MX2010010198A - Metodos para tratamiento de inflamacion. - Google Patents

Metodos para tratamiento de inflamacion.

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cancer
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Christian Weber
Juergen Bernhagen
Joshua Robert Schultz
Benedikt Vollrath
Alma Zernecke
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Carolus Therapeutics Inc
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Abstract

Lo que se divulga aquí, en ciertas realizaciones, es un método para tratar un desorden mediado por MIF. En algunas realizaciones, el método comprende administrar un agente activo que inhibe (i) el enlazamiento de MIF a CXCR2 y CXCR4 y/o (ii) activación por MIF de CXCR2 y CXCR4; (iii) la capacidad de MIF para formar un homomultimero; o una combinación de los mismos.

Description

METODOS PARA TRATAMIENTO DE INFLAMACION CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene como campo de aplicación los métodos para tratar desórdenes mediados por MIF.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ciertas condiciones inflamatorias son caracterizadas, en parte, por la migración de linfocitos hacia el tejido afectado. La migración de linfocitos induce el daño de los tejidos y exacerba las condiciones inflamatorias. Muchos linfocitos siguen un gradiente MIF hacia el tejido afectado. En general, el MIF, interactúa con los receptores CXCR2 y CXCR4 de los leucocitos para disparar y mantener la migración de los leucocitos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se describe aquí, en ciertas realizaciones, un método para tratar un desorden mediado por MIF en un individuo que necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente activo que inhiba (i) el enlazamiento de MIF a CXCR2 y/o CXR4 (ii) la activación por MIF de CXCR2 y/o CXCR4 ; (iii) la capacidad del MIF para formar un homomultímero ; (iv) enlazamiento de MIF a CD74; o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el agente activo se enlaza específicamente a todo o una porción de o compite con un motivo pseudo ELR del MIF. En algunas realizaciones, el agente activo específicamente se enlaza a todo o una porción de o compite con un motivo N-bucle del MIF. En algunas realizaciones, el agente activo específicamente se enlaza a todo o una porción de los motivos pseudo ELR y N-bucle de MIF. En algunas realizaciones, el agente activo se selecciona de un antagonista de CXCR2; un antagonista de CXCR4; un antagonista de MIF; o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente activo se selecciona a partir de CXCL8 ( 3-74 ) 11R/G31P; Sch527123; N- ( 3- ( aminosul fonil ) -4-cloro-2-hidroxifenil ) -N- (2, 3-diclorofenil ) úrea; IL-8(I-72); ( R ) IL-8 , NMeLeu ; (AAR)IL-8; GRO (l-73); R) GROOÍ; ( ELR ) PF4 ; R)PF4; SB-265610; antileucinato; SB-517785-M; SB265610; SB225002; SB455821; DF2162; Reparixin; ALX40-4C; AMD-070; AMD3100; AMD3465; KRH-1636; RH2731; RH-3955; RH3140; T134; T22; T140; TC14012; TN14003; RCP168; POL3026; CTCE-0214; COR100140; o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente activo es un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción del motivo pseudo ELR del MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción del motivo N-bucle MIF; o un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de los motivos pseudo-ELR y N-bucle; un péptido que inhibe el enlazamiento del MIF y CXCR2; un péptidó que inhibe el enlazamiento de MIF y CXCR4 ; un péptido que inhibe el enlazamiento de MIF y JAB-1 un péptido que inhibe el enlazamiento de MIF y CD74; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQ y los correspondientes rasgos/dominios de al menos un monómero de MIF o un trímero de MIF; o un péptido que imita una secuencia de péptido como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHVVPDQ y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o trímero de MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o a una porción de una secuencia de péptidos como sigue: DQLMAFGGSSE PCALCS F y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: DQLMAFGGSSEPCALCS F y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHWPDQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o trímero de MIF; un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHVVPDQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptido que específicamente se enlaza a todo o una porción de una secuencia de péptidos tal como sigue: FGGSSEPCALCSLHSI y el correspondiente rasgo/dominio de al menos uno de un monómero MIF o un trímero MIF; un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: FGGSSEPCALCSLHSI y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la conversión de un macrófago en una célula espuma es inhibida después de la administración de un agente activo divulgado aquí. En algunas realizaciones, la apoptosis de un miocito cardíaco se inhibe después de la administración de un agente activo divulgado aquí. En algunas realizaciones, la apoptosia de un macrófago infiltrante se inhibe después de la administración de un agente activo divulgado aquí. En algunas realizaciones, la formación de un aneurisma aórtico abdominal es inhibida después de la administración de un agente activo divulgado aquí. En algunas realizaciones, el diámetro de un aneurisma aórtico abdominal disminuye después de la administración de un agente activo divulgado aquí. En algunas realizaciones, una proteína estructural en un aneurisma es regenerada después de la administración de un agente activo divulgado aquí. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente la coadministración de un segundo agente activo. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente la coadministración de un segundo agente activo. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente coadministrar niacina, un fibrato, una estatina, un péptido mimetico de Apo-Al (por ejemplo, DF-4, Novartis), un supraregulador apoA-I transcripcional , un inhibidor de ACAT, un modulador de CETP, antagonistas de receptor de glicoproteína (GP) Ilb/IIIa, antagonista de receptor P2YI2, inhibidores de Lp-PLA2, un agente anti-TNF, un antagonista del receptor de IL-1, un antagonista del receptor de IL-2, un agente citotóxico, un agente inmunomodulador , un antibiótico, un bloqueador coestimulador de células T, un agente antirreumático modificador del desorden, un agente anulador de células B, un agente de inmunosupresión, un anticuerpo antilinfocitos, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, un terpenoide, un inhibidor de topoisomerasa , un antibiótico antitumoral, un anticuerpo monoclonal, una terapia hormonal, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el desorden mediado por MIF es arteriesclerosis; aneurisma aórtico abdominal; encefalomielitis diseminada aguda; enfermedad de Moyamoya; enfermedad de Takayasu; síndrome coronario agudo; vasculopatía de aloinjerto cardíaco; inflamación pulmonar; síndrome de distensión respiratoria agudo; fibrosis pulmonar; encefalomielitis diseminada aguda; enfermedad de Addison; espondilitis anguilosante; síndrome de anticuerpo de antifosfolípido; anemia hemolítica autoinmune; hepatitis autoinmune; enfermedad autoinmune del oído interno; pemfigoide Bulloso; enfermedad de Chagas; enfermedad pulmonar obstructiva crónica; enfermedad celiaca; dermatomiositis ; diabetes mellitus tipo I; diabetes mellitus tipo II; endometriosis; síndrome de Goodpasture; enfermedad de Grave; síndrome de Guillan Barré; enfermedad de Hashimoto; purpura t rombocitopenica idiopática; cistitis intersticial; lupus eritematoso sistémico (SLE); síndrome metabolico; esclerosis múltiple; miastenia gravis; miocarditis; narcolepsia; obesidad; pemfigus vulgaris; anemia perniciosa; polimiositis ; cirrosis biliar primaria; artritis reumatoidea; esquizofrenia; escleroderma; síndrome de Sjogren; vasculitis; vitíligo; granulomatosis de eneger; rinitis alérgica; cáncer de próstata; carcinoma de células pulmonares no pequeñas; cáncer ovárico; cáncer de seno, melanoma; cáncer gástrico; cáncer colorectal; cáncer de cerebro; desorden óseo metastatico; cáncer pancreático; un linfoma; pólipos nasales; cáncer gastrointestinal; colitis ulcerativa; desorden de Crohn; colitis colagenosa; colitis linfocitica; colitis isquémica; colitis de diversión; síndrome de Behcet; colitis infecciosa; colitis indeterminada; desorden inflamatorio del hígado; choque de endotoxinas; choque séptico; espondilitis reumatoide; espondilitis anquilosante; artritis gotosa; polimialgia reumática; enfermedad de Alzahemir; enfermedad de Parkinson; epilepsia; demencia por Sida; asma; síndrome de distensión respiratoria en adultos; bronquitis; fibrosis quística; lesión pulmonar aguda mediada por leucocitos; proctitis distal; granulomatosis de Wegener; fribomialgia ; bronquitis; fibrosis quística; uveítis; con untivitis; psoriasis; eczema; dermatitis; desórdenes de proliferación de músculos lisos; meningitis; herpes zoster; encefalitis; nefritis; tuberculosis; rinitis; dermatitis atópica; pancreatitis; gingivitis periodontal; necrosis coagulativa; necrosis licuefactiva ; necrosis fibrinoide; hiperplasia neointimal; infarto del miocardio; apoplejía; rechazo al trasplante de órganos; o combinaciones de ios mismos.
Lo que se divulga aquí, de ciertas realizaciones, es una composición farmacéutica para tratar un desorden mediado por MIF en un individuo que requiere del mismo, que comprende al menos un agente activo que inhibe (i) el enlazamiento de MIF a CXCR2 y CXCR4 y/o (ii) activación por MIF de CXCR2 y CXCR ; (iii) la capacidad del MIF para formar un homomultimero; o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agente activo se enlaza específicamente a todo o una porción de un motivo de pseudo-ELR del MIF. En algunas realizaciones, el agente activo se enlaza específicamente a todo o una porción de un motivo N-bucle del MIF. En algunas realizaciones el" agente activo se enlaza específicamente a todo o una porción de los motivos pseudo-ELR o N-bucle de MIF. En algunas realizaciones, el agente activo es seleccionado del agente antagonista de CXCR2; un antagonista de CXCR4; un antagonista de MIF; o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente activo se selecciona de CXCL8 ( 3-74 ) 11R/G31P; Sch527123; N-(3(amino sul foni 1 ) -4 -clo o-2-hidroxi feni 1 )N-(2,3-diclorofenil)úrea; IL-8(l-72); ®IL-8; ®IL-8 , NMeLeu; (AAR)IL-8; GROa; ( 1-73) ; ®GROa; (ELRJPF4; ®PF4; SB-265610; Antileucinato; SB-517785-M; SB 265610; SB 225002; SB455821; DF2162; Reparixin; ALX40-4C; AMD-070; AMD3100; AMD3465; RH-1636; KRH-2731; KRH-3955; KRH-3140; T134; T22; T140; TC14012; TN14003; RCP168; POL3026; CTCE-0214; COR100140; o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente activo es un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción del motivo de pseudo ELR del MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción del motivo de N-bucle del MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de los motivos de pseudo ELR y N-bucle; un péptido que inhibe el enlazamiento de MIF y CXCR2; un péptido que inhibe el enlazamiento de MIF y CXCR4; un péptido que inhibe el enlazamiento de MIF y JAB-1; un péptido que inhibe el enlazamiento de MIF y CD74; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQ y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATGK PQYIAVHWPDQ y los correspondientes rasgos/dominios de al menos un monómero de MIF o trímero de MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de péptidos como sigue: : DQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominio de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: DQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHWPDQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHWPDQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o trímero de MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de péptidos como sigue: : FGGSSEPCALCSLHSI y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF y un trímero de MIF; un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: FGGSSEPCALCSLHSI; o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la composición comprende adicionalmente un segundo agente activo. En algunas realizaciones, la composición comprende adicionalmente niacina, un fibrato, una estatina, un péptido mimetico de Apo-Al (por ejemplo, DF-4, Novartis), un sobreregul ador apoA-I transcripcional , un inhibidor ACAT, un modulador CETPr un antagonista de receptor de glicoproteína (GP) Ilb/IIIa, antagonista de receptor P2Y12, inhibidores de Lp-PLA2, un agente anti TNF, un antagonista del receptor de IL-1, un antagonista del receptor de IL-2, un agente citotoxico, un agente inmunomodulador , un antibiótico, un bloqueador coestimulador de células T, un agente reumático modificador del desorden, un agente eliminador de células B, un agente inmunosupresor , un anticuerpo antilinfocitos , un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, un terpenoide, un inhibidor de topoisomerasa , un antibiótico antitumoral , un anticuerpo monoclonal, una terapia hormonal, o combinaciones de los mismos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Los rasgos novedosos de la invención se establecen con particularidad en las reivindicaciones anexas. Un mejor entendimiento de los rasgos y ventajas de la presente invención se tendrá con referencia a la siguiente descripción detallada que define realizaciones a manera de ilustración, en la cuales se utilizan los principios de la invención, y las figuras acompañantes de las cuales: Las figuras 1A-H es una ilustración de que una detención celular mononuclear disparada por MIF es mediada por CXCR2/CXCR4 y CD74. Células endoteliales aórticas humanas (HAoECs), células CHO que expresan de forma estable ICAM-1 (CHO/ICAM-1) y células endoteliales microvasculares de ratón (SVECs) fueron preincubadas con o sin MIF (ambasa con anticuerpos para MIF, antivuerpos para CXCL1 y CXCL8, o isótopo de control), CXCL8, CXCL10 o CXCL12durante 2 horas según se indica. Las células mononucleares fueron pretratadas con anticuerpos para CXCR1, CXCR2, ß2, CXCR4, CD74, o controles isotópicos durante 30 minutos, o toxina pertussis (PTX) durante 2 horas como se indica. (Figura 1A) Las HAoECs fueron perfusionadas con monocitos humanos primarios. (Figura IB) La inmunofluorescencia utilizando anticuerpos para MIF revelo una presentación superficial de MIF (verde) sobre células HAoECs y CHO/ICAM-1 después del pretratamiento durante 2 horas, pero no de 30 minutos (no mostrado); en contraste, el MIF estaba ausente en células tratadas con el regulador (control). Barra de escala, 100 µ?. (Figuras 1C,D) células CHO/ICAM-1 fueron perfusionadas con células MonoMac6. (Figura 1E) Las HAoECs fueron perfusionadas con células T. (Figura 1F, G) Células CHO/ICAM-1 fueron perfusionadas con células Jurkat T (Figura 1F), y con trans fectantes Jurkat CXCR2 o controles vectoriales (Figura 1G). En Figuras 1C, D, F, y G, el enlazamiento de fondo a las células transíectadas con el vector CHO fue sustraído. Figura 1H SVECs de ratón fueron perfusionadas con trans fectantes Ll .2 que expresaban de forma estable CXCR1, CXCR2 o CXCR3, y con controles que expresaban solamente CXCR4 endógeno, en presencia del antagonista de CXCR4 , el AMD3465. La detención se cualifica como células/mm2 o como por porcentaje de adhesión de las células de control. Los datos en Figura 1A y Figura 1C - G representan la media ± desviación estándar de 3 - 8 experimentos independientes; los datos en h son resultados de uno de los ¦ experimentos representativos de cuatro experimentos.
Las figuras 2A-H es una ilustración de que la quimiotaxis de las células mononucl ea res disparada por MIF es mediada por CXCR2/CXCR4 y CD74.. Monocitos humanos primarios (Figuras 2A-E), células CD3+T (Figura 2F) y neutrófilos (Figura 2G,H) fueron individualizadas para el análisis de transmigración en presencia o ausencia de MIF. Las CCL2 (Figura 2A) , cxcl8 (Figura 2A,G,H) y CXCL12 (Figura 2F) sirvieron como controles positivos o fueron utilizados como prueba de desensibilización por MIF (o por CXCL8, Figura 2H ) . los efectos quimiotáxicos del MIF, CCL2 y CXCL8 sobre los monocitos (Figura 2A) o del MIF sobre los neutrófilos (Figura 2G) siguió curvas de respuesta a dosis en forma de campana. La quimiotaxis disparada por MIF de monocitos fue abrogada por el agente activo al MIF, hirviendo (Figura 2B), o por MIF en concentraciones indicadas (en la cámara superior; Figura 2C) . (Figura 2D) la quimiotaxis disparada por MIF fue mediada por señalización de GD/ fos foinocitida-3-quinasa , según lo evidencia tratamiento con componentes de toxina pertussis A y B (PTXA+B), componente B del PTX solo o Ly294002. (Figura 2E) La quimiotaxis de monocitos mediada por MIF fue bloqueada por anticuerpos de CD74 o CXCR1/CXCR2. (Figura 2F) la quimiotaxis de células T inducidas por MIF fue bloqueada por anticuerpos de MIF y CXCR4. (Figura 2G) La quimiotaxis de los neutrofilos inducida por MIF. (Figura 2H) Quimiotaxis de neutrofilos inducida por MIF contra la misma inducida por CXCL8, efectos de los anticuerpos de CXCR2 o CXCR1, y desensibilización' de CXCL8 por parte del MIF. Los datos en Figura 2A y Figura 2F-H se expresan como índice quimiotáctico; los datos en Figura 2C se expresan como porcentaje de control; y los datos en Figura 2B, D y E como porcentaje de entrada. Los datos representan la media ± desviación estándar de 4 - 10 experimentos independientes, a excepto para los paneles mostrados en las Figuras 2A, C y G, el MIF hervido en Figura 2B, y los controles de agente aislado activo en Figuras 2B y E, que son el promedio de s experimentos independientes.
Las figuras 3A-G es una ilustración de que el MIF dispara una activación rápida de la integrina y de la señalización del calcio. (Figura 3A) Células endoteliales aórticas humanas fueron estimuladas con MIF o TNF-OÍ durante 2 horas. Se analizaron los ARNm de CXCL1 y CXCL8 por PCR en tiempos reales y se normalizaron para control. El CXCL8 sobrenadante derivado fue establecido por ELISA (n = 3 experimentos independientes llevados a cabo en duplicado). (Figura 3B) Las células MonoMac6 fueron estimuladas directamente con MIF o CXCL8 durante 1 minuto y perfusionadas sobre células CHO-ICAM-1 durante 5 minutos (promedio ± desviación estándar de 8 experimentos independientes) . (Figura 3C) Las células MonoMac6 fueron estimuladas con MIF durante los tiempos indicados. La activación de LFA-1 (detectada por el anticuerpo 327C) fue monitoreada por FACSAria, y se expreso como el incremento de intensidad media de fluorescencia (MFI). (Figura 3D) Como en Figura 3C pero para monocitos primarios; los datos expresan con respecto a la activación máxima con Mg2+/EGTA. Figura 3E muestra las células MonoMac6 fueron pretratadas con anticuerpos integrina, CD74 o CXCR2, estimulados con MIF durante 1 minuto, perfusionados sobre VCAM-1. Fe durante 5 minutos. La adhesión se expresa como porcentaje de control. Los datos de detención en Figuras 3C-E representan en promedio ± la desviación estándar de 5 experimentos independientes. (Figura 3F) Los transientes de calcio en neutrófilos marcados con Fluo-4AM fueron estimulados con MIF, CXCL8 o CXCL . El MFI derivado de calcio fue registrado por la FACSAria durante 0 -240 s. para la desensibilización, se añadieron los estímulos 120 segundos después de la estimulación. Las trazas muestran 4 experimentos independientes. (Figura 3G) Curvas de respuesta a la dosis del influjo del calcio disparada por CXCL8, CXCL7 o MIF, en concentraciones indicadas, en transíectantes LI.2-CXCR2. Los datos son expresados como la diferencia entre la linea base y el pico MFI (media ± desviación estándar de 4 - 8 experimentos independientes).
Las figuras 4A-H muestran una ilustración de la interacción de MI F con CXCR2/CXCR4 y la formación de complejos CXCR2/CD7 . Los trans fectantes de HEK293-CXCR2 (Figura 4A) o las células Jurkat T portadoras de CXC 4 (Figura 4C) fueron individualizadas para las pruebas de enlazamiento al receptor, analizar la competición de [I125] CXCL8 (Figura 4A) o [I125] CXCL12 (Figura 4C) por MI F o un ligando cognado frió (promedio ± desviación estándar n = 6 -.10). (Figura 4B) La internalización de CXCR2 inducida por MI F y CXCL8 en HEK293-CXCR2 o RAW264.7-CXCR2 como transfectantes (el inserto muestra los histogramas representativos) según se indicó; se estableció por análisis de FACSA sobre expresión en superficie de CXCR2 (porcentaje regulador (Con), promedio ± desviación estándar., n = 5). (Figura 4D) Internalización de CXCR4 inducida por MI F y CXCL12 en células Jurkat T tal como en Figura 4B (promedio ± desviación estándar n = 4 - 6). (Figura 4E) El enlazamiento de la floresceina-MIF a los trans fectantes HE 293-CXCR2 o a los controles vectoriales analizados por FACS . El inserto muestra el enlazamiento de biotina-MIF a CXCR2 establecido por western blot utilizando anticuerpos para CXCR2 antes de la caída por estreptavidina (SAv) de los trans fectantes HE 293-CXCR2 en comparación con los controles vectoriales. (Figura 4F) La colocalización de CXCR2 y CD74 (superposición naranja-amarillo) en transfectantes RAW26 .7-CXCR2 teñidos para CXCR2, CD74 y núcleos (Hoechst), analizados por microscopía de fluorescencia (superior) o microscopía de barrido por láser con focal (parte inferior). Barra de escala, 10 pm. (Figura 4G) La coinmunoprecipitación de complejo CXCR2/CD74 en extractos de CHAPSO de transfectantes HEK293-CXCR2 que expresaban CD74 marcado con His. Inmunoprecipitación con anti-His (IP) seguida por western blotting de anti CXCR2 o a nti -Hi S-CD74 ( B; parte superior) o inmunoprecipitación anti CXCR2 seguida por western blotting de anti-His CD74 o anti-CXCR2 (parte inferior). Controles: lisados sin inmunoprecipitación o perlas solas. (Figura 4H) Como en Figura 4G para los transfectantes L1.2-CXCR2. Inmunoprecipitación anti CXCR2 a partir de transfectante L1.1-CXCR2 seguida por western blotting de anti CD74 o anti CXCR2 (parte superior) . Inmunoprecipitación con el isótopo IgG o células Ll .2 negativas a CXCR2 (parte inferior), sirvió como control. Los datos representan 3 experimentos independientes (Figura 4E-H).
Las Figuras 5A-H muestran una ilustración de que la inflamación aterogénica y microvascular inducida por MIF a tráves de CXCR2 in vivo y los efectos del bloqueo de MIF sobre la regresión en placa. (Figura 5A) La adhesión de monocitos al lumen in vivo y el contenido de macrófago de lesión en raíces aórticas nativas fueron determinados en ratones Mif1+Ldlip/a y Mi ?°p??1 r070 (n = 4) alimentados con una dieta de masticación durante 30 semanas. Se presentan las imágenes representativas. Las flechas indican monocitos adherentes a la superficie luminal. La barra de escala, 100 pm. (Figura 5B,C) La exposición al reclutamiento de leucocitos de CXCR2 inducida por MIF in vivo. Después de una inyección intraescrotal de MIF, la microvascularización cremastérica fue visualizada por microscopia intravital; pretratamiento con anticuerpo bloqueador de CXCR2 abrogó la adhesión y la emigración, en comparación con la IgG de control (n = 4) . (Figura 5D) La inyección intraperitoneal de MIF o del vehículo elicito el reclutamiento de neutrófilos en ratones tipo silvestre (n = 3) reconstituidos con tipo silvestre pero no IL8rbn/a, médula ósea. (Figura 5E-H) El MIF bloqueante pero no CXCL1 o CXCL12 dieron como resultado la regresión y estabilización de placas ateroscleróticas avanzadas (ratones ñpoeD/D recibieron una dieta alta en grasa durante 12 semanas y fueron tratados subsecuentemente con anticuerpos para MIF, CXCL1 o CXCL12, o con vehículo (control) durante 4 semanas adicionales (n = 6 - 10 ratones). Las placas en la raíz aórtica fueron teñidas utilizando Oil Red - O. las imágenes representativas muestran en e (barras de escala, 500 µp\) . Los datos en Figura 5F representan el área de la placa en la linea base (12 semanas) y después de 16 semanas. El contenido relativo de macrófagos en MOMA-2+ se muestra en Figura 5G y el número de células T CD3+ por sección en Figura 5H. los datos representan en promedio ± desviación estándar.
La figura 6 es una ilustración de los meca'nismos celulares del MIF en el contexto de la aterogenesis . La expresión de MIF es inducida en células de la pared vascular y los macrófagos íntimos mediante diversos estímulos proaterogenicos , por ejemplo, LDL oxidado (oxLDL) o angitensina II (ATII). Subsecuentemente, el MIF regula las moléculas de adhesión celular endotelial (por ejemplo, moléculas de adhesión vascular [vcam-1] e intracelulares [ICAM-1] y quimioguinas (por ejemplo, CCL.2) y dispara la activación directa de los receptores de integrina respectivos (por ejemplo, LFA-1 y VLA-4) enlazando y señalizando a través de sus receptores heptahelicoidales ( quimioquina ) CXCR2 y CXCR4. Esto limita el reclutamiento de células mononucleares (monocitos y células T) y la conversión de macrófagos en células espuma, inhibiendo la apoptosis y regulando (por ejemplo, impidiendo) la migración o proliferación de SMCs . Induciendo las MMPs y las catepsinas, el MIF promueve la degradación de la elastina y el colágeno, llevando finalmente a la progresión hacia placas inestables. El ROS indica especies con oxígeno reactivo; PDGF-BB, factor BB de crecimiento derivado de plaquetas.
La figura 7 es una ilustración de la señalización a través de un complejo del receptor de MIF funcional. El MIF es inducido por glucocorticoides que sobrepasan su función regulando la producción de citoquina y, después de su endocitosis, pueden interactuar con proteínas intracelulares , a saber JAB-1, subregulando por lo tanto las señales de MAPK y modulando la homeostasis redox celular. En algunas realizaciones, el MIF extracelular se enlaza a las proteínas de la superficie de las células CD74 (cadena no variante Ii) El CD74 carece de un dominio intracelular transductor de señal pero interactua con el proteoglicano CD44 e intermedia de la señalización a través del CD 44 para inducir la activación de RT de la familia Src y MAPK/quinasa regulada por señal extracelular (ERK), para activar la ruta PI3K/Akt, o para iniciar la inhibición dependiente de p53 de la apoptosis. El MIF también se enlaza y señaliza a través de los receptores quimioquina acoplados con la proteína G (CXCR2 y CXCR ) sola. La formación de complejos de CXCR2 con CD74, permitiendo el enlazamiento accesorio, facilita la activación de GPCR y la formación de un complejo de señalización similar a GPCR-RTK para disparar el influjo de calcio y la activación rápida de la integrina.
La figura 8 es una ilustración de los efectos del MIF en la patología del miocardio. En el contexto de la isquemia-reperfusión, hipoxia, especies reactivas con oxígeno (ROS), y endotoxinas (por ejemplo, lipopolisacaridos [LPS] ) en una sepsis induce la secreción de MIF a partir de los cardiomiocitos a través de una proteína quinasa C (PKC) como mecanismo dependiente y da como resultado una activación de la quinasa (ERK) regulada por señales extracelulares, lo que contribuye a la apoptosis de cardiomiocitos. Expresada por cardiomiocitos supervivientes o por células progenitoras endoteliales (por ejemplo, eEPCs) utilizada para inyección terapéutica, en algunas realizaciones el MIF promueve la angiogenosis a través de sus receptores CXCR2 y CXCR4, requiriendo la activación de MAPK y PI3K.
Las figuras 9A-C muestran una ilustración de que la interferencia con CXCR4 sin interferencia concomitante con CXCR2 agrava la arteriosclerosis . Ratones Apoe-/- que reciben una dieta alta en grasas fueron tratados de forma continua, con vehículo (control) o AMD3465 a través de minibombas osmóticas durante 12 semanas (n = 6 en cada caso). Las placas arterioscleróticas fueron cuanti ficadas en la raíz aórtica (Fig. 9A) y en la aórtica toracoabdominal (Fig. 9B) después de la tinción con aceite rojo 0. el número relativo de neutrófilos fue determinado por análisis citometrico de flujo o por citometria estándar en sangre periférica en los puntos de tiempo indicado (Fig. 9C) .
La figura 10 ilustra la estructura cristalina de un trímero de MIF. El dominio de pseudo-ELR forma un anillo en el trímero mientras que los dominios N-bucle se extienden hacia fuera desde el anillo psudo-ELR.
La figura 11 ilustra la secuencia de nucleótidos de MIF de SEQ ID NO: 1 anotada para mostrar las secuencias que corresponden con el dominio de N-bucle y el dominio de pseudo-ELR .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Lo que se describe aquí como de ciertas realizaciones, son métodos para inhibir la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4. Las mismas realizaciones, la señalización de MFI a través de CXCR2 y CXCR4 se inhibe ocupando el dominio de enlazamiento de MIF de CXCR2 y CXCR4 con un agente activo. En algunas realizaciones la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 se inhiba ocupando, enmascarando o perturbando de alguna otra manera los dominios sobre el MIF. En algunas realizaciones, la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 se inhibe mediante un agente activo que ocupa, enmascara o de alguna otra forma perturba los dominios sobre el MIF y por lo tanto perturba EN el enlazamiento de CXCR2 y/o CXCR4 al MIF. En algunas realizaciones, la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 es inhibida por un agente activo que ocupa, enmascara o de alguna otra forma perturba los dominios sobre el MIF y por lo tanto perturba la trimeri zación del MIF.
Mientras que hay muchos métodos para inhibir las interacciones del MIF o subregular la expresión de MIF, la técnica carece del reconocimiento de que ciertas porciones de MIF son más importantes que otras con respecto a las interacciones con los leucocitos. Un problema aquí resuelto es la identificación y generación de péptidos y moléculas pequeñas que se enlazan a las porciones selectivas del MIF que son importantes en la quimiotaxis de los leucocitos.
Adicionalmente, hay muchos péptidos y moléculas pequeñas que inhiben o subregular. las interacciones de CXCR2 y CXCR4 con sus ligandos. Sin embargo, estos receptores también están involucrados en las interacciones con otros ligandos (por ejemplo, IL-8/CXCL8, GRObeta/CXCL2 y/o factor 1A (SDF-1A)/CXCL12) derivado de células estromales. Los efectos colaterales en detrimento surgen frecuentemente si estas interacciones últimas se inhiben. Un problema que se resuelve aquí es la falla de la técnica para enseñar péptidos y moléculas que inhiban selectivamente las interacciones de CXCR2 y CXCR4 con MIF.
Ciertas definiciones Los términos "individuo", "sujeto" o "paciente" se utilizan de forma intercambiable. Tal como se usan aquí, significan cualquier mamífero (esto es especies de cualquier orden, familia, género dentro de la clasificación taxonómica de animales: cordata; vertebrata; mammalia). En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. En algunas realizaciones el mamofero es un no humano. En algunas realizaciones el mamífero es un miembro de los ordenes taxonómicos: primates (por ejemplo, lémures, lóridos, gálagos, tarsercs, monos, simios y humanos); rodentia (por ejemplo, ratones, ratas, ardillas, ardillas listadas, y topos); lagomorpha (por ejemplo liebres, conejos, y pika); erinaceomorpha (por ejemplo erizos y gimnures); soricomorpha (por ejemplo musarañas), topos, y solenodons); chiroptera (por ejemplo, murciélagos); cetácea (por ejemplo ballenas, delfines y marsopas); carnívora (por ejemplo gatos, leones, y otros feliformia; perros, osos, nutrias y focas); perissodactyla (por ejemplo caballos, cebras, tapires y rinocerontes); artiodactyla (por ejemplo, cerdos, camellos, ganado y venados); probóscidea (por ejemplo elefantes), sirenia (por ejemplo manatíes, dugongos y vacas marinas); cingulata (por ejemplo armadillos); pilosa (por ejemplo osos hormigueros y ' (perezosos); didelphimorphia ' (por ejemplo opossums amaericano ( zarigüeya ); paucituberculata (por ejemplo musaraña oposums); microbiotheria (por ejemplo monito del monte); notoryctemorphia (por ejemplo, ' (topo marsupial); dasyuromorphia (por ejemplo carnívoros marsupiales); peramelemorphia (por e emplo bandicuts y bilbios); o diprodontia (por ejemplo, (oso australiano, koalas, zarigüeyas, planeadores, canguros, wallarus, y wallabis). En algunas realizaciones, el animal es un reptil (esto es especies de cualquier orden, familia y género dentro de la clasificación taxonómica animalia: cordata: vertebrata : reptilia). En algunas realizaciones el animal es un ave (esto es, animalia: cordata: vertebrata: aves) . Ninguno de los términos requiere o están limitados a una situación caracterizada por la supervisión (por ejemplo constante o intermitente) de un trabajador del cuidado de la salud (por ejemplo un doctor, una enfermera registrada, un practicante de enfermería, un asistente de médico, un ordenanza, o un trabajador de un hospicio).
La frase "se enlaza específicamente" cuando se refiere a la interacción entre una molécula enlazante (esto es el agente activo; por ejemplo, un péptido o un péptido mimético) y una proteína o polipéptido o epítope, se refiere típicamente a una molécula enlazante que reconoce y se enlaza específicamente de forma detectable con alta afinidad al objetivo de interés. Preferiblemente, bajo condiciones designadas o fisiológicas, los anticuerpos especificados o moléculas enlazantes se enlazan a un polipéptido en particular a un polipéptido, proteína o epítope particular si bien no se enlaza en una cantidad significativa o indeseable a otras moléculas presentes en una muestra. En otras palabras el anticuerpo especificado o molécula enlazante no reacciona de forma entrecruzada e indeseable con antígenos y/o epitopes que no son objetivo. Se utiliza una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar los anticuerpos u otras moléculas enlazantes que son inmunoreactivas con un polipéptido particular y tienen una especificidad deseada. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA en fase sólida, BIAcore, citometría de flujo y radioinmunoensayos se utilizan para seleccionar anticuerpos monoclonales que tienen una inmunoreactividad y especi icidad deseadas. Véase, Harlow, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications , New York (de aquí en adelante, "Harlow"), para una descripción de formato de inmunoensayo y condiciones que se utilizan para determinar o establecer la inmunorreactividad y especificidad en todos los casos.
"Enlazamiento selectivo", "selectividad", y similares se refiere a lá preferencia de un agente activo para interactuar con una molécula en comparación con otra. De preferencia, las interacciones entre un agente activo aquí divulgado y las proteínas son ambas específicas y selectivas. Nótese que en algunas realizaciones un agente activo esta diseñado para "enlazarse específicamente" y "enlazarse selectivamente" a dos objetivos distintos si bien similares sin enlazarse a otros objetivos indeseables.
Los términos "polipeptidos", "péptidos" y "proteínas" se utilizan de forma intercambiable aquí para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos de origen natural así como a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más de los residuos de aminoácidos es un aminoácido de origen no natural (por ejemplo, una análogo de un aminoácido). El termino abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa (esto es antígenos), donde los residuos de aminoácidos están enlazados por enlaces peptídicos covalentes.
El termino "antígeno" se refiere a una sustancia que es capaz de inducir la producción de un anticuerpo. En algunas realizaciones un antígeno es una sustancia que se enlaza específicamente a una región variable de un anticuerpo.
Los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos rríonoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos biespeci fieos , anticuerpos multiespeci fieos , anticuerpos injertados, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados, Fvs(scFv) de cadena sencilla, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de Fab, fragmentos de F (ab'), Fvs (sdFv) con puente de disulfuro, intracuerpos , y anticuerpos antiidiotipicos (anti-Id) y fragmentos enlazantes de antigenos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobul ina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina , esto es, moléculas que contienen un sitio enlazante de antigenos. Dependiendo de las secuencias de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases. Los dominios constantes de cadena pesada (Fe) que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Las moléculas de inmunoglobulinas son de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan de forma intercambiable en el sentido más amplio. En algunas realizaciones un anticuerpo es una parte de una molécula más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con uno o más proteínas o péptidos.
Con respecto a los anticuerpos, el término "dominio variable" se refiere a los dominios variables de anticuerpos que se utilizan en el enlazamiento y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, J a variabilidad no se distribuye de manera homogénea a través de los dominios variables de anticuerpos. Más bien, se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables (también conocidas como CDRs ) tanto en los dominios variables de la cadena liviana como en la cadena pesada. Las porciones de dominios variables más altamente conservadas se denominan "las regiones marco" o FRs". Los dominios variables de las cadenas pesada y livianas no modificadas contienen cada una cuatro FRs (FR1, FR2, FR3 y FR4 ) , adoptando sobradamente una configuración de lámina ß intercaladas con tres CDRs los cuales forman bucles que conectan, y en algunos casos, parte de la estructura de la lamina ß. Los CDRs en cada cadena se mantienen juntos en cercana proximidad mediante los CDRs y, con los CDRs de otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlazamiento del antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 5th Ed . Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md . (1991), paginas 647 - 669).
Los términos "región hipervariable" y "CDR" cuando se usan aquí se refieren a residuos de aminoácidos del anticuerpo que son responsables con el enlazamiento del antígeno. Los CDRs comprenden residuos de aminoácidos de tres regiones de secuencia que enlazan de una forma complementaria a un antigeno y son conocidos como CDR1, CDR2 y CDR3 para cada una de las cadenas VH y VL. En el dominio de cadena variable liviana, los CDRs típicamente corresponden con valores de aproximadamente 24 - 34 (CDRL1), 50 - 56 (CDRL2) y 89 -97 (CDRL3), y en el dominio de cadena variable pesada los CDRs típicamente corresponden a residuos aproximadamente de 31 - 35 (CDRH1), 50 -65 (CDRH2) y 95 -102 (CDRH3) de acuerdo con Kabat et al., Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md . (1991). Se entiende que los CDRs de diferentes anticuerpos pueden contener inserciones, así que la numeración de los aminoácidos puede diferir. El sistema de numeración de Kabat tiene en cuenta tales inserciones con un esquema de numeración que utiliza letras unidas a residuos específicos (por ejemplo, 27A, 27B, 27C, 27D, 27E, y 27F del CDRL1 en la cadena liviana) para reflejar cualquier inserción en las numeraciones entre anticuerpos diferentes. Alternativamente, en el dominio de cadena variable liviana, los CDRs corresponden típicamente con residuos aproximadamente de 26 - 32 (CDRL1), 50 - 52 (CDRL2) y 91 - 96 (CDRL3), y en el dominio de cadena variable pesada, los CDRs típicamente corresponden a aproximadamente los residuos 26 -32 (CDRH1), 53 - 55 (CDRH2) y 96 - 101 (CDRH3) de acuerdo con Chothia and Lesk, J. Mol. Biol . , 196: 901 - 917 (1987).
Los dominios constantes (Fe) de los anticuerpos no se involucran directamente en el enlazamiento de un anticuerpo o un antígeno pero, más bien, exhiben funciones efectoras diversas, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo a través de interacciones con, por ejemplo, receptores de Fe ( FcR ) . Los dominios Fe también peuden incrementar la biodisponibilidad de un anticuerpo en circulación después de la administración a un paciente.
Tal como se usa aquí, el término "afinidad" se refiere a la constante de equilibrio para el enlazamiento reversible de dos agentes y se expresa como Kd . La afinidad de una proteína enlazante a un ligando tal como la afinidad de un anticuerpo para un epítope puede ser, por ejemplo, desde aproximadamente 100 nanomolar (nM) hasta aproximadamente 0.1 nM, desde aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 1 picomolar (pM), o desde aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 1 fentornolar (fM) . Tal como se usa aquí, el término "avidez" se refiere a la resistencia de un complejo de dos o más agentes para la disociación después la dilución.
El término' "pePticuerpo" se refiere a una molécula que comprende péptidos fusionados bien de forma directa o indirecta a un anticuerpo o uno o más dominio de anticuerpos (por ejemplo, un dominio Fe de un anticuerpo), donde la unidad estructural de péptido se enlaza específicamente a un objetivo deseado. Los péptidos pueden estar fusionados bien a una región Fe o insertados en un bucle Fe, una molécula Fe modificada. El término "pepticuerpo" no incluye proteínas de fusión Fe (por ejemplo, proteínas de longitud completa fusionadas a un dominio Fe).
Los términos "aislados" y "purificados" se refieren a un material que ha sido sustancial o esencialmente eliminado de o concentrado en su ambiente natural. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado es uno que esta separado de al menos alguno de los ácidos nucleicos que normalmente lo flanquean u otros ácidos nucleicos o componente (proteínas, lípidos, etc.) en una muestra. En otro ejemplo, un polipéptido es purificado si es retirado sustancialmente de o concentrado en su ambiente natural. Los métodos para purificación y aislamiento de ácidos nucleicos y proteínas son metodologías documentadas. Realizaciones de "susntancialmente" incluyen al menos 20%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99%.
Los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento" y otros equivalentes gramaticales tal como se usan aquí, incluyen, aliviar, inhibir o reducir síntomas, reducir o inhibir la severidad de, reducir la incidencia de, el tratamiento profiláctico de, la reducción o inhibición de la recurrencia de, prevención, retraso de la aparición de, retraso de la recurrencia de, abatir o mejorar una enfermedad o síntomas de la condición, mejorar las causas metabólicas subyacentes de los síntomas, inhibir la enfermedad o condición, por ejemplo, detener el desarrollo de la enfermedad o condición, aliviar la enfermedad o condición, causar la regresión de la enfermedad o condición, aliviar una condición causada por la enfermedad o condición, o detener los síntomas de la enfermedad o condición. Los términos incluyen además alcanzar un beneficio terapéutico. Por beneficio terapéutico se entiende la erradicación o mejoramiento del desorden subyacente que está siendo tratado y/o la erradicación o mejoramiento de uno o más de los síntomas fisiológicos asociados con el desorden subyacente de forma tal que se observa una mejora en el individuo.
Los términos "prevenir", "previniendo" o "prevención", y otros equivalentes gramaticales tal como se usan aquí, incluyen prevenir síntomas adicionales, prevenir las causas metabólicas subyacentes de los síntomas, inhibe la enfermedad o condición, por ejemplo, detener el desarrollo de la enfermedad o condición y pretenden incluir la profilaxis. Los términos incluyen adicionalmente alcanzar un beneficio profiláctico. Para un beneficio profiláctico, las composiciones se administran opciona lmente a un individuo en riesgo de desarrollar una enfermedad particular, a un individuo que reporta uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, o a un individuo en riesgo de recurrencia de la enfermedad.
Los términos "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" tal como se usan aquí, se refieren a una cantidad suficiente de al menos un agente que es administrado el cual alcanza un resultado deseado, por ejemplo, aliviar en algún grado uno o más síntomas de una enfermedad o condición que está siendo tratada. En ciertos casos, los resultados son una reducción y/o alivio de las señales, síntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. En instancias especificas, ei resultado es un descenso en el crecimiento de, la muerte de, la inducción de la apoptosis en al menos una célula anormalmente proliferante, por ejemplo, una célula madre cancerígena. En ciertas instancias, una "cantidad efectiva" para usos terapéuticos es la cantidad de una composición que comprende un agente tal como se define aquí requerido para proveer un descenso clínicamente significativo en una enfermedad. Una cantidad "efectiva" apropiada en un caso individual se determina utilizando cualquier técnica adecuada, tal como un estudio de escalamiento de dosis.
Los términos "administrar", "administrando", "administración", y similares, tal como se usan aquí se refieren a métodos que se utilizan para permitir la administración de agentes o composiciones al sitio deseado de acción bilógica. Estos métodos incluyen pero no se limitan, a rutas orales, rutas intradudodenales, inyección parenterica (incluyendo intravenosas, subcutáneas, intraperitoneales, intramusculares, intravasculares o infusión) administración tópica y rectal. Las técnicas de administración que se emplean opcionalmente con los agentes y métodos aquí descritos, incluyen, por ejemplo, como se discute en Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics , current ed . ; Pergamon; y Remington's, Pharmaceutical Sciences (current edition), Mack Publishing Co . ; Easton, Pa . En ciertas realizaciones, los agentes y composiciones aquí descritas se administran oralmente.
El término "farmacéuticamente aceptable" tal como se usa aqui se refiere a un material que no abroga la actividad bilógica o propiedades de los agentes aqui descritos, y es relativamente no tóxico (esto es, la toxicidad del material significativamente se contrapone al beneficio del material). En algunas instancias, el material farmacéuticamente aceptable es administrado a un individuo sin causar efectos biológicos indeseables significativos o interactuar significativamente de una forma nociva con cualquiera de los componentes de la composición en la cual está contenido.
Factor de migración de inhibición de macrofagos (MIF) En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben (parcial ototalmente) la actividad del MIF. En ciertos casos, el MIF es una citoquina proinflamatoria . En ciertos casos, es secretada por células inmunes activadas (por e emplo un linfocito (célula T)) en respuesta a una infección, inflamación, o lesión en tejidos. En ciertos caso, el MIF es secretado por la glándula pituitaria anterior por estimulación del eje hipotalámico, pituitario,' adrenal . En ciertos caso, el MIF es secretado junto con insulina por las células beta pancreáticas y actúa como un factor autocrino para estimular la liberación de insulina. En ciertos caso, el MIF es un ligando para los receptores CXCR2, CXCR4 y CD74. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben (parcial o totalmente) la actividad de CXCR2, CXCR4 y/o CD74.
En ciertos casos, el MIF induce la quimiotaxis en leucocitos cercanos (por ejemplo, linfocitos, granulocitos , monocitos/macrófagos, y células TH-17) junto con un gradiente de MIF. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí previenen la quimiotaxis a lo largo de un gradiente de MIF, o reducen la quimiotaxis a lo largo de un gradiente de MIF. En ciertos casos, el MIF induce la quimiotaxis de un leucocito (por ejemplo, linfocitos, granulocitos, onoci tos/macrófagos y células TH-17) en el sitio de una infección, inflamación o lesión de tejido. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí previenen o hacen disminuir la quimiotaxis de un leucocito en el sitio de una infección, inflamación o lesión de tejido. En ciertos casos, la quimiotaxis de un leucocito (por ejemplo, linfocitos, granulocitos, monocitos/macrófagos y células TH-17) junto con un gradiente de MIF dan como resultado una inflamación en el sitio de la infección, inflamación, o lesión de tejido. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí tratan la inflamación en el sitio de la infección, inflamación o lesión de tejido. En ciertos casos, la quimiotaxis de los monocitos junto con un gradiente de RANTES resulta en la detención de monocitos (esto es, la deposición de monocitos sobre el epitelio), en el sitio de la lesión o inflamación. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí previenen o hacen disminuir la detención de los monocitos en el sitio de la lesiono inflamación. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben el tratamiento de un desorden mediado por un linfocito. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí tratan un desorden mediado por granulocitos . En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí tratan un desorden mediado por macrófagos. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí tratan un desorden mediado por TH-17. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí tratan un desorden pancreático mediado por células beta.
En ciertos casos, el MIF es inducible por glucocorticoides , un mecanismo implicado en una aceleración de la aterosclerosis asociada con muchas enfermedades que requieren terapia con glucocorticoides. Así, en algunas realizaciones las composiciones y métodos aquí descritos inhiben la inducción de la expresión del MIF por glucocorticoides .
En ciertos casos, un polipéptido de MIF humano es codificado por una secuencia de nucleótidos localizada en el cromosoma 22 en la banda citogénica 22qll.23. En ciertos caso, una proteína MIF es una proetina de 12.3 kDa . En ciertos casos, una proteina de MIF es un homotrímero que comprende trespolipeptidos de 115 aminoácidos. En ciertos casos, de MIF comprende un motivo pseudo-ELR que imita el motivo ELR encontrado en las quimioquinas . En ciertos casos, el motivo pseudo-ELR comprende dos residuos no adyacentes pero adecuadamente espaciados (Arg 12 y Asp45 & véase Figura 11) . En algunas realizaciones el motivo pseudo-ELR comprende la secuencia de aminoácidos del aminoácido 12 al aminoácido 45 (tal numeración incluye el primer residuo de metionina) . Esto es equivalente a un motivo pseudo-ELR del aminoácido 11 al aminoácido 44 en el cual no se cuenta el primer residuo de metionina (en tales casos, el motivo pseudo-ELR comprende Arg 11 y Asp 44) . En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí tratan un desorden mediado por MIF inhibiendo el enlazamiento del motivo pseudo-ELR a CXCR2 y/o CXCR4.
En ciertos casos, una proteína MIF comprende un motivo de bucle N-terminal de 10 a 20 residuos (bucle N). En ciertos casos, un bucle N de MIF participan en el lanzamiento a un receptor de CXCR2 y/o CXCR4. En ciertos casos, el motivo del bucle N del MIF comprende los residuos secuenciales (47 - 56) del MIF (esto es L47M48A 9F50G51G52S53S54E55P56; véase Figura 11). En ciertos casos, el motivo de bucle N del MIF comprende los aminoácidos 45 - 60. En ciertos casos, el motivo de bucle N del MIF comprende aminoácidos 44 - 61. En ciertos casos, el motivo de bucle N del MIF comprende los aminoácidos 43 - 62. En ciertos casos, el motivo del bucle N del MIF comprende los aminoácidos 42 - 63. En ciertos casos, el motivo del bucle N del MIF comprende los aminoácidos 41 - 64. En ciertos casos, el motivo de bucle N del MIF comprende los aminoácidos 40 -65. En ciertos casos, el motivo de bucle N del MIF comprende los aminoácidos 46 - 59. En ciertos casos, el motivo del bucle N de MIF comprende los aminoácidos 47 -59. En ciertos casos, el motivo del bucle N del MIF comprende los aminoácidos 48 -59. En ciertos casos, el motivo del bucle N del MilF comprende aminoácidos 50 - 59. En ciertos casos, el motivo del bucle N en MIF comprende los aminoácidos 47 - 58. En ciertos casos, el motivo del bucle N del MIF comprende los aminoácidos 47 - 57. En ciertos casos, el motivo del bucle N del MIF comprende los aminoácidos 47 - 56. En ciertos casos, el motivo del bucle N del MIF comprende los aminoácidos 48 -58. En algunas realizaciones, el motivo del bucle N comprende los aminoácidos 48 - 57. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí tratan un desorden mediado por MIF inhibiendo el enlazamiento del motivo del buque N a CXCR2 y/o CXCR4.
En algunas realizaciones, un método y/o composiciones divulgados aquí tratan un desorden mediado por MIF inhibiendo (1) el enlazamiento del motivo de bucle N a CXCR2 y/o CXCR ; y (2) enlazamiento del motivo pseudo-ELR a CXCR2 y/o CXCR4.
En algunos casos, el CD74 activa los receptores acoplados a proteina G (GPCRs), activa el CXCR2, y/o se asocia con estas moléculas para formar complejos de señalización. Así, en algunas realizaciones un método y/o composición divulgados aquí tratan un desorden mediado por el MIF inhibiendo la activación de GPCRs o CXCR2 mediante CD74.
En ciertos casos, el MIF es expresado por células endoteliales , SMCs, células mononucleares , y/o macrófagos después de una lesión arterial. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben la expresión del MIF mediante células endoteliales, SMCs, células mononucleares y/o macrófagos después de una lesión arterial. En ciertos casos, el MIF es expresado por células endoteliales, SMCs, células mononucleares, macrófagos después de la exposición, lipoproteíñas oxidads de baja densidad (oxLDL), ligando CD40, angiotensina II, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben la expresión de MIF por células endoteliales , SMCs, células mononucleares , y/o macró.fagos después de la exposición a lipoproteíñas de baja densidad oxidadas, ligando CD40, angitensina II o combinaciones de los mismos.
En ciertos casos, el MIF induce la expresión de CCL2, TNF, y/o ICAM-1 en las células endoteliales. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben la expresión inducida por MIF de CCL2, TNF y/o ICAM-1 en células endoteliales.
En ciertos casos, el MIF induce la expresión de MMPs y la catepsinas en SMCs.. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben la expresión inducida por MIF, MMPs y catepsinas SMCs.
En ciertos casos, el MIF dispara un inflijo de calcio atraves de CXCR2 o CXCR4 , induce una activación rápida de las integrinas, induce la activación de MAPK, y media la detención de Gai y dependiente de integrina y la quimiotaxis de monocitos y células T (Figuras 2A-H y 3A-G) . Así, en algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben el influjo de calcio en monocitos y/o células T, inhibe la activación de MAPK, inhibe la activación de integrinas, .inhibe la detención dependiente de Gai integrina de los monocitos y células T, o combinaciones de los mismos.
En ciertos caso, el reclutamiento de monocitos inducido por MI F involucra el enlazamiento a MI F de la proteína CD74. En ciertos casos, el enlazamiento a MIF a la proteína CD74 incluye el influjo de calcio, activación de la quinasa( MAPK) activada por mitogenos, o la activación de la integrina dependiente de Gai (Figura 7). En alguna realización en la presente invención comprende un método para inhibir la activación de la quinasa MAPK mediada por MIF en un individuo que así lo requiere. En lagunas realizaciones la presente invención comprende un método para inhibir la activación de la integrina dependiente de Gai mediada por MIF en un individuo que así lo requiere.
En ciertos casos, la señalización inducida por MIF a través de CD74 involucra las quinasa CD44 y Src. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben la activación de la quinasa de Src mediada por CD74.
En ciertos casos, el MIF consumido por endocitosis interactua directamente con JAB-1. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben la endocitosis de MIF.
En ciertos casos, las arrestinas facilitan el reclutamiento de> receptores acoplados con proteína G en los vesiculos recubiertos con clatrina que median la internalizacion del MIF. Asi, en algunas realizaciones, un método y/ o composición divulgados a quí comprenden adicionalmente un antagonista de arrestina. Ejemplo de agentes que inhiben el enlazamiento de la arrestina aun GPCR comprenden carvedilol, isoprenalina , isoproterenol , formoterol, cimeterol, clenbuterol, L-epinef iña , espinofilina y salmeterol.
En ciertos casos, la ubiquitilación del MIF da como resultado (bien sea parcial o totalmente) la internalizacion rápida y subsecuente degradación del MIF. Así, en algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí comprenden adicionalmente la inhibición de la ubequitilación del MIF. Ejemplos de agentes que inhiben la ubequitilación incluye, pero no se limitan a, PYR-41 y pirazonas relacionadas .
En ciertos casos, el MIF entra a las células utilizando la endocitosis mediada por la clatrina. Así, en algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí comprenden adicionalmente la inhibición de la endocitosis del MIF mediada por la clatrina.
En ciertas realizaciones, el MIF regula negativamente la señalización del MAP o modula las funciones celulares regulando la homeostasis redox a través de JAB-1. En ciertos casos, el MIF sub-regula la expresión de p53. En ciertos casos, la subregulación de MIF de la expresión de p53 da como resultado la inhibición de la apoptosis y la supervivencia prolongada de macrófagos. Así, en algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben la supervivencia de macrofágos modulada por MIF.
En ciertos casos, el MIF induce el MMP-1 y MMP-9 en placas vulnerables. En ciertas instancias la inducción de MMP-1 y MMP-9 en placas vulnerables da como resultado (bien parcial o totalmente) la degradación del colágeno, una debilitación de la cubierta fibrosa, y la desestabilización de la placa. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí inhiben (bien parcial o totalmente) la degradación del colágeno, debilitamiento de la cubierta fibrosa y desestabilización de la placa.
Inhibidores de la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 Lo que se divulgan aquí, en ciertas realizaciones, son métodos para inhibir la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4. En algunas realizaciones, la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 se inhibe ocupando el dominio de enlace de MIF de CXCR2 y CXCR4 (esto es, la aproximación del antagonista GPCR) como moléculas pequeñas, péptidos y/o pepticuerpos con una molécula pequeña, péptido o un pepticuerpo. En algunas realizaciones, la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 es inhibida por ocupación, enmascaramiento o perturbación de alguna otra manera de los dominios de MIF (esto es la aproximación del inhibidor de citoquinas) . En algunas realizaciones, la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 es inhibida por una molécula pequeña, péptido y/o pepticuerpo que ocupa, enmascara o de alguna otra manera perturba los dominios de MIF y por lo tanto perturban el enlazamiento de CXCR2 y/o CXCR4 al MIF. En algunas realizaciones, la señalización del MIF a través de CXCR2 y CXCR4 es inhibida por una molécula pequeña, péptido y/o pepticuerpo que ocupa, enmascara o de alguna otra manera perturba los dominios de MIF y por lo tanto perturba la trimerización del MIF. En cierto caso, la ocupación, enmascaramiento o la perturbación de otra* manera de los dominios sobre el MIF' no afecta la señalización de CXCR2 y CXCR4 mediada por otros agonistas/ligandos (por ejemplo, IL-8/CXCL8, GRObeta/CXCL2 y/o factor derivado de células estrornales la (SDF-la) (CXCL12) .
Agentes de perturbación del dominio de MIF En algunas realizaciones la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 es inhibida por ocupación, enmascaramiento o de alguna otra manera perturbación de los dominios sobre MIF (por ejemplo, el motivo de bucle N y/o el motivo de pseudo ELR) . En algunas realizaciones, la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 es inhibida por una molécula pequeña, péptido y/o pepticuerpo que ocupa, enmascara o de otra manera perturba los dominios sobre MIF y por lo tanto perturban el enlazamiento de CXCR2 y/o CXCR4 al MIF. En algunas realizaciones, una molécula pequeña, péptido y/o pepticuerpo, inhibe (i) el enlazamiento de MIF a CXCR2 y CXCR4 y/o (ii) la activación por MIF de CXCR2 y CXCR4; o (iii) cualquier combinación de (i) y (ii). En algunos casos, la ocupación, enmascaramiento o de alguna otra forma la perturbación de los dominios sobre el MIF no afecta la señalización CXCR2 y CXCR4 mediada por otros agonistas/ligandos (por ejemplo, IL-8/CXCL8, GR0beta/CXCL2 y/o factor la derivado de células estromales ( SDF-la ) / ( CXCL12 ) .
En ciertos casos, el dominio extracelular N-terminal asi como el primero y/o segundo bucle extracelular son mediadores del enlazamiento de ligandos a MIF. En ciertas realizaciones, una molécula pequeña, péptido y/o pepticuerpo inhiben el enlazamiento de MIF a CXCR2 y/o CXCR4 enlazando un motivo pseudo-ELR del MIF. En algunas realizaciones, una molécula pequeña, péptido y/o pepticuerpo inhiben el enlazamiento de MIF a CXCR2 y/o CXCR4 enlazando un motivo de bucle N de MIF. En algunas realizaciones, una molécula pequeña, péptido y/o pepticuerpo modulan los residuos críticos y/o invocan un cambio generacional en el MIF que previene las interacciones del receptor o sustrato. En algunas realizaciones, una molécula pequeña, péptido y/o pepticuerpo interfiere con los motivos relevantes para el enlazamiento y señalización de CXCR2 y/o CXCR4.
En algunas realizaciones, el agente activo es un péptido que inhibe el enlazamiento del MIF y CXCR2; un péptido que inhibe el enlazamiento de MIF y CXCR ; un péptido que inhibe el enlazamiento de MIF y JAB-1; un péptido que inhibe el enlazamiento de MIF y CD74; o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones el agente activo es un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción del motivo pseudo-ELR del MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción del motivo o bucle N de MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de los motivos de pseudo-ELR y bucle N, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el agente activo es un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQ y los correspondientes rasgos/dominio de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptidoque se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de peptidos como sigue: DQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero MIF; un péptido que se enlaza específicamente a todo o una porción de una secuencia de péptidos como sigue: FGGSSEPCALCSLHSI y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; o combinaciones de los mismos.
Pruebas para identificar los agentes que perturban el dominio de MIF En algunas realizaciones, se identifica un péptido que perturba el dominio de MIF. En algunas realizaciones, un péptido que perturba el dominio de MIF no influye los eventos de señalización independientes de MIF en CXCR2 y CXCR4.
En algunas realizaciones, se genera una biblioteca de péptidos que cubren el dominio N terminal extracelular y/o los bucles extracelulares de CXCR2 y CXCR4. En algunas realizaciones, los péptidos varían en tamaño desde aproximadamente 5 aminoácidos hasta aproximadamente 20 aminoácidos; desde aproximadamente 20 aminoácidos hasta aproximadamente 18 aminoácidos; desde aproximadamente 10 aminoácidos hasta aproximadamente 15 aminoácidos. En algunas realizaciones, la biblioteca de péptidos es seleccionada para la inhibición de la señalización mediada por MIF a través de CXCR2 y CXCR4 utilizando cualquier método adecuado (por ejemplo, la tecnología de selección HTS GPCR) . En algunas realizaciones, la biblioteca de péptidos es seleccionada adicionalmente para la inhibición de la señalización mediada por II-8 y/o SDF-1 sobre CXCR2 y CXCR4. en algunas realizaciones, un péptido es identificado como péptido que perturba el dominio de MIF si inhibe la señalización del MIF a través de CXCR2 y - CXCR4 pero permite la señalización mediada por SDF-1 e IL-8 a través de CXCR2 y CXCR4.
En algunas realizaciones, las secuencias de péptidos del dominio N terminal extracelular y los bucles extracelulares de CXCR2 y CXCR4 se disponen sobre una membrana. En algunas realizaciones las secuencias de péptidos del dominio N terminal extracelular y los bucles extracelulares de CXCR2 y CXCR4 que se disponen sobre una membrana son sondeados con MIF de longitud completa. En algunas realizaciones, el MIF esta marcado (por ejemplo, marcado isotópicamente, marcado radioactivamente, o marcado con un fluoróforo. En algunas realizaciones, la secuencias de péptidos a los cuales se enlazan específicamente el MIF marcado son probados en cuanto a la inhibición de la señalización mediada por MIF de CXCR2 y CXCR . En algunas realizaciones, las secuencias de péptidos que inhiben la señalización mediada por MIF de CXCR2 y CXCR4 se seleccionan utilizando cualquier método adecuado (por ejemplo, la prueba de selección GPCR).
En algunas realizaciones, cualquiera de los péptidos y/o polipeptidos antes mencionados (por ejemplo, un péptido derivado de un motivo pseudo-ELR del MIF o un motivo de bucle N del MIF) se utilizan como un "modelo" para hacer la química de relación estructura-actividad (SAR) (tal como se proporciona en detalle aquí). En algunas realizaciones, la química SAR produce péptidos más pequeños. En algunas realizaciones, los péptidos más pequeños producen moléculas pequeñas que perturban la capacidad del MIF para enlazarse a CXCR2 y/o CXCR4 (por ejemplo, determinando los residuos de aminoácidos involucrados en la perturbación de la capacidad del MIF para enlazarse a CXCR2 y/o CXCR4 ) .
Agentes que perturban la trimeri zación de MIF Lo que se divulga aquí, en ciertas realizaciones, son métodos para inhibir la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4. En algunas realizaciones, la señalización de MIF a través de CXCR2 y CXCR4 es inhibida por ocupación, enmascaramiento o perturbación de alguna otra forma de los dominios sobre el MIF. En algunas realizaciones, la señalización del MIF a través de CXCR2 y CXCR4 es inhibida por una molécula pequeña, péptido y/ o pepticuerpo que ocupa, enmascara o de alguna otra forma perturba los dominios sobre el MIF y por lo tanto perturba la trimerización del MIF. En algunas realizaciones, el impedimento de la capacidad de un péptido del MIF para formar un homotrimero perturba (parcial o totalmente) la capacidad del MIF para enlazarse a un receptor (por ejemplo, CXCR2, o CXCR4 ) . En ciertos casos, la ocupación, enmascaramiento o de alguna otra forma perturbación de los dominios sobre el MIF no afecta la señalización de CXCR2 y CXCR4 mediada por otros agonistas/ligandos (por ejemplo, IL-8/CXCL8, GR0beta/CXCL2 y/o FACTOR la derivado de células estromales (SDF-la) / (CXCL2) ) .
En ciertos casos, el MIF comprende tres secuencias de polipeptidos de MIF (esto es un trímero). En ciertos casos, los motivos pseudo-ELR de cada polipéptido de MIF forman un anillo en el trímero. En ciertos casos, los motivos de bucle N de cada polipéptido de MIF se extienden hacia afuera desde el anillo pseudo-elr (véase figura 10) . En ciertos casos, la perturbación del trímero perturba la alta afinidad del enlazamiento del MIF a sus receptores objetivo. En ciertos casos, los residuos 38 -44 (hebra beta-2) de la subunidad interactúan con los residuos 48 - 50 (hebra beta 3) de una segunda subunidad. En ciertos casos los residuos 96 - 102 (hebra beta-5) de una subunidad interactúan con los residuos 107 - 109 (hebra beta-6) de una segunda subunidad. En ciertos caso, un dominio de una subunidad formada por N73, R74, S77, 78, y C81 interactúa con Nlll, S112 y T113 de una segunda subunidad .
En algunas realizaciones, un antagonista de MIF se deriva de y/o se incorpora cualquiera o todos los residuos de aminoácidos 38 - 44 (hebra beta-2) del MIF. En algunas realizaciones, un antagonista de MIF, es un péptido derivado de y/o incorpora cualquiera o todos los residuos de aminoácidos de 48 - 50 (hebra beta-3) del MIF. En algunas realizaciones, un antagonista del MIF es un péptido derivado de y/o que incorpora cualquiera de o todos los residuos de aminoácidos 96 - 102 (hebra beta-5) del MIF. En algunas realizaciones, un antagonista del MIF es un péptido derivado de y/o incorpora cualquiera o todos los residuos de aminoácidos 107 - 109 (hebra beta-6) del MIF. En algunas realizaciones, un antagonista del MIF es un péptido derivado de y/o incorpora cualquiera o todos los residuos de aminoácidos N73, R74, S77, K78 Y C81 del MIF. En algunas realizaciones, un antagonista del MIF es un péptido derivado de y/o incorpora cualquiera o todos los residuos de aminoácidos de Nlll, S112 y T 113 del MIF.
Ensayos para identificar los agentes que perturban la trimerizacion del MIF En algunas realizaciones, se identifica un péptido que perturba la trimerizacion del dominio del MIF. En algunas realizaciones, un péptido que perturba la trimerizacion del dominio del MIF no influye los eventos de señalización independientes del MIF en CXCR2 y CXCR4. En algunas realizaciones, un péptido y/o polipéptido derivado de cualquiera de las secuencias de aminoácidos antes mencionadas (por ejemplo, residuos de aminoácidos 38 - 44 (hebra beta-2) del MIF, residuos de aminoácidos 48 - 50 (hebra beta-3) del MIF, residuos de aminoácidos 96 - 102 (hebra beta-5) del MIF, residuos de aminoácidos 107 - 109 (hebra beta - 6) del MIF, residuos de aminoácidos N73, R74, S77, 8 y C81 del MIF, y/o residuos de aminoácidos Nlll, S112 y T113 del MIF) seleccionan para inhibición de la señalización mediada por el MIF a través de CXCR2 y CXCR4 utilizando cualquier método adecuado (por ejemplo, tecnología de selección por HTS GPCR).
En algunas realizaciones, un péptido y/o polipéptido derivado de cualquiera de las secuencias de aminoácidos antes mencionadas (por ejemplo, residuos de aminoácidos 38 - 44 (hebra beta-2) del MIF, residuos de aminoácidos 48 - 50 (hebra beta-3) del MIF, residuos de aminoácidos 96 - 102 (hebra beta-5) del MIF, residuos de aminoácidos 107 - 109 (hebra beta-6) del MIF, residuos de aminoácidos N73, R74, S77, 78 y C81 del MIF, y/o residuos de aminoácidos Nlll, S112 Y T113 del .MIF) se utilizan como un "modelo" para hacer química de relación relacionada con la estructura (SAR) . En algunas realizaciones la química SAR produce péptidos más pequeños. En algunas realizaciones, los péptidos más pequeños producen moléculas pequeñas que perturban la capacidad del MIF para formar un homotrímero (por ejemplo, estimando los residuos de aminoácidos involucrados en la perturbación de la capacidad del MIF para formar un homotrímero).
En algunas realizaciones, el antagonista del MIF es una molécula de ARNsi y/o una molécula antisentido complementaria al gen MIF y/o a la secunda ARN del MIF. En algunas realizaciones, el ARNsi y/o molécula antisentido disminuye el nivel o la vida media del ARNm del MIF y/o de la proteína por al menos aproximadamente %; al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente · 95% o sustancialmente el 10%.
Antagonistas del enlazamiento de CXCR2 y CXCR4 Lo que se describe aqui, en ciertas realizaciones, son métodos para inhibir la señalización del MIF a través de CXCR2 y CXCR4. En algunas realizaciones, la señalización del MI a través de CXCR2 y CXCR4 se inhibe ocupando el dominio de enlazamiento del MIF del CXCR2 y CXCR4 (esto es, la aproximación del antagonista GPCR) con una molécula pequeña o péptido .
En algunas realizaciones, el antagonista del MIF es un derivado del hidroxidocinnamato. Los análogos del triptófano de bases de Schiff, o metabolitos imino quinona del acetaminofén .
En algunas realizaciones, el antagonista del MIF es gliburide, probenicida, DIDS (ácido 4,4-diisotiocianatostilben-2, -disul fónico ) , bumetanida , furosemida, sulfobromoftaleina, ácido-difenilamino-2-carboxilico, ácido flufenamico, o combinaciones de los mismos .
En algunas realizaciones, el antagonista del CXCR2 es de CXCL8,3~74)K11R/G31P; IL-8 (4-721 IL-8 (6-72) ; IL-8 (rIL-8) recombí nante; IL-8,NMeLeu (rhIL-8 con N leucina en posición 25) recombinante; (AAR)IL-8 (IL-8 con AIa4-AIa5 N-terminal en vez de Glu4-Leu5); GRO-al fa (1-73) ( también conocido como CXCL1 ) ; GRO-alfa(4-73) ; GRO-al fa (5-73) ; GRO-al fa (6-73) ; GRO (rGRO) recombinante; (ELR)PF4 (PF4 con una secuencia ELR en el término N ) PF4 (rPF4) recombinante; Antileucinato; Sch527123 (-hidroxi-N,N-dimetil-3-{2-[ [ (R)-l - ( 5-metil-furan-2-il ) -propil ] ami no] -3, 4 -dioxo-ciclobuta-l-eni lamino} -benzamida ) ; N-(3-(aminosulfonil) -4 -cloro-2-hidroxi fenil ) -N ' - ( 2, 3-diclorofenil ) urea; SB-517785-M (GS ); SB 265610 (N-(2-Bromofenil ) -N ' - ( 7-ciano-lH-benzotriazol- -il ) urea ) ; SB225002 (N- ( 2-Bromofenil ) -N ' - ( 2-hidroxi-4 -nitrofenil ) urea ) ; SB455821 (GSK), SB272844 (GSK); DF2162 ( 4- [ ( IR) -2-amino-l-metil-2-oxoetil ] fenil tri fluorometanosul fonato ) ; Reparixin; o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el antagonista de CXCR4 es ALX40-4C (N-alfa-acetil-nona-D-arginina amida acetato); A D-070 (AMD11070, AnorMED) ; Plerixafor (AMD3100); AMD3465 (AnorMED) ; AMD8664 ( 1-pi ridin-2-i 1-N- [ - ( 1 , 4 , -triazaciclotetradecan-4-ilmetil )bencil]meanamina) ; KRH-1636 (Kureha Chemical Industry Co . Limited); KRH-2731 (Kureha Chemical Industry Co . Limited); KRH-3955 (Kureha Chemical Industry Co . Limited); KRH-3140 (Kureha Chemical Industry Co . Limited); T134 ( L-citrulinal 6-TW70 sustituido en la amida C terminal por una ácido carboxilico) ; T22 ( [Tyr5,12, Lys7] -polifemusina II); TW70 (des- [Cys8, 13, Tyr9, 12] - [ D-Lysl0, Proll]-T22); T140 ( H-Arg-Arg-Nal-Cys-Tyr- Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Cit-Cys-Arg-OH) ; TC14012 ( R-R-Nal-C-Y- ( L ) Cit-K- ( D) Cit-P-Y-R- (L) citrulin-C-R-NH2, donde Nal=L-3-(2-naftilalanina ) , Cit=citrul ina y el péptidoes ciclizado con las cisteinas); TN14003; RCP168 (vMIP-II (1i-7i) con aminoácidos D añadidos al termino N ) ; POL3026 (Arg(*)~Arg-Nal (2) -Cys (lx) -Tyr-Gln-Lys- (d-Pro) -Pro-Tyr-Arg-Cit-Cys (lx) -Arg-Gly- (d-Pro) (* ) ) ; POL2438; compuesto 3 (N- (1-metil-l-feniletil ) -N- [ ( ( 3S) -1- { 2- [ 5- ( H-1, 2,4-triazol-4-il) -lH-indol-3-il ] etil } pirrolidin-3-il ) metil ] amina ) ; isotioureas la-lu (para información respecto a las isotiureas la - lu Gebhard Thoma, et al., Orally Bioavailable Isothioureas Block E'unction of the Chemokine Receptor CXCR4 In Vitro and In Vivo, J. Med. Chem. , Article ASAP (2008), que se incorpora aquí como referencia, para tales divulgaciones): o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el antagonista de MIF inhibe (parcial o totalmente) la capacidad del MIF para enlazarse al CXCR2 y/o CXCR4. En algunas reali aciones, el antagonista de MIF es COR100140 (Genzyme Corp/Cortical Pty Ltd.); ácido ISO-1 ( (S, R) -3- ( -hidroxi fenil ) -4 -5-dihidro-5-isoxazol acético, éster metílico); 4-IPP ( -yodo-6-fenilpirimidina ) ; o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un antagonista de MIF es un péptido derivado de CXCR2 y/o CXCR4.
En algunas realizaciones, la molécula pequeña, péptido y/o antagonista del anticuerpo inhibe la liberación de una forma biológicamente activa del MIF. En algunas realizaciones, la molécula pequeña, péptido y/o antagonista del anticuerpo inhibe la liberación inducida por esteroides, inducida por TNFa, inducida por IFN- ?, e inducida por endotoxinas del MIF (por ejemplo, de macrófagos, de los pulmones, de los transportadores del cásete (ABC) enlazantes del ATP) .
Imitación de MIF En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí divulgados comprenden un péptido redox activo similar al MIF' que imita al MIF e inhibe el enlazamiento de CXCR2 y/o CXCR4 y la señalización.
En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí divulgados comprenden una molécula pequeña, péptido y/o anticuerpo que adopta características estructurales o funcionales similares al motivo de bucle N del MIF. En algunas realizaciones, el péptido, y/o polipéptido comprende al menos uno de los residuos L47 M48 A 9 F50 G51 G52 S53 S54 E55 y P56. En algunas realizaciones, una molécula pequeña, péptido y/o anticuerpo comprende de 5 a 16 aminoácidos consecutivos del MIF humano que comprende todo o una porción de los residuos L47 M48 A49 F50 G51 G52 S53 S54 E55 y P56. En algunas realizaciones, el péptido, y/o el polipéptido que adopta las características estructurales o funcionales similares al motivo de bucle N del MIF comprende 1 o más de los péptidos seleccionados de la Tabla. En algunas realizaciones, el péptido, y/o polipéptido comprende modificaciones químicas en los terminales N y/o C para mejorar el ADME-P . En algunas realizaciones, el péptido y/o polipéptido comprende aminoácidos no naturales. En algunas realizaciones, el péptido y/o polipéptido comprende variantes cíclicas .
Tabla 1 LMAFGGSSE PCALC SSEPCALC ciclo (GSSEPCAL) LMAFGGSSEPCAL GSSEPCALC ciclo (GSSEPCA) LMAFGGSSEPCA GSSEPCAL ciclo (GSSEPC) LMAFGGSSE PC GSSEPCA ciclo (SSEPCALC) LMAFGGSSEP GSSEPC ciclo (SSEPCAL) LMAFGGSSE SSEPCALC ciclo ( SSEPCA) LMAFGGSS SSEPCAL ciclo (SEPCALC) LMAFGGS SSEPCA ciclo ( SEPCAL) LMAFGG SEPCALC ciclo (EPCALC) MAFGGSSEPCALC SEPCAL ciclo (QLMAFGGSSEPCALC) MAFGGSSEPCAL EPCALC ciclo (QLMAFGGSSEPCAL) MAFGGSSEPCA QLMAFGGSSEPCALC ciclo (QLMAFGGSSEPCA) MAFGGSSEPC QLMAFGGSSEPCAL ciclo (QLMAFGGSSEPC) MAFGGSSEP QLMAFGGSSEPCA ciclo (QLMAFGGSSEP) MAFGGSSE QLMAFGGSSEPC ciclo (QLMAFGGSSE) MA GGSS QLMAFGGSSE ciclo (QLMAFGGSS) MAFGGS QLMAFGGSSE celo (QLMAFGGS) AFGGSSE PCALC QLMAFGGSS ciclo (QLMAFGG) Tabla 1 (continuación) Péptidos miméticos En algunas realizaciones, se utiliza un péptido mimético en lugar de los polipeptidos aquí descritos, incluso para el uso en el tratamiento o prevención de las enfermedades aquí divulgadas.
Los péptidos miméticos (y los inhibidores basados en péptidos) se desarrollan utilizando, por ejemplo, modelación molecular computarizada. Los péptidos miméticos son. diseñados para incluir estructuras que tienen una o más uniones peptidicas reemplazadas opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo consistente de: : —CH2NH—, —CH2S—, -CH2 -CH2 -, -CH=CH-(cis y trans), -CH=CF- ( trans ) , -CoCH2 -, - CH(0H)CH2 —, y —CH2SO—, por métodos bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, tales péptidos miméticos tienen mayor estabilidad química propiedades farmacológicas potenciadas (vida media, absorción, potencia, eficacia, etc), especificidad alterada (por ejemplo, una espectro amplio de actividades bilógicas), antigenicidad reducida, y son preparados de forma más económica. En algunas realizaciones, los péptidos miméticos incluyen el enlazamiento covalente de uno o más marcadores conjugados, directamente o a través de ¦ un espaciador (por ejemplo, un grupo amida), a posiciones no interferentes sobre el análogo, que son predichas por datos de actividad estructural cuantitativos y/o modelación molecular. Tales posiciones no interferentes generalmente son posiciones que no forman contactos directos con los receptores a los cuales el péptido mimético se enlaza específicamente para producir el efecto terapéutico. En algunas realizaciones, la sustitución sistemática de uno o mas aminoácidos de una secuencia de consenso con un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se utilizan para generar peptidos más estables con propiedades deseadas.
Han surgido bibliotecas de péptidos de despliegue de fagos como una técnica en la generación de péptidos miméticos (Scott, J. K. et al. (1990) Science 249:386; Devlin, J. J. et al. (1990) Science 249:404; US5,223,409, US5, 733,731; US5, 498, 530; US5 , 32 , 018 ; US5, 338 , 665 ; US5 , 922 , 5 5; WO 96/40987and WO 98/15833 (cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia para tal divulgación) . En tales bibliotecas, se despliegan secuencias de péptidos aleatoriamente por fusión con proteínas de recubrimiento de fagos filamentosos. Típicamente, los péptidos desplegados son eluídos por afinidad contra un dominio extracelular inmovilizado por anticuerpos (en este caso PF4 o RANTES). En algunas realizaciones los péptidos miméticos son aislados mediante biobarrido (No akowski , G.S, et al . (2004) Stem Cells 22: 1030-1038). En algunas realizaciones, se utilizan células completas que expresan el MIF para seleccionar la biblioteca utilizando FACs para aislar las células enlazadas específicamente a fagos aislados. Los fagos retenidos son enriquecidos con rondas sucesivas de biobarrido de repropagación. Los mejores péptidos enlazantes son secuenciados para identificar los residuos claves dentro de una o más familias de péptidos estructuralmente relacionadas. Las secuencias de péptidos también sugieren cuales residuos reemplazar por barrido con alanina y no por mutagenesis a nivel de ADN . En algunas realizaciones se crean y seleccionan bibliotecas de mutagénesis para optimizar adicionalmente las secuencias de los mejores enlazantes. Lowman (1997) Ann Rey Biophys Biomol Struct, 26: 401 - 24.
En algunas realizaciones el análisis estructural de la interacción proteina proteína se utiliza para sugerir péptidos que limiten la actividad enlazante de los péptidos aquí descritos. En algunas realizaciones la estructura cristalina resultante de tal análisis sugiere la identidad y orientación relativa de los residuos críticos del polipéptido, a partir de los cuales se diseña un péptido. Véanse, por ejemplo, Takasaki, et al. (1997) Nature Biotech, 15: 1266 - 70.
En algunas realizaciones, el agente activo es un péptido o polipéptido. En algunas realizaciones, el péptido es un péptido que imita una secuencia de péptidos tal como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHWPDQ y los correspondientes rasgos/dominios de al menos un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: DQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominios de al menos un monómero de MIF o un trímero de MIF; un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQLMAFGGSSEPCALCSL y los correspondientes rasgos/dominios de al menos un monómero de MIF o un trímero de MIF. Un péptido que imita una secuencia de péptidos como sigue: FGGSSEPCALCSLHSI y los correspondientes rasgos/dominios de al menos uno de un monómero de MIF o un trímero de MIF; o combinaciones de los mismos .
Líneas celulares Lo que se describe aquí, en ciertas realizaciones, es una línea celular que expresa un CXCR4 humano recombinante más CD74 humano. En algunas realizaciones, la línea celular que expresa un CXCR4 recombinante más CD74 humano es una línea celular humana (por ejemplo, HE 293). En algunas realizaciones, la línea celular que expresa un CXCR4 recombinante humano más CD74 humano es una línea celular no humana (por ejemplo, CHO) .
Inflamación En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan una inflamación (por ejemplo, aguda o crónica). En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan la inflamación resultante de (bien sea parcial o totalmente) una infección. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan las inflamaciones que resultan de (bien sea parcial o totalmente) daño de un tejido (por ejemplo, por una quemadura, por una picadura de insectos, por exposición a un agente citotóxico o por un trauma). En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aqui descritos tratan la inflamación resultante de (bien parcial o totalmente) un desorden autoinmune. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aqui descritos tratan información resultante de (bien parcial o totalmente) la presencia de un cuerpo extraño (por ejemplo, una astilla) . En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aqui descritos tratan la inflamación resultante de la exposición a una toxina y/o irritante químico.
Tal como se usa aqui, "inflamación aguda" se refiere a una inflamación caracterizada porque se desarrolla en el curso de unos pocos minutos hasta unas pocas horas, y cesa una vez que el estimulo ha sido eliminado (por ejemplo, un agente infeccioso ha sido exterminado por la respuesta inmune o la administración de un agente terapéutico, un cuerpo extraño ha sido eliminado por una respuesta inmune o extracción, o el tejido dañado ha sido curado) . La duración corta de la inflamación aguda resulta de la corta vida media de la mayoría de los mediadores inflamatorios.
En ciertos caso, la inflamación aguda comienza con la activación de leucocitos (por ejemplo, células dendriticas, células endoteliales y mastocitos). En ciertos casos, los leucocitos liberan mediadores inflamatorios (por ejemplo, histaminas, proteoglicanos , proteasas de la serina, eicosanoides y citoquinas). En ciertos casos, los mediadores inflamatorios dan como resultado (bien sea parcial o totalmente) los síntomas asociados con inflamación. Por ejemplo, en ciertos casos un mediador inflamatorio dilata las vénulas postcapilares, e incrementan la permeabilidad de los vasos sanguíneos. En ciertos casos, el flujo' sanguíneo incrementado que sigue a la vasodiulatacion da como resultado (bien parcial o totalmente) el rubor y el calor. En ciertos caso, la permeabilidad incrementada en los vasos sanguíneos da como resultado una exudación de plasma hacia el tejido lo que lleva a un edema. En ciertos casos, este último permite que los leucocitos migren a lo largo de un gradiente quimiotactico hacia el sitio del estimulante inflamatorio. Adicionalmente, en ciertos casos, ocurren cambios estructurales en los vasos sanguíneos (por ejemplo, capilares y vénulas) . En ciertos casos, los cambios estructurales son inducidos (bien parcial o totalmente) por monocitos y/o macrófagos. En ciertos casos, los cambios estructurales incluyen, pero no se limitan, a la remodelación de vasos., y la angiogénesis . En ciertos casos, la angiogénesis contribuye al mantenimiento de la inflamación crónica permitiendo el transporte incrementado de leucocitos. Adicionalmente, en ciertos casos, las histaminas y la bradiquinina irritan las terminales nerviosas llevando a piquiña y/o dolor.
En ciertos casos, la inflamación crónica resulta de la presencia de un estimulante persistente (por ejemplo, inflamación aguda persistente, infección ' bacteriana (por ejemplo, por Mycobacterium tuberculosis), exposición prolongada a agentes químicos (por ejemplo, silica, o humo de tabaco) y reacciones autoinmunes (por ejemplo, artritis reumatoide ) ) . En ciertos casos, el estimulante persistente da como resultado una inflamación continua (por ejemplo, debido al reclutamiento continuo de monocitos, y la proliferación de macrófagos). En ciertos casos, la inflamación continua daña adicionalmente tejido lo que resulta en el reclutamiento adicional de células mononucleares manteniendo y exacerbando así la inflamación. En ciertos casos, las respuestas fisiológicas a la inflamación incluyen adicionalmente angiogénesis y fibrosis.
En algunas realizaciones, lo métodos y composiciones aquí descritos tratan un desorden asociado con la inflamación (esto es desórdenes mediados por MIF) . Los desórdenes mediados por MIF incluyen, pero no se limitan a, ateriosclerosis ; aneurisma aórtico abdominal; encefalomielitis aguda diseminada; enfermedad de Moyamoya; enfermedad de Takayasu; síndrome coronario agudo; vasculopatia cardiaca de aloinjerto; inflamación pulmonar; síndrome de distensión respiratoria aguda; fibrosis pulmonar; encefalomielitis diseminada aguda; enfermedad de Addison; espondilitis anquilosante; síndrome de anticuerpos antifosfolipidos; anemia hemolítica autoinmune; hepatitis autoinmune; enfermedad del oído interno autoinmune; bullous pemfigoides; enfermedad de Chagas; enfermedad pulmonar obstructiva crónica; enfermedad celiaca; dermatomiositis; diabetes mellitus tipo I; diabetes mellitus tipo II; endometriosis; síndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; síndrome de Guillan Barré; enfermedad de Hashimoto; purpura trombocitopenica idiopática; cistitis intersticial; lupus eritematoso sistémico (SLE); síndrome metabolico; esclerosis múltiple; miastenia gravis; miocarditis; narcolepsia; obesidad; Pemphigus vulgaris; anemia perniciosa, polimiositis ; cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide; esquizofrenia; escleroderma ; síndrome de Sjogren; vasculitis; vitíligo; granulomatosis de Weneger; rinitis alérgica; cáncer de próstata; carcinoma de células pulmonares no pequeñas; cáncer ovárico; cáncer de seno; melanoma; cáncer gástrico; cáncer colorrectal; cáncer de cerebro; desorden óseo metastatico; cáncer pancreático; un linfoma; pólipos nasales; cáncer gastrointestinal; colitis ulcerativa; desorden de Crohn; colitis colágenosa; colitis linfocítica; colitis isquémica; diverticulitis ; síndrome de Behcet; colitis infecciosa; colitis determinada; desorden hepático inflamatorio, choque de endotoxinas, choque séptico, espondilitis reumatoidea, espondilitis anquilosante, artritis gotosa, polimialgia reumática, enfermedad de Alzheimar, enfermedad de Parkinson, epilepsia, demencia por Sida, asma, síndrome de distensión respiratoria en adultos, bronquitis, lesión pulmonar aguda mediada por leucocitos, proctitis distal, granulomatosis de Wegener, fibromialgia , bronquitis, fibrosis quística, uveítis, conjuntivitis, psoriasis, eczema, dermatitis, desórdenes de proliferación de músculos lisos, meningitis, herpes zoster, encefalitis, nefritis, tuberculosis, retinitis, dermatitis atópica, pancreatitis, gingivitis . periodontal, necrosis coagulante, necrosis licuefaciente, necrosis fibrinoide, hiperplasia neointima, infarto del miocardio, apoplejía, rechazo al trasplante de órganos; o combinaciones de los anteriores.
Ateroesclerosi s En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan la aterosclerosis . Tal como se utiliza aquí, "aterosclerosis" significa la inflamación de la pared arterial e incluye todas las fases de la aterogénesis (por ejemplo deposición de lipidos, engrosamiento de la intima-media, e infiltración subintimal con monocitos) y todas las lesiones ateroescleróticas (por ejemplo, lesiones tipo I o lesiones tipo VIII). En algunos casos, la arteriosclerosis resulta a partir de (parcial o totalmente) la acumulación de macrófagos. en algunas realizaciones, lo métodos y composiciones aqui descritos previenen la acumulación de macrófagos, disminuyen el número de macrófagos acumulados y/o disminuyen la velocidad en la cual los macrófagos se acumulan) . En ciertos caso, la aterosclerosis resulta a partir de (parcial o totalmente) la presencia de LDL oxidado. En ciertos casos, el LDL oxidado daña una pared arterial. En algunas realizaciones, lo métodos y composiciones aquí descritos previenen el daño inducido por el LDL oxidado de una pared arterial, disminución de la porción de una pared arterial dañada por LDL oxidado, disminuye la severidad del daño a una pared arterial, y/o disminuye la velocidad a la cual se deteriora una pared arterial por el LDL oxidado. En ciertos casos, los monocitos responden a (esto es, sigue a un gradiente quimiotactico ) la pared arterial deteriorada. En ciertos casos, los monocitos diferencian los macrófagos. En ciertos casos, los macrófagos endocitosan el LDL oxidado (células tales como los macrófagos con LDL endocitosado son denominadas "células espuma") . En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos previenen las formación de células espuma, disminuye el número de células espuma y/o disminuye la velocidad a la cual se forman las células espuma. En ciertos casos, una célula espuma muere y subsecuentemente se rompe. En ciertos casos, la ruptura de una célula espuma deposita colesterol oxidado en la pared arterial. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritas previenen la deposición de colesterol oxidado depositado sobre una pared arterial, disminuye la cantidad de colesterol oxidado depositado sobre una pared arterial y/o disminuye la velocidad a la cual el colesterol oxidado se deposita sobre una pared arterial. En ciertos casos, la pared arterial se inflama debido al daño causado por el LDL oxidado. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos previenen la inflamación de la pared arterial, disminuyen la porción de una pared arterial que se inflama, y/o disminuye la severidad de la inflamación. En algunos casos, la inflamación de las paredes arteriales dan como resultado (bien parcial o totalmente) la expresión de la matriz metaloproteinasa (MMP)-2, ligando CD40, y el factor de necrosis tumoral (TNF)-a. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos previenen la expresión de la matriz metaloproteinasa (MMP)-2 ligando CD40, el factor de necrosis tumoral (TNF)-OÍ, o disminuyen la cantidad de matriz metaloproteinasa (MMP)-2 ligando CD40, y factor de necrosis tumoral en (TNF)-a expresado. En ciertos casos, las células forman un recubrimiento duro sobre el área inflamada. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos previenen la formación del recubrimiento duro, disminuyen la porción de una pared arterial afectada por el recubrimiento duro, y/o disminuyen la velocidad a la cual se forma el recubrimiento duro. En ciertos casos, el recubrimiento celular estrecha una arteria. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos previenen el estrechamiento arterial, disminuyen la porción de una arteria que es estrechada, disminuyen la severidad del estrechamiento, y/o disminuyen la velocidad a la cual se estrecha la arteria.
En ciertos casos, una placa arteriosclerótica da como resultado (parcial o totalmente) la estenosis (esto es, el estrechamiento de un vaso sanguíneo ). En ciertos casos, la estenosis da como resultado (parcial o totalmente), un flujo sanguíneo disminuido. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan la estenosis y/o restenosis. En ciertos casos, la lesión mecánica de las lesiones arterioscleróticas estenoticas por intervención percutánea (por ejemplo, angioplastia o injerto de balón) induce el desarrollo de hiperplasia neointima. En ciertos casos, la lesión aguda de la pared vascular induce el desnudamiento endotelial agudo y la adición de plaquetas, asi como la apoptosis de SMCs en las paredes vasculares medias. En ciertos casos, la acumulación de SMC fenotipicamente único dentro de la capa intima en respuesta a la lesión funciona para restablecer la integridad de la pared vascular arterial pero subsecuentemente llega al estrechamiento progresivo del vaso. En ciertos casos, el reclutamiento de monocitos dispara una respuesta inflamatoria mas sostenida y crónica. En ciertas realizaciones, los métodos y composiciones aquí divulgados inhiben la acumulación de SMC fenotipicamente único dentro de la capa intima. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí divulgados inhiben la acumulación de SMC fenotipicamente único dentro de la capa intima en un individuo tratado por angioplastia o injerto de balón .
En ciertos casos como la ruptura de una placa arterosclerotica resulta (parcial o totalmente) en un infarto (por ejemplo infarto del miocardio o apoplejía) de un tejido. En ciertos casos, la expresión del MIF miocardial es sobreregulada en cardiomicitos y macrófagos supervivientes después de una lesión isquémica aguda del miocardio. En ciertos caso, la hipoxia y el estrés oxidativo inducen la secreción de MIF a partir de cardiomiocitos a través de un mecanismo de exportación dependiente de la proteína quinasa C atípica y da como resultado una activación de la quinasa regulada por señales extracelulares . En ciertos caso, las concentraciones incrementadas de suero del MIF son detectadas en individuos con infarto agudo del miocardio. En ciertos casos, el MIF contribuye a la acumulación de macrófagos en las regiones infartadas y al papel proinflamatorio del daño inducido por miocitos durante el infarto. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones descritos aquí tratan un infarto. En cierto casos, las lesiones por reperfusión siguen a un infarto. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan la lesión por reperfusión.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es marcado para análisis por imagen. En algunas realizaciones el anticuerpo esta marcado para imágenes médicas. En algunas realizaciones, el anticuerpo está marcado para radioimagenes , imágenes de PET, imágenes de MRI, e imágenes de fluorescencia. En algunas realizaciones, el anticuerpo se localiza en áreas del sistema circulatorio con altas concentraciones de MIF. En algunas realizaciones, un área del sistema circulatorio para las concentraciones de MIF es una placa arterosclerotica . En algunas realizaciones, los anticuerpos marcados son detectados por cualquier método adecuado (por ejemplo, mediante el uso de una cámara gamma, MRI, escáner de PET, tomografia computarizada de rayos X (CT), imágenes de resonancia magnética funcional ( fMRI ) , y tomografia computarizada de emisión de fotones sencilla (SPECT)).
Aneurisma aórtico abdominal En ciertos casos, una placa arterosclerotica da como resultado (parcial o totalmente), el desarrollo de un aneurisma. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos son administrados para tratar un aneurisma. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos son administrado para tratar un aneurisma aórtico abdominal ("AAA"). Como se usa aquí, un "aneurisma aórtico abdominal" es una dilatación localizada de la aorta abdominal caracterizada por al menos 50% de incremento sobre su diámetro arterial normal. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos hacen disminuir la dilatación de la aorta abdominal.
En ciertos casos, los aneurismas aórticos abdominales resultan (parcial o completamente), a partir de una ruptura de proteínas estructurales (por ejemplo, elastina y colágeno). En algunas realizaciones, un método y/o composición descrita aquí parcial o totalmente inhiben la ruptura de la proteína estructural (por ejemplo, elastina y colágeno). En algunas realizaciones, un método y/o composición descritos aquí facilitan la regeneración de una proteína estructural (por ejemplo, elastina y colágeno). En ciertos casos, la ruptura de las proteínas estructurales es causada por MMPs activados. En algunas realizaciones, un método y/o composición divulgados aquí parcial o totalmente inhiben la activación de un MMP. En algunas realizaciones, una composición y/o método divulgados aquí inhiben la sobreregulación de MMP-1, MMP-9 o MMP-12. En ciertos casos, los MMPs son activados después de la infiltración de una sección de la aorta abdominal por leucocitos (por ejemplo, macrófagos y neutrófilos ) .
En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos hacen disminuir la filtración de leucocitos. En algunos casos, el MIF es supraregulado en aneurismas aórticos abdominales tempranos. En ciertos casos, los leucocitos siguen a un gradiente de MIF a una sección de la aorta abdominal que es suceptible al desarrollo de un AAA (por ejemplo, la sección de la aorta afectada por una placa arterosclerotica, infección, necrosis media cística, arteritis, trauma, una perturbación anastomotica que produce seudoaneurisma . En algunas realizaciones, un método y/o composiones aquí divulgados inhiben parcial o totalmente la actividad de MIF. En algunas realizaciones, un método y/o composición aqui divulgados inhiben parcial o totalmente la capacidad del MIF para funcionar como una quimioquina para macrófagos o neutrófilos.
En algunas realizaciones, un anticuerpo aqui divulgados se administra para identificar y/o localizar un AAA en un individuo que asi lo requiere. En algunas realizaciones, un individuo en necesidad del mismo despliega uno o más factores de riesgo para desarrollar un AAA (por ejemplo, 60 años de edad o mayor; masculino; fumador de cigarrillos; presión sanguínea alta; colesterol alto en suero; diabetes mellitus; arteriosclerosis). En algunas realizaciones, un anticuerpo se marca para imágenes. En algunas realizaciones, el anticuerpo se marca para imágenes médicas. En algunas realizaciones, el anticuerpo se marca para radioimagenes , imágenes por PET, imágenes MRI, e imágenes fluorescentes. En algunas realizaciones el anticuerpo se localiza en áreas del sistema circulatorio con altas concentraciones de MIF. En algunas realizaciones, un área del sistema circulatorio con altas concentraciones de MIF es un AAA. En algunas realizaciones, los anticuerpo marcados son detectados por cualquier método adecuado (poe ejemplo, mediante el uso de una cámara gamma, MRI, escáner PET, tomografia computarizada de rayos X (CT), e imágenes de resonancia magnética funcional ( fMRI ) , y tomografía computarizada de emisión de fotones sencilla (SPECT) ) .
Desórdenes misceláneos En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan un desorden autoinmune mediado por células T. en ciertas instancias, un desorden autoinmune mediado por células T es caracterizado por una respuesta inmune mediada por células T contra si mismo (por ejemplo, células y tejidos nativos). Ejemplos de desórdenes autoinmunes mediados por células T incluyen, pero no se limitan a colitis, esclerosis múltiple, artritis, artritis reumatoide, osteoartritis , artritis juvenil, artritis psoriatica, pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, diabetes, diabetes mellitus dependiente de la insulina (IDDM o diabetes tipo I), insulitis, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndromes hemolíticos autoinmunes, hepatitis autoinmune, neuropatía autoinmune, fallo ovárico autoinmune, orquitis autoinmune, trombocitopenia autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, enfermedad autoinmune asociada con implante de silicona, síndrome de Sjogren, lupos eritematoso sfstémico (SLE), síndrome de vasculitis (por ejemplo, arteritis de células gigantes, enfermedad de Behcet y granulomatosis de Wegener), vitíligo, manifestación hematológica secundaria de enfermedades autoinmunes (por ejemplo, anemias), autoinmunidad inducida por fármacos, tiroiditis de Hashimoto, hipofisitis, purpura trombocitica ideopatica, autoinmunidad inducida por metales, miastenia gravis, pemfigus, sordera autoinmune (por ejemplo, enfermedad de Meniere), síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndromes autoinmunes relacionados con HIV y enfermedad de Guillain-Barré .
En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan el dolor. El dolor incluye pero no se limita a dolor agudo, dolor inflamatorio agudo, dolor inflamatorio crónico y dolor neuropatico.
En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan la hipersensibilidad . Tal como se usa aquí "hipersensibilidad" se refiere a una respuesta del sistema inmune indeseable. La hipersensibilidad se divide en cuatro categorías. La hipersensibilidad tipo I incluye alergias (por ejemplo, atopía, anafilaxis, o asma). La hipersensibilidad tipo II es citotóxica/mediada por anticuerpos (por ejemplo, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia , eritoblastosis fetalis, o síndrome de Goodpasture). El tipo III es una enfermedad inmune compleja (por ejemplo, enfermedad del suero, reacción de Artus o SLE) . La tipo IV es hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH). La respuesta de la memoria inmune mediada por células, e independiente de los anticuerpos (por ejemplo, dermatitis por contacto, prueba de tuberculina en piel, o rechazo crónico de trasplante ) .
Tal como se usa aquí "alergia" significa un desorden caracterizado por la activación excesiva de las células mastiticas y los basófilos por el IgE. En ciertos casos, la activación excesiva de las células mastiticas y los basófilos mediante el IgE da como resultado (bien sea parcial o totalmente) una respuesta inflamatoria. En ciertos casos, la respuesta inflamatoria es local. En ciertos casos, la respuesta inflamatoria da como resultado el estrechamiento de las vías respiratorias (esto es, broncoconstriccion). En ciertos casos, la respuesta inflamatoria da como resultado una inflamación de la nariz (esto es, rinitis). En ciertos casos, la respuesta inflamatoria es sistémica (esto es, anafilaxis ) .
En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan la angiogénesis . Tal como se usa aquí, "angiogénesis" se refiere a la formación de nuevos vasos sanguíneos. En ciertos casos, la angiogénesis ocurre con inflamación crónica. En ciertos casos, la angiogénesis es inducida por monocitos y/o macrófagos. En ciertas realizaciones, un método y/o composición divulgada aquí inhibe la angiogénesis . En ciertos casos, el MIF se expresa en células progenitoras endoteliales . En ciertos casos, el MIF se expresa en neovasculaturas asociadas a tumores.
En algunas realizaciones la presente invención comprende un método para tratar una neoplasia. En ciertos casos, una célula neoplástica induce una respuesta inflamatoria. En ciertos casos, parte de la respuesta inflamatoria a una células neoplástica es la angiogénesis. En ciertos casos, la angiogénesis facilita el desarrollo de una neoplasia. En algunas realizaciones, la neoplasia es : angiosarcoma , sarcoma de Ewing, osteosarcoma y otros sarcomas, carcinoma de seno, carcinoma cecu , carcinoma de colon, carcinoma de pulmón, carcinoma ovárico, carcinoma faríngeo, carcinoma rectosigmoide, carcinoma pancreático, carcinoma renal, carcinoma endometrico, carcinoma gástrico, carcinomna del hígado, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de seno y otros carcinomas, linfoma de Hodgkins y otros linfomas, melanomas malignos y otros, tumor de paratiroides, leucemia linfocítica crónica y otras leucemias, astrocitomas , gliomas, hemangiomas, retinoblastoma , neuroblastoma , neuroma acústico, neurofibroma , tracoma y granulomas piogénicos.
Lo que se divulga aquí, en algunas realizaciones, son métodos para promover la neurovascularizacion que comprende administrar a dicho individuo MIF o un análogo de MIF.
Tal como se usa aquí, "sepsis" es un desorden caracterizado por la inflamación de todo el cuerpo. En ciertos casos la inhibición de la expresión o actividad del MIF incrementa la rata de supervivencias de individuos con sepsis. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan la sepsis. En ciertos casos, la sepsis da como resultado (bien parcial o completamente) disfunción del miocardio (por ejemplo, disfunción del miocardio) . En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aqui descritos tratan la disfunción del miocardio (por ejemplo, la disfunción del miocardio) resultante de la sepsis.
En ciertos casos, el MIF induce la activación y fosforilación de la quinasa en el corazón (esto es indicadores de depresión cardiaca). En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aqui descritos tratan la disfunción del miocardio (por ejemplo la disfunción del miocardio) resultante de la sepsis.
En ciertos casos, el LPS induce la expresión del MIF. En ciertos casos, el MIF es inducido por las endotoxinas durante la sepsis y funciona como un factor de iniciación en las respuestas inflamatorias del miocardio, apoptosis miositica cárdiaca y disfunción cárdiaca (Figura 8) .
En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aqui descritos inhiben las respuestas inflamatorias del miocardio resultantes de la exposición a las endotoxinas. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos inhiben la apoptosis miositica cardiaca resultante de la exposición a endotoxinas. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos inhiben la disfunción cardiaca resultante de la exposición a endotoxinas.
En ciertos casos, como la inhibición del MIF da como resultado (bien parcial o completamente) un incremento significativo en los factores de supervivencia, (por ejemplo, Bcl-2, Bax y fosfo-A T y un mejoramiento en la supervivencia de los cardiomicitos y la función del miocardio. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos incrementan la expresión de Bcl-2, Bax o fosfo AKT .
En ciertos casos, el MIF media la depresión cardiaca tardía y prolongada después de heridas por quemaduras asociadas y/o un daño mayor en los tejidos. En algunas realizaciones los métodos y composiciones aquí descritos tratan la depresión cardiaca prolongada después de lesiones por quemadura. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones aquí descritos tratan la depresión cardiaca prolongada después del daño mayor a los tejidos.
En ciertos caso, el MIF es liberado desde los pulmones durante la sepsis.
En ciertos casos, la neutralización de los anticuerpos del MI F inhibe la aparición de y reduce la severidad de la miocarditis autoinmune. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones descritos aquí tratan la miocarditis autoinmune.
Combinaciones Lo que se describe aquí como en ciertas realizaciones, son métodos y composiciones farmacéuticas para modular un desorden de un sistema cardiovascular, que comprende una combinación sinergistica de (a) un agente activo que inhibe (i) el enlazaraíento del MI F a CXCR2 y CXCR4 y/o (ii) la activación por MI F de CXCR2 y CXCR ; (iii) la capacidad del MIF para formar un homomultimero; o una combinación de los mismos; (iv) un segundo agente activo seleccionado de un agente que trata un desorden mediado por el MIF (el "agente de desorden mediado por MIF").
Lo que se describe aquí, como en ciertas realizaciones, son métodos y composiciones farmacéuticas para modular un desorden de un sistema cardiovascular que comprende una combinación sinergistica (a) un agente activo que inhibe (i) el enlazamiento del MIF a CXCR2 y CXCR4 y/o (II) la activación por MIF de CXCR2 y CXCR4 : (iii) la capacidad del MIF para formar un homomultimero; o una combinación de los mismos; y (b) un segundo agente activo seleccionado de un agente que trata un desorden un componente del cual es la inflamación.
Lo que se divulga aquí en ciertas realizaciones, son métodos y composiciones farmacéuticas para modular un desorden de un sistema cardiovascular, que comprende una combinación sinergistica de (a) un agente activo que inhiben (i) el enlazamiento de MI F a CXCR2 y CXCR4 y/o (ii) activación por MI F de CXCR2 y CXCR4 ; (iii) la capacidad de MIF para formar un homomultimero; o una combinación de los mismos; (b) un segundo agente activo seleccionado de un agente del cual un efecto lateral es una inflamación indeseada. En ciertos casos, las estatinas (por ejemplo, atorbastatina , lovastatina y simbastatina ) inducen la inflamación. En ciertos casos, la administración de una estatina da como resultado (parcial o totalmente) una miositis .
Tal como se usan aquí, los términos "combinación farmacéutica" "administrar una terapia adicional", "administrar un agente terapéutico adicional", y similares se refieren a una terapia farmacéutica resultante de la mezcla o combinación de más de un ingrediente activo e incluyen tanto combinaciones fijas como no fijas de los ingredientes activos. El término "combinación fija" significa que al menos uno de los agentes aqui descritos, y al menos un coagente, se administran juntos a un individuo de forma simultánea en la forma de una entidad o dosificación individual. El termino "combinación no fija" significa que al menos uno de los agentes aquí descritos, y al menos un coagente, son administrados al mismo individuo como entidades separadas bien simultáneamente, concurrentemente o secuencialmente con límites de tiempo de intervención variables, donde tal administración proporciona niveles efectivos de los dos o más agentes en el cuerpo del individuo. En algunos caso, el coagente es administrado una vez o durante un periodo de tiempo después de lo cual el agente es administrado una vez o durante un periodo de tiempo. En otras instancias, el coagente es administrado durante un periodo de tiempo, después del cual, se administra una terapia que involucra la administración del coagente y el agente. En aún otras realizaciones, el agente se administra una vez o durante un periodo de tiempo, después del cual, el coagente se administra una vez o durante un periodo de tiempo. Esto también aplica a terapias coctel, por ejemplo, la administración de tres o más ingredientes activos.
Tal como se usan aquí, los términos "coadministración", "administrado en combinación con" y sus equivalentes gramaticales pretenden abarcar la administración de los agentes terapéuticos seleccionados a un individuo aislado, y pretenden incluir los regímenes de tratamiento en los cuales los agentes son administrados por la misma o diferentes rutas de administración o en el mismo o en diferentes tiempos. En algunas realizaciones los agentes descritos aquí serán coadministrados con otros agentes. Estos términos abarcan la administración de dos o más agentes a un animal de forma que ambos agentes y/o sus metaboiitos están presentes en el animal al mismo tiempo. Incluyen la administración simultánea en composiciones separadas, administración en diferentes tiempos en composiciones separadas y/o administración en una composición en la cual están presentes ambos agentes. Asi, en algunas realizaciones, los agentes aquí descritos y los otros agentes son administrados en una composición individual. En algunas realizaciones, los agentes aquí descritos y los otros agentes son mezclados en la composición.
Cuando se contemplan tratamientos de combinación o métodos de prevención, no se pretende que los agentes aquí descritos sean limitados por la naturaleza particular de la combinación. Poe ejemplo, los agentes aquí descritos son administrados opcionalmente en combinación como mezclas individuales así como híbridos químicos. Un ejemplo de esto último es cuando el agente esta enlazado en forma covalente a un vehículo objetivo o a un producto farmacéutico activo. El enlazamiento covalente puede ser logrado de diversas maneras, tales como por ejemplo pero no limitándose a, el uso de agentes de entrecruzamiento disponibles comercialmente . Adicionalmente, los tratamientos de combinación se administran opcionalmente de forma separada o concomitante.
En algunas realizaciones, la coadministración de (a) un agente activo divulgado aquí; (b) un segundo agente activo permite (de forma parcial o total) que un profesional médico incremente la dosificación prescrita del agente de desorden mediado por MIF. En ciertos casos, la miositis inducida por estatina depende de la dosis. En algunas realizaciones, la prescripción del agente activo permite (parcial o totalmente) que un profesional médico incremente la dosificación prescrita de estatina. en algunas realizaciones, la coadministración de (a) un agente activo, y (b) un segundo agente activo permite (parcial o totalmente) que un profesional médico prescriba el segundo agente activo (esto es, la coadministración rescata el agente de desorden mediado por MIF) .
En algunas realizaciones, el segundo agente activo es un agente activo que apunta a los niveles de HDL por medios indirectos (por ejemplo, inhibición de CETP). En algunas realizaciones, la combinación de una terapia no selectiva del HDL con el agente activo aquí descrito; (2) un modulador de una interacción entre RANTES y el Factor de Plaquetas 4; o (3) combinaciones de los mismos que convierten el segundo agente activo que apunta a los niveles de HDL por medios indirectos en una terapia más eficaz. en algunas realizaciones, el segundo agente activo se administra, después o simultáneamente con el modulador de la inflamación .
Terapias farmacéuticas En algunas realizaciones, el segundo agente activo es niacina, un fibrato, una estatina, un péptido mimetico del Apo-Al (por ejemplo, DF-4, Novartis), un sobreregulador transc ipciona 1 del Apo-Al, un inhibidor de ACAT, un modulador de CETP, glicoproteina (GP) Ilb/IIIa como antagonistas del receptor del mismo, antagonistas receptor de P2Y12, inhibidores de Lp-PLA2, un agente anti TNF, un antagonista de receptor de IL-1, un antagonista de receptor de IL-2, un agente citotoxico, un agente inmunomodulador, un antibiótico, un bloqueador estimulador de células T, un agente anti reumático modificador del desorden, un agente eliminador de células B, un agente inmunosupresor , un anticuerpo antilinfocitico, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, un terpenoide, un inhibidor de topoisomerasa , un antibiótico antitumoral, un anticuerpo monoclonal, una terapia hormonal (por ejemplo, inhibidores de aromatasa), o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo principio activo es niacina bezafibrato; cipofibrato; clofibrato; genfibrocil; fenofibrato; ; DF4 ( Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E- -F-K-E-A-F-NH2); DF5; RVX-208 ( Resverlogix ) ; avasimibe; pactimibe sulfato (CS-505) ; CI-1011 ( 2, 6-diisopropilfenil [(2, 4,6-triisopropilfenil ) acetil] sulfamato ) ; CI-976 ( 2 , 2-dimeti 1-N-(2,4,6- trimetoxifenil ) dodecanamida ) ; VULM1457 (l-(2,6-diisopropil-fenil ) -3- [ - ( 4 ' -nitrofeniltio ) fenil ] urea); CI-976 ( 2, 2-dimetil-N- ( 2 , 4 , 6- trimetoxi feni 1 ) dodecanamida ) ; E-5324 (n-butil-N'-(2-(3-(5-etil-4-fenil-lH-imidazol-l-.11 ) propoxi ) -6-metilfenil ) urea ) ; HL-004 (N-(2,6-diisopropil fenil ) tetradeciltioacetamida ) ; KY-455 (N-(4,6-dimetil-1- pentilindolin-7-il ) -2, 2-dimetilpropanamida ) ; FY-087 (N- [2- [N ' -pentil- ( 6, 6-dimetil-2, 4-heptadiinil ) amíno] etil] - ( 2-metil-l-naftil-tio) acetamida) ; MCC-147 (Mitsubishi Pharma); F 12511 ( ( S ) -21 , 3 ' , 5 ' -trimetil-4 ' -hidroxi-alfa-dodeciltioacetanilida ) ; SMP-500 (Sumitomo Pharmaceuticals ) ; CL 277082 ( 2, 4-difluoro-fenil-N [ [ 4- ( 2, 2-dimetilpropil ) fenil ] metil ] -N- ( heptil ) urea ) ; F-1394 ((ls,2s)-2- [ 3- ( 2 , 2-dimetilpropil ) -3-nonilureido] aminociclohexano-1-il 3-[N-(2,2,5, 5-tetramet il -1 , 3-dioxano-4-carbonil ) amino] propionato ) ; CP- 113818 (amida del ácido N-(2, -bis (metiltio) -6-metilpiridin-3-il ) -2- ( hexilhio ) decanóico ) ; YM-750; torcetrapib; anacetrapid; JTT- 705 (Japan Tobacco/Roche); abciximab; eptifibatide; tirofiban; roxifiban; variabilina; XV 459 (N (3 ) - ( 2- ( 3- ( 4-formamidinofenil ) isoxazolin-5-il ) acetil ) -N ( 2 ) - ( 1-butiloxicarbonil ) -2, 3-diaminopropionato ) ; SR 121566A (3-[N-{ 4- [ 4- ( aminoiminometil ) fenil ] -1 , 3-tiazol-2-i 1 } -N- ( 1 carboximetilpiperid-4-il ) aminol propionico ácido, trihidroclorida ) ; F 419 (ácido ( S ) -2-acetilamino-3- [ ( R ) - [ 1-[3- (piperidin-4-yl ) propionil] piperidin-3-i lcarboni 1 ] amino] propionico trihidrato); clopidogrel; prasugrel; cangrelor; AZD6140 (AstraZeneca ) ; MRS 2395 (ácido 2, 2-Dimetil-propionico 3- ( 2-cloro-6-met ilaminopurina-9-il ) - 2- ( 2 , 2-dimeti 1 -propioniloximetil ) -propil éster) ; BX 667 (Berlex Biosciences ) ; BX 048 (Berlex Biosciences ) ; darapladib (SB 480848); SB-435495 (GlaxoSmith line ) ; SB-222657 (GlaxoSmithKline); SB-253514 (GlaxoSmithKline); alefacept, efalizumab, metotrexato, acitretina, isotretinoina , hidroxiurea, micofenolato mofetil, sulfasalazina, 6-Tioguanina, Dovonex, Taclonex, betameasona, tazaroteno, hidroxicloroquina , sulfasalazina, etanercept, adalimumab, infliximab, abatacept, rituximab, trastuzumab, anticuerpo monoclonal Anti-CD45 AHN-12 (NCI), yodo-131 anticuerpo Anti-Bl (Corixa Corp.), anticuerpo monoclonal anti-CD66 B 250/183 (NCI, Southampton General Hospital), anticcuerpo monoclonal anti-CD45 (NCI, Baylor College of Medicine), anticuerpo anti- anb3 integrina (NCI), BI -8962 (BioWa Inc.), Antibody BC8 (NCI), anticuerpo muJ591 (NCI), indio In 111 anticuerpo monoclonal MN-14 (NCI), itrio Y 90 anticuerpo monoclonal N-14 (NCI), anticuerpo monoclonal F105 (NIAID) , anticuerpo monoclonal RAV12 (Raven Biotechnologies), CAT-192 (anticuerpo monoclonal humano Anti-TGF-Betal , Genzyme), anticuerpo 3F8 (NCI), 177Lu-J591 (Weill Medical College of Cornell University) , TB-403 (Biolnvent International AB) , anakinra, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina A, leflunomida, d-penicilamina, amitriptilina, o nortriptilina, chlorambucil , nitrógeno mostaza, prasterona, LJP 394 (abetimus sodio), LJP 1082 (La Jolla Pharmaceutical ) , eculizumab, belibumab, rhuCD40L (NIAID), epratuzumab, sirolimus, tacrolimus, pimecrol imus , talido ida, antitimocito globulina-equina (Atgam, Pharmacia Upjohn), antitimocito globulina de conejo (Timoglobulina, Genzyme), Muromonab-CD3 (FDA Office of Orphan Products Development ) , basiliximab, daclizumab, riluzole, cladribina, natalizumab, interferón beta-lb, interferón beta-la, tizanidina, baclofen, mesalazina, asacol, pentasa, mesalamina, balsalazide, olsalazina, 6-mercaptopurina , AIN457 (anticuerpo monoclonal Anti IL-17, Novartis), teofilina, D2E7 (un anti-TNF mAb humano de noll Pharmaceuticals), Mepolizumab (antiucerpo Anti-IL-5, SB 240563), Canakinumab (Anti-IL-1 Beta Antibody, NIAMS), anticuerpo receptor Anti- IL-2 (Daclizumab, NHLBI ) , CNTO 328 (anticuerpo monoclonal Anti IL-6, Centocor), ACZ885 (anticuerpo monoclonal completamente humano anti-interleucina-lbeta, Novartis), CNTO 1275 (anticuerpo completamente humano Anti-IL-12, Centocor), (3S)-N-hidroxi-4-( {4-[ ( 4 -hidroxi-2-butinil )oxi] fenil}sulfonil)-2, 2-dimet-il-3-tiomorfolina carboxamida ( apratastat ) , golimumab (CNTO 148), Onercept, BG9924 (Biogen Idee), Certolizumab Pegol (CDP870, UCB Pharma), AZD9056 ( AstraZeneca ) , AZD5069 ( AstraZeneca ) , AZD9668 (AstraZeneca), AZD7928 (AstraZeneca), AZD2914 (AstraZeneca), AZD6067 (AstraZeneca), AZD3342 (AstraZeneca), AZD8309 (AstraZeneca), ), ácido [ ( IR ) -3-metil-l- ( { ( 2S ) -3-fenil-2-[ (pirazin-2-i 1 carbóni 1 ) amino] propanoil } amino ) butil ] borónico ( Bortezomib ) , AMG-714, (anticuerpo monoclonal humano Anti-IL 15, Amgen), ABT-874 (anticuerpo monoclonal Anti IL-12, Abbott Labs), MRA ( Tocilizumab, un anticuerpo monoclonal receptor Anti IL-6, Chugai Pharmaceutical ) , CAT-354 (un anticuerpo monoclonal humano anti-interleukin-13, Cambridge Antibody Technology, Medlmmune), aspirina, ácido salicilico, ácido gentísico, salicilato de colina magnesio, salicilato de colina, salicilato de magnesio, salicilato de sodio, diflunisal, carprofeno, fenoprofeno, fenoprofeno calcio, flurobiprofeno, ibuprofeno, cetoprofeno, nabutona, ketolorac, ketorolac trometamina, naproxen, oxaprozin, diclofenac, etodolac, indometacina, sulindac, tolmetina, meclofenamato, meclofenamato sodio, ácido mefenámico, piroxicam, meloxicam, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, parecoxib, etoricoxib, lumiracoxib, CS-502 (Sankyo), JTE-522 (Japan Tobacco Inc.), L-745,337 (Almirall), NS398 (Sigma), betametasona (Celestone), prednisona (Deltasona), alclometasona , aldosterona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, ciclesonida, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, cortisona, cortivazol, deflazacort, desoxicorticosterona, desonide, desoximetasona , desoxicortona , dexametasona, diflorasona, di flucortolona , di fluprednato, fluclorolona , fludrocortisona, fludroxicortide, flumetasona, flunisolida, fluocinolona acetonida, fluocinonida , fluocortina, fluocortolona , fluorometolona, fluperolona, fluprednideno , fluticasona, formocortal, formoterol, halcinonida, halometasona , hidrocortisona, hydrocortisona aceponato, hidrocortisone buteprato, hidrocortisona butirato, loteprednol, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, metilprednisolona aceponato, mometasona furoato, parametasona , prednicarbato, prednisona, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, ulobetasol; cisplatina; carboplatina; oxaliplatina; mechloretamina ; ciclofosfamida; chlorambucil ; vincristina; vinblastina; vinorelbina; vindesina; azatioprina; mercaptopurina ; fludarabina; pentostatina ; cladribina; 5-fluorouracil (5FU); floxuridina (FUDR); citosina arabinósido; metotrexato; trimetoprim; pirimetamina ; pemetrexed; paclitaxel; docetaxel; etoposide; teniposide; irinotecan; topotecan; amsacrina; etoposide; etoposide fosfate; teniposide; dactinomicina ; doxorubicina ; daunorubicina ; valrubicina; idarubicina; epirubicina; bleomicina ; plicamicina; mitomicina; trastuzumab; cetuximab; rituximab; bevacizumab; finasteride; goserelina; aminoglutetimida ; anastrozol; letrozol; vorozol; exemestano; 4 -androsten-3, 6, 17-triona ("6-OXO"; 1,4,6-androstatrien-3, 17-diona (ATD) ; formestano ; testolactona ; fadrozol; milatuzumab; milatuzumab conjugado con doxorubicina; o combinaciones de los mismos.
Terapia de genes Lo que se divulga aqui, en ciertas realizaciones, es una composición para modular un desorden mediado por MIF, que comprende una combinación de (a) un agente activo divulgado aqui; y (b) una terapia de genes. Lo que se divulga aqui, en ciertas realizaciones, es un método para modular un desorden mediado por MIF, que comprende la coadministración de una combinación de (a) un agente activo divulgado aquí; y (b) una terapia de genes.
En algunas realizaciones, la terapia genética comprende modular la concentración de un lipido y/o lipoproteina (por ejemplo, HDL) en la sangre de un individuo que así lo requiere. En algunas realizaciones, la modulación de la concentración de un lipido y/o lipoproteina (por ejemplo, HDL) en la sangre comprende la transfección de ADN en un individuo que así lo requiere. En algunas realizaciones, el ADN codifica un gen Apo Al, un gen LCAT, un gen LDL, un gen 11-4, un gen IL-10, un gen IL-lra, un gen galectin-3, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el ADN es transfectado a una célula del hígado.
En algunas realizaciones, el ADN es transfectado a una célula de hígado a través del uso de ultrasonido. Para divulgaciones de técnicas relacionadas con la transfección de Apo Al ADN a través del ultrasonido, véase la patente de los Estados Unidos No. 7,211,248, la cual se incorpora aquí como referencia para estas divulgaciones.
En algunas realizaciones, un individuo recibe la administración de un vector manipulado para portar el gen humano (el "vector genético"). Para divulgaciones de técnicas para crear un vector genético LDL véase la patente de los Estados Unidos No. 6,784,162, la cual se incorpora aquí como referencia para estas divulgaciones. En algunas realizaciones, el vector genético es un retrovirus. En algunas realizaciones el vector genético no es un retrovirus (por ejemplo, es un adenovirus ; un lentivirus; o un sistema de administración polimérica tal como METAFECTENE, SUPERFECT®, EFFECTENE®, o MIRUS TRANSIT). En ciertos casos, un retrovirus, adenovirus o lentivirus tendrá una mutación tal que el virus se hace incompetente.
En algunas realizaciones, el vector se administra in vivo (esto es, el vector es inyectado directamente en el individuo, por ejemplo en una célula de hígado), ex vivo (esto es, las células de individuos se cultivan in vitro y son transducidas con el vector genético, embebido en un vehículo, y luego implantado en el individuo), o una combinación de los mismos.
En ciertos casos, después de la administración del vector genético, el vector genético infecta las células en el sitio de administración (por ejemplo el hígado). En ciertos casos la secuencia genética se incorpora en el genoma del individuo (por ejemplo, cuando el vector genético es un retrovirus). En ciertos casos la terapia necesitará ser readministrada periódicamente (por ejemplo, cuando el vector genético rio es un retrovirus). En algunas realizaciones, la terapia es readministrada anualmente. En algunas realizaciones, la terapia se readministra semianualmente . En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL en el individuo disminuye por debajo de aproximadamente 60 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL en el individuo disminuye por debajo de aproximadamente 50 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL en el individuo disminuye por debajo de aproximadamente 45 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 40 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 35 mg/Dl. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 30 mg/Dl.
Terapias de ARNi Lo que se divulga aqui, en ciertas realizaciones, es una composición para modular los desórdenes mediados por MIF, que comprende una combinación de (a) un agente activo divulgado aqui; y (b) una molécula de ARNi diseñada para silenciar la expresión ¦ de un gen que participa en el desarrollo y/o progresión del desorden mediado por MI (el "gen objetivo") . Lo que se divulga aqui, en ciertas realizaciones, es un método para modular un desorden mediado por MIF, que comprende administrar una combinación de (a) un agente activo divulgado aqui; y ib) una molécula de ARNi diseñada para silenciar la expresión de un gen que participa en el desarrollo y/o progresión de un desorden mediado por MIF (el "gen objetivo"). En algunas realizaciones, el gen objetivo es apoliproteina B (Apo B), proteina del choque por calor 110 (Hsp 110), poproteína convertasa subtilisina Kexin 9 (Pcsk9), CyDl, TNF-OÍ, IL-?ß, receptor de péptido natriuretico atrial A (NPRA), GATA-3 , Syk, VEGF, MIP-2, fasL, DDR-1, C5aR, AP-1, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el gen objetivo es silenciado por el ARN de interferencia (ARNi). En algunas realizaciones, la terapia con ARNi comprende el uso de una molécula de ARNsi. En algunas realizaciones, se genera una molécula de doble hebra de ARN (dsARN) consecuencias complemetarias a una secuencia de ARNm de un gen que va a ser silenciado (por ejemplo Apo B, Hsp 110 Y Pcsk9) (por ejemplo mediante PCR). En algunas realizaciones, se genera una molécula bp siARN con secuencias complementarias a ARNm de un gen que va a ser silenciado. En algunas realizaciones, la molécula 20 - 25 bp ARNsi tiene 2 - 5 bp sobre derivados sobre el extremo 3'de cada hebra, y un terminal 5'fosfato y un terminal 3' hidroxilo. En algunas realizaciones, la molécula de 20 - 25 bp ARNsi tiene extremos cerrados. Para técnicas de generación de secuencias de ARN véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), denominada aquí como "SambrooK" ) ; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, incluyendo suplementos hasta 2001); Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000) los cuales se incorporan aquí como referencia para tal divulgación .
En algunas realizaciones, una molécula de ARNsi es "completamente complementaria" (esto es, 100% complementaria) al gen objetivo. En algunas realizaciones, una molécula antisentido es "mayormente complementarias" (por ejemplo 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80%, 75% o 70% complementarias) al gen objetivo. En algunas realizaciones, hay una falta de coincidencia de 1 bp, una falta de coincidencia de 2 bp, una falta de coincidencia de 3 bp, una falta de coincidencia de 4 bp, o una falta de coincidencia de 5 bp.
En ciertos casos, después de la administración de la molécula de ARNds o ARNsi, las células en el sitio de la administración (por ejemplo las células del hígado o del intestino delgado) se transforman con la molécula de ARNds o ARNsi. En ciertos casos después de la transformación, la molécula de ARNds se rompe en múltiples fragmentos de aproximadamente 20 - 25 bp para producir ARNsi. En ciertos casos, los fragmentos tienen aproximadamente derivaciones de 2 bp en el extremo 3 'de cada hebra.
En ciertos casos, una molécula de ARNsi es dividida en dos hebras (la hebra guia y la hebra antiguia) mediante un complejo silenciador inducido por ARN (RISC). En ciertos casos, la hebra de guia es incorporada en el componente catalítico del RISC (esto es, argonauta) . En ciertos casos, la hebra de guía específicamente se enlaza a una secuencia de ARNm RB1. En ciertos casos, el RISC rompe una secuencia de ARNm de un gen que va sin silenciador. En ciertos casos, la expresión del gen que va a ser silenciado es subregulada.
En algunas realizaciones, una secuencia complementaria a una secuencia de ARNm de un gen objetivo es incorporada en un vector. En algunas realizaciones, la secuencia se coloca entre dos vectores. En algunas realizaciones los promotores se orientan en direcciones opuestas. En algunas realizaciones, el vector se pone en contacto con una célula. En ciertos casos, una célula se transforma con el vector. En ciertas instancias después de la transformación, se generan hebras sentido y antisentido de la secuencia. En ciertos casos, las hebras sentido y antisentido se hibridizan para formar una molécula de ARNds la cual es excindida en moléculas de ARNsi. En ciertos casos, las hebras se hibridizan para formar una molécula de ARNsi. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido (por ejemplo pSUPER; pSUPERneo; pSUPERneo+gfp) .
En algunas realizaciones, se administra una molécula de ARNsi in vivo (esto es, el vector es inyectado directamente en el individuo, por ejemplo en una célula de hígado o en una célula del intestino delgado, o en el torrente sanguíneo).
En algunas realizaciones, una molécula de ARNsi es formulada con un vehículo de administración (por ejemplo, un liposoma, un polímero biodegradable, una ciclodextrina , una microesfera de PLGA, una microesfera de PLCA, una nanocápsula biodegradable, una microesfera bioadhesiva, o un vector proteináceo ) , vehículos y diluyentes, y otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Para métodos de formulación y administración de una molécula de ácidonucleico a un individuo que así lo requiere véase Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics , ed. Akhtar, 1995; Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol . , 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192; Beigelman et al., U.S. Pat . No. 6, 395, 713; Sullivan et al., PCT WO 94/02595; González et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang et al., publicación Internationacional PCT Nos. WO 03/47518 y WO 03/46185; patente de los Estados Unidos No. 6,447,796; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2002130430; publicación de solicitud internacional PCT de O'Hare and Normand No. WO 00/53722; y publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030077829; solicitud de patente provisional de los Estados Unidos No. 60/670,531, todas las cuales se incorporan aquí como referencia para tales divulgaciones.
En algunas realizaciones, una molécula de ARNsi descrita aquí se administra al hígado de cualquier manera adecuada (véase por ejemplo, Wen et al., 2004, World J Gastroenterol . , 10, 244-9; Murao et al., 2002, Pharm Res., 19, 1808-14; Liu et al., 2003, Gene Ther., 10, 180-7; Hong et al., 2003, J Pharm Pharmacol., 54, 51-8; Herrmann et al., 2004, Arch Virol., 149, 1611-7; and Matsuno et al., 2003, Gene Ther., 10, 1559-66) .
En algunas realizaciones, una molécula de ARNsi descrita aquí se administra por iontoforesis, por ejemplo a un órgano o compartimiento en particular (por ejemplo el hígado o el intestino delgado). Ejemplos no limitantes de administración iontoforetica se describen, por ejemplo, en WO 03/043689 y WO 03/030989, los cuales se incorporan aquí como referencia para tales divulgaciones.
En algunas realizaciones, una molécula de ARNsi descrita aquí se administra en forma sistémica (esto es absorción sistémica in . vivo o acumulación de una molécula de ARNsi en el torrente sanguíneo seguida por distribución a través de todo el cuerpo) . La ruta de administración contempladas para la administración sistémica incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, subcutánea, vena portal, intraperitoneal e intramuscular. Cada una de estas rutas de administración exponen las moléculas de ARNsi de la invención a un tejido enfermo accesible (por ejemplo hígado).
En ciertas instancias la terapia necesitara ser readministrada periódicamente. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada anualmente. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada semi anualmente . En algunas realizaciones, la terapia es administrada mensualmente . En algunas realizaciones, la terapia es administrada semanalmente . En algunas realizaciones la terapia es administrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuya por debajo de aproximadamente 60 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de DHL del individuo disminuya por debajo de aproximadamente 50 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de DHL del individuo disminuye por debajo de 45 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de DHL del individuo disminuye por debajo de 40 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de DHL del individuo disminuye por debajo de 35 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de DHL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 30 mg/dL.
Para divulgaciones de técnicas relacionadas con el silenciamiento de la expresión de Apo B y/o HspllO véase la publicación de Estadounidense No. 2007/0293451 la cual, se incorpora aquí como referencia para tales divulgaciones. Para divulgaciones de técnicas relacionadas con silenciamiento de la expresión de Pcsk9 véase la publicación estadounidense No. 2007/0173473 la cual se incorpora aquí como referencia para tales divulgaciones.
Terapias antisentido Lo que se divulga aquí, en ciertas realizaciones, es una composición para modular un desorden mediado por MIF, que comprende una combinación de (a) un agente activo aquí divulgado; (b) una molécula antisentido diseñada para inhibir la expresión de y/o actividad de una secuencia de ADN o ARN que participan en el desarrollo y/o progresión de un desorden mediado por MIF (la "secuencia objetivo") . Lo que se divulga aquí, en ciertas realizaciones, es un método para modular un desorden mediado por MIF, que comprende coadministrar (a) un agente activo divulagdo aquí; y (b) una molécula antisentido diseñada para inhibir la expresión de y/o actividad de una secuencia de ADN o ARN que aprticipan en el desarrollo y/o progresión de un desorden mediado por MIF (la "secuencia objetivo"). En algunas realizaciones, la inhibición de la expresión de y/o actividad de una secuencia objetivo comprende el uso de una molécula antisentido complementaria a la secuencia objetivo. En algunas realizaciones la secuencia objetivo es microARN-122 (miARN-122 o mARN-122), fosfolipasa A2 (sPLA2) secretora, molécula 1 de adhesión intracelular (ICAM-1), GATA-3 , NF-KB, Syk, o combinaciones de las mismas. En ciertos casos, la inhibición de las expresión de y/o actividad de miARN-122 da como resultado (parcial o totalmente), un descenso en la concentración de colesterol y/o lipidos en la sangre.
En algunas realizaciones, se genera una molécula antisentido que es complementaria a una secuencia objetivo (por ejemplo por PCR) . En algunas realizaciones, la molécula antisentido tiene aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 nucleótidos. En algunas realizaciones la molécula antisentido tiene aproximadamente 17 a aproximadamente 28 nucleótidos. En algunas realizaciones, la molécula antisentido tiene de aproximadamente 19 a aproximadamente 26 nucleótidos. En algunas realizaciones, la molécula antisentido tiene aproximadamente 21 a aproximadamente 24 nucleótidos. Para técnicas para la generación de secuencias de ARN véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), jointly referred to herein as "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds . , 1987, including supplements through 2001); Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000), las cuales se incorporan aquí como referencia para tal divulgación .
En algunas realizaciones, las moléculas antisentido son de hebra sencilla, de doble hebra, circulares o curva cerrada. En algunas realizaciones, las moléculas antisentido contienen elementos estructurales (por ejemplo protuberancias internas o terminales, o bucles).
En algunas realizaciones, una molécula antisentido es "completamente complementaria" (esto es 100% complementarias) a la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, una molécula antisentido es "mayormente complementaria" (por ejemplo, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80%, 75% o 70% complementarias) a la secuencia de ARN objetivo. En algunas realizaciones, hay una descoordinación de 1 bp, una descoordinación de 2 bp, una descoordinación de 3 bp, una descoordinación de 4 bp, o una descoordinación de 5 bp .
En algunas realizaciones, la molécula antisentido hibridiza a. la secuencia objetivo. Tal como se usa aqui, "hibridiza" significa el apareamiento de nucleótidos de una molécula antisentido con los nucleótidos correspondientes de la secuencia objetivo. En ciertos casos, la hibridización involucra la formación de uno o más enlaces de hidrogeno (por ejemplo, enlazamiento por puentes de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen reverso) entre los nucleótidos apareados.
En ciertos casos, la hibridización da como resultado (parcial o completamente), la degradación, ruptura y/o secuestro de la secuencia de ARN.
En algunas realizaciones, se formula una molécula de ARNsi con un vehículo de administración (por ejemplo, un liposoma como un polímero biodegradable, una ciclodextrina, una microesfera de PLGA, una microesfera de PLCA, una nanocápsula biodegradable, una microesfera bioadhesiva, o un vector proteinaceo ) , vehículos y diluyentes, y otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Para métodos de formulación y administración de una molécula de ácido nucleico a un individuo que asi lo requiere véase Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995; Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol . , 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192; patente de los Estados Unidos No. 6,395,713 de Beigelman et al., PCT O 94/02595 DE Sullivan et al., González et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; ang et al., publicaciones internacionales PCT Nos. WO 03/47518 Y WO 03/46185; patente de los Estados Unidos No. 6,447,796; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2002130430; publicación de PCT internacional No. WO 00/53722 de O'Hare y Normand; y publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030077829; solicitud de patente provisional de los Estados Unidos No. 60/678,531, todas las cuales se incorporan aquí como referencia para tales divulgaciones.
En algunas realizaciones, una molécula de ARNsi descrita aquí se administra al hígado de cualquier manera adecuada (véase por ejemplo, Wen et al., 2004, World J Gastroenterol . , 10, 244-9; Murao et al., 2002, Pharm Res., 19, 1808-14; Liu et al., 2003, Gene Ther., 10, 180-7; Hong et al., 2003, J Pharm Pharmacol., 54, 51-8; Herrmann et al., 2004, Arch Virol., 149, 1611-7; and Matsuno et al., 2003, Gene Ther., 10, 1559-66) .
En algunas realizaciones, una molécula de ARNsi descrita aquí se administra iontoforeticamente, por e emplo ' a un órgano o compartimiento en particular (por ejemplo, el hígado o el intestino delgado). Ejemplo no limitantes de administración iontoforetica se describen en, por ejemplo, WO 03/03043689 y WO 03/030989, que se incorporan aquí como referencia para tales divulgaciones.
En algunas realizaciones, una molécula de ARNsi descrita aquí es administrada en forma sistémica (esto es, por absorción sistémica in vivo o acumulación de una molécula de ARNsi en el torrente sanguíneo seguido por distribución a lo largo de todo el cuerpo. Las rutas de administración contempladas para la administración sistémica incluyen, pero no se limitan a intravenosa, subcutánea, de la vena portal, intraperitoneal e intramuscular. Cada una de estas rutas de administración exponen las moléculas de ARNsi de la invención a un tejido enfermo accesible (por ejemplo hígado).
En ciertos casos la terapia necesitará ser readministrada periódicamente. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada anualmente. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada bi anualmente . En algunas realizaciones, la terapia es administrada mensualmente . En algunas realizaciones, la terapia es administrada semanalmente . En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 60 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 50 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 45 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 40 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 35 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 30 mg/dL.
Para divulgaciones de técnica relacionadas con el silenciamiento de la expresión del ARNmi-122, véase WO 07/027775A2, la cual se incorpora aqui como referencia para tal divulgación.
Terapias mediadas por un dispositivo En algunas realizaciones, la estrategia mediada por un dispositivo comprende retirar un lipido de una molécula de DHL en un individuo que asi lo requiere (deslipi ficación ) , retirar una molécula de LDL de la sangre o plasma de un individuo que asi lo requiere (deslipificación) , o una combinación de los mismos. Para divulgaciones de técnicas para retirar un lipido de una molécula de HDL y retirar una molécula de LDL de la sangre o plasma de un individuo que asi lo requiere véase la publicación de los Estados Unidos No. 2008/230465, la cual se incorpora aquí como referencia para des astibulaciones .
En ciertos casos, la terapia de deslipificación necesitará ser readministrada periódicamente. En algunas realizaciones, la terapia de deslipificación es readministrada anualmente. En algunas realizaciones, la terapia de deslipi ficación es readministrada semi anualmente . En algunas realizaciones, la terapia de deslipi ficación es readministrada mensua lmente . En algunas realizaciones, la terapia de deslipi ficación es readministrada semanalmente . En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 60 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia se readministrada cuando el nivel de HDL del individuo está por debajo de aproximadamente 50 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 45 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 40 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 35 mg/dL. En algunas realizaciones, la terapia es readministrada cuando el nivel de HDL del individuo disminuye por debajo de aproximadamente 30 mg/dL.
Composiciones farmacéuticas Lo que se describe aquí, en ciertas realizaciones, es una composición farmacéutica para modular una inflamación y/o un desorden mediado por MIF que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente activo divulgado aquí.
Las composiciones farmacéuticas aquí se formulan utilizando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables incluyendo excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento del agente activo en preparaciones que son usadas farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la ruta de administración escogida. Se encuentra un resumen de composiciones farmacéuticas, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa . : Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed . (Lippincott Williams .& Wilkins, 1999).
En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica para modular u desorden de un sistema cardiovascular comprende adiciohalmente un diluyente ( s ) , excipiente ( s ) , o vehículo(s) farmacéuticamente aceptable ( s ) . en algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen otros agentes medicinales o farmacéuticos, vehículos, adyuvantes, tales como preservantes, estabilizantes, humectantes o agentes emulsificantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica, y/o reguladores. Además, las composiciones farmacéuticas también contienen otras sustancias terapéuticamente valiosas.
Las formulaciones farmacéuticas aquí descritas se administran opcionalmente a un individuo por múltiples rutas de administración, incluyendo pero no limitándose a, rutas de administración oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), intranasal, bucal, tópica, rectal o transdérmica . Las formulaciones farmacéuticas aquí descritas incluyen, pero no se limitan a, dispersiones liquidas acuosas, dispersiones semiemulsificantes, soluciones sólidas, dispersiones liposomicas, aerosoles, formas de dosificación solidas, polvos, formulaciones de liberación inmediata, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, tabletas, pildoras, formulaciones de liberación retardad, formulaciones de liberación extendida, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones en microparticulas, y formulaciones de liberación mixta intermedia y controlada.
Las composiciones farmacéuticas aquí descritas se formulan en cualquier forma de dosificación adecuada, incluyendo pero no limitándose a, dispersiones, líquidos, geles, jarabes, elixires, pastas orales acuosas, suspensiones similares para ingestión oral por un individuo que va a ser tratado, formas de dosificación oral sólida, aerosoles, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, formulaciones efervescentes, formulaciones liofilizadas, tabletas, polvos, pildoras, grageas, cápsulas, formulaciones de liberación modificada, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación extendida, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones en microparticulas, y formulaciones de liberación inmediata y liberación controlada mixtas.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas aquí descritas están formuladas como formulaciones en microparticulas. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica descrita aquí comprende una primera población de partículas y una segunda población de partículas. En algunas realizaciones, la primera población comprende un agente activo. En algunas realizaciones, la segunda población comprende un agente activo. En algunas realizaciones, la dosis de agente activo en la primera población es igual a la dosis de agente activo en la segunda población. En algunas realizaciones, la dosis de agente activo en la primera población no es igual (por ejemplo es mayor que o menor que) la dosis del agente activo en la segunda población.
En algunas realizaciones, el agente activo de la primera población es liberado antes del agente activo de la segunda población. En algunas realizaciones, la segunda población de partículas comprende un recubrimiento de liberación controlada (por ejemplo liberación retardada, liberación controlada o liberación extendida) .
En algunas realizaciones, la segunda población de partículas comprende una matriz de liberación modificada (por ejemplo, de liberación retardada, liberación controlada o liberación extendida.
Los materiales de recubrimiento para uso con las composiciones farmacéuticas aquí descritas incluyen, pero no se limitan a, materiales de recubrimeinto poliméricos (por ejemplo, acetato ftalato de celulosa, acetato triamalato de celulosa, hidroxipropilmetil celulosa ftalato, acetato ftalato de polivinilo); copol imeros de amonio metacrilato (por ejemplo Eudragit® es RS y RL) . Copolimeros de ácido poliacrilico y poliacrilato y copolimeros de metacrilato (por ejemplo Eudragite S y L, acetato de polivinilacetil dietil amino, acetato succinato de hidroxipropil celulosa, snellac); hidrogeles y materiales formadores de geles (por ejemplo polímeros de carboxivinilo, alginato de sodio, carmelosa de sodio, carmelosa de calcio, carboximetil almidón de sodio, alcohol polivinilico, hidroxietil celulosa, metil celulosa, gelatina, álmidon, hidroxi propil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, polivinilpirrolidona, almidón entrecruzado, celulosa microcristalina , quitina, copolimero aminoacril-metacrilato, pululano, colágeno, caseína, agar, goma arábiga, carboximetil celulosa de sodio (polimeroshidrifilicos hinchables) poli ( hidroalquil metacrilato), (p.m. a aproximadamente 5k-5.000k), polivinilpirrolidona (p. m. aproximadamente 10k-360k), hidrogeles anionicos y catiónicos, alcohol polivinilico que tiene un acetato residual bajo, una mezcla hinchable de agar y carboximetil celulosa, copolimeros de anhídrido maleico y estireno, etileno, propileno o isobutileno, pectina (p.m. aproximadamente 30k-300k), polisacáridos tales como agar, acacia, karaya, tragacanto, alginas y guar, poliacrilamidas , óxidos de polietileno Poliox® (p.m. aproximadamente 100k- 5000k), polímeros de acrilato Aquakeep®, diésteres de poliglucano, alcohol polivinilico y poli N-vinil-2-pirrolidona entrecruzados, almidón de sodio, polímeros hidrofilicos (por ejemplo, polisacáridos, metil celulosa, carboximetil celulosa de sodio o calcio, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxietil celulosa, nitrocelulosa , carboximetil celulosa, éteres de celulosa, óxidos de polietileno, metiletil celulosa, etilhidroxietil celulosa, acetato de celulosa, butirato de celulosa, propionato de _ celulosa, gelatina, colágeno, almidón, maltodextrina , pullulan, polivinil pirrolidona, alcohol polivinilico, acetato de polivinilo, ásteres de ácidos de glicerol, poliacrilamida, ácido poliacrilico, copolimeros de ácido metacrilico o ácido metacrilico, otros derivados de ácido acrílico, ésteres de sorbitano, gomas naturales, lecitinas, pectina, alginatos, alginato de amonio, alginatos de sodio, calcio, potasio, alginato de propilen glicol, agar, goma arábiga, goma karaya, goma de grano de soja, goma de tragacanto, goma carraqinato, goma guar, goma de xantano, goma de escleroglucano); o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el cubrimiento comprende un plastificante, un lubricante, un solvente o combinaciones de los mismos. Plasti ficantes adecuados incluyen, pero no se limitan ar monogliceridos acetilados; glicolato de butilnaftil butilo; tartrato de dibutilo; ftalato de dietilo; ftalato de dimetilo; glicolato de etilftalil etilo; glicerina, propilenglicol, triacetina; citrato, tripropionina; diacetina; dibutil ftalato; acetil monoglicerido; polietilen glicoles; aceite de castor, citrato de trietilo; alcoholes polihidricos , glicerol, ésters de acetato, triacetato de glicerol, citrato de acetil trietilo, ftalato de dibencilo; ftalato de dihexilo, ftalato de butiloctilo; ftalato de diisononilo, ftalato de octilbutilo; azelato de dioctilo, talato epoxidisado, trimetrilato detriisoctilo, ftalato de dietilhexilo, ftalatao de di-n-octilo, ftalato de di-i-octilo, ftalato de di-i-decilo, ftalato de di-n-undecilo, ftalato de di-n-tridecilo, trimetilato de tri-2-etilhexilo, adipato de di-2-etilhexilo, sebacato de di-2-etilhexilo, azelato de di-2-etilhexilo, sebacato de dibutilo.
En algunas realizaciones, la segunda población de partículas comprende un material de matriz de liberación modificada. Los amteriales para uso con las composiciones farmacéuticas aquí descritas incluyen, pero no se limitan a celulosa microcristalina, carboximetil celulosa de sodio, hidroxialquil celulosas (por ejemplo hidroxipropilmetil celulosa e hidroxipropi 1 celulosa), oxido de polietileno, alquil celulosa (por ejemplo metil celulosa y etil celulosa) polietilen glicol, polivinil pirrolidona, acetato de celulosa, acetato butirato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, acetato trimetilato de celulosa, ftalato de polivinil acetato, polialquil metacrilatos, acetatos de polivinilo, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la primera población de partículas comprende un agente para el desorden cardiovascular. En algunas realizaciones, la segunda población de partículas comprende (1) un modulador de MIF; (2) un modulador de una interacción entre RANTES y el factor de plaquetas 4 o (3) combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la primera población de partículas comprende (1) un modulador de MIF; (2) un modulador de una interacción entre RANTES y el factor de plaquetas 4; o (3) combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la segunda población de partículas comprende un agente contra el desorden cardiovascular.
Se proveen núcleos de grageas con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se utilizan generalmente soluciones concentradas de azúcar, las cuales opcionalmente contienen goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietilen glicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes o mezclas de solventes orgánicos adecuados. Los colorantes o pigmentos se añaden opcionalmente a las tabletas o recubrimientos de grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de las dosis del agente activo.
En algunas realizaciones, las formas de dosificación sólidas divulgadas aqui están en forma de una tableta, (incluyendo una tableta para suspensión, una tableta de fusión rápida, una tableta por desintegración en la boca, una tableta de desintegración rápida, una tableta efervescente, o una capsuleta), una pildora, un polvo (incluyendo un polvo estéril empacado, un polvo dispensable, o un polvo efervescente), una cápsula (incluyendo tanto cápsulas suaves como duras, por ejemplo, cápsulas hechas de gelatina derivada de animales o HPMC derivado de plantas, o "cápsulas de aspersión"), dispersión sólida, solución sólida, forma de dosificación bioerosionable, formulaciones de liberación controlada, formas de dosificación de liberación pulsátil, formas de dosificación en multiparticulas , pellas, gránulos o un aerosol. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica está en la forma de un polvo. En aún otras realizaciones, la formulación farmacéutica esta en la forma de una tableta, incluyendo pero no limitándose a, una tableta de fusión rápida. Adicionalmente, las formulaciones farmacéuticas aqui descritas se administran opcionalmente como una cápsula individual o una forma de dosificación de cápsulas múltiples. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica se administra en dos, o tres, o cuatro, cápsulas o tabletas.
En aún otro aspecto, las formas de dosificación incluyen formulaciones microencapsuladas . En algunas realizaciones, uno o mas materiales compatibles están presentes en el material de microencapsulación . Ejemplos de materiales incluyen pero no se limitan a, modificadores de pH facilitadores de la erosión, agentes antiespumantes , antioxidantes, agentes saborizantes y materiales t ansportadores tales como enlazantes, agentes de s u spen s i ón , agentes de desintegración, agentes de llenado, surfactantes , solubilizantes , estabilizantes, lubricantes, agentes humectantes y diluyentes.
En materiales de microencapsulación de ejemplo útiles para retardar la liberación de las formulaciones que incluyen un inhibidor recepto r de MIF, incluye pero no se limitan a éteres de hidroxipropil celulosa, (HPC) tales como Klucel® o Nisso HPC, éteres de hidroxipropil celulosa con baja sustitución (L-HPC), éteres de hidroxipropilmeti 1 celulosa (HPMC) tales como Seppifilm LC, Pharmacoat®, MetoloseSR, ethocal®-E, Opadry YS, PrimaFlo, Benecel MP824, y Benecel MP843, polímeros de metil celulosatales como Methocel®-A, hldroxipropilmetil celulosa acetato estearato Aqoat (HF-LS, HF-LG, HF-MS ) y Metolose®, etilcelulosa . ( EC ) y mezclas de los mismos tales como E46.1, Ethocel®, Aqualon®-EC, Surelease®, alcohol polivinilico (PVA) tal como Opadry AMB, hidroxietil celulosa tales como Natrosol®, carboximetil celulosa y sales de las carboximetil celulosa (CMC) tales como Aqualon®-CMC, alcohol polivinilico y copolimeros de alcohol polivinilico y polietilen glicol tales como ollicoat IR®, monogliceridos (Myverol), trigliceridos (KLX), polietilen glicol, almidón alimenticio modificado, polímeros acrilicos y mezclas de polímeros acrilicos con éteres de celulosa tales como Eudragit® EPO, Eudragit® L30D-55, Eudragit® FS 30D Eudragit® L100-55, Eudragit® L100, Eudragit® S100, Eudragit® RD100, Eudragit® E100, Eudragit® L12.5, Eudragit® S12.5, Eudragit® NE30D, and Eudragit® NE 40D, acetato ftalato de celulosa, sepipeliculas tales como mezclas de HPMC y ácido estéarico, ciclodextrinas y mezclas de estos materiales.
Las formas de dosificación de formulación liquida para administración oral son opcionalmente suspensiones acuosas seleccionadas del grupo que incluye, pero no se limita a, dispersiones, emulsiones, soluciones, elixires, geles y jarabes farmacéuticamente aceptables. Véase por ejemplo, Singh et al., Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 2ndEd., pp. 754 - 757 (2002). Además de un inhibidor del receptor de MIE, la forma de dosificación liquida incluye aditivos, tales como (a) agentes desintegrantes; (b) agentes dispersantes, (c) agentes humectantes; (d) al menos un preservativo, (e) agentes mejoradores de la viscosidad, (f) al menos un agente endulzante, y (g) al menos un agente saborizante. En algunas realizaciones, las dispersiones acuosas incluyen adicionalmente un inhibidor de la formación de cristales.
En algunas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas aquí descritas son sistemas de administración de fármacos autoemulsi ficantes (SEDDS). Las emulsiones son dispersiones de una fase inmiscible en otra, usualmente la forma de pequeñas gotas. En general, las emulsiones se crean mediante dispersión mecánica vigorosa. El SEDDS, en oposición a las emulsiones o microemulsiones , forman espontáneamente una emulsión cuando se añade un exceso de agua sin ninguna dispersión o agitación mecánica externa. Una ventaja del SEDDS, es que solamente se requiere una mezcla suave para distribuir las gotas a lo largo de la solución. Adicionalmente, se añade opcionalmente agua o la fase acuosa justo antes de la administración, lo que asegura la estabilidad de un cualquier ingrediente activo inestable o hidrófobo. Así, la SEDDS proporciona un sistema de administración efectivo para administración oral y parentérica de los ingredientes activos hidrófobos. En algunas realizaciones, las SEDDS proporcionan mejoramientos en la biodisponibilidad del agente hidrófobo activo. Métodos de producción de formas de dosificación autoemulsionantes incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, U. S. Pat Nos. 5.858.401, 6,667,048 y 6,960,563.
Las formulaciones intranasales adecuadas incluyen las descritas en, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 4,476,116, 5,116,817 y 6,391, 452. Las formas de dosificación nasal generalmente contienen grandes cantidades además del ingrediente activo. Cantidades menores de otros ingredientes tales como ajustadores de pH, emú 1 s i fi cadores o agentes dispersantes, preservativos, surfactantes , agentes gelificantes, o regulación y otros agentes estabilizantes y solubilizantes están presentes opcionalmente .
Para la administración por inhalación, las composiciones farmacéuticas aquí divulgadas tienen opcionalmente una forma de aerosol, una niebla o un polvo. Las composiciones farmacéuticas descritas aquí son administradas convenientemente en la forma de una presentación de aerosol presurizada o un nebulizador (con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, dicloroforometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación es determinada proveyendo una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, tal como, a manera de ejemplo solamente, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador, se formulan conteniendo una mezcla en polvo y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Las formulaciones bucales incluyen, pero no se limitan a, patente de los Estados Unidos Nos. 4,229,447, 4,596,795, 4,755,386, y 5,739,136. Adicionalmente , las formas de dosificación bocal aquí descritas incluyen adicionalmente de forma opcional un vehículo polimérico bioerosionable (hidrolizable) que también sirve para adherir la forma de dosificación a la mucosa bucal. La forma de dosificación bucal es fabricada de manera que se erosione gradualmente durante un periodo predeterminado . la administración del fármaco bucal evita las desventajas encontradas con la administración oral de fármacos, por ejemplo, absorción lenta, degradación del agente activo por fluidos presentes en el tracto gastrointestinal y/o inactivación en el primer paso en el hígado. El vehículo polimérico bioerosionable (hidrolizable) comprende generalmente polímeros hidrofilicos (solubles en agua e hinchables con el agua) que se adhieren a la superficie húmeda de la mucosa bucal. Ejemplo de vehículos poliméricos útiles aquí incluyen polímeros del ácido acrílico y co, por ejemplo, los conocidos como "carbomeros" (Carbopol®, que se obtiene en B.F. Goodrich, es uno de tales polímeros). Otros componentes también pueden ser incorporados en las formas de dosificación bucal descritos aquí que incluyen, pero no se limitan, a desintegrantes, diluyentes, aglomerantes, lubricantes, saborizantes , colorantes, preservativos, y similares. Para administración bocal o sublingual, la composición opcionalmente toma la forma de tabletas, capsulas o geles formulados en una forma convencional .
Las formulaciones trandermicas de las composiciones farmacéuticas aquí divulgadas se administran por ejemplo mediante las descritas en las patentes de los Estados Unidos Nos. 3,598,122, 3,598,123, 3,710,795, 3,731,683, 3,742,951, 3,814,097, 3,921,636, 3,972,995, 3,993,072, 3,993,073, 3,996,934, 4,031,894, 4,060,084, 4,069,307, 4,077,407, 4,201,211, 4,230,105, 4,292,299, 4,292,303, 5,336,168, 5, 665, 378, 5, 837, 280, 5, 869, 090, 6,923, 983, 6, 929, 801 y 6, 946, 144.
Las formulaciones transdermi cas aquí descritas incluyen al menos tres componentes: (1) un agente activo; (2) un potenciador de la penetración; y (3) un adyuvante acuoso. Además, las formulaciones transdermicas incluyen componentes tales como, pero no limitándose a, agentes gelificantes, bases para cremas y ungüentos, y similares. En algunas realizaciones, la formulación transdermica incluye adicionalmente un material de soporte tejido o no tejido para potenciar la absorción y evitar que se retire la formulación transdermica de la piel. En otras realizaciones, las formulaciones transdermicas aqui descritas mantienen un estado saturado o supersaturado para promover la difusión hacia la piel.
En algunas realizaciones, las formulaciones adecuadas para administración transdermica emplean dispositivos de administración transdermica y parches de administración transdermica y son emulsiones lipofilicas o reguladas, soluciones acuosas, disueltas y/o dispersadas en un polímero o un adhesivo. Tales parches están construidos opcionalmente para administración continua, pulsátil o por demanda de los agentes farmacéuticos. Aún más, la administración transdermica se logra opcionalmente por medio de parches iontoforeticos y similares. Adicionalmente, los parches transdermicos proveen administración controlada. La rata de absorción se disminuye opcionalmente utilizando membranas para controlar la rata o atrapando un agente activo dentro de una matriz polimerica o gel . Por el contario, los potenciadores de absorción se utilizan para incrementar la absorción. Un potenciador de la absorción o vehículo incluye un solvente absorbible farmacéuticamente aceptable para ayudar en el paso a través de la piel. Por ejemplo, los dispositivos transdermicos están en la forma de un venda e que comprende un miembro de soporte, un reservorio que contiene un agente activo opcionalmente con vehículos, opcionalmente una barrera controladora de la rata para administrar un agente activo de la piel del huésped o una rata controlada y predeterminada durante un periodo prolongado de tiempo, y medios para asegurar el dispositivo a la piel .
Las formulaciones adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa incluyen soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables, y polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones estériles inyectables. Ejemplos de transportadores, diluyentes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol , polietilenglicol, glicerol, cremofor y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada se mantiene, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de surfactantes . Las formulaciones adecuadas para la inyección subcutánea también contienen aditivos opcionales tales como agentes de preservación, humectación, emulsificación y dispensación.
Para inyecciones intravenosas, un agente activo se formula opcionalmente en soluciones acuosas, preferiblemente en reguladores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o solución salina fisiológica. Para la administración transmucosa, se utilizan penetrantes apropiados para la barrera transmucosa, se utilizan penetrantes apropiados para que la barrera sea permeada en la formulación. Para otras inyecciones parentéricas , las formulaciones apropiadas incluyen soluciones acuosas o no acuosas, preferiblemente con reguladores o excipientes compatibles fisiológicamente.
Las inyecciones parenterales sinvolucran opcionalmente la inyección de bolos o infusión continua. Las formulaciones para inyección se presentan opcionalmente en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en contenedores de dosis múltiples, con un preservativo añadido. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica aquí descrita esta en una forma adecuada para la inyección parenterica como suspensiones, soluciones o emulsiones estériles en vehículos oleosos o acuosos, y contienen agentes formulatorios tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenterica incluyen soluciones acuosas de un agente activo en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones se preparan opcionalmente como suspensiones para inyección oleosas apropiadas .
En algunas realizaciones, un agente activo aquí divulgado se administra tópicamente y se formula una variedad de acomposiciones tópicamente administrables , tales como soluciones, suspensiones, lociones, geles, pastas, barras medicadas, bálsamos, cremas o ungüentos. Tales composiciones farmacéuticas contienen opcionalmente solubilizantes, estabilizantes agentes potenciadores de la tonicidad, reguladores y preservativos.
Un agente activo divulgado aquí también se formula opcionalmente en composiciones rectales tales como enemas, geles rectales, espumas rectales, aerosoles rectales, supositorios, supositorios de gelatina, o enemas de retención, que contienen bases para supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos, así como polímeros sintéticos tales como polivinilpirrolidona ; PEG, y similares. En las formas en supositorio de las composiciones, se funde primero una cera de bajo punto de fusión tal como, pero no limitándose a, una mezcla de glicéridos de ácidos grasos, opcionalmente en combinación con manteca de cacao.
Un agente activo aquí divulgado se utiliza opcionalmente en la preparación de medicamentos para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de condiciones inflamatorias o condiciones que beneficiarían, al menos en parte, por me oramiento. Además, un método para tratar cualquiera de las enfermedades o condiciones aquí descritas en un individuo que requiere tal tratamiento, involucran administración de composiciones farmacéuticas que contienen un agente activo divulgado aquí, o una sal farmacéuticamente aceptable, un N-oxido farmacéuticamente aceptable, un metabolito activo farmacéuticamente aceptable, una prodroga farmacéuticamente aceptable, o un solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos, en cantidades terapéuticamente efectivas a dicho individuo .
En el caso donde la condición del individuo no mejore, por discreción del doctor la administración de un agente activo aquí divulgado se puede administrar de forma opcional de forma crónica, esto es, un periodo extendido de tiempo, incluyendo la duración de la vida del individuo con el fin de mejorar o de alguna otra manera controlar o limitar los síntomas de la enfemedad o condición del individuo.
En el caso donde el estatus del individuo no mejore, por discreción del doctor la administración de un agente activo divulgado aquí se puede dar opcionalmente de forma continua; alternativamente, la dosis de fármaco que esta siendo administrado se reduce temporalmente o se suspende temporalmente durante un cierto periodo de tiempo (esto es unas "vacaciones de fármaco") . La longitud de las vacaciones de fármaco opcionalmente varían entre dos días y un año, incluyendo a manera de e emplo solamente, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, 12 días, 15 días, 20 días, 28 días, 35 días, 50 días, 70 días, 100 días, 120 días, 150 días, 180 días, 200 días, 250 días, 280 días, 300 días, 320 días, 350 días, o 365 días. La reducción de dosis durante unas vacaciones de fármaco incluyen desde 10% - 100%, incluyendo, a manera de ejemplo solamente, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%.
Una vez que la mejora de las condiciones del individuo ha sucedido, se administra una dosis de mantenimiento si es necesario. Subsecuentemente, la dosis o la frecuencia de administración, o ambas, se reduce, en función de los síntomas, hasta un nivel en el cual la enfermedad desorden o condición mejorada se mantenga. En algunas realizaciones, los individuos requieren un tratamiento intermitente con base a largo plazo por cualquier recurrencia de los síntomas.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica aquí descrita es una forma de dosificación unitaria adecuada para administración individual de dosis precisas. En la forma de dosificación unitaria, la formulación se divide en dosis unitaria que contienen cantidades apropiadas de un agente activo divulgado aquí. En algunas realizaciones, la dosificación unitaria esta en la forma de un paquete que contiene cantidades discretas de la formulación. Ejemplos no limitantes son tabletas o cápsulas empacadas, y polvos en viales o ampollas. En algunas realizaciones, las composiciones en suspensión acuosa se empacan en contenedores de dosis individual no recerrables. Alternativamente, se usan los contenedores recerrables de dosis múltiples, en cuyos casos es típico incluir un preservativo en la composición. A manera de ejemplo solamente, las formulaciones para inyección parenterica se presentan en formas de dosificación unitaria, que incluye, pero no se limitan a ampollas, o contenedores de dosis múltiples, con un preservativo añadido.
Las dosificaciones diarias apropiadas para un agente activo divulgado aquí van desde aproximadamente 0.01 a 3 mg/kg por peso corporal. Una dosificación diaria indicada en un mamífero grande, incluyendo, pero no limitándose a, humanos, esta en el rango de aproximadamente 0.05 mg hasta aproximadamente 100 mg, administrados convenientemente en dosis divididas, incluyendo, pero no limitándose a, hasta cuatro veces al dia o en una forma de liberación extendida. Las formas de dosificación unitarias adecuadas para administración oral incluyen desde aproximadamente 1 hasta 50 mg de ingrediente activo. Los rangos anteriores son solamente a titulo de sugerencia, puesto que el número de variables con respecto a un régimen de tratamiento individual es bastante grande, y la separación considerable de estos valores recomendados no es infrecuente. Tales dosificaciones son alteradas opcionalmente dependiendo de un número de variables, no limitándose a la actividad del inhibidor del receptor MIF utilizado, la enfermedad o condición que se va a tratar, el modo de administración, los requerimientos del individuo, la severidad de la enfermedad o condición que esta siendo tratada, y el juicio del médico.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales regímenes terapéuticos se determina opcionalmente en cultivos celulares o en animales experimentales, incluyendo, pero no limitándose a, la determinación del LD50 (la dosis letal para el 501 de la población) y ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) . La relación de dosificación entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, el cual se expresa como la relación entre LD50 y ED50. Un agente activo aquí divulgado que exhibe altos índices terapéuticos es el preferido. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios animales se utilizan opcionalmente en la formulación de un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tal agente activo divulgado aquí se basa preferiblemente en un rango de concentraciones circulantes que incluyen LD50 con toxicidad mínima. La dosificación varia opcionalmente dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos específicos se deben considerar como ilustrativos y no limitantes de la divulgación o de las reivindicaciones.
EJEMPLO 1 Líneas celulares y reactivos Se usaron como se describen células endoteliales aórticas humanas (Schoher, A., et al. (2004) Circulation 109, 380 - 385) así como de vena umbilical ( eber, .S., et al (1999) Eur. J. Inmunol. 2_9, 700 - 712 (PromocelL) células de Monomac6 (Weber, C, et al (1993) Eur. J. Inmunol 23, 852 -859) y de ovario de hámster chino (CHO) ICAM-1 transíectante (Ostemann, G. , et al (2002) Nat. Inmunol 3, 151 - 158). Se transfectaron células Jurkat y macrofagos RAW264.7 con pcADN3-CXCR2. Se trans fectaron células HL-60 con pcADN3.1/V5-HÍSTOPO-TA-CD74 o de control de vector (kit nucleofector V, Araaxa ) . Las células L1.2fueron transfectadas con pcADN3-CXCRs o pcADN-CCR5 (UMR ADNc Resource Center) para ensayos sobre células endoteliales micrivasculares de ratones transformadas con virus 40 de simio (SVECs). Las células mononucleares sanguíneas periféricas fueron preparadas a partir de recubrimientos suaves, monocitos por adherencia o separación inmunomagnetica (Miltengy) , las células T primarias por estimulación de fitohemoaglutinina/interleucina-2 (Biosurce) y/o selección inmunomagnetica (anticuerpo a CD3/M-450 Dynabeads), y neutrófilos por centrifugación con gradiente de Ficoll. Los transfectantes CXCR2 de riñon humano embrionario (HE 293-CXCR2 ) han sido descritos previamente (Ben Baruch, A., et al. (1997) Citakine 9, 37 - 45).
El MIF recombinante fue expresado y purificado como se describe (Bernhagen, J., et al (1993) Nature 365, 756 - 759). Las quimioquinas fueron de PePro Tech Human VCAM-1. La quimera Fe, los anticuerpos bloqueantes a CXCR1 (42705, 5A12), CXCR2 (48311), CXCR4 (44708, FABSP2 en forma de coctail. R & D) , MIF humano y MIF de ratón (NIHIII.D.9) (Lan, H.Y., et al. (1997) J.Exp. Med . 1_85, 1455 - 1465), CD74 (M- B741, Pharmingen), integrina ß2 (TS1/18), integrina a4 (HP2/1) (Weber,C, et al (1996) J.Cell Biol. 134, 1063 -1073) y CXCR2 (RUI 15), y anticuerpo para la aL integrina (327C) (Shamri,R., et al. (2005) Nat. Inmunol. 6, 497 - 506) el PTX y el B-oligomero fueron de Merck.
Ejemplos de métodos usados Ensayos de adhesión Detención de monocitos marcados con calceina-AM (Molecular Probes), células T y trans fectantes Ll .2 fueron cuantificados en cámaras de paredes paralelas en flujo (1.5 dinas/cm2, 5 minutos) (Schober,A., et al, (2004) Circulation 109, 380 - 385; Ostermann, G.,et al, (2002) Nat. Inmunol 3, 151 - 158; Weber, C, et al. (1996) J.Cell Biol 134, 1063 -1073). Las células endoteliales confluyentes, células CHO-ICAM-1, placas recubiertas con VCAM-l.Fc y leucocitos fueron pretratados con MIF, quimioquinas o anticuerpos. Las células CHO-ICAM-1 incubadas con MIF (2h) fueron teñidas con el anticuerpo para MIF a565 (Leng.L., et al. (2003)' J.Exp. Med . 19 , 1467 - 1476) y anticuerpo conjugado con FITC.
Ensayos de quimiotaxis Utilizando cámaras Transwell (Costar), cuanti ficamos la migración de leucocitos primarios hacia MIF o quimioquinas por microscopía de fluorescencia o utilizando marcado con calceina-AM y filtros FluoroBlok (Falcon). Las células fueron pretratadas con el oligomero PTX/B, Ly294002, MI F (para desensibilización), anticuerpos para CXCRs o CD74¦, o el isotipo IgG. Los tamaños de poro y los intervalos fueron de 5 µ?? y 3h ( monocitos ) , 3 pm y 1.5 h (células T), y 3 mm y lh ( neutrófilos ) .
Q-PCR y ELISA El ARN fue sometido a transcripción reverso utilizando iniciadores oligo-dT. El RTPCR fue llevado a cabo utilizando el kit QuantiTect con verde SYBR (Qiagen), iniciadores específicos y un MJ Opticon2 (Biozym) . El CXCL8 fue cuantificado mediante Quantikine ELISA (R & D) .
Prueba de activación de a?ß? integrina Los monocitos estimulados con MIF o Mg2+/EGTA (control positivo) fueron fijados, se hicieron reaccionar con el agente activo 327C y un anticuerpo conjugado de FITC e IgG de ratón. La activación de LFA-1 analizada por citometría de flujos se reporta como el incremento en la intensidad fluorescente media (MFI) o relativa al control positivo (Shamri, R. , et al (2005) Nat. Inmunol. 6, 497 - 506).
Movilización de calcio Los neutrófilos o trans fectantes Ll .2 CXCR2 fueron marcados con Fluo-4 AM (Molecular Probes ) . Después de la adición del primero o de un estimulo subsecuente (MIF, CXCL8 o CXCL7 ) , se monitoreo el MFI como una medida de las concentraciones citosolicas de Ca2+ durante 120 segundos utilizando un BD FACSAria. Los controles Ll .2 mostraron un influjo de calcio despreciable.
Ensayos receptor-enlazamiento Puesto que el MI yodado es inactivo (Leng.L., et al, (2003) J.Exp.Med. 1_97, 1467 - 1476; leemann,R.r et al. (2002) J.Interferon Cytokine Res. 2_2, 351 - 363), Ael enlazamiento al receptor competitivo (Hayashi,S., et al. (1995) J.Inmunol, 15 , 814 -824) se llevo a cabo utilizando trazadores radioyodados (Amersham) : [I ]CXCL8, reconstituido en 4 nM (80 Ci/ml) hasta una concentración final de 40 pM; el [I125] CXCL12, reconstituido a 5 nM (100 Ci/ml) hasta una concentración final de 50 pM . Por competición del [I125] CXCL8 con MIF para el enlazamiento de CXCR2 o competición de [I125] CXCL12 con MIF para el enlazamiento del CXCR4 en pruebas de enlazamiento en equilibrio, el MIF y/o CXCL en frió con trazadores de HEK293-CXCR2 o CXCR4 en células portadoras de los mismos Jurkat fue añadido. El análisis se llevó a cabo por conteo de centelleo en liquido. Para calcular los valores EC50 y Kd, se asumió un modelo de enlazamiento receptor ligando en un sitio y se aplicó la ecuación de Cheng/ Prusoff y el GrandPad Prism.
Para deshacer los complejos biotina-MI F-CXCR, los transíectantes o controles de HE 293-CXCR2 fueron incubados con MIF marcado con biotina ( leemann, R. , et al. (2002) J.Interferon Cytokine Res. 2_2, 351 - 363), se lavaron y se sometieron a una lisis con regulador de coinmunoprecipitación (CoIP) . Los complejos fueron aislados a partir de los lisados clarificados mediante perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (M280, Dynal) y se analizaron por wester blotting con el anticuerpo para el CXCR2 o para la estreptavidina-peroxidasa . Para la citometria de flujo, las células trans fectantes HEK293-CXCR2 o de Jurkat pretratadas con AMD3465 y/o un exceso de 20 veces de MIF sin marcar fueron incubados con MIF marcado con fluoresceína y analizados utilizando un BD FACSCalibur.
Pruebas de internalización de CXCR Las células HE 293-CXCR2 o Jurkat fueron tratadas con CXCL8 o CXCL12, respectivamente, tratadas con MIF, se lavaron con regulador de glicina ácida, se tiñeron con anticuerpos para CXCR2 o CXCR4, y se analizaron por citometria de flujo. La internalización fue calculada con respecto a la expresión de superficie de las células tratadas con regulador (100% como control) y a la tinción de control con el isotipo (0% como control): MFI [experimental] geométrico -MFI[control 0%] /MFI [control 100%] -MFI [control 0%] x 100.
Colocalización de CXCR2 y CD74 Los transíectantes RAW264.7-CXCR2 fueron coteñidos con CXCR2 y anticuerpo de rata para CD74 de ratón (In-1, Pharmingen) , seguido por anticuerpo conjugado con FITC para IgG de rata y anticuerpo conjugado con Cy3 para IgG de ratón, y se analizaron por microscopía de barrido o por láser con focal ( eiss ) .
Coinmunoprecipitación de CXCR2 y CD74 Las células HEK293-CXCR2 trans fectadas de forma tranciente con pcADN3.1/V5-HÍS TOPO-TA-CD74 fueron Usadas en un regulador CoIP no desnaturalizante. Los sobrenadantes fueron incubados con el anticuerpo de CXCR2 RII1.15 o un isotipo de control y fueron prebloqueados con proteína de G-sefarosa durante la noche.- Las proteínas fueron analizadas por Western blots utilizando el agente activo para el marcador His (Santa Cruz). De la misma forma, los CoIP y los inmunoblots fueron llevados a cabo con anticuerpos para el marcado de His-tag y CXCR2, respectivamente. Las células L1.2-CXCR2 fueron sometidas a inmunoprecipitación con el anticuerpo para el CXCR2 e inmunoblotting con un anticuerpo para CD74 de ratón.
Perfusión ex vivo y microscopía intravital de arterias carótidas .
Ratones Mif Ldlr y Mif Ldrl de control interno, originados por cruzamiento a partir de Mif (Fingerle, Rowson,G.,et al (2003) Proc . Nati . Acad . Set . USA 100, 9354 -9359) y ratones Apoe fueron alimentados con una dieta aterogénica (21% de grasa; Altromin) durante 6 semanas. Todas las cepas individuales habían sido retrocruzadas en el C57BL/6 diez veces. Los ratones Mif + y Mif _ fueron tratados con TNF-a (intraperitonealmente) (i.p.), 4 horas). Las arterias explantadas fueron transferidas sobre la platina de un microscopio de epifluorescencia y se perfusionaron a 4 µ?/min con células Monomac6 marcadas con Calceina- AM tratadas con anticuerpos para CD74 o CXCR2, isotipo de control de IgG, o se dejaron sin tratamiento (Huo,Y.,et al. (2001) J Clin. Invest. 108, 1307 - 1314). Las células monociticas no tratadas fueron perfusionadas después del bloqueo con el anticuerpo para MIF durante 30 minutos. Para microscopía intravital, se administro intravenosamente (i.v.) rodamina-G (Molecular Probes ) y las arterias carótidas fueron expuestas en ratones anestesiados. La detención (> 30 segundos) de los leucocitos marcados fue analizada por microscopía de epifluorescencia (Zaiss Axiotech, 20x inmersión en agua). Todos los estudios fueron aprobados por las autoridades locales (Bezirksregierung Colonia), y cumplieron con la ley alemana para protección de animales Az : 50.203.2-AC36, 19/05.
Modelo de un ratón de progresión de enfermedad arteriosclerótica Ratones Apoe";" alimentados con una dieta aterogenica de 12 semanas fueron inyectados (3 inyecciones por semana, cada 50 µ?) con anticuerpos de MI F (NIHIIID.9), CXCL12 (79014) o CXCL1 (124014 , R&D) ( n=6 - 10 ratones) durante 4 semanas adicionales. Se fijaron raices aórticas por perfusión in situ y se cuantifico la arteriesclerosis por tinción de secciones transversales con Oil-Red-O. Los contenidos de macrófagos relativos y células T fueron determinados por tinción con anticuerpos para MOMA-2 ( MCA519 , Serotec) hasta CD3 (PC3/1883, Dako) y anticuerpo conjugado de FITC. En los ratones Mif" _ Ldl_/" y Mif" + Ldl~ _ alimentados con una dieta masticable durante 30 semanas, la abundancia de monocitos iuminales y macrófagos de lesión en las raices aórticas fue determinada como se describió ( Verschuren, L. , et al. (2005) Ateriocler.Thromb. Vac. Biol . 25, 161 —167).
Modelo de microcirculación cremaster El MIF humano(l \iq) fue inyectado intraescroto y el músculo cremaster fue exteriorizado en ratones tratados con el anticuerpo para CXCR2 (100 µ? i.p.). después de 4 horas, se llevo a cabo la microscopía intravital (Zeiss Axiplan: 20x) en vénulas postcapilares (Gregory, J.L. , ET AL. (2004) Arthritis Rheum. 50, 3023 - 3034; eane,M.P. et al. (2004) J.Inmunol. 172, 2853 - 2860). La adhesión fue medida como leucocitos estacionarios durante más de 30 segundos de emigración como : el número de leucocitos extravasculares por campo .
Transplante de médula ósea Los fémures y tibias fueron retirados asépticamente de ratones donor I18rb~ ~ (Jackson laboratories ) o BALB/c. las células, extraídas de las cavidades de la médula, fueron administradas intravenosamente en ratones Mif/+ o Mif/" después de 24 de la irradiación ablativa del cuerpo completo (Zernecke, A., ET AL . ( 2005 ) Circ . es .96, 784 - 791) .
Modelo de peritonitis aguda Ratones repoblados con I18rb+/+ o I18rb~ _ en la médula ósea fueron inyectados i.p. con MIF (200 ng ) . Después de 4 horas se llevo a cabo un lavado peritoneal y se cuantificaron los neutrófilos Gr-I+CD115 F4/80 cuanti ficados por citometría de flujo utilizando los anticuerpos conjugados relevantes.
Análisis estadístico El análisis estadístico fue llevado a cabo utilizando un análisis de una via de variancia (ANOVA) y la prueba de Newman-Keuls post-hoc o la prueba no pareada de Student con la corrección de Welch (GraphPad Prism) .
EJEMPLO 2: Detención de monocitos inducidos por MIF enlazado a la superficie a través de CXCR2 Los anticuerpos monoclonales y la toxina pertussis (PTX) se utilizaron para explorar si la detención de monocitos inducida por MIF depende de las actividades acopladas a Gm del CXCR2. Las células epiteliales aórticas humanas que habían sido pretratadas con MIF recombinante durante 2 horas incrementaron sustancialmente la detención de los monocitos humanos primarios bajo condiciones de flujo, un efecto bloqueado por un anticuerpo del MIF (Figura 1A) . En forma notable, la detención de monocitos disparada por el MIF pero no espontánea fue cortada por un anticuerpo para el CXCR2 o por el PTX, implicando el CXCR2 acoplado con Gm. La capacidad de MIF para inducir la detención de los monocitos a través de CXCR2 fue confirmada utilizando células Mono-Mac6 y esta actividad estuvo asociada con la inmovilización del MIF sobre las células endoteliales aórticas (Fig. IB). Estos datos significan que el MIF estaba presente sobre la superficie celular endotelial y ejerció una función de detención similar, a la quimioquina como un ligando de CXCR2 noncognate. Los agonistas de CXCR2 clásicos de bloqueo (CXCL1 CXCL8 ) no pudieron interferir con estos efectos del MIF (Fig. 1A) .
Transíectantes de ovario de hámster chino (CHO) que expresan el ligando integrina ß2, ICAM-1 (molécula 1 de adhesión intercelular) se utilizaron para diseccionar los mecanismos mediante los cuales el MIF promueve la detenció dependiente de la integrina. Tal como se cuantifico bajo condiciones de flujo, la exposición de los trans fectantes de CHO a MIF durante 2 horas dio como resultado en su superficie la presentación (Fig.lB) y, como exposición de los transíectantes a CXCL8, una detención incrementada de los monocitos (Fig. 1C). este efecto fue completamente sensible al PTX y a un anticuerpo para la integrina B2 (Fig. 1C), confirmando un papel del Gm en detención mediada por integrina ß2 inducida por MIF. Los monocitos primarios y las células MonoMac6 expresan tanto CXCR1 como CXCR2 (Weberr .S., et al(1999) Eur. J. Inmunol 29, 700 - 712). A la vez que el bloqueo del CXCR1 no tiene efecto, el bloqueo del CXCR2 sustancialmente pero no completamente impidió la detención de las células monociticas disparado por MIF y disparado por CXCL8 La adición de anticuerpos tanto a CXCR1 como CXCR2 inhibió completamente las funciones de detención del MIF o CXCL8 (Fig. ID y Fig. 8). El uso de anticuerpos del CD74 implico esta proteina junto con el CXCR2, en la detención inducida por MIF (Fig. ID), la detención espontánea no fue afectada (Fig. 8). Asi, el CXCR2 asistido por el CD74 media en la detención inducida por el MIF.
Detención de células T inducida por MIF a través de CXCR4 Bien sea MIF o CXCL12 inmovilizadas sobre células endoteliales aórticas dispararon la detención de células T efectoras humanas primarias (Fig. 1E), inducida por MIF, pero no espontánea. Las células T eran sensibles a PTX y fueron inhibidas por un anticuerpo de CXCR4 (Fig. le). Aunque menos pronunciada que un CXCR2 que expresa monocitos (Fig. ID), la presentación de MIF (o CXCL12) sobre la detención de transfectantes que expresan ICAM-1 elicitó la detención dependiente de a 2 de células Jurkat T, un efecto mediado por CXCR4 ( Fig. 1F) .
La expresión ectópica de CXCR2 en células Jurkat T incremento la detención disparada por MI (Fig. 1G) , corroborando la idea de que el CXCR2 imparte capacidad de respuesta al MIF en leucocitos. Trans fectantes de linfoma L1.2 pre-B que expresan CXCR1, CXCR2, o CXCR3, y controles que utilizan células que expresan CXCR4 endogénas fueron utilizadas únicamente en presencia del antagonista CXCR4 AMD3465. El MIF disparo la detención de trans fectante CXCR2 y controles portadores de CXCR4 sobre células endoteliales con una eficacia similar a la de los ligandos canónicos CXCL8 y CXCL12, mientras que los transfectantes CXCR1 y CXCR3 respondían a CXCL8 y CXCL10 respectivamente, pero no a MIF (Fig. 1H) . Estos datos establecieron que CXCR2 y CXCR4, pero no CXCR1 o CXCR3, soportan la detención inducida por MIF.
EJEMPLO 3 Quimiotaxis de leucocitos inducidos por MIF a través de la activación de CXCR2/4 [00218 Las quimioquinas habían sido definidas epónimamente como inductores de quimiotaxis ( Baggiolini , M . , et al. (1994) Adv. Inmunol . 55, 97 - 179, Weber, C, et al (2004) Aterioscler.Thromb. Vasc. Biol . 24, 1997 - 2008). Paradó icamente, 'del MIF se pensó inicialmente que interfería con la migración "aleatoria" (Calandra, T., et al (2003) Nat. Rev. Inmunol. 3, 791 - 800). Aunque esto puede ser atribuible a la repulsión activa o a la desensibilización de la migración dirigida, los mecanismos específicos evocados por el MIF para regular la migración permanecen aún sin clarificar. Otros resultados muestran que las funciones mediada por Gm inducidas por MIF de CXCR2 y CXCR4 no llevaron a probar si el MIF directamente elicita la quimiotaxis de los leucocitos a través de estos receptores.
Usando un sistema de transposo, los efectos promigratorios del MIF y el CXCL8 fueron comparados con los monocitos derivados de células mononucleares sanguíneas periféricas humanas. El CCL2 también fue utilizado como una quimioquina prototípica para los monocitos. De la misma forma que el CXCL8 y el CCL2, añadiendo MI F, la adición de MI a la cámara inferior indujo la migración, la que siguió a una curva de respuesta a la dosificación en forma de campana típica para las quimioquinas , con un óptimo en 25-50 ng/ml, a pesar de lo cual con un índice migratorio de pico bajo (Fig. 2A) . El tratamiento con calor o la neutralización de los anticuerpos del MIF coartaron la transmisión ción de la transmigración inducida por MIF. En contraste, la inmunoglobulina comparada con el isotipo (IgG) no tuvo efecto (Figuras 2A-H). Cuando se añadió a la cámara superior, el MIF dependiente de la dosis desensibilizo la migración hacia MIF en la cámara inferior (Fig. 2C) pero no elicito la migración cuando estaba presente en la cámara superior solamente, sugiriendo que el MIF evoca una quimiotaxis verdadera en vez de una quimioquinesis . Consistente con la señalización dependiente de Gm a través de la fosfoinositida-3-quinasa, la quimiotaxis de monocitos inducida por MIF fue sensible a PTX y abrogada por Ly294002 (Fig, 2D) . Tanto CXCR2 como CD74 contribuyeron específicamente a la quimiotaxis de monocitos disparada por MIF (Fig.2E). El papel de CXCR2 fue confirmado mostrando una desensibilización cruzada mediada por MIF de la quimiotaxis inducida por CXCL8 en células Ll .2 transíectadas con CXCR2. La actividad quimiotactica de MIF fue verificada en macrófagos RAW264.7 (Fig.8) y monocitos THP-1. Estos datos demuestran que el MIF dispara la quimiotaxis de monocitos a través de CXCR2.
Para sustanciar las interacciones MIF-CXCR4, se evaluó la transmigración de linfocitos primarios CD3+T dependiente de CXCR1 y CXCR2. De la misma forma que el CXCL12 , un ligando de CXCR4 conocido y quimioatractivo para las células T, la t ansmigración inducida dependiente de la dosis de MIF, un proceso que fue quimiotactico y transducido a través de CXCR2, tal como se demuestra por el bloqueo de anticuerpos y la desensibilización cruzada de CXCL12 (Fig. 2F y Fig 8). Asi, el MIF elicita la migración dirigida por células T a través de CXCR . En neutrófilos humanos primarios, un tipo de célula principal que porta CXCR2, el MIF ejerció actividad quimiotáctica mediada por CXCR2 pero no por CXCR1 , exhibiendo una curva de respuesta a la dosificación en forma de campana y un desensibilización cruzada al CXCL8 (Fig 2G, H) . La actividad quimiotáctica de los neutrófilos hacia el MIF probablemente está relacionada con una ausencia de CD74 en los neutrófilos, como su expresión ectópica en células HL-60 promielociticas CD74- que potencian la migración inducida por MIF (Fig. 8). Aunque el MIF igual que otros ligandos CXCR2 , funciona como una quimioquina de detención, los datos presentes revelaron que el MIF también tiene propiedades quimiotácticas apreciables sobre células mononucleares y nuetrófilos .
EJEMPLO 4 El MIF dispara la activación rápida de integrina y el flujo de calcio Las funciones de detención del MIF pueden reflejar una señalización directa MIF/CXCR, pero no pueden excluirse completamente que el MIF induce otras quimioquinas de detención durante el tiempo requerido para la inmovilización del MIF. Para consolidar la evidencia de que el MIF induce directamente la detención de leucocitos (Figuras 1A-H), se llevo a cabo un PCR en tiempo real y ELISA y se encontró que la preincubación de 2 horas de incubación de células endoteliales aórticas humanas (o venosas) con MIF no podía suprarregular las quimioquinas de detención química conocidas por engancharse al CXCR2 (Fig.3A).
Una exposición a largo término de las quimioquinas presentes en solución o inmovilizadas en yuxtaposición con ligandos de integrina (por ejemplo, moléculas de adhesión celular vascular (VCAM)-l) pueden sobreregular rápidamente la actividad de la integrina, la cual media la detención de los leucocitos (Laudana, C, et al. (2006) Thromb. Haemost. 95, 5 - 11) . Esto se logra mediante la aglomeración (por ejemplo, a^ ?) o cambios conformacionales (por ejemplo, O<LP2) inmediatamente precedentes en el enlazamiento del ligando. La estimulación de las células monociticas con MIF (o CXCL8) durante 1 - 5 minutos disparó la detención dependiente de a?ß2 sobre células CHO/ICAM-1 (Fig.3B). Para obtener evidencia de una estimulación directa de integrinas monociticas, el anticuerpo informador 327C, gue reconoce una conformación de alta afinidad extendidad de a?ß2 fue utilizado en este caso (Shamri,R.et al. (2005) Nat.Inmunol. 6, 497 - 506). Estos ensayos revelaron que la activación a1ß2 en células MonoMac6 (Fig.3C) y monocitos sanguíneos humanos (Fig.3D), se presentó tan rápidamente como 1 minuto después de la exposición al MIF y persistió durante 30 minutos. Para evaluar si los efectos del MIF estaban restringidos a la detención de células monociticas dependientes de 0<1ß2a4ß1 sobre VCAM-1 también fue estudiada. La exposición al MIF durante 1 - 5 minutos indujo la detención marcada, la que fue mediada por CXCR2, CD74 y a4ß1 (Fig.3E). De la misma forma que el efecto del CXCL12, la estimulación de las células Jurkat T con MIF durante 1- 5 minutos disparo la adhesión dependiente de CXCR4 sobre VCAM-1 (Fig. 8) .
Puesto que el CXCR2 puede mediar los incrementos en el calcio citosolico elicitado por CXCL8 (Jones, S.A., et al. (1997) J.Biol.Chem. 272, 16166 - 16169), la capacidad del MIF para estimular los influjos de calcio y desensibilizar las señales de CXCL8 se probó en este caso. En efecto, al igual que el CXCL8, el MIF indujo el influjo de calcio en neutrófilos humanos primarios y desensibilizó los transientes de calcio en repuesta tanto a CXCL8 como a MIF (Fig. 3F) , confirmando que el MIF activa la señalización de GPCR/Gai. La desensibilización parcial de la señalización por CXCL8 por parte de MIF vista en neutrófilos es paralela a los hallazgos con otros ligandos de CXCR2 (Jones, S.A.,et al. (1997) J.Biol.Chem. 272, 16166 - 16169) y refleja la presencia de CXCR1. En trans fectante Ll .2 que expresan CXCR2, el MIF desensibilizó completamente el influjo de calcio inducido por CXCL8, y en neutrófilos, el MIF desensibilizó los transientes inducidos por el ligando selectivo CXCR2 y CXCL7 (y los transientes desensibilizados de CXCL7 inducidos por MIF) (Fig. 3F) . En los trans fectantes de CXCR2, el MIF indujo dependiente de la dosis el influjo de calcio, y fue ligeramente menos potente y efectivo que el CXCL8 o CXCL7 (Fig.3G). En conclusión, el MIF actuó sobre CXCR2 y CXCR4 para elicitar una activación rápida de la integrina y el influjo de calcio.
EJEMPLO 5 El MIF interactua conCXCR2 y CXCR4 Para establecer las interacciones físicas del MIF con CXCR2 y CXCR4, se llevaron a cabo estudios de competición en enlazamiento del receptor e internalización . En células HE 293 con expresión ectópica de CXCR2, el MIF compitió fuertemente con CXCL8 marcado con 125I para el enlace de CXCR2 bajo condiciones de equilibrio. El enlace del trazador CXCL8 al CXCR2 fue inhibido por el MIF con una concentración de efector para una respuesta máxima media (EC50) de 1.5 nM (Fig. 4A) . La afinidad de CXCR2 por el MIF ( Kd = 1.4 nM) fue cercana a la de CXCL8 (Kd = 0.7 nM) y dentro del rango de la concentración de MIF que indujo la quimiotaxis óptima (2-4 nM) . Para confirmar el enlazamiento al CXCR2, utilizamos una prueba de internalización de receptor que reporta las interacciones especificas receptor-ligando. El análisis FACS de la superficie CXCR2 sobre transíectantes HE 293 estables mostró que el MIF indujo la intenali zación del CXCR2 con una respuesta a la dosis que recuerda a la de CXCL8 (Fig. 4B). se obtuvieron datos comparables en macrófagos RA 264.7 transíectados con CXCR2 (inserto en la Fig. 4B) .
Para verificar una interacción del MIF con el CXCR4 se llevaron a cabo estudios receptor-enlace en células Jurkat T, con CXCR4 , las cuales se expresaron en CXCR4 de forma endógena. El MIF compitió con el CXCL12 marcado con 125I para el enlazamiento de CXCR4 (Kd para CXCL12 = 1.5 nM; EC50 = 19.9 nM, Kd para MIF = 19.8 nM ) (Fig. 4C). El Kd era concordante con las concentraciones de MIF que inducían la quimiotaxis de las células T. consistentemente, el MIF, al igual que CXCL12, elicitaba la internali zación de CXCR4 de una forma dependiente de la dosis (Fig. 4D) . La internalización inducida por MIF de CXCR2 y CXCR4 fue especifica para estos receptores, como en el MIF, a diferencia del ligando cognado CCL5, que fue capaz de inducir la internalización de CCR5 en trans fectantes Ll .2 CCR5.
Para corroborar sus interacciones con CXCRs, el MIF fue marcado con biotina o fluoresceina , los cuales en contraste con el MIF yodado, permiten pruebas de receptor-enlace directas. Los transíectantes de CXCR2, pero no los controles vectoriales, soportaron el enlazamiento directo del MIF marcado, como evidencia por citometría de flujo (Fig. 4E), impulsados por perlas de estreptavidina (insertada en Fig. 4E) y microscopía de fluorescencia. Además, el enlazamiento especifico de la fluoresceína-MI F a células Jurkat portadoras de CXCR4 fue inhibido por el antagonista de CXCR4 AMD3465.
Formación de complejo entre CXCR2 y CD74 Nuestros datos sugieren la posibilidad de que un complejo del receptor de MIF funcional involucre tanto GPCRs y CD74. Así, la colocalización de CD74 y CXCR2 endógenos fue visualizado utilizando microscopía de fluorescencia con focal en macrófagos RA 264.7 que expresaban CXCR2 humano. Utilizando esta técnica, se observo una colocalización prominete en un patrón polarizado en aproximadamente el 50% de las células (Fig. 4F).
Además, los ensayo de coinmunoprecipitación revelaron que el CXCR2 interactua fiosicamente con CD74. Los complejos CXCR2/CD74 fueron detectados en células HEK293 que sobreexpresaban de forma estable el CXCR2 y de forma transiente expresaban el CD74 marcado con His. Estos complejos fueron observados por precipitación con un anticuerpo del CXCR2 y detectando el CD74 coprecipitado por western blot contra el marcador His. La coprecipitación también fue vista cuando se invirtió el orden de los anticuerpos (Fig. 4G) . También se detectaron complejos con CD74 en trans fectantes Ll .2 que expresaban de forma estable el CXCR2 humano, tal como se estableció por coinmunoprecipitación con un anticuerpo del CXCR2. En contraste, no se observaron complejos con controles Ll .2 o control de isotipo (Fig. 4H). los datos fueron consistentes con un modelo en el cual el CD74 forma un complejo de señalización con CXCR2 para mediar las funciones de MIF.
EJEMPLO 6 El CXCR2 media la detención de monocitos inducida por MIF en arterias El MIF promueve la formación de placas complejas con proliferación de células abundante, infiltración de macrófagos y deposición de lipidos ( eber, C, et al . , (2004) Arterioscler.Thromb.Vasc. Biol . 24, 1997 - 2008; Morand, E.F., et al. (2006) Nat . Rev. Drug . Discov . 5, 399 - 410). Esto se ha relacionado con la inducción de MIF endotelial por oxLDL, disparando la detención de rnonocitos (Schober,A. et al. (2004) Circulation 109, 380 - 385). El ligando de CXCR2 y CXCL1 también puede elicitar la acumulación de rnonocitos dependiente de a4ß1 en arterias carótidas perfusionadas ex vivo de ratones con endotelio arteriosclerótico temprano (Huo,Y., et al. (2001) J . Clin . Innvest . 108, 1307 - 1314). Este sistema fue utilizado para probar si el MIF actúa a través de CXCR2 para inducir el reclutamiento. La detención de rnonocitos en arterias carótidas, de ratones Apoe~/_ alimentados con una dieta alta en grasas fue inhibida por los anticuerpos de CXCR2, CD74 o MIF (Fig. 5A, y Figuras 9A-C) , indicando que el MIF contribuye al reclutamiento aterogenico a través de CXCR2 y CD74. Después del bloqueo del MIF, el CXCR2 y CD74 durante 24 horas, se observó un patrón similar para la detención de rnonocitos en arterias de ratones tipo silvestre tratados con factor de necrosis tumoral (TNF)-a, imitando una inflamación vascular aguda (Fig. 5B). En arterias de ratones Mif_ ~ tratados con TNF-OÍ, los efectos inhibidores del CD74 fueron atenuados y el bloqueo del MIF fue inefectivo, mientras que hubo inhibición residual de CXCR2, implicando la participación de otros ligandos inducibles (Fig. 5C) en comparación con el efecto de la deficiencia de MIF observado con la estimulación con TNF-a, la acumulación de monocitos fue impedida con más claridad por la deficiencia de MIF en las arterias de ratones Mif_ " Ldlr_ " (en comparación con ratones aterogenicos Mif+ + Ldlr~ -; Fig.5D, E). en ausencia de MIF, no hubo contribución aparente de CXCR2. Además, el MIF de bloqueo no tuvo efecto (Fig. 5D, E). Los efectos inhibidores del bloqueo de CXCR2 fueron restaurados cargando MIF exógeno (Fig. 5F) .
Para proveer evidencia adicional acerca de la idea de que el CXCR2 se requiere para un reclutamiento de monocitos mediado por MIF in vivo, se lleva a cabo microscopía intravital sobre arterias carótidas de ratones Mif+/+ y Mif_/" tipo silvestre quiméricos reconstituidos con médula ósea de tipo silvestre o I18rb-/- (I18rb codifica CXCR2; Fig.5G, H). Después del tratamiento con TNF-a durante 4 horas, la acumulación de leucocitos marcados en G con rodamina fue atenuada en ratones Mif" _ reconstituidos con médula ósea tipo silvestre comparada con los ratones tipo silvestre constituidos con médula ósea de tipo silvestre. La reducción en la acumulación de leucocitos debida a la deficiencia en CXCR2 de médula ósea fue más marcado en los ratones tipo silvestre quiméricos que en los ratones Mif_ " quiméricos (Fig. 5G, H) .
EJEMPLO 7 Inflamación inducida por MIF in vivo basada en CXCR2 La importancia de CXCR2para el reclutamiento de leucocitos mediado por MIF bajo condiciones aterogenicas inflamatorias fue corroborado in vivo. La adhesión de monocitos a la superficie luminal de las raices aórticas fue reducida en ratones Mif~ - Ldlr_ ~ versus Mi f+/+Ldrl+/+ con arterosclerosis primaria, y esto fue corroborado por un descenso marcado en el contenido de macrófagos de lesión (Fig. 6A) . La microscopía intravital de la circulación en el músculo cremaster revelo que la inyección de MIF adyacente al músculo causo un incremento marcado en (principalmente CD68+) la adhesión de leucocitos y emigración en las venas postcapilares, la cual fue inhibida por el anticuerpo de CXCR2 (Fig. 6B, C). El conteo de monocitos circulantes no se afectó .
A continuación se utilizó un modelo de peritonitis inducida por MIF en ratones quiméricos reconstituidos con médula ósea de tipo silvestre o I18rb-/- . La inyección intraperitoneal de MIF elicito el reclutamiento de neutrófilos después de 4 horas en ratones con médula ósea tipo silvestre, lo cual fue abrogado en ratones con médula ósea il8rb-/- (Fig. 6D) . Colectivamente, estos resultados demuestran que el MIF dispara el reclutamiento de leucocitos bajo condiciones aterogenicas e inflamatorias in vivo a través de CXCR2.
La objetivación de MIF dio como resultado la regresión de la arteriosclerosis Como se describe aquí, el MIF actúa a través de tanto CXCR2 como de CXCR4. Dado el papel del MIF y el CXCR2 en el desarrollo de lesiones arterioscleróticas , la objetivación del MIF, en vez de la de CXCL1 o CXCL12, se investigó como un método para modificar lesiones avanzadas y su contenido de monocitos de CXCR2 y células T CXCR4 + . Ratones Apoe";" , que habían recibido una dieta alta grasa durante 12 semanas y habían desarrollado lesiones arterioscleróticas severas, fueron tratados con anticuerpos neutralizantes del MIF, CXCL1 o CXCL12 durante 4 semanas. Se utilizaron pruebas de inmunobltoting y adhesión para verificar la especificidad del anticuerpo del MIF. Esto ensayos confirmaron que el anticuerpo de MIF bloqueaba la detención inducida por MIF, pero no inducida por CXCL1 o CXCL8 (Fig. 10).
El bloqueo de MIF pero no de CXCL1 o CXCL12, se tradujo en un área de placa reducida en la raíz aórtica a las 16 semanas y una regresión de placas significativa (P<0.05), en comparación con la línea base a las 12 semanas (Fig.6E,F).
Además, el bloqueo del MI F, pero de no de CXCL1 o CXCL12, se asoció con menos de un fenotipo de placa inflamatoria a las 16 semanas, como . fue evidente por un contenido menor de macrófagos y de células T CD3+ (Fig. 6G, H). Por lo tanto, la objetivación de MIF y la inhibición de la activación de CXCR2 y CXCR4, la regresión terapéutica y la estabilización de lesiones arterioscleróticas avanzadas se alcanzó en estas condiciones. En algunas realizaciones, la presente invención comprende un método para reducir el área de placas en un individuo que asi lo requiera, comprendiendo la administración a dicho individuo de uno o más agentes que inhiben (i) el enlazamiento de MIF a CXCR2 y/o CXCR4 y/o (ii) la activación por MIF de CXCR2 y/CXCR4; o (iii) cualquier combinación de (i) y (ii).
EJEMPLO 8 La interferencia con CXCR4 agrava la arteriesclerosis Para explorar el papel de CXCR4 en la arteriesclerosis, ratones Apoe-/- recibieron como alimentación una dieta aterogénica y fueron tratados continuamente con el antagonista de CXCR4 AMD3465 o vehículos (controles) a través de mini bombas osmóticas, y se analizo la formación de placas arteroscleroticas después de 12 semanas. En comparación con los controles, el tratamiento con AMD3465 exacerba significativamente la formación de lesiones en secciones de la raíz aórtica teñidas con rojo 0 (Fig. 9A) y en las aortas toracoabdominales preparadas en fase (Fig.9B). Además el tratamiento continuo de los ratones Apoe-/- con AMD3465 induce una leucocitosis sanguínea periférica pronunciada al cabo de 2 días, la cual es sostenida a través del periodo de estudio y una expansión en el número relativo de neutrófilos circulantes, el cual se incrementa adicionalmente durante la progresión de la enfermedad (Fig. 9C).
EJEMPLO 9 Desarrollo del bloqueo de Th-17 en un modelo de ratón de esclerosis múltiple Ratones C57BL/6 de ocho a doce semanas de edad (obtenidos del Jackson Laboratory, Bar Harbor, Main, USA) se pretrataron en el día -1 y semanalmente después con inyecciones intraperi toneales de 5 mg/kg bien de un anticuerpo de control (grupo 1), un anticuerpo antiratón MIF antagonista (grupo 2), un anticuerpo de CXCR2 que bloquea el enlazamiento de MIF y/o la activación de CXCR2 (grupo 3), un anticuerpo de CXCR4 que bloque el enlazamiento de MIF y/o la activación de CXCR4 (grupo 4) o un anticuerpo de CXCR4 que bloquea el enlazamiento de MIF y/o activación de CXCR4 y un anticuerpo de CXCR2 que bloquea el enlazamiento de MIF y la activación de CXCR2 (grupo 5). Los ratones (n = 30 por grupo) se inmunizaron el día siguiente (día 0) mediante dos inyecciones subcutáneas en el lomo totalizando 200 µ? de una emulsificación del péptido MOG35-55 ( MEVGWYRSPFSRWHLYRNGK; Bachem AG, Bubendorf, Suiza) en CFA. La concentración final de péptido y M. tuberculosis es de 150 g/ratón y 1 mg/ratón, respectivamente. Se inyecto PTX (400 ng; LIST Biological Laboratories Inc., Campbell, California, USA) intraperitonealmente en los días servidos. La enfermedad es monitoreada diariamente midiendo la parálisis en una escala de 0 - 6 como se describió más arriba. Los marcadores máximos de la enfermedad promedio se comparan entre los grupos utilizando una ANOVA de una vía.
Las mediciones de parálisis se comparan entre los ratones del grupo 2 y grupo 1 para determinar la eficacia del anticuerpo anti MIF antagonistico para tratar o prevenir EAE . Los ratones del grupo 5 se comparan con los ratones del grupo 1 para determinar la eficacia deun agente que bloquee el enlazamiento de MIF y/o la activación de CXCR2 y CXCR , para tratar o prevenir EAE. Los ratones del grupo 5 se comparan con los grupos 3 y 4 para determinar el efecto del bloqueo del enlazamiento de MIF y/o la activación tanto de CXCR2 como de CXCR4 para efectuar el bloqueo de CXCR2 o CXCR4 individualmente .
Las células T mixtas se preparan a partir de nodos linfáticos drenantes y de bazo en el día 7 - 11 después de la inmunización. Las células viables (3.75 x 106/ml) se cultivan en un medio completo con ( restimulado ) o sin péptido MOG (aminoácidos 35 - 55) en diversas concentraciones. Los sobrenadantes de las células activadas se recolectan 72 horas después y se miden el TNF, IFN-?, IL-23 e IL-17 mediante ELISA (BD Pharmingen) . Los niveles altos de IL-17 e IL-23 indican el desarrollo de una célula Th-17 y un fenotipo de enfermedad mediado por Th-17. La inhibición de estas citoquinas por el tratamiento de los ratones y cultivos celulares con anticuerpos que bloquean el MIF (grupo 2), o por el bloqueo del enlazamiento de MIF y/o activación tanto de CXCR2 y CXCR4 (grupo 5) ilustra una papel clave regulatorio del MIF en el desarrollo de células Th-17 y en la progresión de una enfermedad inflamatoria mediada por Th-17 (esto es, esclerosis múltiple).
Para la atención de citoquinas intracelular, las células de bazo y de nodulo linfático a partir de ratones inmunizados se estimulan durante 24 horas con un antigeno peptidicc, y se añade GolgiPlug (BP Pharmingen) en las últimas 5 horas o GolgiPlug mas 500 ng/ml de ionomicina y 50 ng/ml de forbol 12-miristato 13-acetato ( PMA; Sigma-Aldrich ) que se añaden durante 5 horas. Para la tinción, las células son permeabilizadas con el kit Citofix/citoperm Plus (BD Pharmigen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Células T de portal CD4-positivas fueron analizadas en cuanto a la presencia de IL-17, IL-23 intracelular o el receptor de superficie celular IL-23 (IL23R) mediante citometria de flujo. La presencia de células T doble positivas CD4 + , IL-17+ indica el desarrollo de un fenotipo Th-17 que conduce la progresión de la enfermedad. Además la sobreregulación de IL-23Rs sobre células positivas dobles CD4 + , y IL-17 proporciona evidencia de soporte de un fenotipo de Th-17. La presencia de IL-23 intracelular elevado en células dobles positivas CD4 + , IL-17 o en cualquier leucocito proporciona evidencia de soporte adicional en cuanto a que el IL-23 conduce la expansión de células Th-17 y/o su mantenimiento. La inhibición del desarrollo de las células Th-17, tal como se determina por los niveles más bajos de IL-17, IL-23R o IL-23, como se describió en el experimento anterior, tratando ratones con agentes de bloqueo de MIF (ratones grupo 2] o agentes que bloquean el enlazamiento/o activación de MIF de CXCR2 y CXCR4 (ratones del grupo 5) demuestra un papel dominante del MIF en la conducción de la progresión de la enfermedad autoinmune mediada por Th-17. La inhibición del desarrollo de células Th-17 y la inhibición de la progresión de EAE en ratones por bloqueo del MIF demuestra la utilidad valiosa de los agentes que inhiben (i) el enlazamiento de MIF a CXCR2 y/o CXCR4 y/o (ii) la activación por MIF de CXCR2 y/o CXCR4; o (iii) cualquier combinación de (i) y (ii) para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades autoinmunes mediadas por Th-17 tales como esclerosis múltiple.
EJEMPLO 10 Identificación de un agente perturbador del dominio de MIF Se genera una biblioteca de péptidos que cubren el dominio N-terminal extracelular de CXCR2. Los péptidos varían en tamaño desde aproximadamente 12 aminoácidos hasta aproximadamente 15 aminoácidos.
La biblioteca de péptidos es seleccionada para la inhibición de la señalización mediada por MIF a través de CXCR2 utilizando la tecnología de selección HTSGPCR.
Los péptidos que inhiben la señalización negada por MIF son seleccionados a continuación en cuanto a la inhibición de la señalización mediada por IL-8 y/o SDF-1 sobre CXCR2.
Los péptidos que inhiben la señalización de MIF a través de CXCR2 pero permiten la señalización mediada por SDF-1 e IL-8 a través de CXCR2 son seleccionados para investigación posterior .
EJEMPLO 11 Identificación de agentes perturbadores de la trimerización de MIF Se generan polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos 38 - 44 (hebra beta2) de MIF.
Los polipéptidos son seleccionados para la inhibición de la señalización mediada por MIF a través de CXCR2 utilizando tecnología de selección HTS GPCR.
Los polipéptidos que inhiben la señalización mediada por MIF son seleccionadas a continuación en cuanto a la inhibición de la señalización mediada por IL-8 y/o SDF-1 sobre CXCR2.
Los péptidos que inhiben la señalización de MIF a través de CXCR2 pero permiten la señalización mediada por SIF-1 e IL-8 a través de CXCR2 son seleccionados para investigación posterior.
EJEMPLO 12 Pruebas clínicas en humanos Objetivos del estudio: El objetivo primario de este estudio es establecer la eficacia del péptido 2 (C-KEYFYTSGKCSNPAWFVTR-C ) (P2; 20 mg, 40 mg, 80 mg ) en individuos con hipercolesteronemia homocigótica familiar (HoFH) .
Métodos Diseño del estudio: Este es un estudio de titulación forzada en grupos sencillos multicentro, de marcación abierta, de combinación de P2 en individuos masculinos y femeninos = de 18 años de edad con HoFH. Después de una selección inicial, los individuos elegibles entran en un periodo de selección de 4 semanas, consistente en 2 visitas (semanas -4 y -1), durante las cuales se descontinúan todos los fármacos para disminución de lípidos (excepto los secuestrantes de ácidos biliares e inhibidores de la absorción de colesterol) y se aconseja un cambio del estilo de vida terapéutico (TLC) de acuerdo con el National Cholesterol Education Program (NCEP) Adult Treatment Panel (ATP-III), y se inician sus guias clínicas o equivalentes. Los individuos ya en aféresis continúan su régimen de tratamiento manteniendo condiciones e intervalos consistentes durante el estudio. En la visita 3 (semana 0), se determinan los valores de eficacia/seguridad de línea base y los individuos comienzan el tratamiento con la dosis inicial de P2 (20 mg) una vez al día ( QD) durante 6 semanas. En la semana 6 (visita 4) se titulan dosis a P2 40 mg QD durante 6 semanas, y se titula de nuevo en la semana 12 (visita 5) a P2 80 mg QD, durante 6 semanas, si los individuos toleraron la dosis previa. La visita final (visita 6) se presenta en la semana 18. Las visitas de estudio son agendadas con tratamientos de aféresis individuales que ocurren inmediatamente antes de los procedimientos de visita, cuando sea aplicable. Cuando los intervalos entre los afereses están desalineados con un periodo de estudio del tratamiento del fármaco, los individuos se mantienen en el mismo periodo de tratamiento con fármaco hasta que se programa la siguiente aféresis, y hasta que los intervalos se regresan a su longitud original de tiempo. Las medidas de eficacia se hacen al menos 2 semanas después de la aféresis previa y justo antes del procedimiento de aféresis programado para el dia de la visita de estudio.
Número de participantes: Entre 30 y 50 individuos.
Diagnostico y criterios principales para inclusión: hombres y mujeres de 18 años de edad o mayores con evidencia definida de hipercolesterolemia familiar (FH) homocigótica según las guias de la Organización Mundial de la Salud, y con triglicéridos en suero en ayunas ((TG) =400 mg/dL (4.52 mmol/L) para individuos de más de 20 años de edad y 200 mg/dL (2.26 mmol/L) para individuos entre 18 - 20 años de edad, son seleccionados para la participación en el estudio.
Tratamiento del estudio: Durante los tres periodos de tratamiento de marcación abierta de 6 semanas, los individuos tomaron una tableta de QD, con alimento, inmediatamente después de la comida de la mañana. No se permite ninguna titulación hacia abajo. Si los individuos son incapaces de tolerar los incrementos en las dosis, son retirados del estudio.
Evaluaciones de eficacia: Los puntos finales primarios son los cambios porcentuales medios en HDL-C y LDL-C a partir de la línea base hasta el final de cada periodo de tiempo de tratamiento (esto es, semana 6, 12 y 18). Se obtiene un perfil de lipidos que incluye HDL-C y LDL-C en cada visita del estudio.
Evaluaciones de seguridad: La seguridad se establece utilizando evaluaciones de laboratorio clínico de rutina (paneles de hematología y análisis de orina en las semanas -4, 0 y 18, y químicos también en la semana 6 y 12). Las señales vitales se monitorean en cada visita, y se llevan a cabo exámenes físicos y electrocardiogramas (ECG) en las semanas 0 y 18. Se lleva a cabo prueba de embarazo por orina cada visita excepto durante la semana -1. Los individuos son monitoreados en cuanto a eventos adversos (AEs) desde la semana 0 a la semana 18. Se terminan determinaciones de seguridad en la semana 18 en la terminación más pronta si esto toma lugar.
Métodos estadísticos: Los puntos finales de eficacia primaria son los cambios en porcentaje en HDL-C y LDL-C a partir de la linea base al final de cada periodo de tratamiento ' (esto es, semana 6, 12 y 18). La población de análisis de eficacia es el conjunto de análisis completo (FAS) el cual incluye todos los individuos que reciben al menos una dosis de fármaco por estudio y tienen tanto una linea base y al menos una medición post linea base válida en cada periodo de análisis.
Los puntos finales de eficacia primaria se analizan a través de la computación de muestras medias de cambios porcentuales (o nominales), sus intervalos de confidencia del 95% (CIs), una estadística de muestras t de una muestra, y los valores p correspondientes. También se estiman las diferencias entre los diferentes niveles de dosis en los tratamientos increméntales y se obtiene un 95% de CIs. La prueba de hipótesis es de 2 lados con una rata de error tipo I por familia global de 5% (esto es, p = nivel de significancia de 0.05) . se utiliza el procedimiento de Hochberg para controlar la rata de error por familia para comparaciones múltiples.
EJEMPLO 13 Modelo animal para el tratamiento de aneurismas aórticos abdominales (???) Los modelos animales se prepararon como sigue. Una rata macho adulta se somete a infusión de elastasa durante 2 horas. Se lleva a cabo análisis histológico 12 - 24 horas después de la infusión para confirmar la presencia de elastina fragmentada y desorganizada. Diariamente se lleva a cabo ultrasonido para identificar y monitorear áreas de agrandamiento aórtico. 2 semanas después de administración de elastasa, a la rata se administra péptido 2 8p2; C- EYFYTSGKCSNPAWFVTR-C). La administración inicial de P2 se infusiona en el sujeto a una velocidad de 0.5 mg/hora. La ausencia de toxicidad a la infusión, incrementa la rata de infusión en 0.5 mg/hora en incrementos cada 30 minutos, hasta un máximo de 2.0 mg/hora. Cada semana después, se infusiona P2 a una velocidad de 1.0 mg/hora. En ausencia de toxicidad por infusión, se incrementa la rata en 1.0 mg/hora en incrementos a intervalos de 30 minutos, hasta un máximo de 4.0 mg/hora.
Evaluaciones de eficacia: los puntos finales primarios son los cambios porcentuales medios en tamaño de AAA (esto es, diámetro aórtico) desde la linea base hasta las semanas 3, 6 y 12.
EJEMPLO 14 Pruebas clínicas en humanos para tratamiento de aneurismas aórticos abdominales (???) Objetivos del estudio: El objetivo primario de este estudio es establecer la eficacia del péptido 2 (P2; C-KEY FYTSGKCSNPAWFVTR-C ) en individuos con AAA temprano.
Diseño del estudio: Este es un grupo sencillo, de marcación abierta, multicentro, de P2 en individuos masculino y femenino de más o igual de 18 años de edad con AAA temprano. La presencia de AAA temprano se confirma con imágenes transversales en serie. En la semana 0, los valores de eficacia/seguridad de la linea base se determina y los individuos comienzan el tratamiento con la dosis inicial de P2. A los sujetos se administra P2 una vez a la semana durante 12 semanas.
Número de participantes: Entre 30 y 50 individuos.
Tratamiento de estudio: La administración inicial de P2 es infusionada en sujetos a una velocidad de 50 mg/hora. En la ausencia de toxicidad por infusión, el incremento de rata de infusión por 50 mg/hora se incrementa cada 30 minutos, hasta un máximo de 400 mg/hora. Cada semana después, se infusiona P2 a una velocidad de 100 mg/hora. En ausencia de toxicidad por infusión, se incrementa la rata en 100 mg/hora en incrementos a intervalos de 30 minutos, hasta un máximo de 400 mg/hora.
Evaluaciones de eficacia: Los puntos finales primarios son los cambios porcentuales medios en el tamaño de AAA (esto es, diámetro aórtico) desde la linea base hasta las semanas 3, 6 y 12.
Mientras que se han mostrado y descrito realizaciones preferidas de la presente invención aquí, será obvio para los expertos en la técnica que tales realizaciones se proporcionan a manera de ejemplo únicamente. Se presentaran numerosas variaciones, cambios y sustituciones evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Debe entenderse que pueden emplearse las diversas alternativas a las realizaciones de la invención aquí descritas al poner en práctica la invención. Se entiende que las siguientes reivindicaciones definen el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes serán cubiertos por las mismas.

Claims (3)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES LO QUE SE REIVINDICA ES: .
1. Uso de un péptidc que inhibe (i) la unión MIF al CXCR2 y/o CXCR4 (ii) la activación MIF del CXCR2 y/o CXCR ; (iii) la capacidad del MIF para formar un homomultímero; (iv) la unión MIF al CD74; (v) o una combinación de los mismos, para tratar una enfermedad seleccionada de: inflamación pulmonar, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), aneurisma aórtico abdominal (AAA) , lesión por reperfusión - isquemia miocárdica, cistitis, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, infección o una combinación de los mismos.
2. El uso de la reivindicación 1, en donde el péptido se une específicamente a (a) toda o una porción del motivo de bucle N de MIF, o (b) toda o una porción del seudo-ELR y los motivos de bucle N.
3. El uso de la reivindicación 1, en donde el péptido se une específicamente a o imita toda o una porción de: (a) la secuencia de péptido PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQ y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF (b) la secuencia de péptido DQLMAFGGSSEPCALCSL y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (c) la secuencia de péptido PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQLMAFGGSSEPCALCSL y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (d) la secuencia de péptido FGGSSEPCALCSLHSI y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (e) o combinaciones de los mismos. El uso de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente co- administrar un agente activo seleccionado de: niacina, un fibrato, una estatina, un péptido imitador Apo-Al, un regulador ascendente transcripcional apoA-I, un inhibidor de ACAT, un modulador CETP, antagonistas del receptor Ilb/IIIa de Glucoproteína (GP), antagonistas del receptor P2Y12, inhibidores de Lp-PLA2, un agente anti-TNF, un antagonista del receptor IL-1, un antagonista del receptor IL-2, un . agente citotóxico, un agente inmunomodulador , un antibiótico, un bloqueador co-estimulador de célula T, un agente antirreumático que modifica la enfermedad, un agente de agotamiento de célula B, un agente inmunosupreso , un anticuerpo anti- linfocito, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, unos terpenoides, un inhibidor de topoisomerasa , un antibiótico antineoplásico, un anticuerpo monoclonal, una hormona, o combinaciones de los mismos. Una composición farmacéutica que comprende un péptido que inhibe (i) la unión MIF al CXCR2 y CXCR4; (ii) la activación MIF de CXCR2 y CXCR4 ; (iii) la capacidad del MIF para formar un homomultimero; (iv) o una combinación de los mismos, para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de: inflamación pulmonar, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , aneurisma aórtico abdominal (AAA) , lesión por reperfusión - isquemia miocárdica, cistitis, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, infección o una combinación de los mismos. La composición de la reivindicación 5, en donde el péptido se une específicamente a (a) toda o una porción del motivo de bucle N de MIF, o (b) toda o una porción del seudo-ELR y motivos de bucle N. La composición de la reivindicación 5, en donde el péptido se une específicamente a o imita toda o una porción de: (a) la secuencia de péptido PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQ y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (b) la secuencia de péptido DQLMAFGGSSEPCALCSL y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (c) la secuencia de péptido PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQLMAFGGSSEPCALCSL y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (d) la secuencia de péptido FGGSSEPCALCSLHSI y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (e) o combinaciones de los mismos. La composición de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente un agente activo seleccionado de: niacina, un fibrato, una estatina, un péptido imitador Apo-Al , un regulador ascendente transcripcional apoA-I, un inhibidor de ACAT, un modulador CETP, antagonistas del receptor Ilb/IIIa de Glucoproteína (GP), antagonistas del receptor P2Y12, inhibidores de Lp-PLA2, un agente anti-TNF, un antagonista del receptor IL-1, un antagonista del receptor IL-2, un agente citotóxico, un agente inmunomodulador, un antibiótico, un bloqueador co-estimulador de célula T, un agente antirreumático que modifica la enfermedad, un agente de agotamiento de célula B, un agente inmunosupresor, un anticuerpo anti- linfocito, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, unos terpenoides, un inhibidor de topoisomerasa, un antibiótico antineoplásico, un anticuerpo monoclonal, una hormona, o combinaciones de los mismos. Uso de un peptido que (a) se une específicamente a toda o una porción del motivo de bucle N de MIF, o (b) imita toda o una porción del motivo de bucle N de MIF, para tratar un trastorno mediado por MIF en un individuo en necesidad del mismo. El uso de la reivindicación 9, en donde el péptido se une específicamente a toda o una porción del seudo-ELR y los motivos de bucle N. El uso de la reivindicación 9, en donde el péptido se une específicamente a o imita toda o una porción de: (a) la secuencia de péptido PRASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHWPDQ y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (b) la secuencia de péptido DQLMAFGGSSE PCALCSL y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (c) la secuencia de péptido PRASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHWPDQLMAFGGSSEPCALCSL y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (d) la secuencia de péptido FGGSSEPCALCSLHSI y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (e) o combinaciones de los mismos. El uso de la reivindicación 9, en donde el trastorno mediado por MIF se selecciona de: Aterosclerosis ; Aneurisma aórtico abdominal (AAA) ; lesión por reperfusión - isquemia miocárdica; Encefalomielitis diseminada aguda; enfermedad de Moyamoya; enfermedad de Takayasu; Síndrome coronario agudo; Vasculopatía del aloinjerto cardiaca; Inflamación pulmonar; Síndrome de dificultad respiratoria aguda; Fibrosis pulmonar; Encefalomielitis diseminada aguda; enfermedad de Addison; Espondiloartritis anquilosante; Síndrome de anticuerpos antifosfolipido; Anemia hemolítica autoinmune ; Hepatitis autoinmune; Enfermedad del oído interno autoinmune; Penfigoide ampolloso; enfermedad de Chagas; Enfermedad pulmonar obstructiva crónica; Celiaquía; Dermatomiositis ; Diabetes melitus tipo 1; Diabetes melitus tipo 2; Endometriosis ; síndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; síndrome de Guillain-Barré; enfermedad de Ha sh imoto ; Púrpura trombocitopénica idiopática; Cistitis intersticial; Lupus eritematoso sistémico (SLE); Síndrome metabólico; Esclerosis múltiple; Miastenia grave; Miocarditis; Narcolepsia; Obesidad; Pénfigo Vulgar; Anemia perniciosa; Polimiositis; Cirrosis biliar primaria; Artritis reumatoide; Esquizofrenia; Escleroderma; síndrome de Sjógren; Vasculitis; Vitíligo; granulomatosis de Wegener; Rinitis alérgica; Cáncer de próstata; Carcinoma de célula macrocítica; Cáncer de ovario; Cáncer de mama; Melanoma; Cáncer gástrico; Cáncer colorrectal; Cáncer de cerebro; Enfermedad ósea metastásica; Cáncer pancreático; un Linfoma; Pólipos nasales; Cáncer gastrointestinal; Colitis ulcerativa; enfermedad de Crohn; Colitis colagenosa; Colitis linfocitica; Colitis isquémica; Colitis por desviación; síndrome de Behget; Colitis infecciosa; Colitis indeterminada; Trastorno inflamatorio del hígado; Choque por endotoxina; Choque séptico; Espondiloartritis reumatoide; Espondiloartritis anquilosante; Artritis gotosa; Polimialgia reumática; trastorno de Alzheimer; trastorno de Parkinson; Epilepsia; demencia por SIDA; Asma; Síndrome de dificultad respiratoria aguda; Bronquitis; Fibrosis quistica; Lesión pulmonar mediada por leucocito aguda; Proctitis distal; granulomatosis de Wegener; Fibromiaigia; Bronquitis; Uveítis; Con untivitis; Psoriasis; Eczema; Dermatitis; Trastornos de proliferación del músculo liso; Meningitis; Zóster; Encefalitis; Nefritis; Tuberculosis; Retinitis; Dermatitis atópica; Pancreatitis; Gingivitis, Periodontitis ; Necrosis Coagulativa; Necrosis Licuefactiva; Necrosis Fibrinoide; Hiperplasia neoíntima; Infarto del miocardio; Apoplejía; rechazo por trasplante de órgano; o combinaciones de los mismos . Una composición farmacéutica para tratar un trastorno mediado por MIF en un individuo en necesidad del mismo, que comprende un péptido que (a) se une específicamente a toda o una porción del seudo-ELR y motivos de bucle N, o (b) imita toda o una porción del seudo-ELR y los motivos de bucle N. La composición de la reivindicación 13, en donde el péptido se une específicamente a o imita toda o una porción de: (a) la secuencia de péptido PRASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHWPDQ y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (b) la secuencia de péptido DQLMAFGGSSE PCALCSL y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (c) la secuencia de péptido PRASVPDGFLSELTQQLAQATG PPQYIAVHWPDQLMAFGGSSE PCALCSL y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (d) la secuencia de péptido FGGSSEPCALCSLHSI y la característica/dominio correspondiente de por lo menos uno de un monómero MIF o trímero MIF; (e) o combinaciones de los mismos. La composición de la reivindicación 13, que comprende adicionalmente un agente activo seleccionado de: niacina, un fibrato, una estatina, un péptido imitador Apo-Al , un regulador ascendente transcripcional apoA-I, un inhibidor de ACAT, un modulador CETP, antagonistas del receptor Ilb/IIIa de Glucoproteína (GP), antagonistas del receptor P2Y12, inhibidores de Lp-PLA2, un agente anti-TNF, un antagonista del receptor IL-1, un antagonista del receptor IL-2, un agente citotóxico, un agente inmunomodulador, un antibiótico, un bloqueador co-estimulador de célula T, un agente antirreumático que modifica la enfermedad, un agente de agotamiento de célula B, un agente inmunosupresor, un anticuerpo anti- linfocito, un agente de alquilación, un anti-metabolito, un alcaloide de planta, unos terpenoides, un inhibidor de topoisomerasa , un antibiótico antineoplásico, un anticuerpo monoclonal, una hormona, o combinaciones de los mismos. La composición de la reivindicación 13, en donde el trastorno mediado por MIF se selecciona de: Aterosclerosis ; Aneurisma aórtico abdominal (AAA) ; lesión por reperfusión - isquemia miocárdica; Encefalomielitis diseminada aguda; enfermedad de Moyamoya; enfermedad de Takayasu; Síndrome coronario agudo; Vasculopatía del aloinjerto cardiaca; Inflamación pulmonar; Síndrome de dificultad respiratoria aguda; Fibrosis pulmonar; Encefalomielitis diseminada aguda; enfermedad de Addison; Espondiloartritis anquilosante; Síndrome de anticuerpos antifosfolípido; Anemia hemolítica autoinmune; Hepatitis autoinmune; Enfermedad del oído interno autoinmune; Penfigoide ampolloso; enfermedad de Chagas; Enfermedad pulmonar obstructiva crónica; Celiaquia; Dermatomiositis; Diabetes melitus tipo 1; Diabetes melitus tipo 2; Endometriosis ; síndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; síndrome de Guillain-Barré; enfermedad de Hashimoto; Púrpura trombocitopénica idiopática; Cistitis intersticial; Lupus eritematoso sistémico (SLE); Síndrome metabólico; Esclerosis múltiple; Miastenia grave; Miocarditis; Narcolepsia; Obesidad; Pénfigo Vulgar; Anemia perniciosa; Pol imiositis ; Cirrosis biliar primaria; Artritis reumatoide; Esquizofrenia; Escleroderma; síndrome de Sjogren; Vasculitis; Vitíligo; granulomatosis de egener; Rinitis alérgica; Cáncer de próstata; Carcinoma de célula macrocítica ; Cáncer de ovario; Cáncer de mama; Melanoma; Cáncer gástrico; Cáncer colorrectal; Cáncer de cerebro; Enfermedad ósea metastásica; Cáncer pancreático; un Linfoma; Pólipos nasales; Cáncer gastrointestinal; Colitis ulcerativa; enfermedad de Crohn; Colitis colagenosa; Colitis linfocítica; Colitis isquémica; Colitis por desviación; síndrome de Behget; Colitis infecciosa; Colitis indeterminada; Trastorno inflamatorio del hígado; Choque por endotoxina; Choque séptico; Espondiloartritis reumatoide; Espondiloartritis anquilosante; Artritis gotosa; Polimialgia reumática; trastorno de Alzheimer; trastorno de Parkinson; Epilepsia; demencia por SIDA; Asma; Síndrome de dificultad respiratoria aguda; Bronquitis; Fibrosis quística; Lesión pulmonar mediada por leucocito aguda; Proctitis distal; granulomatosis de Wegener; Fibromialgia; Bronquitis; Uveítis; Conjuntivitis; Psoriasis; Eczema; Dermatitis; Trastornos de proliferación del músculo liso; Meningitis; Zóster; Encefalitis; Nefritis; Tuberculosis; Retinitis; Dermatitis atópica; Pancreatitis; Gingivitis, Periodontitis ; Necrosis Coagulativa; Necrosis Licuefactiva ; Necrosis Fibrinoide; Hiperplasia neoíntima; Infarto del miocardio; Apoplejía; rechazo por trasplante de órgano; o combinaciones de los mismos .
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