는 또 다른 이점은 표적화에도 불구하고 환자에서 빈혈 또는 다른 혈구 감소증을 유발하지 않는다는 것이다. 이는 CD47/SIRPα 상호작용이 RBC의 용해에 중요한 역할을 하지만, 본 명세서에 기재된 바와 같이, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 RBC의 용해를 일으키지 않기 때문이다. 따라서, 보 발명의 방법은 예를 들어, 항-CD47 Ab보다 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증을 유발할 가능성이 적다.
키메라 단백질은 정맥내 주입에 의해서 정맥내로 또는 볼러스 주사에 의해서 혈류로 투여될 수 있다. 키메라 단백질은 진행성 난소암, 나팔관암 및 원발성 복막암을 앓고 있는 환자를 위해 정맥내 주입에 의해 정맥내로 투여될 수 있다.
키메라 단백질은 종양내 주사로 투여될 수 있다. 실시형태에서, 종양내 투여에 대한 치료 용량은 정맥내 주입의 치료 용량과 동일하거나 더 적다. 실시형태에서, 종양내 투여에 대한 치료 용량은 정맥내 주입의 치료 용량과 동일하다. 실시형태에서, 종양내 투여에 대한 치료 용량은 정맥내 주입의 치료 용량보다 더 적다. 실시형태에서, 진행성 또는 전이성 CSCC 및 HNSCC를 앓고 있는 대상체에 대한 종양내 투여에 대한 치료 용량.
실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 종래의 면역요법(예를 들어, OPDIVO, KEYTRUDA, YERVOY 및 TECENTRIQ 중 1종 이상에 의한 치료)에 의해 인지되는 것보다 더 적은 부작용을 제공하는 이중 효과를 허용한다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 단백질은 다양한 조직 및 기관, 예컨대, 피부, 위장관, 신장, 말초 및 중추 신경계, 간, 림프절, 눈, 췌장 및 내분비계; 예컨대, 뇌하수체염, 대장염, 간염, 폐렴, 발진 및 류마티스성 질환에 영향을 미치는 일반적으로 관찰되는 면역 관련 부작용을 감소시키거나 예방한다.
정맥내 투여에 적합한 투여형은 예를 들어 용액, 현탁액, 분산액, 에멀션 등을 포함한다. 이들은 또한 사용 직전에 멸균 주사용 매질 중에 용해되거나 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물(예를 들어, 동결건조된 조성물)의 형태로 제조될 수 있다. 이들은 예를 들어 관련 기술 분야에 공지된 현탁제 또는 분산제를 함유할 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 키메라 단백질의 투여량, 및 투여 스케줄은 치료하고자 하는 질환, 대상체의 일반적인 건강 및 투여하는 주치의의 결정을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 매개변수에 따라 달라질 수 있다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 인간 대상체에게 유효량의 하기 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하고; N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 여기서 투여 단계는 2상(biphasic) 투여를 포함한다. 실시형태에서, 제1 상 및 제2 상은 각각 독립적으로 약 1주마다 2회 내지 약 2개월마다 1회의 투여 빈도를 포함한다. 실시형태에서, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
실시형태에서, 제1 상의 투여 빈도 및 제2 상의 투여 빈도와 동일하다. 다른 실시형태에서, 제1 상의 투여 빈도 및 제2 상의 투여 빈도와 상이하다.
실시형태에서, 제1 상의 투여 빈도는 약 3일마다, 약 1주에 2회, 약 1주마다, 약 10일마다, 약 3주마다 2회, 약 2주마다, 약 3주마다, 약 4주마다, 약 1개월마다, 약 5주마다, 약 6주마다, 약 7주마다, 약 8주마다 및 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 제1 상의 투여 빈도는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된다.
실시형태에서, 제2 상의 투여 빈도는 약 3일마다, 약 1주에 2회, 약 1주마다, 약 10일마다, 약 3주마다 2회, 약 2주마다, 약 3주마다, 약 4주마다, 약 1개월마다, 약 5주마다, 약 6주마다, 약 7주마다, 약 8주마다 및 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 제2 상의 투여 빈도는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된다.
실시형태에서, 제1 상의 투여 빈도는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다로부터 선택되고; 제2 상의 빈도는 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다로부터 선택된다.
추가로 또는 대안적으로, 실시형태에서, 제1 상 및 제2 상은 각각 독립적으로 약 2일 내지 약 12개월 지속된다. 실시형태에서, 제1 상은 약 2주 내지 약 2개월 지속되고; 제2 상은 약 2주 내지 약 12개월 지속된다. 실시형태에서, 제1 상은 약 2주 내지 약 1개월 지속되고; 제2 상은 약 2주 내지 약 12개월 지속된다. 실시형태에서, 제1 상은 약 2주 내지 약 1개월 지속되고; 제2 상은 약 4주 내지 약 12개월 지속된다.
추가로 또는 대안적으로, 실시형태에서, 제1 상, 제2 상 및 제3상에 대한 유효량은 각각 독립적으로 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎖를 포함한다. 실시형태에서, 제1 상, 제2 상 및 제3 상은 각각 독립적으로 약 0.03㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏, 약 1㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 10㎎/㎏, 및 이들 값을 포함하고/하거나 이들 값 중 임의의 2개 사이의 임의의 범위로부터 선택된다. 실시형태에서, 제1 상, 제2 상 및 제3 상에 대한 유효량은 각각 독립적으로 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 0.1㎎/㎏, 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 0.3㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏, 및 약 1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏으로부터 선택된다. 실시형태에서, 제1 상, 제2 상 및 제3 상에 대한 유효량은 동일하다. 실시형태에서, 제1 상, 제2 상 및 제3 상에 대한 유효량은 상이하다. 실시형태에서, 제1 상에 대한 유효량은 제2 상에 대한 유효량보다 더 많다. 실시형태에서, 제1 상에 대한 유효량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 0.3㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏이고; 제2 상에 대한 유효량은 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 0.1㎎/㎏, 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 0.3㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏이다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 인간 대상체에게 유효량의 하기 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하고; N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 여기서 투여 단계는 제1 주기, 제2 주기 및 제3 주기를 포함한다. 실시형태에서, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 실시형태에서, 제1 주기, 제2 주기 및 제3 주기는 각각 독립적으로 약 1주마다 2회 내지 약 2개월마다 1회의 투여 빈도를 포함한다 실시형태에서, 제1 주기의 투여 빈도, 제2 주기의 투여 빈도 및 제3 주기의 투여 빈도는 동일하다. 실시형태에서, 제1 주기의 투여 빈도, 제2 주기의 투여 빈도 및 제3 주기의 투여 빈도는 상이하다. 실시형태에서, 제1 주기의 투여 빈도는 약 3일마다, 약 1주에 2회, 약 1주마다, 약 10일마다, 약 3주마다 2회, 약 2주마다, 약 3주마다, 약 4주마다, 약 1개월마다, 약 5주마다, 약 6주마다, 약 7주마다, 약 8주마다 및 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
실시형태에서, 제1 주기의 투여 빈도는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 제2 주기의 투여 빈도는 약 3일마다, 약 1주에 2회, 약 1주마다, 약 10일마다, 약 3주마다 2회, 약 2주마다, 약 3주마다, 약 4주마다, 약 1개월마다, 약 5주마다, 약 6주마다, 약 7주마다, 약 8주마다 및 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 제2 주기의 투여 빈도는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 제3 주기의 투여 빈도는 약 3일마다, 약 1주에 2회, 약 1주마다, 약 10일마다, 약 3주마다 2회, 약 2주마다, 약 3주마다, 약 4주마다, 약 1개월마다, 약 5주마다, 약 6주마다, 약 7주마다, 약 8주마다 및 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 제3 주기의 투여 빈도는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 제1 주기의 투여 빈도는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다로부터 선택되고; 제2 주기의 빈도는 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다로부터 선택된다.
추가로 또는 대안적으로, 실시형태에서, 제1 주기, 제2 주기 및 제3 주기는 각각 독립적으로 약 2일 내지 약 12개월 지속된다. 실시형태에서, 제1 주기는 약 2주 내지 약 2개월 지속되고; 제2 주기는 약 2주 내지 약 12개월 지속된다. 실시형태에서, 제1 주기는 약 2주 내지 약 2개월 지속되고; 제2 주기는 약 2주 내지 약 12개월 지속되고, 제3 주기는 약 2주 내지 약 6개월 지속된다.
추가로 또는 대안적으로, 실시형태에서, 제1 주기, 제2 주기 및 제3 주기에 대한 유효량은 각각 독립적으로 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎖를 포함한다. 실시형태에서, 제1 주기, 제2 주기 및 제3 주기는 각각 독립적으로 약 0.03㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏, 약 1㎎/㎏, 약 3㎎/㎏, 약 10㎎/㎏, 및 이들 값을 포함하고/하거나 이들 값 중 임의의 2개 사이의 임의의 범위로부터 선택된다. 실시형태에서, 제1 주기, 제2 주기 및 제3 주기에 대한 유효량은 각각 독립적으로 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 0.1㎎/㎏, 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 0.3㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏, 및 약 1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏으로부터 선택된다.
실시형태에서, 제1 주기, 제2 주기 및 제3 주기에 대한 유효량은 동일하다. 다른 실시형태에서, 제1 주기, 제2 주기 및 제3 주기에 대한 유효량은 상이하다. 실시형태에서, 제1 주기에 대한 유효량은 제2 주기에 대한 유효량보다 더 많다. 다른 실시형태에서, 제1 주기에 대한 유효량은 제2 주기에 대한 유효량보다 더 적다. 추가의 다른 실시형태에서, 제1 주기에 대한 유효량 및 제2 주기에 대한 유효량은 동일하다.
실시형태에서, 제1 주기에 대한 유효량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 0.3㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏이고; 제2 주기에 대한 유효량은 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 0.1㎎/㎏, 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 0.3㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏이다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 인간 대상체에게 유효량의 하기 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여 요법으로 투여하는 단계를 포함하고; N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 여기서 투여 요법은 약 3일마다 내지 약 2개월마다의 범위의 빈도로 투여하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 실시형태에서, 투여 요법은 약 3일마다, 약 1주에 2회, 약 1주마다, 약 10일마다, 약 3주마다 2회, 약 2주마다, 약 3주마다, 약 4주마다, 약 1개월마다, 약 5주마다, 약 6주마다, 약 7주마다, 약 8주마다 및 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 투여 요법은 약 1주마다, 약 10일마다, 약 2주마다, 약 3주마다, 약 4주마다, 약 1개월마다, 약 5주마다, 약 6주마다, 약 7주마다, 약 8주마다 및 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 투여 요법은 약 2주마다, 약 3주마다 또는 약 4주마다이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 인간 대상체에게 유효량의 하기 구조를 갖는 키메라 단백질을 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택되는 투여 요법으로 투여하는 단계를 포함한다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 실시형태에서, 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 실시형태에서, 투여 요법은 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다 또는 약 2주마다 내지 약 4주마다이다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 제1 도메인은 CD172a(SIRPα) 리간드에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제1 도메인은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함한다. 실시형태에서, 제2 도메인은 CD40 수용체에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 제2 도메인은 CD40L의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함한다. 실시형태에서, 링커는 IgG4, 예를 들어, 인간 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, (a) 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하고, (b) 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하고, (c) 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 5 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.2% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.4% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.6% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.8% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 대상체는 표준 요법을 제공받은 적이 있거나, 표준 요법에 내약성이었거나, 표준 요법에 부적격이고/이거나 암은 표준 치료인 것으로 간주되는 승인된 요법이 없다.
일 양상에서, 본 개시내용은 림프구 이동 촉진을 필요로 하는 인간 대상체에서 림프구가 말초 혈액으로부터 2차 림프계 기관(예를 들어, 림프절 및 비장)으로 이동하는 것을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 인간 대상체에게 유효량의 하기 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하고: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다.
본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 인간 대상체는 동시 화학요법, 면역요법, 생물학 또는 호르몬 요법을 제공받고 있지 않다.
일 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 실시형태 중 임의의 것의 방법에 사용하기 위한 키메라 단백질에 관한 것이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
제1 상의 투여 빈도 및 제2 상의 투여 빈도와 동일하거나 상이할 수 있다. 실시형태에서, 제1상의 투여 빈도 및 제2 상의 투여 빈도는 각각 독립적으로 약 3일마다, 약 1주에 2회, 약 1주마다, 약 10일마다, 약 3주마다 2회, 약 2주마다, 약 3주마다, 약 4주마다, 약 1개월마다, 약 5주마다, 약 6주마다, 약 7주마다, 약 8주마다 및 약 2개월마다로부터 선택된다. 실시형태에서, 제1 상의 투여 빈도는 약 3일마다 내지 약 10일마다, 약 1주마다 내지 약 2주마다, 약 10일마다 내지 약 3주마다, 약 2주마다 내지 약 4주마다, 약 3주마다 내지 약 5주마다, 약 4주마다 내지 약 6주마다, 약 5주마다 내지 약 7주마다, 약 6주마다 내지 약 8주마다 및 약 6주마다 내지 약 2개월마다로부터 선택된다.
실시형태에서, 제1 상 및 제2 상은 각각 독립적으로 약 2일 내지 약 12개월 지속된다. 예를 들어, 실시형태에서, 제1 상은 약 2주 내지 약 2개월 지속되고; 제2 상은 약 2주 내지 약 12개월 지속된다. 실시형태에서, 제1 상은 약 2주 내지 약 1개월 지속되고; 제2 상은 약 2주 내지 약 12개월 지속된다. 실시형태에서, 제1 상은 약 2주 내지 약 1개월 지속되고; 제2 상은 약 4주 내지 약 12개월 지속된다.
제1 상, 제2 상 및 제3 상에 대한 유효량은 동일하거나 상이할 수 있다. 실시형태에서, 제1 상, 제2 상 및 제3상에 대한 유효량은 각각 독립적으로 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎖를 포함한다. 실시형태에서, 제1 상에 대한 유효량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 0.3㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏이고; 제2 상에 대한 유효량은 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 0.1㎎/㎏, 약 0.03㎎/㎏ 내지 약 0.3㎎/㎏, 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 1㎎/㎏, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질이다.
실시형태에서, 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 지속적인 면역조정 효과를 제공할 수 있다.
실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, 링커는 IgG로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 IgG1 및 IgG4로부터 선택된 IgG로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 링커는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인은 인간 IgG4로부터 유래된다.
추가로 또는 대안적으로, 실시형태에서, 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 실시형태에서, 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 실시형태에서, 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 90% 또는 93% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 인간 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 인간 대상체에게 하기 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계로서: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 및 (ii) 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 용량으로 투여된다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.3㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 0.3㎎/㎏ 또는 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 1㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
실시형태에서, 키메라 단백질의 투여는 키메라 단백질의 투여 전 RO, 키메라 단백질이 투여되지 않은 제2 대상체 및/또는 외부 대조군에 비해서 적어도 약 30% 또는 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50% 또는 적어도 약 60% 또는 적어도 약 65% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%인 백혈구 상에서의 CD47 수용체 점유율 (RO)을 초래한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 투여는 키메라 단백질의 투여 전 RO, 키메라 단백질이 투여되지 않은 제2 대상체 및/또는 외부 대조군에 비해서 적어도 약 30% 또는 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50% 또는 적어도 약 60% 또는 적어도 약 65% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%인 B 세포 상에서의 CD47 수용체 점유율 (RO)을 초래한다. 실시형태에서, 키메라 단백질의 투여는 키메라 단백질의 투여 전 RO, 키메라 단백질이 투여되지 않은 제2 대상체 및/또는 외부 대조군에 비해서 IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC % 중 하나 이상의 양 또 활성을 증가시킨다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고; 대상체는 제2 치료제로 치료 중이거나 제2 치료제로 치료된 적이 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 용량으로 투여된다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.3㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 0.3㎎/㎏ 또는 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 1㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 제2 항암 치료제를 투여하는 단계를 포함하되, 대상체는 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질로 치료 중이거나 치료를 받은 적이 있고, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 용량으로 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 제2 치료제 이전에 투여된다. 실시형태에서, 제2 치료제는 키메라 단백질 이전에 투여된다. 실시형태에서, 제2 치료제 및 키메라 단백질은 실질적으로 함께 투여된다.
실시형태에서, 제2 치료제는 항체 및 화학치료제로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)이 가능하다. 실시형태에서, 항체는 세툭시맙, 리툭시맙, 오비누투주맙, Hul4.18K322A, Hu3F8, 디누툭시맙 및 트라스투주맙으로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)이 가능하다. 실시형태에서, 항체는 세툭시맙, 다라투쿠맙, 리툭시맙 및 트라스투주맙으로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 암종배아 항원(CEA), EGFR, HER-2, 상피 세포 접착 분자(EpCAM) 및 인간 상피 뮤신-1, CD20, CD30, CD38, CD40 및 CD52로부터 선택된 분자에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 항체는 EGFR에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 항체는 Mab A13, AMG595, 세툭시맙(Erbitux, C225), 파니투무맙(ABX-EGF, Vectibix), 데파툭시주맙(ABT 806), 데파툭시주맙, 마포도틴, 둘리고투주맙(MEHD7945A, RG7597), 푸툭시맙(Sym004), GC1118, 임가투주맙(GA201), 마투주맙(EMD 72000), 네시투무맙(Portrazza), 니모투주맙(h-R3), 아니투무맙(Vectibix, ABX-EGF), 잘루투무맙, humMR1 및 토무조툭시맙으로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 세툭시맙이다.
실시형태에서, 화학치료제는 안트라사이클린이다. 실시형태에서, 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin) 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체로부터 선택된다. 실시형태에서, 화학치료제는 독소루비신이다.
실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.0001㎎/㎏, 예를 들어, 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10.0㎎/㎏이다. 키메라 단백질은 초기 용량(예를 들어, 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6 또는 약 10.0㎎/㎏ 중 하나로 투여될 수 있고) 키메라 단백질은 하나 이상의 후속 투여로 (예를 들어, 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6, 약 8 및 약 10㎎/㎏ 중 하나 이상으로) 투여된다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.3㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 0.3㎎/㎏ 또는 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 1㎎/㎏, 예를 들어, 적어도 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 또는 약 3, 약 4㎎/㎏ 또는 약 6㎎/㎏ 또는 약 8㎎/㎏ 또는 약 10㎎/㎏이다. 실시형태에서, 초기 용량은 후속 투여(예를 들어, 후속 투여 각각) 중 적어도 하나에 대한 용량보다 적거나 또는 초기 용량은 후속 투여(예를 들어, 후속 투여 각각) 중 적어도 하나에 대한 용량과 동일하다. 실시형태에서, 출발 용량 및/또는 후속 용량은 최대 내약 용량이거나 최대 내약 용량보다 적다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 1회, 예를 들어, 적어도 약 1개월에 2회, 적어도 약 1개월에 3회 및 적어도 약 1개월에 4회 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 투여되고; 대안적으로, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 1개월당 2회, 예를 들어, 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 2주마다 1회 투여된다.
실시형태에서, 암은 진행성 고형 종양(국소 및/또는 전이성) 또는 림프종을 포함한다. 실시형태에서, 암은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택된다. 실시형태에서, 암은 진행성 고형 종양(국소 및/또는 전이성) 또는 진행성 림프종을 포함한다.
치료를 위한 대상체를 선택하는 방법 및 암 치료의 효능을 평가하는 방법
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능의 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고, 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 대상체에게 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능의 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고, 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15, IL23 및 TNFα로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15 및 IL23으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 그리고/또는 대상체에서 IL6 및/또는 TNFα의 수준 및/또는 활성의 실질적인 증가가 결핍된 경우 대상체에게 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻은 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 대상체를 키메라 단백질을 사용한 치료를 위해서 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻은 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15, IL23 및 TNFα로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 그리고/또는 대상체에서 IL6 및/또는 TNFα의 수준 및/또는 활성의 실질적인 증가가 결핍된 경우 대상체를 키메라 단백질을 사용한 치료를 위해서 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 대상체를 키메라 단백질을 사용한 치료를 위해서 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15, IL23 및 TNFα로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15 및 IL23으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 그리고/또는 대상체에서 IL6 및/또는 TNFα의 수준 및/또는 활성의 실질적인 증가가 결핍된 경우 대상체를 키메라 단백질을 사용한 치료를 위해서 선택하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (i) 인간 대상체에게 하기 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계로서: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; 및 (ii) 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 용량으로 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고; 대상체는 제2 치료제로 치료 중이거나 제2 치료제로 치료된 적이 있다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 용량으로 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 제2 항암 치료제를 투여하는 단계를 포함하되, 대상체는 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질로 치료 중이거나 치료를 받은 적이 있고, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 용량으로 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 예를 들어, 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.7㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 1.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 2.5㎎/㎏ 내지 약 3㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 1.0㎎/㎏ 또는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 0.5㎎/㎏의 용량 범위에서 선형 용량 반응을 나타낸다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 종형 용량 반응을 나타내지 않는다.
실시형태에서, 키메라 단백질은 제2 치료제 이전에 투여된다. 실시형태에서, 제2 치료제는 키메라 단백질 이전에 투여된다. 실시형태에서, 제2 치료제 및 키메라 단백질은 실질적으로 함께 투여된다.
실시형태에서, 제2 치료제는 항체 및 화학치료제로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)이 가능하다. 실시형태에서, 항체는 세툭시맙, 리툭시맙, 오비누투주맙, Hul4.18K322A, Hu3F8, 디누툭시맙 및 트라스투주맙으로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)이 가능하다. 실시형태에서, 항체는 세툭시맙, 다라투쿠맙, 리툭시맙 및 트라스투주맙으로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 암종배아 항원(CEA), EGFR, HER-2, 상피 세포 접착 분자(EpCAM) 및 인간 상피 뮤신-1, CD20, CD30, CD38, CD40 및 CD52로부터 선택된 분자에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 항체는 EGFR에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 항체는 Mab A13, AMG595, 세툭시맙(Erbitux, C225), 파니투무맙(ABX-EGF, Vectibix), 데파툭시주맙(ABT 806), 데파툭시주맙, 마포도틴, 둘리고투주맙(MEHD7945A, RG7597), 푸툭시맙(Sym004), GC1118, 임가투주맙(GA201), 마투주맙(EMD 72000), 네시투무맙(Portrazza), 니모투주맙(h-R3), 아니투무맙(Vectibix, ABX-EGF), 잘루투무맙, humMR1 및 토무조툭시맙으로부터 선택된다. 실시형태에서, 항체는 세툭시맙이다.
실시형태에서, 화학치료제는 안트라사이클린이다. 실시형태에서, 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin) 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체로부터 선택된다. 실시형태에서, 화학치료제는 독소루비신이다.
실시형태에서, 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 약 0.0001㎎/㎏, 예를 들어, 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10.0㎎/㎏이다. 키메라 단백질은 초기 용량(예를 들어, 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6 또는 약 10.0㎎/㎏ 중 하나로 투여될 수 있고) 키메라 단백질은 하나 이상의 후속 투여로 (예를 들어, 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6, 약 8 및 약 10㎎/㎏ 중 하나 이상으로) 투여된다. 실시형태에서, 초기 용량은 후속 투여(예를 들어, 후속 투여 각각) 중 적어도 하나에 대한 용량보다 적거나 또는 초기 용량은 후속 투여(예를 들어, 후속 투여 각각) 중 적어도 하나에 대한 용량과 동일하다. 실시형태에서, 출발 용량 및/또는 후속 용량은 최대 내약 용량이거나 최대 내약 용량보다 적다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 1회, 예를 들어, 적어도 약 1개월에 2회, 적어도 약 1개월에 3회 및 적어도 약 1개월에 4회 투여된다. 실시형태에서, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 투여되고; 대안적으로, 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 1개월당 2회, 예를 들어, 3주 동안 주 1회 투여되고 그 다음 키메라 단백질은 약 2주마다 1회 투여된다.
실시형태에서, 암은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택된다. 실시형태에서, 암은 진행성 고형 종양(국소 및/또는 전이성) 또는 진행성 림프종을 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능의 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 대상체는 암을 앓고 있고, 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻은 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 키메라 단백질의 치료를 계속하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 효능의 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법에 관한 것이며, 대상체는 암을 앓고 있고, 방법은 (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하는 단계로서, 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고; 키메라 단백질은 하기 일반 구조를 갖는, 단계: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고, (b)는 제1 도메인과 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인임; (ii) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻은 단계; (iii) 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15, IL23 및 TNFα로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 (iv) 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 그리고/또는 대상체에서 IL6 및/또는 TNFα의 수준 및/또는 활성의 실질적인 증가가 결핍된 경우 키메라 단백질의 치료를 계속하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 증가는 대상체에게 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하기 전 대상체에서의 또 다른 생물학적 샘플에서 사이토카인의 수준 및/또는 활성과 비교하여 계산된다. 실시형태에서, 증가는 일정 용량의 키메라 단백질이 투여된 적이 없는 상이한 대상체로부터의 또 다른 생물학적 샘플에서 사이토카인의 수준 및/또는 활성에 비교하여 계산된다. 실시형태에서, 증가는 음성 대조군에서 사이토카인의 수준 및/또는 활성과 비교하여 계산된다. 실시형태에서, 음성 대조군은 사이토카인이 없다. 실시형태에서, 음성 대조군은 염증 반응을 겪고 있지 않은 개체에서 발견되는 사이토카인의 수준을 함유한다. 실시형태에서, 증가는 음성 대조군에 비해서 적어도 약 0.1×, 약 0.2×, 약 0.3×, 약 0.4×, 약 0.5×, 약 0.6×, 약 0.7×, 약 0.8×, 약 0.9×, 약 1×, 약 1.1×, 약 1.2×, 약 1.3×, 약 1.4×, 약 1.5×, 약 1.6×, 약 1.7×, 약 1.8×, 약 1.9×, 약 2×, 약 2.1×, 약 2.2×, 약 2.3×, 약 2.4×, 약 2.5×, 약 2.6×, 약 2.7×, 약 2.8×, 약 2.9×, 약 3×, 약 3.1×, 약 3.2×, 약 3.3×, 약 3.4×, 약 3.5×, 약 3.6×, 약 3.7×, 약 3.8×, 약 3.9×, 약 4×, 약 4.1×, 약 4.2×, 약 4.3×, 약 4.4×, 약 4.5×, 약 4.6×, 약 4.7×, 약 4.8×, 약 4.9×, 약 5×, 약 5.1×, 약 5.2×, 약 5.3×, 약 5.4×, 약 5.5×, 약 5.6×, 약 5.7×, 약 5.8×, 약 5.9×, 약 6×, 약 6.1×, 약 6.2×, 약 6.3×, 약 6.4×, 약 6.5×, 약 6.6×, 약 6.7×, 약 6.8×, 약 6.9×, 약 7×, 약 7.1×, 약 7.2×, 약 7.3×, 약 7.4×, 약 7.5×, 약 7.6×, 약 7.7×, 약 7.8×, 약 7.9×, 약 8×, 약 8.1×, 약 8.2×, 약 8.3×, 약 8.4×, 약 8.5×, 약 8.6×, 약 8.7×, 약 8.8×, 약 8.9×, 약 9×, 약 9.1×, 약 9.2×, 약 9.3×, 약 9.4×, 약 9.5×, 약 9.6×, 약 9.7×, 약 9.8×, 약 9.9× 또는 약 10×의 양만큼 일어난다.
실시형태에서, 증가는 양성 대조군에서 사이토카인의 수준 및/또는 활성과 비교하여 계산된다. 실시형태에서, 양성 대조군은 사이토카인을 포함한다. 실시형태에서, 양성 대조군은 염증 반응을 겪고 있는 개체에서 발견되는 사이토카인의 수준을 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 실시형태에서, 대상체는 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 감소한다. 실시형태에서, 대상체는 IL6 및/또는 TNFα의 수준 및/또는 활성의 실질적인 증가가 부족하다. 실시형태에서, 감소는 대상체에게 일정 용량의 키메라 단백질을 투여하기 전 대상체에서의 또 다른 생물학적 샘플에서 사이토카인의 수준 및/또는 활성과 비교하여 계산된다. 실시형태에서, 감소는 일정 용량의 키메라 단백질이 투여된 적이 없는 상이한 대상체로부터의 또 다른 생물학적 샘플에서 사이토카인의 수준 및/또는 활성에 비교하여 계산된다. 실시형태에서, 감소는 음성 대조군에서 사이토카인의 수준 및/또는 활성과 비교하여 계산된다. 실시형태에서, 음성 대조군은 사이토카인이 없다. 실시형태에서, 음성 대조군은 염증 반응을 겪고 있지 않은 개체에서 발견되는 사이토카인의 수준을 함유한다. 실시형태에서, 감소는 음성 대조군에 비해서 적어도 약 0.1×, 약 0.2×, 약 0.3×, 약 0.4×, 약 0.5×, 약 0.6×, 약 0.7×, 약 0.8×, 약 0.9×, 약 1×, 약 1.1×, 약 1.2×, 약 1.3×, 약 1.4×, 약 1.5×, 약 1.6×, 약 1.7×, 약 1.8×, 약 1.9×, 약 2×, 약 2.1×, 약 2.2×, 약 2.3×, 약 2.4×, 약 2.5×, 약 2.6×, 약 2.7×, 약 2.8×, 약 2.9×, 약 3×, 약 3.1×, 약 3.2×, 약 3.3×, 약 3.4×, 약 3.5×, 약 3.6×, 약 3.7×, 약 3.8×, 약 3.9×, 약 4×, 약 4.1×, 약 4.2×, 약 4.3×, 약 4.4×, 약 4.5×, 약 4.6×, 약 4.7×, 약 4.8×, 약 4.9×, 약 5×, 약 5.1×, 약 5.2×, 약 5.3×, 약 5.4×, 약 5.5×, 약 5.6×, 약 5.7×, 약 5.8×, 약 5.9×, 약 6×, 약 6.1×, 약 6.2×, 약 6.3×, 약 6.4×, 약 6.5×, 약 6.6×, 약 6.7×, 약 6.8×, 약 6.9×, 약 7×, 약 7.1×, 약 7.2×, 약 7.3×, 약 7.4×, 약 7.5×, 약 7.6×, 약 7.7×, 약 7.8×, 약 7.9×, 약 8×, 약 8.1×, 약 8.2×, 약 8.3×, 약 8.4×, 약 8.5×, 약 8.6×, 약 8.7×, 약 8.8×, 약 8.9×, 약 9×, 약 9.1×, 약 9.2×, 약 9.3×, 약 9.4×, 약 9.5×, 약 9.6×, 약 9.7×, 약 9.8×, 약 9.9× 또는 약 10×의 양만큼 일어난다.
실시형태에서, 감소는 양성 대조군에서 사이토카인의 수준 및/또는 활성과 비교하여 계산된다. 실시형태에서, 양성 대조군은 사이토카인을 포함한다. 실시형태에서, 양성 대조군은 염증 반응을 겪고 있는 개체에서 발견되는 사이토카인의 수준을 포함한다.
본 명세서에 개시된 양상 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 암은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택된다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 체액, 분리된 세포의 샘플, 조직 또는 기관으로부터의 샘플 또는 대상체의 외부 또는 내부 신체 표면으로부터 얻은 세척/헹굼 유체의 샘플이다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 세침 생검 샘플, 세포 함유 체액, 자유 부유 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 대변, 림프액, 부인과액(gynecological fluid), 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 세정액 또는 세척액, 예컨대, 관 세척액 또는 기관지 폐포 세척액, 흡인물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 시편, 수술 시편, 대변, 다른 채액, 분비물 및/또는 배설물 및/또는 이로부터의 세포로부터 선택된 체액이다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 동결 종양 조직 시편, 배양 세포, 순환 종양 세포 또는 폼알린 고정 파라핀 포매 종양 조직 시편이다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택된 종양으로부터 유래된 종양 샘플이다.
실시형태에서, 생물학적 샘플은 스크레이프(scrape), 면봉 또는 생검을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 잘 알려진 기술에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 바늘 생검에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 브러시, (면) 면봉, 숟가락, 헹굼액/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘로 구멍을 뚫거나 수술 기구를 사용하여 얻는다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 얻은 세포이거나 이를 포함한다. 실시형태에서, 얻어진 세포는 생물학적 샘플이 얻어진 개체로부터의 세포이거나 이를 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 관심 공급원으로부터 적절한 수단에 의해서 직접 얻은 "1차 샘플"이다. 예를 들어, 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생검(예를 들어, 미세 바늘 흡인 또는 조직 생검), 수술, 체액 수집(예를 들어, 혈액, 림프, 대변 등) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 얻어진다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 종양, 혈액, 간, 비뇨생식관, 구강, 상부 호흡소화관 표피 또는 항문관에서 기원한다. 본 개시내용의 방법을 수행하기 위해 생물학적 샘플을 추가로 가공할 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 "가공된 샘플"은 예를 들어, 샘플로부터 추출되거나 1차 샘플에 mRNA의 증폭 또는 역전사, 특정 성분의 단리 및/또는 정제 등과 같은 기술을 적용하여 얻은 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 사이토카인의 수준 및/또는 활성은 RNA 서열결정, 면역조직화학적 염색, 웨스턴 블로팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 중 하나 이상에 의해 측정된다.
실시형태에서, 사이토카인의 수준 및/또는 활성은 샘플을 하나 이상의 사이토카인에 특이적으로 결합하는 작용제와 접촉시킴으로써 측정된다. 실시형태에서, 하나 이상의 사이토카인에 특이적으로 결합하는 작용제는 항체 또는 이의 단편이다. 실시형태에서, 항체는 재조합 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체 또는 이의 단편이다.
실시형태에서, 사이토카인의 수준 및/또는 활성은 샘플을 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 작용제와 접촉시킴으로써 측정된다. 실시형태에서, 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 작용제는 핵산 프라이머 또는 프로브이다.
실시형태에서, 평가는 진단, 예후 및 치료에 대한 반응 중 임의의 하나를 포함한다. 실시형태에서, 평가는 대상체를 고위험군 또는 저위험군으로 분류하는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 고위험 분류는 높은 수준의 암 공격성을 포함하고, 여기서 공격성은 높은 종양 등급, 낮은 전체 생존율, 높은 전이 가능성 및 공격성을 나타내는 종양 마커의 존재 중 하나 이상을 특징으로 한다. 실시형태에서, 저위험 분류는 낮은 수준의 암 공격성을 포함하고, 여기서 공격성은 낮은 종양 등급, 높은 전체 생존율, 낮은 전이 가능성 및 공격성을 나타내는 종양 마커의 부재 및/또는 감소 중 하나 이상을 특징으로 한다. 실시형태에서, 저위험 또는 고위험 분류는 신보조 요법(neoadjuvant therapy)의 보류를 나타낸다. 실시형태에서, 저위험 또는 고위험 분류는 보조 요법(adjuvant therapy)의 보류를 나타낸다. 실시형태에서, 저위험 또는 고위험 분류는 키메라 단백질의 투여를 계속한다는 것을 나타낸다. 실시형태에서, 저위험 또는 고위험 분류는 키메라 단백질의 투여를 보류한다는 것을 나타낸다.
실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 투여에 대한 긍정적 반응 및/또는 이로부터의 유익을 예측한다. 실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 투여에 대한 부정적인 또는 중성 반응 및/또는 이로부터의 유익을 예측한다. 실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 투여를 계속하거나 보류하는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 투여를 계속하는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 용량을 변화시키는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 용량을 증가시키는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 용량을 감소시키는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 투여 요법을 변화시키는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 투여 빈도를 증가시키는 정보를 제공한다.
실시형태에서, 평가는 신보조 요법의 투여 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 보조 요법의 투여 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 신보조 요법의 보류 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 신보조 요법의 변경 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 보조 요법의 변경 정보를 제공한다. 실시형태에서, 평가는 보조 요법의 보류 정보를 제공한다.
실시형태에서, 평가는 신보조 화학요법에 대한 긍정적인 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 신보조 화학요법에 대한 무반응 및/또는 이로부터의 유익의 부족을 예측한다. 실시형태에서, 평가는 보조 화학요법에 대한 긍정적인 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 보조 화학요법에 대한 무반응 및/또는 이로부터의 유익의 부족을 예측한다. 실시형태에서, 평가는 신보조 화학요법에 대한 부정적인 반응 또는 중성 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 신보조 화학요법에 대한 무반응 및/또는 이로부터의 유익의 부족을 예측한다. 실시형태에서, 평가는 보조 화학요법에 대한 부정적인 반응 또는 중성 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 보조 화학요법에 대한 무반응 및/또는 이로부터의 유익의 부족을 예측한다.
실시형태에서, 평가는 키메라 단백질의 투여 빈도를 감소시키는 정보를 제공한다. 실시형태에서, 신보조 요법 및/또는 보조 요법은 화학치료제이다. 실시형태에서, 신보조 요법 및/또는 보조 요법은 세포독성제이다. 실시형태에서, 신보조 요법 및/또는 보조 요법은 면역관문 저해제이다.
실시형태에서, 신보조 요법 및/또는 보조 요법은 면역관문 저해제이다. 실시형태에서, 면역관문 저해제는 TIM-3, BTLA, CTLA-4, B7-H4, GITR, 갈렉틴-9, HVEM, PD-L1, PD-L2, B7-H3, CD244, CD160, TIGIT, SIRPα, ICOS, CD172a 및 TMIGD2 중 하나를 표적으로 하는 작용제이다.
대상체 및/또는 동물
실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 인간이다. 실시형태에서, 인간은 소아 인간이다. 실시형태에서, 인간은 성인 인간이다. 실시형태에서, 인간은 노인 인간이다. 실시형태에서, 인간은 환자라고 지칭될 수 있다.
실시형태에서, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 투여는 환자에서 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증을 유발하지 않는다. 실시형태에서, 이러한 용량의 투여는 RBC의 용해를 초래하지 않는다. 실시형태에서, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 투여는 예를 들어, 항-CD47 Ab보다 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증을 유발할 가능성이 적다. 따라서, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 빈혈 또는 또 다른 혈구 감소증의 위험이 있는 개체에게 투여될 수 있다.
실시형태에서, 인간 대상체는 표준 요법을 제공받은 적이 있거나, 표준 요법에 내약성이었거나, 표준 요법에 부적격이고/이거나 암은 표준 치료인 것으로 간주되는 승인된 요법이 없다. 표준 치료는 의료 전문가들이 특정 유형의 암에 대한 적절한 치료법으로 승인하고 헬쓰케어 전문가들이 널리 사용하는 치료법이며, Best Practice, Standard Medical Care, Standard Therapy라고도 한다. 예를 들어, 근치 수술(radical surgery)은 적합한 I기 비소세포폐암(NSCLC) 환자를 위한 치료의 표준인 것으로 보고되었다(Zarogoulidis et al., J Thorac Dis. 5(Suppl 4): S389-S396(2013)). 치료 환경에서, 방사선 요법과 병행하는 고용량 시스플라틴은 1차 치료 또는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)에 대한 수술 후 표준 치료로 보고되었다(Oosting and Haddard, Front Oncol. 9: 815(2019)). 일부 암은 의료 전문가가 적절한 치료법으로 인정하는 치료법이 없거나 치료법이 없기 때문에 치료 표준이 없다.
실시형태에서, 표준 요법에 부적격한 인간 대상체는 제외 기준, 예컨대, 혈액 수치, 장기 기능, 동반이환 병태(예를 들어, 심장 질환, 예컨대, 기준선 비정상적인 심전도 판독값을 갖는 개체, 조절되지 않는 당뇨병, 신장 질환, 간 질환), 임신 중이거나 임신할 가능성이 있는 여성, 이전 암 치료, 특정 약물에 대한 노출, 인구 통계, 질환 특징, 전반적인 병 부담, 이전 암 이력 및 생리학적 저장(physiological reserve)을 가질 수 있다.
실시형태에서, 인간 대상체는 예를 들어, 단일요법으로서 또는 병용 면역요법으로서 2개 초과의 사전 면역관문 저해제-함유 치료 요법을 제공받았다.
실시형태에서, 인간 대상체는 백금계 요법에 실패하였고, 선택적으로 추가 백금 요법에 부적격이다. 실시형태에서, 인간 대상체는 동시 화학요법, 면역요법, 생물학 또는 호르몬 요법을 제공받고 있지 않고/않거나 인간 대상체는 표준 요법을 제공받은 적이 있거나, 표준 요법에 내약성이었거나, 표준 요법에 부적격이고/이거나 암은 표준 치료인 것으로 간주되는 승인된 요법이 없다.
실시형태에서, 인간 대상체는 사전 면역관문 저해제 요법에 난치성이다. 예를 들어, 대상체는 사전 면역관문 저해제 요법의 채료 개시 3개월 이내에 질환 진행을 경험 중이고 경험한 적이 있다.
실시형태에서, 인간 대상체는 12주 초과의 기대 수명을 갖는다.
실시형태에서, 인간 대상체는 iRECIST(고형 종양) 또는 RECIL 2017(림프종)에 의해서 측정 가능한 질환을 갖는다.
실시형태에서, 인간 대상체는 동시 화학요법, 면역요법, 생물학 또는 호르몬 요법을 제공받고 있지 않다. 그러나, 인간 대상체는 허용 가능한 암과 관련되지 않은 병태에 대해 동시 호르몬 요법을 제공받을 수 있다.
특정 실시형태에서, 인간은 약 0개월 내지 약 6개월, 약 6 내지 약 12개월, 약 6 내지 약 18개월, 약 18 내지 약 36개월, 약 1세 내지 약 5세, 약 5 내지 약 10세, 약 10 내지 약 15세, 약 15 내지 약 20세, 약 20 내지 약 25세, 약 25 내지 약 30세, 약 30 내지 약 35세, 약 35 내지 약 40세, 약 40 내지 약 45세, 약 45 내지 약 50세, 약 50 내지 약 55세, 약 55 내지 약 60세, 약 60 내지 약 65세, 약 65 내지 약 70세, 약 70 내지 약 75세, 약 75 내지 약 80세, 약 80 내지 약 85세, 약 85 내지 약 90세, 약 90 내지 약 95세 또는 약 95 내지 약 100세 범위의 연령이다.
실시형태에서, 인간 대상체는 암을 갖되, 치료될 암은 종양 미세환경에서 대식세포를 갖고/거나 종양 내에 CD47+인 종양 세포를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 개시내용의 양상은 의약, 예를 들어, 암의 치료용 의약의 제조에서의 본 명세서에 개시된 바와 같은 키메라 단백질의 용도를 포함한다.
본 개시내용의 양상은 암의 치료에서의 본 명세서에 개시된 바와 같은 키메라 단백질의 용도를 포함한다.
본 명세서에 개시된 임의의 양상 또는 실시형태는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양상 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 단백질(예를 들어, 인간 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인, 인간 면역글로불린 불변 감마 4(IgG4)로부터의 중심 도메인 및 인간 CD40L의 세포외 도메인을 포함하는 재조합, 키메라 당단백질, 즉, hCD172a(SIRPα)-Fc-CD40L)은 개별적으로 그리고 동시에 용량-의존적 방식으로 나노몰 단위의 친화도로 이의 동족 표적 분자 CD47 및 CD40에 결합한다. 본 명세서에 개시된 키메라 단백질은 대조군 분자와의 상호작용에 비해서 CD47 및 CD40에 결합되는 경우 더 느린 해리 동력학을 나타내었는데, 이는 Fc 도메인을 통한 CD172a(SIRPα) 및 CD40L의 융합이 종양 미세환경에서의 유익한 특징인 수용체-점유율 시간을 증가시킨다는 것을 시사한다.
CD40에 대한 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)의 결합은 NFκB 신호전달을 증가시키고, 높은 수준의 CD47을 발현하는 종양 세포의 존재 하에서 CD3+ T 세포로부터의 IL2의 분비를 증가시키는 것으로 나타났다. 그것은 또한 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 Ki67(세포 증식에 대한 세포내 마커)의 발현을 자극하고, 인간 CD8+ T 세포에서 IFNγ 및 TNFα의 발현을 증가시키는 것을 발견하였다.
스타필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B: SEB) 검정에서, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)은 이의 성분 단독 또는 조합보다 더 높게 인간 PBMC로부터의 사이토카인 생산을 자극하였는데, 이는 Fc 단편에 의한 CD172a(SIRPα) 및 CD40L 도메인의 물리적 테더링이 리간드/수용체 각각보다 더 큰 IL2 반응을 제공함을 시사한다. SEB 슈퍼 항원 자극, 50ng/㎖ 및 100ng/㎖ 후 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)의 EC50 값에 대한 기하 평균은 0.4866nM 및 0.5903nM이었지만; SEB는 PBMC 샘플에 존재하는 많은 비율의 TCR을 활성화할 수 있기 때문에, 이러한 값은 추가 면역 자극제(예컨대, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)가 환자에서 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 인간 암 환자에서 종양-항원 특이적 면역 반응은 전체 T 세포 매개 면역 반응 레퍼토리 중 적은 비율만을 포함하기 때문에, SEB 검정으로부터의 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)에 대한 추정된 EC50 값은 인간 암 환자에서 유사한 반응이 관찰될 수 있는 용량 수준에 대한 보수적 추정치를 제공한다. 하기에 개시된 비인간 영장류 연구에서 사용된 종인 시노몰거스 원숭이로부터의 PBMC를 사용한 유사한 실험에서, 인간 PBMC의 것과 유사한 농도의 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)에서 IL-2 분비가 관찰되었다. 상업적인 항체와의 비교 시에, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)은 또한 더 높은 IL2의 발현을 유도하였는데, 이는 CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)의 이중특이적 작용이 임상 환경에서 현재 입수 가능한 면역 관문 또는 CD40 단일-표적화 요법의 성공률을 개선시킬 것이라는 예측을 추가로 뒷받침한다.
요약하면, CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)은 높은 친화도로 CD47 및 CD40의 이의 의도된 표적에 선택적으로 그리고 특이적으로 결합한다. CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L 키메라 단백질(예를 들어, 서열번호 59 또는 서열번호 61)은 시험관내 항종양 모델을 비롯한 다양한 시험관내 검정에서 두 표적 모두의 결합과 연관된 기능적 활성을 나타내었다. 단백질의 뮤린 버전의 생체내 항-종양 활성은 마우스 종양 모델에서 입증되었다. 비특이적 표적들과의 최소 교차 반응성이 인간 조직에서 관찰되었다. SEB 슈퍼 항원 자극 검정의 EC50에 기초한 최소 예상 생물학적 효과 수준(minimum anticipated biological effect level: MABEL)은 0.587nM 또는 33.8ng/㎖인 것으로 결정되었다.
본 발명을 하기 실시예에 의해서 추가로 기술할 것이며, 이는 청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예
본 명세서의 실시예는 본 개시내용의 이점 및 이익을 설명하고 본 개시내용의 키메라 단백질을 제조하거나 사용하는 데 있어서 당업자를 추가로 돕기 위해 제공된다. 본 명세서의 실시예는 또한 본 개시내용의 바람직한 양상을 보다 완전하게 예시하기 위해 제시된다. 실시예는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실시예는 상기에 기재된 본 개시내용의 변형, 양상 또는 실시형태 중 임의의 것을 포함하거나 통합할 수 있다. 전술한 변형, 양상 또는 실시형태는 또한 각각 본 개시내용의 임의의 또는 모든 다른 변형, 양상 또는 실시형태의 변형을 포함하거나 통합할 수 있다.
실시예 1: 물질 및 방법
작제물 생성 및 단백질 정제.
인간(h) 및 마우스(m) SIRPα-Fc-CD40L 둘 다의 암호 서열을 코돈-최적화하고, pcDNA3.4 TOPO TA(써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific), 카탈로그 번호 A14697) 포유동물 발현 벡터에 방향성으로 클로닝하였고, Sanger 서열결정 방법론에 의해 뉴클레오타이드 서열을 확인하였다(GENEWIZ가 사이트 외부에서 수행). SIRPα-Fc-CD40L 서열을 하기 표에 제공한다:
Figure pct00012
일시적 형질주입-기반 단백질 생산 실행을 위해, 인간 또는 마우스 SIRPα-Fc-CD40L-발현 벡터를 ExpiFectamine 293 형질주입 키트(써모 피셔 사이언티픽사, 카탈로그 번호 A14524)를 사용하여 Expi293 세포에 형질주입시키고, SIRPα-Fc-CD40L을 함유하는 세포 배양 배지를 형질주입 후 제6일에 수거하였다. 또한, hSIRPα-Fc-CD40L 벡터를 CHO 세포에 안정적으로 형질주입시키고, hSIRPα-Fc-CD40L을 높은 수준으로 발현하는 최종 클론을 대규모 단백질 생산 및 정제를 위해 선택하였다(Selexis SA). 간략하면, SIRPα-Fc-CD40L 함유 세포 배양 배지를 5,000rpm에서 10분 동안 원심분리시킨 후 0.2-μm 필터를 통해 여과하여 수거하였다. 정화된 상청액을 HighTrap 단백질 A HP 칼럼에 결합시키고, 세척하고 표준 조건에서 용리시켰다. 용리된 단백질을 1X PBS로 투석하고, 농도를 NanoDrop 분광광도계(써모 피셔 사이언티픽사)를 사용하여 280nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다.
웨스턴 블롯 분석
인간(h) 및 마우스(m) SIRPα-Fc-CD40L 단백질을 제조업체의 권장 사항에 따라 37℃에서 1시간 동안 데글리코실라제 PNGase F(NEB, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하거나 사용하지 않고 처리하고, 그 다음 환원제 β-머캅토에탄올을 사용하거나 사용하지 않고 처리하고, SDS 로딩 완충액으로 희석시키고, SDS-PAGE로 분리시켰다. 1차 및 2차 항체를 hSIRPα-Fc-CD40L(항-SIRPα; 셀 시그널링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology), 카탈로그 번호 43248S, 항-인간 IgG; 잭슨 이뮤노리서치사, 카탈로그 번호 109-005-098, 항-CD40L; 알앤디 시스템즈사(R&D Systems), 카탈로그 번호 AF1054) 및 mSIRPα-Fc-CD40L(항-SIRPα; 바이오레전드사(BioLegend), 카탈로그 번호 144001, 항-마우스 IgG; 잭슨 이뮤노리서치사, 카탈로그 번호 115-005-068, 항-CD40L; 알앤디 시스템즈사, 카탈로그 번호 AF1163)를 프로빙하기 위해서 사용하였다. 2차 항-염소 IgG 및 항-토끼 IgG를 LI-COR에서 얻었고; 카탈로그 번호는 각각 925-32214 및 925-32211이다.
전자 현미경
샘플을 PBS(30 내지 140배)로 희석시키고, 400메시 구리 격자에서 나이트로셀룰로스로 지지되는 연속 탄소 층 위에서 영상화하였다. 전자 현미경검사는 FEI Eagle 4k×4k CCD 카메라(나노이미징 서비스즈사(NanoImaging Services))가 장착된 120keV에서 작동하는 FEI Tecnai T12 전자 현미경을 사용하여 수행하였다. 네거티브 염색 격자를 실온 단계를 사용하여 전자 현미경으로 옮겼다. 시편의 전체 분포를 평가하기 위해 각각의 격자의 영상을 여러 척도에서 획득하였다. 영상화에 적합한 대상 영역을 식별한 후, 공칭 배율 110,000× 및 67,000×에서 고배율 영상을 획득하였다. -1.6μ㏖/ℓ 내지 -0.9μ㏖/ℓ의 공칭 언더포커스 및 약 25e-/A2의 전자 선량에서 영상을 획득하였다. 자동화 피킹 프로토콜 그 다음 XMIPP 처리 패키지를 기반으로 하는 참조 없는 정렬을 사용하여 2차원 평균 분석을 수행하였다.
기능성 ELISA
인간 또는 마우스 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 특징규명을 위해, 고결합 ELISA 플레이트(코닝사(Corning))를 밤새 4°C에서 PBS 중의 5㎍/㎖의 항-hFc, 항-mFc, 재조합 hCD47-Fc, hCD40-His, mCD47-Fc 또는 mCD40-His로 코팅하였다(시약은 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈사, 시노 바이오로직스사, 아크로바이오시스템즈사(아크로바이오시스템즈사) 및 알앤디 시스템즈사로부터 얻었다). 그런 다음 플레이트를 실온에서 1시간 동안 카세인 완충액으로 차단시킨 다음, 적절한 표준(인간 및 마우스; IgG, SIRPα-Fc 및 Fc-CD40L)과 함께 인간 또는 마우스 SIRPα-Fc-CD40L의 연속 희석액으로 실온에서 1시간 동안 프로빙하였다. 플레이트를 TBS-T(0.1% Tween 20을 포함하는 Tris-완충 식염수)로 세척한 다음 검출 항체를 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 검출 항체는 항-hIgG-HRP, 항-mIgG-HRP, 항-hCD40L, 항-mCD40L 및 그 다음 항-염소-HRP를 포함하였다(모든 항체는 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈사 또는 알앤디 시스템즈사에서 구입하였다). 플레이트를 다시 세척하고, SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL; VWR에서 구입, 카탈로그 번호 95059-282)를 각각의 웰에 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 인큐베이션시켰다. 반응을 멈추기 위해, 각각의 웰에 1N 황산을 첨가하고 BioTek 플레이트 판독기에서 즉시 450nm에서의 흡광도를 판독하였다. 샘플을 최소 삼중 및 다중 희석으로 실행하였다.
SIRPα-차단 ELISA를 위해, hCD47-Fc(시노 바이올로지컬사(Sino Biological Inc.))를 사용하여 전술한 바와 같이 고결합 ELISA 플레이트를 코팅하였다. 다음날, 증가하는 농도의 hSIRPα-Fc-CD40L(CD47에 대한 SIRPα-바이오틴 결합과 경쟁하기 위해) 또는 양성 대조군으로서 제공된 항-CD47 차단 항체(클론 CC2C6, 바이오레전드사)와 조합하여 재조합 hSIRPα-바이오틴 단백질(아크로 바이오시스템즈사(Acro Biosystems))을 사용하여 결합을 검출하였다. 이 인큐베이션 후, 플레이트를 상기에 기재된 바와 같이 세척하고, 아비딘-HRP 검출 항체(바이오레전드사)로 1시간 동안 실온의 어두운 곳에서 프로빙하였다. 그런 다음 플레이트를 세척하고 상기와 같이 분석하였다.
표면 플라스몬 공명
재조합 단백질 표적에 대한 인간 또는 마우스 SIRPα-Fc-CD40L 융합 단백질의 직접 결합을 바이오라드사 ProteOn XPR36 단백질 상호작용 어레이 기기를 사용하여 수행하였다. 의도된 결합 표적("리간드"라고 함)에 대한 hSIRPα-Fc-CD40L의 온-레이트(K a ), 오프-레이트(K d ) 및 결합 친화도(KD)를 결정하기 위해, 히스티딘-태그 버전의 인간 재조합 표적-CD47(아크로바이오시스템즈사), CD40(아크로바이오시스템즈사), FcγR1A(시노 바이올로지컬사), FcγR2B(시노 바이올로지컬사), FcγR3B(시노 바이올로지컬사) 및 FcRn(알앤디 시스템즈사)을 Ni-황산염 활성화 ProteOn HTG 센서 칩(바이오라드사)에 고정화하였다. pH 7.0의 PBS/Tween(0.005%) 완충액에 희석된 증가하는 농도의 hSIRPα-Fc-CD40L 융합 단백질("분석물"이라고 함)을 3분 동안 주입시킨 다음 80㎕/분의 유량으로 5분의 해리 단계를 유지시켰다. hSIRPα-Fc 및 hCD40L-Fc(아크로바이오시스템즈사) 재조합 단백질을 이들의 파트너(각각 CD47 및 CD40)에 결합하기 위한 양성 대조군 분석물로 사용하였고, 인간 IgG를 Fcγ 수용체 및 FcRn에 결합하기 위한 양성 대조군으로 사용하였다. FcRn 리간드에 결합하는 분석물을 평가하기 위해, 완충액의 pH를 pH 5.5로 감소시켰다.
세포 배양
CHO-K1, CT26, A20, WEHI3, Toledo, Raji, Ramos, A431, HCC827, K562, HCC1954 및 MCF7 세포를 ATCC(2017년에서 2019년 사이)에서 입수하여 지침에 따라 배양하고; 5% CO2에서 37℃로 유지시켰다. 활성 배양 중인 모든 모체 세포주를 Venor GeM Mycoplasma Detection Kit(시그마사(Sigma))를 사용하여 월단위로 시험하였다. 형질주입된 모든 세포주를 형질주입 후 적어도 2주 간격을 두고 추가로 2회 시험하고, 마이코플라즈마(Mycoplasma)에 대해 음성으로 남아 있음을 확인하였다. 구매한 모든 세포주의 연구 세포 은행(RCB)을 초기 세포주 해동의 5 계대 내에서 생성시켰다. 실험에 사용된 모든 세포는 바이알 해동의 10 계대 내에서 사용하였다. 수용체/리간드 과발현 세포주로부터의 발현을 RCB를 생성하기 전에 유세포 분석법으로 확인한 다음, 새로운 바이알을 해동시키고, 배양할 때 주기적으로 다시 확인하였다.
시험관내 세포주 생성
인간 및 마우스 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 시험관내 결합을 평가하기 위해 안정적인 세포주를 생성시켰다. CHO-K1/hCD47, CHO-K1/mCD47 및 CHO-K1/mCD40 세포주를 생성시키기 위해, RNeasy 미니 키트(퀴아젠사(Qiagen), 카탈로그 번호 74104)를 사용하여 CD3/CD28 활성화 인간 PBMC 및 마우스 비장 세포(1×106개 세포)로부터 총 RNA를 추출시키고, 1㎍의 RNA를 사용하여 상업용 키트(오리진사(Origene), 카탈로그 번호 11801-025)를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA를 생성시켰다. 생성된 첫 번째 가닥 cDNA 1마이크로리터를 사용하여, Platinum Taq DNA 중합효소(써모 피셔 사이언티픽사, 카탈로그 번호 10966034) 및 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 PCR 단편을 pcDNA3.1(-) 발현 벡터(라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies))에 서브클로닝하기 위해 5' 단부에 제한 효소 부위가 첨부된 다음 프라이머 쌍을 사용하여 표적 각각을 PCR 증폭시켰다 - hCD47 정방향 5' GCGGCGCTCGAGGCCACCATGTGGCCCCTGGTAGCGG (서열번호 67); hCD47 역방향 5' ACTAGCGGTACCCCATCACTTCACTTCAGTTATTCCACAAATTTC (서열번호 68); mCD47 정방향 5' GCGGCGCTCGAGGCCACCATGTGGCCCTTGGCGGC (서열번호 69), mCD47 역방향 5' ACTAGCGGTACCTCACCTATTCCTAGGAGGTTGGATAGTCC (서열번호 70); mCD40 정방향 5' GCGGCGCTCGAGGCCACCATGGTGTCTTTGCCTCGGCTG (서열번호 71); mCD47 역방향 5' ACTAGCGGTACCTCAGACCAGGGGCCTCAAG (서열번호 72). hCD40 cDNA(알앤디 시스템즈사 #RD1325)를 pcDNA3.1(-) 벡터에 클로닝하여 CHOK1-hCD40 세포주를 생성시켰다. pcDNA3.1(-) 벡터에서 서브클로닝된 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 Sanger 서열결정(GENEWIZ)에 의해 확인하였다. 제조업체의 지시에 따라 4D-Nucleofector 및 Cell Line Nucleofector Kit SE(론자사, 카탈로그 번호 V4XC-1012)를 사용하여 pcDNA3.1(-) 벡터를 발현하는 각각의 표적 cDNA로 모체 CHO-K1 세포를 뉴클레오펙션시켰다. 뉴클레오펙션 2일 후, 세포를 2주 동안 G418 선택(0.5mg/㎖) 하에 두었고, 이어서 안정적인 풀을 제한 희석을 사용하여 단일 세포 클로닝하여 많은 양의 표적 수용체를 발현하는 클론을 단리시켰는데, 이것을 바이오레전드사로부터의 다음 APC-접합된 형광 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해서 확인하였다-항-hCD40(카탈로그 번호 334310), 항-hCD47(카탈로그 번호 323124), 항-마우스 CD40(카탈로그 번호 124612) 및 항-마우스 CD47(카탈로그 번호 127514). 그 다음 CHO-K1/mCD40 및 CHO-K1/hCD40 세포를 또한 pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](프로메가사(Promega)) 리포터 플라스미드로 안정적으로 뉴클로펙션시켜 CD40-유도 NFκB 리포터 세포를 생성시켰다.
유세포 분석법
간략하면, 단리된 세포를 1X PBS로 1회 세척한 후, 400 × g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 그런 다음 세포를 어두운 곳에서 얼음 위에서 30분 동안 항체로 염색하였다. 제시된 항체는 소니사(Sony), 바이오레전드사 또는 압캠사(Abcam)에서 구입하여, 권장 농도로 사용하였고, FACS 완충액[1% BSA, 0.02% 아지드화나트륨 및 2m㏖/ℓ EDTA를 포함하는 1X PBS 완충액]에 희석시켰다. AH1-사량체 시약은 MBL 인터내셔널사(카탈로그 번호 TB-M521-2)에서 구입하였고, 어두운 곳에서 얼음 위에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시킨 후 나머지 항체 칵테일을 첨가하였다. 이 인큐베이션 기간 후, 0.5㎖의 FACS 완충액을 첨가하여 염색된 세포를 세척한 다음 400 × g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 그런 다음 펠릿 위의 상청액을 흡인하고, 생성된 세포를 FACS 완충액에 재현탁시키고, 제조업체의 권장 사항에 따라 BD LSRII Fortessa에서 유세포 분석법을 수행하고, 데이터를 FlowJo로 분석하였다.
시험관내 기능성 검정
식세포작용 검정
건강한 인간 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 냉동 바이알을 스템셀 테크놀로지즈사(STEMCELL Technologies)에서 구입하고 제조업체의 프로토콜(STEMCELL, 카탈로그 번호 19059)에 따라 상업용 키트를 사용하여 단핵구를 단리시키고, APC-접합된 항-인간 CD14(바이오레전드사, 카탈로그 번호 367118) 및 적절한 아이소타입 대조군 항체를 사용하여 유세포 분석법 사후단리에 의해서 CD14+인 것으로 확인되었다. 단핵구 단리 후, 살아있는 세포 계수를 Trypan blue 염색 4×105개 라이브를 사용하여 수행하였고, 단핵구를 24-웰 플레이트(코닝사) 내의 10% FBS 및 50ng/㎖의 인간 대식세포 콜로니 자극 인자(M -CSF; BioLegend)를 함유하는 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove modified Dulbecco media: IMDM)에 시딩하였다. 세포를 37℃/5% CO2에서 7일 동안 인큐베이션시켜 대식세포로 분화시켰다 제4일에 배지를 교체하고 M-CSF를 보충하였다. 제7일에, 배지를 10ng/㎖의 리포폴리사카라이드(LPS-EB; 인비보젠사(InvivoGen)) 및 50ng/㎖의 인간 IFNγ(스템셀 테크놀로지즈사)를 함유하는 신선한 배지로 교체하여 대식세포를 M1 상태로 분극화시켰다. 세포를 추가로 48시간 동안 인큐베이션시키고, M1 분극화 상태를 CD11b, HLA-DR, CD80 및 CD206(바이오레전드사)에 대한 유세포 분석법으로 확인하였다. 대식세포는 CD11b, HLA-DR 및 CD80에 대해 양성으로 염색되고 CD206에 대해 음성으로 염색되는 경우 M1 분극화된 것으로 확인되었다. 제9일에, LPS 및 IFNγ를 함유하는 배지를 새로운 배지(IMDM + 10% FBS)로 교체하고, 대식세포:종양 공배양을 시작하였다.
유세포 분석법-기반 분석: 종양 세포를 수거하고, SIRPα-Fc-CD40L과 함께 1μ㏖/ℓ의 시험 농도에서 단독으로 또는 선택된 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)-적격 항체(검정에서 사용된 종양 유형에 기초함)와 조합하여 0.06μ㏖/ℓ 시험 농도에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 Dulbecco PBS(DPBS)로 세척하고, 제조업체 지침에 따라 CellTracker Green CMFDA 염료(써모 피셔 사이언티픽사/인비트로젠사(Invitrogen), 카탈로그 번호 C2925)로 염색하였다. 세포를 DPBS로 2회 세척하고 무혈청 배지에 재현탁시켰다. 염색된 종양 세포를 5:1의 종양:대식세포 비율로 37℃에서 2시간 동안 M1-분극화된 대식세포와 함께 공배양하였다. 적절한 경우, Fc 수용체 및 CD40 수용체를 상업용 항체(각각 20㎍/㎖; 바이오레전드사 및 알앤디 시스템즈사)를 사용하여 대식세포에서 차단시켰고, 공배양 시작 전에 칼레티쿨린을 칼레티쿨린 차단 펩타이드(10㎍/㎖; MBL 인터내셔널사)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 종양 세포에서 차단시켰다. 공배양 인큐베이션 기간 후, 결합되지 않은/삼켜지지 않은 종양 세포를 제거하고, 대식세포를 DPBS에서 헹구고, 비효소 세포 스트리핑 용액(써모 피셔 사이언티픽사/코닝사, 카탈로그 번호 25-056-C1)을 사용하여 수거하였다. 수거된 대식세포 Fc 수용체를 상업용 인간 Fc 차단 시약(바이오레전드사)을 사용하여 차단시켰다. 그 후, Fc-수용체 차단된 대식세포를 PE/Cy7(바이오레전드사)에 접합된 항-인간 CD11b 항체로 염색하고, 세척하고, LSRII Fortessa 유세포 분석기(비디 바이오사이언시스사(BD Biosciences))에서 분석하여 식세포작용 이벤트 후 CD11b 및 CellTracker Green CMFDA 염료 둘 다에 대해 양성으로 염색된 대식세포를 검출하였다. 세포를 CD11b+ 대식세포에 대해서 사전 게이팅시켰다. LSRII Fortessa에서 샘플을 분석하고, FlowJo 소프트웨어 버전 10을 사용하여 유세포 분석 표준(FCS) 파일을 분석하였다. CD11b+ Green 염료+ 대식세포의 백분율을 GraphPad Prism 8에 플로팅하였다. 처리군에 걸친 최대 반응을 1로 설정하고 최대 반응에 대한 각각의 처리군에 대한 배수 변화를 계산함으로써 식세포작용 지수를 계산하였다. 유사한 유동-기반 방법을 사용하여 마우스 SIRPα-Fc-CD40L 또는 마우스 항-CD47(바이오엑스셀사(BioXCell), 클론 MIAP301)을 사용하여 골수-유래 대식세포(BMDM)에 의한 마우스 종양 세포(WEHI 또는 A20)의 식세포작용을 연구하였다. BMDM을 단리시키고, 7일 동안 마우스 M-CSF(50ng/㎖)가 보충된 10% FBS가 있는 IMDM에서 성장시키고, 2일 동안 LPS(10ng/㎖) 및 mIFNγ(50ng/㎖)로 활성화시켰다.
형광 현미경 기반 분석: 인간 단핵구(CD14+)를 16웰 챔버 유리 슬라이드(써모 피셔 사이언티픽사)에 플레이팅하여 대식세포로 분화시키고 상기에 기재된 바와 같이 LPS 및 IFNγ를 사용하여 M1 상태로 분극화시켰다. 실험 당일, 종양 세포(Toledo)를 준비하고, SIRPα-Fc-CD40L 단독 또는 선택된 ADCP-적격 항체와의 조합물의 존재 하에서 37℃에서 2시간 동안 챔버 슬라이드에서 M1 대식세포와 공배양하였다. 인큐베이션 기간 후 결합되지 않은/삼켜지지 않은 종양 세포를 웰에서 제거하고 대식세포를 1x DPBS에서 4회 헹구었다. 후속 차단 및 염색 단계를 챔버 슬라이드에서 수행하였다. 대식세포의 Fc 수용체를 이전에 기재된 바와 같이 차단시킨 후, 광으로부터 보호된 4℃에서 밤새 Alexa Fluor 594(바이오레전드사)에 접합된 항-인간 CD11b 항체로 염색하였다. 대식세포를 DPBS에서 2회 헹구어 결합되지 않은 염색제를 제거하고 커버슬립을 DAPI(인비트로젠사)를 포함하는 ProLong Diamond 변색 방지 마운트에 장착하고, 광으로부터 보호된 실온에서 밤새 건조되도록 하였다. 일단 건조되면, 커버슬립의 가장자리를 투명한 매니큐어로 밀봉하고 Zeiss 800 공초점 현미경에서 형광 영상화를 수행하였다. 챔버 슬라이드에서 웰당 4개의 대표 영상을 10배 및 60배 배율로 획득하고, ImageJ 소프트웨어(NIH, 미국 미들랜드주 베데스다 소재)를 사용하여 원시 영상을 처리하고, 픽셀 밀도에 기초하여 총 대식세포(적색으로 표지)당 삼켜진 종양 세포(녹색으로 표지)의 수를 정량화하였다. 컴파일된 데이터는 조건당 하나의 대표적인 영상을 포함하였고, 정량화 데이터는 웰당 적어도 4개의 영상 및 조건당 2개의 웰을 포함하였다.
시간-경과 현미경 기반 분석: 인간 단핵구(CD14+)를 96웰 플레이트(밀리포어 시그마사(밀리포어사 Sigma))에 플레이팅하고, 대식세포로 분화시키고, 상기에 기재된 바와 같이 LPS 및 IFNγ를 사용하여 M1 상태로 분극화시켰다. 실험 당일, Toledo 종양 세포를 제조업체의 지침에 따라 IncuCyte phRodo Red cell 표지 키트(사토리우스사(Sartorius), 카탈로그 번호 4649)로 표지한 후, SIRPα-Fc-CD40L(1 μ㏖/ℓ), 항-CD20(리툭시맙; 1㎍/㎖), 항-CD47(바이오레전드사 클론 CC2C6; 33 ㎍/㎖); 또는 항-CD20과 SIRPα-Fc-CD40L 또는 항-CD47의 조합물의 존재 하에서 M1 대식세포와 5:1 비율로 공배양하였다. 96웰 플레이트를 IncuyCyte S3에 넣고 37℃에서 5시간에 걸쳐서 시간 경과 영상화를 수행하였다. 각각의 처리군에 대해 10배 배율 하에서 2개의 개별 공여자를 사용하여 웰당 5개의 영상을 이중으로 획득하고, IncuCyte S3 소프트웨어를 사용하여 영상당 적색 물체 적분 강도를 계산하였다. 각각의 실험에서 관찰된 최대 신호를 취하고, 이것을 100% 지점으로 설정하여 식세포작용 지수를 계산하였다. 주어진 실험의 각각의 데이터 지점을 해당 실험에 대한 최대값(즉, 형광 또는 발광)으로 정규화하였다. 이러한 계산을 각각의 실험 복제에 대해 반복하였고, 모든 조합된 데이터는 GraphPad Prism 8을 사용하여 플로팅하였다.
생체내 DC 활성화 검정.
BALB/C 마우스는 잭슨 래보러토리즈사에서 입수하였고, 1×107개의 PBS 세척된 양 적혈구(PBS에 희석된 RBC; 락랜드 이뮤노케미컬즈사(Rockland Immunochemicals)), 항-CD47(클론 MIAP301), 항-SIRPα(클론 P84), 또는 mSIRPα-Fc-CD40L의 단일 정맥내 주사로 처리하였다. 항체는 100㎍의 총 용량으로, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 300㎍으로 제공되었고; 모두 PBS에 희석된 100㎕의 부피이다. 6시간 또는 24시간 후, 마우스를 인도적으로 안락사시키고, 처리된 동물로부터 비장을 제거하고 두 면도날의 편평한 단부를 사용하여 기계적으로 분리한 다음 피펫팅을 반복하여 더 큰 조각으로 부수고 그 다음 100μm 셀 스트레이너를 통해 세포를 통과시킴으로써, DC의 유세포 분석법-기반 면역 프로파일링을 위해 비장세포를 단리시켰다. 제조업체의 권장 사항(바이오레전드사 카탈로그 번호 420301)에 따라 RBC 용해 완충액으로 RBC를 용해시키고, 나머지 단핵 세포를 CD11c, DC1R2, I-Ab(MHC-II) 및 CD4 또는 CD8에 대한 형광-접합된 항체로 염색하였다. 어두운 곳에서 얼음 위에서 30분 후에 세포를 세척한 다음, LSR II Fortessa 유세포 분석기에서 분석하였다. CD4+ 또는 CD8+ DC를 CD11c+/DC1R2+ 집단에 대해서 사전게이팅시키고, 활성화된 DC는 I-Ab에 대해서도 양성이었다. mSIRPα-Fc-CD40L의 용량 적정의 단일 복강내 주사 후 24시간 후에 말초 혈액에서 추가적인 약력학적 활성을 평가하였다. 꼬리에서 소량의 말초 혈액을 채취하고 상기에 기재된 바와 같이 RBC를 용해시켰다. CD20+ 세포의 집단을 유세포 분석법에 의해서 평가하였다.
NFκB-루시페라제 리포터 검정
CHOK1/mCD40/NFκB-루시페라제 세포를 mSIRPα-Fc-CD40L, 재조합 Fc-mCD40L 단백질(시노 바이올로지스사) 또는 항-mCD40(클론 FGK4.5; 바이오엑스셀사)의 용량 적정으로 처리하였다. CHOK1/hCD40/NFκB-루시페라제 세포를 SIRPα-Fc-CD40L 및 재조합 hCD40L-His 단백질(시노 바이올로지스사)의 용량 적정으로 처리하였다. Bright-Glo 루시퍼라제 시약 및 GloMax Navigator 광도계를 사용하여 NFκB 신호 전달의 활성화를 평가하였다. 발현 벡터, 루시페라제 시약(카탈로그 번호 E2650) 및 광도계(카탈로그 번호 GM2000)는 모두 프로메가사 제품이며 제조업체 제안에 따라 사용하였다. 간략하면, 10,000개의 CHO-K1/CD40/NFκB-루시페라제 세포를 96웰 플레이트 ± SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 또는 다른 시험 작용제의 각각의 웰에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃/5% CO2에서 6시간 동안 인큐베이션시킨 다음, Bright-Glo 시약을 첨가하고 광도계에서 발광을 평가하였다.
NIK/NFκB 리포터 검정
CD40을 발현하는 U2OS/NIK/NFκB 리포터 세포는 Eurofins/DiscoverX(카탈로그 번호 93-1059C3)에서 구입하였고, 권장 사항에 따라 배양하였다. 분석 당일, 10,000개의 U2OS/NIK/NFκB 리포터 세포를 SIRPα-Fc-CD40L, 재조합 Fc-hCD40L 단백질(시노 바이올로지스사) 또는 항-CD40 효능제 항체(클론 HB14; 바이오레전드사)의 용량 적정으로 96웰 플레이트의 각각의 웰에 플레이팅하였다. 배양 6시간 후, 상기에 기재된 바와 같이 광도계(프로메가사)에서 발광 활성을 평가하였다.
AIMV 활성화 검정.
증식: PBMC를 50개의 건강한 공여자 버피 코트에서 단리시키고, CD8+ T 세포를 CD8+ RosetteSep(스템셀 테크놀로지즈사)를 사용하여 고갈시켰다. 세포 고갈은 유세포 분석법에 의해 확인되었고 모든 공여자에 대해 90% 초과였다. 세포를 AIM-V 배지(깁코사(Gibco))에서 ㎖당 4 내지 6백만개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 제5일, 제6일 및 제7일에, 세포를 3×100㎕의 분취물에 부드럽게 재현탁시키고, 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각각의 웰로 옮겼다. 배양물을 100㎕ AIM-V 배양 배지에서 0.75μCi [3H]-티미딘(퍼킨엘머사(PerkinElmer))으로 펄싱하고, 추가로 18시간 동안 인큐베이션시킨 후 TomTec Mach III 세포 수거기를 사용하여 필터 매트(퍼킨엘머사)에서 수거하였다. 각각의 웰에 대한 분당 계수치(cpm)를 1450 Microbeta Wallac Trilux 액체 섬광 계수기(퍼킨엘머사)에서 낮은 배경 계수로 Meltilex(퍼킨엘머사) 섬광 계수에 의해 결정하였다.
IL2 ELISpot: PBMC를 단리시키고, CD8 세포를 고갈시키고, 상기 기재된 바와 같이 AIM-V에서 배양하고, 제8일에 세포를 평가하였다. 간략하게, ELISpot 플레이트(밀리포어사(Millipore))를 미리 적시고, PBS 중의 100㎕/웰로 IL2 포획 항체(알앤디 시스템즈사)로 밤새 코팅하였다. 세포를 웰당 100㎕의 부피로 4 내지 6백만개 세포/㎖의 밀도로 6개의 반복물로 플레이팅하였다. 8일 후, ELISpot 플레이트를 dH2O 및 PBS(x3)에서 순차적으로 세척하여 현상시킨 후, 100㎕의 여과된 바이오티닐화된 검출 항체(알앤디 시스템즈사)를 첨가하였다. 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 PBS 및 1% BSA로 추가로 세척하고, 100㎕의 여과된 스트렙타비딘-AP(알앤디 시스템즈사)와 함께 1시간 동안 인큐베이션시키고; 다시 세척하였다. 100마이크로리터의 BCIP/NBT 기질(알앤디 시스템즈사)을 실온에서 30분 동안 각각의 웰에 첨가하였다. dH2O로 웰을 3회 세척하여 스팟 현상을 중지시켰다. 건조된 플레이트를 Immunoscan 분석기에서 스캔하고, Immunoscan 버전 5 소프트웨어를 사용하여 웰당 스팟(SPW)을 결정하였다. 샘플은 인간 SIRPα-Fc-CD40L(0.3, 3, 30 및 300n㏖/ℓ), 양성 대조군으로서의 신생항원 KLH(키홀 림펫 헤모사이아닌(Keyhole limpet hemocyanin); 300n㏖/ℓ) 및 임상 벤치마크 대조군으로서의 엑세나타이드(Bydureon, 20μ㏖/ℓ)을 포함하였고; 이것은 이 검정에서 음성 대조군을 나타낸다. ELISpot의 경우, ELISpot 기능 및 세포 생존력에 대한 내부 시험으로서 미토겐-양성 대조군(8㎍/㎖의 PHA)이 각각의 플레이트에 포함되었다.
타입 I IFN 반응
유전자 발현 분석
인간 대식세포:Toledo/Raji 종양 공배양을 상기에 기재된 바와 같이 설정하였다. SIRPα-Fc-CD40L(1μ㏖/ℓ), 항-인간 CD20/리툭시맙(0.06μ㏖/ℓ) 또는 두 작용제의 조합물과 함께 공배양 및 처리 2시간 후; 비효소 세포 스트리핑 용액(써모 피셔 사이언티픽사/코닝사, 카탈로그 번호 25-056-C1)을 사용하여 플레이트로부터 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, Fc 차단 후 CD11b에 대한 형광 접합 항체로 염색하였다. 어두운 곳에서 얼음 위에서 30분 인큐베이션시킨 후, 세포를 세척하고, CD11b+ 집단을 FACS Melody(비디 바이오사이언시스사)를 사용하여 분류하였다. 분류된 대식세포를 5% 2-머캅토에탄올을 함유하는 RLT 용해 완충액(Qiagen RNeasy Micro Kit, 카탈로그 번호 74004)으로 용해시키고, 온-칼럼 DNase I 소화를 비롯한 제조업체의 지시에 따라 처리하였다. Nanodrop을 사용하여 RNA를 정량화하고, 생성된 RNA 250ng을 제조업체의 권장 사항에 따라 역전사시켰다(Origene First-strand cDNA 합성 키트). 생성된 cDNA를 뉴클레아제가 없는 물로 희석시키고, 10ng 당량의 시작 RNA를 각각의 qPCR 반응의 주형으로 사용하였다. SYBR Green 및 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System(바이오라드사)을 사용하여 유전자 발현을 평가하였다. 하우스키핑 대조군으로서 IFNα1, IFNβ1, CD80, CD86 및 β-액틴(ACTB)에 대한 검증된 qPCR 프라이머를 오리진사로부터 구입하였다. 유전자 발현의 배수 변화를 처리되지 않은 샘플과 비교하여 ΔΔC t 방법을 사용하여 결정하였다. 생성된 데이터는 모두 적어도 삼중으로 실행된 최소 3개의 실험 반복물로부터 유래되었다. 오차 막대는 SEM을 나타내며 유의성은 일원 ANOVA을 사용하여 결정하였다.
ISG 리포터 세포.
RAW264.7-Lucia ISG 세포를 InvivoGen에서 구입하였고, 권장 사항에 따라 배양하였다. RAW-Lucia ISG 세포를 A20 종양 세포, 및 50㎍/㎖의 mSIRPα-Fc-CD40L, 재조합 mFc-CD40L, 재조합 mSIRPα-Fc(둘 다 50㎍/㎖), mFc-CD40L과 mSIRPα-Fc의 조합물, 항-mCD20(바이오엑스셀사 클론 AISB12; 1㎍/㎖) 또는 mSIRPα-Fc-CD40L과 항-CD20의 조합물과 직접 배양하였다. 배양 24시간 후에 배양물로부터 상청액을 수집하고, QUANTI-Luc 시약(인비보젠사, 카탈로그 번호 rep-qlc1; 권장 사항에 따름)과 함께 인큐베이션시키고, 광도계(프로메가사)에서 판독하였다.
종양 모델 시스템
CT26, A20 및 WEHI3 연구의 경우, BALB/C 마우스에게 PBS 100㎕ 중의 5 x 105(CT26 및 A20) 또는 1 x 106(WEHI3)개의 종양 세포를 각각 제0일에 후방 옆구리에 피하 이식하였다. 치료일(도면에 치료 개략도를 표시하고 도면 범례에 기재함)에, 종양 보유 마우스를 무작위로 분류하고, 처리하지 않거나, mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 또는 항-CD40(클론 FGK4.5), 항-CD47(클론 MIAP301), 항-CD20(클론 AISB12), 항-PD-1(클론 RMP1-14) 또는 항-CTLA4(클론 9D9)로 복강내 주사를 통해 처리하였다. 모든 시험 작용제를 PBS로 희석시키고, 100 내지 200㎕의 부피로 주사하였다. 모든 치료용 항체는 바이오엑스셀사로부터의 제품이다. 시간 경과에 따라 종양 부피(mm3) 및 전체 생존율을 평가하였다. 생존 기준은 종양 궤양의 징후가 없는 1,700mm3 미만의 총 종양 부피를 포함하였다. 종양이 확립되고 이후에 거부된 완전 반응자를 적절한 도면에 열거한다. CT26 실험용 마우스의 코호트를 유세포 분석법을 사용하여 비장세포 및 종양 조직에서의 면역 프로파일링을 위해 제11일 내지 제13일에 안락사시켰다. 이들 마우스로부터 종양을 절제하고, 종양 해리 키트(멜테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotec), 카탈로그 번호 130-096-730)를 사용하여 해리시켰다. 종양을 절제하고, 해리 시약과 합한 다음, 면도기로 잘게 썰었다. 생성된 슬러리를 1.5㎖ 에펜토르프 튜브로 옮기고, 30분 동안 37℃ 진탕기에 두었다. 이 기간 동안, 슬러리를 10분마다 위아래로 피펫팅하여, 더 큰 조각을 부수었다. 해리된 세포를 100μm 스트레이너를 통해 균질화하여 종양 세포 및 침윤 면역 세포를 단리시켰다. 실험 군 크기는 각각의 도면 범례에 설명되어 있으며, 최소 2개의 독립적인 실험으로부터 유래된다.
CD4, CD8 및 IFNAR1 고갈 실험의 경우, 마우스를 적절한 범례에 설명된 스케줄로 100㎍의 항-CD4(클론 GK1.5), 100㎍의 항-CD8(클론 2.43) 또는 500㎍의 항-IFNAR1(클론 MAR1-5A3)의 복강내 주사를 통해 처리하였다(모든 항체는 바이오엑스셀사 제품임). 항체를 PBS로 희석시키고, 100㎕의 부피로 주사하였다. 고갈을 확인하기 위해 여러 시점에서 말초 혈액의 CD4, CD8 및 IFNAR1 집단을 평가하고, 미처리 마우스에 대해 정규화시켰다. 제7일, 제9일 및 제11일에 300㎍의 SIRPα-Fc-CD40L ± 항-IFNAR1로 처리한 WEHI3-보유 마우스로부터의 말초 혈액을 수집하고, RBC를 용해시키고, 생성된 단핵 세포(MNC)를 CD45, CD11c, CD20, CD4 및 CD8(바이오레전드사로부터의 항체)에 대한 형광적으로 접합된 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해서 평가하였다.
안전성 연구
비인간 영장류 연구
미경험 시노몰거스 마카크(2 내지 4년령)에게 0.1, 1, 10 및 40㎎/㎏ 용량으로 연속 5주 동안 매주 SIRPα-Fc-CD40L을 정맥내에 의해서 제공하였다. 혈액학 및 임상 화학 매개변수를 각각의 용량 전후에 정맥 천자에 의해 수집하였다. 순환 RBC에서의 CD47 발현을 유세포 분석법에 의해 평가하였다. MNC 및 혈청을 피콜 구배 분리를 사용하여 전혈에서 단리시켰다. 생성된 적혈구 펠릿을 항-CD47로 염색하고 전방/측면 산란을 사용하여 사전 게이팅하여 대부분의 RBC 집단을 단리시켰다. 모든 연구는 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 지침에 따라 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)에서 수행되었다.
실험 동물 지침
모든 동물 연구는 IACUC의 승인에 따라 수행되었으며 면허가 있는 수의사의 검토 및 승인을 받았다. 실험용 마우스를 매일 모니터링하고 고통의 징후가 나타나기 전에 CO2 질식 및 경추 탈구로 안락사시켰다.
통계 분석
GraphPad Prism을 사용하여 전체적으로 모든 그래프를 플로팅하고 생성시켰고; 오류 및 유의성을 자동으로 계산한다. 실험 복제물(N)을 도면 및 도면 범례에 표시한다. 달리 명시되지 않는 한, 플로팅된 값은 최소 3개의 구별되는 실험으로부터의 평균을 나타내며 오류는 SEM이다. 통계적 유의성(P 값)은 언페어드 t 검정 또는 다중 비교를 통한 일원 ANOVA을 사용하여 결정하였다. 유의한 P 값은 하나 이상의 *로 표지되며, *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; 및 ****, P < 0.0001을 나타낸다. Mantel-Cox 통계 시험을 사용하여 생존 곡선 간의 유의성을 결정하였다. P 값은 이들 수치에 대한 범례에 기록되어 있다.
실시예 2: SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 생산 및 특징규명
SIRPα 및 CD40L의 ECD를 인간 및 마우스 둘 다에 대한 항체 Fc 도메인을 통해 융합시켜 SIRPαECD-Fc-CD40LECD를 생성하고; 이하 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질로 지칭한다. 인실리코 구조 모델링은 인접 작제물의 각각의 개별 도메인이 천연 분자에 따라 접힐 것으로 예측하였는데, 이는 두 결합 기능의 보존을 시사하다(도 3A, 상단 패널). 그 다음 정제된 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 항-SIRPα, 항-Fc 및 항-CD40L을 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해서 각각의 개별 도메인의 존재에 대해서 분석하였는데(도 3A, 하단 패널), 이것은 비환원 조건 하에서 88.1kDa의 예측된 단량체 분자량에서 다량체를 형성한 글리코실화된 단백질을 나타낸다. 세제의 부재 하에서 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 천연 상태를 추가로 특징규명하기 위해, 전자 현미경을 수행하였는데, 이는 주요 피크 분획이 육량체 종(마우스 및 인간 모두에 대해 60% 이상)을 포함하고 있음을 입증하였고, 이것은 이전에 TNF 리간드 융합 단백질에 대해 기재된 것과 일관된다(도 3B)(Oberst et al. Potent immune modulation by MEDI6383, an engineered human OX40 ligand IgG4P Fc fusion protein. Mol Cancer Ther 17:1024-38 (2018)). 적은 피크 분획(약30% 내지 35%)이 또한 존재하였는데, 이것은 이중-결합 ELISA에서 동일한 활성을 갖는 사량체 단백질 복합체를 포함하였다(헥사머 EC50 = 24.21n㏖/ℓ, 사량체 EC50 = 33.3n㏖/ℓ, 참조 = 18.1n㏖/ℓ). 재조합 CD47에 대한 SIRPα의 동시 결합 및 재조합 CD40에 대한 CD40L의 동시 결합을 정량적으로 입증하기 위해 이중-결합 ELISA 검정을 개발하였다(도 3C). 개별 ELISA는 또한 재조합 인간 CD47, Fc 및 CD40에 대한 결합을 확인해주었다(도 9A). 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 결합 친화도 연구를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이 연구의 결과를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00013
상기 표에 나타낸 바와 같이, SPR을 사용한 결합 친화도 연구는 재조합 인간 CD47에 대해 0.628n㏖/ℓ의 친화도, 재조합 인간 CD40에 대해 4.74n㏖/ℓ의 친화도로 결합된 인간 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 FcγR1a, -2b 및 -3b에 대해서 검출 가능하지 않은 결합을 가지면서, FcRn에 대해 2.33n㏖/ℓ의 결합 친화도를 보존하였다는 것을 나타내었다(도 3D). 비인간 영장류에서 인간 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 시험을 정당화하기 위해, 재조합 시노몰거스 마카크 CD40(3.24n㏖/ℓ) 및 CD47(1.7n㏖/ℓ)에 대한 고친화도 결합이 또한 확인되었다. 마지막으로, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 재조합 CD47 및 CD40과 유사한 방식으로 천연 CD47 및 CD40과 상호작용함을 확인하기 위해, CHOK1-hCD47 및 CHOK1-hCD40 리포터 세포주를 개발하였다(도 9B 및 도 9C). 이러한 리포터 세포주를 사용한 유세포 분석 연구는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 CHOK1-CD47 세포(31.85n㏖/ℓ EC50) 및 CHOK1-CD40 세포(22.48n㏖/ℓ EC50)에 결합하지만 모체 CHOK1 세포에는 결합하지 않음을 확인해주었다(도 3D, 도 9B 및 도 9C). 기능적 ELISA는, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 재조합 CD47에 대한 결합에 대해 상업적으로 이용 가능한 단면 SIRPα-Fc 대조군을 능가하여, 상업용 CD47-차단 항체에 의해서 생성된 14n㏖/ℓ EC50과 대등한 22n㏖/ℓ의 EC50을 생성하였다는 것을 나타내었다(도 3E). 도 9D는 비-환원, 환원 및 PNGase F/환원 조건 하에서 mSIRPα, mFc 및 mCD40L을 검출하는 항체를 사용한 뮤린 SIRPα-Fc-CD40L 대용체의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 9E는 재조합 마우스 CD47 및 CD40에 대한 동시 결합을 입증하는, 뮤린 SIRPα-Fc-CD40L 대용체의 이중 기능성 ELISA를 나타낸다.
이러한 결과는 마우스 및 인간 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 작제되었음을 입증한다. 이들 단백질은 이들의 동족 수용체/리간드에 특이적으로 결합하고, 인간 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 비인간 영장류(시노몰거스 마카크) CD40 및 CD47에 고친화도로 결합하였다.
SL-172154의 792개 아미노산 서열(리더 서열 제외)은 올리고머 형태의 프로파일로 존재한다. 8개의 가능한 이황화물 쌍과 함께 아미노산 서열에 17개의 시스테인이 존재한다. N 및 O-연결된 글리코실화가 확인되었다. 아래 표는 번역 후 변형의 위치를 제공한다(글리코실화 프로파일 및 이황화 가교 포함).
Figure pct00014
산화, 탈아마이드화 및 석신산화와 함께 글리코실화 변형이 또한 검출되었다.
Figure pct00015
Asn159의 석신이미드 형성(2.6%)(펩타이드 T20)
Figure pct00016
Met644의 산화(14.3%)(펩티드 T71)
Figure pct00017
Asn283/Asn682/Asn688의 석신이미드 형성, 잔기(특정 펩타이드를 확인할 수 없음)
Figure pct00018
Asn688의 탈아마이드화(각각 1.9% 및 1.6%)(펩티드 T74).
하기 표는 RP-UPLC-UV/MSE를 통한 펩타이드 매핑을 나타낸다: 클리핑된 펩타이드 SL-172154 참조 표준 NB8670p33의 요약
Figure pct00019
하기 표는 RP-UPLC-UV/MSE를 통한 탈매핑을 나타낸다. 변형된 펩타이드 SL-172154 참조 표준 NB8670p33의 요약
Figure pct00020
Figure pct00021
하기 표는 비환원 분해에서 확인된 이황화 결합의 요약을 나타낸다.
Figure pct00022
감소된 분해로부터의 결과는 유리 Cys의 마커로서 알킬화된 Cys 잔기의 존재에 대해 검색되었다. 임의의 유리 Cys 잔기를 캡핑하기 위해 분해 전에 샘플에 알킬화 시약(IAM)을 첨가하였다. 알킬화된 Cys는 잔기 Cys709(5.6%), C725(4.3% 및 3.4%) 및 Cys749(49.9%)에서 관찰되었다. 2개의 스크램블드 이황화 결합, {C140 = C243 = C709/C725} 및 {C615 쇄1 = C615 쇄 2}이 검출되었다.
실시예 3: SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 SIRPα 도메인의 기능적 활성
SIRPα-Fc-CD40L의 올리고머 특성을 고려하여, 독립적으로 SIRPα 및 CD40L 도메인 둘 다의 기능성의 특징규명을 수행하였다. SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 이중기능성으로 인해, SIRPα 도메인 및 CD40L 도메인 둘 다의 활성을 독립적으로 특징규명하기 위해 별개의 기능적 검정을 활용하였다. SIRPα/CD47 축을 특징규명하는 데 사용되는 일반적인 시험관내 검정은 정제된 대식세포가 종양 세포를 식세포작용하는 능력을 분석한다(Oldenborg et al., Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science 288:2051-2054 (2000); Gardai et al., Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell 123:321-334 (2005)), particularly in the presence of ADCP-competent therapeutic antibodies. Chao et al., Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell 142:699-713 (2010)). 따라서, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 단독으로 그리고 표적 항체와 조합하여 다양한 종양 세포주의 대식세포-매개 식세포작용을 향상시켰는지 여부를 결정하기 위해 시험관내 종양 세포 식세포작용 검정을 확립하였다. 먼저, 여러 CD20+ 림프종(Toledo, Raji, Ramos) 세포주를 인간 단핵구-유래 대식세포와 함께 공배양하여 다음 3가지 유사한 접근법을 사용하여 식세포작용 평가에 적합한 플랫폼을 확인하였다; (i) 면역형광(IF); 표지된 대식세포와 표지된 종양 세포 사이의 신호 중첩을 시각화하기 위해, (ii) 유세포 분석법; 이중-양성 종양 및 대식세포의 구별되는 집단을 정량화하기 위해; 그리고 (iii) IncuCyte 플랫폼을 사용하여 살아있는 세포를 영상화함; 종양 세포의 대식세포-매개 식세포작용을 가시화 및 정량화하기 위해 - 종양 세포가 대식세포에 의해 삼켜지고 낮은 pH(pH 4.5 내지 5.5) 파고솜에 진입할 때만 형광을 나타내는 pH-감응성 마커(pHrodo)로 사전 코팅된 종양 세포를 사용함(도 4A 내지 도 4E, 및 도 10A). 3가지 접근법 모두 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 단일요법으로 식세포작용을 유도할 수 있고, 이러한 활성은 항체-의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP)-적격 항-CD20 작용제인 리툭시맙과 조합되는 경우 CD20+ 림프종 세포주에서 상당히 향상되었음을 나타낸다(도 4A 내지 도 4D, 및 도 10A). SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질/리툭시맙 조합물의 식세포작용-자극 활성은, Fc 수용체가 대식세포에서 차단되었을 때 부분적으로 저해되었지만; CD40-차단 항체로 대식세포를 전처리했을 때 활성이 영향을 받지 않았는데, 이는 CD40에 대한 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 결합이 종양 세포의 식세포작용에 기여하지 않는다는 것을 나타낸다.
종양 세포 상의 칼레티쿨린은 CD47/SIRPα 경로 봉쇄 후 종양 세포의 식세포작용을 촉진하는 식세포작용 신호 역할을 한다(Chao et al., Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47. Sci Transl Med 2:63ra94 (2010)). 칼레티쿨린 차단 펩타이드(CALR)를 사용하는 리툭시맙과 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 조합물에 의한 CD20+ B-세포 림프종 세포의 효율적인 식세포작용에 칼레티쿨린과 Fc 수용체 맞물림 둘 다가 필요하다는 것이 입증되었는데, 이는 Fc-적격 표적화 항체에 대한 Fc 상호작용의 중요성을 확인해 주고, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질에 의한 식세포작용의 개시가 SIRPα 도메인에 의해 유도되었다는 증거를 제공한다(도 4C). SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 유사한 단일요법 식세포작용 활성이 항-CD47의 CC2C6 클론에서 관찰되었다(도 4D). 두 작용제를 리툭시맙과 조합한 경우, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질/리툭시맙 조합물은 항-CD47/리툭시맙 조합물보다 훨씬 더 큰 식세포작용 활성을 자극하였는데, 이는 Fc 수용체 맞물림을 필요로 하는 2가지 개별 치료제에 의한 경쟁을 시사한다. 여러 ADCP-표적화 항체를 사용하여 다양한 인간 종양 세포주에서 식세포작용 활성을 조사하였다; EGFR+ 흑색종(A431 세포) 및 폐(HCC827 세포), EGFR- 만성 골수성 백혈병(CML; K562 세포) 및 HER2+ 유방(HCC1954HER2 HI 및 MCF7HER2 LOW 세포)을 사용하여 EGFR-(세툭시맙) 및 HER2-(트라스투주맙) 표적화 항체와의 조합을 용이하게 하였다. 림프종 세포주와 일관되게, 단일요법인 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 대식세포 식세포작용을 자극하였는데, 이는 표적화 항체와 조합되어 향상되었다(도 4E, 도 10B). 트라스투주맙은 HER2LOW 세포주 MCF7에서 식세포작용을 유도하지 않았지만; SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 적당한 단일요법 활성을 나타내었다. 단일요법 또는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질과 세툭시맙의 조합물을 사용한 경우 EGFR-음성 K562 세포에서는 식세포작용 활성이 관찰되지 않았다(도 4E). BMDM과 A20 또는 WEHI3 세포의 공배양물을 처리하기 위해 마우스 대용체인 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 사용하여 유사한 식세포작용 활성이 관찰되었다(도 9F). 흥미롭게도, mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 사용하면 마우스 CD47-차단 항체와 비교하여 더 높은 식세포작용 지수가 생성되었다.
마지막으로, SIRPα/CD47 저해제 또는 양 RBC에 대한 반응으로 비장 DC의 활성화 상태를 조사하는 생체내 마우스 검정(Keating, Rituximab: a review of its use in chronic lymphocytic leukaemia, low-grade or follicular lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma. Drugs 70(11):1445-76) (2010))을 사용하여, 양 RBC, CD47 차단 항체 또는 SIRPα 차단 항체의 정맥 투여가 모두 6시간 이내에 MHC-II에 대해 양성인 활성화된 CD4+ 및 CD8α+ DC 둘 다의 상향 조절을 자극하였다는 것을 관찰하였다(도 4F, 도 10D 내지 도 10F). 유사하게, 마우스 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 투여는 또한 비장 CD4+ 및 CD8α+에서 MHC-II, CD80 및 CD86의 표면 발현을 항체 처리군에서 관찰된 것보다 더 높은 비율로 전체 비장 DC에서 상향조절하였다.
종합하면, 이들 데이터는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 SIRPα 도메인이 높은 친화도로 CD47에 결합하고 단독으로 그리고 여러 ADCP-적격 항체의 존재 하에서 대식세포 매개 식세포작용을 강화함으로써 예상된 바와 같이 기능하였다는 것을 입증하였다.
실시예 4: SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 CD40L 도메인의 기능적 활성
CD40-의존성 교차-프라이밍에 대한 NIK 신호전달의 보고된 역할에 기초하여, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 CD40L 도메인의 기능성을 2개의 상이한 CD40-의존성 NFκB/NIK 리포터 시스템을 사용하여 평가하였다(도 5A 및 도 5B)(Senter and Sievers, The discovery and development of brentuximab vedotin for use in relapsed Hodgkin lymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma. Nat Biotechnol 30(7):631-637 (2012); de Weers et al., Daratumumab, a novel therapeutic human CD38 monoclonal antibody, induces killing of multiple myeloma and other hematological tumors. J Immunol 186(3):1840-1848 (2011)). 이러한 데이터는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 두 리포터 시스템에서 단면 CD40L 융합 단백질과 유사한 활성을 가짐을 나타낸다. SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 두 검정 모두에서 가용성 형태로 존재하였고, Fc 수용체 또는 다른 가교제는 존재하지 않았다. 이러한 맥락에서, CD40 효능제 항체는 Fc 수용체 맞물림을 제공할 수 있는 보조 세포가 없는 동일한 시스템에서 NIK/NFκB 활성을 자극할 수 없었다(도 5B). 이러한 데이터는 아마도 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 고유한 육량체 구성으로 인해서 가교의 부재 하에서 CD40 신호전달을 자극할 수 있음을 나타낸다. 마우스 CD40 효능제 항체와 비교하여 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 사용하여 유사한 관찰이 이루어졌다(도 9G).
SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 CD40 신호전달을 자극한다는 관찰은 CD40 신호전달에 의존하는 다른 세포 기능에 대한 조사를 촉발시켰다. CD40은 가교된 항-CD40 항체 또는 CD40L의 존재 하에서 인간 PBMC로부터 B 세포 및 CD4+ T 세포의 증식을 자극한다(Valle et al., Activation of human B lymphocytes through CD40 and interleukin 4. Eur J Immunol 19:1463-1467 (1989). Cayabyab et al., CD40 preferentially costimulates activation of CD4+ T lymphocytes. J Immunol 152:1523-1531 (1994)). 이 정보를 조사하기 위해, CD8+ T-세포-고갈된 PBMC를 총 33 내지 50명의 상이한 인간 공여자로부터 단리시키고, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 용량 적정 존재 하에 배양하였다(도 5C, 도 5D 및 도 11A). 배지-단독 음성 대조군 및 키홀 림펫 헤모사이아닌(KLH)-양성 대조군과 비교하여, 가용성 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 7일 배양에 걸쳐 인간 PBMC의 용량-의존적 증식을 자극하였고(도 5C), 이전에 CD40 활성화의 하류 이벤트로 보고된, 배양 제8일에 IL2-분비 PBMC 수의 용량-의존적 증가를 자극하였다(도 5D)(Kindler et al., Interleukin-2 secretion by human B lymphocytes occurs as a late event and requires additional stimulation after CD40 cross-linking. Eur J Immunol 25:1239-1243 (1995)).
SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 처리된 대식세포 Toledo 림프종 세포 공배양물로부터의 대식세포의 활성화 상태를 타입 I IFN 조절 유전자인 IFNα1 및 IFNβ1의 발현 및 대식세포 활성화 마커 CD80 및 CD86의 발현에 대해 qRT-PCR로 평가하였다(도 5E). SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질과 리툭시맙(항-CD20)을 사용한 단일요법은 단리된 대식세포에서 대식세포 활성화 및 타입 I IFN 유전자의 발현을 유도하였는데, 이는 두 작용제가 조합되었을 때 강화되었다. 유사한 결과가 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질, 리툭시맙 또는 조합물의 존재 하에서 Raji 세포와 공배양 후 단리된 대식세포에서 관찰되었다(도 11B).
대식세포 리포터 시스템(RAW264.7 ISG)을 사용하여 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질에 의한 타입 I IFN 반응의 활성화를 결정하였다. RAW264.7 ISG 세포를 A20 림프종 세포와 함께 공배양한 경우, mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 IFN 유전자-유도 루시페라제 활성의 증가를 자극하였다(도 5F). 상업적으로 입수 가능한 재조합 뮤린 Fc-CD40L이 또한 IFN 생산을 자극할 수 있었지만; 재조합 단면 SIRPα-Fc 단백질을 사용하면 유의한 신호가 관찰되지 않았는데, 이는 타입 I IFN-활성화가 CD40 맞물림 통해 종양 세포 식세포작용으로부터 하류에서 그리고 독립적으로 작용함을 나타낸다(도 5F). 뮤린 리툭시맙 대용체(항-CD20)는 일부 단일요법 IFN 반응을 유도하고 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질에서 관찰되는 단일요법 신호를 상당히 증폭시켰는데(도 5F), 이는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질과 표적화된 ADCP-적격 항체의 조합물에 대한 추가적인 근거를 제공한다. 이러한 조합물은 종양 세포 식세포작용을 증가시키고 APC를 활성화하고 항원 처리/제시를 향상시킬 수 있는 경로를 개시하는 능력을 가졌을 수 있다. 이러한 데이터는 SIRPα와 CD40L이 서로 물리적으로 연결될 때 타입 I IFN 반응의 크기가 향상될 수 있음을 나타내었다.
종합하며, 이들 데이터는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 CD40L 도메인이 정규 및 비정규 NFκB 신호전달 둘 다를 활성화하고 시험관내에서 인간 PBMC 증식 및 IL2 분비를 자극함을 입증한다. CD47 봉쇄는 종양 미토콘드리아 DNA의 흡수에 따라 타입 I IFN 반응을 유도하여 효과적인 항종양 면역을 유도한다.
시험관내 검정은 SIRPα 또는 CD40L 도메인의 생물학을 선호하는 경향이 있지만(즉, NFκB 리포터 검정은 주로 CD40 활성화에 대한 정보를 제공하는 반면 대식세포 식세포작용 검정은 주로 SIRPα/CD47 봉쇄에 대한 정보를 제공함), 생체내 연구는 이러한 작제물의 전체 기능성의 보다 완전한 식견을 제공하였다. 본 명세서에서 입증된 바와 같이, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 사용한 치료는 단독으로 또는 조합하여 사용된 CD40 및 CD47을 표적으로 하는 개별 항체와 비교하여 1차 및 2차 종양 둘 다의 거부반응을 상당히 개선시켰다. 강화된 항종양 면역의 관찰은 AH1-사량체-양성 CD8 T-세포 집단에 의해 완전히 설명될 수 없었지만; AH1 사량체에 의해 검출되지 않은 다른 클론형이 활성화되었을 가능성이 있으며, 이는 CD8-고갈이 항종양 면역을 제거하였다는 관찰과 일치한다. 또한 개별 종양 특이적 CD8+ T-세포 클론의 세포용해 활성이 향상되었을 가능성도 있으며, 이는 계속 조사 중이다.
또한, SIRPα-Fc-CD40L이 선천 면역 반응과 후천 면역 반응을 가교한다는 추가적인 증거가 항종양 면역이 생체 내에서 타입 I IFN과 T 세포 둘 모두에 의존한다는 관찰에 의해 제공되었다. CD47/SIRPα 봉쇄의 하류에서 T-세포 매개 면역 반응은 면역 관문에 의해 억제되었을 수 있다. 따라서, SIRPα-Fc-CD40L과 함께 이들 항체의 서열결정은 확립된 종양의 통제 및 거부에 극적인 영향을 미쳤다. 항-CTLA4 또는 항-PD-1로의 전처리는 종양 침윤 백혈구 내 CD40+ DC 및 B 세포의 비율을 증가시켜 CD40L이 또한 존재할 때 항종양 이점을 설명할 수 있는 가능한 기계론적 통찰력을 제공한다.
실시예 5: 뮤린 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 항종양 활성
동계 CT26 결장 종양 모델을 사용하여 뮤린 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 항종양 활성을 CD40 효능제 및 CD47-차단 항체와 비교하여 초기 평가를 제공하였다. 이식된 CT26 종양을 약 30mm3까지 성장시킨 후, CD40 효능제 항체(클론 FGK4.5), CD47-차단 항체(클론 MIAP301), 두 항체의 조합물 또는 뮤린 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 항체의 두 가지 용량의 고정 요법으로의 치료를 시작하였다. 비히클 대조군과 비교하여, CD40 효능제 및 CD47-차단 항체 둘 다는 종양 성장에서 보통의 확장을 제공하였고, CD40 효능제 단일요법군에서 마우스의 25%가 1차 종양을 완전히 거부하였다(도 6A). CD40과 CD47 항체의 조합물로 처리된 마우스는 종양 과성장이 더 오래 지연되고 마우스의 33%가 종양을 거부하는 것으로 관찰되었다. 항체 군과 비교하여, mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질로 처리된 마우스의 50%에서 완전한 종양 거부가 관찰되었으며, 이와 함께 나머지 마우스에서 상당한 종양 성장 지연 및 연장된 생존이 관찰되었다(Mantel-Cox 검정, 항-CD40/항-CD47 조합물군 대비 P = 0.0364), 1차 종양을 거부한 대다수의 마우스는 추가 치료 없이 2차 종양 시험감염을 거부하였다(60%; 도 6A). 항체 조합물 처리군 및 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 처리군 둘 다에서, 종양 및 비장 둘 다에서 AH1-사량체(CT26 종양 세포주에 의해 발현되는 gp70의 MHC H-2Ld-제한 면역우성 에피토프에 특이적임) CD8+ T 세포의 비율이 증가하였다(도 6B 및 도 12A). 이러한 T-세포 반응이 치료 효능에 기여하는지 여부를 결정하기 위해, CD4+ 및 CD8+ T-세포 항체-고갈 마우스에서 이러한 연구를 반복하였다(도 6C; 도 11A, 및 도 12B 내지 도 12D). CD4+ T 세포는 치료 효능에 부분적으로 필요한 반면, CD8+ 세포의 손실은 CD47-차단 항체와 유사한 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 치료 효능을 완전히 제거하였다(Liu et al., CD47 blockade triggers T cell-mediated destruction of immunogenic tumors. Nat Med 21:1209-1215 (2015); Xu et al., Dendritic cells but not macrophages sense tumor mitochondrial DNA for cross-priming through signal regulatory protein alpha signaling. Immunity 47:363-373 (2017)). mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 요법의 개시 후 CD8 고갈은 관찰된 항종양 효능을 부분적으로 제거하였다(도 12D).
CD47-차단 항체와 리툭시맙은 대식세포 매개 식세포작용을 강화하여 말기 미만성 거대 B세포 림프종 환자에서 이러한 조합물의 유망한 임상 효능과 상관관계가 있다(Advani et al., CD47 Blockade by Hu5F9-G4 and rituximab in non-Hodgkin's lymphoma. N Engl J Med 379:1711-1721 (2018); Sikic et al., First-in-human, first-in-class phase I trial of the anti-CD47 antibody Hu5F9-G4 in patients with advanced cancers. J Clin Oncol 37:946-53 (2019)). SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 리툭시맙의 활성을 강화시켰기 때문에, SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질과 리툭시맙에 대한 뮤린 대용체(항-마우스 CD20; 클론 AISB12)의 조합물을 2가지 CD20+ 마우스 종양 모델인 WEHI3 및 A20에서 조사하였다. 종양 모델 둘 다에서, 항-CD20 항체 또는 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 단일요법으로서 시험되었을 때 확립된 종양 성장의 유사한 제어가 관찰되었다(도 6D 및 도 6E). A20(P = 0.0302) 및 WEHI(P = 0.0166)에서의 항-CD20 단일요법 또는 A20(P = 0.0017) 및 WEHI(0.0095)에서의 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 단일요법과 비교하여 항-CD20 항체와 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 조합했을 때 종양 성장의 추가적인 제어가 관찰되었다. 다음으로, 생체내 설정에서 타입 I IFN 활성화에서 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질과 관련된 이전의 시험관내 연구 결과를 탐색하고자 하였고, 항종양 효능에 대한 IFNα 수용체 1(IFNAR1) 차단 항체의 영향을 평가하였다. IFNAR1의 항체-매개 봉쇄는 확립된 WEHI3 종양을 보유하는 마우스에서 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 단독 및 항-CD20과의 조합물 둘 다의 효능을 상당히 감소시켰다(도 6D 및 도 6E, 도 12C 및 도 12E). IFNAR1 봉쇄는 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 처리군에 가장 유의하게 영향을 미쳤으며, 항CD20 단일요법 처리된 마우스에서는 효과가 더 적었다. 이러한 관찰과 일치하게, 종양 제어는 항-CD20 단일요법과 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질과의 조합물 사이에서 유사하였는데, 이는 병용 이점의 대부분이 기능적 타입 I IFN 반응을 필요로 함을 나타낸다. mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 사용한 초기 치료 후 IFNAR1의 고갈이 시작되었을 때, 종양 성장에서 약간의 가속(WEHI3)이 존재하였거나 가속 전혀 존재하지 않았는데(A20), 이는 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질로 치료한 후에 IFNAR1 신호전달이 매우 빨리 기능한다는 것을 나타낸다(도 12E).
SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 효능은 면역-매개이기 때문에, 이론에 얽매이지 않고, CTLA4- 및 PD-1-차단 항체가 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 항종양 효과를 개선시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 이러한 조합물을 연구하기 위해, 대략 89mm3로 성장시킨 CT26 종양을 3가지 용량의 CTLA4- 또는 PD-1-차단 항체와 조합된 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 3회 용량의 고정 요법을 상이한 순서로 치료하였다(도 7A 및 도 7B). 조합물의 부가적 또는 상승작용적 효과를 관찰하기 위해 두 치료의 단일요법 활성이 감소되도록 더 큰 시작 종양 부피를 선택하였다. mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질은 항-CTLA4 또는 항-PD-1 항체와 유사한 항종양 효능을 가졌지만(도 7A 및 도 7B); SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질 항종양 효능은 항-CTLA4(58.8% 거부) 이후에 또는 항-PD-1(25% 거부) 이후에, 항-CTLA4(57% 거부)와 함께, 항-PD-1(50% 거부)과 함께 제공되었을 때 상당히 개선되었다(도 5A, 도 5B 및 도 13A 내지 도 13D). 1차 CT26 종양을 거부한 거의 모든 마우스는 미경험 마우스와 비교하여 2차 종양 시험감염을 거부하였다(도 13A 내지 도 13D).
PD-1 및 CTLA4의 면역관문 봉쇄는 CD40 효능제를 포함하여 면역-프라이밍 활성으로 면역치료제의 항종양 활성을 향상시킬 수 있다. PD-1/CTLA4 봉쇄와 mSIRPα-Fc-CD40L 사이의 상승작용에 대한 기계론적 근거를 이해하기 위해, CT26 종양을 접종 11일 후 항 PD-1 또는 항 CTLA4 처리 마우스로부터 절제하고, 종양-침윤 림프구의 표현형 분석을 수행하였다. 작용제 둘 다 CD40+ 수지상 세포/B 세포 및 CD3+ T 세포를 확장시켰고, MHC-I 및 MHC-II의 상향조절을 유도하였다(도 7C). 따라서, 항-PD-1 또는 항-CTLA4를 사용한 초기 치료는 CD40-발현 면역 세포의 확장을 자극하였는데, 이는 mSIRPa-Fc-CD40L을 사용한 개선된 반응성을 잠재적으로 설명한다. 면역관문 저해제 봉쇄는 CD47의 종양 표면 발현에 영향을 미치지 않았는데(도 7C 및 도 13E), 이는 면역관문 조합 상승작용이 식세포작용 활성과 독립적으로 기능함을 시사한다.
실시예 6: 비인간 영장류에서 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 안전성 및 활성
SIRPα/CD47 저해의 임상적 유용성을 둘러싼 열광은 적혈구 및 혈소판에서의 CD47 발현 및 연관된 용혈 및 혈소판 감소증 위험에 의해 다소 누그러졌다(Lin et al., TTI-621 (SIRPalphaFc), a CD47-blocking cancer immunotherapeutic, triggers phagocytosis of lymphoma cells by multiple polarized macrophage subsets. PLoS One 12:e0187262 (2017); Advani et al., CD47 Blockade by Hu5F9-G4 and rituximab in non-Hodgkin's lymphoma. N Engl J Med 379:1711-1721 (2018); Brierley et al., The effects of monoclonal anti-CD47 on RBCs, compatibility testing, and transfusion requirements in refractory acute myeloid leukemia. Transfusion 59:2248-2254 (2019)). 하기 표에 나타낸 바와 같이, 인간 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 Fc 도메인은 효과기 Fc 수용체에 결합하지 않는다:
주입 전과 비교하여 주입 후 NHP 혈청에서 각각의 제시된 사이토카인에 대한 최대 변화 배수
Figure pct00023
흥미롭게도, 시험관내 연구는 인간 또는 시노몰거스 마카크 적혈구에서 용혈의 증거를 밝히지 못했지만(도 14B); 이 질문을 시험하는 데 사용된 시험관내 시스템은 대식세포의 완전한 결여를 포함하여 상당한 한계가 있었다. 따라서, 관련 동물 모델에서 생체내 투여가 필요한 혈액학적 독성의 보다 정확한 측정이 필요하였다.
시노몰거스 마카크는 인간과 시노몰거스 마카크 사이의 CD47의 높은 상동성(98.69% 동일성) 및 CD47-특이적 Hu5F9-G4 항체에 대한 프라이밍 용량 전략의 개발로 인해 SIRPα/CD47 관련 독성을 평가하기 위한 관련 종이다(Liu et al., Pre-clinical development of a humanized anti-CD47 antibody with anti-cancer therapeutic potential. PLoS One 10:e0137345 (2015)). 인간 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질과 재조합 시노몰거스 CD47(1.7n㏖/ℓ 결합 친화도) 및 CD40(3.24n㏖/ℓ 결합 친화도)의 종 교차 반응성을 확인하였다. 다음으로, 시노몰거스 마카크에서 반복 투여 후 인간 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 안전성 및 활성을 시험하고자 하였다. 연구 과정에 걸쳐 최대 40㎎/㎏의 용량으로 인간 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질을 반복 주입한 후 용혈 또는 혈소판 감소증의 증거가 없었다(도 8A). 혈액학 매개변수의 경미한 감소가 나타났지만; 이러한 감소는 비히클 대조군에서도 주목되었으며, 절차 효과 및 반복 혈액 수집과 관련이 있을 가능성이 가장 컸다. 용량-의존적 수용체 점유율은 투여군에 걸쳐 관찰되었고 이는 주입 후 4시간에 80.96% ± 2.6%로 정점에 도달하였으며, 10 내지 40㎎/㎏ 용량군 사이에서 대략 동등하였다(도 8B 및 도 14A). CD47 점유율은 안정적이었고 주입 후 168시간에 평가했을 때 RBC CD47에서 62.78% ± 2.3% 점유율로 유지되었다(도 8B). 총 림프구 수의 용량-의존적 간헐적 변동이 또한 각각의 용량 전후에 관찰되었으며, 이는 순환 CD40+ 림프구에 대해 관찰된 투여 후 감소보다 더 낮은 크기였다(도 8C). CD40+ B 세포의 이러한 말초 감소는 mSIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질로 처리된 마우스의 혈액에서 관찰된 유사한 관찰과 일치하였다(도 14C 내지 도 14F). 마우스에서, B 세포의 감소는 용량 의존적이었고, 150 ㎍의 단일 복강내 용량에서 정체되었고, CD8+ DC의 상당한 증가를 동반하였다(도 14C 내지 도 14F). 마지막으로, 상기 표에 나타낸 바와 같이, 표적내 약력학적 생물학을 시사하는 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL6, IL15 및 IL23을 포함하는 인간 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질의 각각의 주입 후 시노몰거스 마카크의 다중 혈청 사이토카인/케모카인에서 용량-의존적 증가가 관찰되었다. 도 8D는 또한 투여 전 배경 수준과 비교한 투여 후 혈청 내 사이토카인 CCL2, IL-8 및 CXCL9의 수준을 나타낸다. 도 8E는 투여 전 배경 수준과 비교하여 투여 후 림프절에서 Ki67 양성 세포의 염색을 나타낸다. 이들 데이터는 SIRPα-Fc-CD40L 키메라 단백질이 대식세포-매개 종양 세포 식세포작용을 APC 활성화 및 항원 제시에 가교하기 위해 제안되는 전체 기전이 도 8F 내지 도 8I에 요약되어 있음을 나타낸다.
종합하면, 이러한 데이터는 CD47 봉쇄가 대식세포 매개 종양 세포 식세포작용을 향상시키는 효과적인 전략인 반면, CD47/SIRPα 봉쇄와 함께 조정된 방식으로 CD40 자극을 통해 타입 I IFN 반응을 향상시키는 것이 항종양 면역을 강력하게 향상시킨다는 것을 시사한다. SIRPα-Fc-CD40L이 용혈 또는 혈소판 감소증을 유발하지 않으면서 시노몰거스 마카크에서 다중 혈청 사이토카인 및 CD40+ B 세포 변연화의 용량 의존적 증가를 자극하였다는 관찰은 인간 암 환자에서 이 전략을 추가로 탐색할 정당성을 제공한다.
실시예 7: SL-172154에 의한 림프구 변연화
다음으로, SL-172154 처리 후 림프구의 국재화를 조사하였다. 시노몰거스 원숭이를 제1일, 제8일 및 제15일에 SL-172154로 제시된 용량으로 처리하였다. 투여 전 및 투여 후 림프구 수치를 3차 투여 전 제15일 및 3차 투여 대략 24시간 후 제16일에 얻었다. 도 15A는 제15일부터 제16일까지 투여 후 림프구 변연화를 나타낸다. 말초 혈액 림프구의 수는 제15일 투여 후 용량-의존적 방식으로 감소하는 것으로 관찰되었으며, (100 - ((제16일 림프구의 수)/(제15일 림프구의 수) x 100으로 플로팅한다. 각각의 데이터 지점은 개별 동물을 나타낸다. 도 15A에 나타낸 바와 같이, 대조군 원숭이와 비교하여 SL-172154-처리 원숭이에서 말초 혈액 림프구의 수가 용량 의존적으로 감소하였다. 이 데이터는 투여 후 림프구 변연화를 설명한다.
CD40+ 림프구 국재화에 대한 SL-172154의 효과를 시노몰거스 원숭이에서 추가로 조사하였다. 시노몰거스 원숭이에게 5회의 연속 주단위 용량 SL-172154를 투여하였다. 림프구를 면역조직화학에 의해 다양한 조직 절편에서 염색하였고, 현미경으로 가시화하였다. 도 15B는 미처리 및 SL-172154-처리 시노몰거스 원숭이로부터의 비장의 예시적인 조직화학적 분석을 나타낸다. 도 15B에 도시된 바와 같이, SL-172154-처리된 시노몰거스 원숭이로부터의 비장 절편은 미처리 시노몰거스 원숭이로부터의 폐 절편에 비해 더 높은 수준의 CD40+ 림프구를 나타내었다. 유사하게, SL-172154로 처리된 시노몰거스 원숭이는 말초 혈액에서 림프절 및 비장을 포함하는 2차 림프 기관으로 CD40+ 세포의 용량 의존적 이동을 갖는 것으로 관찰되었다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 효과는 5회 연속 주단위 용량에 대해서 0.1 내지 40㎎/㎏의 용량 범위에 걸쳐 SL-172154로 처리된 시노몰거스 원숭이에서 나타났다.
이 데이터는 SL-171154가 말초 혈액에서 림프절 및 비장을 포함한 2차 림프 기관으로 림프구의 용량 의존적 이동을 유도했음을 입증한다. 종합하면, 이러한 데이터는 CD40에 의해 유도되는 표적내 생물학의 증거를 제공하며 이러한 효과는 여러 혈청 사이토카인의 뚜렷한 변화를 동반하였다.
실시예 8: 정맥내로 투여된 SL-172154의 1[/2]상 용량 증량 및 용량 확장 시험 연구 설계
도 16은 SL-172154의 1상 임상 시험 설계의 개략도를 도시한 도면. 1상 임상 시험은 진행성 고형 종양 또는 림프종을 갖는 대상체에서의 최초의 인간, 공개, 다기관, 용량 증량 및 용량 확장 연구이다. 이 연구의 주요 목적은 SL-172154의 안전성, 내약성을 평가하는 것이다. 이 연구의 2차 목적은 SL-172154의 권장 2상 용량(RP2D), 약동학(PK), 항종양 활성 및 약력학적 효과를 평가하는 것이다. 수술, 방사선 또는 표준 전신 요법으로의 추가 치료가 불가능한 국소 진행성 또는 전이성 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 환자에서 종양내 투여된 SL-172154의 1상 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 2020년 11월부터 시작한 본 연구에 환자를 등록할 것으로 예상한다. 연구의 용량 증량 부분에서, 3명 이상의 환자가 0.003mg 내지 0.1mg 범위의 4가지 용량 수준 각각을 통해 등록될 것이다. 연구의 용량-증량 부분에 이어, 약력학적 종점을 추가로 평가하기 위해 6명의 환자를 용량-확장 코호트에 등록할 계획이다(도 16).
단일요법 RP2D의 확인 후, SL-172154를 세툭시맙과 조합하여 평가할 것이다. 3명 이상의 환자가 본 연구의 용량-증량 부분에서 4개의 용량 수준 각각을 통해 등록될 것이다. 연구의 용량-증량 부분에 이어 약력학적 종점을 추가로 평가하기 위해 6명의 환자가 등록될 것이다. 연구의 용량 증량 및 확장 부분에 걸쳐 총 약 1840명의 환자를 등록할 것으로 예상된다. 임상 시험 설계의 개요는 다음과 같다: 연구 설계는 도 16(각각 좌측 및 중간 패널)에 표시된 용량 증량 코호트 및 PD 코호트로 이루어진다. 이 연구에서 사용된 용량 수준(DL)은 0.1㎎/㎏ 내지 10.0㎎/㎏ 범위의 DL1에서 DL5까지였다. 구체적으로, DL1, DL2, DL3, DL4 및 DL5는 각각 0.1㎎/㎏, 0.3㎎/㎏, 1.0㎎/㎏, 3.0㎎/㎏ 및 10.0㎎/㎏이었다. SL-172154에 대한 권장 2상 용량(RP2D) 및 스케줄의 선택은 각각의 연구에서 용량 증량으로 치료된 환자 및 약력학적 코호트에서의 안전성, PK, PD 및 항종양 활성을 비롯한 데이터 전체에 기초할 것이다(도 16, 우측 패널)
도 17은 난소암에서 SL-172154의 초기 임상 개발 전략의 개략도를 도시한 도면이다. 본 연구에서 사용된 용량 수준(DL)은 0.1㎎/㎏ 내지 10.0㎎/㎏ 범위의 DL1에서 DL5까지였다. SL-172154의 1상[/2] 시험은 진행성 난소암, 나팔관암 및 원발성 복막암 환자에게 정맥내로 투여하였다. 환자는 백금계 요법에 실패하여 추가 백금 요법에 부적격한 환자를 포함할 것이다. 연구의 용량 증량 부분에서, 3명 이상의 환자가 0.1㎎/㎏ 내지 10.0㎎/㎏ 범위의 5가지 용량 수준 각각을 통해 등록될 것이다. 권장 2상 용량 또는 RP2D를 확인한 후, SL-172154를 난소암에 대한 2개의 확장 코호트에서 평가할 것인데: 하나는 ADCC/ADCP 적격 항체인 세툭시맙과의 조합물이고, 나머지 하나는 독소루비신과의 조합물이다. 본 발명자들은 연구의 용량 증량 및 확장 부분에 걸쳐 총 대략 70명의 환자를 등록할 것으로 예상한다.
도 18 및 도 19는 CSCC 및 HNSCC에서 SL-172154의 1상 임상 실험 설계의 개략도를 나타낸다. 연구의 용량 증량 부분에서, 3명 이상의 환자가 0.003mg 내지 0.1mg 범위의 4가지 용량 수준 각각을 통해 등록될 것이다. 국소 진행성 또는 전이성 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 환자에서 종양내 투여된 SL-172154의 1상 연구를 수행할 것이다. 환자는 수술, 방사선 또는 표준 전신 요법으로 추가 치료를 받을 수 없는 환자를 포함할 것이다. 연구의 용량 증량 부분에서, 3명 이상의 환자가 0.003mg 내지 0.1mg 범위의 4가지 용량 수준 각각을 통해 등록될 것이다. 연구의 용량-증량 부분에 이어, 약력학적 종점을 추가로 평가하기 위해 6명의 환자를 용량-확장 코호트에 등록할 것이다. 단일요법 RP2D의 확인 후, SL-172154를 세툭시맙과 조합하여 평가할 것이다. 3명 이상의 환자가 본 연구의 용량-증량 부분에서 4개의 용량 수준 각각을 통해 등록될 것이다. 연구의 용량-증량 부분에 이어, 본 발명자들은 약력학적 종점을 추가로 평가하기 위해 6명의 환자를 등록할 계획이다. 본 발명자들은 연구의 용량 증량 및 확장 부분에 걸쳐 총 약 45명의 환자를 등록할 것으로 예상한다. 각각의 1[/2]상 시험의 1차 목적은 정맥 주입 또는 종양내 주사에 의한 SL-172154의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 2차 목표는 약동학 프로파일, 면역원성 및 항종양 활성의 평가를 포함한다. 탐색적 목적은 수용체 점유율, 면역 표현형분석, 혈청 사이토카인을 포함하는 혈액 및 치료 전 및 치료 후 생검으로부터의 면역조직화학을 포함하는 종양에서의 약력학적 활성 평가를 포함한다.
이러한 용량 증량 연구를 시작하였다. 현재까지, 용량-제한 독성이 관찰되지 않았으며 더 높은 용량 수준의 코호트에서 계속 투여할 것이다. SL-172154는 CD47 저해 및 CD40 효능제 도메인 둘 다를 함유하기 때문에, 안전성 데이터는 이전 CD47 저해제 및 CD40 효능제와 관련하여 고려할 수 있다. CD47 측면에서는, 빈혈 또는 혈소판 감소증의 증거가 관찰되지 않았다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 관찰된 빈혈 또는 혈소판 감소증의 결여는 돌연변이된 Fc 영역으로 인한 것일 수 있다고 여겨진다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 효과기 기능이 결여된 Fc 도메인(예를 들어, 효과기 기능을 갖는 Fc 수용체(즉, FcRn 이외의 것)에 대한 감소된 결합)이 안전성 프로파일에 기여하는 것으로 여겨지는데, 이것은 임상 연구에서 빈혈 또는 혈소판 감소증을 보고한 활성 Fc 도메인을 갖는 다른 CD47 저해제로부터 SL-172154를 구별한다.
CD40 측면에서는, 다양한 CD40 효능제 항체가 20년에 걸쳐서 임상 시험 중이었지만, 저용량에서의 독성과 '종형' 용량-반응 곡선의 증거로 인해 진행이 반복적으로 방해를 받았다. 이러한 CD40 효능제 항체는 대략 0.3㎎/㎏의 용량에서 사이토카인 방출 증후군 및 간 기능 장애의 조합을 포함하여 용량-제한 독성을 나타냈다. 대조적으로, 하기에 논의된 결과에 나타난 바와 같이, SL-172154의 3㎎/㎏ 용량 수준 - CD40 효능제 항체보다 10배 더 높음 - 조차도 용량 제한 독성을 생성하지 않았다. 또한, 하기에 논의된 결과로부터, 현재까지 시험된 용량 범위에 대한 용량-반응 곡선은 투여된 SL-172154의 용량과 SL-172154에 대한 상응하는 약력학적 반응 사이에 증가하는 선형 관계를 나타냈다. 사이토카인 방출 증후군 또는 간 기능 장애가 관찰되었지만 CD40 맞물림 및 약력학적 활성의 고유한 증거가 관찰되었다.
실시예 9: 백금-내성 난소암 대상체에서 효능제 재지향 면역관문, SL-172154(SIRPα-Fc-CD40L)의 1상 용량 증량 연구
방법:
이러한 인간 최초의 1상 용량 증량 연구는 백금 내성 난소암, 나팔관암 및 원발성 복막암 환자에서 단일요법으로서 SL-172154를 평가하는 것이다. 목적은 안전성, 용량 제한 독성(DLT) 및 권장 2상 용량(RP2D), 약동학(PK) 매개변수, 약력학(PD) 효과 및 고형 종양 반응 평가 기준(RECIST)에 기초한 항종양 활성 평가를 포함한다.
결과
상당한 사전 치료를 많이 받은 14명의 환자(연령 중앙값, 67세)를 등록하고, SL-172154를 2가지 스케줄에 따라 4가지 용량 수준에 걸쳐 정맥(IV) 투여하여 치료하였다: 스케줄 1(제1일, 제8일, 제15일, 제29일, Q2주) 0.1, 0.3㎎/㎏ 및 스케줄 2(주단위) 0.3, 1.0, 3.0㎎/㎏. 임의의 등급(G)의 가장 공통적인 치료 관련(>20%) 이상 반응(AE)은 피로(n=7, 50%), 주입 관련 반응(IRR)(n=6, 43%), 메스꺼움(n=4, 29%) 및 식욕 감소(n=3, 21%)였다. 치료 관련 IRR(G1/G2)은 일반적으로 주입 종료 시점 근처 또는 주입 직후에 발생하였고; 전체 용량은 각각의 IRR 이벤트에서 전달될 수 있었고 IRR이 있는 환자의 후속 주입은 사전 의약품으로 관리되었다. G3 이상의 치료와 관련되지 않은 AE 또는 DLT는 발생하지 않았다. 백혈구 상의 CD47 수용체 점유율(RO)은 1.0 및 3.0㎎/㎏에서 90%에 근접하였다. CD47+ 적혈구에 대한 최소한의 결합이 모든 용량 수준에서 관찰되었다. B 세포 상의 CD40 RO는 0.1㎎/㎏ 이상의 용량에서 60%를 초과하였고, 1.0 및 3.0㎎/㎏ 용량에서 75% 내지 100%였다. SL-172154 주입 후 신속하고 일시적인 B 세포 및 단핵구 변연화가 관찰되었으며 IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC의 용량 의존적 증가와 일치하였다. 흥미롭게도, IL-6 또는 TNFα의 눈에 띄는 증가는 주목되지 않았고, IRR과 사이토카인 증가 사이에는 상관관계가 없었다. 평가 가능한 12명의 환자 중에서, 3명의 환자에서 안정적인 질환이 관찰되었다.
결론
SL-172154는 빈혈, 혈소판 감소증, 간 기능 장애 또는 사이토카인 방출 증후군의 증거 없이 내약성이 우수하였다. CD40 RO 및 활성화와 일치하는 고유한 혈청 사이토카인 시그니처가 관찰되었으며 이 시그니처는 반복 투여 후에도 유지된다. 용량 증량은 SL-172154의 6㎎/㎏ 및 10㎎/㎏ 용량까지 계속될 것이다. 놀랍게도 IL-6 및 TNFα의 결여는 전신 염증의 결여를 나타낸다.
상기에 논의된 바와 같이, 현재까지 시험된 용량 범위에 대한 용량-반응 곡선은 투여된 SL-172154의 용량과 SL-172154에 대한 상응하는 약력학적 반응 사이에 증가하는 선형 관계를 나타냈다.
실시예 10: 급성 골수성 백혈병(AML) 및 고위험 골수이형성 증후군(HR-MDS) 대상체에서 효능제 재지향 면역관문, SL-172154(SIRPα-Fc-CD40L)의 1상 용량 증량 연구
방법:
급성 골수성 백혈병(AML) 및 고위험 골수이형성 증후군(HR-MDS) 환자에서 단일요법으로 SL-172154를 평가하기 위한 1A/B상 임상 시험을 수행할 것이다. 본 연구의 목적은 단일요법 및 병용 요법 둘 다에서 SL-172154의 안전성, 내약성, 약동학, 항종양 활성 및 약력학적 효과를 평가하는 것을 포함한다. AML에서, SL-172154를 아자시티딘 및 베네토클락스 둘 다와 함께, 그리고 아자시티딘 단독과 함께 평가할 것이다. HR-MDS에서, SL-172154를 아자시티딘과 함께 평가할 것이다. 연구 설계를 도 20에 나타낸다. 간략하면, 1A상(SL-172154 단일요법)에서, SL-172154를 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 투여할 것이고, 안전성, 내약성, 약동학, 항종양 활성 및 약력학적 효과를 평가할 것이다. 1B상(병용 요법) 동안, SL-172154의 용량 증량을 투여된 환자에서 용량 수준 DL1 내지 DL3으로 수행할 것이다. 연구의 이 부분에서, 치료 미경험 AML 환자에게 SL-172154와 아자시티딘 및 베네토클락스의 조합물을 투여할 것이고; TP53 돌연변이 AML을 갖는 환자에게는 SL-172154와 아자시티딘의 조합물을 투여할 것이며; 고위험(IPSS-R(International Prognostic Scoring System-Revised)(IPSS-R)) MDS 최전선 환자에게는 SL-172154와 베네토클락스의 조합물을 투여할 것이다. 용량 증량 후, 용량 확장을 수행할 것이다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 간행물은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전에 단지 이의 개시내용에 대해 제공된다. 본 명세서에서의 어떤 것도 본 개시내용이 선행 발명에 의해 이러한 공개를 선행하는 자격이 없다는 인정으로서 해석되지 않아야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 모든 주제는 임의의 방식으로 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 임의의 개별 섹션의 내용은 모든 섹션에 동등하게 적용 가능할 수 있다.
등가물
본 발명은 이의 구체적인 실시형태와 관련하여 개시되어 있지만, 이것은 추가로 변형될 수 있고, 본 발명이 속한 분야에서 공지되거나 또는 통상의 실시로 존재하는 바와 같은, 상기 본질적인 특징에 적용될 수 있는 바와 같은, 그리고 상기에 기술되고 첨부된 청구범위의 범주에 따르는 바와 같은 본 개시내용으로부터의 이러한 일탈을 포함하여, 일반적으로 본 발명의 원칙에 따라서 본 출원이 본 발명의 임의의 변동, 사용 또는 개작을 포괄하는 것으로 의도된다고 이해될 것이다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 구체적으로 개시된 구체적인 실시형태에 대한 다수의 균등물을 인식하거나 확신할 수 있다. 이러한 균등물은 하기 청구범위의 범주에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Shattuck Labs, Inc. <120> CLINICAL DOSING OF SIRP1A CHIMERIC PROTEIN <130> WO/2022/061124 <140> PCT/US2021/050888 <141> 2019-03-14 <150> US 63/231,578 <151> 2021-08-10 <150> US 63/229,244 <151> 2021-08-04 <150> US 63/079,982 <151> 2020-09-17 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 2 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 2 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Thr Pro His 65 70 75 80 Ser Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 3 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 3 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 4 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 5 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 6 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 7 Ile Glu Gly Arg Met Asp 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 8 Gly Gly Gly Val Pro Arg Asp Cys Gly 1 5 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 9 Ile Glu Gly Arg Met Asp Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 10 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 11 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 12 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 13 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 14 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 16 Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Arg 20 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ser <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 18 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 19 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <220> <221> misc_feature <223> SEQ ID NO: 19 can be GS or GGS or LE <400> 19 Gly Ser 1 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 20 Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 21 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser 1 5 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 23 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro 20 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 24 Cys Pro Pro Cys 1 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 27 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 28 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 29 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 31 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 32 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 33 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 34 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 35 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 36 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 37 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 38 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 39 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 40 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ala <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 41 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala 20 <210> 42 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 42 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 20 25 <210> 43 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 43 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 44 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 45 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 46 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 47 Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 48 Gly Ser Glu Ser Gly 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 49 Gly Ser Glu Gly Ser 1 5 <210> 50 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 50 Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Glu Gly Ser Ser Ser 1 5 10 15 Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 51 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 51 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp 225 230 <210> 52 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 52 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Thr Pro His Ser Asp Trp Leu Ser 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp 225 230 <210> 53 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 53 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp 225 230 <210> 54 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 54 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp 225 230 <210> 55 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 55 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Thr Pro His Ser Asp Trp Leu Ser 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp 225 230 <210> 56 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 56 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp 225 230 <210> 57 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 57 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala 115 120 125 Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly 130 135 140 Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu 145 150 155 160 Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser 165 170 175 Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val 180 185 190 His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp 195 200 205 Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro 210 215 220 Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr 245 250 255 Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val 260 265 270 Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val 275 280 285 Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu 290 295 300 His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser 305 310 315 320 Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly 325 330 335 Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr 340 <210> 58 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 58 His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp 1 5 10 15 Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser 20 25 30 Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe 35 40 45 Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser 50 55 60 Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val 65 70 75 80 Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu 85 90 95 Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly 100 105 110 Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln 115 120 125 Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile 130 135 140 Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu 145 150 155 160 Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser 165 170 175 Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe 180 185 190 Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr 195 200 205 Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 210 215 <210> 59 <211> 792 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 59 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala 115 120 125 Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly 130 135 140 Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu 145 150 155 160 Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser 165 170 175 Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val 180 185 190 His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp 195 200 205 Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro 210 215 220 Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr 245 250 255 Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val 260 265 270 Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val 275 280 285 Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu 290 295 300 His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser 305 310 315 320 Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly 325 330 335 Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 340 345 350 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 355 360 365 Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 370 375 380 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 385 390 395 400 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 405 410 415 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 420 425 430 Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 435 440 445 Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr 450 455 460 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 465 470 475 480 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 485 490 495 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 500 505 510 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 515 520 525 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 530 535 540 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 545 550 555 560 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met 565 570 575 Asp His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu 580 585 590 Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg 595 600 605 Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly 610 615 620 Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn 625 630 635 640 Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His 645 650 655 Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala 660 665 670 Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn 675 680 685 Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala 690 695 700 Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe 705 710 715 720 Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu 725 730 735 Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln 740 745 750 Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val 755 760 765 Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe 770 775 780 Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 785 790 <210> 60 <211> 2436 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 60 atggaatgga gctgggtgtt cttgttcttc ctgtccgtga ccaccggcgt gcactcggag 60 gaggagctcc aggtcatcca gccggacaag tcggtgctcg tggccgccgg agaaactgcc 120 accctgaggt gcaccgcgac ctcgctgatt cccgtgggcc cgattcagtg gttccggggg 180 gccgggcctg gcagagaact gatctacaac cagaaggaag gccatttccc tcgcgtgact 240 actgtgtccg atcttactaa gcggaacaac atggacttca gcattaggat cggcaacatc 300 acccctgctg acgcgggaac ctactactgc gtcaagttca ggaaaggaag cccggacgac 360 gtggagttca agagcggggc gggcaccgaa ctgtccgtgc gcgccaagcc atccgcgccc 420 gtggtgtccg gacccgcagc cagagcaact ccgcagcaca ccgtgtcgtt cacttgcgaa 480 tcacacggat tctccccgcg cgatatcacg cttaagtggt tcaagaacgg gaacgaactg 540 agcgacttcc agaccaacgt ggaccccgtc ggagaaagcg tcagctactc cattcactcg 600 accgccaaag tggtgctgac cagggaggac gtgcatagcc aagtgatctg cgaggtcgcc 660 cacgtcactc tgcaaggaga tccgctgcgg ggaacagcca acctgtccga aactatccgc 720 gtgcctccca ccctggaagt gacccagcag cccgtccgag cggagaatca agtcaatgtg 780 acctgtcaag tccggaaatt ctaccctcaa cggctccagc tgacctggct ggaaaacgga 840 aacgtgtccc gcacggaaac cgcctcgacc gtgaccgaga acaaggacgg cacctacaac 900 tggatgtcct ggctcttggt gaacgtgtca gcccaccggg acgatgtcaa gctgacttgc 960 caagtggaac atgatgggca gccagctgtc agcaagagcc acgacctgaa ggtgtccgcg 1020 cacccgaagg aacagggttc gaatactgcc gccgaaaaca ctggtagcaa cgaacggaac 1080 atctactcta agtacggccc accttgccct ccctgcccgg cacctgaatt tctgggtgga 1140 ccctccgtgt ttcttttccc gcccaagcca aaggaccagt tgatgatctc ccgcactccg 1200 gaagtgacat gcgtggtggt ggacgtgtcc caggaagatc cggaagtgca gttcaattgg 1260 tacgtggatg gcgtggaggt ccataacgcc aagactaagc cgcgcgagga acagttcaat 1320 tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcatc aggactggct ctccggcaaa 1380 gagtacaagt gcaaggtgtc atccaagggt ctgccgtcgt caatcgaaaa gaccatttcc 1440 aatgccactg ggcagcccag agaacctcaa gtctacaccc tcccaccgtc ccaagaggaa 1500 atgaccaaga accaagtctc gctgacgtgt ctcgtgaagg gattctaccc atccgacatt 1560 gctgtggaat gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagactac ccctcccgtc 1620 ctggactccg acggttcctt cttcctttac tctcgcctca ccgtggataa gtcgcggtgg 1680 caggagggga acgtgttctc ctgctccgtc ctgcacgaag cattgcacaa ccactacacc 1740 cagaagtccc tgtcactgtc cctgggaaag attgagggtc ggatggatca tcggcgcctg 1800 gacaagatcg aggacgagcg gaacctccac gaggatttcg tgttcatgaa aaccatccag 1860 agatgcaaca ccggagagag aagcctgtcc ctgctcaact gcgaggaaat caagtcccag 1920 tttgaaggat ttgtgaagga cattatgctg aacaaggaag agactaagaa ggaaaactcc 1980 ttcgagatgc agaagggcga tcagaaccca cagatcgcgg cccacgtgat ctccgaggcc 2040 tcgtcaaaga ccacttcagt gctccaatgg gccgagaagg gttactatac catgagcaac 2100 aaccttgtga ccctggagaa cggaaagcag ctcaccgtga aaagacaggg actgtactat 2160 atctatgccc aagtcacctt ctgttcgaac cgcgaggcta gcagccaggc cccgttcatc 2220 gcctccctct gtttgaagtc gccggggcgg tttgaaagga ttctgctgag agctgcgaat 2280 acccattcgt ccgccaagcc ttgcggacag cagtcaatcc acctgggggg agtgttcgag 2340 ctgcagcctg gcgcgagcgt gttcgtcaac gtgaccgacc cctcccaagt gtctcacggc 2400 accggattca cttcgtttgg cctgctgaag ctgtaa 2436 <210> 61 <211> 811 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 61 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val 20 25 30 Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser 35 40 45 Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly 50 55 60 Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr 65 70 75 80 Thr Val Ser Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg 85 90 95 Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys 100 105 110 Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly 115 120 125 Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly 130 135 140 Pro Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu 145 150 155 160 Ser His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn 165 170 175 Gly Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu 180 185 190 Ser Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg 195 200 205 Glu Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu 210 215 220 Gln Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg 225 230 235 240 Val Pro Pro Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn 245 250 255 Gln Val Asn Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu 260 265 270 Gln Leu Thr Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala 275 280 285 Ser Thr Val Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp 290 295 300 Leu Leu Val Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys 305 310 315 320 Gln Val Glu His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu 325 330 335 Lys Val Ser Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu 340 345 350 Asn Thr Gly Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 355 360 365 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 370 375 380 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 385 390 395 400 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 405 410 415 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 420 425 430 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 435 440 445 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 450 455 460 Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 465 470 475 480 Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 485 490 495 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 500 505 510 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 515 520 525 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 530 535 540 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 545 550 555 560 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His 565 570 575 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu 580 585 590 Gly Arg Met Asp His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn 595 600 605 Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr 610 615 620 Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln 625 630 635 640 Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys 645 650 655 Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile 660 665 670 Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu 675 680 685 Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr 690 695 700 Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr 705 710 715 720 Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln 725 730 735 Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu 740 745 750 Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys 755 760 765 Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly 770 775 780 Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly 785 790 795 800 Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 805 810 <210> 62 <211> 342 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 62 Lys Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val 20 25 30 Gly Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp 50 55 60 Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val 65 70 75 80 Thr Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly 85 90 95 Ser Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val 100 105 110 Tyr Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp 115 120 125 Arg Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly 130 135 140 Phe Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu 145 150 155 160 Leu His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser 165 170 175 Tyr Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val 180 185 190 Asn Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser 195 200 205 Pro Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro 210 215 220 Thr Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn 225 230 235 240 Leu Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile 245 250 255 Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu 260 265 270 Thr Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val 275 280 285 Asn Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys 290 295 300 His Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe 305 310 315 320 Ala His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Asp Asn Asn 325 330 335 Ala Thr His Asn Trp Asn 340 <210> 63 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 63 Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu 1 5 10 15 Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr 20 25 30 Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys 35 40 45 Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val 50 55 60 His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 65 70 75 80 Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu 145 150 155 160 Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro 165 170 175 Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val 180 185 190 Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 64 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 64 His Arg Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp 1 5 10 15 Phe Val Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser 20 25 30 Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu 35 40 45 Val Lys Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe 50 55 60 Glu Met Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val 65 70 75 80 Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys 85 90 95 Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys 100 105 110 Gln Leu Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln Val 115 120 125 Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val 130 135 140 Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys 145 150 155 160 Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val 165 170 175 His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val 180 185 190 Asn Val Thr Glu Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser 195 200 205 Phe Gly Leu Leu Lys Leu 210 <210> 65 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 65 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala 115 120 125 Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly 130 135 140 Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu 145 150 155 160 Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser 165 170 175 Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val 180 185 190 His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp 195 200 205 Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro 210 215 220 Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr 245 250 255 Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val 260 265 270 Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val 275 280 285 Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu 290 295 300 His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser 305 310 315 320 Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly 325 330 335 Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr 340 <210> 66 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 66 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 67 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 67 gcggcgctcg aggccaccat gtggcccctg gtagcgg 37 <210> 68 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 68 actagcggta ccccatcact tcacttcagt tattccacaa atttc 45 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 69 gcggcgctcg aggccaccat gtggcccttg gcggc 35 <210> 70 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 70 actagcggta cctcacctat tcctaggagg ttggatagtc c 41 <210> 71 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 71 gcggcgctcg aggccaccat ggtgtctttg cctcggctg 39 <210> 72 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer <400> 72 actagcggta cctcagacca ggggcctcaa g 31

Claims (151)

  1. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 인간 대상체에게 하기 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하되:
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단,
    여기서,
    (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 도메인과 상기 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 상기 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고,
    (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인인, 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 0.0001㎎/㎏인, 암을 치료하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여되는 키메라 단백질의 용량은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏인, 암을 치료하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 초기 용량으로 투여되고, 상기 키메라 단백질은 1회 이상의 후속 투여로 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 초기 용량은 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6, 약 8 또는 약 10㎎/㎏ 중 하나인, 암을 치료하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 1회 이상의 후속 투여는 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6.0 또는 약 10㎎/㎏ 중 하나 이상의 용량을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 용량은 상기 후속 투여 중 적어도 하나에 대한 용량보다 적은, 암을 치료하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 초기 용량은 상기 후속 투여 각각에 대한 용량보다 적은, 암을 치료하는 방법.
  9. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 용량은 상기 후속 투여 중 적어도 하나에 대한 용량과 동일한, 암을 치료하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 초기 용량은 상기 후속 투여 각각에 대한 용량과 동일한, 암을 치료하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 1회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 2회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 3회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고, 그 다음 상기 키메라 단백질은 약 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고, 그 다음 상기 키메라 단백질은 약 1개월당 2회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고, 그 다음 상기 키메라 단백질은 약 2주마다 1회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 4회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 약 주 1회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 진행형 고형 종양 또는 림프종을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(cutaneous squamous cell carcinoma: CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck: SCCHN)으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 CD172a(SIRPα) 리간드에 결합할 수 있는, 암을 치료하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 CD40 수용체에 결합할 수 있는, 암을 치료하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 CD40L의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 선택적으로 상기 링커는 인간 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하며,
    (c) 상기 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 더 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 5 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 더 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  32. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.2% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.4% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.6% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.8% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 백금계 요법에 실패하였고, 선택적으로 추가 백금 요법에 부적격한, 암을 치료하는 방법.
  41. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 동시 화학요법, 면역요법, 생물학 또는 호르몬 요법을 제공받고 있지 않고/않거나 상기 인간 대상체는 표준 요법을 제공받은 적이 있거나, 표준 요법에 내약성이었거나, 표준 요법에 부적격이고/이거나 상기 암은 표준 치료인 것으로 간주되는 승인된 요법이 없는, 암을 치료하는 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한, 키메라 단백질.
  43. 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.
  44. 제42항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.
  45. 제44항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.
  46. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (i) 상기 인간 대상체에게 하기 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계로서:
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단,
    여기서,
    (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 도메인과 상기 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 상기 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고,
    (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인인, 상기 투여하는 단계;
    및
    (ii) 제2 치료제를 투여하는 단계
    를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  47. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단의 일반 구조의 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하되,
    (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 도메인과 상기 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 상기 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고,
    (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고;
    상기 대상체는 제2 치료제로 치료 중이거나 치료된 적이 있는, 암을 치료하는 방법.
  48. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제2 항암 치료제를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 대상체는 하기 일반 구조의 키메라 단백질로 치료 중이거나 치료된 적이 있고,
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단
    여기서,
    (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 도메인과 상기 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 상기 링커는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고,
    (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인인, 암을 치료하는 방법:
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 상기 제2 치료제 이전에 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  50. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 치료제는 상기 키메라 단백질 이전에 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  51. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 치료제 및 상기 키메라 단백질은 실질적으로 함께 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 치료제는 항체 및 화학치료제로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 항체는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)이 가능한, 암을 치료하는 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 항체는 세툭시맙, 리툭시맙, 오비누투주맙, Hul4.18K322A, Hu3F8, 디누툭시맙 및 트라스투주맙으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  55. 제52항에 있어서, 상기 항체는 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)이 가능한, 암을 치료하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 항체는 세툭시맙, 다라투쿠맙, 리툭시맙 및 트라스투주맙으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  57. 제52항에 있어서, 상기 항체는 암종배아 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), EGFR, HER-2, 상피 세포 접착 분자(EpCAM) 및 인간 상피 뮤신-1, CD20, CD30, CD38, CD40 및 CD52로부터 선택된 분자에 결합할 수 있는, 암을 치료하는 방법.
  58. 제52항에 있어서, 상기 항체는 EGFR에 결합할 수 있는, 암을 치료하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 항체는 Mab A13, AMG595, 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux, C225), 파니투무맙(panitumumab)(ABX-EGF, Vectibix), 데파툭시주맙(depatuxizumab)(ABT 806), 데파툭시주맙(depatuxizumab), 마포도틴, 둘리고투주맙(duligotuzumab)(MEHD7945A, RG7597), 푸툭시맙(Futuximab)(Sym004), GC1118, 임가투주맙(imgatuzumab)(GA201), 마투주맙(matuzumab)(EMD 72000), 네시투무맙(necitumumab)(Portrazza), 니모투주맙(nimotuzumab)(h-R3), 아니투무맙(anitumumab)(Vectibix, ABX-EGF), 잘루투무맙(zalutumumab), humMR1 및 토무조툭시맙(tomuzotuximab)으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  60. 제52항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 세툭시맙인, 암을 치료하는 방법.
  61. 제52항에 있어서, 상기 화학치료제는 안트라사이클린인, 암을 치료하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin) 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  63. 제52항에 있어서, 상기 화학치료제는 독소루비신인, 암을 치료하는 방법.
  64. 제46항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여되는 키메라 단백질의 용량은 적어도 0.0001㎎/㎏인, 암을 치료하는 방법.
  65. 제46항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여되는 키메라 단백질의 용량은 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏인, 암을 치료하는 방법.
  66. 제46항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 초기 용량으로 투여되고, 상기 키메라 단백질은 1회 이상의 후속 투여로 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 초기 용량은 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6.0 또는 약 10㎎/㎏ 중 하나인, 암을 치료하는 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 1회 이상의 후속 투여는 약 0.0001, 약 0.001, 약 0.003, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 6.0 또는 10㎎/㎏ 중 하나 이상의 용량을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 용량은 상기 후속 투여 중 적어도 하나에 대한 용량보다 적은, 암을 치료하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 초기 용량은 상기 후속 투여 각각에 대한 용량보다 적은, 암을 치료하는 방법.
  71. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 용량은 상기 후속 투여 중 적어도 하나에 대한 용량과 동일한, 암을 치료하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 초기 용량은 상기 후속 투여 각각에 대한 용량과 동일한, 암을 치료하는 방법.
  73. 제46항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 1회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  74. 제46항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 2회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  75. 제46항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 3회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고, 그 다음 상기 키메라 단백질은 약 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고, 그 다음 상기 키메라 단백질은 약 1개월당 2회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 먼저 3주 동안 주 1회 투여되고, 그 다음 상기 키메라 단백질은 약 2주마다 1회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  79. 제46항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 적어도 약 1개월에 4회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  80. 제46항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 약 주 1회 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  81. 제46항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 진행형 고형 종양 또는 림프종을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  82. 제46항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  83. 제46항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 CD172a(SIRPα) 리간드에 결합할 수 있는, 암을 치료하는 방법.
  84. 제46항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 CD172a(SIRPα)의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  85. 제46항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 CD40 수용체에 결합할 수 있는, 암을 치료하는 방법.
  86. 제46항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 CD40L의 세포외 도메인 중 실질적으로 전부를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  87. 제46항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고, 선택적으로 상기 링커는 인간 IgG4로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  88. 제46항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  89. 제46항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  90. 제46항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  91. 제46항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 제1 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 제2 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하며,
    (c) 상기 링커는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  92. 제46항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 더 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  93. 제46항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 5 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 더 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  94. 제46항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.2% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.4% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.6% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61과 적어도 약 99.8% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 서열번호 59 또는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  102. 제46항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 백금계 요법에 실패하였고, 선택적으로 추가 백금 요법에 부적격한, 암을 치료하는 방법.
  103. 제46항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 동시 화학요법, 면역요법, 생물학 또는 호르몬 요법을 제공받고 있지 않고/않거나 상기 인간 대상체는 표준 요법을 제공받은 적이 있거나, 표준 요법에 내약성이었거나, 표준 요법에 부적격이고/이거나 상기 암은 표준 치료인 것으로 간주되는 승인된 요법이 없는, 암을 치료하는 방법.
  104. 암 치료 효능의 평가를 필요로 하는 대상체에서 암 치료 효능을 평가하는 방법으로서,
    상기 대상체는 암을 앓고 있고, 상기 방법은,
    (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 상기 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고;
    상기 키메라 단백질은 하기 일반 구조식을 가지며:
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단,
    여기서,
    (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 도메인과 상기 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 상기 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며,
    (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인인, 상기 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    및
    (ii) 상기 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및
    (iii) 상기 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 상기 대상체에게 상기 키메라 단백질을 투여하는 단계
    를 포함하는, 암 치료 효능을 평가하는 방법.
  105. 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법으로서,
    (i) 일정 용량의 키메라 단백질을 제공받은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 상기 용량은 약 0.03㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이고;
    상기 키메라 단백질은 하기 일반 구조식을 가지며:
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단,
    여기서,
    (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 도메인과 상기 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 상기 링커는 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하며,
    (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인인, 상기 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (ii) 상기 생물학적 샘플에 대한 검정을 수행하여 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 사이토카인의 수준 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및
    (iii) 상기 대상체에서 CCL2, CXCL9, CXCL10, IFNα, IL15, IL23, IL-12, MCP-1, MIP-1β, MIP-1α 및 MDC로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준 및/또는 활성이 증가한 경우 상기 대상체를 상기 키메라 단백질을 사용한 치료를 위해서 선택하는 단계
    를 포함하는, 대상체를 암에 대한 요법을 사용한 치료를 위해서 선택하는 방법.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 상기 암은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택되는, 방법.
  107. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 누액, 눈물, 골수, 혈액, 혈액 세포, 복수, 조직 또는 세침 생검 샘플, 세포 함유 체액, 자유 부유 핵산, 가래, 타액, 소변, 뇌척수액, 복막액, 흉수, 대변, 림프액, 부인과액(gynecological fluid), 피부 면봉, 질 면봉, 구강 면봉, 비강 면봉, 관 세척액 또는 기관지 폐포 세척액으로부터 선택된 세정액 또는 세척액, 흡인물, 스크레이핑, 골수 표본, 조직 생검 시편, 수술 시편, 대변, 다른 채액, 분비물 및/또는 배설물 및/또는 이로부터의 세포로부터 선택된 체액인, 방법.
  108. 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 신선한 조직 샘플, 동결 종양 조직 시편, 배양 세포, 순환 종양 세포 또는 폼알린 고정 파라핀 포매 종양 조직 시편인, 방법.
  109. 제104항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 난소암, 나팔관암, 복막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC) 및 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)으로부터 선택된 종양으로부터 유래된 종양 샘플인, 방법.
  110. 제104항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 스크레이프(scrape), 면봉 또는 생검으로부터 선택된 기술에 의해서 얻어지는, 방법.
  111. 제104항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 브러시, (면) 면봉, 숟가락, 헹굼액/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘로 구멍을 뚫거나 수술 기구를 사용하여 얻어지는, 방법.
  112. 제104항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인의 수준 및/또는 활성은 RNA 서열결정, 면역조직화학적 염색, 웨스턴 블로팅, 세포내 웨스턴, 면역형광 염색, ELISA 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 이들의 조합에 의해 측정되는, 방법.
  113. 제104항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 상기 샘플을 하나 이상의 사이토카인에 특이적으로 결합하는 작용제와 접촉시킴으로써 측정되는, 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토카인에 특이적으로 결합하는 작용제는 항체 또는 이의 단편인, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 항체는 재조합 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체 또는 이의 단편인, 방법.
  116. 제104항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인의 수준 및/또는 활성은 샘플을 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 작용제와 접촉시킴으로써 측정되는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 작용제는 핵산 프라이머 또는 프로브인, 방법.
  118. 제104항 및 제106항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 진단, 예후 또는 치료에 대한 반응을 포함하는, 방법.
  119. 제104항 및 제106항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 평가는 대상체를 고위험군 또는 저위험군으로 분류하는 정보를 제공하는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 고위험 분류는 높은 수준의 암 공격성을 포함하되, 상기 공격성은 높은 종양 등급, 낮은 전체 생존율, 높은 전이 가능성 및 공격성을 나타내는 종양 마커의 존재 중 하나 이상을 특징으로 하는, 방법.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 저위험 분류는 낮은 수준의 암 공격성을 포함하되, 상기 공격성은 낮은 종양 등급, 높은 전체 생존율, 낮은 전이 가능성 및 공격성을 나타내는 종양 마커의 부재 및/또는 감소 중 하나 이상을 특징으로 하는, 방법.
  122. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저위험 또는 고위험 분류는 신보조 요법(neoadjuvant therapy)의 보류를 나타내는, 방법.
  123. 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저위험 또는 고위험 분류는 보조 요법의 보류를 나타내는, 방법.
  124. 제119항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저위험 또는 고위험 분류는 키메라 단백질의 투여를 계속한다는 것을 나타내는, 방법.
  125. 제119항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저위험 또는 고위험 분류는 키메라 단백질의 투여를 보류한다는 것을 나타내는, 방법.
  126. 제104항 및 제106항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 키메라 단백질의 투여에 대한 긍정적 반응 및/또는 이로부터의 유익을 예측하는, 방법.
  127. 제104항 및 제106항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 키메라 단백질의 투여에 대한 부정적인 또는 중성 반응 및/또는 이로부터의 유익을 예측하는, 방법.
  128. 제104항 및 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 키메라 단백질의 투여를 계속하거나 보류하는 정보를 제공하는, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 평가는 키메라 단백질의 투여를 계속하는 정보를 제공하는, 방법.
  130. 제128항 또는 제129항에 있어서, 상기 평가는 키메라 단백질의 용량을 변화시키는 정보를 제공하는, 방법.
  131. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 상기 키메라 단백질의 용량을 증가시키는 정보를 제공하는, 방법.
  132. 제128항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 상기 키메라 단백질의 용량을 감소시키는 정보를 제공하는, 방법.
  133. 제128항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 상기 키메라 단백질의 투여 요법을 변화시키는 정보를 제공하는, 방법.
  134. 제128항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 상기 키메라 단백질의 투여 빈도를 증가시키는 정보를 제공하는, 방법.
  135. 제104항 및 제106항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 신보조 요법을 투여하는 정보를 제공하는, 방법.
  136. 제104항 및 제106항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 신보조 요법을 중단하는 정보를 제공하는, 방법.
  137. 제104항 및 제106항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 보조 요법을 투여하는 정보를 제공하는, 방법.
  138. 제104항 및 제106항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 신보조 요법을 변화시키는 정보를 제공하는, 방법.
  139. 제104항 및 제106항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 보조 요법을 변화시키는 정보를 제공하는, 방법.
  140. 제104항 및 제106항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 보조 요법을 중단하는 정보를 제공하는, 방법.
  141. 제104항 및 제106항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 신보조 화학요법에 대한 긍정적인 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 신보조 화학요법에 대한 무반응 및/또는 이로부터의 유익의 부족을 예측하는, 방법.
  142. 제104항 및 제106항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 신보조 화학요법에 대한 부정적인 반응 또는 중성 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 신보조 화학요법에 대한 무반응 및/또는 이로부터의 유익의 부족을 예측하는, 방법.
  143. 제104항 및 제106항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 보조 화학요법에 대한 긍정적인 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 보조 화학요법에 대한 무반응 및/또는 이로부터의 유익의 부족을 예측하는, 방법.
  144. 제104항 및 제106항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가는 보조 화학요법에 대한 부정적인 반응 또는 중성 반응 및/또는 이로부터의 유익 또는 보조 화학요법에 대한 무반응 및/또는 이로부터의 유익의 부족을 예측하는, 방법.
  145. 제123항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신보조 요법 및/또는 보조 요법은 화학치료제인, 방법.
  146. 제123항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신보조 요법 및/또는 보조 요법은 세포독성제인, 방법.
  147. 제123항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신보조 요법 및/또는 보조 요법은 면역관문 저해제인, 방법.
  148. 제1항 내지 제41항 및 제46항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 정맥내 주입에 의해서 투여되는, 방법.
  149. 제1항 내지 제41항 및 제46항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 종양내 주사에 의해서 투여되는, 방법.
  150. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 인간 대상체에게 하기 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하되:
    N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단,
    여기서,
    (a)는 인간 신호 조절 단백질 α(CD172a(SIRPα))의 세포외 도메인을 포함하는 제1 도메인이고,
    (b)는 상기 제1 도메인과 상기 제2 도메인을 연결하는 링커이고, 상기 링커는 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고/하거나 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함하고,
    (c)는 인간 CD40 리간드(CD40L)의 세포외 도메인을 포함하는 제2 도메인이고,
    상기 키메라 단백질은 약 0.3㎎/㎏ 초과의 용량으로 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  151. 제150항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 약 1.0㎎/㎏ 초과의 용량으로 투여되는, 암을 치료하는 방법.
KR1020237012931A 2020-09-17 2021-09-17 Sirp1a 키메라 단백질의 임상적 투여 KR20230088722A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063079982P 2020-09-17 2020-09-17
US63/079,982 2020-09-17
US202163229244P 2021-08-04 2021-08-04
US63/229,244 2021-08-04
US202163231578P 2021-08-10 2021-08-10
US63/231,578 2021-08-10
PCT/US2021/050888 WO2022061124A1 (en) 2020-09-17 2021-09-17 Clinical dosing of sirp1a chimeric protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230088722A true KR20230088722A (ko) 2023-06-20

Family

ID=80775682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237012931A KR20230088722A (ko) 2020-09-17 2021-09-17 Sirp1a 키메라 단백질의 임상적 투여

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4214222A1 (ko)
JP (1) JP2023541996A (ko)
KR (1) KR20230088722A (ko)
AU (1) AU2021342487A1 (ko)
CA (1) CA3192385A1 (ko)
IL (1) IL301454A (ko)
MX (1) MX2023003142A (ko)
WO (1) WO2022061124A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023213290A1 (en) * 2022-05-06 2023-11-09 Biosion Inc. Recombinant fusion protein targeting cd40 and cd47

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190367579A1 (en) * 2017-02-27 2019-12-05 Shattuck Labs, Inc. Tigit- and light-based chimeric proteins
WO2020047328A1 (en) * 2018-08-29 2020-03-05 Shattuck Labs, Inc. Combination therapies comprising pd-1-based chimeric proteins

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021342487A1 (en) 2023-05-25
MX2023003142A (es) 2023-05-17
JP2023541996A (ja) 2023-10-04
IL301454A (en) 2023-05-01
EP4214222A1 (en) 2023-07-26
WO2022061124A1 (en) 2022-03-24
CA3192385A1 (en) 2022-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7153626B2 (ja) 抗ヒト４－１ｂｂ抗体およびその使用
JP7459058B2 (ja) Ｃｄ１３７／ｈｅｒ２二重特異性物質とｐｄ－１系阻害物質とを含む併用療法およびその使用法
CN111511766A (zh) 修饰的抗SIRPa抗体及其应用
JP7474235B2 (ja) ＯＸ４０抗原結合部位を含むＦｃ結合断片
JP2022522479A (ja) 併用療法
KR20230088722A (ko) Sirp1a 키메라 단백질의 임상적 투여
AU2022387678A1 (en) Sirp1a - and cd40l-based chimeric proteins
CN112771067A (zh) 包含基于SIRPα的嵌合蛋白的组合疗法
WO2022117569A1 (en) A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
CN116847866A (zh) 使用基于tigit和基于light的嵌合蛋白治疗癌症的方法
JP2020508636A (ja) ＩＦＮ−γ誘導性制御性Ｔ細胞転換性抗癌（ＩＲＴＣＡ）抗体およびその使用
JP2023552093A (ja) ガンマデルタｔ細胞調節剤を同定する方法
CN116670175A (zh) Sirp1a嵌合蛋白的临床给药
JP2022518441A (ja) ヒトｃｄ１３７に結合する抗体の製剤およびその使用
US20240018248A1 (en) An ltbr agonist in combination therapy against cancer
KR20230129229A (ko) Tigit- 및 light-기반 키메라 단백질을 이용한 암 치료방법
WO2022212845A2 (en) Pd-1- and ox40l-based chimeric proteins
CN117120073A (zh) 鉴定γ/δT细胞调节剂的方法
KR20240058149A (ko) Vista 항원-결합 분자를 사용한 암의 치료 및 예방
CN117377687A (zh) 抗癌组合疗法中的ltbr激动剂
EA042790B1 (ru) АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С VISTA ПРИ КИСЛОМ pH