WO2007138961A1

WO2007138961A1 - マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害の予防乃至治療剤

Info

Publication number: WO2007138961A1
Application number: PCT/JP2007/060557
Authority: WO
Inventors: Junji Yodoi; Norihiko Kondo; Aoi Son; Noriko Katou; Tomijirou Hara
Original assignee: Redox Bioscience Inc.
Priority date: 2006-05-29
Filing date: 2007-05-23
Publication date: 2007-12-06
Also published as: US20090170108A1; US20120003673A1; US8440413B2; JPWO2007138961A1

Abstract

（課題）　マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）によって引き起こされる障害に対して効果が高く、副作用の少ない予防乃至治療剤の提供を主たる目的とする。（解決手段）　チオレドキシンファミリーのポリペプチド（ＴＲＸ）が、ＭＩＦに直接結合することによって、ＭＩＦの炎症活性を阻害すること、ＭＩＦの細胞内への取り込みを抑制することを見出したので、ＴＲＸがＭＩＦによって引き起こされる障害に広く有効であるとの結論に達した。　従って、ＴＲＸ及びその誘導剤の１種以上を有効成分とするＭＩＦによって引き起こされる障害の予防乃至治療剤とする。

Description

明細書

マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害の予防乃至治療剤

技術分野

[0001] 本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（Macrophage migration inhibitory factor: 以下「MIF」と略記する）によって引き起こされる障害の予防乃至治療剤に関し、詳しくは、チォレドキシンファミリーのポリペプチド（以下「TRX」と略記する)及びその誘導剤の 1種以上を有効成分とする、 MIFによって引き起こされる障害の予防乃至治療剤に関する。

背景技術

[0002] マクロファージ遊走阻止因子（MIF)は、炎症部位中にマクロファージがランダムに遊走するのを阻止する炎症性サイト力インで、全身 Z局所の炎症と免疫応答に重要な役割を果たす (非特許文献 1、 2)。

MIFは、（リンパ球、マクロファージ等の）免疫担当細胞や、脳下垂体などから生体侵襲 (例えば、酸化ストレスを引き起こすエンドトキシン、活性酸素、紫外線などの刺激）に即応して産生され、炎症性サイト力インカスケードの上流に位置し、（MIFが他の炎症性サイト力インの発現を誘導することによって)炎症反応を制御することが報告されて!/ヽる（非特許文献 3、 4)。

他にも、（MIFが）ダルココルチコイドの抗炎症作用を抑制し、炎症反応促進させること、 Tリンパ球の活性ィ匕促進因子であること、さらには p53の機能を抑制することや、脂肪細胞，癌細胞等の増殖'分化に関与すること等、様々な生体反応に重要な役割を果たしていることなどが報告されている（非特許文献 2、 5、 6)。

[0003] し力しながら、 MIFは炎症作用を有する為、その過剰な産生が過度の炎症反応を引き起こし、（炎症を伴う)各種障害の原因となる。

MIFによって引き起こされる障害 (疾病）は多岐に渡り、代表的なものとして、慢性リゥマチ様関節炎等の遅延型アレルギー (IV型：細胞免疫性反応）が挙げられるが、近年、その関連疾患は拡大を見せ、動脈硬化、子宮内膜症などへの寄与も明らかにされている。他にも、急性呼吸急迫症候群 (ARDS)の肺胞洗浄液、腎臓移植を受けた患者の拒絶反応時における尿、及び急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、アトピー性皮膚炎患者で、血清中の MIF濃度が健常人と比べて顕著に上昇していることを示した報告などが挙げられる。

カロえて、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、エンドドキシンショック等の動物病態モデルでは、抗 MIF中和抗体の投与群で明らかな改善効果が認められた (非特許文献 7)。このことは MIFの炎症作用がこれら病態の悪ィ匕に関与することを示す。

MIFと各種疾患との関係について、詳しく報告された公知文献として、非特許文献 8〜 16を例示することができる。

1)非特許文献 8

肺障害モデルラットにリポポリサッカライド（LPS： lipopolysaccharide)刺激を与えることによって、 MIFの mRNAが上昇し、好中球や単球の肺胞への浸潤や気管支肺胞洗浄液中への誘導がみられるが、 LPS投与前に抗 MIF抗体を投与するとこれらの浸潤や誘導は減少し、肺出血も抑制されたことが確認されて、る。

このことは MIF活性の阻害が肺障害の予防乃至治療に有効であることを示す。又、血小板減少が抑制されたことから、 MIF活性の阻害が感染症による敗血症治療にも有効であることが示された。

2)非特許文献 9

BCG (bacilli Calmette Guerin) LPS誘導急性肝炎モデルマウスにおいて、抗 Ml F抗体を投与することにより、生存率の改善や TNF— αの増加抑制が確認されている。このことは MIF活性の阻害が急性肝炎の予防乃至治療に有効であることを示す

3)非特許文献 10及び 11

typell collagen関節炎や、 adjuvant関節炎モデル動物実験において、抗 MIF抗体による炎症反応の軽減が見られたことから、 MIF活性の阻害が関節リウマチの予防乃至治療に有効であることが報告されている。

4)非特許文献 12

急性呼吸急迫症候群 (ARDS)患者に対し、抗 MIF抗体を投与することにより、炎症性サイト力インの上昇が抑制されて、ることが確認されて、る。

即ち、 MIF活性の阻害が急性呼吸急迫症候群 (ARDS)の予防乃至治療に有効であることが示されている。

5)非特許文献 13

マウス気管支喘息モデルにぉ、て、抗 MIF抗体が病態改善に有効であったことから、 MIF活性の阻害が気管支喘息の予防乃至治療に有効であることが示された。

6)非特許文献 14及び 15

急速進行性糸球体腎炎モデルにぉ、て、抗 MIF抗体が病態改善に有効であったことから、 MIF活性の阻害が急速進行性糸球体腎炎の予防乃至治療に有効であることが示された。

7)非特許文献 16

IgA腎症モデルにおいて、抗 MIF抗体が病態改善に有効であったことから、 MIF 活性の阻害が IgA腎症の予防乃至治療に有効であることが示された。

[0005] 以上より、 MIFの制御は諸疾患の症状緩和に有益であるので、 MIFをターゲットにした (炎症性)疾患の治療乃至予防薬、言い換えれば、過剰に発現した MIFによる炎症を軽減することができ、且つ副作用のなヽ (MIFを原因とする)各種障害の治療乃至予防薬の開発が強く求められている。

[0006] 一方、チォレドキシン（Thioredoxin)は、その活性部位配列： Cys— Gly- Pro Cys -：の 2つのシスティン残基間でのジスルフイド Zジチオール交換反応による酸化還元（レドックス)活性を有する 12kDaの多機能ポリペプチドである（非特許文献 1 7)。チォレドキシンは、リボヌクレオチドリダクターゼに対する水素イオン供与体、デォキシリボヌクレオチドの合成に重要な酵素として大腸菌力単離されて以来、多くの原核生物、真核生物から単離同定されてきた。

成人 T細胞白血病誘導因子 (ADF)は、本発明者らが HTLV— 1に感染した Tリンパ球によって産生される IL— 2受容体誘導因子として最初に同定したもので、ヒトチォレドキシンである。

細胞内チォレドキシンはラジカル消去や、 activator protein- 1 (AP— 1)、 nuclear fa ctor- kappa B (NF— κ B)などのレドックスに関する転写因子の制御に重要な役割を果たして!/ヽる (非特許文献 18)。

ヒトチォレド³ rシン ii、 p38 mitogen activating protein kinase (MAPKjや apoptosis signal regulating kinase— 1 (ASK- 1)のシグナル伝達を制御する。

チォレドキシンが細胞外に放出され、サイト力インまたはケモカイン作用を示すこと（非特許文献 19)、更には細胞外 TRXが細胞内へ移行すること (非特許文献 20)が本発明者らによって報告されてきた。

し力しながら、 MIFによって引き起こされる疾病と、チォレドキシンとの関係については、現在に至るまで、報告されていない。

非特許文献 1 : Nishihira J., J Interferon Cytokine Res,(2000)20:751-762

非特許文献 2 : Bucala R.， FASEB J (1996) 7:19-24

非特許文献 3 : Annual Reports in Medicinal Chemistry,第 33卷, 24頁, 1998年非特許文献 4 : Advances in Immunology,第 66卷, 197頁, 1997年

非特許文献 5 : Bernhagen J, et al Nature 365: 756-759,1993

非特許文献 6 : Calandra T, et al Nature 377: 68-71,1995

非特許文献 7 international Journal of Molecular Medicine,第 2卷, 17頁, 1998年非特許文献 8 : Makita H, et al Am J Respir Crit Care Med 158:573-579,1998 非特許文献 9 : Kobayashi S, et al Hepatology 29:1752-1759,1999

非特許文献 10 : Mikulowaska A, et al J Immunol 158:5514-5517,1997

非特許文献 l l : Ichiyama H, et al Cytokine 26:187-194,2004

非特許文献 12 : Donnelly SC, et al Nat Med 3:320-323,1997

非特許文献 13 : Mizue Y, et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA102: 14410— 14415,2005 非特許文献 14 : Yang N, et al Mol Med 4:413-424,1998

非特許文献 15 : Lan HY, et al J Exp Med 185:1455-1465,1997

非特許文献 16 : Leung JC, et al Nephrol Dial Transplant 19:36-45,2003

非特許文献 17 : Redox regulation of cellular activation Ann . Rev. Immunol .1997;15:35

1-369

非特許文献 18 :AP- 1 transcriptional activity is regulated by a direct association bet ween thioredoxin and Ref- 1 PNAS.1997;94:3633-3638 非特許文献 19 : Circulating thioredoxin suppresses lipopolysaccharide- induced neutr ophil chemotaxis PNAS.2001; 98: 15143-15148

非特許文献 20： Redox- sensing release of thioredoxin from T lymphocytes with negat ive feedback loops J.Immunol.2004;172:442-448

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、 MIFによって引き起こされる障害 (疾患）に対して効果が高ぐ副作用の少ない予防乃至治療剤の提供を主たる目的とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、鋭意研究の結果、チォレドキシンファミリーのポリペプチド (TRX)が、 MIFに直接結合することによって、 MIFの活性を抑え、抗炎症作用を発揮することを見出した。

このこと力 TRXが（MIFによって引き起こされる）炎症反応を抑制し、（TRXが） M IFによって引き起こされる障害に広く有効であるとの結論に達した為、本発明を完成するに至った。

[0010] 即ち、請求の範囲第 1項に力かる発明は、チォレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の 1種以上を有効成分とするマクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害の予防乃至治療剤に関する。

請求の範囲第 2項に力かる発明は、チォレドキシンファミリーのポリペプチドがマクロファージ遊走阻止因子に直接結合することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の予防乃至治療剤に関する。

請求の範囲第 3項に力かる発明は、チォレドキシンファミリーのポリペプチドがマクロファージ遊走阻止因子の細胞内への移行を抑制することを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の予防乃至治療剤に関する。

請求の範囲第 4項に力かる発明は、チォレドキシンファミリーのポリペプチドがマクロファージ遊走阻止因子の活性を阻害することを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか記載の予防乃至治療剤に関する。

請求の範囲第 5項に力かる発明は、チォレドキシンファミリーのポリペプチドがヒトチォレドキシンである請求の範囲第 1項乃至第 4項いずれか記載の予防乃至治療剤に関する。

請求の範囲第 6項に力かる発明は、マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害が、 T細胞、単球 ·マクロファージ、榭状細胞、メサンギゥム細胞、尿細管上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、卵細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、ァストロサイト、癌細胞、粘膜、脳下垂体からなる群より選択されるいずれか一つの細胞又は組織における炎症によるものである請求の範囲第 1 項乃至第 5項いずれか記載の予防乃至治療剤に関する。

請求の範囲第 7項に力かる発明は、マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害が、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害である請求の範囲第 1項乃至第 5項いずれか記載の予防乃至治療剤に関する。

請求の範囲第 8項に力かる発明は、マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害が、慢性リウマチ様関節炎、動脈硬化、子宮内膜症、急性呼吸急迫症候群、気管支喘息、腎臓移植による障害、急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、アトピー性皮膚炎、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、 IgA腎症、エンドドキシンショック、感染症による敗血症力なる群より選択されるいずれ力 1つである請求の範囲第 1項乃至第 5項いずれか記載の予防乃至治療剤に関する。

請求の範囲第 9項に力かる発明は、チォレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の 1種以上を有効成分とし、マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害の予防乃至治療のための製剤に関する。

請求の範囲第 10項に力かる発明は、チォレドキシン誘導剤力スルフオラフアンである請求の範囲第 9項に記載の製剤に関する。

請求の範囲第 11項に力かる発明は、飲食品の形態である請求の範囲第 9項又は第 10項に記載の製剤に関する。

発明の効果

本発明にかかる予防乃至治療剤は、チォレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の 1種以上を有効成分とするので、 MIFと直接結合し、その活性を喪失させ、また、 MIFの細胞内への取り込みを抑制することで、 MIFによって引き起こされる炎症反応、並びに該炎症反応に起因する組織の繊維化を抑制する効果を発揮することがでさる。

従って、 MIFによって引き起こされる障害に広く有効である。

[0012] さらに本発明にかかる予防乃至治療剤は、体内でも発現する内因性チオールタンパク質である TRX又は体内におヽて TRXの発現を誘導する物質を有効成分とするため、副作用の心配がない、安全性の高い予防乃至治療剤であるといえる。

発明を実施するための最良の形態

[0013] 本発明者らは、鋭意研究の結果、チォレドキシンファミリーのポリペプチド (TRX)の新たな機能として、炎症作用を有するマクロファージ遊走阻止因子 (MIF)に直接結合することによって、 MIFの活性を阻害すること、 MIFの細胞内への取り込みを抑制することを解明した。

このことから、 TRXが、 MIFによる炎症反応を抑制する効果、並びに該炎症反応に起因する組織の繊維化を抑制する効果を発揮することができ、 MIFによって引き起こされる障害に広く有効であるとの結論に達し、本発明を完成するに至った。

以下、本発明に力かるチォレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の 1 種以上を有効成分とする予防乃至治療剤の実施形態について詳説する。

[0014] [TRX]

本発明におけるチォレドキシンとしては、ヒトチォレドキシン以外に「チォレドキシンファミリー」に属するものであればよぐその活性中心に Cys— Gly— Pro— Cys— 、一Cys— Pro— Tyr— Cys―、一 Cys— Pro— Ills— Cys―、一 Cys— Pro— Pro— Cys を有するポリペプチド類を有するものが例示される。

これらの中でも活性中心に配列 Cys— Gly Pro Cys を有する「チォレドキシン」又は「チォレドキシン 2 (ミトコンドリア特異的チォレドキシン)」が好ましぐ特に「チォレドキシン」が好まし!/、。

[0015] 上記の活性中心を有するものであれば、チォレドキシンの由来は特に限定されず、ヒトを含む動物のチォレドキシン (ヒトを含む動物の ADF)、大腸菌などの細菌のチォレドキシン、酵母のチォレドキシン；ヒト ADF活性を有するポリペプチド（ヒト ADFP)；ヒト，大腸菌等のダルタレドキシン等が含まれる。特にヒトチォレドキシン及び酵母チォレドキシンが好ましい。酵母チォレドキシンは、酵母から単離したものでもよいが、チォレドキシンを多く含む酵母の形態で使用することもできる。

[0016] 本明細書において、ヒトチォレドキシン (hTRX)とは、配列番号 1に示される 105個のアミノ酸力なるポリペプチドを指す。 hTRXの塩基配列は、配列番号 2に示される

[0017] また、 MIFに直接結合し得るものであれば、配列番号 1のヒトチォレドキシンをもとにして公知の遺伝子工学的手法により作製された TRX改変体であってもよい。該改変体としては、配列番号 1の 32位と 35位以外、好ましくは 32位〜 35位以外のアミノ酸の 1又は複数個、好ましくは 1又は数個が置換、欠失、付加、挿入されているものが挙げられる。

[0018] 上記のチォレドキシンファミリーに属するポリペプチド (TRX)を、単独又は 2種以上を組み合わせて使用することができる。

[0019] 本発明に係る予防乃至治療剤の投与経路としては、経口及び非経口のいずれでも投与することができ、臨床医によって適宜選択される。また有効成分であるチォレドキシンを単独又は通常使用される担体と共に投与することができる。

[0020] 本発明の予防乃至治療剤を経口投与する場合は、薬剤の形態として、錠剤、丸剤

、散剤、被覆錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液状製剤、エアゾール剤、アトマイザ一、ネブライザ一等の吸入剤、及びリポソーム封入剤等が挙げられる。

[0021] 本発明に係る予防乃至治療剤は、上記の有効成分と共に薬学的に許容される製剤担体を用いて、医薬製剤の形態として実用される。該製剤担体としては、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、滑沢剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩、緩衝剤等の希釈剤又は賦形剤を例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。

[0022] 錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩ィ匕ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケィ酸、リン酸カリウム等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビュルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸ェステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第 4級アンモ-ゥム塩基、ラゥリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケィ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。

さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができる。この剤皮の層の数によつて二重錠、多層錠とすることができる。

丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。

[0023] 本発明の予防乃至治療剤を非経口投与する場合は、薬剤の形態として静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び腹腔内注射などに使用される注射剤 (液剤、乳剤、懸濁剤等)、液剤 (例えば、点眼剤、点鼻薬等)、懸濁剤、乳剤、点滴剤、吸入剤 (エアロゾル剤、粉末吸入剤等)等が挙げられる。

[0024] 本発明の予防乃至治療剤が液剤、乳剤、懸濁剤等の注射剤として調製される場合、これらは殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましぐこれらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレンダリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。

尚、この場合、等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはダリセリンを本発明薬剤中に含有させてもょ、。また、通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。

[0025] 本発明の予防乃至治療剤が液状製剤である場合は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存してもよい。凍結乾燥製剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再度溶解して使用される。

[0026] 本発明の予防乃至治療剤を吸入剤として用いる場合、一般的に使用される従来公知の吸入剤用添加剤を使用して調製すればよい。この様な添加剤としては、例えば、噴射剤；白糖、乳糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の固形賦形剤：プロピレングリコール等の不活性液体のような液状賦形剤;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュルピロリドン、ポリエチレングリコール、白糖等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケィ酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；クェン酸、クェン酸ナトリウム等の安定化剤;メチルセルロース、ポリビュルピロリドン、レシチン、トリオレイン酸ソルビタン等の懸濁化剤;界面活性剤等の分散剤;水等の溶剤;塩ィ匕ナトリウム等の等張化剤;硫酸、塩酸等の pH調整剤;エタノール等の可溶化剤等が挙げられる。

[0027] さらに、本発明に係る予防乃至治療剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させて調製することもできる。

[0028] TRXファミリーに属するポリペプチドの有効量は、当業者が従来の技術を参考に容易に決定することができる力例えば、成人 1人 1日あたり 0. 001〜100mgZkg程度、好ましくは 0. 01〜： LOmgZkg程度、より好ましくは 0. 1〜： LOmgZkg程度であるこれを 1日あたり 1回又は数回に分けて投与することができるが、各種製剤の形態、患者の性別、年齢、疾患の程度に合わせて適宜調節することが好ましい。

[0029] [TRX誘導剤]

本発明の予防乃至治療剤として、体内で TRXを誘導する物質を用いて、 MIFによつて引き起こされる障害を抑制することもできる。この様な物質としては、スルフオラフアンが挙げられる。

スルフオラフアンは、例えば、キャベツ、ムラサキキャベツ、ブロッコリ一、ケール、口ケット菜、カリフラワー、ダイコン、ハクサイ、カブ、コマツナ、チンゲンサイ等に含まれ、これらの植物の新芽を用いることが好ましい。

中でも、スルフオラフアンは、ブロッコリ一の新芽（ブロッコリースプラウト）、ダイコンの新芽 (カイヮレダイコン）、ムラサキキャベツの新芽等に多く含まれている。

[0030] スルフオラフアンは、従来公知の抽出方法に従って上記の植物から得ることができ、必要に応じて精製、凍結乾燥等の処理を加えてもよい。

得られたスルフオラフアン含有抽出物は、スルフオラフアンを 0. 001〜200mgZg 程度、好ましくは 0. 005〜80mgZg程度、より好ましくは 0. 01〜50mgZg程度含むことが望ましい。

[0031] 又、摂取されるスルフオラフアンの量は、その用法、摂取する人の年齢、性別、体重、健康状態、その他の条件、症状の程度等により適宜選択されるが、成人 1人当り 1 曰当り 0. OO ^lOOO /z gZkg程度、好ましくは 0. 005〜200 gZkg程度、より好ましくは 0. 01-60 μ gZkg程度となるようにすることが望ま、。

[0032] 上記のスルフオラフアンの他に、 TRX誘導剤であるゲラ -ルゲラ-ルアセトン（GG A)を組み合わせて使用することも可能である。

[0033] 上記の抽出物をそのまま使用してもよぐ TRX誘導剤を有効成分とする医薬製剤の形態で用いてもよい。医薬製剤の形態で使用する場合は、上記 [TRX]で記載した製剤担体と共に調製することができる。

また、本発明の TRX誘導剤を有効成分とする製剤を、飲食品の形態で使用することもできる。飲食品の形態で使用する場合には、上記の抽出物に、原料である植物を加えて調製してもよい。

[0034] 飲食品としては、例えば、健康食品、栄養補助食品 (バランス栄養食、サプリメント等)、栄養機能食品、特定保健用食品、病者用食品等が挙げられる。これらの食品の製造方法は、チォレドキシン発現の誘導と、う所期の効果が得られるものであれば特に限定されず、各用途で当業者によって使用されている方法に従えばよい。

[0035] 飲食品としては、例えば、ガム、キャンディー、グミ、錠菓、クッキー、ケーキ、チョコレート、アイスクリーム、ゼリー、ムース、プリン、ビスケット、コーンフレーク、チュアブノレタブレット、ウエハース、煎餅等の菓子類;炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、果汁飲料、栄養飲料、アルコール飲料、ミネラルウォーター等の飲料類;粉末ジュース，粉末スープ等の粉末飲料;バランス栄養食;粉末、カプセル、錠剤等の形態を有するサプリメント；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類；麵類；かまぼこ等の練り製品；ふりかけ等が挙げられる。

[0036] 又、チォレドキシンファミリーのポリペプチド (TRX)とチォレドキシン誘導剤を、組み合わせて本発明の予防乃至治療剤又は製剤として調製してもよい。

[0037] [マクロファージ遊走阻止因子（MIF) ]

MIFは、ヒトをはじめ様々な動物種に存在し、 114個のアミノ酸残基力もなる分子量 12. 3kDaタンパク質で、分子内にレドックス活性領域である Cys—X—X—Cysモチーフを有することから、チォレドキシンファミリーに属する。

MIFは、リンパ球のみならず、脳や腎臓など種々の臓器で発現し、特に腎臓では尿細管上皮細胞、皮膚や角膜では細胞増殖の盛んな基底膜細胞等で発現が強、。

MIFを発現する細胞 '組織としては、 T細胞、単球 ·マクロファージ、榭状細胞、メサンギゥム細胞、尿細管上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、卵細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、ァストロサイト、癌細胞、粘膜、脳下垂体などを例示することができる。

[0038] 本発明の限定的解釈を望むものではないが、 TRXは炎症作用を有する MIFに直接結合することにより、 MIFの活性を低減させ、 MIFによる炎症（並びに炎症による繊維化）を抑えることができる。詳細には、 TRXが MIFのレドックス活性領域に直接結合することによって、 MIFの活性を阻害するものと考えられる。

また、 TRXは MIFの細胞内への取り込みを抑制することにより、 MIFによる炎症（並びに炎症による繊維化）を抑えることができる。

本発明にかかる予防乃至治療剤は、 TRX及びその誘導剤の 1種以上を有効成分とするので、 MIFによる炎症を抑制することにより、体内の炎症反応を軽減させ、 Ml Fによって引き起こされる障害の予防乃至治療に有効である。

[0039] 本発明にかかる予防乃至治療剤が適用可能な疾患（障害)群、即ち、 MIFによって引き起こされる障害について説明する。 MIFによって引き起こされる障害とは、 MIF によって起きる「炎症反応」、並びに炎症反応に引き続く「組織の繊維化」を引き起こすものであれば、特に限られるものではないが、後述する疾患を列挙することができる。

[0040] [障害 Z疾患]

本発明の予防乃至治療剤が適用される疾患、即ち、 MIFによって引き起こされる障害としては、 MIFを発現する細胞'組織である、 T細胞、単球 'マクロファージ、榭状細胞、メサンギゥム細胞、尿細管上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、卵細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、ァストロサイト、癌細胞、粘膜、脳下垂体などにおける炎症等が挙げられる。

このような障害には、上述した MIFを発現する細胞 '組織において MIFの炎症作用によって直接的に引き起こされる障害、及び MIFによる間接的作用によって各種細胞 '組織等において間接的に引き起こされる障害が含まれるものとする。

[0041] MIFによって引き起こされる疾患の代表的なものとしては、遅延型アレルギー、慢性リウマチ様関節炎、動脈硬化、子宮内膜症、急性呼吸急迫症候群 (ARDS)、気管支喘息、腎臓移植による障害、急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、アトピー性皮膚炎、腎炎 (特に急速進行性糸球体腎炎)、 IgA腎症、肝炎 (特に急性肝炎)、肺障害 (例えば、好中球や単球の肺胞への浸潤、気管支肺胞洗浄液中への誘導や肺出血による肺障害)、肺炎 (例えば、 BCG— LPS誘導急性肝炎）、関節炎、関節リウマチ (特に typell collagen関節炎及び adjuvant関節炎）、ェンドドキシンショック、血小板減少に伴う感染症による敗血症などを列挙することができる。

[0042] その他、 MIFによって引き起こされる障害の一つに、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害が挙げられる。これはタバコ等の煙に含まれる有害成分によって MIFの発現が誘導され、この MIFが炎症反応を引き起こすからである。

ここで、前記有害成分の吸入には、能動的に吸入する場合 (例えば、タバコの主流煙の吸入等)及び受動的に吸入する場合 (例えばタバコの副流煙の吸入等）の両方が含まれる。また、該有害成分の吸入又は吸収の期間は特に限定されず、 1回〜数日程度の急性、 1〜3週間程度の亜急性、数ケ月以上の慢性的に吸入又は吸収することを含む。

[0043] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。

実施例 1

[0044] 〔細胞内における TRXと MIFの結合確認実験〕

ATL2細胞及び HL60細胞内における TRXと MIFの結合を（後述の如く）免疫沈降法によって確認した。

[0045] 〔実験材料〕

ATL2細胞：ヒト成人型 T白血病細胞株

公開特許公報昭 62- 19532、 Tagaya, Y., Y. Maeda, A. Mitsui, N. Kondo, H. Mats ui, J. Hamuro, N. Brown, K. Arai, T. Yokota, H. Wakasugi, et al 1989. EMBO J. 8: 75 参照

HL60細胞：ヒト急性前骨髄性白血病細胞株

京都大学ウィルス研究所淀井淳司教授譲渡分

Protein G Sepharose 4 Fast Flow: (GEヘルスケアバイオサイエンス社製）抗 TRX抗体 (ADF11抗体）：（レドックスバイオサイエンス社製）

抗 MIF抗体：（サンタクルズ社製）

抗 Rabbit抗体：（upstate社製）

[0046] 〔実験方法〕

細胞は 175cm²フラスコで、 10% FCS, lOOU/ml penicillin, 100 /z gZmlストレプトマイシンを含む RPMI 1640 (シグマ社製)培地で培養した。

1 X 10⁷〜⁸Zcellの細胞を回収し、 lOOOrpm, 4°C, 15分間で遠心後、得られた沈殿を lysis bufferで可溶ィ匕し 30分間氷上で静置した。

溶液を lOOOrpm, 4°C, 15分間遠心し、得られた上清を免疫沈降実験に使用した。タンパク質の濃度測定は、 DCプロテインアツセィキット（BIO RAD社製)を用いた。マイクロチューブに 20 μ 1の Protein G Sepharose, 500 μ gの細胞溶液をカ卩え、 pho sphate bufferで lmlに調整し、小型回転培養機で 4°C, 3時間反応させた。細胞溶液を 15, 000rpm、 4°C、 2分間遠心し、得られた上精を新しいマイクロチューブに加え、さらに 20 μ 1の Protein G Sepharose, 4 μ gZmlの抗 MIF抗体を添カ卩した。

また、コントロールには抗 MIF抗体の代わりに抗 Rabbit抗体をカ卩えた。

反応は小型回転培養機を用い、 4°Cで一晩行った。反応溶液を 15000rpm、 4°C、

2分間遠心し、沈殿を洗浄 buffer(50mM Tris—HCl (pH7. 5) , 150mM NaCl,

0. 1% NP40)で洗浄した。

沈殿に SDS— PAGE sample bufferをカ卩え、 15% SDS— PAGEゲルに供した

。泳動後、ウェスタンブロッテイングを行い抗 TRX抗体 (ADF11抗体）で確認した（図 1)。

[0047] 図 1より、 ATL2細胞及び HL60細胞内のいずれにおいても、 TRXが MIFに直接結合することが示された。

実施例 2

[0048] 〔細胞外における TRXと MIFの結合実験〕

ATL2細胞外での TRXと MIFの結合を免疫沈降法によって確認した。

[0049] 〔実験材料〕

ATL2細胞：ヒト成人型 T白血病細胞株

公開特許公報（特開昭 62- 19532)、 Tagaya, Y., Y. Maeda, A. Mitsui, N. Kondo, H. Matsui, J. Hamuro, N. Brown, K. Arai, T. Yokota, H. Wakasugi, et al 1989. EMBO J. 8:75 参照

Protein G Sepharose 4 Fast Flow: (GEヘルスケアバイオサイエンス社製）抗 TRX抗体 (ADF 11抗体）：（レドックスバイオサイエンス社製）

抗 MIF抗体：（サンタクルズ社製）

抗 Rabbit抗体：（upstate社製）

amicon ultra- 4 (ミリポア社製）

[0050] 〔実験方法〕

l X 10⁵/cellの ATL2細胞を 175cm²フラスコで、 100U/ml penicillin, 100 ^ g/mlストレプトマイシンを含む RPMI 1640 (シグマ社製)培地で 3日間培養した。回収し、 lOOOOrpm, 4°C, 15分間で遠心後、得られた上清を最終濃度が 10%になるように FCSを加え、 amicon ultra-4で濃縮し、得られた濃縮液を免疫沈降実験に使用した。マイクロチューブに 20 μ 1の Protein G Sepharose、 30 μ 1の培養上清をカロえ、 phosphate bufferで lmlに調整し、小型回転培養機で 4°C, 3時間反応させた。細胞溶液を 15, 000rpm、 4°C、 2分間遠心し、得られた上精を新しいマイクロチューブにカロえ、さらに 20 μ 1の Protein G Sepharose、 4 μ gZmlの抗 MIF抗体を添カ卩した。また、コントロールには抗 MIF抗体の代わりに抗 Rabbit抗体をカ卩えた。反応は小型回転培養機を用い、 4°Cで一晩行った。反応溶液を 15000rpm、 4°C、 2分間遠心し、沈殿を洗浄 buffer (50mM Tris—HCl (pH7. 5) , 150mM NaCl, 0. 1 % NP40)で洗浄した。

沈殿に SDS— PAGE sample bufferをカ卩え、 15% SDS— PAGEゲルに供した。泳動後、ウェスタンブロッテイングを行い抗 TRX抗体 (ADF11抗体）で確認した（図 2)。

[0051] 図 2より、 ATL2細胞外で TRXが MIFに直接結合することが示された。

実施例 3

[0052] 〔TRXによる MIFの細胞内への取り込み抑制確認実験〕

MIFはオートクライン、ノクライン作用により細胞内に取り込まれ、炎症性サイト力イン TNF alpha ( a )や IL 1の産生を誘導する。そこで TRXによる MIFの細胞内取り込みに対する影響を調べ、炎症応答制御メカニズムの解明を試みた。

[0053] 〔実験材料〕

ATL2細胞：ヒト成人型 T白血病細胞株、

組換え型 MIF (MIF)：発現ベクター pQE30 (キアゲン社）を用いて His tag付き組換え型 MIFを大腸菌内で発現し、 MagneHis™ Protein Purification System (プロメガ社製）によるカラム精製した。

組換え型 TRX (TRX)： (味の素株式会社製）

抗 His tag抗体：（プロメガ社製）

[0054] 〔実験方法〕

ATL2細胞は、 75cm²フラスコで 10%FCS, lOOU/ml penicillin, 100 /z gZ ml ストレプトマイシンを含む RPMI 1640培地で培養した。

24穴プレートに ATL2細胞を 1 X 10⁶Zcell加え、終濃度 0〜250 gZml組換え型 TRXと 25 μ gZml組換え型 MIFをカ卩ぇ 37°C、 0. 5%CO条件下で 24時間培養し

2

た。

培養後細胞を回収し、沈殿に SDS— PAGE sample bufferをカ卩え、 15%SDS— P AGEゲルで電気泳動後、ウェスタンブロッテイングを行い抗 His tag抗体で細胞内に取り込まれた MIFを検出した。ウェスタンブロッテイングによるバンドの変化をデンシトメーターで解析した。測定結果を図 3に示す。

[0055] 図 3より、 TRXは濃度依存的に ATL2細胞への MIFの取り込みを抑制した。

このことから、 TRXは MIFの細胞内取り込みを抑制することにより、炎症応答を抑制することが示唆された。

実施例 4

[0056] 〔TRXによる MIF活性阻害確認実験〕

TRXによる MIFの活性阻害実験を (後述の如く）炎症性サイト力イン TNF— aの濃度を測定することによって確認した。

[0057] 〔実験材料〕

RAW 264. 7細胞：マウス由来マクロファージ細胞株、

現理化学研究所免疫 ·アレルギー科学総合研究センター石井保之博士譲渡分組換え型 MIF (MIF)： (ATGEN社製）

組換え型 TRX(TRX)： (味の素株式会社製）

lipopolysaccharide (LPS)： (SIGMA社製）

TNF- a ELISAキット：（R&D systems社製）

[0058] 〔実験方法〕

RAW 264. 7細胞は、 75cm²フラスコで 10% FCS, lOOU/ml penicillin, 10 0 μ g/ml ストレプトマイシンを含む RPMI 1640培地で培養した。 24穴プレートに RAW 264. 7細胞を l X 10⁶Zcellになるように加え、終濃度 lOngZmlMIFをカロえ、 0〜500ngZmlの TRXを添カ卩し、 37°C, 5%CO条件下で 4時間静置した。

2

さらに、 lOOngZmlの LPSをカ卩ぇ（LPS ( + )と表記）、 37。C， 5%CO条件下で 4

2

時間静置した後、培養液を回収した。

産生する TNF— alpha ( a )の量は Duo Set ELISA Development system mo use TNF— αキットにより測定した。

測定方法はキットに添付のプロトコールに従った。測定結果を図 4に示す。

[0059] 図 4より、 TRXは、濃度依存的に MIFの活性を阻害し、炎症性サイト力インである Μ

IF由来の TNF— alphaの産生を抑制することが確認された。

[0060] 上記実施例 1、 2及び 3の結果から、 TRXは MIFに直接結合することで、 MIFの細胞内への移行を抑制することが確認された。

また、上記実施例 4の結果から、チォレドキシンファミリーのポリペプチドが MIFの細胞内への移行を抑制することで TNF— alphaの産生を抑制し、炎症応答を抑制することが確認された。

従って、 TRX力 MIFによって引き起こされる障害に、広く有効であると考えられる図面の簡単な説明

[0061] [図 1]細胞内における TRXと MIFの結合を確認した結果である。

[図 2]細胞外における TRXと MIFの結合を確認した結果である。

[図 3]TRXによる MIFの細胞内への取り込み抑制を確認した結果である。

[図 4]TRXによる MIFの活性阻害を TNF— alpha ( a )の濃度 (pgZmL)で確認した結果である。

Claims

請求の範囲

[1] チォレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の 1種以上を有効成分とするマクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害の予防乃至治療剤。

[2] チォレドキシンファミリーのポリペプチドがマクロファージ遊走阻止因子に直接結合することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の予防乃至治療剤。

[3] チォレドキシンファミリーのポリペプチドがマクロファージ遊走阻止因子の細胞内への移行を抑制することを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の予防乃至治療剤。

[4] チォレドキシンファミリーのポリペプチドがマクロファージ遊走阻止因子の活性を阻害することを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 3項いずれか記載の予防乃至治療剤。

[5] チォレドキシンファミリーのポリペプチドがヒトチォレドキシンである請求の範囲第 1 項乃至第 4項、ずれか記載の予防乃至治療剤。

[6] マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害力 T細胞、単球'マクロファージ、榭状細胞、メサンギゥム細胞、尿細管上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、卵細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、ァストロサイト、癌細胞、粘膜、脳下垂体からなる群より選択されるいずれか一つの細胞又は組織における炎症によるものである請求の範囲第 1項乃至第 5項いずれか記載の予防乃至治療剤。

[7] マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害が、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害である請求の範囲第 1項乃至第 5項いずれか記載の予防乃至治療剤。

[8] マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害が、慢性リウマチ様関節炎、動脈硬化、子宮内膜症、急性呼吸急迫症候群、気管支喘息、腎臓移植による障害、急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、アトピー性皮膚炎、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、 IgA腎症、エンドドキシンショック、感染症による敗血症力なる群より選択されるいずれか 1つである請求項の範囲第 1項乃至第 5項いずれか記載の予防乃至治療剤。

[9] チォレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の 1種以上を有効成分とし、マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害の予防乃至治療のための製剤。

[10] チォレドキシン誘導剤が、スルフオラフアンである請求の範囲第 9項に記載の製剤。

[11] 飲食品の形態である請求の範囲 9項又は第 10項に記載の製剤。